Brevet FR2893631A1 — publié le 20070525

La présente invention a trait à des promoteurs à inductibilité maintenue. Le phénomène de mise sous silence ('silencing') transcriptionnel des vecteurs d'expression comportant un promoteur rétroviral est généralement expliqué comme étant imposé par la cellule transduite qui modifie la méthylation de l'ADN du provirus et l'acétylation des nucléosomes qui lui sont associés. Le silencing transcriptionnel explique l'évolution habituelle des souches rétrovirales vers la latence de type post-intégrative. Ce phénomène est activement étudié, en particulier dans l'infection par le HIV-1, car il est responsable du maintien au long cours des provirus chez le sujet infecté malgré les résultats souvent spectaculaires obtenus par la chimiothérapie combinée (HAART), et ne permet donc pas l'éradication complète de l'infection. L'utilisation de vecteurs rétroviraux, en thérapie cellulaire ou génique, peut se heurter à ce même phénomène qui provoque l'extinction de l'expression des transgènes. La mise au point de vecteurs inductibles par la protéine Tat du HIV-1 peut présenter le même inconvénient puisque les promoteurs utilisés sont précisément copiés sur celui du HIV-1. La présente invention fournit maintenant des promoteurs qui permettent d'échapper à la régulation négative de type silencing transcriptionnel. Ces promoteurs offrent une très forte activité transcriptionnelle et sont inductibles au long cours, c'est-à-dire que l'inductibilité est maintenue sans mise sous silence. Ils ont de plus l'avantage d'être totalement silencieux en l'absence d'inducteur. Cette propriété utile en thérapie, peut également être appréciée in vitro dans les essais d'expression différentielle où l'absence totale de 'bruit de fond' est souhaitée. L'échappement de ces promoteurs au silencing transcriptionnel et leur forte inductibilité par la protéine Tat les rend particulièrement utiles pour contrôler l'expression de gènes thérapeutiques ciblés contre des rétrovirus du type HIV. L'invention est basée sur les observations suivantes. La souche HIV-1 LAI(Bru) appartient au sous-type B (van Opijnen, et al, 2004). Le promoteur de ce sous-type, présent dans les 2 LTR, est caractérisé par la présence de 2 sites NF-kB suivis de 3 sites Spi activables par les facteurs transcriptionnels cellulaires correspondants, et d'une séquence régulatrice TAR propre à toutes les souches HIV-1 et contrôlée par la protéine transactivatrice virale Tat (Jeeninga, et al, 2000 ; Centlivre, et al, 2005), (Figure 1A). Selon l'organisation générale de tous les rétrovirus, chacun des 2 LTRs de HIV-1 comporte, successivement de 5' en 3', les 3 segments U3, R et U5. Les sites NF-kB et SPI sont localisés en 3' de U3 et la ou les tiges-boucles TAR en 5' de R. Dans le contexte de la présente demande, il est fait référence à la région U3-R de HIV-1 regroupant l'ensemble des motifs propres à l'invention. La souche HIV-1 LAI a été maintenue en réplication ininterrompue pendant plus de trois ans. Cette réplication continue a été rendue possible grâce à l'ajout régulier, 2 fois par semaine, de 20% de cellules Iymphoblastoïdes CEM parentales fraîches. En effet, sans ce type de précaution, la réplication du HIV-1 diminue progressivement après infection de cellules neuves, et s'arrête complètement après quelques semaines seulement de réplication (Li, et al, 1996 ; Song, et al, 1996 ; Lassen, et al, 2004). Il s'agit du phénomène bien connu de l'entrée en latence. Le séquençage des LTR de la souche LAI, tout au long de son maintien en réplication, a montré une évolution tout à fait inattendue. Une puis deux séquences TAR complètes ont été trouvées insérées dans la continuité immédiate de la séquence TAR originelle; de plus, un troisième site NF-KB supplémentaire a également été trouvé inséré entre les 2 sites NF-KB originels (Figure 1 B). Les 3 sites SPI ont été constamment retrouvés. Enfin, un site PEA3 (AGGAAG), inhabituel dans les LTR HIV-1, généré par une mutation G-->A dans le site SPI-III a régulièrement été retrouvé dans les LTR des variants LAI après trois années de culture (Figures 1, 2, 3). Les différentes combinaisons, listées ci-dessous, ont pu être détectées par sous-clonage à différents temps de la culture continue: 2xNF-KB + 3xSP1 + 1 xTAR 2xNF-KB + 3xSP1 + 2xTAR 2xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + IxTAR 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 2xTAR 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR De façon inattendue, il a été observé qu'après 3 années de réplication, l'entrée en latence de la souche LAI n'était plus obtenue, même après plus de 20 mois de culture sans ajout de cellules CEM parentales. Or dans les conditions habituelles d'infection de ces cellules CEM, l'extinction de la réplication est observée après quelques semaines seulement de production virale (Song, et al, 1996). Toutes les séquences LTR obtenues par PCR sur les souches obtenus après trois années de culture continue contenaient 3 sites NFKB, 1 site PEA3 ainsi que 2 ou 3 séquences TAR. L'apparition des nouveaux variants s'accompagnait d'une surproduction virale importante, appréciée par l'évaluation du taux de protéine virale p24 en intra- et extra-cellulaire, ainsi que par l'augmentation de la production virale proprement dite dans les surnageants de culture, mesurée à plus de 102 fois supérieure à celle observée avec la souche LAI sauvage. Sur cette base, la présente invention fournit un promoteur transcriptionnel, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un acide nucléique comprenant au moins trois sites NF-kB, au moins trois sites SPI, au moins deux sites TAR, et éventuellement un site PEA3. L'invention fournit également un vecteur comprenant un tel promoteur, et une cellule hôte transfectée avec ledit vecteur. Le promoteur peut être mis à profit dans des procédés d'expression de séquence d'intérêt (séquence codante ou siRNA), l'expression étant gouvernée par ce promoteur présentant l'avantage d'être inductible par la protéine Tat, voire aussi par d'autres agents exogènes, et de ne pas subir de phénomène de mise sous silence . De plus, en l'absence d'inducteur, le promoteur reste totalement muet. Enfin, après induction, le niveau de transcription est extrêmement élevé. Ces propriétés peuvent être mises à profit pour le contrôle de l'expression de gènes d'intérêt dans les systèmes d'étude in vitro ainsi que dans les procédures de transgénèse ex vivo ou in vivo. Eléments du promoteur De préférence, le promoteur de l'invention comprend trois sites NF-kB, trois sites SPI et deux ou trois sites TAR, et éventuellement un site PEA3. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites proviennent de HIV-1. Une séquence de promoteur comprenant trois sites NF-kB, un site PEA3, trois sites SPI et trois sites TAR est présentée en annexe (SEQ ID NO :1). On désigne par site TAR une séquence nucléotidique reconnue spécifiquement par, et capable de fixer, le facteur de transcription viral Tat. La transcription du provirus HIV-1 comporte une première phase classique d'initiation sous la dépendance de facteurs cellulaires tels que NF-KB, SPI, et Ets qui se fixent sur les motifs nucléotidiques correspondants présents dans le LTR 5' en amont de la TATA box. La transcription ainsi initiée démarre immédiatement au pied de la tige boucle TAR (Figure 1A), structure naissante qui va provoquer l'arrêt de la transcription en l'absence de la protéine virale Tat. La deuxième phase d'élongation se déroule donc sous la dépendance de ce facteur viral. Cette `auto-dépendance' viro-virale pose un problème de compréhension que l'on peut résoudre pour certains auteurs en admettant le caractère 'de fuite' ( leaky ) du promoteur HIV-1. L'amorçage d'une élongation efficace pourrait se produire grâce à une transcription 'de fuite' capable de produire les premières molécules Tat indispensables. La multiplication des sites NF-kB associés au site PEA3 pourrait favoriser les fuites, indispensables au franchissement des multiples tiges-boucles TAR qui permettraient, elles, ensuite l'emballement de la transcription. Le jeu subtil de régulation de la transcription du HIV-I établi entre facteurs cellulaires et facteur viral est conservé dans le type de promoteur décrit ici, au cours de l'amorçage de la transcription puis considérablement amplifié. Les expressions site NF-kB , site SPI et site PEA3 désignent une séquence d'ADN reconnue spécifiquement par la famille de facteurs de transcription NF-kB, le facteur de transcription Spi et la famille de facteurs de transcription PEA3, respectivement. Les facteurs de transcription NF-kB, Spi et PEA3 sont des facteurs de transcription cellulaires codés par le génome de la cellule hôte. Les facteurs nucléaires de la famille NFûkB sont des facteurs de transcription impliqués dans le contrôle d'une variété de processus cellulaires tels que la réponse immunitaire, la réponse inflammatoire, le développement, la croissance cellulaire et l'apoptose. L'activation par NF-kB semble être une composante importante dans la régulation du promoteur de HIV-1 puisque la délétion des sites NF-kB entraîne une absence d'activation du LTR 5' par les activateurs classiques de cette voie, c'est à dire le TNF-a, I'IL-1 ou encore les mitogènes des cellules T. Spi est un facteur de transcription contenant 3 structures en doigt de zinc requises pour l'interaction avec les promoteurs d'une grande variété de gènes contenant un motif appelé boîte GC. Le facteur SPI module la transcription des gènes de HIV-1 par liaison aux trois boîtes GC adjacentes à la séquence TATA comprises dans le LTR 5'. La délétion de ces sites de liaison a pour résultat la production d'un provirus HIV-I déficient, ce qui démontre le rôle critique de Spi dans la fonction du promoteur de HIV-1. Les protéines membres du groupe PEA3 sont des facteurs de transcription appartenant à la famille Ets et qui sont exprimées dans plusieurs tissus normaux et tumoraux. Leur rôle précis n'a pas encore été complètement défini mais leur activation par la voie Ras a été rapportée. Deux sites de liaison aux facteurs de la famille Ets ont été identifiés dans les LTR de HIV-1. Ces sites Ets peuvent activer la transcription des gènes de HIV-1. Selon un mode de réalisation particulier, le promoteur de l'invention peut en outre comprendre un ou plusieurs élément(s) conférant une inductibilité à un agent exogène différent d'une protéine Tat. II peut s'agir notamment d'éléments TetO (opérateur tétracycline) ou TetO2 (courte séquence capable de bloquer un promoteur eucaryote classique en fixant le répresseur TetR, voir Berens C and Hillen W. 2003), l'agent exogène étant alors la tétracycline ou un analogue de tétracycline. Les analogues de tétracycline sont les composés apparentés à la tétracycline et qui lient le répresseur TetR avec un Ka d'au moins 106 M-i, de préférence d'au moins 109 M"' . Des exemples d'analogues de tétracycline sont connus (voir notamment Hlavka and Boother, "The Tetracyclines," IN: Handbook of Experimental Pharmacology 78, R. K. Blackwood et al. (eds.), Springer-Verlag, Berlin-N.Y., 1985). De préférence, le promoteur comprend plusieurs éléments TetO2, de préférence de cinq à neuf éléments, de préférence encore sept éléments. Vecteurs Un autre aspect de l'invention vise un vecteur d'acide nucléique, comprenant un promoteur tel que défini ci-dessus, lié de manière opérante à une séquence d'intérêt, qui est une séquence codante ou un siRNA. Selon un mode de réalisation particulier, il peut s'agir d'un vecteur rétroviral, de préférence dont le ou les domaines U3-R ont été modifiés par ledit promoteur. Dans ce cas, l'insertion de la région U3-R, comportant les motifs originaux, dans le LTR 3' permet d'obtenir sa copie dans le LTR 5' (promoteur proprement dit) au cours de la première rétrotranscription et son maintien dans toute la descendance virale. Alternativement, et préférentiellement, il peut s'agir d'un vecteur rétroviral autoinactivant (dont la séquence U3-R du LTR 3' a été délétée et non remplacée), dans lequel le promoteur de l'invention est inséré en situation médiane, en dehors des LTR. Il est ainsi possible de supprimer l'éventuelle activité promotrice du LTR 3' sur des gènes cellulaires de proximité. La séquence codante d'intérêt peut être typiquement toute séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt thérapeutique. Par