Brevet FR2893131A1 — publié le 20070511

L'invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules de taille inférieure à 60 nm possédant une résonance plasmon et présentes à la surface supérieure d'un support solide plan. L'invention comprend également un dispositif pour la mise en oeuvre d'un tel procédé ainsi que ses applications. Dans de nombreux domaines liés à la biologie, des travaux expérimentaux mettent en oeuvre l'observation de molécules par des mesures de fluorescence. On citera notamment les études sur la dynamique réactionnelle de médicaments ou de molécules biologiques jouant un rôle essentiel dans le fonctionnement d'une cellule (protéines, ARN, ...). Le véritable enjeu de ces études est l'obtention de ce type d'information au niveau de la molécule unique. L'activité d'un médicament au niveau du génome d'une cellule peut, par exemple, mettre en jeu l'action d'une seule molécule qu'il est donc nécessaire de pouvoir observer et caractériser. La faiblesse du signal de fluorescence est alors une limitation majeure. D'autre part, le marquage fluorescent présente une autre limitation majeure liée aux processus de photodestruction des marqueurs. Les molécules fluorescentes ne peuvent absorber et émettre qu'un nombre limité de photons avant d'être détruites, ainsi la fluorescence moyenne d'un échantillon marqué diminue au cours du temps. Ce phénomène limite la durée pendant laquelle peut-être suivie une molécule marquée. De plus, la dégradation des marqueurs fluorescents rend impossible l'archivage à long terme : par exemple, une biopuce devient illisible quelques semaines après sa fabrication. Le problème de la photodestruction des marqueurs fluorescents a été partiellement résolu grâce aux progrès récents réalisés dans l'utilisation des nanocristaux semi-conducteurs comme fluorophores. Toutefois, ces marqueurs plus résistants à la photodestruction introduisent de nouveaux problèmes comme celui du clignotement et de la biocompatibilité, qui limitent leur efficacité dans les études dynamiques en milieu biologique. Il existe de nombreux types de marqueurs non fluorescents, notamment les nanoparticules métalliques, qui possèdent des propriétés optiques uniques. En particulier, elles présentent, pour certaines longueurs d'onde, des résonances d'absorption marquées associées aux oscillations collectives de leurs électrons de conduction. Les nanoparticules sont ainsi de plus en plus utilisées comme traceurs en biologie moléculaire en remplacement des marqueurs fluorescents. Elles ne sont pas photodétruites, permettent un marquage multicouleur et émettent un signal bien plus intense que les fluorophores standards. Leur détection est basée sur leur capacité à diffuser la lumière (diffusion Rayleigh). Malheureusement, cette aptitude diminue avec leur taille et en pratique les nanoparticules de taille inférieure à 30 nm ne peuvent être détectées. Cette limite de taille est rédhibitoire pour toute étude dynamique, en particulier pour le suivi de biomolécules in vivo car les nanoparticules rendraient par exemple impossible la migration des biomolécules marquées à travers les canaux membranaires. Par conséquent, le marquage par nanoparticules est souvent effectué ou modifié a posteriori (dans le cas de biomarqueur notamment). Par exemple, lorsque des nanoparticules plus petites sont utilisées pour le marquage, il est nécessaire d'augmenter leur taille a posteriori, afin d'augmenter le signal lumineux et pouvoir les détecter (amplification à l'argent). Des techniques récentes, mettant en jeu des mesures d'effet photothermique, rendent possible la détection de nanoparticules inférieures à 10 nm. Ces techniques, qui ne sont pas encore commercialisées, ne permettent pas de réaliser de l'imagerie plein champ mais uniquement point par point. Les études dynamiques restent donc difficiles, voire impossibles à cause de la lenteur des mesures. De plus, ces techniques indirectes nécessitent l'utilisation de deux sources lumineuses. Les nanoparticules sont également utilisées dans des dispositifs d'observation en atténuation totale de la réflexion (ATR) sur une lame métallisée. Cette technique permet de mesurer avec une grande sensibilité les variations d'indices de réfraction au voisinage d'une surface. Le mode plasmon de surface d'un film métallique déposé sur un support transparent peut être excité en éclairant le film à travers le support, à un angle bien précis. A cet angle uniquement, la réflexion de la lumière sur le métal est totalement atténuée. La mesure de cet angle permet de détecter avec une grande sensibilité les variations d'indices proche de la surface dans l'échantillon étudié. Les nanoparticules qui s'approchent de la surface de la lame métallisée amplifient localement l'indice du milieu. Cette technique lorsque utilisée en imagerie nécessite un appareillage spécifique. Enfin, il existe de nombreuses techniques non optiques appliquées aux biocapteurs (gravimétrique, électrochimique et électrique). Tous ces types de détection sont relativement marginaux et nécessitent des investissements financiers considérables et spécifiques. Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'une méthode efficace, fiable et facile à mettre en oeuvre permettant la détection et/ou la quantification de nanoparticules dont la taille est inférieure ou égale à 60 nm, notamment inférieure ou égale à 20 nm à la surface d'un support solide. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible de détecter des nanoparticules de quelques nanomètres de diamètre se trouvant à une distance inférieure à quelques centaines de nanomètres d'une surface métallique revêtant un support solide plan transparent. Les inventeurs ont notamment pu montrer que lorsqu'une nanoparticule s'approche d'une surface métallique, des composantes évanescentes présentes dans son champ proche se couplent au plasmon de surface du métal induisant un transfert d'énergie vers ce dernier. Cette énergie peut être ensuite transférée sous la forme d'un cône de lumière émis par la face arrière du film mince métallique (cf. figure 5). Il est ainsi possible de détecter et d'imager en plein champ, à l'aide d'un microscope optique classique, des nanoparticules de quelques nanomètres de diamètre. Ainsi, sous un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules présentes à la surface supérieure d'un support solide plan, lesdites nanoparticules possédant une résonance plasmon, ledit support solide comprenant un support solide transparent revêtu sur sa surface supérieure d'un film métallique présentant un plasmon de surface et l'indice dudit support transparent étant supérieur à celui du milieu dans lequel se trouvent lesdites nanoparticules, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support solide, afin d'éclairer les nanoparticules éventuellement présentes sur la surface supérieure ; b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que : - à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface supérieure ; et - à l'étape b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure est réalisée en s'affranchissant de la lumière directe issue de l'éclairage qui traverse le film métallique, ou en ce que: - à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface inférieure ; et - à l'étape b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure est réalisée en s'affranchissant de la lumière réfléchie issue de l'éclairage. L'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support, afin d'éclairer les nanoparticules éventuellement présentes sur la surface supérieure, a pour but dans le procédé de l'invention d'exciter les nanoparticules à une longueur d'onde accordée à la fréquence de résonance plasmon desdites nanoparticules. Par lumière issue de nanoparticules par la surface inférieure , on entend particulièrement désigner ici la lumière issue de la nanoparticule à la même longueur d'onde que la longueur d'onde d'excitation de la nanoparticule et qui est transmise par la surface inférieure. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que les nanoparticules sont des nanoparticules métalliques, notamment choisies parmi des nanoparticules d'or, d'argent, d'aluminium, de platine ou de cuivre, les nanoparticules d'or ou d'argent étant les plus préférées. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que le film métallique qui revêt la surface supérieure du support solide transparent est choisi parmi un film dont le métal est celui des nanoparticules à détecter. De préférence, ce film métallique a une épaisseur comprise entre 5 nm et 500 nm, notamment entre 20 nm et 80 nm. Ce film métallique aura une épaisseur comprise entre 20 nm et 80 nm en particulier lorsque la longueur d'onde d'excitation des nanoparticules est une longueur d'onde d'une lumière située dans le visible. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que lesdites nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à la longueur d'onde d'excitation desdites nanoparticules, de préférence inférieure ou égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation desdites nanoparticules. De préférence, les nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à 500 nm, en particulier si la lumière utilisée pour l'éclairage est dans le domaine du visible. De préférence, les nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à 500 nm, de préférence inférieure ou égale à 400 nm, à 300 nm ou à 200 nm, de la surface supérieure du support solide, une distance inférieure ou égale à 200 nm étant la plus préférée. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le film métallique situé à la surface supérieure du support est revêtu d'un film transparent permettant d'ajuster la distance minimum entre les nanoparticules et le film métallique. De préférence, ce film transparent a une épaisseur inférieure ou égale à 50 nm. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface supérieure. De préférence, dans ce mode de réalisation, à l'étape b), la lumière issue des nanoparticules est transmise à la surface inférieure au travers dudit support. Dans un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que à l'étape a), l'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support est réalisé soit : - avec une source de lumière blanche ou avec une lumière polychromatique dont les longueurs d'ondes d'excitation contiennent au moins une longueur d'onde d'excitation accordée à la fréquence de résonance plasmon desdites nanoparticules ; ou soit - avec une source de lumière monochromatique dont la longueur d'excitation est accordée à la fréquence de résonance plasmon desdites nanoparticules. Selon un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que à l'étape b), la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules à la surface inférieure est réalisée au moyen d'un microscope, le cas échéant couplé à une caméra CCD. Un tel microscope est notamment un microscope en réflexion muni d'un objectif à immersion et grande ouverture numérique et préférentiellement équipé d'un cache qui, lorsque l'éclairage est réalisé par la surface supérieure, permet de masquer ou d'éliminer la lumière directe issue de l'éclairage qui traverse le film métallique, ou qui lorsque l'éclairage est réalisé par la surface inférieure, permet de masquer ou d'éliminer la lumière réfléchie issue de l'éclairage. Il est à noter que l'utilisation d'un objectif à immersion à grande ouverture numérique pour collecter la lumière issue des nanoparticules à la surface inférieure et que l'on souhaite détecter et/ou quantifier est également particulièrement préférée pour la configuration avec l'éclairage par la partie supérieure (voir exemple 4 B). Le microscope utilisé pour la détection des nanoparticules peut également être un microscope point par point à balayage de type microscope confocal ou scanner. Afin de collecter le cône de lumière, décrit dans l'exemple 2 et représenté figure 5, issu des particules par la face inférieure, un objectif à immersion de grande ouverture numérique peut être utilisé. Ce microscope pourra en particulier être équipé d'un objectif parabolique à immersion basé sur un principe tel que celui décrit à la figure 1 page 48 dans l'article de Dr. Thomas Ruckstuhl dans le Journal Biophotonics International de Septembre 2005. Selon un mode de réalisation également préféré, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier ont un diamètre inférieur ou égal à 60 nm, de préférence inférieur ou égal à 40 nm, 30 nm ou 20 nm, un diamètre inférieur ou égal à 20 nm étant particulièrement préféré. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier présentent des couleurs différentes associées à leur résonance plasmon. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention est caractérisé en ce que ledit support est un support solide transparent revêtu à sa surface supérieure d'un film métallique sur lequel est fixé un composé sonde capable de reconnaître spécifiquement un composé cible que l'on cherche à détecter et/ou quantifier au moyen ou par la présence de nanoparticules. Les nanoparticules sont aujourd'hui couramment utilisées en biologie pour la capture ou le marquage de composés, notamment biologiques tels que des protéines, des neurotransmetteurs, des acides nucléiques, des lipides ou encore des hydrates de carbone mais également de cellules. En général, la surface des nanoparticules est revêtue d'un ou fonctionnalisée par un composé capable de se lier spécifiquement au composé cible recherché pour former un complexe (par exemple un complexe formé par hybridation spécifique d'acides nucléiques complémentaires, complexe de type anticorps-antigène, ligand-récepteur, etc.). La détection ou la quantification de ces nanoparticules ainsi complexées au composé cible sera directement corrélée à la présence et/ou à la quantité du composé cible présente dans un échantillon. Ainsi, sous un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon au moyen d'un support solide, dans lequel la détection et/ou la quantification dudit composé cible est corrélée à la détection et/ou la quantification de nanoparticules, caractérisé en ce que les nanoparticules sont détectées et/ou quantifiées par un procédé selon l'invention. L'invention comprend également un procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'invention ou un procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon selon l'invention, caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier sont utilisées comme marqueur spécifique dudit composé cible que l'on cherche à détecter et/ou quantifier. Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier sont revêtues (ou fonctionnalisées à l'aide) d'un composé capable de se lier spécifiquement au composé cible, notamment d'un acide nucléique complémentaire du composé cible si le composé cible est un acide nucléique, d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement le composé cible si le composé cible est une protéine, d'un ligand, notamment un neurotransmetteur, capable de reconnaître spécifiquement le composé cible si le composé cible est un récepteur . Ainsi, la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules ou procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon selon l'invention, caractérisé en ce que le composé sonde ou le composé cible est choisi parmi le groupe de composés constitué par les acides nucléiques, les polypeptides, peptides-nucléiques acides (PNA), les lipopeptides, les glycopeptides, les neurotransmetteurs, les hydrates de carbone, les lipides, de préférence les acides nucléiques, les polypeptides, les neurotransmetteurs ou les hydrates de carbone. Dans un mode de réalisation préféré des procédés selon l'invention, ledit support solide plan est en verre. Sous encore un autre aspect, la présente invention comprend un dispositif pour la détection