Brevet FR2896952A1 — publié le 20070810

La présente invention décrit l'utilisation d'inhibiteurs de l'hormone de stress, l'éthylène, pour augmenter la production d'embryons issus de la culture de microspores isolées de Brassica, en vue de leur utilisation en tant que plantes homozygotes dans les processus de sélection végétale. L'un des objectifs des sélectionneurs est de disposer de variétés homogènes et stables génétiquernent. Pour ce faire, les structures génétiques hybride F1 ou lignée pure sont les plus adaptées. Les parents d'hybrides FI ou les lignées pures sont créés par autofécondations successives ou par haplométhodes. Ces dernières permettent d'obtenir des plantes haploïdes doublées, à partir de cellules reproductrices haploïdes, suite à un doublement chromosomique spontané ou provoqué. Elles présentent divers avantages : 1/ le temps de création variétale est fortement diminué car l'obtention de plantes parfaitement homozygotes est rapide, les lignées pures sont disponibles, par exemple, au bout de 9 mois au lieu de 9-10 ans chez une espèce à cycle annuel; 2/ les caractères génétiques des parents d'hybrides sont rapidement fixés; 3/ les plantes dérivant de l'haploïdisation sont le reflet direct des produits de la méïose et permettent de mettre en évidence des caractères peu héritables, des phénotypes homozygotes pour des gènes récessifs, et d'étudier des mutants récessifs; 4/ elles peuvent servir de matériel de base en vue de faire de l'embryogenèse somatique ou pour la transformation génétique. Cependant, ces méthodes nécessitent un haut niveau de technicité et peuvent se heurter à diverses difficultés. Il est aussi possible d'exploiter en création variétale des plantes homozygotes de niveau de ploïdie supérieur à deux (exemple : triploïde, tétraploïde...) obtenues par les mêmes techniques. L'androgenèse est un processus permettant d'obtenir des plantes à partir de cultures d'anthères ou de microspores isolées. Elle a été initialement décrite en utilisant des cultures d'anthères de carotte. De multiples études ont montré, depuis, que cette technique, adaptée en fonction des cas, était applicable à de nombreuses autres espèces. La production de plantes haploïdes a été utilisée chez plus de 240 espèces de 38 familles de plantes. La culture d'anthères est la première technique d'androgenèse mise au point. Elle fonctionne chez de très nombreuses espèces. Toutefois, la présence des tissus de l'anthère autour des microspores complique le système et peut être une source d'échec. En effet, ces tissus produisent de l'éthylène (Biddington et Robinson, 1991, Plant Cell Tissue Organ Cult. 25: 169-177) qui peut gêner le développement futur des embryons. II est de plus nécessaire de récupérer les embryons à un stade précoce dans des anthères, ce qui peut être délicat. La culture de microspores isolées permet de s'affranchir de ces difficultés, tout en allégeant l'opération technique de mise en culture et en permettant de placer davantage de microspores en conditions inductrices. Le phénomène d'embryogenèse peut être induit in vitro par l'application d'un stress (Touraev et al., 1996, Planta 200 :144-152). La nature de celui-ci varie selon les espèces végétales : carence nutritive chez le tabac, stress chimique chez Brassica napus, prétraitement au froid pour l'orge et certaines Brassica, fortes températures. Chez les Brassica, c'est le choc thermique (application de fortes températures, comprises entre 30 et 35 C, pendant une période déterminée) qui est le plus couramment utilisé pour induire l'embryogenèse. Le stress induit une reprogrammation des microspores, qui initient alors un développement embryonnaire. Après l'application du stress, l'initiation de l'embryogenèse se matérialise par une division symétrique de la microspore, qui poursuit son développement en proliférant à l'intérieur de l'exine. Après 5 à 6 jours, l'exine se rompt et libère un proembryon globulaire, qui continue de se diviser pour former un embryon au stade coeur puis torpille et enfin cotylédonaire, visible macroscopiquement après 15 jours de culture. Après un mois de culture, ces embryons nécessitent une subculture