Brevet FR2894254A1 — publié le 20070608

La présente invention concerne un procédé de caractérisation de la viabilité, de la vitalité et de la stabilité de bactéries dans des environnements stressants ainsi que l'utilisation de ce procédé pour le contrôle qualité de l'adaptation au stress de préparations bactériennes et/ou pour la sélection de telles préparations. Dans le domaine de la vinification, on recourt à des ferments levuriens pour la fermentation alcoolique et à des ferments bactériens pour la fermentation malolactique. A cette fin, il a été développé des préparations de ferments bactériens qui permettent le déclenchement de la fermentation malolactique au moment opportun du processus de vinification, par inoculation des ferments dans le vin. Cette inoculation, ou ensemencement, peut être réalisée de façon directe ou après réactivation des ferments. Oenococcus oeni est l'espèce bactérienne la plus fréquemment utilisée et la mieux adaptée pour réaliser cette fermentation. Les fabricants de ces préparations ainsi que leurs utilisateurs sont confrontés au problème de la survie des bactéries lors de l'inoculation dans le vin : en effet, les conditions physico-chimiques du vin sont extrêmement défavorables à l'implantation de ces ferments lactiques et causent donc une mortalité importante des bactéries. Afin de réduire ce problème et d'optimiser l'utilisation de ces ferments malolactiques, les producteurs de bactéries ont mis au point des protocoles de pré-acclimatation des bactéries. Les cultures bactériennes sont soumises à une série de stress physico-chimiques forçant les bactéries à adapter leur structure cellulaire et leur métabolisme, permettant d'obtenir des souches capables de survivre après ensemencement dans le vin. D'une manière plus générale, les ferments bactériens, et en particulier les ferments lactiques, sont soumis à des conditions défavorables (acidité, carence nutritionnelle, stress oxydatif, etc.) lors de leur mise en oeuvre. Les producteurs de ferments sont donc confrontés au problème de UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 2 - garantir une survie, une vitalité et une stabilité des ferments lors de leur stockage ou lors de leur utilisation dans des procédés fermentaires ou encore, dans le cas des probiotiques, lors de leur ingestion et notamment la traversée de l'estomac. Par probiotiques, on entend les suppléments alimentaires composés de bactéries vivantes qui exercent un effet bénéfique en améliorant l'équilibre de la flore intestinale ; ces ferments probiotiques contiennent des lactobacilles, des bifidobactéries et des streptocoques. La difficulté aujourd'hui pour ces producteurs de ferments bactériens est donc d'obtenir une mesure fiable du niveau d'adaptation aux stress des préparations bactériennes pré-acclimatées ou de leur aptitude à survivre après inoculation dans des milieux, ainsi que de valider la qualité des produits obtenus après congélation ou lyophilisation, leur permettant de proposer les ferments les plus performants. Dans le cas des ferments malolactiques, les industriels ont actuellement recours à des expériences de micro-vinification qui sont coûteuses, longues (plusieurs semaines) et dispendieuses en main d'oeuvre. De surcroît, elles sont éloignées des conditions réelles d'utilisation des ferments, à cause des faibles volumes considérés et de la difficulté d'utiliser dans ces expériences un vin représentatif des vins des utilisateurs finals de ces ferments. D'autres tests ont également été développés, basés sur l'influence des bactéries sur des paramètres physiques de leur environnement, comme la concentration de certains métabolites. Aucun de ces tests n'est aujourd'hui réellement satisfaisant : d'une part, ils sont fastidieux et réclament une durée de réalisation importante, et d'autre part, leur degré de précision ne donne pas entière satisfaction en terme d'outils de contrôle qualité. La présente invention a donc pour but de circonvenir aux difficultés sus-mentionnées en proposant un procédé UB0001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 3 fiable, précis et rapide qui permet d'une part, d'estimer et de valider le niveau d'adaptation aux stress de préparations bactériennes produites industriellement et destinées à être utilisées dans des milieux hostiles à la survie de ces bactéries et d'autre part, de sélectionner des souches bactériennes constitutives de telles préparations. A cet égard, la présente invention a pour objet un procédé de caractérisation de la viabilité, de la vitalité et de la stabilité de bactéries dans des environnements stressants remarquable en ce qu'on combine une mesure moléculaire de l'adaptation au stress à une mesure de l'état physiologique desdites bactéries. Selon un autre aspect de l'invention, le procédé comporte une étape de comparaison des valeurs mesurées avec les valeurs de témoins et/ou d'étalons de référence. Cette étape permet de définir précisément les caractéristiques de vitalité, de viabilité et de stabilité des bactéries considérées. La présente invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé pour le contrôle de l'adaptation aux stress de ferments bactériens. Ces ferments peuvent être obtenus par des procédés de pré-acclimatation ou des présélections de souches bactériennes. Une des utilisations particulièrement privilégiée concerne le contrôle des ferments malolactiques destinés à l'ensemencement du vin. Selon un premier aspect de l'invention, la mesure moléculaire est basée sur la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène marqueur représentatif de l'état de stress des espèces bactériennes