Brevet FR2888249A1 — publié le 20070112

L'invention concerne l'effet synergique de l'association de phytases sur l'hydrolyse de l'acide phytique. Les sels de l'acide phytique (myo-inositol hexakis phosphate) ou phytates (myo-inositol hexakis dihydrogène phosphate) sont la forme majeure de stockage du phosphore dans les céréales, les plantes légumineuses et oléagineuses. Ils constituent ainsi la source principale de phosphore dans les aliments pour animaux à base de plantes, composants principaux des régimes des animaux monogastriques (volailles et porcs). Cependant, la biodisponibilité de ce phosphore dans les aliments est limitée pour ces animaux. En effet, ils ne possèdent pas les enzymes intestinales dégradant les phytates en quantité suffisante pour permettre l'hydrolyse des phytates et fournir ainsi les quantités de phosphate inorganique qui leur sont nécessaires. En outre, l'acide phytique est un facteur antinutritionnel, qui forme des complexes avec les protéines et les ions (Fe3+, Cal+, Zn2+, Mg2+) et diminue donc la disponibilité de ces éléments. Les rations alimentaires des volailles et des porcs doivent donc être supplémentées en phosphate inorganique alors que le phosphore des phytates est excrété et contribue à l'eutrophisation des eaux de surface dans les zones d'élevage intensif d'animaux monogastriques. Les phytases (myo-inositol hexakis phosphate 3- et 6-phosphohydrolases EC 3.1.3.8 et 3.1.3.26) font partie de la famille des histidines phosphatases acides. Les phytases sont des hexakisphosphohydrolases qui hydrolysent les liaisons phospho-esters présentes dans l'acide phytique ou le phytate. Ainsi, elles catalysent l'hydrolyse du myo-inositol hexakisphosphate (acide phytique, InsP6) en monophosphates inorganiques et en myo-inositols phosphate de degré de phosphorylation inférieur (InsP5 à InsP1) et en myo-inositol libre dans certains cas. Il existe deux sous classes de phytases, différenciées uniquement par la position du premier phosphate hydrolysé. Les 3-phytases (EC 3.1.3.8) hydrolysent le phosphate en position 3 et les 6-phytases (EC 3.1.3.26) hydrolysent le phosphate en position 6. Ces enzymes utilisées comme additif en alimentation animale, permettent d'une part d'augmenter la disponibilité du phosphore phytique, d'autre part d'améliorer la digestibilité des aliments. De plus, la libération de phosphate phytique diminue considérablement les coûts dus à la supplémentation en phosphate, ainsi que la pollution provoquée par un excès de phosphates excrétés. Les phytases sont produites par une grande variété d'organismes: plantes, animaux, et surtout microorganismes. Ces phytases possèdent des caractéristiques biochimiques très différentes en particulier leur activité en fonction du pH et leur stabilité à la température. De plus, ces enzymes présentes des différences au niveau: (a) de leur efficacité à hydrolyser la totalité des phosphates, (b) de leur stéréospécificité, (c) de leur affinité vis-à-vis des inositols phosphates. Parmi les microorganismes producteurs de phytases on citera notamment: les champignons des genres Aspergillus, Penicillium, Mucor et Rhizopus, les bactéries: Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis et levures: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis (synonyme Schwanniomyces castellii) , Kluyveromyces fragilis. De nombreuses phytases de microorganismes ont déjà été étudiées et utilisées dans diverses applications agro-industrielles. L'efficacité de ces enzymes dans l'aliment et au cours de la digestion chez l'animal dépend de leur capacité à maintenir leur potentiel quelles que soient les différentes conditions rencontrées au cours des étapes de préparation de l'aliment ainsi que dans le tractus digestif. La préparation des aliments nécessite des enzymes thermorésistantes alors que les valeurs de pH varient par exemple de 5.02, 2.75, 6.28, 6.63, et 5.98 lors du passage dans les divers compartiments jabot, estomac, duodénum, jéjunum, iléon des volailles. La plupart des phytases décrites à ce jour n'hydrolysent que partiellement l'acide phytique et certaines avec des cinétiques très lentes. Ainsi, de nombreuses phytases n'hydrolysent que 5 liaisons phosphate de l'acide phytique soit 83% du phosphore potentiel. A ce jour, parmi les levures, seule la phytase de la levure Schwanniomyces occidentalis a été décrite comme capable d'hydrolyser toutes les liaisons phosphate du phytate (EP 0 699 762 et Segueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castelliii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11). En conditions expérimentales, on n'obtient cependant pas une hydrolyse complète du phytate ou de l'acide phytique. Pour obtenir une hydrolyse plus efficace de l'acide phytique, il a ainsi été proposé de combiner différentes phytases. W098/30681 décrit la combinaison de phytases ayant différentes stéréospécificités et notamment la combinaison de 3-phytase et de 6phytase. Ce document décrit en particulier la combinaison d'une 6-phytase de Peniophora