Brevet FR2889949A1 — publié le 20070302

La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de pyrus ma/us et en particulier d'un extrait d'huile de pépins de pyrus ma/us dans la composition et la conception de produits cosmétiques ou dermocosmétiques, et l'utilisation de ces produits dans le domaine de l'amélioration de l'état de l'épiderme en dermocosmétique ou en cosmétique. Les aquaporines sont des canaux hydriques qui sont des systèmes protéiques transmembranaires transporteurs d'eau et de petites molécules en solution telles que le glycérol et l'urée par exemple. La taille de aquaporines est d'environ 30 kDa avec six passages transmembranaires en hélice alpha (Jung et al. Molecular structure of the water channel through aquaporin CHIP dans J. Biol. Chem. 1994; vol. 269, p. 14648- 14654). La présence d'aquaporines de type 3 ou AQP3 dans l'épiderme humain et, plus précisément dans la membrane plasmique des kératinocytes de la peau humaine a été décrite R. SOUGRAT et al. dans un article Functional expression of AQP3 in human epidermis and keratinocyte cell cultures publié dans Molecular Biology of the Cell, Nov. 1998; vol. 9, page 499a; R. SOUGRAT et al. ont également décrit dans un article le rôle important que jouent ces AQP3 dans le transport de l'eau au sein de l'épiderme humain. L'invention concerne des extraits de fruits et en particulier de pyrus ma/us, présentant des propriétés cosmétiques intéressantes, en raison d la mise en évidence de leur action dans le domaine de l'hydratation et en particulier pour réguler et/ou améliorer la fonctionnalité des aquaporines, par exemple les aquaporines AQP1, AQP3 et AQP9. Ces extraits permettent, en particulier, d'améliorer la qualité des aquaporines des kératinocytes, ce qui permet d'améliorer l'hydratation de l'épiderme et d'obtenir une activité hydratante et/ou anti-vieillissement particulièrement efficace. Par ailleurs, la demanderesse a pu observer que les extraits avaient une efficacité particulière pour réguler les flux hydriques dans l'épiderme, activité qu'ils ont pu relier à une activité des extraits sur la régulation et/ou la fonctionnalité des aquaporines et en particulier sur celle des AQP3, permettant ainsi une meilleure hydratation des couches cellulaires de l'épiderme. Ces extraits par leur activité particulière sur les kératinocytes, peuvent contribuer au renforcement du rôle de barrière hydrique de l'épiderme, en améliorant ainsi son hydratation et en jouant un rôle antivieillissement, améliorant l'aspect et la qualité de la peau, permettant ainsi d'obtenir une belle peau, une peau douce. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un extrait végétal de pyrus ma/us comme actif cosmétique ou dermocosmétique, pour la préparation d'un produit cosmétique ou dermocosmétique destiné à corriger, maintenir et améliorer l'hydratation de l'épiderme. L'extrait végétal de pyrus ma/us contient en outre au moins un dérivé de flavonoide et/ou isoflavonoide. Le pyrus ma/us est une variété connue de pommier. Les extraits tels que définis précédemment ont une activité sur le transport de l'eau dans l'épiderme qui peut être exprimée en partie par 15 leur activité sur la régulation des aquaporines AQP3. L'intérêt de la correction du maintien et de l'amélioration de l'hydratation de la peau est majeur. Elle peut résulter des effets perturbateurs de la pollution, du stress et du froid sur l'activité cellulaire de la peau et se traduit par des symptômes du tiraillement jusqu'à l'inconfort, mais également perte d'éclat et abaissement de la fonction protectrice de la peau. La perturbation de l'hydratation de la peau est également un facteur intervenant dans le vieillissement cutané. En effet, il est bien connu que, lors du vieillissement de la peau, elle devient plus fine, plus sèche donnant cet aspect fin avec écailles rencontré en particulier chez les personnes âgées. Dans la peau, il est bien connu qu'il existe un gradient d'eau de la couche basale de l'épiderme aux couches les plus superficielles du stratum corneum. Les études réalisées par la demanderesse ont permis de mettre en évidence un effet de l'actif cosmétique et/ou dermocosmétique à base d'un extrait végétal de pyrus ma/us sur les aquaporines de l'épiderme par des