Brevet FR2890081A1 — publié le 20070302

Domaine de l'invention La présente invention divulgue une méthode pour identifier et quantifier les microorganismes utiles dans les procédés de l'industrie biominière présents dans un échantillon. Cette méthode est présentée comme un outil utile dans l'industrie biominière, dans tous les cas où on requiert d'évaluer la population microbiologique présente, aussi bien sur le minéral lui-même que dans des solutions, dans des piles de biiolixiviation, dans le laboratoire biominier ou dans quelque autre endroit qui implique l'utilisation desdits microorganismes. Art antérieur de l'invention L'industrie biominière est, dans des termes généraux, l'utilisation de microorganismes pour la récupération de métaux à partir des minéraux. Son expression plus traditionnelle est la biolixiviation, qui comprend non seulement ces procédés biorniniers, mais aussi son contrôle et son déroulement, étant donné que ces techniques sont complexes et qu'elles se trouvent en développement constant, ainsi que la recherche au niveau du laboratoire associée à l'amélioration des procédés ou au développement de nouvelles méthodologies. Jusqu'à présent, la biolixiviation est toujours le procédé le plus important dans le cadre de l'industrie biominière, et elle est définie comme une méthode de solubilisation de métaux à partir de matrices complexes dans un milieu acide, en utilisant l'action directe ou indirecte de microorganismes. Les microorganismes qui sont utiles dans ces procédés appartiennent tant au domaine Bacteria qu'au domaine Archaea et remplissent deux conditions basiques: ils sont acidophiles et chimiolithotrophes. 2890081 2 Diversité microbiologique des communautés associée aux procédés de biolixiviation On a décrit de nombreux microorganismes qui sont utiles dans les procédés de biolixiviation, parmi lesquels on peut identifier dix taxons: 3 genres et 2 espèces du domaine Bacteria, les genres Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp. et les espèces Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans, et cinq genres du domaine Archaea, les genres Acidianus sp., Ferroplasma sp., Metallosphaera sp., Su/fo/obus sp. et Thermoplasma sp. (Rawlings DE. Heavy metal mining using microbes. Annu. Rev. Microbiol. 2002; 56: 65-91; Rawlings DE. Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microb. Cell. Fact. 2005 Mai 6; 4(1): 13). Facteurs qui déterminent la diversité et l'activité métabolique de la communauté microbiologique associées au procédé de biolixiviation Chacun des genres ou espèces indiqués ci-dessus, catalyse des réactions différentes et requiert des conditions différentes pour effectuer lesdites réactions qui, par exemple, peuvent être aérobies ou anaérobies, ou peuvent requérir une substance nutritive spécifique. C'est pour cela que les conditions environnementales clans lesquelles on réalise le procédé de biolixiviation modifieront la composition bactérienne de la communauté. D'autre part, il a été proposé que la participation des microorganismes dans le procédé de biolixiviation puisse être directe et/ou indirecte (Rawlings DE. Characteristics and adaptability of iron-and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microb. Cell. Fact. 2005 Mai 6; 4(1): 13). Cette participation serait directe quand les microorganismes oxydent directement le métal d'intérêt ou son contre-ion, en libérant dans les deux cas un ion du métal d'intérêt dans la solution. D'autre part, ladite participation serait indirecte quand le microorganisme n'utilise pas le métal d'intérêt ni son contre-ion comme substrat, mais génère les conditions chimiques qui permettent la solubilisation dudit métal, soit par l'acidification du milieu (par exemple, en générant de l'acide sulfurique) soit en générant un agent oxydant qui finalement interagit avec le sel (métal et contre-ion) qu'on cherche à solubiliser. Compte tenu de ce qui a été exposé, il est possible que la communauté bactérienne change de composition d'espèces en fonction du temps de biolixiviation qu'on applique aux différents échantillons minéraux et/ou en fonction de la prédominance des conditions ambiantes dans lesquelles ce procédé est réalisé. Par exemple, les espèces correspondant au genre Acidithiobacillus sont capables de catalyser l'oxydation des composés réduits du soufre (comme sulfure, soufre élémentaire, thionates, etc.) en utilisant l'oxygène comme accepteur d'électrons et en générant de l'acide sulfurique comme produit final et aussi des espèces réductrices telles que le sulfite et le thiosulfate, comme produits intermédiaires, ce qui permet de solubiliser les métaux associés à des sulfures dans le minéral. Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans sont capables de catalyser l'oxydation du fer(ll) en fer(llI) en utilisant l'oxygène comme accepteur d'électrons, et le fer(III) généré est un agent oxydant puissant qui peut oxyder les sulfures présents ou un autre composé dont on requiert l'oxydation. La pratique habituelle dans l'industrie minière des procédés de biolixiviation est de laisser une pile de minéral dans un milieu acide, généralement de l'acide sulfurique, et de renouveler constamment le milieu acide pour obtenir le métal par électrolyse. Fréquemment on obtient des piles dans lesquelles le rendement de récupération du métal est efficace, et des piles inefficaces , celles qui, dans les mêmes conditions opérationnelles et caractéristiques du substrat qui va être lixivié, ont un rendement faible. L'explication de ce résultat disparate requiert d'élucider s'il y a des différences en abondance et nombre d'espèces dans la communauté microbiologique des deux piles. De cette façon, le problème du faible rendement pourrait être expliqué par la composition de la communauté biologique, et à son tour il pourrait être résolu au moyen de l'inoculation des microorganismes qui catalysent la réaction que l'on a besoin de maintenir pendant le procédé de biolixiviation. Cependant, à ce jour, il n'existe pas de méthode qui permette de quantifier la population d'archébactéries et de bactéries utiles dans des procédés de l'industrie biominière. La présente demande décrit une méthode qui résout le problème technique décrit précédemment, en fournissant une méthode pour identifier et quantifier la présence des microorganismes connus pour être les plus efficaces dans les procédés de l'industrie biominière, les bactéries: Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans; et les archébactéries: Acidianus sp., Ferroplasma sp., Metallosphaera sp., Su/fo/obus sp. et Thermoplasma sp. La technique choisie pour développer cette méthode est la réaction en chaîne de polymérisation (PCR) nichée. Dans cette technique, on amplifie d'abord, dans une première réaction de PCR, une région conservée du génome des microorganismes, soit des bactéries soit des archébactéries. On a choisi comme région conservée le gène 16S de I'ADNr. Ensuite, on utilise des amorces spécifiques pour chaque taxon (genre ou espèce) pour identifier, dans une seconde réaction de PCR, la présence des microorganismes d'intérêt. Cette seconde réaction de PCR est réalisée dans un équipement qui permet de mesurer l'accroissement du produit amplifié à chaque cycle d'amplification, information qui permet de quantifier, par 2890081 5 interpolation, la quantité originale du génome d'intérêt dans l'échantillon analysé. La réaction de PCR dans ces conditions est appelée PCR quantitative ou qPCR. Une étape critique dans la technique de la PCR nichée est le dessin des amorces de la seconde réaction d'amplification, qui doivent être spécifiques pour le taxon à déterminer, aspect extrêmement important dans ce cas particulier, étant donné que les échantillons sur lesquels on appliquera le procédé sont généralement des échantillons métagénomiques. Par conséquent, il est nécessaire de diminuer la possibilité d'hybridation non-spécifique des amorces avec des séquences présentes dans le génome de microorganismes non identifiés dans la communauté. Pour le dessin de ces amorces, on a produit deux outils fondamentaux: premièrement une base de données de séquences 16S d'ADNr épurée, obtenue à partir de toutes les séquences 16S d'ADNr divulguées et un programme d'ordinateur de dessin d'amorces qui utilise comme données d'entrée ladite base de données et qui permet le dessin des amorces spécifiques et thermodynamiquement stables. Dans l'état de la technique, il existe de nombreux exemples d'application de la PCR nichée ou de la qPCR, mais aucun d'entre eux n'est appliqué aux bactéries ou archébactéries utiles dans des procédés de l'industrie biominière. Par exemple, la publication de J.L.M. Rodrigues et al. (Journal of Microbiological Methods 51 (2002): 181-189) décrit une