Brevet FR2891052A1 — publié le 20070323

Titre: Procédé de préparation d'un échantillon La présente invention se situe dans le domaine de l'histologie et concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un échantillon. L'histologie est l'étude microscopique de la morphologie et de la composition des tissus biologiques. Cette étude est de première importance, notamment en vue d'établir un diagnostic permettant d'orienter le traitement d'un patient. Préalablement à leur étude microscopique, les tissus biologiques sont, de manière habituelle, inclus dans une matrice qui se trouve à l'état solide à température ambiante, puis préparés sous forme de coupes minces d'une épaisseur de l'ordre de quelques micromètres, et enfin soumis à des réactions de coloration permettant la mise en évidence des différents constituants du tissu. Les méthodes faisant référence dans le domaine de la préparation de tissus biologiques destinés à l'observation microscopique sont décrites depuis de nombreuses années, par exemple dans l'ouvrage de M. Langeron Précis de microscopie Ed. Masson et Cie, Paris 1942 ou celui de P. Ganter et G. Jollès, Histochimie normale et pathologique Ed. Gauthier- Villars, Paris 1969. L'inclusion a pour but de permettre la réalisation de coupes fines et régulières à partir de la pièce de tissu à examiner. Le milieu d'inclusion le plus utilisé est la paraffine. La paraffine étant hydrophobe, le prélèvement doit subir une déshydratation, de manière habituelle par immersion dans des bains d'éthanol de degré croissant, puis dans des bains de toluène ou de xylène. Le prélèvement est ensuite placé dans un bain contenant de la paraffine fondue, qui infiltre alors toute la pièce, cette phase est connue sous le nom d'imprégnation. La pièce est alors moulée pour conduire, après refroidissement, à un bloc de paraffine solide à l'intérieur duquel la pièce biologique est incluse. Les coupes du bloc de paraffine sont ensuite réalisées avec un microtome permettant de produire des coupes minces, généralement de 1 à 3 pm d'épaisseur. Ces coupes sont recueillies sur des lames de verre et sont soumises à des colorations. Les colorants étant souvent hydrosolubles, les coupes doivent être réhydratées avant coloration, de manière à se trouver dans un état qui les rend aptes à subir les colorations histologiques. La réhydratation est effectuée par déparaffinage des coupes, qui est réalisée par immersion dans des bains de toluène ou de xylène, puis par immersion dans des bains d'alcool de degré décroissant, puis dans l'eau. La préparation de ces coupes avant coloration (déparaffinage et hydratation) utilise de grandes quantités de solvants organiques, particulièrement des alcools, du toluène ou du xylène. Il en résulte un coût important en raison des contraintes réglementaires d'usage, puis d'élimination ou de recyclage, de tels solvants. On sait également que l'évolution des usages et de la réglementation conduit à diminuer, voire même à supprimer, l'utilisation des solvants organiques. Par analogie avec certains solvants, comme le benzène ou le chloroforme, qui étaient usuellement manipulés dans les dernières décennies et dont l'usage est désormais sévèrement réglementé, il est à craindre que la manipulation de solvants comme le toluène ou le xylène soit à l'avenir soumise à des contraintes réglementaires extrêmement sévères. Il existe donc un besoin de nouvelles méthodes de préparation d'échantillon pour analyse médicale en vue de la réduction ou de la suppression de l'usage de solvants organiques. La présente invention a pour but de proposer un procédé de traitement de tissus biologiques inclus dans une matrice solide, particulièrement des coupes minces de tissus déshydratés et inclus dans la paraffine, en vue de produire des tissus débarrassés de cette matrice et de les porter dans un état physico-chimique, notamment un état d'hydratation ou d'imprégnation par une substance hydrosoluble, qui les rend aptes à subir des colorations histologiques. On connaît des exemples de solvants organiques, purs ou en mélange, dont l'utilisation a été évaluée dans le domaine de la préparation d'échantillon pour analyse histologique,et qui sont aptes à se substituer au toluène ou au xylène. On peut notamment citer le dioxane, le chloroforme, le méthylcyclohexane, ou les hydrocarbures aliphatiques. Il est bien connu que ces solvants posent des problèmes de toxicité et/ou des problèmes de sécurité de manipulation en raison de leur caractère inflammable. D'autre part, l'homme du métier sait que la qualité des échantillons