Brevet FR2894970A1 — publié le 20070622

La presente invention concerne le domaine des particules composites. Plus particulierement, la presente invention a pour objet un procede de preparation de particules composites par encapsulation d'emulsion appauvrie en phase organique par polymerisation, ladite emulsion consistant enou comprenant des gouttelettes d'emulsion inorganique comprenant une phase organique et des nanoparticules inorganiques distribuees dans ladite phase organique, ledit procede etant caracterise en ce que la polymerisation est mise en oeuvre en utilisant, A. titre de monomere de polymerisation, de 60 a 100% d'au moins un agent de reticulation et de 0 a 40% d'au moins un monomere hydrophobe, etant entendu qu'aumoins 95% du ou des agents de reticulation sont hydrophobes, ainsi que les nouvelles particules composites ainsi obtenues. L'encapsulation est un procede utilise pour 1'obtention de particules solides enrobees par au moins une couche de polymere. Un tel systeme est suppose presenter des proprietes differentes de la somme des proprietes des composants individuels, en particulier de meilleures proprietes mecaniques. Les procedes d' encapsulation ont notamment ete utilise dans le domaine de la preparation de pigments, d' encres, de plastiques et de peintures. Une des applications les plus importantes de particules et pigments encapsules est trouvee dans le domaine des peintures en emulsion. Mais quand les particules inorganiques obtenues par encapsulation sont magnetisables, cela ouvre des voies particulieres dans le domaine de la biologie, par exemple grace au couplage de proteins ou d'anticorps sur les particules encapsulees pour une utilisation dans des tests de diagnostic. De telles particules sont egalement utilisees dans des procedes de separation biochimique. D'une maniere generale, les particules encapsulees presentent un interet comme support, vecteur ou vehicule dans les domaines de 1'ingenierie biologique, du diagnostic et de la pharmacie. A cet effet, elles ont ete utilisees dans le diagnostic medical comme support solide pour des macromolecules biologiques. Les particules colloidales presentent plusieurs avantages par rapport aux supports solides traditionnels, tels que tubes et plaques. En effet, elles permettent de disposer d'une grande surface pour des interactions, elles diffusent dans le volume, ce qui augmente la cinetique de capture, et elles sont facilement modifiables chimiquement par introduction de groupements fonctionnels susceptibles de reagir avec d'autres molecules ou macromolecules naturelles, synthetiques ou biologiques, telles que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des proteines, des polypeptides, des polynucleotides, des acides nucleiques, des fragments d'acides nucleiques, des enzymes, ou des molecules chimiques telles des catalyseurs, des molecules cages, des chelatants, voire des colloides biologiques, tels que des bacteries, des cellules, des virus et des parasites. Parmi les particules colloidales, les latex magnetisables ont suscite un grand interet dans le domaine analytique et sont utilises par exemple comme moyen pour separer, concentrer et/ou detecter des analytes, tels que des antigenes, des anticorps, des molecules biochimiques, des acides nucleiques, les bacteries, les virus, les parasites et autres. Il est possible de classer les particules colloidale s en trois categories : les petites particules ayant un diametre inferieur a 50 nm, les grosses particules ayant un diametre strictement superieur a 1000 nm et les particules intermediaires d'un diametre compris entre 50 et 1000 nm. Pour que les particules magnetiques soient considerees comme de bons candidats, en particulier pour une application diagnostique, elles doivent repondre a certains criteres. Une bonne teneur en charge inorganique (i.e. oxyde de fer), it est preferable que la charge magnetique soit repartie de fawn relativement homogene dans le coeur et d'une particule a 1'autre. La charge magnetique doit 'are parfaitement encapsulee afin d'eviter le relargage de la charge magnetique. Elles ne doivent pas s'agreger de maniere irreversible sous 1'action d'un champ magnetique, ce qui signifie qu'elles puissent etre redispersees facilement, rapidement une fois le champ magnetique supprime. De meme, elles doivent presenter une densite physique relativement faible pour reduire le phenomene de sedimentation. Avantageusement, elles doivent presenter une distribution granulometrique etroite pour une separation homogene sous faction d'un champ magnetique. On parle encore de particules monodisperses ou isodisperses. Ainsi, en raison de leur taille et de leur densite, les grosses particules magnetiques en suspension dans une phase liquide ont tendance a sedimenter rapidement. A contrario, les petites particules magnetiques ont tendance a rester en suspension du fait de leur mouvement Brownien induit par 1' agitation thermique et sont difficilement separables (voire pas du tout) par un aimant, en particulier si le champ magnetique applique est relativement faible. Elles ne sont donc pas bien appropriees pour les utilisations ci-dessus. Ii existe donc un interet evident a produire des particules composites presentant une taille intermediaire entre 50 et 1000 nm qui a la fois pallient les inconvenients precites et repondent notamment aux criteres etablis ci-dessus. Mais l'invention n'est pas limitee a des particules composites magnetisables, comme decrit ci apres. La demande de brevet EP-A-O 390 634 decrit des microspheres composites magnetisables de polymere vinylaromatique reticule hydrophobe d'un diametre de 1'ordre de 50 a 10 000 nm et comprenant un coeur solide constitue de particules magnetisables et d'une ecorce constituee d'un copolymere hydrophobe derive d'au moins un monomere vinylaromatique hydrophobe et d' au moins un polymere emulsifiant polyethyleniquement insature soluble dans le ou les monomeres vinylaromatiques et susceptible de reticuler avec le ou lesdits monomeres. Toutefois, bien qu'elles puissent repondre a 1'exigence de la taille, les particules presentent 1'inconvenient de ne pas avoir une repartition homogene de la charge magnetique qui est localisee a 1'interieur du coeur. Par ailleurs, et comme cela ressort a 1'evidence des figures annexees, les particules ne sont pas homogenes en taille. 