qPCR pour détecter et quantifier des Rhodococcus qui dégradent des PCB présents dans le sol, où on séquence le gène 16S de dADNr de la souche ayant l'activité souhaitée, on dessine des amorces spécifiques pour ladite séquence et on réalise des réactions de qPCR avec lesdites amorces. Dans cette publication, on utilise une stratégie de qPCR directe, et pas nichée, dirigée à d'autres classes de microorganismes, dont le maniement a été largement étudié et on trouve différentes techniques d'extraction d'ADN de départ. Un autre document qui emploie une stratégie similaire est la demande de brevet EP 1 484 416, qui divulgue une méthode de détection et de quantification de bactéries et de champignons pathogènes présents dans un échantillon environnemental, qui emploie une réaction de qPCR. La méthode comprend l'extraction de l'ADN des bactéries et des champignons présents dans un échantillon environnemental, l'obtention d'amorces spécifiques, sens et inverses, pour chaque taxon à détecter et quantifier, et la réalisation de réactions de qPCR avec une paire d'amorces pour chacun des pathogènes visés. On pourrait continuer en énumérant des documents dans lesquels on identifie et quantifie des microorganismes avec la technique de la PCR quantitative, puisqu'elle est une technique connue, mais l'important est d'avoir construit une base de données épurée qui permette un dessin d'amorces spécifiques et qui n'avait pas été mise en oeuvre jusqu'à ce jour pour l'identification de microorganismes utiles dans des procédés de l'industrie biominière, objet de la présente invention. Description résumée de l'invention. 20 La présente invention divulgue une méthode pour identifier et quantifier les microorganismes de l'environnement utiles dans les procédés de l'industrie biominière. Ces microorganismes sont basiquement au nombre de 10, 5 du domaine Bacteria: Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans; 5 du domaine Archaea: Acidianus sp., Ferroplasma sp, Metallosphaera sp, Su/fo/obus sp. et Thermoplasma sp. La méthode comprend la réalisation d'une PCR en deux étapes connue 30 comme PCR nichée, où dans la première étape, appelée PCR primaire, on amplifie les séquences 16S de l'ADN ribosomal (nucléotides 27 à 1492, par rapport à I'ADNr d'Escherichia cols) en utilisant des amorces universelles pour le domaine Bacteria ou pour le domaine Archaea. Dans la seconde étape, ces séquences amplifiées primaires sont utilisées comme matrices pour des réactions de qPCR, ou PCR secondaire, dans lesquelles on utilise des amorces universelles internes pour le domaine Bacteria, ou pour le domaine Archaea, en correspondance, et des séquences spécifiques, dessinées par notre laboratoire pour les différents taxons à déterminer. La première PCR multiplie linéairement les séquences 16S des bactéries ou archébactéries, de façon à augmenter la qualité des matrices pour la PCR secondaire en conservant la proportion originale des organismes présents dans l'échantillon. Ceci garantit que le procédé général aura une sensibilité supérieure à celle obtenue dans le cas d'une utilisation directe des amorces spécifiques du taxon sur l'échantillon. Cependant, la méthode fonctionne aussi et elle est applicable sans la PCR primaire, et par conséquent cette étape aurait un caractère optionnel. Avec les résultats de la qPCR et des autres données de l'échantillon analysé on calcule, au moyen d'une formule, la concentration de microorganismes de chacun des taxons analysés présents dans l'échantillon. Brève description des figures. Les Figures 1 à 7 montrent les résultats de l'exemple 1, où on a quantifié la présence de Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp., Acidiphilium sp. et les bactéries totales sur 7 échantillons différents. Dans chaque figure on présente graphiquement les résultats pour chacun des échantillons solides (MS), identifiés comme MS-1, MS-2, MS-3, MS-4, MS-5, et pour les échantillons liquides (ML) ML-1 et ML-2. Pour chaque graphique, on a indiqué les taxons quantifiés en abscisse et le nombre de microorganismes par unité d'échantillonnage en ordonnées, en échelle logarithmique. Les données qui sont à l'origine des graphiques sont présentées dans les Tableaux 26 à 32. À partir de ces résultats, on peut observer quelle est l'espèce prédominante dans chacun des échantillons de minéral des piles de biolixiviation (MS-1 à MS-5) et des échantillons liquides récupérés à partir des effluents de biolixiviation (ML-1 et ML-2). En outre, cette valeur peut être comparée avec les bactéries totales trouvées clans les échantillons. C'est ainsi que dans 6 des 7 échantillons on observe une prédominance de Leptospirillum sp. et même que, dans un des échantillons liquides, ce genre de microorganismes est l'unique genre présent. Un seul des échantillons solides (MS-2) présente une prédominance d'A. thiooxidans, et on en conclut que, dans ce genre d'échantillons minéraux, le microorganisme le plus abondant serait Leptospirillum sp. Les Figures 8 et 9 montrent les résultats de l'exemple 2, où on a quantifié la présence de Sulfobacillus sp, Sulfolobus sp, Ferroplasma sp., les bactéries totales et les archébactéries totales dans deux échantillons différents obtenus à partir de minéral des piles de biolixiviation. Pour chaque figure, on a présenté les résultats graphiquement pour chacun des échantillons solides (MS), identifiés comme MS-6 et MS-7. Pour chaque graphique, on a indiqué les taxons quantifiés en abscisse et le nombre de microorganismes par unité d'échantillonnage en ordonnées en échelle logarithmique. Les données qui sont à l'origine des graphiques sont présentées dans les Tableaux 45 et 46. À partir de ces résultats, on peut conclure que la quantité de microorganismes du domaine Archaea est inférieure dans les deux échantillons, par rapport à celle du domaine Bacteria. Cependant, dans l'échantillon MS-6, on a observé que les quantités spécifiques du genre Sulfolobus (Archaea) sont légèrement supérieures au nombre de bactéries du genre Sulfobacillus, ce qui indique qu'il y a un grand nombre de bactéries appartenant à d'autres genres présents dans les échantillons. De même, dans l'échantillon MS-7 on détecte la présence d'un microorganisme du genre Ferroplasma, absent de l'échantillon précédent. Ces données peuvent être, de nouveau, l'explication des comportements spécifiques de la communauté présente dans le minéral analysé. Description détaillée de l'invention. Comme déjà mentionné, l'invention concerne une méthode qui permet d'identifier et de quantifier les microorganismes essentiels dans les procédés de l'industrie biominière. Ces microorganismes essentiels appartiennent à 10 taxons: soit du domaine Bacteria: les genres Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp., et les espèces: Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans; soiit du domaine Archaea: les genres Acidianus sp., Ferroplasma sp, Metallosphaera sp, Su/fo/obus sp. et Thermoplasma sp. Comme indiqué, pouvoir compter sur une méthode qui permette d'identifier et de quantifier les microorganismes biominiers aurait des applications dans différents secteurs du travail industriel. Par exemple, identifier quels microorganismes sont présents dans une pile de biolixiviation et en quelle quantité serait un outil pour contrôler de façon appropriée le procédé de biolixiviation, puisqu'on pourrait établir s'il est nécessaire d'inoculer un microorganisme particulier ou simplement déterminer quels nutriments doivent être ajoutés au mélange, en maximisant de cette façon la quantité de minéral récupérée par le procédé. L'idée est de mettre en rapport l'efficacité de récupération des différents métaux présents dans la pile avec la composition de la communauté microbiologique dans la pile, en nombre et genre des individus présents. Dans les exemples, les échantillons à analyser par la méthode de l'invention seront des échantillons biominiers, mais ceux-ci ne limitent pas la portée de l'invention, puisque la méthode décrite, objet de la présente invention, peut s'appliquer chaque fois qu'on a besoin d'identifier et de quantifier un ou plusieurs des 10 taxons. Dans la description de l'invention, toutes les séquences d'oligonucléotides sont décrites de 5' en 3'. Les oligonucléotides décrits correspondent aux amorces pour les réactions de PCR. II est indiqué expressément si ce sont des amorces sens ou inverses (par exemple, en en-tête d'un tableau) ou, alternativement, en incluant dans le nom de l'amorce la lettre F' pour les amorces sens et la lettre 'R' pour les amorces inverses. Ensuite, on décrira en détail chacune des étapes de la méthode. Préparation de l'ADN. Dans une première étape, on extrait l'ADN de l'échantillon. Différentes méthodes ont été divulguées pour extraire l'ADN à partir d'échantillons de minéral ou de sol, et on peut employer l'une d'entre elles, en considérant dans chaque cas la nature particulière de l'échantillon. (Appt. Environ. Microbiol. 