Brevet FR2895677A1 — publié le 20070706

Le vieillissement est un phénomène inévitable, lentement évolutif et irréversible entraînant des modifications anatomiques et histologiques responsables d'anomalies fonctionnelles des organes. Les premiers signes visibles se manifestent au niveau du tissu cutané par des altérations de la texture, de la couleur, de la transparence et par l'apparition de rides. Ces manifestations peuvent être potentialisées par des facteurs extrinsèques comme le soleil, le tabac... L'importance des radicaux libres oxygénés (RLO) dans les processus impliqués dans le vieillissement est retenue comme une des théories majeures. Au niveau cutané, les RLO sont décrits comme les médiateurs précoces de pathologies inflammatoires et du vieillissement 15 (Kress M. et al. Pain 1995; 62:87-94). Au cours du vieillissement, toutes les structures de la peau se modifient. Mais les altérations fondamentales prédominent dans le derme et ce sont les fibroblastes et la 20 matrice extracellulaire qui en sont les principales cibles et les principaux acteurs. Les fibroblastes sont capables d'entrer en sénescence. En conséquence, leur nombre diminue, leur fonction est ralentie et leur phénotype est modifié. Ils participent alors activement à la dégradation 25 de la matrice extracellulaire dermique. De plus, lors de la sénescence, les fibroblastes perdent leur réactivité et voient leur régulation modulée. En effet, il est admis que le vieillissement est associé à une réduction voire une perte de la réponse au stress environnemental et, de ce 30 fait, à une apparition de maladies infectieuses, auto-immunes et de cancers (Gardner I.D. Rev. Infect. Dis. 1980; 2: 801-10). L'apparition des rides est un des signes les plus précoces du vieillissement. Elle constitue, pour certaines personnes, un véritable problème dans leurs relations avec l'extérieur. Ainsi aujourd'hui, de nombreux produits cosmétiques visant le traitement du vieillissement cutané sont mis à la disposition du public. Principalement, ces spécialités sont à base d'extraits végétaux. L'Arganier, connu dans la nomenclature botanique internationale sous l'appellation d'Argania spinosa (L.) Skells, a notamment été valorisé par l'industrie cosmétique, et plus particulièrement l'amande de la graine. L'Arganier est un arbre trapu de 6 à 10 mètres de haut, dont le port rappelle celui de l'Olivier. Le port de la couronne foliaire est quelque peu variable, pouvant être dressé ou pleureur. Les rameaux, très épineux, portent de toutes petites feuilles lancéolées, alternes, étroites, courtes (environ 2 cm), souvent regroupées en fascicules. Le feuillage de l'Arganier est généralement persistant, mais il arrive qu'en période de grande sécheresse, il devienne caduc. Les fleurs, de coloration jaune-verdâtre, hermaphrodites (étamines et pistils sur la même fleur) et pentamères (5 pétales, 5 sépales...), sont regroupées en inflorescences de type glomérule. Elles s'épanouissent de mai à juin. L'Arganier fructifie dès l'âge de 5 ans. Le fruit est une baie sessile jaune et ovale de 4 à 5 cm de long. Elle est formée d'un péricarpe charnu (aussi appelé pulpe), renfermant une sorte de faux noyau très dur de couleur marron. Cet élément est constitué en réalité de 2 à 3 graines aplaties soudées entre elles et renfermant chacune une amande oléagineuse. Les applications les plus valorisées ont pour origine l'amande de la graine. Celle-ci fournit une huile puis dans un second temps un tourteau. L'huile issue des graines a fait l'objet de plusieurs brevets d'invention : obtention de l'huile par solvant (FR 2 553 788), l'huile d'argan enrichie en insaponifiable (FR 2 724 663). Des substances autres que l'huile ont également été brevetées. C'est le cas de peptides issus des tourteaux des graines obtenus après extraction de l'huile : association de l'huile et de peptides de tourteaux pour le traitement des troubles liés au vieillissement cutané (FR 2 756 183). La feuille de l'Arganier, les protéines et les saponines de tourteaux ont également fait l'objet de brevets d'invention : EP 1 213 025 concerne des extraits de feuilles, EP 1 213 024 traite des protéines de tourteaux et EP 1 430 900 des saponines de Tourteaux. Les pulpes de fruits de l'Arganier ont fait l'objet plus récemment de la demande de brevet W02005/039610. Le fruit de l'Arganier est une fausse drupe. Il est donc constitué d'un péricarpe charnu appelé pulpe (55 à 75 % du fruit) et d'un noyau pourvu d'une coquille très dure contenant une à trois amandes. De ces dernières est extraite l'huile. La pulpe du fruit a fait l'objet d'études chimiques. Elle est constituée de glucides dont la cellulose, du glucose, fructose et saccharose (Charrouf Z. Guillaume D., Ethnoeconomical, ethnomedical, and phytochemical study of Argania spinosa (L.) Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 - Sandret F.G., Etudes préliminaires des glucides et du latex de la pulpe du fruit d' Argan (Argania spinosa) : variation au cours de la maturation, Bulletin de la Société de Chimie Biologique, 1957, 39, 5-6, 619-631). Les lipides y sont également présents. Leur teneur est de 6 Dans la fraction insaponifiable de ces lipides ont été identifiés 5 alcools triterpéniques = érythrodiol, lupéol, a et R-amyrine, bétulinaldéhyde et 2 stérols = a spinostérol et schotténol (Charrouf Z., Fkih-Tetouani S., Charrouf M., Mouchel B., Triterpènes et stérols extraits de la pulpe d'Argania spinosa, Plantes Médicinales et Phytothérapie, 1991, 25, 2-3, 112-117). La demande de brevet WO2005/039610 a trait, d'une manière générale, à l'utilisation de composition à base de pulpes de fruits d'arganier pour la préparation de produits cosmétiques. L'extrait des pulpes de fruits a été plus ou moins purifié. En effet, les inventeurs ont testé l'extrait à différentes étapes du procédé. Ainsi, c'est préférentiellement l'utilisation d'un extrait de pulpes de fruits obtenu suite à une extraction à l'hexane qui est décrit (page 15). Puis suite à une classique étape de saponification connue de l'homme du métier, les auteurs ont testé la fraction insaponifibale ainsi recueillie. Enfin, les auteurs ont également envisagé une étape de fractionnement de l'insaponifiable par chromatographie en prenant soin d'écarter le composé triterpénique érythrodiol. Ce raisonnement a vraisemblablement été guidé par les résultats obtenus notamment par le fait que l'érythrodiol seul est présenté comme toxique (exemple 1) à une dose plus faible que la fraction triterpénique telle que définie dans le document : fraction A dépourvue d'érythrodiol (page 38). De plus, l'érythrodiol seul ne présente qu'un bénéfice médiocre vis à vis des UVA et UVB (exemples 3 et 4), par rapport à ladite fraction triterpénique. L'enseignement général de ce document porte donc sur l'utilisation de la fraction triterpénique d'un extrait de pulpe de fruits d'arganier pour la préparation de produits cosmétiques et préférentiellement dans le traitement des peaux agressées par les UVA et UVB via la stimulation du métabolisme des fibroblastes.Plus spécifiquement, ce document enseigne que ladite fraction triterpénique telle que divulguée dans W02005/039610 sera d'autant plus active que la quantité d'érythrodiol sera faible. De manière surprenante et inattendue, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence un effet d'inhibition de la sénescence des fibroblastes de peaux matures avec un extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier riche en érythrodiol ; ledit extrait étant susceptible d'être obtenu par une extraction acétonique suivie d'une étape classique de saponification. Cependant, on peut raisonnablement envisager que les bénéfices de la présente invention puissent être étendus à tout extrait insaponifiable de pulpe végétale présentant une fraction triterpénique dont la composition en ses composés majoritaires est proche de celle issue des pulpes de fruits d'arganier. La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale comprenant une fraction triterpénique, caractérisé en ce que ladite fraction triterpénique dudit extrait est composée d'érythrodiol, d'a-amyrine, de R-amyrine et du lupéol, pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à prévenir et/ou traiter des désordres cutanés associés au vieillissement cutané ; ledit extrait étant susceptible d'être obtenu par une extraction acétonique suivie d'une étape classique de saponification. Ce produit, appelé insaponifiable initial, peut être solubilisé dans un excipient pour faciliter sa formulation. Préférentiellement ledit extrait est obtenu à partir d'un végétal choisi dans la famille des Sapotaceae ; et encore plus préférentiellement ledit extrait est obtenu à partir de pulpes de fruits d'arganier. Un avantage de l'extraction acétonique réside dans le fait que l'on peut s'affranchir du latex, qui représente la très grande majorité de la fraction lipidique, et ainsi être plus concentré en substances insaponifiables dans la fraction lipidique. La composition de l'insaponifiable selon la présente invention se différencie à la fois qualitativement et quantitativement de celle décrite préférentiellement dans la demande de brevet WO2005/039610. Les extraits selon la présente invention sont caractérisés par leur teneur en substances triterpéniques. Ces dernières peuvent être analysées par chromatographie en phase gazeuse selon une méthode appropriée classique qui permet d'identifier la R-amyrine, l'érythrodiol. Par contre l'aamyrine et le lupéol ne sont pas séparés par cette méthode, ces molécules peuvent alors être dosées communément. Avantageusement, la fraction triterpénique dudit extrait est composée d'érythrodiol dont la fraction massique est comprise entre environ 7% et environ 40% de l'insaponifiable initial, de R-amyrine dont la fraction 30 massique est comprise entre environ 5% et environ 30% de l'insaponifiable initial, de a-amyrine et de lupéol dont la somme de ces deux fractions massiques est comprise entre environ 10% et environ 50% de l'insaponifiable initial. Les teneurs en ces différentes molécules dépendent des conditions d'extraction. Ces valeurs seront moins importantes en fonction de l'excipient qui sera ajouté à l'insaponifiable initial. Un point remarquable de la présente invention est la contribution importante de l'érythrodiol dans les propriétés anti-vieillissement de l'extrait insaponifiable selon la présente invention. Les RLO jouant un rôle important dans le processus de vieillissement cutané, l'effet antiradicalaire (anti-RLO) de l'érythrodiol a été évalué en comparaison avec l'insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier selon la présente invention. Les dommages créés par les RLO au sein des cellules se traduisent par l'altération des composants lipidiques de la membrane plasmique (lipoperoxydation), des protéines (dénaturation et dégradation) et du matériel génétique ou ADN (mutations). Les essais réalisés in vitro ont porté sur la détermination: - de l'efficacité de protection par l'érythrodiol et par l'extrait insaponifiable contre l'oxydation de lipides membranaires (exemple 