traités à l'aide de ces solvants est bien souvent moindre que celle obtenue avec la méthode de référence utilisant le toluène. Les fluides comprimés, particulièrement le dioxyde de carbone liquide ou supercritique, connaissent des applications croissantes pour de nombreux procédés où ils permettent de remplacer avantageusement des solvants organiques. On rappellera tout d'abord les différents états d'un fluide et ses propriétés dans chacun de ces états. On sait 2891052 4 que les corps sont généralement connus sous trois états, à savoir solide, liquide ou gazeux et que l'on passe de l'un à l'autre en faisant varier la température et/ou la pression. Outre l'état solide, il existe l'état liquide et l'état gazeux séparés par la courbe de vaporisation/condensation; et il existe un point au-delà duquel on peut passer de l'état liquide à l'état gaz ou vapeur sans passer par une ébullition ou, à l'inverse, par une condensation, et ceci de façon continue: ce point est appelé le point critique. Un fluide supercritique est caractérisé soit par une pression et une température respectivement supérieures à la pression et à la température critiques dans le cas d'un corps pur, soit par un point représentatif (pression, température) situé au-delà de l'enveloppe des points critiques représentés sur un diagramme (pression, température) dans le cas d'un mélange; il présente alors, pour de très nombreuses substances, un pouvoir solvant élevé sans commune mesure avec celui observé dans ce même fluide à l'état de gaz comprimé. Il en est de même des liquides dits "subcritiques", c'est-à- dire des liquides qui se trouvent dans un état caractérisé soit par une pression supérieure à la pression critique et par une température inférieure à la température critique dans le cas d'un corps pur, soit par une pression supérieure aux pressions critiques et une température inférieure aux températures critiques des composants dans le cas d'un mélange (voir à ce sujet l'article de Michel PERRUT - Les Techniques de l'Ingénieur Extraction par fluide supercritique, J 2 770 1 à 12, 1999 ). Les variations importantes et modulables du pouvoir solvant des fluides supercritiques sont d'ailleurs utilisées dans de nombreux procédés d'extraction (solide/fluide), de fractionnement (liquide/fluide), de chromatographie analytique ou préparative, de traitement des matériaux (céramiques, polymères, ...) et de génération de particules. Des réactions chimiques ou biochimiques sont également réalisées dans de tels solvants. Il est à noter que les propriétés physico-chimiques du dioxyde de carbone ainsi que ses paramètres critiques (pression critique: 7,4 MPa et température critique: 31 C) en font le solvant préféré dans de nombreuses applications, d'autant qu'il ne présente pas de toxicité et est disponible à très bas prix en très grande quantité. D'autres fluides peuvent également être utilisés dans des conditions voisines, comme le protoxyde d'azote, les hydrocarbures légers ayant deux à quatre atomes de carbone, les éthers et certains hydrocarbures halogénés. On notera que l'eau est en général très peu soluble dans les fluides à pression supercritique et les gaz liquéfiés classiquement utilisés, et en particulier dans le dioxyde de carbone sous haute pression au sein duquel l'eau n'est soluble qu'à raison de 1 à 3 g/kg entre 25 et 50 C. Toutefois, bien que faible, cette solubilité entraîne des conséquences importantes sur les propriétés du fluide ainsi hydraté, et se traduit également par la déshydratation du matériau traité par ce fluide lorsque ce dernier est introduit sans contenir d'eau. Dans la suite, et par commodité de langage, on appellera fluide comprimé tout fluide porté à une pression sensiblement supérieure à la pression atmosphérique. On appellera fluide à pression supercritique un fluide porté à une pression supérieure à sa pression critique, c'est-à-dire soit un fluide supercritique proprement dit, soit un liquide dit sub- critique comme défini ci-dessus. De même, on appellera gaz liquéfié un liquide, constitué d'un composé qui se trouve à l'état gazeux à pression atmosphérique et à température ambiante, porté à une pression et à une température inférieures à sa pression et sa température critiques respectivement. On sait que de nombreux procédés d'extraction utilisant les fluides comprimés, particulièrement le dioxyde de carbone à pression supercritique, ont été développés et connaissent actuellement des applications industrielles (voir à ce sujet l'article de Michel PERRUT sus-mentionné). Ces procédés reposent sur la mise en