Brevet FR2897942A1 — publié le 20070831

La présente invention concerne une méthode d'analyse de sang, permettant d'identifier de façon sélective les aliments potentiellement dangereux chez des sujets susceptibles de développer des réactions à certains aliments. Ces réactions à des aliments peuvent provoquer notamment de l'obésité, et plus 5 généralement un sentiment de mal être chez ces sujets. La méthode selon l'invention est particulièrement bien adaptée lorsque ces aliments dangereux ne peuvent pas être facilement identifiés ; cette méthode, en effet, ne convient pas aux sujets par ailleurs sains, mais présentant des réactions anaphylactiques graves à chaque fois qu'ils ingèrent un aliment déterminé, ni aux enfants présentant une sensibilité 10 potentielle à des aliments, que l'on nourrit avec un substitut de lait de vache à l'exclusion de tout autre aliment, ce qui est à la fois approprié et constitue une approche diagnostique financièrement valable. Il est largement connu que la nourriture est digérée et réduite en fragments avant d'être absorbée afin d'être utilisée pour produire de l'énergie ; le corps humain ne 15 reconnaît pas la nourriture sous une forme plus complexe et la considère alors comme un corps étranger contre lequel il lance une réponse immunitaire afin de le combattre. Le processus physiologique de digestion transforme la nourriture en une forme utilisable par les cellules en premier lieu en glucose et en acides gras libres. Le glucose est libéré des glucides alimentaires tels que l'amidon ou le saccharose par hydrolyse à 20 l'intérieur de l'intestin grêle, puis absorbé dans le sang où les cellules peuvent métaboliser le glucose en une forme énergétique. Toutefois, des sujets peuvent réagir à certains aliments en présentant une réponse immunitaire. Si tel est le cas, le glucose ne peut pas être métabolisé mais est transformé en glycogène. Les graisses resteront sous forme de graisses ou bien seront oxydées sous forme 25 d'acides acétylés. De telles réponses immunitaires à certains aliments induisent un état d'inflammation chronique et tournent autour de petites particules alimentaires non digérées. Les agrégats macromoléculaires (petites particules alimentaires), qui ont déjà subi une digestion partielle, atteignent l'intestin grêle où ils feront essentiellement l'objet d'une 30 poursuite de la digestion en des particules plus petites grâce aux enzymes pancréatiques et à la bile. Ces molécules de plus faibles dimensions (comprenant de l'eau, des électrolytes, du glucose, des acides aminés et des acides gras) sont alors absorbées dans le corps grâce à trois mécanismes : au travers de la muqueuse intestinale où elles sont emportées par la circulation sanguine grâce à de petits vaisseaux sanguins, à travers la membrane -2-plasmatique des cellules épithéliales de l'intestin également dénommées entérocytes (processus communément appelé la route transcellulaire ) et finalement au travers d'étroites jonctions entre les entérocytes (processus généralement appelé la route paracellulaire ). Cependant, de faibles quantités d'agrégats macromoléculaires vont inévitablement échapper à une digestion totale. Lorsque ce phénomène se produit, ces agrégats vont devenir antigéniques et donc engendrer une réponse immunitaire. Cette réponse immunitaire démarre dans l'intestin mais se propage rapidement lorsque ces agrégats se retrouvent dans la circulation sanguine. De façon à mieux comprendre le but de l'invention, il est essentiel de préciser comment interagissent les processus chimiques des cellules du corps humain. La cellule est l'endroit du corps où des centaines de milliers de réactions se produisent. Les deux processus présentant un intérêt particulier en matière de poids et d'énergie sont le processus immunitaire et le processus métabolique. Ces deux processus sont régulés par un récepteur à la surface de la cellule qui peut activer les récepteurs de type insuline. Le récepteur immunitaire (intégrine) va déclencher