Brevet FR2896692A1 — publié le 20070803

NOUVELLES COMPOSITIONS COSMETIQUES ET DERMATOLOGIQUES A BASE D'EXTRAITS D'ALGUES La présente invention se rapporte au domaine des nécessités de la vie et plus particulièrement au domaine des compositions destinées à améliorer ou traiter la peau. L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions cosmétiques ou dermatologiques associant 2 extraits d'algues pour accroître d'une manière importante la stabilité des 13-endorphines dans les cultures de tissu tout en stimulant très fortement l'expression de 13-endorphine et des héparane sulfates par les cellules L'invention a spécifiquement pour objet des compositions cosmétiques ou dermatologiques caractérisées en ce qu'elles contiennent comme principe actif une association d'extraits de la micro-algue Cyclotelle et de l'algue Padina pavonica, dont on connaît l'effet stimulant sur l'expression des protéoglycanes, dans un excipient ou dans un véhicule inerte non-toxique permettant l'application sur la peau. Une telle préparation possède la propriété d'augmenter sensiblement la production de f3-endorphine dans les tissus. La cinétique de dégradation de la [i-endorphine montre normalement une dégradation à plus de 50 % au bout de 3 heures. Les effets de l'association selon l'invention consistent donc à retarder très notablement la dégradation de la f3-endorphine, obtenant ainsi une stabilité pendant au moins 8 heures, voire même plus de 24 heures. On connaît déjà l'effet de l'extrait de Cyclotelle sur l'expression de la proopiomélanocortine par les cellules, notamment de la (3-endorphine. Cet effet est décrit dans les brevets français n 2774292 (INOVAT) et n 2838459 (au nom de COMBE Pierre), le produit utilisé étant un extrait éthanolique ou acétonique. On a constaté que la réponse cellulaire est dose-dépendante et que l'extrait de Cyclotelle reste statistiquement actif de façon significative jusqu'à une dilution de 1/2000. L'induction de l'expression d'héparane sulfate grâce à la présence d'extrait de Padina pavonica assure une protection de la (3-endorphine, qui est dégradée à une vitesse beaucoup plus lente : entre 40 et 50% de cette molécule sont préservés après 24 heures d'incubation d'une culture cellulaire. L'induction de l'expression de l'héparane sulfate endogène constitue donc à la fois un réservoir et une protection, permettant en même temps de stocker les molécules de (3-endorphine et de préserver leur intégrité structurale pour une activité biologique plus intense et plus durable. On connaît depuis les années 1970 le rôle important joué par les endorphines et par les enképhalines dans la perception de la douleur. Cette sécrétion de molécules opioïdes ou peptidiques, d'origine cérébrale ou périphérique, constitue un mécanisme normal de lutte contre la douleur et pour la sensation de bien être, de confort ou de plaisir. Cependant en raison du caractère labile de telles molécules leur effet est transitoire et leur utilisation contre la douleur s'en trouve très limitée. Il a donc fallu modifier chimiquement les structures des enképhalines pour arriver à obtenir une molécule stable, résistant aux processus physiologiques de dégradation. Une telle transformation chimique s'accompagne souvent d'une baisse importante du niveau d'activité ou même d'une disparition de l'effet antalgique. Il était donc important de disposer d'un moyen susceptible d'assurer d'une manière durable l'intégrité de la structure des endorphines et principalement de la (3-endorphine d'une manière durable, sans affecter son niveau d'activité. L'induction d'une expression accrue d'héparane sulfate par un extrait d'algues, en particulier par un extrait éthanolique ou acétonique de l'algue Padinapavonica, permet de réaliser cet objectif. L'essence de l'invention réside dans l'obtention d'une expression conjointe d'héparane sulfate. L'expression d'héparane sulfate (protéo glycane) et de (3-endorphine est obtenu par des extraits d'algues ; tout extrait de plante susceptible d'induire une surexpression de protéoglycane sulfaté peut être utilisé. Le terme "héparane sulfate" est un terme général qui sert à désigner d'une manière globale, tout poly saccharide dérivé de l'héparane, naturel, synthétique ou recombinant, d'un poids moléculaire variant de 6.000 à 30.000 Da. 30 Les compositions selon l'invention comportent en outre des véhicules ou des diluants lipophiles, hydrophiles ou amphiphiles, qui permettent l'application sur la peau d'une quantité efficace de préparation pour assurer une expression importante et durable de P--endorphine.25 Les essais biologiques reportés ci-après mettent en évidence le niveau élevé d'activité des compositions selon l'invention sur l'expression et la stabilité de la J3-endorphine, permettant ainsi d'amener une sensation de soulagement et/ou de plaisir durable après un traumatisme ou une plaie importante. I - ACTIVITE BIOLOGIQUE DE L'EXTRAIT DE CYCLOTELLE 1 - Expression de 0-endorphine But Evaluer l'activité biologique d'un extrait brut de Cyclotelle en mesurant l'expression de a-10 endorphine par les kératinocytes humains (HaCaT) en culture. Protocole : Traitement des cellules : Les kératinocytes sont ensemencés à une densité de 50.000 cellules /puits (microplaques 96 15 puits) dans 200 l de milieu de culture. Après une nuit d'incubation, les surnageants sont éliminés, puis remplacés par le même volume de milieu neuf seul (contrôle) ou contenant 0.5 % d'une solution éthanolique de l'extrait de Cyclotelle (flacon de 5 ml). Les cellules ainsi traitées sont incubées pendant 48 heures. 20 A la fin de l'incubation, les surnageants sont éliminés et les tapis cellulaires sont rincés 3 x 5 minutes dans 300 1,11 de tampon PBS, puis fixés dans un volume de 50 l d'une solution à 4 % de paraformaldéhyde contenant 0.01 % de Triton X-100. Après 30 minutes de fixation à 4 C, les tapis cellulaires sont rincées plusieurs fois dans le tampon PBS suivi immédiatement du marquage de (3-endorphine à l'aide de la technique d'immunofluorescence indirecte. 25 Mesure de la fluorescence A la fin de la réaction d'immunofluorescence, les cellules sont lysées grâce à un tampon de lyse permettant la mise en solution de la fluoresceine. Les surnageants fluorescents ainsi obtenus sont lus au spectrofluorimètre (Fluoroskan) à une longueur d'onde d'excitation de 485 30 nm et à une longueur d'onde d'émission de 518 nm. Les valeurs obtenues sont des valeurs arbitraires mais proportionnelles à la quantité de (3-endorphine marquée. Conclusion Les résultats montrent que l'addition de l'extrait de Cyclotelle dans le milieu de culture stimule très fortement l'expression de f3-endorphine par les cellules kératinocytaires. Il est à noter que la réponse cellulaire est dose-dépendante et que l'effet de l'extrait de Cyclotelle reste statistiquement significatif jusqu'à une dilution de 1/2000. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 1 ci-après annexée. 2-Stabilité de 0-endorphine dans le surnageant de culture. Les résultats obtenus sur la cinétique de dégradation de la 0-endorphine montrent une disparition beaucoup plus rapide du neuropeptide dans les milieux PBS et surnageant de culture, en absence de l'héparane sulfate. Cependant, à partir de 2 heures d'incubation, on observe que la vitesse de dégradation de (3-endorphine est plus accélérée dans le surnageant de culture par rapport au tampon PBS, en conséquence de la présence de certains enzymes de dégradation comme les protéases. En revanche, lorsque l'héparane sulfate est présent, aussi bien dans le tampon PBS que dans le surnageant de culture, la 0-endorphine est dégradée à une vitesse beaucoup plus lente, préservant ainsi entre 40 et 50 % des molécules après 24 heures d'incubation à température ambiante contre seulement 9 % environ en l'absence de l'héparane sulfate. La présence de l'héparane