Brevet FR2894146A1 — publié le 20070608

Utilisation d'un polysaccharide excrété par l'espèce Vibrio diabolicus à des fins d'ingénierie des tissus conjonctifs non minéralisés. La présente invention se rapporte à l'ingénierie des tissus conjonctifs non minéralisés, notamment les tissus de recouvrement (la peau, la gencive le cartilage, les tendons). Des bactéries productrices d'exopolysaccharide (EPS) ont été isolées parmi des microorganismes provenant des écosystèmes hydrothermaux profonds. HE800 est un EPS produit par la souche Vibrio diabolicus. Sa masse molaire moyenne en poids est d'environ 800 000 g/mol à l'état natif. Il est caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire originale constituée par 4 résidus osidiques : [(-3)-D GlcNac (3 (1-4) D G1cA (3 (1-4) D G1cA R (1-4) D GalNac a HE800 a été décrit dans la demande internationale au nom de IFREMER publiée sous le numéro W09838327 ainsi que dans les articles suivants : Raguénès et al, Int J Syst Bact, 1997, 47, 989-995 et Rougeaux et al, Carbohyd. Res, 1999, 322, 40-45. De nombreuses applications pour cet exopolysaccharide ont été décrites. A titre d'exemple d'application, on peut citer la demande internationale W00202051, qui décrit les propriétés bénéfiques de HE800 en cicatrisation osseuse. Aucune application de HE800 n'est à ce jour connue en ce qui concerne l'ingénierie des tissus conjonctifs non minéralisés. Le tissu conjonctif se caractérise par la présence entre ses cellules d'une très abcndante matrice extracellulaire. La matrice extracellulaire constitue l'armature du tissu conjonctif non minéralisé. Elle confère aux tissus conjonctifs non minéralisés leur forme, leur résistance mécanique, leur souplesse et assure des fonctions physiologiques importantes. L'organisation de la trame collagénique est un élément essentiel de la structuration tissulaire. En effet, les collagènes et notamment les collagènes fibrillaires constituent la classe protéique majoritaire des matrices extracellulaires et en particulier celles du derme de la gencive et du cartilage. La matrice extracellulaire est également nécessaire au maintien de l'état différencié des cellules qui la synthétisent et la remodèlent, en particulier les cellules mésenchymateuses (fibroblastes, myofibroblastes, chondroncytes, péricytes...) qui sont les cellules reines des tissus conjonctifs non minéralisés. On distingue notamment les myofibroblastes qui prolifèrent lors de la cicatrisation mais persistent lors de processus inflammatoires chroniques aboutissant à l'installation de fibroses. Le but principal de l'ingénierie tissulaire est la reconstruction tant des tissus que des organes humains. Plusieurs voies sont développées. Une première voie consiste à implanter une structure de guidage au sein d'un tissu endommagé. La structure de guidage sert de moule au tissu à reconstruire. La structure peut être éventuellement enrichie avec des molécules stimulant la croissance cellulaire. A titre d'exemple de cette approche d'ingénierie tissulaire on peut citer EP1555035, qui décrit un implant bioabsorbable constitué d'une matrice mixte collagene-glycosaminoglycanne pontée. Cette matrice constitue une structure de guidage qui a pour objet de baliser le potentiel régénératif du tissu. Une deuxième voie d'ingénierie tissulaire consiste à reconstruire ex vivo des substituts de tissus à partir de cellules vivantes pour des usages in vivo ou ex vivo. L'objectif est de reproduire l'architecture tissulaire. La méthode basée sur la production d'un gel de collagène a été la première à démontrer les vastes possibilités du génie tissulaire. Les premiers travaux de reconstruction tissulaire réalisés ont mis en évidence que l'incorporation de fibroblastes dans un gel de collagène permettait de produire des équivalents de derme pouvant être ensuite épidermisés par ensemencement de kératinocytes à leur surface. Le résultat final, une peau reconstruite vivante, peut atteindre un excellent niveau de différenciation dans des conditions de culture adéquates et de nombreux aspects de la différenciation terminale des kératinocytes peuvent ainsi être reproduits. Cette méthode de reconstruction tissulaire s'est avérée applicable pour l'élaboration de nombreux autres organes à des visées cliniques (transplantation) ou fondamentales (modélisation tissulaire in vitro). Cependant, il n'est pas certain que cette méthode permette d'obtenir des tissus ayant la résistance mécanique indispensable à leur application clinique. Cet aspect mécanique est l'une des raisons qui ont poussé au développement d'une seconde méthode, basée sur l'utilisation de biomatériaux colonisables par les cellules et leur culture in vitro. Ainsi, les cellules une fois incorporées dans ces supports sécrètent des quantités variées de matrice extracellulaire conduisant à la reconstruction d'une structure tissulaire proche du tissu d'origine, mais comprenant également la trame biodégradable du biomatériau. A titre d'exemple de procédé d'ingénierie tissulaire on peut citer WO03041568 qui décrit une matrice tridimensionnelle comprenant une matrice de fibrine et des fibroblastes. Cette matrice permet de générer des équivalents de tissus qui peuvent être greffés. Un des