Brevet FR2890747A1 — publié le 20070316

METHODE ET DISPOSITIF D'ANALYSE SPECTRALE DE LA MODIFICATION DE LA STRUCTURE DE COMPOSES CHIMIQUES DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne une méthode et un dispositif optique qui permettent de collecter et détecter les rayonnements émis par un composant sous l'action d'un faisceau laser incident. Elle s'applique en particulier à l'étude et l'analyse de molécules en mode non destructif. Elle peut notamment être appliquée pour suivre en temps réel l'évolution de la structure d'un composant excité en fonction de l'environnement de ce composant. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Certaines méthodes d'analyse en continu de phénomène physico-chimique font appel à des techniques basées sur des capteurs. Un phénomène physico chimique peut être une variation de température, une mesure de pression, une mesure de pH, une mesure de concentration,... Le élément qui permet de traduire ce phénomène physico chimique en une information exploitable électriquement (ou électroniquement) se dénomme usuellement sous le nom de capteur. Il existe bien entendu un très grand nombre de capteurs. Les technologies utilisées évoluent très rapidement en fonction des progrès de la science. On assiste de plus en plus à des transferts entre métiers 2 2890747 qui apparemment n'ont que peu de rapport: en particulier, les nanotechnologies issues du monde de la microélectronique ont été adaptées avec succès dans le domaine de la biologie. La biologie est en effet un des secteurs de la science les plus demandeurs de ces nouvelles technologies. Il est en effet très délicat de transformer des données d'origine biologique en données exploitables, c'est-à-dire qui peuvent se matérialiser sous forme de signal électrique. Pour répondre à la problématique, les scientifiques cherchent à se rapprocher le plus possible du fonctionnement de phénomènes biologiques. Un exemple concerne la détection d'odeur. Les travaux récents de Richard Axel et de Linda Luck (1991) ont mis en évidence l'existence de récepteurs olfactifs dans les organes sensoriels des mammifères supérieurs. A ce jour, les instruments qui ont été développés pour assurer la détection d'odeur utilisent des technologies basées sur des capteurs essentiellement issus du monde de la microélectronique. Ils ne sont ni sensibles, ni sélectifs, et présentent des performances très éloignées d'un nez naturel (humain ou animal). Il est donc tentant d'étudier le fonctionnement d'un neurone olfactif, et d'essayer d'en extraire le récepteur spécifique qui pourrait être potentiellement utilisé pour capter une odeur, ou, plus précisément, une molécule odorante. De nombreux travaux 3 2890747 ont donc été entrepris pour identifier ce principe, et une des propositions les plus intéressantes est basée sur l'utilisation de protéine(s) recombinante(s) issue(s) de la séquence des gènes codant les récepteurs olfactifs. Cette protéine recombinante (ces protéines recombinantes), si la séquence a été correctement choisie, est (sont) susceptible(s) de lier spécifiquement la ou les molécules odorantes correspondantes. Une analyse détaillée du fonctionnement du récepteur olfactif montre qu'il s'agit en fait d'une modification de la structure de la protéine: d'un coté la protéine seule, de l'autre la protéine avec une molécule odorante. A ce stade, les groupes de recherche butent sur une difficulté majeure: comment identifier la différence entre une protéine (ici un récepteur olfactif) suivant qu'elle s'est liée ou non à une molécule odorante, ou plus généralement, un récepteur, suivant qu'il est lié ou non à son ligand? Plusieurs techniques sont disponibles en 25 chimie analytique, pour l'analyse de la structure d'une molécule. La plus connue concerne la spectrométrie de masse. Cette technique permet de d'identifier très précisément les atomes qui entrent dans la composition de la molécule. Elle délivre des informations extrêmement précises sur les différents constituants 4 2890747 d'une molécule. La Spectrométrie de Masse présente néanmoins un inconvénient majeur: elle est destructive. L'échantillon est définitivement détruit pendant