Brevet FR2891831A1 — publié le 20070413

Procédé de dépolymérisation de polysaccharides par ultrasons La présente invention concerne le domaine des polysaccharides plus précisément les procédés de dépolymérisation par ultrasons des polysaccharides. Les polysaccharides sont en général des substances de poids molaire élevé. De nombreuses applications existent pour des chaînes osidiques obtenues par dépolymérisation de ces polysaccharides. Parmi les méthodes de dépolymérisation, la dépolymérisation par ultrasons a été utilisée avec succès pour dépolymériser différentes macromolécules comme l'ADN, le dextrane et des polysaccharides bactériens. On peut citer comme exemples EP0511932 et WO9722629. EP0511932 décrit un procédé de dépolymérisation par ultrasons à basse fréquence à une température comprise 20 entre 0 et 15 C. WO9722629 décrit un procédé à l'efficacité accrue de dépolymérisation par ultrasons de l'acide hyaluronique. La dépolymérisation s'effectue en présence de NaOC1 à une température de 4 C. Les rendements obtenus sont de 25 l'ordre de 60%. Au cours de la réaction de dépolymérisation, de nombreux produits présentant une structure osidique altérée sont formés; ce qui est indésirable et rend nécessaire des étapes ultérieures de purification. 30 Le but de la présente invention est de fournir un procédé de dépolymérisation par ultrasons de polysaccharides qui présente un rendement élevé, généralement supérieur à 90%. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de dépolymérisation qui permet d'obtenir des polysaccharides de masse homogène tout en préservant leur composition en oses, c'est-à-dire tout en préservant leur structure osidique. L'objet de la présente invention est un procédé de dépolymérisation par ultrasons de polysaccharides caractérisé en ce que la dépolymérisation a lieu en présence d' H2O2 . Les définitions qui suivent, permettront de mieux 15 définir les termes utilisés pour décrire la présente invention. Par exopolysaccharide (EPS), on entend un polysaccharide produit par un microorganisme et sécrété dans le milieu ou présent à la surface du 20 microorganisme. Par polysaccharide, on entend un polymère constitué d'oses. Ce polymère peut être ramifié ou non. Les polysaccharides se trouvent le plus souvent sous la forme d'un mélange de chaînes osidiques de différentes 25 tailles. Par Mn, on entend la masse molaire moyenne en nombre, à savoir la masse totale de toutes les chaînes osidiques dans un échantillon divisé par le nombre total des chaînes dans l'échantillon. 30 Mn = (E Ni Mi) / (E Ni) Mi représente la masse molaire de l'espèce i et Ni représente le nombre de molécules de l'espèce i. Par Mp, on entend la masse molaire moyenne en poids. Mp = (E Ni Mie) / (E Ni Mi) Par indice de polydispersité (Ip), on entend le rapport Mp/Mn. Cet indice permet de caractériser globalement la dispersité des masses molaires d'un polysaccharide. Par basse fréquence, on entend une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, typiquement 20 kHz. Par R(H202/EPS) ou ratio H2O2/EPS, on entend le rapport massique entre la quantité d'H2O2 et la quantité d'EPS introduite. Le procédé de dépolymérisation conforme à l'invention présente les avantages suivants : les rendements obtenus sont élevés, ils sont généralement supérieurs à 90%. Le procédé permet d'obtenir des polysaccharides de masse homogène et par conséquent les indices de polydispersité des produits obtenus sont faibles, c'est-à-dire toujours compris entre 1 et 5, en particulier compris entre 1,5 et 3. Les conditions de dépolymérisation étant douces, le procédé selon l'invention permet un contrôle aisé de la dépolymérisation. En effet, en choisissant la durée d'exposition aux ultrasons on peut contrôler la masse molaire moyenne en poids des chaînes osidiques obtenues, tout en préservant leur structure osidique. Le procédé de dépolymérisation conforme à l'invention et tel que décrit ci-dessus permet entre autre d'obtenir un mélange de chaînes osidiques présentant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 80 000 et 120 000 g/mol et un indice de polydispersité compris entre 1 et 5, en particulier compris entre 1,5 et 3. Les procédés conformes à l'invention peuvent mettre en oeuvre des composés tels que des sels ou des métaux et/ou comprendre des étapes de purification supplémentaires. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le procédé de dépolymérisation conforme à l'invention ne met pas en oeuvre des composés tels que des sels ou des métaux, composés qui peuvent être indésirables pour certaines applications. Selon un mode préféré de réalisation, dans le cas où le procédé ne met pas en œuvre de métaux, les phénomènes de "peeling", c'est-à-dire d'hydrolyse, sont fortement réduits, si bien qu'aucune étape supplémentaire destinée à stabiliser le mélange de chaînes osidiques obtenu n'est requise. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, une étape de purification supplémentaire n'est pas 25 nécessaire. Selon un mode de mise en œuvre de la présente invention, la fréquence des ultrasons utilisée au cours du procédé dépolymérisation est comprise entre 10 et 40 30 kHz, préférentiellement 20 kHz. Selon un mode de réalisation de l'invention, au cours du procédé dépolymérisation H2O2 est ajouté de manière continue au cours de la réaction de dépolymérisation. Typiquement le rapport massique entre la quantité d'H2O2 et la quantité de polysaccharides introduite est compris entre 0,1 et 5, en particulier compris entre 0,3 et 1,5. Selon un mode de réalisation particulier, la réaction de dépolymérisation a lieu à pH neutre, c'est-à-dire à un pH compris entre 6,5 et 7,5. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la concentration initiale en polysaccharide est comprise entre 0,5 g/l et 10 g/l, en particulier comprise entre 2 g/l et 7 g/l. Lorsque les réactions sont terminées, les chaînes osidiques obtenues à la suite de la dépolymérisation peuvent être recueillies par toute technique appropriée bien connue de l'homme du métier telle que par exemple l'ultrafiltration sur membrane, la précipitation. Une fois recueillies, les chaînes osidiques peuvent être lyophilisées. Selon un mode de réalisation de l'invention, les polysaccharides utilisés sont des exopolysaccharides (EPS). Selon un sous mode de réalisation de l'invention il s'agit d'exopolysaccharides provenant de bactéries marines mésophiles issues du milieu hydrothermal profond, en particulier il peut s'agir de bactéries du genre Alteromonas ou Vibrio, ou plus précisément des bactéries Alteromonas macleodii (par exemple les souches HYD657 et MS907 (J Appl Microbiol. 2002;93(2):310-5 et Curr Microbiol. 2003 Jun; 46(6):448-52)), Alteromonas infernus (par exemple la souche GY785 (J Appl Microbiol. 1997 Apr;82(4):422-430)), ou Vibrio diabolicus (par exemple la souche HE800 (Int J Syst Bacteriol. 1997 Oct;47(4):989-95)). Typiquement, les polysaccharides qui sont dépolymérisés par le procédé de l'invention sont des polysaccharides hydrosolubles qui présentent un indice de polydispersité compris entre 1 et 5 et une masse molaire moyenne en poids supérieure à 700 000 g/mol, en particulier supérieure à 1 000 000 g/mol, préférentiellement supérieure à 1 500 000 g/mol. Selon un mode réalisation, le procédé dépolymérisation par ultrasons des polysaccharides hydrosolubles est effectué en présence ou en absence d'H2O2 à une température comprise entre Ti et T2, les températures Tl et T2 étant choisies indépendamment l'une de l'autre, Tl étant choisie parmi les valeurs 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 C et T2 étant choisie parmi les valeurs 60, 65, 70, 75, 80 C, préférentiellement Tl est égale à 50 C et T2 à 70 C, plus préférentiellement Tl et T2 sont égales à 60 C. A ces températures, la cinétique de la réaction est accrue. Ces résultats sont surprenants car il est connu dans l'art antérieur (cf. Chen et al, Carbohydrate Research 299 (1997) 287-294 et Lorimer et al. Ultrasonics Sonochemistry 1995 vol 2 Nol, S55-S57) qu'une élévation de température entraîne une diminution de la cinétique de la dépolymérisation par ultrasons. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, ce phénomène inattendu pourrait s'expliquer par la forte viscosité des polysaccharides soumis au procédé. Une forte viscosité ne favorise pas la dépolymérisation par ultrasons. Ainsi, l'élévation de la température entraîne une diminution de la viscosité du milieu réactionnel, et c'est la diminution de la viscosité qui favorise la dépolymérisation par ultrasons. Typiquement le procédé selon l'invention peut être réalisé à l'échelle industrielle. Des équipements capables de traiter par ultrasons des volumes de produit de l'ordre de 100 1 et plus sont disponibles dans le commerce. Un exemple de montage d'un procédé en continu est commercialisé par Sodeva (process sonitube ). Ce montage peut être décrit de la façon suivante . Le produit contenu dans un réservoir approprié circule en boucle. Le réservoir peut être à double enveloppe avec circulation d'un liquide de refroidissement, pour maintenir le produit dans une fourchette de température précise, si nécessaire. Le produit passe dans un dispositif d'irradiation ultrasonique en continu, le temps opportun pour obtenir l'effet désiré ; certaines applications demandent quelques heures de traitement. Si le traitement est répétitif et le produit présente des caractéristiques constantes, les paramètres de l'opération (puissance ultrasonique dissipée, débit de produit, temps de traitement) peuvent être fixés une fois pour toutes. Si le produit présente des caractéristiques variables, il pourra être avantageux de faire des prélèvements de temps à autre pour contrôler l'état du produit par rapport à l'effet désiré. Le dispositif assure un traitement totalement homogène du lot complet de produit. La puissance unitaire est très élevée : plus de 1500 W par litre pour Sonitube 20 kHz et plus de 5000 W par litre pour le Sonitube de 35 kHz. L'invention couvre également les mélanges de chaînes osidiques susceptibles d'être obtenus selon les procédés de l'invention. En particulier, l'invention couvre les mélanges qui présentent une masse molaire moyenne en poids comprise entre 80 000 et 120 000 g/mol et un indice de polydispersité compris entre 1 et 5, en particulier compris entre 1,5 et 3. La présente invention sera mieux illustrée ci-après à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemples . Les expériences avec ajout d'H2O2 qui suivent, ont été 30 réalisées à basses fréquences (20 kHz) en mode batch. Les expériences ont été réalisées selon les conditions du laboratoire : Les polysaccharides sont dissous dans de l'eau déminéralisée afin d'obtenir une concentration donnée. Un sonificateur haute intensité VCX 600 basse fréquence de 20 kHz commandé par un microprocesseur Vibra Cell 72412 (Bioblock Scientific) est utilisé. Le microprocesseur permet de prérégler la température de consigne et la durée des pulses et de l'intervalle entre ceux-ci. La microsonde conique ultra haute intensité, d'une amplitude de 16% soit environ 100W, permet de travailler sur des échantillons ayant un volume compris entre 1 et 10 ml. La sonde standard haute intensité, d'une amplitude de 40%, permet de travailler sur des échantillons ayant une volume compris entre 10 et 250 ml. Le sonificateur est destiné à délivrer une amplitude constante. Au fur et à mesure que la charge ou la pression exercée sur la face de la sonde augmente, le générateur amplifie automatiquement la puissance afin de garantir que l'amplitude reste telle qu'elle a été sélectionnée. La sonde est préférablement immergée à une profondeur suffisante pour empêcher l'air d'être injecté dans l'échantillon et pour éviter la formation d'aérosol et de mousse. Une syntonisation de la sonde est réalisée régulièrement. Celle-ci augmente l'efficacité et assure un transfert