Brevet FR2887333A1 — publié le 20061222

PROCEDE DE PREPARATION D'UN REACTIF DE COLORATION DE CELLULES, REACTIF OBTENU ET UTILISATION La présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle ainsi que le réactif obtenu. L'invention se rapporte également au procédé de coloration de cellules utilisant 5 ce réactif. La coloration cellulaire est aujourd'hui une technique très répandue, indispensable aussi bien en recherche fondamentale qu'en analyse médicale pour le cytodiagnostic. Associée à l'observation au microscope, elle permet de différencier les différentes cellules ou parties de cellules. Depuis de très nombreuses années, des réactifs sont utilisés de façon continue et commercialisés sans qu'ils aient été modifiés, ce sont les réactifs connus sous les noms de MGG, May-Grunwald Giemsa. Ces colorants se présentent sous forme de deux composés avec une composition connue et généralement appliquée - May-Grunwald réalisé à partir de poudre de bleu de méthylène-éosine à 0,30 g dilués dans 100 g de méthanol, et - Giemsa réalisé à partir de poudres de bleu Azur II- éosine 3,0 g et d'Azur II 0,8 g dilué dans 375 g de méthanol avec 125 g de glycérine. Afin de réaliser une analyse, le praticien procède à un trempé d'une lame portant les cellules à observer dans la première solution puis dans le réactif dilué avec de l'eau tamponnée, généralement au 1/2. La lame est à son tour trempée dans la seconde solution, généralement diluée entre 1/20 et 1/30 avec de l'eau tamponnée, puis rincée et séchée. 2887333 2 On obtient alors des colorations connues de tous les praticiens qui font que ce colorant MGG est devenu un standard, ceci afin de permettre des comparaisons. Il est essentiel de conserver cette reproductibilité et d'établir un standard. Néanmoins, on sait que les solvants, notamment le méthanol, utilisés pour réaliser les colorants en général et le MGG en particulier, sont des composés toxiques et volatils dont il serait souhaitable de limiter l'utilisation. La présence de glycérine engendre également des inconvénients car elle rend plus difficile les rinçages des lames et peut engendrer des colmatages des filtres lors de la filtration finale. De plus, pour réaliser une bonne coloration il est important que le colorant soit stable et qu'il ne persiste pas de dépôts de colorants après le rinçage de la lame. Or de tels dépôts peuvent apparaître avec les produits de l'art antérieur. Ces dépôts perturbent le fonctionnement des dispositifs automatiques de reconnaissance de cellules et empêchent de distinguer les différents éléments cellulaires et de reconnaître les cellules saines des cellules malades dans le cas d'un cytodiagnostic. Enfin, il est nécessaire de faire évoluer le MGG afin d'améliorer la rapidité de réalisation de la coloration tout en obtenant de bons résultats, de qualité équivalente voire meilleure. En effet les produits de coloration connus de type MGG demandent un temps de coloration compris entre 14 et 24 minutes, ce qui est relativement long. Ainsi il subsiste un besoin pour un réactif de coloration présentant des résultats comparables à ceux d'un MGG, qui soit rapide d'utilisation, non toxique, stable, et qui présente une grande rinçabilité. C'est ce à quoi répond la présente invention en proposant un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, se présentant sous forme de deux composés réalisés à base d'eau, non toxique, stable et facilement rinçable. 2887333 3 Un tel réactif ne nécessite l'utilisation que d'une faible teneur en colorants. La présente invention propose également un procédé de coloration utilisant le réactif de coloration selon l'invention, qui permet d'obtenir toujours une même coloration pour les mêmes éléments afin de pouvoir établir des comparaisons d'images réalisées à partir de lames colorées. Avantageusement, ce procédé de coloration est rapide, le temps de coloration étant diminué au moins de moitié par rapport au temps de coloration pratiqué dans l'art antérieur. Le réactif de coloration selon la présente invention est maintenant décrit en 10 détail. Le réactif selon la présente invention utilise comme colorants dans les rouges l'éosine et éventuellement l'érythrosine et dans les bleus le bleu azur, et éventuellement le bleu de méthylène. Selon un perfectionnement le réactif selon l'invention utilise également dans les 15 bleus un composé du groupe des thiazines. Le procédé de préparation du réactif de coloration selon l'invention consiste à préparer deux composés. La préparation du premier composé consiste à mettre en solution les poudres de chacune des couleurs rouge dans un solvant, en l'occurrence le bMSO, et à diluer 20 cette solution dans une solution tamponnée. La préparation du second composé consiste à mettre en solution les poudres de chacune des couleurs bleues dans du bMSO, et à diluer le mélange dans une solution tamponnée. La solution tamponnée utilisée est une solution tamponnée à pH compris entre 6,0 25 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate monopotassique et de phosphate disodique. 2887333 4 Les quantités sont données pour être mises en solution dans une quantité de 62,5 ml de bMSO pour les couleurs rouges et de 12,5 ml pour les couleurs bleues puis diluées dans environ 1L de solution tamponnée. On prépare le composé dans le rouge avec de l'éosine, dont le dosage est compris 5 entre 0,100 et 0,400 g, plus particulièrement 0,100 et 0,250 g. Si le composé intègre de l'érythrosine, sel disodique de tétraiodofluorescéine, elle l'est à raison de 0,100 à 0,200 g, plus particulièrement à raison de 0,150 et 0,200 g. Ce composé dans le rouge est dilué avec une solution tamponnée dont le pH est 10 compris entre 6,0 et 7,4, plus particulièrement entre 6, 0 et 6,5. Selon une variante de l'invention, on ajoute un conservateur à ce composé dans le rouge. On prépare le composé dans le bleu avec du bleu azur dosé entre 0, 100 g et 0,250 g, plus particulièrement entre 0,100 g et 0,150 g. Si le composé intègre du bleu de méthylène, il l'est à raison de 0, 100 g et 0,250g, plus particulièrement à raison de 0,100 g et 0,150 g. Selon un perfectionnement de l'invention, on ajoute une quantité comprise entre 0,010 g et 0,050 g d'un composé du groupe des thiazines, plus particulièrement comprise entre 0,020 g et 0,050 g. Ce composé dans le bleu est dilué avec une solution tamponnée dont le pH est compris entre 6,0 et 7,4, plus particulièrement entre 6,0 et 6, 5. On constate que ce réactif de coloration se présentant sous forme de deux composés n'est pas toxique. Il permet une excellente stabilité et également une excellente dissolution car il 25 n'y a pas de phase avec glycérine. La dissolution de chacun des composés ne pose pas de problème car elle ne génère pas de complexes. 