Brevet FR2886651A1 — publié le 20061208

L'invention concerne un procédé de quantification rapide des microorganismes coliformes vivants dans un échantillon d'eau, ainsi que son utilisation. En particulier, mais de façon non limitative, la présente invention porte sur le procédé de quantification rapide des micro-organismes Escherichia coi/ dans un échantillon d'eau de baignade, notamment d'eau de mer. Dans le cadre de la surveillance de la qualité des eaux de baignade, les analyses courantes portent essentiellement sur les paramètres microbiologiques et principalement sur la recherche de bactéries indicatrices (coliformes fécaux tels que Escherichia coi/ et entérocoques) témoignant d'une pollution fécale, qu'elle soit d'origine humaine où animale (animaux à sang chaud). La présence de ces germes dans l'eau indique que celle-ci a été contaminée par des matières fécales et sousentend une présence potentielle de germes pathogènes. Ainsi, la réglementation de la qualité des eaux de baignade fixe des valeurs guides et impératives qui correspondent à deux plafonds de concentrations de ces indicateurs dans les eaux analysées et qui permettent d'évaluer la qualité microbiologique des eaux. Aujourd'hui, les méthodes normalisées utilisées pour l'énumération des coliformes fécaux et des entérocoques reposent pour la plupart sur des méthodes Pasteuriennes. Certaines méthodes sont basées sur la mise en culture des microorganismes sur des milieux de culture sélectifs puis sur leur quantification après une période d'incubation allant de 24 heures à 48 heures. D'autres méthodes sont basées sur des méthodes enzymatiques et reposent sur la détection d'une enzyme ou d'une combinaison d'enzymes dans des conditions de croissance en conditions sélectives. Les mesures sont effectuées en microplaques et les résultats reposent sur une estimation statistique de la concentration en germes cibles. Ces tests sont actuellement utilisés en routine et représentent la méthode de référence dans le domaine de l'analyse des eaux de baignade. Un des enjeux dans le domaine du diagnostic en microbiologie, et dans celui de l'analyse des eaux de baignade en particulier, est de développer des méthodes alternatives aux méthodes de culture qui soient plus rapides. 2886651 2 Le brevet EP 0 386 051 propose un procédé de quantification des micro-organismes coliformes totaux utilisant la mesure d'une activité enzymatique spécifique (activité (3-D-galactosidase) dans des conditions standardisées de pH, de température et de concentration en substrat. La vitesse de formation des produits de la réaction (hydrolyse du 4méthylumbélliféryl-[3-D-galactoside (MuGala) en acide R-D-galactosique et en 4-méthylumbelliferone (MUF) (fluorescent) catalysée par l'enzyme p-Dgalactosidase) est proportionnelle dans des conditions standardisées à la quantité d'enzyme présente naturellement dans le milieu réactionnel. En partant du principe que la quantité d'enzyme est constante au sein des bactéries des espèces formant les micro-organismes coliformes totaux, la mesure de l'activité enzymatique (suivi de la cinétique de formation du 4méthylumbelliferone (fluorescent) par spectrofluorimétrie) permet de déterminer le nombre des micro- organismes coliformes totaux, dans un échantillon d'eau, et donc d'en déduire sa concentration. En particulier, EP 0 386 051 prévoit l'ajout de constituants aptes à augmenter l'activité enzymatique, pour activer la fluorescence et faciliter la mesure de la vitesse de variation de la fluorescence dans le cas où la concentration en micro-organismes est faible, sans attendre la multiplication des micro-organismes par reproduction sur plusieurs générations. Il est également connu ( Use of enzymatic methods for rapid enumeration of co/iforms in fresh waters , Journal of Applied Microbiology 2000, 88, 404-413, George et al) de réaliser une quantification rapide des microorganismes coliformes vivants constitués des Escherichia co//, dans un échantillon d'eau. Dans ce cas, on utilise à titre de substrat fluorogène le 4méthylumbélliféryl-[3-D-glucuronide (MuGlu) qui est catalysé par l'enzyme 3-D-glucuronidase en acide 13-Dglucuronique et en 4-méthylumbelliferone (MUF) dont la fluorescence est mesurée. Il existe aussi une méthode normalisée de dénombrement des Escherichia col/ dans l'eau (ISO 9308-3) dite microplaque , qui sert de référence dans la réglementation relative à la qualité microbiologique des eaux de surface, en particulier des eaux de baignade, pour déterminer le niveau de contamination. 