Brevet FR2894969A1 — publié le 20070622

PEPTIDES ACTIFS CONTRE LES BACTERIES DU GENRE LEGIONELLA La presente invention concerne un nouveau peptide provenant de la souche Staphylococcus warneri RK, actif contre les bacteries du genre Legionella (denomme ci-apres peptide anti-Legionella >>). Elie a egalement pour objet des peptides analogues, different d'un ou plusieurs acides amines, par rapport audit peptide, cette modification n'alterant pas toutefois leur activite anti-Legionella telle qu'observee avec ledit peptide. Les bacteries du genre Legionella appartiennent a la famille des Legionellaceae. Le genre Legionella est divise en 48 especes regroupant 70 serogroupes distincts. L'espece Legionella pneumophila (L. pneumophila) est la bacterie responsable de la legionellose, une pneumonie mortelle dans environ 15 % des cas. Cette bacterie est principalement presente dans les eaux douces et tiedes. Dans les canalisations d'eau, Legionella est presente dans les biofilms ou elle est capable de survivre. Les biofilms sont des communautes microbiennes adherant a une surface et frequemment incluses dans une matrice de polymeres extracellulaires. Les biofilms sont presents non seulement dans la nature mais egalement dans I'environnement humain (canalisations, appareils medicaux ...). On peut egalement trouver Legionella a I'etat libre ou associee a des amibes, au sein desquelles elles se developpent. Les amibes sont des eucaryotes unicellulaires qui appartiennent a la famille des protozoaires. Elles jouent un role crucial au niveau de I'amplification des populations de Legionella dans les systemes aquatiques, et elles les protegent des conditions exterieures defavorables. Elles leur fournissent egalement un environnement particulier qui va favoriser leur virulence vis-a-vis des cellules humaines. L'infection de I'homme par Legionella s'effectue exclusivement par I'inhalation de gouttelettes d'eau contaminees ou d'aerosols contamines induits par differentes sources comme les systemes de refroidissement par vole humide (tours aerorefrigerantes, reseaux de climatisation ...), les douches ... . L. pneumophila se multiplie dans I'eau du robinet a des temperatures comprises entre 25 et 45 C, avec une temperature optimale de croissance de I'ordre de 35 C. En outre L. pneumophila se developpe dans une gamme de pH comprise entre 5,5 et 9,2 avec un pH optimum de croissance egal a 6,9. Differents traitements peuvent titre utilises pour limiter le developpement de Legionella dans ('eau. La desinfection thermique (>_ 70 C) peut titre utilisee, mais les traitements les plus courants sont les traitements chimiques (chlore et derives, traitements oxydants, ions metalliques ...) (Kim et al (2002), Water Res 36, 4433-4444). Cependant, ces traitements ne sont pas specifiquement cibles contre Legionella, ce qui a notamment pour effet de perturber I'equilibre ecologique de ('ensemble des microorganismes dans I'environnement. En outre, des la fin du traitement, les Leg/one/la se developpent a nouveau, montrant I'efficacite limitee du procede. Enfin, les produits chimiques utilises sont une source importante de pollution pour I'environnement. La publication Hechard et at. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23) divulgue que la souche Staphylococcus warneri inhibe le developpement de Legionella, ce qui est du a une molecule secretee par S. warneri qui semble titre une bacteriocine. Les bacteriocines sont des proteines ou des peptides anti-bacteriens produits par des bacteries. Elles sont produites aussi bien par des bacteries a Gram-negatif que par des bacteries a Gram-positif. Elles ont ete decrites tout d'abord chez E. col/ et nommees colicines. Chez les bacteries a Gram positif, ce sont les bacteriocines produites par les bacteries lactiques qui ont ete le plus etudiees, car potentiellement utilisables en agroalimentaire et plus rarement en hygiene ou sante. Le brevet US 5 817 362 decrit une bacteriocine produite par Lactococcus lactis, qui inhibe le developpement d'un grand nombre de bacteries telles que Staphylococcus, Pediococcus, Lactococcus, Lactobacillus ... et qui est utilisable en alimentaire. Le brevet US 5 445 835 decrit une methode de production d'un yaourt comprenant la bacteriocine PA-1. Le brevet EP 927023 concerne une composition pour traiter ('acne, comprenant une bacteriocine produite par Propionibacterium. Le brevet EP 851751 concerne un chewing-gum comprenant a titre d'agent anti-bacterien une bacteriocine. La