Brevet FR2891993A1 — publié le 20070420

La présente invention a pour objet des compositions pour application phytopharmaceutique destinées à stimuler les défenses naturelles des plantes, notamment de la Vigne. En particulier, l'invention a pour objet des compositions contenant des oligosaccharides secrétés par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes. Tout au long de leur développement, les plantes sont soumises à des agressions continuelles de la part de leur environnement. Cependant, elles se montrent souvent capables de résister naturellement à ces agressions extérieures grâce à la présence ou à l'activation de mécanismes de défense (Hammond- Kosack et Jones, 1996). Ainsi, bien que certains de ces mécanismes soient constitutifs et fournissent une' barrière physique et chimique à une agression, d'autres ne sont induits qu'après une attaque par un nuisible. Dès qu'une plante détecte un pathogène, elle met en place un des systèmes de défense naturelle les plus efficaces : la réponse d'hypersensibilité. Au niveau du site de pénétration du pathogène, cette réaction, rapide et violente, se traduit par la mort des premières cellules infectées et l'apparition d'une petite zone nécrotique, isolant ainsi les cellules attaquées du reste de la plante (Dangl et al., 1996 ; Lamb et Dixon, 1997). Le déclenchement de cette réponse dépend d'une reconnaissance spécifique de l'agent pathogène par la plante hôte. En effet, la plante attaquée reconnaît par l'intermédiaire d'une protéine (récepteur) des molécules produites par le pathogène, nommées éliciteurs. Chez la plante, les gènes codant pour les protéines réceptrices sont appelés gènes de résistance (gènes R), et pour le pathogène, les gènes codant pour les molécules élicitrices sont nommés gènes d'avirulence (gène Avr) : on parle alors ici d'une relation gène pour gène ou relation R-Avr (Hammond-Kosack, 1996). D'autres molécules, qualifiées d'éliciteurs généraux, sont également capables d'initier (de façon moins spécifique que les éliciteurs cités précédemment) une réaction de défense de la plante hôte. Celles-ci sont le plus souvent des oligosaccharides libérés par le pathogène (éliciteurs exogènes) ou la cellule végétale (éliciteurs endogènes) (Scheel et Parker, 1996). Ces oligosaccharides se décomposent en 4 classes : oligoglucanes, oligochitine et oligochitosane d'origine fongique ; et oligogalacturonides d'origine végétale. Les oligoglucanes sont composés de résidus 13-glucose liés en 3-, 6- et 3,6-. La chitine est un polymère linéaire de résidus N-acétyl- ù glucosamine liés en 4-, qui représente le constituant majeur de la paroi du mycélium des champignons ; le chitosane est formé des mêmes résidus désacétylés. Les oligogalacturonides sont libérés par la dégradation des composés pectiques de la paroi des cellules végétales (homogalacturonanes) suite à l'attaque du pathogène ; ils sont composés de résidus d'acide a-galacturonique liés en 4-. Les oligosaccharides doivent le plus souvent être composés d'un nombre de résidus compris entre 4 et 15, pour avoir une action élicitrice (Côté et al., 1994). Cette réaction de défense intense est ensuite suivie par la mise en place de mécanismes de défense dans les cellules voisines de la zone infectée, impliquant la diffusion d'un signal, c'est la réaction locale. Enfin, il y a émission de divers signaux d'alerte vers tous les autres organes de la plante, ce qui permet à la plante de réagir plus rapidement et plus efficacement lors d'une nouvelle agression, on parle alors de réaction systémique. Lors de ces réactions, trois catégories de systèmes de défense peuvent être activés : - la formation d'un épiderme de cicatrisation et le renforcement des parois (lignification...) (Dai et al., 1995) ; - la synthèse de protéines de défense ou Pathogenesis Related (PR) proteines découvertes en 1970 chez le Tabac. Parmi ces protéines PR on trouve, par exemple, des inhibiteurs de protéase (Ryan, 1992), des enzymes hydrolytiques, comme les chitinases ou les 13-1,3 glucanases (Derckel et al., 1996 ; Robinson et al., 1997, Kraeva et al., 1998 ; Salzman et al., 1998 ; Renault et al., 2000) ; - et la synthèse de métabolites secondaires de type phytoalexines. Parmi les métabolites secondaires, plus de 300 phytoalexines ont déjà été caractérisées. Elles appartiennent à un large spectre de classes chimiques différentes parmi lesquelles on pourra citer les coumarines, les benzofuranes, les terpènes, les alcaloïdes, et certains polyphénols (Smith,1996). La mise en place des réactions de défense des plantes implique toute une panoplie de signaux de