Brevet FR2897063A1 — publié le 20070810

La présente invention concerne l'utilisation de nouveaux antigènes identifiés chez le parasite Trichinella dans le cadre du diagnostic et de la prévention de la trichinellose. La trichinellose est une zoonose associée à la consommation de viande infestée par le parasite Trichinella (MURRELL et al., 2000). Ce nématode de la classe des Adenophorea appartient à la famille des Trichinellidae laquelle comprend 8 espèces et 3 génotypes apparentés en 2 groupes phylogénétiquement distincts : d'une part les trichines encapsulées (T. spiralis; T. nativa; T. britovi; T. murrelli; T. nelsoni) qui infestent les mammifères, et d'autre part les trichines non-encapsulées (T. pseudospiralis; T. papuae; T. zimbabwensis) qui infestent les mammifères, les oiseaux et les reptiles (GASSER et a1., 2004). Toutes ces espèces peuvent infester l'homme. Le cycle biologique du parasite est auto-hétéroxène : il se déroule entièrement chez un même hôte qui est successivement hôte définitif (porteur de parasites adultes) et hôte intermédiaire (porteur de larves infestantes) (BOIREAU et a1., 2002). Le passage des larves infestantes d'un hôte à un autre est nécessaire pour la réalisation d'un nouveau cycle. Ce passage se fait par ingestion de viande crue ou peu cuite contaminée par les larves. Au cours de la digestion, celles-ci sont libérées, et pénètrent dans l'épithélium intestinal où elles vont muer en vers adultes (Ad) sexués. Les femelles fécondées expulsent ensuite des larves Ll Nouveau-Nées (L1NN) qui gagnent les muscles striés via la circulation lymphatique et sanguine. Ces larves L1NN pénètrent dans les cellules musculaires (stade de développement infestant L1M : Larve Ll Musculaire) dont elles provoquent la dédifférenciation en cellules nourricières entourées d'une capsule de collagène protectrice épaisse dans le cas des trichines encapsulées, très fine dans le cas des trichines dites non-encapsulées. Alors que la trichinellose est asymptomatique chez l'animal, l'infestation humaine se traduit durant la phase intestinale initiale par des diarrhées associées à des nausées, vomissements et de violentes douleurs abdominales, alors que les symptômes liés à la phase d'invasion musculaire se caractérisent par l'association fièvre, œdème de la face et myalgies (CAPO & DESPOMMIER, 1996). Des atteintes oculaires, pulmonaires, gastro-intestinales, cardiaques et neurologiques peuvent venir compléter ce tableau clinique de la trichinellose dont l'évolution peut être mortelle. Le caractère chronique de l'infestation, marqué par la persistance de douleurs musculaires chez les patients, est associé à la survie du parasite au sein de la cellule nourricière. Le traitement spécifique des trichinelloses humaines par des anthelminthiques est d'autant plus efficace que le diagnostic de l'infestation est posé précocement pour permettre une action contre tous les stades parasitaires et surtout avant la formation de la capsule protectrice de collagène autour des larves L1M (FOURESTIE et al., 1988). Les données épidémiologiques ont démontré une distribution géographique du parasite sous toutes les latitudes associée à un mode de transmission impliquant de nombreuses espèces de la faune sauvage qui entretiennent aussi un cycle d'infestation domestique principalement représenté par le porc (DUPOUY-CAMET, 2000). Les épidémies de trichinellose sumaine, zoonose émergente ou ré-émergente, constituent un véritable problème de santé publique à travers le monde en raison des habitudes alimentaires et des contrôles sanitaires pas toujours efficaces (MURRELL & POZIO, 2000). Ces épidémies impliquent essentiellement la viande de porc et de sanglier ainsi que celle de cheval (BOIREAU et al., 2000). La prévention de la contamination humaine passe donc par une cuisson à cœur de la viande et l'amélioration des conditions d'élevage et/ou de contrôle des trichinelloses animales (porc, cheval, sanglier et autres espèces animales sauvages sensibles à Trichinella) (BOIREAU et al., 2002). Les techniques de dépistage de la trichinellose se divisent en deux catégories : 1) la détection directe des larves L1M, par trichinoscopie (observation microscopique d'un fragment de viande), ou après digestion artificielle 3 d'échantillons de muscles, et 2) la détection indirecte par différentes méthodes immunologiques, permettant de détecter des anticorps dirigés contre les antigènes de Trichinella. A chacun des stades de développement du parasite : adulte (Ad), larve nouveau-née (L1NN), et larve musculaire (L1M), correspond un profil antigénique particulier. Ce sont des préparations antigéniques issues de larves du stade L1M qui sont actuellement utilisées pour l'immunodiagnostic. En effet, les fractions antigéniques des deux stades précoces Ad et L1NN sont difficiles à purifier, et des antigènes immunodominants associés à l'un et/ou l'autre de ces deux stades n'avaient pas pu être identifiés jusqu'à présent. On utilise principalement soit des préparations d'antigène total soluble, obtenues par lyse des larves, centrifugation du lysat, et récupération du surnageant, soit plus fréquemment, des antigènes d'excrétion/sécrétion (antigènes E/S). Les antigènes d'excrétion-sécrétion sont produits lors de la mise en survie des larves LiM dans un milieu de culture ; ils proviennent d'un organe particulier, dénommé le stichosome, qui est constitué d'une cinquantaine de cellules discoïdes, les stichocytes. Les stichocytes contiennent des granules dont le contenu est évacué par un canalicule dans la lumière de l'oesophage du parasite. Ce contenu qui est très fortement antigénique, constitue une partie des antigènes d'excrétion sécrétion. Ces antigènes forment un mélange complexe de protéines, contenant notamment un groupe de glycoprotéines (dénommées antigènes TSL1) portant une molécule glucidique particulière, connue uniquement chez Trichinella et présente chez toutes les espèces de ce parasite, le beta-tyvelose. Les préparations d'antigènes d'excrétion- sécrétion qui sont actuellement utilisées comme référence en matière d'immunodiagnostic de la trichinellose sont obtenues à partir de milieu de culture de larves LiM de Trichinella spiralis. Après 18 à 20 heures de culture, le milieu est récupéré par filtration, puis concentré (GAMBLE et al., 1983; GAMBLE et al., 1988). Les préparations d'antigène total soluble ont comme principal inconvénient leur manque de spécificité. Des réactions antigéniques croisées avec d'autres parasitoses sont fréquemment observées. Les antigènes d'excrétion-sécrétion permettent d'obtenir une meilleure spécificité. Cependant, dans les deux cas, il est délicat de produire en quantité importante des lots standardisés d'antigène. La structure saccharidique contenant du betatyvelose, qui représente un épitope immunodominant des préparations d'antigène E/S (REASON et al., 1994; Brevets US 5541075 et 5707817) a été synthétisée chimiquement, son utilisation pour l'immunodiagnostic de Trichinella a été proposée. Ce réactif présente une bonne spécificité, mais que celle des synthèse de cette lourde à 20 mettre en oeuvre. Un autre problème rencontré dans le cadre du diagnostic sérologique de Trichinella est l'existence