lycii et d'une 3-phytase d'Aspergillus piger (phytase NovoTM) US 6,183740 décrit également la combinaison de phytases de différentes stéréospécificités ainsi que la combinaison avec d'autres acides phosphatases. Une hydrolyse complète de l'acide phytique en phosphate et en inositol n'est cependant pas observée. Le problème que se propose de résoudre la présente invention consiste à améliorer la vitesse et l'efficacité d'hydrolyse de l'acide phytique afin d'obtenir une hydrolyse complète de l'acide phytique dans diverses applications agro-industrielles. Ce problème est résolu par les compositions et les procédés de la présente invention dans lesquels on associe au moins deux phytases spécifiques. De façon avantageuse, les compositions de la présente invention permettent une hydrolyse complète de tous les groupements phosphate de l'acide phytique grâce à l'effet synergique observé. Avantageusement, les compositions de la présente invention sont actives dans un plage de pH large adaptée aux applications agro-industrielles des phytases et notamment aux applications dans le domaine de l'alimentation animale. Un autre avantage de la présente invention est que les phytases utilisées sont thermostables. Description des séquences SEQ ID No. 1: Phytase de Schwanniomyces castellii. SEQ ID No. 2: Phytase de Debaryomyces castellii. SEQ ID No. 3: Phytase d'Aspergillus piger. SEQ ID No. 4: Phytase de Penicillium funiculosum. SEQ ID No. 5: Phytase de Peniophora lycii. SEQ ID No. 6: Séquence codant pour la phytase de blé. SEQ ID No. 7: Phytase de blé (Triticum aestivum). Description de l'invention L'invention a pour objet une composition associant au moins deux phytases pour l'hydrolyse de l'acide phytique (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis 5 phosphate) comprenant: une première phytase présentant au moins 80% d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.2; une deuxième phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la 10 phytase de la SEQ ID No. 3. De préférence, la première phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse des six liaisons phosphate de l'acide phytique. Préférentiellement, la première phytase a une température optimum comprise entre 55 C et 80 C et un pH optimum compris entre pH 3.5 15 et pH 5. Dans un mode de réalisation préféré, la première phytase est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii ou une phytase de la levure Debaryomyces castellii. Dans un autre mode de réalisation préféré, la première phytase est 20 la phytase de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de la SEQ ID No. 2. De préférence, la deuxième phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse d'au moins cinq liaisons phosphate de l'acide phytique. Préférentiellement, la deuxième phytase à une température optimum comprise entre 50 C et 60 C et un pH optimum compris entre pH 2 et pH 6. Dans un mode de réalisation préféré, la deuxième phytase est une phytase d'Aspergillus piger. Dans un autre mode de réalisation préféré, la deuxième phytase est la phytase de la SEQ ID No. 3. Préférentiellement, les compositions selon l'invention consistent en un additif nutritionnel pour animaux ou en un aliment pour animaux. L'invention a également pour objet, l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un additif nutritionnel pour animaux ou d'un aliment pour animaux. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention pour augmenter la disponibilité du phosphore phytique et améliorer la digestibilité des aliments pour animaux. La présente invention concerne aussi un procédé d'hydrolyse de l'acide phytique (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis phosphate) en monophosphates inorganiques, en myo-inositols de degré de phosphorylation inférieur et en myo-inositol libre comprenant les étapes suivantes: on dispose d'une première phytase présentant au moins 80% d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 2; on dispose d'une deuxième phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3; on met simultanément en contact l'acide phytique avec la première phytase et la deuxième phytase. De préférence, la première phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse des six liaisons phosphate de l'acide phytique. Préférentiellement, la première phytase a une température optimum comprise entre 55 C et 80 C et un pH optimum compris entre pH 3.5 et pH 5. Dans un mode de réalisation préféré, la première phytase est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii ou une phytase de la levure Debaryomyces castellii. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la première phytase est la phytase de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de la SEQ 25 ID No. 2. De préférence, la deuxième phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse d'au moins cinq liaisons phosphate de l'acide phytique. Préférentiellement, la deuxième phytase à une température optimum comprise entre 50 C et 60 C et un pH optimum compris entre pH 2 et pH 6. Dans un mode de réalisation avantageux, la deuxième phytase est une phytase d'Aspergillus piger. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la deuxième phytase est la phytase de la SEQ ID No. 3. L'invention a aussi pour objet un kit ou ensemble pour l'alimentation des animaux comprenant: la phytase de Schwanniomyces castellii de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de Debaryomyces castellii de la SEQ ID No. 2; la phytase d'Aspergillus niger de la SEQ ID No. 3. Les compositions selon l'invention associent une première phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.2; et une deuxième phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3. De façon surprenante, cette association spécifique de phytases permet d'obtenir un effet synergique sur l'hydrolyse de l'acide phytique. Les compositions selon la présente invention catalysent ainsi une hydrolyse rapide et totale de l'acide phytique dans une large gamme de pH. On entend par phytase, les myo-inositol hexakis phosphate phosphohydrolases (EC 3.1.3.8 et 3.1.3.26). Ces enzymes catalysent l'hydrolyse du myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis phosphate (acide phytique, InsP6) en monophosphates inorganiques et en myo-inositols phosphate de degré inférieur (InsP5 à InsPI) et en myo-inositol libre pour certaines phytases. Les compositions selon l'invention comprennent une première phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.2. La phytase de la SEQ ID No. 1 est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii alors que la phytase de la SEQ ID No. 2 est une phytase de la levure Debaryomyces castellii. Ces phytases ont des propriétés catalytiques très proches et sont donc interchangeables dans les associations de phytases selon l'invention. De préférence, la première phytase présente au moins 80 %, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présente au moins 80 %, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec la phytase de la SEQ ID No.2. De préférence, la première phytase a les mêmes propriétés et notamment les mêmes propriétés catalytiques que les phytases de la SEQ ID No. 1 et de la SEQ ID No. 2. Préférentiellement, la première phytase est isolée d'autres souches de Schwanniomyces castellii, de Debaryomyces castellii ou d'autres levures. Alternativement, la première phytase peut être obtenue par des techniques de mutagenèse dirigée par exemple. Par acides aminés identiques, on entend des acides aminés invariants entre deux séquences. La première phytase peut présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport aux phytases de la SEQ ID No. 1 ou de la SEQ ID No. 2. Les phytases de la SEQ ID No. 1 et de la SEQ ID No. 2 ont des propriétés catalytiques communes. Selon l'invention, la première phytase mise en oeuvre dans les compositions et les procédés selon l'invention présente un degré d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.1 ou de la SEQ ID No. 2 et conserve ces propriétés catalytiques communes. De préférence, la première phytase a une activité de 3-phytase. Préférentiellement, la première phytase catalyse l'hydrolyse des six liaisons phosphate de l'acide phytique. Les 3-phytases (EC 3.1.3.8) hydrolysent en premier lieu le phosphate en position 3. Une phytase capable d'hydrolyser toutes les liaisons phosphate de l'acide phytique (positions 1, 2, 3, 4, 5, 6) catalyse l'hydrolyse du myoinositol 1,2,3,4,5,6-hexakis phosphate (acide phytique, InsP6) en monophosphates inorganiques et en myo-inositol libre. De nombreuses phytases n'hydrolysent que 5 liaisons phosphate de l'acide phytique soit 83% du phosphore potentiel. Ces enzymes hydrolysent l'acide phytique en myo-inositol monophosphate mais pas en myo-inositol libre. Par activité de la phytase, on entend l'activité enzymatique de la phytase. Cette activité s'exprime en Unités Internationales (U.I) par milligramme de protéine. Une U.I. d'activité enzymatique est la capacité catalytique à transformer une micromole de substrat par unité de temps, à un pH et à une température donnés. De préférence, la première phytase a une température optimum comprise entre 55 C et 80 C et un pH optimum compris entre pH 3.5 et pH 5. Dans un mode de réalisation préféré, la première phytase est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii ou une phytase de la levure Debaryomyces castellii. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la 35 première phytase est la phytase de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de la SEQ ID No. 2. Les compositions selon l'invention comprennent au moins une deuxième phytase présentant au moins 80% d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3. La phytase de la SEQ ID No. 3 est une phytase du champignon 5 filamenteux Aspergillus piger. De préférence, la deuxième phytase présente au moins 80 %, 90%, 95%, 98% et préférentiellement au moins 99% d'acides aminés identiques avec la phytase de la SEQ ID No. 3. De préférence, la deuxième phytase conserve les propriétés et notamment les propriétés catalytiques de la phytase de la SEQ ID No. 3. Préférentiellement, cette phytase est isolée d'autres souches d'Aspergillus piger ou d'autres champignons filamenteux. Alternativement, cette phytase peut être obtenue par des techniques de mutagenèse dirigée par exemple. Par acides aminés identiques, on entend des acides aminés invariants entre deux séquences. La deuxième phytase peut présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé par rapport à la phytase de la SEQ ID No. 3. Selon l'invention, la deuxième phytase mise en oeuvre dans les compositions et les procédés selon l'invention présente donc un degré d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3 et conserve les propriétés catalytiques de cette dernière. De préférence, la deuxième phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse d'au moins cinq liaisons phosphate de l'acide phytique. Préférentiellement, la deuxième phytase a une température optimum comprise entre 50 C et 60 C et un pH optimum compris entre pH 2 et pH 6. Encore plus préférentiellement, la deuxième phytase a un premier pH optimum entre pH 2.5 et 3.5 et un deuxième pH optimum entre pH 4.5 et 5.5. Dans un mode de réalisation préféré, la deuxième phytase est une phytase d'Aspergillus piger. Dans un mode de réalisation avantageux, la deuxième phytase est la phytase de la SEQ ID No. 3. L'activité enzymatique d'une phytase varie notamment en fonction du pH. Les phytases ont ainsi des gammes (ou des plages) de pH dans lesquelles leur activité enzymatique est plus élevée ou optimale. Par gamme on entend une plage ou un intervalle de pH donné. Deux phytases ont des activités enzymatiques dans des gammes de pH complémentaires lorsque ces phytases ont une activité dans des gammes de pH différentes. De préférence, ces gammes se chevauchent ou se superposent partiellement. Typiquement, les phytases ont une activité enzymatique plus élevée à pH acide. Deux phytases ayant des gammes de pH complémentaires ont ainsi par exemple une activité enzymatique maximale entre pH 2 et pH 4 pour la première phytase et une activité enzymatique maximale entre pH 4 et pH 6 pour la deuxième phytase. Dans les compositions et les procédés de la présente invention, la première et la deuxième phytase ont de préférence des gammes de pH ou des pHs optimums complémentaires. Les compositions et les procédés selon l'invention permettent ainsi une hydrolyse de l'acide phytique dans une gamme de pH large. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité entre polypeptides sont connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De préférence, on utilise les paramètres par défaut. Les phytases des compositions et procédés selon l'invention sont isolées ou purifiées de leur environnement naturel. Les phytases peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces phytases, la production de phytases recombinantes par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, les phytases mises en oeuvre dans les compositions et les procédés de la présente invention peuvent être isolées à partir de Schwanniomyces castellii, de Debaryomyces castellii ou d'Aspergillus piger. Dans un autre mode de réalisation, les phytases de la présente invention sont isolées à partir d'organismes hôtes recombinants. Préférentiellement, les compositions selon l'invention consistent en un additif nutritionnel pour animaux ou en un aliment pour animaux. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un additif nutritionnel pour animaux ou d'un aliment pour animaux. La présente invention concerne donc également des additifs alimentaires apportant une activité phytase. L'apport de ce type d'activité enzymatique permet d'améliorer la digestibilité de l'aliment et d'améliorer sa valeur nutritionnelle. On entend par additif nutritionnel une substance ajoutée intentionnellement à un aliment, généralement en petites quantités, pour améliorer ses caractéristiques nutritionnelles ou sa digestibilité. Les additifs nutritionnels pour animaux peuvent par exemple contenir des vitamines, des sels minéraux, des acides aminés et des enzymes. La présente invention concerne aussi les aliments pour animaux. Ces aliments se présentent habituellement sous la forme de farines ou de granulés dans lesquels sont incorporés les additifs selon l'invention. On entend par aliment tout ce qui peut servir à la nourriture des animaux. Pour l'élevage intensif des animaux, les aliments pour animaux comprennent habituellement une base nutritionnelle et des additifs nutritionnels. On entend par base nutritionnelle, ce qui constitue l'essentiel de la ration alimentaire de l'animal, constitué à titre d'exemple par un mélange de céréales, de protéines et de matières grasses d'origine animale et/ou végétale. Les bases nutritionnelles pour animaux sont adaptées à l'alimentation de ces animaux et sont bien connues de l'homme du métier. Habituellement, ces bases nutritionnelles comprennent par exemple du maïs, du blé, du pois et du soja. Ces bases nutritionnelles sont adaptées aux besoins des différentes espèces animales auxquelles elles sont destinées. Ces bases nutritionnelles peuvent déjà contenir des additifs nutritionnels comme des vitamines, des sels minéraux et des acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des aliments pour animaux monogastriques et notamment pour les volailles et les porcs. Les volailles comprennent notamment les poules pondeuses, les poulets de chair, les dindes et les canards. Les porcs comprennent notamment les porcs croissance et finition ainsi que les porcelets. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition selon 30 l'invention pour augmenter la disponibilité du phosphore phytique et améliorer la digestibilité des aliments pour animaux. Les compositions et les procédés selon l'invention associent une première phytase capable d'hydrolyser toutes les liaisons phosphate de l'acide phytique, choisie parmi les phytases de Schwanniomyces castel/il et les phytases de Debaryomyces caste/Ili et une deuxième phytase capable d'hydrolyser au moins cinq liaisons phosphate de l'acide phytique et ayant une activité enzymatique dans une gamme de pH complémentaire à la gamme de pH de la première phytase. Fiqures Fiqure 1: Comparaison des cinétiques d'hydrolyse de l'acide phytique à différents pH pour les 6 phytases seules ou associées deux à deux. Les résultats sont exprimés en % des phosphates théoriques libérés. Fiqure 2: Pourcentage d'hydrolyse de l'acide phytique par les différentes phytases après 120 minutes de réaction. (A) phytases seules, (B) phytases associées. Les traits en pointillés correspondent à l'hydrolyse de 5 liaisons phosphate. Fiqure 3: Comparaison des vitesses initiales d'hydrolyse de l'acide phytique (pmol.ml-'.min-l) pour 6 phytases à différents pH. (A) phytases seules, (B) phytases associées. Les vitesses sont calculées pendant les 10 premières minutes de la réaction. Exemples Matériels et methodes 1. Origines des phytases ^ Aspergillus piger Natuphos (AN): lot R2503 ou lot: 057NPH02 Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van Zeijl, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E. G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gerard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom and Cees A. M. J. J van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of the phytaseencoding gene (phyA) of Aspergillus piger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993) ^ Peniophora lycii (PL): lot 172NHS02 Lassen,S.F., Breinholt,J., Ostergaard, P.R., Brugger,R.,Bischoff,A., Wyss,M. and Fuglsang,C.C.; Expression, gene cloning, and characterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001) ^ Penicillium funiculosum (PF): Godo A1346 lot 1301 ^ Blé (B) : Sigma référence P1259. ^ Schwanniomyces castellii (SC): produite dans Candida boidinii lot 10059 CN 25 EP 0931837 ^ Debaryomyces castellii souche CBS 2923 (DC). 2. Méthode enzymatique L'activité phytasique est mesurée en suivant la libération de phosphate inorganique au cours du temps. L'activité est mesurée en présence de 8 mM de phytate de sodium (Sigma) dissous dans un tampon acétate de sodium pH 5.5, 200 mM à 37 C (5 volumes) . La réaction est déclenchée par l'addition de l'extrait enzymatique (1 volume). La réaction est stoppée par acidification du milieu par de l'acide trichloracétique 20% (1 volume de milieu réactionnel + 1 volume d'acide). La quantité de phosphate libéré est déterminée après différents temps d'incubation. Une unité enzymatique (U) est définie comme la quantité d'enzyme qui libère une pmole de phosphate inorganique en une minute. 3. Condition d'hydrolyse des phytates à différents pH L'hydrolyse est réalisée à 40 C dans 10 ml de tampon acétate 250 mM pour les pH 4 à 6.5 ou de tampon glycine 200 mM à pH 3, renfermant: 0,340 mM de phytate de sodium, 0,04 ou 0,08 U/mL de phytase. Des prélèvements sont réalisés à des temps différents pendant 120 minutes. La réaction est arrêtée par adition d'acide trichloracétique. Les phosphates sont dosés directement sans dilution. 4. Dosage des phosphates La quantité de phosphate libéré est révélée par colorimétrie. La solution de révélation, préparée extemporanément, contient du sulfate de fer (380 mM, 1 volume) et de l'heptamolybdate d'ammonium (12 mM, 4 volumes). La mesure de l'absorbance, à 700 nm, se fait après 30 minutes de révélation à température ambiante (1 volume de milieu réactionnel + 1 volume de solution de révélation), à l'aide d'un spectrophotomètre UV/visible (Beckman DU 530). Une droite d'étalonnage est préalablement établie avec du potassium dihydrogénophosphate. Résultats 1. Phytases testées Les phytases testées se distinguent selon différents critères: (1) caractéristiques biochimiques (pH optimum, stéréospécificité : 3, 4, ou 6 phytases), (2) nombre de liaisons phosphates hydrolysés. Toutes ces phytases ont un pH optimum d'hydrolyse proche de 5, cependant les phytases de AN et PL ont un deuxième pH optimum à 2,5. Trois hydrolysent totalement les phosphates (SC, DC, Blé). La