11 s'agit donc d'un ensemble de particules polydisperses qui devront etre triees par application d'un champ magnetique pour ne retenir que les particules de taille souhaitees. On peut egalement citer les particules Dynabeads (nom commercial, Invitrogen). Ces particules sont des microspheres constituees d'un coeur poreux de polystyrene et d'oxydes de fer. Les oxydes sont deposes dans les pores disponibles par precipitation des sels ferreux et ferriques en milieu basique. Afin d'eviter le relargage des oxydes de fer, 1'encapsulation est realisee par introduction d'une enveloppe d'un autre polymere. Les particules elaborees via ce procede presentent un diametre respectivement de 2,8 m (particules M280) et de 4,5 m (particules M450). Elles sont considerees comme des particules isodisperses, mais, en raison de leur taille eel/6e, presentent les inconvenients precites, principalement le phenomene de sedimentation. De plus, leur surface specifique est faible. La demande de brevet WO01/33223, deposee par rune des Demanderesses, decrit des nanospheres composites de diametre compris entre 50 et 1000 nm, comprenant un cceur essentiellement liquide constitue d'une phase organique et de nanoparticules inorganiques distribuees a 1'interieur de la phase organique, et une enveloppe constituee d'un polymere hydrophile issu de la polymerisation d'au moins un monomere hydrosoluble. Ces particules sont isodisperses, de la taille appropriee, mais ont pour inconvenient qu'elles ne sont pas stables dans des solvants organiques. La demande de brevet WO03/004559, egalement deposee par rune des Demanderesses, decrit des particules composites comprenant un cceur en un polymere hydrophobe formant la matrice et des nanoparticules inorganiques distribuees dans ladite matrice, ledit cceur etant au moins entoure par un copolymere amphiphile pour la stabilisation du cceur et permettant d'introduire des fonctions reactives a la surface des particules. Comme precedemment, ces particules sont isodisperses, de la taille appropriee, mais ont pour inconvenient qu'elles ne sont pas stables dans des solvants organiques. Selon 1'invention, on dispose maintenant contre toute attente de nouvelles 15 particules composites permettant de pallier tous les inconvenients cites precedemment et qui repondent aux criteres suivants : particules spheriques isodisperses, particules ayant une morphologie homogene tendant vers une structure du type cceur/ecorce (cceur entoure d'une ecorce polymere), 20 particules possedant une charge inorganique repartie de maniere homogene dans le cceur, particules de taille intermediaire, a savoir ayant un diametre compris entre 50 et 1000 nm, et de preference entre 100 et 1000 nm particules fonctionnalisees ou fonctionnalisables, 25 leur charge inorganique peut etre magnetique ou magnetisable, particules obtenues par un procede de synthese original, simple et controlable, particules stables dans des solvants polaires tels que le DMSO (dimethylsulfoxyde), DMF (dimethylformamide), l'acetonitrile et les alcools. Ainsi, la presente invention a pour objet un procede de preparation de particules 30 composites par encapsulation d'anulsionappauvrie enphase organique par polymerisation, ladite emulsion consistant en ou comprenant des gouttelettes d'emulsion inorganique comprenant une phase organique et des nanoparticules inorganiques distribuees dans ladite phase organique, ledit procede etant caracterise en ce que la polymerisation est mise en oeuvre en utilisant, a titre de monomere de polymerisation, de 60 a 100% d'au moins un agent de reticulation et de 0 a 40% d'au moins un monomere hydrophobe, etant entendu qu'au moins 95% du ou des agents de reticulation sont hydrophobes. Les particules composites obtenues par le procede de l'invention sont nouvelles et constituent un autre objet de l'invention. Enfin, l'invention a egalement pour objet l'utilisation de ces nouvelles particules composites dans des applications biomedicales et en particulier diagnostiques. Les inventeurs ont donc mis au point pour la premiere fois un nouveau procede de preparation de nouvelles generations de particules qui sont, contre toute attente, tres stables en milieu aqueux dans lequel elles sont preparees mais egalement de plus en plus stables a tres stables dans les solvants organiques dans lesquels elles sont transferees ou transferables, 1'augmentation de la stabilite etant fonction de l'utilisation croissante d'agent de reticulation hydrophobe. De plus, le procede de l'invention permet d'elaborer des particules composites ayant une morphologie homogene tendant vers une structure du type coeur/ecorce, cette derniere structure etant obtenue lorsqu'on utilise 100% d'agent de reticulation hydrophobe a titre de monomere de polymerisation. L'avantage d'une telle structure avec une ecorce polymere est que celle-ci encapsule parfaitement la charge inorganique. La caracteristique du procede reside dans le fait d'utiliser majoritairement (au moins 95% de 60 a 100%) au moins un agent de reticulation hydrophobe comme monomere principal en presence d'emulsion appauvrie en phase