Brevet FR2898058A1 — publié le 20070907

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE FRACTION SEROCOLOSTRALE ENRICHIE EN TGF-R2 MAJORITAIREMENT LATENTS L'invention porte sur la préparation d'une fraction notamment hypoallergénique enrichie en TGF-332 majoritairement latents, à partir de colostrum, de préférence d'origine bovine et de première traite. La méthode de préparation utilise une chromatographie de pseudo-affinité sur colorant et permet d'obtenir des rendements élevés en TGF-f32 latents ainsi qu'un enrichissement intéressant en ces facteurs de croissance. Le colostrum bovin est une source abondante de facteurs de croissance comme les Insulin-like growth factors (IGF-I et IGF-II), Transforming growth factor-13 (TGF-131, 2, 3), Epidermal growth factor (EGF), Transforming growth factor-a (TGF-a), Plateted-derivated growth factor (PDGF). Cette richesse en facteurs de croissance suggère que ces molécules jouent un rôle important dans la croissance et le développement des veaux. La famille des TGF-f3 compte cinq membres (TGF-331 à 5) qui présentent une analogie de structure supérieure à 70 % et une similitude fonctionnelle. Parmi les cinq gènes de TGF-L3 connus à l'heure actuelle, trois seulement sont exprimés chez les mammifères (TGF-f31, 2, 3) (ROBERTS et SPORN, 1993). Dans le colostrum bovin, les TGF-132 sont majoritaires (85-95 %) par rapport aux TGF-(31 et 3. Leur concentration peut atteindre 150 à 1150 ng/ml dans des colostrums de première traite, sachant qu'elle diminue au fur et à mesure des traites. (PAKKANEN, 1998). Dans le colostrum bovin, plus de 90 % des TGFI32 sont sous forme latente (PAKKANEN, 1998). A l'heure actuelle, la forme biologiquement active ou mature des TGF-132 a été bien identifiée. Il s'agit d'un homodimère de 25 kDa et de point isoélectrique compris entre 9,5 et 10. Cependant, les caractéristiques physico-chimiques des complexes latents formés par les TGF-132 du colostrum restent inconnues, bien que de nombreuses formes aient déjà été isolées et caractérisées à partir de différents tissus ou cellules, comme les liquides des kystes mammaires 1 (ERBAS et co/%, 1999) ou les cellules de reins de singe (LIOUBIN et co/%, 1991). Ce manque d'information quant aux TGF-fit latents du colostrum rend leur purification plus difficile. De manière générale, le TGF-3 est sécrété sous forme de complexe biologiquement inactif, dans lequel la partie C-terminale du TGF-3 mature reste associée de manière non covalente à son propeptide N-terminal appelé Latent Associated Peptide (LAP). Cette association avec le LAP, qui est un dimère d'environ 80 kDa associé par ponts disulfure, forme un petit complexe latent d'environ 105 kDa. La rupture des interactions entre le LAP et le TGF-f3 rend possible la liaison du TGF-13 avec ses récepteurs membranaires, lui permettant ainsi d'exercer ses fonctions biologiques (GLEIZES et colt, 1997). In vitro, cette activation peut être réalisée par le chauffage (à partir de 65-75 C), l'utilisation de pH extrêmes ( inférieur ou égal à 4,1 ou supérieur ou égal à 11) ou le traitement enzymatique (déglycosylation et protéolyse). (LAWRENCE, 1985 ; LYONS et coll., 1988 et 1990 ; MIYAZONO et HELDIN, 1989 ; BROWN, 1990 ; KOLI, 2001) Une plus grande forme (235-345 kDa) a été identifiée dans de nombreux types cellulaires, notamment dans les fibroblastes, les plaquettes sanguines, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales et endothéliales (FEIGE et coll., 1996 ; MIYAZONO et colt,,, 1988 et 1993 ; ERBAS et coll., 1999 ; SAHARINEN et coll., 1996). Ce grand complexe latent est issu de l'association entre le petit complexe latent (TGF-p-LAP) et une protéine de liaison additionnelle de 120 à 240 kDa appelée Latent TGF-13 binding protein (LTBP). Durant la sécrétion, la LTBP se lie au LAP par l'intermédiaire de ponts disulfure. Outre les petits et grands complexes latents qui ont été localisés dans une grande variété de cellules, un autre complexe a été identifié dans un nombre limité de types cellulaires. Ce dernier qui est considéré comme étant la forme latente majoritairement présente dans le plasma humain, est constitué d'une association entre le TGF-13 et de l'a2-macroglobuline. Le rôle physiologique de ce type de complexe reste à déterminer, mais il pourrait servir de réservoir aux TGF- 2 [3, qui pourraient être libérés sur les sites d'inflammation en cas de traumatisme. (O'CONNOR-McCOURT et WAKEFIELD, 1987 ; ERBAS et colt., 1999). La latence est un antagoniste naturel à l'activité des TGF-13, maintenant ainsi un réservoir de facteurs de croissance. Elle permet de réguler leur ciblage vers la matrice extracellulaire ou vers des tissus distincts. Selon ROGERS et coll. (1996), les TGF-las latents du lait bovin comprendraient une majorité de petits complexes latents de 80 kDa et une minorité de très grands complexes latents probablement issus de l'association TGF-R-a2-macroglobuline. De nombreuses tentatives de préparations de fractions enrichies en TGF-R à partir de produits laitiers sont connues. Cependant, dans la plupart des cas, le procédé de fabrication passe inévitablement par une étape d'activation des TGF-13, qui deviennent labiles et risquent de disparaître rapidement au cours du temps. Le document WO 03/006500 Al décrit la préparation d'une fraction protéique enrichie en TGF-(3 activés à partir de lait ou de lactosérum, par précipitation protéique acide, microfiltration et diafiltration. Outre le fait que les TGF-R soient activés, le produit final contient encore une majorité d'a-lactalbumine et une petite quantité de R-lactoglobuline (moins de 11 %) qui rendent la fraction potentiellement