essais sur culture d'épiderme reconstruit. Elles ont permis de mettre également en évidence un effet notable sur l'hydratation de l'épiderme et de ses couches basales donc une amélioration de la barrière hydrique de l'épiderme. L'invention concerne également une composition cosmétique ou dermocosmétique destinée à corriger, maintenir et/ou améliorer l'hydratation de l'épiderme, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité cosmétiquement efficace d'un extrait végétal de pyrus malus. L'extrait végétal de la composition cosmétique et/ou dermocosmétique comprend en outre au moins un dérivé flavonoïde et/ou 10 isoflavonoïde. Dans un mode de réalisation, l'actif cosmétique ou dermocosmétique à base d'extrait végétal de pyrus malus est utilisé pour la préparation d'une composition cosmétique dans des proportions pondérales comprises entre 0, 0005 et 10 % par rapport au poids total de la composition. Dans un mode de réalisation, ce pourcentage pondéral est compris entre 0, 001 et 2 %. L'invention concerne également une composition cosmétique et/ou dermocosmétique comprenant de 0,0005 et 10 % par rapport au poids total de la composition de l'actif cosmétique et/ou dermocosmétique à base d'un extrait végétal de pyrus malus. Elle concerne également une composition cosmétique et/ou dermocosmétique comprenant entre 0,001 et 2 % dudit actif cosmétique. L'invention concerne également un procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique sur la peau une quantité cosmétiquement efficace d'un actif cosmétique à base d'un extrait végétal de pyrus malus. Selon un mode de réalisation, l'extrait de végétal de pyrus malus est l'extrait commercialisé sous la marque déposée EDERLINE par la société 30 IMPAG. Les exemples ainsi que les tests qui suivent permettent d'illustrer l'invention et les propriétés particulières de l'actif cosmétique sur les mécanismes de l'hydratation de l'épiderme. TEST D'OBJECTIVATION Traitement et culture Les kératinocytes ont été précultivés en milieu d'essai SFM Ep, -EGF. Les cellules ont ensuite été traitées ou non (témoin) par les produits à l'essai et cultivées pendant 24 h à 37 C et 5 % de CO2. Chaque traitement a été réalisé en triplicata. Les surnageants de culture ont été éliminés et les tapis cellulaires ont été rincés avec une solution de PBS (Invitrogen 14190094) puis placés dans des tubes stériles RNA-free en présence de Tri-Reagent (sigma T9424) et immédiatement congelés à -80 C. RT-PCR Quantitative L'expression des marqueurs sélectionnés par le commanditaire a été évaluée par RT-Q-PCR sur les ARN messagers extraits des tapis cellulaires de chaque traitement (les triplicates ont été poolés avant l'extraction de l'ARN). Les couples de primers qui ont été utilisés dans cette étude permettent l'amplification des fragments spécifiques suivants: Nom du gène Abreviation GenBank n Human beta-Actin Act X00351 Aquaporin-3 AQP3 NM 004925 Réverse Transcription Extraction des ARN totaux de chaque échantillon à l'aide de Tri-30 Reagent selon le protocole préconisé par le fournisseur. Elimination des traces d'ADN potentiellement contaminant par traitement avec le système DNA-free (Ambion). Réalisation de la réaction de réverse-transcription de l'ARNm en présence de l'amorce oligo(dT) et de l'enzyme Superscript II (Gibco). Quantification, par fluorescence, de dADNc synthétisé et ajustement des concentrations à 100 ng/pl. Une nouvelle quantification de chaque ARNc, après dilution finale, est réalisée avant la réaction de PCR. PCR Quantitative Les réactions de PCR (polymerase chain reactions) ont été réalisées par PCR quantitative avec le système Light Cycler (Roche 10 Molecular Systems Inc.) et selon les procédures recommandées par le fournisseur. Ce système d'analyse permet de réaliser des réactions de PCR rapides et performantes, moyennant une mise au point préalable des conditions d'analyse des différents primers. Il est formé de deux composants principaux: un thermocyc/eur: optimisé grâce à l'utilisation de capillaires en verre et à des transferts thermiques extrêmement rapides. un fluor/mètre: permettant de mesurer en continu l'intensité de fluorescence incorporée dans l'ADN (détection à 521 nm). Le mélange réactionnel (10 pl final) introduit dans des capillaires