2886651 3 Dans cette méthode normalisée NF EN ISO 9308-3, l'échantillon dilué selon plusieurs dilutions est ensemencé dans une série de puits d'une microplaque contenant le milieu de culture déshydraté et le substrat de l'enzyme, le 4-méthylumbélliféryl-13-D-glucuronide (MuGlu). Après une période d'incubation de 36 à 72 heures à 44 C, les puits de la microplaque sont examinés sous rayonnement ultraviolet de longueur d'onde 366 nm. La présence d'Escherich/a cois dans un puit donné est indiquée par une fluorescence bleue résultant de l'hydrolyse du MuGlu. Pour chaque dilution, le nombre de puits positifs est noté. Les résultats sont donnés en nombre le plus probable (NPP) par 100mI (le NPP est une estimation statistique de la densité des micro-organismes, supposée répondre à une distribution de Poisson dans les volumes ensemencés). Il faut relever que cette méthode normalisée est particulièrement adaptée aux eaux riches en matières en suspension. Cependant, cette méthode normalisée par microplaque nécessite en moyenne 48 heures alors que les méthodes de détection rapide des Esche/chia coi/ décrites dans l'art antérieur, permettent d'obtenir un résultat en 1 heure et peuvent être utilisées comme indicateur rapide de la qualité microbiologique de l'eau et donc comme outil de gestion du risque sanitaire immédiat. Cependant les méthodes de détection rapides d'Escherichia coi/ ne donnent pas toujours un résultat comparable à la méthode normalisée par microplaque. Notamment, dans le cas des eaux chargées en matières en suspension de type sable ou sédiments, les méthodes rapides donnent un résultat supérieur à celui de la méthode normalisée. La présente invention a pour objectif de fournir un procédé de quantification rapide des micro-organismes coliformes vivants dans un échantillon d'eau, permettant de surmonter les inconvénients de l'art antérieur et en particulier offrant la possibilité de donner des résultats comparables à la méthode normalisée, pour tout type d'eau, et notamment pour une eau turbide, riche en matières en suspension. Dans la suite du présent texte et au sens de la présente invention, par rapide , on entend un procédé apte à être réalisé en quelques heures au maximum, et notamment en 1 heure au plus. A cet effet, selon la présente invention, le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: 2886651 4 a) réaliser une étape préliminaire de traitement de l'échantillon permettant de retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau; b) filtrer l'échantillon sur un filtre ayant une taille de pores inférieure à la taille des micro-organismes coliformes, afin de concentrer les microorganismes coliformes sur le filtre; c) placer le filtre retenant les micro-organismes coliformes dans un récipient contenant une solution tampon; d) porter le récipient à une température d'activité de l'enzyme mesurée; e) ajouter dans le récipient un substrat fluorogène apte à former, par hydrolyse sous l'effet de l'enzyme, de la 4méthylumbelliferone (MUF) ; f) réaliser à intervalles régulier la mesure de la quantité de fluorescence émise en: fl) prélevant une quantité du milieu réactionnel contenu dans ledit récipient, f2) ajoutant un agent modificateur du pH pour augmenter la fluorescence; f3) exposant le prélèvement à de la lumière d'une longueur d'onde proche de la longueur d'onde d'excitation de la 4-méthylumbelliferone (MUF) ; f4) réalisant la mesure de fluorescence émise par la 4-méthylumbelliferone (MUF) produite par le substrat fluorogène sous l'effet de l'enzyme contenue dans les micro-organismes coliformes; g) calculer la vitesse de variation de la fluorescence émise; et h) déterminer la concentration des microorganismes coliformes dans l'échantillon d'origine à partir de la vitesse de variation calculée et d'un schéma de corrélation de vitesse de variation en fonction de la concentration en micro-organismes coliformes. De cette manière, on comprend que par la présence de l'étape préliminaire de traitement de l'échantillon qui permet de retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau, on diminue, le cas échéant, la turbidité de l'eau et on obtient ainsi, avec cette méthode de détection rapide, un résultat comparable à celui obtenu par la méthode normalisée par microplaque, quelle que soit la turbidité de l'eau à tester. Cette solution présente aussi l'avantage supplémentaire, de permettre, outre une simplicité de mise en oeuvre de cette étape préliminaire, de ne pas nécessiter un temps de mise oeuvre important. 