Brevet FR2892515A1 — publié le 20070427

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE DÉTECTION IMMUNO-CHROMATOGRAPHIQUE La présente invention concerne le domaine général des tests immunologiques pour le diagnostic. Plus spécifiquement l'invention porte sur un kit et un procédé utilisant les techniques de test immuno-chromatographiques utiles dans les tests immunologiques pour le diagnostic et utilisant des échantillons liquides en tant qu'échantillon testé préférentiellement. De nombreux procédés et dispositifs analytiques sont couramment utilisés dans des tests pour déterminer la présence et/ou la concentration de substances qui peuvent être présentes dans des liquides biologiques ou d'autres matériels. De telles substances sont habituellement qualifiées d'analytes et incluent par exemple les anticorps, les antigènes, les drogues, les hormones, etc. Les techniques de tests immunologiques se basent sur les mécanismes des systèmes immunitaires des organismes supérieurs dans lesquels des anticorps sont produits en réponse à la présence d'antigènes, lesquels antigènes sont pathogéniques ou étrangers auxdits organismes. Les anticorps et antigènes (i.e., les immunoréactants) sont capables de se lier entre eux par un mécanisme réactionnel hautement spécifique qui peut être utilisé in vitro pour déterminer la présence ou la concentration d'un antigène ou anticorps particulier dans un échantillon biologique. De nombreux tests immunologiques de diagnostic utilisent généralement les caractéristiques spécifiques de fixation qui existe entre un analyte et un antigène ou un anticorps spécifique associé à un élément traceur. Des tests de ce type incluent par exemple les tests radio-immunologiques (RIA) et les tests immuno-enzymatiques (EIA), lesquels incluent un élément traceur durant la phase de détection sur un support solide, des techniques immunologiques d'agglutination dans lesquelles l'interaction entre l'antigène et l'anticorps s'opère en solution et des techniques immuno-chromatographiques dans lesquelles l'interaction avec les éléments traceurs sous la forme d'anticorps ou d'antigènes marqués s'opère dans la membrane poreuse. Les échantillons utilisés dans de nombreuses techniques immunologiques, incluant les tests immuno-chromatographiques, peuvent comprendre des matériels environnementaux ou organiques ou des extraits liquides de ceux-ci et des liquides biologiques comprenant le sérum, le plasma, l'urine, le liquide céphalorachidien (LCR), la salive, la sueur, le lait, le fluide oculaire et le sang total. Certains échantillons testés, comme le sang total, sont utilisés préférentiellement pour la détection spécifique d'anticorps, comme les anticorps anti-tétaniques ou d'autres anticorps et antigènes qui sont présents aux plus hautes concentrations dans le sang total ou qui ne sont pas présents dans d'autres échantillons sous forme viable ou intacte. Des échantillons testés, comme le sang total, l'urine ou la salive, sont spécialement préféré en tant qu'échantillons adaptés dans les lieux de diagnostiques, comme les services d'urgence des hôpitaux, les cabinets des médecins, les vétérinaires et les exploitations agricoles où les équipements de traitement des échantillons ne sont pas très disponibles ou alors dans lesquels les contraintes de temps rendent l'utilisation d'une telle instrumentation impraticable. Les plateformes de test immuno-chromatographiques utilisées pour la détection d'analytes peuvent être de type cassette dans lesquelles les composants du test sont contenus dans un compartiment plastique solide ou de type bandelette réactive (dipstick) où les composants du test ne sont pas contenus dans un boîtier solide mais sont plutôt positionnés en couche sur un matériau support plastique fixés aux composants du test. Le procédé d'application de l'échantillon sur la cassette de test immunochromatographique comprend l'addition de l'échantillon dans un tube ou un récipient secondaire, suivi de l'addition de tampons ou d'activateurs de diffusion audit tube ou récipient de façon à améliorer la diffusion et l'application de l'échantillon à la membrane suivi par l'application de la bandelette réactive dans le tube ou récipient. Pour autant, les procédés et les kits de l'art antérieur ne permettent pas toujours d'obtenir une sensibilité satisfaisante et/ou un résultat avec une grande rapidité. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence qu'une application directe d'un échantillon de sang sur une bandelette réactive, et donc sans dilution préalable dudit échantillon, permet d'obtenir un diagnostic avec une plus grande sensibilité que les tests de l'art antérieur. En conséquence, un premier objet de l'invention porte 25 sur un procédé de détection d'un analyte comprenant les étapes consistant à : 1) appliquer directement un échantillon biologique liquide susceptible de contenir ledit analyte sur un élément absorbant (100) correspondant à 30 la partie distale de la bandelette réactive d'un dispositif de test analytique par immunochromatographie ; et appliquer un tampon de migration sur ledit élément absorbant (100) de façon à permettre la migration d'un réactif de liaison marqué spécifique vers la zone de détection (103) du support poreux (102), sur laquelle zone de détection (103) est immobilisé de façon permanente un réactif de liaison non marqué spécifique et lequel support poreux (102) est relié directement ou indirectement à l'élément absorbant (100) ; la présence dudit analyte dans l'échantillon biologique liquide étant déterminée en observant le niveau (s'il en y a un) auquel les réactifs de liaison marqués spécifiques sont immobilisés sur la zone de détection. Par appliquer directement l'échantillon biologique liquide, on entend appliquer ledit échantillon biologique 20 liquide sans dilution préalable de celui-ci. La présente invention fournit un procédé amélioré pour l'application d'échantillons sur des bandelettes réactives de tests immuno-chromatographiques. Ledit procédé permet ainsi d'obtenir une sensibilité accrue, des limites de 25 détection moindres et des temps de développement améliorés comparativement à des résultats de tests utilisant les techniques d'application de l'art antérieur. Avantageusement, ledit échantillon biologique liquide est choisi dans le groupe comprenant le sang, l'urine, la 30 salive et le liquide céphalorachidien. ) 2 10 15 De préférence, ledit échantillon biologique liquide est un échantillon de sang. Du fait des caractéristiques de coagulation du sang, il était attendu que son application directe sur une bandelette réactive engendrerait sa coagulation et contrecarrerait sa diffusion, entraînant finalement une moindre sensibilité d'un procédé de détection utilisant une telle étape d'application directe. Au contraire, les inventeurs ont mis en évidence que le procédé selon l'invention permettait d'obtenir une sensibilité supérieure aux procédés de l'art antérieur. Les dispositifs de test analytique par immunochromatographie utilisant des bandelettes réactives sont bien connus de l'homme du métier. À titre d'exemple de tels dispositifs, on peut citer les dispositifs décrits dans les brevets EP 0383619 B1, EP 0560411 B1, EP 0679893 B1 et dans la demande de brevet EP 1248112 A2. Par élément absorbant (100), on entend un élément à base de matériau poreux ou fibreux et capable d'absorber l'échantillon biologique liquide rapidement. À titre d'exemple de tels matériaux, on peut citer notamment les matériaux plastiques poreux comme ceux à base de polypropylène, de polyéthylène, d'éthylène vinylacétate, d'acrylonitrile et de polytétrafluoroéthylène, et également la cellulose. De préférence, ledit élément absorbant (100) est à base de cellulose. Ledit élément absorbant (100) peut être saturé en échantillon biologique liquide en quelques secondes, ledit échantillon biologique liquide est ensuite libre de migrer vers le support poreux (102) avec lequel il est directement ou indirectement en contact. Avantageusement, l'étape 1) d'application est maintenue pendant un temps suffisant pour qu'un volume déterminé d'échantillon biologique liquide soit absorbé par l'élément absorbant. Ce temps est fonction du volume de l'élément absorbant, des caractéristiques de viscosité de l'échantillon biologique liquide et de la concentration potentielle de l'analyte dans ledit échantillon biologique liquide. L'homme du métier sera à même de déterminer simplement le temps nécessaire au regard de ses connaissances générales. À titre d'exemple et pour un échantillon de sang, ce temps est compris entre une seconde et une minute, de préférence entre 2 et 30 secondes et de manière particulièrement préférée entre 5 et 10 secondes. Avantageusement encore, la capacité d'absorption de l'élément absorbant (100) est limitée de telle sorte que quel que soit la quantité d'échantillon biologique liquide appliquée, notamment une grosse goutte de sang, la quantité d'échantillon biologique liquide effectivement absorbé sera constante. Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'élément absorbant comprend une marque témoin 25 (104). L'étape 1) d'application de l'échantillon biologique liquide est maintenue jusqu'à ce que l'échantillon biologique liquide migre dans l'élément absorbant jusqu'à la marque témoin (104). Dans le cas d'échantillons biologiques liquides colorés comme le sang, la migration de ces derniers peut être suivie simplement. Dans le cas d'échantillons biologiques liquides incolores comme la salive, l'élément absorbant (100) peut comprendre des composés changeant de couleur en présence de l'échantillon biologique liquide. De tels composés peuvent correspondre notamment à des composés changeant de couleur en fonction du pH ou de leur état d'hydratation. Le positionnement de la marque témoin (104) permet d'indiquer le volume minimal d'échantillon biologique liquide à déposer. Ledit positionnement est fonction du volume de l'élément absorbant et du volume d'échantillon biologique liquide nécessaire pour une détection correcte de l'analyte. Le positionnement de cette marque témoin (104) sur l'élément absorbant peut être effectué simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales et par de simples expériences de routine. À titre d'exemple, ladite marque témoin (104) correspond à la frontière entre la partie externe de l'élément absorbant qui est découverte et la partie interne qui est couverte par un film adhésif. Des tampons de migration destinés à permettre la migration d'un réactif de liaison marqué spécifique de l'élément absorbant (100) vers le support poreux (102) sont bien connus de l'homme du métier. À titre d'exemple de tels tampons de migration, on peut citer le tampon phosphate (PBS). Ledit tampon de migration peut également comprendre au moins un activateur de migration comme notamment des tensioactifs (par exemple du TRITON X100). Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour la détection d'une large variété d'analytes en choisissant les réactifs de liaison spécifiques adaptés. Les analytes peuvent être par exemple des protéines, des haptènes, des immunoglobulines, des polynucléotides, des hormones, des antigènes spécifiques d'agents infectieux. L'étape 2) d'application dudit tampon est effectuée en plaçant ledit élément absorbant (100) dans un tube ou un réceptacle comprenant ledit tampon ou en mettant en contact ledit élément absorbant (100) avec un coton ou une matrice celluloïde imbibée avec ledit tampon. Avantageusement, le support poreux (102) comprend une couche chromatographique, de préférence une couche de nitrocellulose. La nitrocellulose constitue en effet un support particulièrement avantageux par rapport à des matériaux classiques comme le papier du fait de sa capacité naturelle à fixer les protéines sans activation préalable. Des réactifs de liaison spécifiques d'un analyte de nature protéique comme les immunoglobulines peuvent ainsi être directement appliqués et immobilisés sur celle-ci. Aucun traitement chimique susceptible d'interférer avec l'activité de liaison n'est donc requis. Les sites de liaison non utilisés sur la nitrocellulose peuvent être bloqués par la suite, notamment à l'aide de protéines (albumine sérique bovine (BSA) ou protéines de lait), ou avec de l'alcool de polyvinyl (PVA), de l'éthanolamine ou une combinaison de ceux-ci. En outre, la nitrocellulose présente l'avantage d'être disponible avec une grande gamme de taille de pores ce qui permet de choisir un support poreux adapté à une utilisation particulière. De préférence, la nitrocellulose présente une taille de pores d'au moins un m, de préférence supérieure à 5 m et de manière particulièrement préférée comprise entre 8 et 12 m. De telles nitrocelluloses sont notamment disponibles auprès des sociétés SCHLEICHER and SCHUELL GMBH ou Advanced Microdevices Pvt. Ltd. De préférence encore, la nitrocellulose présente une taille de pores inférieure à 20 m. Avantageusement encore, le support poreux (102) 10 comprend au moins une couche destinée à augmenter sa résistance et recouvrant la couche de nitrocellulose. À titre d'exemple, on peut citer une couche de matière plastique comme le polyester, laquelle présente en outre l'avantage d'être imperméable à l'humidité. 15 Selon un second mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, les réactifs de liaison (marqué ou non marqué) spécifique correspondent à des immunoglobulines spécifiques de l'analyte à détecter. Le réactif de liaison marqué, l'analyte et le réactif de liaison non marqué 20 participent alors à une réaction en sandwich correspondant à l'immobilisation du réactif de liaison marqué au niveau de la zone de détection et ceci dans le cas où l'analyte est présent dans l'échantillon biologique liquide. Les deux réactifs de liaison spécifiques doivent 25 alors se fixer à des épitopes différents de l'analyte à détecter. Selon un troisième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le réactif de liaison marqué spécifique correspond à l'analyte lui-même ou à un analogue 30 de celui-ci, lequel analyte ou analogue est couplé directement ou indirectement avec un marqueur. Dans ce mode de réalisation, l'analyte (ou son analogue) marqué