d'une fenêtre aveugle de détection correspondant aux stades précoces de l'infestation, qui se traduit par des résultats 25 faussement négatifs. En outre, chez le cheval, une disparition progressive des anticorps a été observée 25 semaines après infestation. Les Inventeurs ont entrepris d'identifier des antigènes immunodominants associés aux stades précoces de 30 l'infestation par Trichinella, et utilisables pour le diagnostic sérologique de la trichinellose, afin de fournir des moyens d'obtenir une détection précoce, spécifique, et sensible des infestations à Trichinella, aussi bien chez l'homme que chez les animaux. Dans ce but, ils ont recherché 35 s'il existait, parmi les produits des gènes exprimés par Trichinella au stade L1NN et/ou au stade Ad, des protéines qui posséderaient les propriétés antigéniques souhaitées. Dans ce cadre, ils ont découvert qu'une protéine de Trichinella spiralis, qui fait partie des protéines sa sensibilité apparaît plus faible préparations d'antigène E/S. En outre, la structure par voie chimique demeure coûteuse et exprimées spécifiquement au stade L1NN chez cet organisme, constituait un antigène immunodominant, permettant une détection précoce de la réponse humorale dirigée contre Trichinella et qu'elle était en outre conservée entre différentes espèces de Trichinella. Cette protéine sera dénommée ci-après NBL1. La séquence d'ADNc codant pour cette protéine ainsi que la séquence polypeptidique déduite sont accessibles sur Genbank sous le numéro AF331160 et AAK16520; ces séquences sont annotées comme sérine protéase SS2, spécifique des larves nouvelles nées . Ces séquences sont également respectivement reproduites dans le listage de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2. Les Inventeurs ont en outre montré que l'immunoréactivité associée à la réponse humorale dirigée contre NBL1 était localisée sur la partie C-terminale de cette protéine, et identifié un épitope immunodominant responsable de cette réactivité. D'autre part, les Inventeurs ont identifié, à partir d'une banque d'ADNc des stades précoces mélangés Ad+L1NN de T. spiralis un nouveau gène, dénommé ciaprès 411. La séquence de ce gène est représentée dans le listage de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3, et celle de son produit de traduction sous le numéro SEQ ID NO: 4. Ce produit de traduction de ce gène est apparenté (78,7% d'identité) à un antigène E/S, dénommé protéine Tp21-3, identifié chez T. pseudospiralis (AAF79206 ; NAGANO et al., 2001), ainsi qu'au produit de traduction de l'ORF 17.20 hypothétique de T. spiralis (AAB48489), avec lequel il présente 86,6% d'identité. Le produit de traduction du gène 411 permet également de détecter à un stade précoce, la réponse humorale dirigée contre différentes espèces de Trichinella. En outre chacun des antigènes NBL1 et 411 a permis, lors des essais effectués, de détecter des animaux infestés par Trichinella qui n'étaient détectés ni par l'autre antigène, ni par l'antigène E/S, au moins pendant la période J15-J30 post-infestation (pi). L'association de l'antigène NBL1 (ou d'un épitope immunodominant de celui-ci) avec l'antigène 411 permet donc d'améliorer la sensibilité du diagnostic, notamment aux stades précoces de l'infestation (15 à 20 jours après l'infestation). La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un polypeptide antigénique reconnu par des anticorps anti-Trichinella comme réactif pour la détection d'anticorps anti-Trichinella dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce que ledit polypeptide est choisi parmi : a) un polypeptide comprenant un épitope immunodominant de l'antigène NBL1, lequel épitope est défini par la séquence PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5); b) un polypeptide, également dénommé ci-après antigène 411, comprenant les acides aminés 25-175 de la séquence SEQ ID NO: 4 (qui représentent la forme mature de la protéine 411), ou comprenant une séquence présentant au moins 80%, et par ordre de préférence croissante, au moins 85%, 90%, ou 95% d'identité avec la séquence des acides aminés 25- 175 de la séquence SEQ ID NO: 4. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de détection de la présence d'anticorps anti-Trichinella dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs polypeptide(s) a) et/ou un ou plusieurs polypeptide(s) b), tels que définis ci-dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les anticorps anti-Trichinella éventuellement présents dans ledit échantillon ; - la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé. Généralement, ledit prélèvement biologique est un prélèvement de sérum. Il peut être obtenu à partir de tout sujet (mammifères, oiseau ou reptile) appartenant à une espèce pouvant être infestée par Trichinella, et chez lequel on souhaite détecter la présence de ce parasite. Avantageusement, il s'agit d'un prélèvement obtenu à partir 7 d'un mammifère, par exemple d'un animal d'élevage, ou d'un patient humain. Avantageusement, on utilise un mélange, comprenant un ou plusieurs polypeptide(s) a) et/ou un ou plusieurs polypeptide(s) b) tels que définis ci-dessus. Cette association permet notamment d'élargir le spectre de réactivité, par rapport à chacun des polypeptides utilisé individuellement. Les polypeptides a) définis ci-dessus, à l'exclusion de l'antigène NBL1 entier identifié par le numéro d'accès Genbank AAK16520, font également partie, en tant que tels, de l'objet de la présente invention. Parmi ces polypeptides conformes à l'invention, on citera notamment les polypeptides contenant une ou plusieurs des séquences suivantes la séquence : PSSGSRPTYPSSGSR (SEQ ID NO: 6); la séquence PSSGSRPTYPYTGSR (SEQ ID NO: 7); la séquence RPTSPSSGSRPTYPS (SEQ ID NO: 8). Ceci englobe par exemple des fragments de la région C-terminale de l'antigène NBL1 : on citera notamment les fragments comprenant la séquence suivante : PSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 9) qui correspond aux acides aminés 363-409 de la séquence SEQ ID NO: 2, et, plus particulièrement, les fragments comprenant la séquence suivante : SRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPY TGSRPT (SEQ ID NO: 10) qui correspond aux acides aminés 349-415 de la séquence SEQ ID NO: 2; et, de manière particulièrement avantageuse, les fragments contenant la séquence suivante, ENSPEGTVKWASKEDSPVDLSTASRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSR PTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYPYTGSRPTPQKPVFPSYQKYPPAVQKYIDSLPSGTQGTLE YTVTQNGVTTTT (SEQ ID NO:11) qui correspond aux acides aminés 326-459 de la séquence SEQ ID NO: 2. Les polypeptides b) définis ci-dessus, à l'exception de ceux identifiés par les numéros d'accès GenBank AAF79206 et AAB48489 font partie, en tant que tels, de l'objet de la présente invention. Des polypeptides préférés sont notamment le polypeptide de séquence SEQ ID NO: 4, ou le polypeptide correspondant aux acides aminés 25-175 de la séquence SEQ ID NO: 4, ainsi que les polypeptides présentant au moins 90%, ou de préférence au moins 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, ou avec la séquence des acides aminés 25-175 de la séquence SEQ ID NO: 4. La présente invention