pour chaque échantillon est le suivant: 2.5 NI d'ADNc dilué 1/10e. amorces des différents marqueurs utilisés mélange réactionnel (Roche) contenant l'enzyme taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green I (fluorophore qui s'intercale dans 30 l'ADN double brin, au cours de l'étape d'élongation) et du MgCl 2. Conditions de PCR: Activation: 10 min à 95 C. Réactions de PCR: [10 sec à 95 C, 5 sec à 64 C et 35 sec à 35 72 C] 40 cycles. Fusion: 5 sec à 95 C puis 5 sec à 60 C puis de 60 C à 95 C (0.1 C/sec). Analyse des PQ-PCR L'incorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié est mesurée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système permet d'obtenir des courbes de mesure de la fluorescence en fonction des cycles de PCR et d'évaluer ainsi une valeur d'expression relative pour chaque marqueur. Le nombre de cycles est déterminé à partir des points de sortie des courbes de fluorescence. Pour un même marqueur analysé, 15 plus un échantillon sort tard (nombre de cycle élevé), plus le nombre initial de copies de I'ARNm est faible. La valeur de RE (relative expression) est exprimée en unités arbitraires selon la formule suivante: (1 /2nombre de cycles) x 1 06 RESULTATS Cytotoxicité sur kératinocytes humains normaux (NHDF) Les résultats des tests de viabilité au MTT et l'observation des tapis cellulaires ont conduit à sélectionner, en accord avec le commanditaire, une concentration non-cytotoxique à tester pour chaque produit à l'essai. Effets sur l'expression du marqueur Aquaporine 3 (AQP3) Afin de confirmer les effets observés, deux PCRs indépendantes ont été réalisées dans cette étude. Dans les conditions expérimentales de ces essais, le sorbitol testé à 20 mg/ml (référence positive) a stimulé l'expression relative du marqueur Aquaporine 3 dans les cultures de kératinocytes humains (192 % et 185 % du témoin). L'acide rétinoïque testé à 10-6 M n'a pas montré d'effet significatif sur l'expression d'AQP3. Ce composé, connu pour ses effets inhibiteurs de la différenciation, aurait pu modifier le taux d'expression de l'AQP3. Il a été montré qu'il modulait cette expression dans les modèles de culture de kératinocytes d'épithélium nasal, mais seulement lorsque ceux-ci sont cultivés sur filtre, à l'interface air-eau. Par ailleurs, des essais de R&D réalisés dans notre laboratoire ont montré que les effets de l'acide rétinoïque sur la différenciation des kératinocytes de l'épiderme sont faibles dans les cultures en monocouche alors qu'ils sont réellement notables dans le modèle d'épiderme reconstruit. Ainsi il n'est pas surprenant que l'acide rétinoïque n'ait pas montré d'effet dans cet essai. AQP3/Actine - PCRn 1 Traitement Concentration Cycles Cycles RE*Act RE*AQP3 % témoin Act AQP3 (UA) (UA) Témoin 1 - 16.19 18.71 13.612 2.373 100 16.14 18.66 Témoin 2 - 16.05 18.60 14.842 2.400 93 16.03 18.74 Acide 10-6 M 16.22 18.43 13.474 2.923 124 rétinoique 16.14 18.34 Extrait 0.01 % 16.31 18.19 12.614 3.254 148 de Soja 16.24 18.27 Extrait 0.1 % 16.46 18. 16 11.093 3.322 172 de pomme 16.46 18.24 Sorbitol 20 mg/mi 16.19 17.86 13. 148 4.402 192 16.24 17.73 RE* = Expression relative, exprimée en unités arbitraires (UA) n=1; première série de PCR AQP3/Actine PCRn 2 Traitement Concentration Cycles Cycles RE*Act RE*AQP3 % témoin Act AQP3 (UA) (UA) Témoin 1 - 17.21 19.11 6.689 1.731 100 17.17 19.17 Témoin 2 -17. 00 19.26 7.301 1686 89 17.13 19.10 Acide 10-6 M 17.18 18.93 6.853 1.995 112 rétinoique 17.13 18.94 Extrait 0.01% 17.47 18.83 5.586 2.168 150 de Soja 17.43 18.80 Extrait 0.1% 16.97 18.42 7.844 2.822 139 de pomme 16.95 18.45 Sorbitol 20 mg/mi 17.32 18.29 6.331 3.026 185 17.22 18.38 RE* = Expression relative, exprimée en unités arbitraires (UA) n=2; deuxième série de PCR Par ailleurs, l'extrait de pyrus malus selon la présente invention est avantageusement utilisé dans les compositions de l'invention en combinaison avec tout autre principe actif connu de l'homme de l'art, en particulier avec tout autre principe actif choisi dans le groupe constitué des vitamines et de /ou de leurs esters, les extraits de racines de plantes riches en aquaporines végétales, I'aspartate de magnésium, le chlorure de manganèse, l'acide hyaluronique, le gluconate de calcium. Comme démontré par les