Brevet FR2887988A1 — publié le 20070105

L'invention concerne une méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles ainsi qu'une trousse de détection permettant la mise en oeuvre de ces méthodes. Elle concerne également une composition pharmaceutique, en particulier pour la thérapie des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles. Les Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles (ESST ou EST) sont des maladies neurodégénératives qui affectent aussi bien l'Homme que certains mammifères. Chez l'Homme, il est fait référence au Kuru, à la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MO) sporadique, au io syndrome de GerstmannStrëussler-Scheinker, et à l'insomnie fatale familiale (IFF). Chez l'animal, les EST naturelles décrites à ce jour sont la tremblante naturelle des ovins et caprins, la maladie du dépérissement chronique des ruminants sauvages, l'encéphalopathie transmissible du vison, l'encéphalopathie spongiforme féline et l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). La tremblante des ovins est connue depuis plus de deux siècles en Europe. L'encéphalopathie spongiforme bovine est apparue en 1985 au Royaume-Uni, puis s'est propagée dans les pays européens, au Japon, au Canada et aux Etats Unis. L'annonce faite en mars 1996 par les autorités du Royaume-Uni précisant que 10 patients britanniques venaient de succomber à une "variante" de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (nvDD) liée à l'ESB, a entraîné une crise de confiance sans précédent des consommateurs et la mise en place de nombreux travaux, afin d'arrêter, sur des bases rationnelles, les mesures de prévention et de contrôle des EST. Ces maladies sont induites par des agents transmissibles aux propriétés biologiques et physicochimiques très atypiques, appelés "prions". Elles se caractérisent toujours par une longue période d'incubation cliniquement silencieuse, pouvant fluctuer entre 10 et 40 ans chez l'Homme, par l'évolution subaiguë du tableau clinique à la phase d'état et par des stigmates neuropathologiques (identifiés lors des examens post- mortem) constitués de l'association d'une spongiose, d'une gliose astrocytaire et d'une mort neuronale plus ou moins prononcée. La nature exacte des agents, à l'origine des EST, fait aujourd'hui l'objet d'un consensus scientifique établi sur de nombreuses preuves 2887988 2 expérimentales, directes ou indirectes. Elle est associée uniquement à l'une des protéines de l'hôte, la PrPc (protéine prion cellulaire), sous une forme anormale, résistante partiellement à la digestion protéolytique, la PrPres (protéine prion résistante) ou encore ci-après dénommée PrPrst (pour protéine prion associée aux EST). Le pouvoir infectieux associé à ces protéines prion EST s'est révélé extrêmement résistant aux procédés d'inactivation connus et mis en oeuvre pour inactiver les microorganismes pathogènes (virus, bactéries, levures). L'identification, à ce jour, de plus de 165 cas de nvCJD souligne io bien l'aptitude de ces protéines prions infectieuses à franchir les barrières d'espèces et à se propager essentiellement par voie orale lors de la consommation d'aliments contaminés. Les problèmes de santé publique, associés et posés par la prévention de la dissémination de ces agents, au travers des actes médicaux et chirurgicaux, sont particulièrement difficiles à surmonter compte tenu, entre autres: de l'absence de test de dépistage des individus infectés (et donc de l'impossibilité d'estimer la prévalence de l'infection) et de la longueur inhabituelle de la phase asymptomatique ainsi que de la résistance extrême de ces agents infectieux aux procédés physiques et chimiques retenus dans la routine des laboratoires spécialisés en infectiologie. A ce jour, le diagnostic des EST, de certitude, repose sur la recherche des lésions neuronales, au mieux sur la détection immunologique de la Prpres lors d'un examen post-mortem. Cette même recherche de la PrP' est encore possible, mais plus aléatoire, pour certaines EST (nvCJD et tremblante), à partir de l'examen des tissus lymphoïdes (plaques de Peyers, ganglions, rate, amygdales) prélevés par biopsie. De plus, la recherche très active des stigmates de l'infection, en périphérie c'est-à-dire dans les fluides biologiques accessibles (sang, liquide céphalorachidien (LCR), urine...), est aujourd'hui restée vaine. De nombreuses approches se sont avérées infructueuses. Citons les plus marquantes: - la mesure compétitive de la PrPres fondée sur l'électrophorèse 35 capillaire (MJ Schmerr USDA), - la mesure de marqueurs sériques indirects par spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier (P. Latsch et M. Beekes, Berlin, Germany), - le test de fluorescence épiconfocale repéré SIFT (Kreschmar, 5 Germany), - le test PMCA, fondé sur l'amplification in vitro de la PrP', proposé en 2001 par Claudio Soto de la société Serono. A ce jour, ces méthodes et les tests prototypes associés se sont avérés insuffisamment sensibles et/ou non appropriés au regard du io problème posé. Le problème est d'une acuité renouvelée, au regard des risques encourus, via la transmission sanguine. En effet, cette voie de contamination initialement supposée est aujourd'hui avérée et établie sur un faisceau convergent de preuves expérimentales et sur l'identification de deux premiers cas humains probables en Angleterre en 2004. Les experts responsables de l'hémovigilance ne peuvent aujourd'hui appréhender le risque exact, en l'absence d'une étude précise de la prévalence des infections sub-cliniques ou des porteurs asymptomatiques, après l'exposition prolongée aux contaminations ESB. Le nombre de cas avérés de nvCJD est très éloigné des résultats de l'étude rétrospective de la présence de la PrPres dans la population anglaise, effectuée à partir de l'examen de 12000 échantillons d'appendices et/ou d'amygdales (prévalence estimée à 237 cas par million). Ces sujets, rappelons le, n'expriment aucune manifestation clinique de la maladie, contractée de longue date. Ils peuvent être la source de contaminations subséquentes iatrogènes, par le don de sang ou d'organes, ou encore, par contamination d'instruments chirurgicaux, utilisés lors des interventions sur leurs tissus qui hébergent la PrPres Une autre insuffisance au plan du dépistage des EST chez les animaux d'élevage, et notamment chez les bovins, relève de la politique préventive et des abattages "en aveugle" des cheptels (ou des cohortes d'âge) lorsqu'un individu du cheptel (ou de la cohorte d'âge) est diagnostiqué comme infecté par l'ESB, à l'abattage. En l'absence de tout test de dépistage fiable et praticable, en particulier ante-mortem, sur un échantillon prélevé simplement, le principe de précaution entraîne l'abattage obligatoire de tous les animaux du troupeau, ou, au minimum, 2887988 4 de tous les animaux de la même cohorte d'âge, et cela, tout en sachant qu'au plus 1 à 2 % des animaux sont réellement infectés. Ces abattages massifs qui perdurent sont d'un coût très élevé et extrêmement dommageable pour les éleveurs. L'invention vise donc à fournir une méthode permettant de déterminer si un sujet (humain ou animal) est infecté et, en particulier susceptible de transmettre la pathologie par l'une ou l'autre des voies évoquées sans avoir à pratiquer un examen post-mortem des tissus lymphoïdes et neuronaux. io A cet effet l'invention propose une méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles comprenant la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique prélevé chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 5 - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, s - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX: protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 6 - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. L'invention propose également, dans une première variante, une méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles chez des animaux en phase de neuro-invasion comprenant io la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 7 - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX: protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. 