englobe notamment des polypeptides chimériques comprenant une ou plusieurs copies 10 de la séquence PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5), ou d'un fragment de l'antigène NBL1 contenant cette séquence et/ou une ou plusieurs copies d'un polypeptide b) tels que définis ci-dessus, éventuellement fusionnés à une ou plusieurs autres séquence(s) hétérologue(s). La présente invention a également pour objet les polynucléotides codant pour les polypeptides conformes à l'invention, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant lesdits polynucléotides, et des cellules-hôtes transformées par lesdits vecteurs. La présente invention a également pour objet une composition comprenant un ou plusieurs polypeptide(s) a) et un ou plusieurs polypeptide(s) b), tels que définis ci-dessus, ainsi qu'une composition comprenant un ou plusieurs polynucléotide(s) codant pour le(s)dit(s) polypeptide(s). Les polypeptides a) et b) définis ci-dessus peuvent être utilisés dans le cadre de différentes méthodes de détection d'anticorps, qui sont connues en elles-mêmes. A titre d'exemples, on citera notamment les méthodes de type ELISA (direct, indirect ou sandwich), les méthodes de 30 microagglutination sur billes, ainsi que les méthodes de transfert électrophorétique couplé à un immunomarquage. La présente invention a également pour objet un nécessaire pour la détection de la présence d'anticorps anti- Trichinella dans un échantillon biologique, caractérisé en ce 35 qu'il comprend un ou plusieurs polypeptide(s) a) et/ou un ou plusieurs polypeptide(s) b) tels que définis ci-dessus, et, le cas échéant, des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation 15 20 25 9 d'un complexe antigène/anticorps, et, optionnellement, des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps. Avantageusement, ledit nécessaire comprend un polypeptide a) et/ou un polypeptide b) tels que définis ci- dessus, immobilisé(s) sur un support solide. A titre d'exemples non-limitatifs de supports solides utilisables, on citera des plaques de microtitration, des billes, des microbilles ou microparticules, des bandelettes, etc.... Ledit nécessaire peut également comprendre des échantillons de référence, tels qu'un ou plusieurs sérum(s) négatif(s) et un ou plusieurs sérum(s) positif(s). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide a) ou d'un polypeptide b), tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'anticorps 15 spécifiquement dirigés contre ledit polypeptide. Ces polypeptides peuvent être utilisés dans le cadre de différentes méthodes, connues en elles-mêmes, de préparation d'anticorps. Ils peuvent par exemple (éventuellement après addition d'un adjuvant approprié) être 20 utilisés pour l'immunisation d'un animal. Ils peuvent également être greffés sur un support de chromatographie d'affinité, afin de permettre de purifier, à partir d'un liquide biologique, les anticorps spécifiquement dirigés contre le polypeptide concerné. Le liquide biologique peut 25 être par exemple le sérum d'un animal préalablement immunisé avec le polypeptide concerné, ou un surnageant d'hybridome ; il peut s'agir également du sérum d'un animal infesté par Trichinella à partir duquel on souhaite isoler une sous-population d'anticorps spécifiquement dirigés contre le 30 polypeptide concerné. La présente invention englobe également tout anticorps spécifiquement dirigé contre un polypeptide a) ou un polypeptide b) tels que définis ci dessus. Il peut s'agir d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Des anticorps 35 préférés sont ceux reconnaissant l'épitope PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5). Des anticorps spécifiquement dirigés contre un polypeptide peuvent être obtenus par diverses techniques connues en elles-mêmes, et notamment par les méthodes lo classiques comprenant l'immunisation d'un animal avec le polypeptide concerné (éventuellement additionné d'un adjuvant approprié), et la récupération de son sérum (pour la production d'anticorps polyclonaux), ou de ses cellules lymphocytaires(pour la production d'anticorps monoclonaux). Les polypeptides a) et b) définis ci-dessus, ainsi que les polynucléotides codant pour ces polypeptides peuvent être utilisés pour la préparation de compositions immunogènes, et notamment de vaccins anti-Trichinella. La présente invention a également pour objet une composition immunogène, comprenant un ou plusieurs polypeptide(s) a) et/ou un ou plusieurs polypeptide(s) b) tels que définis ci dessus, ou un ou plusieurs polynucléotide(s) codant pour le(s)dit(s) polypeptide(s), associé(s) à un ou plusieurs adjuvant(s) permettant d'améliorer la réponse immunitaire. Selon un mode de réalisation préféré d'une composition immunogène conforme à l'invention, il s'agit d'un vaccin. Une grande variété d'adjuvants permettant d'augmenter l'immunogénicité des peptides sont connus en eux mêmes de l'homme de l'art : on citera, à titre d'exemples d'adjuvants, l'alum (hydroxyde d'aluminium), l'adjuvant complet ou incomplet de Freund (AIF), les liposomes, ainsi que les virosomes (enveloppes virales reconstituées), les dérivés peptidiques de l'acide muramique, etc. Dans le cas d'un vaccin, on choisira bien entendu un adjuvant pharmacologiquement acceptable ; à titre d'exemples d'adjuvants préférés on citera des adjuvants de type émulsion eau dans l'huile , par exemple les adjuvants commercialisés par la société SEPPIC sous les dénominations MONTANIDE ISA 70 et MONTANIDE ISA 775, et qui sont également décrits dans les Brevets EP 480 982, EP 825 875, US 5422109, US 6251407, US 6610309. Le cas échéant, notamment dans le cas de peptides courts (- 11 l'albumine du sérum bovin (BSA), l'ovalbumine, l'anatoxine tétanique ou diphtérique. On peut également former une composition multiépitopique, en associant plusieurs copies d'un même peptide entre elles, et éventuellement avec d'autres épitopes peptidiques, sous forme de polypeptides chimériques, ou par l'intermédiaire d'une chaîne polymérique, par exemple une polylysine. Si l'on utilise comme immunogène un polynucléotide, la composition immunogène peut se présenter sous forme d'un vecteur recombinant dans lequel est (sont) inséré(s) le (les) polynucléotide(s) à administrer. On peut utiliser par exemple des vecteurs viraux tels que les poxvirus, les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les herpesvirus, et les AAV (adeno-associated virus), etc.... Elle peut également se présenter sous la forme d'une bactérie non-pathogène, transformée par un ou plusieurs vecteurs d'expression contenant le(s)dit(s) polynucléotide(s). On peut également administrer directement le (les) polynucléotide(s), sous forme d'ADN nu, ou l'incorporer dans des liposomes. Dans le cas d'un vaccin, on utilisera de préférence une bactérie non-pathogène (par exemple un lactobacille, ou une souche non pathogène d'Escherichia coli ou de Salmonella suis), ou un vecteur dérivé d'une souche virale vaccinale ; par exemple un vecteur dérivé d'une souche vaccinale du virus de la 2.5 pseudorage (maladie d'Aujeszky). La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'utilisation des antigènes NBL1 et 411, pour l'immunodiagnostic précoce de la 30 trichinellose. Légende des figures Figure 1 : Séquence de la protéine THX-NBL1(Cterm). La séquence provenant de NBL1 est indiquée en caractères gras et les séquences provenant du plasmide pET102 sont indiquées 35 en italique. Figure 2 : Immunoréactivité de la protéine THX-NBLl(Cterm). M: Marqueur de poids moléculaires ; 1 : sérum de porc négatif ; 2 : sérum de porc expérimentalement infesté par 20000 LiM de T. spiralis. 