allergisante. La préparation de fractions enrichies en TGF-R nécessite souvent la mise en oeuvre de nombreuses étapes successives de chromatographie, qui allongent et compliquent le procédé de fabrication. D'autre part, plus le nombre d'étapes nécessaires à l'obtention d'un degré de purification est important, plus le rendement en TGF-1i diminue, du fait de la dégradation progressive de ces polypeptides au cours de la purification. Le document EP 1.409.538 Al décrit un procédé d'extraction de fractions contenant des facteurs de croissance comme les TGF-Q et les IGF-1 à partir de lait et de lactosérum, ledit procédé mettant en oeuvre trois types de chromatographies successives : échange de cations, interaction hydrophobe sur groupement butyl ou phényl et séparation sur hydroxyapatite. Egalement, une molécule dimère de 25 kDa, d'abord nommée Milk Growth Factor (MGF), puis identifiée comme étant le TGF-(32 mature a été isolée à partir de lait par COX et BÜRK (1991), dont les travaux ont fait l'objet du brevet 3 européen EP 0.313.515 (CIBA Ceigy). Ici aussi, la purification met en jeu une succession de chromatographies utilisant des résines échangeuses de cations, des supports d'interactions hydrophobes (HPLC-RP) et des gels d'exclusion stérique. Bien que la grande majorité des TGF-13 (plus de 90 %) soit combinée à une ou plusieurs protéines de liaison dans le colostrum, leur purification sous cette forme latente semble très difficile. Cela peut s'expliquer par le fait que les propriétés physico-chimiques des complexes latents sont peu connues, contrairement à celles des TGF-Ç3 matures ou actifs, compliquant ainsi la mise en oeuvre d'un procédé de purification. Par ailleurs, le maintien de la latence nécessite d'employer des conditions douces, puisque la liaison entre le Latent Associated Peptide et le TGF-Ç3 mature de 25 kDa est de type faible. Par ailleurs, les procédés de préparation de fractions enrichies en TGF-1i à partir de lait ou de lactosérum, connus, sont difficilement extrapolables à la récupération de fractions similaires à partir de colostrum. En effet, le colostrum contient beaucoup plus d'immunoglobulines que le lait ou le lactosérum, ce complique l'isolement des facteurs de croissance à grande échelle, car les immunoglobulines peuvent s'adsorber sur le support chromatographique en même temps que les TGF- [32. La présente invention a pour but de proposer un procédé simplifié de préparation d'une fraction protéique enrichie en TGF-132 sous forme majoritairement latente, à partir de colostrum, en n'utilisant qu'une seule étape de chromatographie de pseudo-affinité sur colorant. L'extrait final pourra ensuite être activé soit par l'utilisation d'un traitement physico-chimique, soit lors de son passage dans le tractus digestif. La fraction d'intérêt présente également l'avantage d'être débarrassée des protéines laitières les plus allergisantes (Ç3-lactoglobuline, a-lactalbumine, caséines, tout ou partie de la sérumalbumine). A cet effet et selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une fraction protéique sérocolostrale notamment hypoallergénique enrichie en TGF-332 majoritairement latents, à partir de 4 colostrum entier, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - écrémer le colostrum entier, pour obtenir un colostrum délipidé ; - décaséiner ledit colostrum délipidé, pour obtenir un sérocolostrum délipidé ; - soumettre ledit sérocolostrum délipidé à une étape de chromatographie de pseudo-affinité sur colorant immobilisé. De manière préférée, le colostrum entier est un colostrum bovin et de première traite. La chromatographie de pseudo-affinité sur colorant immobilisé du sérocolostrum délipidé comprend les étapes suivantes : a) adsorption des molécules protéiques contenues dans le sérocolostrum délipidé, sur le colorant immobilisé sur un support formant une alors matrice chromatographique de pseudo-affinité; b) lavage de ladite matrice de pseudo-affinité ; c) élution des molécules protéiques adsorbées sur le colorant immobilisé, conduisant à l'obtention d'une fraction enrichie en TGF-t32 majoritairement latents. Le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de traitement de la fraction enrichie en TGF132 majoritairement latents, ledit traitement comprenant au moins une opération choisie dans le groupe : dessalage, concentration, séchage. Le colorant immobilisé sur une matrice de pseudo-affinité mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est apte à générer des interactions multiples du type ionique, hydrophobe, hydrogène avec des molécules protéiques, conduisant à l'immobilisation sélective des molécules protéiques d'intérêt. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-f32 totaux caractérisée en ce qu'elle comprend jusqu'à 82 % des TGF-p2 initialement présents dans le sérocolostrum, avec un taux de récupération protéique allant de 20% à 2,7% de protéines initialement présentes dans le sérocolostrum. Le facteur 5 d'enrichissement en TGF-(32 totaux dans ladite fraction protéique, calculé par rapport au sérocolostrum délipidé, peut aller jusqu'à 25,8. Selon un deuxième aspect l'invention a pour objet une fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-332 totaux caractérisée en ce que les TGF-f32 totaux 5 comprennent au moins 75% de TGF-132 latents. La fraction protéique d'intérêt présente également l'avantage d'être débarrassée des protéines laitières les plus allergisantes (8-lactoglobuline, cc-lactalbumine, caséines, tout ou partie de la sérumalbumine). Les étapes du procédé de préparation d'une fraction protéique 10 sérocolostrale hypoallergénique enrichie en TGF-R2 vont maintenant