une réaction immunitaire et le récepteur métabolique (tyrosine kinase) va déclencher une production accrue d'énergie. Afin de mieux comprendre comment ces processus métabolique et immunitaire interagissent, il convient de voir la cellule comme disposant d'une porte qui permet à l'aliment de rentrer puis de produire de l'énergie grâce au processus métabolique. Si la porte de la cellule est ouverte, l'aliment pourra pénétrer dans la cellule et sera utilisé pour produire efficacement de l'énergie. Toutefois, si cette porte est fermée, l'aliment est bloqué en dehors de la cellule et ne peut pas être converti en énergie : il sera en revanche stocké sous forme de graisses ; la tyrosine kinase est responsable de cette ouverture de la porte mais aussi de l'activation/stimulation du métabolisme intracellulaire glycogène/lipide pour la croissance cellulaire. Ces deux processus immunitaire et métabolique, sont régulés par un agent chimique l'IgF1 libre ( insulin-like growth factor 1 ). Les niveaux d'IgF1 dans le corps sont limités et sont produits par le foie pour plus de 80%. L'IgF1 est capable de se lier à la fois à l'intégrine (système immunitaire) et à la tyrosine kinase (métabolisme). Bien évidemment, si davantage d'IgFl est nécessaire ou utilisé par l'un de ces récepteurs, il y en aura d'autant moins pour l'autre. Plusieurs conditions sont nécessaires pour que la porte de la cellule soit ouverte, en particulier un approvisionnement équilibré en aliments disponibles ainsi que de l'IgFl -3 libre, susceptible de se lier à la tyrosine kinase (métabolisme). Il est important de savoir ce qui arrive lorsque l'organisme réagit aux aliments qui sont absorbés. Lorsque le corps humain présente une réponse immunitaire à un aliment déterminé, plusieurs phénomènes se produisent. Une fois repéré l'aliment étranger, des signaux sont envoyés aux cellules qui lancent la réponse immunitaire, mettant alors en oeuvre une grande quantité de l'IgF1 libre qui va se lier à l'intégrine (activateur du système immunitaire) afin d'ordonner aux cellules de combattre l'intrus. Cette opération laissera moins d' IgF1 libre capable de se lier à la tyrosine kinase (métabolisme), la clé qui ouvre la porte de la cellule et active, ainsi que cela a déjà été expliqué, le métabolisme glycogène/lipide et la croissance cellulaire. Par suite, les aliments auront moins de facilité pour pénétrer dans les cellules, mais auront tendance à rester à l'extérieur sous forme de graisse. Une autre conséquence de ce qui précède est que les muscles du corps disposeront de moins d'énergie et adresseront un signal au cerveau lui disant qu'il faut manger davantage afin d'obtenir plus d'énergie. Toutefois, manger davantage ne réglera pas le problème car le sujet pourra alors absorber des aliments qui provoqueront une réaction au niveau de son corps. Si c'est le cas, peu importe la quantité d'aliments absorbée, l'énergie ne sera pas fournie aux muscles et la fatigue et la faim persisteront. Ces principes généraux ayant été rappelés, il existe de nombreux sujets susceptibles de développer des réactions à la nourriture pour lesquels existe la possibilité de réaction à au moins un aliment et pour lesquels la possibilité de mécanismes pathogènes autres que seulement l'IgE existe également. Certains de ces aliments suspects peuvent être identifiés par une étude historique fine, le recours aux régimes et questionnaires, ou même l'usage de tests cutanés ; toutefois ces approches n'ont qu'une valeur limitée.. Un objet de la présente invention est donc de présenter une méthode applicable à un panel d'aliments déterminés, susceptible d'identifier les aliments qui peuvent déclencher des réactions pathogènes, identifiant également les aliments qui n'aboutissent pas à de telles réactions (on sera alors en présence de résultats négatifs). La méthode selon la présente invention aboutira ainsi à une sélection d'aliments susceptibles d'être inclus ou exclus d'un programme alimentaire de la façon suivante : 1. aliments qui peuvent être absorbés ; 2. aliments qui ne peuvent pas être absorbés pendant un certain nombre de semaines, voire même au-delà d'un an. -4- Afin que la présente invention soit parfaitement comprise, la description de la méthode selon l'invention va maintenant être présentée. On prélèvera de façon habituelle 20 ml de sang au sujet ; le sang sera ensuite anticoagulé grâce à du K2EDTA ou K3EDTA dans la mesure où l'échantillon sanguin parviendra au laboratoire de tests dans les 8 heures suivant son prélèvement. Si ce délai n'est pas respecté, le sang sera anti-coagulé avec du citrate ou préférentiellement avec un mélange citrate/EDTA ou SACD ou autre substance équivalente. Les échantillons seront ensuite stockés à une température constante préférentiellement de l'ordre de 4 C. La méthode selon l'invention sera rendue encore plus précise si un criblage préliminaire est effectué sur l'échantillon sanguin complet avant que le test de la méthode selon l'invention soit réalisé. Un tel criblage s'intéressera à l'un au moins des six paramètres suivants et préférentiellement à l'ensemble de ces paramètres : 1. Si le taux de leucocytes en vie est inférieur à 0,75 (moins de 75% de leucocytes sont vivants) le test ne sera pas réalisé et un nouvel échantillon sera demandé au sujet. 2. Si des hématies nucléées sont présentes dans l'échantillon sanguin complet du sujet, cet échantillon sera analysé une deuxième fois ; si, lors de cette deuxième analyse, des hématies nucléées sont encore présentes, il conviendra de déterminer si l'échantillon contient réellement des hématies nucléées, ou bien si le repérage d'hématies nucléées est dû au vieillissement de l'échantillon (lymphocytes non viables) : a. en cas d'hématies nucléées réellement présentes, l'échantillon sanguin complet pourra être refusé ; b. en cas d'hématies nucléées présentes (avec plus de 10 hématies nucléées / 100 leucocytes) en raison d'un vieillissement de l'échantillon, il sera demandé un nouveau prélèvement au sujet. 3. Si une anémie est présente, c'est-à-dire pour les valeurs suivantes : taux d'hémoglobine pour un sujet féminin inférieur à 6 mmol/1, taux d'hémoglobine pour un sujet masculin inférieur à 7 mmol/1, volume globulaire moyen inférieur à 80 fl (type fer) ou supérieur à 110 fl (type vitamine B6, B12, acide folique), le test ne sera pas réalisé. 4. Si l'échantillon sanguin traduit une inflammation (différenciation anormale : taux de neutrophiles supérieur à 8/nl, taux de lymphocytes supérieur à 4/nl), le test peut être refusé et le sujet pourra finalement être soumis à un protocole inflammatoire. 5. S'il y a une leucopénie (taux de leucocytes inférieur à 2/nl, taux d'hyperleucocytose supérieur à 12/n1), le test peut être refusé et le sujet pourra 5 finalement être soumis à un protocole inflammatoire. 6. S'il y a agrégation plaquettaire (seuil d'alerte d'agrégats plaquettaires atteint), le sujet devra fournir un nouvel échantillon sanguin. Lorsque l'échantillon a passé les différentes étapes du criblage préliminaire, si ce dernier a eu lieu, il pourra alors être transféré à un robot de pipetage Tecan pour dilution 10 avec des fragments alimentaires ; le robot Tecan effectuera préférentiellement une dilution de 80 l de sang pour 120 l d'extrait alimentaire, soit environ un rapport de 40/60. Après pipetage, le mélange pourra être incubé à la température ambiante au minimum pendant 10 minutes et au maximum pendant 45 minuties ; après incubation, le mélange sang/extrait alimentaire fera l'objet du test selon l'invention en utilisant un 15 automate du type Cell-Dyn Sapphire ou Cell-Dyn 4000 des Laboratoires Abbott. Les aliments utilisés pour la préparation d'extraits alimentaires sont obtenus selon la méthode Allergon ou Sigma ou toute autre méthode équivalente et dilués avec une solution saline de phénol à 0,2% ; ils sont mélangés dans une machine rotative pendant 36 heures, centrifugés à 1200 g et filtrés sur un filtre Sartorius de 20 g. La solution ainsi 