sulfate constitue un réservoir qui va permettre à la fois de stocker les molécules de 0-endorphine et de préserver leur intégrité structurale pour une activité biologique plus intense et plus durable. II - STABILITE DE (3-ENDORPHINE ENDOGENE But Mesurer la cinétique de dégradation de (3-endorphine néosynthétisée par les kératinocytes dans le surnageant de culture, en présence ou en absence de l'héparane sulfate. Protocole La cinétique de dégradation de 0-endorphine endogène a été mesurée dans le milieu extracellulaire c'est-à-dire dans le surnageant de culture dans lequel le neuromédiateur a été libéré, par les kératinocytes pour enrichir le surnageant de culture en (3-endorphine. Les cellules ont été incubées en présence de l'extrait de Cyclotelle. Après 24 heures d'incubation le milieu conditionné kératinocytaire est récupéré puis divisé en 2 parties dont l'une sera supplémentée avec de l'héparane sulfate à la concentration de 5 g/ml. Ces 2 milieux contenant de la 0-endorphine en présence ou en l'absence d'héparane sulfate sont ensuite incubés à température ambiante (22+/-l C), puis les concentrations du neuropeptide sont immédiatement déterminées par la technique d'immunofluorescence indirecte après 1, 2, 3, 4, 8 et 24 heures. Les densités de fluorescences sont quantifiées à l'aide d'un spectrofluorimètre (Fluoroscan) à une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une longueur d'onde d'émission de 518 nm. Le choix d'étudier la cinétique de dégradation de la [3-endorphine dans le surnageant de culture a été fait afin de reproduire plus ou moins exactement les propriétés physiologiques du milieu extracellulaire de l'organisme dans lequel le neuromédiateur est naturellement libéré. Ainsi, dans les milieux extra cellulaires "in vivo" comme "in vitro" se trouvent de nombreuses autres molécules biologiquement actives, notamment des enzymes de dégradation, qui peuvent interférer dans la stabilité et l'activité de la 0-endorphine. Ces résultats sont mis en évidence dans les figures 2 et 3 ci-après annexées. Système neuro-cutané Le système nerveux et le tissu cutané sont très étroitement liés à la fois par leur origine embryonnaire (le système nerveux et la peau proviennent tous les deux du même tissu, l'ectoderme) et par l'existence de connexions cutanéo-nerveuses distales, les prolongements dendritiques des cellules neuronales étant présentes aussi bien dans le derme que dans l'épiderme. Les cellules nerveuses ont de véritables contacts avec les cellules cutanées et notamment avec les kératinocytes. Neuromédiateurs cutanés Au niveau de la peau humaine a été mis en évidence la présence de nombreux neuromédiateurs, parmi lesquels on peut citer la substance P, le neuropeptide Y, le CGRP (calcitonin gene-related peptide), le VIP (vasoactive intestinal peptide) et les POMC (proopiomelanocortines). Ces neuromédiateurs sont libérés par les cellules nerveuses elles- mêmes. Ainsi, les populations kératinocytaires et fibroblastiques sont capables de synthétiser les POMC dans des conditions normales en quantités non négligeables. 0-endorphine Il s'agit d'un neuromédiateur et plus exactement d'un neurohormone appartenant à la famille des mélanocortines, qui inclut aussi d'autres molécules comme ACTH, MSH et Met-enképhaline. Ces neuropeptides proviennent tous de la même protéine qui est la proopiomelanocortine. Cette dernière va subir un clivage protéolytique pour se scinder en plusieurs petites molécules peptidiques (citées ci-dessus) biologiquement actives. Toutefois, la 0-endorphine reste le représentant principal de cette famille, surtout pour son rôle physiologique important dans l'organisme. En effet, la 13-endorphine est connue pour ses effets divers, notamment ses effets analgésiques et anti-inflammatoires provoquant des sensations de confort, de bien-être, de plaisir voire d'euphorie. Il est évident que la molécule de 0-endorphine présente un grand