transduction conduisant à l'induction rapide de l'expression de gènes de défense. Ainsi, la reconnaissance du pathogène par la plante hôte va activer toute une cascade de signaux dans les cellules attaquées tels que la phosphorylation de protéines par des protéines kinases, les flux d'espèces ioniques (Ca2+), la formation d'espèces oxygénées réactives (Coté et Hahn, 1994 ; Shibuya et al., 1996 ; Benhamou, 1996). De plus, les cellules attaquées sont capable de produire des signaux d'alarme transmis au cellules voisines (réaction locale) ainsi qu'à toute la plante engendrant ainsi, comme énoncé dans le paragraphe précédent, le phénomène de réaction systémique. Le mécanisme de résistance systémique le plus étudié est le phénomène de SAR ou systemic acquired resistance . Le terme de SAR a été défini par Ross en 1961. Il décrit l'apparition de résistance d'une plante consécutive à une attaque par un pathogène, aussi bien dans les parties infectées que dans les parties saines de la plante. Elle se développe, en général, après l'apparition de lésions nécrotiques autour du site d'inoculation. Cette réponse d'hypersensibilité localisée restreint le pathogène dans, et autour du site d'infection, et semble rendre la plante plus résistante aux agressions par divers organismes (Ryals et al., 1996). C'est en 1966 que Ross a développé l'idée de l'existence de molécules signal qui, à de faibles concentrations, seraient capables d'activer des mécanismes de défense dans les tissus distants de la zone infectée. Trois types de molécules peuvent intervenir chez les plantes comme signal d'alarme aux niveaux intra et intercellulaire, à courte ou longue distance : l'acide salicylique, l'éthylène et les jasmonates. Chez la Vigne, les mécanismes de signalisation impliqués dans l'expression des réactions de défense ne sont pas encore bien connus. Cependant, on retrouve la synthèse des trois types de molécules de défense (lignine, protéines de défense et phytoalexines). En particulier, le rôle de phytoalexines est notamment tenu par une famille de composés originaux : les polyphénols (Deloire et al., 2000). Présents en plus ou moins grandes quantités dans tous les organes de la plante, les phytoalexines sont inductibles au niveau des feuilles et des baies. Ce type d'induction est désigné sous le terme d'élicitation. Les facteurs d'élicitation (ou éliciteurs) peuvent avoir des origines différentes. Il peut s'agir : -d'élicitation biotique, par exemple lors d'une agression par un pathogène comme Botrytis cinerea, agent de la Pourriture grise (Jeandet et al., 1995 ; Bavaresco et al., 1997), Plasmopara viticola, agent du Mildiou (Dercks et Creasy, 1989) ou Phomopsis viticola, responsable de l'Excoriose (Hoos et Blaich, 1990). - d'élicitation abiotique par les facteurs environnementaux tels que U.V., température, lumière, asphyxie (Jeandet et al., 1997 ; Langcake et Pryce, 1977b ; Douillet-Breuil et al., 1999), le chlorure d'aluminium (Adrian et al., 1996) ou l'ozone (Sang et al., 1996). Lors d'une élicitation, des polyphénols et notamment des stilbènes comme le trans-resvératrol, le trans-picéide, l'-viniférine, la 6-viniferine et le ptérostilbène, peuvent être induits au niveau des feuilles et des baies (Soleas et al., 1997 ; Jeandet et al., 2004). Cette propriété de biosynthèse de novo de stilbènes en réponse à un stress, et en particulier après attaque par un pathogène, suggère que ces molécules pourraient jouer le rôle de moyen de défense naturelle des plantes. Ce rôle de molécules de défense est corroboré par certaines études qui semblent indiquer une corrélation étroite entre le niveau de résistance naturelle de la plante et son aptitude à synthétiser ces molécules. Par exemple, Langcake et Mc Carthy (1979) ont mis en évidence une relation entre la résistance de certaines espèces du genre Vitis à Botrytis cinerea ou Plasmopara viticola et leur capacité de biosynthèse de stilbènes (resvératrol et viniférines). De plus, Dercks et Creasy (1989) ont montré que les espèces résistantes à Plasmopara viticola produisent cinq fois plus de phytoalexines que les espèces sensibles. De même, à l'intérieur de l'espèce vinifera, on trouve des cépages plus ou moins tolérants à l'attaque par des champignons selon leur capacité de production de phytoalexines. II est également intéressant de noter chez d'autres plantes, l'acquisition de résistance à certaines maladies fongiques rendue possible après introduction du gène codant pour la stilbène synthase. Ainsi, des plants de Luzerne (Medicago sativa L.) transformés avec le gène de la stilbène synthase d'Arachide (Arachis