Brevet FR2892196A1 — publié le 20070420

Procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée L'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, ainsi que le biocapteur obtenu par exécution de ce procédé. Un biocapteur à détection intégrée comprend un substrat de support d'éléments chromophores et un ensemble de photodétecteurs destinés à capter la lumière émise par les éléments chromophores en réponse à une excitation lumineuse, l'ensemble de photodétecteurs étant associé au substrat et formant un ensemble unitaire avec celui-ci. On connaît, par le document WO 02/16912, un biocapteur de ce type dans lequel un miroir interférentiel et une couche absorbante sont agencés dans le substrat pour rejeter la lumière d'excitation des chromophores et l'empêcher de bruiter les photodétecteurs appliqués sur la face arrière du substrat. On connaît aussi, par le document WO 2004/042376, un biocapteur à luminescence intégrée et à excitation évanescente, dont le substrat peut être associé à un ensemble de photodétecteurs et comprend en surface un guide d'onde planaire contenant des constituants photoluminescents qui sont éclairés par une lumière d'excitation primaire et qui émettent eux-mêmes une lumière d'excitation des chromophores déposés sur le guide d'onde. Ces structures ont l'avantage d'améliorer la sensibilité de la détection grâce à une augmentation très significative de l'efficacité de la collecte de la lumière émise par les chromophores et à une réduction de la capture de la lumière d'excitation ainsi qu'à une réduction de la fluorescence parasite provenant du milieu ambiant : on sait qu'environ 80 % de la lumière émise par les chromophores est transmise dans le substrat et qu'un objectif associé à une matrice de photodétecteurs CCD placée au-dessus des chromophores dans l'air ne peut capter qu'une faible fraction des 20 % du flux lumineux émis dans l'air. De ce fait, la sensibilité maximale de la détection est typiquement de l'ordre de 10 chromophores/ m2. La disposition d'un ensemble de photodétecteurs sur la face arrière du substrat ou face opposée à celle portant les chromophores permet une efficacité de collecte du flux lumineux émis par les chromophores qui est plusieurs dizaines de fois supérieure à celle d'un imageur standard placé au-dessus des chromophores. La présente invention a pour but de perfectionner encore le biocapteur à détection intégrée décrit dans le document WO 02/16912. Elle propose à cet effet un procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, le biocapteur comprenant un substrat destiné à porter des éléments chromophores qui émettent une lumière en réponse à une excitation lumineuse à une longueur d'onde donnée, et un ensemble de photodétecteurs associé au substrat pour capter la lumière émise par les éléments chromophores à l'intérieur du substrat, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à déposer sur l'ensemble de photodétecteurs des couches minces constituant à la fois le substrat précité et un filtre de rejection de la lumière d'excitation des éléments chromophores et de transmission de la lumière émise par ces éléments, ce filtre assurant une transmission de la lumière d'excitation de l'ordre de 10-6 ou moins, de préférence d'environ 10"$. Le procédé selon l'invention permet de réaliser un biocapteur à détection ultrasensible, qui est intégré et qui ne comprend pas d'objectif ou de composants optiques, et dans lequel des sondes biologiques peuvent être déposées directement sur un filtre de rejection à couches minces qui recouvre un ensemble de photodétecteurs. On peut ainsi réaliser des biocapteurs miniaturisés et à faible coût, en utilisant les techniques connues de fabrication en grande série des composants de la microélectronique, ces biocapteurs ayant de plus une sensibilité de l'ordre d'un chromophore/ m2. Dans une première forme de réalisation de l'invention, le filtre de 30 rejection comprend au moins une couche mince absorbant la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores. Cette couche absorbante peut être réalisée par tout moyen connu, par exemple par le procédé sol-gel ou par dépôt et étalement d'une couche de colorant par un procédé du type spin coating ou par trempage par un procédé du type dip coating . Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le filtre de rejection comprend un miroir de Bragg formé de couches minces de matériaux transparents à la longueur d'onde de l'émission par les chromophores, ou un filtre interférentiel formé par exemple de couches minces de polymères superposées. De préférence, ce miroir de Bragg ou ce filtre interférentiel recouvre au moins une couche absorbante qui est déposée sur l'ensemble de photodétecteurs. C'est la combinaison d'un miroir de Bragg ou d'un filtre interférentiel et d'une couche absorbante qui est susceptible de donner les meilleurs résultats en terme de rejection de la lumière d'excitation des éléments chromophores. Le miroir de Bragg produit un effet d'amplification de l'excitation par interférence constructive et un effet de réjection pure de l'excitation, la rejection étant toutefois principalement assurée par la couche absorbante. Dans une variante, le biocapteur comprend une couche de surface opaque, par exemple métallique, dans laquelle sont formés des trous, cette couche permettant de limiter le flux lumineux global sur le biocapteur. Pour réduire I'autofluorescence des molécules qui assurent l'absorption de la lumière d'excitation dans la couche absorbante, l'invention prévoit dans un mode de réalisation de former sur l'ensemble de photodétecteurs une pluralité de couches minces absorbantes superposées de natures différentes, dans lesquelles une couche inférieure (plus proche des photodétecteurs) est destinée à absorber I'autofluorescence d'une couche supérieure. Cette disposition en cascade des couches minces absorbantes est d'autant plus avantageuse que la différence spectrale entre la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores et la longueur d'onde centrale de la lumière émise par les éléments chromophores est grande. Dans un exemple de réalisation de l'invention, le filtre de réjection comprend un miroir de Bragg formé d'une série de couches minces superposées ayant une épaisseur optique égale au quart de la longueur d'onde d'excitation, ce miroir de Bragg assurant une réjection de 0,025 de l'excitation (soit 0,1 en réjection pure). Dans cette structure, des effets interférentiels à la surface du substrat permettent d'augmenter d'un facteur de l'ordre de 4 l'énergie du champ électromagnétique d'excitation, ce qui conduit à une amplification du taux de photo-excitation par un facteur 4. Pour ce qui concerne la transmission de l'énergie d'excitation à travers ces couches, cela correspond à une densité optique équivalente de 1,6. Ce miroir de Bragg est associé à une couche absorbante ayant une densité optique de 6,4, le filtre de rejection ayant une densité optique équivalente totale égale à 8, donnant lieu à un taux de réjection de 10-8. La sensibilité de la détection est alors d'un élément chromophore/ m2, pour les chromophores usuels. Le biocapteur selon l'invention peut être réalisé par dépôt d'une ou de plusieurs couches minces absorbantes sur une matrice de photodétecteurs, puis par dépôt de couches minces destinées à former un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, les différentes couches étant déposées ou formées successivement les unes sur les autres. Dans une variante de réalisation, le procédé selon l'invention consiste à réaliser le filtre de réjection sur un substrat initial, puis à déposer l'ensemble formé par le filtre et le substrat initial sur un ensemble de photodétecteurs, le filtre se trouvant entre cet ensemble de photodétecteurs et le substrat initial, et enfin à retirer le substrat initial. Dans ce cas, le filtre de rejection est fixé sur l'ensemble de photodétecteurs par adhérence, soit grâce à son adhérence propre, soit au 30 moyen d'une couche de matière adhésive appropriée. Le filtre de rejection qui est initialement formé sur le substrat initial peut comprendre un film absorbant, ou un film réfléchissant, ou l'association d'un film absorbant et d'un film réfléchissant. Par rapport à un procédé de fabrication directe des différentes couches sur le capteur, on s'affranchit de contraintes liées à diverses opérations de recuit ou de traitement et on élargit les possibilités de conception et d'intégration. Cela permet notamment de former d'abord, sur le substrat initial, un film réfléchissant tel qu'un miroir de Bragg, qui implique des opérations de recuit qui ne seraient pas bien supportées par les photodétecteurs et par le film absorbant, et de déposer ensuite sur le miroir de Bragg la couche mince ou l'ensemble de couches minces formant le film absorbant. Avantageusement, le filtre de rejection et le substrat initial peuvent former un film souple, facile à stocker et à utiliser, par exemple sous forme de rouleau. Dans une variante, le miroir de Bragg ou le filtre interférentiel peut être formé sur un substrat initial et le film absorbant peut être formé sur un autre substrat initial, ce qui permet ensuite de réaliser le biocapteur selon l'invention par report du film absorbant sur un ensemble de photodétecteurs, puis par report du miroir de Bragg ou du filtre interférentiel sur le film absorbant. Lorsque ce biocapteur est réalisé, des sondes