Brevet FR2893504A1 — publié le 20070525

PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF EXHAUSTEUR DE LA RESISTANCE MECANIQUE CUTANEE, PRINCIPE ACTIF ET COMPOSITIONS La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'un principe actif issu de fibres et/ou de graines et/ou de sons de céréales et/ou de légumineuses, pour augmenter la résistance mécanique de la peau et lutter notamment contre l'apparition des signes du vieillissement cutané. L'invention concerne également le principe actif susceptible d'être obtenu par ce procédé et les compositions cosmétiques associées. Dans nos sociétés, on accorde une grande importance au vieillissement cutané, en particulier aux aspects esthétiques et psychosociaux qui en découlent. Le vieillissement cutané résulte de diverses altérations du derme provoquées par des facteurs à la fois génétiques et environnementaux. Il se manifeste notamment par la perte de la résistance mécanique et des propriétés liftantes du derme. La peau a alors tendance à s'étendre sous l'influence de son propre poids, provoquant ainsi des déformations de surface, la formation de rides et de plis disgracieux notamment au niveau des paupières et de la partie basse du massif facial. Pour paraître plus jeunes et raffermir leur peau, beaucoup de gens souhaitent atténuer ces modifications physiques inesthétiques directement visibles. C'est ce que propose le principe actif selon la présente invention en stimulant les équipements naturels cutanés impliqués dans la résistance mécanique de la peau et en renormalisant ses propriétés liftantes naturelles. Le derme est un tissu conjonctif de soutien essentiellement constitué de fibroblastes et d'un réseau microfibrillaire de collagène, d'élastine et de protéoglycanes formant la matrice extracellulaire. La matrice extracellulaire est le substrat d'adhésion des fibroblastes et le support mécanique du tissu. En cas de pression à la surface de la peau, les fibroblastes détectent les contraintes mécaniques transmises par des mécanorécepteurs, responsables de la jonction entre les fibroblastes et la matrice extracellulaire, et répondent notamment en stimulant la synthèse de collagène et en inhibant la production des métalloprotéinases. Les mécanorécepteurs sont constitués d'intégrines, protéines de la membrane cellulaire dont la partie intracellulaire est associée à un complexe d'adhésion focale composé d'un ensemble de protéines de structure et de signalisation telle que la vinculine. Au niveau de ce complexe, sont attachées des fibres de stress dont l'alpha-smooth muscle actine (a-SMA), éléments rétractiles du cytosquelette du fibroblaste. Ces fibres, produites par les fibroblastes pour élever leurs propriétés rétractiles, assurent la maturation des mécanorécepteurs et permettent une transmission du signal mécanique plus efficace. L'activité synergique des mécanorécepteurs et des fibres d'a-SMA assure 20 l'équilibre perpétuel entre l'état de contraction et de relaxation cutanée et régule ainsi les propriétés liftantes naturelles de la peau. Lors du vieillissement cutané, cet équilibre est perturbé conduisant à la perte des propriétés mécaniques du derme. Les fibroblastes provenant de peaux âgées ou photoexposées montrent en 25 particulier une diminution des intégrines a2131 et de la vinculine, et donc une diminution de la formation des mécanorécepteurs, qui conduit à la perte du contact entre les fibroblastes et la matrice extracellulaire. De fait, la présente invention a pour objectif de favoriser la formation des mécanorécepteurs en stimulant la synthèse des intégrines et de la vinculine, protéine marqueur des adhésions focales, et ainsi restaurer les capacités d'adhésion des fibroblastes. En outre, les fibroblastes issus de peaux âgées sont aussi caractérisés par des fibres de stress courtes et désorganisées contrairement aux fibroblastes de peaux jeunes. Cette désorganisation du cytosquelette entraîne une réduction des forces rétractiles et par conséquent une résistance mécanique cutanée amoindrie. C'est pourquoi la présente invention se propose également d'accroître la résistance mécanique de la peau en stimulant la synthèse des fibres d'a-SMA responsables de la génération des forces rétractiles des fibroblastes. Le principe actif selon la présente invention restaure donc la résistance de la peau et ses propriétés liftantes naturelles à la fois - en favorisant la formation des mécanorécepteurs par stimulation de la synthèse de l'intégrine a2131 et de la vinculine, et - en augmentant la résistance mécanique de la peau par stimulation de la synthèse d' a-SMA. Ainsi, en dopant les équipements naturels cutanés impliqués dans la résistance mécanique de la peau et en renormalisant ses propriétés liftantes naturelles, le principe actif selon l'invention raffermit le tissu cellulaire. Avantageusement, il permet de renforcer la résistance mécanique de la peau en augmentant la tonicité et la tension de la peau, et d'atténuer les rides et ridules notamment au niveau de la patte d'oie et du sillon nasogénien. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux appréhender les résultats obtenus regroupés en tableaux. I/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : Le procédé selon la présente invention comprend la succession des étapes suivantes : - solubilisation de fibres et/ou de graines et/ou de son de céréales et/ou de légumineuses dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées ou successives, - séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation, décantation, - traitement de la fraction active, et -filtration stérilisante. II/ EXEMPLE 1 : PRINCIPE ACTIF OBTENU SELON L'INVENTION A PARTIR DE GRAINES ET/OU DE SON D'UNE CEREALE, LE SEIGLE II.1/Procédé d'obtention du principe actif Le procédé comprend la succession des étapes suivantes : -solubilisation de graines et/ou de son de seigle dans l'eau, -hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées ou successives, - séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation, décantation, -traitement thermique, - purification de la fraction active par filtration, et - filtration stérilisante. II.2/Caractérisation du principe actif II.2-1/ Matières sèches On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matières sèches est compris entre 17 et 210 g/I, plus particulièrement entre 50 et 70 g/I. II.2-2/ Mesure du pH Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante conduit à des valeurs comprises entre 6 et 9, plus particulièrement entre 7 et 8. II.2-3/ Détermination de la teneur en sucres totaux On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 14 à 195 g/I, préférentiellement de 45 à 65 g/I. II.2-4/ Caractérisation des carbohydrates a. Dosage de sucres simples Le taux de sucres simples est réparti en 96,4% de glucose, en 2, 6% de xylose et en 1,0% d'arabinose. b. Degré de polymérisation Le tableau ci-dessous montre que la fraction glucidique du principe actif selon la présente invention comprend du glucose, du xylose et de l'arabinose essentiellement sous forme de disaccharides, pentasaccharides et d'oligosaccharides. Degré de Taux de polymérisation carbohydrates Monosaccharides 1 4,8% Disaccharides 2 25,0% Oligosaccharides 3 8,5% Oligosaccharides 4 3, 9% Oligosaccharides 5 19,1% Oligosaccharides 6 7,0% Oligosaccharides et polysaccharides 7 27,6% II.2-5/ Caractérisation des composés phénoliques La caractérisation et la quantification des composés phénoliques du principe actif obtenu selon l'exemple 1 sont réalisées par HPLC, (High Performance Liquid Chromatography). Le chromatogramme du principe actif obtenu selon l'exemple 1 montre la présence de composés hydroxybenzoïques et de composés hydroxycinnamiques, les proportions étant sensiblement de l'ordre des valeurs données dans le tableau suivant Composés phénoliques Concentration identifiés Hydroxybenzoïques 16,1 % Hydroxycinnamiques 83, 9% dont 71,4% d'acide férulique et 10,1% d'acide p-coumarique II.2-6/ Identification de la fraction active Dans le but d'identifier la ou les fractions actives, on fractionne les sucres du principe actif obtenu selon l'exemple 1 par chromatographie gel filtration. L'efficacité de la fraction obtenue est évaluée par l'expression des ARNm de la vinculine par PCR (Polymerase Chain Reaction ou Amplification en chaîne par Polymérase) quantitative. L'analyse des résultats montre que l'efficacité du principe actif obtenu selon l'exemple 1 réside dans une fraction oligosaccharidique riche en arabinoxylane et en glucose. II.3/Evaluation de l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 1 II.3-1/Evaluation de l'effet sur la synthèse des protéines du mécanorécepteur Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 1 sur l'expression de protéines du mécanorécepteur, à savoir - les intégrines de type a2131, et - la vinculine, marqueur des adhésions focales. L'étude est réalisée par PCR quantitative sur des fibroblastes humains normaux, comparé à un modèle de fibroblastes humains vieillis. A J1, les fibroblastes humains normaux et vieillis sont ensemencés et incubés à 37 C. A J3, les cellules sont traitées. Elles sont cultivées en présence du principe actif obtenu selon l'exemple 1 dosé à 0,25% ou de TGF-131 à 1ng/ml, molécule de référence. A J4, les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits. Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus sont analysés par la technique de PCR quantitative. a. Effet sur la synthèse des intégrines a2131 sur fibroblastes humains normaux et fibroblastes humains vieillis Les résultats obtenus concernant l'expression des ARN messagers (ARNm) des intégrines a2131 sont exprimés en pourcentage dans le 5 tableau suivant : Taux d'ARNm des intégrines a213l (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux vieillis Témoin (non traité) 100 84 TGF-131 à ing/ml 161 150 Principe actif selon l'exemple 1 120 109 de l'invention à 0,25% On constate que l'expression des ARNm des intégrines a2131 par les fibroblastes vieillis est réduite de 16% par rapport aux fibroblastes humains normaux. 10 Les résultats de l'étude montrent que le principe actif selon l'exemple 1 dosé à 0,25% augmente de 20% l'expression des ARNm des intégrines a2131 par les fibroblastes normaux et restaure l'expression des ARNm des intégrines a2131 par les fibroblastes vieillis. 15 b. Effet sur la synthèse de la vinculine sur fibroblastes humains normaux et fibroblastes humains vieillis Les résultats obtenus concernant l'expression des ARNm de la vinculine sont exprimés en pourcentage dans le tableau suivant : Taux d'ARNm de la vinculine (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux vieillis Témoin (non traité) 100 81 Principe actif selon l'exemple 1 128 103 de l'invention à 0,25% On constate que l'expression des ARNm de la vinculine par les fibroblastes vieillis est réduite de 19% par rapport aux fibroblastes humains normaux. Le principe actif selon l'exemple 1 dosé à 0,25% augmente de 28% l'expression des ARNm de la vinculine par les fibroblastes normaux et restaure l'expression des ARNm de la vinculine par les fibroblastes vieillis. Le principe actif selon l'exemple 1 favorise donc la formation des mécanorécepteurs en stimulant la synthèse de l'intégrine a2131 et de la vinculine, et participe ainsi à l'augmentation de la résistance de la peau et de ses propriétés liftantes naturelles. II.3-2/Evaluation de l'effet sur l'expression de l'alpha smooth muscle actine L'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 1 sur l'expression de l'alpha-smooth muscle actine (a-SMA), fibre de stress impliquée dans les propriétés rétractiles des fibroblastes. Cette étude est réalisée sur des fibroblastes humains normaux comparés à un modèle de fibroblastes humains vieillis. a. Etude sur fibroblastes humains normaux et fibroblastes humains vieillis par spectrofluorimétrie Le protocole opératoire est le suivant A J1, les fibroblastes humains normaux et vieillis sont ensemencés et incubés à 37 C. A J3, les cellules sont traitées. Elles sont cultivées en présence du principe actif selon l'exemple 1 à 0,25% ou 0,50% ou de TGF-131 à 1ng/ml. A J5, les cellules sont traitées comme à J3. A J8, on réalise l'immunomarquage notamment avec un anticorps primaire anti-a-SMA. La fluorescence est quantifiée à l'aide d'un fluorimètre. Les résultats obtenus, exprimés en pourcentage d'a-SMA exprimés, sont présentés dans le tableau suivant : Taux d' a-SMA (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux vieillis Témoin (non traité) 100 40 TGF-R1 à ing/ml 194 140 Principe actif selon l'exemple 1 134 65 à 0,25% Principe actif selon l'exemple 1 162 72 à 0,50% Ces résultats montrent que le principe actif obtenu selon l'exemple 1 testé à 0,50% sur fibroblastes normaux augmente le taux des a-SMA de 62% par rapport au témoin, et stimule le taux des a-SMA sur fibroblastes vieillis. b. Etude sur fibroblastes humains normaux et fibroblastes humains vieillis par immunocytologie Le protocole opératoire est le suivant A J1, les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture complet. A J3, les cellules sont traitées. Les fibroblastes humains normaux et vieillis sont traités avec le principe actif selon l'exemple 1 à 0,10% ou avec le TGF-131 à 0,50 ng/ml dans du milieu de culture complet. A J5, les cellules sont traitées comme à J3. A J8, on réalise le marquage immunocytologique des a-SMA, puis on réalise un immunomarquage à l'aide notamment d'un anticorps primaire anti-a-SMA. Les résultats sont visualisés sur un microscope couplé à un système d'analyse d'images. Ces résultats immunohistochimiques