hypogae) présentent une résistance à l'infection par Phoma medicaginis qui est corrélée à l'apparition de picéides au niveau des feuilles (Hipskind et Palva, 2000). De même, des plants de Tabac, de Tomate ou de Riz transgéniques ayant incorporé un gène codant pour la stilbène synthase de Vigne sont moins sensibles à l'infection par Botrytis cinerea, Phytophtora infestans et Pyricularia oryza, respectivement (Thomzick et al., 1997; Stark-Lorenzen et al., 1997; Hain et al., 1993 ). Plus récemment, Coutos-Thévenot et al. (2002) ont obtenu des plants de Vigne transformés par le gène de la stilbène synthase (Vstl) placé sous l'influence d'un promoteur inductible. Dans ces plantes, l'accumulation de trans-resvératrol est très nettement augmentée (d'un facteur 200) et ces Vignes transgéniques présentent une très grande résistance à Botrytis cinerea. On connaît par le document FR 2836011 un procédé pour la stimulation des défenses naturelles des plantes qui comprend l'application auxdites plantes d'un agent éliciteur ou sensibilisateur qui est capable au contact des plantes de provoquer préventivement dans celles-ci l'activation des gènes de défense sur le site d'application du produit. Ce procédé utilise une quantité efficace d'un oligo B 1-3 glucane, préparée à partir de bactéries, d'algues ou de céréales. Cependant ces oligosaccharides possèdent 20 à 33 unités osidiques, ce qui limite leur pénétration au niveau des feuilles. D'autre part, ils sont extraits à partir d'algues marines, ce qui est une source épuisable, et pouvant contenir des résidus de pollution marine. De plus, ils sont modifiés chimiquement par sulfatation. 6 2891993 Les inventeurs ont développé une technologie innovante et maîtrisée, garantissant la qualité et l'authenticité des produits. Il s'agit de la mise en culture de champignons en grand volumes, répondant aux besoins de l'industrie, notamment : 5 - L'absence de solvant et de résidus, - L'homogénéité des substrats, - La production continue, - L'absence totale de polluants, - La production standardisée et reproductible quant à la qualité et la 10 concentration des métabolites. De manière tout à fait surprenante, les inventeurs de la présente demande ont découvert que l'on pouvait directement incorporer le filtrat de culture, après autoclavage, dans une composition phytopharmaceutique. Ce procédé présente notamment l'avantage d'apporter une alternative utile et 15 innovante aux extractions conventionnelles par solvants et d'éviter ainsi de produire des effets toxiques sur la plante. Dans le cas d'une extraction à l'éthanol, comme présenté à l'exemple 1, les inconvénients sont minimes car il s'agit d'un solvant naturel, produit classiquement par des levures à partir du glucose et que l'on retrouve dans le vin ou la bière. Le but de la présente invention est de 20 proposer un procédé alternatif à l'emploi de produits chimiques et respectant ainsi l'environnement et le consommateur. De plus, l'élicitation des défenses naturelles des plantes permet de limiter la dose et le nombre de traitements Un autre aspect de l'invention se situe au niveau du mode d'action qui est préventif. En effet, cette nouvelle classe d'éliciteurs permet de simuler une 25 attaque de pathogènes au niveau des cellules de la plante. Ces dernières vont enclencher un mécanisme naturel de défense qui va provoquer une réaction d'hypersensibilité mais aussi une résistance systémique acquise, et ce au moins une fois, ce qui permettra de prévenir encore plus efficacement l'attaque ultérieure. De très faibles quantités d'éliciteurs suffisent pour sensibiliser la 30 membrane cytoplasmique. Ainsi, le seuil de détection des éliciteurs par les plantes peut atteindre une valeur de 109 Molaire ou même inférieure. Un premier aspect de la présente invention concerne une composition pour application phytopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un oligosaccharide secrété par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes. Par composition phytopharmaceutique on entend désigner selon la présente invention toute composition qui a trait à la protection des plantes ou des produits récoltés. Par oligosaccharides on entend désigner selon la présente invention des substances formées de plusieurs molécules d'oses (majoritairement de 4 à 15) liées par des liaisons osidiques. Par champignon, on entend désigner selon la présente invention toutes les espèces de champignons connues. De manière préférée, le champignon est choisi parmi Botrytis cinerea, Phomopsis viticola et Eutypa lata et leurs mélanges Bien entendu les principes actifs utilisables dans la composition