l'analyse. Il n'est donc pas possible d'étudier les transformations d'une molécule dans un processus continu. Il existe une autre méthode qui repose sur la fluorescence. Un marqueur fluorescent est greffé sur le récepteur olfactif, et l'homme de l'art espère que cette fluorescence sera modifiée par la réception de la molécule d'odeur. Cette technologie a deux principales faiblesses: le greffage du marqueur perturbe nécessairement le fonctionnement du récepteur, et la mesure de la variation de fluorescence est très délicate à mettre en place, ne serait-ce que parce que le niveau du signal de fluorescence est lui-même très faible. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention vise à résoudre les difficultés rencontrées avec les techniques précédentes pour détecter la variation des propriétés, notamment le changement conformationnel, d'un récepteur biologique sous l'effet d'un ligand. L'invention repose sur l'utilisation des propriétés de l'effet Raman lorsqu'on excite le récepteur biologique avec un faisceau laser. 2890747 On s'est en effet rendu compte que les spectres Raman émis par un récepteur biologique peuvent fournir des indications particulièrement pertinentes sur des changements conformationnels d'un tel récepteur biologique sous l'effet d'un ligand. En particulier, ces indications peuvent être utilisées pour identifier la présence ou non de molécule odorante. Le récepteur biologique peut être en son état naturel ou modifié par génie génétique. L'effet Raman est un phénomène connu depuis très longtemps (Chandrasekhara Venkata Raman, Nature, 121-619, 1928). Un laser excite le composant à une longueur d'onde donnée. Ce composant, sous l'effet de cette énergie, se met à émettre un spectre de lumière qui est très proche de la longueur d'onde d'excitation. Le spectre émis est fonction non seulement de la composition, mais aussi de la structure de la molécule dans une mesure qui peut être suffisante pour détecter l'association d'un récepteur avec un ligand L'avantage majeur de cette technique est qu'elle ne touche pas à l'intégrité du récepteur. En pratique, l'analyse de structure d'une molécule par effet Raman, très prometteuse, est limitée par deux facteurs: la sensibilité peut s'avérer difficile à obtenir, et l'identification de chacun des constituants de la molécule le long du spectre obtenu peut se révéler très difficile. 6 2890747 Une avancée importante est apparue en 2001, quand on a pu montrer que l'utilisation de lasers fonctionnant dans l'UV (224 nm ou 248 nm) augmentait considérablement le niveau d'émission de l'effet Raman (Storrie-Lombardi M.C., Hollow cathode ion lasers for deep ultraviolet Raman Spectroscopiy and Fluorescence imaging. American Institute of Physics. 2001). Les résultats de cette publication ont montré qu'il est tout à fait possible d'utiliser l'effet Raman pour étudier la structure d'une molécule. Par ailleurs, la puissance instantanée de ces lasers, autour de 10 mW réel, est compatible avec les molécules utilisées en biologie moléculaire, ce qui n'est pas vrai pour les lasers dits pulsés, où la puissance instantanée peut atteindre plusieurs kW, et détruire ainsi la molécule irradiée. Profitant de cette constatation, il est prévu selon une réalisation préférentielle de l'invention d'utiliser, pour identifier une différence exploitable entre un récepteur biologique seul et un récepteur biologique lié avec un ligand l'effet Raman produit par son excitation par des lasers fonctionnant dans les UV (200 à 300nm, et avantageusement dans la partie basse des longueurs d'onde où le rendement de l'émission du spectre Raman est le plus important, 224 nm par exemple). Une deuxième difficulté pratique, malheureusement rencontrée, est que les lasers UV sont très difficiles à manipuler, et les expérimentations sont restées au niveau de la recherche. A cet égard, l'invention prévoit de mettre avantageusement à profit une deuxième avancée réalisée par l'utilisation d'un système de collecte basé sur les propriétés de réflexion d'un matériau approprié aux longueurs d'onde du spectre Raman collecté. A cet effet, il est proposé d'utiliser avantageusement le dispositif optique