comportant éventuellement des marqueurs fluorescents, sont déposées en phase liquide sur des zones déterminées, par exemple en réseau, sur le filtre de réjection du biocapteur (technique connue de spotting ). Après séchage, le biocapteur est stocké, pour une durée qui peut être longue. Les sondes peuvent comporter des marqueurs fluorescents. Eventuellement, un liquide tampon aqueux contenant un agent tensioactif est utilisé pour le dépôt des sondes sur le filtre de rejection, dont la surface peut être très hydrophobe. Dans un mode de réalisation de l'invention, le biocapteur portant les sondes est finalement encapsulé dans un boîtier utilisable ensuite pour l'hybridation des sondes, ce boîtier comprenant au moins une entrée et une sortie de liquide qui sont reliées dans le boîtier par un canal s'étendant sur la surface du filtre portant les sondes, au moins une fenêtre d'observation et/ou d'éclairage des sondes par la lumière d'excitation étant formée dans la face du boîtier qui recouvre les sondes. La face opposée du boîtier, qui est située du côté des photodétecteurs, permet l'accès à une interface électronique de liaison des photodétecteurs à des moyens de traitement de l'information. Typiquement, l'ensemble de photodétecteurs utilisé est une matrice de photodétecteurs CCD ou CMOS, dont la face avant est recouverte par le filtre de rejection. En variante, il peut être avantageux d'utiliser une matrice de photodétecteurs CCD ou CMOS éclairée par la face arrière, pour gagner un facteur 2 sur la sensibilité. En effet, les matrices de photodétecteurs CCD à éclairage par la face avant (du côté des photodétecteurs) ont une sensibilité réduite de l'ordre de la moitié dans le spectre visible, par rapport à celle des matrices de photodétecteurs éclairées par la face arrière, en raison de l'absorption des photons par des grilles de transfert en polysilicium. A l'inverse, l'utilisation en éclairage par la face arrière nécessite un amincissement délicat du substrat en silicium. Selon une autre caractéristique de l'invention, on forme des ouvertures dans une ou plusieurs des couches du filtre de réjection en regard de quelques uns des photodétecteurs pour l'étalonnage de la réjection de la lumière d'excitation par ces couches. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon l'invention ; - la figure 2 est une vue schématique partielle en coupe d'une variante de réalisation de ce biocapteur ; - la figure 3 est une vue schématique en coupe représentant un biocapteur selon l'invention monté dans une boîte d'hybridation ; - la figure 4 illustre schématiquement quatre étapes de la réalisation d'un biocapteur selon l'invention ; - la figure 5 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon l'invention à matrice de photodétecteurs CCD éclairée par la face arrière ; - la figure 6 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon une autre variante de l'invention ; - la figure 7 est une vue schématique partielle d'une matrice de photodétecteurs à pixels de tailles différentes ; - la figure 8 est une vue schématique en coupe d'une variante de réalisation de l'invention. Le biocapteur de la figure 1 comprend un ensemble matriciel 10 de photodétecteurs 12 du type CCD ou CMOS sur lesquels est déposée une couche 14 d'une matière destinée à absorber une radiation lumineuse d'excitation d'éléments chromophores, localisés dans des plages ou spots 16 à la surface du biocapteur, les éléments chromophores émettant une lumière centrée sur une longueur d'onde Xf lorsqu'ils sont excités par une radiation lumineuse de longueur d'onde Xe (Xf étant par exemple égale à 570 nm et Xe à 532 nm quand les éléments chromophores sont des marqueurs Cy3). Environ 80 % du flux lumineux émis par les éléments chromophores passent dans la couche absorbante 14 et sont captés par les photodétecteurs 12, le flux lumineux d'excitation à la longueur d'onde Xe étant absorbé par la couche 14. Celle-ci a de préférence une densité optique au moins égale à 6 à la longueur d'onde considérée, pour assurer une sensibilité de détection de 1 élément chromophore par m2. La couche absorbante 14 peut être formée d'une seule couche de matière absorbante, ou d'une pluralité de couches absorbantes superposées de natures différentes pour réduire l'autofluorescence de cette couche provoquée par la lumière d'excitation. Dans ce cas, une couche absorbante n située sous une couche absorbante n+1 a une nature déterminée pour absorber l'autofluorescence de la couche absorbante n+1, tout en laissant passer le flux lumineux à la longueur d'onde k f vers les photodétecteurs 12. En raison de l'absence d'élément imageur entre les chromophores et les photodétecteurs, un même photodétecteur