selon l'invention peuvent provenir de mélanges de cultures de champignons obtenus à partir de genres différents. Selon la présente invention, le principe actif peut être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par récupération du milieu de culture et du mycélium, sans séparation. Toute la culture, c'est-à-dire le milieu de culture et le mycélium, est alors utilisé pour obtenir le principe actif. En outre, le principe actif selon l'invention peut également être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par séparation du milieu de culture d'avec le mycélium. Le principe actif est alors obtenu soit à partir du milieu de culture, soit à partir du mycélium. Dans le premier cas, le plus simple pour une exploitation industrielle, le principe actif est constitué d'une fraction acellulaire du milieu de culture. Par fraction acellulaire, on entend désigner une fraction sans cellules entières, mais pouvant contenir des fragments de cellules ainsi que des molécules initialement présentes dans le corps cellulaire. Ce milieu de culture peut être éventuellement purifié, la purification étant effectuée par précipitation d'un filtrat aqueux du milieu de culture par un solvant, de préférence de l'alcool. Dans le deuxième cas, le principe actif est obtenu par extraction et lyse des cellules du mycelium. Ainsi, par exemple, un procédé d'obtention d'un extrait de champignon caractérisé en ce que l'extrait de champignon est un filtrat de culture et/ou une préparation de mycélium comprend les étapes suivantes : a) mise en culture du champignon en milieu liquide pendant 3 à 28 jours b) séparation du filtrat de culture et du mycélium c) récupération du filtrat de culture obtenu à l'étape b) et, optionnellement, autoclavage de ce filtrat de culture et/ou d) récupération du mycélium obtenu à l'étape b) et élaboration d'une préparation de mycélium. Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du milieu de culture, le procédé ne comprend pas l'étape d) mais peut comprendre de manière optionnelle les étapes suivantes : • après l'étape c), une étape e) d'isolement d'une fraction polysaccharidique 20 à partir du filtrat de culture obtenu à l'étape c). Cette étape e) peut se faire par précipitation à l'éthanol. • une étape f) de lyophilisation de la fraction polysaccharidique isolée à l'étape e). • la fraction polysaccharidique qui est obtenue à l'étape e), et 25 éventuellement lyophilisée à l'étape f), est redissoute dans de l'eau puis optionnellement autoclavée afin d'obtenir une solution comprenant des fragments oligosaccharidiques. Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du mycélium, le 30 procédé ne comprend pas l'étape c) et l'élaboration de la préparation de mycélium à l'étape d) consiste en une extraction aqueuse, une hydrolyse acide, une hydrolyse enzymatique et/ou un autoclavage à partir du mycélium récupéré à l'étape d). Dans le cas où le principe actif est obtenu à partir du mycélium et du milieu de culture, le procédé comprend les étapes c) et d) ainsi qu'éventuellement les 5 étapes optionnelles mentionnées. Les cultures de champignons in vitro utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode connue de l'art antérieur. Notamment les cultures de champignons peuvent être réalisées dans un milieu de culture liquide, dans des fioles Erlemneyer ou en bioréacteurs. 10 Par milieu de culture on entend désigner selon la présente invention tout milieu de culture généralement connu de l'homme du métier. De tels milieux peuvent être solides, liquides ou semi-solides. De manière préférée, le milieu de culture est un milieu liquide. On peut citer comme milieu de culture solide le Malt-Agar à 2% et le milieu 15 Potato Dextrose Agar, et comme milieu de culture liquide le milieu Czapek-Dox De plus, la composition selon la présente invention peut être autoclavée. De manière préférée, le principe actif de la composition selon la présente invention est sous forme liquide. Selon la présente invention, la composition se présente sous la forme d'une 20 solution, d'un concentré, ou d'une poudre lyophilisée. Selon la présente invention, la composition est utilisée à titre préventif ou curatif. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la composition selon la présente invention pour stimuler les réactions de défense naturelle des plantes 25 vis-à-vis d'une agression présente ou à venir. Selon la présente invention, l'agression est une attaque par un pathogène, de préférence un champignon. De manière préférée, le champignon est Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora sp. ou en particulier 30 Phyhophtora infestans ou Phytophtora parasitica . Selon la présente invention, les réactions de défense naturelle des plantes sont la production par les feuilles et/ou les fruits de molécules de défense telles que les phytoalexines, comme par exemple les polyphénols de la Vigne, particulièrement les stilbènes, plus particulièrement les trans- et cis-picéides, leurs aglycones (les trans- et cis-resvératrol), le ptérostilbène ou les oligomères comme les s- et 8- viniférines. On remarque que l'expression de certains gènes est nettement augmentée, comme ceux codant la stilbène synthase, des glucanases et chitinases. Selon la présente invention, les plantes sont choisies parmi la Vigne, les 10 arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, le tabac et les plantes ornementales. De manière préférée la plante choisie est la Vigne ou la tomate. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes pour la stimulation des défenses naturelles aux agents pathogènes des 15 plantes, caractérisé en ce que l'on applique notamment aux feuilles ou aux fruits ou aux semences ou aux graines, de préférence les feuilles, une quantité efficace d'une composition selon la présente invention. Dans le procédé selon la présente invention, les plantes suivantes sont traitées: la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales, les 20 oléagineux, les protéagineux, le tabac, les plantes ornementales, de préférence la Vigne ou la tomate. Dans le procédé selon la présente invention, on traite des plantes pour lutter contre des pathogènes, de préférence des champignons, de préférence encore Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, 25 Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora infestans ou Phytophtora parasitica . De préférence on traite des plantes pour lutter contre les mildious et les oïdiums. De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention permet 30 de traiter la Vigne contre Uncinula necator (responsable de l'oïdium) et Plasmopara viticola (responsable du mildiou), et de traiter la Tomate contre Phytophtora sp. (responsable du mildiou). Le procédé selon la présente invention permet de prévenir ou traiter des maladies, de plantes telles que la pourriture grise, les oïdiums, les mildious, l'excoriose, Black-rot, l'Eutypiose, les tavelures des arbres fruitiers, la cloque du pêcher, les septorioses, les rouilles, les charbons, les caries, l'anthracnose, la pourriture du collet ou 1'Esca. De manière préférée ces maladies sont la pourriture grise, les oïdiums, les mildious. De manière encore plus préférée ces maladies sont l'oïdium de la Vigne ou le mildiou de la tomate. La liste ci-dessous reprend les principales maladies (numérotées de 1 à 11), ainsi que les champignons responsables (en italique) et les plantes touchées (entre parenthèses), pour lesquelles le procédé selon la présente invention permettrait un traitement ou une prévention : 1 ù Oïdiums Erysiphe necator = Uncinula necator (Vigne) Erysiphe graminis (céréales) Podosphera leucotricha (arboriculture, fruitiers) Sphaerotheca pannosa (Rosiers) 2 ù Mildious Plasmopara viticola (Vigne) Plasmopara helianthi (Tournesol) Phytophthora infestans (Pomme de terre) Phytophthora parasitica (Tomate) 3- Tavelures des arbres fruitiers Venturia inaequalis (pommier) Venturia pirina (poirier) 4- Cloque du pêcher Taphrina deformans 5- Septorioses Septoria nodorum et Septoria tritici (Céréales) Septoria sp. (colza) 6- Rouilles Puccinia graminis , Puccinia recondita et Puccinia strüformis (Céréales) 7- Charbons 10 Ustaligo tritici (Blé) Ustaligo maydis (Maïs) Ustaligo hordei (Orge) 8- Caries 15 Tilletia tritici, Tilletia caries et Tilletia foetida (Céréales) 9- Pourriture du collet Phoma lingam (Crucifères, Colza) Rhizoetonia solani (Pomme de terre) 20 Sclerotinia sclerotiorum (tomate) 10- Anthracnose Colletotrichum gloeosporioides (Pois) Colletotrichum lindemuthianum (haricot) 11- Pourriture grise Botrytis cinerea (Vigne) Dans la pratique, on traite les plantes dont il s'agit de stimuler les 30 défenses naturelles soit lors d'une attaque par un agent pathogène soit en vue d'une attaque future, à l'aide d'une composition, notamment d'une solution 25 aqueuse qui doit être appliquée sur les feuilles, les fruits ou sur les semences et qui comprend, outre les véhicules et constituants classiques de ce genre de composition, un ou plusieurs oligosaccharides de parois de champignons tels que définis plus haut, présents à des concentrations qui dépendent du résultat recherché, c'est-à-dire une stimulation immédiate ou une potentialisation des défenses. Le traitement est