être décrites en détail. ECREMAGE Le colostrum entier de préférence bovin et de première traite (voir colostrum issu des autres traites, ou lait) est écrémé par un procédé classique 15 d'écrémage par centrifugation. DECASEINATION La décaséination du colostrum écrémé est effectuée à la présure, selon les étapes suivantes : - sous agitation modérée, la température du colostrum est augmentée 20 jusqu'à 42 C ; 50 ml de gluconate de calcium à 6%, puis 10 ml de présure sont ajoutés par litre de colostrum ; l'agitation est alors arrêtée, et le mélange est laissé 16 heures à 42 C ; le caillé compact formé laisse exsuder, en se rétractant, un surnageant 25 jaunâtre : le sérocolostrum, qui est filtré sur un tamis inox à mailles carrées de 50 pm de côté ; - le sérocolostrum est de préférence centrifugé à 9000 rpm pendant 15 minutes afin d'éliminer les lipides ou les particules insolubles résiduelles. CHROMATOGRAPHIE DE PSEUDO-AFFINITE SUR COLORANT 30 Le sérocolostrum est déposé sur une matrice de pseudo-affinité sur laquelle un colorant est immobilisé, de préférence du Cibacron Blue F3GA. La 6 chromatographie de pseudo-affinité est une technique chromatographique dans laquelle un ligand est sélectivement immobilisé pour retenir des enzymes ou d'autres protéines. Cette chromatographie permet d'éliminer la majorité des protéines du sérocolostrum lors du lavage (entre 66 et 97 %) (la totalité de la 13-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la transferrine, voire de la sérumalbumine et la majorité des immunoglobulines, comme vérifié par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS). La fraction d'intérêt est obtenue lors de l'élution. Cette fraction hypoallergénique contient très peu de protéines (entre 2,7 % et 20 %) et la majorité des TGF-132 (jusqu'à environ 82 %) sous forme majoritairement latente. En moyenne, 79 % des TGF-132 de la fraction d'intérêt sont sous forme latente et 21 % sont sous forrne active. La fraction se compose également d'immunoglobulines G et du Polymeric-immunoglobulin Receptor (Poly-Ig R), voire de sérumalbumine selon les conditions d'adsorption employées. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un facteur d'enrichissement en TGF-132 par rapport au sérocolostrum allant jusqu'à 25,8 fois. Le facteur d'enrichissement en TGF-132 est calculé par rapport au sérocolostrum : c'est le rapport entre le taux de TGF-Ç32 et le taux de protéines présents dans la fraction d'intérêt. Le restant des immunoglobulines et des protéines initialement en faible abondance dans le sérocolostrum, ainsi que la totalité de la lactoferrine non décrochés lors de l'élution, sont éliminés au cours de la procédure de nettoyage du gel. Choix du support de chromatographie Les TGF-132 latents et actifs s'adsorbent bien sur un colorant immobilisé sur une matrice qui pourra par exemple être du type agarose ou sepharose. Le gel utilisé sera de préférence le Blue Sepharose 6 Fast Flow qui est une matrice rigide de Sepharose 6 Fast Flow, sur laquelle le chromophore du bleu dextran, appelé Cibacron Blue F3GA, a été couplé de manière covalente par l'intermédiaire d'une fonction triazine. Le Cibacron Blue F3GA appartient à la famille des dérivés monochloro-triazine dont la structure comporte un cycle triazinyle très réactif. 7 Le Blue Sepharose 6 Fast Flow est adapté à l'échelle industrielle, car il est résistant, possède des capacités dynamiques élevées et donne des résultats très reproductibles. Avantageusement, le colorant immobilisé sur une matrice de pseudo-affinité mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est apte à générer des interactions multiples du type ionique, hydrophobe, hydrogène avec des molécules protéiques. De nombreux types de colorants, autres que le Cibacron Blue, peuvent être immobilisés sur des matrices de chromatographie, afin de réaliser des supports de pseudo-affinité permettant l'adsorption des TGF-82, car ils possèdent notamment des groupements de types sulfoniques et des cycles aromatiques dans leur structure. A titre d'exemples, les colorants pouvant être utilisés pour l'adsorption des TGF-332 sont choisis parmi : Cibacron Blue 3 GA, Reactive Blue 4, Reactive Blue 72, Reactive Blue 2, Basilen blue E3-G, Reactive Red 120, Reactive Red ME-BA, Procion Red HE-3B, Reactive Bright red 6C, Reactive Brown 10, Reactive Yellow 2, Reactive Yellow 3, Reactive Yellow 86, Reactive Green 5, Reactive Green 19, Procion Green HE-4BD, Reactive violet ME-RN. Préparation de l'échantillon à déposer sur le support de chromatographie Avant d'être déposé sur le gel formant le support de chromatographie, le sérocolostrum est dilué dans du tampon d'adsorption de manière à régler son pH et sa viscosité par rapport au tampon de chromatographie. Le sérocolostrum dilué est ensuite filtré sur 0,45 pm ou 0,22 pm. Il peut également être centrifugé afin d'éliminer les particules insolubles. Choix du tampon d'adsorption Deux types de paramètres d'adsorption (avec des zones de pH et des forces ioniques différentes) pourront être utilisés selon qu'on souhaite conserver une partie de la sérumalbumine dans la fraction d'intérêt, ou au contraire l'éliminer totalement. Quel que soit le type d'adsorption choisie, les taux de récupération en TGF- f32 latents et leur enrichissement dans la fraction d'intérêt resteront très satisfaisants. 