2); et du pouvoir protecteur de l'érythrodiol et d'autres molécules triterpéniques (lupéol, a et R-amyrine) vis à vis de l'altération de l'ADN génomique (exemple 3). Ces essais ont permis de mettre en évidence que l'érythrodiol est une molécule qui possède un potentiel anti-oxydant important. Dans un mode particulier de réalisation de la présente invention, l'extraction peut être réalisée comme suit : les pulpes de fruit d'Arganier séchées sont broyées puis extraites avec de l'acétone. On peut également utiliser un mélange acétone-eau. L'extraction est menée sous agitation ou de façon statique, dans un ratio plante/solvant pouvant varier de 1/2 à 1/20, à des températures variant de la température ambiante à la température d'ébullition du solvant et sur une durée pouvant aller de 30 minutes à 24 heures. Une fois extrait, le résidu solide de plante est séparé de la solution extractive par filtration ou centrifugation. La solution peut être plus ou moins concentrée jusqu'à l'obtention d'un extrait sec. Dans ce dernier cas, la matière sèche peut être solubilisée dans un alcool pour permettre la saponification. A la solution, est ajouté un hydroxyde métallique, en particulier la soude ou la potasse à des concentrations variant de 0,1 à 10 N. La saponification est menée à des températures variant de la température ambiante à l'ébullition, sous agitation et sur une durée variant de 15 minutes à 48 heures selon la température. La purification est menée par une extraction 20 liquide/liquide. On rajoute alors au milieu d'hydrolyse un solvant non miscible qui peut être de l'eau saturée ou non en sels [NaCl, (NH4) 2 SO4] et ajustée à des pH variant de 3 à 9. Ce solvant peut être un éther oxyde, un ester, un alcane, un hydrocarbure halogéné, ou un mélange de ces 25 solvants. Une, deux ou trois extractions liquides/liquides successives sont réalisées. Les phases organiques sont réunies puis lavées avec de l'eau saturée ou non en sels et à des pH variant de 3 à 9. Cette phase de lavage peut être répétée plusieurs fois. 30 Après purification, les phases organiques sont traitées de façon à éliminer le solvant. Ce traitement peut être effectué par évaporation en contrôlant la pression. L'étape d'évaporation peut mener à un produit de consistance lipidique plus ou moins cireuse, l'insaponifiable initial. On peut rajouter un excipient qui peut être une cire animale (abeille par exemple) ou végétale (cire de Carnauba, de Candellila ou de Jojoba) une huile végétale (maïs, carthame, sésame, argan...) la glycérine, des produits d'origine synthétique comme l'huile de vaseline, les polyols (comme le propylène glycol, le butylène glycol, le glycérol...) des triglycérides estérifiés (comme le miglyol 812, le myritol 318, le neobee MJ) les polymères oxypropylénés de formule H (OCH2-CHCH3)n OH ou les polymères oxyéthylénés de formule H (OCH2-CH2)n OH, les diesters d'alcool gras de longueur variable, de C1 à C40. Les proportions de l'insaponifiable initial de pulpes d'Arganier et de l'excipient peuvent varier de 1/99 à 99/1. De façon avantageuse, la présente invention permet une valorisation des pulpes de fruits dans le traitement antivieillissement, à un coût de revient raisonnable. L'extrait insaponifiable est utilisé sans étape de purification supplémentaire, qui est très coûteuse. La composition selon la présente invention peut donc être obtenue à l'aide d'un procédé faisant intervenir des étapes classiques d'extraction et de saponification connues de l'homme du métier. L'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale selon la présente invention permet de prévenir et/ou traiter les désordres cutanés qui se manifestent par des altérations de texture, de couleur, de la transparence de la peau et par l'apparition des rides. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte de réponse au stress environnemental, notamment causé par le soleil ou le tabac. -10- Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte d'inductibilité des protéines HSP72. Les protéines HSP pour Heat Shock Protein sont exprimées constitutivement dans de nombreuses cellules et possèdent des fonctions indispensables dans le maintien des protéines, d'où leur nom de protéines chaperon . En effet, elles inhibent l'agrégation des protéines dénaturées, empêchent des associations non appropriées de protéines et elles sont impliquées dans le transport intracellulaire et dans le maintien sous forme inactive de certaines protéines (Morris S.D. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27: 220-224). Les HSPs jouent également un rôle essentiel dans la réponse au stress et notamment dans les processus de protection cellulaires mettant en jeu la réponse adaptative (Maytin E.V. J. Invest. Dermatol. 1995; 104: 448-55). De façon inattendue, l'utilisation d'un extrait selon la présente invention permet de restaurer l'induction des 20 protéines HSP72 dans les fibroblastes sénescents. Dans le cadre de la présente invention, le produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique, renfermant un extrait selon l'invention, est administré par voie orale ou 25 par voie topique, et préférentiellement par voie topique. Pour une administration par voie topique, la forme galénique est choisie dans le groupe comprenant les crèmes, les gels, les pommades et les sprays. Avantageusement, la forme orale est choisie parmi le groupe 30 comprenant des comprimés, des gélules et des poudres pour suspensions buvables. De façon avantageuse, la quantité dudit extrait dans le produit cosmétique final est comprise entre environ 0,001% et environ 50%, préférentiellement entre environ 0,01% et -11- environ 10% en poids du poids total de la préparation. De façon encore plus avantageuse, le produit cosmétique final contient environ 0, 1% en poids dudit extrait par rapport au poids total de la préparation. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 : procédé d'obtention d'un extrait insaponifiable 10 de pulpes de fruits d'arganier 1 tonne de pulpes de fruits d'Arganier séchées est broyée puis extraite dans un réacteur par 5 tonnes d'acétone. L'extraction est menée sous agitation pendant une heure à 15 reflux. Une fois refroidie, la solution est récupérée par filtration puis concentrée sous vide jusqu'à l'obtention d'un extrait huileux désolvanté. Ce résidu est repris dans 500 1 d'éthanol à 95 % v/v. On y ajoute 100 1 de lessive de soude 10 N et on porte à reflux sous agitation pendant une 20 heure. Après refroidissement, la solution hydrolysée est placée dans un décanteur, on y ajoute 500 1 d'heptane et 300 1 d'eau. L'extraction liquide/liquide est menée avec précaution. Après décantation, on récupère la phase 25 organique. On répète 2 extractions nouvelles avec 500 1 d'heptane. Les 3 phases heptaniques sont regroupées et lavées 3 fois avec 500 1 d'eau chaque fois. Les phases organiques lavées sont désolvantées. On récupère ainsi une pâte cireuse. Cet extrait, qui correspond à 30 l'insaponifiable initial, est dosé pour sa teneur en substances triterpéniques. Il contient 10 % de 0 amyrine, 15 % en érythrodiol et 20 % du mélange lupéol-a amyrine.5 -12- EXEMPLE 2 : analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de la peroxydation lipidique 1) Introduction La membrane plasmique constitue la principale et la première cible des RLO et, étant riche en lipides, elle est le site d'une peroxydation accrue (Girotti A.W. J. Free Radic. Biol. Med. 1985 ; 1 : 87-95). Les peroxydes générés au cours de cette oxydation lipidique sont aussi très réactifs et capables de dégrader le matériel protéique et génomique. Pour évaluer l'altération membranaire, les auteurs de l'invention ont mesuré la peroxydation lipidique par un dosage in vitro des complexes entre les produits d'oxydation lipidique et l'acide thiobarbiturique. Ces complexes sont appelés TBARS (pour Thiobarbituric Acid Reactive Substances) et donnent le nom au test : Test des TBARS. Afin de mimer un stress oxydatif chimique, on a traité la lignée de fibroblastes, L929, par un complexe composé de peroxyde d'hydrogène (H202) et de fer (Fe2+/Fe3+) reconstituant ainsi la réaction de Fenton, source de RLO et plus particulièrement de radical hydroxyle (OH ) (Vessey D.A. et al J. Invest. Dermatol. 1992 ; 99 : 859-63) : H202 + Fe2+ - OH + OH- + Fe3+ 2) Méthodologie O Produits testés : Les produits ont été évalués sur la lignée de fibroblastes murins L929. Les cellules sont prétraitées avec les différentes concentrations de produits (Tableau I) pendant 16 heures et sont ensuite stimulées avec le complexe H202-Fe2+/Fe3+ pendant 1 heure. Le lot LK0304 d'extrait -13- insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier a été préparé selon l'exemple 1. Tableau I : Présentation des solutions testées Référence Produit Solution mère Solutions testées Insaponifiable de pulpes 10mg/ml 0.3 g/ml de fruits d'arganier (DMEM/TWEEN20) 1 g/ml Lot : LK0304 -20 C 3 g/ml Erythrodiol / 10 mg/ml DMSO 0.3 j.g/ml - 0,68 M EXTRASYNTHESE 1 g/ml -2,26 gM -20 C Lot: 05040605 3 pg/ml - 6,78 gM 400mg/ml Vitamine E* SIGMA T-1539 400 g/ml - 928.7 M -20 C (*Molécule de Référence Anti-radicalaire) La peroxydation des lipides membranaires est analysée en mesurant les TBARS (selon Morlière P. et al Biochim. Biophys. Acta. 1991 ; 1084 : 261-268). O Principe du test : En milieu acide, à 95 C, se forment des complexes, notés TSARS pour Thio Barbituric Acid Reactive Substance, entre les produits d'oxydation lipidiques (malondialdéhyde ou 15 MDA) et l'acide thiobarbiturique (TBA) qui peuvent être dosés en fluorescence par rapport à une gamme étalon avec le MDA. Le dosage des TBARS est alors exprimé en pmole/gg de protéines. Les protéines et TSARS sont dosés dans le milieu intracellulaire. 20 O Calcul du pourcentage de protection des membranes cellulaires : A partir du calcul des TSARS en pmole/ g protéines, l'efficacité protectrice des différents produits contre10 -14- l'oxydation des lipides membranaires a été calculé comme suit. [TBARS contrôle] -[TBARS (+ produits)] % de protection = X 100 [TBARS contrôle] 3) Résultats - Discussion Après un traitement de 16h avec les divers produits à tester, le modèle de stress radicalaire utilisé dans cette expérience (réaction de Fenton) induit une peroxydation lipidique importante dans les fibroblastes L929. Cette décharge massive de radical hydroxyle OH génère donc un stress oxydatif au niveau cellulaire et notamment au niveau des membranes. Cependant, dans ce type de réaction oxydative, les produits issus de la peroxydation lipidique sont internalisés dans les cellules et les TSARS sont alors dosés dans le milieu intracellulaire. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-dessous. Tableau II: Analyse de la peroxydation lipidique Protection des lipides membranaires en % Actifs testés Moyenne Ecart Type N : nombre d'expériences Vit E 400 g/ml - 928,7 M 56,62 8,74 3 Erythrodiol 33,75 15,39 3 0,3 g/ml - 0,68 M 1 g/ml - 2,26 M 38,43 7,68 3 3 g/ml - 6,78 M 53,22 17,30 3 -15- Insaponifiable de pulpes 21,38 37,53 3 de fruits d'arganier 0,3 .g/ml 1 g/ml 30,53 17,80 3 3 g/ml 37,39 9,45 2 La vitamine E, constituant la molécule de référence antiradicalaire, diminue la peroxydation lipidique induite par le complexe H2O2-Fe2+/Fe3+, et protège très efficacement les membranes cellulaires (56% environ). L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier préparé selon l'exemple 1 présente une activité antiradicalaire aux concentrations de 1 et 3 g/ml (30 et 37% de protection des membranes lipidiques, respectivement). L'érythrodiol, molécule contenue dans la fraction triterpénique de l'extrait insaponifiable, présente une bonne activité anti-oxydante avec un effet dépendant de la dose. L'érythrodiol est actif dès 0,4g/ml (33 % de protection). L'effet anti-radicalire de l'érythrodiol à 3 g/ml est très important et comparable à la Vitamine E. 4) Conclusion Le modèle in vitro présenté dans cette étude reflète les conséquences dues à un stress oxydatif majeur sur la principale cible cellulaire qu'est la membrane plasmique. Ainsi le dosage de la peroxydation lipidique constitue un bon marqueur du stress oxydatif et permet l'évaluation de l'action antioxydante, vis à vis du radical hydroxyle, de principes actifs au niveau de la membrane cellulaire. La Vitamine E, molécule anti-oxydante, permet la validation de ce modèle. -16- Dans ces conditions expérimentales, il a été observé que l'extrait selon la présente invention contenant l'érythrodiol ainsi que l'érythrodiol lui-même possèdent un potentiel anti-oxydant important. EXEMPLE 3 : analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de l'atteinte génomique 1) Introduction 10 L'ADN est une cible des RLO qui induisent la modification de bases (oxydation, nitration, déamination : Guetens G. et al Clin. Lab. Sci. 2002 ; 39 : 331-457), la formation de cassures de brins (sites abasiques ou [3-élimination) et de pontage ADN-protéines ou ADN-hydroperoxydes. L'altération 15 du matériel génomique induit une cascade de réactions cellulaires (blocage fourche de réplication, activation de protéines clés, arrêt dans le cycle cellulaire) qui aboutissent à l'induction des mécanismes de réparation. Les bases modifiées par un stress oxydatif sont ainsi prises en 20 charge majoritairement par le système de réparation des bases ou BER pour Base Excision Repair (Friedberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress ; Washington DC 1995). Ce système agit vite et efficacement selon trois étapes clés : 25 1- reconnaissance de la base altérée; 2- incision et excision de la lésion; 3- resynthèse de la brèche. Les RLO peuvent être produits en quantité telle que les systèmes de défense et de réparation cellulaires peuvent 30 être saturés. Si les effecteurs de l'apoptose sont activés, la cellule endommagée meurt. Mais, dans le cas où les lésions à l'ADN sont mal réparées, il peut y avoir génération de mutations délétères qui sont alors impliquées dans l'étape d'initiation de la carcinogenèse. C'est5 -17- pourquoi, l'incidence biologique d'un stress oxydatif (mortalité ou mutagenèse) conditionne des évènements à plus long terme comme le vieillissement et le cancer. De nombreuses études ont démontré la forte corrélation entre le vieillissement et l'accumulation progressive et irréversible de dommages oxydatifs au niveau des macromolécules cellulaires. Plusieurs groupes de recherche ont montré, chez le rongeur, que les taux de 8-OxoGuanine, mesuré dans différents tissus tels que la peau, augmentent avec l'âge (Tahara S. et al Mech. Ageing Dev. 2001 ; 122 : 415-426). Les travaux de Mecocci P. et al (Free Radic. Biol. Med. 1999 ; 26 : 303-8) sur le muscle squelettique chez l'homme, montrent que des lésions oxydantes sur l'ADN ou sur les lipides s'accumulent avec l'âge. La même équipe a également montré que chez des sujets atteints de maladie d'Alzheimer, les taux de bases oxydées dans l'ADN des lymphocytes et les taux d'antioxydants dans le plasma sont significativement plus hauts et plus bas respectivement, que chez les sujets sains (Mecocci P. et al Arch. Neurol. 2002 ; 59 : 794-8). 2) Objectif Suite à l'exemple 2 et afin de contrôler l'activité antiradicalaire de l'érythrodiol sur un autre modèle, les auteurs de l'invention ont analysé son pouvoir protecteur vis à vis de l'altération de l'ADN génomique induite par un stress oxydatif, en comparaison avec l'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier et d'autres molécules triterpéniques contenues également dans ledit extrait. Ils ont choisi de générer des lésions à l'ADN par un stress H2O2 et d'analyser indirectement les dommages ainsi formés en analysant la réaction de réparation. Pour cela, un kit -18- appelé test 3D pour DNA Damage Detection, a été utilisé. Cet essai biochimique mime in vitro la réaction de réparation par excision (Salles B. et al Anal. Biochem. 1995 ; 232 : 37-42 et Salles B. et al Biochimie 1999 ; 81 : 53-58). Le test 3D a pour base la réparation des lésions de l'ADN au moyen d'extraits cellulaires humains purifiés. Au cours de l'étape de réparation, un marqueur est incorporé à l'ADN et cette incorporation, reflet quantitatif du nombre de lésions réparées, 10 chimiluminescence.est ensuite révélée par 3) Méthodologie O Produitstestés : Les produits ont été évalués sur la lignée de fibroblastes 15 murins L929. Les cellules sont prétraitées avec les produits (Tableau III) pendant 16 heures et sont ensuite stimulées avec H202 (Peroxyde d'Hydrogène 3% - Réf. GIFRER - Laboratoire Gifrer Barbezat) à 100 M pendant 30 minutes. 