peut recevoir des signaux lumineux en provenance de points ou zones différentes ce qui génère un signal parasite de diaphonie, d'autant plus grand que l'espacement ou distance verticale entre ces points ou zones et le photodétecteur est grande. Dans une réalisation préférée de l'invention, cet espacement est faible et le signal parasite est réduit à un minimum. Par exemple, le diamètre de ces points ou zones est de 400pm et leur espacement avec les photodétecteurs est de 10pm, de sorte que le signal parasite est minimal. Lorsque leur espacement avec les photodétecteurs est plus important et atteint 100pm, le signal de diaphonie peut être important et de nature à réduire la sensibilité de la détection. Dans ce cas, un traitement informatique de déconvolution de l'image parasitée, bien connu de l'homme du métier, permet de récupérer le signal utile en supprimant le signal parasite. La couche absorbante 14 peut être préparée et déposée sur les photodétecteurs 12 de la façon suivante : - on prépare une solution de colorant ayant une rejection compatible avec l'émission lumineuse des marqueurs fluorescents utilisés, par exemple avec le colorant commercialisé sous la dénomination ORASOL par la société CIBA, qui a un pic d'absorption centré sur 532 nm, valeur commode quand on utilise un marqueur fluorescent tel que le Cy3 précité. Ce colorant ORASOL est un complexe métallique à base de chrome ou de cobalt et comprend des ligands formés par des molécules organiques à base de dérivés azoïques. La solution de colorant est préparée par dissolution d'un gramme du colorant ORASOL dans un ml de DMF (Diméthyl Formamide). Après agitation, la solution obtenue est filtrée et mélangée avec 1,5 ml d'une solution de polyimide (commercialisée par HD Microsystems sous la référence PI 2555) ou avec du butylcyclobenzène. La solution finale a une concentration massique en colorant d'environ 400mg/ml et a un coefficient d'extinction molaire égal à 9.103 cm-1 environ. - cette solution de colorant est déposée sur les photodétecteurs d'un capteur matriciel CCD, dont la fenêtre de protection a été retirée et dont les contacts métalliques ont été protégés, par exemple par dépôt localisé d'une résine d'enrobage capable d'assurer une bonne étanchéité et une tenue mécanique et chimique lors des étapes de recuit thermique ou de photopolymérisation nécessaires à l'élaboration du biocapteur. Par exemple, on peut utiliser la résine EPOTEK T7139 de la société POLYTEC PI SA. La solution de colorant est étalée par spin coating avec une vitesse de rotation de 3000 tours par minute, l'étalement étant suivi d'un pré-recuit à 100 C pendant 30 minutes à l'étuve, puis d'un recuit à 210 C à l'étuve pendant 1h30, ces températures étant supportées par la matrice de photodétecteurs. Le film de colorant obtenu a une épaisseur de l'ordre de 10 m et une densité optique égale à 9 à la longueur d'onde de 532 nm, ce qui correspond à une transmission de 10"9. Des sondes biologiques sont ensuite déposées sur la surface de la couche absorbante 14 par une technique connue de spotting pour former les plages 16 précitées. Comme la couche absorbante 14 est de nature très hydrophobe, il est nécessaire d'utiliser pour le dépôt des sondes biologiques un liquide tampon contenant une quantité relativement élevée d'un agent tensio-actif du type SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) pour former des plages 16 d'une dimension d'environ 400 m (ou moins en fonction de l'application). On remarquera à ce propos que les dimensions relatives des différents éléments représentés en figure 1 n'ont pas été respectées dans le dessin, pour plus de clarté. En réalité, les plages 16 ont des dimensions de 100 à 400 m par exemple, la couche absorbante 14 a une épaisseur de l'ordre de la dizaine de m, les photodétecteurs 12 ont des dimensions unitaires de l'ordre de la dizaine de m, les plages 16 couvrant donc une ou plusieurs dizaines de photodétecteurs. Dans le cas général, une couche de fonctionnalisation 18 est formée sur la surface supérieure de la couche 14 sur laquelle on dépose les sondes biologiques, cette couche de fonctionnalisation permettant la fixation des sondes. Dans la variante de réalisation de la figure 2, les photodétecteurs 12 du capteur 10 sont recouverts par une pluralité de couches minces absorbantes 14 de nature différente, permettant de réduire l'influence de l'autofluorescence des colorants utilisés dans ces couches absorbantes, et par un miroir de Bragg 20 formé d'une pluralité de couches minces superposées 22 de matériau diélectrique, ayant des indices de réfraction qui sont respectivement haut et bas et qui sont disposées en alternance, d'une façon bien connue de