8 - Paramètres d'adsorption permettant d'obtenir une fraction très hypoallergénique, sans sérumalbumine Afin d'éliminer la sérumalbumine, la p-lactoglobuline, l'a-lactalbumine et la majorité des immunoglobulines, tout en évitant au maximum l'élimination des 5 TGF-R2 latents, le tampon d'adsorption présente les propriétés suivantes : un pH compris entre 6,5 et 9,5, de préférence pH 7,4 ; une force ionique comprise entre 0,25 et 0,3 M, de préférence du NaCl 0,25M. Le tampon d'adsorption est de préférence un tampon phosphate de sodium 10 (Na2HPO4/ NaH2PO4) à pH 7,4, contenant du NaCl 0,25 M. Les tampons utilisés devront contenir une force ionique équivalente à du NaCI 0,25 à 0,3 M, et peuvent être du type : K2HPO4/ KH2PO4, Clark et Lubs (KH2PO4/ NaOH) (pH 5,8-8) ou (KCl/ H3BO3) (pH 8- 10,2), bicarbonate de sodium (NaHCO3- CO2 5 %) (pH 6.-8), Tris(Hydroxyméthyl)aminométhane (pH 7,1- 8,9), 15 borate (Na2B4O7/ HCI) (pH 8,1-9). 2- Paramètres d'adsorption pouvant conduire à l'obtention d'une fraction contenant encore une partie de sérumalbumine : Malgré la présence de la sérumalbumine, la fraction conservera un caractère hypoallergénique, puisque cette protéine ne fait pas partie des protéines 20 les plus allergisantes du sérocolostrum que sont la R-lactoglobuline et l'a-lactalbumine. En revanche, les paramètres détaillés ci-après permettront d'éliminer la [3-lactoglobuline, l'a-lactalbumine, ainsi que la majorité des immunoglobulines, tout en évitant au maximum l'élimination des TGF-132 latents au cours de l'adsorption. 25 Le tampon d'adsorption présente dans ce cas les propriétés suivantes : - un pH supérieur à 4,1 et inférieur ou égal à 9,5, de préférence pH 7,4 ; une force ionique inférieure à 0,3 M. Comme précédemment, le tampon d'adsorption sera de préférence un tampon phosphate de sodium (Na2HPO4/ NaH2PO4). Mais il pourra être remplacé 30 par un tampon ayant les mêmes propriétés de pH et de force ionique. 9 L'adsorption se fait à pH supérieur à 4,1 pour éviter l'activation des TGF-132, et à pH inférieur ou égal à 9,5 pour éviter la non adsorption d'une trop grande quantité de TGF-132. De préférence, l'adsorption se fait à pH 7,4. Après l'adsorption du sérocolostrum sur la colonne de pseudo-affinité, le restant des molécules non accrochées sera éliminé par un lavage avec le même tampon que celui utilisé lors de l'adsorption. Le lavage sera effectué jusqu'au retour à ligne de base, c'est-à-dire jusqu'au moment où l'absorbance mesurée à 280 nm sera revenue à zéro, signifiant l'absence de protéines dans la solution de lavage. Choix du tampon d'éiution Après l'élimination totale des molécules non adsorbées visualisée par le retour à ligne de base, les molécules interagissant avec le colorant seront éluées par une augmentation de la force ionique et/ou une augmentation du pH. Quel que soit le pH, le tampon d'élution doit contenir une force ionique équivalente à une concentration en NaCI supérieure ou égale à 1 M, afin de permettre l'élution d'un maximum de TGF-132. Le pH doit rester supérieur à 4,1 et inférieur à 11, pour éviter l'activation des TGF-132. Le tampon d'élution sera de préférence un phosphate de sodium (Na2HPO4/ NaH2PO4) à pH 7,4, contenant du NaCI 1M. D'autres moyens d'élution pourront cependant être utilisés : des solutions contenant une concentration en sel supérieure ou égale à 1 M, telles que du KCI 3 M ; Elution par une augmentation progressive du pH (entre 4,1 et 11), avec un maximum de TGF-132 élués à pH 10,5. Il faudra cependant conserver un pH Les figures 1 et 2 annexées montrent l'efficacité de la guanidine-HCI sur l'élution des protéines. La figure 1 présente la variation de l'absorbance à 280 nm en fonction du volume d'élution et de la concentration de guanidine-HCI. 0,8 ml sérocolostrum dilué au tiers dans du tampon phosphate de sodium (0,01 M), NaCl 0,25 M, pH 7,4 ont été déposés sur 1ml de gel Blue Sepharose 6 FF. Les protéines ont été éluées par des paliers croissants de guanidine- HO 1 M, 2 M, 3 M et 6 M préparée dans du tampon phosphate (pH 7,4). La figure 2 illustre le profil électrophorétique en SDS-PAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue Sepharose 6 Fast Flow (élution par des paliers de guanidine-HCI aux concentrations indiquées pour la figure 1). Les sept fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) (2) Molécules non adsorbées (92 % des protéines, 20 % des TGF-,32) (3) Molécules décrochées par la guanidine- HCI 1 M (4 % des protéines, 76,6 % des TGF-,32) (4) Molécules décrochées par la guanidine- HCI 2M (3 % des protéines, 1,3 % des TGF-/32) (5) Molécules décrochées par la guanidine- HCI 3 M (0,9 % des protéines, 0,9 % des TGF-132) (6) Molécules décrochées par la guanidine- HCI 6 M (0,1 % des protéines, 0,9 % des TGF-132) Cependant, la guanidine-HCI ne peut être envisagée que comme un moyen de nettoyage, car c'est un puissant activateur des TGF-F32. La figure 3 annexée 11 montre le degré d'activation des TGF-!32 d'un sérocolostrum incubé pendant 2h en présence de différentes concentrations finales en guanidine-HCI. Les résultats montrent que, même en faible concentration, la guanidine-HCI active les TGF-132. La fraction d'intérêt issue de la chromatographie contient une concentration en NaCl égale à 1 M. Elle peut être dessalée par des techniques courantes telles que la dialyse, l'électrodialyse ou la diafiltration. Elle peut ensuite être concentrée par filtration ou séchée, par exemple par lyophilisation. Par ailleurs, le support de chromatographie nettoyé pourra être reconditionné. Techniques de concentration/ dessalage Au cours de l'ultrafiltration tangentielle, la fraction d'intérêt circulera sous pression, parallèlement à une ou plusieurs membranes filtrantes de seuil de coupure devant être deux fois inférieur à la taille des facteurs de croissance, c'est-à-dire inférieur ou égal à 12,5 kDa. Ainsi, après le passage à travers une ou plusieurs membrane(s) d'ultrafiltration, on obtiendra : - un perméat (ou filtrat), qui contient le solvant et toutes les molécules dissoutes ayant un diamètre inférieur au diamètre des pores de la membrane, tels que les sels. - un rétentat (ou concentrat), qui contiendra toutes les protéines et les TGF-r32 de 20 la fraction d'intérêt, ainsi que les molécules et les particules ayant un diamètre supérieur au diamètre des pores de la membrane. Dans le cas de la filtration frontale, le passage de la fraction d'intérêt s'effectuera perpendiculairement au plan de la membrane. Là aussi, il sera préférable d'utiliser une membrane ayant un seuil de coupure inférieur ou égal à 25 12,5 kDa. Si la filtration centrifuge est utilisée pour concentrer et dessaler la fraction d'intérêt, la membrane de filtration du système de séparation centrifuge aura un seuil de coupure inférieur ou égal à 12,5 kDa. Sous l'effet de la force centrifuge, le perméat contenant les molécules ayant un diamètre inférieur à celui des pores de 30 la surface filtrante (comme les sels), traversera la membrane. En revanche, les particules de taille supérieure au seuil de coupure seront arrêtées par la membrane. 12 Que ce soit en filtration tangentielle, frontale ou centrifuge, en plus d'être concentrée, la fraction d'intérêt pourra être dessalée par diafiltration en diluant le rétentat dans plusieurs volumes d'eau désionisée, et en répétant ensuite le processus de concentration par filtration, jusqu'à obtention de la force ionique finale souhaitée. De manière caractéristique, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-132 totaux caractérisée en ce qu'elle comprend jusqu'à 82 % des TGF-132 initialement présents dans le sérocolostrum, avec un taux de récupération protéique allant de 20% à 2,7% de protéines initialement présentes dans le sérocolostrum. Par TGF-132 totaux on entend la totalité des facteurs de croissance de type TGF-132, à savoir les TGF-(32 latents (aptes à être activés) et les TGF-132 sous forme active. Cette fraction se caractérise par un facteur d'enrichissement en TGF-132 totaux, calculé par rapport au sérocolostrum délipidé, pouvant aller jusqu'à 25,8. Selon un deuxième aspect l'invention a pour objet une fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-132 totaux caractérisée en ce que les TGF-132 totaux comprennent au moins 75%, de TGF-132 latents. La fraction protéique d'intérêt présente également l'avantage d'être 20 débarrassée des protéines laitières les plus allergisantes (13-lactoglobuline, a-lactalbumine, caséines, tout ou partie de la sérumalbumine). L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples de réalisation suivants, non limitatifs de l'invention. Exemple 1 25 0,8 ml de sérocolostrum dilué au 1/3 dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M à pH 5,8 et contenant du NaCI 0,25 M ont été déposés sur une colonne contenant 1 ml de gel Blue Sepharose 6 Fast Flow. Le lavage a été réalisé avec le même tampon. Après retour à la ligne de base, la plupart des protéines adsorbées a été 30 éluée par un gradient linéaire de pH sur 20 volumes de colonne. Le gradient a été réalisé avec un mélange de tampon phosphate de sodium 0,01 M contenant du 13 NaCl 0,25 M (pH 5,8) et avec du Na2HPO4 (0,01 M) contenant du NaCl 0,25 M (ajusté à pH 10,5 avec de la soude). A la fin du gradient, une solution de Na2HPO4 (0,01 M) contenant du NaCI 0,25 M et ajustée à pH 10,5 avec de la soude a ensuite été appliquée jusqu'au retour à la ligne de base. Le restant des protéines fortement adsorbées, dont fait partie la lactoferrine, a été éliminé lors du nettoyage de la colonne par de la guanidine-HCI 1 M préparée dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M et ajustée à pH 7,4 avec de la soude. Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 4 annexée. La flèche indique le moment où la guanidine- HCI a été injectée pour nettoyer le gel. Plusieurs fractions successives ont étécollectées au cours de l'élution par le gradient (fractions 3, 4, 5,, 6, 7) afin de doser et d'analyser leur contenu en fonction des zones de pH d'élution. La figure 5 illustre le profil électrophorétique en SDS-PAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue Sepharose 6 Fast Flow (élution par un gradient de pH 5,8 à 10,5 aux concentrations indiquées pour la figure 4). Les neuf fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) (2) Molécules non adsorbées à pH 5,8 (85,2 % des protéines, 4,6 % des TGF-,62) (3) Molécules éluées entre pH 5,8 et 6,3 (quantités de protéines et de TGF-)32 négligeables) (4) Molécules éluées entre pH 6,3 et 7,6 (0,3 % des protéines, 0,0 % des TGF-)62) (5) Molécules éluées entre pH 7,6 et 9,7 (1,7 % des protéines, 2,2 % des TGF-/32) (6) Molécules éluées entre pH 9,7 et 10,5 (1,7 % des protéines, 18,8 % des TGF-,32) (7) Molécules éluées à pH 10,5 (3,2 % des protéines, 48,8 % des TGF-,32) (8) Molécules éliminées par la procédure de nettoyage Lors du lavage, 85,2 % des protéines du sérocolostrum ont été éliminées. Il s'agit essentiellement de la totalité de la p-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la transferrine, d'une partie de la sérumalbumine et de la majorité des 14 immunoglobulines. 4,6 % des TGF-132 n'ont pas été adsorbés au cours de cette étape. Le calcul de la somme des pourcentages de protéines et de TGF-(32 récupérés dans les fractions 3 à 7 (sous l'effet du gradient de pH) permet de voir que 6,9 % des protéines et 69,8 % des TGF-(32 totaux (latents et actifs) sont élués entre pH 5,8 et 10,5, pour une concentration en NaCl de 0,25 M. Les meilleurs résultats ont été obtenus quand le pH a atteint une valeur de 10,5, avec 69,8 % des TGF-(32 totaux (53,7 % TGF-(32 latents et 16,1 % TGF-F32 actifs). A pH 10,5, le facteur d'enrichissement en TGF-32 totaux par rapport au sérocolostrum est de 10,1. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la sérumalbumine ne commence à être éluée qu'à pH supérieur ou égal à 6,5, pour une concentration en NaCl de 0,25 M. Exemple 2 0,8 ml de sérocolostrum dilué au 1/3 dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M à pH 8 et contenant du NaCl 0,2 M ont été déposés sur une colonne contenant 1 ml de gel Blue Sepharose 6 Fast Flow. Le lavage a été réalisé avec le même tampon. Après retour à la ligne de base, la plupart des protéines adsorbées a été éluée avec du tampon phosphate de sodium 0,01 M contenant du NaCI 0,25 M (pH 8), puis par du NaCl 1M dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M (pH 8). Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 6 annexée. A pH 8 et pour une concentration en NaCl de 0,2 M, 93,6 % des protéines du sérocolostrum ont été éliminées. Il s'agit essentiellement de la totalité de la 13-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la sérumalbumine, de la transferrine et de la majorité des immunoglobulines. Dans ces conditions, 17 % des TGF-132 n'ont pas été adsorbés. L'augmentation de la concentration en NaCl jusqu'à 0,25 M a permis de calculer les quantités de protéines et de TGF-132 non adsorbées pour cette force 15 ionique. Si le sérocolostrum avait été directement déposé dans ces conditions, cela aurait permis d'éliminer 94,6 % des protéines et 21 % des TGF-(32. Enfin, la fraction d'intérêt éluée par le NaCI 1 M contient 3,5 % des protéines, 60 % TGF-132 totaux (46,8 % TGF-(32 latents et 13,2 % TGF-[32 actifs). Elle présente un facteur d'enrichissement en TGF-02 totaux par rapport au sérocolostrum de 17,1. Elle contient également des IgG et des récepteurs d'IgA (polymeric-immunoglobulin receptors). S'il n'y avait pas eu d'élution intermédiaire par le NaCl 0,25 M, l'élution par le NaCl 1 M à pH 5,8, aurait permis d'obtenir environ 64 % de TGF-[32 totaux (53,7 % TGF-[32 latents et 10,3 % TGF-E32 actifs). Cependant, la fraction d'intérêt éluée obtenue aurait été beaucoup moins enrichie en TGF-[32 totaux par rapport au sérocolostrum (seulement 14,2 fois). La figure 7 annexée illustre le profil électrophorétique en SDS-PAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue 15 Sepharose 6 Fast Flow. Les six fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) (2) Molécules non adsorbées pour NaCI 0,2 M (93,6 % des protéines, 17 % des TGF-,62) (3) (4) Molécules non retenues quand la [NaCl] passe à 0,25 M (1 % des protéines, 4 % des TGF-132) (5) Fraction éluée pour NaCI 1 M (= fraction d'intérêt) (3,5 % des protéines, 60 % des TGF-/32, facteur d'enrichissement en TGF-)62= 17) Exemple 3 0,8 ml de sérocolostrum dilué au 1/3 dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M à pH 5,8 et contenant du NaCl 0,25 M ont été déposés sur une colonne 20 contenant 1 ml de gel Blue Sepharose 6 Fast Flow. Le lavage a été réalisé avec le même tampon. Après le retour à la ligne de base, la plupart des protéines adsorbées a été éluée avec du tampon phosphate de sodium 0,01 M contenant du NaCI 1 M (pH 5,8). 16 Le restant des protéines fortement adsorbées, dont fait partie la lactoferrine, a été éliminé lors du nettoyage de la colonne par de la guanidine-HCI 1 M préparée dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M et ajustée à pH 5,8 avec de la soude. Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 8 annexée. Lors du lavage, 84 % des protéines du sérocolostrum ont été éliminées. Il s'agit essentiellement de la totalité de la p-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la transferrine, d'une partie de la sérumalbumine et de la majorité des immunoglobulines. 7,2 % des TGF- f32 n'ont pas été adsorbés. La fraction d'intérêt éluée par le NaCI 1 M contient 4,1 % des protéines et 65,2 % des TGF-J32 totaux (53,7 % des TGF-R2 latents et 1,5 % des TGF-rit actifs). Elle présente un facteur d'enrichissement en TGF-f32 totaux par rapport au sérocolostrum de 15,9 et contient encore beaucoup de sérumalbumine en plus des IgG et des récepteurs d'IgA (polymeric-immunoglobulin receptors), comme illustré par la figure 9 annexée, qui présente le profil électrophorétique en SDS-PAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue Sepharose 6 Fast Flow. Les cinq fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) (2) Molécules non adsorbées pour NaCI 0,25 M (84 % des protéines, 7,2 % des TGF-/32) (3) Fraction éluée pour NaCl 1 M (= fraction d'intérêt) (4,1 % des protéines, 65,2 % des TGF-132, facteur d'enrichissement= 15,9) (4) Molécules éliminées par la procédure de nettoyage Exemple 4 50 ml de sérocolostrum dilué au 1/3 dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M (pH 7,4), contenant du NaCI 0,25 M ont été déposés sur une colonne de 2,6 cm de diamètre, contenant 60 ml de gel Blue Sepharose 6 Fast Flow. Le lavage a été réalisé avec le rnême tampon. Après retour à la ligne de base, la plupart des protéines adsorbées a été éluée par du Na2HPO4 (0,01 M) contenant du NaCl 1 M et ajusté à pH 10,5 avec de la soude. 17 Le restant des protéines fortement adsorbées, dont fait partie la lactoferrine, a été éliminé lors du nettoyage de la colonne par de la guanidine-HCI 1 M préparée dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M et ajustée à pH 7,4 avec de la soude. Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 10 annexée. Lors du lavage, 92,4 % des protéines du sérocolostrum ont été éliminées. Il s'agit essentiellement de la totalité de la [3-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la sérumalbumine, de la transferrine et de la majorité des immunoglobulines. Lors de cette étape, 16,6 % des TGF-(32 n'ont pas été adsorbés. La fraction d'intérêt éluée contient 6,3 % des protéines et 70,8 % des TGF-f32 totaux (55,2 % latents + 15,6 % actifs). Le facteur d'enrichissement en TGF-f32 totaux est de 11,2. Elle contient également des IgG et des récepteurs d'IgA (polymeric-immunoglobulin receptors), comme illustré par la figure 11 annexée, qui présente le profil électrophorétique en SDS-PAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue Sepharose 6 Fast Flow. Les quatre fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) Molécules non adsorbées (92,4 % des protéines, 16,6 % des TGF-82) (2) Fraction éluée par du NaCI 1 M (= fraction d'intérêt) (6,3 % des protéines, 70,8 % des TGF-/32, facteur d'enrichissement en TGF-/62 = 11,2) (3) Molécules éliminées par la procédure de nettoyage Exemple 5 50 ml de sérocolostrum dilué au tiers dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M (Na2HPO4/ NaH2PO4) à pH 7,4 et contenant du NaCI 0,25 M ont été déposés sur une colonne de 2,6 cm de diamètre, contenant 60 ml de gel Blue Sepharose 6 Fast Flow. Le lavage a été réalisé avec le même tampon. Après retour à la ligne de base, la plupart des protéines adsorbées a été éluée par du tampon phosphate de sodium 0,01 M (pH 7,4) contenant du NaCI 1 M. Le restant des protéines fortement adsorbées, dont fait partie la lactoferrine, a été éliminé lors du nettoyage de la colonne par de la guanidine-HCI 18 M préparée dans du tampon phosphate de sodium 0,01 M et ajustée à pH 7,4 avec de la soude. Le chromatogramme obtenu est représenté à la figure 12 annexée. Lors du lavage, 96,4 % des protéines du sérocolostrum ont été éliminées. Il s'agit essentiellement de la totalité de la 13-lactoglobuline, de l'a-lactalbumine, de la sérumalbumine, de la transferrine et de la majorité des immunoglobulines. 16 % des TGF-132 n'ont pas été adsorbés au cours de cette étape. La fraction d'intérêt éluée contient 2,7 % des protéines et 69,7 % des TGF-132 totaux (55,1 % TGF-(32 latents et 14,6 % TGF-132 actifs). Le facteur d'enrichissement en TGF-(32 totaux est de 25,8. Elle contient également des IgG et des récepteurs d'IgA (polyrneric-immunoglobulin receptors), comme illustré par la figure 13 annexée, qui présente le profil électrophorétique en SDSPAGE (gradient 5-20%) des fractions obtenues après chromatographie sur Blue Sepharose 6 Fast Flow. Les quatre fractions sont détaillées ci-après : (S) Sérocolostrum (1) Molécules non adsorbées (96,4 % des protéines, 16 % des TGF-/32) (2) Fraction éluée par du NaCI 1 M (= fraction d'intérêt) (2,7 % des protéines, 69,7 % des TGF-,32, facteur d'enrichissement en TGF-82 = 25,8) (3) Molécules éliminées par la procédure de nettoyage (T étant des témoins de poids moléculaire). Les résultats présentés cidessus ont été regroupés dans le tableau 1 ci-dessous. 30 19 Paramètres Paramètres Taux de récupération Enrichissement d'adsorption en TGF-R2 totaux (actifs et latents) dans la fraction d'intérêt d'élution en TGF132 dans la [NaCI] pH fraction d'intérêt [NaCl] pH Totaux Latents Exemple 1 0,25 M 5,8 0,25 M 5,8 à 69,8 % 53,7 % 10,1 10,5 Exemple 2 0,2 M 8 1 M 8 64 % 49,9 % 14,2 0,25 M 8 1 M 8 60 % 46,8 % 17,1 Exemple 3 0,25 M 5,8 1 M 5, 8 65,2 % 52,2 % 15,9 Exemple 4 0,25 M 7,4 1 M 10,5 70,8 % 55,2 % 11,2 Exemple 5 0,25 M 7,4 1 M 7,4 69,7 % 55,1 % 25,8 Tableau 1 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES BROWN PD., WAKEFIELD LM., LEVINSON AD., et al., 1990, Physicochemical activation of recombinant latent transforming growth factor-betas 1, 2, and 3. Growth Factors, 3 : 35-43. COX D.A., BÜRK R.R., 1991, Isolation and characterization of milk growth factor, a 15 transforming growth-factor-(32-related polypeptide from bovine milk. Eur. J. Biochem., 197: 353-358. ERBAS H., LENNARD TWJ., LAI LC., 1999, Latent forms of transforming growth factor-beta 2 (TGF-(32) in breast cyst fluid. Anticancer Res., 19: 3077- 3082. 20 FEIGE J-J., QUIRIN N., SOUCHELNITSKIY S., 1996, TGF(3, un peptide sous contrôle : formes latentes et mécanismes d'activation. m/s, 8-9 (12): 929-939. 10 20 GLEIZES P-E., MUNGER J.S., NUNES I., HARPEL J.G., MAllIERI R., NOGUERA I. RIFKIN D B., 1997, TGF-(3 Latency : biological significance and mechanisms of activation. Stem Cells, 15 (3): 190-197. KOLI K., SAHARINEN J., HYYTIAINEN M., PENNTINEN C., KESKI-OJA J., 2001, Latency, activation, and binding proteins of TGF-(3. Microbiol. Res. Techn., 52 : 354-362. LAWRENCE DA., PIRCHER R., JULLIEN P., 1985, Conversion of high molecular weight latent (3- TGF from chicken embryo fibroblaste into a low molecular weight active (3- TGF under 10 acidic conditions. Biochem. Biophys Res. Commun., 133 (3) : 1026-1034. LIOUBIN MN., MADISEN L., ROTH RA., PURCHIO AF., 1991, Characterization of latent transforming growth factor-132 from monkey kidney cells. 15 LYONS RM., GENTRY LE., PURCHIO AF., 1988, Proteolytic activation of latent transforming growth factor-beta from fibroblast-conditioned medium. J. Gel/. Biol., 106: 1659-1665. LYONS RM., GENTRY LE., PURCHIO AF., 1990, Mechanism of activation of latent recombinant transforming growth factor beta 1 by plasmin. J. Cell. Biol., 110 :1361-1367. MIYAZONO K., HELDIN CH., 1989, Role of carbohydrate structures in TGF-beta 1 latency. Nature, 338: 158- 160. MIYAZONO K., HELLMAN U., WERNSTEDT C., HELDIN CH., 1988, Latent high 25 molecular weight complex of transforming growth factor-131. Purification from human platelets and structural characterization. J Biol Chem, 263: 6407-6415. MIYAZONO K., ICHIJO H., HELDIN CH., 1993, Transforming growth factor-13 : latent forms , binding proteins and receptors. Growth Factors, 8: 11-22. O'CONNOR-McCOURT M., WAKEFIELD LM., 1987, Latent transforming growth factor-beta in serum ; a specific complex with alpha 2-macroglobulin. JBiol Chem, 262: 14090-14099. PAKKANEN R., 1998, Determination of transforming growth factor-132 (TGF432) in bovine 35 colostrum samples. J. Immunoassay, 19 (1): 23-37. ROBERTS AB., SPORN MB., 1993, Physiological actions and clinical applications of transforming growth factor-13 (TGF-13). Growth Factors, 8: 1-9. 