objets de la présente invention est une matrice aux propriétés mécaniques améliorées qui favorise la prolifération des fibroblastes. Les inventeurs ont mis en évidence, de façon surprenante et inattendue, qu'un polysaccharide de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant les 4 résidus osidiques suivants . [(-3)-D GlcNac (3 (1-4) D G1cA (3 (1-4) D GIcA (3 (1-4) D GalNac a (1-)l présente les propriétés suivantes : il induit une sélection des souches fibroblastiques, il stimule la mobilisation et la prolifération des fibroblastes dans la matrice extracellulaire, il accélère la fibrillation collagénique et favorise ainsi la reconstitution de la matrice extracellulaire. Ce polysaccharide permet la restructuration de la trame collagénique des tissus conjonctifs non minéralisés, et il constitue un support permettant l'adhésion et la prolifération cellulaire des fibroblastes. Ainsi, de par ses propriétés, le polysaccharide permet la fabrication de matrice de collagène fibrillaire aux propriétés améliorées. La trame collagénique des matrices de collagènes fibrillaires comprenant le polysaccharide présente une meilleure résistance devant des facteurs physiques tels que la température et les contraintes mécaniques. Enfin, il favorise la culture des cellules mésenchymateuses en particulier la culture des fibroblastes et permet la réalisation de substitut de tissus. L'invention a pour objet l'utilisation d'un polysaccharide ou un sel de ce polysaccharide de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, préférentiellement comprise entre 700 000 et 900 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant les 4 résidus osidiques suivants : ](-3)-D GlcNac 13 (1-4) D G1cA 13 (1-4) D G1cA 13 (1-4) D GalNac a (1-)] à des fins d'ingénierie des tissus conjonctifs non minéralisés. La présente invention a pour objet une matrice de collagène comprenant un polysaccharide ou un sel de ce polysaccharide de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, préférentiellement comprise entre 700 000 et 900 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant __es 4 résidus osidiques suivants . [(-3)-D GlcNac R (1-4) D G1cA (3 (1-4) D G1cA (3 (1-4) D GalNac a (1-)] Typiquement le polysaccharide peut se présenter sous 15 la forme d'un sel. Typiquement le polysaccharide est un polysaccharide excrété par l'espèce Vibrio diabo.licus de taille comprise entre 500 000 et 2 000 000 daltons. Des modes de préparation ont été décrits dans les 20 documents suivants : WO 98/38327, Raguénès et al, Int J Syst Bact, 1997, 47, 989- 995 et Rougeaux et al, Carbohyd. Res, 1999, 322, 40-45. Typiquement le collagène de la matrice est un 25 collagène choisi dans le groupe constitué des collagènes fibrillaires tels que les collagènes de type I, II, III, V et XI ou d'un mélange de ceux-ci. Préférentiellement le collagène est un collagène de type I. 30 Typiquement pour fabriquer une telle matrice de collagène, l'homme du métier utilisera les techniques couramment utilisées pour la fabrication des matrices de collagènes à partir de collagènes fibrillaires acido-solubles. En présence du polysaccharide selon l'invention, les collagènes fibrillaires acido-solubles se fibrillent naturellement après neutralisation du pH. Alternativement la matrice de collagène selon l'invention pourra être obtenue par pontage du polysaccharide selon l'invention avec le collagène. Pour réaliser le pontage l'homme du métier utilisera les techniques couramment utilisées pour le pontage de polysaccharides avec le collagène. EP1374857 est une illustration d'une technique de pontage utilisable. La présente invention a également pour objet une matrice comprenant le polysaccharide tel que décrit précédemment caractérisée en ce que le polysaccharide a été rendu insoluble par réticulation à l'aide d'un ou plusieurs agents réticulants. Typiquement pour réticuler afin de rendre insoluble le polysaccharide selon l'invention, l'homme du métier utilisera les techniques couramment utilisées pour la réticulation des polysaccharides. A titre d'exemples d'agents réticulants, on peut citer le trimétaphosphate de sodium, l'épichlorhydrine, la divinylsulfone, le glutaraldéhyde et les bisépoxyranes comme par exemple l'éther de 1,4-butanediol-bis(époxypropyle) et l'éther de 1,4butanediol-diglycidyle. De manière avantageuse, les matrices selon l'invention pourront comprendre en outre un facteur de croissance qui favorise la colonisation de la matrice par les cellules mésenchymateuses, en particulier par les fibroblastes. Préférentiellement le facteur de croissance pourra être choisi dans le groupe consistant en TGF-beta, PDGF, FGFs, BMPs (bone morphogenetic proteins), VEGF, CTGF (connective tissue growth factor). Typiquement les matrices selon l'invention pourront servir de dispositif médical, résorbable ou non, ou d'implant ou pourront être intégrées dans un dispositif médical ou dans un implant. De telles matrices permettront le remplacement mécanique et fonctionnel de structures endommagées avec un minimum de réactions indésirables. Ces matrices une fois déposées sur le tissu ou implantée dans un tissu endommagé serviront de structure de guidage et balisera le potentiel régénératif du tissu. La présence du polysaccharide au sein de la matrice accélère la régénération en accélérant la restructuration des tissus conjonctifs. Il permet d'aboutir à une régénération complète de sorte que l'apparition de situations patholcgiques de type fibrotique ou inflammatoire est évitée. La présence du polysaccharide au sein de la matrice favorise également la pénétration de façon ordonnée après la greffe de la matrice des cellules mésenchymateuses des tissus conjonctifs non minéralisés tels que les fibroblastes, tout en incitant ces mêmes cellules à produire leur propre matrice extracellulaire. A titre d'exemple, le dispositif médical peut être un pansement. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention les matrices selon l'invention pourrcnt comprendre en outre des cellules mésenchymateuses émanant de tout tissu conjonctif non minéralisé de façon à constituer un substitut de tissu conjonctif, notamment un substitut de derme, de cartilage ou de tendon. Ce substitut pourra être implanté in vivo. La matrice pourra comprendre des cellules mésenchymateuses issues de la moelle ou du sang circulant, des fibroblastes ou des cellules chondrocytaires. De manière avantageuse, les cellules mésenchymateuses qui coloniseront la matrice, seront des fibroblastes dermiques de façon à constituer un substitut de derme. La matrice pourra également comprendre des kératinocytes de façon à constituer un substitut de peau. De manière avantageuse, les cellules mésenchymateuses, qui coloniseront la matrice, seront des chondrocytes de façon à constituer un substitut de cartilage. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un support de culture cellulaire caractérisé en ce que la surface du support sur laquelle les cellules sont cultivées comprend le polysaccharide selon l'invention. Typiquement le polysaccharide est sous forme d'un film, d'une membrane ou d'une structure alvéolée tridimensionnelle ou d'un hydrogel. Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de culture de cellules mésenchymateuses, en particulier de fibroblastes, notamment de fibroblastes dermiques, caractérisé en ce que les dits fibroblastes sont cultivés sur une matrice selon l'invention ou sur un support tel que décrit précédemment. Le contenu de tous les documents cités doit être considéré comme faisant partie de la présente 15 description. La présente invention sera mieux illustrée ci-après à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet 20 de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemples 25 Description des figures : Figure 1 : Graphique montrant l'effet d'un film d'HE800 au cours du temps sur la prolifération de fibroblastes gingivaux Figure 2a : Photographie montrant des cultures de 30 fibroblastes gingivaux sur film d'HE800 après immunodétection de l'a-actine Figure 2b : Photographie de cultures de fibroblastes gingivaux sur plastique après immuno-détection de 1'a-actine Figure 3a : Photographie en lumière transmise de films de collagènes après coloration au rouge sirius Figure 3b : Photographie en lumière transmise de films composites constitués de collagènes et d'HE800 après coloration au rouge sirius Figure 4 : Graphique montrant la rétraction des 10 lattis en présence de différentes concentrations d' HE800 Figures 5a,b,c,d : Photographies en lumière polarisée de coupes de tissus conjonctifs équivalents après coloration au rouge sirius 15 Figure 5a :la photographie est prise après 11 jours de culture, lattis témoin constitué de collagène Figure 5b :la photographie est prise après 11 jours de culture, lattis composite constitué de collagène et d'HE800 20 Figure 5c : photographie prise après 40 jours de culture, lattis témoin constitué de collagène Figure 5d : photographie prise après 40 jours de culture, lattis composite constitué de collagène et d' HE800 25 Figures 6a,b,c,d : Photographies en microscopie électronique de lattis après 11 jours de culture Figure 6a : Lattis témoin, grandissement xlO 000 Figure 6b : Lattis composite, la masse d'HE800 représente 5% de la masse du collagène, grandissement 30 xlO 000 Figure 6c : Lattis composite, la masse d'HE80O représente 5% de la masse du collagène, grandissement x20 000 Figure 6d : Lattis composite, la masse d'HE800 5 représente 10% de la masse du collagène, grandissement x20 000 1 Matériels et Méthodes. 10 1.1-Préparation de l'exopolysaccharide 8E800 à partir de cultures de Vibrio Diabolicus (la souche HE800). Des modes de préparation d'HE800 ont été décrits dans les documents suivants : WO 98/38327, Raguénès et al, Int J Syst Bact, 1997, 47, 989-995 et Rougeaux et a1, 15 Carbohyd. Res, 1999, 322, 40-45. a) Cultures de Vibrio diabolicus La souche HE800 est cultivée sur milieu 2216E [OPPENHEIMER, J. Mar. Res. 11, 10-18 (1952)] enrichi avec du glucose (30 g/1). La production est effectuée 20 à 30 C et à pH 7,4 en fermenteur de 2 litres contenant 1 litre du milieu 2216E-glucosé. Après 48 heures de culture, le moût présente une faible viscosité (de l'ordre de 40 centipoises à 60 rpm). 