Brevet FR2897238A1 — publié le 20070817

PROCEDE DE PURIFICATION DE LA THAUMATINE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de grande quantité d'un édulcorant naturel, la thaumatine, à partir de son fruit et ses applications industrielles, notamment en industrie alimentaire et pharmaceutique. ETAT DE LA TECHNIQUE La thaumatine est une protéine d'origine naturelle qui est issue d'un fruit d'Afrique tropicale, le Thaumatococcus daniellii. Elle est située dans la pulpe du fruit aussi appelée arille. L'arille est entouré d'un gel polysaccharique qui possède une forte propriété de gonflement et qui peut poser des problèmes lors des étapes d'extraction/purification. La molécule de thaumatine existe sous plusieurs formes, dont 2 isomorphes principaux désignés thaumatine I et II et plusieurs formes moins courantes mais toutes ces formes ont une structure très voisine. Ces protéines sont composées de 207 acides aminés et ont des poids moléculaires de respectifs de 22 209 et 22 293, poids proche des caséines du lait, de la trypsine et de la papaïne. La thaumatine possède 8 ponts di-sulfures entre les résidus cystéines qui lui confèrent sa structure quaternaire particulière. Son point iso-électrique est élevé, proche de Il, ce qui la classe parmi les protéines basiques et lui donne une charge positive à un pH acide ou neutre. La stabilité de la thaumatine dépend du pH : elle est plus stable à pH acide qu'à pH :neutre ou qu'à pH alcalin. Les propriétés organoleptiques de la thaumatine sont particulières : elle a un pouvoir sucrant très important et en ce sens peut être employée comme édulcorant intense, son pouvoir sucrant étant 2500 à 3000 fois plus élevé que le sucre courant, le saccharose. Elle a aussi le pouvoir de modifier la sensation gustative des aliments. En effet, elle tend à adoucir ou à masquer le goût des substances amères. Pour d'autres substances comme les arômes de fruits ou de plantes, elle tend à en prolonger et intensifier le goût. La thaumatine présente de nombreuses applications industrielles et notamment en tant qu'additif alimentaire et plus particulièrement comme substitut du sucre du commerce. "TALIN " (nom commercial de la thaumatine produite par le plus grand fournisseur actuel de ce produit) a une saveur sucrée, avec un pouvoir sucrant de 2000, c'est pourquoi il a été référencé comme un édulcorant intense naturel nommé E957 mais il est également utilisé à faibles doses, de l'ordre de quelques ppm, pour modifier la qualité sensorielle des produits. Les applications de la thaumatine sont nombreuses et peuvent à titre d'exemple servir dans les domaines de la fabrication de compositions aromatiques et mélanges d'épices, de boissons (jus de fruits, thés, R VBrevets\24900'4904--0602 1 5-DEPOTFRANCE doc février 2006 - 1:13 cafés, boissons carbonatées, sirops, concentrés poudre et liquide...), produits laitiers (yaourts, mousses), confiserie (Chewing-gum), crèmes glacées et sorbets, mélanges d'édulcorants (sucrettes), pâtisserie, biscuiterie, snacks, produits diététiques (faibles calories) et compléments alimentaires (vitamines) , produits déshydratés, divers plats cuisinés divers sauces et marinades et aussi dans l'élaboration de produits cosmétiques (bains de bouche, dentifrices) et/ou pharmaceutiques et/ou nutraceutiques (par ex. alicaments). Enfin des applications peuvent être également envisagées dans l'industrie du tabac. De nombreuses références dans l'état de l'art ont étudié le pouvoir sucrant de la thaumatine. Les travaux de Henk Van der Wel et al., "Influence of the chemical modification of the sweet-tasting proteins thaumatine and monellin on the sweetness intensity and character (1981), the quality of foods and beverages" (p 113-118) divulgue la localisation du centre actif du goût sucré de la thaumatine par modification des acides aminés responsables du goût sucré et ont montré que la création d'un complexe entre les protéines responsables du goût sucré avec de l'alginate de sodium était un bon procédé pour isoler les protéines depuis l'extrait brut du fruit. La publication de C.A.M Hough et al., Developments in Sweeteners, Applied science Publishers ltd pp 87-123 (1979) s'intéresse aux produits à pouvoir sucrant. Il décrit une méthode de purification de la thaumatine basée sur les travaux de Inglett et May de 1968 qui comprend l'homogénéisation des arilles suivis par une ultracentrifugation pour enlever les petites molécules puis une purification sur Sephadex G-50 et une séparation par une chromatographie échangeuse d'ions. Il est décrit dans l'art antérieur deux techniques pour la production de la thaumatine: (1) le génie génétique et le (2) l'extraction à partir du fruit. Le génie génétique (1) utilise de la thaumatine recombinante et les méthodes usuelles sont divulguées dans de nombreuses demandes de brevets notamment la demande WO 87/03007 qui décrit l'utilisation d'un gène spécifique utilisé pour la synthèse de la thaumatine I dans un hôte recombinant. L'extraction (2) à partir du fruit par le procédé de Tate & Lyle est décrit dans le brevet US4011206, qui a pour objet 3o l'extraction de la thaumatine à l'aide d'un sel d'aluminium qui a pour avantage, plus que d'autres sels comme le chlorure de sodium par exemple, d'inhiber le gonflement du gel de polysaccharides entourant les arilles. D'autre part l'utilisation de sel d'aluminium permet selon l'auteur du brevet d'obtenir un jus peu coloré, un jus qui se clarifie plus facilement et une extraction plus sélective de la thaumatine que le jus 35 obtenu avec du chlorure de sodium. Selon l'auteur la thaumatine aurait une affinité particulière et formerait un complexe avec l'aluminium. Cette méthode présente plusieurs inconvénients : son inefficacité pour obtenir de très grande quantité de thaumatine à échelle industrielle, l'utilisation de sel d'aluminium n'est pas recom- R.V13revets\24900A24904--060215-DEPOTFRANCE. doc - I5 février 2006 - mandé pour ses effets sur la santé si l'aluminium n'est pas parfaitement éliminé ultérieurement. La purification se fait par adsorption de la thaumatine du jus sur une résine échangeuse de cations (les résines à groupements sulphopropyles ou carboxyméthyles), qui laisse dans le jus la plupart des impuretés. La thaumatine adsorbée est libérée par élution à l'aide d'une solution d'acide organique en faible concentration et l'aluminium et autres sels présents sont éliminés par dialyse ou ultrafiltration, puis séchée par lyophilisation. Le brevet GB2015533 décrit une invention ou l'intérieur du fruit est séché, et où l'arille est ensuite séparée mécaniquement. La thaumatine est ensuite extraite à l'aide d'une solution faiblement acide (pH 2,0 à 4,5). Cette technique selon ses auteurs a l'avantage de permettre une extraction rapide et avec un rendement maximum de la thaumatine. Des articles de la littérature scientifique présentent un procédé similaire avec quelques variantes (van der Wel et al. (1972) : séchage de l'arille, extraction à l'eau, filtration des débris et séparation de la thaumatine par filtration sur gel ; McKenzie et al ; (1985) : extraction avec de l'eau et des sels en forte concentration (0,3 M), clarification et adsorption sur résine échangeuse d'ions chargée positivement). Ramsohoye (1990) a montré que l'extraction avec du chlorure de sodium en milieu acide donnait des résultats presque aussi bons que l'extraction avec un sel d'aluminium. Comme chez les autres auteurs, la purification se fait à l'aide de résine échangeuse de cations. La combinaison d'une étape de traitement enzymatique et de l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration a déjà été décrite pour la purification d'un composé biologique, en particulier dans "Purification and concentration of betalaines by ultra-filtration and reverse osmosis", Lee Y.N. et al, Journal of Food Science, vo147, p465475 (1982). Il est indiqué que le choix des conditions opératoires et de la préparation enzymatique est primordial pour obtenir une bonne purification et un bon rendement. Il existe un besoin pour une nouvelle méthode de purification de la thaumatine permettant de surmonter les inconvénients précédemment cités et utilisable à échelle industrielle pour la synthèse de très grandes quantités de produit. RESUME DE L'INVENTION Il a été maintenant trouvé que la combinaison d'une étape de traitement