contact d'un matériau contenant la substance à extraire avec un fluide comprimé, dans des conditions de température et de pression pour lesquelles le fluide comprimé peut solubiliser la substance à extraire. L'homme du métier sait que la structure de ce matériau peut être altérée lors de la mise en oeuvre d'un tel procédé d'extraction. La dissolution d'une fraction du fluide comprimé à l'intérieur du matériau, puis la décompression qui s'accompagne d'une désorption rapide du fluide comprimé, peut modifier de manière irréversible la structure de ce matériau. D'autre part, à l'issue de l'extraction par le fluide comprimé, particulièrement par du dioxyde de carbone liquide ou supercritique, le matériau se retrouve déshydraté. Par ailleurs, il est bien connu que de nombreux hydrocarbures, notamment la paraffine, ont une solubilité suffisamment élevée dans le dioxyde de carbone liquide ou supercritique pour que l'on puisse mettre en oeuvre de tels procédés d'extraction, destinés à récupérer lesdits hydrocarbures. Toutefois, on comprend aisément que la mise en oeuvre de tels procédés d'extraction pourrait gravement altérer la structure d'un tissu biologique inclus dans une matrice solide, ce qui dégraderait gravement la qualité des résultats d'une étude microscopique et du diagnostic en résultant. En outre, à l'issue de l'extraction de la paraffine à l'aide de dioxyde de carbone comprimé, le tissu biologique se trouverait déshydraté ce qui ne permettrait pas de procéder à des colorations histologiques utilisant des colorants hydrophiles. Les propriétés avantageuses des fluides comprimés pour la mise en oeuvre de procédés d'extraction d'une substance à partir d'un matériau, permettent, de manière réciproque, de réaliser l'imprégnation d'un matériau. On connaît en effet des procédés d'imprégnation utilisant les fluides comprimés, particulièrement le dioxyde de carbone à pression supercritique, où une substance solubilisée ou dispersée dans le fluide comprimé imprègne une matrice solide, comme décrit dans le brevet FR 2 798 863. Ces procédés tirent profit à la fois des propriétés de diffusion favorables des fluides comprimés et des interactions entre le fluide comprimé et la matrice solide qui conduit à une modification de la structure de cette matrice, la rendant ainsi apte à être imprégnée par une substance. Ces procédés connaissent un développement croissant, particulièrement pour le traitement de polymères, comme décrit dans une revue récente de D.L. TOMASKO et al. ( A review of CO2 applications in the Processing of Polymers publiée dans Industrial & Engineering Chemistry Research, Volume 42, P. 6431 à 6456, 2003). De récents brevets et publications enseignent que l'utilisation de ces procédés d'imprégnation provoque, de manière générale, une altération de la microstructure de la matrice à imprégner. On connaît ainsi de nombreux exemples où l'imprégnation d'une matrice solide à l'aide de fluide comprimé est inévitablement accompagnée de la formation d'une structure poreuse, comme des mousses expansées ou des pièces microporeuses. On connaît également par la demande de brevet WO 2005/001437 un procédé de préparation d'échantillons biologiques pour analyse histologique, mettant en uvre des fluides supercritiques. Ce procédé est destiné à l'inclusion de tissus biologiques dans une matrice solide, préférentiellement constituée de paraffine. Selon cette demande, l'échantillon biologique est mis en contact avec une composition comprenant un fluide supercritique, puis est imprégné par mise en contact avec la matrice d'inclusion fondue. La présente invention a pour but quant à elle de proposer un procédé permettant d'extraire et éliminer une matrice solide, particulièrement de la paraffine, d'un tissu biologique inclus dans cette matrice, et de porter ce tissu dans un état hydraté, ou imprégné par une substance hydrosoluble, état qui le rend apte à subir des colorations histologiques, sans aucune altération dommageable de la structure de ce tissu. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de traitement d'un échantillon constitué d'un tissu biologique inclus dans une matrice support solide, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes successives consistant à : - mettre en contact avec l'échantillon un flux d'un premier fluide comprimé dans lequel ladite matrice support est soluble, de façon à provoquer l'extraction de ladite matrice solide, 2891052 9 mettre en contact l'échantillon avec un second fluide comprimé, apte à imprégner le tissu par une substance aqueuse ou hydrosoluble, - évacuer le second fluide comprimé de manière 5 graduelle et contrôlée, - récupérer l'échantillon. Le procédé objet de l'invention est particulièrement intéressant en ce qu'il permet de supprimer l'utilisation de solvants organiques toxiques, particulièrement le toluène ou le xylène, lors de la préparation d'un échantillon biologique en vue d'une étude microscopique. Par ailleurs, le procédé objet de l'invention ne nécessite de manipuler l'échantillon que lors de son introduction dans un réacteur à haute pression et lors de sa récupération dans ce réacteur. Il est donc particulièrement avantageux en ce qu'il permet de simplifier les traitements antérieurs complexes et comprenant de multiples étapes de manipulation, notamment des immersions successives de l'échantillon dans des bains de solvants organiques. Cette invention repose sur le fait qu'il est surprenant de constater que la mise en contact d'un tissu biologique inclus dans une matrice solide, avec un premier fluide comprimé dans lequel ladite matrice est soluble, de manière à extraire la matrice d'inclusion, puis avec un second fluide comprimé dans lequel une substance aqueuse ou hydrosoluble est solubilisée ou dispersée, permet, après une décompression graduelle et contrôlée, de préparer un tissu dont la structure n'est pas altérée et qui se trouve imprégnée de la dite substance aqueuse ou hydrosoluble, ce qui le rend apte à subir des colorations histologiques. Au contraire des procédés d'extraction ou d'imprégnation par les fluides comprimés susmentionnés, le procédé objet de l'invention utilise des compositions de fluide comprimé, des conditions de température et de pression, ainsi qu'une étape de décompression graduelle et contrôlée, qui ne provoquent pas d'altération de la structure du tissu biologique. Il est en outre surprenant de constater que certaines compositions des deux fluides comprimés permettent, de manière graduelle, d'extraire la matrice d'inclusion hydrophobe et d'imprégner le tissu avec une substance aqueuse ou hydrosoluble. L'utilisation d'un second fluide comprimé qui comprend du dioxyde de carbone et un solvant organique hydrosoluble, ainsi que, dans une mise en oeuvre particulière, un solvant aqueux hydrosoluble, permet de porter le tissu dans un état physico-chimique contrôlé et compatible avec les exigences des colorations usuellement mises en oeuvre pour l'analyse histologique. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, le premier fluide comprimé est constitué de dioxyde de carbone à pression supercritique, et éventuellement d'un mélange de celui-ci avec un solvant organique. Par ailleurs le solvant organique pourra comprendre un alcool ayant entre 1 et 5 atomes de carbone, de préférence 2 atomes de carbone. Dans une autre variante de ce mode de mise en oeuvre, on peut utiliser comme premier fluide comprimé un mélange de dioxyde de carbone, de solvant organique hydrosoluble et de solvant aqueux. Suivant l'invention, le second fluide comprimé pourra être constitué d'un mélange de dioxyde de carbone, d'un solvant organique hydrosoluble auquel on pourra ajouter un solvant aqueux. Selon un autre mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux de l'invention, le premier et le second fluide comprimé seront identiques. Les premier et second fluides comprimés seront maintenus, lors de la mise en contact avec les échantillons, à une pression comprise entre 4 et 70 MPa, de préférence à une pression entre 6 et 30 MPa, et à une température comprise entre 0 et 50 C, de préférence entre 20 et 40 C. D'autres composés peuvent être additionnés à chacun des deux fluides comprimés, particulièrement, en vue d'améliorer la qualité du tissu après traitement et d'en assurer une bonne conservation, de diminuer la durée du traitement, d'imprégner le tissu avec un réactif destiné à effectuer, de préparer ou de modifier les colorations, ou encore de contrôler le pH du fluide comprimé comprenant un solvant aqueux. Selon les compositions des deux fluides comprimés et les paramètres du procédé, les étapes d'extraction de la matrice d'inclusion et d'imprégnation du tissu par une substance aqueuse peuvent être avantageusement réalisées, soit de manière concomitante, soit de manière successive. Le procédé objet de l'invention est particulièrement avantageux en ce qu'il permet de préparer un tissu biologique destiné à l'analyse histologique en utilisant des conditions opératoires modérées, notamment une température voisine de l'ambiante. Le procédé objet de l'invention est donc particulièrement adapté à la préparation de