25 b) Purification de l'exopolysaccharide Les bactéries sont séparées du moût par une centrifugation à 20 000 g pendant 2 heures, puis le polysaccharide est précipité à partir du surnageant à l'aide d'éthanol pur, puis on effectue plusieurs 30 lavages éthanol/eau en proportions croissantes d'éthanol, selon le procédé décrit par TALMONT et al. [Food Hydrocolloids 5, 171-172 (1991)] ou VINCENT et al. [Appl. Environ. Microbiol., 60, 4134-4141 (1994)]. Le polysaccharide obtenu est séché à 30 C et conservé à température ambiante. 2,5 g de polysaccharide purifié par litre de culture ont ainsi été obtenus. 1.2-Obtention des fibroblastes Les expériences ont été réalisées sur des fibroblastes d'origine dermique et des fibroblastes d'origine gingivale. Ces deux types de cellules mésenchymateuses adoptent vis-à-vis du HE800 un comportement très similaire, par conséquent les résultats obtenus avec les fibroblastes gingivaux sont extrapolables aux fibroblastes dermiques. 1.2.1) Milieux de culture : Les cultures sont effectuées dans un milieu, dit complet, composé, de Dubelco MEM Glutamax I contenant de 100 U/ml de pénicilline 100 log/ml de streptomycine et 2pg/ml de fungizone (Gibco BRL Cergy Pontoise France) supplémenté ou non (milieu carencé) en sérum de veau foetal (SVF). 1.2.2) Origine des prélèvements tissulaires : Les biopsies dermiques utilisées sont mises en culture dans les 3 heures qui suivent leur prélèvement par le praticien. Les prélèvements utilisés sont obtenus après circoncision, à partir de prépuces d'enfants cliniquement sains. Les biopsies gingivales sont prélevées sur des patients jeunes (moins de 30 ans) exempt de pathologies. Ces biopsies sont situées au niveau de la gencive attachée de prémolaires extraites pour raisons orthodontiques. Ces gencives sont de plus, déclarées cliniquement saines par le praticien. Ces biopsies sont des bribes tissulaires détachées au cours de l'extraction et qui n'ont demandé aucune modification de l'acte opératoire. 1.2.3) Mise en culture : Les prélèvements dermiques et gingivaux sont rincés deux fois dans un milieu DMEM contenant une concentration d'antibiotique supérieure à la normale (pénicilline 6x, streptomycine 4x, fungizone2x) puis ils sont découpés en très petits explants(2mm2). Ces expiants sont déposés à la pipette Pasteur stérile ou avec la pointe du scalpel, dans un flacon de culture de 25 cm2, coté parenchyme sur le plastique. La boîte est relevée et laissée 15 minutes dans cette position pour que les expiants, à sec, adhèrent au plastique. Les expiants ayant adhéré sont recouverts de quelques gouttes de DMEM supplémenté à 20 % en sérum de veau foetal (SVF). La boîte de culture est alors placée pendant une nuit dans un incubateur à 37 C, sous une atmosphère composée de 5 % de CO2 et de 95 % d'air. Le lendemain le surnageant est remplacé par du milieu frais comprenant 20% de SVF, il est renouvelé par la suite toutes les semaines. Après trois semaines les fibroblastes ont colonisé tout le fond de la boîte (les kératinocytes présents dans l'expiant n'adhèrent pas dans ces conditions de culture), on procède alors au repiquage. Les expiants sont retirés à l'aide d'une pince, les cellules sont rincées deux fois au PBS, puis trypsinisées (Trypsine EDTA Gibco). La trypsinisation est alors stoppée par l'ajout de DMEM comprenant 10% de SVF. Les cellules sont comptées au compteur (Coulter) puis réensemencées dans plusieurs boîtes de culture. Elles sont, à ce moment, considérées en premier passage et sont entretenues dans un milieu complet contenant 10 % de SVF. Lorsque les cellules sont à nouveau confluentes un autre passage est effectué suivant la même procédure, et ce jusqu'au début des expérimentations. 1.3-Préparation des films et culture des fibroblastes 1.3.1) Préparation des films d'HE800 et culture des 15 fibroblastes Un surfactage est effectué par le dépôt de 200pl d'une solution à 2mg/ml d'HE800 au fond des puits de culture (boîte 24 puits, 2cm2). La boîte de culture est déposée sous hotte de culture sur une platine 20 chauffante réglée à 37 C, pendant au moins 5 heures. Après évaporation, un film d'HE800 se constitue au fond de la boîte. Les fibroblastes gingivaux sont ensemencés à raison de 10000 cellules par puits et cultivés pendant 7 jours. Une numération des cellules 25 est effectuée chaque jour, certains puits sont fixés pour l'étude morphologique et l'immuno-détection de 1' a-actine des muscles lisses. 1.3.2) Préparation de films de collagène et de films composite collagène-HE800 et culture des fibroblastes : Le collagène utilisé est un collagène de type I acido-soluble (2mg/ml) obtenu à partir de queue de rat (Institut Jacques Boy, Reims). Le surfactage des boîtes de culture s'effectue par le dépôt de 200pl d'un mélange de collagène (40pg total) et d'HE800 (5, 50, ou 200pg total). La boîte de culture (boîte 24 puits, ou labtek, 2cm2 par puits) est déposée sous hotte de culture sur une platine chauffante réglée à 37 C, pendant au moins 5 heures. Après évaporation, un film de collagène avec ou sans HE800 se constitue au fond de la boîte. Des fibroblastes sont ensemencés sur ces films afin de s'assurer de la biocompatibilité de la nouvelle surface de culture. 1.3.3) Caractérisation de la structure des films : Les films de collagène et les films composites sont fixés à l'éthanol absolu -20 C puis réhydratés pour être colorés au rouge sirius ((coloration de Junquera, spécifique des collagènes). Ainsi, en rouge Sirius, sous lumière transmise tous les collagènes sont colorés, mais seuls les collagènes correctement fibrillés sont capables de dévier la lumière polarisée. 