enzymatique et de l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration/diafiltration permet de purifier la thaumatine avec des résultats performants et peu coûteux. Le procédé selon l'invention permet une mise en oeuvre du procédé d'extraction à grande échelle. L'utilisation de l'étape d'enzymage permet d'éviter le colmatage de la membrane par effet de gel des polysaccharides. Ceux-ci sont, en effet, extraits et R VBrevets \24900`.24904--060215-UEPOTFRANCE doc - 15 février 2006 - 3/13 coupés ce qui permet leur élimination dans le perméat et permet d'obtenir ainsi une plus grande pureté et un meilleur rendement du produit. L'invention fournit donc un procédé de purification de la thaumatine comprenant la combinaison d'une étape de traitement enzymatique et d'une étape de ultra- filtration/diafiltration sur membrane. Ce procédé comprend avantageusement une étape de passage sur résine échangeuse après l'étape de traitement enzymatique et avant l'étape de ultrafiltration/diafiltration sur membrane. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'extraction et de purification de la thaumatine qui comporte les étapes suivantes : étape d'extraction; (ii) éventuellement étape de clarification; (iii) traitement enzymatique; (iv) passage sur résine échangeuse; (v) ultrafiltration/diaf ltration sur membrane; (vi) éventuellement cristallisation; (vii) éventuellement séchage. Selon un mode de réalisation, la résine est une résine échangeuse d'anions, de préférence forte. Selon un mode de réalisation, l'enzyme est choisie dans le groupe consistant en 20 pectinases, de cellulases, hémicellulases et leurs mélanges. Avantageusement, cet enzyme est un enzyme qui hydrolyse la cellulose, la cellobiose et les polymères de glucose. Selon un mode de réalisation, l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane est mise en oeuvre sur une membrane ayant un seuil de coupure d'environ 10kD. 25 Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape intermédiaire d'acidification à pH compris entre 2 et 6, de préférence entre 2,5 et 3,5, entre l'étape de passage sur résine échangeuse et l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane. Selon un mode de réalisation, l'étape de traitement enzymatique a lieu après ou 30 avant l'étape de clarification. Selon un mode de réalisation, l'étape d'extraction (i) est mise en oeuvre avec une solution saline, de préférence acidifiée, éventuellement en deux ou plusieurs étapes d'extraction successives. Selon un mode de réalisation, l'étape de clarification (ii) est mise en oeuvre par 35 filtration sur adjuvant de filtration, de préférence de la silice, éventuellement précédée ou suivie d'une centrifugation, avec éventuellement un ajustement final à un pH entre 4,5 et 5. R VBrevers1,24900A24904-0602 15-DEPOTFRANCT duc - 15 février 2006 - 4'13 La thaumatine ainsi produite trouve des applications dans l'industrie alimentaire et pharmaceutique. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure unique est une représentation schématique du procédé selon l'inven- tion, dans laquelle PVPP signifie polyvinylpolypyrolidone, Jus Ext. signifie jus d'extraction, Métabi. Na+ signifie métabisulfite de sodium, UF signifie ultrafiltration, DF signifie dialiltration et Tartrate de Na+/K+ signifie tartrate de potassium et de sodium. DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION Selon l'invention, le traitement enzymatique permet d'hydrolyser les polysaccharides extraits en même temps que la thaumatine. La purification sur résine échangeuse (d'anions) est destinée à éliminer des substances colorantes et certains polysaccharides chargés et l'ultrafiltration/diafiltration a pour avantage d'éliminer dans le perméat., les ions et les petites molécules (dont les polysaccharides hydroly- sés). Ainsi, au moyen du traitement enzymatique suivi de la purification, un degré de pureté élevé peut être atteint, en réalisant une opération peu coûteuse. L'utilisation d'enzymes permet de réduire la taille des polysaccharides qui peuvent ainsi traverser la membrane d'ultrafiltration et être séparés de la thaumatine qui est retenue par la membrane. D'une manière générale on