organique. Par emulsion appauvrie en phase organique, on entend une emulsion comprenant une phase inorganique dispersee dans une phase organique, ladite phase organique representant de 10 mg a 200 mg par gramme d'emulsion seche, de preference au plus 100 mg et de preference encore au plus 50 mg par gramme d'emulsion seche. Comme indique precedemment, 1' augmentation de la quantite d'agent de reticulation hydrophobe a titre de monomere de polymerisation dans le procede de l'invention permet d'ameliorer la stabilite dans les solvants organiques des particules composites obtenues par ledit procede et d'ameliorer leur structure eu egard notamment a leur homogenate. Ainsi, le procede de l'invention utilise au moins 70%, de preference au moins 80%, de preference encore au moins 90% d'au moins un agent de reticulation. On prefere encore davantage utiliser au moins 95% et meme 100% d'au moins un agent de reticulation, ce qui constitue un mode de realisation de l'invention. On prefere egalement utiliser 100% d'agent de reticulation hydrophobe. Le procede de l'invention peut mettre en oeuvre un ou plusieurs agents de reticulation dans la mesure ou le ou les agents de reticulation majoritaires (au moins 10 95%) sont hydrophobes. Par agent de reticulation hydrophobe, on entend toute molecule ou macromolecule possedant au moins deux liaisons vinyliques et presentant une solubilite dans 1'eau inferieure a 0,3g/l. Des exe mples d' agent de reticulation hydrophobe comprennent les agents de 15 reticulation a base de derive styrenique, tel que le divinylbenzene, et ses derives et tout agent de reticulation presentant des groupements hydrophobes. Selon un mode de realisation de l'invention, le procede met en oeuvre au moins un agent de reticulation, de preference au moins un desdits agents de reticulation est un agent de reticulation a base de derive styrenique. Avantageusement, 1agent de 20 reticulation est le divinylbenzene. Selon un autre mode de realisation de l'invention, le procede met en oeuvre un seul agent de reticulation, de preference un agent de reticulation a base de derive styrenique, et de preference le divinylbenzene. Lorsque le procede met en oeuvre au moins deux agents de reticulation, et de 25 preference deux agents de reticulation, au moins run des deux est un agent de reticulation fluorescent ou bien un agent de reticulation hydrophile. Les agents de reticulation hydrophiles (non hydrophobes) comprennent les derives acrylamides, tels que le methylenebisacrylamide et 1'ethyleneglycodimethacrylate, et tout agent de reticulation presentant des groupements 30 hydrosolubles. A titre d' agent de reticulation fluorescent, on peut citer les derives du pyrene, les derives de la fluoresceine portant a ses extremites deux fonctions methacrylates, comme fluoresceinedimethacrylate (Polyfluor 511), le naphtalenedimethacrylate. De tels agents de reticulation fluorescents sont disponibles chez Polysciences (US coporation). Selon un mode de realisation particulier de l'invention, le procede met en oeuvre au plus 5% d'un agent de reticulation hydrophile, de preference a base d'acrylamide, ou d'un agent de reticulation fluorescent. L'ajout d'un agent de reticulation fluorescent dans le procede de l'invention permet d'obtenir des particules fluorescentes en une seule etape et leur utilisation ulterieure dans des applications ou un marquage est approprie, comme dans les applications biomedicales telles que le diagnostic. L'ajout d'un agent de reticulation hydrophile, notamment a base d'acrylamide, dans le procede de l'invention permet 1'obtention de particules de surface hydrophile en une seule etape et leur utilisation ulterieure dans des applications ou une liaison avec un partenaire de liaison est approprie, comme dans les applications biomedicales telles que le diagnostic. Selon un mode de realisation de l'invention, le procede de l'invention met en oeuvre deux agents de reticulation, run etant un agent de reticulation hydrophobe, de preference le divinylbenzene, en quantite majoritaire, et 1'autre etant un agent de reticulation fluorescent en quantite minoritaire, de preference a raison de 1%, ou bien run etant un agent de reticulation a base de derive styrenique, de preference le divinylbenzene, en quantite majoritaire, et 1'autre etant un agent de reticulation hydrosoluble (a base d'acrylamide) en quantite minoritaire, de preference a raison de 5%. Le procede de l'invention met egalement en oeuvre au plus 40% d'au moins un 25 monomere hydrophobe. Par monomere hydrophobe, on entend un monomere presentant une seule liaison vinylique et une solubilite dans 1'eau inferieure a 0,5 g/l. Des exemples de tels monomeres comprennent les monomeres styreniques ou derives, le styrene etant particulierement preferes. 30 Lorsque dans le procede de l'invention, on n'utilise ni un agent de reticulation fluorescent, ni un agent de reticulation hydrophile, on peut utiliser un monomere fluorescent en quantite minoritaire pour marquer les particules. Ainsi, selon un mode de realisation, le procede de l'invention met en oeuvre de 0 a 30 et de preference de 0 a 35% d'un monomere hydrophobe, notamment styrenique, et au plus 10 et de preference 5% d'un monomere hydrophobe fluorescent. Les monomeres fluorescents hydrophobes sont largement connus de 1'homme du metier. A titre de monomere fluorescent hydrophobe, on peut citer le 2-naphtylmethacrylate (polyfluor 345), monomere fluorescent utilise en tres faible quantite pour fonctionnaliser les particules. Ainsi, dans le procede de l'invention, on peut utiliser differentes formulations de monomeres, etant entendu qu'on a toujours une quantite majoritaire d'agent de reticulation hydrophobe et qu'on n'a jamais en meme temps une