20 Tableau III : Présentation des solutions testées Référence Produit Solution mère Solutions testées Insaponifiable de pulpe 10mg/ml 3 g/ml de fruits d'arganier (DMEM/TWEEN20) Lot : LK0304 -20 C Erythrodiol / 10 mg/ml DMSO 3 g/ml - 6,78 M EXTRASYNTHESE -20 C Lot: 05040605 50mM DMSO Lupéol (Triterpène) -20 C 3 g/ml - 7 M a-Amyrine (Triterpène) 50mM DMSO 3 g/ml - 7 M -20 C ~i-Amyrine (Triterpène) 50mM DMSO 3 g/ml - 7 M -20 C 2895677 -19- O Test3D : Le principe est le suivant: Après endommagement de l'ADN génomique (traitement oxydatif), les cellules sont lysées. 5 Le lysat est déposé sur une microplaque coatée avec de la polylysine : 1-Adsorption de l'ADN 2- Incubation de l'ADN avec un extrait protéique (enrichi en enzymes de réparation) et un pool de nucléotides dont un nucléotide est marqué à la biotine (dUTPBiotine) - Réparation des lésions et incorporation dans l'ADN des nucléotides marqués dUTP-Biotine . 3- Incubation avec un complexe enzymatique Avidine-Peroxydase - Reconnaissance par l'avidine des dUTP- Biotine incorporés. 4-Addition d'un substrat de la peroxydase luminescent et quantification du signal émis proportionnel au nombre de lésions réparées. Le protocole de réalisation du test est suivi selon les instructions du fournisseur du kit (Test 3D Solyscel - Réf : SFRIDN013 -AES Laboratoire). A la fin de la réaction, la plaque est lue dans un luminomètre (MITHRAS LB940 - BERTHOLD). 0 Calcul du pourcentage de protection de l'ADN: Le rapport ci-dessous permet de calculer, pour chaque concentration de produit testé, le % de protection contre l'induction de lésions sur l'ADN par un stress oxydatif (l'Intensité de Luminescence - ou IL - exprime la quantité 30 de lésions de l'ADN). IL (H202) - IL (produit) % Protection de l'ADN = X 100 IL(H202) - IL (témoin) -20- 4) Résultats et conclusion Les résultats obtenus à l'exemple 2 ont montré que l'érythrodiol présente l'activité anti-radicalaire la plus forte à 3 g/ml (6,78 M). C'est pourquoi, les auteurs ont choisi de tester tous les tripterpènes (lupéol, a-amyrine, (3-amyrine et érythrodiol) et l'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier à 3 g/ml sur le test 3D DNA Damage Detection . Ledit extrait insaponifiable a été obtenu suivant le procédé de l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau IV ci-dessous. Les valeurs indiquées dans ce tableau sont les pourcentages d'inhibition (ou % de protection) des lésions à l'ADN suite à un stress oxydatif exogène, par rapport aux cellules témoin basal (100%) et aux cellules stressé H2O2 (0%). Tableau IV: Protection de l'ADN par l'Erythrodiol Intensité % Lésions à % protection de luminescence l'ADN l'ADN Témoin 5460 0 H202 100 M-30 min 11576,7 100 0 Erythrodiol 5520 1 99 3 g/ml - 6,78 M Insaponifiable de 6193,3 12 88 pulpes de fruits d'arganier 3 g/ml Lupéol 9020 58,2 41,8 3 g/ml - 7 M a-Amyrine 8663,3 52,4 47,6 3 g/ml - 7 M (3-Amyrine 13133,3 125,4 -25,4 3 g/ml - 7 M - 21 - Le traitement par H2O2 induit une forte proportion d'oxydation au niveau de la Guanine avec formation en particulier de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-OxoGuanine) (Dizdaroglu M. et al Arch. Biochem. Biophys. 1991 ; 285 : 388-390). Le test 3D montre une forte augmentation de luminescence après traitement à l'H2O2, reflétant une forte activité de réparation et par conséquent un taux important de bases endommagées sur l'ADN. L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier protège efficacement l'ADN vis à vis du stress oxydatif. L'érythrodiol, molécule contenue dans ledit extrait insaponifiable, à 3 g/ml présente une très bonne activité anti-oxydante avec 99% de protection de l'ADN vis à vis de la formation de lésions oxydatives. En comparant les molécules triterpéniques à concentration molaire équivalente (environ 7 M), c'est l'érythrodiol qui est le plus actif. EXEMPLE 4 : Modèle d'étude in vitro de l'effet de l'extrait insaponifiable selon l'invention sur l'induction des protéines HSP72 1) Bibliographie Différents travaux ont montré la perte d'inductibilité des protéines HSP72 lors du vieillissement. Chez des patients âgés, l'induction de la protéine HSP72 par la chaleur est réduite de façon importante au niveau cutané (Muramatsu T. et al. Br. J. Dermatol. 1996; 134: 1035-1038). D'autre part, Gustmann-Conrad A. et al. (Exp. Cell. Res. 1998; 241: 404-413) ont montré que l'induction de la protéine HSP72 par un stress thermique, est significativement diminuée dans des fibroblastes issus de la peau de sujets âgés par - 22 - rapport à ceux issus de sujets jeunes. Dans cette même étude, il a été montré que le niveau d'induction d'HSP72 est également réduit dans des fibroblastes (issus de peau jeune) ou dans des lignées de fibroblastes (IMR-90) devenus sénescents au cours des divisions cellulaires. Un premier stress modéré suffit à induire in vitro les protéines HSPs afin qu'elles protègent la cellule vis à vis de nouveaux stress (Morris S.D. et al. J. Clin. Invest. 1996; 97: 706-12). L'HSP72 est une protéine majoritaire de la famille des HSP70, exprimée dans les kératinocytes et les fibroblastes cutanés et inductible par de nombreux agents stressants (chaleur, UV..) (Trautinger F. et al. J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 334-38 ; Charveron M. et al. Cell. Biol. Toxicol. 1995; 11: 161-65). 