utilise un mélange enzymatique tels que ceux qui sont utilisés dans la production de sucres fermentescibles, dans la réduction de viscosité de jus de fruits ou dans la l'augmentation du rendement d'extraction de produits d'intérêt à partir de plantes; De tels enzymes sont par exemples choisis dans le groupe consistant en pectinases, de cellulases, hémicellulases et leurs mélanges. Le choix de la préparation enzymatique dépend de l'application particulière ciblée et de la nature souvent très diverse des impuretés à hydrolyser. On respectera aussi les conditions préconisées par le fournisseur de l'enzyme, en particulier en ce qui concerne le pH, la température et la concentration de l'enzyme. Pour le jus d'extraction de la thaumatine, des tests nous ont montrés que la préparation commerciale Celluclast , un enzyme qui hydrolyse la cellulose, la cellobiose et les polymères de glucose, donnait les meilleurs résultats. Le traitement enzymatique est mis en œuvre pendant une période de 1 à 4 heures, de préférence pendant 2 heures. Selon l'invention l'étape de traitement enzymatique peut avoir lieu avant ou après l'étape de clarification, c'est-à-dire que les étapes (ii) et (iii) peuvent être inver- sées. Selon l'invention, à l'issue de l'étape de traitement enzymatique, on procède à une purification en deux étapes, par (iv) passage sur résine, de préférence anionique, et par (v) ultrafiltration/diafiltration. Une étape intermédiaire entre les étapes (iv) et R\Brevets\24900'24904ù06021 DEPOTFRANC'E doc 15 fe ner 2006 - 5/13 (v) peut être prévue, cette étape intermédiaire étant l'acidification du produit qui est passé au travers des résines échangeuses. L'acidification peut être une acidification à pH compris entre 2 et 6, de préférence entre 2,5 et 3,5, avantageusement voisin de 3. De manière surprenante, l'utilisation des enzymes combinée au passage sur résines (échangeuses d'anions) et à l'ultrafiltration/diafiltration permet une purification importante de la thaumatine. Les résines échangeuses d'anions telles que celles décrites dans la présente invention sont des résines peu coûteuses utilisées dans l'industrie agro-alimentaire alors que les résines cationiques mentionnées dans les brevets antérieurs sont des résines coûteuses, utilisées principalement en pharmacie. to La purification sur résine échangeuse (d'anions) est destinée à éliminer des substances colorantes et certains polysaccharides chargés. Les résines échangeuses d'anions éliminent certains colorants qui auraient tendance à former des flocs insolubles avec les protéines s'ils étaient présents. Les résines échangeuses d'anions permettent aussi d'éliminer certains polysaccharides et certaines protéines chargées négativement. La 15 thaumatine globalement chargée positivement, n'est pas adsorbée par les résines échangeuses d'anions. Les résines échangeuses de cations peuvent être utilisées dans l'invention, mais elles ne sont pas préférées. Avantageusement les résines peuvent être choisies parmi les résines anioniques telles que la résine Purolite A600, la résine Rohm et Haas FPA40CI ou la résine Rohm et Haas IRA 402, à titre d'exemple la 20 résine Rohm et Haas FPA40CI. L'étape d'ultrafiltration/diafiltration est mise en oeuvre de façon classique, par exemple sur des modules de la société Orelis, avec un seuil de coupure approprié, par exemple 10kD. L'ultrafiltration/diafiltration a pour avantage d'éliminer dans le perméat, les ions et les petites molécules (dont les polysaccharides hydrolysés). 25 L'utilisation de l'étape d'enzymage permet d'éviter le colmatage de la membrane par effet de gel des polysaccharides. Ceux-ci sont, en effet, extraits et coupés ce qui permet leur élimination dans le perméat et permet d'obtenir ainsi une plus grande pureté et un meilleur rendement du produit. Ainsi, au moyen du traitement enzymatique suivi de la purification, un degré 30 de pureté élevé peut être atteint, en réalisant une opération peu coûteuse. L'étape d'extraction (i) extrait la substance active de la pulpe du fruit (en particulier du fruit de l'espèce thaumatococcus daniellii). Cette étape est généralement mise en oeuvre avec une solution