l'homme du métier. On peut par exemple utiliser des couches alternées 22 de matériau ayant des indices de réfraction égaux à 1,45 (bas indice) et 1,95 (haut indice), le nombre de couches dépendant du rapport de ces deux indices et étant par exemple égal à 20 lorsque la densité optique recherchée du miroir de Bragg est égale à 1. Ces couches minces alternées 22 ont une épaisseur optique égale au quart de la longueur d'onde d'excitation Xe, pour augmenter d'un facteur 4, par interférences constructives, l'intensité du flux lumineux d'excitation au niveau des éléments chromophores et donc l'intensité de la lumière émise par les éléments chromophores en réponse à cette excitation. Le miroir de Bragg 20 peut ne pas être exactement centré sur la longueur d'onde d'excitation Xe, afin d'augmenter la pente de rejection totale du filtre constitué par le miroir de Bragg 20 et par l'absorbant multicouche 14. Il faut cependant que le centrage du filtre de Bragg soit réalisé de manière relativement précise sur la longueur d'onde d'excitation k e pour assurer une amplification significative (supérieure à 3) de l'excitation lumineuse. Les couches minces alternées 22 du miroir de Bragg 20 peuvent être déposées par tout procédé connu, par exemple par des techniques de dépôt physique, par un procédé sol-gel, ou encore par extrusion. Ensuite, une couche de fonctionnalisation 18 est formée sur la surface supérieure du miroir de Bragg 20, puis des plages 16 contenant des sondes biologiques peuvent être déposées et fixées sur cette couche 18 comme précédemment décrit pour le biocapteur de la figure 1. Dans une variante de réalisation, un miroir métallique semi-transparent peut jouer le rôle d'un premier filtre. Dans une variante de réalisation, le miroir de Bragg 20 déposé sur les couches absorbantes 14 peut être remplacé par un filtre interférentiel formé de couches minces superposées de polymères ayant alternativement des indices de réfraction haut et bas, la technique de fabrication de ces filtres interférentiels étant connue de l'homme du métier et décrite notamment dans le document US 6737154. Le biocapteur selon l'invention, sur lequel ont été formées les plages 16 contenant les sondes biologiques, peut être finalement encapsulé dans un boîtier ou une cartouche d'hybridation 24 (figure 3) dont une face avant 26 comporte au moins une ouverture 28 d'entrée de liquide et une ouverture 30 de sortie de liquide, reliées entre elles par un canal 32 permettant au liquide entrant par l'ouverture 28 de circuler sur la face du biocapteur portant les plages 16 de dépôt des sondes biologiques. La face avant 26 de la cartouche 24 comporte au moins une autre ouverture 34, formée en regard des plages 16 de dépôt des sondes biologiques et permettant l'éclairage de ces plages par la lumière d'excitation des éléments chromophores. Une interface électronique 36 associée à la face arrière de l'ensemble 10 de photodétecteurs est accessible par la face arrière de la cartouche d'hybridation 24 et permet de transférer les données captées par les photodétecteurs à des moyens 38 de traitement de l'information. Lorsque le filtre de réjection qui recouvre l'ensemble 10 de photodétecteurs comprend un miroir de Bragg 20 et des couches absorbantes 14, des difficultés peuvent être rencontrées pendant la fabrication du miroir de Bragg dans la mesure où celle-ci nécessite un re-cuit à température relativement élevée afin de densifier les couches 22 et d'éviter leurs déformations ultérieures alors que l'ensemble 10 de photodétecteurs et les colorants utilisés dans les couches absorbantes 14 doivent en général être protégées des températures élevées. Pour éviter ces inconvénients, l'invention propose un procédé de fabrication du biocapteur comportant les étapes essentielles a, b, c et d représentées en figure 4, ce procédé consistant, à l'étape a, à former d'abord le miroir de Bragg 20 (ou un filtre interférentiel) sur un substrat initial 40 d'un type classique, puis à déposer ou former la ou les couches absorbantes 14 sur le miroir de Bragg. Cela permet de soumettre les couches 22 du miroir de Bragg (ou du filtre interférentiel) au recuit nécessaire sans se soucier de l'influence de ce recuit sur les autres composants du biocapteur. Ensuite, à l'étape b, l'ensemble formé par le substrat 40, le miroir de Bragg 20 et la couche absorbante 14 est reporté sur l'ensemble 10 de photodétecteurs en étant retourné de sorte que la couche absorbante 14 soit appliquée sur les photodétecteurs 12 de l'ensemble 10. A l'étape suivante c, on retire le substrat initial 40 et on obtient un biocapteur du type de celui représenté en figure 2. L'étape suivante d consiste à déposer sur le miroir de Bragg 