20 obtenue pourra être soumise à vieillissement pendant 7 jours et stockée à 4 C ; avant son utilisation cette solution fera l'objet d'une dilution 1:5. Après dilution, ces extraits alimentaires ainsi dilués sont stables pendant 6 jours. Le criblage préliminaire ayant été réalisé avec succès et les extraits alimentaires étant prêts, la méthode selon l'invention peut être mise en route en utilisant 25 préférentiellement un automate du type Cell-Dyn Sapphire ou Cell-Dyn 4000 des Laboratoires Abbott qui est un analyseur en hématologie utilisant une combinaison de 4 techniques (avec technologie laser) afin de déterminer la réaction immunitaire d'un sujet déterminé à des aliments testés ; chaque aliment est testé séparément. A l'issue de ce test, plus de 4 millions de cellules vivantes auront été testées sur une base individuelle afin de 30 déterminer si elles donnent lieu ou non à une réaction auxdits aliments. Parmi ces cellules, ce sont les leucocytes qui seront étudiés. Le logiciel qui est associé à l'analyseur Cell-Dyn, ou autre, prendra en considération les différentes catégories suivantes de cellules : - neutrophiles - monocytes éosinophiles - lymphocytes -hématies nucléées Une fois que le test de la méthode selon l'invention aura été réalisé, ces catégories de cellules apparaîtront sous forme de nuages séparés dans un diagramme de dispersion qui sera interprété afin de déterminer le programme alimentaire qui sera proposé à chaque sujet. L'algorithme qui est utilisé dans la présente méthode se compose de deux flux de données: - les données Com Port, - les données d'extraction Datalog. Grâce aux données Com Port, ce sont la stabilité de l'analyseur Cell-Dyn, le robot Tecan et la qualité de l'échantillon qui seront contrôlés ; ces contrôles impliqueront le recours aux paramètres suivants : impédance des hématies, hémoglobine, volume globulaire moyen, spectre de dispersion des hématies ainsi que les données d'alerte d'invalidité. L'impédance des hématies et l'hémoglobine sont choisies pour leur stabilité analytique, y compris dans les échantillons anciens. Le volume globulaire moyen et le spectre de dispersion des hématies sont choisis parce que ces paramètres, outre le fait qu'ils sont également stables pour des échantillons anciens, sont indépendants du taux de dilution. L'acceptation pour l'intervalle des données numériques est de 0,6 x échantillon sanguin complet +/- 10% (5% pour le volume globulaire moyen et pour le spectre de dispersion des hématies) ; si trois fois de suite les critères d'acceptation sont rejetés, l'analyseur devra être arrêté et ne pourra être remis en route qu'une fois le problème réglé. L'intervalle d'acceptation pour les données d'alerte d'invalidité est le suivant : si trois fois de suite des données d'invalidité apparaissent, il conviendra d'arrêter l'analyse de l'échantillon et de dépanner le système. En ce qui concerne les données d'extraction, la moyenne des paramètres suivants (fraction viable de leucocytes, leucocytes, volume globulaire moyen, spectre de dispersion des hématies, neutrophile 0 , neutrophile 7 , neutrophile 90 , neutrophile 90 dépolarisé, fluorescence rouge 3, lymphocyte 0 , lymphocyte 7 , plaquette optique 7 , plaquette optique 90 , coefficient de variation lymphocyte 0 , coefficient de variation neutrophile 7 , coefficient de variation neutrophile 90 , coefficient de variation neutrophile 90 dépolarisé, coefficient de variation fluorescence rouge 3, coefficient de variation lymphocyte 0 , coefficient de variation lymphocyte 7 , coefficient de variation plaquette optique 7 , coefficient de variation plaquette optique 90 ) doit être calculée individuellement à partir de 5 échantillons vierges. Si un échantillon vierge diffère de plus de 5%, il doit être rejeté et ne fera pas partie du calcul ; pas plus de deux échantillons vierges ne pourront être rejetés (dans l'hypothèse où ces échantillons vierges montrent une dispersion anormale des résultats, ces derniers feront l'objet