exemple, la séquence codante d'intérêt peut coder pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV. La séquence codante peut aussi coder pour un immunogène ou pour toute protéine recombinante ou naturelle capable d'inhiber la réplication d'un virus ou de détruire les particules virales et les cellules qui les répliquent. Les siRNA sont des molécules ARN doubles brins, typiquement d'environ une vingtaine de nucléotides en longueur, qui provoquent l'induction d'un mécanisme endogène appelé ARN interférence, conduisant à la dégradation spécifique des molécules des ARNm homologues en séquence aux siRNA. Ce système original est maintenant largement reconnu et utilisé comme outil de biologie moléculaire du fait de son efficacité et de sa spécificité d'action. Lorsque le promoteur comprend un élément TetO2, le vecteur comprend de préférence un élément d'expression TetR, en plus de la séquence d'intérêt. Cellules hôtes Les vecteurs décrits ci-dessus sont utiles pour transfecter des cellules hôtes, c'est-à-dire transférer l'acide nucléique qu'ils portent, de manière transitoire, ou, de préférence, stable (par intégration dans le génome de la cellule hôte). La cellule hôte est de préférence une cellule eucaryote, de préférence 15 de mammifère. Des cellules hôtes typiques sont les cellules CHO, HeLa, 293T (cellules rénales humaines), et NIH 3T3. Les cellules hôtes peuvent être aussi des cellules de patients. Dans ce cas, il peut s'agir plus précisément de progéniteurs hématopoïétiques prélevés chez l'hôte, transformées par transgénèse ex vivo et réintroduits chez l'hôte. 20 Expression in vitro ou ex vivo Un aspect particulier de l'invention est un procédé in vitro ou ex vivo d'expression d'une séquence d'intérêt (séquence codante ou siRNA), ledit procédé comprenant la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur tel que 25 défini ci-dessus, dans des conditions permettant l'induction du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt. Ces conditions impliquent notamment soit l'utilisation d'un agent d'inductibilité exogène, soit la production d'un agent d'inductibilité par la cellule hôte elle-même. De préférence, la cellule est ainsi cultivée en présence de 30 molécules de protéine Tat. La protéine Tat, exprimée par une cellule infectée est en partie sécrétée. Elle peut être ensuite internalisée par d'autres cellules de voisinage et être transloquée dans le noyau. S'agissant d'une cellule descendant d'un précurseur transformé à l'aide d'une cassette sous contrôle d'un promoteur décrit dans la présente invention, l'expression de la séquence d'intérêt peut alors être induite soit par infection de la cellule transformée elle-même ou par l'intermédiaire de la protéine Tat exprimée par une cellule de voisinage infectée, et internalisée par la cellule transformée. De même, la protéine d'intérêt ou le siRNA, dont l'expression est sous la dépendance d'un promoteur activable par la protéine Tat, peut agir sur la cellule transformée elle-même et/ou sur les cellules de voisinage. On peut aussi utiliser d'autres agents exogènes. Selon un mode de réalisation particulier, une cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend des éléments TetO2, ledit vecteur comprenant en outre un élément d'expression TetR, est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. De manière alternative, la cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend des éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément d'expression TetR, et est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend trois sites NF-KB et deux ou trois sites TAR, ainsi que sept éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément d'expression TetR, et est cultivée en présence de la protéine Tat ainsi que de la tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. Applications thérapeutiques L'invention fournit également des compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur tel que défini précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces vecteurs sont particulièrement utiles pour l'expression in vivo des séquences d'intérêt (séquences codantes ou siRNA), dans le cadre de thérapie génique, en raison de l'absence totale de bruit de fond, de leur très haut niveau d'expression en présence d'inducteur et du maintien de leur inductibilité au long cours sans silencing transcriptionnel. L'administration d'un agent d'inductibilité (la tétracycline le cas échéant), provoque l'expression des séquences portées par le vecteur. L'inductibilté est maintenue sans mise sous silence. Une application thérapeutique particulière est la thérapie anti-HIV. Dans ce cas, c'est la protéine Tat produite par les cellules infectées du patient qui induit l'activation du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt, qui est de préférence une séquence codant pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV, ou capable de détruire le virus et/ou les cellules qui le répliquent. En fonction du gène d'intérêt, et en particulier de sa séquence nucléotidique, l'induction du promoteur de l'invention qui pilote ce gène peut nécessiter l'utilisation simultanée des deux inducteurs Tat et Tétracycline. Le vecteur d'expression peut être administré sous forme nue (voir EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des figures : - La figure 1A représente un schéma des motifs du domaine U3-R de la souche HIV-1 Bru (LAI) sauvage, qui encadrent le nucléotide +1 de départ de transcription; - La figure 1B représente un alignement de séquences des domaines 30 U3-R des souches Bru(LAI) et 3xN-3xT (SEQ ID NO :1); - La figure 2 représente la séquence du plasmide pBlue-U3TAR3tetO (SEQ ID NO :2); - La figure 3 représente l'alignement des 3 séquences TAR originales (SEQ ID NO : 3, 4, et 5) du promoteur 3xN-3xT avec la séquence TAR de la souche HIV-1 Bru (LAI) historique (SEQ ID NO :6), et leur structuration secondaire en 3 tiges boucles successives. Le bas de la Figure 3 montre également l'enchaînement des 3 sites NF-kB du promoteur 3xN-3xT. L'ensemble 3xN-3xT a été découvert dans une souche variante ayant évolué spontanément in vitro à partir de la souche historique HIV-1 Bru (LAI); - La figure 4 est un schéma de