20 les plages 16 contenant les sondes biologiques. En variante, il est bien entendu possible de former le miroir de Bragg 20 (ou le filtre interférentiel) sur un substrat initial 40 et la ou les couches absorbantes 14 sur un autre substrat initial, et de les déposer tour à tour sur l'ensemble 10 de photodétecteurs en plaçant d'abord la ou les couches absorbantes 14 sur les photodétecteurs 12 et en retirant le substrat initial portant ces couches absorbantes, puis en déposant le miroir de Bragg 20 sur la ou les couches absorbantes 14 et en retirant le substrat initial 40 portant le miroir de Bragg. On peut aussi former ou déposer directement la ou les couches absorbantes 14 sur les photodétecteurs 12 de l'ensemble 10, et en parallèle former un miroir de Bragg 20 sur un substrat initial 40, puis retourner l'ensemble obtenu pour déposer le miroir de Bragg 20 sur la ou les couches absorbantes 14 portées par l'ensemble 10 de photodétecteurs et retirer le substrat initial 40. La technologie de fabrication de filtres interférentiels par empilement de couches de polymères, décrite dans le document US 6737154 est bien adaptée à ce procédé de fabrication par report, la ou les couches absorbantes et le filtre interférentiel étant fixés par collage. Dans encore une autre variante de ce procédé, ce sont les couches absorbantes 14 qui sont formées d'abord sur un substrat initial 40 puis un filtre interférentiel ou un miroir de Bragg est formé sur les couches absorbantes, après quoi l'ensemble couches absorbantes 14 et miroir de Bragg ou filtre interférentiel est retiré du substrat initial 40 et déposé et collé sur l'ensemble 10 de photodétecteurs. Dans ce cas, il est possible, après fonctionnalisation de la surface, de former les plages 16 contenant les sondes biologiques sur le miroir de Bragg 20 ou sur le filtre interférentiel avant de reporter cet ensemble sur l'ensemble 10 de photodétecteurs. Cette technologie permet de réaliser la ou les couches absorbantes 14 et le miroir de Bragg 20 ou le filtre interférentiel sous forme de films qui peuvent être des films souples, déposés sur un substrat initial 40 lui aussi constitué d'un film souple. L'ensemble du substrat initial 40, du filtre interférentiel ou du miroir de Bragg 20 et du filtre absorbant 14 constitue alors un film souple qui peut être stocké sous forme de rouleau. Si nécessaire, des particules ou des nano-fibres telles par exemple que des fullerènes, des nano-tubes de carbone, des fibres de verre... peuvent être incorporées dans ce film pour renforcer ses propriétés mécaniques. Inversement, on peut incorporer dans ce film des inclusions de taille micrométrique de polymères ayant une température de transition vitreuse supérieure à la température ambiante de telle sorte que le film puisse être rendu flexible par chauffage au moment du retrait du substrat initial 40 et redevenir rigide quand il est déposé sur l'ensemble 10 de photodétecteurs. Dans tous les modes de réalisation du biocapteur selon l'invention, le filtre de rejection de la lumière d'excitation à la longueur d'onde Xe peut être déposé, non pas sur la face avant de l'ensemble 10 de photodétecteurs 12 comme représenté au figures 1 à 4, mais sur sa face arrière comme représenté en figure 5, c'est-à-dire sur sa face opposée à celle comportant les photodétecteurs 12. Dans ce cas, le substrat de silicium est aminci jusqu'à une dizaine de pm pour éviter l'absorption des photons par le silicium. Ce substrat même aminci forme une surépaisseur qui éloigne les points lumineux du plan des photodétecteurs et peut augmenter le signal parasite de diaphonie. Un traitement informatique des données, basé sur une déconvolution de l'image parasitée, permet de supprimer le signal parasite. Dans l'exemple deréalisation de la figure 5, la ou l'ensemble de couches absorbantes 14 est recouverte par une couche 42 de silicium dopée p qui est recouverte elle-même par une couche 44 de silicium dopée n au-dessus de laquelle se trouvent les photodétecteurs 12. Les plages 16 de dépôt des sondes biologiques sont formées sur la face inférieure du miroir de Bragg 20 ou du filtre interférentiel et sont éclairées par la lumière d'excitation à la longueur d'onde Xe. Cela permet notamment de gagner un facteur 2 sur la sensibilité, car les ensembles 10 de photodétecteurs CCD éclairés sur leur face avant (du côté des photodétecteurs 12) ont une sensibilité réduite dans le spectre visible en raison de l'absorption des photons par les grilles de transfert en polysilicium qui se trouvent au niveau des photodétecteurs 12. Dans tous les modes de réalisation de l'invention, les chromophores peuvent être des nanocristaux organiques ou inorganiques incorporés dans