2886651 5 Globalement, grâce à la solution selon la présente invention, il est possible de façon très simple, de mettre en oeuvre une méthode de quantification rapide des micro-organismes vivants qui donne un résultat comparable à la méthode normalisée. Le procédé selon l'invention comporte l'une ou plusieurs de autres dispositions préférentielles suivantes: - l'étape préliminaire de traitement comporte une pré-filtration; - la pré-filtration est réalisée avec au moins un filtre présentant une porosité supérieure ou égale à 8 pm; - la pré-filtration est réalisée avec un premier filtre et un deuxième filtre présentant une porosité inférieure au premier filtre, placé en amont du premier filtre; - la pré-filtration est réalisée avec un premier filtre présentant une taille de pores supérieure ou égale à 15 pm (avantageusement sensiblement égale à 20 pm) et un deuxième filtre présentant une taille de pores supérieure ou égale à 8 pm (avantageusement sensiblement égale à 10 dam) ; - le premier filtre et le deuxième filtre sont superposés; - le(s) filtre(s) est (sont) réalisé(s) dans un matériau appartenant au groupe comportant le nylon, le polycarbonate, l'acétate de cellulose, le sulfone, le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polyéthersulfone (PES) et le polyacrylonitrile, ou plus généralement dans tout type de polymère de synthèse. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront à la lecture de la description suivante faite à titre d'exemple et en référence aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 représente schématiquement une particule en suspension dans l'eau de l'échantillon; la figure 2 représente la corrélation entre la vitesse de 30 fluorescence avec la concentration en bactéries Escherichia coi/ dans l'eau de mer; et - la figure 3 est un diagramme représentant des résultats obtenus selon la méthode normalisée, selon la méthode rapide de l'art antérieur et selon l'invention. Sur la figure 1, est représentée schématiquement une particule 10, par exemple un grain de sable, susceptible de se trouver en 2886651 6 suspension dans l'eau de l'échantillon dont on souhaite mesurer la concentration en bactéries Escherichia col. Cette particule 10 porte sur sa surface dix bactéries Escherichia co//12. Dans le cas de la mise oeuvre de la méthode de quantification normalisée, les particules de matières en suspension auxquelles sont fixées des cellules bactériennes du type Escher/ch/a coi/ sont réparties dans les puits des microplaques. Chaque particule 10 tombée dans un puits entraîne le comptage de ce puits comme positif, c'est-à-dire, statistiquement contenant une seule cellule de Escherichia co/i, alors qu'en réalité il y a un nombre supérieur de Escherichia col/ (dix dans le cas de la particule 10 de la figure 1). En revanche, pour la méthode rapide enzymatique, c'est une activité globale que l'on mesure. Ainsi, toutes les cellules bactériennes Escherichia col/ attachées aux particules présentent une activité enzymatique mesurable. C'est pour cette raison que la méthode rapide enzymatique de l'art antérieure donne un résultat supérieur à celui de la méthode de quantification normalisée par microplaque du fait de la numération de toutes les cellules de E. col/ , y compris chacune de celles attachées aux matières en suspension. La présente invention a donc pour principe de retirer tout ou partie des particules en suspension dans l'eau afin de quantifier les microorganismes coliformes vivants, notamment les Escherichia colt, individuellement sans prendre en considération celles qui sont regroupées sur une particule. A titre d'exemple de la présente invention, des essais ont été menés pour de l'eau de mer. Cependant, le procédé selon l'invention n'est pas limité à être utilisé pour l'eau de mer, mais également pour quantifier les micro-organismes coliformes vivants dans de l'eau douce. Dans cet exemple, l'enzyme est la 33-D-glucuronidase, le substrat fluorogène est du 4-méthylumbélliféryl-f3-D-glucuronide (MuGlu) afin de quantifier les micro-organismes coliformes vivants Escherichia Coli et l'agent modificateur du pH est de l'hydroxyde de sodium, pour obtenir un pH supérieur à 10. 2886651 7 Egalement, dans cet exemple, l'étape préliminaire de traitement de l'échantillon qui a été utilisée pour retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau est la pré-filtration. A cet effet, l'échantillon d'eau à analyser est filtré au travers de deux filtres superposés. Le premier situé sur le dessus est en Nylon (marque déposée) et de porosité 20 pm. Le deuxième filtre, situé sur le dessous est en polycarbonate et de porosité 10 pm. C'est le filtrat issu de cette étape de pré-filtration qui est utilisé pour réaliser la mesure d'activité enzymatique rapide. Dans cet exemple, on cherche à mesurer la quantité de bactéries de type Escherichia coi. On réalise donc ensuite une étape de filtration pour concentrer les Escherichia coi/ sur un filtre. Cette étape de filtration consiste à passer les 100 mL 15 d'échantillon du filtrat sur un filtre en polycarbonate de 47 mm de diamètre et 0.22 pm de porosité, Avant la fin de