migrera dans le support poreux (102) jusqu'à la zone de détection et se fixera au réactif de liaison non marqué spécifique dudit analyte, ce dernier pouvant correspondre à une immunoglobuline spécifique. Tout analyte présent dans l'échantillon biologique liquide entrera en compétition avec le réactif de liaison marqué spécifique pour la réaction de fixation au réactif de liaison non marqué immobilisé dans la zone de détection (103). Une telle compétition résultera en une réduction de la quantité de réactifs de liaison marqués spécifiques immobilisée au niveau de la zone de détection et en une diminution correspondante du signal observé au niveau de la zone de détection en comparaison avec le signal obtenu en l'absence d'analyte. Selon un quatrième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le réactif de liaison non marqué immobilisé au niveau de la zone de détection correspond à un analyte ou à un analogue de ce dernier et le réactif de liaison marqué correspond à une immunoglobuline spécifique dudit analyte. Lorsqu'un échantillon biologique liquide est appliqué sur le dispositif, la compétition entre l'analyte immobilisé et l'analyte libre réduit le niveau auquel le réactif de liaison marqué sera immobilisé sur la zone de détection. Le réactif de liaison marqué spécifique comprend un réactif de liaison spécifique couplé directement ou indirectement à un marqueur particulaire. Selon un cinquième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'analyte correspond à une immunoglobuline spécifique et le réactif de liaison non marqué au niveau de la zone de détection ainsi que le réactif de liaison marqué correspondent à l'antigène spécifique de ladite immunoglobuline ou à l'un de ses dérivés. Un tel procédé est qualifié de double sandwich (cf. exemple 1). De tels marqueurs particulaires, qualifiés également de marqueurs directs sont bien connus de l'homme du métier et incluent notamment les billes de latex colorées, l'or colloïdal et les particules de charbon. Lesdits marqueurs peuvent être utilisés pour produire un résultat instantané sans nécessité l'ajout de réactifs pour obtenir un signal détectable lorsqu'ils sont immobilisés dans la zone de détection. De préférence, ledit marqueur particulaire est une particule de latex colorée. Ladite particule présente une forme sphérique ou quasi-sphérique avec un diamètre inférieur à 0,5 m. Avantageusement, ladite particule de latex colorée 20 présente un diamètre compris entre 0,05 m et 0,5 m. Selon un sixième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le couplage du marqueur particulaire au réactif de liaison spécifique correspond à un couplage direct, lequel est effectué par pontage covalent ou par 25 interaction hydrophobe. De telles techniques sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cas des particules de latex colorées, le pontage hydrophobe est préféré. Avantageusement, le réactif de liaison marqué spécifique est maintenu à l'état sec dans un corps 30 macroporeux (101) distinct ayant une taille de pore au moins dix fois supérieure à la taille du marqueur particulaire et dans lequel corps macroporeux (101) l'échantillon biologique liquide doit traverser avant de migrer dans le support poreux (102), lequel support poreux (102) est lié via le corps macroporeux (101) à l'élément absorbant (100) sur lequel est appliqué l'échantillon biologique liquide. De préférence, le corps macroporeux présente une taille de pore supérieure à 10 m et de manière particulièrement 10 préférée supérieure à 100 m. Le corps macroporeux (101) doit comprendre des matières n'ayant pas de capacité de liaison pour les protéines et doit pouvoir être simplement neutralisé au moyen d'agents, tels que la BSA et le PVA de sorte de minimiser une 15 fixation non spécifique et la migration du réactif de liaison marqué spécifique après que l'échantillon biologique liquide ait été appliqué. Un tel corps macroporeux (101) peut comprendre des matières plastiques ou minérales, notamment de la fibre de 20 verre. Un tel corps macroporeux (101) est décrit dans le brevet EP 0679893 B1. Selon un septième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le couplage du marqueur 25 particulaire au réactif de liaison spécifique correspond à un couplage indirect, lequel couplage indirect est obtenu par la liaison entre deux partenaires spécifiques A et B dont l'un est couplé au réactif de liaison et l'autre est couplé au marqueur particulaire. Comme précédemment, 30 lesdits couplages peuvent être effectués par liaison covalente ou par interaction hydrophobe. À titre d'exemple de tels partenaires spécifiques, on peut citer le couple biotine/streptavidine. Avantageusement, le marqueur particulaire couplé au premier