la couche superficielle du biocapteur, comme décrit dans le document WO 2004005590. Selon une autre caractéristique de l'invention représentée en figure 6, on peut former une ou plusieurs ouvertures 46, par exemple rectangulaires, dans la ou les couches supérieures 14, 20 du biocapteur pour la calibration d'un ou de plusieurs des éléments suivants : miroir de Bragg (ou filtre interférentiel), couche absorbante,, matériel biologique pré-déposé, ... On éclaire la surface du biocapteur avec la lumière d'excitation et on compare les signaux fournis par les photodétecteurs 12 situés au niveau de ces ouvertures avec les signaux fournis par des photodétecteurs situés en dehors de ces ouvertures, pour étalonner la réjection de la lumière d'excitation par le miroir de Bragg, par la couche absorbante, par l'ensemble miroir de Bragg-couche absorbante, etc.... Les ouvertures 46 peuvent être formées soit dans une même région, soit dans de régions différentes et n'occupent que quelques pourcents de la surface utile du biocapteur. Comme représenté en figure 7, on peut utiliser dans le biocapteur selon l'invention une matrice 10 de photodétecteurs 12a, 12b ayant des tailles différentes. Cela permet de disposer des chromophores dupliqués au-dessus de pixels de tailles différentes, pour bénéficier d'une dynamique différente au niveau des signaux fournis par ces pixels, ce qui est avantageux dans le cas de signaux très faibles ou très forts. Dans la variante de réalisation de la figure 8, on a disposé, à la surface du biocapteur, sur le filtre de réjection précité, un film métallique 48 comportant des ouvertures 50 de très petite taille, d'une dimension inférieure à la longueur d'onde de la lumière émise par les chromophores. Ces ouvertures délimitent des volumes d'observation très petits (par exemple d'un diamètre de 150 nm) pour la détection et l'observation de chromophores individuels dans des solutions à concentration élevée. Ces ouvertures amplifient de plus la lumière émise par les chromophores se trouvant dans leur voisinage immédiat. En variante, le film métallique (ou opaque) 48 est déposé sur le biocapteur de la figure 6 et les trous formés dans ce film ont des dimensions plus importantes et sont en regard des ouvertures 46 formées dans les différentes couches du filtre de réjection. Le biocapteur selon l'invention est utilisable de la façon habituelle dans des solutions fluorescentes immobiles. Mais il est aussi utilisable dans des solutions fluorescentes en mouvement, en particulier dans des circuits microfluidiques. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, ce biocapteur comprenant un substrat destiné à porter des éléments chromophores qui émettent une lumière en réponse à une excitation lumineuse à une longueur d'onde donnée, et un ensemble (10) de photodétecteurs (12) associé au substrat pour capter la lumière émise par les éléments chromophores vers l'intérieur du substrat, caractérisé en ce qu'il consiste à déposer sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) des couches minces (14, 22) constituant à la fois le substrat précité et un filtre de réjection de la lumière d'excitation des éléments chromophores et de transmission de la lumière émise par ces éléments, ce filtre ayant une réjection de la lumière d'excitation d'au moins 10"6. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le filtre de 15 réjection comprend au moins une couche mince (14) absorbant la longueur d'onde d'excitation. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un miroir de Bragg (20) formé de couches minces (22) transparentes à la longueur d'onde émise par les éléments 20 chromophores , ayant respectivement des indices de réfraction haut et bas et disposées en alternance. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les couches minces (22) du miroir de Bragg (20) ont une épaisseur optique sensiblement égale au quart de la longueur d'onde d'excitation. 25 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un filtre interférentiel formé d'une série de couches minces de polymère superposées ayant des indices de réfraction haut et bas respectivement et disposées en alternance. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé 30 en ce que le filtre de réjection comprend une série de couches minces (22) formant un miroir de Bragg (20) ou un filtre interférentiel et recouvrant aumoins une couche absorbante (14) déposée sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12). 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend une pluralité de couches minces absorbantes (14) superposées de natures différentes, dans lesquelles une couche inférieure (plus proche des photodétecteurs) est destinée à absorber l'autofluorescence d'une couche supérieure. 