2887988 8 L'invention propose encore, dans une seconde variante, une méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de réplication périphérique comprenant la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique prélevé chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 9 - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Préférablement dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins deux desdits biomarqueurs. Plus préférablement, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins trois desdits biomarqueurs. Encore plus préférablement, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins quatre desdits biomarqueurs. Toujours plus préférablement, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins cinq desdits biomarqueurs. De préférence, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins six desdits biomarqueurs. Encore de préférence, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins sept desdits biomarqueurs. Toujours de préférence, dans la méthode de l'invention et toutes ses variantes, on détecte au moins huit desdits biomarqueurs. 2887988 10 Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins neuf desdits biomarqueurs. Encore selon un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins dix desdits biomarqueurs. Toujours selon un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins onze desdits biomarqueurs. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins douze desdits biomarqueurs. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins treize desdits biomarqueurs. Selon toujours un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins quatorze desdits biomarqueurs. Selon un mode de mise en oeuvre préférable de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins quinze desdits biomarqueurs. Selon un mode de mise en oeuvre également préférable de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins seize desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins les dixsept desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins dix-huit desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins dix-neuf desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins vingt desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la 5 méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins vingt-et-un desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins vingt-deux desdits biomarqueurs. io Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins vingt-trois desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de toutes ses variantes, on détecte au moins 15 vingtquatre desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de sa première variante, on détecte au moins vingt-cinq desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la 20 méthode de l'invention et de sa première variante, on détecte au moins vingt-six desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de sa première variante, on détecte au moins vingt-sept desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention et de sa première variante, on détecte au moins vingt-huit desdits biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention, on détecte au moins vingt neuf desdits 30 biomarqueurs. Mais encore, selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode de l'invention, on détecte les trente dits biomarqueurs. La méthode selon l'invention et toutes ses variantes est avantageusement mise en oeuvre sur du sang provenant du sujet à tester. 2887988 12 Plus préférablement, elles sont mises en oeuvre sur du sérum provenant du sujet à tester. Mais elles peuvent également être mises en oeuvre sur du plasma, ou du liquide céphalorachidien, ou de l'urine, ou de la salive, ou de la moelle osseuse, ou de la moelle épinière, ou un échantillon de rate, ou un échantillon d'amygdale, ou encore un échantillon de ganglion lymphoïde, ou tous tissus ou liquides biologiques, provenant du sujet à tester. Quant au sujet à tester, il peut être un ovin, en particulier un mouton, ou un caprin, en particulier une chèvre, ou un bovin, en io particulier une vache, ou un cervidé, ou un félidé, ou un primate humain ou non humain, ou tout autre vertébré. L'invention propose également une trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs selon l'invention. L'invention propose aussi, dans une première variante, une trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de neuro-invasion, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs selon la première variante de la méthode de l'invention. L'invention propose également, dans une seconde variante, une trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de réplication périphérique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs selon la seconde variante de la méthode de l'invention. De préférence, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins deux desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Egalement de préférence, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins trois desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. 2887988 13 Aussi de préférence, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins quatre desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Toujours de préférence, la trousse selon l'invention et toutes ses 5 variantes comprend au moins cinq desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins six desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. io Encore préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins sept desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Toujours préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins huit desdites sondes biologiques, en 15 particulier desdits anticorps. Plus préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins neuf desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Toujours plus préférablement, la trousse selon l'invention et 20 toutes ses variantes comprend au moins dix desdites sondes biologiques, enparticulier desdits anticorps. Encore plus préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins onze desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Egalement plus préférablement, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins douze desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. De manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins treize desdites sondes biologiques, en 30 particulier desdits anticorps. Encore de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins quatorze desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. 2887988 14 Toujours de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins quinze desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Egalement de manière préférée, la trousse selon l'invention et 5 toutes ses variantes comprend au moins seize desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins dix-sept desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. io Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins dix-huit desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins dix-neuf desdites 15 sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins vingt desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon 20 l'invention et toutes ses variantes comprend au moins vingt-et-un desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins vingt-deux desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins vingt-trois desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et toutes ses variantes comprend au moins vingt-quatre 30 desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et sa première variante comprend au moins vingt-cinq desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. 