2003 Jui; 69(7): 4183-9; Biotechniques. 2005 Avr; 38(4): 579-86). Dans le cas où l'ADN total extrait (à partir d'échantillons de minéral, ce qui peut être, par exemple, chalcopyrite, concassée classe 1 ou une autre classe) présente de la turbidité ou une couleur jaune ou orangée, il est recommandé de purifier l'échantillon, en utilisant n'importe quelle technique de purification existante; dans notre laboratoire, cette étape est réalisée avec des colonnes commerciales de purification d'ADN. La fraction purifiée est re-suspendue dans H20 stérile et dépourvue de nucléases. 2890081 11 Une fois le ou les échantillons d'ADN total purifié(s), on doit quantifier l'ADN total présent dans l'échantillon. De nouveau, cette quantification peut être faite en utilisant n'importe quelle méthode existante pour quantifier l'ADN; dans notre laboratoire nous le faisons par spectrophotométrie. Après avoir quantifié l'ADN total présent dans l'échantillon, on prend un aliquote et on le dilue jusqu'à atteindre une concentration appropriée pour la méthode, qui se trouve dans l'intervalle entre 0,5 et 40 ng/pl, de préférence dans un intervalle entre 1 et 30 ng/pl, et de manière particulièrement préférée dans l'intervalle entre 1 et 10 ng/pl final. La dilution doit être faite avec de l'eau stérile et dépourvue de nucléases. PCR primair. Cette étape est optionnelle et elle pourrait ne pas être réalisée, néanmoins sa réalisation dans notre cas présente des avantages pour restreindre l'étendue des sujets d'analyse et augmenter la sensibilité de la méthode. Sur l'échantillon d'ADN ainsi préparé, on réalise au moins une des deux PCR primaires, l'une d'elles en utilisant des amorces qui amplifient la région 16S pour le domaine Bacteria ("amorces universelles de Bacteria"), et l'autre en utilisant des amorces qui amplifient la région 16S pour le domaine Archaea ("amorces universelles d'Archaea"). Les PCR primaires ont pour but d'amplifier la région qui code pour le gène 16S de l'ARN ribosomal; pour cela on peut utiliser n'importe quelle paire d'amorces pour la PCR primaire qui remplissent les conditions décrites; de manière préférée dans notre laboratoire on choisit les amorces universelles de la liste incluse dans le Tableau 1. Tableau 1. PCR primaire 2890081 12 Amorces Bacteria Eub27-F' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG = SEQ ID NO:1 Univ1492-R' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T = SEQ ID NO:2 Amorces Archaea Arch21-F2 TTC CGG TTG ATC C(CT)G CCG GA= SEQ ID NO:3 Univ1492-R' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T= SEQ ID NO:2 Il est important que la PCR primaire soit linéaire, c'est-à-dire que l'on n'atteigne pas la saturation dans l'amplification, puisqu'on doit maintenir la proportion présente à l'origine dans l'échantillon. Outre l'échantillon, on soumet à cette première PCR un contrôle négatif, qui présente de l'eau stérile à la place de l'ADN, et on dessine une courbe de calibration de cinq points, formée par un mélange concentré et quatre dilutions sériées de celui-ci. Le mélange concentré est spécifique pour chaque domaine, Bacteria ou Archaea, et il est constitué par un mélange d'ADN standard de chacun des taxons à déterminer. Cela veut dire que dans la PCR dans laquelle on utilise les amorces universelles pour Bacteria, l'ADN standard utilisé dans le mélange concentré contiendra de l'ADN extrait de souches pures de toutes les bactéries à identifier et à quantifier, telles que Acidiphilium sp., Leptospirillurn sp., Sulfobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans; tandis que dans la PCR primaire dans laquelle on utilise les amorces universelles pour Archaea, le mélange concentré contiendra de l'ADN de toutes les archébactéries à identifier, telles que Acidianus sp., Ferroplasma sp, Metallosphaera sp, Su/fo/obus sp. et Thermoplasma sp. Bond P., 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66(9): 3842-9. 2 DeLong, E. F., 1992, Proc. Nac. Acad. Sei. USA 89: 5685-9. 2890081 13 Le mélange concentré contient de manière optimale entre 1 et 100 ng d'ADN de chacune des souches, et de préférence 100 ng d'ADN total, bien qu'on puisse travailler avec des quantités supérieures ou inférieures à cette valeur. La courbe de calibration est utilisée dans la quantification réalisée pendant la PCR secondaire et correspond au mélange concentré avec des concentrations lx, 0,1x, 0,01x, 0,001x et 0, 0001x; chacune des ces dilutions étant soumise a la PCR primaire. De préférence, chaque PCR primaire est réalisée avec 1 pl d'ADN, aussi bien de l'échantillon que de la courbe de calibration, ou avec 1 pl d'eau pour le contrôle négatif, plus 24 pl du mélange réactionnel, dont la composition est décrite dans le Tableau 2. Tableau 2 H2O stérile et dépourvue de 18,35 pL nucléases Tampon PCR 10x 2,5 pL MgCl2 (50 mM) 1,5 pL dNTPs (10mM chacun) 0,5 pL Amorce Eubac27F (10 pM) 0, 5 pL Amorce Univ1492R (10 pM) 0,5 pL Taq avec Hot Start (5U/pL) 0,15 pL Les cycles de la PCR primaire sont décrits dans le Tableau 3. Tableau 3 Etrape Température Temps (s) ( C) 1. Dénaturation initiale 95 120 2. Dénaturation 95 30 3. Hybridation 2890081 14 3.1. pour Bacteria 56 30 3.2. pour Archaea 57 30 4. Extension 72 120 Les étapes 2 à 4 sont répétées entre 15 à 20 fois, en évitant d'atteindre la saturation. Une fois cette PCR primaire réalisée, la région de la séquence 16S de toutes les bactéries et archébactéries présentes dans l'échantillon est amplifiée. PCR secondaire On réalise ensuite une pluralité de PCR, spécifiques pour chaque taxon à identifier, en employant des amorces spécifiques qui amplifient dans la région 16S de I'ADNr amplifiée dans la PCR primaire. Dans cette étape, il est très important de pouvoir compter sur des amorces spécifiques et efficaces qui arnplifient le fragment attendu, sans réaction croisée avec des organismes d'autres taxons, et qui soient stables thermodynamiquement, c'est-à-dire qui ne forment pas d'épingles, ni d'homo- ou hétérodimères. Les amorces utilisées dans cette demande ont été dessinées par la méthode protégée dans la demande de brevet CL 21022005, qui est propriété de E3iosigma; puisque ladite méthode assure l'efficacité et la spécificité des arnorces dessinées. Dans chaque PCR primaire, on a réalisé une réaction pour amplifier chacun des échantillons et un contrôle négatif, et pour dessiner les 5 points de la courbe de calibration. Chaque PCR secondaire sera réalisée sur tous les produits de réaction de chacune des réactions de PCR primaire correspondante. De façon avantageuse, toutes les réactions sont réalisées en duplicate et on ajoute un contrôle négatif. Quand on dit que la PCR secondaire est réalisée sur la PCR primaire correspondante, nous nous référons au taxon d'intérêt que nous amplifierons dans la PCR secondaire. S'il appartient au domaine Archaea, alors nous emploierons les produits de réaction de la PCR primaire pour les archébactéries. De la même façon, si le taxon à quantifier est une bactérie, nous emploierons dans la PCR secondaire le produit de réaction de la PCR primaire pour les bactéries. II est important d'indiquer que la méthode de l'invention peut être réalisée pour l'identification et la quantification de tous les taxons décrits ou bien seulement de l'un d'entre eux, ainsi que de toutes les combinaisons intermédiaires possibles, et par conséquent chacune de ces options restera comprise dans la portée de la présente invention. La PCR secondaire est une PCR quantitative (qPCR), et par conséquent on doit la réaliser dans un thermocycleur adéquat, et avec des réactifs fluorescents pour qPCR. Il y a différentes alternatives sur le marché, tant d'appareils que de réactifs; pour réaliser la présente méthode on peut choisir l'une d'entre elles. Pour chaque réaction de PCR secondaire on prépare le mélange suivant: Tableau 4 H20 stérile et libre de 10,5 pL nucléases Amorce sens (10 pM) 0,5 pL Amorce inverse (10 pM) 0,5 pL Réactif qPCR 12,5 pL Au mélange décrit au Tableau 4, on ajoute 1 pl du résultat de la réaction de 5 PCR primaire, ou de l'eau stérile pour le témoin de qPCR. Amorces pour la PCR secondaire. Comme indiqué précédemment, les conditions qui doivent être remplies par chaque paire d'amorces choisie pour la PCR secondaire sont la spécificité pour chaque taxon, sans présenter de réactivité croisée, et la stabilité thermodynamiquement, pour assurer la disponibilité de l'amorce dans la réaction de PCR. Notre laboratoire a développé un programme de dessin d'amorces qui donne une grande quantité d'amorces possibles qui remplissent toutes