position hydrolysée en premier est soit la position 3 (AN, PL, DC), soit la position 6 (PL), soit la position 4 (Blé) (Tableau 1). Tableau 1: Comparaison des caractéristiques biochimiques des phytases Origine Km pg optimum Température Nombre Stéréospécificité (11M) optimum de (ordre d'hydrolyse ( C) liaisons des liaisons phosphate phosphate) hydrolysé A sperillus 40/27 2.5 5.5 55/58 5 3/4/5/6/1 figer Peniophora 33 2.5 - 5.5 58 5 6/3 (pH5.5) lycii(1) 3/6 (pH3 et 5.5) Penicillium 550 45 50 5 ou 6 3/4 funiculosum (2) Blé (3) 22 5 - 7 55 6 4/3/5/6/1/2 Schwanniomyces 38 4.4 77 6 ? castellii (4) Debaryomyces 236 4-4.5 60 6 3/4/5/6/1-2 cas tellii 4 (1)Ullah, A. H. J and Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 463 468 (2)WO 03054199 Filed Jun 13 2003 Bohlmann, R., Moussu, F., Nore, O., Pierrard, J., Saunier, D., Testeniere, O., New polynucleotide encoding fungal phytase, useful as feed additive to improve phosphate assimilation, also new strain of Penicillium. (3)Nakano, T., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T. (2000) The pathway of dephosphorylation of myo-Inositol Hexakisphosphate by Phytases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L. cv Nourin#61. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64:995-1003 (4) Segueilha, L., Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G. and Galzy, P. (1992) Purification and Properties of the Phytase from Schwanniomyces castellii. J. Ferment. Bioeng. 74(1): 7-11. 2. Comparaison de l'efficacité d'hydrolyse de l'acide phytique par 6 phytases à divers pH L'étude est réalisée en présence de 0,340 mM de phytate. La quantité d'enzyme apportée correspond à 0,08 U/mL de phytase, mesurée dans des conditions standard à pH 5.5. Les valeurs de pH testées sont de 3, 4, 5.5, 6, 6.5. La réaction est suivie pendant 120 minutes. Des prélèvements sont effectués au cours du temps, la réaction est arrêtée par acidification, les phosphates sont dosés par colorimétrie. La comparaison des diverses phytases est effectuée en fonction de l'efficacité d'hydrolyse, c'est à dire du pourcentage de phosphate libéré par rapport au pourcentage théorique. Les résultats sont présentés dans la figure 1A. D'après la littérature, 4 phytases (PF, SC, DC, B) sont capables d'hydrolyser totalement l'acide phytique en inositol et phosphate; 2 phytases (AN et PL) n'hydrolysent que 5 liaisons soit 83% du phosphore potentiel. Dans les conditions testées à pH 3 et pH 4, 4 phytases (SC, PF, DC et PL) hydrolysent 80% au moins de l'acide phytique. La phytase de Blé est peu active aux pH 3 et 4. Pour les valeurs de pH supérieures à pH 5,5, aucune phytase n'hydrolyse plus de 70% de l'acide phytique. Les phytases PF et DC sont peu actives à pH 6,5. La phytase AN est la moins sensible aux variations de pH, cependant elle ne libère que 60 à 70 % des phosphates soit des valeurs 10 à 20 % inférieures à celles attendues (Fig 2A). La comparaison des vitesses initiales de libération des phosphates montre une grande hétérogénéité entre les phytases (Fig 3A). La phytase la plus performante à pH acide est celle de Schwaniomyces caste/Ili alors que celle de A. piger est la plus performante aux valeurs de pH supérieures à 5,5. La phytase de blé est la moins efficace quelles que soient les conditions testées. 3. Influence du pH sur la vitesse de libération de phosphate en présence de phytases associées. Afin d'améliorer l'efficacité d'hydrolyse de l'acide phytique, plusieurs associations de deux phytases sont testées. Chaque phytase est apportée à 0,04 U/ml, soit une valeur totale de 0,08 U/ml dans le tube réactionnel. La phytase DC, hydrolysant 6 liaisons phosphate, est systématiquement testée en association avec les autres phytases, hydrolysant 5 ou 6 liaisons phosphate. Deux autres associations sont également utilisées pour comparer d'une part une autre association de phytases pouvant libérer 6 et 5 phosphates (SC/AN), d'autre part deux phytases, PL/AN ayant des caractéristiques biochimiques très proches (Fig. 1 B). Une analyse globale permet de montrer que l'association de 2 phytases favorise la plupart du temps l'efficacité d'hydrolyse de l'acide phytique. Alors que dans les mêmes conditions, aucune phytase n'hydrolyse totalement l'acide phytique, pour 2 mélanges (DC/AN et SC/AN), 100% à 85% des liaisons phosphate sont hydrolysées quel que soit le pH. Pour l'association DC/PL on observe également un gain de 20 % environ aux pH acides. Les associations PL/AN, DC/PF et DC/SC apportent peu d'amélioration (Fig. 2B). La comparaison des vitesses initiales d'hydrolyse, montre qu'il existe un fort effet synergique pour l'association SC/AN et pour l'association DC/AN par rapport aux phytases seules et par rapport aux autres associations de phytases. Les différences de vitesse d'hydrolyse liées au pH sont minimisées lors de l'association. Les autres associations sont moins efficaces, l'effet synergique n'est visible que pour certains pH, par exemple pour DC/PL aux pH 3 et 4 (Fig. 3). L'effet synergique semble être dû en grande partie à la capacité des phytases à hydrolyser la totalité des phosphates. De plus, les meilleures associations concernent des phytases ayant des pH optimum d'activité complémentaires (2,5-4,5). Il faut cependant noter qu'il y a peu d'effet synergique pour les phytases les moins performantes en termes d'efficacité d'hydrolyse, telles que celle de Blé et de Pénicillium funiculosum. 