40 ROGERS M-L., GODDARD C., REGESTER G.O., BALLARD F.J., BELFORD D.A., 1996, Transforming growth factor 13 in bovine milk : concentration, stability and molecular mass forms. J. Endocrinol., 151: 77-86. SAHARINEN J. TAIPALE J., KESKI-OJA J., 1996, Association of the small latent 45 transforming growth factor-13 with an eight cysteine repeat of its binding protein LTBP-1. The EMBO Journal, 15 (2): 245-253. 50 20 30 21 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une fraction protéique sérocolostrale notamment hypoallergénique enrichie en TGF-R2 majoritairement latents, à partir de colostrum entier, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - écrémer le colostrum entier, pour obtenir un colostrum délipidé ; - décaséiner ledit colostrum délipidé, pour obtenir un sérocolostrum délipidé ; - soumettre ledit sérocolostrum délipidé à une étape de chromatographie depseudo-affinité sur colorant immobilisé. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le colostrum entier est un colostrum bovin et de première traite. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 dans lequel l'étape de chromatographie de pseudo-affinité sur colorant immobilisé du sérocolostrum délipidé comprend les étapes suivantes : a) adsorption des molécules protéiques contenues dans le sérocolostrum délipidé, sur le colorant immobilisé sur une matrice de pseudo-affinité formant support de chromatographie; b) lavage de ladite matrice de pseudo-affinité; c) élution des molécules protéiques adsorbées sur le colorant immobilisé, conduisant à l'obtention d'une fraction enrichie en TGF-132 majoritairement latents. 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel l'étape de chromatographie de pseudo-affinité sur colorant immobilisé du sérocolostrum délipidé comprend en outre les étapes de : d) nettoyage dudit support de chromatographie ; e) reconditionnement dudit support de chromatographie. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel le sérocolostrum délipidé, préalablement à son dépôt sur le colorant immobilisé, est dilué dans un tampon d'adsorption puis filtré ou centrifugé. 22. Procédé selon la revendication 5 dans lequel ledit tampon d'adsorption présente un pH supérieur à 4,1 et inférieur ou égal à 9,5 et une force ionique inférieure à 0,3 M. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 dans lequel l'élution est réalisée au moyen d'un tampon d'élution dont le pH est supérieur à 4,1 et inférieur à 11, et dont la force ionique est supérieure ou égale à 1 M. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7 dans lequel le support de chromatographie comprend une matrice du type agarose ou sepharose. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel le colorant immobilisé sur une matrice de pseudo-affinité est apte à générer des interactions multiples du type ionique, hydrophobe, hydrogène avec des molécules protéiques. 10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel le colorant est choisi dans le groupe : Cibacron Blue 3 GA, Reactive Blue 4, Reactive Blue 72, Reactive Blue 2, Basilen blue E3-G, Reactive Red 120, Reactive Red ME-BA, Procion Red HE-3B, Reactive Bright red 6C, Reactive Brown 10, Reactive Yellow 2, Reactive Yellow 3, Reactive Yellow 86, Reactive Green 5, Reactive Green 19, Procion Green HE-4BD, Reactive violet ME-RN. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 dans lequel le support de chromatographie est le Blue Sepharose 6 Fast Flow. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 11 comprenant en outre une étape de traitement de la fraction enrichie en TGF-p2 majoritairement latents, ledit traitement comprenant au moins une opération choisie dans le groupe : dessalage, concentration, séchage. 13. Procédé selon la revendication 12 dans lequel le dessalage de la fraction enrichie en TGF-[32 majoritairement latents s'effectue par dialyse, électrodialyse ou diafiltration. 14. Procédé selon la revendication 12 dans lequel la concentration de la fraction enrichie en TGF-(32 majoritairement latents se fait par une 23technique choisie parmi : ultrafiltration tangentielle, filtration frontale, filtration centrifuge. 15. Procédé selon la revendication 12 dans lequel le séchage de la fraction enrichie en TGF-(32 majoritairement latents se fait par lyophilisation. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 dans lequel la fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-J32 totaux comprend jusqu'à 82 % des TGF-(32 initialement présents dans le sérocolostrum, avec un taux de récupération protéique allant de 20% à 2, 7% de protéines initialement présentes dans le sérocolostrum. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 dans lequel la fraction protéique présente un facteur d'enrichissement en TGF-(32 totaux, calculé par rapport au sérocolostrum délipidé, pouvant aller jusqu'à 25,8. 18. Fraction protéique de sérocolostrum enrichie en TGF-(32 totaux susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que les TGF-(32 totaux comprennent au moins 75% de TGF-p2 latents. 19. Fraction protéique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle est hypoallergénique. 24