de la demande de brevet FR 03 14519 pour collecter l'effet Raman émis par les récepteurs biologiques. Ce dispositif présente non seulement un excellent rendement de collecte de l'effet Raman, mais est aussi compatible avec la longueur d'onde laser 224 nm qui est la plus performante. L'invention permet ainsi d'utiliser, pour identifier une différence exploitable entre un récepteur biologique seul et un récepteur biologique sur laquelle s'est lié un ligand tel qu'une molécule odorante, un procédé de détection non destructif qui est l'effet Raman, en association avec des lasers fonctionnant dans les UV (224 nm par exemple), et une cellule de collecte de l'Effet Raman compatible avec les lasers UV, et qui seule peut proposer un rendement de collecte suffisant pour avoir un signal exploitable. L'invention est compatible avec des procédés de mesure continue. 8 2890747 Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode d'analyse spectrale non destructive d'un échantillon de matière dans laquelle on irradie une zone quasi ponctuelle de celui-ci avec une radiation lumineuse incidente et on détecte en une autre zone spatialement distincte de la zone irradiée tout ou partie du rayonnement émergent de l'échantillon en réponse pour détecter le spectre Raman reflétant les propriétés de résonance de l'échantillon sous l'effet de la radiation incidente, caractérisé en ce qu'on récupère le rayonnement émergent dans un angle solide couvrant au moins 10 % de la totalité des émissions Raman de l'échantillon dans au moins une longueur d'onde voisine de la longueur d'onde du rayonnement incident pour analyser une partie substantielle de l'intensité du spectre Raman émis par l'échantillon. Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet un dispositif d'analyse spectrale non destructive d'un échantillon de matière, comportant des moyens pour présenter une zone quasi-ponctuelle de l'échantillon à une radiation lumineuse incidente, des moyens de collection d'une radiation lumineuse émergeant de l'échantillon sous l'effet de l'excitation de la radiation incidente pour la diriger vers une zone de détection dans le dispositif, caractérisé en ce que ces moyens de collection comportent une surface réfléchissante concave disposée autour d'un axe passant par la zone quasi ponctuelle apte à concentrer une fraction substantielle de la lumière émergente vers 9 2890747 ladite zone de détection et en ce que ladite surface réfléchissante est réalisée en un matériau adapté à la réflexion des rayons ultraviolets de préférence dans la fourchette de 200 nm à 300 nm et avantageusement à 224 nm. La surface réfléchissante concave peut être un miroir elliptique concave, où la zone quasi-ponctuelle et la zone de détection sont placées respectivement aux deux foyers du miroir elliptique. Un mode de réalisation d'un dispositif conforme à un aspect de l'invention comporte des moyens de présentation d'un échantillon destiné à être irradié par un faisceau laser et des moyens de collection de la lumière émise en réponse par l'échantillon. Les moyens de présentation comprennent un disposition de circulation de fluide au voisinage immédiat de la zone quasi-ponctuelle de l'échantillon, cette dernière contenant au moins un capteur susceptible de réagir à la présence d'un ligand dans le fluide. Dans un mode de réalisation comportant une série de capteurs placés les uns à coté des autres, un système de déplacement relatif entre les capteurs et le dispositif d'irradiation et de collecte permet d'analyser séquentiellement l'état des capteurs (présence ou non de ligand) à l'aide d'un moyen unique d'excitation/détection. Le dispositif de réalisation comprend un support, en forme de bande étroite, réalisé dans un matériau transparent aux UV (Silice UV par exemple), et de faible épaisseur, de façon à limiter les 2890747 perturbations dues aux variations d'indice de diffraction, que ce soit pour le laser ou pour l'énergie lumineuse émise par le récepteur biologique. A l'extrémité de ce support, le récepteur biologique est fixé sur le support par des moyens appropriés. Ce support est inséré dans un tube de silice transparente aux UV, de telle façon