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la ou les couches minces absorbantes du filtre de réjection ont une densité optique au moins égale à 6,4 environ à la longueur d'onde d'excitation. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 et 6 à 8, caractérisé en ce que les couches minces du filtre de réjection sont réalisées par procédé sol-gel. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins une couche mince (14) absorbant la longueur d'onde d'excitation est déposée ou formée sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12), puis des couches minces formant un miroir de Bragg (20) ou un filtre interférentiel sont déposées ou formées successivement sur la couche mince absorbante (14). 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le filtre de réjection est formé sur un substrat initial (40), puis est reporté sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12), le filtre se trouvant entre l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) et le substrat initial (40), ce substrat initial (40) étant ensuite retiré. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le filtre de réjection est fixé sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) par adhérence. 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le filtre de réjection et le substrat initial (40) forment un film souple. 14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un film absorbant (14) et un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, qui sont posés ensemble sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12). 15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un film absorbant (14) et un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, qui sont posés séparément sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12). 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche absorbante (14) est réalisée par dissolution d'un colorant dans un solvant, mélange de la solution de colorant avec une solution de polyimide ou de butylcyclobenzène, dépôt de ce mélange sur un substrat ou sur l'ensemble de photodétecteurs (12), et recuit par passage dans une étuve du substrat ou de l'ensemble de photodétecteurs portant la couche absorbante, cette couche absorbante ayant une épaisseur de l'ordre de 101.tm ou supérieure et une densité optique au moins égale à 6 environ à la longueur d'onde d'excitation. 17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des sondes comportant éventuellement des marqueurs fluorescents sont ensuite déposées en plages (16) sur le filtre de réjection. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un liquide tampon contenant un agent tensio-actif est utilisé pour le dépôt des sondes sur le filtre de réjection. 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que le biocapteur portant les sondes est encapsulé dans une cartouche ou un boîtier (24) utilisable pour l'hybridation des sondes et comprenant au moins une entrée (28) et une sortie (30) de liquide reliées par un canal (32) s'étendant sur la surface du filtre portant les sondes, et au moins une fenêtre (34) d'observation et/ou d'éclairage des sondes par la lumière d'excitation, l'ensemble (10) de photodétecteurs comportant une interface électronique (36) de liaison à des moyens (38) de traitement del'information, qui est accessible par la face arrière du boîtier ou de la cartouche. 20. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) est une matrice de photodétecteurs (12) du type CCD ou CMOS, dont la face avant porte le filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation. 21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) est une matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS, dont la face arrière porte le filtre 10 de réjection de la longueur d'onde d'excitation. 22. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on forme des ouvertures (46) dans des couches (14, 22) du filtre de réjection en regard de photodétecteurs (12) pour l'étalonnage de la réjection de la lumière d'excitation par ces couches. 15 23. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice (10) de photodétecteurs comprend des photodétecteurs (12a, 12b) de taille différente. 24. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à disposer à la surface du biocapteur un film métallique 20 (48) comportant des ouvertures (50) d'une dimension inférieure à la longueur d'onde émise par les chromophores. 25. Utilisation d'un biocapteur fabriqué selon le procédé décrit dans l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le biocapteur est dans une solution fluorescente immobile ou en mouvement, comme par 25 exemple dans un circuit microfluidique.