considérées. Selon un second aspect de l'invention, la mesure de l'état physiologique qui traduit la viabilité et la vitalité des bactéries est liée à l'intégrité membranaire des bactéries. La caractérisation de la stabilité physiologique dans le temps de ces bactéries est réalisé en répétant les deux types de mesures sur une période de temps correspondante à UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 4 la durée de stockage et/ou d'utilisation des bactéries. On comprend bien que la combinaison de ces deux paramètres permet une interprétation fiable de la qualité de survie et d'activité des ferments après inoculation : on vérifie, par la quantification de l'expression génique, l'adaptation aux conditions de stress des bactéries, et on s'assure, par la caractérisation de l'état physiologique, que ces bactéries sont viables et présentent un niveau de vitalité satisfaisant, la mise en corrélation de ces données conduisant à une information complète et significative de l'adaptation des bactéries. On compare les valeurs mesurées à celles de témoins et/ou d'étalons pour définir le degré de l'expression génique et la nature de l'état physiologique afin de caractériser les bactéries testées. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront mieux de la description détaillée qui va suivre du procédé selon l'invention. Selon une caractéristique essentielle de l'invention, le procédé met en oeuvre une mesure du niveau d'expression d'au moins un gène marqueur représentatif de l'état de stress des bactéries. Ce niveau d'expression est quantifié par la technique 25 de transcription inverse couplée à la PCR quantitative en temps réel (RT-gPCR). De préférence, la mesure de la réponse au stress portera sur l'expression de plusieurs gènes marqueurs, ce qui augmente la fiabilité de la mesure. On choisira 30 avantageusement des gènes qui s'expriment à différents stades de croissance des bactéries. Ainsi, dans le cas des ferments malolactiques et de la bactérie Oenococcus oeni, l'expression du gène hspl8 sera au minimum celle mesurée dans le cadre du procédé. Ce 35 gène code la protéine chaperon small Hsp Lo18. De préférence, on ajoutera la mesure de l'expression des gènes clpX, trxA et cfa qui sont impliqués dans l'adaptation de Oenococcus oeni aux stress. L'expression de UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 5 - hsp18 est fortement induite par de multiples stress, ainsi qu'en phase stationnaire. C1pX en revanche se distingue comme marqueur de la phase de latence tandis que trxA et cfa sont des marqueurs de stress exprimés pendant toutes les phases. L'Homme de l'Art se référera aux bases de données génétiques publiant le génome de Oenococcus oeni pour déterminer les séquences des sondes nucléotidiques qui seront employées lors de la RT-qPCR. On se référera également aux publications suivantes, dont le contenu fait partie intégrante de la description du présent brevet, pour les caractéristiques de ces gènes marqueurs pour Oenococcus oeni : - Jobin, M.P., Delmas, F., Garmyn, D., Diviès C. and Guzzo, J. Molecular characterization of the gene encoding a 18-kDa small heat shock protein associated with the membrane of Leuconostos oenos. Appl. Env. Microbiol. 63 : 6309-614 (1997). - Jobin, M.P., Garmyn, D., Diviès, C. and Guzzo, J. Expression of the Oenococcus oeni trxA gene is induced by hydrogen peroxide and heat shock. Microbiology. 145 : 1245-1251 (1999). - Jobin, M.P., Garmyn, D., Diviès, C. and Guzzo, J. The Oenococcus oeni c1pX homologue is a heat shock gene preferentially expressed in exponential growth phase. J. Bacteriol. 181 : 6634-6641 (1999). Bien entendu, dans le cas d'autres préparations bactériennes, et en particulier les probiotiques, l'Homme de l'art choisira les marqueurs géniques les plus appropriés. Le protocole de la mesure moléculaire est basé sur l'application conventionnelle de la technique de RT-qPCR et se décompose selon les principales étapes suivantes : - première étape de réhydratation des préparations bactériennes lyophilisées ou congelées pendant quinze minutes à 30 C dans de l'eau peptonée (NaCl à 9g.L-1 et peptone à lg. L-1) ; extraction des ARN et dosages des ARN par mesure UB0001•FR-19 TEXTE DEPOSE - 6 - spectrophotométrique à 260/280 nm ; - traitement à la DNase et vérification de l'efficacité du traitement par PCR ; -transcription inverse; - PCR quantitative avec amorces spécifiques des gènes ciblés et utilisation d'un témoin interne pour la normalisation des résultats. On utilise ensuite un étalonnage et/ou un comparatif avec des souches témoins pour qualifier l'adaptation aux stress des bactéries en fonction de l'expression génique mesurée. Selon une autre caractéristique essentielle de l'invention, les procédés mettent en œuvre une mesure de l'état physiologique qui traduit à la fois la viabilité et la vitalité des bactéries. Selon une première variante, la mesure de l'état physiologique est basée sur des techniques de mesure de l'intégrité membranaire par fluorescence, par exemple par microscopie à épifluorescence ou de suivi de la fluidité membranaire par fluorescence. Selon une seconde variante, cette mesure de l'état physiologique est basée sur une mesure du pH intracellulaire (pHi)des bactéries. En effet, non seulement cette technique nous renseigne sur l'intégrité membranaire mais elle est également significative de la capacité à survivre en milieu acide, paramètre primordial dans le cas des ferments lactiques notamment. De fait, les bactéries qui se sont bien adaptées aux conditions de stress ont un pHi significativement différent des témoins non adaptés. On peut donc