intérêt, ceci non seulement pour ses propriétés évoquées précédemment, mais aussi parce qu'elle peut être synthétisée sur place par des cellules de la peau. L'activité de synthèse de ces cellules peut être modulée, ouvrant ainsi la voie à une cosmétologie active orientée vers l'obtention du confort, du bien-être, et du plaisir. La sécrétion de (3-endorphine peut être stimulée par plusieurs facteurs comme le sport, les variations de température et les pressions mécaniques exercées sur la peau (contact, massage...). Ainsi lorsque son taux augmente suffisamment dans le sang, la 0-endorphine procure chez l'individu une sensation graduelle mais fugace de bien-être et de plaisir. Stabilité de l'activité biologique de 0-endorphine Comme toute molécule de nature peptidique, la 0-endorphine est très instable dans les milieux biologiques. Sa durée de vie est rendue très courte par la présence dans le milieu intercellulaire d'enzymes de dégradation, regroupés sous l'appellation générale de protéases. En effet, aussitôt synthétisées par les cellules et libérées dans le milieu extracellulaire, les molécules de 0-endorphine sont aussitôt dégradées par ces protéases. Pour prolonger dans le temps les sensations de bien être et de plaisir, il est donc obligatoire de maintenir stable ce type de peptide. Les résultats obtenus sur l'expression de 0-endorphine par les kératinocytes et par les fibroblastes sont représentés aux figures 4 et 5 ci-après annexées. Les dosages de 0-endorphine intra et extracellulaire montrent une stimulation importante de l'expression du neuropeptide par les cultures de kératinocytes et de fibroblastes, après addition de l'extrait de Cyclotelle seul ou associée à un extrait de Padina pavonica et ce, dès les premières 24 heures d'incubation. Toutefois, on constate que cette expression est de plus en plus élevée en fonction du temps, dès lors que l'extrait de Cyclotelle est associé à un extrait de Padina pavonica. Par ailleurs, on note une induction significative de l'expression de [3-endorphine par un extrait de Padina pavonica seul à partir de 48 H pour les kératinocytes et 72 H pour les fibroblastes. Cette induction est liée indirectement à l'effet réservoir de l'héparane sulfate dont la synthèse est largement stimulée par un extrait de Padina pavonica, ce qui explique aussi l'efficacité plus importante de l'extrait de Cyclotelle lorsqu'il est associé à un extrait de Padina pavonica. En effet, comme ce dernier augmente la synthèse des protéoglycanes et notamment de l'héparane-sulfate, on assiste à une fixation en grand nombre des molécules de (3-endorphine par cette matrice extracellulaire riche en protéoglycanes, qui va les accumuler au fil du temps tout en préservant leur activité biologique comme il est montré aux figures 4 et 5. Comment faire durer le plaisir ? L'effet clinique insuffisant observé avec l'extrait de Cyclotelle est dû à la disparition rapide par dégradation extracellulaire, de [3-endorphine. On a donc recherché un procédé capable de stabiliser la molécule très rapidement au moment de sa synthèse. Il a été trouvé qu'une quantité importante d'héparane sulfate administrée localement permet de stabiliser la molécule. En effet, ce protéoglycane est connu pour développer une forte affinité vis-à-vis de nombreuses molécules physiologiques. Les molécules liées à l'héparane sulfate deviennent beaucoup plus stables et plus actives. Pour induire la stabilité recherchée il est apparu judicieux de stimuler la synthèse de l'héparane sulfate en rajoutant à l'extrait de Cyclotelle un autre composant comme l'extrait de Padina pavonica dont on connaît l'effet stimulant sur l'expression des protéoglycanes, notamment de l'héparane-sulfate. Par ailleurs, il est à noter que dans le tissu cutané, l'héparane sulfate est localisé surtout au niveau de la membrane basale et est synthétisé aussi bien par les kératinocytes (cellules épidermiques) que par les fibroblastes (cellules dermiques). La présence de ce protéoglycane en quantités suffisantes va donc permettre la fixation et par conséquent la stabilisation d'un plus grand nombre de molécules de 0-endorphine, augmentant ainsi leur biodisponibilité. Le rôle réservoir que joue l'héparane sulfate pour les molécules de (3-endorphine est d'une importance capitale pour le maintien de leur activité et pour la prolongation de l'effet clinique désiré. Synthèse de (3-endorphine par les kératinocytes humains Effets croisés de l'extrait de Cyclotelle et d'extrait de Padine. Méthode On mesure l'effet de l'extrait de Padine qui est un stimulant de l'expression des protéoglycanes, sur la cinétique de synthèse de la (3-endorphine par les kératinocytes et les fibroblastes en présence d'extrait de Cyclotelle. Protocole Traitement des cellules Les kératinocytes ou les fibroblastes sont ensemencés à une densité de 50.000 cellules par puits (microplaques 96 puits) dans 200 l de milieu de culture. Après 1 nuit d'incubation, les surnageants sont éliminés, puis remplacés par le même volume de milieu neuf seul (contrôle) ou contenant : - soit l'extrait de Cyclotelle - soit l'extrait de Padine - soit l'extrait de Cyclotelle + un extrait de Padina pavonica Les cellules ainsi traitées sont incubées pendant 24 heures, 48 heures, 72 heures et 7 jours. Les milieux de culture et les traitements sont renouvelés tous les 2 jours. A la fin de chaque intervalle de temps, les surnageant sont éliminés et les tapis cellulaires sont rincés 3 x 5 dans 300 l du tampon PBS, puis fixés dans un volume de 50 l d'une solution à 4 % de parafoinialdehyde contenant 0.01 % de Triton X-100. Après 30 minutes de fixation à 4 C, les tapis cellulaires sont rincés plusieurs fois dans le tampon PBS suivi immédiatement du marquage de la (3-endorphine à l'aide de la technique d'immunofluorescence indirecte. Mesure de la fluorescence A la fin de la réaction d'immunofluorescence, les cellules sont lysées grâce à un tampon de lyse permettant la mise en solution de la fluorescéine. Les surnageants fluorescents ainsi obtenus sont lus au spectrofluorimètre (Fluroskan) à une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et à une longueur d'onde d'émission de 518 nm. Les valeurs obtenues sont des valeurs arbitraires mais proportionnelles à la quantité de 13-endorphine marquée. Les valeurs obtenues sont rassemblées dans les tableaux 1 et 2 ci-après et dans les figures 6 et 7 ci-après annexées. Tableau 1 1 - Synthèse de 13-endorphine par les kératinocytes 24H 48H 72H 7J Contrôle 0,274 0,412 0,529 0,74 Cycl. 0,436 0,775 0,961 1,507 Extrait de Padine 0,332 0,559 0,757 1,196 Cycl.+Extrait de Padine 0,524 1,014 1,239 2,102 Tableau 2 2 - Synthèse de (3-endorphine par les fibroblastes 24H 48H 72H 7J Contrôle 0,081 0,282 0,355 0,649 Cycl. 0,139 0,495 0,607 1,126 Extrait de Padine 0,113 0,328 0,485 1,346 Cycl.+Extrait de Padine 0,158 0,736 0,952 2,385 Tableau 3 Cinétique de dégradation de la e-endorphine Qté (3-End. Valeur 1 Valeur 2 Valeur 3 Valeur 4 Moyenne Ecart-type 0,25 ng/ml 0,072 0,07 0,065 0,069 0,069 0,003 0,5 ng/ml 0,135 0,127 0,119 0,121 0,126 0,007 1 ng/ml 0,173 0,168 0,161 0,166 0,167 0,005 2 ng/ml 0,274 0,276 0,27 0,272 0,273 0,003 4 ng/ml 0,402 0,406 0,3999 0,398 0,401 0,004 8 ng/ml 0,73 0,734 0,686 0,62 0,693 0,053 16 ng/ml 1, 085 1,069 1,01 1,019 1,046 0,037 Ces résultats sont figurés graphiquement à la figure 8. Tableaux 4 et 5 Concentration d'héparane sulfate utilisée : 1 g/ml (pour saturer les puits). Concentration de (3-Endorphine utilisée : 5ng/ml (déterminée d'après la courbe étalon). Sans H-S Valeur 1 Valeur 2 Valeur 3 Moyenne Ecart-type OH 0,39 0,416 0,425 0,410 0,018 1 H 0,328 0,316 0,317 0,320 0,007 2H 0,22 0,224 0,231 0,225 0,006 3H 0,154 0,156 0,149 0,153 0,004 4H 0,103 0,111 0,107 0,107 0,004 8H 0,049 0,038 0,04 0,042 0,006 24H 0,048 0,06 0,036 0,048 0,012 Avec H-S Valeur 1 Valeur 2 Valeur 3 Moyenne Ecart-type OH 0,359 0,401 0,419 0,393 0,031 1H 0,427 0,388 0,385 0,400 0,023 2H 0,341 0,341 0,347 0,343 0,003 3H 0,321 0,311 0,321 0,318 0,006 4H 0,294 0,308 0,327 0,310 0,017 8H 0,273 0,248 0,259 0,260 0,013 24H 0,161 0,17 0,177 0,169 0,008 Tableau 6 et 7 Milieu conditionné des kératinocytes récolté après 24 heures de culture M.0 sans H-S Valeur 1 Valeur 2 Valeur 3 Moyenne Ecart-type OH 0,478 0,517 0,525 0,507 0,025 1H 0,413 0,429 0,461 0,434 0,024 2H 0,271 0,241 0,261 0,258 0,015 3H 0,183 0,166 0,153 0,167 0,015 4H 0,097 0,109 0,103 0,008 8H 0, 062 0,061 0,062 0,001 24H 0,049 0,046 0,047 0,047 0,002 M.0 avec H-S Valeur 1 Valeur 2 Valeur 3 Moyenne Ecartype OH 0,557 0,585 0,588 0,577 0,017 1 H 0,599 0,578 0,575 0,584 0,013 2H 0,521 0,51 0,516 0,516 0,006 3H 0,481 0,466 0,462 0,470 0,010 4H 0,423 0,45 0,449 0,441 0,015 81-1 0,388 0,392 0,396 0,392 0,004 24H 0,308 0,263 0,26 0,277 0,027 Les compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'invention, contiennent de 0,001 mg à 0,1 mg d'extrait de Cyclotelle et de 0,005 mg à 5 mg d'extrait de Padina pavonica pour cent g et de préférence de 0,02 mg à 0,5 mg d'extrait de Cyclotelle et de 0,02 mg à 1 mg d'extrait de Padina pavonica pour 100 g de préparation. Les compositions selon l'invention se présentent sous forme de crèmes, de gels, de laits, d'émulsions O/W ou W/0, de liposomes ou de suspensions. Les excipients usuels sont des matières grasses, des triglycérides à chaîne moyenne, des 10 alcools gras, des cires ou des phospholipides. Les véhicules seront par exemples des liquides aqueux, des liquides hydro-alcooliques ou des solvants pénétrants. Ils pourront être additionnés d'agents émulsionnants, d'agents épaississants, d'agents tensio-actifs, d'agents parfumant, de colorants ou de gaz propulseur. 15 Les compositions, selon l'invention sont répartis en flacons, en pots, en tubes, dans des flacons pulvérisateurs, dans des flacons à pompe ou dans des brumisateurs sous pression. Les compositions selon l'invention trouvent un emploi pour lutter ou faire disparaître les manifestations douloureuses ou d'irritation ou d'inflammations de la peau, des muqueuses ou 20 des téguments.5 REVENDICATIONS 1. Compositions cosmétiques et dermatologiques à base d'extrait d'algues, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif une association d'extraits de l'algue Cyclotella et de l'algue Padina pavonica, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, adapté pour l'application topique. 2. Compositions cosmétiques et dermatologiques selon la revendication 1, dans lesquelles l'extrait de Cyclotella est celui obtenu par épuisement éthanolique ou acétonique de l'algue Cyclotella. 3. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon la revendication 1, dans lesquelles l'extrait d'algue Padina pavonica est un extrait éthanolique ou acétonique de poudre d'algue séchée. 4. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,001 mg à 0,1 mg d'extrait de Cyclotelle pour cent grammes de préparation. 20 5. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,02 mg à 0,5 mg d'extrait de Cyclotelle pour 100 g de préparation. 6. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'une des revendications 25 précédentes, caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,005 mg à 5 mg d'extrait de Padina pavonica pour 100 g de préparation. 7. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles contiennent de 0,02 mg à 1 mg d'extrait de 30 Padina pavonica pour 100 g de préparation 8. Compositions cosmétiques ou dermatologiques selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crèmes, de gels, de laits, de suspensions, d'émulsions O/W ou W/0 ou de liposomes.15 9. Utilisation des compositions dermatologiques et cosmétiques selon la revendication 1, pour le soulagement ou la suppression des manifestations douloureuses ou des phénomènes d'irritation de la peau, des muqueuses ou des téguments.5