Brevet FR2896164A1 — publié le 20070720

FORMULATION COLLOÏDALE D'INSULINE LONGUE ACTION ET SA PRÉPARATION Le domaine de la présente invention est celui des médicaments à base d'insuline, en 5 particulier des formulations injectables d'insuline, pour le traitement des diabètes de type I et II chez l'homme et l'animal. La présente invention concerne, plus précisément, des formulations injectables d'insuline formées par des suspensions colloïdales d'insuline destinées à une administration parentérale journalière et capables de maintenir durant tout le 10 nycthémère chez le patient ou l'animal diabétique, une concentration d'insuline plasmatique voisine de la concentration basale observée chez un sujet non diabétique. L'invention concerne, également, des procédés de préparation desdites suspensions colloïdales d'insuline. 15 Les diabétiques sont assujettis à un traitement très contraignant et imparfait, les obligeant à s'injecter de l'insuline plusieurs fois par jour. Outre les injections d'insuline à absorption rapide, destinées à corriger la montée de glycémie après ou au cours d'un repas, il est également nécessaire de maintenir l'insuline sérique au niveau basal jour et nuit afin d'éviter des effets secondaires très néfastes. Cette dernière correction est 20 particulièrement délicate car la nuit, les patients n'ont pas l'opportunité de se traiter et ainsi de rétablir le niveau souhaitable d'insuline. Les formulations injectables d'insuline doivent être stables, à savoir que l'insuline qu'elles contiennent ne doit pas se dégrader au stockage. Cette insuline se doit par exemple d'être toujours pleinement efficace au terme d'un stockage de 2 ans à 5 C. Les 25 formulations injectables d'insuline doivent avoir une rhéologie adaptée aux systèmes d'injection couramment utilisés pour l'insuline. Il existe donc un besoin aigu d'une formulation d'insuline longue action injectable au travers de très fines aiguilles et stable. Le problème de la mise au point d'une telle formulation est connu depuis longtemps et a fait l'objet de nombreux travaux. 30 Au sens du présent exposé, "insuline" désigne aussi bien l'insuline humaine ou une insuline animale ou encore un analogue de l'insuline. Au sens du présent exposé, une formulation d'insuline longue action est une formulation permettant, d'une part, d'éviter, après administration, tout pic d'hypoglycémie néfaste pour le patient et, d'autre part, de maintenir une action 35 hypoglycémiante sur 24 heures au moins. ART ANTERIEUR Il est fait ci-après état d'un certain nombre de propositions techniques antérieures pour des formulations d'insuline longue action. Ainsi, on connaît par exemple l'insuline humaine longue action NPH. Il s'agit de suspensions partiellement micro-cristallisées de complexes insuline humaine / zinc / protamine (comme décrites par exemple dans US-B-5,834,422), qui permettent de ralentir la libération in vivo de la protéine. Dans ces suspensions, l'insuline est complexée à la protamine et au zinc pour former un précipité partiellement cristallisé. Après injection sous-cutanée, la vitesse de libération de l'insuline est contrôlée par la cinétique de dissolution in vivo de ce précipité et la cinétique de décomplexation de l'insuline. La durée d'action de ce type d'insuline, bien que prolongée par rapport à celle d'une insuline rapide, ne dépasse pas 16 heures et ne couvre donc pas réellement le nycthémère. Par ailleurs, on observe un pic d'hypoglycémie, après administration de cette insuline humaine longue action NPH. Cette dernière n'est donc pas une véritable insuline longue action telle que définie ci-dessus. Récemment, le brevet US-B-5,656,722 décrit une nouvelle structure de protéine analogue à l'insuline dénommée GLARGINE incluse dans une formulation. Une voie totalement différente pour obtenir une forme à libération prolongée de protéine est divulguée dans le brevet US-B- 5 904 936 (EP-B0 734 720). La technique proposée ne consiste ni à modifier chimiquement l'insuline, ni encore à complexer l'insuline avec la protamine et le zinc. Il s'agit plutôt d'adsorber l'insuline humaine sur des nanoparticules biocompatibles formées spontanément, par auto- assemblage dans l'eau de polyaminoacides amphiphiles tels que le poly(L-leucine-bglutamate de sodium) -ci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu). Cet auto-assemblage conduit à une suspension colloïdale de nanoparticules. L'insuline humaine, lorsqu'elle est mise en présence d'une telle suspension colloïdale, s'adsorbe spontanément sur les particules pour former un complexe non covalent insuline/particule. Après injection sous-cutanée, l'insuline humaine se dissocie progressivement du complexe ce qui permet de maintenir sa concentration plasmatique à une valeur voisine de sa valeur basale pendant une durée prolongée. L'avantage de cette approche est de mettre en oeuvre dans un procédé non dénaturant, de l'insuline humaine non modifiée et un polymère biocompatible, sans faire appel à des tensioactifs potentiellement dénaturants. Il est précisé dans l'exemple 14 du brevet US-B- 5 904 936 que l'insuline humaine s'associe spontanément à des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) jusqu'à un taux maximal de 0,65 mg d'insuline humaine pour 10 mg de poly(Leu-bloc-Glu) soit 6,5 % massique. Cette formulation d'insuline longue action injectable selon l'exemple 14 du brevet US-B- 5 904 936 est perfectible s'agissant des points suivants: - La formulation pourrait gagner en facilité d'injection, en particulier avec des seringues à aiguilles fines 29G, 30G ou 31G, qui améliorent nettement le confort du patient sachant que celui-ci est soumis à une injection quotidienne sur plusieurs dizaines d'années. - La formulation pourrait gagner en stabilité pour retarder encore la dégradation de l'insuline. - L'injection sous-cutanée de cette formulation chez le porc peut parfois conduire à la formation d'érythèmes et d'oedèmes marqués, traduisant une tolérance locale susceptible d'être améliorée, ce qui rend cette formulation difficilement compatible avec une application pharmaceutique journalière sur une très longue durée. - La formulation est difficilement stérilisable par filtration. Dans son exemple 9, la demande WO-A-01/37809 décrit une formulation d'insuline longue action injectable, dont le pH est de 7,4 et qui comprend une suspension de nanoparticules de polymère poly(Leu-bloc-Glu). Cette suspension comprend (par ml de préparation) : 80 UI d'insuline et 56 mg de polymère, soit un rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu) de 5%. Administrée chez le chien Beagle à raison de 2 UI/kg, cette suspension donne lieu à une libération prolongée sur 24 heures environ. Cependant, cette formulation présente une stabilité perfectible comme démontrée dans l'exemple 5 infra de la présente demande. Forte de cette expérience, la demanderesse a redéfini un cahier des charges pour une formulation d'insuline humaine longue action injectable: 1. La formulation gagnerait à être plus aisément injectable au travers d'une aiguille de petit diamètre (e.g. 29G, 30G ou 31G), afin d'améliorer le confort du patient, et ainsi l'observance du traitement. 