tissus biologiques pour mettre en oeuvre des techniques d' immunohistochimie,de lectinohistochimie, d' histoenzymologie ou encore d'hybridation in situ. Le tissu biologique pourra être taillé sous forme de coupe mince, de préférence d'une épaisseur comprise entre 1 et 5 pm. Le procédé objet de l'invention est avantageux lorsque il est appliqué à des coupes micrométriques de tissus inclus dans la paraffine, et particulièrement lorsque lesdites coupes sont montées sur une lame de verre. Le procédé objet de l'invention permet de traiter des prélèvements de tissus biologiques d'origine humaine, animale ou végétale, parmi lesquels on peut citer les épithéliums, particulièrement les épithéliums de revêtement et les épithéliums glandulaires; les tissus conjonctifs, particulièrement les tissus conjonctifs lâches, les tissus conjonctifs denses, les tissus osseux, les tissus cartilagineux, les tissus lymphatiques et hématopoïétiques; les tissus nerveux, particulièrement les tissus du système nerveux central et du système nerveux périphérique; les tissus musculaires, particulièrement les tissus musculaires lisses, striés squelettiques ou striés cardiaques. Parmi les colorations que peuvent subir les échantillons traités par le procédé objet de l'invention, on peut citer les colorations bichromiques, particulièrement les colorations par l'hémalun-éosine, l'hémalun-phloxine, l'hémalun-érythrosine; les colorations trichromiques, particulièrement les colorations par l'hémalun-éosine-safran, l'hémalun-phloxine-safran, les colorations trichromiques de Masson au vert lumière ou au bleu d'aniline; les colorations panoptiques, particulièrement la colorations de May-Grunwald Giemsa; les colorations spéciales, particulièrement la coloration par l'acide périodique-Schiff, la coloration par le noir Soudan, la coloration par l'orcéine, la coloration de Perls; les colorations immunohistochimiques, particulièrement pour la mise en évidence d'antigènes tumoraux. On peut également citer les procédures de préparation d'échantillon utilisées dans le domaine de la lectinohistochimie, de l'histoenzymologie ou encore de l'hybridation in situ. La figure 1 représente un schéma d'un équipement permettant la mise en uvre du procédé objet de l'invention. Les figures 2 et 4 représentent des photographies obtenues lors de l'observation microscopique d'une coupe de vésicule séminale traitée selon le procédé objet de l'invention tel que décrit dans l'exemple 1. Les figures 3 et 5 représentent des photographies obtenues lors de observation microscopique d'une coupe de vésicule séminale traitée selon le un procédé conventionnel tel que décrit dans l'exemple 1. Les différents exemples de mise en uvre présentés afin d'illustrer de façon non limitative le procédé selon l'invention, ont été réalisés dans un équipement conforme à celui décrit ci-après. Celui-ci comprend une réserve 1 d'un gaz liquéfié, constitué de dioxyde de carbone, dont la sortie est reliée, par l'intermédiaire d'une pompe 2 et d'un échangeur 3, qui permettent respectivement de porter le flux du gaz qui les traverse à la pression et à la température souhaitées, à un autoclave 4. Cet autoclave est pourvu de moyens, non représentés sur le dessin, permettant de recevoir les lames de verre supportant les coupes minces, et de les faire balayer par le flux de dioxyde de carbone provenant de la réserve 1. L'autoclave 1 comporte des moyens de soutirage constitués d'un dispositif de régulation de pression 5 qui est relié à un séparateur 6 dans lequel il est porté à l'état gazeux avant d'être rejeté vers une ligne d'évent 9. L'équipement comporte également une ligne d'addition de solvant comprenant un réservoir 7 relié à l'autoclave 4 par l'intermédiaire d'une pompe 8, permettant d'admettre dans celui-ci un solvant, organique ou aqueux, ainsi que d'autres composés susceptibles d'être mélangés au solvant. Ces différents éléments pourront être récupérés à l'état liquide au pied 10 du séparateur 6. Exemple 1: Traitement de coupes minces de vésicule séminale Dans cet exemple, des lames de verre, sur lesquelles ont été déposées des coupes minces de vésicule séminale d'épaisseur comprise entre 1 et 5 p incluses dans la paraffine, sont introduites dans l'autoclave 4. Celui-ci a ensuite été fermé et sa température fixée à 35 C. Les étapes suivantes du procédé ont été réalisées a) l'autoclave a été balayé par un flux de dioxyde de carbone introduit à l'aide de la pompe 2 à une pression de 20 MPa, à une température de 35 C et à un débit de 4 kg/h. Ce balayage a été maintenu pendant 30 