demande WO01/92533 concerne une bacteriocine de classe Ila produite a partir d'une souche specifique de Lactobacillus sakei, qui s'avere particulierement efficace pour inhiber la croissance de Lister/a, et qui peut donc etre utilisee industriellement comme agent actif contre des flores pathogenes ou indesirables dans la preparation de produits alimentaires. Excepte la publication susmentionnee (Hechard et at., 2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23), aucun document de I'art anterieur ne decrit une bacteriocine presentant une activite contre Legionella. Dans la publication Hechard et at., la bacteriocine est cependant decrite de fapon imprecise, incomplete et en outre erronee car les auteurs n'ont pas reussi a purifier, isoler et identifier la molecule responsable de I'activite contre Legionella. En effet, ('analyse par spectrometrie de masse de la fraction active anti-Leg/one/1a revele deux masses moleculaires de 2613,8 Da et 2449,4 Da respectivement. Cependant, aucune de ces deux bacteriocines ne concerne le peptide de ('invention, qui est un peptide pur et qui presente une masse moleculaire differente. L'un des buts de la presente invention est de fournir un (ou plusieurs) peptide(s) anti-Legionella presentant une activite specifique ciblee contre Ies bacteries du genre Leg/one/la. Un autre but de ('invention est de fournir un traitement de decontamination specifiquement cible contre les bacteries du genre Legionella. Un autre but de ('invention est de fournir un traitement de decontamination de Leg/one/la sans perturber I'equilibre ecologique de I'environnement. 25 La presente invention a par consequent pour objet des peptides actifs contre les bacteries du genre Legionella, caracterises en ce qu'ils correspondent a la sequence en acides amines repondant a SEQ ID N 1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK, 30 ou a toutes autres sequences analogues. Elie a plus particulierement pour objet un peptide actif contre les bacteries du genre Leg/one/la, caracterise en ce qu'iI correspond a la sequence en acides amines repondant a SEQ ID N 1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK. Le (ou Ies) peptide(s) de 22 acides amines defini(s) ci-dessus presente(nt) une masse moleculaire d'environ 2561 Daltons et provien(nen) t de la souche 5 Staphylococcus warner/ RK. Le (ou Ies) peptide(s) de ('invention est (sont) plus particulierement une (des) bacteriocine(s) presentant des proprietes thermo-resistantes et hydrophobes. 10 De fapon avantageuse le ou les peptide(s) de I'invention presente(nt) une activite contre toutes les bacteries du genre Legionella. A I'inverse il(s) n'est (ne sont) pas actif(s) contre les autres bacteries non-Legionella. Le (ou Ies) peptide(s) de ('invention est (sont) notamment actif(s) contre les bacteries 15 du genre Legionella choisies dans le groupe constitue par les especes Legionella pneumophila, Legionella bozemanii, Legionella dumofll, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Legionella feeleli, Legionella hackeliae, Legionella sainthelensi, Legionella spiritensis, Leg/one/la erythra et Legionella quinlivanii. 20 La presente invention a egalement pour objet I'utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel(s) que defini(s) ci-dessus, pour la preparation d'un medicament destine a lutter contre la legionellose. Elle a aussi pour objet ('utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel(s) que defini(s) ci- 25 dessus, pour prevenir la contamination de surfaces ou de materiaux par les bacteries du genre Legionella ou pour la decontamination de surfaces ou de materiaux infectes par Legionella. Elle a encore pour objet I'utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel(s) que defini(s) ci-30 dessus, pour prevenir ou limiter le developpement de Legionella dans ('eau etlou ('air ou pour la decontamination de I'eau etlou de I'air infecte(e)(s) par Legionella. L'invention vise egalement le (ou les) fragment(s) d'ADN codant pour un (ou des) peptide(s) tel(s) que defini(s) ci-dessus. L'invention vise en outre le (ou les) vecteur(s), notamment de type plasmide, caracterise(s) en ce qu'iI(s) comporte(nt) le (ou les) fragment(s) d'ADN tel(s) que defini(s) ci-dessus. Un autre objet de ('invention reside dans la (ou les) composition(s) pharmaceutique(s), caracterisee(s) en ce qu'elle(s) comprend (comprennent), a titre d'agent actif, une quantite therapeutiquement efficace d'un ou plusieurs peptide(s) tel(s) que defini(s) ci-dessus. 