4. Influence des concentrations et de la proportion de 5 phytases sur l'efficacité d'hydrolyse de l'acide phytique. Nous avons comparé l'influence de la quantité de phytase (effets dose) et de la proportion du mélange de phytases sur l'hydrolyse de l'acide phytique. Trois associations sont utilisées DC/AN, DC/PL et AN/PL, et 2 concentrations (0,04 et 0,08 U/mL) en phytases sont testées (Tableaux 2 et 3). Tableau 2: Comparaison du pourcentage d'hydrolyse de l'acide phytique pour les différentes associations, testées à deux concentrations finales 0,04 et 0,08 U/ml. Les trois premières colonnes donnent les valeurs pour les trois phytases seules à la concentration 0,08 U/ml. AN DC PL AN/DC AN/DC PL/DC PL/DC AN/PL AN/PL (0,08U) (0,08U) (0,08U) (0, 08U) (0,04U) 0,08U) (0,04U) (0,08U) (0,04U) pH 4 pH 5,5 pH 6 pH 6,5 Les pourcentages d'hydrolyse lors de l'étude en mélange (concentration globale 0,08 U/ml) sont supérieurs à ceux déterminés avec les enzymes seules (0,08 U/ml) et proches de 100% pour les mélanges AN/DC et PL/DC et cela dans une gamme de pH variant de 3 à 6. Le mélange AN/PL n'augmente pas de manière significative le pourcentage d'hydrolyse observé avec chaque phytase prise séparément. La réduction par un facteur 2 de la quantité globale apportée (0,04U/ml) n'induit pas une diminution par 2 des phosphates libérés. Dans certains cas, AN/DC et PL/DC à pH 4 et pH 5, 5, et pH 3 67 94 70 (73%) (74%) 96 100 93 (101%) (94%) 81 85 71 (87%) (84%) 78 85 47 (83%) (56%) 42 35 10 (56%) (30%) Les valeurs entre parenthèses représentent le rapport entre les valeurs 0,04 U/ml et celles en présence de 0,08 U/ml. 69 55 72 63 63 42 6 83 67 64 34 92 94 75 (89%) (94%) (90%) (86%) obtenues avec (72 %) 79 86 70 74 61 AN/PL pH 4 à 6, les pourcentages d'hydrolyse sont équivalent à ceux observés en présence de 0,08U/ml (Tableau 3). Tableau 3: Comparaison des vitesses initiales d'hydrolyse ( mol/ml/min) de l'acide 5 phytique pour les différentes associations, testées à deux concentrations finales 0,04 et 0,08 U/ml. Les trois premières colonnes donnent les valeurs pour les trois phytases seules à la concentration 0,08 U/ml. AN DC PL AN/DC AN/DC PL/DC PL/DC AN/PL AN/PL (0,08 (0,08 (0,08 (0,08U) (0, 04U) (0,08U) (0,04U) (0,08U) (0,04U) U) U) U) pH 1,45 1,60 2,04 1,78 2,52 4,00 X42%) 3,88 2,18 3 (37%) (73%) pH 3,33 2,73 4,98 3,96 5,36 6,49 X44 8, 61 4,29 4 j) (39%) (63%) pH 0,85 2,82 7,76 1,56 4,00 7,26 2 3,79 4,56 5,5 j) (22%) (62%) pH 0,04 2,60 6 7,91 0,39 2,87 7,53 (1,04 2,10 (2%) 3,96 (66%) ) pH 0,00 0,74 5,09 0,00 0,85 3,71 j) 0,22 1,89 6,5 (0%) (39%) Les valeurs entre parenthèses représentent le rapport entre les vitesses obtenues avec 0,04 U/ml et celles en présence de 0,08 U/ml. L'association de phytase permet donc de diminuer la quantité de phytase dans le milieu réactionnel par un facteur deux en maintenant une efficacité d'hydrolyse identique et cela dans une gamme de pH étendue. Il y a un net effet dose sur la libération de phosphate. Par contre, les vitesses initiales d'hydrolyse de l'acide phytique sont au moins deux fois plus faible en présence de 0,04 U/mL de phytase qu'en présence de 0,08 U/mL (Tableau 3). Ces résultats confortent l'hypothèse que la synergie entre les phytases permet essentiellement l'hydrolyse totale des phosphates présents. La proportion de chaque phytase dans le milieu réactionnel ne semble pas avoir beaucoup d'influence sur l'efficacité d'hydrolyse (Tableau 4). Dans tous les cas, une augmentation de la quantité de phosphate libéré est observée, avec un léger avantage pour une association à 50 % de chaque phytase, principalement pour les pH supérieur à 5,5. Tableau 4: Comparaison du pourcentage d'hydrolyse de l'acide phytique en fonction 5 de la proportion de chaque phytase dans le mélange. La quantité globale reste dans tous les cas de 0,08 U/ml. de AN DC AN/DC AN/DC AN/DC (1/1) (1/2) (2/1) 66 82 92 90 88 69 85 95 93 93 63 92 79 79 72 42 94 87 86 63 6 75 52 64 Proportion phytases pH 3 pH 4 pH 5,5 pH 6 pH 6,5 Dans nos conditions expérimentales, aucune phytase n'hydrolyse totalement l'acide phytique en inositol et phosphates, bien que 4 d'entre elles soient capables de libérer tous les phosphates selon la littérature. Quatre phytases, SC, PF, DC, PL hydrolysent 80% des liaisons phosphate aux valeurs de pH 3 et 4. Deux mélanges DC/AN et SC/AN hydrolysent de 80% à 100% des liaisons phosphate à tous les pH testés. L'association de phytase de type, 3-phytase (AN, DC, PF), 4-phytase (B) ou 6-phytase (PL) entre elles n'apportent pas d'amélioration notable. La complémentation et la synergie entre phytases semble dépendre de 2 critères propres