2. La formulation d'insuline est perfectible s'agissant de sa stabilité notamment à 4 C et à température ambiante, pour ne pas provoquer des modifications des propriétés de la formulation ni des dégradations de l'insuline humaine. 3. la formulation serait grandement améliorée si elle était dotée d'une excellente tolérance locale, afin d'être compatible avec une injection journalière sur une durée de plusieurs dizaines d'années. 4. La biodisponibilité de l'insuline fournie par une telle formulation gagnerait à être aussi élevée que possible. 5. L'efficacité de la formulation, mesurée, par exemple, par son effet hypoglycémiant, gagnerait à être la plus élevée possible pendant au moins 24 heures, après 5 l'injection. 6. La formulation gagnerait à avoir une rhéologie permettant un remplissage aisé de la seringue par le patient. 7. L'aptitude à la stérilisation par filtration serait un atout déterminant pour la formulation. 10 La demande de brevet français non publiée N 04 51578 du 19.07.2004 décrit une suspension colloïdale injectable d'insuline longue action. Cette suspension vise à satisfaire le cahier des charges susvisé. Elle comprend des nanoparticules d'au moins un poly(Leu-bloc-Glu), chargées en insuline. Son pH est compris entre 5,8 et 7,0 (e.g. 6,36,5). Son osmolarité O (en mOsmol) est telle que: 270 O 800 (e.g. circa 300). Cette osmolarité est ajustée par ajout d'au moins un sel, par exemple de NaCl ou de MgC12.Sa viscosité v (en mPa.$) est telle que v 40 (e.g. 25). Les nanoparticules du poly(Leubloc-Glu) ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh tel que : 15 Dh 40. La concentration en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30-55 g/1 (e.g. 42). Le rapport 20 Insuline/ poly(Leu-bloc-Glu) est compris entre 5 et 11. Le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est telque:12Ta25. 25 Cette suspension colloïdale injectable d'insuline longue action est dotée de très bonnes performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Cependant, il est apparu que cette suspension est perfectible en termes de viscosité. En effet pour une administration au moins une fois par jour la vie durant, il est hautement souhaitable de faire en sorte que cette suspension soit la plus fluide possible, idéalement comme l'eau. 30 Cette exigence vaut aussi bien au regard de la facilité de remplissage de la seringue équipée d'une fine aiguille (pompage/aspiration), qu'au regard de la facilité d'injection (expulsion de la suspension). La diminution de viscosité escomptée ne doit pas se faire au détriment des performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la suspension. Or, les inventeurs ont mis en évidence que la solution simple qui consisterait à réduire la concentration en poly(Leu-bloc-Glu) pour diminuer la viscosité de la suspension est nuisible aux performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. EXPOSE SUCCINCT DE L'INVENTION Confrontés à ce problème technique, les inventeurs se sont donc fixés pour objectif essentiel d'y apporter une solution convenable. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des formulations d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale: • qui permette un remplissage aisé d'une seringue au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G) • et/ou qui soit aisément injectable au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G), sans nuire à l'efficacité thérapeutique de l'insuline. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale comprenant des nanoparticules de poly(Leuûbloc-Glu) et qui soit filtrable sur des filtres de 0,2 m à des fins de stérilisation. Un autre objectif essentiel de l'invention est de perfectionner la suspension divulguée dans la demande de brevet français non publiée N 04 51578 du 19.07.2004. Un autre objectif essentiel de l'invention est de satisfaire pleinement le cahier des charges sus-décrit. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, qui maintienne un effet hypoglycémiant important s'étendant sur 24 heures au moins, après une seule administration, par exemple par voie sous-cutanée. Un autre objectif essentiel est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, qui soit stable et qui n'induise pas de modification de la structure et de la bioactivité de l'insuline. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des formulations d'insuline longue action sous forme de suspensions colloïdales injectables à faible volume d'injection et concentration élevée en insuline humaine, typiquement 100 IU/ml, et ce sans nuire à l'efficacité thérapeutique et en particulier à la durée de l'effet hypoglycémiant. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, présentant une bonne tolérance locale et une sécurité d'emploi compatibles avec le traitement chronique des diabétiques. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale, dans laquelle l'insuline est une 5 insuline humaine non modifiée. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir une formulation d'insuline longue action sous forme de suspension colloïdale comprenant des nanoparticules de poly(Leuùbloc-Glu) sur lesquelles les protéines sont adsorbées de façon réversible, non covalente et sans dénaturation. 10 Un autre objectif essentiel de l'invention est de proposer un procédé de préparation de ces suspensions colloïdales d'insuline longue action, ledit procédé se devant d'être, simple à mettre en oeuvre, non dénaturant pour la protéine et devant en outre toujours assurer de façon fiable la reproductibilité des caractéristiques de la formulation. 