d'une vérification manuelle). Chaque échantillon, avec l'extrait alimentaire, devra être comparé individuellement pour chacun des paramètres susmentionnés avec la moyenne obtenue avec l'échantillon vierge. La différence entre la moyenne de l'échantillon avec extrait alimentaire et la moyenne de l'échantillon vierge sera multipliée par un coefficient de pondération ; la somme de toutes ces différences est classée de façon décroissante. Le coefficient de pondération se situe entre 0 et 100 en fonction de la fraction viable de leucocytes qui elle-même doit se situer entre 75 et 100. Lorsque la somme desdites différences est inférieure à une valeur comprise entre 50 et 100, l'aliment ne sera pas interdit. Ainsi qu'il a été précédemment mentionné, le programme alimentaire aboutira à deux groupes de régimes, à savoir : 1. aliments pouvant être absorbés, 2. aliments ne pouvant pas être absorbés pendant plusieurs semaines, voire pendant plus d'un an. Ce qui précède est déterminé dans l'analyseur Cell-Dyn, ou autre, en examinant les changements apportés aux cellules vivantes par les aliments par rapport à l'état de ces cellules vivantes dans les échantillons de référence (sang testé en dilution saline). Selon un mode préférentiel de la présente invention, les leucocytes analysés seront les neutrophiles ; les diagrammes de dispersion précités sépareront ainsi les neutrophiles en : 1. neutrophiles normaux : pas de réaction 2. neutrophiles avec toxine : présence d'une réaction toxique 3. neutrophiles avec phagocytose : présence d'une réaction toxique avec phagocytose 4. neutrophiles avec dégranulation : présence d'une réaction toxique avec dégranulation. S'agissant des aliments à éviter pendant 5 semaines, une réaction toxique telle que précitée est commune ; la phagocytose, la dégranulation ou la mort des neutrophiles sont rares. Lorsqu'on passe aux aliments devant être évités pendant 10 semaines, une réaction toxique avec phagocytose et dégranulation est courante. La mort des neutrophiles et la dégranulation sont habituelles pour les aliments qui ne peuvent plus jamais être absorbés. Le test selon la méthode de l'invention sera répété pour chaque aliment ; de façon à obtenir un vaste spectre d'aliments destinés à intégrer l'une des 4 catégories précitées, on testera préférentiellement de l'ordre de 115 aliments différents et 5 échantillons de référence, aboutissant ainsi à un programme alimentaire approprié pour le sujet. Ce dernier aura ainsi son propre programme et ce programme pourra être périodiquement adapté de façon à prendre en compte les variations normales dans la vie du sujet. Les seuils de l'analyseur Cell-Dyn sont assez souples, ce qui veut dire que des échantillons anciens (jusqu'à 72 heures) peuvent valablement être testés. Dans la mesure où chaque réponse immunitaire est absolument unique, cela signifie que si une cellule présente une réaction à l'un des substrats (aliments) qui lui sont présentés, cette réaction elle-même pourra être mesurée. Le test réalisé selon la méthode de la présente invention est suffisamment sophistiqué pour que chaque sujet reçoive des résultats détaillés et exacts. Le sang du sujet déterminera ainsi les aliments donnant lieu à une réaction positive par rapport aux échantillons testés. La méthode selon la présente invention présente une amélioration certaine par rapport aux méthodes habituelles dans la mesure où elle est adaptée à chaque sujet en lui fournissant une liste d'aliments à absorber de façon sélective (sans restriction, exclus pour une période limitée ou pour toujours). Le programme alimentaire déterminé par cette méthode évitera les inconvénients des régimes traditionnels dans lesquels les lipides et/ou glucides sont régulièrement exclus ; dans ce type de régimes, au bout d'un certain temps, le message émis par les cellules est que le combustible n'est pas adapté (pas de lipides ou pas de glucides), aboutissant à la fermeture de la porte de la cellule avec les conséquences préalablement