ces conditions. La méthode de l'invention peut être réalisée en combinant certaines amorces sens avec certaines amorces inverses dessinées par notre programme. Ensuite nous donnons, pour chaque taxon, 20 amorces sens et 20 amorces inverses, et on peut choisir quelques-unes des combinaisons possibles pour la qPCR. (Note: les séquences des amorces dessinées ont été comparées, en utilisant l'outil (logiciel) Blast du NCBI, avec la divulgation de séquences existantes, en nous assurant de cette manière de la nouveauté comme amorces.) Domaine Bacteria: Tableau 5 Acidiphilium sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 4 à 23 SEQ ID NO: 24 à 43 CAA CCA CGG TCG GGT CAG A TCT CTG ACC CGA CCG TGG TT GAC CTT AAG TTG ATG CGC T TCA ACT TAA GGT CAA ACC AA AGT CAA CCA CGG TCG GGT C GGA GCT TAT TCT GCG GGT A GGT TTG ACC TTA AGT TGA TG GCA TCA ACT TAA GGT CAA AC CTT AAG TTG ATG CGC TAA C AGC GCA TCA ACT TAA GGT CA GGC AGT CAA CCA CGG TCG G GTT AGC GCA TCA ACT TAA GG CGA TGC TGA GCT GAT CCT G CCG ACC GTG GTT GAC TGC C AAG TTG ATG CGC TAA CCG C GGA TCA GCT CAG CAT CGC TG AAA GTC GCC TAA GGA GGA G TCA GGA TCA GCT CAG CAT CG GTC GCC TAA GGA GGA GCC T CGG TTA GCG CAT CAA CTT A AAG GAG GAG CCT GCG TCT G GGC TCC TCC TTA GGC GAC TT AGG AGC CTG CGT CTG ATT A GTT GAC TGC CTC CTT GCG GT AGG AGG CAG TCA ACC ACG GT TCC TCC TTA GGC GAC TTT CG GCG AAA GTC GCC TAA GGA G GTG GTT GAC TGC CTC CTT GC GCC TAA GGA GGA GCC TGC GT ACC GTG GTT GAC TGC CTC CT GCA AGG AGG CAG TCA ACC A GCA GGC TCC TCC TTA GGC GA GCA AGT CGC TCG GGC AGT A GAC GCA GGC TCC TCC TTA GG ACC CGT AGG AAT CTA TCC T TCA GAC GCA GGC TCC TCC TT GCA CAG TCA GGC GTG AAA TA TGC TAC TGC CCG AGC GAC TT ACA CAT GCA AGT CGC TCG GG TGA CCC GAC CGT GGT TGA C Tableau 6 Leptospirillum sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 44 à 63 SEQ ID NO: 64 à 83 TGA GGG GAC TGC CAG CGA C CTA GAC GGG TAC CTT GTT AC TAA ATA TCC CCG ATG ACG G CCG TCA TCG GGG ATA TTT A TTG TCC GGA ACC GTG AAG GG TTC ACG GTT CCG GAC MT AT GGA ACC GTG MG OCT TTC G CGG TTC CGG ACA ATA TTC G CCG AAT ATT GTC CGG AAC C CCC TTC ACG GTT CCG GAC AA CGA CAG AGT TTG ATC GTG G CCA CGA TCA AAC TCT GTC GA AAT ATT GTC CGG AAC CGT G AAA CCC TTC ACG GTT CCG GA TCC GGA ACC GTG AAG GGT T TTC CGG ACA ATA TTC GGT AT AAA TCG GGC CAT CAC ACA G CCG MA CCC TTC ACG GTT CC CAA AGA GAC TGG CAG ACT AGA TAG TCT GCC AGT CTC TTT GGC TCG GGC CAT CAC ACA GGT G GCA OCT GTG TGA TGG CCC GAT AGA GAC TGG CAG ACT AGA G CTC TAG TCT GCC AGT CTC TTT GGG GGG GCA ATA CCG AAT AGA GCA GCA CCT GTG TGA TGG CCC ATA TCA MT AM TAT CCC CG OCT GTG TGA TGG CCC GAT TT AAG GGA TAT CGA ATA AAT AT TCT ATT CGG TAT TGC CCC CCC CTA GAG GCT GGG AGA GGG AAG CCC CTT TCG GTT CCC TAC TCG GAC GCA GCA ACG CCA GCA GTG TCC CTC TCC CAG OCT CTA GTC AAA TAA ATA TCC CCG ATG A TCG GGG ATA TTT ATT TGA T CAG TGT GGG AAG AAG OCT TTC CAT ACC TTG GGC GGC TCC CT AAC AAG GTA CCC GTC TAG A CAG OCT CTA GTC TGC CAG T Tableau 7 Sulfobacillus sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 84 à 103 SEQ ID NO: 104 à 123 CGA AGG CGG TGC ACT GGC C CAG TGC ACC GCC TTC GCC A GTG GCG AAG GCG GTG CAC T GGC CAG TGC ACC GCC TTC G AGG TGT CGC GGG GGT CCA CC GGT GGA CCC CCG CGA CAC C TGT CTG TCG GGA CGA GGA C GGT CCT CGT CCC GAC AGA C GAG GGC AGG AGA GGT GCA T CAT GCA CCT CTC CTG CCC TC GTC CAC CTC GCG GTG CCG G TTA GCT CCG GCA CCG CGA GG CAC CTC GCG GTG CCG GAG C GCG AGG TGG ACC CCC GCG A GGG GGT CCA CCT CGC GGT GC TGC ACC GCC TTC GCC ACC G CTC GCG GTG CCG GAG CTA A CGT ATC CAT CGT TTA CGG CG TGT CGC GGG GGT CCA CCT C GAC CCC CGC GAC ACC TCG TA GGA TAC GAG GTG TCG CGG G GAG TGC GTT AGC TCC GGC AC CGG AGC TAA CGC ACT CAG T TCC ACC AGG AAT TCC ATG C GTA AAC GAT GGA TAC GAG GT GCC AGG CCA GTG CAC CGC C TGA GTG GGG GAT ATC GGG C CCA GGA ATT CCA TGC ACC TC TAC GAG GTG TCG CGG GGG T CCT OCT ATC CAT CGT TTA CG AGC TM CGC ACT CAG TAT C ACT GAG TGC GTT AGC TCC GG ACG ATG GAT ACG AGG TGT CG GAT ACT GAG TGC GTT AGC TC GTG CCG GAG CTA ACG CAC TC GCG ACA OCT CGT ATC CAT CG AGG TGC ATG GM TTC CTG GT CGG GAT ACT GAG TGC GTT AG TGC ATG GM TTC CTG GTG GA GCC CGA TAT CCC CCA CTC A Tableau 8 Acidithiobacillus ferrooxidans Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 124 à 143 SEQ ID NO: 144 à 163 CGG GTT CTA ATA CAA TCT G AGA ACC CGC CTT TTC GTC CT AGG ACG AAA AGG CGG GTT CT CCG CCT TTT OCT OCT CCA C GTG GAG GAC GAA AAG GCG G CAG ATT GTA TTA GAA CCC G ACG AAA AGG CGG GTT CTA AT ATT AGA ACC CGC CTT TTC GT AAA AGG CGG GTT CTA ATA CA TGT ATT AGA ACC CGC CTT TT AGG CGG GTT CTA ATA CAA T CTC TGC AGA ATT CCG GAC AT TTC TAA TAC AAT CTG CTG TT AAC AGC AGA TTG TAT TAG AA TAA TAC AAT CTG CTG TTG AC GTC AAC AGC AGA TTG TAT TA TAC AAT CTG CTG TTG ACG TG CAC GTC AAC AGC AGA TTG TA AAT CTG CTG TTG ACG TGA AT AU CAC GTC AAC AGC AGA TT CGC TAA GGG AGG AGC CTA CG GTA GGC TCC TCC CTT AGC GC GCG GAC TAG AGT ATG GGA G GCTC CTC CCT TAG CGC GAG CTA GAG TAT GGG AGA GGG TG CCA TAC TCT AGT CCG CCG GT CCT CGC GCT AAG GGA GGA G TCT AGT CCG CCG GTT TCC A GGC GGA CTA GAG TAT GGG AG GAC GTA GGC TCC TCC CTT AG GGG AGG AGC CTA OCT CTG AT TAC TCT AGT CCG CCG GTT T CGC GCT AAG GGA GGA GCC T TCA GAC GTA GGC TCC TCC CT CGG ACC TCG CGC TAA GGG AG CCT CCC TTA GCG CGA GGT CO GGC GGA CTA GAG TAT GGG A TAG TGC GCC GGT TTC CAC C TAA GGG AGG AGC CTA OCT CT ATT GTA TTA GAA CCC GCC T Tableau 9 Acidithiobacillus thiooxidans Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 164 à 183 SEQ ID NO: 184 à 203 GGG AGA CGA AAA GGT AAT CG ATC CCC CGG TTT CTC CCT C AAA GTT CTT TCG GTG ACG GG ATA TTA GCG ATT ACC TTT T CGG GGA AGG TTG ATA TGT TA CAA CCT TCC CCG TCA CCG AA GAG GGA GAA ACC GGG GGA T CCG AAG ATC CCC CGG TTT CT AAT CGC TAA TAT CGG TTA C CTC CAA TAG CAC GAG GTC CG CCG GGG GAT CTT CGG ACC TC ACC GAT ATT AGC GAT TAC CT TAA TAT CGCC TGC TGT TGA C AAG ATC CCC CGG TTT CTC C TCG GTG ACG GGG AAG GTT G TAT CAA CCT TCC CCG TCA CC GGA GAA ACC GGG GGA TCT T GGT TTC TCC CTC AGG ACG TA ACG TCC TGA GGG AGA AAC CG GGT CCG AAG ATC CCC CGG TT AGA CGA AAA GGT AAT CGC TA TTT CAC GAC AGA CCT AAT G GTG ACG GGG AAG GTT GAT A GTA ACC GAT ATT AGC GAT TA GAA ACC GGG GGA TCT TCG G ACA TAT CAA CCT TCC CCG TC TCC TGA GGG AGA AAC CGG GG CCC GGT TTC TCC CTC AGG AC CGA AAA GGT AAT CGC TAA TA GCG AU ACC TTT TCG TCT CC AAA GGT AAT CGC TAA TAT CG CCC CGT CAC CGA AAG AAC TT TCG TGG GAG ACG AAA AGG TA TTA ACA TAT CAA CCT TCC CC CGG ACC TCG TGC TAT TGG AG TTA GCG ATT ACC TTT TCG TC GTT CTT TCG GTG ACG GGG A CTT CCC CGT CAC CGA AAG AA CTT TCG GTG ACG GGG AAG G ATT ACC TTT TCG TCT CCC AC Domaine Archaea: Tableau 10 Acidianus sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 204 à 223 SEQ ID NO: 224 à 243 GGG AAA CCG TGA GGG CGC T CCG CAT TGG GGA CGT TTC GCG GCG MA CGT CCC CAA TGC GG GCG CCC TCA CGG TTT CCC GCA CCG CAG GGA AAC CGG TAA GCC CCG CAT TGG GGA CGT TTC GCG CCC GGG AAA GGG CAG TGA TA GCG CCC TCA CGG TTT CCC GCA GGG AAA GGG CAG TGA TAC T TTC CCG CAT TGG GGA CGT TTC AAT CCG GGG CAG GCG AAG GG TAG CGC CCT CAC GGT TTC CC AGG GTA CTG GM CGT CCC TT GGC TTA CCG GTT TCC CTG CG AAG CGT CCG GCC AGA ACG CGC CTG CCC TTT CCC GGG TTG A CGC CTA AAG GGG CAT GGG CT TCA CTG CCC TTT CCC GGG T GGC TAT TTC CCG CTC ATG CC GTA TCA CTG CCC TTT CCC G CGT ACG CCC TCG GGT AAG AGG GCC CGG GTC TTT MG CAG TG AAC GGC CCG CCA AAC CGA TA CTC CCG CCC CCT AGC CCT GCA AGC CGG CCC TGC AAG TCA C CCC GGG ATC TGT GGA TTT CGC CAC TGC TTA AAG ACC CGG G TAC CCG AGG GCG TAC GAC T GGA OCT AAT CCG GGG CAG GCG CCT CTT ACC CGA GGG CGT ACG AAA CCG TGA GGG CGC TAC CC TTC GCC TGC CCC GGA TTA G AGG CGA AGG GTA CTG GAA CGT GGC GGC AGG CTT ACC GGT TTC ACC CCC AGT GCT CCC GAA AG CGG ATT AGC TCC AGT TTC CCG CCC TTC GCC TAA AGG GGC ATG GGA OCT TCC AGT ACC CTT C GCA TGG OCT ATT TCC CGC, TCA CCC CGG ATT AGC TCC AGT TT GGG AAA CCG TGA GGG CGC T TAC CCT TCG CCT GCC CCG GAT GCG AAA CGT CCC CAA TGC GG CCA TGC CCC TTT AGG CGA A Tableau 11 Ferro plasma sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 244 à 263 SEQ ID NO: 264 à 283 AGA GTC AAC CTG ACG AGC TTA AAG CTC GTC AGG TTG ACT CT GTC AAC CTG ACG AGC TTA CTC GTA AGC TCG TCA GGT TGA C TGA GAG TCA ACC TGA CGA GC CGA GTA AGC TCG TCA GGT T GAG CTT ACT CGA TAG CAG GAG CTG CTA TCG AGT AAG CTC G TTT AAT TCG AGA GGG TTA A TTT AAC CCT CTC GAA TTA A CTT ACT CGA TAG CAG GAG AGG CTC CTG CTA TCG AGT MG C AAT CAA ATC TGA TGT CGG TGA TCA GAT TTG ATT TAA CCC TC GGT TAA ATC AAA TCT GAT G ACC CTC CTC ACC GAC ATC AG TTC GAG AGG GU AAA TCA MT ACA TCA GAT TTG ATT TAA C CAA ATC TGA TGT CGG TGA GGA CCG ACA TCA GAT TTG ATT T TAA ATC AAA TCT GAT GTC G TGA TTT AAC OCT CTC GAA T GAG AGG GTT AAA TCA MT CTG TCA CCG ACA TCA GAT TTG A ATC TGA TGT CGG TGA GGA GGG ATT TGA TTT AAC OCT CTC G AAT TCG AGA GGG TTA MT C CTA CCT GAT AGG TTG CAG ACT GAT GTC GGT GAG GAG GGT T GCA CCA OCT CTC TGC TAT CG GAG GGA TGG CAG TGT CGG A ATC CCT CAA CGG AM AGC A TGG CCA AGA CTT TTC TCA T ACA CTT AAA GTG AAC GCC