2887988 15 Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et sa première variante comprend au moins vingt-six desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon 5 l'invention et sa première variante comprend au moins vingt-sept desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention et sa première variante comprend au moins vingt-huit desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. io Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention comprend au moins vingt-neuf desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. Encore également de manière préférée, la trousse selon l'invention comprend les trente desdites sondes biologiques, en particulier 15 les trente dits anticorps. L'invention propose encore une composition pharmaceutique pour la thérapie des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles qui comprend au moins une protéine biomarqueur selon l'invention. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comprendre, en plus ou en combinaison avec l'une des protéines biomarqueurs de l'invention, au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une de ces protéines biomarqueurs. Les analogues, dérivés, et fragments, qu'ils soient synthétiques ou naturels, des protéines biomarqueurs de l'invention ou de leurs sondes biologiques, en particulier leurs anticorps pourront être également utilisés pour fabriquer une composition pharmaceutique, en particulier pour le traitement des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles que ce soit seul ou en combinaison les uns avec les autres ou en combinaison avec les protéines biomarqueurs de l'invention. Les protéines, leurs fragments, leurs analogues et dérivés et les anticorps entrant dans la composition pharmaceutique de l'invention pourront être d'origine naturelle ou synthétique. L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et 35 caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la 2887988 16 description qui suit et qui est faite en référence aux figures dans lesquelles: - la figure 1 représente les courbes ROC multimarqueurs généralisée et empirique obtenues à partir des pics protéiques de 9 395 Da, 8450 Da, 6830 Da, 4030 Da, et 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, apparaissant dans le sérum du groupe de moutons infectés en phase de réplication périphérique, en comparaison aux mêmes pics apparaissant dans le sérum du groupe des moutons de contrôle, io - la figure 2 représente les courbes ROC multimarqueurs généralisée et empirique obtenues à partir des pics protéiques de 12235 Da, 8450 Da, 7690 Da, 7555 Da et 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, apparaissant dans le sérum du groupe de moutons en phase de neuro-invasion, en comparaison aux mêmes pics apparaissant dans le sérum du groupe des moutons de contrôle, -la figure 3 représente les courbes ROC multimarqueurs généralisée et empirique obtenues à partir des pics protéiques de 9395 Da, 7590 Da, 6830 Da, 4030 Da, et 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, apparaissant dans le sérum du groupe de moutons infectés en phase de réplication périphérique, en comparaison aux mêmes pics apparaissant dans le sérum du groupe des moutons de contrôle, - la figure 4 représente les courbes ROC multimarqueurs généralisée et empirique obtenues à partir des pics protéiques de 13670 Da, 12235 Da, 8450 Da, 7690 Da, et 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, apparaissant dans le sérum du groupe de moutons infectés en phase de neuro-invasion, en comparaison aux mêmes pics apparaissant dans le sérum du groupe des moutons de contrôle. Lors de la contamination par voie orale, c'est-à-dire après la consommation d'aliments contaminés, la Prpres infecte les cellules des plaques de Peyers. Elle est alors transportée jusqu'aux organes lymphoïdes comme la rate, la moelle osseuse, les ganglions lymphoïdes et les amygdales soit par des cellules du système lymphoïde soit au travers du système nerveux par migration rétro-axonale. Dans les organes lymphoïdes, elle entraîne la transformation de la protéine prion cellulaire 2887988 17 (PrP), constituant normal de certains types cellulaires, en PrPres selon un mode encore obscur à ce jour. Cette phase est appelée dans ce qui suit et ce qui précède "phase de réplication périphérique". Puis, la PrPres est transportée jusqu'au système nerveux central (SNC) où elle s'y accumule dans certaines zones privilégiées et entraîne la mort neuronale relevée à l'examen post-mortem. Cette phase est appelée dans ce qui suit et ce qui précède "phase de neuro-invasion". Ce phénomène induit, en périphérie, des modifications au niveau des marqueurs directement ou indirectement reliées au processus io pathologique. L'agent pathogène est encore disséminé secondairement du SNC en périphérie par les fibres nerveuses motrices dans de nombreux tissus, y compris dans les muscles. On précisera que la détection de la Prpres au niveau des tissus lymphoïdes est avérée chez le mouton mais pas chez la vache. Pour cette raison, on parle, dans ce qui suit et ce qui précède, de "phase de réplication périphérique" pour désigner la phase de réplication au sens large, c'est-à-dire incluant ou non une phase de réplication de la PrP' au niveau lymphoïde. La protéine PrPres, agent des EST, peut être détectée au niveau des organes lymphoïdes, après un acte chirurgical qui ne peut pas être décidé pour un diagnostic de routine, notamment chez les donneurs de sang. Il est de loin préférable de rechercher les stigmates de l'infection en périphérie dans les fluides biologiques aisément accessibles. L'invention a consisté à identifier par spectrométrie de masse SELDI MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) un ou plusieurs marqueurs biologiques circulants spécifiques de la pathologie, autres que la protéine PrP', et à développer secondairement des dosages plus simples, dont un immunodosage de ces marqueurs à l'aide des anticorps appropriés. Et on a découvert que l'on pouvait établir un profil protéique corrélé et reflétant le processus pathologique des maladies à prion. Ce profil protéique a, dans un premier temps, été déterminé à partir du sang des moutons, infectés par l'agent de la tremblante. 2887988 18 Le protocole utilisé est le suivant: Echanti//ons Chez les ovins, une dizaine de génotypes du gène de la protéine prion sont connus, avec des informations plus détaillées concernant le polymorphisme pour cinq codons parmi lesquels trois codons (correspondant aux acides aminés situés aux positions de la séquence protéique 136, 154 et 171) influencent la sensibilité de l'animal à la io tremblante naturelle. Par convention, on ne considérera ci-après que ces trois codons qui seront désignés par leurs acides aminés correspondants. Ces acides aminés sont désignés à l'aide du symbole à une lettre. Ainsi, on distingue: - les moutons ayant le génotype ARR/ARR, de race Romanov, provenant du troupeau Langlade (Toulouse, France) qui sont des moutons résistants à l'infection naturelle (100 % à 2 ans et au-delà), les moutons ayant le génotype VRQ/VRQ, de race Romanov, provenant du troupeau Langlade (Toulouse, France) qui sont des moutons sensibles à l'infection naturelle (98 % des animaux sont infectés dès 2 mois) et 100%à6mois, et - les moutons ayant le génotype VRQ/VRQ, de races Cheviot et Dorset, provenant de Nouvelle-Zélande, qui sont des moutons sensibles à l'infection naturelle mais exempts de l'agent pathogène PrPres (appelés communément TSE free), et qui ne développent pas la pathologie. Les moutons de génotype ARR/ARR, de race Romanov, et les moutons de génotype VRQ/VRQ, de races Cheviot et Dorset, ont été retenus comme contrôles. Ces moutons sont appelés dans ce qui suit et ce qui précède "moutons de contrôle", quels que soient leur race et leur génotype. Les moutons de génotype VRQ/VRQ, de race Romanov, ont été utilisés pour détecter les marqueurs de la pathologie chez les moutons en phase de réplication périphérique ou chez les moutons en phase de neuroinvasion. 