maximum d'énergie, en adaptant la fréquence du générateur d'ultrasons à celle du dispositif convertisseur/sonde.30 La taille des chaînes osidiques a été déterminée à l'aide d'analyse par chromatographie d'exclusion stérique à haute performance (HPSEC). La composition osidique des chaînes a été déterminée à l'aide d'analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Dans tous les essais avec H2O2, la composition osidique est conservée. Description des EPS utilisés pour les différents 10 essais . Tous les EPS utilisés présentent une masse molaire moyenne en poids supérieure à 700 000 g/mol et un indice de polydispersité compris entre 1 et 5. 15 Tableau I Souche COMPOSITION OSIDIQUE Sulfates Ose Ose osamine % Neutre Acide % % % HYD 657 47 26 1.6 5 Alteromonas macleodii sp supsp fijiensis biovar deepsane GY 785 55 40 Les valeurs de Mp et Ip ont été ensuite déterminées. Les résultats obtenus montrent que les chaînes osidiques obtenues présentent une valeur de Mp inférieure à 3000 g/mol et qu'une proportion de ces chaînes présente une structure osidique modifiée. Exemple 3 Importance d'un ajout continu d'H202: Une pompe péristaltique a permis de tester l'effet d'un ajout continu de la solution de peroxyde d'hydrogène. 5 ml d'une solution d'EPS HYD 657 à 4 g/1 ont été placés dans le réacteur et soumis à 2 heures d'ultrasons. Après deux minutes d'ultrasons (pulse de 2s avec un intervalle entre les pulses de 2s), 5 ml d'une solution de peroxyde d'hydrogène permettant d'obtenir le rapport massique final souhaité ont été ajoutés goutte à goutte pendant 100 minutes. Les valeurs de Mp et Ip ont été ensuite déterminées. Les résultats obtenus sont présentés au tableau III. Tableau III Rapport massique = m H202 Ajout Mp (g/mol) Ip mHYD657) 0 - 195 000 1,8 en 1 fois 140 000 2,6 0,5 continu 110 000 1,2 L'ajout de peroxyde d'hydrogène permet de diminuer de façon considérable la masse molaire: celle-ci peut être est divisée par 2 par rapport à l'utilisation des ultrasons seuls. Revendications 1. Procédé de dépolymérisation par ultrasons de polysaccharides caractérisé en ce que la dite dépolymérisation a lieu en présence d'H2O2. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce 10 que la fréquence des ultrasons utilisée est comprise entre 10 et 40 kHz. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-2 caractérisé en ce que H2O2 est ajouté de manière 15 continue au cours de la réaction de dépolymérisation. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-3 caractérisé en ce que le rapport massique entre la quantité d'H2O2 et la quantité de polysaccharides 20 introduite est compris entre 0,1 et 5, en particulier compris entre 0,3 et 1,5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4 caractérisé en ce que la réaction de 25 dépolymérisation a lieu à un pH compris entre 6,5 et 7, 5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-5 caractérisé en ce que la concentration initiale en 30 polysaccharides est comprise entre 0,5 g/1 et 10 g/l. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-6 caractérisé en ce que les polysaccharides sont des exopolysaccharides. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-7 caractérisé en ce que les polysaccharides sont des polysaccharides hydrosolubles qui présentent un indice de polydispersité compris entre 1 et 5 et une masse molaire moyenne en poids supérieure à 700 000 g/mol, en particulier supérieure à 1 000 000 g/mol. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la dépolymérisation est effectuée à une température comprise entre 30 et 80 C, préférentiellement entre 50 et 70 C. 10. Mélange de chaînes osidiques susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1-9. 11. Mélange de chaînes osidiques selon la revendication 10 caractérisé en ce que le mélange présente une masse molaire moyenne en poids comprise entre 80 000 et 120 000 g/mol et un indice de polydispersité compris entre 1 et 5, en particulier compris entre 1,5 et 3.