tests, des extraits de soja ont également une activité interessante sur la régulation et/ou la fonctionnalité des aquaporines et peuvent être utilisés à titre d'ingrédients cosmétiques seuls ou en mélange pour la préparation de compositions cosmétiques destinées à corriger, maintenir et améliorer l'hydratation de l'épiderme. D'une façon générale, les compositions cosmétiques de l'invention contiennent des excipients ou supports cosmétiquement acceptables pour une application topique sur la peau. Des exemples de tels excipients ou supports cosmétiquement acceptables sont bien connus de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisaton, la composition cosmétique et/ou dermocosmétique selon l'invention contient en outre au moins une substance choisie dans le groupe consituté des acides aminés, l'acide hyaluronique, la glycérine, le sorbitol, le xylitol, la Tri-Methyle glycine. Les compositions de l'invention peuvent être formulées sous toute forme cosmétiquement acceptable, en particulier sous forme de crème, de gel, de lotion. Les exemples qui suivent ne sont nullement limitatifs. 7 % Exemple 1: Emulsion H/E - Alcool cétylique - Stéarate de glycéryle 2,5 % Stéarate de PEG-50 2,5 % - Myristate d'isopropyle 3 % - Extrait pyrus malus(Ederline ) 0.25 % - Acétate de vitamine E 1.00 % - Palmitate de vitamine A 0.10 % - Ascorbyle phosphate de magnésium 2.00 % - Acide piperazine-N,N'-bis[2-éthanesulfonique] 10 % conservateurs 0,3 % - Soude qsp pH =7 0.2 - Eau qsp 100 % Exemple 2: Emulsion H/E 7 % - Alcool cétylique Stéarate de glycéryle 2,5 % Stéarate de PEG-50 2,5 % - Huile de vaseline 6,2 % - Myristate d'isopropyle 3 % - Ederline 0,40 % - Chlorure de manganèse 1,00% - D-xylose 1,00 % - Acide N,N'-bis[2-Hydroxyéthyl]-2aminoéthanesulfonique 7,1% - conservateurs 0,3 % - Soude qsp pH=7 0.2 Eau qsp 100 Exemple 3: Gel hydratant - Brij 721 2,4 % - Extrait huileux de pyrus malus( Ederline ) 0,40 % - Aspartame de magnésium 1,00 % - Saponines de soja 0,50 - Volpo S72 2,6 % -Prostéaryl-15 8,0 - Cire d'abeille 0,5 % Abil ZP2434 3,0 % - Propylène glycol 3,0 - Carbopol 941 0,25 Triéthanolamine 0,25 % - Extrait d'/mperata Cy/indrica L. 3,0 % - Eau, conservateurs qsp 100 Exemple 4: Lotion hydratante et tonifiante Ederline 0,01 % Caféine 0,10 Twen 20 2.00 Cérimide BP 0.15 Eau & parfums qsp. 100 g REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un actif cosmétique et / ou dermo-cosmétique à base d'un extrait végétal de pyrus ma/us, pour la préparation d'un produit cosmétique destiné à corriger, maintenir et améliorer l'hydratation de l'épiderme. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait végétal de pyrus ma/us comprend en outre au moins un dérivé de 10 flavonoîde et/ou isoflavonoïde. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait végétal a une activité sur la régulation des aquaporines AQP3. 4. Utilisation selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait végétal de pyrus ma/us est utilisé dans des proportions pondérales comprises entre 0,0005 et 10% par rapport au poids total du produit cosmétique. 5. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le pourcentage pondéral est compris entre 0,01 et 2%. 6. Composition cosmétique ou dermo-cosmétique destinée à corriger, maintenir et / ou améliorer l'hydratation de l'épiderme, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité cosmétiquement efficace d'un extrait végétal de pyrus ma/us. 7. Composition cosmétique selon la revendication 6, 25 caractérisée en ce que l'extrait végétal comprend en outre au moins un dérivé de flavonoîde et/ou isoflavonoïde.. 8. Composition cosmétique et/ou dermo-cosmétique comprenant entre 0,0005 et 10% par rapport au poids total de la composition de l'actif cosmétique. 9. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 0,01 et 2 % de l'actif cosmétique. 10. Composition selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient en outre au moins une substance choisie dans le groupe constitué des acides aminés, l'acide hyaluronique, la glycérine, le sorbitol, le xylitol, la Tri-Methyle glycine.. 11. Procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique sur la peau une quantité cosmétiquement efficace d'un actif cosmétique à base d'un extrait végétal de pyrus ma/us.