minutes, b) l'autoclave a ensuite été balayé par un flux d'un mélange composé de 75% en masse de dioxyde de carbone, 22,5 d'éthanol et 2,5 d'eau, fourni par les pompes 2 et 8 à une pression de 20 MPa, à une température de 35 C et à un débit de 4 kg/h. Ce balayage a été maintenu pendant 15 minutes, c) le pompage du fluide comprimé a été stoppé, et la pression a été graduellement diminuée dans l'autoclave 30 jusqu'à la pression atmosphérique, en maintenant la température à 35 C. La durée de cette décompression a été de 30 minutes, d) l'autoclave a été ouvert dès retour à la pression atmosphérique,et les lames de verre ont été récupérées. On a pu noter que l'aspect de chacune des lames de verre était identique. On n'a observé aucune trace de paraffine lors d'une étude microscopique de ces lames. Les lames ont ensuite été soumises à une procédure de coloration. On a fait appel à la coloration trichromique de Masson (variante au vert lumière) qui associe une coloration nucléaire par l'Hémalun, une coloration cytoplasmique par un mélange de colorants acides (Fuchsine-Ponceau) et une coloration élective du collagène par un autre colorant acide, le Vert lumière. La coloration a été effectuée en utilisant le Kit Trichrome de Masson variante au vert lumière - code 361350-0000 commercialisé par la société Réactifs R.A.L. en suivant le mode opératoire consistant à colorer les lames dans l'Hémalun de Mayer pendant 10 minutes; rincer dans l'eau; colorer dans la solution de Fuchsine-Ponceau pendant 5 minutes; rincer dans l'eau; mordancer dans un bain d'acide phosphomolybdique pendant 3 minutes; sans rincer, colorer dans la solution de Vert lumière pendant 5 minutes; rincer dans 2 bains d'Eau acétique à 1%; différencier successivement dans des bains d'alcools de degré croissant; passer dans un bain de toluène et enfin effectuer le montage des lames. Une fois colorées, les lames ont été observées en lumière blanche, à l'aide d'un microscope utilisant les objectifs x20 et x40. A titre de référence, des coupes minces provenant du même tissu ont été déparaffinées puis hydratées par la méthode de référence (immersion dans des bains de toluène puis d'éthanol de degré décroissant, puis d'eau) avant de subir une coloration identique. Après coloration, l'aspect des lames traitées par le procédé objet de l'invention (figures 2 et 4) s'est révélé identique à celui des lames de référence (figures 3 et 5). Aucune altération du tissu n'a été observée et les éléments histologiques ont bien été conservés avec une chromatine caractéristique. La coloration a permis de distinguer dans les deux cas, en vert, à l'intérieur des lumières, les sécrétions séminales. Le contour des lumières est constitué par le revêtement épithélial, coloré en rouge, dont les cellules, mal rangées, sont caractéristiques de la vésicule séminale. Le matériel hyalin constitué de dépôts amyloïdes, a été coloré en rose. Les noyaux cellulaires sont apparus colorés en bleu-violet ainsi que quelques spermatozoïdes. Les hématies sont colorées en rouge vif. Le muscle lisse est apparu en rouge foncé, en périphérie et à l'intérieur de la vésicule. Enfin toute la topographie de la coupe a été clairement reconnue. Le tissu se trouvait donc dans un état physico-chimique, notamment d'hydratation lui permettant de subir avec succès une procédure de coloration. Le procédé objet de l'invention est donc un procédé en mesure de se substituer aux méthodes de référence, et permet d'obtenir une qualité d'échantillon équivalente, sans l'usage de solvants organiques toxiques. Exemple 2: Variante de mise en oeuvre du procédé objet de l'invention Cet exemple illustre un mode de mise en uvre particulièrement simple du procédé objet de l'invention où, après extraction de la paraffine par du dioxyde de carbone pur, un volume défini de substance(s) aqueuse(s) ou hydrophile(s), comme par exemple un mélange d'éthanol et d'eau, a été introduit en pied de l'autoclave 4. Le tissu a ensuite été laissé au contact du fluide ainsi saturé en éthanol et en eau. Les lames de verre, sur lesquelles ont été déposées des coupes minces de vésicule séminale incluse dans la paraffine ont été introduites dans l'autoclave 4 et maintenues dans sa partie supérieure à l'aide d'un support non représenté sur le dessin. L'autoclave a été fermé, et sa température fixée à 35 C. Les étapes suivantes du procédé ont étéréalisées: a) l'autoclave a été balayé par un flux de dioxyde de carbone introduit à l'aide de la pompe 2 à une pression de 20 MPa, à une température de 35 C et à un débit de 4 kg/h. Ce balayage a été