étant qualitatifs, 4 niveaux d'expression des a-SMA ont été définis : - très faible détection d'immunoréactivité + - faible détection d'immunoréactivité ++ - moyenne détection d'immunoréactivité +++ - forte détection d'immunoréactivité ++++ Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit : Expression des a-SMA Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux vieillis Témoin (non traité) +++ + Principe actif selon l'exemple 1 à 0,10% ++++ ++ On constate que le principe actif obtenu selon l'exemple 1 dosé à 0,10% augmente l'expression des a-SMA sur fibroblastes. Le principe actif obtenu selon l'exemple 1 augmente donc la résistance mécanique de la peau en stimulant la synthèse d' a-SMA. II.3-3/Evaluation de l'effet sur l'expression de collagène I Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 1 sur la synthèse de collagène I sur des fibroblastes. L'étude est réalisée par PCR quantitative sur des fibroblastes humains normaux comparés à un modèle de fibroblastes humains vieillis. A J1, les fibroblastes humains normaux et vieillis sont ensemencés à 37 C. A J3, les cellules sont traitées. Elles sont cultivées en présence du principe actif obtenu selon l'exemple 1 dosé à 0,10% ou 0,25%. A J4, les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits 15 Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus sont analysés par la technique de PCR quantitative. Les résultats obtenus concernant l'expression des ARN messagers (ARNm) de collagène I sont exprimés en pourcentage dans le tableau suivant Taux d' ARNm de collagène I (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux vieillis Témoin (non traité) 100 64 Principe actif selon l'exemple 1 - 106 à 0,10% Principe actif selon l'exemple 1 -129 à 0,25% 20 On constate que l'expression des ARNm de collagène I par les fibroblastes vieillis est réduite de 36% par rapport aux fibroblastes humains normaux. Les résultats de l'étude montrent que le principe actif selon l'exemple 1 dosé à 0,25% augmente de 29% l'expression des ARNm de collagène I par les fibroblastes vieillis. II.3-4/Evaluation de l'effet sur les propriétés biomécaniques de la peau Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité du principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion contre placebo sur les propriétés biomécaniques de la peau. L'étude est réalisée sur 20 volontaires sains de sexe féminin d'âge compris entre 39 et 70 ans. Les mesures sont réalisées au niveau du visage à l'aide d'un cutomètre. Le cutomètre est un appareil de mesure qui aspire la peau et permet de calculer divers paramètres caractéristiques des propriétés mécaniques cutanées: - La tonicité de la peau est appréciée par le paramètre X qui correspond à la tonicité ou rétractation élastique ; si X diminue, la tonicité augmente. - L'effet tenseur est apprécié par les paramètres Uf et Ue ; si Uf diminue, la peau est moins extensible donc plus tendue et si Ue diminue la peau est moins souple donc plus tendue également. L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du visage de chaque volontaire, une destinée au placebo, l'autre à l'émulsion contenant le principe actif obtenu, et on mesure les propriétés biomécaniques de la peau sur ces deux zones. Entre JO et J27, l'actif et le placebo sont appliqués biquotidiennement. A J28, on mesure les propriétés mécaniques de la peau sur les mêmes zones qu'à JO. Entre J28 et J55, l'actif et le placebo sont appliqués biquotidiennement. A J56, on mesure les propriétés mécaniques de la peau sur les zones 5 étudiées. a. Tonicité de la peau Les résultats obtenus pour le paramètre -X sont les suivants : 10 Ces résultats montrent qu'après 56 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 1 15 augmente le paramètre -X caractéristique de la tonicité de la peau de 19%. b. Tension de la peau Les résultats pour le paramètre -Uf sont exprimés dans le tableau qui 20 suit . Placebo Principe actif selon l'exemple 1 JO J28 J56 JO J28 J56 Moyenne des volontaires 0,638 0,793 0,618 0,754 0,810 0,594 Variation (Principe actif /placebo en %) +11 +19 Concernant le paramètre -Ue, les résultats sont les suivants : On constate que le principe actif obtenu selon l'exemple 1 testé à 4% en émulsion augmente les paramètres -Uf de 16% et -Ue de 19%, paramètres représentatifs de la tension de la peau. Le principe actif obtenu selon l'exemple 1 améliore donc les propriétés 10 biomécaniques de la peau : il augmente la tonicité et la tension cutanée. II.3-5/Etude des propriétés anti-rides Cette étude a pour objectif