sur milieu solide pour régénérer une plantule prête à acclimater. Toutefois, de nombreux facteurs influencent la réussite de l'androgenèse : le génotype, les conditions de culture de la plante mère, le stade de développement des microspores, les conditions de culture, le type de stress appliqué, etc. L'impossibilité répétée, avec certains génotypes, de produire des plantes haploïdes doublées en grand nombre conduit à caractériser ces génotypes comme récalcitrants . Or, en sélection, pour exploiter pleinement la variabilité issue d'un croisement, il est nécessaire de disposer d'un nombre suffisant de plantes haploïdes doublées. Différentes méthodes ont été proposées afin d'améliorer les rendements finaux en embryons, puis en plantes. Le brevet US 5,900,375 décrit une méthode pour induire l'embryogenèse de microspores de Brassica napus par l'utilisation de colchicine. Cette technique permet d'obtenir également un doublement des chromosomes. Le brevet US 6,200,808 couvre une méthode d'induction de l'androgenèse qui consiste à ajouter dans le milieu de culture, lors de la mise en culture, un agent modifiant le cytosquelette ou un inhibiteur de la synthèse de protéine. La demande de brevet WO 00/14 202 décrit une méthode permettant la production d'embryons puis de plantes à partir de cultures de microspores mises en contact avec un inducteur du développement sporophytique. Cet inducteur peut être ajouté avant, pendant ou après l'étape de stress thermique. Afin d'améliorer la production d'embryons et les connaissances sur les mécanismes de contrôle de l'embryogenèse gamétophytique chez les Brassica, une étude sur le rôle des hormones de stress, et en particulier l'éthylène, a été entreprise. L'objet de cette invention est de montrer qu'un traitement avec un inhibiteur de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène est suffisant pour induire l'embryogenèse dans une culture de microspores et augmenter fortement la production d'embryons. La présente invention montre que de tels traitements permettent d'obtenir un bon rendement en embryons même pour des génotypes récalcitrants. L'art antérieur décrit l'utilisation d'un choc thermique de façon routinière pour de nombreuses espèces végétales, mais qui n'est pas suffisant dans certains cas pour obtenir le nombre d'embryons viables nécessaires. La présente invention repose sur la mise en évidence de l'action négative de l'éthylène, au niveau même des microspores, sur le processus d'embryogenèse gaméthophytique. En effet, la demanderesse a mis en évidence que l'embryogenèse à partir de microspores isolées pouvait être accentuée par addition d'inhibiteur de la biosynthèse ou de l'action de l'éthylène. Ainsi, l'inhibition de la biosynthèse ou de l'action de l'éthylène favorise l'androgenèse dans une culture de microspores isolées. La production d'éthylène résulte probablement du stress lié à l'isolement des microspores. L'éthylène est aussi un élément nécessaire à la maturation des microspores chez le tabac. Or, en androgenèse, on souhaite bloquer ce développement en grain de pollen. Les plantes obtenues, même pour des génotypes récalcitrants, pourront ensuite être utilisées dans des programmes de sélection, de création variétale, de multiplication de plantes présentant des caractéristiques intéressantes (plantes transgéniques par exemple) ou pour étudier des génotypes rares, difficiles à maintenir. De plus, comme décrit dans ce document, l'utilisation d'inhibiteurs de la biosynthèse ou de l'action de l'éthylène pendant le choc thermique permet d'augmenter d'autant plus le nombre d'embryons et de plantes viables in fine. La présente invention décrit, suivant un premier aspect, une méthode d'induction de l'embryogenèse à partir de cultures de microspores de plantes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les trois étapes suivantes : 1/ isoler les microspores de plantes et les mettre en culture, 2/ traiter les cultures de microspores isolées avec un inhibiteur spécifique de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène, et ce, avec ou sans choc thermique ; 3/ incuber pendant un temps suffisant pour induire l'embryogenèse et