saline, de préférence en utilisant du chlorure de sodium entre 1 et 50 g/l que l'on acidifiera entre pH 2 et 3 avec de l'acide chlor- 35 hydrique, avec éventuellement du métabisulfte de sodium. L'étape d'extraction peut être constituée de plusieurs étapes successives, par exemple 3 étapes. Les étapes d'extraction peuvent être mises en oeuvre au moyen d'une solution saline, par exemple dans une solution aqueuse de chlorure de sodium, à un pH allant de 1,8 à 6 R.ABrevets\249001,24904 -060215- DEPOTFRANC[ doc février 2006 - 6113 et de préférence à un pH de 2 à 3. La première étape d'extraction est avantageuse-ment mise en oeuvre en présence de polyvinylpolypyrolidone (PVPP), à un pH d'environ 2 de préférence à pH=2. De préférence la solution de chlorure de sodium est une solution de 0,1 à 5% et plus particulièrement une solution à 2% de NaCl et l'on opère à une température comprise entre 40 et 50 C, de préférence 42 à 48 C. A l'issue de chaque étape d'extraction les jus d'extraction sont recueillis et stockés, éventuellement après une étape de préfiltration. La préfiltration a typiquement lieu sur un tamis ayant une ouverture appropriée, par exemple 500 m. Suite à l'étape d'extraction, on procède à l'étape de clarification (ii). Cette étape de clarification peut cependant n'être qu'optionnelle, même si elle est préférée. Cette étape de clarification peut être mise en oeuvre par filtration. Cette filtration peut être effectuée par une technique de filtration à l'aide d'un adjuvant de filtration par exemple de la silice. Elle est avantageusement effectuée sur Kieselguhr à une température comprise entre 40 et 55 C, de préférence 53 C. On peut utiliser une étape de centrifugation avant ou après cette étape de filtration, ou à la place de la filtration sur silice. La clarification par centrifugation et/ou filtration sur Kieselguhr peut avantageusement être remplacée par une étape de filtration sur membrane, par exemple de la rnicrofiltration. De préférence à la fin de l'étape on procède à un ajustement du pH entre 4,5 à 5. Lorsqu'une opération de cristallisation (vi) est introduite on obtient avantageusement un grand degré de pureté. L'étape de cristallisation peut être effectuée par exemple au moyen d'un tartrate alcalin, par exemple au moyen de tartrate de potassium et de sodium et permet d'obtenir un très bon degré de purification, notamment si l'on veut d'obtenir un produit de qualité très pure, pour un usage pharmaceutique par exemple. Le séchage (vii) s'effectue avantageusement par lyophilisation ou par toute autre technique connue de l'homme de l'art qui ne dénature pas la molécule. EXEMPLES Dans un premier temps on prépare les produits de départ suivants: 50 kg de pulpe (congelée) 3 kg NaCl et 0,45 kg PVPP pour la première extraction 3 kg NaCl pour la deuxième extraction 3 kg NaCl pour la troisième extraction 2 fois 30 g de métabisulfite de sodium 101 HCI dilué à 2,3% Dans une cuve agitée de 300 1 qui est utilisée comme cuve d'extraction, introduire 140 1 d'eau chaude à environ 60 C. Agiter pour mélanger. R 'vBrevets\24900`24904-060215-DEPOTFRANCE. Aoc - 15 (écrier 2006 - 7r 13 Dans 10 1 d'eau, dissoudre les produits chimiques (NaCl + PVPP) et introduire la solution dans la cuve d'extraction. Ajouter l'acide chlorhydrique concentré (HCI 23%) en vérifiant le pH. Pour la première extraction, le pH est de 2,0 +/- 0,1 au départ. Introduire ensuite la pulpe dans la cuve d'extraction et agiter de manière à obtenir un bon brassage. Réguler la température à 42 C. Première Extraction et Préfiltration Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le passant sur un tamis de 500 pm pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction. Dissoudre 30g de métabisulfite de sodium dans 1 1 d'eau chaude environ et le verser dans la cuve de stockage. La pulpe reste dans la cuve d'extraction. Deuxième Extraction et Préfiltration Préparer la solution pour l'extraction 2: Dans 150 1 d'eau à une température de 42 C environ, ajouter le sel. Ajuster le pH à 2,5. Introduire la solution dans la cuve 15 d'extraction. Agiter. Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le passant sur un tamis de 500 m pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction. Dissoudre 30g de métabisulfite de sodium dans 1 1 d'eau chaude environ et le verser dans la cuve de stockage. La pulpe reste dans la cuve d'extraction. 20 Troisième extraction et Préfiltration Préparer la solution pour l'extraction 2: Dans 150 1 d'eau à une température de 42 C environ, ajouter le sel. Ajuster le pH à 2,5. Introduire la solution dans la cuve d'extraction. Agiter. Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le 25 passant sur un tamis de 500 gm pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction et le verser dans la cuve de stockage_ La pulpe reste dans la cuve d'extraction. Filtration sur Kieselguhr Les trois jus d'extraction et de préfiltration sont filtrés sur Kieselguhr. 30 L'appareil de filtration est un filtre à plateaux horizontaux d'une surface de 1,5 m2 de marque Della Toffola (modèle ECP). Un gâteau de filtration est formé sur les plateaux avec environ 4 kg de Kieselguhr. Le mélange de jus d'extraction est passé dans le filtre, en ajoutant graduellement 4kg supplémentaires de Kieselguhr. Enzymage 35 La solution d'enzymage utilisée est 200 ml de Celluclast 1.5 L FG de la société Novozymes. R.ABrevetsV24900A24904-060215-DFPOTFRANCF doc . 15 février 2006- 8/13 Chauffer le mélange des jus clarifiés entre 54 et 56 C, de préférence à 53 C. Ajuster le pH avec NaOH 1N jusqu'à 4,5, puis ajouter l'enzyme. Agiter pendant 1 heure au minimum, de préférence 2 heures tout en maintenant la température. Résines Anioniques La résine anionique utilisée est la résine Rohm et Haas FPA40CI. A la fin de l'enzymage, faire passer le jus sur 2 colonnes de résine en série de 30 1 chacune (ou une colonne unique de 60 1) à une vitesse comprise de préférence entre 100 et 600 1/h. On soutire ainsi un jus échangé. Acidification L'acidification du jus échangé à pH 3 dans le bac d'acidification se fait à l'aide d'une solution d'HCI diluée (HCI à 2,3%). Ultrafiltration/diafiltration On utilise un pilote MF/UF de filtration tangentielle de la société Orelis, munie d'un module membranaire en spirale modèle Persep 10kd de 5m2 de surface : Les pressions opératoires sont de 1,8 bar en entrée et 1 bar en sortie environ. La température est régulée à 40 C. Le perméat qui contient les impuretés qui sont passées au travers de la membrane est éliminé. On remplace le volume de perméat par un égal volume de solution de diafiltration qui consiste en de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique. Le volume de solution de diafiltration est égal à quatre fois le volume initial de jus. Puis le jus ainsi récupéré est concentré jusqu'à obtenir un volume d'environ 25 1. Cristallisation Verser le tartrate de potassium et de sodium dans la solution de thaumatine en agitant et en maintenant la température à 40 C pendant environ une heure environ. La vitesse d'agitation est augmentée à une valeur correspondant à une vitesse en bout de pales de 1,3 m/s environ. La cristallisation commence lorsque la solution commence à se troubler. Refroidir la solution sous agitation à 10 C à raison de 4 C/heure. Lorsque la température de 4 C est atteinte, laisser la solution sous agitation à cette température, pendant une durée d'au moins 6 heures puis arrêter l'agitation. Pour récupérer les cristaux, laisser sédimenter la suspension puis éliminer le liquide surnageant ou passer la suspension de cristaux sur un filtre sécheur ou sur une essoreuse. Les cristaux sont lavés trois fois à l'aide d'eau déminéralisée froide (4 C) pour éliminer les sels de tartrate. Pour une plus grande élimination des sels de tartrate, il est possible de redissoudre les cristaux dans de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique (environ 25 1) puis d'effectuer une diafiltration avec de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique (environ 50 1). La solution ainsi diafiltrée R.ABrevets\24900A24904-0602 1 5-DEPOTFRANCF doc-5 février 2006 - 9/13 pourra aussi être passée sur une cartouche de membrane filtrante (taille de pore 0,2 m) pour assurer une bonne qualité bactériologique du produit. Séchage Le séchage peut-être effectué par des techniques connues de séchage de