qu'il soit possible de faire circuler un fluide à l'intérieur de ce tube. Le tube peut avoir une section circulaire, carrée, ou rectangulaire. Le tube et son support sont installés dans une cellule elliptique creuse, dont la surface réfléchissante est réalisée en aluminium ou alliage d'aluminium, protégée ou non par un dépôt de nickel, de telle façon que le récepteur biologique soit placé sur un des deux foyers, et que l'axe du tube soit perpendiculaire à l'axe de révolution de l'ellipse. Un faisceau laser est focalisé sur le récepteur biologique, grâce à une ouverture aménagée à proximité du deuxième foyer de la cellule elliptique. Il est prévu une deuxième ouverture dans le prolongement du faisceau laser, pour éviter les réflexions dues à la cellule elliptique, et une troisième ouverture autour de l'axe de réflexion du faisceau laser sur le support, aussi pour éviter les réflexions du faisceau laser dans la cellule. Une lentille est placée à proximité du deuxième foyer, de telle façon que son point focal coïncide avec le deuxième foyer de l'ellipse. De cette façon, l'effet Raman collecté par la cellule se matérialise sous forme de rayons lumineux parallèles. 11 2890747 Un spectrographe, l'instrument qui permet la détection de l'effet Raman, est placé dans le grand axe de la cellule elliptique, juste après la lentille de collecte. Dans un tel dispositif adapté spécifiquement à la détection d'odeur, un écoulement gazeux circulant à l'intérieur du tube vient lécher le récepteur biologique constitué d'un récepteur olfactif fixé à l'extrémité du support. Ce récepteur olfactif émet donc un effet Raman en permanence. Cet effet Raman est collecté par la cellule elliptique, et est analysé par le Spectrographe, qui délivre le spectre Raman du récepteur olfactif. Quand ce récepteur olfactif fixe une molécule d'odeur portée par l'écoulement, elle émet aussi un effet Raman, mais différent de celui du précédent. Le Spectrographe est alors en mesure d'afficher cette différence, et donc de détecter la présence ou non d'une molécule odorante. Selon une variante de réalisation, il est possible d'installer plusieurs récepteurs olfactifs à l'extrémité du support longitudinal en silice. Le support longitudinal est glissé à l'intérieur d'un tube de silice transparente aux UV. La mesure de l'effet Raman de chacune des récepteurs olfactifs sera assurée d'une manière séquentielle de façon à ce que chaque récepteur olfactif soit éclairé tour à tour par le faisceau 12 2890747 laser. Cette fonction peut être assurée soit en déplaçant le support longitudinal, soit en déplaçant la cellule elliptique. Les mouvements mécaniques du support longitudinal ou de la cellule elliptique peuvent être réalisés en mode pas à pas, ou en continu. Des moyens logiciels appropriés permettent de piloter le spectrographe, et donc d'isoler les différents spectres Raman correspondant aux récepteurs olfactifs déposés sur le support. Cette variante permet des analyses beaucoup plus complètes des molécules d'odeur contenues dans le fluide. Le tube qui assure la mobilité des fluides sera dimensionné pour recevoir le support longitudinal. Bien entendu, la méthode et le dispositif ainsi décrits peuvent être étendu à d'autres types de mesures, autre que les molécules odorantes, et à d'autres types de milieu, qu'ils soient liquides ou gazeux, et à des mesures continues ou discontinues. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels: 13 2890747 - les figures la et lb sont des vues en coupe illustrant, de manière schématique, un procédé de collecte de l'effet Raman, selon l'invention; - les figures 2a et 2b sont des vues de dessus, illustrant, de manière schématique, l'utilisation du procédé pour collecter de l'Effet Raman sur plusieurs récepteurs olfactifs. 