1.4-Culture en Lattis (matrice de collagène) . préparation de tissu conjonctif non minéralisé équivalent. Les lattis sont constitués avec le même collagène I que celui utilisé pour former les films collagéniques. Après neutralisation de la solution acide de collagène (3mg/lattis), le gel contenant les cellules et qui est en cours de polymérisation est versé dans une boîte de pétri de 5cm de diamètre. HE800 est ajouté au collagène avant: l'addition des cellules à raison de 150pg, 300pg ou 600}ig par lattis (respectivement 5%, 10%, et 20% de la quantité totale de collagène) 1.4.1) Préparation de la solution stock : Composants Quantité DMEM (poudre) 5g NaHCO3 1,1g AA non essentiels 5 ml (100x) H20 biA (stérile) 17 ml Filtrer H2O biA (stérile) 1250 ml Pour 50 ml de solution stock ajouter 10ml de Sérum de Veau Foetal 1.4.2) Préparation des lattis : Toutes les étapes de préparation du lattis se font dans la glace. solution stock 2,75 ml (SVF) Collagène (2mg/ml) 1,5 ml NaOH (0,1N) 0,25 ml cellules 0,5 ml (300000/ml) - Remuer puis verser dans la boîte de Pétri puis laisser pendant 5 min à 37 C le lattis. - Après 1h les boîtes sont légèrement remuées afin de décoller les lattis des rebords. -Les milieux de culture sont changés chaque semaine. 1.4.3) Caractérisation des lattis (des matrices de collagène) . A différents temps de culture (11 et 40 jours) les lattis sont récupérés fixés dans du paraformaldéhyde puis préparés en vue de l'inclusion en paraffine. Des coupes de 7pm d'épaisseur sont alors effectuées au microtome. Les colorations spécifiques de ces coupes permettent d'observer et d'étudier la structure, la cellularité des tissus conjonctifs reconstruits. Certains des paramètres mis en évidence peuvent par la suite être étudiés par analyse d'images et ainsi être quantifiés. La qualité de la fibrillation collagénique est observée après coloration au rouge Sirius, la cellularité des tissus conjonctifs équivalents a pu être estimée par analyse d'images après coloration des coupes à l'hémalun-éosine. 1.4.4) Détermination du nombre de fibroblastes contenus dans les lattis : La coloration par l'hémalun-éosine permet de distinguer les cellules de la matrice qui les environne. En effet l'hémalun colore les noyaux des cellules en bleu noir, tandis que l'éosine colore en rouge plus ou moins intense les cytoplasmes et les structures extracellulaires (éosinophile). Le contraste ainsi créé permet de distinguer chaque cellule sous un microscope équipé d'une caméra CDD reliée à un analyseur d'images semi-automatique. Les cellules se trouvant dans les champs définis par le grandissement microscopique sont alors comptées dans les lattis à 11 et 40 jours. Une dizaine de champs par coupe a été analysée. Deux groupes de cellules peuvent ainsi être différenciés selon leur situation géographique : les cellules se trouvant à l'intérieur du lattis (matrice de collagène) d'une part et les cellules se trouvant à la périphérie du lattis d'autre part. Pour calculer la cellularité des tissus conjonctifs équivalents chaque lattis est considéré cylindrique, la périphérie du lattis se définissant comme une couronne de 10pm d'épaisseur (équivalente au diamètre de deux assises cellulaires) représentant 2% du volume total du lattis. 1.5-Immuno-détection indirecte de l'a-actine des muscles lisses. Les cellules fixées sont re-perméabilisées dans l'éthanol à 70% (20min), puis réhydratées dans du PBS (10 min). Les peroxydases endogènes sont bloquées avec une solution méthanol (30%), H2O2 (0,3%). Cette opération est suivie d'un rinçage au PBS (2min) puis d'un blocage des sites antigéniques non spécifiques par une solution PBS/lait écrémé 1% (1h). Les cultures sont alors incubées avec un anticorps primaire (IgG de souris) dirigé centre l'a-actine humaine (1/30; 50min) puis rincées au PBS (3 x 10 min). Les cellules sont alors incubées, dans le noir pendant 60 min avec un anticorps anti-IgG de souris biotinylé (1/200), rincées au PBS (3 x 10 min) puis incubées avec de la streptavidine couplée à la peroxydase(1/200). Après rinçage (PBS 3x 10 min), la révélation de l'activité peroxydasique avec la 3-3' diaminobenzidine s'effectue dans un tampon Tris/HC1 (100mM, pH 7,2-7,4) contenant 0,1% de H2O2 (15 min, à l'obscurité). L'activité peroxydasique fait apparaître un matériel fibrillaire brun (correspondant aux microfilaments d'a-actine) dans le cytoplasme des cellules positives. Les produits utilisés proviennent de la firme DAKO. Les expériences contrôles concernant l'immunodétection de l'a-actine des muscles lisses ont été réalisées en omettant l'anticorps primaire et/ou en utilisant un anticorps secondaire d'une autre espèce animale que celle ayant permis l'obtention de l'anticorps primaire. 2-Résultats et Discussion. 