quantite minoritaire (d'au plus 10 et de preference 5 %) soit de monomere hydrophobe fluorescent, soit d' agent de reticulation fluorescent, soit d' agent de reticulation hydrophile. Des exemples non limitatifs de formulations de monomeres comprennent : - 60% a 99 % d'un agent de reticulation hydrophobe, en particulier du divinylbenzene, et 1 a 40% d'un monomere hydrophobe, en particulier le styrene ; - 60 a 99,9% d'un agent de reticulation hydrophobe, en particulier du divinylbenzene, 39,9 a 0% d'un monomere hydrophobe, en particulier le styrene, et 0,1 a 10%, de preference 5%, soit de monomere fluorescent, soit d'agent de reticulation fluorescent, soit d'agent de reticulation hydrophile. Des exemples de phase organique dans laquelle les nanoparticules inorganiques sont distribuees, comprennent les phases comprenant un hydrocarbure aliphatique, cyclique ou aromatique. En particulier, 1'hydrocarbure est choisi parmi les alcanes, de preference ayant au moins 5 atomes de carbone, tels que le pentane, 1'hexane, 1'heptane, l'octane, le nonane, le decane, 1'undecane, le dodecane, l'octane etant particulierement prefere. Les nanoparticules inorganiques appropriees aux fins de l'invention sont toutes nanoparticules ayant un diametre de particules d'au plus 50 nm, de preference d'au plus 10 nm et de preference encore d' au moins 1 nm. Selon un mode de realisation, lesdites nanoparticules sont choisies parmi les oxydes metalliques de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganese, de nickel ; la magnetite ; 1'hematite ; les ferrites tels que les ferrites de manganese, nickel, manganese- zinc ; les alliages de cobalt, nickel ; les zeolites ; le talc ; les argiles telles que la bentonite et kaolin ; 1'alumine ; la silice ; le graphite ; les cristaux fluorescents (comme par exemple CdSe) ; l'or colloidale ; et le noir de carbone. Selon un autre mode de realisation, lesdites nanoparticules inorganiques sont des nanoparticules magnetiques et elles sont choisies parmi les oxydes metalliques et de preference les oxydes de fer comme la magnetite et la maghemite. Lesdites mnoparticules inorganiques sont presentes dans 1'emulsion a raison de 40 a 80% et de preference a raison de 60%. La taille de 1'emulsion est comprise entre 150 et 300 nm. De preference, elle est 10 inferieure a 250 nm et de preference encore superieure a 180 nm. La preparation de 1'emulsion utile aux fins de l'invention peut etre mise en oeuvre par toute methode connue de 1'homme du metier. Un exemple de tel procede est decrit par J. Bibette, 1993, J. Magn. Magn. Mater, 122 : 37. Le procede d'encapsulation par polymerisation d'emulsion est largement connu 15 de 1'homme du metier et est decrit par exemple dans la demande de brevet WO01/33223. Selon un mode de realisation prefere, le procede de preparation de particules composites de l'invention comprend ou consiste en les etapes consistant a (a) mettre en presence 1'emulsion avec un tensioactif, 20 (b) ajouter un ou des agents de reticulation hydrophobes et (c) proceder a la polymerisation Les agents tensioactifs sont largement connus de 1'homme du metier. Selon un mode de realisation approprie, ils sont choisis parmi les tensioactifs anioniques tels que les polymeres amphiphiles et le dodecylsulfate de sodium, et les tensioactifs non 25 ioniques tels que le triton X-405, les tensioactifs anioniques tels que les polymeres amphiphiles et le dodecylesulfate de sodium etant particulierement preferes. Les polymeres amphiphiles appropries aux fins de l'invention sont par exemple decrits dans la demande de brevet EP 892 020. Des exemples de tels polymeres sont disponibles aupres de la societe Coatex SA (France). 30 Comme indique precedemment, le principe de la polymerisation est largement connu de 1'homme du metier. Elie est amorcee pour tout procede d'amorcage connu de 1'homme du metier tel que par elevation de la temperature pour favoriser le decomposition et/ou en presence d'un amorceur radicalaire, ou par photochimie a 1' aide de rayonnements, tels que des rayonnements UV ou un faisceau laser ou d'autres sources d'energie. Selon un mode de realisation de l'invention, la polymerisation est mise en oeuvre en presence d'un amorceur, de preference un amorceur radicalaire hydrosoluble. Des exemples d'amorceurs hydrosolubles comprennent par exemple le persulfate de potassium et le metabisulfite, le persulfate de potassium etant particulierement prefere. L'amorceur est introduit soit simultanement a l'introduction des agents de reticulation, soit prealablement a leur introduction, soit encore posterieurement a leur introduction. La polymerisation est mise en oeuvre de preference par elevation de la temperature jusqu'a environ 60 a environ 90 C, de preference a environ 70 C, en presence de 1'amorceur de polymerisation, etant entendu que les conditions de polymerisation seront determinees par 1'homme du metier en fonction de 1'amorcage choisi. Les particules composites obtenues par le procede de l'invention sont nouvelles, de sorte que l'invention a egalement pour objet les particules composites susceptibles d'etre obtenues par le procede decrit precedemment. Les nouvelles particules composites de l'invention comprennent une matrice polymere reticulee dans laquelle sont distribuees des nanoparticules inorganiques. La matrice polymere reticulee est obtenue a partir d'au moins un agent de reticulation comme defini precedemment. Les nanoparticules inorganiques proviennent de 1'emulsion et representent de 40 a 80% en masse par rapport a la masse totale de 1'emulsion a 1'etat sec. Les particules composites de l'invention trouvent notamment des applications dans le domaine de la peinture, des encres, des plastiques et, quand elles sont