2) Protocole expérimental Les auteurs de la présente invention ont choisi d'analyser le niveau d'induction, par un stress thermique, des protéines HSP72 dans des fibroblastes IMR-90 (lignée fibroblastique) lors de la sénescence, et ceci afin d'évaluer les propriétés anti-âge d'un extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 1, soit contenant 10 % de Q amyrine, 15 % d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - a amyrine. Dans un premier temps, les auteurs ont mis en place et validé un modèle de vieillissement cellulaire en induisant la sénescence des fibroblastes par un stress oxydatif. - Modèle de sénescence induite : Les fibroblastes se divisent jusqu'à un stade critique qu'on appelle la sénescence réplicative et qui s'assimile à un vieillissement cellulaire. Mais la sénescence peut également être induite notamment par un stress oxydatif, il -23- s'agit de la Stress-Induced Premature Senescence ou SIPS (Dumont et al Free Radic. Biol. Med. 2000 ; 28 : 361-373)• Modèle utilisé : L'induction de la sénescence dans la lignée de fibroblastes IMR-90 jeunes a été mise en évidence en traitant les cellules 2h avec de l'H202. 72h après ce stress, les cellules IMR-90 sont sénescentes. Dans un second temps, ils ont montré la diminution du niveau d'induction des HSP72 suite à un stress thermique, dans des fibroblastes sénescents comparés à des fibroblastes jeunes. Finalement, ils ont évalué les propriétés d'un extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 1, soit contenant 10 % de Q amyrine, 15 % d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - amyrine sur ce modèle de sénescence. 3)Résultats L'invention sera mieux comprise et les buts, avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement de la description qui suit et qui est faite en référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 présente l'analyse du taux d'induction des HSP72 dans les fibroblastes IMR-90 au niveau 25 transcriptionnel et traductionnel. la figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72 dans les cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier selon l'invention. 30 la figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des protéines HSP72 (normalisée par le niveau d'expression de la (3-actine) dans les Fibroblastes IMR-90 sénescents pré-traités avec -24- différentes concentrations de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier selon l'invention. - Analyse de l'induction des HSP72 par un stress thermique au cours de la sénescence des fibroblastes IMR-90 : Les cellules cultivées à 37 C sont incubées 1h à 45 C et sont ensuite incubées à 37 C pendant 2h (analyse des ARNm) ou pendant 4h (analyse des protéines) : * Expression de la protéine (Western Biot) Les protéines intracellulaires, extraites des fibroblastes, ont été analysées par la technique du Western Blot, en utilisant un anticorps anti-HSP72 (Anticorps monoclonal, CHEMICON) et un système de révélation indirecte en luminescence. La membrane est analysée et l'intensité des bandes est quantifiée par densitométrie (Logiciel ImageMaster TotalLab AMERSHAM). Le niveau d'expression de HSP72 est normalisé par celui d'une protéine exprimée de façon constitutive, la (3-Actine. La figure lA présente l'analyse semi-quantitative par Western Blot du taux d'induction des protéines HSP72 dans les IMR-90 jeunes () et IMR-90 sénescents (^) (sénescence induite par H2O2). Ainsi, la figure 1A montre clairement que le taux de protéines HSP72 est induit par un stress thermique dans des fibroblastes IMR-90 jeunes. Cette induction d'HSP72 est diminuée dans des fibroblastes IMR-90 sénescents. * Expression des ARNm (PCR en temps réel) Les auteurs ont analysé l'expression HSP72 au niveau transcriptionnel en quantifiant les ARNm par la technique 30 de PCR en temps réel. Le niveau d'expression du gène d'intérêt HSP72 est calculé dans les échantillons traités par un stress thermique et les échantillons témoins. Le niveau d'expression du gène HSP72 est ensuite normalisé en utilisant trois gènes de - 25 - référence [(3-actine, GAPDH (Human glyceraldehyde-3- phosphate deshydrogenase) et YWHAZ (Tyrosine-3- monooxygenase, tryptophane-5-monooxygenase activation protein zeta polypeptide)], dont l'expression est constitutive. Enfin, en fixant le niveau d'expression dans les échantillons témoins à 1, il est alors possible de déterminer le facteur d'induction du gène HSP72. La figure 1B présente l'analyse quantitative par PCR en temps réel du taux d'induction des ARNm HSP72 dans les IMR-90 jeunes (^) et IMR-90 sénescents (^) (sénescence induite par H2O2). La figure 1B montre clairement que l'induction des ARNm HSP72 est également très diminuée lors de la sénescence induite des fibroblastes IMR-90. - Analyse de l'efficacité de l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier : Les auteurs de l'invention ont utilisé le modèle de sénescence induite ou SIPS (Stress Induced Premature Senescence) avec la lignée fibroblastique IMR-90 pour évaluer l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 1. Les cellules ont été incubées avec l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier aux concentrations de 1 et 3 g/ml pendant 24h. Puis elles ont subi le stress oxydatif induisant la sénescence. Tous les traitements ont été comparés à un lot de cellules IMR90 jeunes et un lot de cellules sénescentes (sénescence induite) non pré-traitées par l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier. Trois jours (72h) après le stress oxydatif, les HSP72 ont été induites par la chaleur. Finalement, les ARN et les -26- protéines HSP72 ont été analysées par PCR en temps réel et Western Blot, respectivement. La figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72 dans les cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait insaponifiable préparé selon l'exemple 1. Les mentions T et ST signifient respectivement Témoin