15 Les objectifs ci-dessus, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne, tout d'abord, une formulation injectable d'insuline longue action comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules à base d'au moins un polymère séquencé de L-Leucine et de L-Glutamate de sodium, ou poly(L-leucine-b-L-glutamate de sodium) ùci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu)-, ces nanoparticules 20 étant chargées en insuline, le pH de cette suspension étant tel que: 6,0 pH 7,0; caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de magnésium en quantité telle que : ^ l'osmolarité Osm (en mOsmol) est telle que: 270 Osm 600, ^ la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, est 25 telle que: v 15. ^ la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65. Le fondement inventif de cette nouvelle suspension colloïdale apte à constituer une 30 formulation galénique injectable d'insuline longue action, réside, notamment, dans la combinaison des sélections suivantes: -fenêtre d'osmolarité assurant notamment une bonne tolérance locale pour la formulation; - fenêtre de viscosité avec un plafond à 15 mPa.s, qui participe à l'instauration dans 35 la formulation de propriétés rhéologiques telles qu'il est possible de remplir aisément une seringue en aspirant la formulation au travers d'une aiguille de faible diamètre (par exemple de gauge 29G, 30G ou 31G) et d'injecter aisément au travers de ces mêmes aiguilles; - nature (Mg2+) et quantité de l'électrolyte utilisé pour ajuster l'osmolarité. Ces avancées sont obtenues sans grever le coût de revient de cette nouvelle formulation. Avantageusement, la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) de la formulation, est comprise entre 30 et 70, de préférence 38 et 65. Cette fenêtre de concentration en poly(Leu-bloc-Glu) permet de préserver les performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la suspension; De préférence, le contre-anion du Mg2+ est choisi dans le groupe comprenant Cr, SO4- - et leurs mélanges. Par ailleurs, la formulation selon l'invention possède de préférence au moins l'une (idéalement toutes) des caractéristiques suivantes : - les particules du poly(Leu-bloc-Glu) retenu ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh exprimé en nanomètres (nm) et mesuré selon un mode opératoire Md, tel que : 10 Dh 50 de préférence, 15 Dh 40 ; - le rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu), exprimé en %, est tel que : 6 insuline/poly(Leu-bloc-Glu) 10, de préférence 3 insuline/poly(Leu-bloc-Glu) 5; - la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 25 70, de préférence 38 et 65; - le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que : 30 - l'insuline est une insuline humaine non modifiée. Finalement, la formulation injectable d'insuline longue action selon l'invention est 35 dotée des propriétés essentielles suivantes: 10 Ta de préférence, 10 Ta 40 et, plus préférentiellement encore, 12 Ta 25 • une viscosité suffisamment faible pour avoir une bonne aptitude au remplissage d'une seringue par aspiration au travers d'une aiguille de faible diamètre et une "injectabilité" aisée au travers d'une aiguille de faible diamètre, ce qui améliore considérablement le confort du patient et accroît donc l'observance du traitement; et ce en combinaison avec de bonnes performances pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, en particulier une activité hypoglycémiante étendue sur 24 heures après administration chez l'homme d'une dose standard de 0,6 UI/kg; • une excellente stabilité; • une bonne tolérance locale; • une aptitude à la filtration par stérilisation sur un filtre de 0,2 micron, grâce à la petite taille des particules. Cette suspension présente en outre la propriété de présenter un faible rapport massique 15 polymère/insuline conduisant à un surcoût limité en polymère. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La sélection des paramètres sus définis pour obtenir une suspension colloïdale d'insuline adaptée en tant que formulation médicamenteuse injectable d'insuline longue 20 action, est le fruit d'importantes et longues recherches sur la mesure et la comparaison des activités pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de ces formulations d'insuline sur divers modèles animaux ainsi que de nombreux travaux sur la viscosité (caractère injectable et aptitude à être aspirée au travers d'une aiguille), la stabilité, la tolérance et la bio compatibilité de cette suspension particulière. 25 La suspension colloïdale stable formant la formulation comporte des nanoparticules structurées submicroniques, constituées par auto assemblage d'un copolymère poly(Leu-bloc-Glu). Ces nanoparticules sont aptes : 30 o à s'associer (adsorber) spontanément à l'insuline, de façon non covalente, en suspension colloïdale, à l'état non dissous et sans dénaturation, pour former un complexe nanoparticule/insuline, o et à libérer l'insuline, notamment in vivo, de manière prolongée et/ou retardée. 35 Enfin, ces nanoparticules sont stables en phase aqueuse même en l'absence de tensioactif(s). Il est du mérite de la Demanderesse d'avoir montré que l'on peut réduire la viscosité de la suspension et donc la force nécessaire pour injecter la suspension colloïdale au travers d'une aiguille de faible diamètre, en jouant notamment sur le choix du cation qui permet d'ajuster l'osmolarité Osm et sur la concentration CMg2+ de ce cation. Un autre mérite des inventeurs est d'avoir abaissé la viscosité en ajustant l'osmolarité Osm (en mOsm) de la suspension à une valeur supérieure à 270 et inférieure ou égale à 600, par ajout d'au moins un sel, et plus spécialement d'un ou plusieurs sels monovalents et/ou multivalents (e.g. divalents ou trivalents) de magnésium. Ainsi, CMgz+ compris entre 0,06 et 0,125 mole/L (de préférence de l'ordre de 0,08 +/-0,01 mole/L) permet d'optimiser le compromis entre la durée d'action et le caractère injectable de la suspension. Au sens du présent exposé, le terme "de l'ordre" associée à une valeur numérique 15 signifie que cette valeur est donnée avec une tolérance qui peut atteindre, par exemple, 20 % Cette viscosité réduite et donc cette aptitude remarquable de la formulation de l'invention à être facilement injectable au travers d'une aiguille de petit diamètre (par 20 exemple gauge 29G, 30G et 31G ou diamètre: 0,15 à 0,4 mm, longueur: 8 à 20 mm) est appréciée notamment au travers de la force à exercer sur le piston de la seringue. Il est par exemple souhaitable que cette force n'excède pas une valeur raisonnable, e.g. de l'ordre de 40 newtons, de préférence de l'ordre de 30 Newtons, et que le débit ne soit pas inférieur ou égal à lml/min. 25 La possibilité de remplir aisément la