CT GAT GAG TCT GCA ACC TAT CA TCG CTC CGA CAC TGC CAT C TAG CAG AGA GGT GGT GCA TGG CCG ATC TCA TGT CTT GCA GT ACG GCC ACT GCT ATC AAG TTC ATG AGA AAA GTC TTG GCC A Tableau 12 Metallosphaera sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 284 à 303 SEQ ID NO: 304 à 323 AGG GCG TTA CCC CTA GTG C GGC ACT AGG GGT AAC GCC C TAC CCC TAG TGC CCT CGC A AGA AGC TCG ACC TCC CAC CC GCG CCC GTA GCC GGC CTG TAA TAC AGG CCG GCT ACG GGC GC GAG CTT CTC CTC CGC GAG GGG AGC TCG ACC TCC CAC CCC G GCA CCA GGC GCG GAA CGT CCC CCC CTC GCG GAG GAG AAG C GAG GTC GAG CTT CTC CTC. CG TGC GAG GGC ACT AGG GGT A CCC TAG TGC CCT CGC AAG A TGA CTT TAC AGG CCG GCT ACG CCC GTA GCC GGC CTG TAA AGT CAT GGC TTA GCC CTA CCC CTA CGG GGT GGG AGG TCG AGC TTC AGG AGA AGC TCG ACC TCC CA GTC GAG CTT CTC CTC CGC. GA GAC CTT CCG CGC CTG GTG C GGT GGG AGG TCG AGC TTC TCC CTT TAC AGG CCG GCT ACG GG TCG GGG TGG GAG GTC GAG C TCT TGC GAG GGC ACT AGG G GCG TTA CCC CTA GTG CCC. T CGG AGG AGA AGC TCG ACC TC TAG GGG TAG GGC TAA GCC ATG TCG CGG AGG AGA AGC TCG AC CGC ACC AGG CGC GGA ACG T GAG GGC ACT AGG GGT AAC G GGG AGG TCG AGC TTC TCC T ACC CCG AGG GGC AAG AGG CC AGG TGG AGG AAT MG CGG GG GGG GTT ATC CAG ATC CCA AGG GAA AGG TGG AGG MT AAG C GCC ACG CCC TCT TCC CGA GA GGG AGT CGT ACG CTC TCG GGA GTT ATC CAG ATC CCA AGG GC CTA ACC TGC OCT TGG GAT CTG CTT ATT OCT CCA OCT TTC TGG Tableau 13 Sulfolo bus sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 324 à 343 SEQ ID NO: 344 à 363 TAA ACC CTG CCG CAG TTG G CCT TAA ACC CTG CCG CAG T GTC CTG GAA CGG TTC CTC. G CTC TAC MA GGC GGG GGA ATA CTG GAA CGG TTC CTC GCT GA GGC GAG GAG TCC TGG AAC GGT TTT CCC CGC TCT ACA AAG G TAC AAA GGC GGG GGA ATA AGC CGC TCT ACA AAG GCG GGG G ATA GGC GAG GAG TCC TGG AA CCA TAG GCG AGG AGT CCT G GCT TTT CCC CGC TCT ACA A CCA ACT GCG GCA GGG TTT A ACT GCG GCA GGG TTT AAG G CGA GGA ACC GTT CCA GGA CTC AAC CGT TCC AGG ACT CCT CG TCC AGG ACT CCT CGC CTA TGG CCT TTG TAG AGC GGG GAA A AGC GAG GAA CCG TTC CAG GA CGT TCC AGG ACT CCT CGC CTA CCC CCG CCT TTG TAG AGC G TTC AGC GAG GAA CCG TTC CA ATT CCC CCG CCT TTG TAG A TTG TAG AGC GGG GAA AAG C GCT AAC CTA CCC TGA GGA GG TCT CCC ATA GGC GAG GAG TC TGG CTA ACC TAC CCT GAG G ATA ATC TCC CAT AGG CGA. G TGA GGA GGG AGA TAA CCC CG ATC TCC CTC CTC AGG GTA GGT GGG TTA TCT CCC TCC TCA G TCG CCT ATG GGA GAT TAT C TCA GGG TAG GTT AGC CAC GT CCT CAG GGT AGG TTA GCC A ACA CGT GGC TAA CCT ACC CTG CCG GGG TTA TCT CCC TCC T CCT GAG GAG GGA GAT MC C TCC TCG CCT ATG GGA GAT T AAA CTG GGG ATA ATC TCC C CCT CCT CAG GGT AGG TTA G Tableau 14 Thermoplasma sp. Amorces sens Amorces inverses SEQ ID NO: 364 à 383 SEQ ID NO: 384 à 403 TCC TGA AAG GAC GAC CGG TG CAG GGG CAT ATT CAC OCT AG GGA CTG AGG GCT GTA ACT C TCA GGA TTA CAG GAT TTT A GAG GTT GAA TGT ACT TTC AGG ACC CTG AAA GTA CAT TCA ACC GGT GGC GAA AGC GTT CAA CT GCC ACC GGT CGT OCT TTC A GCC CTC ACG AAT GTG GAT T CTA GTT GAA CGC TTT CGC C ACC TCG AAA CCC GTT OCT AG TCG TCC TTT CAG GAT TAC AGG TCC GTA GTA ATC GTA GGT C ACG CTT TCG CCA CCG GTC GTC ATC CTG TAA TCC TGA MG GAC GGG TTT CGA GGT TAG CTT C GTA GTC AGG ACT GAG GGC TG CCC TCA GTC CTG ACT ACG A AGG ACG ACC GGT GGC GAA AGC CTG AAG ATT TAT AAG ACC GG TAA CTC GCC CTC ACG MT GT TTA CAG CCC TCA GTC CTG ACT GAA GGT GTT AAG TGG GTC, A AAT CCA CAT TCG TGA GGG CGA AAA CCC GTT OCT AGT CAG GAC ATG GGG GTC TTG CTC GTT AT TAC GGT GAA TAT GCC CCT GC GCT GTT GAC CTA CGA TTA C CAC TTG GTG TTG CTT CTC CGT OCT ACG AU ACT ACG GAA TCC GAT CAC TTT TAT TGA GTC T ACC CAC TTA ACA CCT TCG C AGC ATC AGG AAT AAG GGC. TG CCC MG TCT TAC AGT CTC TT AAG ACC CCC ATC TCT MT T CTA CCC TGA MG TAC ATT CA CCG GTC TTA TAA ATC TTC A CAG CCC TTA TTC CTG ATG C ATA ACG AGC AAG ACC CCC, AT GGT CGT CCT TTC AGG ATT AC Dans les PCR secondaires on inclut aussi une réaction pour quantifier les bactéries ou archébactéries totales présentes dans l'échantillon; dans ce cas on emploie des amorces universelles connues pour les deux domaines, et on les choisit parmi les amorces présentées dans le Tableau 15. Tableau 15. PCR secondaire Amorces Bacteria Eub271 F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG = SEQ ID NO: 1 Univ533-F' GTG CCA GCM GCC GCG GTA= SEQ ID NO: 404 Bact358-F2 CCT ACG GGA GGC AGC AG= SEQ ID NO: 405 Univ907-R3 CCG TCA ATT CCT TTG AGT T= SEQ ID NO: 406 Bact338-R4 GCT GCC TCC CGT AGG AGT= SEQ ID NO: 407 Bact1387-R5 GGG CGG WGT GTA CAA GGC= SEQ ID NO: 408 Amorces Archaea Arch344-F6 ACG GGG CGC AGC AGG CGC GA= SEQ ID NO: Univ515-F' GTG CCA GCA GCC GCG GTA A= SEQ ID NO: 410 Arch958-R5 YCC G(3C GTT GAM TCC AAT T= SEQ ID NO: 411 Arch915-R4 GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT= SEQ ID NO: 412 Univ534-R5 ATT ACC GCG GCT GCT GG= SEQ ID NO: 413 Chaque PCR secondaire a un cycle spécifique où la température d'hybridation est spécifique pour chaque paire d'amorces utilisées. Le 5 Tableau 16 résume les conditions générales pour tous les cycles de qPCR. Tableau 16 Pas Température ( C) Temps (s) 1 Dénaturation initiale 95 120 2 Dénaturation 95 30 3 Hybridation (*) 30 Bond P., 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66(9): 3842-9. Schauer M, 2003, Aquat. Microb. Ecol. Vol. 31: 163-174. Nakagawa T, 2002, FEMS Microbiology Ecology 41: 199-209. 4 Schrenk MO, 1998, Science. 279: 1519-22. Ellis R, 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69(6): 3223-30. 6 Casamayor EO, 2002, Environ. Microbiol. 4(6): 338-48. Edwards K, 2003, App!. Environ. Microbiol. 69(5): 2906-13. 8 Orphan VJ, 2001, Appl. Environ. Microbiol. 66(2): 700-11. 2890081 28 4 Extension 72 40 Pré-lecture 80 10 6 Lecture 80 ------Répéter 40 fois à partir du pas 2 à 6 (cycle de qPCR) 7 Courbe de dénaturation Entre 70 et 100 C, lecture chaque 0,2 C. (*) Température spécifique pour chaque paire d'amorces utilisées La courbe de dénaturation, qui est réalisée à la fin des 40 cycles, nous donne la Tm du produit d'amplification, et elle sert aussi à établir s'il y a plus d'un produit d'amplification présent dans l'échantillon amplifié, puisque chacun d'entre eux produirait sa propre courbe. Le thermocycleur de qPCR donne un résultat qui correspond à la concentration d'ADN présent dans chaque réaction; cette donnée est utilisée pour calculer le nombre de microorganismes présents dans l'échantillon, ce qui est appelé Q. Cette valeur est déduite par le programme d'ordinateur associé au thermocycleur à partir de la concentration d'ADN dans les réactions pour la courbe de calibration et le cycle dans lequel l'échantillon commence à être amplifié (ou dans lequel sa valeur de fluorescence commence à augmenter exponentiellement). La corrélation entre le logarithme de la concentration d'ADN et le cycle dans lequel l'amplification est observée produit une équation linéaire, à partir de laquelle on déduit la concentration d'ADN des échantillons à analyser. Calcul des microorganismes présents dans l'échantillon En prenant en compte le résultat de la qPCR et d'autres données produites pendant le procédé, les inventeurs ont développé une formule qui permet de calculer le nombre précis de microorganismes d'un taxon déterminé présents dans un échantillon déterminé, en particulier dans un échantillon biominier. La formule est la suivante: QxT où: Mo / Um est le nombre de microorganismes, bactéries ou 10 archébactéries, par unité d'échantillonnage; Q est la quantité d'ADN initiale en nanogrammes présente dans chaque réaction de PCR secondaire, déterminée par le programme associé à l'équipement de qPCR; T est la quantité totale d'ADN extraite de l'échantillon; U est la quantité d'ADN utilisée dans la réaction de PCR primaire; et Cm est la quantité d'échantillon biominier duquel on a extrait l'ADN, en ml pour des échantillons liquides ou en g pour des échantillons solides. Le nombre 5X10-6 ng / Mo correspond à la quantité moyenne de nanogrammes d'ADN que contient un microorganisme dans son génome, selon Kuske et al. (1998). En appliquant la méthode de l'invention, on peut déterminer le nombre de 25 microorganismes des taxons Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp. Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans, Acidianus sp., Ferroplasma sp, Su/fo/obus sp., Metallosphaera sp, et/ou Thermoplasma sp. présents dans un échantillon. Mo/Um = 5.10-6 [ng/mo] x U x Cm 2890081 30 Exemples Exemple 1. Quantification d'Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp. et Acidiphilium sp. présentes dans un échantillon. On a travaillé avec 5 échantillons obtenus de minéral de piles de biolixiviation (MS-1 à MS-5) et avec 2 échantillons liquides récupérés des effluents de biolixiviation (ML-1 et ML-2). La quantité totale d'ADN présent dans l'échantillon a été extraite. Pour tous les échantillons solides, il a été nécessaire de réaliser une étape additionnelle de re-purification die l'ADN consistant en une repurification de l'échantillon, avec n'importe quelle technique de purification existante. Dans notre laboratoire, cette étape est réalisée avec des colonnes commerciales de purification d'ADN, pour obtenir un aspect translucide de la solution d'extraction. Ensuite, la quantité totale d'ADN présente dans chaque échantillon a été quantifiée avec le spectrophotomètre NanoDrop 1.0. Dans le Tableau 17, sont présentés l'ADN total extrait en nanogrammes (T) et le volume initial d'échantillon sur lequel on a travaillé (Cm). Les résultats sont: Tableau 17 Échantillon T Cm MS-1 316,8 0,5 g MS-2 370,4 0,5 g MS-3 315,2 0,5 g MS-4 526,4 0,5 g MS-5 400 5,0 g 2890081 31 ML-1 2938 81,00 ml ML-2 1114 76,55 ml Chacun de ces échantillons a été dilué dans de l'eau stérile dépourvue de nucléases de façon à obtenir une concentration entre 0,5 et 30 ng/pl. Le Tableau 18 montre le volume final auquel l'ADN a été porté et la concentration à laquelle il est resté. Tableau 18 Échantillon Volume final (pi) Concentration (ng/pl) MS-1 80 3,96 MS-2 80 4,63 MS-3 80 3,94 MS-4 80 6,58 MS-5 80 5,00 ML-1 100 29, 38 ML-2 100 11, 14 De la même façon, on a préparé une courbe de calibration permettant de calculer la concentration d'ADN dans les échantillons expérimentaux. On a réalisé 4 dilutions sériées d'un mélange standard d'ADN contenant 25 ng d'ADN de chacun des microorganismes suivants: Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp. et Acidiphilium sp., dans un volume final de 30 pI, pour obtenir 100 ng d'ADN total présent dans l'échantillon standard, qui fait aussi partie de la courbe de calibration. Spécifiquement, on a utilisé l'ADN des souches: A. ferrooxidans DSM 16786; A. thiooxidans DSM 504; Leptospirillum sp. DSM 1931 et 2890081 32 Acidiphilium acidophilus DSMZ 700. On a préparé un mélange réactionnel pour la PCR primaire, où la quantité de chaque constituant a été multipliée par la quantité totale de réactions à réaliser, de façon à préparer un seul mélange réactionnel afin d'homogénéiser les concentrations des réactifs dans les différents tubes de PCR. Le mélange réactionnel a été aliquoté en tubes de 0,2 ml, à un volume de 24 pl de mélange réactionnel par tube. Dans le présent exemple, on a réalisé en duplicate: a) 7 réactions pour les échantillons et b) 5 réactions pour la courbe de calibration, correspondant au mélange concentré d'ADN standards en concentrations 1 x, 0,1x, 0,01x, 0,001x et 0,0001x, et un blanc, ce qui donne un total de 25 réactions. Le mélange préparé est présenté dans le Tableau 19,. Tableau 19 Réactif 1 réaction 25 réactions H2O stérile et libre de nucléases 18,35 pI 458,75 pl Tampon PCR 10X 2,5 pl 62,5 pl MgCl2 (50 mM) 1,5 pl 37,5 pl dNTPs's (10 mM c/u) 0,5 pl 12,5 pl Amorce Bacteria 27F (10 pM) 0,5 pI 12, 5 pl Amorce Bacteria 1492R (10 pM) 0,5 pl 12,5 pl Taq avec Hot Start (5 Uipl) 0,15 pI 3,75 pl Les amorces utilisées ont été ensuite décrites dans le Tableau 20: Tableau 20 Microorganisme T Amorces utilisées à déterminer Hybridation Bactéries totales 59 C Eubac27F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG Univ1492R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T On a homogénéisé ce mélange de PCR primaire et on a fait 25 aliquotes de 24 pl chacun, en tubes de 0,2 ml convenablement légendés. On a ajouté à ces mélanges 1 pl des dilutions d'ADN des échantillons ou 1 pl d'ADN de la courbe de calibration. On a ajouté au contrôle négatif de la PCR primaire, à la place de l'ADN, l pl d'H2O stérile dépourvue de nucléases. Les réactions ont été incubées dans un thermocycleur MJ Research modèle 10 PTC-100, avec le programme de cycles suivant: Tableau 21 Etape Température Temps ( C) (s) 1. Dénaturation initiale 95 120 2. Dénaturation 95 30 3. Hybridation 56 30 4. Extension 72 120 Les étapes 2 à 4 ont été répétées 18 fois. Ensuite, on a réalisé 5 PCR secondaires, une pour chaque taxon: Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp., Acidiphilium sp., et une pour les bactéries totales, avec des amorces 2890081 34 spécifiques pour chacun d'entre eux, qui s'hybrident dans la zone amplifiée par la PCR primaire. Pour les différents taxons, on a choisi des amorces sens et inverses parmi celles présentées dans la description dans les tableaux correspondants à chaque taxon, dans ce cas, dans les Tableaux 5, 6, 8 et 9. D'autre part, pour les bactéries totales, on a employé des amorces décrites dans la littérature, et qui sont présentées dans le Tableau 15. Les amorces employées pour chaque taxon et leurs températures d'hybridation sont indiquées dans le Tableau 22. Tableau 22 Microorganisme T Amorces utilisées à déterminer Hybridation Bactéries totales 56 C (P.1) 533-F: 5'- GTG CCA GCA GCC GCG GTA -3' (P.2) 907-R: 5'CCG TCA ATT CCT TTG AGT T -3' A. ferrooxidans 60 C (P.1) F: 5'-GTG GAG GAC GAA AAG GCG G -3' (P.2) R: 5'- ATT AGA ACC CGC CTT TTC GT -3' A. thiooxidans 56 C (P.1) F: 5'- AAA GGT AAT CGC TAA TAT CG -3' (P.2) R: 5'ATT ACC TTT TCG TCT CCC AC -3' Leptospirillum 58 C (P.1) F: 5'- AAC AAG GTA CCC GTC TAG sp. A -3' (P.2) R: 5'- CTA GAC GGG TAC CTT GTT AC -3' Acidiphilium sp. 61 C (P.1) F: 5'- AGG AGG CAG TCA ACC ACG 2890081 35 GT -3' (P.2) R: 5'- GTT AGC GCA TCA ACT TAA GG -3' On a réalisé une qPCR, pour chaque taxon à déterminer, sur chacun des produits de réaction de la PCR primaire; ces réactions de PCR ont été réalisées en duplicate. La qPCR a été réalisée en utilisant le Mix SYBR Green qPCR. Pour chaque PCR secondaire, on considère deux essais pour chacune des 25 réactions de la PCR primaire et un contrôle, ce qui donne un total de 51 réactions. Pour chaque PCR on prépare le mélange réactionnel présenté dans le Tableau 23, où les amorces sont celles qui correspondent au Tableau 22: Tableau 23 1 réaction 51 réactions H2O stérile et dépourvue de 16,1 pl 821,1 pl nucléases Amorce 1 (10 pM) 0,5 pl 25,5 pI Amorce 2 (10 pl111) 0,5 pl 25,5 pl Tampon PCR 10X 2,5 pI 127,5 pl MgCl2 (50 mM) 1,5 pI 76,5 pl dNTPs's (10 mM c/u) 2,5 pI 127,5 pl Taq avec Hot Start (5 U/pl) 0,15 pI 7,65 pI SYBR Green qPCR 100X 0,25 pI 12,75 pl Ce mélange réactionnel a été homogénéisé et aliquoté dans 51 tubes de 0,2 ml; à chacun d'entre eux, convenablement légendé, on a ajouté 1 pI de la PCR primaire ou l pl d'H2O stérile et dépourvue de nucléases pour le blanc. Les tubes de PCR avec le mélange réactionnel et l'échantillon ont été mélangés au vortex pendant 5 secondes et centrifugés 1 minute à 2000 rpm, 2890081 36 pour respectivement homogénéiser et culoter les réactions au fond des tubes. Tout de suite après, les tubes avec les réactions de la PCR secondaire ont été soumis à des cycles de température pour leur amplification. Suivant le microorganisme à quantifier, on a utilisé différentes paires d'amorces, et par conséquent, différents programmes d'amplification. On détaille ensuite les programmes d'amplification employés dans les différentes PCR secondaires. Tableau 24 Etape Température ( C) Temps (s) 1 Dénaturation initiale 95 120 2 Dénaturation 95 30 3 Hybridation (*) 30 4 Extension 72 40 Pré-lecture 80 10 6 Lecture 80 ------ Répéter 40 fois à partir du pas 2 à 6 (cycle de qPCR) 7 Courbe de dénaturation Entre 70 et 100 C, lecture chaque 0,2 C. (*) Température spécifique pour chaque paire d'amorces utilisée, indiquée au Tableau 22. Une fois la réaction de qPCR terminée, on a conservé les données générées par le thermocycleur de la qPCR; ces données correspondent à Q et sont présentées dans le Tableau 25; dans ce tableau on inclut en plus les nanogrammes d'ADN utilisés en (U). Tableau 25 Échantillon Q U Bact. A. A. Leptospirillum Acidiphilium Totales ferrooxidans thiooxidans sp. sp. MS-1 187,68 x 10- 1,63 x 10_-3 0,13 x 10-3 25,36 x 10-3 0,03 x 10-3 2 MS2 33,91 x 10-3 0,51 x 1CÎ 2,33 x 10-3 1,63 x 10-3 0 2 MS-3 149,60 x 100,59 x 10-3 0,03 x 10-3 10,46 x 10-3 0,008 x 10-3 2 M$-4 71,08 x 10-0,01 x 1C--3 0,03 x 10-3 6,23 x 10- 0,002 x 10-3 2 MS-5 142,68 x 10- 0,29 x 1Ci' 3,20 x 10-' 15,10 x 10-3 0 2 ML-1 9,20 x 10-3 0 0 0,26 x 10 3 0 2 ML- 2 49,03 x 10- 0,05 x 1673 0 2,15 x 10-3 0 2 Calcul des microorganismes présents dans les échantillons. Avec le résultat de la qPCR, et les autres données générées pendant le procédé, on a utilisé la formule suivante, dont les abréviations ont été définies dans la description: QxT Mo /Um = 5É:10-6[nglmo]xUxCm Avec celleci, on a déterminé que les échantillons analysés contenaient les populations suivantes: Tableau 26. MS-1 Bactéries Mo. / g d'échantillon Bact. totales 1,19 x 10' A. ferrooxidans 1,03 x 105 A. thiooxidans 8,03 x 103 Leptospirillum sp. 1,61 x 10b Acidiphilium sp. 2,11 x 103 Tableau 27. MS-2 Bactéries Mo. I g d'échantillon Bact. totales 2,51 x 10b A. ferrooxidans 3,81 x 104 A. thiooxidans 1,72 x 105 Leptospirillum sp. 1,21 x 105 Acidiphilium sp. 0 Tableau 28. MS-3 Bactéries Mo. I g d'échantillon Bact. totales 9,43 x 10b A. ferrooxidans 3,70 x 104 A. thiooxidans 2,11 x 103 Leptospirillum sp. 6,60 x 105 Acidiphilium sp. 5, 07 x 102 Tableau 29. MS-4 Bactéries Mo. I g d'échantillon Bact. totales 7,48 x 10b A. ferrooxidans 1, 03 x 103 A. thiooxidans 2,78 x 103 Leptospirillum sp. 6,56 x 105 Acidiphilium sp. 2,45 x 101 Tableau 30. MS-5 Bactéries Mo. / g d'échantillon Bact. totales 1,14 x 106 A. ferrooxidans 3,31 x 10 A. thiooxidans 2,56 x 104 Leptospirillum sp. 1,21 x 105 Acidiphilium sp. 0 Tableau 31. ML-1 Bactéries Mo. / ml d'échantillon Bact. totales 3,34 x 104 A. ferrooxidans 0 x 100 A. thiooxidans 0 x 100 Leptospirillum sp. 9,47 x 102 Acidiphilium sp. 0 Tableau 32. ML-2 Bactéries Mo. / ml d'échantillon Bact. totales 7,13 x 104 A. ferrooxidans 6,69 x 101 A. thiooxidans 0 x 100 Leptospirillum sp. 3,12 x 103 Acidiphilium sp. 0 Les Figures 1 à 7 correspondent aux graphiques des résultats décrits dans les Tableaux 26 à 32. 