et/ou de quantification de nanoparticules présentes à la surface supérieure d'un support solide plan, lesdites nanoparticules possédant une résonance plasmon, ledit support solide comprenant un support solide transparent revêtu sur sa surface supérieure d'un film métallique présentant un plasmon de surface et l'indice dudit support transparent étant supérieur à celui du milieu dans lequel se trouvent lesdites nanoparticules, ledit dispositif comprenant une source de lumière permettant l'éclairage de la surface supérieure ou de la surface inférieure dudit support et un système de détection et/ou de quantification de la lumière transmise par la surface inférieure dudit support, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend en outre un système permettant d'éliminer ou de masquer : soit - la lumière réfléchie issue de la source de lumière lorsque l'éclairage est réalisé par la surface inférieure du support solide ; ou - la lumière directe transmise par la source de lumière lorsque l'éclairage est réalisé par la surface supérieure du support solide. De préférence, le dispositif selon l'invention est un microscope en réflexion, particulièrement muni d'un objectif à immersion, de préférence encore à grande ouverture numérique, comme par exemple un microscope utilisé traditionnellement pour la fluorescence en réflexion totale interne (TIRF), ce microscope étant caractérisé en ce qu'il est muni d'un cache qui lorsque l'éclairage des nanoparticules est réalisé par la surface supérieure du support solide plan, ce cache permet de masquer ou d'éliminer la lumière directe issue de l'éclairage qui traverse le film métallique, ou d'un cache qui lorsque l'éclairage est réalisé par la surface inférieure, permet de masquer ou d'éliminer la lumière réfléchie issue de l'éclairage. De préférence encore, un tel dispositif est représenté à la figure 6. La présente invention comprend également sous un autre aspect, l'utilisation d'un procédé ou d'un dispositif selon la présente invention, pour : - la détection et/ou la quantification de composé présent dans un échantillon ; - le diagnostic in vitro de maladie chez un patient liée à la présence ou à la concentration d'un composé particulier dans un échantillon biologique issu dudit patient ; - l'imagerie biologique de systèmes confinés sur quelques centaines de nm, notamment pour l'étude de transferts membranaires, de localisation précise de composé dans un compartiment cellulaire ou de biocapteurs, ceci en remplacement des techniques traditionnelles : fluorescence en réflexion totale interne (TIRF) et imagerie de résonance de plasmon de surface (SPR) ; et - l'imagerie plein champ de nanoparticules, notamment de diamètre inférieur ou égal à 20 nm, sur une épaisseur inférieure ou égale à 500 nm, de préférence inférieure ou égale à200nm. Cette imagerie plein champ ultra sensible permet de visualiser les interactions moléculaires sur les surfaces ce qui représente un intérêt fondamental en biologie cellulaire et moléculaire car de nombreux processus de transport moléculaire sont transmembranaires. On peut citer comme exemple l'activation des cellules par des hormones, des neurotransmetteurs et des antigènes, l'adhésion des cellules aux surfaces (dans les biofilms notamment), les transports électroniques dans les membranes, les dynamiques de membrane et du cytosquelette; les événements liés aux sécrétions cellulaires et la fusion de vésicules avec les membranes. L'extrême finesse de la zone sondée par cette technique permet de ne détecter que les nanoparticules attachées à la surface. Celles présentes dans le milieu environnant sont invisibles avec cette technique. Le domaine des biocapteurs est également un domaine d'application considérable pour cette invention. Ce nouveau procédé ouvre la voie à des études de suivi de biomolécules uniques, ainsi qu'à une imagerie ultra sensible et rapide d'échantillons marqués à l'aide de nanoparticules de quelques nanomètres. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures Figure 1 : Schémas représentant un plasmon de surface : champ EM induit par les charges, amplitude de l'onde évanescente associée du côté du métal et du côté du diélectrique, cartographie théorique du champ électrique Ez (W. L. Barnes et al., Nature 424 p. 824 (2003)). Figure 2 : Relation de dispersion du plasmon de surface (courbe tendant vers une asymptote horizontale représentée en pointillés) pour une interface métal/échantillon (d'indice n'), la droite de plus forte pente (droite gris foncé) représente la courbe limite de dispersion pour un rayon provenant du côté de l'échantillon avec une incidence rasante, la droite de plus faible pente (droite gris clair) montre que cette limite est repoussée pour des rayons provenant d'un milieu d'indice plus élevé n>n'. Le couplage avec le plasmon métal-échantillon est alors possible. C'est ainsi que le plasmon peut générer un cône de lumière ou être excité par la face arrière. o)p = fréquence plasma n = indice de réfraction du substrat (i.e. verre) Figure 3 : Probabilité de transfert d'énergie d'un fluorophore à x = 600 nm en fonction de sa distance à la surface. Ligne pointillée : moyenne pour un ensemble de dipôles orientés aléatoirement (W. H. Weber et C. F. Eagen, Opt. Lett. 4 (8) p. 236 (1979)). ( emission probability pour probabilité d'émission ). Figure 4 : Puissance dissipée en fonction du vecteur d'onde parallèle à la surface normale pour une nanoparticule d'argent de rayon 10 nm (a), 30 nm (b) et 50 nm (c), éclairée sous incidence normale à x = 500 nm et située à 50 nm de l'interface métallique (J. Soller and D. G. Hall J. Opt. Soc. Am. B 19 (5) p. 1195 (2002)). Figure 5 : Cône de lumière provenant du couplage avec le plasmon de surface : dans ce cas le couplage est issu de nano rugosités présentes à la surface du film mince métallique (N. Fang, Opt. Express 11 p. 682 (2003)). Figure 6 : Objectif à immersion et grande ouverture numérique utilisé traditionnellement pour l'imagerie de fluorescence et en particulier pour l'imagerie en réflexion totale interne (TIRF) muni d'un cache pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention (image de l'objectif tiré du site : http://www.olympusmicro.com/primer/). Figure 7 : Simulation de l'amplitude relative de l'onde évanescente par rapport à celle obtenue en réflexion totale interne en fonction de l'angle d'incidence pour des épaisseurs d'argent de 30, 40, 50 et 60 nm. Les maxima sont obtenus entre 40 et 50 nm. Exemples Exemple 1 : Principe du couplage nanoparticule - plasmon de surface Lorsqu'un fluorophore s'approche d'une surface métallique, un nouveau processus de transfert d'énergie apparaît via le plasmon de surface. Le plasmon de surface est un mode d'oscillation collectif des électrons de conduction à l'interface entre un métal et un diélectrique. Ces oscillations génèrent une onde électromagnétique (EM) évanescente qui se propage à la surface du métal (cf. figure 1). Pour qu'il y ait couplage (Le. transfert d'énergie) entre deux modes, il faut que l'énergie et les composantes du vecteur d'onde de ces deux modes coïncident. Un faisceau de lumière arrivant sur la surface métallique, du côté de l'échantillon associé à un indice n', et faisant un angle B avec la normale à la surface, possède une relation de dispersion linéaire : w = c k / n' sin 9 où k = 2 7r/X est la norme du vecteur d'onde et c est la vitesse de la lumière dans le vide. Le graphe représenté à la figure 2 représente l'ensemble de ces relations de dispersion en fonction de la composante de k parallèle à la surface du métal. Quel que soit l'angle d'incidence, la courbe de dispersion associée au faisceau de lumière incident est située à gauche de la droite w = c k / n' associée à une onde incidente rasante. La courbe de dispersion du plasmon de surface étant située à droite de cette ligne, elle ne croise jamais les courbes de dispersion associées aux rayons incidents du côté de l'échantillon. Il est donc impossible d'exciter le plasmon avec une onde EM incidente sur la surface du côté échantillon. Réciproquement, le plasmon ne peut pas émettre de lumière de ce côté. La fluorescence émise par un fluorophore situé loin de la surface métallique (en dehors de l'onde évanescente) ne peut donc pas exciter le plasmon. Seules les composantes évanescentes associées au dipôle d'émission et qui sont présentes uniquement dans le champ proche du fluorophore, peuvent se coupler avec le plasmon (cf. figure 2). En effet, les composantes évanescentes peuvent posséder une composante du vecteur d'onde parallèle à la surface arbitrairement grande, la composante orthogonale devenant imaginaire (i.e. évanescente). Ainsi, seuls les fluorophores situés dans l'onde évanescente, i.e. typiquement à moins de 200 nm, peuvent exciter le plasmon de surface. Ce couplage dépend de l'orientation du dipôle émetteur du fluorophore par rapport à la surface. Il représente environ 60 % de l'énergie perdue par un ensemble de fluorophores orientés aléatoirement (cf. figure 3) et peut atteindre 93 % lorsque le dipôle est orienté orthogonalement à la surface. De la même façon que pour un fluorophore, cet effet est présent dans le cas d'une nanoparticule située près d'une surface métallique. La nanoparticule métallique se comporte comme un dipôle. La figure 4 présente les résultats de la modélisation d'une nanoparticule d'argent située à 50 nm d'une interface métallique, éclairée sous incidence normale à x = 500nm, pour des rayons de 10, 30 et 50 nm. D'après ces calculs théoriques, la proportion d'énergie transmise par la nanoparticule au plasmon de surface atteint 46 % (pour un rayon de 10 nm). On s'attend à obtenir une proportion encore plus importante lorsqu'on diminue la distance séparant la nanoparticule de la surface métallique. Le couplage nanoparticule û plasmon de surface est d'autant plus fort que les nanoparticules sont petites (cf. figure 4). En effet, pour les petites nanoparticules, la distribution des composantes du champ EM en fonction du vecteur d'onde est plus importante dans les grandes fréquences spatiales. Autrement dit, la proportion relative du champ évanescent (champ proche) est plus grande comparée à celle associée au champ propagatif. Or c'est précisément ces composantes qui sont susceptibles de se coupler avec la plasmon de surface (pics sur la figure 4). Le rendement de diffusion des nanoparticules diminue lorsque leur taille diminue. Cette baisse est induite par la diminution relative des processus radiatifs de dissipation de l'énergie (diffusion Rayleigh) par