Brevet FR2896691A1 — publié le 20070803

UTILISATION D'ESTERS D'ALKYLGLUCOSIDE COMME INDUCTEURS DE BETA-DEFENSINES La présente invention est relative à l'utilisation d'esters d'alkylglucoside pour la fabrication d'une composition topique dermatologique ou dermocosmétologique destinée au traitement préventif ou curatif d'affections microbiennes par induction de l'expression de peptides antimicrobiens endogènes, et plus particulièrement en provoquant un rééquilibrage de la flore commensale de la peau et des muqueuses et/ou une diminution de l'adhésion des microorganismes pathogènes sur le tissu épithélial. Dans le cadre de la présente invention, les produits à base d' alkyle mono- ou di-ester d'a,(3-butylglucoside sont utilisés pour déclencher une réaction immune dans un organisme hôte par génération in vivo , de peptides anti-microbiens endogènes, de la famille des 3-défensines (hBD-2, hBD-3) et des cathélicidines (LL-37), protecteurs vis-à-vis d'infections par des micro-organismes vivants tels les virus enveloppés, les bactéries ou parasites, conduisant ainsi à l'élimination sélective du ou des agents pathogènes. Ces produits ne stimulent pas de manière concomitante ou séparée de réactions inflammatoires, d'irritation ou d'intolérance. Ces produits peuvent être utilisés à titre préventif (traitement prophylactique) ou curatif (traitement thérapeutique) au cours d'infections des tissus épithéliaux cutanés et cornéens, des muqueuses gingivales et vaginales, afin de ré-équilibrer la microflore et favoriser l'homéostasie épithéliale au cours de phénomènes infectieux durant lesquels les processus cicatriciels sont altérés. L'utilisation d'esters d'alkylglucoside selon la présente invention est plus particulièrement destinée à la fabrication de composition topique dermatologique ou dermo-cosmétologique destinée au traitement de la dermatite atopique, destinée à favoriser l'homéostasie épithéliale pour le 2 traitement d'affections ophtalmiques, pour le traitement d'affections gingivales ou encore pour favoriser l'homéostasie épithéliale dans le traitement d'affections vaginales. Les interfaces épithéliales des vertébrés supérieurs ont une importance stratégique évidente puisqu'il s'agit du site de premier contact d'un organisme avec l'environnement microbien antigénique. Les épithéliums squameux stratifiés fonctionnent en tant que barrière vis-à-vis des traumatismes mécaniques, de la perte en eau et des infections microbiennes. Pour comprendre cette fonction, on ne peut isoler ces épithéliums de leur environnement physique, telle que l'étanchéité conférée par les systèmes d'adhésion inter-cellulaires (Presland & Dale, 2000), mais aussi chimique ou microbien. Ainsi, l'épithélium joue parallèlement un rôle actif dans les défenses immunitaires de l'hôte, mises en jeu lors d'agressions exogènes et en particulier dans l'immunité innée ou naturelle, constituant une première ligne de défense, caractérisée par une réponse immédiate et non spécifique. Un des mécanismes est l'induction par les cellules épithéliales d'organes tels que la peau, les bronches, les intestins, les voies urinaires, l'oeil, l'appareil génital, de composés antimicrobiens de nature peptidique (Pour revue, Koczulla et Bals, 2003 ; Yang D., et al 2004). Ces peptides produits par les cellules épithéliales fonctionneraient dans une certaine mesure en maintenant la flore naturelle de micro-organismes dans un état d'équilibre propre à chaque niche écologique. La microflore commensale joue en effet un rôle important dans cet environnement en limitant la colonisation par des germes pathogènes et en stimulant les défenses naturelles immunitaires. Ils sont répartis en quatre groupes sur la base de leur taille, de leur séquence en acides aminés et de leur structure (Koczulla & Bals, 2003). Parmi ces groupes : ^ la famille des défensines a fait l'objet d'investigations importantes depuis la fin des années 90 (pour revue Gantz, 1999; Huttner & Bevins, 1999). Toutes les défensines sont des peptides polycationiques riches en acides aminés basiques, formant trois ponts disulfures à partir de leurs six résidus cystéine aboutissant à une structure en triple feuillet bêta. Sur la base de l'alignement de ces ponts disulfures, deux classes de défensines ont été définies, les a et 8-défensines (Koczulla & Bals, 2003). Principalement, quatre 8-défensines ont été mises en évidence soit après isolement à partir des épithéliums, HBD-1 et 2 (Weinberg et al, 1998) ou par screening biomoléculaire, HBD-3 et 4 (Koczulla & Bals, 2003). ^ la famille des cathélicidines constitue un autre grand groupe de peptides antimicrobiens retrouvé chez de nombreux mammifères. Un seul peptide de cette famille a été mis en évidence chez l'être humain, hCAP18/LL-37 (Zanetti et al, 2004). Son expression a été retrouvée chez plusieurs tissus épithéliaux et en particulier dans les kératinocytes lors de pathologies cutanées de type inflammatoire (Frohm et al, 1997), mais aussi chez diverses cellules immunitaires (monocytes, cellules NK et lymphocytes B) (Yang et al, 2004). Ce peptide est composé au départ d'un peptide signal à l'extrémité NH2_terminale (pré-région), d'une région conservée, le domaine cathelin-like (pro-région) et du domaine antimicrobien en COOH terminal LL-37. La cathélicidine est stockée dans les granules des neutrophiles sous forme inactive Cathelin/LL-37 puis clivée par l'élastase ou la protéinase 3 pour libérer LL-37 (Koczulla & Bals, 2003). Dans la plupart des épithéliums, le peptide HBD-1 est exprimé constitutivement alors que HBD-2, HBD-3 et LL-37 sont inductibles par les stimuli pro-inflammatoires comme le TNF-a ou l'IL1-8, les stimuli infectieux et le niveau de différenciation des kératinocytes cutanés (Liu et al, 2002 ; Frohm et al, 1997). Les récepteurs ou PRRs (Gordon, 2000) mis en jeu pour cette induction, les plus fréquemment rencontrés sont les récepteurs de l'immunité innée et en particulier les récepteurs Toll Like ou TLR (TLR2 et TLR4) et CD14 (Chung et Dale, 2004), mais aussi PAR-2 (Protease activated receptor) (Chung et al, 2004) impliquant l'activation les voies de signalisation (NF)-KB ou AP-1. Les 13-défensines et LL-37 présentent un large spectre antimicrobien : bactéries, champignons et parasites. Leur fonction microbicide repose sur leur structure amphipathique, permettant leur association avec la surface membranaire microbienne, leur agrégation et finalement la formation de pores (Gallo RL & Huttner KM., 1998 ; Zaiou et al, 2003). HBD-2 exerce une action bactéricide sur les souches à gram négatif, mais le plus souvent restreinte à une action bactériostatique sur les souches à gram positif. En complément, le peptide HBD-3 a une forte activité microbicide qui inclut les bactéries de type gram négatif mais aussi gram positif tel que Staphylococcus aureus (S. aureus) (Schibli et al, 2002). LL-37 présente non seulement une large activité microbicide dirigée contre les bactéries