construction des sous-clones pNL4.3 ; - La figure 5 est une photographie comparative de la révélation par immunofluorescence de la protéine virale p24 intracellulaire produite par des cellules CEM infectées avec le recombinant NL4.3NF3-TAR3 et le pNL4.3 sauvage ; - La Figure 6 montre une cytométrie de flux (contrôle = CEM non infectées ; pNL4.3 = infectées par le clone moléculaire sauvage ; pNL 3N3T = infectées par le sous-clone dont le U3-R était permuté avec NL4.3NF3-TAR3) ; - La Figure 7 montre des cartes de restriction des vecteurs pRevTRE et pMSCVpuro de Clontech ; - La Figure 8 montre des cartes de restriction des vecteurs pcDNA3 et 20 pMV7-H-ras ; - La Figure 9 représente une cytométrie de flux montrant l'induction par Tat de cellules CEM inductibles ; - La Figure 10 représente une cytométrie de flux montrant l'induction par le HIV-1 LAI des cellules CEM transfectées par pcPMAU3TAR3-25 tetO-CD24 ou pMV7AU3TAR3-tetO-CD24. Exemples : Exemple 1 : Démonstration moléculaire du rôle joué par le 30 promoteur 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR dans le maintien de la réplication sans évolution vers le silencing transcriptionnel Afin de démontrer le rôle précis joué par le bloc promoteur comportant les sites 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR, cet assemblage ainsi que les séquences apparentées ont été analysés en les construisant dans le clone moléculaire HIV-1 infectieux pNL4.3 (Adachi, et al, 1986). Ainsi, un même génome HIV- 1 se trouvait être modifié dans sa seule région U3-R, permettant donc d'analyser les effets induits par cette seule région. Matériels et méthodes Chaque promoteur LTR de provirus rétroviral contient l'enchaînement U3-R-U5 . Le codon d'initiation de transcription du provirus correspond au nucléotide (nt) +1 de la tige-boucle TAR du domaine R du LTR5'. La longueur du domaine R est de 97 nt dont les 59 premiers pour TAR). La région U3 contient toutes les séquences régulatrices de la polymérase Il cellulaire et n'est donc pas présente au niveau 5' des ARN viraux transcrits à partir du provirus, et qui sont encapsidés pour donner les particules infectieuses . Après infection, les provirus sont obtenus après rétrotranscription de l'ARN viral . Le processus de rétrotranscription comporte obligatoirement une phase de copie du domaine U3 du LTR3' pour reconstruire le LTR5' en commençant par la région répétée R qui, présente en 5' de l'ARN infectieux, peut s'hybrider avec la même région présente également en 3' de l'ARN infectieux (Telesnitsky, A., et S. Goff. 1997). Ce domaine U3 contient toutes les séquences régulatrices du promoteur rétroviral. II est ainsi possible d'apporter des modifications au promoteur LTR5' en les introduisant dans le LTR3' du clone moléculaire proviral pNL4.3, sachant qu'elles sont obligatoirement copiées au cours de la première rétrotranscription. Comme on le voit sur la figure 4A, la région du LTR3' qui contient les sites NF-KB, PEA3, SPI et TAR est encadrée par les sites Mrol et AMI que l'on retrouve également dans le LTR5'. La mise à profit de ces sites pour réaliser les permutations rend donc nécessaire l'isolement préalable du LTR3' dans un vecteur intermédiaire. Le clone pNL4.3 a la particularité d'avoir été construit à partir de la moitié 5' du génome HIV-1 NY5 ligué à la moitié 3' du HIV-1 BRU et de comporter des séquences génomiques cellulaires différentes de part et d'autre du génome viral (Adachi, et al, 1986). Opportunément, pNL4.3 contient les sites uniques Xhol et Ncol situés de part et d'autre du seul LTR3' (Figure 4A). Le segment Xhol-Ncol de pNL4.3 a été transféré dans un vecteur pGL2-Basic (Promega) spécialement préparé. Ce dernier a été préalablement délété d'un grand fragment compris entre Xhol (situé dans le MCS) et BamHl (dans le gène luciférase, inutile dans l'application développée) pour le remplacer par un linker contenant un site Ncol (Figure 4B), à l'aide des 2 amorces: 5'-TCGAGCATATGTCGCGAACTAGTCCATG-3' (SEQ ID NO :7) et 5'-10 GATCCATGGACTAGTTCGCGACATATGC-3' (SEQ ID NO :8) pour donner le linker représenté ci-dessous, comportant plusieurs sites de restriction en plus du Ncol, et utiles par ailleurs: TGGAGGA `ATGTGGC AACTAGTGGATG CGTAT CAG G T` TCAGGTACCTAG Xhol N del NruI Spel Ncol BamHl 15 Cette procédure permet également de déléter les 2 sites Mrol indésirables du gène luciférase (Figure 4B). Les différents segments Mrol-AfIlI (Figure 4A, segments b, c, d, e), obtenus par PCR, ont été échangés avec leur homologue de pNL4.3 (Figure 4A, segment a) pour donner autant de sous- 20 clones variants infectieux. Ces clones sont transfectés dans des cellules HEK-293 à l'aide du MBS MAMMALIAN TRANSFECTION KIT (Stratagene). Un cycle unique complet de réplication, générant des particules infectieuses, se déroule alors dans ces cellules, et les surnageants de cultures permettent d'infecter des cellules T CEM dont la production virale a été suivie en quantitatif 25 et au cours du temps. Résultats Le recombinant pNL4.3 construit avec le segment U3-R contenant 3 sites NF-KB + 1 site PEA3 + 3 sites SPI + 3 domaines TAR (NL4.3NF3-TAR3) 30 possèdent les propriétés originales suivantes: A- NL4.3NF3-TAR3 pilote une expression très accrue des protéines virales. La démonstration en a été faite par la détection intracellulaire de la protéine virale gag. Les cellules étaient lavées deux fois en PBS puis traitées par une solution de paraformaldéhyde 1% en PBS, pendant 20 minutes. La révélation était ensuite menée en 2 temps: (i) incubation de 30 minutes dans le mélange PBS, 0,1% triton X100, 5% sérum de veau foetal, anticorps anti-HIV-1 gag p24/p54 dilué 1:100 (ARGENE, Varilhes, France) (ii) après 2 lavages en PBS, incubation de 30 minutes avec le conjugué immunoglobulines de lapin anti-souris /FITC dilué 1:100 (DAKO, Danemarque). Après deux derniers lavages, les cellules étaient photographiées et analysées en cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA). La Figure 5 permet de comparer l'intensité de fluorescence obtenue avec le recombinant NL4.3NF3-TAR3 et le pNL4.3 sauvage par rapport aux cellules parentales CEM non infectées. L'intensité moyenne de fluorescence était évaluée par cytométrie de flux (Figure 6, contrôle = CEM non infectées, pNL4.3 = infectées par le clone moléculaire sauvage, pNL 3N3T = infectées par le sous-clone dont le U3-R était permuté avec NL4.3NF3-TAR3). Sur 5 essais parallèles menés sur des lots différents de cellules infectées. Les valeurs obtenues étaient normalisées par rapport à la fluorecence basale produite par les cellules parentales pour donner: 12,02 02 pour les cellules CEM infectées par la souche sauvage NL4.3 et 118,4 8,3 pour les CEM infectées par la souche recombinante NL4.3NF3-TAR3. B- NL4.3NF3-TAR3 confère à la souche recombinante la propriété d'échapper au silencing transcriptionnel. Après infection, trois lots de cellules CEM infectées par la souche sauvage NL4.3 et trois autres lots par la souche recombinante NL4.3NF3-TAR3 ont été entretenues sans ajout de cellules CEM parentales. Les lots CEM-NL4.3 ont cessé toute production virale dans un délai compris entre 4 et 6 semaines. Les lots CEM- NL4.3NF3-TAR3 sont toujours producteurs après 8 mois d'entretien et au même niveau que celui de l'infection initiale. Exemple 2 : Préparation du vecteur Promoteur U3-R HIV-1 original La séquence originale U3-R (3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR), présente en 3' dans les ARN viraux encapsidés, a été obtenue par PCR nichée (nested PCR) en utilisant les ARN viraux extraits à partir des virions de surnageants de culture CEMLAI entretenue sur plus de trois années, avec la paire d'amorces 5'-GGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATC-3' (sens) (SEQ ID NO :9) et 5'-GCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-3' (antisens) (SEQ ID NO :10), pour la première RT-PCR, et la paire 5'-GCGGCCGCGCTAGCACTTCAAGAACTGCTGAC-3' (sens, site Notl double souligné et site Nhel souligné, tous deux ajoutés à la séquence virale) (SEQ ID NO :11) et 5'- CTTAAGCAGTGGGTTCCC-3' (antisens, site AMI souligné, présent dans le LTR viral) (SEQ ID NO :12) pour la seconde PCR. La même technique a été utilisée pour sous-cloner toutes les séquences U3-R. Motif 7xtetO2 Le motif 7xtetO2 a été construit danspBlueScript (Stratagene) par ajout successif de la séquence unitaire TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO :13) ou de ses multiples. Les oligonucléotides (synthétisés par Proligo): 5'-CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGTCACGTG-3' (SEQ ID NO :14) et 5'-GATCCACGTGACTAGTCTCTATCACTGATAGGGAC-3' (SEQ ID NO :15) hybridés donnent le double brin tetO2 (en gras sur le schéma ci-dessous), encadré par des sites de restriction utiles à la formation des tandems: 5'-CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGTCACGTG-3' CAGGGATAGTCACTATCTCTGATCAGTGCACCTAG- 5 ' Avril. TetO2 Spel Ptnll BamHl Les sites Spel (ACTAGT) et Avril (CCTAGG) étant compatibles (CTAG), le double strand tetO2 désigné ci-dessus, et qui possède les extrêmités cohésives 5' Avril et 3' BamHl, peut être ligué entre les sites Spel et BamHl de pBlueScript, avec comme conséquence la perte du site Spel de pBlueScript en 5'. Il devient ensuite possible de liguer un nouveau segment TetO2 entre le site Spel en 3' du TetO2 précédent et le site BamHl de pBlueScript. L'opération peut être répétée avec le double brin TetO2 ou avec des multiples de ce dernier. A partir de 2xtetO2, il est possible de construire 3xtetO2. Un ensemble de 4xtetO2 est obtenu en sortant un 2xtetO2 d'un pBlueScript par Xbal (situé immédiatement en amont du site Spel d'origine) et BamHI, et en le religant dans une autre construction 2xtetO2 ouverte par Spel et BamHl, en sachant que Xbal est également compatible (TCTAGA) avec Spel. Selon la même procédure, un ensemble de 7xtetO2 est finalement obtenu en associant un 3xtetO2 à un 4xtetO2. La construction ainsi obtenue est appelée pBlue-tetO. Note: Site multiple de clonage de pBlueScript: BssHll Sacl Bstxl Sacll (BstUl) Notl Eagl Xbal Spel BamHl Smal Pstl EcoRl EcoRV HindIll Clal Sali Xhol Apal Knpl (BstUl) BssHll Construction d'un vecteur rétroviral murin auto-inactivant (pcPMAU3) à partir de 2 demi-vecteurs CLONTECH L'intérêt des vecteurs rétroviraux n'est plus à démontrer. Leur promoteur propre (LTR5') est habituellement celui utilisé pour la transcription du ou des gènes d'intérêt insérés dans le vecteur. Lorsque l'utilisation d'un promoteur exogène est envisagé, il est nécessaire d'inactiver le propre promoteur du vecteur. La stratégie du rétrovirus auto-inactivant est alors mise à profit. Pour obtenir un vecteur rétroviral de type auto-inactivant, il est nécessaire de déléter la plus grande partie possible du domaine U3 de son LTR3'. Ce domaine contient en effet tous les motifs enhancers du promoteur LTR. Ce faisant, le LTR5' conservé sera fonctionnel pour assurer la transcription des longs ARN rétroviraux infectieux qui seront produits dans les cellules d'encapsidation. Au cours de la première rétrotranscription de ces ARN, le domaine U3 du LTR3' est recopié pour donner le U3 du LTR5'. On obtient ainsi un vecteur rétroviral infectieux dont le promoteur LTR5' est inactivé. La construction proposée repose sur l'assemblage de deux demi-plasmides pRevTRE et pMSCV (Clontech). Comme pour tous les rétrovirus, les 2 LTR de pRevTRE possèdent les mêmes sites de restriction. Pour déléter le domaine U3 du LTR3', il est donc nécessaire de l'isoler dans un plasmide intermédiaire, ce qui est réalisé ici au cours de la 1 ère étape. I ère étape: Modification de pRevTRE (Clontech): délétion du fragment LTR5' + yr+ Hygro + pCMVtetO, par coupures Sspl + Hpal + Xhol, religation et transformation dans les bactéries pour l'obtention par amplification du seul demi-plasmide contenant ColE1 et le seul LTR3' (pARevTRE). 2ème étape: Délétion de la presque totalité du segment U3 du LTR3'de pDRevTRE par Nhel-BssHll (366 nt), et religation en insérant un linker contenant les sites uniques Notl, Pmll et Muni, à l'aide des 2 oligos: 5'-CTAGCGGCCGCACGTGCAATTG-3' (SEQ ID NO :16) et 5'-CGCGCAATTGCACGTGCGGCCG-3' (SEQ ID NO :17) qui après hybridation, donnent le double brin suivant avec les extrémités cohésives 5'Nhel et 3'BssHII: 5'- CTAGCGGCCGCACGTGCAATTG- 3 ' GCCGGCGTGCACGTTAA.CGCGC t Nhel No .I Pmll Muni Bss 3ème étape: Le fragment Xmnl-Clal est extrait de pMSCVpuro (LTR5' 20 + yr + MCS + Ppkg + Puror) et inséré dans pARevTRE modifié et clivé par les mêmes endonucléases, pour donner le pcSINAU3. 