partenaire (e.g., la strepatvidine) est maintenu à l'état sec dans un corps macroporeux (101) tel que décrit précédemment et le réactif de liaison spécifique couplé au second partenaire (e.g., la biotine) est présent dans le tampon de migration utilisé à l'étape 2). Selon un huitième mode de réalisation du procédé selon l'invention, une couche absorbante (105) est positionnée dans la zone distale du dispositif en contact direct avec le support poreux (102), laquelle couche absorbante possède une capacité d'absorption suffisante pour absorber l'excès de réactif de liaison marqué spécifique n'ayant pas réagi au niveau de la zone de détection (103). Selon un neuvième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le support poreux (102) comprend une zone contrôle (106), laquelle zone contrôle doit permettre à l'utilisateur de déterminer que le test a bien fonctionné. À titre d'exemple, la zone contrôle (106) peut comprendre un anticorps qui se fixera au réactif de liaison marqué spécifique (par exemple un anticorps anti-IgG de souris si un tel anticorps est utilisé en tant que réactif de liaison marqué spécifique) ou à un réactif contrôle marqué non spécifique présent dans le dispositif de test analytique à la même localisation que le réactif de liaison marqué spécifique (par exemple un anticorps anti- IgG de lapin avec l'ajout d'immunoglobulines de lapin marquées avec des particules de latex colorées en zone (101)). Avantageusement, ladite zone contrôle (106) est localisée en aval de la zone de détection (103). La figure 1 présente un mode de réalisation préféré d'un dispositif de test analytique par immuno- chromatographie utilisé dans le procédé selon l'invention avec un élément absorbant (100), un corps macroporeux (101), un support poreux (102), une zone de détection (103), une marque témoin (104), une couche absorbante (105) et une zone contrôle (106). Un second objet de l'invention porte sur un dispositif de test analytique par immuno-chromatographie réunissant i) un élément absorbant (100) sur lequel on peut appliquer un échantillon biologique liquide susceptible de contenir un analyte à détecter, ii) un support poreux (102), lequel support poreux est relié directement ou indirectement à l'élément absorbant (100) ; iii) une zone de détection (103) sur ledit support poreux (102), sur laquelle zone de détection (103) est immobilisé de façon permanente un réactif de liaison non marqué spécifique ; et iv) un réactif de liaison spécifique marqué librement mobile dans le support poreux (102) à l'état humide, les réactifs de liaison spécifiques marqués et non marqués étant capables de participer soit à une réaction en sandwich soit à une réaction de compétition en présence de l'analyte ; 25 lequel dispositif étant caractérisé en ce que ledit élément absorbant (100) comprend une marque témoin (104) permettant de déterminer que le volume d'échantillon biologique liquide directement appliqué est suffisant pour détecter l'analyte éventuellement contenu dans ledit échantillon. Les caractéristiques du dispositif selon l'invention sont telles que décrites précédemment. De préférence, le marqueur du réactif de liaison spécifique marqué est un marqueur particulaire et de manière particulièrement préféré une bille de latex colorée. Avantageusement, le dispositif selon l'invention comprend un corps macroporeux (101) distinct ayant une taille de pore au moins dix fois supérieure à la taille du marqueur particulaire et dans lequel corps macroporeux (101) l'échantillon biologique liquide doit traverser avant de migrer dans le support poreux (102), lequel support poreux (102) étant lié via le corps macroporeux (101) à l'élément absorbant (100) sur lequel est appliqué l'échantillon biologique liquide. Avantageusement encore, le marqueur du réactif de liaison spécifique marqué est maintenu à l'état sec dans ledit corps macroporeux (101). Selon un mode de réalisation particulier, le dispositif selon l'invention comprend en outre une couche absorbante (105) qui est positionnée dans la zone distale du dispositif en contact direct avec le support poreux (102), laquelle couche absorbante possède une capacité d'absorption suffisante pour absorber l'excès de réactif de liaison marqué spécifique n'ayant pas réagi au niveau de la zone de détection (103). Selon un second mode de réalisation particulier, le dispositif selon l'invention comprend en outre une zone contrôle (106) dans le support poreux (102), laquelle zone contrôle doit permettre à l'utilisateur de déterminer que le dispositif a bien fonctionné. Un troisième objet de l'invention concerne un kit comprenant i) un dispositif tel que décrit précédemment et 10 ii) un tampon de migration. Selon un mode de réalisation particulier du kit selon l'invention, le marqueur et le réactif de liaison spécifique formant le réactif de liaison spécifique marqué sont couplés indirectement. 