2887988 19 Ces moutons sont appelés dans ce qui suit et ce qui précède "moutons infectés", en précisant, le cas échéant, la phase de la maladie. En effet, on distingue deux phases de la pathologie. La première est une phase de réplication de la PrPres en périphérie ou phase de réplication périphérique. Durant cette phase, il est possible de révéler la présence de PrPres dans différents organes chez les moutons de génotype VRQJVRQ, de race Romanov. On la détecte au niveau des plaques de Peyers, des cellules folliculaires dendritiques et des macrophages chez les moutons âgés de 3 mois, puis au niveau des autres io organes lymphoïdes. Durant cette phase, on observe une atteinte partielle du SNC vers 10 mois. Les animaux durant cette phase sont appelés dans ce qui suit et ce qui précède "moutons infectés en phase de réplication périphérique". L'atteinte partielle du SNC est le début de la seconde phase. Durant cette phase, on observe une atteinte globale du SNC à 16 mois. La mort de l'animal survient en général entre 18 et 24 mois selon les cohortes. Durant cette phase, les premiers symptômes corrélés à la pathologie vont apparaître (troubles du comportement alimentaire, animaux à l'écart du troupeau, troubles locomoteurs, raideur de l'arrière, prurits, perte de la laine). Ces symptômes apparaissent à partir de 17 mois. Les animaux dans cette phase sont appelés dans ce qui suit et ce qui précède "moutons infectés en phase de neuro-invasion". Un total de 194 échantillons de sérums provenant de moutons a été utilisé. 101 animaux étaient infectés, parmi lesquels 46 animaux étaient en phase de neuro-invasion et 55 animaux étaient en phase de réplication périphérique, 65 animaux étaient des animaux de contrôle de race Romanov chez lesquels l'absence de la pathologie a été vérifiée cliniquement et 24 animaux étaient des animaux de contrôle néo-zélandais de race Cheviot, 7 animaux étaient des animaux de contrôle néo-zélandais de race Dorset. L'âge des animaux étudiés était compris entre 7 et 95 mois. 2887988 20 Pour les animaux de contrôle de race Romanov, 4 étaient âgés de 95 mois, 2 de 82 mois, 4 de 83 mois, 1 de 77 mois, 4 de 53 mois, 8 de 52 mois, 1 de 47 mois, 1 de 41 mois, 1 de 28 mois, 1 de 16 mois, 28 de 14 mois et 7 de 7 mois. Pour les animaux en phase de neuro-invasion, 10 étaient âgés de 19 mois, 10 de 16 mois, 18 de 14 mois et 8 de 13 mois. Quant aux animaux en phase de réplication périphérique, 20 étaient âgés de 10 mois et 35 de 7 mois. Les 31 animaux de contrôle néo-zélandais de race Cheviot et de io race Dorset étaient tous âgés de 6 à 9 mois. Traitement des échantillons Le sang est collecté sur un tube sec, une coagulation est effectuée 15 pendant 30 minutes à 37 C. Une forte centrifugation permet la séparation du sérum, qui est immédiatement congelé à 20 C. De préférence, l'échantillon de sérum de mouton est préparé avant la détection des biomarqueurs. Typiquement, la préparation implique le fractionnement de l'échantillon et la collecte des fractions déterminées comme contenant les biomarqueurs. Les méthodes de préfractionnement incluent la chromatographie d'échanges d'ions. Cette méthode est utile pour simplifier l'échantillon pour une analyse ultérieure. Tous les échantillons sont fractionnés par une chromatographie d'échange d'anions qui permet la séparation grossière des protéines dans un échantillon selon leurs caractéristiques de charges. Dans l'invention, une résine échangeuse d'anions Q est utilisée (Q hyper DF Ciphergen) et l'échantillon peut être séquentiellement élué avec des éluants ayant différents pH. La chromatographie échangeuse d'anions permet la séparation, dans un échantillon, des biomolécules qui sont chargées plus 35 négativement que d'autres types de biomolécules. 2887988 21 Les protéines qui sont éluées avec un éluant ayant un pH élevé sont susceptibles d'être faiblement chargées négativement, et une fraction qui est éluée avec un éluant ayant un faible pH est susceptible d'être fortement chargée négativement. Pour le fractionnement du sérum, un kit de Ciphergen a été utilisé. microlitres (pl) de sérum sont ajoutés à chaque puits d'une microplaque standard à 96 puits, l'échantillon est dénaturé par addition de 30 pi d'un mélange d'urée 9 M, de CHAPS à 2 % (un détergent non ionique), et de Tris-HCI 50 mM pH 9. io Puis ces 50 pl sont ajoutés dans une microplaque, contenant dans chaque puits, des billes de Q hyper DF ayant préalablement été réhydratées avec 200 pl de tris-HCI 50 mM pH 9 (3 fois) puis équilibrées avec de l'urée 1 M, du CHAPS à 0,2 %, du tris-HCI 50 mM, pH 9 (3 fois). De façon à lier l'échantillon sur les billes de Q hyper DF, 50 pl d'urée 1 M, de CHAPS à 0,2 %, de Tris-HCI 50 mM, pH 9 sont ajoutés aux 50 pl de l'échantillon dénaturé. Le mélange est incubé pendant 30 mn à 4 C sous agitation. Pour collecter la fraction à pH 9, 100 pl de tris-HCI 50 mM, de noctyl glucopyranoside (OGP) à 0,1 % pH 9, sont ajoutés à chaque puits de la plaque de filtration et sont collectés dans une microplaque à 96 puits marquée F1, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'utilisation ultérieure. Pour collecter la fraction à pH 7, 200 pl d'Hepes 50 mM, d'OGP à 0,1 % pH 7, sont ajoutés dans chaque puits de la plaque de filtration et sont collectés dans une microplaque à 96 puits marquée F2, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'utilisation ultérieure. Pour collecter la fraction à pH 5, 200 pl d'acétate de sodium 100 mM et d'OGP à 0,1 % pH 5, sont ajoutés dans chaque puits de la plaque de filtration et sont collectés dans une microplaque à 96 puits marquée F3, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'une utilisation ultérieure. Pour collecter la fraction à pH 4, 200 pl d'acétate de sodium 100 mM et d'OGP à 0,1 % pH 4, sont ajoutés dans chaque puits de la plaque de filtration et sont collectés dans une microplaque à 96 puits 2887988 22 marquée F4, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'une utilisation ultérieure. Pour collecter la fraction à pH 3, 200 pI de citrate de sodium 50 mM avec de l'OGP à 0,1 % pH 3 sont ajoutés dans chaque puits de la plaque de filtration et sont collectés dans une microplaque à 96 puits marquée F5, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'utilisation ultérieure. Pour collecter la fraction organique, les billes sont lavées par addition de 200 pl d'isopropanol à 33,3 %, d'acétonitrile à 16,7 %, d'acide trifluoroacétique à 0,1 %, dans chaque puits de la plaque de filtration et io sont collectées dans une microplaque à 96 puits marquée F6, les échantillons sont conservés à -20 C en vue d'une utilisation ultérieure. Analyses sur puces, par /a méthode SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization 77me of F/ight--Mass Spectrometry, 15 Ophergen), des protéines Le dispositif utilisé est la puce à protéine CM 10 (échangeur de cation faible, Ciphergen). Les puces sont prétraitées avec 5 pI d'acétate de sodium 0,1 M, pH 4, 2 fois. 5 pl de chaque fraction sont dilués dans 5 pl d'acétate de sodium 0,1 M pH 4 puis les 10 pl sont déposés sur chaque spot d'une puce à protéine de type CM10 et incubés pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation douce. Les spots sont lavés 2 fois pendant 5 minutes en utilisant 5 pl d'acétate de sodium 0,1 M pH 4, suivi par un rinçage rapide dans de l'eau désionisée. Après un séchage à l'air, l'acide sinapinique (SPA, Ciphergen), préparé selon les instructions du fabricant, est appliqué sur chaque spot, en tant que matrice pour permettre l'analyse par spectrométrie de masse. Chaque puce est ensuite introduite dans un spectromètre de masse PBS-II SELDI TOF. L'analyse des protéines fixées sur chaque spot est réalisée à l'aide du logiciel SELDI 3.2.1 (Ciphergen). On obtient alors un profil protéique en fonction des masses moléculaires et des charges (m/z) des protéines. Les données collectées sont le résultat de la moyenne de 60 tirs laser avec une intensité de 260 et une sensibilité de détecteur de 9, la valeur du détecteur de volts étant fixée à 1900 Volts. 