obtenir de jeunes embryons, au moins 15 jours à l'obscurité puis 15 jours à la lumière, à une température comprise entre 19 C et 27 C, jusqu'à l'obtention d'embryons suffisamment différenciés pour être repiqués sur un milieu solide. Suivant un deuxième aspect, la présente invention a pour objet une méthode pour améliorer le rendement en embryons, puis en plantes viables, à partir d'une culture de microspores de plantes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les trois étapes suivantes : 1/ isoler les microspores de plantes et les mettre en culture, 2/ traiter les cultures de microspores isolées avec un inhibiteur spécifique de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène, et ce, avec ou sans choc thermique ; 3/ incuber pendant un temps suffisant pour induire l'embryogenèse et obtenir de jeunes embryons, au moins 15 jours à l'obscurité puis 15 jours à la lumière, à une température comprise entre 19 C et 27 C, jusqu'à l'obtention d'embryons suffisamment différenciés pour être repiqués sur un milieu solide, puis l'obtention de plantes viables. Lorsque les cultures de microspores sont soumises en plus à un choc thermique, celui-ci est réalisé à des températures comprises entre 30 C et 35 C, pendant 24 à 72 15 heures, lors de la mise en culture. La technique de culture de microspores isolées et d'induction in vitro de l'embryogenèse, quoique classique, doit être adaptée à chaque espèce végétale utilisée. La méthode décrite dans la présente invention est particulièrement intéressante pour augmenter le nombre d'embryons et de plantes viables à partir de cultures de 20 microspores principalement dans le cas de génotypes récalcitrants. Selon l'invention, l'inhibiteur est ajouté dans le milieu de culture lors de l'initiation de la culture de microspores ou bien il peut être introduit à différents temps de culture compris dans les 7 premiers jours de culture, de préférence 24 heures, 48 heures ou 72 heures après cette initiation. 25 Une efficacité maximale est obtenue lorsque l'inhibiteur est utilisé en complément d'un choc thermique et ajouté dès l'initiation de la culture. L'inhibiteur est utilisé à raison d'une concentration finale allant de 0,1 pM à 125 pM. Cette concentration est de préférence comprise entre 5 pM et 10 pM pour le chlorure de cobalt, entre 1 pM et 5 pM pour le (2-aminoethoxyvinyl)-glycine et entre 0,1 et 30 10 pM pour le thiosulfate d'argent. Suivant un mode particulier de réalisation, l'inhibiteur est ajouté à raison d'une concentration finale allant de 0,1 pM à 125 pM, et de préférence comprise entre 1 pM et 10 pM en complément d'un choc thermique. La culture des microspores est poursuivie à une température comprise entre 19 C et 27 C jusqu'à l'obtention d'embryons 35 suffisamment différenciés pour être repiqués sur un milieu solide. Ainsi chez le chou fleur (Brassica oleracea) et le colza (Brassica napus), dans de telles conditions, on observe une nette augmentation du nombre d'embryons obtenus, jusqu'à 15,7 fois plus que dans les cultures témoins lors de l'utilisation de (2-aminoethoxyvinyl)-glycine (AVG), jusqu'à 61,7 fois plus lors de l'utilisation de chlorure de cobalt (CoCl2) et 10,7 fois plus lors de l'ajout de thiosulfate d'argent (STS). Selon un autre mode de réalisation, l'inhibiteur est utilisé seul à raison d'une concentration allant de 0,1 pM à 125 pM, et de préférence comprise entre 1 pM et 10 pM. La culture des microspores est poursuivie à une température comprise entre 19 et 27 C jusqu'à l'obtention d'embryons suffisamment différenciés pour être repiqués sur un milieu solide. Dans de telles conditions, cette méthode utilisée chez le colza, permet d'obtenir une augmentation notable du nombre d'embryons viables, c'est-à-dire jusqu'à 3 fois plus lors de l'utilisation de CoCl2. Selon un autre mode particulier de réalisation, les cultures de microspores précitées sont des cultures de cellules de Brassica napus ou Brassica oleracea. La méthode selon l'invention décrite convient en effet particulièrement à ces espèces végétales, mais ne se limite pas aux espèces citées. Selon l'invention, l'inhibiteur de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène est choisi de préférence parmi le chlorure de cobalt, le (2-aminoethoxyvinyl)-glycine ou le thiosulfate d'argent. Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet une plante obtenue à partir d'une méthode décrite précédemment, cette plante appartenant en particulier au genre Brassica. Le procédé selon la présente invention est particulièrement adapté pour obtenir un nombre intéressant d'embryons et de plantules à partir de génotypes récalcitrants. L'invention ne se limite pas à la seule description ci-dessus. Les exemples suivants sont donnés afin de montrer d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Ces données sont d'ordre purement illustratif et n'en limitent pas la portée. Exemple 1 : influence de la concentration en inhibiteur de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène sur le nombre d'embryons obtenus à partir de microspores de Brassica oleracea, en complément d'un choc thermique. Origine de la culture Dans la présente invention, les pieds mères sont cultivés en serre ou en phytotron (conditions de culture bien définies). Deux variétés de plantes ont été utilisées : Brassica oleracea var botrytis G11 (chou-fleur réactif à l'androgenèse) et Brassica oleracea var botrytis 65 694 (chou-fleur peu réactif/récalcitrant à l'androgenèse). La taille des boutons floraux de chou-fleur à prélever est déterminée par une coloration des microspores au DAPI (Vergne et al., 1987, Stain Tech. 62: 299-304) qui permet de visualiser les noyaux et ainsi déterminer leur stade de développement. Le stade le plus réactif est le stade unicellulé tardif à bicellulé précoce (Pechan et Keller, 1988, Physiol. Plant. 74: 377-384). Culture des microspores Les microspores sont isolées mécaniquement par broyage puis filtrées et rincées 3 fois dans un milieu de lavage B5 (Gamborg et al., 1968, Exp. Oeil Res. 50:151-158). La suspension de microspores est ensuite diluée dans du milieu NLN (Takahata et Keller, 1991, Plant Sci. 74, 235-242) à 50 000 microspores par ml. La suspension est alors répartie en boîtes de pétri (5ml) ou plaques 6 puits (3ml). Un stress thermique de 24 h à 32,5 C peut leur être alors appliqué, puis les microspores sont cultivées à 25 C +1- 1 C pendant 14 jours à l'obscurité. Les cultures sont ensuite transférées à la lumière avec une photopériode de 16 h et une température de 21 C environ pendant 2 semaines. Solutions stocks d'inhibiteurs Des solutions stocks d'inhibiteurs sont préparées, de manière à pouvoir les ajouter aisément lors des expérimentations : (2-aminoethoxyvinyl)-glycine (AVG, Sigma Ref. A6685) à 100mg/l dans de l'eau Ultrapure , chlorure de cobalt (CoC12, 6H2O) à lg/I dans de l'eau Ultrapure , le thiosulfate d'argent (STS) à 100NM, obtenu par le mélange d'une solution d'AgNO3 et d'une solution de Na2S2O3. Toutes les solutions sont stérilisées par filtration à 0,22 pm. Effet de l'ajout d'inhibiteurs de la voie de biosynthèse ou de l'action de l'éthylène sur des cultures de microspores De petits volumes de solutions stocks d'inhibiteurs sont ajoutés aux cultures de microspores isolées pour obtenir les concentrations souhaitées. Les inhibiteurs sont ajoutés avant l'application du choc thermique de 24h à 32,5 C. Les cultures témoins sont des cultures de microspores soumises au choc thermique, mais dans lesquelles aucun inhibiteur n'a été ajouté. Après 30 jours de culture, le nombre d'embryons obtenus à partir des cultures de microspores est compté. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 et sont exprimés en nombre d'embryons obtenus par millilitre de culture de départ. Pour chaque expérience, trois répétitions ont été réalisées. Tableau 1 : Effet de l'ajout d'inhibiteurs de la biosynthèse ou de l'action de l'éthylène, en complément du choc thermique, sur le rendement embryonnaire moyen pour un génotype réactif de chou-fleur, Gl 1, et un génotype récalcitrant de chou fleur, 65 694, et rapports 5 de ces rendements moyens à celui du témoin. chou fleur G11 chou-fleur 65 694 (génotype réactif) (génotype récalcitrant) Embryons/ml traitement/ Embryons/ml traitement/ (moyenne + ET) témoin (moyenne + ET) témoin 0,1 pM 8,6 1,4 bc 1,6 0,4 0,3 a 1,3 AVG 1 pM 9,4 1,1 c 1,8 1,4 0,6 a 4,7 pM 6,3 1,2 a 1,2 4,7 0,7 c 15,7 2,5 pM 6,2 0,5 a 1,2 0,5 0,1 a 1, 7 CoCl2 5 pM 6,3 0,3 a 1,2 0,4 0,0 a 1,3 pM 7,0 0,9 ab 1,3 0,3 0,1 a 1,0 0,01 pM - - 0,1 0,1 a 0,3 STS 0,1 pM - - 0,0 0,0 a 0,0 1 pM -3, 2 1,1 b 10,7 Témoin 0 pM 5,3 0,9 a 1,0 0,3 0,1 a 1,0 En colonne, les moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes, test de Newman-Keuls (p Les cultures de microspores sont réalisées dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, mais en absence de choc thermique. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 et sont exprimés en nombre d'embryons obtenus par millilitre de culture de départ. Pour chaque expérience, trois répétitions ont été réalisées. Tableau 2 : Effet de l'ajout de CoCl2, en absence de choc thermique, sur le rendement embryonnaire moyen pour un génotype réactif de colza, et rapport de ce rendement à celui du témoin. Embryons/ml traitement/ (moyenne + ET) témoin 0,25 pM 17,5 3,5 c 1,7 1,25 pM 16,5 0,7 c 1,6 2,5 pM 17,7 2,4 c 1,7 CoCl2 5 pM 30,8 0,7 d 3,0 10 pM 24,0 2,4 e 2,4 25 pM 1,3 0,5 a 0,1 50 pM 0,0 0,0 a 0,0 Témoin 0 pM 10,2 1,6 b 1,0 En colonne, les moyennes suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes, test de Newman-Keuls (p Lors de ces expériences, les conditions témoins n'ont permis d'obtenir que très peu d'embryons (0,3 par millilitre en moyenne). Ceci est lié au fait que les microspores mises en culture étaient à un stade de développement trop avancé (plus de 50% de microspores bicellulées, contre 10% maximum souhaité). Il apparaît cependant que le CoCl2, à la concentration la plus efficace, 5pM, est capable d'induire l'embryogenèse lorsqu'il est apporté lors des premières 48h. Ceci suggère que le CoCl2 est efficace lors des premières phases de la culture et probablement lors de l'induction. Le CoCl2 apparaît aussi intéressant lorsque la population de microspores est à un stade trop avancé de développement. REVENDICATIONS 1. Une méthode pour induire l'embryogenèse à partir de cultures de microspores de plantes, caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins les trois étapes suivantes : a. l'isolement de microspores de plantes et leur mise en culture ; b. le traitement de cette culture de microspores isolées de plantes avec un inhibiteur spécifique de voies de la biosynthèse ou de l'action de l'éthylène ; c. l'incubation pendant un temps suffisant pour induire l'embryogenèse et obtenir de jeunes embryons, au moins 15 jours à l'obscurité puis 15 jours à la lumière, à une température comprise entre 19 et 27 C. 2. Une méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les microspores sont isolées à partir de boutons floraux de Brassica, de préférence Brassica 15 napus ou Brassica oleracea. 3. La rnéthode selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les cultures de microspores peuvent être soumises en plus à un choc thermique à une température comprise entre 30 C et 35 C, pendant 24 à 72 heures, lors de la mise en culture. 20 4. La méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur utilisé est choisi préférentiellement parmi le chlorure de cobalt, le (2-aminoethoxyvinyl)-glycine ou le thiosulfate d'argent. 5. La méthode selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l'inhibiteur est utilisé à des concentrations finales allant de 0,1 pM à 125 pM. 25 6. La méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le chlorure de cobalt est utilisé à des concentrations allant de 5 pM à 10 NM. 7. La méthode selon la revendication 5, caractérisée par le fait que le (2- aminoethoxyvinyl)-glycine est utilisé à des concentrations allant de 1 pM à 5 pM. 8. La méthode selon la revendication 5, caractérisée par le fait que le 30 thiosulfate d'argent est utilisé à des concentrations allant de 0,1 à 10 pM. 9. La méthode selon la revendication 3, caractérisée par le fait que l'inhibiteur est ajouté à différents temps de culture compris dans les 7 premiers jours de culture. 10. La méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les embryons obtenus subissent ensuite des subcultures en absence d'inhibiteurs, en vue de régénérer 35 de jeunes plantules.