fonctionnalisees, dans des domaines divers de la biologie, en particulier pour la separation de molecules biologiques ou biochimiques, pour des essais de diagnostic, pour le tri cellulaire, pour la capture biologique ou biochimique, pour des applications analytiques et egalement pour la chimie supportee. Selon un mode de realisation de l'invention, les particules composites presentent de plus a leur surface des groupements fonctionnels reactifs susceptibles de reagir avec au moins un ligand ou un polymere. Par ligand, on entend une molecule biologique telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps, une proteine, un polypeptide, une enzyme, un polynucleotide, une sonde, une amorce, un fragment d' acide nucleique ; une molecule chimique telle que des polymeres chimiques, des substances medicamenteuses, des molecules cages, des agents chelatants, des catalyseurs. Des exemples de groupements fonctionnels appropries aux fins de l'invention comprennent les groupements carboxylique, amine, thiol, aldehyde, hydroxyle, tosyle, hydrazine 1'acide phenyl-boronique et des esters actives. Ces groupements fonctionnels peuvent etre apportes par un traitement de la surface des particules, par exemple par traitement chimique tel qu'hydrolyse ou greffage, ou bien par introduction d'agent de reticulation fonctionnalise ou selon des procedes (chimique ou physique) largement connus de 1'homme du metier Selon un autre mode de realisation de l'invention, les particules presentent de plus un agent de liaison specifique pour une substance susceptible de liaison. Par agent de liaison specifique pour une substance susceptible de liaison, on entend un compose intermediaire qui se lie a un substance qui est susceptible de liaison a un ligand. A titre de couple agent de liaison specifique/substance susceptible de liaison, on peut citer les couples biotine/streptavidine, haptene/anticorps, antigene/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucleotide/complementaire du polynucleotide. Selon un mode de realisation particulier de l'invention, 1' agent de liaison specifique est la streptavidine. Les particules de l'invention peuvent egalement presenter de plus a leur surface une couche hydrophile fonctionnalisee pour une liaison ulterieure a un ligand, ce qui constitue un autre mode de realisation de l'invention. A titre de couche hydrophile fonctionnalisee, on peut citer les couches de polymeres hydrophiles naturels ou synthetiques, telles qu'une couche de dextrane, de chitosane, de derives poly(N-alkylacrylamide), poly(N-alkylmethacrylamide), poly(acide acrylique), poly(oxyde d'ethylene). La couche hydrophile peut etre appliquee aux particules de l'invention par adsorption ou liaison covalente selon des procedes largement connus de 1'homme du metier. Les particules ainsi modifiees et bees a un ligand sont egalement nouvelles. Ainsi, l'invention a egalement pour objet des conjugues comprenant une particule modifiee telle que definie precedemment et un ligand, ledit ligand pouvant etre lie a une substance susceptible de liaison. Les conjugues trouvent egalement des applications dans des domaines divers de la biologie, en particulier pour la separation de molecules biologiques ou biochimiques, pour des essais de diagnostic, pour le tri cellulaire, pour la capture de bacteries, pour la capture biologique ou biochimique. Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des particules ou des conjugues de l'invention dans un test de diagnostic in vitro. A titre de diagnostic in vitro, on peut citer les tests de dosage des acides nucleiques et derives, des proteines et derives, et des cellules et derives. L'invention sera mieux comprise a 1'aide des exemples suivants donnes uniquement a titre illustratif et non- limitatif, ainsi qu' a 1' aide de la figure unique qui est une photographie de Western-blot mettant en evidence la capture de proteine transmembranaire (TM) issue d'un lysat cellulaire par les particules composites de l'invention sur lesquelles sont greffes des anticorps anti TM, la piste 1 correspondant a des particules auxquelles ont ete ajoutes 50 g d'anticorps, la piste 2 correspondant a des particules auxquelles ont ete ajoutes 150 g d'anticorps, la piste de droite correspondant a la piste des marqueurs de poids moleculaire. Exemple 1 : Preparation de particules de l'invention Les polymerisations sont effectuees dans un reacteur en verre d'une contenance de 50 ml muni d'un systeme d'agitation mecanique (ancre en Teflon, forme en demilune). Ce reacteur est equips d'un refrigerant et possede une double enveloppe permettant la circulation d'eau provenant d'un Bain thermostats. Les polymerisations sont realisees en presence de 50 ml d'emulsion magnetique presentant un taux de solide de 4% (soit 2 g d'emulsion). L'emulsion est prealablement lavee > trois fois avec une solution aqueuse contenant un agent tensioactif (polymere amphiphile Coatex M883 a 0,5 g/1 prepare a pH 9), puis une derniere fois avec de 1eau deionisee, bouillie et degazee, avant d'etre finalement introduite dans le reacteur de polymerisation. L'operation de lavage >> de 1'emulsion consiste a separer magnetiquement les gouttelettes de la phase dispersante a 1'aide d'un aimant et de remplacer la phase continue par une nouvelle a volume egal. Le milieu reactionnel est ensuite maintenu sous atmosphere inerte (quelques minutes sous un flux regulier de diazote N2). L'agent de reticulation hydrophobe divinylbenzene (DVB) (900 mg) est ajoute a 1'emulsion magnetique placee sous agitation afin qu'il puisse aisement diffuser dans les gouttelettes d'emulsion pendant une heure. Le persulfatede potassium (KPS) (18mg) est ajoute apres 1'etape de diffusion et lorsque le milieu reactionnel est a