seringue par aspiration de la formulation au travers d'aiguilles de petit diamètre (par exemple gauge 29G, 30G et 31G ou diamètre : 0,15 à 0,4 mm, longueur : 8 à 20 mm) est également une caractéristique visée au travers de l'abaissement de la viscosité. Cette opération doit, par exemple, être typiquement 30 réalisée dans un temps La viscosité est mesurée selon le mode opératoire Mv décrit ci-après : 35 Mode Opératoire Mv Conformément à la présente invention, la détermination du paramètre important qu'est la viscosité v (en mPa.s à 20 C) peut être réalisée, par exemple, à 20 C à l'aide d'un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4 cm, 2 ). La viscosité v est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10 s-i. La suspension colloïdale de nanoparticules selon l'invention résulte d'une sélection particulière parmi celles décrites de manière générale dans le WO-A-01/37809. Cette sélection particulière a été trouvée après de nombreux essais visant à optimiser les exigences contradictoires du cahier des charges mentionné supra. L'optimisation de la stabilité de la suspension passe par un ajustement du pH de la suspension entre 5,8 et 7,0, de préférence entre 6,0 et 7,0 et, plus préférentiellement encore à une valeur de l'ordre de 6,5. La stabilité dont il est question est, d'une part, une stabilité physicochimique de la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu-Bloc-Glu) et, d'autre part, une stabilité de l'actif insulinique en termes d'efficacité thérapeutique (contrôle de la glycémie). Avantageusement, la formulation reste stable après un stockage de 2 ans à 5 C, par exemple. Conformément à l'invention, les nanoparticules ont une petite taille et présentent plus précisément un diamètre hydrodynamique Dh, mesuré selon le mode opératoire Md, tel que (en nm) dans l'ordre croissant de préférence : 10 Dh 50 et 15 Dh 40. L'une des incidences parmi d'autres de ces choix de taille de particules de poly(Leubloc-Glu) est que la formulation selon l'invention est aisément filtrable sur un filtre stérilisant de 0,2 m de taille de pores, ce qui permet d'obtenir, aisément et à moindre coût, une formulation injectable stérile. Par ailleurs, il apparaît que de façon surprenante, la tolérance locale de ces particules est meilleure que celle de plus grande taille, comme démontré ci-après dans les exemples. Mode opératoire Md : La solution de poly(Leu-bloc-Glu), d'une concentration d'environ 75 g/L, est diluée à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,15 M, de façon à obtenir au final une concentration en poly(Leu-bloc-Glu) comprise entre 0,5 et 4 g/L et, de préférence, égale à 2 g/L. Cette suspension est agitée 1 heure, puis introduite dans la cellule de diffusion d'un appareil de diffusion de la lumière, de type Brookhaven, fonctionnant avec un faisceau laser de longueur d'onde 488 nm et polarisé verticalement. Le diamètre hydrodynamique est calculé à partir de la fonction d'autocorrélation du champ électrique par le méthode des cumulants, comme décrit dans l'ouvrage Surfactant Science Series volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984. Suivant une autre caractéristique préférée, les poly(Leu-bloc-Glu)s sélectionnés 5 conformément à l'invention, présentent la caractéristique suivante : le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon un mode opératoire Ma, est tel que : 10 Ta de préférence, 10 Ta 40 et, plus préférentiellement encore, 12 Ta 25. Mode opératoire Ma : (a) Préparation de solutions aqueuses d'insuline: de l'insuline recombinante humaine 15 lyophilisée est versée dans un volume V de solution d'acide chlorhydrique 0,01 N durant au maximum 15 min. Cette solution est ensuite versée dans un même volume V de solution NaOH 0.01 N. Le pH est ajusté entre 7,2 et 7,4 avec une solution de soude 1 N. La solution est agitée doucement pendant 30 min. La masse d'insuline et le volume V sont calculés en fonction du volume V' souhaité de 20 solution finale afin d'obtenir des concentrations en insuline de 100 UI/ml, 120 UI/ml et 140 UI/ml. (b) Préparation de la formulation d'insuline. La solution concentrée (concentration d'environ 75 g/1 ) de poly(Leu-bloc-Glu) est ajoutée aux solutions d'insuline à raison de 11 mg/ml. Ces mélanges sont dégazés puis placés dans un agitateur à 25 basculement à 25 C pendant 2 heures puis dégazés de nouveau. Le pH est ajusté entre 7,2 et 7,4 avec une solution HC1 1N et les mélanges sont agités (agitateur à basculement) pendant une nuit à température ambiante. (c) Dosage de l'insuline libre : les formulations sont injectées sur une colonne de chromatographie liquide d'exclusion stérique dans des conditions non dissociantes 30 et l'insuline libre est dosée par fluorimétrie. Suivant une variante avantageuse, l'insuline associée aux nanoparticules dans la suspension constituant la formulation de l'invention est une insuline non modifiée. Au sens de l'invention, une insuline non modifiée est une insuline recombinante ou 35 non, n'ayant subi aucune transformation de sa structure primaire, ni aucune modification des groupements latéraux des acides aminés. 10 Avantageusement, la suspension constituant la formulation de l'invention comprend au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols (e.g méta-crésol), le parahydroxybenzoate de méthyle, de propyle, de butyle, ou tout autre conservateur connu de l'homme de l'art (consulter par exemple l'article de L.A. Gatlin et al. in Injectable Drug Development, P.K.Gupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), et leurs mélanges. Le procédé de synthèse du poly(Leu-bloc-Glu) ainsi que le procédé d'obtention des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) en suspension aqueuse s'effectuent, de préférence, selon les modalités et les recommandations décrites dans le WO-A-01/37809. Au lieu d'être en suspension stable en milieu liquide aqueux, les nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline pourraient également exister dans un état solide stable, de préférence sous forme pulvérulente. Ainsi, la présente invention concerne également un solide -de préférence pulvérulent-, caractérisé en ce qu'il comprend des nanoparticules à base de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline et en ce qu'il est obtenu à partir de la suspension liquide qui est définie ci-dessus et qui constitue au moins une partie de la formulation de l'invention. Cette obtention est effectuée par tout moyen connu et approprié tel que la lyophilisation, l'atomisation ou le séchage. Le procédé de préparation de la formulation liquide injectable d'insuline longue action 25 fait intervenir du poly(Leu-bloc-Glu) non chargé en insuline et consiste essentiellement - d'une part, i. à mélanger, en milieu liquide aqueux, au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et de l'insuline, de préférence sous agitation, ii. et à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0; -d'autre part, à ajuster l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: • 270 Osm 600; • la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v 15. 