à chaque phytase: (1) de leur profil d'activité en fonction du pH, (2) de leur capacité à hydrolyser la totalité ou non des phosphates. L'utilisation de telles associations en nutrition animale pourrait permettre de diminuer les quantités de phytases utilisées d'au moins 20% et donc de diminuer les coûts. La teneur en phosphate d'origine phytique dans l'aliment serait également augmentée, améliorant la valeur alimentaire et permettrait ainsi de diminuer l'apport en phosphate inorganique. La pollution provoquée par les rejets de phosphate non disponible serait ainsi diminuée. REVENDICATIONS 1) Composition associant au moins deux phytases pour l'hydrolyse de l'acide phytique (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis phosphate) caractérisée en ce qu'elle comprend: a) une première phytase présentant au moins 80% d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.2; b) une deuxième phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3. 2) Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que la première phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse des six liaisons phosphate de l'acide phytique. 3) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la première phytase a une température optimum comprise entre 55 C et 80 C et un pH optimum compris entre pH 3.5 et pH 5. 4) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la première phytase est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii ou une phytase de la levure Debaryomyces castellii. 5) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la première phytase est la phytase de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de la SEQ ID No. 2. 6) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la deuxième phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse d'au moins cinq liaisons phosphate de l'acide phytique. 7) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en 35 ce que la deuxième phytase à une température optimum comprise entre 50 C et 60 C et un pH optimum compris entre pH 2 et pH 6. 8) Composition selon l'une des revendication précédentes caractérisée en ce que la deuxième phytase est une phytase d'Aspergillus piger. 9) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la deuxième phytase est la phytase de la SEQ ID No. 3. 10) Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle consiste en un additif nutritionnel pour animaux ou en un aliment pour animaux. 11) Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1-9 pour la fabrication d'un additif nutritionnel pour animaux ou d'un aliment pour animaux. 12)Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1-10 pour augmenter la disponibilité du phosphore phytique et améliorer la digestibilité des aliments pour animaux. 13) Procédé d'hydrolyse de l'acide phytique (myo-inositol 1,2,3,4,5,6hexakis phosphate) en monophosphates inorganiques, en myo-inositols de degré de phosphorylation inférieur et en myo-inositol libre caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on dispose d'une première phytase présentant au moins 80% d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 1 ou présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No.2; b) on dispose d'une deuxième phytase présentant au moins 80 % d'identité avec la phytase de la SEQ ID No. 3; c) on met simultanément en contact l'acide phytique avec la 30 première phytase et la deuxième phytase. 14) Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la première phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse des six liaisons phosphate de l'acide phytique. 15) Procédé selon l'une des revendications 13-14 caractérisé en ce que la première phytase a une température optimum comprise entre 55 C et 80 C et un pH optimum compris entre pH 3.5 et pH 5. 16) Procédé selon l'une des revendications 13-15 caractérisé en ce que la première phytase est une phytase de la levure Schwanniomyces castellii ou une phytase de la levure Debaryomyces castellii. 17) Procédé selon l'une des revendications 13-16 caractérisé en ce que la 10 première phytase est la phytase de la SEQ ID No. 1 ou la phytase de la SEQ ID No. 2. 18) Procédé selon l'une des revendications 13-17 caractérisé en ce que la deuxième phytase est une 3-phytase catalysant l'hydrolyse d'au moins 15 cinq liaisons phosphate de l'acide phytique. 19) Procédé selon l'une des revendications 13-18 caractérisé en ce que la deuxième phytase à une température optimum comprise entre 50 C et 60 C et un pH optimum compris entre pH 2 et pH 6. 20) Procédé selon l'une des revendications 13-19 caractérisé en ce que la deuxième phytase est une phytase d'Aspergillus piger. 21) Procédé selon l'une des revendications 13-20 caractérisé en ce que la 25 deuxième phytase est la phytase de la SEQ ID No. 3. 22) Kit ou ensemble pour l'alimentation des animaux caractérisé en ce qu'il comprend: a) la phytase de Schwanniomyces castellii de la SEQ ID No. 1 ou la 30 phytase de Debaryomyces castellii de la SEQ ID No. 2; b) la phytase d'Aspergillus niger de la SEQ ID No. 3.