rapport aux processus de dissipation d'énergie interne (absorption). Les petites nanoparticules (typiquement inférieures à 10 nm de rayon) sont donc difficiles à détecter par diffusion. Cette diffusion correspond sur la figure 4 aux valeurs normalisées de k inférieures à 1 (champ non évanescent). Les méthodes actuelles qui permettent de détecter des nanoparticules aussi petites sont des méthodes de détection de l'effet photothermique qui s'appuient sur l'absorption (voir la demande internationale de brevet publiée sous le numéro WO 2004/025278). Exemple 2 : Détection des nanoparticules Les plasmons de surface ne pouvant a priori pas se coupler au champ propagatif, l'énergie transmise à ces modes non-radiatifs est perdue (dissipée sous forme de chaleur dans le film métallique). On peut alors considérer qu'en optimisant la distance les séparant, on a augmenté la section efficace d'absorption du système formé par la nanoparticule et la surface métallique. Il est cependant possible de récupérer sous forme de lumière cette énergie. En effet, si l'indice du milieu situé sur la face arrière du film est supérieur à celui situé sur la face avant et si le film métallique possède une épaisseur bien déterminée, alors le plasmon de surface se couple avec le champ EM propagatif (cf. figure 2) en émettant un cône de lumière par la face arrière (cf figure 5). L'épaisseur optimale du film métallique pour permettre ce couplage (typiquement quelques dizaines de nanomètres) dépend de la longueur d'onde d'excitation et de l'indice de réfraction des milieux de part et d'autre du film métallique. Il est alors possible, en réalisant une image de la surface métallique à travers le support transparent, de visualiser en plein champ, avec un microscope standard, des nanoparticules de quelques dizaines de nanomètres. Exemple 3 : Les nanoparticules comme marqueurs biologiques Les nanoparticules métalliques possèdent une résonance plasmon, i.e. une fréquence pour laquelle leur section efficace d'absorption devient très grande (par rapport à leur taille géométrique). Ce phénomène est dû au confinement du mode d'oscillation des électrons de conduction. Cette résonance dépend de la forme, de la taille et de la nature des nanoparticules. Elle est très marquée pour les nanoparticules d'argent ou d'or par exemple. Il est essentiel d'accorder la longueur d'onde d'excitation des nanoparticules sur leur fréquence de résonance plasmon afin de pouvoir les détecter, cette fréquence de résonance plasmon étant notamment fonction de la nature, de la forme et de l'environnement de ces nanoparticules, en particulier de leur distance par rapport au film métallique. Cette propriété des nanoparticules permet de faire du marquage multicouleur (comme en fluorescence) en utilisant plusieurs types de nanoparticules différentes (en nature ou en forme par exemple). Par rapport aux marqueurs fluorescents, les nanoparticules présentent l'avantage de ne pas être photodétruites. Le marquage de cellules biologiques par des nanoparticules fonctionnalisées de quelques nanomètres est aujourd'hui bien maîtrisé car il est largement utilisé pour les observations de microscopie électronique. Ainsi le procédé selon l'invention ne pose pas de problème quant à la phase de marquage déjà disponible commercialement. Exemple 4 : Configurations d'excitation Plusieurs modes d'excitation sont possibles pour exciter les fluorophores : A) Les fluorophores peuvent être excités en ondes évanescentes en excitant le plasmon Par le même processus que le couplage entre le plasmon et l'émission de lumière sous forme de cône transmis par la face arrière, il est possible d'exciter le plasmon à l'interface échantillon-métal par un faisceau incident sur la face arrière incliné suivant un angle bien précis û correspondant à l'accord de la composante de vecteur d'onde parallèle avec le plasmon (configuration Kretschmann, cf. figure 2). Pour ce faire, il est possible d'utiliser une configuration (et un appareillage) similaires aux montages classiques pour les excitations en ondes évanescentes (pour les mesures de réflectométrie de résonance plasmon ou pour celles de fluorescence en réflexion totale interne, cf. figure 6). Il faut toutefois veiller à ce que la polarisation du faisceau soit de type p pour exciter le plasmon et à mettre un cache pour stopper le faisceau incident réfléchi qui laisse passer le reste du cône de lumière couplée avec le plasmon de surface. Il est également souhaitable que ce cache stoppe l'ensemble de la lumière diffusée dans l'échantillon traversant le film mince métallique. Il est à noter que lorsque le faisceau incident possède le bon angle pour exciter le plasmon, l'intensité dans le faisceau réfléchi est minimale. Ainsi, la lumière parasite provenant de l'excitation est réduite. Ce type de configuration d'excitation peut également être implémenté avec un montage utilisant un prisme hémisphérique, hémicylindrique ou triangulaire. Ces configurations d'excitation correspondent à des configurations préférées car elles présentent l'avantage de n'éclairer que les fluorophores situés dans la zone d'intérêt (i.e. situés dans l'onde évanescente) comme dans un système TIRF standard. De plus, lorsque l'épaisseur du film métallique est ajustée, l'amplitude de