de quantifier l'efficacité anti-rides du principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion contre 15 placebo. Elle est réalisée sur 20 volontaires sains de sexe féminin d'âge compris entre 39 et 70 ans. L'efficacité anti-rides est mesurée par l'intermédiaire d'empreintes siliconées réalisées au niveau des pattes d'oie ou du sillon naso-génien des Placebo Principe actif selon l'exemple 1 JO J28 J56 JO J28 J56 Moyenne des volontaires ,010 169 0,936 150 1,208 0,914 Variation (Principe actif/placebo en %) +9 +16 Placebo Principe actif selon l'exemple 1 JO J28 J56 JO J28 J56 Moyenne des volontaires 0,779 0,930 0,725 0,926 0,968 0, 709 Variation (Principe actif/placebo en %) +10 +19 volontaires. L'analyse de ces empreintes à l'aide d'un prof ilomètre muni d'un analyseur d'images permet d'obtenir trois paramètres : le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. a. Au niveau des pattes d'oie L'étude est réalisée selon le protocole ci-dessous. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau des pattes d'oie, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Entre J28 et J55, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J56, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif par rapport à ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau qui suit : Variation/Placebo (%) à J28 à J56 Nombre de rides +1 -14 Surface totale ridée -1 -16 Longueur totale +1 -16 On constate qu'après 56 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion diminue à la fois le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. b. Au niveau du sillon naso-génien L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du sillon naso-génien, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Entre J28 et J55, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J56, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif en comparaison de ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau suivant Variation/Placebo (%) à J28 à J56 Nombre de rides -17 -23 Surface totale ridée -9 -26 Longueur totale -13 -27 On constate qu'après 56 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion diminue le nombre de rides de 23% la surface totale ridée de 26% et la longueur totale des rides de 27%. Le principe actif obtenu selon l'exemple 1 a donc des propriétés liftantes et un effet anti-rides. II.3-6/Etude des propriétés lissantes Cette étude a pour objectif de quantifier l'efficacité lissante du principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion contre placebo. L'étude est réalisée sur 20 volontaires sains de sexe féminin d'âge compris entre 39 et 70 ans. L'efficacité lissante est mesurée par l'intermédiaire d'empreintes siliconées réalisées au niveau des pattes d'oie des volontaires. L'analyse de ces empreintes à l'aide d'un prof ilomètre muni d'un analyseur d'images permet d'obtenir deux paramètres : un indice Ra de rugosité moyenne, et un indice Rz de rugosité maximale. L'étude est réalisée selon le protocole ci-dessous. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau des pattes d'oie, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Entre J28 et J55, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J56, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif par rapport à ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau qui suit : Variation/Placebo (%)à J56 à J28 à J56 Indice de rugosité moyenne (Ra) -4,8 -7,8 Indice de rugosité maximale (Rz) -4,0 -5,0 On constate qu'après 56 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 1 formulé à 4% en émulsion diminue les indices de rugosité moyenne et maximale. Le principe actif obtenu selon l'exemple 1 présente donc un effet lissant. III/ EXEMPLE 2 : PRINCIPE ACTIF OBTENU SELON L'INVENTION A PARTIR DE FIBRES D'UNE LEGUMINEUSE, LE SOJA III.1/Procédé d'obtention du principe actif Le procédé comprend la succession des étapes suivantes : -solubilisation de fibres de soja dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées ou successives, - ajustement du pH, séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation, décantation, -concentration de la fraction active par filtration, ultrafiltration, osmose inverse, ou nanofiltration, et - filtration stérilisante. III.2/Caractérisation du principe actif III.2-1/ Matières sèches On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matières sèches est compris entre 4 et 54 g/I, plus particulièrement entre 12 et 18 g/I. III.2-2/ Mesure du pH Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante conduit