2887988 23 Bioinformatiques et statistiques Le système de logiciel WIZARD ProteinChip Ciphergen (Ciphergen) est utilisé pour étudier les pics présents sur les spectres obtenus dont l'intensité est normalisée en fonction du courant ionique total. Les pics de masse qualifiée (signal/bruit 4; fenêtre de masse d'agglomération à 0,3 %) dans l'intervalle de m/z de 2-30 kDa ont été sélectionnés automatiquement. La précision sur la valeur de masse est de +/- 50 Da, de préférence io +/30 Da, le plus préférablement +/- 10 Da. Résultats Les résultats de ces essais montrent que certaines protéines apparaissent sur les spectres avec des pics d'intensités différentes, lorsque l'on compare les sérums des moutons infectés avec les sérums des moutons de contrôle. En effet, seuls ont été retenus les pics protéiques dont la présence était détectable dans le sérum de tous les animaux quels que soient la race et leur génotype mais dont l'intensité différait selon qu'ils provenaient du sérum d'un mouton infecté ou d'un mouton de contrôle. Les protéines correspondant aux pics sélectionnés sont donc les biomarqueurs circulants permettant de détecter les EST dans leurs différentes phases. Les résultats sont traités par la méthode d'analyse statistique SAM (Statistical Analysis of Microarray). Dans cette méthode, on attribue un score aux différences d'intensité constatées par rapport à la déviation standard. Cette valeur est notée dans ce qui suit score SAM. Les pics présentant un score SAM plus important qu'un seuil donné sont significatifs. Le choix de ce seuil est effectué par ajustement d'un paramètre (désigné delta). Ce seuil est fixé en fonction du taux de faux positifs (FDR pour Fold Discover Rate) exprimé par la q value. Des analyses statistiques supplémentaires ont été effectuées sur les pics préalablement sélectionnés par la méthode SAM. Ces analyses consistaient en le calcul des valeurs médianes et moyennes des intensités, des 2887988 24 coefficients de variation et des rapports moyens des intensités au sein de la population étudiée. Pour chacun des biomarqueurs, on calcule également le "Fold Change", noté FC dans ce qui suit, qui est la valeur du rapport de la moyenne des intensités mesurées dans la population des moutons infectés à la moyenne des intensités mesurées dans la population des moutons de contrôle. Les résultats de ces analyses ont permis de montrer que les biomarqueurs circulants permettant de détecter les EST dans leurs io différentes phases sont les suivants: - biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/Da, - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 25 - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX: protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et 2887988 26 - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Parmi ces trente protéines biomarqueurs, les vingt-huit protéines biomarqueurs qui permettent de différencier les animaux infectés en phase de neuro-invasion, des animaux de contrôle sont les suivants: biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, io - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poidsmoléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 27 - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX: protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Parmi les trente protéines biomarqueurs identifiées, les vingt-quatre protéines biomarqueurs qui permettent de différencier les animaux infectés en phase de réplication périphérique, des animaux de contrôle sont les suivants: - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 28 biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 29 - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. En effet, l'intensité de ces biomarqueurs diffère selon que l'animal est non infecté, infecté, en phase de neuro-invasion ou en phase de réplication périphérique. L'intensité des pics correspond ici à la hauteur du pic qui est 15 représentative, de manière semi-quantitative, de la concentration de la protéine dans l'échantillon. Il ne s'agit pas ici de mesurer la concentration réelle en protéine dans l'échantillon testé mais de comparer cette concentration à celle obtenue, dans les mêmes conditions, dans un échantillon provenant d'un sujet de contrôle. Le pic protéique peut être surexprimé chez l'animal infecté, c'est-à-dire que l'intensité de ce pic est supérieure chez l'animal infecté à celle du même pic chez les animaux de contrôle. Il peut également être sous exprimé chez l'animal infecté, c'est-à-25 dire que l'intensité de ce pic est inférieure chez l'animal infecté à celle détectée chez les animaux de contrôle. Par surexpression dans le cadre de ces essais, on entend une variation supérieure ou égale à 30 % de l'intensité du pic chez l'animal infecté par rapport au même pic chez les animaux de contrôle. Cette 3o valeur de 30 % est le seuil maximum d'erreur lié à la méthode utilisée ici. Cette valeur n'est pas la valeur du FC qui, elle, tient compte de la moyenne des intensités relevées chez plusieurs animaux infectés. Cette moyenne peut donc être inférieure à la variation de l'intensité du pic concerné chez un seul animal à tester en comparaison aux moutons de contrôle. 2887988 30 Les résultats en terme de surexpression ou de sousexpression de l'intensité de chaque pic biomarqueur ainsi que les principaux résultats statistiques de l'analyse de ce pic sont regroupés au tableau 1 suivant: Biomarqueurs Poids variation Animaux infectés (n=101) moléculaire Phase de réplication Phase de neuro-invasion périphérique (n=55) (n=46) q-val Score FC q-val Score FC SAM SAM I 27450 SUR X X X 0,0456 2,90 1,50 _ _ II 22120 SUR 0,0012 3,09 3,48 0,0035 3,03 3,60 III 22080 SUR 0,0012 6,98 2,52 0,0035 6,42 2,43 _ IV 22040 SOUS X X X 0,1414 -1,47 1,28 _ 13670 SUR _ _ 1,27 0,0035 4,39 1, 44 V 0,0012 2,59 VI 12235 SOUS _ X X 0,0456 -3,42 1,52 X _ 12030 SOUS _ _ 1,21 0,0456 -3,29 1,46 VII 0,1913 -0,97 VIII 9425 SUR 0, 2317 0,294 1,15 0,0456 3,37 1,44 _ IX 9395 SUR _ 1,11 1,69 X X X X 9185 SUR _ 3,62 1,57 0,0035 2,55 1,37 XI 9180 SOUS 0,0012 -3,9 1,4 0,0035 -6,07 1,62 XII 8450 SOUS _ -0,64 1,59 0, 0456 -2,58 1,94 _ 0,1913 XIII 8350 SUR _ 0,913 1,14 0,0876 2,08 1,17 _ 0, 0382 _ XIV _ 7690 SUR 0,0012 3,75 1,58 0,0035 5,45 1,71 XV 7590 SUR 0,0012 6,40 2,69 0,0035 4,43 2,47 XVI 7555 SUR _ 5,37 1,83 0,0035 5,27 1,96 _ XVII 7475 SUR 0,1324 0,544 1,64 X X X XVIII 7435 SOUS _ -5,75 1,73 0,0035 -10,06 2,62 XIX 6830 SUR _ 4,24 1,70 0,0035 7,49 2,90 _ 0,0012 XX 6815 SUR _ X X 0,0035 5,35 1,55 X XXI 5990 SOUS _ X X 0,0456 -3,01 1,79 X XXII 5590 SOUS _ X X 0,0456 -2,56 1,43 _ X _ XXIII 4575 SUR 0,0012 5,74 3,68 0,0035 6,23 3,06 XXIV 4250 SOUS 0,0012 13,9 3,60 0,0035 -3,45 2,50 XXV 4030 SUR 0,0382 2,44 1,63 0,1771 1,83 1, 18 XXVI 3920 SUR 0,1324 0,58 1,17 0,0876 2,21 1,35 _ X(VII 3915 SOUS 0,0012 -14,33 3,90 0,0035 -13,31 4,06 XXVIII 3895 SOUS 0, 1913 -0,75 1,35 0,0456 -1,99 1,65 )CXIX 3830 SUR 0,0012 5,21 2,80 0,0035 4,95 2,82 XXX 3780 SOUS 0,0012 -11,2 3,23 0,0035 -11,84 3,93 Tableau 1 2887988 31 On a ensuite effectué des analyses par courbes ROC multimarqueurs de certain groupe de pics sélectionnés par l'analyse qui précède, pour confirmer s'ils sont bien significatifs. Les courbes ROC sont une illustration graphique de la relation réciproque entre la sensibilité et la spécificité d'un test pour différentes valeurs utilisées. L'aire sous la courbe ROC, notée AUC dans les