et Stress Thermique . Les analyses A, B, C, et D se rapportent respectivement à des fibroblastes IMR-90 jeunes, des fibroblastes IMR-90 sénescents (sénescence induite par H202), des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés avec l'extrait insaponifiable à l g/ml et enfin des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés avec l'extrait insaponifiable à 3 g/ml. La figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des protéines HSP72 (normalisée par le niveau d'expression de la (3-actine) dans les fibroblastes IMR-90 sénescents pré-traités avec l'extrait insaponifiable à l g/ml (C) et à 3 g/ml (D). Sont également représentés les taux d'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes IMR-90 jeunes (A) et dans les fibroblastes IMR-90 sénescents (B) (sénescence induite par H202). Ces Figures 2 et 3 montrent qu'il n'y a plus d'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes IMR-90 devenus sénescents, mais que l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier, aux concentrations de 1 et 3 g/ml, restaure l'induction des HSP72 par le stress thermique. Enfin, le tableau V ci-après donne le facteur d'induction (après normalisation) des ARNm HSP72 dans des fibroblastes sénescents prétraités avec différentes concentrations d'extrait de pulpes de fruits d'Arganier. -27- Tableau V : Facteur d'induction Facteur d'induction IMR-90 jeunes 109.1 IMR-90 sénescence induite par l'H202 79.0 IMR-90 sénescents + extrait de pulpes de 84.3 fruit d'Arganier 1 g/ml IMR-90 sénescents + extrait de pulpes de 98.1 fruit d'Arganier 3 g/ml Ce tableau confirme les résultats obtenus au niveau transcriptionnel et montre la restauration quasi-totale de l'induction des ARNm HSP72 par l'extrait de pulpes de fruit 15 d'Arganier. C'est à la concentration de 3 g/ml que cet extrait est le plus actif. 4) Conclusion Les protéines HSP72 sont des protéines inductibles par de 20 nombreux stress (chaleur..) et sont fortement impliquées dans les processus de réponse adaptative. Il est reconnu que l'inductibilité des protéines HSP72, au niveau cutané et dans d'autres tissus, diminue avec l'âge et notamment lors de la sénescence cellulaire. De plus, il est admis que 25 le vieillissement est associé à une réduction de la réponse au stress environnemental entraînant des pathologies liées à l'âge. A partir d'un modèle de sénescence induite dans des fibroblastes en culture, les auteurs ont évalué la capacité 30 de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier à moduler la diminution d'induction des HSP72 par la chaleur. L'ensemble des résultats confirme d'une part qu'il y a une forte diminution de l'induction des HSP72 (par un - 28 - stress thermique) dans des fibroblastes sénescents en comparaison avec des fibroblastes jeunes. D'autre part, ces travaux montrent que l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier restaure l'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes sénescents. Dans ce modèle d'étude in vitro, l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier limite les conséquences biologiques de la sénescence cellulaire et donc présente des propriétés anti-vieillissement.10 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale comprenant une fraction triterpénique, caractérisé en ce que ladite fraction triterpénique dudit extrait est composée d'érythrodiol, d'a-amyrine, de (3-amyrine et du lupéol, pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique destiné à prévenir et/ou traiter des désordres cutanés associés au vieillissement cutané. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la fraction massique d'érythrodiol est comprise entre 7% et 40% de l'insaponifiable initial . 3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la fraction massique de (3-amyrine est comprise entre 5% et 30% de l'insaponifiable initial. 4. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la somme des fractions massiques d'a-amyrine et de lupéol est comprise entre 10% et 50% de l'insaponifiable initial. 5. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la quantité dudit extrait dans le produit cosmétique final est comprise entre 0,001% et 50%, préférentiellement entre 0,01% et 10%, et préférentiellement 0,1% en poids du poids total de la préparation. 6. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir d'un végétal choisi dans la famille botanique des Sapotaceae. 7. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir de pulpes de fruits d'arganier.-30- 8. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés se manifestent par des altérations de texture, de couleur, de la transparence de la peau et par l'apparition des rides. 9. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte de réponse au stress environnemental. 10. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en 10 ce que le stress environnemental est causé par le soleil, le tabac. 11. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les désordres cutanés sont consécutifs à une réduction ou une perte d'inductibilité des protéines 15 HSP72. 12. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique est sous forme orale ou topique, préférentiellement sous forme topique. 20 13. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en ce que la forme topique est choisie parmi le groupe comprenant des crèmes, des gels, des pommades et des sprays. 14. Utilisation selon la revendication 12 caractérisée en 25 ce que la forme orale est choisie parmi le groupe comprenant des comprimés, des gélules et des poudres pour suspensions buvables.