à gram négatif et positif (Zaiou et al, 2003), mais aussi des effets antimicrobiens synergiques avec celui des 13-défensines, notamment HBD-2 qu'il rend bactéricide vis-à-vis de S. aureus (Ong et al, 2002). En plus de cette activité anti-microbienne directe, les 13-défensines et la cathélicidine LL-37 épithéliales sont capables à des concentrations sous-micromolaires d'exercer un certain nombre d'autres activités de signalisation qui aboutissent à l'initiation des défenses immunes adaptatives et ainsi de servir de lien entre immunité innée et adaptative (pour revue Yang D., 2002 et 2004). Ainsi les 13-défensines HBD-2 et -3 sont capables d'émettre un signal chimiotactique qui va permettre le recrutement des cellules dendritiques immatures et des lymphocytes T mémoires, sur le site de l'infection via le récepteur spécifique CCR6 (Yang D. et al, 1999 ; pour revue Yang D. et al, 2004). Par ailleurs il a été démontré que HBD-2 pouvait induire la maturation de ces lymphocytes par l'intermédiaire d'un récepteur Toll-Like TLR-4 porté par les cellules dendritiques (Biragyn A. et al, 2002). De son côté, LL- 37 possède des propriétés importantes de signalisation comme le chimiotactisme des cellules immunitaires, à des concentrations de l'ordre du nanomolaire. Ce peptide contribue ainsi au recrutement de neutrophiles, de mastocytes, de monocytes et de macrophages par l'intermédiaire du Human Formyl Peptide Receptor Like-1 (FPRL-1) (Scott et al, 2002). (Pour revue Yang D. et al, 2004). D'autres fonctions lui sont attribuées telles qu'une action protectrice vis-à-vis des chocs endotoxiques en bloquant la liaison du LPS 5 aux cellules exprimant le CD14, mais aussi son activité dans le domaine de l'angiogenèse et de la cicatrisation (Koczulla R. et al, 2003 ; Pour revue Yang D. et al, 2004). Dans le cas de certaines pathologies les f3-défensines et LL-37 pourraient éviter la colonisation de l'épithélium par des micro-organismes pathogènes. Ainsi, elles sont fortement exprimées au niveau de lésions psoriatiques où des surinfections par des micro-organismes ne sont que très rarement détectées. Au contraire, dans le cas d'autres pathologies comme la dermatite atopique (DA), fréquemment accompagnée de surinfections par S. aureus par exemple, ces peptides ne sont pas exprimés (Ong et al, 2002). Ainsi, l'absence ou l'inactivation de l'expression de ces peptides peut mener à des surinfections au décours de pathologies épithéliales diverses. Dans ce cas l'expression endogène des peptides HBD-2, HBD-3 et LL-37 étant potentiellement inductible au niveau de divers épithéliums (cutané, gingival, nasal, vaginal, tractus respiratoire...) (Kao et al, 2004 ; Krisanaprakornkit et al, 2002), la stimulation locale de leur synthèse se définit comme une cible potentielle de l'induction de l'immunité innée pour apporter une réponse thérapeutique en relation avec l'écosystème microbien et l'homéostasie épithéliale. Chez les individus sains, la surface épithéliale de la cavité orale est régulièrement colonisée par différentes souches de micro-organismes commensales (Fusobacterium nucleatum, F. nucleatum) sans qu'elle ne soit pour autant infectée par des micro-organismes pathogènes. La barrière mécanique, les composants de l'immunité adaptative et de l'immunité innée tels que les peptides antimicrobiens sont responsables du maintien de la balance écologique et de l'homéostasie épithéliale buccale (Chung WO. and Dale BA, 2004) .Le spectre antimicrobien des peptides et protéines sécrétés par l'épithélium oral et les glandes salivaires, leur régulation et les conditions de leur production, définissent la microflore de la cavité orale (Yoshimura A. et al, 2002). L'absence ou l'inactivation de ces peptides sont fréquemment corrélés à l'apparition de pathologies parodontales comme les parodontites, faisant suite à la colonisation par des pathogènes anaérobies à gram négatifs libérant de nombreux facteurs de virulence, tels que Prevotella intermedia (P. intermedia) Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) et Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), ou des infections opportunistes comme les candidoses (Feucht EC., et al, 2003). Par ailleurs, ces peptides fonctionneraient dans une certaine mesure en maintenant la flore naturelle de micro-organismes dans un état d'équilibre propre à chaque niche écologique. La microflore commensale joue en effet un rôle important dans cet environnement en limitant la colonisation par des germes pathogènes et en stimulant les défenses naturelles immunitaires. En tant que molécules de signalisation, ils pourraient stimuler la réponse adaptative après avoir recruté les cellules immunitaires au niveau cutané. Ainsi, la Demanderesse a considéré que le potentiel adjuvant indirect des alkyle mono- ou di-ester d'a,(3-butylglucoside , via la stimulation de l'expression des peptides antimicrobiens cationiques (hBD-2, hBD-3, et LL-37) au niveau de différents épithéliums (cutané, gingival, vaginal ou oculaire) peut être ciblé en vue d'un renforcement préventif du système immunitaire des individus. L'intérêt de la Demanderesse s'est porté sur l'étude de l'effet inducteur des alkyles mono- ou di-ester d'a,[3-butylglucosides sur l'expression des gènes codant pour les peptides cationiques antimicrobiens humains hBD-2, hBD-3 et LL-37 en comparaison de l'effet de cytokines pro-inflammatoires ou d'éléments infectieux, au niveau de modèles cellulaires (lignée de kératinocytes humains HaCat, primoculture de kératinocytes humains) et de modèles tissulaires (expiants cutanés ou gingivaux, épithélium gingival reconstruit, maintenus en survie in vitro). Cet effet régulateur a été mis en évidence au niveau des acides ribonucléiques messagers (ARNm) de manière quantitative par la technique de transcription inverse (RT) couplée à la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel. En complément, la synthèse peptidique induite a été qualitativement évaluée par immuno-histochimie dirigée contre les peptides hBD-2, hBD-3 et LL-37. Dans un second temps, nous avons analysé l'effet biologique ex vivo des alkyle mono- ou di-ester d'a,13-butylglucoside sur l'adhésion d'une surface cutanée par S. aureus à l'aide d'un modèle à double compartiment séparé. Conformément à la présente invention, on utilisera plus particulièrement l'ester d'alkylglucoside constitué par un C8-C20-alkyle mono-ou di-ester de C1-C6-alkylglucoside, en particulier un C8-C20-alkyle mono- ou di-ester de butylglucoside, le fragment ester pouvant être avantageusement un mono-ou di-caprylate, -caprate, -laurate, -palmitate, -myristate, -stéarate, -cocoate d'a-butylglucoside. Les aikylglucosides avec une chaîne alkyle formée de 8 à 20 atomes de carbone sont des agents tensioactifs dont les structures et synthèses chimiques ont été décrites dans la demande de brevet WO 93/04185. - Modèle cellulaire : lignée cellulaire HaCat, kératynocytes d'origine humaine, primoculture de kératinocytes humains Modèle tissulaire : • Explants de peau normale provenant de déchet opératoire de chirurgie esthétique • Explants de gencive normale provenant de déchet opératoire de chirurgie implantatoire ou d'épithélium gingival reconstruit à partir de cellules épithéliales orales primaires > Les cellules HaCat sont ensemencées et cultivées en plaque 6 puits à 200 000 cellules/puits sous un volume de 2 ml de milieu de culture DMEM 1640: (Ref : Invitrogen) complémenté par 10 % de sérum de veau foetal (SVF, Ref : CH30160.02 Perbio-Hyclone) pendant 18 h (sur la nuit). 