30 35 • la concentration (en mg/mL) enpoly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65; - et, éventuellement à filtrer la suspension ainsi obtenue. De préférence, l'ajustement de l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium est effectué de telle sorte que la concentration en CMg2+ (en mole/L) soit la suivante: 0,06 CMgz+ Avantageusement, l'association de l'insuline aux nanoparticules lors de l'étape (i) est effectuée par mise en oeuvre d'au moins l'une des méthodes suivantes : - Une première méthode consiste essentiellement à mettre en présence une phase aqueuse contenant l'insuline avec la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu); - Une deuxième méthode consiste essentiellement à mettre en présence (en les mélangeant) le poly(Leu-bloc-Glu) à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant l'insuline e.g. à une concentration entre 100 et 200 UI/ml; - Une troisième méthode consiste essentiellement à mélanger l'insuline à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant le poly(Leu-bloc-Glu). 20 Plus précisément, dans la première méthode, une suspension de nanoparticules à pH neutre et isotonique est reconstituée à une concentration de 60 mg/ml ou plus (selon la concentration voulue dans la suspension finale). Une solution d'insuline concentrée (typiquement entre 500 et 600 UI/ml û pH compris entre 7 et 8 - isotonique) est alors 25 préparée extemporanément à partir de poudre d'insuline (dissolution en milieu acide puis neutralisation). Les deux solutions sont mélangées par agitation pendant quelques minutes et cette phase est éventuellement suivie d'une phase de maturation de quelques heures. Le pH est ensuite ajusté à une valeur comprise entre 5,8 et 7,0. 30 Il importe de veiller au respect d'au moins l'une des caractéristiques essentielles de l'invention, à savoir l'établissement d'un pH compris entre 6,0 et 7,0. Ce facteur participe de façon importante à la stabilité de la suspension de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu). L'ajustement du pH peut s'effectuer par tout moyen connu et approprié, à savoir notamment par acidification, par exemple, de la façon suivante : - 1- ajout d'acide chlorhydrique 0,1N dans la suspension chargée d'insuline (il se produit alors une précipitation intermédiaire qui disparaît au bout d'une heure d'agitation environ) - 2- ajout d'acide acétique O,1N dans la suspension chargée d'insuline (pas de précipitation intermédiaire) L'ajout -2-d'acide acétique est préféré. Lors de la préparation de la formulation selon l'invention, on peut éventuellement ajouter des excipients, et au besoin réajuster le pH à une valeur comprise entre 5,8 et 7,0, et, éventuellement stériliser la suspension ainsi obtenue par filtration sur des pores de 0,2 microns. Ces autres excipients peuvent être notamment au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols (e.g méta-crésol), les parahydroxybenzoates de méthyle, de propyle, ou de butyle, ou tout autre conservateur connu de l'homme de l'art (consulter par exemple l'article de L.A. Gatlin et al. in Injectable Drug Development, P.K.Gupta eds Interpharm Press, Denver Colorado, 1999), et leurs mélanges. Les conditions de mélange aussi bien pour la régulation du pH que pour l'addition d'excipients, sont classiques et à la portée de l'homme du métier notamment en termes de température, pression et agitation. Finalement, la suspension liquide peut être transformée en un solide pulvérulent par 25 toute méthode classique connue de l'homme de l'art, telle que par exemple la lyophilisation, l'atomisation ou le séchage. De manière plus générale, l'invention vise également un procédé de préparation d'une formulation injectable de protéine(s) caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement 30 - - d'une part, à mélanger au moins une protéine à un milieu liquide aqueux, à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0; - - et d'autre part, à ajuster l'osmolarité de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: 35 • 270 Par "protéine", on désigne tout polyamino-acide, par exemple oligopeptide, polypeptide [e.g poly(Leu-bloc-Glu)], protéine stricto sensu [e.g. insuline]. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les applications pharmaceutiques et vétérinaires de la suspension poly(Leu-bloc-Glu)-insuline. L'application essentielle est le traitement du diabète, et plus précisément du diabète de type I et II. 15 Ainsi, l'invention a également pour objet un médicament caractérisé en ce qu'il comprend de la formulation comprenant une suspension colloïdale poly(Leu-bloc-Glu)-insuline, cette formulation étant telle que définie ci-dessus et/ou de la formulation obtenue par le procédé lui aussi décrit supra et/ou du solide pulvérulent tel défini ci-dessus. 20 Il s'agit de préférence d'un médicament destiné au traitement du diabète et plus précisément du diabète de type I et II. Suivant une disposition avantageuse de l'invention, le médicament qu'elle concerne est assimilable à une formulation liquide injectable d'insuline humaine longue action 25 susceptible d'assurer au patient diabétique, après une injection sous-cutanée, une concentration basale en insuline, pendant au moins 24 heures, en régime d'injections répétées. La concentration basale d'insuline doit s'entendre dans le présent exposé comme une 30 concentration typique dans le sang observée chez l'individu sain, soit 30 picomoles/l. L'invention concerne en outre une méthode de traitement du diabète, en particulier du diabète de type I et II, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement à administrer au patient le médicament susvisé à base d'une formulation comprenant une suspension 35 colloïdale aqueuse stable de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline, de préférence non modifiée. 