la filtration, on effectue le rinçage des parois de l'entonnoir à l'eau distillée (ou à l'eau apyrogène), Ensuite, on place le filtre de polycarbonate dans un récipient contenant du tampon Phosphate (pH 6.9) à 44 C (bain-marie thermostaté). Ensuite, on effectue la mesure de l'activité enzymatique proprement dite. Pour cela, on ajoute de la solution de 4-méthylumbélliféryl-R-Dglucuronide (MuGlu 1.1 mg/ml, Triton X100 0.04% vol/vol) dans le 25 récipient contenant le mélange réactionnel. Au bout d'1 minute environ, on mesure au cours du temps ( par un prélèvement effectué toutes les 5 minutes, pendant environ 30 minutes) la fluorescence émise par le mélange réactionnel préalablement ajusté à pH 10.6 par addition d'hydroxyde de sodium (NaOH) au prélèvement. On utilise une lumière avec une longueur d'onde d'excitation de 362 nm et une longueur d'onde d'émission de 445 nm. On réalise enfin le traitement des données, à savoir des mesures de fluorescence. 2886651 8 Il s'agit du calcul de la pente de la droite représentant l'évolution de la concentration en MUF (nmol/L) en fonction du temps, et qui est significative de l'activité enzymatique (pmol de MUF/minute). La concentration en E col/ (nombre de E col/ pour 100 mL) est déterminée à l'aide de la droite de corrélation Activité Enzymatique/Dénombrement par microplaque . Le nombre de E col/ dans les 100 mL d'échantillon est calculé en même temps que l'activité enzymatique. Cette droite de corrélation est représentée sur la figure 2 dans le cas de l'eau de mer: il s'agit de la régression linéaire logarithmique entre l'activité GLUase et la concentration en Escher/ch/a col/ pour des échantillons d'eau de mer d'un site de la Méditerranée (PyrénéesOrientales, France) , à savoir Log (GLUase act. pmoles/min.100 ml) = 0. 6534 Log (Escherichia co///100 ml) + 0.8856 (r2= 0.7229). Sur la figure 3, on a reporté, les résultats obtenus avec les trois méthodes: méthode normalisée, méthode enzymatique rapide sans préfiltration, et selon l'invention, à savoir la méthode enzymatique rapide avec l'étape de pré-filtration sur des échantillons d'eau de mer de turbidité allant de 34 à 223 FNU. Les résultats montrent que plus la turbidité est importante, plus la réalisation de l'étape de pré-filtration est cruciale pour obtenir des résultats proches de ceux obtenus avec la méthode normalisée et fournir un indicateur de la qualité microbiologique réglementaire. Sur la base de ces résultats, on comprend que le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre quelle que soit la turbidité de l'eau, et qu'elle est très avantageuse pour l'analyse d'une eau présentant une turbidité supérieure ou égale à 35 FNU, avantageusement supérieure à 50 FNU. Si dans l'exemple préférentiel qui précède, on a utilisé deux filtres (respectivement en Nylon (marque déposée) et de porosité 20 pm puis en polycarbonate et de porosité 10 pm), d'autres essais ont montré que des résultats sont possibles avec une préfiltration réalisée avec un seul filtre, par exemple un filtre de porosité 8 pm notamment en polycarbonate. Il est à noter que le deuxième filtre en polycarbonate et de porosité 10 pm peut être remplacé par un filtre ayant une porosité de 8pm. 2886651 9 L'utilisation de deux filtres superposés dans une même unité de pré-filtration est équivalente à la réalisation successive des deux préfiltrations. Le choix du ou des filtre(s) de l'étape de pré-filtration repose sur le matériau et sur la taille des pores (seuil de coupure), étant entendu qu'il faut éviter un seuil de coupure trop faible entraînant un colmatage ou encore retenant les bactéries formant les micro-organismes coliformes vivants à quantifier. La présente invention n'est pas non plus limitée à la mise en oeuvre d'un traitement préliminaire consistant à effectuer une préfiltration. En effet, on peut retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau par d'autres moyens. En particulier, cette étape préliminaire de traitement peut comporter ou consister en une centrifugation à basse vitesse. De cette façon, on peut séparer les particules en suspension du filtrat. Cette étape préliminaire de traitement peut aussi comporter ou consister en la mise en oeuvre d'une sédimentation ou d'une décantation, c'est-àdire de la chute naturelle des particules par la mise au repos de l'échantillon, puis la récupération du surnageant pour effectuer la mesure. Une telle étape préliminaire de sédimentation peut être combinée à un phénomène physico-chimique d'agrégation (floculation ou coagulation) Il faut noter que la présente invention propose une étape de traitement préliminaire permettant d'adapter les résultats obtenus par la méthode rapide de l'art antérieur aux résultats obtenus par la méthode normalisée. Toutefois, pour rapprocher ces deux mesures, on peut envisager d'adapter les résultats obtenus par la méthode normalisée aux résultats obtenus par la méthode rapide de l'art antérieur. A cet effet, on peut par exemple réaliser un décrochage des bactéries fixées aux particules avant de réaliser l'analyse par la méthode normalisée, et ceci afin de dénombrer toutes les bactéries. Dans le cas du prétraitement par décrochage, la fraction de l'échantillon mesurée par les deux méthodes est celle des bactéries non fixées et celle des bactéries fixées aux particules des matières en suspension. 