figures, est une estimation de l'efficacité globale du test, le test étant d'autant plus discriminant que son AUC est proche de 1. Les courbes obtenues sont représentées aux figures 1 à 4. io Ainsi, la figure 1 représente les courbes ROC multimarqueurs des pics protéiques de 9 395 Da, 8450 Da, 6830 Da, 4030 Da, et 3915 Da +/-50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Ces courbes montrent que cette combinaison de pics permet de classer avec une spécificité de 74,2 % et une sensibilité de 85,5 %, les moutons en phase de réplication périphérique par rapport aux moutons de contrôle. Dans ce cas, l'aire sous la courbe AUC est égale à 0,846. La figure 2 montre les courbes ROC multimarqueurs des pics protéiques de 12235 Da, 8450 Da, 7690 Da, 7555 Da, et 6830 Da +/-50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Ces courbes montrent que cette combinaison de pics permet de classer avec une spécificité de 69,9 % et une sensibilité de 95,7 %, les moutons infectés en phase de neuro-invasion par rapport aux moutons de contrôle. Dans ce cas, l'aire sous la courbe AUC est égale à 0,880. La figure 3 montre les courbes ROC multimarqueurs des pics protéiques de 9395 Da, 7590 Da, 6830 Da, 4030 Da, et 3915 Da +/-50 Da, de préférence +/30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. Ces courbes montrent que cette combinaison de pics permet de classer avec une spécificité de 81,7 % et une sensibilité de 76,4 %, les moutons infectés en phase de réplication périphérique par rapport aux moutons de contrôle. Dans ce cas, l'aire sous la courbe AUC est égale à 0,862. La figure 4 montre les courbes ROC multimarqueurs des pics protéiques de 13670 Da, 12235 Da, 8450 Da, 7690 Da, et 7555 Da +/-50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. 2887988 32 Ces courbes montrent que cette combinaison de pics permet de classer avec une spécificité de 78,5 % et une sensibilité de 87 %, les moutons infectés en phase de neuro-invasion par rapport aux moutons de contrôle. Dans ce cas, l'aire sous la courbe AUC est égale à 0,892. Des résultats identiques ont été obtenus sur des échantillons d'intestin, de rate, de moelle osseuse, de ganglion lymphoïde, d'amygdale, de liquide céphalorachidien, d'urine et de tissu neuronal. Les mêmes essais ont été réalisés sur des bovins infectés expérimentalement et les résultats obtenus étaient identiques. Ces résultats ont été également vérifiés sur des êtres humains. Une fois les protéines d'intérêt détectées, elles ont été identifiées. Trois méthodes principales d'identification peuvent être utilisées. La première des méthodes est l'électrophorèse bidimensionnelle suivie d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionisation time of flight). L'électrophorèse bidimensionnelle consiste à séparer les protéines par focalisation isoélectrique (IEF) selon leur point isoélectrique (pI) et dans une deuxième direction, perpendiculaire à la première, selon leur masse moléculaire. Les protéines présentes dans l'échantillon à analyser doivent être dénaturées et complètement solubilisées dans le tampon qui servira à l'électrofocalisation et qui contient: - de l'urée pour solubiliser et déplier la plupart des protéines et rendre les groupes ionisables accessibles, - du CHAPS, un détergent non ionique, pour assurer une complète solubilisation et prévenir de l'agrégation due à des interactions hydrophobes, - du dithiothréitol (DU), un agent réducteur qui rompt les ponts disulfures et maintient les protéines dans un état réduit, - des ampholytes correspondant aux pH désirés pour définir le gradient de pH lorsqu'on appliquera le courant et pour augmenter la solubilité des protéines en minimisant leur agrégation due aux charges électrostatiques mises en présence. Lors de la première dimension les protéines de l'échantillon sont séparées selon leur point isoélectrique: les protéines chargées 2887988 33 positivement migrent à travers le gradient de pH vers la cathode en perdant au fur et à mesure leurs charges positives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu'elles atteignent leur pI; les protéines chargées négativement migrent, à travers le gradient de pH, vers l'anode en perdant au fur et à mesure leurs charges négatives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu'elles atteignent leur pI. Lors de la deuxième dimension, on effectue une électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécylsulfate (SDS) et ici la migration n'est pas déterminée par les charges électriques des protéines io mais par leur masse moléculaire. Le SDS est un agent anionique qui se fixe sur les protéines, masquant la charge propre des protéines, en formant un complexe anionique ayant une charge nette négative. Le SDS rompt les ponts hydrogènes, bloque les interactions hydrophobes et déplie partiellement les protéines. Les protéines sont totalement dépliées et réduites par addition de DTT et alkylées par addition d'iodoacétamide. Le gel de polyacrylamide sert de tamis moléculaire, la présence des protéines est révélée soit par coloration au bleu de coomassie (Coomassie Bio-Safe, Bio-Rad) soit par coloration à l'argent. La distance de migration du polypeptide-SDS est proportionnelle au logarithme de sa masse moléculaire et varie en fonction de la concentration en polyacrylamide du gel. Les protéines d'intérêt dont nous connaissons les masses moléculaires sont identifiées à partir du gel de deuxième dimension et il s'agit alors d'effectuer la découpe des tâches de 1 à 3 mm3 à l'aide d'un scalpel. Un fragment de gel ne contenant aucune protéine est également prélevé et utilisé ultérieurement comme témoin négatif. Une étape de lavage à l'eau distillée puis avec du tampon carbonate d'ammonium (NH4+HCO3-)/ acétonitrile permet d'éliminer l'acrylamide non polymérisé et permet la décoloration des tâches. Les fragments de gel se contractent ensuite en présence d'acétonitrile pur et ils sont ensuite séchés afin d'éliminer tout trace d'acétonitrile. Afin de pouvoir analyser et rechercher la protéine d'intérêt dans les banques de données disponibles (Gene bank, Swiss Prot....), cette dernière subit une digestion trypsique en gel, on obtient alors des peptides correspondants, couvrant une partie ou la séquence entière de la 2887988 34 protéine. L'enzyme de digestion, la trypsine coupe les résidus basiques Lysine ou Arginine des protéines. Les fragments de gel sont réhydratés avec le minimum de tampon de digestion composé de tampon carbonate d'ammonium à 25mM et de trypsine à une concentration finale comprise entre 0,02pg/pl et 0,05pg/pl. La digestion est effectuée à une température de 37 C durant toute une nuit. L'analyse de l'échantillon par MALDI-TOF est réalisée après homogénéisation des peptides dans du tampon carbonate d'ammonium 25mM, TFA 0,1% (acide trifluoroacétique), acétonitrile 60%. Le io surnageant est récupéré, concentré par centrifugation sous vide et analysé par spectrométrie de masse type MALDI-TOF. La deuxième de ces méthodes est l'électrophorèse bidimensionnelle suivie d'identification par SELDI-TOF (surface enhanced laser desorption ionisation-time of flight). Le protocole effectué est identique à celui mené pour l'identification des protéines par MALDI-TOF, la seule différence réside dans l'analyse des peptides sur les puces MALDI ou SELDI. La troisième de ces méthodes est une méthode par HPLC en phase inverse (chromatographie liquide haute performance en phase inverse) suivie d'une identification par LC MS-MS (analyse en spectrométrie double masse) L'HPLC en phase inverse est une chromatographie d'adsorption ayant pour but de séparer les protéines d'un mélange à analyser. L'HPLC utilise une pression produite par une pompe pour pousser la phase mobile à travers la phase stationnaire de la colonne. Cette chromatographie d'adsorption inverse utilise la différence d'hydrophobicité des constituants du