10 Il s'agit préférentiellement d'une administration journalière par injection, de préférence sous-cutanée. Le médicament selon l'invention peut également se présenter sous la forme d'un solide pulvérulent décrit ci-avant et, éventuellement du liquide aqueux pour la préparation de la suspension. Il en résulte que l'invention couvre également une présentation galénique comprenant, d'une part, du solide pulvérulent tel que défini supra et, d'autre part, de manière séparée, du liquide aqueux pour la reconstitution, avant l'administration, de la suspension constituant la formulation selon l'invention. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention dans ses différents aspects produit/procédé/application. Ces exemples illustrent la préparation de la formulation selon l'invention à base de suspension de nanoparticules de poly(Leubloc-Glu) chargées en insuline, de même qu'ils présentent les caractéristiques de structure et les propriétés de cette formulation, en la comparant avec des formulations poly(Leu-bloc-Glu)-insuline selon l'art antérieur. EXEMPLES Exemple 1 û Préparation d'une suspension d'insuline longue action 1.1- préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules de poly(L leucine bloc L glutamate de sodium) (P) intermédiaire concentrée à 60 mg/g : La préparation de la suspension est faite sous hotte à flux laminaire ou en pièce stérile. Dans un flacon de verre on introduit successivement 159 g de polymère poly(Leu-bloc-Glu) en solution dans l'eau à 73,9 mg/g. On ajoute ensuite successivement 1,9 g de NaCl 30% et 0,1 g de NaOH 1N sont ajoutés à la solution pour ajuster le pH à 7,4 et l'osmolarité à 300 mOsm/kg et régler la concentration en polymère à 60,5 mg/ml. 1.2-préparation d'une solution d'insuline intermédiaire à 590 UI/ml : 7 g d'insuline humaine recombinante (poudre) d'activité 27,5 UI/g et contenant 3,8% d'humidité sont introduits dans un flacon en verre, 149,5 g d'eau pour injection sont rajoutés et l'insuline est dispersée sous agitation magnétique lente. 51,20 g d'HC10,1N sont ajoutés jusqu'à obtention d'une solution limpide d'insuline acide. 7,7 g de soude 0,1N sont alors ajoutés de façon à obtenir une solution finale ayant un pH compris entre 7,2 et 7,6. 9,4 g de NaCl 30% sont ajoutés pour ajuster l'osmolarité. La solution est alors diluée par ajout de NaCl 0.9% (15,1g) afin d'atteindre une concentration finale en Insuline de 590 UI/ml La solution est filtrée sur membrane polyéthersulfone 0,2 m avant mélange avec la suspension de nanoparticules. 1.3 - préparation d'une solution d'excipients (phénol 140 mM ; m-crésol 140 mM, acide acétique 0,1N) : Dans un flacon de 1 1 on rajoute successivement : - 13,2 g de phénol (M=94 g/mol) - 100 g d'eau - 15,1 g de m-crésol (M=108 g/mol) - 100 g d'acide acétique 1N - 771,7 g d'eau. La solution est agitée au moins une demi-heure jusqu'à obtention d'une solution limpide puis filtrée sur membrane 0,2 .im PVDF (polyfluorovinylidène)ou PTFE (polytétrafluoroéthylène). 1.4- préparation d'une formulation comparative témoin négatif (Formulation compA) comprenant la suspension colloïdale d'insuline longue action P de 1.1 supra: (Osmolarité Osm = 300 mOsm; pH=6,5; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 42 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml) 800 g de suspension P sont introduits dans un flacon de 1 litre. Sous agitation magnétique lente, 196 g de solution à 590 UI/ml d'insuline sont rajoutés. L'agitation est maintenue pendant 15 heures à 25 C. 171 g de solution d'excipients sont alors rajoutés au mélange et la solution est laissée à agiter pendant 1 heure. La formulation ainsi obtenue est filtrée sur membrane polyéthersulfone 0,2 m.35 Exemple 2 û Préparation d'une formulation comparative témoin négatif (Formulation compB) comprenant d'une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1 : (Osmolarité Osm = 450 mOsm; pH = 6,5; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 5 42 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml) La formulation B est préparée de manière similaire à l'exemple 1, la concentration en polymère étant ajustée à 60 mg/ml et l'osmolalité Osm à 507 mOsm/kg à l'étape 1.1. Exemple 3 ù Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation C) 10 comprenant d'une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1: (Osmolarité Osm = 450 mOsm; pH=6,5; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 42 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml) La formulation C est préparée de manière similaire à l'exemple 1, l'osmolalité Osm étant ajustée à 507 mOsm/kg à l'étape 1.1, par ajout d'une solution de MgC12 à 32%. 15 Exemple 4 ù Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation compD) comprenant une suspension colloïdale sans insuline: (Osmolarité Osm = 450 mOsm; pH=7,4; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 45 mg/ml; Concentration en insuline C insulin = 0 mg/ml) 20 La préparation de la suspension est faite sous hotte à flux laminaire ou en pièce stérile. Dans un flacon de verre on introduit successivement 65,6 g de polymère poly(Leubloc-Glu) en solution dans l'eau à 73,5 mg/g. On ajoute ensuite successivement 2,21 g de NaCl 30% et 0,53 g de NaOH 1N sont ajoutés à la solution pour ajuster le pH à 7,4 et l'osmolarité à 450 mOsm/kg. On ajoute ensuite 2,3 g NaCl 30% et 37,88 g d'eau 25 injectable afin de régler la concentration en polymère à 45 mg/ml tout en maintenant l'osmolalité à 450 mOsm/kg. Exemple 5ù Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation E) comprenant une suspension colloïdale sans insuline: 30 (Osmolarité Osm = 450 mOsm; pH=7,4; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 45 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 0 mg/ml) La préparation de la suspension est faite sous hotte à flux laminaire ou en pièce stérile. Dans un flacon de verre on introduit successivement 64,5 g de polymère poly(Leubloc-Glu) en solution dans l'eau à 73,5 mg/g. On ajoute ensuite successivement 2,1 g 35 de MgC12 32% et 0,63 g de NaOH 1N sont ajoutés à la solution pour ajuster le pH à 7,4 et l'osmolarité à 450 mOsm/kg. On ajoute ensuite 1,35 g de MgC12, 0,96 g de NaCl 30% et 37,32 g d'eau injectable afin de régler la concentration en polymère à 45 mg/ml tout en maintenant l'osmolalité à 450 mOsm/kg. Exemple 6û Préparation d'une formulation selon l'invention (Formulation F) comprenant une suspension colloïdale d'insuline longue action P de l'exemple 1.1: (Osmolarité Osm = 450 mOsm; pH = 6,5; Concentration en poly(Leu-bloc-Glu) Cpol = 45 mg/ml; Concentration en insuline C insuline = 3,5 mg/ml) La formulation F est préparée de manière similaire à l'exemple 1, la concentration en polymère étant ajustée à 64, 7 mg/ml et l'osmolalité Osm à 535 mOsm/kg à l'étape 1.1. 