2890081 40 Exemple 2. Quantification de Sulfobacillus sp., Su/fo/obus sp., et Ferro plasma sp. présents dans un échantillon. On a travaillé avec deux échantillons solides obtenus du minéral de piles de biolixiviation (MS-6 et MS-7). On a extrait l'ADN total présent dans un échantillon de chacune. Il a été nécessaire de réaliser une étape additionnelle de repurification de l'ADN, jusqu'à l'obtention d'un aspect translucide de la solution d'extraction. Ensuite, la quantité totale d'ADN présente dans chaque échantillon a été quantifiée avec le spectrophotomètre NanoDrop 1.0. Dans le Tableau 34 sont présentés l'ADN total extrait en nanogrammes (T) et le volume initial d'échantillon sur lequel on a travaillé (Cm). Les résultats sont présentés dans le Tableau 33: Tableau 33 Échantillon T Cm MS-6 426,8 0,5 g MS-7 277,2 0,5 g Chacun de ces échantillons a été dilué dans de l'eau stérile dépourvue de nucléases de façon à obtenir une concentration entre 0,5 et 30 ng/pl. Le Tableau 34 montre le volume final auquel l'ADN a été porté et la concentration à laquelle il est resté. Tableau 34 2890081 41 Échantillon Volume final (pI) Concentration (ng/pl) MS-1 80 5, 34 MS-2 80 3,47 Parallèlement on a préparé deux courbes de calibration, une pour le domaine Bacteria et une autre pour le domaine Archaea, lesquelles permettront le calcul de la concentration d'ADN dans les échantillons expérimentaux. Pour le domaine Bacteria, on a réalisé 4 dilutions sériées d'un standard d'ADN, ici standard Bacteria, contenant 100 ng d'ADN de Sulfobacillus sp., dans un volume final de 30 pI; la solution standard fait, en même temps, partie de la courbe de calibration. Spécifiquement on a utilisé l'ADN de la souche: Sulfobacillus sp. DSM 10 332 et Pour le domaine Archaea, on a réalisé 4 dilutions sériées d'un mélange standard d'ADN contenant 50 ng d'ADN de chacun des microorganismes suivants: Sulfolobus sp., et Ferroplasma sp., dans un volume final de 30 pI, obtenant 100 ng d'ADN total présent dans le mélange standard, qui fait en même temps partie de la courbe de calibration. Spécifiquement on a utilisé l'ADN des souches: Sulfolobus sp. DSM 6482 et Ferroplasma sp. DSM 12658. Ensuite, on a préparé les mélanges réactionnels pour les PCR primaires, où la quantité totale de chaque constituant a été multipliée par le nombre total de réactions à réaliser, afin de préparer un seul mélange réactionnel pour homogénéiser les concentrations des réactifs dans les différents tubes de 2890081 42 PCR. Le mélange réactionnel a été aliquoté en tubes de 0,2 ml, jusqu'à un volume de 24 pl de mélange réactionnel par tube. Pour le domaine Bacteria, pour la détermination de Sulfobacillus, on a réalisé en duplicate: a) 2 réactions pour les échantillons et b) 5 réactions pour la courbe de calibration, correspondant à la solution standard Bacteria en concentrations 1 X, 0,1X, 0,01X, 0,001x et 0,0001X, et un blanc, ce qui donne un total de 15 réactions. Dans le Tableau 35 on indique le mélange préparé. Tableau 35 Réactif 1 réaction 15 réactions H2O stérile et dépourvue de 18,35 pl 275, 25 pl nucléases Tampon PCR 10X 2,5 pl 37,5 pl MgCl2 (50 mM) 1,5 pl 22,5 pl dNTPs's (10 mM chi) 0,5 pl 7,5 pl Amorce Bacteria 27F (10 pM) 0,5 pl 7, 5 pl Amorce Bacteria 1492R (10 pM) 0,5 pl 7,5 pl Taq avec Hot Start (5U/pl) 0,15 pl 2,25 pl Les amorces utilisées ont été décrites dans le tableau 36: Tableau 36 Microorganisme T Amorces utilisées à déterminer Hybridation Bactéries totales 59 C Eubac27F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC 2890081 43 AG Univ1492R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T On a homogénéisé ce mélange de PCR primaire et on a préparé 15 aliquotes de 24 pl chacun, en tubes de 0,2 ml convenablement légendés. On a ajouté à ce mélange 1 pl des dilutions d'ADN des échantillons ou 1 pl d 'ADN de la courbe de calibration, en correspondance. On a ajouté au contrôle négatif, à la place de l'ADN, 1 pl d'H20 stérile dépourvue de nucléases. Les réactions ont été incubées dans un thermocycleur MJ Research modèle PTC-100, avec le programme de cycles suivant: Tableau 37 Etape Température Temps ( C) (s) 1. Dénaturation initiale 95 120 2. Dénaturation 95 30 3. Hybridation 62 30 4. Extension 72 120 Les étapes 2 à 4 ont été répétées 18 fois. Dans le domaine Archaea, pour la détermination de Su/fo/obus sp. et Ferroplasma sp., on a réalisé en duplicate: a) 2 réactions pour les échantillons et b) 5 réactions pour la courbe de calibration, qui correspondent à la 20 solution standard Archaea en concentrations lx, 0, 1X, 0,01X, 0,001x et 0,0001X, et un blanc, ce qui donne un total de 15 réactions. 2890081 44 Dans le Tableau 38, on indique le mélange préparé. Tableau 38 Réactif 1 réaction 15 réactions H20 stérile et dépourvue de 18,35 pI 275, 25 pl nucléases Tampon PCR 10X 2,5 pI 37,5 pI MgCl2 (50 mM) 1,5 pl 22,5 pl dNTPs's (10 mM chi) 0,5 pI 7,5 pI Amorce Archaea 21F (10 pM) 0,5 pI 7, 5 pI Amorce Archaea 1492R (10 pM) 0,5 pl 7,5 pI Taq avec Hot Start (5U/pI) 0,15 pI 2,25 pl Les amorces utilisées sont celles décrites dans le Tableau 39: Tableau 39 Microorganisme T Amorces utilisés à déterminer Hybridation Archébactéries 57 C Arch2l F: TTC CGG TTG ATC CTG CCG totales GA Univ1492R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T On a homogénéisé ce mélange de PCR primaire et on a préparé 15 aliquotes de 24 pI chacun, en tubes de 0,2 ml convenablement légendés. On a ajouté à ce mélange 1 pl des dilutions d'ADN des échantillons ou 1 pl d'ADN de la courbe de calibration, en correspondance. On a ajouté au contrôle négatif, à la place de l'ADN, 1 pl d'H2O stérile dépourvue de nucléases. Les réactions ont été incubées dans un thermocycleur MJ Research modèle 5 PTC-100, avec le programme de cycles suivant: Tableau 40 Etape Température Temps ( C) (s) 1. Dénaturation initiale 95 120 2. Dénaturation 95 30 3. Hybridation 57 30 4. Extension 72 120 Les étapes 2 à 4 ont été répétées 18 fois. Tout de suite après, on a réalisé 5 PCR secondaires, deux sur le produit de réaction de la PCR primaire pour le domaine Bacteria, pour Sulfobacillus sp. et pour les bactéries totales; et trois sur le produit de réaction de la PCR primaire pour le domaine Archaea, pour Su/fo/obus sp. et Ferroplasma sp., et pour les archébactéries totales, avec des amorces spécifiques pour chacun d'eux, qui s'hybrident dans la zone amplifiée par la PCR primaire. Pour les différents genres, on a choisi des amorces sens et inverses parmi celles présentées dans la description dans les tableaux correspondants a chaque taxon, dans ce cas, dans les Tableaux 7, 11 et 13. D'autre part, pour les bactéries totales ou les archébactéries totales, on a employé des amorces décrites dans la littérature, et qui sont présentées dans le Tableau 15. Les amorces employées pour chaque taxon et leurs températures d'hybridation sont indiquées dans le Tableau 41. Tableau 41 Microorganisme à T Amorces utilisées déterminer Hybridation Bactéries totales 59 (P.1) 27-F: 5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -2 (P.2) 338-R: 5'GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3' Sulfobacillus sp. 66 (P.1) F: 5'-AGG TGT CGC GGG GGT CCA CC -3' (P.2) R: 5'- CCA GGA ATT CCA TGC ACC TC -3' Archées totales 60 (P.1) 515-F: 5'- GTG CCA GCA GCC GCG GTA A - 3' (P.2) 958-R: 5'- TCC GGC GTT GAA TCC AAT T -3 Su/fo/obus sp. 60 (P.1) F: 5'- TAA ACC CTG CCG CAG TTG G -3' (P.2) R: 5'- CCA ACT GCG GCA GGG TTT A -3' Ferroplasma sp. 56 (P.1) F: 5'- GAT GTC GGT GAG GAG GGT T -3' (P.2) R: 5'ATT TGA TTT AAC CCT CTC G -3' On a réalisé une qPCR, pour chaque taxon à déterminer, sur chacun des produits de réaction de la PCR primaire; ces réactions de qPCR ont été réalisées en duplicate. La qPCR a été réalisée en utilisant le Mix SYBR Green qPCR. Pour chaque PCR secondaire, on