déterminer, pour chaque espèce bactérienne et pour un milieu donné, des valeurs seuils et/ou des plages des valeurs de pHi avec lesquelles on caractérise l'état physiologique global des bactéries. Le protocole mis en oeuvre pourra être basé sur une mesure de pH intracellulaire via une sonde fluorescente sensible au pH , par exemple la carboxy-fluoresceine UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 7 -diacetate (CFDA). Ce protocole dérive de la technique décrite par Breeuwer et al. (Applied and Environmental Microbiology, Jan. 1996). Les compositions des solutions tampons sont à adapter 5 par l'Homme du Métier pour chaque type de souche bactérienne testée, afin d'optimiser la mesure. Le procédé de caractérisation a été validé pour Oenococcus oeni par comparaison avec les paramètres de l0 préparations non acclimatées (souche de laboratoire) et par la réalisation d'expériences de micro-vinification permettant de corréler les mesures effectuées avec la survie après implantation des bactéries dans le vin. Ainsi, les préparations acclimatées ont un fort niveau 15 d'expression des gènes marqueurs et un pH intracellulaire significativement différent par rapport aux témoins, non acclimatés. Les expériences de micro-vinification ont mis en évidence une croissance de la population bactérienne pré-acclimatée, associée à une baisse de la concentration 20 en acide malique tandis que les populations non acclimatées survivaient très difficilement et n'avaient aucune incidence sur le taux d'acide malique. On comprend bien l'avantage de l'utilisation de ce procédé de caractérisation comme outil de contrôle qualité, 25 qui permet d'obtenir très rapidement une indication du degré d'adaptation aux stress des préparations bactériennes, qu'elles soient obtenues par sélection ou par pré-acclimatation. Ce procédé permet, en outre, aux industriels 30 d'ajuster bien plus efficacement leurs paramètres de pré-acclimatation et d'optimiser plus aisément leurs processus de pré-acclimatation. En effet, la mesure d'expression génique est réalisable en 48 heures à compter de la réception de la culture bactérienne, tandis que la mesure 35 de pH intracellulaire nécessite 4 à 5 heures. Le contrôle qualité de la stabilité de ces préparations bactériennes lors de leur stockage et/ou leur utilisation, en répétant dans le temps les mesures du UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE - 8 - procédé de caractérisation, est donc également bien plus aisé et rapide par rapport aux techniques connues. Il en va de même de l'utilisation du procédé selon l'invention pour la sélection de souches bactériennes, en particulier des ferments probiotiques. Le procédé selon l'invention trouvera notamment une utilisation pour le contrôle qualité et/ou la sélection de préparations bactériennes dans les domaines de la nutrition humaine et animale (probiotiques), de l'agroalimentaire (processus fermentaires, en particulier du vin, de la bière, du maïs, du soja et dans les salaisons et charcuterie), de l'agriculture (inoculi bactériens) et de l'environnement (compostage, lutte contre les bactéries pathogènes et hygiénisation des effluents). On utilisera également le procédé selon l'invention pour optimiser les procédés de production de ferments bactériens destinés à une utilisation dans des environnements stressants. Enfin, il va de soi que le procédé selon l'invention peut être appliqué sans difficulté et sans effort excessif pour l'Homme du Métier à d'autres préparations bactériennes confrontées lors de leur utilisation à des environnements stressants et/ou hostiles, les marqueurs géniques étant bien entendu adaptés aux espèces considérées et le paramètre de l'état physiologique global étant directement applicable. UB0001-FR-19 TEXTE DEPOSE REVENDICATIONS 1 - Procédé de caractérisation de la viabilité, de la vitalité et de la stabilité de bactéries dans des environnements stressants caractérisé en ce qu'on combine une mesure moléculaire de l'adaptation au stress à une mesure de l'état physiologique desdites bactéries. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mesure moléculaire est basée sur la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène marqueur représentatif de l'état de stress pour chaque espèce bactérienne considérée. 3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que la mesure de l'état physiologique est basée sur une mesure du pH intracellulaire des bactéries. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que les bactéries 20 sont des ferments lactiques. 5 - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le ferment est constitué d'Oenococcus oeni et en ce que la mesure moléculaire porte sur l'expression du gène 25 hspl8. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la mesure moléculaire porte en outre sur l'expression d'au moins un gène pris parmi : clpx, trxA, 30 cfa. 7 - Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour le contrôle qualité de l'adaptation aux stress de préparations bactériennes 35 confrontées lors de leur utilisation à des environnements stressants. UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE- 10 - 8 - Utilisation du procédé selon la revendication 4 pour le contrôle qualité de l'adaptation aux stress de ferments probiotiques. 9 - Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 pour le contrôle qualité de l'adaptation aux stress de ferments malolactiques destinés à l'ensemencement du vin. l0 10 - Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la sélection de préparations bactériennes confrontées lors de leur utilisation à des environnements stressants. UBG001-FR-19 TEXTE DEPOSE