bio- molécules, comme la lyophilisation ou la zéodratation ou le séchage des cristaux sur un filtre sécheur. Le produit est une poudre blanche ou de couleur légèrement crème. Résultats d'Analyse Le procédé selon l'invention permet l'obtention de thaumatine en des quantités considérables par rapport aux procédés de l'état de la technique. Différentes tailles de lots de pulpe ont été traités par le présent procédé, de 25 à 300 kg mais il est possible de traiter des lots beaucoup plus gros par ce procédé. Les rendements de récupération de la thaumatine purifiée varient entre 51 et 84 % selon les lots et est en moyenne de 70 à 75% par rapport à la thaumatine présente dans la pulpe au départ. En outre la pureté de la thaumatine obtenue par ce procédé est nettement plus grande. Un exemple détaillé d'analyse d'un lot typique de thaumatine cristallisée et séchée est donné ci-dessous. Dans le même tableau ont été reportés les résultats d'analyse d'un lot selon l'état de la technique illustrée par le brevet antérieur US4011206. Analyse Présente invention Comparatif Azote total (Kjeldahl) 16,1% 14-15% Matière sèche 98,8% 91-92% Aluminium 17 mg/kg 300 mg/kg Plomb 0,27 mg/kg ND* Arsenic On constate qu'il y a moins d'impuretés dans la thaumatine produite par le procédé faisant l'objet de la présente de demande de brevet, que dans le brevet antérieur. R Brevets.24900y24904-060215- DEPOTFRANCE doc (écrier 2006 - 10/13 REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de la thaumatine comprenant la combinaison d'une étape de traitement enzymatique et d'une étape de ultrafiltration/diafiltration 5 sur membrane. 2. Procédé selon la revendication 1 comprenant en outre une étape de passage sur résine échangeuse après l'étape de traitement enzymatique et avant l'étape de ultrafiltration/diafiltration sur membrane. 10 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, d'extraction et de purification de la thaumatine qui comporte les étapes suivantes : étape d'extraction; (ii) éventuellement étape de clarification; 15 (iii) traitement enzymatique; (iv) passage sur résine échangeuse; (v) ultrafiltration/diafiltration sur membrane; (vi) éventuellement cristallisation; (vii) éventuellement séchage. 20 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la résine est une résine échangeuse d'anions, de préférence forte. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'enzyme est 25 choisie dans le groupe consistant en pectinases, de cellulases, hémicellulases et leurs mélanges. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'enzyme est un enzyme qui hydrolyse la cellulose, la cellobiose et les polymères de glucose. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane est mise en œuvre sur une membrane ayant un seuil de coupure d'environ 10kD. 35 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, comprenant une étape intermédiaire d'acidification à pH compris entre 2 et 6, de préférence entre 2,5 et 3,5, entre l'étape de passage sur résine échangeuse et l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane. R vBrevets\24900A24904--06021 -DEPOTFRANCE doc - 15 février 2006 - 11/13 30 10 15 9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, dans lequel l'étape de traitement enzymatique a lieu après l'étape de clarification. 10. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, dans lequel l'étape de traitement enzymatique a lieu avant l'étape de clarification. 11. Procédé selon l'une des revendications 3 à 10, dans lequel l'étape d'extraction (i) est mise en oeuvre avec une solution saline, de préférence acidifiée, éventuellement en deux ou plusieurs étapes d'extraction successives. 12. Procédé selon l'une des revendications 3 à 11, dans lequel l'étape de clarification (ii) est mise en oeuvre par filtration sur adjuvant de filtration, de préférence de la silice, éventuellement précédée ou suivie d'une centrifugation, avec éventuellement un ajustement final à un pH entre 4,5 et 5. 13. Utilisation de la thaumatine obtenue par le procédé selon l'une des revendications I. à 12 dans l'industrie alimentaire ou pharmaceutique. k \Brevets\24900`24904--06021 5-DEPOTFRANCE doc - 15 février 2006 - 12/13