temperature de polymerisation. Les polymerisations sont effectuees a une temperature de 70 C et pendant 20 heures. Exemple 2 : Preparation de particules de 1'invention On a procede comme indique dans 1'exemple 1 ci-dessus, a ceci pres qu'on a utilise 1500 mg de DVB. Exemple 3 : Preparation de particules de 1'invention Les polymerisations sont effectuees dans un reacteur en verre d'une contenance de 50 ml muni d'un systeme d'agitation mecanique (ancre en Teflon, forme en demilune). Ce reacteur est equips d'un refrigerant et possede une double enveloppe permettant la circulation d'eau provenant d'un Bain thermostats. Les polymerisations sont realisees en presence de 50 ml d'emulsion magnetique presentant un taux de solide de 4% (soit 2 g d'emulsion). L'emulsion est prealablement lavee > trois fois avec une solution aqueuse contenant un agent tensioactif (polymere amp hiphile Coatex M883 a 0,5 g/l prepare a pH 9), puis une derniere fois avec de 1eau deionisee, bouillie et degazee, avant d'etre finalement introduite dans le reacteur de polymerisation. L'operation de lavage > de 1'emulsion consiste a separer magnetiquement les gouttelettes de la phase dispersante a 1'aide d'un aimant et de remplacer la phase continue par une nouvelle a volume egal. Le milieu reactionnel est ensuite maintenu sous atmosphere inerte (quelques minutes sous un flux regulier de diazote N2). L'agent de reticulation DVB (900 mg) et 1' agent de reticulation fluorescent polyFluor 511 (1% en masse par rapport au DVB soit 9 mg) sont ajoutes a 1'emulsion magnetique placee sous agitation afin qu'il puisse aisement diffuser dans les gouttelettes d'emulsion pendant une heure. Le persulfate de potassium (KPS) (18mg) est ajoute apres 1'etape de diffusion et lorsque le milieu reactionnel est a temperature de polymerisation. Les polymerisations sont effectuees a une temperature de 70 C et pendant 20 heures. Exemple 4 : Preparation de particules de l'invention Les polymerisations sont effectuees dans un reacteur en verre d'une contenance de 50 ml muni d'un systeme d'agitation mecanique (ancre en Teflon, forme en demilune). Ce reacteur est equips d'un refrigerant et possede une double enveloppe permettant la circulation d'eau provenant d'un Bain thermostats. Les polymerisations sont realisees en presence de 50 ml d'emulsion magnetique presentant un taux de solide de 4% (soit 2 g d'emulsion). L'emulsion est prealablement lavee > trois fois avec une solution aqueuse contenant un agent tensioactif (polymere amphiphile Coatex M883 a 0,5 g/l prepare a pH 9), puis une derniere fois avec de 1eau deionisee, bouillie et degazee, avant d'etre finalement introduite dans le reacteur de polymerisation. L'operation de lavage > de 1'emulsion consiste a separer magnetiquement les gouttelettes de la phase dispersante a 1'aide d'un aimant et de remplacer la phase continue par une nouvelle a volume egal. Le milieu reactionnel est ensuite maintenu sous atmosphere inerte (quelques minutes sous un flux regulier de diazote N2). L'agent de reticulation DVB (900 mg) et un monomere fluorescent Polyfluor 345 (2% en masse par rapport au DVB soit 18 mg) sont ajoutes a 1'emulsion magnetique placee sous agitation afin qu'il puisse aisement diffuser dans les gouttelettes d'emulsion pendant une heure. Le persulfate de potassium (KPS) (18mg) est ajoute apres 1'etape de diffusion et lorsque le milieu reactionnel est a temperature de polymerisation. Les polymerisations sont effectuees a une temperature de 70 C et pendant 20 heures. Exemple 5 : Preparation de particules de l'invention Les polymerisations sont effectuees dans un reacteur en verre d'une contenance de 50 ml muni d'un systeme d'agitation mecanique (ancre en Teflon, forme en demi- Lune). Ce reacteur est equips d'un refrigerant et possede une double enveloppe permettant la circulation d'eau provenant d'un Bain thermostats. Les polymerisations sont realisees en presence de 50 ml d'emulsion magnetique presentant un taux de solide de 4% (soit 2 g d'emulsion). L'emulsion est prealablement lavee > trois fois avec une solution aqueuse contenant un agent tensioactif (polymere amphiphile Coatex M883 a 0,5 g/l prepare a pH 9), puis une derniere fois avec de 1eau deionisee, bouillie et degazee, avant d'etre finalement introduite dans le reacteur de polymerisation. L'operation de lavage >> de 1'emulsion consiste a separer magnetiquement les gouttelettes de la phase dispersante a 1'aide d'un aimant et de remplacer la phase continue par une nouvelle a volume egal. Le milieu reactionnel est ensuite maintenu sous atmosphere inerte (quelques minutes sous un flux regulier de diazote N2). L' agent de reticulation DVB (900 mg) et 1' agent de reticulation hydrosoluble methylene bis acrylamide (MBA) (5% en masse par rapport au DVB soit 45 mg) sont ajoutes a 1'emulsion magnetique placee sous agitation afin qu'il puisse aisement diffuser dans les gouttelettes d'emulsion pendant une heure. Le persulfate de potassium (KPS) (18mg) est ajoute apres 1'etape de diffusion et lorsque le milieu reactionnel est a temperature de polymerisation. Les polymerisations sont effectuees a une temperature de 70 C et pendant 20 heures. Exemple 6: Fonctionnalisation des particules composites elaborees par fixation d'un polymere hydrophile amine. 6.1. Via adsorption (processus physique) Deux ml des particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 1 ci-dessus sont laves trois fois avec une solution de Triton X405 a lg/l. Les particules lavees sont reprises dans 1,9 ml de tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). 100 pl d'une solution d'aminodextrane (de concentration variable de 15 a 160 g/l) sont ajoutes aux particules. Le melange est homogenise pendant une nuit. Les particules sont par la suite separees sous faction d'un champ magnetique et lavees avec le tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). 