10 D'autres caracteristiques et avantages de I'invention seront donnes dans I'exemple qui suit, dans lequel it est fait reference aux figures 1 a 3, qui representent, respectivement : - la figure 1, le chromatogramme obtenu fors de la chromatographie liquide haute 15 performance (HPLC) des sept fractions T15 a T21 obtenues par extraction en phase solide, - la figure 2, le spectre de masse de la fraction active T17, - la figure 3, les resultats du test d'activite en puits obtenus avec la fraction purifiee en HPLC. 20 EXEMPLE : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE LA SOUCHE Staphylococcus warneri PRODUCTRICE DU PEPTIDE anti-Leg/one/la DE L'INVENTION 1) Isolement de la souche bacterienne La souche bacterienne Staphylococcus warneri, nommee RK est isolee comme indique dans ('article des Inventeurs Hechard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23). 30 2) Purification de la souche bacterienne Le peptide anti-Legionella est purifie par une methode qui differe de celle decrite dans ('article des Inventeurs puisqu'il n'a pas ete possible dans le protocole decrit 25 dans Hechard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23) d'obtenir un peptide pur et que seul un melange a ete obtenu. Cet article ne permettait donc pas de prevoir que le peptide de I'invention obtenu par 5 purification existait et qu'il etait alors possible d'obtenir un produit d'une grande efficacite exploitable industriellement puisque pur. Parmi les nombreuses possibilites de changement du protocole de purification envisageables par I'homme de fart, les modifications concernent (a) le pourcentage 10 d'acide trifluoroacetique utilise dans les eluants qui a ete abaisse a 0,05% et (b) Ia solubilisation de I'echantillon avant injection en HPLC qui a ete realisee avec de ('eau acidifie a pH 5 avec HCI au lieu d'un melange d'eau et d'acetonitrile. La souche de Staphylococcus warneri RK est cultivee 24 h dans un milieu BHI (Brain 15 Heart Infusion) (200 ml dans un erlen d'1 L sous agitation a 37 C). La culture est centrifugee (6000 g, 15 min, 4 C). Le surnageant est conserve et chauffe 15 min a 70 C. Cet echantillon constitue I'extrait brut. Le pH de I'extrait brut est amene a 5 avec une solution d'acide chlorhydrique HCI. La 20 solution (100ml) est ensuite passee sur une colonne chromatographique echangeuse de cation (HiprepTM 16/10 Carboxy-Methyl FF, Amersham Biosciences), lavee successivement avec 100 ml de tampon d'acetate de sodium (20 mM, pH 5) a 0, 0,1 et 1 M NaCl. La croissance de L. pneumophila est inhibee par la fraction eluee avec de ('acetate de sodium a 1 M NaCl. 25 Cette fraction (-100 ml) est ensuite chargee sur une cartouche d'extraction en phase solide (Sep-pak C18, Waters) prealablement lavee et equilibree (10 ml d'ethanol, 5 ml d'acetonitrile et 10 ml d'eau Milli-Q). L'elution est realisee sequentiellement avec 5 ml de solution de plus en plus concentree en acetonitrile (0, 20, 40, 80 et 100%) et 30 contenant 0,05% d'acide trifluoroacetique (TFA). Les differentes fractions recoltees sont ensuite concentrees et lyophilisees pour titre a la fin suspendues dans 1 ml d'eau sterile, puis testees en activite contre L. pneumophila. L. pneumophila est inhibee avec la fraction contenant 80 % d'acetonitrile. Cette fraction est injectee sur une colonne analytique C8 Kromasil (250 x 4 mm) et analysee en HPLC (Perkin Elmer). Le chromatogramme obtenu est represents en figure 1. Ce chromatogramme est significativement different de celui publie dans Hechard et al. (2005, FEMS Microbiol. Lett., 252,19-23). En effet, dans la publication Hechard et al., le peptide actif est slue en melange avec d'autres peptides qui seuls sont detectes en spectrometrie de masse. Dans la presente invention, le peptide est totalement isole. II presente une grande efficacite, exploitable industriellement puisque pur. L'elution se fait a partir d'un gradient lineaire H2O-acetonitrile-TFA (0,05%) allant de 20% a 100% d'acetonitrile et cela en 45 min avec les 10 dernieres minutes a 100% d'acetonitrile-TFA (debit :0,8 ml.min-l). La detection s'effectue a 220 nm. Apres evaporation de ('acetonitrile et lyophilisation, chacune des fractions, T15 a T21, est suspendue dans 1 ml d'eau sterile, puis est testee en activite. Test d'activite en quits anti-Leqionella : Une suspension de Leg/one/1a pneumophila Lens est realisee dans 1 ml d'eau milli-Q sterile. La densite optique (DO) a 600 nm avec 1/10e de la suspension est mesuree. Aux 900 pl de suspension restante, un volume d'eau necessaire est ajoute afin d'avoir au final une solution de DO egale a 1. 