cette onde peut être amplifiée par rapport au faisceau incident de plus d'un ordre de grandeur ce qui induit une augmentation significative du signal par rapport au TIRF standard (cf figure 7). B) Les fluorophores peuvent être également éclairés du côté de l'échantillon (cf figure 5) Cette configuration est généralement moins intéressante car il n'y a pas de sélectivité à l'excitation et l'amplitude du champ proche de la surface est plus faible (champ pratiquement nul au niveau du métal). Néanmoins, la sélection spatiale se fait à l'émission car seules les nanoparticules proches de la surface métallique peuvent exciter le plasmon. La diffusion de nanoparticules plus éloignées de la surface (non couplées au plasmon) bien que fortement atténuée par la traversée de la couche métallique parvient au détecteur. Le lobe de la lumière diffusée est transmise avec un angle maximal inférieur à celui du cône issu du couplage avec le plasmon. Aussi est-il possible de filtrer cette fluorescence à l'aide d'un cache de la forme d'un disque. Il est possible, même dans le cas d'une excitation placée du côté de l'échantillon, de filtrer totalement le signal provenant des nanoparticules situées loin du métal. Exemple 5 : Fabrication des supports Les échantillons sont fabriqués par évaporation thermique sous vide. L'épaisseur de la couche métallique est optimisée pour une longueur d'onde d'excitation donnée. D'autres techniques peuvent également être employées, ce type de support n'étant pas difficile à réaliser. L'argent ou l'or sont des candidats de choix et permettent des amplifications de champ important dans le domaine du visible. D'autres métaux (aluminium, platine, cuivre,...) peuvent également être utilisés. Le procédé selon l'invention a été réalisé par exemple avec des nanoparticules d'or de 20 nm en phase aqueuse. Ces nanoparticules peuvent être observées directement à l'oeil nu au microscope et leur mouvement brownien est visible. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules présentes à la surface supérieure d'un support solide plan, lesdites nanoparticules possédant une résonance plasmon, ledit support solide comprenant un support solide transparent revêtu sur sa surface supérieure d'un film métallique présentant un plasmon de surface et l'indice dudit support transparent étant supérieur à celui du milieu dans lequel se trouvent lesdites nanoparticules, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support, afin d'éclairer les nanoparticules éventuellement présentes sur la surface supérieure ; b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure. 2. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 1, caractérisé en ce que : - à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface supérieure ; et - à l'étape b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure est réalisée en s'affranchissant de la lumière directe qui traverse le film métallique issue de l'éclairage, ou en ce que: - à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface inférieure ; et - à l'étape b) la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules par la surface inférieure est réalisée en s'affranchissant de la lumière réfléchie issue de l'éclairage. 3. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les nanoparticules sont des nanoparticules métalliques. 4. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 3, caractérisé en ce que les nanoparticules sont des nanoparticules choisies parmi des nanoparticules d'or, d'argent, d'aluminium, de platine ou de cuivre. 5. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 4, caractérisé en ce que les nanoparticules sont des nanoparticules choisies parmi des nanoparticules d'or ou d'argent. 6. Procédé de fabrication selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit film métallique est choisi parmi un film dont le métal est celui des nanoparticules à détecter. 7. Procédé de fabrication selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit film métallique a une épaisseur comprise entre 5 nm et 500 nm, de préférence entre 20 nm et 80 nm. 8. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à la longueur d'onde d'excitation desdites nanoparticules, de préférence inférieure ou égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation desdites nanoparticules. 9. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à 500 nm si la lumière utilisée pour l'éclairage est dans le domaine du visible. 10. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon lune des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdites nanoparticules susceptibles d'être présentes à la surface supérieure du support solide que l'on cherche à détecter et/ou quantifier sont à une distance inférieure ou égale à 500 nm, de préférence inférieure ou égale à 200 nm, de la surface supérieure du support solide. 11. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le film métallique situé à la surface supérieure du support est revêtu d'un film transparent permettant d'ajuster la distance minimum entre les nanoparticules et le film métallique. 12. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit film transparent à une épaisseur inférieure ou égale à 50 nm. 13. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que à l'étape a), l'éclairage est réalisé par la surface supérieure. • 2893131 18 14. Procédé de détection de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que à l'étape b), la lumière issue des nanoparticules est transmise à la surface inférieure au travers dudit support. 15. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon 5 l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que à l'étape a), l'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support est réalisé avec une source de lumière blanche ou avec une lumière polychromatique dont les longueurs d'ondes d'excitation contiennent au moins une longueur d'onde d'excitation accordée à la fréquence de résonance plasmon desdites nanoparticules. 10 16. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que à l'étape a), l'éclairage par la surface supérieure ou inférieure dudit support est réalisé avec une source de lumière monochromatique dont la longueur d'excitation est accordée à la fréquence de résonance plasmon desdites nanoparticules. 15 17. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que à l'étape b), la détection et/ou la quantification de la lumière issue des nanoparticules à la surface inférieure est réalisée au moyen d'un microscope, le cas échéant couplé à une caméra CCD. 18. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon 20 l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier ont un diamètre inférieur ou égal à 60 nm, de préférence inférieur ou égal à 20 nm. 19. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on 25 cherche à détecter et/ou à quantifier présentent des couleurs associées à leur résonance plasmon. 20. Procédé selon l'une des revendication 1 à 19, caractérisé en ce que ledit support est un support solide transparent revêtu à sa surface supérieure d'un film métallique sur lequel est fixé un composé sonde capable de reconnaître spécifiquement 30 un composé cible que l'on cherche à détecter et/ou quantifier au moyen ou par la présence de nanoparticules. 21. Procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon au moyen d'un support solide, dans lequel procédé la détection et/ou la quantification dudit composé cible est corrélée à la détection et/ou la quantification de nanoparticules, caractérisé en ce que les nanoparticules sont détectées et/ou quantifiées par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20. 22. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules selon la revendication 20 ou procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon selon la revendication 21, caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier sont utilisées comme marqueur spécifique dudit composé cible. 23. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules ou procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon selon la revendication 22, caractérisé en ce que les nanoparticules que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier sont revêtues d'un composé capable de se lier spécifiquement au composé cible. 24. Procédé de détection et/ou de quantification de nanoparticules ou procédé de détection et/ou de quantification d'un composé cible dans un échantillon selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que le composé sonde ou le composé cible est choisi parmi le groupe de composés constitué par les acides nucléiques, les polypeptides, peptides-nucléiques acides (PNA), les lipopeptides, les glycopeptides, les hydrates de carbone, les lipides, de préférence les acides nucléiques, les polypeptides ou les hydrates de carbone. 25. Procédé selon l'une des revendication 1 à 24, caractérisé en ce que ledit support solide plan est en verre. 26. Dispositif pour la détection et/ou de quantification de nanoparticules présentes à la surface supérieure d'un support solide solide plan, lesdites nanoparticules possédant une résonance plasmon, ledit support solide comprenant un support solide transparent revêtu sur sa surface supérieure d'un film métallique présentant un plasmon de surface et l'indice dudit support transparent étant supérieur à celui du milieu dans lequel se trouvent lesdites nanoparticules, ledit dispositif comprenant une source de lumière permettant l'éclairage de la surface supérieure ou de la surface inférieure dudit support et un système de détection et/ou de quantification de la lumière transmise par la surface inférieure dudit support, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend en outre un système permettant d'éliminer ou de masquer : soit- la lumière réfléchie issue de la source de lumière lorsque l'éclairage est réalisé par la surface inférieure du support solide ; ou - la lumière directe transmise par la source de lumière lorsque l'éclairage est réalisé par la surface supérieure du support solide. 27. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 25 ou d'un dispositif selon la revendication 26, pour : - la détection et/ou la quantification de composé présent dans un échantillon ; - le diagnostic ; - l'imagerie biologique de systèmes confinés sur quelques centaines de nm, notamment pour l'étude de transferts membranaires ou de biocapteurs ; et -l'imagerie plein champ de nanoparticules, notamment de diamètre inférieur ou égal à 20 nm, sur une épaisseur inférieure ou égale à 500 nm, de préférence inférieure ou égale à200nm.15