6.2. Via reaction chimique Deux ml des particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 1 ci-dessus sont laves trois fois avec une solution de Triton X405 a lg/l. Les particules lavees sont reprises dans 1,9 ml de tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). 100 1.11 d'une solution de carboodiimide hydrosoluble 1- (3- dimethylaminopropyl)3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) sont ajoutes a la dispersion particulaire suivie d'une incubation a temperature ambiante durant 40 minutes. Les particules sont lavees trois fois avec 1,9 ml du tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). 100 1.11 d'une solution dl'aminodextrane (de concentration variable de 15 a 160 g/1) sont ajoutes au particules. Le melange est homogenise pendant une nuit. Les particules sont par la suite separees sous 1' action d'un champ magnetique et lavees avec le tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). Apres une incubation d'une nuit, les particules magnetiques sont lavees trois fois avec le tampon acetate (0,002 M, pH 5,6). Exemple 7. Capture antigenique 7.1. Greffage batch avec un carbodiimide organosoluble Un mg des particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 1 ci-dessus (soit 25 l, taux de solide initial des particules : 4,07%) est utilise. Apres une separation magnetique et elimination du surnageant, le culot est complete jusqu'a 250 avec du tampon phosphate 50 mM pH 4,4 + Tween 20 a 1%. Cinq l de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans DMSO sont ajoutes a 50 mM (10 l DCC + 190 l DMSO). Cinq l de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans DMSO a 1,12 M (soit 130 mg/ml) sont ajoutes au melange, puis 46,5 l d'anticorps (i.e. 200 g, concentration initiale en anticorps : 4,3 mg/ml). La dispersion est completee jusqu'a 500 l avec du tampon phosphate 50 mM pH 4,4 + Tween 20 a 1%. Apres une incubation de 3 h a 37 C (agitation au thermomixer, 1000 rpm), une separation magnetique et remplacement du surnageant par du tampon phosphate 10 mM a pH 6,8 sont realisees. 7.2. Greffage en deux etapes avec un carbodiimide organosoluble : Un mg des particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 1 ci-dessus (soit 25 l, taux de solide initial des particules : 4,07%) est lave par separation magnetique, elimination du surnageant, et redisperse dans 25 l du tampon phosphate 50 mM pH 4,4 + Tween 20 a 1%. Puis 5 l de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans DMSO a 50 mM (10 l DCC + 190 l DMSO) sont ajoutes, operation suivie d'un ajout de 5 l de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans DMSO a 1,12 M (soit 130 mg/ml). La dispersion est completee jusqu'a 500 l avec du tampon phosphate 50 mM pH 4,4 + Tween 20 a 1%. Le melange est incube 30 minutes a temperature ambiante sur une roue d'agitation. Apres une separation magnetique et elimination du surnageant, 46,5 l d'anticorps (i.e. 200 g, concentration initiale en anticorps : 4,3 mg/ml) sont ajoutes et la dispersion est completee jusqu'a 500 l avec du tampon phosphate 10 mM pH 6,8. Apres une incubation de 3 h a 37 C (agitation au thermomixer, 1000 rpm), les particules magnetiques sont separees par application de champ magnetique et remplacement du surnageant par du tampon phosphate 10 mM a pH 6,8. 7.3. Adsorption d'anticorps Un mg des particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 1 ci-dessus (soit 20 l, taux de solide initial des particules : 4,99%) est lave par separation magnetique, elimination du surnageant, et redispersion dans 20 l du tampon phosphate 10 mM pH 6,8. Puis 46,5 l d'anticorps (i.e. 200 g, concentration initiale en anticorps : 4,3 mg/ml) sont ajoutes, et la dispersion est completee jusqu'a 500 l avec du tampon phosphate 10 mM pH 6,8. Cette operation est suivie d'une etape d'incubation pendant 3 h a 37 C (agitation au thermomixer, 1000 rpm). Apres une separation magnetique, le surnageant est remplace par du tampon phosphate 10 mM a pH 6,8. 7.4. Greffage et Immunoprecipitation On utilise 22 l de particules magnetiques obtenues dans 1'exemple 2 ci-dessus a 5, 5% en taux de solide + 98 l de tampon d'activation (Ademtech) : soit 120 l de particules a 1%. Apres une separation magnetique et elimination du surnageant, les particules sont dispersees dans 120 l de tampon d'activation (operation repetee deux fois). Puis 96 l de chlorhydrate de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDAC) a 4 ng/ml dans tampon d'activation, soit un volume total de 216 l, sont ajoutes. Une incubation est realisee 10 minutes a 40 C (agitation thermomixer a 900 rpm), laquelle est suivie de 1'ajout de 50 ou 150 g d'anticorps anti TM (6A2B2, bioMerieux, France) a 8,27 mg/ml pour 54 l de particules activees avec 1'EDAC. Apres une incubation 2 h a 37 C (agitation thermomixer a 900 rpm), 15 l de BSA a 2 mg/ml sont ajoutes. Apres une derniere incubation a 30 minutes a 40 C (agitation thermomixer a 900 rpm), les particules sont separees magnetiquement et le surnageant est remplace par du tampon de stockage (Ademtech) Trente l de particules prepares comme ci-dessus sensibilisees avec 1anticorps sont ajoutees a 62 l de lysat cellulaire (lysat de cellules TELCeb6 transfectees avec une proteine d'enveloppe reconnue par les anticorps anti TM, Blond JL. et al., 2000, Journal of Virology, 74(7) : 3321-3329) et 338 l de tampon de lyse (PBS-Triton X100 a 0,05%). Le melange est agite toute la nuit (12 heures) a 4 C, operation suivie d'une separation magnetique pendant deux minutes et d'un lavage avec tampon de lyse. Les proteins liberties (en utilisant le