mélange à analyser. La phase stationnaire est constituée par un support de silice greffé par des chaînes aliphatiques de plusieurs atomes de carbones (C8 à C18). Les séparations sont fondées sur des interactions hydrophobes entre les molécules à séparer et la phase stationnaire. Les protéines sont détectées par leur absorbance à 220nm qui correspond au maximum d'absorbance de la liaison peptidique. De plus un peptide polaire sera moins retenu qu'un peptide plus hydrophobe. La purification de l'échantillon par HPLC permet ainsi de récupérer 35 sous forme de fractions les différentes protéines ou peptides élués dans 2887988 35 un tampon acétonitrile/TFA. Les différentes fractions sont concentrées par centrifugation sous vide puis analysées par la suite en SELDI-TOF. Cette dernière étape permet de confirmer la présence de la protéine d'intérêt dans telle ou telle fraction grâce à son poids moléculaire. A partir de cette fraction, on a isolé les protéines d'intérêt. Cependant, ce sont les différentes fractions qui sont ensuite analysées par LC-MSMS. Cette méthode d'analyse par spectrométrie de masse très sensible convient parfaitement lors d'identification de protéines faiblement 10 représentées au sein d'échantillons divers. Les anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, spécifiques des protéines biomarqueurs ou des fragments des protéines biomarqueurs de l'invention sont obtenus par immunisation d'animaux (généralement des lapins ou des souris) avec les protéines biomarqueurs d'intérêt, ou leurs fragments. Après immunisation d'animaux avec l'antigène, on obtient du sérum contenant un mélange d'anticorps (ou anticorps polyclonaux) sécrétés par les cellules B présentes dans les organes lymphoïdes. Chaque cellule B sécrète une seule espèce d'anticorps. Il est possible d'immortaliser chaque cellule B par hybridation somatique avec une cellule tumorale (lignée de myélome non sécrétant). Par clonage de ces hybrides somatiques, on obtient des hybridomes dérivés chacun d'une seule cellule hybride et produisant une seule espèce moléculaire d'anticorps, appelés anticorps monoclonaux. Les souris peuvent être immunisées par voie intrapéritonéale et/ou souscutanée. Plusieurs immunisations peuvent être effectuées avec une immunisation massive (boost) effectuée 3 ou 4 jours avant la fusion lymphocytaire. La rate (organe lymphoïde) est prélevée et les splénocytes sont fusionnés avec les cellules myélomateuses par addition de polyéthylèneglycol. La suspension cellulaire est cultivée en milieu sélectif contenant de l'aminoptérine, un inhibiteur de la voie de néosynthèse des nucléotides. Dans ces conditions les cellules myélomateuses meurent, alors que les hybrides survivent par utilisation de la voie alterne, intacte dans les splénocytes. 2887988 36 Les cellules font l'objet d'un clonage par ensemencement d'une cellule par puits et on détermine dans chaque surnageant la présence d'immunoglobulines et la spécificité de l'anticorps monoclonal en utilisant habituellement un panel d'antigènes connus pour posséder ou non les épitopes d'intérêt. Les hybridomes retenus font l'objet d'un deuxième clonage. Ces anticorps sont ensuite utilisés dans un test ELISA pour démontrer la faisabilité de la méthode de détection et de diagnostic de l'invention. io Ainsi, la méthode de détection des EST de l'invention comprend la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique prélevé chez le sujet à tester, ce biomarqueur étant l'un des trente biomarqueurs identifiés précédemment. Une fois détecté, la concentration de ce biomarqueur chez le sujet humain ou animal à tester est comparée à celle du même biomarqueur chez un sujet humain ou animal de contrôle. Dans l'invention on entend par "concentration" non pas la concentration absolue et réelle mais la concentration détectée et mesurée par la méthode voulue. En effet, ce que l'on veut déterminer est une variation de concentration, par rapport à un échantillon provenant d'un sujet de contrôle dont la concentration aura été mesurée dans les mêmes conditions. Ici, la concentration est obtenue de manière semi quantitative en 25 mesurant l'intensité du pic. Si le biomarqueur détecté présente une variation d'intensité peu significative par rapport au même biomarqueur dans un échantillon provenant d'un animal sain, une autre protéine sera alors à détecter et à quantifier et ainsi de suite jusqu'à l'établissement du diagnostic. De préférence, tous les biomarqueurs seront détectés et leur concentration sera comparée avec la concentration de ces mêmes biomarqueurs dans un échantillon d'un sujet sain. L'invention propose également une trousse, permettant la mise en oeuvre de la méthode de détection de l'invention, qui comprend au moins 35 une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence 2887988 37 spécifiquement, à l'une des protéines décrites ci-dessus et, de préférence, à l'ensemble des sondes biologiques, en particulier des anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à chaque protéine selon l'invention, qui permet la mise en oeuvre de la méthode de détection de l'invention, dans toutes ses variantes. Par sonde biologique, on entend toute espèce moléculaire capable de se lier de façon spécifique au biomarqueur d'intérêt ou à un de ses fragments. Cette méthode et cette trousse permettent de détecter rapidement 10 et de façon fiable et précise tout sujet contaminé, symptomatique ou non, hébergeant la protéine PrPfes Ainsi par une analyse simple, et rapide, on pourra déterminer au préalable les animaux contaminés et à éliminer d'un troupeau, on pourra également très rapidement lors du contrôle vétérinaire décider quels animaux peuvent être introduits dans la chaîne alimentaire. Egalement et façon plus importante, le sang de tout donneur humain pourra être testé avant d'être utilisé pour une transfusion sanguine. De même, le test pourra être appliqué avant le prélèvement 20 d'organes en vue de leur greffe ultérieure. De plus, les protéines biomarqueurs de l'invention pourront être utilisées pour la fabrication d'une composition pharmaceutique, en particulier pour la thérapie des EST. Ainsi, cette composition pharmaceutique pourra être un vaccin comprenant au moins une des protéines biomarqueurs de l'invention ou au moins un fragment de celles-ci ou au moins un analogue ou au moins un dérivé d'une de ces protéines ou encore un mélange de au moins une protéine biomarqueur de l'invention et, d'au moins un de ses dérivés et/ou analogues. La protéine, son fragment, son analogue et son dérivé pourront être d'origine synthétique ou naturelle. La composition pharmaceutique de l'invention pourra être également utilisée pour traiter au moins un symptôme des EST. Dans ce cas, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend au moins une des protéines biomarqueurs de l'invention ou au moins un fragment de cellesci ou au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps 2887988 38 se liant, de préférence spécifiquement, à cette au moins une protéine biomarqueur ou fragment de celle-ci. Elle pourra également comprendre un mélange d'au moins une protéine biomarqueur de l'invention ou fragment de celle-ci et d'au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à au moins une autre ou la même protéine biomarqueur de l'invention. Les analogues et dérivés des protéines biomarqueurs de l'invention et les sondes biologiques, en particulier ses anticorps, qu'ils soient d'origine synthétique ou naturelle, pourront être également utilisés, seuls io ou en mélange entre eux ou avec les protéines biomarqueurs et/ou les anticorps de celles-ci. Enfin, la composition pharmaceutique de l'invention pourra être utilisée pour le traitement curatif des EST. Dans ce cas, elle comprendra de préférence au moins une des protéines biomarqueurs de l'invention ou un fragment de celles-ci ou une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à au moins une des protéines biomarqueurs de l'invention ou à un fragment de celles-ci ou un mélange de ces composés. Les analogues ou dérivés, synthétiques ou naturels, de ces protéines et anticorps pourront également être utilisés, seuls ou en mélange entre eux ou en mélange avec les protéines biomarqueurs de l'invention et/ou les anticorps de ces protéines. Les bénéfices apportés par l'invention sont donc immenses. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation qui ont été décrits et qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemples. En effet, la méthode de détection des biomarqueurs de l'invention pourra être effectuée par toutes autres méthodes que celles décrites et de la même façon les anticorps pourront être obtenus par toutes autres méthodes que celles décrites, bien connue dans l'art. C'est dire que l'invention comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont effectuées suivant son esprit. 39 REVENDICATIONS 1. Méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles comprenant la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique prélevé chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/Da, io - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da + /- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 40 - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. 2. Méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de neuro-invasion comprenant la 2887988 41 détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur I: protéine ayant un poids moléculaire de 27450 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, io - biomarqueur IV: protéine ayant un poids moléculaire de 22040 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VI: protéine ayant un poids moléculaire de 12235 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 42 - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XX: protéine ayant un poids moléculaire de 6815 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXI: protéine ayant un poids moléculaire de 5990 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXII: protéine ayant un poids moléculaire de 5590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, et - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. 3. Méthode de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de réplication périphérique comprenant la détection d'au moins un biomarqueur dans un échantillon biologique prélevé chez le sujet à tester, caractérisée en ce que le au moins un biomarqueur est au moins une protéine choisie dans le groupe suivant: - biomarqueur II: protéine ayant un poids moléculaire de 22120 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur III: protéine ayant un poids moléculaire de 22080 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 43 - biomarqueur V: protéine ayant un poids moléculaire de 13670 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VII: protéine ayant un poids moléculaire de 12030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur VIII: protéine ayant un poids moléculaire de 9425 Da +/- 50 Da, de préférence + /- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur IX: protéine ayant un poids moléculaire de 9395 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur X: protéine ayant un poids moléculaire de 9185 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XI: protéine ayant un poids moléculaire de 9180 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XII: protéine ayant un poids moléculaire de 8450 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIII: protéine ayant un poids moléculaire de 8350 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIV: protéine ayant un poids moléculaire de 7690 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XV: protéine ayant un poids moléculaire de 7590 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVI: protéine ayant un poids moléculaire de 7555 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVII: protéine ayant un poids moléculaire de 7475 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 7435 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XIX: protéine ayant un poids moléculaire de 6830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIII: protéine ayant un poids moléculaire de 4575 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIV: protéine ayant un poids moléculaire de 4250 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXV: protéine ayant un poids moléculaire de 4030 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, 2887988 44 - biomarqueur XXVI: protéine ayant un poids moléculaire de 3920 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVII: protéine ayant un poids moléculaire de 3915 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXVIII: protéine ayant un poids moléculaire de 3895 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXIX: protéine ayant un poids moléculaire de 3830 Da +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da, - biomarqueur XXX: protéine ayant un poids moléculaire de 3780 Da io +/- 50 Da, de préférence +/- 30 Da, plus préférablement +/- 10 Da. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'on détecte au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize, dix-sept, dix-huit, dix-neuf, vingt, vingt-et-un, vingt-deux, vingt-trois, de préférence vingt-quatre desdits biomarqueurs. 5. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'on détecte au moins vingt-cinq, vingt-six, vingt-sept, de préférence 20 vingt-huit desdits biomarqueurs. 6. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détecte au moins vingt-neuf, de préférence les trente dits biomarqueurs. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est du sang. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est du plasma. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est du sérum. 2887988 45 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est du liquide céphalorachidien. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le sujet est un ovin. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le sujet est un bovin. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le sujet est un primate. 14. Trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles, caractérisée en qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs citées en revendication 1. 15. Trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de neuro-invasion, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs citées en revendication 2. 16. Trousse de détection des encéphalopathies spongiformes subaiguës transmissibles en phase de réplication périphérique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à l'une des protéines biomarqueurs citées en revendication 3. 17. Trousse selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize, dix- sept, dix-huit, dix-neuf, vingt, vingt-et-un, vingt-deux, vingttrois, et de 2887988 46 préférence vingt-quatre desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. 18. Trousse selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins vingt-cinq, vingt-six, vingt-sept et de préférence vingt-huit desdites sondes biologiques, en particulier desdits anticorps. 19. Trousse selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle io comprend au moins vingt-neuf, de préférence, les trente desdites sondes biologiques, en particulier les trente dits anticorps. 20. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un biomarqueur selon la revendication 1 et/ou au is moins un fragment de celles-ci et/ou au moins une sonde biologique, en particulier un anticorps se liant, de préférence spécifiquement, à au moins un desdits biomarqueurs selon la revendication 1, et/ou au moins un analogue synthétique ou naturel et/ou au moins un dérivé synthétique ou naturel, de ladite sonde biologique, en particulier dudit biomarqueur ou dudit anticorps.