4ème étape: Enrichissement du site multiple de clonage de pcSINAU3 (MCS de l'ex-pMSCV), à l'aide des 2 oligonucléotides: 5'-AACGGGCCCTAGGATCCTTCGAATGATCATCGCG-3' (SEQ ID NO :18) et 25 5'-AATTCGCGATGATCATTCGAAGGATCCTAGGGCCCGTT-3' (SEQ ID NO :19) pour insertion entre les sites Hpal et EcoRl du MCS. -AACGGGCCCTAGGATCCTTCGAATGATCATCGCGù3' 3'-TTGCCCGGGATCCTAGGAAGCTTACTAGTAGCGCTT-5' ipai Apal Avril BamHl Sful Hc_li Nrui EccRI Construction du vecteur auto-inactivant Tat + Tet 2xinductible (pcPMAU3TAR3-tetO) 30 1 ère étape: Le promoteur U3-R (3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR) est extrait du vecteur de clonage par coupure Notl + AMI et ligué dans pBlue-tetO en amont du motif 7xtetO2 entre les sites disponibles Notl et Xbal (C.LACGTG) qui est partiellement compatible avec Aflll (C.,AATTG), pour donner pBlue-U3TAR3tetO. 2ème étape: Flanquant le bloc U3-R+7xtetO2, 2 sites BstUl sont présents dont l'un en amont de Notl et l'autre en aval de Apal (voir la note MCS de pBlueScript), mais absent du bloc. Celui-ci est ainsi extrait du vecteur pBlue-U3TAR3tetO à l'aide de BstUl (CG.LCG) en 5' et Apal en 3', et ligué entre Hpal et Apal dans le MCS de pcPMAU3 pour donner le pcPMAU3TAR3-tetO . Construction du vecteur auto-inactivant pMV7 2xinductible (pMV7AU3TAR3-tetO) Le vecteur rétroviral pMV7 (Kirschmeier, et al, 1988), aimablement fourni par le Professeur Nicolas Glaichenhaus, a ainsi pu être modifié pour le 15 rendre auto-inactivant (Figure 8). 1 ère étape: Le LTR3' de pMV7 a été excisé entre les 2 sites uniques Sspl et Rsrll. 2ème étape: Ouverture du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) par les 2 endonucléases Sspl et Rsrll (sites uniques) et insertion du LTR3' pour donner 20 pcDNAAU3-LTR. La région du pcDNA3 conservée Ampicillin-R + ColE1 permet l'amplification et les manipulations du LTR3'. 3ème étape: Délétion du segment Nhel-Sacl du LTR3' dans pcDNAD3-LTR et religation à l'aide d'un linker constitué par hybridation des 2 oligonucléotides 5'CTAGCTGACTGACTGACGAGCT-3' (SEQ ID NO :20) et 25 5'-CGTCAGTCAGTCAG-3' (SEQ ID NO :21) CTAGCTGACTGACTGACGAGCT GACTGA.GTGACTGG NheI S'acd 30 4ème étape: Réinsertion du LTR3' délété dans pMV7 entre Sspl et Rsrll, pour donner pMV7AU3. Sème étape: Extension du site multiple de clonage pMV7 entre EcoRl et Hindlll avec pour effet : élimination du gène H-ras. L'extension Notl-Hpal-Nsil est réalisée à l'aide des 2 oligonucléotides: 5'-AATTCGCGGCCGCGTTAACATGCATA-3' (SEQ ID NO :22) et 5'-5 AGCTTATGCATGTTAACGCGGCCGCG-3' (SEQ ID NO :23) AATTCGCGGCCGCGTTAACATGCATA GCGCCGGCG TTGTACGTATTCGA EcoRI Notl Il pal Nsii llindill 10 pour donner pMV7AU3MCS. La même extension du site multiple de clonage est réalisée sur le vecteur pM7 d'origine, non délété du U3-LTR3', pour obtenir le pMV7MCS qui est utilisé pour exprimer la protéine Tat. hème étape: Construction du bloc 3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR + 7xtetO2, sorti de pBlue-U3TAR3tetO par Notl + EcoRV (blunt), et inséré entre 15 Notl et Hpal dans pMV7 AU3MCS, pour donner pMV7AU3TAR3-tetO. Construction du vecteur auto-inactivant CMV-Tet-inductible (pcPMAU3CMV-tetO). 1 ère étape: Le promoteur CMV a été obtenu par PCR en utilisant l'ADN total de cellules fibroblastiques humaines MRC5 infectées par la souche 20 AD169 du Cytomégalovirus, à l'aide des amorces: 5'- GCGGCCGCATGTTGACATTAGATCTATTGACTAGT -3' (site Notl souligné, site BgIll double souligné, bases modifiées/ajoutées en gras) (SEQ ID NO :24) et 5'-CAGGCGATCTAGACGGTTCACTAAACGAGCT-3' (site Xbal 25 souligné et base ajoutée en gras) (SEQ ID NO :25). Le segment amplifié était cloné dans le vecteur plero-Bluntll (Invitrogen), séquencé, puis extrait par les coupures Notl et Xbal pour être ligué dans pBlue-tetO en amont du motif 7xtetO2 entre les mêmes sites. 2ème étape: Le bloc CMVprom+7xtetO2 était extrait par BgIlI et Xbal 30 pour être ligué dans le MCS de pcPMAU3 pour donner le pcPMAU3CMVp-tetO Construction et expression d'un vecteur IRES-TAT-IRES-NéoR dans les cellules HEK-293 Principe: Le but poursuivi était de s'assurer de pouvoir sélectionner des clones cellulaires producteurs, et d'obtenir une expression forte de la protéine Tat du HIV-1. Il a ainsi été décidé de construire l'ADNc TAT avec un IRES (Internai Ribosomal Entry Sequence) fusionné en 5' de l'ADNc, l'ensemble en amont du gène de résistance NéoR et séparé de lui par un deuxième IRES. II était ainsi attendu que les clones cellulaires transduits avec cette construction et sélectionnés par le G418 exprimaient bien un transcrit complet comportant l'ARN messager TAT et que cet ARNm était bien traduit. Construction du bloc IRES-TAT 1ère étape: Excision du bloc Tk-NéoR du vecteur pMV7MCS par coupure Clal et religation. 2ère étape: Obtention du bloc IRES-TAT par PCR en chevauchement: - PCR 1: ADNc de l'IRES du Poliovirus sérotype 1 (Pelletier, J., et N. Sonenberg. 1988) sur les ARN viraux, obtenus au laboratoire de virologie du CHU de Nice à partir d'une souche isolée chez un patient, par RT-PCR à l'aide du kit OneStep de la Société QIAGEN , avec les amorces: IRES-S 5'-GAATTCTAACTTAGACGCACAAAACCAAGTT-3' (site EcoRl souligné) (SEQ ID NO :26) et IRES-AS 5'-TATGATACAATTGTCTGATTGAAATAACTGTT-3' (SEQ 20 ID NO :27) - PCR 2: ADNc TAT par RT-PCR sur les ARNm de la lignée CEM infectée par la souche HIV-1 LAI et productrice au delà de trois ans d'entretien, avec les amorces: IRES/TAT-S 5'- AGACAATTGTATCATAATGGAGCCAGTAGATCC-3' 25 (SEQ ID NO :28) (Le segment double souligné en 5', correspond à l'extrémité 3' de l'IRES; le segment simple souligné correspond, lui, à l'extrémité 5' de TAT; ces 2 segments soudés permettront de lier l'IRES à TAT dans la PCR finale) et TAT-AS 5'-GTTAACCCTTCTTCTTCTATTCCTTCGGG-3' (site Hpal souligné) (SEQ ID NO :29). 30 - PCR finale: sur le mélange des 2 types d'amplicons obtenus par les RT-PCR 1 et 2, une 3ème PCR est menée avec les amorces IRES-S et TAT- AS. Les 2 types d'amplicons sont allongés au cours des premiers cycles de PCR puis amplifiés. 3ème étape: les amplicons IRES-TAT sont sous-clonés dans le vecteur PCRII-TOPO et séquencés. 