tampon tris, glycerol, SDS a 1% et 5 % beta-mercapto-ethanol, pendant 5 minutes a 100 C) du culot magnetique sont analysees par Electrophorese et Western blot. Les resultats du Western Blot sont montres sur la figure unique qui est une photographie mettant en evidence la capture de proteine transmembranaire (TM) issue du lysat cellulaire par les particules de 1'invention sur lesquelles sont greffes les anticorps anti TM soit en utilisant 50 g d'anticorps (piste 1), soit 150 .ig (piste 2), la piste de droite correspondant a la piste des marqueurs de poids moleculaire. Les resultats mettent en evidence la capture des proteines et donc que 1'activite des anticorps n'est pas modifiee suite a son greffage. Par ailleurs, les resultats montrent egalement qu'on n'observe pas de difference selon la quantite d'anticorps utilisee. REVENDICATIONS 1. Procede de preparation de particules composites par encapsulation par polymerisation d'emulsion appauvrie en phase organique, ladite emulsion comprenant des gouttelettes d'emulsion inorganique comprenant une phase organique et des nanoparticules inorganiques distribuees dans ladite phase organique, caracterise en ce que la polymerisation est mise en ceuvre en utilisant, a titre de monomere de polymerisation, de 60 a 100% d'au moins un agent de reticulation et de 0 a 40% d'au moins un monomere hydrophobe, etant entendu qu'au moins 95% du ou des agents de reticulation sont hydrophobes. 2. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 1, caracterise en ce qu'il met en oeuvre au moins 95% d'au moins un agent de reticulation. 3. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 1, caracterise en ce qu'il met mise en ceuvre 100% d'au moins un agent de reticulation hydrophobe. 4. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des 20 revendications 1 a 3, caracterise en ce qu'il met en oeuvre un agent de reticulation a base de derives styreniques. 5. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 4, caracterise en ce que l'agent de reticulation est le divinylbenzene. 6. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce qu'il met en ceuvre un seul agent de reticulation. 30 7. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce qu'il met en oeuvre de 0 a 35% d'un 25monomere hydrophobe styrenique et au plus 5% d'un monomere hydrophobe fluorescent. 8. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des 5 revendications 1 a 5, caracterise en ce qu'il met en oeuvre au plus 5% d'un agent de reticulation fluorescent ou d'un agent de reticulation a base d'acrylamide. 9. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que la phase organique comprend un 10 alcane. 10. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 9, caracterise en ce que 1' alcane est 1' octane. 15 11. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que les nanoparticules inorganiques sont choisies parmi les oxydes metalliques de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganese, de nickel ; la magnetite ; 1'hematite ; les ferrites tels que les ferrites de manganese, nickel, manganese- zinc ; les alliages de cobalt, nickel ; les zeolites ; le 20 talc ; les argiles telles que la bentonite et kaolin ; 1'alumine ; la silice ; le graphite ; les cristaux fluorescents ; 1' or colloidale ; et le noir de carbone. 12. Procede de preparation de particules composites par encapsulation par polymerisation d'emulsion selon rune quelconque des revendications precedentes, 25 caracterise en ce qu'il comprend les etapes consistant a : (d) mettre en presence 1'emulsion avec un tensioactif, (e) ajouter un ou des agents de reticulation hydrophobe a titre de monomere et (f) proceder a la polymerisation. 30 13. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 12, caracterise en ce que la polymerisation est mise en oeuvre en presence d'un amorceur. 14. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 13, caracterise en ce que 1'amorceur est un amorceur radicalaire hydrosoluble. 15. Procede de preparation de particules composites selon la revendication 14, 5 caracterise en ce que 1'amorceur radicalaire hydrosoluble est le persulfate de potassium. 16. Procede de preparation de particules composites selon rune quelconque des revendications 12 a 15, caracterise que 1' agent tensioactif est un polymere amphiphile ou le dodecylsulfate de sodium. 17. Particules composites susceptibles d'etre obtenues par le procede tel que defini dans rune quelconque des revendications precedentes. 18. Particules composites selon la revendication 17, caracterisees en ce qu'elles 15 presentent de plus a leur surface des groupements fonctionnels reactifs susceptibles de reagir avec au moins un ligand ou un polymere. 19. Particules composites selon la revendications 17, caracterisees en ce qu'elles presentent de plus un agent de liaison specifique pour une substance 20 susceptible de liaison. 20. Particules composites selon la revendication 19, caracterisees en ce que 1'agent de liaison specifique est la streptavidine. 25 21. Particules composites selon la revendications 17, caracterisees en ce qu'elles presentent de plus a leur surface une couche hydrophile fonctionnalisee. 22. Particules composites selon la revendications 21, caracterisees en ce la couche hydrophile fonctionnalisee est constituee de dextrane. 23. Conjugues comprenant une particule telle que definie dans la revendication 18 ou la revendication 21 et un ligand. 10 30 24. Conjugues comprenant une particule telle que definie dans la revendication 19 et un ligand lie a une substance susceptible de liaison. 25. Utilisation des particules telles que defines dans les revendications 17 a 22 ou des conjugues tels que definis dans les revendications 23 ou 24 dans un test diagnostic.