à des valeurs comprises entre 4 et 9, plus particulièrement entre 6 et 7. III.2-3/ Détermination de la teneur en sucres totaux On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 2 à 27 g/I, préférentiellement de 5 à 9 g/I. III.2-4/ Caractérisation des carbohydrates Le taux de sucres simples est réparti en 30,7% de mannose, 29,6% d'acide galacturonique, 15,5% de galactose, 8,9% de rhamnose, 7,2% de glucose, 5,8% d'arabinose et 2,3% de xylose. III.2-5/ Détermination de la teneur en protéines La détermination est réalisée par la méthode de Kjedhal. La teneur en protéines déduite est comprise entre 1,3 et 21 g/I, plus particulièrement 4 et 7g/l. III.3/Evaluation de l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 2 III.3-1/Evaluation de l'effet sur la synthèse des protéines du mécanorécepteur Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 2 sur l'expression de protéines du mécanorécepteur, à savoir la vinculine, marqueur des adhésions focales. L'étude est réalisée par PCR quantitative sur des fibroblastes humains normaux. A J1, les fibroblastes humains normaux sont ensemencés et incubés à 37 C. A J3, les cellules sont traitées. Elles sont cultivées en présence du principe actif obtenu selon l'exemple 2 dosé à 0,25%. A J4, les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits. Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus sont analysés par la technique de PCR quantitative. Les résultats concernant l'expression des ARNm de la vinculine sont exprimés en pourcentage dans le tableau suivant Taux d'ARNm de la vinculine (%) Témoin (non traité) 100 Principe actif selon l'exemple 2 à 0,10% 126 Ces résultats montrent que le principe actif selon l'exemple 2 dosé à 0,10% augmente de 26% l'expression des ARNm de la vinculine par les fibroblastes normaux. Le principe actif selon l'exemple 2 favorise donc la formation des mécanorécepteurs en stimulant la synthèse de la vinculine, et participe ainsi à l'augmentation de la résistance de la peau et de ses propriétés liftantes naturelles. III.3-2/Evaluation de l'effet sur l'expression de l'alpha smooth muscle actine L'objectif de cette étude est dévaluer l'effet du principe actif obtenu selon l'exemple 2 sur l'expression de l'a-SMA, fibre de stress impliquée dans les propriétés rétractiles des fibroblastes. Cette étude est réalisée sur des fibroblastes humains normaux comparés à un modèle de fibroblastes humains vieillis. Le protocole opératoire est le suivant AJO, les fibroblastes humains sont ensemencés dans un milieu de culture complet. A J3, les cellules sont traitées. Les fibroblastes humains normaux sont traités avec le principe actif selon l'exemple 2 à 0,10% dans du milieu de culture complet. A J5, les cellules sont traitées comme à J3. A J8, on réalise le marquage immunocytologique des a-SMA, puis on réalise un immunomarquage à l'aide notamment d'un anticorps primaire anti-a-SMA. Les résultats sont visualisés sur un microscope couplé à un système d'analyse d'images. Ces résultats immunohistochimiques étant qualitatifs, 4 niveaux d'expression des a-SMA ont été définis : - très faible détection d'immunoréactivité + - faible détection d'immunoréactivité ++ - moyenne détection d'immunoréactivité +++ - forte détection d'immunoréactivité ++++ Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit : Expression des a-SMA Témoin (non traité) +++ Principe actif selon l'exemple 2 à 0,10% ++++ On constate que le principe actif obtenu selon l'exemple 2 dosé à 0,10% augmente l'expression des a-SMA sur fibroblastes. Le principe actif obtenu selon l'exemple 2 augmente donc la résistance mécanique de la peau en stimulant la synthèse d' a-SMA. 10 III.3-3/Evaluation de l'effet sur les propriétés biomécaniques de la peau Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité du principe actif obtenu selon l'exemple 2 formulé à 4% en émulsion contre placebo sur les propriétés biomécaniques de la peau. 15 L'étude est réalisée sur 20 volontaires sains de sexe féminin. Les mesures sont réalisées au niveau du visage à l'aide d'un cutomètre. Le cutomètre est un appareil de mesure qui aspire la peau et permet de calculer divers paramètres caractéristiques des propriétés mécaniques cutanées: 20 - la tonicité de la peau est appréciée par le paramètre X qui correspond à la tonicité ou rétractation élastique ; si X diminue, la tonicité augmente. - l'effet tenseur est apprécié par les paramètres Uf et Ue ; si Uf diminue la peau est moins extensible donc plus tendue et si Ue diminue 25 la peau est moins souple