réalise deux essais pour chacune des PCR primaires et un contrôle, ce qui donne un total de 31 réactions. Pour chaque PCR, on prépare un mélange de réactionnel décrit dans le Tableau 42, où les amorces sont celles qui correspondent au Tableau 41. Tableau 42 1 réaction 31 réactions H20 stérile et dépourvue de 16,1 pl 499,1 pl nucléases 2890081 47 Amorce 1 (10 pM) 0,5 pl 15,5 pl Amorce 2 (10 el) 0,5 pl 15,5 pl Tampon PCR 10X 2,5 pl 77,5 pl MgCl2 (50 mM) 1,5 pl 46,5 pl dNTPs's (10m N1 c/u) 2,5 pl 77,5 pl Taq avec Hot Start (5 U/pl) 0,15 pI 4, 65 pl SYBR Green qPCR 100X 0,25 pl 7,75 pl Ce mélange réactionnel a été homogénéisé et aliquoté en 31 tubes de 0,2 ml convenablement légendés; à chaque tube on a ajouté 1 pI de la PCR primaire ou l pl d'H2O stérile et dépourvue de nucléases pour le blanc. Les tubes de PCR avec le mélange réactionnel et l'échantillon ont été mélangés au vortex pendant 5 secondes et centrifugés 1 minute à 2000 rpm, pour respectivement homogénéiser et culoter les réactions au fond des tubes. Tout de suite après, les tubes avec les réactions de la PCR secondaire ont été soumis à des cycles de température pour leur amplification. Suivant le microorganisme à quantifier, on a utilisé différentes paires d'amorces, et par conséquent, différents programmes d'amplification. On détaille ci-dessous les programmes d'amplification employés dans les différentes PCR secondaires. Tableau 43 Etape Température ( C) Temps (s) 1 Dénaturation initiale 95 120 2 Dénaturation 95 30 3 Hybridation (*) 30 4 Extension 72 40 Pré-lecture 80 10 6 Lecture 80 ------ Répéter 40 fois les étapes 2 à 6 (cycle de qPCR) 7 Courbe de dénaturation Entre 70 et 100 C, lecture chaque 0,2 C. (*) Température spécifique pour chaque paire d'amorces utilisée, comme indiqué au Tableau 41. Une fois la réaction de qPCR terminée, on a conservé les données générées par le thermocycleur de la qPCR; ces données correspondent à Q et sont présentées dans le Tableau 44; ce tableau inclut en plus l'ADN utilisé en nanogrammes en (U). Tableau 44 Échantillon Q u Bact. Totales Sulfobacillus Archées Su/fo/obus sp. Ferroplasma sp. totales sp MS-6 20,26 x 10-3 0,01 x 10-3 0,71 x 10-3 0,05 x 10-' 0 2 MS-7 72,51 x 10-3 0,11 x 10-3 0,34 x 10-3 0,03 x 10-3 0,007 x 10' 2 Calcul des microorganismes présents dans l'échantillon. Avec le résultat de la qPCR, et les autres données générées pendant le 15 procédé, on a utilisé la formule suivante, dont les abréviations ont été définies dans la description: QxT Mo/Um= 5.10-6 [ng/rno]x U x Cm Avec celle-ci, on a déterminé que les échantillons analysés présentaient les populations microbiologiques suivantes: Tableau 45. MS-6 Microorganisme Mo. / g d'Échantillon Bact. totales 1,73 x 106 Sulfobacillus sp. 1,05 x 103 Archées totales 6,04 x 104 Su/fo/obus sp. 2, 02 x 103 Ferroplasma sp. 0 Tableau 46. MS-7 Microorganisme Mo. / g d'Échantillon Bact. totales 4,02 x 106 Sulfobacillus sp. 6,00 x 103 Archées totales 1,89 x 104 Sulfolobus sp. 1, 76 x 103 Ferroplasma sp. 4, 33 x 102 Les Figures 8 et 9 correspondent aux graphiques des résultats décrits dans les Tableaux 45 et 46. 20 25 2890081 50 REVENDICATIONS 1. Méthode pour identifier et quantifier les microorganismes utiles dans 5 les procédés de l'industrie biominière, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes de consistant à: (a) extraire l'ADN de l'échantillon; (b) quantifier l'ADN extrait; (c) optionnellement réaliser au moins une PCR primaire avec des amorces universelles pour les domaines: i. Bacteria et/ou ii. Archaea, pour amplifier une région du génome; (d) réaliser la technique de la PCR quantitative (qPCR), en employant comme matrice l'échantillon d'ADN extrait en (a) ou le produit amplifié obtenu dans la PCR primaire correspondante en (c), et des amorces spécifiques pour chaque taxon à déterminer, les taxons étant choisis dans le groupe consistant en: i. Bacteria: Bactéries totales, Acidiphilium sp., Leptospirillum sp., Sulfobacillus sp., Acidithiobacillus ferrooxidans et Acidithiobacillus thiooxidans; et ii. Archaea: Archées totales, Acidianus sp., Ferroplasma sp, Metallosphaera sp, Su/fo/obus sp. et Thermop/asma sp. (e) calculer le nombre de microorganismes dans chacun des taxons analysés présents dans l'échantillon. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que à l'étape (b) l'ADN est quantifié par spectrophotométrie. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la PCR primaire de l'étape (c) est réalisée avec des amorces qui permettent d'assurer l'amplification correcte de la région 16S de I'ADNr. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que que pour la PCR primaire (c) pour le domaine Bacteria on emploie les amorces suivantes: Amorce directe Eub27-F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG = SEQ ID NO:1 Amorce reverse Univ1492-R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T = SEQ ID NO:2. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que pour la PCR primaire (c) pour le domaine Archaea on emploie les amorces suivantes: Amorce directe Arch21-F: TTC CGG TTG ATC C(CT)G CCG GA = SEQ ID NO:3 Amorce reverse Univ1492-R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T = SEQ ID NO:2. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Acidiphilium sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 4 à 23 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 24 à 43. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Leptospirillum sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 44 à 63 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 64 à 83. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Sulfobacillus sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 84 à 103 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 104 à 123. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Acidithiobacillus ferrooxidans est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 124 à 143 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 144 à 163. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Acidithiobacillus thiooxidans est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 164 à 183 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 184 à 203. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Acidianus sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 204 à 223 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 224 à 243. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Ferroplasma sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 244 à 263 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 264 à 283. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Metallosphaera sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 284 à 303 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 304 à 323. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Su/fo/obus sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 324 à 343 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 344 à 363. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la paire d'amorces utilisée pour déterminer le taxon Thermoplasma sp. est le résultat de la combinaison d'une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 364 à 383 avec une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 384 à 403. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite méthode inclut une réaction de qPCR pour déterminer les bactéries totales en utilisant une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO:1, 405 et 406 et une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ IC) NO: 407 à 409 et/ou une réaction de qPCR pour déterminer les archébactéries totales en utilisant une amorce sens choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO:410 et 411 et une amorce inverse choisie dans le groupe consistant en les séquences SEQ ID NO: 412 à 414. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que à l'étape (d) on conserve les résultats de la qPCR et on obtient la concentration initiale d'ADN présent dans chaque mélange réactionnel (Q). 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on calcule le nombre de microorganismes présents dans l'échantillon biominier en utilisant la formule suivante: où Mo / Urn est le nombre de microorganismes, bactéries ou archébactéries, par unité d'échantillonnage; Q est la quantité d'ADN initiale en nanogrammes présente dans chaque réaction de PCR secondaire, déterminée par le programme associé à l'équipement de qPCR; T est la quantité totale d'ADN extraite de l'échantillon; U est la quantité d'ADN utilisée dans la réaction de PCR primaire; et QxT Mo /Um =- 5.10-6 [ng/mo] x U x Cm Cm est la quantité d'échantillon biominier duquel on a extrait l'ADN, en ml pour des échantillons liquides ou en g pour des échantillons solides.