4ème étape: les segments IRES-TAT sont repris par coupures EcoRl et Hpal pour être insérés entre les mêmes sites dans pMV7MCS délété de son bloc Tk-NéoR, pour donner pMV7MCS-IRES-Tat. Construction du bloc IRES-NéoR l ère étape: PCR par chevauchement - PCR1: les segments IRES Hépatite C sont obtenus comme ci-dessus, mais avec les amorces: IRES2-S 5'-ATGCATGACACTCCACCATGAATCACTCC-3' (site Nsil souligné) (SEQ ID NO :30).et IRES-AS 5'-GATGCACGGTCTACGAGACCTCC-3'(SEQ ID NO :31). - PCR2: selon le même principe que ci-dessus, les amorces IRES/NéoR-S 5'-CTCGTAGACCGTGCATCATGATTGAACAAGATGG-3' (SEQ ID NO :32). (segment double souligné = 3' IRES; segment simple souligné = 5' 20 NéoR) et NéoR-AS 5'-AAGCTTCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3' (SEQ ID NO :33). (site Hindlll souligné) servent à amplifier le gène NéoR en utilisant, comme matrice, le pMV7 non délété. - PCR finale: sur le mélange des 2 types d'amplicons obtenus, une 25 3ème PCR est menée avec les amorces IRES2-S et NéoR-AS. 3ème étape: les amplicons IRES-NéoR sont sous-clonés dans le vecteur PCRII-TOPO et séquencés. 4ème étape: les segments IRES-NéoR sont repris par coupures Nsil et Hindlll pour être insérés entre les mêmes sites dans pMV7MCS-IRES-Tat, en 30 aval du bloc IRES-TAT, pour donner le pMV7-2xIRES-Tat-NéoR. Enchaînement final sur le pMV7-2xIRES-Tat-NéoR: LTR5' EcoRI-IRES-TAT-Hpal-Nsil-IRES-NéoR-Hindlll LTR3' Expression de la protéine Tat Des cellules HEK-293 sont transfectées avec la construction pMV7-2xIRES-Tat-NéoR, puis sélectionnées par le G418. La production des ARNm TAT est contrôlée par RT-PCR (One-Step). L'expression de la protéine Tat est vérifiée par Western-Blot sur les extraits cellulaires à l'aide de l'anticorps polyclonal HIV-1 BH10 Tat Antiserum gracieusement fourni par le AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH). Construction du vecteur Tat + Tet 2xinductible dans le vecteur 10 plasmidique pECE (pcPECE-TAR3-tetO) Le vecteur pECE (Ellis, et aI, 1986) contient un ensemble promoteur SV40 et séquence de polyadénylation SV40 encadrant le site multiple de clonage Bglll-Hindlll-Sall-Kpnl-Smal-EcoRl-Sstl-Xbal. Le promoteur SV40 a été délété par les coupures Pvull (blunt) + Bglll et remplacé par bloc le bloc 15 U3-R (3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR) prélevé sur pBlue-U3TAR3tetO par coupures EcoRV (blunt) + BamHl (compatible avec Bglll). Constructions promoteur 2xinductible + gène reporter CD24 murin 1-L'ADNc du CD24 murin (mCD24) a été obtenu par PCR one-step 20 (Quiagen) sur des ARNm extraits de la lignée myélomateuse murine MOPC 315 (ATCC TIB-23) avec les amorces 5'-AACATCTCGAGAGTCGCGCC-3' (site Xhol site sousligné) (SEQ ID NO :34) et 5'-TCTAGAGACGTTTCCAGGCCTGAG-3' (sites Xbal and Stul 25 soulignés) (SEQ ID NO :35). Sous-clonés dans le vecteur plero-Blunt (Invitrogen), les fragments se sont trouvés encadrés par de nouveaux sites de restriction. 2- L'ADNc du mCD24, extrait de plero-Blunt par coupures EcoRV (blunt) + Sstl, a été inséré dans le pPECE-TAR3-tetO en aval du promoteur 30 entre les sites Smal (blunt) et Sstl. 3- L'ADNc du mCD24, extrait de plero-Blunt par coupures Apal + BamHI, a été inséré dans le pcPMAU3TAR3-tetO et dans le pcPMAU3CMV-tetO, en aval du promoteur entre les mêmes sites. 4- L'ADNc du mCD24, extrait de plero-Blunt par coupures Nsil + 5 Hindlll, a été inséré dans le pMV7AU3TAR3-tetO, en aval du promoteur entre les mêmes sites. Résultats d'activité transcriptionnelle des promoteurs originaux pilotant le mCD24 Parmi les différentes constructions décrites ci-dessus, les résultats les 10 plus déterminants ont été obtenus avec les 2 vecteurs rétroviraux auto-inactivants pilotant le mCD24: pcPMAU3TAR3-tetO-CD24 et pMV7AU3TAR3-tetO-CD24. Ces constructions ont été transfectées dans les cellules d'encapsidation GP2-293 (CLONTECH), en utilisant le MBS MAMMALIAN TRANSFECTION KIT. Plusieurs clones de transfectants stables ont ensuite été 15 sélectionnés par le G418 ou la puromycine. A ce stade, une seconde transfection transitoire par le VSV-G (glycoprotéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire) permettait d'obtenir des surnageants capables d'infecter des cellules CEM. Une nouvelle sélection par antibiotique permettait d'obtenir plusieurs clones avec chaque construction. 20 Révélation du mCD24. Le CD24 murin (mCD24), glycoprotéine membranaire du lymphocyte, encore appelé Heat-Stable Antigen (HSA) a été choisi en raison de sa totale neutralité sur le comportement du lymphoblaste T. Ce marqueur est largement utilisé comme gène reporter dans les essais de contôle de production HIV ou d'expression de vecteurs lentiviraux 25 (He, et al, 1995). Le mCD24 était révélé en deux temps, à l'aide de l'anticorps monoclonal de rat anti-souris CD24 5BD (Biosciences Pharmingen) dilué 1:100, puis du réactif Immunoglobulines de lapin anti-rat conjuguées au FITC (Dako) dilué 1:50. Les cellules étaient ensuite analysées en cytométrie de flux sur un FACScan (Becton Dickinson). 30 Induction Tat. Un système de co-culture séparée par membrane semi-perméable (Cell Culture Insert, porosité = 1 micron, Becton Dickinson) a été développé pour permettre cette induction. Des cellules de lignées HEK-293 exprimant la protéine Tat (HIV-1 LAI) établies au laboratoire étaient déposées dans le compartiment inférieur et les CEM pcPMAU3TAR3-tetO-CD24 ou pMV7AU3TAR3-tetO-CD24 dans le compartiment supérieur. L'induction était progressivement obtenue au cours du temps, et 5 maximale à 96h. Notoirement, l'absence de bruit de fond sur les cellules non-induites est totale (Figure 9). Le promoteur TAR3-tetO n'est pas soumis au silencing transcriptionnel. Les CEM pcPMAU3TAR3-tetO-CD24 ont été entretenues 10 en culture pendant plus de 10 mois sans aucun inducteur. L'absence d'expression du marqueur CD24 a été contrôlée durant toute cette période. Environ chaque mois, l'inductibilité a été contrôlée grâce au test de co-culture séparée par membrane semi-perméable. L'expression du marqueur CD24 s'est chaque fois révélée positive à un très haut niveau. 