2886651 10 Un tel décrochage peut être mis en oeuvre par différentes méthodes physico-chimiques: traitement par ultrasons, utilisation de détergents... 11 REVENDICATIONS 1. Procédé de quantification rapide des micro-organismes coliformes vivants clans un échantillon d'eau, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) réaliser une étape préliminaire de traitement de l'échantillon permettant de retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau; b) filtrer l'échantillon sur un filtre ayant une taille de pores inférieure à la taille des micro-organismes coliformes, afin de concentrer les micro-organismes coliformes sur le filtre; c) placer le filtre retenant les micro-organismes coliformes dans un récipient contenant une solution tampon; d) porter le récipient à une température d'activité de l'enzyme mesurée; e) ajouter dans le récipient un substrat fluorogène apte à former, par hydrolyse sous l'effet de l'enzyme, de la 4-méthylumbelliferone (MUF) ; f) réaliser à intervalles réguliers la mesure de la quantité de fluorescence émise en: fl) prélevant une quantité du milieu réactionnel contenu dans ledit récipient, f2) ajoutant un agent modificateur du pH pour augmenter la 20 fluorescence; f3) exposant le prélèvement à de la lumière d'une longueur d'onde proche de la longueur d'onde d'excitation de la 4- méthylumbelliferone (MUF) ; f4) réalisant la mesure de fluorescence émise par la 4méthylumbelliferone (MUF) produite par le substrat fluorogène sous l'effet de l'enzyme contenue dans les micro-organismes coliformes; g) calculer la vitesse de variation de la fluorescence émise; et h) déterminer la concentration des micro-organismes coliformes dans l'échantillon d'origine à partir de la vitesse de variation calculée et d'un schéma de corrélation de vitesse de variation en fonction de la concentration en micro-organismes coliformes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape préliminaire de traitement comporte une pré-filtration. 2886651 12 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la pré-filtration est réalisée avec au moins un filtre présentant une porosité supérieure ou égale à 8 pm. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la préfiltration est réalisée avec un premier filtre et un deuxième filtre présentant une porosité inférieure au premier filtre, placé en amont du premier filtre. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la préfiltration est réalisée avec un premier filtre présentant une taille de pores supérieure ou égale à 15 pm et un deuxième filtre présentant une taille de pores supérieure ou égale à 8 pm. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit premier filtre présentant une taille de pores sensiblement égale à 20 pm et un deuxième filtre présentant une taille de pores sensiblement égale à 10 pm. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le premier filtre et le deuxième filtre sont superposés. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que ledit filtre est réalisé dans un matériau appartenant au groupe comportant le Nylon (marque déposée), le polycarbonate, l'acétate de cellulose, le sulfone, le polyfluorure de vinylidène (PVDF), le polyéthersulfone (PES) et le polyacrylonitrile. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 25 cette étape préliminaire de traitement comporte une centrifugation à basse vitesse. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que cette étape préliminaire de traitement comporte une sédimentation et récupération du surnageant. méthylumbélliféryl-[3-D-glucuronide (MuGlu) afin de quantifier les micro11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite enzyme est la R-D-glucuronidase, en ce que ledit substrat fluorogène est du 4- 2886651 13 organismes coliformes vivants Escherichia Coli et en ce que ledit agent modificateur du pH est de l'hydroxyde de sodium. 12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour l'analyse d'une eau présentant une turbidité 5 supérieure à 35 FNU. 13. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour l'analyse d'un échantillon d'eau de mer ou d'eau douce.