12 Figure 3 : Comparaison des cinétiques d'apparition des anticorps anti-Trichinella détectés par ELISA THX-NBL1(Cterm) ou par ELISA Ag E/S dans des sérums de porcs infestés par T. spiralis. A : Détection par ELISA THX-NBL1(Cterm) ; B : Détection par ELISA Ag E/S En abscisse : nombre de jours après infestation ; en ordonnée : pourcentage de réactivité. Le seuil de détection des ELISA est marqué d'un trait noir (44% pour l'ELISA THX- NBLl(Cterm) et 14% pour l'ELISA Ag E/S). La moyenne et les écarts-types du rapport échantillon/contrôle positif sont indiqués pour chaque groupe de porcs infestés. Figure 4 : Spécificité de l'ELISA NBL1(Cterm). En abscisse : cohorte de 230 échantillons négatifs provenant de porcs industriels ou de porcs plein air. Les 5 échantillons positifs proviennent de sérums de porcs expérimentalement infestés. Le seuil est égal à 2 fois la valeur moyenne des échantillons négatifs. En ordonnée : pourcentage de réactivité. Figure 5 : Séquence de la protéine THX-411. La séquence provenant de 411 est indiquée en caractères gras. Les séquences provenant du plasmide sont indiquées en italique. Figure 6 : Immunoréactivité de la protéine THX-411. 1: sérum positif 50j pi; 2: sérum positif 30j pi; 3: sérum négatif -5j; 4: contrôle conjugué. M: Marqueur de poids moléculaires. Figure 7 : Comparaison des cinétiques d'apparition des anticorps anti-Trichinella détectés par ELISA THX-411 ou par ELISA Ag E/S dans des sérums de porcs infestés par T. spiralis. A : Détection par ELISA THX-411 ; B : Détection par ELISA Ag E/S En abscisse : nombre de jours après infestation ; en ordonnée : pourcentage de réactivité. Le seuil de détection des ELISA est marqué d'un trait noir (52% pour l'ELISA THX-411 et 14% pour l'ELISA Ag E/S). La moyenne et les écarts-types du rapport échantillon/contrôle positif sont indiqués pour chaque groupe de porcs infestés. 13 EXEMPLE 1 : PRODUCTION DE LA PROTEINE RECOMBINANTE THXNBL1(CTERM), CONTENANT UNE PORTION C-TERMINALE DE NBL1. Un immunocriblage d'une banque d'ADNc L1NN de Trichinella spiralis a été réalisé avec un sérum de porc obtenu 35 jours après infestation expérimentale avec 10000 L1M de T. spiralis. Le séquençage des clones reconnus par ce sérum a permis de déterminer que la majeure partie d'entre eux codaient pour une même protéine. Cette protéine est une protéase à sérine putative, dont la séquence d'ADNc et la séquence en acides aminés déduite sont respectivement disponibles sur Genbank sous les numéros AF331160 et AAK16520, et sont également reproduites ici sous les numéros SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2. Elle est dénommée ici NBL1. Une portion de la partie C terminale de la protéine a été amplifiée à l'aide des oligonucléotides NBLlCtermF (5'-CACCGAAAATTCTCCTGAAGGA-3') (SEQ ID NO: 12) et NBL1CtermR (5'-TGTTGTTGTAGTAACTCC-3') (SEQ ID NO: 13), et de l'ADN polymérase AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen), et clonée dans le plasmide pET102D/topo en utilisant le kit d'expression Champion pETl02 Directional TOPO selon les recommandations du fabricant (Invitrogen). Le plasmide recombinant obtenu, dénommé pETl02-NBLl(Cterm) code pour une protéine de fusion thioredoxine- NBL1(Cterm) (THX-NBLl(Cterm), de 291 AA, portant en position C-terminale une étiquette poly-histidine. La séquence de cette protéine de fusion est représentée sur la Figure 1. La protéine de fusion THX-NBL1(Cterm) a été exprimée dans des bactéries E. coli BL21 Star (DE3), BL21 (DE3)pLys (Invitrogen) transformées par le plasmide pET102-NBLl(Cterm), et purifiée par chromatographie d'affinité en conditions dénaturantes sur colonne Ni-NTA (Ni-NTA spin columns kit ; Ni-NTA beads), en utilisant le protocole préconisé par le fournisseur (Qiagen). La protéine de fusion THX-NBLl(Cterm) purifiée apparaît, après électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) sous forme d'une bande à la taille attendue de 31,1 kDa. L'immunoréactivité de la protéine THX-NBLl(Cterm) vis-à-vis d'un sérum de porc indemmne de trichinellose et d'un sérum de porc infesté par 20000 larves L1M de T. spiralis prélevé 60 jours après l'infestation, été analysée par transfert de Western. Après électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE), la protéine a été électro-transférée sur une membrane Hybond P (PVDF) suivant les instructions du fournisseur (Amersham). Les membranes ont été pré-hybridées pendant 1 h en TBS-T (20 mM Tris-HC1 pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) et 5% de lait écrémé. Après 2 lavages en TBS-T pendant 1 min, puis 3 lavages en TBS-T pendant 5 min, les membranes ont été incubées pendant 1 h avec le sérum de porc dilué au 1/200 en TBS. Après lavage, les membranes ont été incubées pendant 20 min avec l'anticorps secondaire de lapin anti-IgG de porc marqué à la phosphatase alcaline (A1192, Sigma) dilué au 1/30000, puis avec le substrat NBT/BCIP (E116, Interchim) pur pendant 30 min pour la révélation du marquage. Les résultats sont illustrés par la Figure 2. On observe une très forte immunoréactivité de THX-NBL1(Cterm) avec le sérum du porc infesté par T. spiralis. EXEMPLE 2 : UTILISATION DE THX-NBL1(CTERM) POUR DETECTER LA 25 REPONSE HUMORALE DIRIGEE CONTRE TRICHINELLA. La protéine THX-NBLI(Cterm),préparée comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, a été évaluée par ELISA indirect vis à vis de sérums issus de porcs infestés par Trichinella, en comparaison avec l'antigène 30 d'Excrétion/Sécrétion (E/S) de T. spiralis. L'antigène E/S de référence est préparé selon le protocole décrit par GAMBLE et al., (1988). Il est obtenu à partir du surnageant de culture des larves LiM maintenues en survie pendant 24h dans du RPMI 1640 contenant 1% de 35 pyruvate, 15% de sérum de veau foetal (SVF), 1% de L-glutamine, 100U/ml de pénicilline 100U/ml et 100pg/ml de streptomycine. Pour les tests ELISA, l'antigène dilué en tampon PBS 1X, à raison de 1,25 pg/ml pour l'antigène E/S et de 2 pg/ml pour THX-NBLl(Cterm), est incubé pendant 1 nuit à 4 C sur des plaques 96 puits (plaques MediSorp, NUNC). Après 3 lavages (PBS 1X, Tween 20 à 0,05%), les plaques sont saturées à température ambiante pendant 1 h avec une solution de lait écrémé dilué à 2 % dans la solution de lavage. On dépose dans chaque puits 100 pl de sérum de porc dilué au 1/20 en tampon PBS 1X, additionné de Tween 20 à 0,05%. Après incubation pendant 30 min à 37 C, suivie de 3 lavages (PBS 1X, Tween 20 à 0,05%), on dépose dans chaque puits 100 pl de la solution de conjugué (protéine G- peroxidase (P-8170, Sigma) dilué au 1/32000 en tampon PBS 1X, additionné de Tween 20 à 0,05%. Après une nouvelle incubation pendant 30 min à 37 C, suivie de 3 lavages (PBS 1X, Tween 20 à 0,05%), on dépose dans chaque puits 100 pl d'une solution de substrat (3,3',5,5' tetramethylbenzidine-hydrogen peroxide : TMB3). Après 20 min d'incubation à température ambiante à l'obscurité, la réaction est arrêtée par addition de 100 pl/puits de H2SO4 0,5 M. La lecture des plaques est effectuée par mesure de l'absorbance à 450 nm. Le résultat des lectures des plaques ELISA est présenté sous la forme du pourcentage de réactivité d'un sérum échantillon sur un sérum contrôle positif. E 90 ù = (OD échantillon - OD contrôle négatif/OD contrôle positif- OD contrôle négatif) x 100 P Le seuil de positivité (égal à 2 fois la valeur moyenne des échantillons négatifs de référence) est de 14% pour l'ELISA Ag E/S, et 44% pour l'ELISA THX-NBL1 (Cterm). La cinétique d'apparition des anticorps anti- Trichinella détectés par ELISA THX-NBL1 (Cterm) ou par ELISA Ag E/S dans des sérums de porcs conventionnels expérimentalement infestés par 200, 1000 ou 20000 larves L1M de T. spiralis a été comparée. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. L'antigène THX-NBL1(Cterm) permet la détection dose-dépendante des réponses humorales dirigées contre T. spiralis. La détection d'épitopes conformationnels par ce test ELISA associée à la détection d'épitopes linéaires par transfert de Western démontrent par ailleurs le caractère immunodominant de la protéine NBL1 de Trichinella. L'ELISA THX-NBLl(Cterm) détecte la séroconversion dès le 25e jour pi, alors que l'ELISA Ag E/S ne détecte la 5 séroconversion que 10 jours plus tard. La détection par ELISA Ag E/S, et ELISA THXNBLl(Cterm) des réponses humorales induites par T. spiralis et les trois autres espèces de Trichinella identifiées en Europe, T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis, a 10 également été comparée. Les résultats sont résumés dans le Tableau I ci- dessous. TABLEAU I -Inoculum ~ Taux de Taux de Taux de I ù -- Nombre Nombre Nombre Gain de Espèce (a). Infectivité dépistage dépistage dépistage Taux de Nombre d'animaux d'animaux d'animaux précocité Trichinella (b.) par l ELISA total par par l'ELISA dépistage d'animaux co- détectés au détectés plus détectés au induit par T. spiralis I A E/S l'ELISA Ag THX- total par détectés plus même précocement meme moment l 'ELISA THX Ag E/S NBL1(Cterm) l'ELISA THX-tardivement moment par par l'ELISA par les 2 tests NBL1(Cterm) ù NBL1(Cterm) par I'ELISA les 2 tests THX ELISA ou plus (c) THX- ELISA NBL1(Cterm) précocement NBL1(Cterm) par l'ELISATHX NBL1(Cterm) 200 3 3/3 9/9 1 /3 7/9 - - 7/7 7/7 5 - 20 1000 43,1 3/3 3/3 20000 538,9 3/3 3/3 T. britovi 200 1,8 1 /3 7/9 1 /3 6/9 - - 6/6 6/6 5 - 45 1000 1 3/3 2/3 20000 123,1 3/3 3/3 T. nativa 200 0,0007 1/3 5/9 1/3 6/9 - - 6/6 6/6 15 1000 0,0015 1/3 2/3 20000 0,1022 3/3 3/3 T. 200 0,058 0/3 6/9 0/3 5/9 -5/5 5/5 5 - 45 pseudospiralis i i i 1000 2,1 3/3 2/3 20000 98,9 3/3 3!3 (a) inoculum infectieux en nombre de L1M de Trichinella par porc (b) charge parasitaire musculaire moyenne par animal (en larves par gramme de muscle) (c) gain de précocité exprimé en jours obtenu par le test ELISA NBL1(Cterm) comparé au test ELISA Ag E/S chez les animaux co-détectés par ces 2 tests. L'ensemble de ces résultats montre que l'ELISA THX-NBLl(Cterm) permet une détection particulièrement précoce des réponses humorales, dès le 15ej pi, pour les animaux fortement infestés et une détection légèrement retardée pour les animaux infestés par une charge moyenne de 1000 L1M (25ej pi). Des résultats similaires ont été obtenus avec des porcs holoxéniques infestés selon le même protocole. La séroconversion la plus précoce détectée par l'ELISA Ag E/S était au 25e j pi. La comparaison des résultats obtenus avec les 2 tests ELISA a démontré un gain de 5 à 20 jours en terme de précocité pour le diagnostic de T. spiralis par utilisation de l'ELISA THX-NBL1(Cterm) (Tableau I). De plus, les animaux infestés par T. spiralis qui ont été diagnostiqués à la fois par l'ELISA Ag E/S et l'ELISA THX- NBL1(Cterm) ont vu, pour tous, leur fenêtre de détection sérologique se réduire avec l'ELISA THX-NBLl(Cterm). La sensibilité de l'ELISA THX-NBL1(Cterm) a été démontrée avec le dépistage effectif de 7/9 porcs conventionnels au cours de cette expérimentation animale, soit 3/3 porcs infestés par 20000 LiM, 3/3 porcs infestés par 1000 L1M et 1/3 porc infesté par seulement 200 LiM de T. spiralis. Les détections étaient associées à la charge parasitaire musculaire de T. spiralis chez ces animaux qui variait en moyenne de 3 larves par gramme (LpG) pour les porcs expérimentalement infestés par 200 LiM, 43 LpG pour les porcs expérimentalement infestés par 1000 LiM, et 538 LpG pour les porcs expérimentalement infestés par 20000 LiM. Les réponses humorales induites par les trois autres espèces de Trichinella identifiées en Europe, T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis, ont elles aussi été détectées de façon dose-dépendante par l'ELISA THX- NBL1(Cterm), démontrant la conservation génétique et antigénique de NBL1 dans le genre Trichinella (immunodominance), et par conséquent tout son intérêt pour le diagnostic à large spectre des trichinelloses. La sensibilité et la précocité du diagnostic (15ej pi) ont été confirmées. La fenêtre de séroconversion a été réduite de 5 à 45 jours avec l'ELISA THX-NBLl(Cterm), et à l'instar de l'infestation par T. spiralis, l'ensemble des animaux qui ont été diagnostiqués à la fois par ELISA Ag E/S et ELISA THXNBLl(Cterm) ont vu leur fenêtre de détection sérologique se réduire avec l'ELISA THX-NBL1(Cterm). De plus, l'analyse de l'infestation par l'espèce T. nativa démcntre la grande sensibilité de l'ELISA THX-NBLl(Cterm) qui a diagnostiqué 6/9 animaux (contre 5/9 animaux par l'ELISA Ag E/S) dont 2 porcs non dépistés par l'ELISA Ag E/S alors que la charge parasitaire musculaire n'était en moyenne que de 7x10-9 à 0,1 LpG seulement. La spécificité de l'ELISA THX-NBLl(Cterm) a été démontrée à l'aide des sérums prélevés sur l'ensemble des animaux avant chaque infestation expérimentale et jusqu'à 10 jours pi. Plus de 200 sérums de porcs plein air ont été utilisés pour montrer la spécificité de la molécule. Aucun porc négatif vis à vis de Trichinella ne réagit avec l'ELISA THX-NBL1(Cterm). Ces résultats sont illustrés par la Figure 4. EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION D'UN EPITOPE IMMUNODOMINANT DE NBL1. Une analyse in silico de la séquence en acides aminés déduite de la partie C terminale de NBL1 a été réalisée afin de prédire les régions les plus antigéniques. Les résultats de l'analyse in silico ont conduit à la sélection de 11 peptides chevauchants couvrant 113 AA de la partie C terminale de NBL1 (de l'AA 327 à l'AA 440). Les séquences de ces peptides sont indiquées ci-après N5EM1 : NH2- NSPEGTVKWASKEDS -CONH2 (SEQ ID NO: 14) N5EM2 : NH2- ASKEDSPVDLSTASR -CONH2 (SEQ ID NO: 15) N5EM3 : NH2-LSTASRPTNPYTGSR -CONH2 (SEQ ID NO: 16) N5EM4 : NH2- PYTGSRPTSPSSGSR -CONH2 (SEQ ID NO: 17) N5EM5 : NH2- PSSGSRPTYPSSGSR -CONH2 (SEQ ID NO: 6) N5EM6 : NH2- PSSGSRPTSPSSGSR -CONH2 (SEQ ID NO: 18) N5EM7 : NH2PSSGSRPTYPYTGSR -CONH2 (SEQ ID NO: 7) N5EM8 : NH2- PYTGSRPTPQKPVFP -CONH2 (SEQ ID NO: 19) N5EM9 : NH2- QKPVFPSYQKYPPAV -CONH2 (SEQ ID NC: 20) N5EM10: NH2-KYPPAVQKYIDSLPS -CONH2 (SEQ ID NO: 21) N5EM11: NH2RPTSPSSGSRPTYPS -CONH2 (SEQ ID NO: 