maintenu pendant 30 minutes; b)le pompage du fluide comprimé a alors été arrêté et 50 mL d'un mélange éthanol/eau 1/1 v/v ont été introduits dans la partie inférieure de l'autoclave 4 au moyen de la pompe 8, et la pression a été maintenue à 20 MPa à l'aide de la vanne de régulation de pression 5 permettant au fluide de s'échapper de l'autoclave. L'échantillon a été laissé durant 15 minutes au contact du second fluide comprimé constitué de dioxyde de carbone, dans lequel de l'éthanol et de l'eau ont été dissous. c) la pression a été graduellement diminuée dans l'autoclave jusqu'à l'amener à la pression atmosphérique, en maintenant la température à 35 C, la durée de cette décompression ayant été de 30 minutes. d)l'autoclave a été ouvert dès retour à pression atmosphérique, et les lames de verre ont été récupérées. Après coloration trichromique de Masson, selon un protocole identique à celui de l'exemple 1, incluant la coloration simultanée d'une lame de référence après déparaffinage par immersion dans des bains de toluène, on a observé que l'aspect microscopique de la lame traitée selon le procédé objet de l'invention étant identique à celui de la lame de référence. Exemple 3: traitement à l'aide de dioxyde de carbone liquide Une coupe mince d'intestin grêle a subi un traitement identique à celui décrit dans l'exemple 2, à l'exception de la température de l'autoclave et de celle du fluide qui ont été maintenues à 25 C et de la pression dans l'autoclave qui a été fixée à 8 MPa. Le dioxyde de carbone était donc à l'état liquide. D'autre part, la durée de l'étape a) (extraction de la paraffine) a été portée à 180 minutes. Après coloration hémalum-éosine-safran incluant la coloration simultanée d'une lame de référence après déparaffinage par immersion dans des bains de toluène, on a observé que l'aspect de la lame traitée selon le procédé objet de l'invention était identique à celui de la lame de référence. Dans les deux cas, le chromatine est caractéristique, les éléments histologiques sont bien conservés et différenciés. 10 15 20 25 REVENDICATIONS 1) Procédé de traitement d'un échantillon constitué d'un 5 tissu biologique inclus dans une matrice support solide, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant a: - mettre en contact avec l'échantillon un flux d'un premier fluide comprimé dans lequel ladite matrice support est soluble, de façon à provoquer l'extraction de ladite matrice solide, -mettre en contact l'échantillon avec un second fluide comprimé, apte à imprégner le tissu par une 15 substance aqueuse ou hydrosoluble, - évacuer le second fluide comprimé de manière graduelle et contrôlée, - récupérer l'échantillon 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le premier fluide comprimé est constitué de dioxyde de carbone à pression supercritique. 3) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que 25 le premier fluide comprimé comprend en outre un solvant organique. 4) Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le premier fluide comprimé comprend en outre un solvant 30 aqueux. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le second fluide comprimé est constitué d'un mélange de dioxyde de carbone et d'un solvant organique hydrosoluble. 6) Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le second fluide comprimé comprend en outre un solvant aqueux. 7) Procédé selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisé en ce que le solvant organique comprend un alcool ayant entre 1 et 5 atomes de carbone, de préférence 2 atomes de carbone. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le premier et le second fluide comprimé sont identiques. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le premier et le second fluide comprimé sont maintenus, lors de la mise en contact avec les échantillons, à une pression comprise entre 4 et 70 MPa, de préférence entre 6 et 30 Mpa, et à une température comprise entre 0 et 50 C, de préférence entre 20 et 40 C. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape d'extraction de la matrice solide et l'étape d'imprégnation du tissu par une substance aqueuse sont réalisées de manière concomitante. - 22 - 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on utilise de la paraffine en tant que matrice solide. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérise en ce que l'on taille le tissu biologique sous forme de coupe mince, de préférence d'une épaisseur comprise entre 1 et 5 pm. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on dispose la coupe mince de tissu biologique sur une lame de verre.