généralement réalisé à partir des premiers stades végétatifs de la plante éventuellement en plusieurs applications successives avantageusement par pulvérisation. Le moment précis de la ou des applications sera choisi notamment en fonction de la plante traitée. Le véhicule vecteur est généralement l'eau. Il est toutefois possible d'avoir recours, en lieu et place de l'eau, à un vecteur choisi dans le groupe comprenant les huiles végétales, les agents tensio-actifs, les solvants, des agents dispersants et/ou des charges solides. La présente invention sera maintenant décrite plus en détail à l'aide des exemples et compositions suivants, qui illustrent l'invention sans en limiter aucunement le cadre. Légende des figures Figure 1 : Teneur en stilbènes dans les feuilles de plantes (Vigne) traitées par l'éliciteur F241. Figure 2 : Efficacité sur le Mildiou de la Vigne du produit F241 testé à deux doses. Contamination 2 jours après le traitement et observation sur les feuilles 25 traitées. EXEMPLES Exemple 1 : Procédé de production de nouveaux éliciteurs. 30 Etape 1 : Préparation des cultures de champignons La première étape pour le développement de cultures de champignons in vitro consiste à sélectionner l'espèce produisant les substances recherchées. On admet aujourd'hui qu'au sein d'une même espèce, il existe une variabilité des capacités de production d'un métabolite donné, en partie d'origine génétique. 5 Lorsque cela est possible, il faudra donc exploiter cette variabilité en sélectionnant le meilleur génotype, c'est-à-dire le plus productif pour le métabolite recherché. La souche de champignon sélectionnée (Botrytis cinerea par exemple) est cultivée sur milieu solide (Malt-agar à 2%) pendant 10 jours à 23 + 2 C avec une 10 photopériode (16h jour/8h d'obscurité) jusqu'à l'obtention de conidies. Les conidies sont ensuite mises en suspension dans de l'eau à 0,05% de tween 20. Des aliquots de cette suspension conidienne sont ajoutés au milieu de culture Czapek-Dox modifié (3 g/L NaNO3, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L KCI, 0,5 g/L MgSO4, 0,01 g/L FeSO4, 5 g/L d'acide tartrique, 20 à 50 g/L de D-glucose ou de saccharose, 15 pH ajusté à 3,2 par KOH) préalablement stérilisé par autoclavage, à la concentration finale de 2,5.104 conidies/ml de milieu. Les cultures sont alors placées dans un fermenteur de 20 litres, à 23 2 C avec une vitesse de rotation maximale de l'agitateur de 300 tr/min. et un débit d'air au maximum de 5 vvm, pendant une durée maximale de 28 jours. 20 Etape 2 : Préparation des oligosaccharides Après séparation du mycélium et du milieu de culture par filtration sur toile à blutter (501.im) ou centrifugation, le filtrat est récupéré et soumis à un autoclavage à 115-120 C d'une durée de 40 à 60 minutes en fonction du volume 25 traité. Après ce traitement, le filtrat, appelé F241, peut être utilisé sous cette forme pour traiter les plantes ou peut être lyophilisé puis remis en solution juste avant utilisation. Eta . e 3 : Sécha e ou atomisation ou 1 o • hilisation des extraits 30 Cette étape est avantageusement opérée à une température inférieure à 60 C, par exemple entre -60 C et 50 C, à l'aide d'un lyophilisateur. Dans ce dernier cas, on obtient après lyophilisation environ 1 à 5 grammes de poudre sèche par litre de culture. La poudre obtenue est ensuite broyée à l'aide d'un broyeur, préférentiellement à l'aide d'un broyeur de type Mortier, à bille ou à couteaux. Etape 4 : mélange et / ou incorporation à un ou des excipients et/ ou à d'autres principes actifs pour la préparation de la composition à usage phytopharmaceutique Les oligosaccharides isolés sont dosés par colorimétrie grâce à la réaction phénol-acide sulfurique (Dubois et al., 1956), puis sont dilués dans de l'eau distillée ou des adjuvants. Exemple 2 : Stimulation des défenses naturelles de plants de Vigne traités par un éliciteur provenant du filtrat de culture (F241). Les essais ont été réalisés sur de jeunes plants de Vigne du cépage Cabernet Sauvignon (CS) et produits en serre à partir de boutures à un oeil. Des lots de 6 plantes ont été constitués pour l'étude de chaque modalité d'un essai. Les niveaux foliaires ont été identifiés au momentdes traitements et contaminations à l'aide d'un repère de couleur placé sous la troisième feuille étalée. On a tout d'abord traité des plantes entières des variétés CS par des compositions aqueuses contenant 0,1% de Triton, et comportant l'éliciteur F241 à la concentration de 20% (v/v) qui est la dose optimale pour l'activité élicitrice. Un mode d'apport classique par pulvérisation au moyen d'un banc de