15 Induction HIV-1. L'infection des CEM pcPMAU3TAR3-tetO-CD24 ou pMV7AU3TAR3-tetO-CD24 par le HIV-1 LAI lui-même produisait une induction beaucoup plus importante, progressive, et maximale à partir du 6ème jour après infection. Ici encore, il faut noter l'absence totale de bruit de fond dans les 20 cellules CEM transduites mais non-induites (Figure 10). 25 Références bibliographiques - Adachi, A., H.E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, and M.A. Martin. 1986. Production of acquired immunodeficiency syndromeassociated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 59:284-291. -Berens C and Hillen W. 2003. Gene regulation by tetracyclines. Constraints of resistance regulation in bacteria shape TetR for application in eukaryotes. Eur. 10 J. Biochem. 270:3109-3121 - Centlivre, M., P. Sommer, M. Michel, R. Ho Tsong Fang, S. Gofflo, J. Valladeau, N. Schmitt, F. Thierry, B. Hurtrel, S. Wain-Hobson, and M. Sala. 2005. HIV-1 clade promoters strongly influence spatial and temporal dynamics of viral replication in vivo. J Clin Invest 115:348-358. 15 - Ellis, L., E. Clauser, D.O. Morgan, M. Edery, R.A. Roth, and W.J. Rutter. 1986. Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase activity and uptake of 2-deoxyglucose. Cell 45:721-732. - He, J., S. Choe, R. Walker, P. Di Marzio, D.O. Morgan, and N.R. Landau. 20 1995. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrests cells in the G2 phase of the celi cycle by inhibiting p34cdc2 activity. J. Virol. 69:6705-6711. -Jeeninga, R.E., M. Hoogenkamp, M. Armand-Ugon, M. de Baar, K. Verhoef, and B. Berkhout. 2000. Functional differences between the long terminal repeat 25 transcriptional promoters of human immunodeficiency virus type 1 subtypes A through G. J. Virol. 74:3740-3751. - Kirschmeier, P.T., G.M. Housey, M.D. Johnson, A.S. Perkins, and I.B. Weinstein. 1988. Construction and characterization of a retroviral vector demonstrating efficient expression of cloned cDNA sequences. DNA 7:219- 30 225. Lassen, K., Y. Han, Y. Zhou, J. Siliciano, and R.F. Siliciano. 2004. The multifactorial nature of HIV-1 latency. Trends Mol. Med. 10:525-531. - Li, X.D., B. Moore, and M.W. Cloyd. 1996. Graduai shutdown of virus production resulting in latency is the norm during the chronic phase of human immunodeficiency virus replication and differential rates and mechanisms of shutdown are determined by viral sequences. Virology 225:196-212. -Pelletier, J., and N. Sonenberg. 1988. Internai initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature 334:320-325. - Song, S.K., H. Li, and M.W. Cloyd. 1996. Rates of shutdown of HIV-1 into latency: roles of the LTR and tat/rev/vpu Bene region. Virology 225:377-386. - Telesnitsky, A., and S. Goff. 1997. Reverse transcriptase and the generation of retroviral DNA. In Retroviruses. J. Coffin, S. Hughes, and H. Varmus, editors. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 121-160. - van Opijnen, T., R.E. Jeeninga, M.C. Boerlijst, G.P. Pollakis, V. Zetterberg, M. Salminen, and B. Berkhout. 2004. Human immunodeficiency virus type 1 subtypes have a distinct long terminal repeat that determines the replication rate in a host-cell-specific manner. J. Virol. 78:3675-3683. Revendications 1. Promoteur transcriptionnel, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un acide 5 nucléique comprenant au moins trois sites NF-xB, au moins trois sites SPI et au moins deux sites TAR. 2. Promoteur selon la revendication 1, comprenant trois sites NF-KB, trois sites SPI, deux ou trois sites TAR, et éventuellement un site PEA3. 3. Promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel lesdits sites proviennent de HIV-1. 4. Promoteur selon l'une des revendications précédentes, comprenant en 15 outre un élément conférant une inductibilité à un agent exogène différent d'une protéine Tat. 5. Promoteur selon la revendication 4, l'élément conférant l'inductibilité étant un ou plusieurs éléments TetO2. 6. Promoteur selon la revendication 3, comprenant la séquence SEQ ID NO :1. 7. Vecteur d'acide nucléique, comprenant un promoteur tel que défini dans 25 l'une des revendications 1 à 6, lié de manière opérante à une séquence d'intérêt, qui est une séquence codante ou un siRNA. 8. Vecteur selon la revendication 7, qui est un vecteur retroviral dont les domaines U3-R sont modifiés par ledit promoteur. 10 20 30 9. Vecteur selon l'une des revendications 7 ou 8, comprenant un promoteur tel que défini à la revendication 5 ou 6 comprenant des éléments TetO2, une séquence d'intérêt, et un élément TetR. 10. Vecteur selon l'une des revendications 7 à 9, dans lequel la séquence d'intérêt code pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV, ou capable de détruire le virus et/ou les cellules qui le répliquent. 11. Cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 10. 12. Cellule hôte selon la revendication 11, ledit vecteur étant intégré dans le génome de la cellule de manière stable. 13. Procédé in vitro ou ex vivo d'expression d'une séquence codante d'intérêt, ledit procédé comprenant la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 10, dans des conditions permettant l'induction du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule est cultivée en présence d'une protéine Tat. 15. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 7 à 10, dont le promoteur comprend des éléments TetO2, ledit vecteur comprenant en outre un élément TetR, est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. 16. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini l'une des revendications 7 à 10,dont le promoteur comprend des éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément TetR, et est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. 17. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 7 à 10, contenant un promoteur comprenant trois sites NF-KB et deux ou trois sites TAR, ainsi que sept éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément TetR, et est cultivée en présence de la protéine Tat ainsi que de la tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. 18. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une des revendications 7 à 10, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 19. Utilisation d'un vecteur selon la revendication 10, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection par le virus HIV.20