10 Exemple 7û Caractéristiques des formulations compA, compB, C, compD, E, F d'insuline longue action selon l'invention (cf Tableau 1). Les mesures de viscosité sont réalisées à 20 C sur un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4cm, 2 ). La viscosité est mesurée 15 pour un gradient de cisaillement de 10 s-i. Tableau 1 [polymère] Osmolalité Viscosité [NaCl] [MgC12] [Insuline] mg/ml mOsm/kg mPa.s mol/L mol/L UI/mL Formulation 42 306 15 0,085 0 97 compA Formulation 42 450 10 0,157 0 102,7 compB Formulation C 42 472 4 0,024 0,085 100 Formulation 44,4 448 15 0,168 0 0 compD Formulation E 45, 5 452 5 0,023 0,09 0 Formulation F 44,2 462 5 0,027 0,08 104,3 20 Le chlorure de magnésium utilisé conformément à l'invention (formulations C, E, F) est particulièrement avantageux, car à osmolalité semblable, il permet une réduction plus importante de la viscosité : 4 et 5 mPa.s respectivement pour les formulations C, E, F versus 10 et 15 mPa.s respectivement pour les formulations compB et compD. Exemple 8 - Temps de remplissage des formulations compA, compB et C. Le temps de remplissage d'une seringue à insuline au travers d'une aiguille de gauge 30 et de longueur 8 mm est mesuré pour les différentes formulations décrites dans les exemples précédents. Le volume de remplissage est de 0,5 ml correspondant à 50UI/ml. On obtient les résultats suivants présentés dans le Tableau 2 ci-dessous: Tableau 2 N Formulation Temps de remplissage (s) compA 50 compB 35 C 15 L'utilisation d'une solution hyperosmotique ajustée en chlorure de magnésium (formulation C) permet de ramener le temps de remplissage d'une seringue à un temps suffisamment court pour permettre aisément un usage quotidien par les patients. 15 Exemple 9 - Temps d'injection des formulations compA, compB et C C. Les produits à base d'insuline sont injectés en sous cutané soit au moyen de seringues à insulines, soir au moyen de stylo à insuline. Le temps d'injection d'une dose de 50UI pour différentes formulations est mesuré pour une force constante de 20 newtons. Le 20 stylo utilisé est un NOVOPEN III, utilisant des cartouches de 3 ml et des aiguilles de 31 G thin wall de marque Becton Dickinson. Tableau 3 N Formulation Temps d'injection d'une dose de 50UI (s) compA > 60 compB 20 C 12 L'utilisation d'une solution hyperosmotique ajustée en chlorure de magnésium (formulation C) permet de ramener le temps d'injection d'une seringue à un temps suffisamment court pour permettre aisément un usage quotidien par les patients. 25 Exemple 10 -Tolérance locale ù Formulations CompD, E et F Le modèle utilisé est un modèle in vivo de peau de porc, dont la grande sensibilité par rapport à une peau humaine a été montrée pour le type de produit étudié. Les tolérances locales des formulations CompD, E et F ont été comparées dans ce 5 modèle. La formulation CompD comprend : • 45 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) • une osmolalité de 450 mosm ajustée par du chlorure de sodium et est préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. 10 La formulation E comprend : • 45 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) • une osmolalité de 450 mosm ajustée par du chlorure de magnésium et est préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5 ci-dessus. La formulation F selon l'invention comprend : 15 • 100 UI/ml d'insuline recombinante humaine • 45 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) • 21 mM de phénol et de métacrésol • une osmolalité de 450 mosm ajustée par du chlorure de magnésium et est préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 6 ci- dessus. 20 Une formulation de NaCl/MgCL2 450 mosm est utilisé en tant que référence négative dans l'étude. Les différents produits ont été injectés en sous-cutané dans des conditions calibrées, sous un volume de 0,50 ml, sur la peau du ventre de 9 porcs domestiques (Seghers hybrid x Landrace pesant de 50 à 60 kg). Les signes cliniques ù érythème et oedème et 25 indurationù ont ensuite été évalués durant les trois jours qui suivent l'injection. La référence négative (NaCl/MgCL2 450 mosm) n'a pas provoqué de réaction clinique. La formulation CompD a provoqué une réaction locale faible et transitoire. La réaction disparaît en 3 jours environ. Les formulations E et F ont provoqué une réaction locale du même type et de même 30 intensité que celle observé pour la formulation CompD. Ainsi, dans ce modèle très sensible, la formulation E ajustée en chlorure de magnésium présente une tolérance locale équivalente à celle de la formulation CompD ajustée en chlorure de sodium. Cette bonne tolérance locale est confirmée sur la formulation F contenant du chlorure de magnésium et de l'insuline. Cette tolérance locale est 35 parfaitement adaptée à l'administration quotidienne du médicament. Exemple 11 ù Essai in vivo ù Formulations compA et C : Une étude a été réalisée de manière à comparer la pharmacodynamie (i.e. la glycémie) de la formulation compA, correspondant à l'exemple 1 ci-dessus et d'une formulation de poly(Leu-bloc-Glu) (formulation C selon l'invention) contenant du chlorure de magnésium décrite dans l'exemple 3. La formulation compA comprend : • 100 UI/ml d'insuline recombinante humaine 10 • 42 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) • 21 mM de phénol et de métacrésol et est préparée selon l'exemple 1 ci-dessus. La formulation C selon l'invention comprend : 15 • 100 UI/ml d'insuline recombinante humaine • 42 mg/ml du polymère poly(Leu-bloc-Glu) • 21 mM de phénol et de métacrésol et est préparée selon l'exemple 3 ci-dessus. 