2.1-Prolifération des fibroblastes gingivaux cultivés sur film de HE800. Les surfaces de culture ont été traitées par le HE800, afin de former un film polysaccharidique au fond des boîtes. On observe, lors premiers jours de culture (Jours 2 et 4) que le nombre de cellules ensemencées dans les boîtes enduites par le HE800 est largement inférieur au nombre de celles des boîtes témoins (Tableau I). Au dernier jour de l'expérimentation, par contre on remarque une inversion de ces résultats (Tableaux I et II). Les courbes présentées figure 1 montrent que les cellules cultivées sur film d'HE800 observent un temps de latence avant l'entrée en phase exponentielle de croissance, plus long que celui exprimé par les cellules cultivées sur plastique. D'autre part, alors que le nombre de cellules des cultures témoins atteint un plateau les jours les plus tardifs de l'expérience (cf. Figure 1 et Tableau III), les cultures sur film HE800 continuent à proliférer. Les observations effectuées lors de la culture ou après fixation des cellules permettent d'avancer des hypothèses quant aux comportements cellulaires exprimés dans les différentes conditions de culture : Les cultures sur film d'HE800 se caractérisent lors des premiers jours de cultures par la présence de nombreuses cellules qui n'adhérent pas au support. Cette non-adhésion peut expliquer le retard à la prolifération observée lors des comptagescellulaires dans ces cultures. Les cellules témoins sont réparties de manière uniforme dans la boîte, sans orientation particulière, alors que les cellules ensemencées sur film HE800 s'organisent en cordons au centre de la boîte (Figure 2a). Ces résultats montrent l'incidence d'HE800 sur l'adhésion cellulaire. En effet les regroupements cellulaires qui sont observés habituellement, dans les cultures gingivales, n'ont pas d'orientation spécifique. Après les 2 premiers jours de culture ces cordons cellulaires commencent à former une structure centrale circulaire, allant en se densifiant exclusivement vers le centre (prolifération centripète). On peut aussi observer de nombreuses cellules à la périphérie de la boîte mais sans orientation particulière. Certaines cellules peuvent être présentes dans les zones séparant les regroupements cellulaires, elles sont isolées et semblent beaucoup plus étirées en longueur que les autres cellules des boîtes HE800 ou même témoin. Le marquage immuno-cytochimique concernant l'a-actine des muscles lisses montre : -Dans les témoins, de nombreuses cellules positives côtoient des cellules n'exprimant pas ces microfilaments (Figure 2b). -Dans les cultures en présence d'HE800, les cellules présentes dans les formations circulaires centrales n'expriment pas l'a-actine des muscles lisses par contre, des cellules exprimant cette isoforme de l'actine peuvent être trouvées en périphérie de la boîte. Ces résultats sont le reflet d'une sélection des souches fibroblastiques, en effet certaines cellules peuvent ne pas exprimer naturellemen_: les récepteurs membranaires nécessaires à leur adhésion sur le film d'HE800. Parmi les sous-populations fibroblastiques non adhérentes, on retrouve celles qui expriment l'a- actine des muscles lisses c'est-à-dire les myofibroblastes. Dans les expériences contrôles (omission de l'anticorps primaire ou utilisation d'un anticorps secondaire inapproprié) aucune positivité n'A été observée. Tableau I : Variation du nombre de cellules par puits au cours de la culture 5 Jour Jour jour 2 4 7 Témoin 14812 45610 52980 HE800 10035 36995 64247 Tableau II: Pourcentages de prolifération Tableau III : Temps de doublement (heures) Jour Jour Jour 2 4 7 Témoin 100 100 100 HE800 67, 75 81,11 127,27 Td Td Td 0-2 2-4 4-7 Témoin 84,68 29.58 333.2 HE800 9522,64 25.50 90 10 2.2-Structuration du collagène de type I en présence d'HE800. 2.2.1) Premières constatations Afin de réaliser les films comprenant à la fois du 15 collagène et de l'exopolysaccharide HE800, des solutions d'HE800 et de collagène I sont préalablement mélangées avant dépôt sur les boîtes de culture. De manière surprenante, il a été constaté que l'addition de l'exopolysacharide bactérien à la 20 solution collagénique provoque l'apparition d'un agglomérat dense de couleur blanche. Cet agglomérat a pu être étalé sur une lame histologique puis colorée au rouge Sirius, colorant spécifique des collagènes. Ces lames histologiques montrent qu'effectivement le 25 matériel étalé sur la lame est coloré par le rouge Sirius. De plus l'observation d'un matériel déviant dans différentes directions la lumière polarisée montre bien la présence de collagène sous sa forme fibrillaire. 30 2.2.2) Organisation de films composites collagène/HE800: Les différents films déposés sont composés de : - (1) collagène (40pg) - (2) collagène (40pg) + HE800 (50pg) - (3) collagène (40pg) + HE800 (200pg) L'observation au microscope du fond des boîtes montre pour les films (3) l'apparition d'un réseau dense composé de longs filaments. Les films (2) comportent quelques fibres beaucoup plus courtes, tandis que les films (1) n'en comportent pratiquement pas (cf. Figure 3a). Les 3 films se colorent au rouge Sirius, mais seul le film (3) montre un réseau fibrillaire déviant la lumière polarisée (cf. Figure 3b). Ces résultats indiquent que HE800 promeut la formation de fibres collagéniques, mais aussi permet une meilleure résistance de la trame collagénique devant des facteurs physiques tels que la température et les contraintes mécaniques. 