14 2890747 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS La figure la est une vue détaillée en coupe longitudinale illustrant, de manière schématique, le positionnement du récepteur olfactif dans le dispositif. Le récepteur olfactif 1 est positionné sur le support longitudinal 2, et l'ensemble support/récepteur olfactif est inséré dans un tube 3, de telle façon qu'un fluide liquide ou gazeux puisse circuler, de 4 en 5. La figure lb est une vue détaillée de 15 l'ensemble du dispositif permettant de collecter l'effet Raman du récepteur olfactif. Le tube 3, avec le support 2 du récepteur olfactif 1, est positionné à l'intérieur d'une cellule elliptique 6, de telle façon que le récepteur olfactif coïncide avec le foyer de la cellule elliptique, et que l'axe du tube 3 soit perpendiculaire à l'axe de révolution de la cellule elliptique. Un faisceau laser 7 est focalisé au moyen d'une lentille 17 sur le récepteur olfactif 1 en traversant le tube 3. Une partie du faisceau laser 8 traverse ensuite le support 2, traverse de nouveau le tube 3, et est évacué par l'orifice 9, de façon à éviter les réflexions directe sur la paroi de la cellule elliptique. Une autre partie du faisceau laser 2890747 est réfléchie par le support 2 et est évacuée par l'orifice 11 de façon, de nouveau, à éviter les réflexions parasites du faisceau laser sur la paroi de la cellule elliptique. Une lentille 12 collecte l'énergie lumineuse 13 émise par le récepteur olfactif 1, pour rendre les faisceaux parallèles 14. Un spectrographe 15 est placé en sortie de la lentille pour assurer la détection du spectre Raman. Les spectres Raman sont stockés et comparés par informatique 16. La comparaison donne l'information sur le couplage ou non d'une molécule odorante sur un récepteur olfactif. Les figures 2a et 2b donnent les schémas du dispositif optique, quand plusieurs récepteurs olfactifs sont installés sur le support. La figure 2a est une vue détaillée de dessus du support longitudinal, avec plusieurs récepteurs olfactifs. Les récepteurs olfactifs 1 sont positionnés sur le support longitudinal 2. Leur nombre n'est pas limitatif, et est fonction de la précision attendue en terme de détection d'odeur. 16 2890747 La figure 2b est une vue de dessus, la coupe étant faite au foyer de la cellule elliptique, et dans un plan perpendiculaire à l'axe de symétrie de la cellule elliptique. Elle montre les mouvements du support longitudinal par rapport à la cellule elliptique de façon à ce que chaque récepteur olfactif se présente à tour de rôle au point focal de la cellule elliptique, de façon à ce que le Spectrographe soit en mesure de collecter le spectre Raman correspondant. Soit la cellule elliptique est fixe, et c'est le support longitudinal qui est en mouvement, soit la le support longitudinal est fixe, et c'est la cellule elliptique qui est en mouvement. La figure 2b montre un exemple où le support reçoit 15 récepteurs olfactifs. Il y aura donc 15 positions différentes du support ou de la cellule. La figure 2b ne montre que 3 positions. 17 2890747 REVENDICATIONS 1. Méthode d'analyse non destructive par effet Raman d'un milieu contenant un récepteur biologique, notamment olfactif, susceptible de fixer un ligand, notamment une cellule odorante, dans laquelle on irradie dans une cellule d'analyse elliptique un échantillon de ce milieu à l'aide d'une radiation lumineuse contrôlée et on analyse au moins une partie de la lumière émise par l'échantillon et réfléchie par la cellule d'analyse en réponse à cette excitation par la radiation incidente, caractérisé en ce que ledit composant est un récepteur olfactif capable de fixer sélectivement au moins un molécule odorante au contact d'un environnement donné, que la radiation incidente est choisie pour favoriser l'excitation d'un effet Raman dans le composant irradié et que l'on analyse au moins une partie du spectre Raman ainsi produit pour déterminer si le récepteur olfactif a fixé ou non une molécule odorante en provenance dudit environnement. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la radiation incidente est sélectionnée dans l'ultraviolet, de préférence dans la fourchette de 200 nm à 300 nm et avantageusement à 224 nanomètres. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'on excite le composant par la radiation lumineuse dans une zone quasiponctuelle d'une cellule d'analyse et qu'on reçoit le rayonnement 18 2890747 Raman émis par l'échantillon en une autre zone spatialement distincte de la zone d'excitation. 4. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que la zone quasi ponctuelle et le point de réception constituent les deux foyers d'une portion de miroir elliptique concave qui réfléchit les rayons de la zone quasi-ponctuelle d'excitation vers la zone où l'on reçoit le rayonnement Raman. 5. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'on fait circuler un fluide contenant des molécules odorantes au contact d'au moins un capteur contenant ladite protéine de récepteur olfactif (OR). 6. Méthode selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'on fait circuler ledit fluide au contact d'une batterie de capteurs comportant chacun au moins un OR spécifique et qu'on détecte le ou les capteurs correspondant à une protéine ayant fixé une molécule odorante pour obtenir une indication sur la nature de cette molécule. 7. Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'on interroge successivement la réponse des capteurs à l'aide d'un moyen unique d'excitation/détection 8. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'on récupère le rayonnement 19 2890747 émergent dans un angle solide couvrant au moins 10 % de la totalité des émissions Raman de l'échantillon dans au moins une longueur d'onde voisine de la longueur d'onde du rayonnement incident pour analyser une partie substantielle de l'intensité du spectre Raman émis par l'échantillon. 9. Méthode selon la revendication 8 caractérisée en ce que la récupération du rayonnement émergent s'effectue par réflexion et que l'on concentre l'énergie réfléchie vers une zone de détection distincte de la zone quasi ponctuelle d'irradiation. 10. Méthode d'analyse spectrale non destructive selon la revendication 9, caractérisée en ce que la zone de détection est une zone quasi ponctuelle de rayonnement dans une deuxième zone quasi ponctuelle distincte de la zone quasi ponctuelle 20 d'irradiation placée au second foyer d'un miroir elliptique concave au premier foyer duquel est située la zone quasiponctuelle d'irradiation. 11. Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'on utilise une radiation lumineuse incidente dans le domaine de l'ultraviolet de préférence dans la fourchette de 200 nm à 300 nm et avantageusement à 224 nanomètres. 12. Dispositif de mise en oeuvre de la méthode d'analyse non destructive selon l'une des 2890747 quelconques revendications précédentes, comportant des moyens pour présenter une zone quasi-ponctuelle de l'échantillon à une radiation lumineuse incidente, des moyens de collection d'une radiation lumineuse émergeant de l'échantillon sous l'effet de l'excitation de la radiation incidente pour la diriger vers une zone de détection dans le dispositif, caractérisé en ce que ces moyens de collection comportent une surface réfléchissante concave disposée autour d'un axe passant par la zone quasi ponctuelle, apte à concentrer une fraction substantielle de la lumière émergente vers ladite zone de détection et en ce que ladite surface réfléchissante est réalisée en un matériau adapté à la réflexion des rayons ultraviolets de préférence dans la fourchette de 200 nm à 300 nm et avantageusement à 224 nm. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que la surface réfléchissante est réalisée en aluminium ou en un alliage d'aluminium et les moyens de détection sont sensibles à une longueur d'onde voisines de la longueur d'onde émise pour permettre la détection du spectre Raman de l'échantillon. 14. Dispositif selon la revendication 12 caractérisé en ce que les moyens de présentation comportent une dispositif de circulation de fluide à proximité de la zone ponctuelle. 21 2890747 15. Dispositif selon la revendication 14 dans le quel les moyens de présentation présentent un capteur susceptible de réagir avec le fluide dans la zone quasi ponctuelle pour modifier sa réponse à la radiation d'excitation en fonction de la présence d'un constituant prédéterminé dans le fluide. 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisant en ce que les moyens de présentation présentent une pluralité de capteurs en contact avec le fluide circulant, et des moyens propre à déplacer le support des capteurs par rapport à la zone ponctuelle d'irradiation relativement à l'autre. 20 25