20 Les formulations compA et C ont été administrées par la voie sous-cutanée à la dose 1 UI/kg chez 12 et 16 chiens Beagle, respectivement, à jeun depuis 16 heures. Les concentrations plasmatiques en glucose ont ensuite été évaluées (automate Advia 1650, Bayer Diagnostics) sur une période de 32 heures après administration afin de déterminer les paramètres pharmacodynamiques Cmin, AUC0_32h et T50%AUC, 25 présentés dans le Tableau 4. Les écarts types sont indiqués entre parenthèses dans le Tableau 4. • SSCo_32h, exprimé en pourcentages du niveau basal de glucose dans le plasma, représente la surface entre le profil de glucose plasmatique en fonction du temps et le niveau basal de glucose plasmatique, de 0 à 32 heures. Ce paramètre est 30 calculé par la méthode dite des trapèzes. • Cmin, exprimé en pourcentages du niveau basal de glucose dans le plasma, représente la concentration minimale observée de glucose dans le plasma • T50%SSC, exprimé en heures, représente le temps nécessaire pour obtenir 50% de la SSCO-32h. 35 Tableau 4 N Formulation Cmin AUCO_32h T50%Auc (%) (%*h) (h) A 38 (8) 827 (205) 9 (2) C 40 (9) 769 (166) 9 (2) On constate que les formulations compA et C selon l'invention permettent l'obtention de paramètres pharmacodynamiques similaires. La formulation C selon l'invention présente donc une efficacité identique à la formulation compA, tout en ayant des temps de remplissage et d'injection significativement améliorés par rapport à CompA. 23 REVENDICATIONS 1. Formulation injectable d'insuline longue action comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules à base d'au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et chargées en insuline, le pH de cette suspension étant tel que :6,0 pH 7,0; caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de magnésium en quantité telle que : ^ l'osmolarité Osm (en mOsmol) est telle que: 270 Osm 600, ^ la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, est 10 telle que: v 15. ^ la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) est comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65. 2. Formulation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le contre-anion du 15 Mg2+ est choisi dans le groupe comprenant Cr, SO4-- et leurs mélanges. 3. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les particules du poly(Leu-bloc-Glu) retenu ont un diamètre hydrodynamique moyen Dh exprimé en nanomètres (nm) et mesuré selon un mode opératoire Md, tel que : 10Dh50 de préférence, 15 Dh 40. 4. Formulation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport massique insuline/poly(Leu-bloc-Glu), exprimé en %, est tel que : 6 insuline/poly(Leu-bloc-Glu) 10. 5. Formulation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le taux maximal de chargement Ta des nanoparticules avec l'insuline, exprimé en % de masse d'insuline associée par rapport à la masse de poly(Leu-bloc-Glu) et mesuré selon 30 un mode opératoire Ma, est tel que : Ta de préférence, 10 Ta 40 et, plus préférentiellement encore, 12 Ta 25. 35 6. Formulation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'insuline est une insuline humaine non modifiée. 20 25 7. Formulation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un conservateur, de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : les phénols, les crésols, les parahydroxybenzoates de méthyle, de propyle, ou de butyle et leurs mélanges. 8. Solide pulvérulent caractérisé en ce qu'il comprend des nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu) chargées en insuline et en ce qu'il est obtenu à partir de la formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Procédé de préparation d'une formulation injectable d'insuline longue action, en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, cette formulation comprenant une suspension colloïdale, aqueuse et stable de nanoparticules d'au moins un poly(L-leucine-b-L glutamate de sodium) ci-après dénommé poly(Leu-bloc-Glu), chargées en insuline, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement - d'une part, i. à mélanger, en milieu liquide aqueux, au moins un poly(Leu-bloc-Glu) et de l'insuline, de préférence sous agitation, ii. et à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0; -d'autre part, à ajuster l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: • 270 Osm 600, • la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v 15. • la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65; - et, éventuellement à filtrer la suspension ainsi obtenue. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'ajustement, à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de l'osmolarité Osm (en mOsmol) de la formulation est effectuée de telle sorte que la concentration en CMg2+ (en mole/L) soit la suivante: 0,06 11. Procédé de préparation d'une formulation injectable de protéine(s) caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : - d'une part, à mélanger au moins une protéine à un milieu liquide aqueux, à ajouter éventuellement des excipients, au besoin à ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,0 et 7,0; - et d'autre part, à ajuster l'osmolarité de la formulation à l'aide d'au moins un sel de magnésium, de telle sorte que: • 270 Osm 600, • la viscosité v (en mPa.s ), mesurée selon un mode opératoire Mv, soit telle que: v 15; • la concentration (en mg/mL) en poly(Leu-bloc-Glu) soit comprise entre 30 et 70, de préférence entre 38 et 65; - et, éventuellement à filtrer le mélange ainsi obtenu. 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'association de l'insuline aux nanoparticules lors de l'étape (i) est effectuée par mise en oeuvre d'au moins l'une des méthodes suivantes : - une première méthode consiste essentiellement à mettre en présence une phase aqueuse contenant l'insuline avec la suspension colloïdale de nanoparticules de poly(Leu-bloc-Glu); - une deuxième méthode consiste essentiellement à mettre en présence (en les mélangeant) le poly(Leu-bloc-Glu) à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant l'insuline ; - une troisième méthode consiste essentiellement à mélanger l'insuline à l'état pulvérulent avec une phase aqueuse contenant le poly(Leu-bloc-Glu). 13. Médicament caractérisé en ce qu'il comprend de la formulation injectable d'insuline longue action selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et/ou de la formulation obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 et/ou du solide pulvérulent selon la revendication 8. 14. Médicament selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement du diabète. 15. Médicament selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'assurer au patient diabétique, après une injection sous-cutanée, un niveau basal d'insuline pendant au moins 24 heures. 16. Médicament selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce qu'il est constitué par une présentation galénique comprenant, d'une part, du solide pulvérulent selon la revendication 8 et, d'autre part, de manière séparée, du liquide aqueux pour la reconstitution, avant l'administration, de la formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et/ou de la formulation obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12.