15 La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent, lesquels sont fournis à titre non limitatif. Exemple 1 : Détection de l'immunité vis-à-vis de la toxine tétanique a) Introduction : 20 La toxine de Clostridium tetani est une toxine qui se fixe sur les membranes cellulaires des nerfs périphériques et inhibe l'envoi des neurotransmetteurs des synapses des cellules du système nerveux central. La toxine tétanique affecte les terminaisons nerveuses de tous les neurones 25 périphériques (neurones moteurs, sensoriels et adrénergiques). Les anticorps anti-toxine tétanique peuvent être produits par le système immunitaire chez l'homme et les autres mammifères par la vaccination (injection d'anatoxine purifiée) dans le but de stimuler le système immunitaire afin de produire ces anticorps rendant ainsi le sujet immun à tous les effets de la toxine tétanique. De plus, l'injection directe de gammaglobulines antitétaniques spécifique d'origine humaine peut aussi être réalisée pour contrecarrer les effets d'une infection aiguë par la toxine tétanique. Dans le cadre de la médecine d'urgence, la connaissance du statut immunitaire chez les sujets à risque (blessures profondes) peut permettre de choisir la meilleure prophylaxie (vaccination antitétanique et éventuellement gammaglobulines antitétaniques). b) Protocole : Le doigt d'un patient est nettoyé et la pulpe de celui-ci est piquée à l'aide d'une lancette à usage unique. Les deux protocoles suivants ont été utilisés sur les mêmes bandelettes : 1) Dépôt du sang directement sur la bandelette avec maintient de la mise en contact pendant 5 à 10 secondes, et enfin immersion de l'extrémité de la bandelette dans un tube contenant 6 gouttes de tampon de migration. 2) Mélange d'un même volume de sang avec 6 gouttes de tampon de migration dans un tube puis immersion de l'extrémité de la bandelette dans le tube. Les résultats sont lisibles à la cinquième minute. 25 c) Résultats : Les résultats ont montré que l'intensité de coloration en zone (103) est systématiquement plus intense avec le premier protocole. De plus avec le premier protocole, 7 échantillons sont positifs contre 4 seulement avec le second protocole ce qui démontre un abaissement du seuil de détection avec le premier protocole. Exemple 2) Détection de Plasmodium falciparum dans un échantillon de sang : a) Principe : Un anticorps monoclonal de capture est immobilisé sur la membrane de nitrocellulose. Les hématies sont lysées grâce au tampon de lyse libérant ainsi l'antigène PfHRP II spécifique de Plasmodium falciparum ( Histidin rich protein II ) qui va se fixer à l'anticorps de capture durant la migration du fluide de migration le long de la membrane de nitrocellulose. Le signal coloré est généré par des particules de latex noires sur lesquelles est immobilisé un anticorps monoclonal spécifique qui va se lier au complexe anticorps / antigène entraînant ainsi l'apparition d'une bande noire. La présence d'une bande de contrôle interne mauve dans la partie supérieure du test permet de valider le bon fonctionnement du test. b) Protocole : 15 l d'un échantillon de sang sont déposés sur l'extrémité basse d'une bandelette réactive et la mise en contact est maintenue pendant 5 à 10 secondes ou l'extrémité basse de la bandelette est directement mise en contact avec une goutte de sang capillaire pendant 5 secondes environ. L'extrémité basse de la bandelette réactive est alors introduite dans un tube comprenant du tampon de migration. Le résultat est lisible à la cinquième minute. Ce même protocole a été réalisé sur 49 autres échantillons de sang. c) Résultats : Les résultatsont montré une sensibilité de 5 100% du test et une spécificité de 97.7% de ce dernier. REVENDICATIONS 1) Un procédé de détection d'un analyte comprenant les étapes consistant à : i) appliquer directement un échantillon biologique liquide susceptible de contenir ledit analyte sur un élément absorbant (100) correspondant à la partie distale de la bandelette réactive d'un dispositif de test analytique par immuno-chromatographie ; et ii) appliquer un tampon de migration sur ledit élément absorbant (100) de façon à permettre la migration d'un réactif de liaison marqué spécifique vers la zone de détection (103) du support poreux (102), sur laquelle zone de détection (103) est immobilisé de façon permanente un réactif de liaison non marqué spécifique et lequel support poreux (102) est relié directement ou indirectement à l'élément absorbant (100) ; la présence dudit analyte dans l'échantillon biologique liquide étant déterminée en observant le niveau (s'il en y a un) auquel les réactifs de liaison marqués spécifiques sont immobilisés sur la zone de détection. 2) Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique liquide est un échantillon de sang. 3) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit élément absorbant (100) comprend une marque témoin (104). 4) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'étape 2) d'application dudit tampon de migration est effectuée en plaçant ledit élément absorbant (100) dans un tube ou un réceptacle comprenant ledit tampon de migration ou en mettant en contact ledit élément absorbant (100) avec un coton ou une matrice celluloïde imbibée avec ledit tampon de migration. 5) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit support poreux (102) comprend une couche chromatographique, de préférence une couche de nitrocellulose. 6) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif de liaison marqué spécifique comprend un réactif de liaison spécifique couplé directement ou indirectement à un 20 marqueur particulaire. 7) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit marqueur particulaire est une particule de latex colorée. 25 8) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le réactif de liaison marqué spécifique est maintenu à l'état sec dans un corps macroporeux (101) distinct ayant une taille de 30 pore au moins dix fois supérieure à la taille du marqueur particulaire et dans lequel corps macroporeux (101) l'échantillon biologique liquide doit traverser avant de migrer dans le support poreux (102), lequel support poreux(102) est lié via le corps macroporeux (101) à l'élément absorbant (100) sur lequel est appliqué l'échantillon biologique liquide. 9) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le couplage du marqueur particulaire au réactif de liaison spécifique correspond à un couplage indirect, lequel couplage indirect est obtenu par la liaison entre deux partenaires spécifiques A et B dont l'un est couplé au réactif de liaison et l'autre est couplé au marqueur particulaire et en ce que le marqueur particulaire couplé au premier partenaire est maintenu à l'état sec dans un corps macroporeux (101) et le réactif de liaison spécifique couplé au second partenaire est présent dans le tampon de migration utilisé à l'étape 2). 10) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'une couche absorbante (105) est positionnée dans la zone distale du dispositif en contact direct avec le support poreux (102), laquelle couche absorbante possède une capacité d'absorption suffisante pour absorber l'excès de réactif de liaison marqué spécifique n'ayant pas réagi au niveau de la zone de détection (103). 11) Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le support poreux (102) comprend une zone contrôle (106), laquelle zone contrôle doit permettre à l'utilisateur de déterminer que le test a bien fonctionné. 12) Un dispositif de test analytique par immuno-chromatographie réunissant :i) un élément absorbant (100) sur lequel on peut appliquer un échantillon biologique liquide susceptible de contenir un analyte à détecter, ii) un support poreux (102), lequel support poreux est relié directement ou indirectement à l'élément absorbant (100) ; iii) une zone de détection (103) sur ledit support poreux (102), sur laquelle zone de détection (103) est immobilisé de façon permanente un réactif de liaison non marqué spécifique ; et iv) un réactif de liaison spécifique marqué librement mobile dans le support poreux (102) à l'état humide, les réactifs de liaison spécifiques marqués et non marqués étant capables de 15 participer soit à une réaction en sandwich soit à une réaction de compétition en présence de l'analyte ; lequel dispositif étant caractérisé en ce que ledit élément absorbant (100) comprend une marque témoin 20 (104) permettant de déterminer que le volume d'échantillon biologique liquide directement appliqué est suffisant pour détecter l'analyte éventuellement contenu dans ledit échantillon. 25 13) Un kit de test analytique par immuno-chromatographie comprenant i) un dispositif selon la revendication 12 et ii) un tampon de migration. 14) Le kit selon la revendication 13, 30 caractérisé en ce que le marqueur et le réactif de liaison spécifique formant le réactif de liaison spécifique marqué 10sont couplés indirectement par la liaison entre deux partenaires spécifiques A et B dont l'un est couplé au réactif de liaison et l'autre est couplé au marqueur particulaire et en ce que le marqueur particulaire couplé au premier partenaire est maintenu à l'état sec dans un corps macroporeux (101) dudit dispositif et le réactif de liaison spécifique couplé au second partenaire est présent dans ledit tampon de migration.