2887333 5 De plus, le réactif de coloration selon l'invention est peu chargé en colorants du fait de leur dilution dans une solution aqueuse, si bien qu'il présente une toxicité réduite et qu'il est très facilement rinçable. Le procédé de coloration mettant en oeuvre ce réactif consiste généralement à 5 immerger une lame portant des cellules dans le premier composé, puis dans le second composé. Plus précisément, le procédé de coloration comprend la succession des étapes suivantes - immerger une lame portant des cellules dans un fixateur, par exemple du 10 méthanol, pendant 5 secondes, - immerger la lame fixée dans le premier composé du réactif pendant 90 secondes, immerger la lame fixée dans le second composé du réactif pendant 240 secondes, - rincer la lame à l'eau claire, et - sécher la lame à l'air pour en permettre l'observation. Selon une variante, le procédé de coloration selon l'invention comprend la succession des étapes suivantes: - immerger une lame portant des cellules dans un fixateur, par exemple du 20 méthanol, pendant 5 secondes, immerger la lame fixée dans le premier composé du réactif pendant 90 secondes, - immerger la lame fixée dans un bain de solution tamponnée à pH compris entre 6,0 et 7,4 pendant 60 secondes, - immerger la lame fixée dans le second composé du réactif pendant 240 secondes, -rincer la lame à l'eau claire, et - sécher la lame à l'air pour en permettre l'observation. Un tel procédé permet d'obtenir des résultats comparables à ceux obtenus à partir du colorant MGG, avec un temps de coloration beaucoup plus rapide. 7 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, se présentant sous forme de deux composés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: préparation du premier composé par mise en solution d'au moins un 5 colorant rouge, l'éosine, dans du diméthylsulfoxide, et dilution de cette solution dans une solution tamponnée, et - préparation du second composé par mise en solution d'au moins un colorant bleu, le bleu azur, dans du diméthylsulfoxide, et dilution de cette solution dans une solution tamponnée. 2. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution tamponnée est une solution tamponnée à pH compris entre 6,0 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate monopotassique et de phosphate disodique. 3. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules selon la 15 revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter au premier composé un second colorant rouge, l'érythrosine. 4. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter au second composé un second colorant bleu, le bleu de méthylène. 5. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter au second composé un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines. 6. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le ou les colorants ajoutés sont mis en solution dans du diméthylsulfoxide. 2887333 8 7. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, se présentant sous forme de deux composés, obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le premier composé comprend au moins de 0,100 à 0, 400 g d'éosine mis en solution dans du diméthylsulfoxide et dilué dans 1L d'une solution tamponnée. 8. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 7, caractérisé en ce que le second composé comprend de 0,100 à 0,252 g de bleu azur mis en solution dans du diméthylsulfoxide et dilué dans 1L d'une solution tamponnée. 9. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le premier composé comprend - de 0,100 à 0,400 g d'éosine mis en solution dans du diméthylsulfoxide, et - de 0,100 à 0,200 g d'érythrosine mis en solution dans du 15 diméthylsulfoxide, ce composé étant dilué dans 1L d'une solution tamponnée. 10. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le second composé comprend: - de 0,100 à 0,252 g de bleu azur mis en solution dans du diméthylsulfoxide, - de 0,100 à 0,250 g de bleu de méthylène mis en solution dans du diméthylsulfoxide, et - de 0,10 à 0,050 g d'un composé du groupe des thiazines mis en solution 25 dans du diméthylsulfoxide, ce composé étant dilué dans 1L d'une solution tamponnée. 2887333 9 11. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que la solution tamponnée comprend du phosphate monopotassique et du phosphate disodique. 12. Procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, 5 mettant en oeuvre le réactif de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes - plonger la préparation de cellules à colorer dans le premier composé, et - plonger la préparation de cellules à colorer dans le second composé. 13. Procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes: - plonger une lame portant la préparation de cellules à colorer 5 secondes dans un fixateur, - plonger la lame fixée 90 secondes dans le premier composé, - plonger la lame fixée 240 secondes dans le second composé, - rincer à l'eau claire, et - sécher à l'air. 14. Procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes: - - immerger une lame portant des cellules dans un fixateur, par exemple du méthanol, pendant 5 secondes, immerger la lame fixée dans le premier composé du réactif pendant 90 25 secondes, - immerger la lame fixée dans un bain de solution tamponnée à pH compris entre 6,0 et 7,4 pendant 60 secondes, - immerger la lame fixée dans le second composé du réactif pendant 240 secondes, -rincer la lame à l'eau claire, et - sécher la lame à l'air pour en permettre l'observation.