8) L'antigénicité des peptides N5EM vis-à-vis d'un sérum de porc infesté par 20000 larves L1M de T. spiralis et recueilli 60 jours après l'infestation été évaluée par ELISA indirect, en utilisant un protocole identique à celui décrit dans l'Exemple 2, à ceci près que les peptides, préalablement biotinylés sont incubés (2 pg/ml en PBS 1X ; 100 pl/puits) sur des plaques prétraitées à la streptavidine. Trois peptides immunoréactifs (N5EM5, 7 et 11) ont été détectés. L'analyse de la séquence primaire des peptides immunoréactifs a révélé la présence d'un motif commun de 10 acides aminés (PSSGSRPTYP) (SEQ ID NO: 5). Ce motif est par ailleurs présent 4 fois sur toute la séquence de la protéine NBL1. D'autre part, la cartographie d'épitopes via des peptides chevauchants de 6AA a permis de mettre en évidence l'importance primordiale d'un seul AA, une tyrosine, pour l'immunoréactivité de l'épitope linéaire au sein des peptides. Des expériences complémentaires ont finalement démontré que N5EM11 était le peptide le plus réactif comparé à N5EM5 et N5EM7 en termes de sensibilité et de précocité. Ce peptide a été comparé avec l'antigène E/S de T. spiralis, comme décrit dans l'Exemple 2 pour THXNBL1(Cterm). Les résultats sont résumés dans le Tableau II ci-dessous : TABLEAU Il Taux de Nombre Nombre Nombre Taux de d'animaux co- d'animaux d'animaux dépistage détectés au détectés plus par l'ELISA total par même moment précocement N5EM11 l'ELISA par l'ELISA par les 2 tests par l'ELISA N5EM11 N5EM11 ELISA N5EM11 Taux de Taux de l' Infectivité dépistage dépal istage (b). par l'ELISA total par l'ELISA Ag E/S Ag E/S Nombre d'animaux' Gain de Espèce Trichinella détectés au même moment par les 2 tests ELISA ou plus précocement par l'ELISA N5EM11 noculum (a). précocité induit par l'ELISA N5EM11 (c) 0/3 3/3 -1-- 2/5 3/5 5/5 5 -10 1/5 4/5 5/5 5 -30 4/4 4/4 15-25 2/4 2/4 2/4 30 9/9 3/3 5/9 200 T. spiralis 1000 III 20000 , 43,1 2/3 3/3 3/3 538,9 1/3 1/3 1/3 3/3 3/3 7/9 200 1,8 T. britovi 1000 1 1 20000 , 123,1 3/3 1/3 200 0/3 1/3 1/3 4/9 5/9 0,0007 0,0015 0,1022 T. nativa 1000 20000 3/3 3/3 200 0,058 0/3 0/3 1000 2,1 3/3 6/9 2/3 4/9 1 20000 98,9 3/3 2/3 T. pseudospirali (a) inoculum infectieux en nombre de L1 M de Trichinella par porc. (b) charge parasitaire musculaire moyenne par animal (en larves par gramme de muscle). (c) gain de précocité exprimé en jours obtenu par le test ELISA N5EM11 comparé au test ELISA Ag E/S chez les animaux co-détectés par ces 2 tests. 22 Ces résultats montrent que l'ELISA N5EM11 permet la détection des infestations modérées à T. spiralis. De plus, une détection précoce dès le 20ème jour après infestation a été obtenue, soit 5 à 10 jours plus tôt que ne l'a permis l'ELISA Ag E/S. On observe également une diminution du taux d'anticorps anti-N5EM11 après le pic de détection, ce qui confirme ce caractère précoce, et qui est utile pour dater une infestation récente. L'ensemble des porcs infestés par T. spiralis et diagnostiqués par L'ELISA N5EM1l peptidique présente une fenêtre de séroconversion en partie similaire mais dans la majorité des cas plus réduite que celle observée avec l'ELISA Ag E/S. Par ailleurs, N5EM11 présente des réactions antigéniques croisées avec le sérum de porcs infestés par T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis démontrant l'immunodominance de ce peptide du stade L1NN de Trichinella. Ces réactions antigéniques croisées conduisent à une détection pouvant être obtenue 5 à 30 jours plus tôt qu'avec l'ELISA Ag E/S. Une érosion de la sensibilité a néanmoins été notée en comparaison avec l'ELISA Ag E/S, en terme de détection retardée pour des animaux infestés par T. pseudospiralis et co-détectés par les deux tests. A contrario, l'ELISA N5EM11 a aussi permis de diagnostiquer un animal infesté par T. nativa et non dépisté par l'ELISA Ag E/S alors que la charge parasitaire musculaire était résiduelle. La spécificité de l'ELISA N5EM11 a été évaluée à l'aide de sérums prélevés sur 300 animaux avant infestation expérimentale et jusqu'à 10 jours pi. Cette spécificité est supérieure à 99% (résultats non illustrés). EXEMPLE 4 : IDENTIFICATION ET ISOLEMENT DE L'ANTIGENE 411 Le clone d'ADNc 411 a été sélectionné à partir 35 d'une banque d'ADNc des stades invasifs précoces Ad+L1NN de T. spiralis. La séquence nucléique de ce clone d'ADNc, ainsi que la séquence polypeptidique déduite ont été déterminées, 23 et sont respectivement représentées dans la liste de séquences sous les numéros SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4. Le cadre ouvert de lecture de 411 code pour une protéine putative de 20 kDa. A l'exception d'un peptide signal, aucun domaine protéique n'a été identifié. La comparaison du cadre ouvert de lecture complet de 411 avec les séquences disponibles sur Genbank montre qu'elle présente 78,7% d'identité avec la protéine Tp21-3 d'Excrétion/Sécrétion identifiée chez T. pseudospiralis (AAF79206 ; NAGANO et al., 2001), et 86,6% d'identité avec la séquence de l'ORF 17.20 hypothétique de T. spiralis soumise par Polvere et Despommier (AAB48489). Ces comparaisons de séquences identifient 411 comme un nouveau membre de cette famille de gènes commune au genre Trichinella. Le cadre ouvert de lecture complet de 411 a été amplifié à l'aide des oligonucléotides 411F (5'- CACCCGAGAAAACATGCAT-3' )(SEQ ID NO: 22) et 411R (5'-TCCATTCAATTTTGCGTCAC-3') (SEQ ID NO: 23), et l'ADN polymérase AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen), et cloné dans le plasmide pET102D/topo, en utilisant le kit d'expression Champion pET102 Directional TOPO selon les recommandations du fabricant (Invitrogen). Le plasmide recombinant obtenu, dénommé pET102-411 code pour une protéine de fusion thioredoxine-411 (THX- 411) de 330 AA, pour une masse moléculaire prédite de 36,7 kDa, et portant en position C-terminale une étiquette polyhistidine. La séquence de cette protéine de fusion est représentée sur la Figure 5. La protéine de fusion THX-411 a été exprimée dans des bactéries E. coli BL21 Star (DE3), BL21 (DE3)pLys (Invitrogen) transformées par le plasmide pET102-411, et purifiée par chromatographie d'affinité en conditions dénaturantes sur colonne Ni-NTA (Ni-NTA spin columns kit ; Ni-NTA beads), en utilisant le protocole préconisé par le fournisseur (Qiagen). La protéine de fusion THX-411 purifiée apparaît, après électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) sous forme d'une bande à la taille attendue de 36,7 kDa. 24 L'immunoréactivité de la protéine THX-411 vis-à-vis d'un sérum de porc indemne de trichinellose, et du sérum du même porc, 30 jours et 50 jours après infestation par 20000 larves L1M de T. spiralis a été comparée avec celle de l'antigène de référence E/S (préparé comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus). L'analyse a été effectuée par transfert de Western, en utilisant le même protocole que celui décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 6. On observe une très forte immunoréactivité de THX-411 avec les sérums du porc infesté par T. spiralis et la détection précoce d'anticorps anti-411 (30 jours pi). On observe un léger bruit de fond dû aux réactions croisées entre les protéines bactériennes résiduelles de haute masse moléculaire subsistant dans la préparation de THX-411 et les anticorps anti E. con présents dans les sérums. EXEMPLE 5 : UTILISATION DE THX-411 POUR DETECTER LA REPONSE HUMORALE DIRIGEE CONTRE TRICHINELLA. La protéine, préparée comme décrit à l'exemple 4 ci-dessus, a été évaluée par ELISA indirect vis à vis de sérums issus de porcs infestés par Trichinella, en comparaison avec l'antigène d'Excrétion/Sécrétion (E/S) de T. spiralis. La cinétique d'apparition des anticorps anti-Trichinella détectés par ELISA THX-411 ou par ELISA Ag E/S dans des sérums de porcs conventionnels expérimentalement infestés par 200, 1000 ou 20000 larves L1M de T. spiralis a été comparée La détection par ELISA Ag E/S, et ELISA THX-411 des réponses humorales induites par T. spiralis et les trois autres espèces de Trichinella identifiées en Europe, T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis, a également été comparée. Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans l'Exemple 2. L'antigène THX-411 a été utilisé à 2 pg/ml, et l'antigène E/S à 1,25 pg/ml. Le seuil de positivité est de 14% pour l'ELISA Ag E/S, et 52% pour l'ELISA THX-411. Les résultats sont illustrés par la Figure 7, ainsi que par le Tableau III ci-dessous. Tableau III Nombre d'animaux détectés au Gain de même précocité moment par induit par les 2 tests l'ELISA ELISA ou plus THX-411 précocement (c) par l'ELISA THX-411 2/5 3/5 5 -10 Espèce Trichinellanoculum (a). I nfectivité (b). Taux de dépistage par l'ELISA Ag E/S Taux de dépistage total par l'ELISA Ag E/S Taux de dépistage par l'ELISA THX-411 Taux de dépistage total par l'ELISA THX-411 5/9 Nombre d'animaux co-détectés plus tardivement par l'ELISA THX-411 2/5 Nombre d'animaux détectés au même moment par les 2 tests ELISA Nombre d'animaux détectés plus précocement par l'ELISA THX-411 4/4 5 -20 200 T. spiralis 1000 20000 T. britovi T. nativa 1 1000 20000 200 43,1 538,9 1,8 1 123,1 3 3/3 3/3 1/3 3/3 9/9 1/3 3/3 I 0/3 1/3- 2/3 3/3 7/9 4/9 6/9 1/5 1 /6 4/4 5/6 6/6 10 - 20 3/3 2/3 200 0,0007 1/3 1/3 20000 0,1022 3/3 2/3 3/3 1/3 1000 5/9 0,0015 200 0,058 T. H 1000 2,1 pseudospiralis 20000 98,9 (a) inoculum infectieux en nombre de L1 M de Trichinella par porc. (b) charge parasitaire musculaire moyenne par animal (en larve par gramme de muscle). (c) gain de précocité (exprimé en jours) obtenu par le test ELISA 411 comparé au test ELISA Ag E/S chez les animaux co-détectés par ces 2 tests. 6/9 0/3-3/3 3/3 0/3 0/3 2/3 20 2/9 1/2 1/2 1/2 L'ensemble de ces résultats montre que l'antigène 411 permet la détection dose-dépendante des réponses humorales dirigées contre T. spiralis. La détection d'épitopes conformationnels par ce test ELISA associée à la détection d'épitopes linéaires par transfert de Western démontrent par ailleurs le caractère immunodominant de la protéine 411 de Trichinella. La protéine recombinante THX-411 permet une détection particulièrement précoce des anticorps dirigés contre T. spiralis (dès le 20ej pi pour les animaux fortement infestés à 20000 L1M). La séroconversion s'accompagne d'un profil de réponses humorales ayant des titres élevés et maintenus jusqu'à 60j pi. La séroconversion des animaux infestés par une charge modérée et faible du parasite a été détectée plus tardivement au 30ej pi et 60e j pi, respectivement. La séroconversion la plus précoce détectée par l'ELISA Ag E/S est au 25e j pi. Les animaux infestés par T. spiralis qui ont été diagnostiqués à la fois par l'ELISA Ag E/S et l'ELISA THX-411 ont vu, pour 2/5 d'entre eux, leur fenêtre de détection sérologique se réduire avec l'ELISA THX-411, avec un gain de 5 à 10 jours en terme de précocité. La sensibilité de l'ELISA THX-411 a été démontrée avec le dépistage effectif de 5/9 porcs conventionnels au cours de cette expérimentation 2.5 animale, soit 3/3 porcs infestés par 20000 L1M, 1/3 porcs infestés par 1000 LiM et 1/3 porc infesté par seulement 200 L1M de T. spiralis. Les détections étaient associées à la charge parasitaire musculaire de T. spiralis chez ces animaux qui variait en moyenne de 3 larves par gramme (LpG) pour les 30 porcs expérimentalement infestés par 200 LiM, 43 LpG pour les porcs infestés par 1000 LiM, et 538 LpG pour les porcs infestés par 20000 LiM. Les réponses humorales induites par T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis ont elles aussi été détectées 35 par l'ELISA THX-41l (10/12 animaux infestés par 20000 L1M), démontrant la conservation génétique et antigénique de 411 dans le genre Trichinella et par conséquent tout son intérêt pour le diagnostic à large spectre des trichinelloses. La précocité du diagnostic a été confirmée dès le 20ej pi. La fenêtre de séroconversion a été réduite de 5 à 20 jours avec l'ELISA 411, et à l'instar de l'infestation par T. spiralis, 50% à 100 des animaux qui ont été diagnostiqués à la fois par ELISA Ag E/S et ELISA THX-411 ont vu leur fenêtre de détection sérologique se réduire avec l'ELISA THX-411. L'analyse de l'infestation par l'espèce T. nativa a démontré une sensibilité accrue de l'ELISA THX-411 qui a diagnostiqué 6/9 animaux (contre 5/9 animaux par l'ELISA Ag E/S) alors que la charge parasitaire musculaire n'était en moyenne que de 7x10-4 à 0,1 LpG seulement. De plus, des profiles de réponses humorales similaires ont été obtenus pour les animaux infestés par T. spiralis et T. nativa, alors que l'intensité de l'infestation générée par cette dernière espèce était significativement plus faible, suggérant un caractère immunogène très important de la protéine 411 de T. nativa et son utilisation pour la détection de cette espèce résistante à la congélation. La spécificité de l'ELISA THX-411 a été évaluée à l'aide de sérums prélevés sur 150 animaux avant infestation expérimentale et jusqu'à 10 jours pi. Cette spécificité est supérieure à 99% (résultats non illustrés). Conclusion Les antigènes NBL1 et 411 constituent des antigènes immunodominants et conservés au sein du genre 2.5 Trichinella. Les tests ELISA utilisant ces antigènes (NBL1 partie C terminale ; épitope peptidique N5EM11 de NBL1 ; antigène 411) ont une spécificité vis-à-vis de Trichinella supérieure à 99%, et permettent le diagnostic précoce (15-60 jours après infestation) des trichinelloses porcines 30 produites par les 4 espèces de Trichinella identifiées en Europe. Le test ELISA utilisant la protéine recombinante purifiée THX-NBL1(Cterm), contenant l'épitope immunodominant de NBL1 localisé dans la partie C terminale de la protéine, 35 est spécifique de Trichinella, sensible, et permet le diagnostic des trichinelloses porcines avec une précocité accrue de 5 à 45 jours par rapport à L'ELISA Ag E/S. De plus, ce test a permis d'obtenir une fenêtre de détection sérologique réduite par rapport à ELISA Ag E/S chez 100% des animaux qui ont été diagnostiqués à la fois par l'ELISA Ag E/S et par ELISA THX-NBLl(Cterm). Le test ELISA utilisant la protéine recombinante purifiée THX-41l reproduit avec une sensibilité actuellement un peu plus réduite (17/36 animaux diagnostiqués) les cinétiques des réponses humorales détectées par l'ELISA Ag E/S. Néanmoins, la sensibilité de ce nouvel ELISA a permis de diagnostiquer un porc non dépisté par l'ELISA Ag E/S. L'ELISA THX-411 peut