donc plus tendue également. L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du visage de chaque volontaire, une destinée au placebo, l'autre à l'émulsion 10 15 20 contenant le principe actif obtenu, et on mesure les propriétés biomécaniques de la peau sur ces deux zones. Entre JO et J27, l'actif et le placebo sont appliqués biquotidiennement. A J28, on mesure les propriétés biomécaniques de la peau sur les 5 mêmes zones qu'à JO. a. Tonicité de la peau Les résultats obtenus pour le paramètre -X sont les suivants : Ces résultats montrent qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 2 augmente le paramètre -X caractéristique de la tonicité de la peau de 19%. b.Tension de la peau Les résultats pour le paramètre -Uf sont exprimés dans le tableau qui suit . Placebo Principe actif selon l'exemple 2 JO J28 JO J28 Placebo Principe actif selon l'exemple 2 JO J28 JO J28 Moyenne des volontaires 0,742 0,689 0,834 0,630 Variation (Principe actif/placebo en %) +19 M Moyenne des volontaires 1,151 1,071 1,253 1,005 Variation (Principe actif/placebo en %) +14 25 Concernant le paramètre -Ue, les résultats sont les suivants : Placebo Moyenne des volontaires 0,887 J0 0,847 J28 Principe actif selon l'exemple 2 0,997 JO 0,783 J28 Variation (Principe actif/placebo en %) +18 On constate que le principe actif obtenu selon l'exemple 2 testé à 4% en émulsion augmente les paramètres -Uf de 14% et -Ue de 18%, paramètres représentatifs de la tension de la peau. Le principe actif obtenu selon l'exemple 2 améliore donc les propriétés biomécaniques de la peau : il augmente la tonicité et la tension cutanée. 10 III.3-4/Etudes des propriétés anti-rides Cette étude a pour objectif de quantifier l'efficacité anti-rides du principe actif obtenu selon l'exemple 2 formulé à 4% en émulsion contre placebo. 15 Elle est réalisée sur 20 volontaires sains de sexe féminin. L'efficacité anti-rides est mesurée par l'intermédiaire d'empreintes siliconées réalisées au niveau des pattes d'oie ou du sillon naso-génien des volontaires. L'analyse de ces empreintes à l'aide d'un prof ilomètre muni d'un analyseur d'images permet d'obtenir trois paramètres : le nombre de rides, 20 la surface totale ridée et la longueur totale des rides. a. Au niveau des pattes d'oie L'étude est réalisée selon le protocole ci-dessous. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau des pattes d'oie, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, on prend les empreintes sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif par rapport à ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau qui suit : Variation/Placebo (%) J28 Nombre de rides -11 Surface totale ridée -19 Longueur totale -12 On constate qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 2 formulé à 4% en émulsion diminue à la fois le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. b. Au niveau du sillon naso-génien L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du sillon naso-génien, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif en comparaison de ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau suivant Variation/Placebo (%)J28 Nombre de rides -6 Surface totale ridée -30 Longueur totale -15 On constate qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'exemple 2 formulé à 4% en émulsion diminue le nombre de rides de 6% la surface totale ridée de 30% et la longueur totale des rides de 15%. Le principe actif obtenu selon l'exemple 2 a donc des propriétés liftantes 15 et un effet anti-rides. 20 IV/ COMPOSITION COSMETIQUE INCLUANT LE PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant le principe actif selon la présente invention dans différentes formes galéniques, notamment gel, solution, émulsion, crème.... 10 15 20 25 Il convient alors d'analyser la stabilité des formes galéniques incluant le principe actif selon l'invention, ceci dans des proportions comprises entre 1 et 5 %. La stabilité est caractérisée par une absence de précipitation de l'actif, une absence de crémage et une absence de déphasage. On peut citer des formulations ayant montré une stabilité physique incluant 5% de principe actif selon l'invention. - Carbopol : 0,5% avec Triéthanolamine qsp pl-I=6,5 - Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% -Eau:93,8% - Sépigel 305: 2,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% -Eau:92,3% Gel émulsionné : - Montanov 202 : 3,0% - Isopropyl palmitate : 12,0% -Phénonip : 0,7% - Viscolam AT 64 : 2,0% - Principe actif : 5,0% - Eau : 77,3% Emulsion non ionique : - Montanov 202 : 3,0% - Simulsol 165: 2,0% -Isopropyl palmitate : 20,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% -Eau : 69,3% Gel limpide : Gel opaque : Emulsion anionique : - Acide stéarique : 7,0% - Triethanolamine : 3,5% - Isopropyl palmitate : 20,0% -Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% - Eau:63,8% Emulsion cationique : - Quaternium-82 : 5,0% - Alcool cétylique : 3,0% -Isopropyl palmitate : 15,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% - Eau : 71,3% De plus, des tests ont montré la compatibilité du principe actif avec les matières premières utilisées en cosmétique. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif pour augmenter la résistance mécanique de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - solubilisation de fibres et/ou de graines et/ou de son de céréales et/ou de légumineuses dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées ou successives, - séparation des phases soluble et insoluble par filtration, centrifugation, décantation, - traitement de la fraction active, et - filtration stérilisante. 2. Procédé d'obtention d'un principe actif pour augmenter la résistance mécanique de la peau selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation consiste à solubiliser des graines et/ou du son de seigle. 3. Procédé d'obtention d'un principe actif pour augmenter la résistance mécanique de la peau selon la revendication 2, caractérisé en ce que le traitement de la fraction active est réalisé par traitement thermique suivi d'une purification par filtration, ultrafiltration, osmose inverse ou nanofiltration. 4. Procédé d'obtention d'un principe actif pour augmenter la résistance mécanique de la peau selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation consiste à solubiliser des fibres de soja. 5. Procédé d'obtention d'un principe actif pour augmenter la résistance mécanique de la peau selon la revendication 4, caractérisé en ce que le traitement de la fraction active consiste à concentrer la fraction active par filtration, ultrafiltration, osmose inverse ou nanofiltration. 6. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matières sèches compris entre 17 et 210 g/I, - pH compris entre 6,0 et 9,0, et - teneur en sucres totaux comprise entre 14 et 195 g/I. 7. Principe actif selon la revendication 6, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matières sèches compris entre 50 et 70 g/I, - pH compris entre 7,0 et 8,0, - teneur en protéines comprise entre 45 et 65g/l, - présence de carbohydrates sous forme de glucose, de xylose et d'arabinose, et - présence de composés phénoliques sous forme d'hydroxybenzoïques et d'hydroxycinnamique. 8. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matières sèches compris entre 4 et 54 g/I, - pH compris entre 4,0 et 9,0, - teneur en sucres totaux comprise entre 2 et 27 g/I, et - teneur en protéines comprise entre 1,3 et 21 g/I. 9. Principe actif selon la revendication 8, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matières sèches compris entre 12 et 18 g/I, - pH compris entre 6,0 et 7,0, - teneur en sucres totaux comprise entre 5 et 9 g/I, - teneur en protéines comprise entre 4 et 7 g/I, et - présence de carbohydrates sous forme de mannose, d'acide galacturonique, de galactose, de rhamnose, de glucose, d'arabinose et de xylose. 10. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour incorporation à une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'il présente un effet exhausteur de la résistance mécanique cutanée. 11. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour incorporation à une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'il augmente la tension et la tonicité de la peau. 12. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour incorporation à une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'il présente un effet anti-rides. 13. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour incorporation à une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'il favorise la formation des mécanorécepteurs des fibroblastes du derme. 14. Utilisation du principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour incorporation à une composition cosmétique, caractérisée en ce qu'il stimule la synthèse des fibres d'alphasmooth actine. 15. Composition cosmétique incluant le principe actif selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un gel limpide, d'un gel opaque, d'un gel émulsionné, d'une émulsion non ionique, d'une émulsion anionique ou d'une émulsion cationique.