2.3- Tissu conjonctif non minéralisé: Microscopie photonique et électronique Les cellules sont cultivées dans une matrice collagénique (modèle de culture tridimensionnelle) afin de mimer au mieux les interactions cellules/matrice observées dans le tissu conjonctif. Ces lattis ou tissus conjonctifs équivalents sont composés de collagène I seul (Témoins) ou de collagène I et d'HE800 en différentes proportions (quantité d'EPS = 20, 10 et 5% par rapport à la quantité de collagène contenu dans le lattis, c'est-à-dire respectivement 300, 150 et 75pg). 2.3.1) Rétraction des lattis : Le premier paramètre étudié est la vitesse de rétraction des lattis : Les courbes de rétraction des lattis témoins et des lattis comprenant de l'HE800 sont similaires (Figure 4). Malgré ces similarités, on remarque que les lattis HE800 ont une vitesse de rétraction plus lente que les lattis témoins lors des jours précoces de culture. Après le 11ème jour la rétraction des lattis est presque totale. 2.3.2) Nombre de fibroblastes contenus dans les 15 lattis : Le nombre de cellules présentes dans chaque lattis varie, aux deux temps de culture entre 180 000 et 250 000 cellules. Le nombre de cellules à la périphérie représente 2 à 12% du nombre total de cellules. Ces 20 données sont compatibles avec ce qui a été décrit dans la littérature pour ce modèle de culture. Les résultats des tableaux IV, V et VI montrent le nombre de cellules par unité volumétrique (mm3) présentes dans la totalité du lattis et dans ses différentes 25 régions. Les densités cellulaires volumétriques totales des lattis après 11 et 40 jours sont comprises entre 3200 et 5900 cellules/mm3 (cf. tableau IV). Ces valeurs sont comparables à celles retrouvées dans un tissu 30 conjonctif humain normal comme cela à été décrit précédemment (Miller et al., Exp Dermatol. 2003 Aug;12(4):403-11). La cellularité physiologique des lattis témoins et des lattis comprenant du HE800 atteste donc de la validité du modèle de culture utilisé et de la compatibilité d'HE800 avec ce modèle physiologique. La densité cellulaire totale (cf. tableau IV) des lattis témoins ne varie pas quelque soit le temps de culture. Au 11eme jour de culture, la densité cellulaire totale des lattis HE800 est inférieure de 25 à 40% à celles des lattis témoin. Au 40ème jour de culture les densités cellulaires des lattis témoins et des lattis HE800 sont équivalentes. Les variations de densités cellulaires observées à l'intérieur des lattis (cf. tableau V) reproduisent exactement celles de la totalité du lattis. L'organisation topologique des cellules de la couronne périphérique (tableau VI) diverge par contre totalement de celles des tableaux IV et V : - A 11 jours de culture les densités cellulaires de la couronne périphérique sont 4 fois supérieures à celles de l'intérieur du lattis et ne présentent que peu de variation entre les tissus conjonctifs équivalents témoins et les tissus conjonctifs équivalents comprenant HE800 (tableau VI). - A 40 jours de culture, une forte diminution de la cellularité périphérique est observée. Si cette diminution n'est que de 40% pour les lattis témoins, elle atteint 100 à 250% pour les lattis contenant du HE800. La densité cellulaire des lattis témoin reste 3 fois plus élevée à la périphérie qu'à l'intérieur (tableau IV et VI) par contre ces densités sont comparables pour les lattis HE800. La cellularité globale des lattis HE800 est plus faible que celle des lattis témoins aux jours précoces de culture puis deviennent équivalentes au jours tardifs de culture. Ces variations qui se répercutent sur les densités cellulaires des régions internes peuvent s'expliquer par une stimulation de la prolifération cellulaire, ou une migration massive de cellules périphériques vers l'intérieur. En effet à la périphérie des lattis, le nombre de cellules diminue au cours du temps de culture, cette diminution est particulièrement accentuée dans les lattis comprenant du HE800 (diminution par 2 à 3,5 fois du nombre de cellules). Cette diminution peut s'expliquer par, une perte d'adhésion des cellules périphérique qui se détache de la matrice extracellulaire et/ou une migration massive de ces cellules à l'intérieur. Cela explique les gains globaux de cellularité, au cours du temps, dans les lattis contenant HE800. Tableau IV : Densité cellulaire dans la totalité du lattis: nombre de cellule par mm3 (entre parenthèse : diamètre des lattis en mm). Temps de 11 jours 40 jours Variation entre 11 et 40 jours culture Témoins 5924 (8,3) 5695 (8) - 4% HE800 20% 4468 (8) 6150 (8) + 27% HE800 10% 3899 (9,7) 6000 (8) + 35% HE800 5 3491 (1,03) 5023 (8) + 30% Tableau V : Densité cellulaire à l'intérieur du lattis: nombre de cellule par mm3. 11 jours 40 jours Temps de culture Variation entre 11 et 40 jours Témoins 5568 5520 ù 3 % HE800 20% 4153 6085 + 22% HE800 10 s 3517 5938 + 41 % HE800 5 ~ 3220 5005 + 36 % Tableau VI: Densité cellulaire à la périphérie du lattis: nombre de cellule par mm3 Temps de 11 jours 40 jours Variation entre 11 culture et 40 jours Témoins 20134 14382 - 40% HE800 20% 23367 6531 ù 258% HE800 10% 22161 9979 ù 122% HE800 5% 17731 5939 - 199% Conclusion : 8E800 favorise la prolifération des fibroblastes dermiques dans la matrice extracellulaire et/ou favorise leur mobilisation c'est-à-dire la sélection, la migration et la pénétration massive des cellules périphériques. 