pulvérisation à jets projetés et à pression constante est utilisé. L'application est réalisée sur l'ensemble du végétal. La pression à laquelle la pulvérisation est pratiquée est fonction du volume à apporter. Un chariot de pulvérisation, équipé de 5 buses (1 supérieure centrale, 2 latérales droites, 2 latérales gauches) se déplace sur un rail de guidage à une vitesse constante. Les plantes d'un même lot sont traitées simultanément et de façon parfaitement contrôlée. Le volume d'application de l'éliciteur retenu est de 6001/ha. 48 heures après traitement des plants, un lot est sélectionné et les feuilles sont récoltées. Elles sont ensuite séchées à l'aide d'un lyophilisateur (Virtis Uni-Trap 10-100). La poudre obtenue après broyage à l'aide d'un broyeur type Mortier, est extraite par du méthanol, à raison de 10 ml pour 200 mg de matière sèche à 4 C. Après centrifugation (10 min., 3500 rpm), 8 ml d'extrait méthanolique de feuilles sont évaporés au Speed Vac. L'échantillon est repris dans 1 ml de MeOH/H20 (30/70 , v/v) puis chromatographié sur mini-colonne de silice greffée C18 (SPE). Le conditionnement des cartouches est réalisé par lavages successifs au MeOH (2 ml), au MeOH 50% (2 ml), et à l'eau distillée (6 ml). Après dépôt de l'échantillon, les stilbènes sont élués avec 5 ml de MeOH/H20 (80/20, v/v). L'éluat obtenu est directement injecté en HPLC sur colonne de silice en phase inverse (C18). Les stilbènes sont détectés par fluorescence, à une longueur d'onde d'excitation de 300 nm et une longueur d'onde d'émission de 390 nm, qui correspondent aux longueurs d'onde optimales pour les stilbènes. Les teneurs en stilbènes des feuilles sont calculées par rapport à des courbes d'étalonnage réalisées avec des composés purs. Les résultats obtenus sont réunis sur la figure 1. Exemple 3 : Etude de la résistance de plants de Vigne traités par l'éliciteur 20 F241 à une infection par Plasmopara viticola. Un lot de plantes traitées par l'éliciteur sont séchées à température ambiante puis remises en serre jusqu'au moment de leur contamination 48 heures plus tard. Le matériel fongique est constitué d'un ensemble de sporocystes de bonne 25 viabilité issu d'une souche de mildiou ou d'oïdium de référence, sensibles aux principales familles fongicides utilisées à l'heure actuelle. La suspension de sporocystes est préparée dans une eau permutée maintenue à basse température afin de bloquer la libération des zoospores jusqu'au moment de l'inoculation. Par un lavage des feuilles infectées, les 30 sporulations du champignon sont récupérées et mises en suspension dans de l'eau permutée. Une titration de la concentration de l'inoculum est opérée à l'aide d'une cellule de Malassez. La concentration optimale recherchée est de 50 000 sp/ml. Pour une plante, environ 10 ml de suspension de sporocystes sont pulvérisés. La préparation de l'inoculum se déroule juste avant la contamination. Chaque plante est manipulée isolément et contaminée sur tous les niveaux de feuilles. Les plantes d'une même condition sont alors placées en incubation dans des enceintes d'isolement. Une brumisation d'eau à l'intérieur de ces enceintes individuelles permettra une saturation en humidité permanente très favorable au développement de la maladie. Toutes les plantes sont mises en incubation après leur contamination dans une salle climatisée à 21 2 C et éclairée 14 heures par jour. Les plantes restent dans ces conditions pendant 8 jours. Au terme de cette période, une notation des dégâts du champignon est réalisée sur chaque plante et pour chaque étage foliaire. La notation est basée sur une observation visuelle de l'intensité des dégâts du champignon décomposée en deux éléments : la surface colonisée par le champignon et l'intensité de la sporulation. Nous utilisons une échelle allant de 0 à 100% (par pas de 5%). Chaque feuille est observée de façon individuelle. Les étages foliaires notés dans le cas de plantes sont ceux correspondant au quatrième niveau de feuille au moment du traitement et des suivants (F4 ; F3 ; F2 ; F1, NI, N2, N3...). Un lien de couleur disposé sous la troisième feuille étalée au moment du traitement nous permet de repérer aisément les différents niveaux de feuille sans aucune équivoque. La moyenne des dégâts notés sur les 6 plantes d'un même lot est dans un premier temps calculée. La plante dont les dégâts sont les plus éloignés de cette moyenne (forte ou faible attaque) est écartée. La moyenne des 5 plantes les plus homogènes sera alors calculée et donnera le taux de dégâts pour chaque condition de l'essai. L'efficacité (E) de chaque modalité de l'essai est ensuite être calculée en référence au lot de plantes non traitées de l'essai selon la formule : E = {[(T-D)/T]*100} où, T est la note moyenne d'attaque sur les plantes non traitées, et D celle observée sur les plantes traitées à la dose d. Une analyse de variance permet la comparaison des résultats et de donner, le cas échéant, les différences entre les conditions étudiées. Les résultats sont présentés sur la figure 2. La figure 2 présente les intensités d'attaque ainsi que les efficacités notées sur les différents lots de plantes (Vigne) traitées ou non par l'éliciteur F241. Près de 43% de surface végétale est attaquée par le mildiou après traitement avec l'éliciteur à la dose 2%. Par contre, les dégâts sont très faibles sur les plantes traitées avec ce même produit à la dose 20% (moins de 1% de dégâts). REVENDICATIONS 1. Composition pour application phytopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un oligosaccharide secrété par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par récupération du milieu de culture et du mycélium, sans séparation, et éventuellement purification du milieu de culture et du mycélium. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par séparation du milieu de culture d'avec le mycélium. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le principe actif est constitué d'une fraction acellulaire du milieu de culture. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le milieu de culture est purifié par précipitation d'un filtrat aqueux du milieu de culture par de l'alcool. 25 6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu après extraction et lyse des cellules du mycélium. 7. Composition selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que le milieu de culture est un milieu liquide. 30 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est autoclavée. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le principe actif est sous forme lyophilisée ou atomisée. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le champignon est choisi parmi Botrytis cinerea, Phomopsis viticola et Eutypa Tata et leurs mélanges. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution, d'un concentré, ou d'une poudre lyophilisée. 15 12. Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est utilisée à titre préventif ou curatif 13. Utilisation de la composition selon la revendication 12 pour stimuler les réactions de défense naturelle des plantes vis-à-vis d'une agression présente ou à 20 venir. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'agression est une attaque par un pathogène, de préférence un champignon. 25 15. Utilisation selon la revendication 14 caractérisée en ce que le champignon est Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa Tata ou Phytophtora sp.. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que les réactions de défense naturelle des plantes sont la production par les 30 feuilles et/ou les baies des plantes de molécules de défense telles que les polyphénols, particulièrement les stilbènes, plus particulièrement les trans et cis10picéides, leurs aglycones, les trans et cis resveratrol, les pterostilbènes ou less et viniferine et/ou la production de protéines PR. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que les plantes sont choisies parmi la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, le tabac et les plantes ornementales, de préférence la Vigne et la tomate. 18. Procédé de traitement des plantes pour la stimulation des défenses naturelles aux agents pathogènes des plantes, caractérisé en ce que l'on applique notamment aux feuilles ou aux fruits ou aux semences ou aux graines, de préférence les feuilles, une quantité efficace d'une composition selon l'une des revendications 1 à 12. 19. Procédé de traitement des plantes selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'on traite les plantes suivantes : la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales, les oléagineux, les protéagineux, le tabac, les plantes ornementales, de préférence la Vigne et la tomate. 20. Procédé de traitement des plantes selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que l'on traite des plantes pour lutter contre des pathogènes, de préférence des champignons, de préférence encore Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, ou Phytophtora sp. 21. Procédé de traitement des plantes selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 caractérisé en ce qu'il permet de prévenir ou traiter des maladies de plantes telles que la pourriture grise, l'oïdium, le mildiou, l'excoriose, Black-rot, l'Eutypiose, ou l'Esca.30