100 pl de cette solution est deposee sur une bolte BCYE (Buffered Charcoal yeast Extract) pour I'etalement (qui est effectue a ('aide d'un etaleur). La composition du milieu BCYE est la suivante : - Tampon ACES 5g - Extrait de levure 10g - Charbon actif 2g - Agar 15g - L-cysteine 0,4g -Pyrophosphate ferrique 0,25g - Eau qsp 11 Les puits sont pratiques dans la gelose BCYE a ('aide d'un emporte-piece. 100 pl de la solution a tester (T15 a T21) est deposee dans un puits. La bone est ensuite incubee a 37 C en presence de 5% CO2 pendant 72h. La fraction T17 est active contre Legionella. L'analyse en spectrometrie de masse par ionisation Electrospray de la fraction active T17 a permis de determiner la masse du peptide correspondant : 2561,04 Da (voir figure 2). L'effet antagoniste est responsible d'une zone d'inhibition de Leg/one/la autour des puits, dont le rayon est proportionnel a la concentration de la bacteriocine. La figure 3 illustre le test d'activita en puits anti-Legionela de la fraction T17 purifiee 15 en HPLC. 3) Sequenpage du peptide anti-Legionella Le microsequengage du peptide purifia de ('invention a ate realise au Centre 20 Commun de Sequenpage de I'IBCP a Lyon, et a conduit a la sequence denommee SEQ ID N 1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK. Le calcul thaorique de la masse de la sequence complete SEQ ID N 1 conduit a 2561,08 Da. De facon avantageuse, le peptide de sequence SEQ ID N 1 a egalement ete obtenu par voie de synthese peptidique (Eurogentec). Le peptide synthetique presente Ies memes propriatas que le peptide provenant de la souche bacterienne : meme temps de retention en HPLC, meme spectre de masse et activite identique. 25 30 REVENDICATIONS 1. Peptides actifs contre les bacteries du genre Legionella, caracterises en ce qu'ils correspondent a la sequence en acides amines repondant a SEQ ID N 1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK, ou a toutes autres sequences analogues. 2. Peptide selon la revendication 1, caracterise en ce qu'il correspond a Ia sequence en acides amines repondant a SEQ ID N 1 : MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK. 3. Peptide(s) selon la revendication 1 ou 2, caracterise(s) en ce qu'il(s) presente(nt) une masse moleculaire d'environ 2561 Daltons. 4. Peptide(s) selon rune quelconque des revendications 1 a 3, caracterise(s) en ce qu'iI(s) provien(nen)t de la souche Staphylococcus warneri RK. 5. Peptide(s) selon rune quelconque des revendications 1 a 4, caracterise(s) en ce qu'il(s) concerne(nt) une bacteriocine presentant des proprietes thermo-resistantes et hydrophobes. 6. Peptide(s) selon rune quelconque des revendications 1 a 5, caracterise(s) en ce qu'iI(s) est (sont) actif(s) contre les bacteries du genre Legionella choisies dans le groupe constitue par les especes Leg/one/la pneumophila, Legionella bozemanii, Legionella dumofii, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Legionella feeleii, Legionella hackeliae, Legionella sainthelensi, Legionella spiritensis, Legionella erythra et Legionella quinlivanii. 7. Utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel que defini(s) a Tune quelconque des revendications 1 a 6, pour la preparation d'un medicament destine a lutter contre la legionellose. 8. Utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel que defini(s) a Tune quelconque des revendications 1 a 6, pour prevenir la contamination de surfaces ou de materiaux parles bacteries du genre Legionella ou pour la decontamination de surfaces ou de materiaux infectes par Legionella. 9. Utilisation d'un (ou des) peptide(s) tel que defini(s) a rune quelconque des revendications 1 a 6, pour prevenir ou limiter le developpement de Legionella dans I'eau et/ou fair ou pour la decontamination de I'eau et/ou de fair infecte(e)(s) par Leg/one/la. 10. Fragment(s) d'ADN caracterise(s) en ce qu'il(s) code(nt) pour un (ou des) peptide(s) tel(s) que defini(s) a rune quelconque des revendications 1 a 6. 11. Vecteur(s), notamment de type plasmide(s), caracterise(s) en ce qu'il(s) comporte(nt) le (ou les) fragment(s) d'ADN tel(s) que defini(s) a la revendication 10. 12. Composition(s) pharmaceutique(s), caracterisee(s) en ce qu'elle(s) comprend (comprennent), a titre d'agent actif, une quantite therapeutiquement efficace d'un ou plusieurs peptide(s) tel(s) que defini(s) a rune quelconque des revendications 1 a 6.