8 - A TO les cellules sont lavées avec du tampon Phosphate (PBS, Ref : 52100-039 Invitrogen) puis privées en sérum pour les rendre quiescentes pendant 24 h (ralentissement de leur croissance et élimination de toute trace de facteurs susceptibles de perturber les effets induits par les traitements ultérieurs). - A T0+24 h les cellules sont traitées par des cytokines pro-inflammatoires (TNF-a à 10 ng/ml, IL1-E3. à 10 ng/ml) ou des éléments bactériens (LPS à 50 ng/ml, SEB à 100 ng/ml) ou des actifs potentiels de type alkyle mono-ou di-ester d'a,6-butylglucoside dilués dans du DMEM (1 ml/puits); La durée du traitement est de 3 h à 37 C. - Les kératinocytes primaires sont préparés à partir de peau normale provenant de déchet opératoire de chirurgie esthétique. Ils sont ensemencés et cultivés en plaque 24 puits à 60 000 cellules/puits sous un volume de 0,5 ml de milieu de culture KSFM (Ref : 37010 Invitrogen) complémenté par de l'EGF (Epidermal Growth Factor) à 1,5 ng/ml et du BPE (bovine pituitary extract) à 25 pg/ml pendant 24 h. - A JO, le milieu est remplacé par 0,5 ml de milieu KSFM complet, additionné de 1,2 nM de calcium. > A J+3, les cellules sont traitées par des cytokines pro-inflammatoires TNF- a et IL1-p à 10 ng/ml ou des actifs potentiels de type alkyle mono- ou di-ester d'a,(3-butylglucoside dilués dans 0,3 ml de milieu KSFM complet, en présence de 1,2 nM de calcium. La durée du traitement est de 3 h à 37 C. - Après plusieurs lavages dans du PBS sans antibiotiques, des punchs de 6 mm de diamètre sont préparés et disposés au fond d'un puits d'une plaque 12 puits. - Un traitement systémique du tissu cutané affleurant non immergé est effectué par des cytokines pro-inflammatoires (TNF-aà 500ng/ml, IL1-p à 100 ng/ml) ou des actifs potentiels de type alkyle mono- ou di-ester d'a,(3-butylglucoside , dilués dans du DMEM (350 pl/puits). Les temps de stimulation sont variables de 1 h, 1 h, 15 h ou 24 h. > Dans le cas de traitement topique, un anneau d'aluminium de 10 mm de diamètre est placé sur l'expiant tissulaire afin de délimiter une surface épithéliale cutanée précise sur laquelle l'application topique sera effectuée. Avant l'application topique du traitement, une rupture de barrière cutanée réversible est effectuée à l'aide d'un solvant, l'acétone pendant 3 min. Les produits dilués dans du DMEM sont ensuite appliqués pour une incubation de 2, 5 ou 16 h, en parallèle d'un témoin de stimulation d'origine bactérienne (SEB à 50 pg/ml). Après incubation, les expiants sont rincés dans le PBS et sont soit congelés rapidement dans de la résine Tissue Tek (SAKURA, Zoeterwoude) dans l'azote liquide (-196 C) en vue de faire des cryocoupes, soit conservés à -80 C pour réaliser des extractions d'ARN totaux. Les expiants gingivaux humains de taille variable et petite sont rincés dix fois dans du PBS sans antibiotiques puis mis en culture sur une grille afin d'éviter leur immersion totale, posés côté derme. L'incubation systémique se fait dans un milieu de survie dans du DMEM seul ou en présence d'a(3-LBG brut à 10 pg/ml, à 37 C et 5 % de CO2. Les inserts d'épithélium gingival reconstruit sont conservés dans du milieu de maintenance (1 ml) dans des boites de culture cellulaire 6 puits pendant 24 h à 37 C et 5 % de CO2 selon les recommandations du fournisseur SkinEthic laboratories (Nice, France). Après 24 h, le tissu est stimulé en topique par 500 pl de milieu de maintenance seul ou additionné d'a(3-LBG brut à 10 pg/ml, à 37 C et 5 % de CO2. Du milieu de maintenance est ajouté en dessous de l'insert (1 ml) pendant la stimulation. Après découpe d'un punch de 3 mm de diamètre et son inclusion dans la résine Tissue Tek , le reste du tissu est conservé à -80 C en vue d'une extraction des ARN totaux. Toutes les manipulations concernant les ARN sont faites avec de l'eau, des tampons et du matériel consommable dépourvus d'ARNases D A partir des cellules : A l'arrêt du traitement, les cellules sont lavées rapidement avec du PBS et reprises dans le tampon de lyse du kit d'extraction Qiagen Rneasye. Io Le protocole d'extraction des ARN totaux est réalisé avec le kit selon les recommandations du fournisseur (Ref : 74106 Qiagen). Les ARN sont repris dans de l'eau sans RNAse (Ref : 0685101 Eppendorf) et conservés à -80 C. >A partir des explants tissulaires : A l'arrêt du traitement, les explants sont lavés rapidement au PBS, égouttés et transférés dans un microtube à centrifuger sans RNAse de 1,5 ml (Eppendorf), lui-même plongé dans l'azote liquide pour congélation et conservation à -80 C. Une première étape consiste à broyer le tissu à froid mécaniquement à l'aide d'un mortier et d'un pilon en Inox (Société Pasquet, Toulouse) pour obtenir une fine poudre. Le broyat est ensuite repris dans le tampon de lyse du kit d'extraction Qiagen Rneasy et l'ARN total est extrait selon les recommandations du fournisseur. Les ARN sont repris dans de l'eau sans RNAse et conservés à -80 C. > Dosage des ARN totaux : Il est effectué à l'aide du kit RNA 6000 Nano LabChip (Ref 5065-4476 Agitent Technologies) sur le Bioanalyser 2100 (Agitent Technologies) selon les indications du fournisseur. L'analyse des données est effectuée à l'aide du logiciel d'analyse Agitent Bioanalyzer 2100 software screen (Agitent Technologies). Ce kit permet de quantifier et de contrôler le degré de pureté des ARN vis-à-vis de l'ADN génomique et des protéines. Chaque échantillon est déposé dans un puits sur une puce (12 par puce). Les ARN totaux sont séparés par électrophorèse et visualisés grâce à un agent intercalant fluorescent. Dans notre cas, la visualisation des ARN 18S et 28S eucaryotes et le rapport ARN 28S/ARN 18S permet d'estimer la non dégradation des ARN. - 1 pg d'ARN totaux est utilisé par échantillon afin d'être transformé en ADN complémentaire (utilisable pour la Réaction de Polymérisation en chaîne ou PCR) selon le protocole de transcription inverse ou RT. Les ARN sont dénaturés 2 min à 95 C puis le mélange de RT contenant l'enzyme de transcription inverse (AMV Reverse Transcriptase), les amorces oligo-dT, les nucléotides et le tampon sont ajoutés. Ces produits 2896691 Il sont issus du kit Access RT-PCR Core Reagents (Ref A3500, Promega). La RT est réalisée à 42 C pendant 60 min puis l'enzyme est dénaturée à 95 C pendant 2 min. Les ADNc obtenus sont conservés à -20 C. > Les analyses de PCR en temps réel sont effectuées à l'aide du 5 thermocycler à fluorescence Icycler iQ (Biorad). Cette technique permet de visualiser cycle après cycle l'accumulation de produit de PCR marqué à la fluorescence. Les ADNc correspondant à 1 pg d'ARN servent de matrice dans un mélange réactionnel de 26 pl contenant le mélange de PCR iQTM SYBR Green SuperMix (Ref : 170-8882, Biorad) et 0,3 pM de chaque 10 amorce. En complément des échantillons, un témoin sans matrice d'ADNc est déposé sur une plaque 96 puits. Pour chaque échantillon, l'amplification des différents gènes d'intérêt, hBD-2, hBD-3 et LL-37 est réalisée en duplicate en plaque 96 puits ainsi que l'amplification parallèle de trois gènes 15 de référence choisis pour leur stabilité durant les différents traitements. Les gènes de référence utilisés sont ceux codant pour YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide), GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), et HPRT (human hypoxantine ribosyl transferase) ou (32-M (Human 02microglobuline) (tableau 1). Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification de ces trois gènes par PCR en temps réel sont décrites par Vandesompele J. et al (2002). Gènes de références Amorces human HPRT Sens 5'-TGA CAC TGG CAA MC MT GCA-3' hypoxantine Antisens 5'- GGT CCT TTT CAC CAG CM GCT -3' ribosyl transferase gly eaaldehyde-3- GAPDH Sens 5'-TGCACCACCAACTGCTTA-3' phosphate Antisens 5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3' dehydrogenase Human P2- p2-M Sens 5'-ACC CCC ACT GAA MA GAT GA-3' microglobuline Antisens 5'-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3' tyrosine-3-mono-oxygenase, tryptophane-5- YWHAZ Sens 5'-ACT TTT GGT ACA TTG TGG CTT CAA-3' mono-oxygenase Antisens 5'-CCG CCA GGA CAA ACC AGT AT-3' activation protein zeta polypeptide Tableau 1 : Séquences des primers utilisés pour l'amplification des gènes de références par PCR en temps réel. La plaque est incubée dans le thermocycler pour les différentes étapes de PCR. Pendant l'amplification, l'émission de fluorescence est enregistrée à la fin de chaque cycle et analysée par le logiciel iCycler (version 3.0 BioRad). L'augmentation de l'émission de fluorescence est proportionnelle à la quantité de produits de PCR accumulée, qui est en fait proportionnelle à la quantité d'ARNm correspondant à la séquence amplifiée. Les résultats sont évalués avec le logiciel iCycler IQ optical system (Version 3.0, BioRad). Pour chaque couple d'amorce, l'efficacité de PCR est vérifiée. Les séquences des amorces pour l'amplification des ARNm de hBD-2, hBD-3 and LL-37 ont été dessinées avec le logiciel Beacon Designer Software (version 2 .1, Biorad). Gènes d'intérêt Amorces human beta- HBD-2 Sens 5'-CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3' défensine 2 Antisens 5'-GGA GCC CTT TCT GAA TCC GCA-3' human beta- HBD-3 Sens 5'-TAG GGA GCT CTG CCT TAC CA-3' défensine 3 Antisens 5'-CAC GCT GAG ACT GGA TGA AA-3' Human cathelicidin LL-37 Sens 5'-CCA AGC AGT CAC CAG AGG ATT G-3' Antisens 5'-GGC CTG GTT GAG GGT CAC T-3' Tableau 2 : Séquences des primers utilisés pour l'amplification des gènes 20 hBD-2, hBD-3 et LL-37 en PCR en temps réel Pour chaque échantillon, le niveau d'expression de chaque gène d'intérêt (hBD-2, hBD-3 et LL-37) est ensuite normalisé par rapport au niveau d'expression des gènes de référence non induits par les différents traitements à l'aide du logiciel Genorm version 3.2c (Vandesompele et al., 2002). Après normalisation, l'induction relative au niveau transcriptionnel (ARNm) des gènes codant pour les E3-défensines hBD-2 et hBD-3 et la cathélicidine LL-37 est donnée par rapport à un témoin absolu non induit (milieu seul). Les échantillons inclus dans la résine Tissue Tek sont coupés à froid (température de la chambre à -25 C et la température du porte-objet à -28 C) à l'aide d'un cryostat (Leica CM 3050s, Nussloch). Les cryocoupes d'une épaisseur de 5 pm sont récupérées sur des lames porte-objet prétraitées, puis mises à sécher environ 2 h à température ambiante et stockées à -20 C pour une utilisation ultérieure. Avant de réaliser l'immunomarquage, les coupes sont fixées à l'acétone à -20 C pendant 10 min, séchées et conservées à -20 C. Lors d'une première étape, les coupes sont hydratées puis incubées avec les anticorps primaires dirigés contre les peptides d'intérêt dilués dans du PBS. Les anticorps primaires utilisés sont les suivants : - Goat Anti-human BD-2 (500-P161G, Peprotech Inc) dilué au 1/50e Rabbit Anti-human defensin-3 (AB3478, Chemicon international) dilué au 1/1000e - Rabbit Anti-human LL37 (G-075-06, Phoenix Pharmaceuticals Inc) dilué au 1/50e Pour révéler le complexe Antigène-Anticorps, le kit DAKO LSAB (DAKO Corporation) est utilisé selon les recommandations du fournisseur. La révélation est réalisée à l'aide d'un substrat de la péroxydase : la 3,3'diaminobenzidine (DAB) (DAKO Corporation). La réaction enzymatique est révélée par une coloration brune. > L'adhésion des micro-organismes est réalisée dans une cellule à double compartimentation, de type cellule de Franz modifiée. - Une suspension de S.aureus (CIP 53.154) équivalente à 0,5.10' microorganismes est introduite au sein du compartiment supérieur de la cellule. Le dispositif est incubé de 2 h à 37 C sous une atmosphère à 5 % de CO2. A la fin de cette période d'incubation, le surnageant est retiré afin d'éliminer les bactéries non adhérentes. Les échantillons de peau sont ensuite rincés deux fois avec 1 ml de mélange DMEM/HAMF12. Un dénombrement bactérien à l'issue de cette étape donne la proportion de bactéries ayant adhéré à l'expiant (T+2 h). Un témoin est réalisé dans le but de déterminer l'adhésion non spécifique des bactéries. > La stimulation de l'expression des 13-défensines cutanées précède l'étape d'adhésion. Son objectif est d'étudier l'impact de l'induction des peptides antimicrobiens par des actifs potentiels de type alkyle mono- ou di-ester d'a,3-butylglucoside sur l'adhésion de souches bactériennes. Le traitement est effectué en topique ou en systémique. Le temps de stimulation des expiants cutanés est de 24 h à 37 C en présence de 5 % de CO2. Pour analyse, les expiants sont retirés de leur cellule, des punchs de diamètres différents (3 mm, 4 mm et 6 mm) sont effectués pour un test MTT de survie, les marquages immuno-histologiques et les analyses des transcrits par RT-PCR. Le reste de peau est utilisé pour une estimation de la flore bactérienne adhérente. Pour la plupart des préparations testées la concentration limite à partir de laquelle une cytotoxicité des préparations d'alkyle mono- ou di-ester d'a,(3-butylglucoside a pu être mise en évidence sur la lignée de kératinocytes HaCat par la méthode du rouge neutre après 24 h d'incubation est de 1,10-2 % soit 100 pg/ml. Aux concentrations efficaces pour l'induction de l'expression des peptideshBD-2 et hBD-3, les alkyles mono- ou di-esters d'a,6-butylglucoside n'entraînent pas une augmentation de la libération de métabolites pro-inflammatoires dérivés de l'acide arachidonique, par les cellules épithéliales cutanées (lignée kératinocytaire HaCat). Ces préparations ne sont donc pas considérées comme pro-inflammatoires. L'induction de l'expression du gène hBD-2 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par la lignée de kératinocytes humains HaCat, normalisée par rapport à l'expression constitutive de trois gènes de référence stables (HPRT, GAPDH, YWHAZ) dans les conditions de traitement testées, citées dans le tableau 3. La méthode de RT-PCR quantitative utilisée est décrite dans le matériel et méthode. Le niveau d'induction est calculé par rapport au témoin non stimulé traité dans les mêmes conditions si ce n'est l'agent stimulant. Traitements Facteur d'induction (FI) Témoin non stimulé 1 TNFa 10 ng/ml 2,5 Produits de a(3-butylglucoside 1 û 1 û 0,6 départ 10 û 1 û 0,1 pg/ml Acide Laurique 1,1 10 pg/ml a(3-LBG brut 1,7 10 pg/ml Tableau 3 : Activité des a(3-LBG sur l'induction de l'expression du gène codant pour hBD-2 chez les cellules HaCat après 3 h de traitement : quantification des ARNm spécifiques par PCR en temps réel et détermination d'un niveau d'induction normalisé, par rapport au témoin cellulaire non stimulé. L'ester de laurate, a8-LBG brut à 10 pg/ml pur à 48,6 % dont 90 % de la forme a-LBG et 10 % de forme R-LBG est actif sur l'induction de la synthèse du peptide hBD-2 au niveau transcriptionnel avec un facteur d'induction (FI) de 1,7 par rapport au témoin non stimulé, en comparaison d'un facteur 2,5 pour le TNF-a. Il a été vérifié parallèlement que les produits de départ ap-butylglucoside et acide laurique utilisés lors de la synthèse enzymatique de cet agent ne provoquent pas une induction de la synthèse du peptide hBD-2, puisque 5,6 % Ac. laurique résiduels sont encore retrouvés dans cette préparation. L'induction de l'expression du gène hBD-2, a été quantifiée par RT-PCR quantitative au niveau des ARNm spécifiques transcrits par des lignées primaires de kératinocytes humains issus de deux donneurs différents. Les résultats sont normalisés par rapport à l'expression constitutive de trois gènes de référence stables (HPRT, GAPDH, YWHAZ) dans les conditions de traitement testées. Le niveau d'induction est calculé par rapport au témoin non stimulé traité dans les mêmes conditions si ce n'est l'agent stimulant. A la concentration de 0,1 pg/ml, l'ester de laurate de butylglucoside pur à 90 %, constitué uniquement de l'isoforme (3 présente une meilleure activité d'induction de l'expression du gène hBD-2 (FI à 2,3) que l'ester de laurate a(3-LBG pur à 90 % constitué de 5 % de l'isoforme a et 44 % de l'isoforme (3 (FI à 1,4) et l'ester de laurate pur à 90 %, constitué uniquement de l'isoforme a (FI à 1,2) La figure 1 annexée illustre l'activité des différentes isoformes de LBG sur l'induction de l'expression du gène hBD-2 chez les kératinocytes primaires humains après 3 h de traitement : quantification des ARNm spécifiques par PCR quantitative en temps réel et détermination d'un niveau d'induction normalisé, par rapport au témoin cellulaire non stimulé (témoin NS). Les cellules primaires NHK apparaissent plus sensibles à la stimulation par les a(3-LBG. Dès 0,1 pg/ml une induction du gène hBD-2 apparaît significative alors que 10 pg/ml sont nécessaires pour obtenir une réponse de la lignée HaCat Le potentiel inducteur de l'ester de laurate, a(3-LBG brut a été analysé sur expiant cutané par addition du traitement dans le milieu de culture, voie systémique , ou après application topique de l'agent, voie topique . Traitement par voie systémique > L'induction de l'expression du gène hBD-2 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par les cellules épithéliales cutanées au sein d'expiants de peau incubés de manière systémique en présence de TNFa à 100 ng/ml, d'ap-LBG brut à 3 et 30 pg/ml. Les variations d'expression du gène hBD-2 ont été normalisées par rapport à l'expression constitutive de trois gènes de référence stables ((3-2M, GAPDH, YWHAZ). Le niveau d'induction est calculé par rapport au témoin tissulaire non stimulé traité dans les mêmes conditions si ce n'est l'agent stimulant. La figure 2 annexée illustre la cinétique d'induction de l'expression du gène hBD-2 au sein d'un expiant cutané par l'a,(3-LBG brut à différentes concentrations, par voie systémique : quantification de la synthèse des transcrits hBD-2 par RT-PCR en temps réel. Comme pour le modèle cellulaire, nous montrons que cet agent sous forme brute à 30pg/ml est capable d'induire la synthèse des transcrits hBD-2 au niveau de l'épithélium cutané après une incubation avec la peau par voie systémique. De plus l'étude cinétique montre que cette induction est rapidement effective, dès 1 h d'incubation. Le pic d'induction du TNFa est un peu plus précoce à 1 h de stimulation. > L'induction de l'expression des gènes HBD-3 et LL-37 au niveau d'un expiant cutané après traitement par voie systémique pendant 2 ou 24 h par l'ap-LBG brut à 30 pg/ml a été quantifiée au niveau des transcrits des deux peptides. La figure 3 annexée illustre la cinétique d'induction de l'expression des gènes codant pour hBD-3 et LL-37 au sein d'un expiant cutané, par l'a,(3-LBG brut à différentes concentrations par voie systémique : quantification de la synthèse des transcrits par RT-PCR quantitative. Ces résultats montrent que l'af -LBG brut à 30 pg/mI induit la synthèse des transcrits hBD-3 sur un temps court à 2 h avec une forte diminution de l'induction à 24 h (FI chutant de 17 à 3) selon une cinétique proche de celle de hBD-2. En ce qui concerne le peptide LL-37 son induction par l'a(3-LBG brut à 30 pg/mI est effective dès 2 h de traitement avec un FI de 6 qui reste stable jusqu'à 24 h. > L'analyse qualitative de l'expression peptidique par immunohistochimie à partir des expiants stimulés par voie systémique a permis de confirmer la stimulation de la production des peptides hBD-2 et hBD-3 dans les couches supérieures de l'épiderme après stimulation par l'a(3-LBG brut pendant 24h. La figure 4 annexée correspond aux photos immunohistologiques. - L'induction de l'expression du gène hBD-2 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par les cellules épithéliales cutanées au sein d'expiants de peau après incubation topique d'a(3-LBG brut à 30 et 300 mg/ml en comparaison du témoin de stimulation, la toxine bactérienne SEB à 50 pg/mI. La figure 5 annexée illustre l'induction de l'expression du gène hBD-2 au sein d'un expiant cutané par l'œ,13-LBG brut à différentes concentrations par voie topique pendant 5 h : quantification de la synthèse des transcrits hBD-2 par RT-PCR quantitative. Ces résultats montrent que l'a(3-LBG sous sa forme brute est capable d'induire par voie topique la synthèse des transcrits hBD-2 au niveau de l'épithélium cutané dès la concentration de 30 pg/mI, FI de 5,2 et dans une moindre mesure à une concentration de 300 pg/ml, FI de 1,7. Pour comparaison, le SEB présente une activité du même ordre que celle de I'a,-- LBG (300 pg/ml) avec un FI de 1,9. De plus cette induction est effective dès 5 h d'incubation. > L'analyse qualitative de l'expression peptidique par immunohistochimie à partir des expiants stimulés par voie topique a permis de confirmer qualitativement la stimulation de la production des peptides hBD-2 et hBD-3 dans les couches supérieures de l'épiderme après stimulation par l'a(3-LBG. La figure 6 annexée correspond aux photos immuno-histologiques. Le potentiel inducteur des isoformes de l'ester de laurate de butylglucoside pur à 90 %, séparées, a seul ou f3 seul, ou en mélange a,(3-LBG (56 % a/44 % (3) a été comparé sur expiant cutané par voie systémique ou topique. - L'induction de l'expression du gène hBD-2 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par les cellules épithéliales cutanées au sein d'expiants de peau incubés de manière systémique en présence de TNFa à 500 ng/ml, d'IL1-(3 à 100 ng/ml, d'a43-LBG pur, d'a-LBG ou de R-LBG pur à 3 pg/ml pour une durée de traitement de 2 h ou de 15 h. La figure 7 annexée illustre la cinétique d'induction par voie systémique pendant 2 et 15 h de l'expression du gène hBD-2 au sein d'un expiant cutané par l'a,(3-LBG pur à 3 pg/ml : Comparaison des formes a(3 (ab), a (a) et p (b) LBG ; quantification de la synthèse des transcrits hBD-2. A une concentration donnée identique, 3 pg/ml, les isoformes en mélange ap-LBG pur à 3 pg/ml présentent un potentiel inducteur significatif surtout après une durée de traitement longue. Après séparation, l'isoforme f3-LBG pure à 3 pg/mI, isolée à plus de 95 % vis-à-vis de l'isoforme a-LBG est plus active que le mélange dès 2 h de traitement (FI de 5,7 contre 1,1). A l'inverse, l'isoforme a-LBG pure ne présente pas d'activité à cette même concentration sur l'induction de l'expression du gène hBD-2 dans les cellules épithéliales cutanées même après un traitement long de 15 h. 20 Dans nos conditions expérimentales, ces résultats montrent que l'isoforme 13-LBG serait à l'origine de l'activité pharmacologique inductrice de l'expression du gène hBD-2. Par voie topique - L'induction de l'expression du gène hBD-2 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par les cellules épithéliales cutanées au sein d'expiants de peau incubés de manière topique en présence d'a/3-LBG pur, d'a-LBG ou de R-LBG pur à 3 ou 30 pg/ml pour une durée de traitement de 18 h. La figure 8 annexée illustre l'induction de l'expression du gène hBD-2 au sein d'un expiant cutané par voie topique après 18 h de traitement par l'a,(3-LBG pur à 3 ou 30 dag/ml : Comparaison des formes ap, a et (3-LBG ; quantification de la synthèse des transcrits hBD-2 par RT-PCR en temps réel. Après 18 h de traitement topique par deux concentrations données identiques, 30 et 3 pg/ml, le mélange a(3-LBG ainsi que les isoformes a, et R-LBG purs isolés induisent une expression du gène de hBD-2 de même ordre au niveau de la transcription (FI entre 1,96 et 2,96). Lorsque la concentration est abaissée à 3 pg/ml, l'isoforme 33-LBG pur (FI de 13,7), est nettement plus active que le mélange a(3-LBG pur et que l'isoforme a-LBG pure Dans nos conditions expérimentales, ces résultats confirment par voie topique ceux obtenus par voie systémique. L'isoforme R-LBG serait à l'origine de l'activité pharmacologique inductrice de l'expression du gène hBD-2. Le dénombrement de la flore bactérienne adhérente exogène par unité de surface de peau a été effectué selon deux méthodes : - par dénombrement bactérien sur milieu solide par comptage de la radioactivité émise (la souche contaminante étant marquée au H3) est effectuée. La comparaison des résultats a permis de montrer qu'il n'existait pas de différence significative entre les deux méthodes. L'analyse par dénombrement a donc été conservée pour le test d'adhésion de S. aureus sur tissu cutané. Après une application topique de 5 h et plusieurs rinçages de la surface épidermique d'un expiant cutané, l'effet du traitement par l'a,8-LBG brut sur l'adhésion de S.aureus sur ce même expiant a été quantifié par le dénombrement des germes adhérents à l'issue d'une mise en contact de 2 h. La figure 9 annexée représente l'activité de l'a,R-LBG brut appliqué en topique à une dose de 30 pg/ml sur un expiant cutané sur l'adhésion de S. aureus (A) corrélé à l'induction de l'expression du gène hBD-2 (B) au niveau de cet expiant en comparaison avec le tissu du même donneur non stimulé (quantification des ARNms spécifiques par PRC en temps réel). Les résultats montrent un effet régulateur significatif du traitement par I'a,(3-LBG brut sur le nombre de germes pathogènes adhérents par rapport au témoin non traité, avec une diminution de ce nombre équivalent à une baisse de 20 % de l'adhésion de S. aureus (figure 9A). Parallèlement, l'induction de l'expression du gène hBD-2 a été vérifiée après 5 h de traitement par l'a,(3-LBG brut. La persistance de cette état d'induction a été démontrée après l'étape d'adhésion (2 h) de S. aureus avec un FI de 3,8 par rapport au témoin non traité mais en tout point identique en ce qui concerne les autres étapes telles que l'adhésion (figure 9B). Sans avoir directement été démontré il serait envisageable que l'induction des bêta-défensines puisse être corrélée à l'effet de l'a,p-LBG brut sur la fonctionnalité du tissu épithélial cutané et en particulier sur la ré-équilibration de la flore cutanée. Une inhibition spécifique de cette induction après traitement pourrait permettre de vérifier cette hypothèse. Bien qu'il ait été vérifié qu'aux concentrations utilisées l'a,(3-LBG brut ne présentait ni activité microbicide directe ni effet sur l'adhésion de S. aureus, des expérimentations ont été menées afin de vérifier la nature indirecte de l'action de l'a,(3-LBG sur l'interaction entre S. aureus et épithélium cutané. Pour cela, le compartiment de traitement du tissu par l'a,(3-LBG et le compartiment d'interaction entre l'épithélium cutané et le germe pathogène ont été séparés, le premier ayant lieu côté profond de l'épiderme (voie systémique) et le second à la surface épidermique (voie topique). La figure 10 annexée illustre l'activité indirecte de l'a,13-LBG brut appliqué en systémique à une dose de 30 tag/ml sur un expiant cutané, sur l'adhésion de S. aureus ou en comparaison avec le tissu du même donneur non stimulé ou traité par le TNFa (quantification des ARNm spécifiques par PRC en temps réel. Les résultats de dénombrement montrent que sans contact direct avec la surface sur laquelle a lieu le contact ultérieur des micro-organismes, l'a,p-LBG est capable de réguler l'adhésion des germes sur l'expiant (diminution de 11 % par rapport au témoin non stimulé), via la régulation à distance de l'expression de molécules antimicrobiennes épithéliales. Parmi les candidats moléculaires potentiels, les bêta-défensines stimulées par l'a,(3-LBG ou le TNF-a pourraient représenter ce lien. Ainsi, la cytokine pro-inflammatoire, le TNF-a, entraîne une forte chute de l'adhésion de S. aureus corrélée à une forte induction des bêtadéfensines épithéliales. Après application topique et plusieurs rinçages de la surface épidermique des explants cutanés, l'effet du traitement par les isoformes de l'ester de laurate de butylglucoside pur à 90 %, séparées, a seul, l3 seul, ou en mélange a,(3-LBG (56 % a/44 % (3) sur l'adhésion de S. aureus sur l'épiderme a été comparé après quantification des germes adhérents par dénombrement. La figure 11 annexée illustre l'activité des différentes isoformes de LBG pur à 90 % appliquées en topique à une dose de 30 pg/ml sur un expiant cutané sur la régulation de l'adhésion de S. aureus : comparaison des formes a et R-LBG et du mélange a/p. Les résultats montrent un effet régulateur du traitement par les différentes préparations pures de LBG sur le nombre de germes pathogènes adhérents par rapport au témoin non traité, avec une diminution de ce nombre équivalente à une baisse moyenne de l'ordre de 19 % de l'adhésion de S. aureus pour le mélange a(3-LBG pur. Pour comparaison, l'isoforme 3-LBG pur est en moyenne plus actif sur la limitation de l'adhésion de S. aureus que l'isoforme a-LBG. Il est par ailleurs possible d'observer la colonisation de l'expiant par le germe exogène (S. aureus) après l'étape d'adhésion pendant 24 h. II est intéressant de noter que l'effet d'un traitement systémique par l'a,(3-LBG brut ralentit la multiplication du germe pathogène et favorise à l'inverse le développement d'un germe commensal endogène Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) (présent sur l'expiant au départ). L'effet inverse est observé avec le traitement par le TNF-a, cytokine pro-inflammatoire, qui après avoir entraîné une forte chute de l'adhésion de S. aureus (Cf.11l.4.2) ne permet pas une limitation de la croissance du germe pathogène sur l'expiant et ceci au dépend du germe commensal S. epidermidis. La figure 12 annexée illustre la comparaison de la colonisation d'une souche contaminante, S. aureus, avec celle d'une souche commensale, S. epidermis. Ces deux traitements semblent donc perturber l'écosystème originel. Cependant, le déséquilibre induit par ces stimulations est en faveur de la souche commensale dans le cas de l'a,(3-LBG. L'ester de laurate, ap-LBG brut à 30 pg/ml pur à 48,6 % dont 90 % de la forme a-LBG et 10 % de forme p-LBG a été testé sur expiant gingival par voie systémique uniquement, l'orientation du tissu étant difficilement réalisable contrairement aux explants cutanés après un traitement de 5 h. - L'analyse qualitative de l'expression peptidique à partir des explants stimulés par voie systémique a été réalisée par immuno-histochimie avec un anticorps dirigé contre le peptide hBD-3. La figure 13 annexée illustre l'activité de l'a(3-LBG pur sur l'induction de l'expression du peptide hBD-3 au niveau de l'épithélium gingival d'un donneur sain après 5 h de traitement en systémique. Localisation du marquage spécifique hBD-3 au sein de l'épithélium traité par l'actif en systémique pendant 5 h (B) et comparaison avec le tissu du même donneur non stimulé (A). Après révélation, la comparaison des marquages a permis de démontrer l'induction de la production du peptide hBD-3 dans les couches supérieures de l'épithélium gingival après traitement du tissu par l'a(3-LBG. II est à noter, que pour l'épithélium gingival, l'expression des peptides antimicrobiens épithéliaux varie fortement selon le donneur non seulement du fait de la richesse de la flore présente au sein de l'écosystème buccal mais aussi du fait de l'état physiologique de l'épithélium (inflammation gingivale, pathologie parodontale...). L'utilisation d'un modèle tissulaire épithélial reconstruit à partir de cellules épithéliales gingivales primaires issues d'un même donneur, présente un intérêt majeur dans l'évaluation de principes actifs. L'ester de laurate, a(3-LBG brut à 30 pg/ml pur à 48,6 % dont 90 % de la forme a-LBG et 10 % de forme R-LBG a été testé sur épithélium gingival reconstruite (SkinEthic Laboratories) après un traitement de 18 h par voie topique ou systémique. > L'induction de l'expression du gène hBD-3 a été quantifiée au niveau des ARNm spécifiques transcrits par les cellules épithéliales gingivales au sein de l'épithélium reconstruit. La figure 14 annexée illustre la cinétique d'activité de l'a(3-LBG pur sur l'induction de l'expression du gène codant pour hBD-3 au niveau d'un épithélium gingival reconstruit (SkinEthic Laboratories) : quantification des ARNm spécifiques par PCR en temps réel. La quantification des transcrits hBD-3 démontre la capacité de l'a(3-LBG sous sa forme brute à induire la synthèse des transcrits hBD-3 au 5 niveau de l'épithélium cutané par voie topique à la concentration de 30 pg/ml par rapport à un témoin non traité (Nst) : à partir de 2 h de traitement (FI de 2) et jusqu'à 19 h d'incubation (FI de 17,6). > L'analyse qualitative de l'expression peptidique par immunohistochimie à partir d'épithélium gingival reconstruit traité par l'a(3-LBG brut 10 en comparaison d'un échantillon non traité, a permis de confirmer la production du peptide hBD-3 par les cellules de différentes strates de l'épithélium gingival reconstruit et en particulier localiser son accumulation dans les couches les plus superficielles. La figure 15 annexée illustre l'activité des a(3-LBG purs sur 15 l'induction de l'expression du peptide hBD-3 au niveau d'un épithélium gingival reconstruit (SkinEthic laboratories) : localisation du marquage spécifique de l'épithélium traité par l'actif en systémique pendant 1 h (B) et comparaison avec le tissu du même donneur non stimulé (A). Cependant, l'apparition de ce marquage étant très rapide il est 20 probable que le peptide ne soit pas issu d'une néo-synthèse du peptide. En conclusion, l'ensemble des résultats démontrent l'activité pharmacologique des alkyles mono- ou di-esters d'a,(3-butylglucoside sur l'induction de l'expression des gènes hBD-2, hBD-3 et LL-37 sur des modèles cellulaires, et tissulaires par voie topique ou systémique aussi bien 25 au niveau de l'épithélium cutané que gingival. Par ailleurs les données de fonctionnalité ex vivo sur l'adhésion d'un germe pathogène exogène permettent de mettre en évidence une activité régulatrice de ces molécules sur la flore cutanée et en particulier sur la ré-équilibration de cet écosystème vers une flore commensale. 30 Le lien direct entre stimulation de l'expression des peptides antimicrobiens et régulation de la flore reste à établir mais il est tout à fait envisageable du fait de la corrélation entre régulation de la flore induction de l'expression des gènes de ces peptides au niveau épithélial en présence d'a,(3-LBG. Enfin, l'analyse de l'activité des différentes isoformes a permis de mettre en évidence la supériorité de l'isoforme 13-LBG vis-à-vis de l'isoforme aLBG aussi bien d'un point de vue pharmacologique in vitro que d'un point de vue fonctionnalité ex vivo. On indiquera ci-après un certain nombre d'exemples de compositions selon l'invention. En fonction de leur pureté, deux types d'APG 10 sont utilisés. Les premiers sont à 70 % de laurate de butylglucoside et comme ils sont très visqueux ils sont dilués au demi avec de l'octyl palmitate. L'ensemble constitue un noyau à 35 % environ de LBG. Les seconds produits, plus purifiés, sont à 85 % voire au-delà et 15 sont utilisés tels quels. EXEMPLE 1 Pâte dentifrice : Octyl palmitate /LBG 1 à 5% ou LBG 0,5 à 2,5 % Phosphate dicalcique 60% 20 Glycérine 15% Gomme adragante / Xanthane 1% Parfum 1% Eau QSP100 Agent moussant type sodium laurylsulfate 1 25 EXEMPLE 2 Gel antimicrobien : Octyl palmitate /LBG 1 à 5% ou LBG 0.5 à 2,5 % Natrosol HHX 250 1,5% Chlorhexidine digluconate 0, 2% 30 alcool 15 % à 20 % vol Eau déminéralisée gsp100 EXEMPLE 3 Cold cream : LBG noyau 1 à 5% Cires végétales 30% Huile d'amande douce 50% Borate de sodium 0,5 % Phénoxyéthanol 0,8% Eau gsp100 10 EXEMPLE 4 Dépilatoire : LBG noyau 5% Gélatine 2% 15 Thioglycoltate de calcium qs pH 11,5 - 12 Eau gsp100 EXEMPLE 5 Lait antiseptique : 20 LBG 2à5% Huile minérale 10% Huile de coprah 15% Ester sorbitane 20% 25 Conservateurs 1% Eau gsp100 Polymère acrylique pour stabiliser ... qsp pH 7 30 EXEMPLE 6 Crème pour les mains : LBG noyau Huile de vaseline huile de silicone glycérine stéarate de triéthanolamine BHT Parahydroxybenzoate de méthyle 10 Parfum Eau déminéralisée EXEMPLE 7 15 Savon liquide : LBG noyau 5% Huile de palme 80% Sodium hydroxyde 12% Glycérine 10% 20 Parfum 0.5% Conservateur 1% 2 à 5% qsp 100 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Brevet WO 93/04185 Chung WO., Hansen SR., Rao D., Dale BA. Protease-Activated Receptor signaling increases epithelial antimicrobial peptide expression. J.Immunol. 2004, 173: 5165-5170. Chung WO., Dale BA. Innate immune response of oral and foreskin keratinocytes: utilization of different pathways by various bacterial species. Infect. Immun. 2004, 72: 352-358. Frohm M., Agerberth B., Ahangari G., Stahle-Bâckdahl M., Lidén S., Wigzell H., Gudmundsson GH. The expression of the gene encoding for antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders. J. Biot. Chem. 1997, 272: 15258-15263. Ganz T. Defensins and host defense, Science, 1999, 286, 420-421. Gordon S. Pattern Recognition Receptors: Doubling up for the innate immune response. Cet/ 2000. 2002, 111: 927-930. Kao CY., Chen Y., Thai P., Wachi S., Huang F., Kim C., Harper RW., Wu R. IL-17 markedly up-regulates f3-Defensin-2 expression in human airway epithelium via JAK and NF-^B signaling pathways. J.Immunol. 2004, 173: 3482-3491. Koczulla R., von Degenfeld G., Kupatt C., Krôtz F., Zahler S., Gloe T., Issbrücker K., Unterberger P., Zaiou M., ..Bals R. An angiogenic rote for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP18. J. Clin. Invest. 2003, 111: 1665-1672. Koczulla A.R. et Bals R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential, Drugs, 2003, 63, 389-406. Krisanaprakornkit S., Kimball JR., Dale BA. Regulation of Human Defensin-2 in gingival epithelial cens: the involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase pathways, but not the NF-KB transcription factor family. J. lmmunol. 2002, 168: 316-324. Liu A.Y., Destoumieux D., Wong A.V., Park C.H., Valore E.V., Liu L. et Ganz T. Human beta-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria, and the state of differentiation, J. Invest Dermatol., 2002, 118, 275-281. Ong Y.P., Ohtake T., Brandt C., Strickland I., Boguniewicz M., Ganz T., Gallo R.L., and Leung D.Y.M., Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. N Eng J Med, 347, No. 15. 2002. Presland RB., Dale BA. Epithelial structural proteins of skin and oral cavity : function in health and disease. Crit. Rev. Oral Biot. Med. 2000, 11: 383-408. Scott M. G., Davidson D. J., Gold M. R., Bowdish D., Hancock R. E. W., The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses. The Journal of lmmunology, 2002, 169: 3883-3891. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A. et Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internai control genes, Genome Biol., 2002, 3, RESEARCH I-0034. Yang D., Biragyn A., Hoover D.M., Lubkowski J., Oppenheim J.J. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense, Annu. Rev. Immunol., 2004, 22, 181-215. Zaiou M., Nizet V., Gallo RL. Antimicrobial and protease inhibitory functions of human Cathelicidin (hCAP18/LL-37). J Invest. Dermatol. 2003, 120: 810-816. Zanetti M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity, Journal of Leukocyte Biology, 2004, 75. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'esters d'alkylglucoside pour la fabrication d'une composition topique dermatologique ou dermocosmétologique destinée au traitement préventif ou curatif d'affections microbiennes par induction de l'expression de peptides antimicrobiens endogènes. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition topique provoque un rééquilibrage de la flore commensale de la peau et des muqueuses et/ou une diminution de l'adhésion des microorganismes pathogènes sur le tissu épithélial. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les peptides antimicrobiens endogènes appartiennent à la famille des pdéfensines et des cathélicidines. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisée en ce que les peptides antimicrobiens endogènes de la famille des p-défensines sont alors HBD-2 et HBD-3. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le peptide antimicrobien endogène de la famille des cathélicidines est le LL-37. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition topique est destinée à favoriser l'homéostasie épithéliale pour le traitement de la dermatite atopique. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition est destinée à favoriser l'homéostasie épithéliale pour le traitement d'affections ophtalmiques. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la composition est destinée à favoriser l'homéostasie épithéliale pour le traitement d'affections gingivales. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition est destinée à favoriser l'homéostasie épithéliale dans le traitement d'affections vaginales. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'ester d'alkylglucoside est un C8-C20-alkyle mono- ou di-ester de C1-C6-alkylglucoside. 11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'ester d'alkylglucoside est un C8-C20-alkyle mono- ou di-ester de butylglucoside. 12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'ester d'alkylglucoside est un mono- ou di-caprylate, -caprate, -laurate, - palmitate, -myristate, -stéarate, -cocoate d'a-butylglucoside. 13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que l'ester d'alkylglucoside est le laurate d'a-butylglucoside, de préférence dilué dans le palmitate d'octyle.