2.4.3) Etat de la matrice collagénique : 2.4.3.1) Microscopie photonique La coloration au rouge Sirius (coloration de Junquera) permet de colorer spécifiquement les collagènes, dans la peau par exemple ses collagènes apparaissent sous la forme d'une structure filamenteuse lâche, colorée en rouge. Les colorations au rouge Sirius des coupes histologiques après observation en lumière transmise et lumière polarisée (cf. Figures 5 a,b,c,d) montrent que l'addition d'HE800 lors de la formation du lattis permet la formation d'une matrice beaucoup plus dense et à des temps beaucoup plus courts que dans les lattis témoins. Pour exemple : la densité de la matrice collagénique témoin après 40 jours de culture est équivalente à celle observée dans les matrices collagéniques constituées en présence de HE800 à 11 jours de culture. Cet effet sur la densité est beaucoup plus important aux doses les plus faibles (10%, 5%). 2.4.3.2) Microscopie électronique La microscopie électronique a été pratiquée sur des tissus conjonctifs équivalents cultivés pendant 11 jours. Un bon état ultrastructural des cellules a été observé, que ce soit dans les témoins ou que ce soit dans les lattis formés en présence des différentes concentrations d'HE800 (Figures 6 a,b,c,d). Aucunes fibres collagéniques n'a pu être observées dans les lattis témoins, les lattis comprenant 20% de HE800 permettent d'observer quelques éléments fibrillaires pris dans un gel constitué de l'exopolysaccharide. Les lattis comprenant 10% et 5 % d'exopolysaccharides sont très différents, en effets de nombreuses fibres collagéniques sont présentes, elles sont réparties dans tout le lattis et présentent, pour certaines, une striation périodique. Ces fibres ou fibrilles collagéniques sont piégées dans le gel constitué par 1'HE800. Conclusion : L'HE800 accélère la fibrillation collagénique et favorise la constitution d'une matrice extracellulaire.5 REVENDICATIONS 1) Matrice de collagène comprenant un polysaccharide ou un sel de ce polysaccharide de masse molaire moyenne en poids 5 comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, préférentiellement comprise entre 700 000 et 900 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant les 4 résidus osidiques suivants [(-3)-D GlcNac P (1-4) D GIcA (3 (1-4) D G1cA p (1-4) D GalNac a (1-)] 2) Matrice selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un polysaccharide excrété par l'espèce Vibrio diabolicus. 3) Matrice de collagène selon la revendication 1, caractérisée en ce que le collagène est un collagène choisi 15 dans le groupe des collagènes fibrillaires constitué des collagènes de type I, Il III, V et XI ou d'un mélange de ceux- ci. 4) Matrice selon la revendication 3 caractérisé en ce que le collagène est un collagène de type I. 20 5) Matrice comprenant le polysaccharide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le polysaccharide a été rendu insoluble par réticulation à l'aide d'un ou plusieurs agents réticulants. 6) Matrice selon l'une quelconque des revendications 1 25 à 5 comprenant en outre un ou plusieurs facteurs de croissance qui favorisent la colonisation de la matrice par les cellules mésenchymateuses, en particulier par les fibroblastes. 7) Matrice selon la revendication 6 caractérisée en ce que le ou les facteurs de croissance sont choisis dans le 30 groupe consistant en TGF-beta, PDGF, FGF, VEGF, BMPs, CTGF. 8) Matrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant en outre des cellules mésenchymateuses. 9) Matrice selon la revendication 8 caractérisée en ce que les cellules mésenchymateuses sont des cellules issues de 10. la moelle ou du sang circulant,' cellules du cartilage. 10) Matrice selon la revendication 9 caractérisée en ce que les cellules mésenchymateuses sont des fibroblastes 5 dermiques. 11) Matrice selon la revendication 10 comprenant en outre des kératinocytes. 12) Matrice selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que les cellules mésenchymateuses sont des chondrocytes. 10 13) Substitut de tissu conjonctif non minéralisé comprenant la matrice selon l'une quelconque des revendication 8 à 12. 14) Substitut selon la revendication 13 caractérisé en ce que le substitut est un substitut de tendon. 15 15) Substitut de derme comprenant la matrice selon la revendication 10. 16) Substitut de peau comprenant la matrice selon la revendication 11. 17) Substitut de cartilage comprenant la matrice selon 20 la revendication 12. 18) Dispositif médical ou implant comprenant la matrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 19) Dispositif médical selon la revendication 18 caractérisé en ce que le dispositif médical est un pansement. 25 20) Procédé de culture de cellules mésenchymateuses, en particulier de fibroblastes, caractérisé en ce que les cellules mésenchymateuses sont cultivées sur la matrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 21) Utilisation d'une matrice selon l'une des 30 revendications 1 à 12 pour la fabrication d'un substitut de tissu conjonctif non minéralisé ou d'un implant utile en ingénierie tissulaire. fibroblastes ou des