décrites. On parle traditionnellement dans ce cas de l'effet yoyo présentant les caractéristiques suivantes : une fois que tous les nutriments ont été utilisés., la cellule ferme sa porte et tombe en apoptose, augmentant alors le taux d'IgF1 ; - l'apoptose provoque en retour un signal au cerveau afin de décroître le taux d' IgF 1 produit ; -à l'issue de la phase d'apoptose de la cellule, le taux d'IgFl va décroître et les nutriments nouvellement absorbés seront transformés en tissu adipeux. - Un tel effet yoyo présente des conséquences dramatiques : le poids perdu proviendra essentiellement de la masse musculaire, - à l'issue de la phase d'apoptose précitée, tout le tissu musculaire perdu sera remplacé par du tissu adipeux. Par suite, l'exclusion des lipides et/ou des glucides aboutira à une perte de poids, seulement à court terme, suivie d'une augmentation de poids provoquant un sentiment de frustration du sujet qui aura perdu son impression de bien-être que lui avait procuré sa perte de poids initiale. La méthode selon l'invention et le programme alimentaire qui en est issu évitera ce sentiment de frustration en privilégiant une perte de poids à long terme. REVENDICATIONS 1) Méthode d'analyse de sang qui consiste à : a) introduire un extrait alimentaire dans un échantillon sanguin d'un sujet, b) tester l'effet dudit extrait sur les leucocytes, c) répartir lesdites cellules après le test en différentes catégories correspondant à un programme alimentaire propre au sujet. 2) Méthode selon la revendication 1 dans laquelle lesdits leucocytes sont divisés en : a) normaux b) avec toxine c) avec phagocytose d) avec dégranulation e) morts 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que lesdits leucocytes sont des neutrophiles. 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'échantillon sanguin a été traité par un anti-coagulant préalablement à la mise en oeuvre de ladite méthode. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que sa mise en oeuvre est précédée d'un criblage préliminaire, portant sur au moins un paramètre, réalisé sur l'échantillon sanguin complet, permettant de déterminer la poursuite du test selon ladite méthode. 6) Méthode selon la revendication 5 caractérisée en ce que ledit criblage préliminaire porte sur au moins l'un des paramètres suivants : a. fraction viable de leucocytes inférieure à 0,75 b. présence d'hématies nucléées dans l'échantillon sanguin c. présence d'anémie d. présence d'une inflammation e. présence de leucopénie f. présence d'une agrégation plaquettaire. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ledit échantillon sanguin est dilué à raison de 40% de sang et 60% d'extrait alimentaire. 8) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que ledit extrait alimentaire est dilué dans une solution saline de phénol à 0,2%.-11 9) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : i. calculer la moyenne des paramètres suivants (fraction viable de leucocytes, leucocytes, volume globulaire moyen, spectre de dispersion des hématies, neutrophile 0 , neutrophile 7 , neutrophile 90 , neutrophile 90 dépolarisé, fluorescence 'rouge 3, lymphocyte 0 , lymphocyte 7 , plaquette optique 7 , plaquette optique 90 , coefficient de variation lymphocyte 0 , coefficient de variation neutrophile 7 , coefficient de variation neutrophile 90 , coefficient de variation neutrophile 90 dépolarisé, coefficient de variation fluorescence rouge 3, coefficient de variation lymphocyte 0 , coefficient de variation lymphocyte 7 , coefficient de variation plaquette optique 7 , coefficient de variation plaquette optique 90 ) à partir de 5 échantillons vierges, ii. comparer individuellement chacun des échantillons comportant un aliment, pour chacun des paramètres précités, à la moyenne de l'échantillon vierge, iii. calculer la différence entre l'échantillon vierge et l'échantillon comportant un aliment, iv. multiplier ladite différence par un coefficient de pondération, v. ajouter lesdites différences.