permettre le diagnostic des trichinelloses porcines avec une précocité accrue de 5 à 20 jours par rapport à l'ELISA Ag E/S. De plus, 50% à 100% des animaux qui ont été diagnostiqués à la fois par ELISA Ag E/S et ELISA THX-411 ont vu leur fenêtre de détection sérologique se réduire avec l'ELISA THX-411. L'ensemble de ces résultats montre que les antigènes NBL1 et 411 peuvent être utilisés, en alternative à l'antigène E/S, ou en complément de celui-ci, pour le diagnostic sérologique précoce des trichinelloses. En outre, l'association de ces deux nouveaux antigènes de Trichinella permet l'amélioration de la sensibilité de l'ELISA par le diagnostic d'un animal supplémentaire. L'association de NBL1 (Cterm) avec un peptide immunodominant de type N5EM11, et 411 permet d'améliorer la sensibilité du diagnostic de Trichinella (24/36 animaux détectés). L'effet additif de NBL1 avec 411 se traduit par le gain de détection d'un animal induit par 411, ainsi que par la détection plus précoce d'un animal induite par 411. Le tryptique (NB1L, 411, N5EM11) stabilise dans le temps le test ELISA par la codétection simultanée d'anticorps via 2 ou 3 antigènes, sans gain supplémentaire en terme de nombre d'animaux toutefois. Par contre le diagnostic précoce RÉFÉRENCES MURRELL et al., The systematics of the genus Trichinella with a key to species, Vet Parasitol, 93, 293-307, (2000). GASSER et al., Nonisotopic single-strand conformation polymorphism analysis of sequence variability in ribosomal DNA expansion segments within the genus Trichinella (Nematoda: Adenophorea), Electrophoresis, 25, 3357-3364, (2004). BOIREAU et al., Risques parasitaires liés aux aliments 10 d'origine animale, Revue française des laboratoires, 71-89, (2002). CAPO & DESPOMMIER, Clinical aspects of infection with Trichinella spp, Clin Microbiol Rev, 9, 47-54, (1996). FOURESTIE et al., Randomized trial of albendazole versus 15 tiabendazole plus flubendazole during an outbreak of human trichinellosis, Parasitol Res, 75, 36-41, (1988). DUPOUY-CAMET, Trichinellosis: a worldwide zoonosis, Vet Parasitol, 93, 191-200, (2000). MURRELL & POZIO, Trichinellosis: the zoonosis that won't go 20 quietly, Int J Parasitol, 30, 1339-1349, (2000). BOIREAU et al., Trichinella in horses: a low frequency infection with high human risk, Vet Parasitol, 93, 309-320, (2000). GAMBLE et al., Diagnosis of swine trichinoses by enzyme-25 linked immunosorbent assay (ELISA) using an excretorysecretory antigen, Vet Parasitol, 13, 349-361, (1983). GAMBLE et al., Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis, Vet Parasitol, 30, 131-137, (1988). 30 REASON et al., Novel tyvelose-containing tri- and tetraantennary N-glycans in the immunodominant antigens of the intracellular parasite Trichinella spiralis, Glycobiology, 4, 593-603, (1994). NAGANO et al., Molecular cloning and characterization of a 21 kDa protein secreted from Trichinella pseudospiralis, J Helminthol, 75, 273-278, (2001). REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un polypeptide antigénique reconnu par des anticorps anti-Trichinella comme réactif pour la détection d'anticorps anti-Trichinella dans un prélèvement biologique, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend un épitope immunodominant de l'antigène NBL1, lequel épitope est défini par la séquence PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5). 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on utilise un mélange comprenant un ou plusieurs polypeptide(s) tel(s) que défini(s) dans la revendication 1, optionnellement en combinaison avec un ou plusieurs polypeptide(s) comprenant les acides aminés 25-175 de la séquence SEQ ID NO: 4, ou comprenant une séquence présentant au moins 70% d'identité avec la séquence des acides aminés 25-175 de la séquence SEQ ID NO: 4. 3) Polypeptide antigénique reconnu par des anticorps anti-Trichinella, tel que défini dans la revendication 1, à l'exclusion du polypeptide identifié par le numéro d'accès GenBank AAK16520. 4) Polypeptide antigénique selon la revendication 3, contenant une ou plusieurs des séquences suivantes : la séquence : PSSGSRPTYPSSGSR (SEQ ID NO: 6); la séquence PSSGSRPTYPYTGSR (SEQ ID NO: 7); la séquence RPTSPSSGSRPTYPS (SEQ ID NO: 8). 5) Polypeptide antigénique selon la revendication 4, contenant les acides aminés 363-409 de la séquence SEQ ID NO: 2. 6) Polypeptide antigénique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copie(s) d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1, optionnellement avec une ou plusieurs copie(s) d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 2, éventuellement fusionnés à une ou des séquence(s) hétérologue(s). 7) Polynucléotide codant pour un polypeptide 35 antigénique selon une quelconque des revendications 3 à 6. 8) Vecteur recombinant contenant un ou plusieurs polynucléotide(s) selon la revendication 7. 9) Cellule-hôte transformée par un vecteur recombinant selon la revendication 8. 10) Utilisation d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 pour l'obtention d'une composition utilisable pour la production d'anticorps. 11) Anticorps reconnaissant spécifiquement un 5 polypeptide tel que défini dans la revendication 1. 12) Anticorps selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il reconnaît l'épitope PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5). 13) Procédé de détection de la présence d'anticorps anti-Trichinella dans un échantillon biologique, lequel procédé 10 est caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs polypeptide(s) tel(s) que défini(s) dans la revendication 1, optionnellement en combinaison avec un ou plusieurs polypeptides tel(s) que défini(s) dans la 15 revendication 2, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les anticorps anti-Trichinella éventuellement présents dans ledit échantillon ; - la détection, par tous moyens appropriés, du 20 complexe antigène/anticorps éventuellement formé. 14) Nécessaire pour la détection de la présence d'anticorps anti-Trichinella dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs polypeptide(s) tel(s) que défini(s) dans la revendication 1, optionnellement en 25 combinaison avec un ou plusieurs polypeptide(s) tel(s) que défini(s) dans la revendication 2, et, le cas échéant, des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et, optionnellement, des moyens de détection 30 dudit complexe antigène/anticorps. 15) Nécessaire selon la revendication 14, caractérisé en ce que le(s)dit(s) polypeptide(s) est (sont) immobilisé(s) sur un support solide. 16) Composition immunogène, comprenant un ou 35 plusieurs polypeptide(s) tels que définis dans la revendication 1, optionnellement en combinaison avec un ou plusieurs polypeptide(s) tel(s) que défini(s) dans la revendication 2, ou un ou plusieurs polynucléotide(s) codant pour le(s)dit(s) polypeptide(s) tel(s) que définis dans la revendication 1, 40 optionnellement en combinaison avec un ou plusieurs polynucléotide(s) codant pour le(s)dit(s) polypeptide(s) tels que définis dans la revendication 2, associé(s) à un ou plusieurs adjuvants permettant d'améliorer la réponse immunitaire. 17) Composition immunogène selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin.