Brevet FR2896690A1 — publié le 20070803

-1- La présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(1-azabicyclo [2.2.2] o ct-3 -yl-méthyl)- 1 OH-ph énothi azine (Méquitazine) et/ou d' au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique. La méquitazine est un dérivé de phénothiazine substitué de formule : La molécule de Méquitazine possède un carbone asymétrique conduisant à deux configurations spatiales différentes : énantiomère (S) lévogyre énantiomère (R) dextrogyre -2- La Méquitazine existe ainsi sous la forme de deux énantiomères optiquement actifs : l'énantiomère lévogyre de configuration (S) et l'énantiomère dextrogyre de configuration (R). Les deux énantiomères de la Méquitazine peuvent être séparés et isolés selon des procédés décrits par exemple dans les demandes de brevet EP 0089860 ou EP 0093643. La Méquitazine est un antihistaminique H1 utilisé pour prévenir ou traiter 10 diverses manifestations d'origine allergique, telles que : • les réactions allergiques, à savoir le traitement symptomatique des réactions d'hypersensibilité immédiate cutanées, oculaires, ORL et des réactions allergiques au cours des traitements de désensibilisation, • la rhinite allergique, en particulier le rhume des foins, 15 • la rhinite vasomotrice, • la conjonctivite allergique, • le prurit, • l'urticaire, en particulier l'urticaire aiguë, • l'allergie médicamenteuse. 20 En France, le mélange racémique de Méquitazine est commercialisé sous forme de comprimé (Quitadrill ) ou bien sous forme de sirop (Primalan ). La méquitazine est classée parmi les antihistaminiques H1 non sédatifs. La 25 méquitazine possède, parallèlement à son activité antihistaminique H1, un effet adrénolytique alpha et un effet atropinique pouvant se traduire, par exemple, par une sécheresse de la bouche ou un trouble de l'accommodation. Les propriétés pharmacologiques de la méquitazine ne diffèrent de celles des antihistaminiques sédatifs qu'à la dose la plus faible 5 mg qui n'est pas sédative; à la dose de 10 mg 30 elle est sédative. -3- Dans certaines conditions, notamment en cas de surdosage ou chez des personnes prédisposées, certains antihistaminiques H1 peuvent induire une toxicité cardiaque et provoquer des troubles cardiaques graves, pouvant être parfois mortels. Par exemple, la terfénadine et l'astémizole ont été retirés du commerce parce qu'ils sont, dans certaines conditions, à l'origine de troubles de la conduction cardiaque, comme l'allongement de l'espace QT pouvant conduire à des torsades de pointe. Cet effet indésirable est lié à leur effet sur les canaux potassiques notamment, conduisant à un ralentissement de la vitesse de repolarisation. Par ailleurs, la mizolastine et l'ébastine peuvent aussi, en cas de surdosage, entraîner un allongement de l'espace QT. La prise concomitante de médicaments pouvant ralentir leur catabolisme est à éviter, notamment macrolides et antifongiques imidazolés. On a étudié le mode d'action de la terfénadine. Cette molécule possède une action bloquante sur les canaux potassiques équivalente à la quinidine et cela avant sa transformation lors du premier passage hépatique, en substance active, la terfénadine carboxylate. Cette dernière, par contre, ne possède pas les mêmes caractéristiques de blocage au niveau des canaux potassiques. L'enzyme responsable de cette biotransformation hépatique est la CYP3A4 dépendante du cytochrome P 450. L'activité de cette enzyme est très variable dans la population générale et la différence de puissance d'activité entre les deux extrêmes de la distribution est de l'ordre d'un facteur 10, ce qui peut expliquer les différences de concentration de terfénadine et de terfénadine carboxylate pour une même dose de médicament absorbée en fonction des individus et en dehors de tout processus pathologique. Ainsi toute substance inhibant cette enzyme hépatique augmente le taux de terfénadine et donc le pouvoir de blocage des canaux potassiques ce qui allonge le QT de manière pathologique créant des post-potentiels tardifs pouvant déclencher une torsade de pointes. Parmi les substances capables de bloquer cette enzyme, on retient justement l'érythromycine, certains imidazolés ainsi que des substances contenues dans les flavinoïdes (jus de pamplemousse) expliquant ainsi les dangers d'une éventuelle association thérapeutique. -4- S'agissant de la Méquitazine, on a rapporté le cas d'une jeune femme atteinte du syndrome QT long congénital, ayant présenté des complications soudaines cardiaques (des torsades de pointes) suite à l'administration simultanée de Méquitazine et de spiromycine (F. Verdun et al., Arch Mal Coeur Vaiss. 1997 Jan ; 90(1) : 103-6). La responsabilité de l'association méquitazine-spiromycine dans l'augmentation subite du QT, plutôt que celle de l'un des deux médicaments est fortement privilégiée. En effet, on suppose que la spiromycine a peut-être bloqué l'enzyme qui favorise la dégradation de la méquitazine. Cette enzyme pourrait être la CYP2D6 (Janicki et al, Med SCI Monit, 2005 ; 11(10) : RA 322- 328). Dans un souci. de prévenir la survenue de tels accidents potentiellement dangereux pour la vie des patients, les inventeurs ont maintenant découvert de manière surprenante que l'énantiomère (S) de la Méquitazine induit moins de toxicité cellulaire, en particulier moins de toxicité cardiaque, que le mélange racémique ou l'énantiomère (R) de la Méquitazine. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique, en particulier les risques de cardiotoxicité. On entend par toxicité cellulaire, la toxicité envers les cellules, c'est-à-dire le caractère d'une substance capable d'altérer l'activité normale des cellules ou d'entraîner la mort des cellules. La toxicité est tissulaire ou organique si l'altération s'étend respectivement au tissu ou à l'organe constitué par ces cellules et à leur fonction. -5- La cardiotoxicité désigne la toxicité envers les cellules cardiaques. Elle entraîne en particulier des altérations de la fonction du myocarde pouvant aller jusqu'à la nécrose ou l'apoptose des cellules myocardiques. Ces altérations peuvent conduire à divers troubles cardiaques, tels que l'ischémie myocardiaque, la prolongation de l'intervalle QT ou QTc, l'arythmie cardiaque, la cardiomyopathie, l'hypertrophie cardiaque, l'infarctus du myocarde, des troubles diastoliques ou une dysfonction systolique (Y.James Kang, Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiotoxicity, Environmental Health Perspectives, Vol. 109, suppl. 1, March 2001). La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-méthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques d'ischémie myocardique, de prolongation de l'intervalle QT ou QTc, d'arythmie cardiaque, notamment les torsades de pointes, de cardiomyopathie, d'hypertrophie cardiaque ou d'infarctus du myocarde, de trouble diastolique ou de dysfonction systolique. La métabolisation de la méquitazine conduit principalement à deux produits : la forme hydroxylée et la forme S-oxydée. Forme hydroxylée OH Forme S-oxydée -6- On entend par métabolite de la méquitazine l'une de ces deux formes. Sel pharmaceutiquement acceptable désigne tous les sels qui conservent l'efficacité et les propriétés d'un principe actif et qui ne présentent pas d'effets secondaires. De préférence, il s'agit de sels d'acides minéraux ou organiques pharmaceutiquement acceptables. A titre d'exemples préférés, mais non limitatifs, on mentionnera les halogénohydrates, tels que chlorhydrate et le bromhydrate, le fumarate, le maléate, l'oxalate, le citrate, le méthane sulfonate, le glutamate, le tartrate, le mésylate, et leurs hydrates éventuels. Selon la présente invention, le sel préféré de la méquitazine est le chlorhydrate de méquitazine. Dans le cadre de la présente invention, mélange d'énantiomères de la méquitazine enrichi en énantiomère (S) signifie un mélange d'énantiomère (S) et d'énantiomère (R) de la méquitazine dans lequel le ratio massique entre l'énantiomère (S) et l'énantiomère (R) est supérieur à 1 : 1. De préférence, le ratio massique entre l'énantiomère (S) et l'énantiomère (R) de la Méquitazine dans le dit mélange est supérieur à 95 : 5 ((S) : (R)), de préférence supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5:0,5. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en l'énantiomère (S). Le mélange d'énantiomères selon la présente invention est particulièrement utile pour la préparation de médicaments destinés à prévenir ou traiter des affections allergiques notamment choisies parmi la rhinite allergique, la rhinite vasomotrice, la rhinite spasmodique, la conjonctivite allergique, l'oedème de Quincke, l'urticaire, ]les allergies médicamenteuses, les affections dermatologiques prurigineuses.30 -7- Le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère (S) substantiellement pur, est administré à tout type de patients nécessitant un tel traitement, que ce soit dans un but thérapeutique et/ou prophylactique. Dans un but thérapeutique, on vise l'éradication ou l'amélioration de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme(s) associé(s). Dans un but prophylactique, on vise la prévention de l'apparition de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme(s) associé(s). Néanmoins, le mélange d'énantiomères selon l'invention est plus particulièrement adapté à des populations de patients à risque qui seraient susceptibles de développer certaines manifestations cliniques indésirables au cours ou à la. suite d'un traitement par la Méquitazine sous forme racémique. Il s'agit notamment des patients présentant une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradicardie ou atteints du syndrome du QT long congénital. EXEMPLE 1: TEST DE PREDICTIVITE PHARMACO-TOXICO-15 GENOMIQUE IN VITRO 1. Les composés Les composés testés sont la méquitazine sous forme racémique, la 1-méquitazine et la d-méquitazine. Pour les besoins de l'étude, chaque composé a été solubilisé 20 dans du DMSO du fait de leur insolubilité dans l'eau et de l'impact de l'éthanol et du chlorure de méthylène sur l'extraction des ARNs. Les principales caractéristiques de ces composés sont résumées dans le Tableau 1 ci-dessous. La Loratadine (SIGMA Catalogue #L9664-10MG) a été utilisée comme comparateur. 25 Tableau 1 : Les composés Produit Quantité Poids Moléculaire Etat Solubilité Méquitazine 90 mg 322,47 Poudre chl. Méthylène et éthanol 1-Méquitazine 100 mg 322,47 Poudre chi. Méthylène et éthanol d-Méquitazine 90 mg 322,47 Poudre chi. Méthylène et éthanol Loratadine 10 mg 382,89 Poudre DMSO -8-2. Les cellules Les cellules testées sont des cardiomyocytes de rat : H9c2 (2-1) ECACC N : 88092904 (fournisseur SIGMA) Description: Rat DB1X heart myoblast Les cellules sont amplifiées dans des conditions standard de culture (Voir ci-après). 3. Toxicogénomique 3.1 Méthodologie Des cardiomyocytes de rat (lignée H9c2) sont traités avec 15 M de méquitazine, L-méquitazine, d-méquitazine et loratadine. L'ARN est extrait à la fois des cellules H9c2 traitées avec le véhicule (DMSO, qui sert de contrôle) et des cellules traitées par les composés après une incubation de 6 heures et de 24 heures. L'impact du traitement sur l'expression de 97 gènes sélectionnés comme potentiels marqueurs de toxicité est analysé par RT-PCR quantitative. Les signatures moléculaires induites par les composés permettent de définir un index de toxicité des différents composés. 3.2 Cellules et traitement Les protocoles utilisés pour la culture et le traitement des cellules sont les suivants : • Milieu et culture : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) - high glucose (Cambrex Catalogue # BE12-614F) ; 2 mM L-Glutamine (Cambrex Catalogue # US 17-605C) ; 10 % Serum de veau fétal (Gibco BRL, Invitrogen Catalogue # 10108-157). • Conditions de culture : 37 C ; 5 % CO2 • Procédure : 220 000 cellules sont ensemencées par puit (6 multi-well plate; Corning Catalogue # 734-1596) à JO dans 3 ml de milieu de culture et incubées à 37 C, 5 % CO2 pendant 48 h (NB. Temps de doublement de H9c2 = 39 heures). Le traitement des cellules par les composés à lieu à J2. -9- La procédure est décrite ci-dessous : • Au jour JO, les cellules H9c2 (Passage 27, 97% de viabilité) sont ensemencées dans des plaques 6 puits à raison de 220 000 cellules par puit dans un volume total de 2,5 ml et placées pendant 48 heures à 37 C, 5% CO2. • Au jour 12, les cellules sont traitées par les composés alors que la confluence est d'environ 70 %. Pour une "plaque type" le milieu est aspiré et remplacé dans chacun des 6 puits par : 1. par du milieu neuf avec 0,015 % de DMSO (véhicule des différents composés). 2. du milieu neuf avec du méquitazine/D02026 à 15 M. 3. du milieu neuf avec du 1-méquitazine à 15 M. 4. du milieu neuf avec du d-méquitazine à 15 M. 5. du milieu neuf avec du loratadine à 15 M. De plus chaque plaque est réalisée en 2 exemplaires afin de prélever les ARNs à deux temps différents (6 heures et 24 heures). Les cellules sont placées à 37 C, 5% CO2 • A J2, 6 heures après le traitement, le milieu est retiré de chacun des 6 puits de trois plaques (une plaque par concentration), les cellules sont lavées au PBS et reprise avec du RNABIe (Eurobio) pour l'extraction de l'ARN. • A J3, 24 heures après l'ajout des composés, une deuxième série de 3 plaques est traitée comme précédemment. 3.3. La RT-PCR quantitative en temps réel 3.3.1. Extraction des ARNs totaux et synthèse des ADNc -10- L'extraction a été réalisée d'après la méthode de Chomczynski et Sacchi (1987). Les protocoles expérimentaux d'extraction des ARN totaux et de la synthèse des ADN complémentaires (ADNc) sont les suivants. • Protocole d'extraction des ARN totaux Les ARN totaux ont été extraits à l'aide de RNABIe (Eurobio, Catalogue # GEXEXTOO-OU). Les cellules sont recueillies dans 1 mL de RNABIe afin de dissocier les complexes nucléoprotéiques, puis 100 L de chloroforme sont rajoutés afin de séparer les protéines des acides nucléiques. Après une centrifugation pendant 20 min à 12500 g, 4 C, la phase aqueuse supérieure contenant les ARN est récupérée. Les ARN sont alors précipités par ajout de 600 L d'isopropanol. Après 15 minutes à 4 C, les échantillons sont placés une nuit à -20 C. Après centrifugation de 15 min à 4 C, le culot d'ARN obtenu est lavé dans 700 L d'éthanol à 75 C et centrifugé à 12 500 g pendant 15 minutes à 4 C. Enfin, les culots sont séchés et dissous dans de l'eau millipore. • Protocole pour Reverse Transcription Produits : SuperscriptTM II Reverse Transcriptase, RT 5X, DTT (Invitrogen Catalogue # 18064-014) ; Random Hexamer (Amersham Catalogue # 27-2166-01) ; dNTP set 100 mM solution (Amersham Catalogue # 27-2035-01) ;RNAsine Ribonuclease Inhibitor (Promega Catalogue # N211B). La transcription inverse se réalise pour 1 gg d'ARN dans un volume final de 20 gL contenant 4 pl de tampon RT 5X, 41.1l de DTT (dithiotréisol), 1 L de dNTP (10 mM), 6 pL d'hexamères aléatoires (500 ng/iL), 0,5 L de RNAsine (40 U/ L) et 0,5 L de RTase Superscript (200 U/ L). Les échantillons sont ensuite incubés 10 min à 25 C, 50 min à 42 C puis 15 min à 75 C afin d'inactiver l'enzyme, et conservés à 4 C. -11- Les ARN totaux extraits ont été dosés et leurs qualités analysées sur le Bioanalyseur Agilent. 3.3.2. La technique de PCR quantitative • Théorique La PCR en temps réel est une méthode précise, sensible et rapide qui permet la quantification relative du taux d'expression d'un gène cible par rapport à celui d'un gène de référence exprimé de façon ubiquitaire. Cette technique permet de quantifier l'ARN messager. Cette opération s'effectue après transcription inverse des ARNs en ADN complémentaires par extension de deux amorces situées de part et d'autre de la cible à amplifier grâce à une ADN polymérase. L'incorporation d'un fluorophore (SYBR Green), lors de l'étape d'hybridation de l'amplification exponentielle, permet la quantification et le suivi en temps réel de la quantité de produit d'amplification néoformé. Les valeurs quantitatives sont obtenues à partir du nombre de cycles seuil (Ct : cycle threshold) auquel l'augmentation du signal, associée à une croissance exponentielle du produit de PCR, commence à être détecté en utilisant un programme d'analyse Biosystems PE selon le manuel du fabriquant. Ainsi, plus la quantité d'ADNc du gène cible à l'instant zéro est importante plus le nombre de Ct est faible (nombre de cycle pour atteindre le seuil). Afin de standardiser les analyses effectuées en QRT-PCR, il est nécessaire de quantifier en parallèle au moins un contrôle endogène appelé "gène de référence". Ces gènes doivent avoir une expression constitutive indépendante de la situation traitée ou non traitée des cellules. Plusieurs gènes de références ont été testés. Leurs caractéristiques sont données dans le Tableau 2.30 -12-Tableau 2 : Gènes de référence testés pour l'étude Gènes Référence Amorces Ct NTC Pente ACTB Cytoplasmic beta-actin NM_031144 58U / 115L 18,44 33 3,16 B2M Beta-2-microglobulin NM_012512 55U / 122L 16,99 39 3,02 GAPDH Glyceraldehyde-3- NM_017008 853U / 931L 16,24 45 3,3 phosphate dehy. GUSB Glucuronidase, beta NM_017015 820U / 907L 25,83 45 3,23 HMBS Hydroxymethylbilane NM_013168 545U / 614L 23,15 36 3,37 synthase PGK1 Phosphoglycerate NM_053291 1005U / 1080L 19, 44 36 3,25 kinase 1 PPIA Peptidylprolyl NM 017101 319U / 401L 19,14 36 3,19 isomerase A RPLPO 60S acidic ribosomal Z29530 613U / 676L 18,45 45 3,37 protein PO TFRC Transferrin receptor M58040 841U / 903L 21,72 38 3,05 protein 1 U représente la position 5' de l'amorce sens d'après la référence GenBank (NM_...) L représente la position 3' de l'amorce anti-sens d'après la référence GenBank (NM_... ) Le Ct (Cycle Threshold) correspond au nombre de cycle nécessaire pour atteindre, à partir de 12,5 ng d'ADNc (ARN de coeur de rat, BD Biosciences Clontech), le seuil de détection NTC (Non Template Control) est représentatif du bruit de fond du à la formation de "dimer" d'amorces La pente est obtenue par une dilution successive (4 points) de 10 en 10. Une pente à 3,32 est représentative d'une efficacité de 100% du couple d'amorces L'efficacité réelle est donnée par la formule E = e2,3026/pente Les gènes les plus stables après stimulation sont choisis grâce au logiciel Genorm (Vandesompele et al., 2002) qui permet de mesurer le niveau de stabilité d'un gène en fonction de la stimulation. La mesure M obtenue doit être inférieure à 1,5. Tous les gènes testés répondent à ce critère (Tableau 3). -13- Au vu des résultats, nous avons choisi comme gènes de référence pour cette étude d'utiliser les 2, plus stables: GAPDH qui code pour la Glyceraldehyde-3-phosphate et est couramment utilisé comme contrôle endogène et RPLPO qui code pour la phosphoprotéine ribosomale de rat P0. Il est à noter que RPLPO est aussi connu sous le nom de 36B4 qui est largement employé comme gène endogène de contrôle en Northern blot. Dans chaque plaque 384 puits, à la fois RPLPO et GAPDH sont quantifiés dans tous les échantillons analysés. Dans une plaque type, 10 gènes cible ainsi que les deux gènes de référence sont quantifiés dans un même "run" pour tous les échantillons. L'expression relative des 97 gènes sélectionnés est calculée par la méthode AACt et le logiciel RQ fournie par le fabricant (Applied Biosystem). Les valeurs d'expression de chaque gène sont également normalisées, dans un 15 premier temps, de telle manière que la valeur des cellules H9c2 traitées avec le véhicule (contrôle) soit égale à 1. Ainsi, la valeur RQ obtenue pour chaque composé à un temps donné pour un gène donné, représente l'expression relative du gène après traitement par la même dose 20 de composé (15 M) par rapport aux cellules contrôles dont l'ARN a été prélevé au même temps (6 heures ou 24 heures). Tableau 3: Stabilité des gènes de référence HMBS PGKI TFRC PPIA B2M RPLPO GUSB GAPDH ACTB Méquitazine 0,46854678 0,114612992 0,204560146 0, 400860175 0,224156618 0,623422552 0,306213862 0,365897636 0,285015049 (5mM / 24h) I-Méquitazine 0,98142573 0,47684986 0,444833239 0,867174056 0,694117111 0,910639377 0,868466738 0,476962253 0,430324385 (5mM / 24h) d-Méquitazine 1,00E+00 0,260455986 0,477940026 0,836324076 0,722621458 (5mM / 24h) 0,957802263 0,886458502 0,579028394 0,454646216 Loratadine 0,533792522 0,472691229 0,137815876 0,64573248 0,246913821 (5mM / 24h) 0,66507537 0,401076127 l 0,494472777 0,421992277 DM/ 2 0,663691407 0,485725287 0,23411106 0,749570198 0,405563156 0,763885997 0,507530525 0,05% / 24h) 0,563188976 0,577676816 Méquitazine 0,544978606 0,486615945 0,3457242 0,828450555 0,552219026 0,72728602 0,637915837 (15mM / 6h) 0,612770819 0,510025488 1-M éguit zzine 0,355673896 0,411714168 0,159661182 0,462200428 0,229192859 0,672037084 0,29946473 0,368694807 0,388478995 15m / 6h)_ d-M11équitazine 0,487567714 0,532195236 0,251619476 0,762885264 0,305225309 0,744154584 0,494869146 0,580612686 0,547594553 (15mM / 6h) Loratadine 0,588115737 0,647446325 0,183658936 0,862001031 0,286367763 (15mM / 6h) 0,792134188 0,483839514 0,517477306 0,798211517 DMSO 0,745030039 0,677384321 0,797436198 1,00E+00) 0,784782078 0,805049417 0,764952727 0,735879781 1,00E+00 (0,15% / 6h) (M 0,534112295 0,320680604 0,25633964 0,267754829 0,217017607 15mM / égtale) 0,550520713 0,255337705 0,246242724 0,245630736 1-Méquitazine 0,727518833 0,378080933 0,667785189 0,520124716 0,610620953 0,875678533 0,736406619 0,454484816 0,347231202 (15mM / 24h) (l 5nM 24h) 0,528096872 0,369191182 0,604290849 0,436081744 0,682746775 0,704729983 0,669724894 0,340683859 0,295005652 Loratadine 0,443434062 0,279817675 0,1788955 0,33892031 0,157292796 0,397261049 0,196047208 0,333113563 0,403677337 (15mM / 24h) DMSO 0,140975513 0,101910492 0,067781224 0,159660296 0,028134429 0,137965289 0,034367828 0,089815547 0,134875901 (0,15% / 24h) Loratadine 0,871211559 0,746272537 1,00E+00 0,673936702 1,00E+00 1,00E+00 1,00E+00 1,00E+00 0,648111752 (25mM / 24h) DMSO (0,25%) 0,850364927 1.00E+00 0,025323322 0,952459729 0,767065404 0,934058782 0,871570638 0,476607315 0,526765585 M • Courbe standard d'amplification L'efficacité des amorces est testée par une gamme de dilutions de 10 en 10 (4 points) réalisé sur de l'ARN de coeur de rat (BD Biosciences Clontech, Catalog #: 636623). Seul les couples d'amorces avec une efficacité d'au moins 90% (pente entre 3,32 et 3,70) sont retenus. Une amplification sans matrice (NTC pour Non Template Control) est également réalisée afin de s'assurer qu'il ne se forme pas de duplex pouvant fausser les 30 résultats de PCR quantitative obtenus par la méthode de SYBR Green. -16- Amplification Les amplifications sont réalisées sur un appareil ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) par la méthode de SYBR Green (SYBR Green PCR Core Reagents kit, Applied Biosystems). L'amplification est constituée d'une étape de dénaturation (10 min à 95 C) puis par la répétition de 40 cycles d'hybridation (15 sec. à 95 C) et d'extension (1 min. à 65 C) qui assurent une duplication exponentielle de chaque brin. Les expériences sont effectuées en double pour chaque point de données et les valeurs sont retenues avec un intervalle de confiance de 95%. La courbe de dissociation obtenue sur l'appareil 7900HT permet de s'assurer que le produit d'amplification obtenu est unique et sa spécificité est contrôlée par séquençage direct du produit PCR. • Choix des Gènes Les gènes sélectionnés l'ont été afin de cribler différents processus métaboliques induit en réponse à un stress oxydatif ou métabolique. Pour cela, nous avons sélectionné des enzymes de réparation (MGMT, MLH1...), des régulateurs du cycle cellulaire (CDK2, GADD45A, PCNA,....), des facteurs impliqués dans les phénomènes inflammatoires (Chemokines, Interleukines....) et bien évidemment les gènes de la mort cellulaire soit par apoptose (Caspases, gènes de la famille de BC12....), soit par nécrose (gènes de la famille du TNF...). Tous ces gènes ont été sélectionnés d'après la littérature et avec l'aide des Oligo GEArray dédiés. La liste des 97 gènes sélectionnés est donnée dans le tableau 4. 4. RESULTATS 4.1 Les cellules H9c2 ont été traitées avec 15 M de méquitazine, de 1-méquitazine, de d-méquitazine et de loratadine.30 -17- Les variations d'expression des 97 gènes sélectionnés ont été étudiées, par RTPCR quantitative (voir Tableau 4). L'expression de chacun de ces gènes a été validée sur des ARNs de coeur de rat (BD Biosciertces Clontech, Catalog #: 636623). Toutefois, les résultats obtenus sur 16 de ces gènes n'ont pasété retenus du fait de leur faible expression (Ct>33) et par voie de conséquence de la difficulté d'interprétation des résultats. Ces 16 gènes apparaissent en gras dans le tableau. Tableau 4 : Liste des gènes quantifiés par RT-PCR quantitative ADRB2 BETA 2 ADRENERGIC RECEPTOR ADORAI ADENOSIN RECEPTOR ADORA3 ADENOSIN RECEPTOR ADPRT (PARP) ADP-RIBOSYLTRANSFERASE (NAD+; POLY (ADPRIBOSE) POLYMERASE AGTRAP ANGIOTENSIN II RC-ASSOCIATED PROTEIN AHR ARYL HYDROCARBON RECEPTOR AKT1 AKTIONCOGENE ANK3 ANKIRIN G (ASSOCIATED TO NAV 1.5) ANXA5 ANNEXIN A5 APAF1 APOPTOTIC PROTEASE ACTIVATING FACTOR 1 BAX BCL2-ASSOCIATED X PROTEIN BCL2 APOPTOSIS REGULATOR BCL-2 BCL2L1 BCL2-LIKE 1 (BCL-XL) BCL2L2 BCL2-LIKE 2 (BCLX) BDKRB 1 BRADYKININ RECEPTOR B1 BDKRB2 BRADYKININ RECEPTOR B2 BlD BH3 INTERACTING DOMAIN DEATH AGONIST BIRC3 INHIBITOR OF APOPTOSIS PROTEIN 1 CA2 CARBONIC ANHYDRASE II (CYTOSOLIC) CA4 CARBONIC ANHYDRASE IV (MEMBRANE) CAPN1 CALPAIN 1 (PTROTEASE ) CAPN2 CALPAIN 2 (PTROTEASE ) CAPN5 CALPAIN 5 -18- CASP1 CASPASE 1, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE CASP3 CASPASE 3, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE CASP8 CASPASE 8, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE CASP9 CASPASE 9, APOPTOSIS-RELATED CYSTEINE PROTEASE CAT CATALASE CCL2 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 2 CCL4 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 4 CCL5 CHEMOKINE, CC MOTIF, LIGAND 5 CDK2 CYCLIN-DEPENDENT KINASE 2 CHEK2 CHECKPOINT KINASE 2 CKM MUSCLE CREATINE KINASE CLU CLUSTERIN COMT CATECHOL-O-METHYLTRANSFERASE CTF1 CARDIOTROPHIN 1 CYCS CYTOCHROME C SOMATIC DDIT3 DNA DAMAGE-INDUCIBLE TRANSCRIPT 3 EDN1 ENDOTHELIN 1 EGR1 EARLY GROWTH RESPONSE 1 F2R COAGULATION FACTOR II (THROMBIN) RECEPTOR 1 SEUL EXON F3 COAGULATION FACTOR III FGG FIBRINOGEN, GAMMA POLYPEPTIDE FMO4 OXIDATIVE OR METABOLIC STRESS GADD45A GROWTH ARREST- AND DNA DAMAGE-INDUCIBLE GENE GADD45, ALPHA GDF15 GROWTH/DIFFERENTIATION FACTOR 15 GPX1 GLUTATHIONE PEROXIDASE HIFIA HYPDXIA-INDUCIBLE FACTOR 1, ALPHA HMOX1 HEME OXYGENASE (DECYCLING) 1 HSPAIA HEAT-SHOCK 70-KD PROTEIN IA HSPCA HEAT-SHOCK 90-KD PROTEIN 1, ALPHA ICAM1 EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE IL I B INTERLEUKIN 1 -BETA -19- IL6 INTERLEUKIN 6 IL10 INTERLEUKIN 10 IL18 INTERLEUKIN 18 ITGA7 EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE ITGB 1 EXTRACELLULAR MATRIX & ADHESION MOLECULE KCNA5 POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, SHAKERRELATED SUBFAMILY, MEMBER 5 KCNB1 POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, SHAB-RELATED SUBFAMILY, MEMBER 1 KCNE1 POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, ISK-RELATED SUBFAMILY, MEMBER 1 KCNH2 POTASSIUM CHANNEL VOLTAGE GATED (HERG) LPA LYSOPHOSPHATIDIC ACID RECEPTOR EDG-2 (LPA RECEPTOR 1) (LPA-1) MGMT O-6-METHYLGUANINE-DNA METHYLTRANSFERASE MW MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR MKI67 PROLIFERATION-RELATED KI-67 ANTIGEN MLH1 MISMATCH REPAIR PROTEIN 1 MMP9 MATRIX METALLOPROTEINASE 9 MYC MYC ONCOGENE NOS1 ENOS, NITRIC OXYDE SYNTHASE 1 (NEURONAL) NOS3 ENOS, NITRIC OXYDE SYNTHASE 3 (ENDOTHELIAL) PCNA PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN PLAU PLASMINOGEN ACTIVATOR, UROKINASE PLAUR PLASMINOGEN ACTIVATOR, UROKINASE RECEPTOR PPARG PEROXISOME PROLIFERATIVE ACTIVATED RECEPTOR, GAMMA PRDX 1 PEROXIREDOXIN 1 PRKAA2 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE ALPHA 2 CATALYTIC PRKAB 1 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE BETA 1 PRKAG1 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE, NONCATALYTIC PRKAG2 AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE GAMMA 2 RYR2 RYANODINE RECEPTOR (PARTIAL) -20- SCN5A (NAV 1.5) PRINCIPAL VOLTAGE-GATED NA CHANNEL SERPINE1 SERINE (OR CYSTEINE) PROTEINASE INHIBITOR, CLADE SLC8A1 NCX1 EXHANGER SLC9A1 SOLUTE CARRIER FAMILY 9, ISOFORM Al (NHE1) SOD1 SUPEROXIDE DISMUTASE 1 SOD2 SUPEROXIDE DISMUTASE 2 TIMP1 TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE 1 TNF TUMOR NECROSIS FACTOR TNFSF5 TUMOR NECROSIS FACTOR (LIGAND) SUPERFAMILY TNFSF6 TUMOR NECROSIS FACTOR LIGAND SUPERFAMILY, MEMBER 6 TNF' SF10 TUMOR NECROSIS FACTOR LIGAND SUPERFAMILY, MEMBER 10 TNFRSFIA TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY, MEMBER lA TNFRSF1B TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY TNFRSF6 TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY TNNI3 TROPONIN TOP2A TOPOISOMERASE (DNA) 2 ALPHA TP53 TUMOR PROTEIN P53 TPSB1 TRYPTASE ALPHA/BETA 1 TPSG1 TRYPTASE GAMMA 1 TRPC 1 TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CATION CHANNEL, SUBFAMILY C, MEMBER 1 VDAC1 VOLTAGE-DEPENDENT ANION CHANNEL 1 Les gènes en gras n'ont pas été analysés du fait de leurs faibles expressions (Ct > 33) dans le modèle H9c2 Sur les 81 gènes qui ont été analysés, nous nous sommes intéressés, dans un premier temps. à tous les gènes qui sont dérégulés d'un facteur > 2 par rapport à la situation des cellules non-traitées.5 -21- Quelques inductions ou répressions sont observées dès 6 heures d'exposition avec les composés, il s'agit des gènes impliqués dans les phénomènes d'apoptose : APAF1 (Apoptotic protease activating factor 1), BCL2L1 (Bc12-Like 1 connu sous le nom de BCL-XL), EGR1 (Early growth response 1), des gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire DDIT3 (DNA damage-inducible transcript 3) et GADD45A (growth arrest- and DNA damage-inducible gene gadd45, alpha), de IL6 (Interleukine 6) marqueur de l'inflammation et de l'enzyme de "détoxification" HMOX1 (Heme oxygenase decycling 1). Ces inductions à 6 heures sont également observées après 24 heures d'exposition avec les composés. Pour plus de clarté dans les résultats, nous avons considéré uniquement les signatures moléculaires induites à 24 heures. Les résultats présentés dans les tableaux sont représentatifs des régulations transcriptionnelles observées après 24 heures d'exposition avec les composés. A la dose de 15 M, trente gènes sont dérégulés d'un facteur > 2 par au moins un composé. Ces résultats sont résumés dans le Tableau 5 ci-après. Tableau 5 : Gènes dérégulés d'un facteur >2 par au moins un composé. AHR méquitazine 1-méquitazine d-méquitazine loratadine 1,30 1,96 2,80 1,40 BCL2 0,89 1,71 2,42 1,28 BCL2L1 4,11 4,11 5,02 1,68 BCL2L2 1,17 1,77 2,26 1,4 B1D 1,65 1,67 2,50 0,93 BIRC3 3,80 4,39 5,53 1,55 CASP8 2, 14 2,37 2,52 1,62 EGR1 2,78 3,04 3,31 2,44 HMOX 1 1,23 1,52 2,38 0,97 TNFRSF6 1,24 1,91 2,82 1,69 DDIT3 3,50 4,00 7,70 1,25 GADD45A 2,30 3,70 5,50 1,06 MGMT 3,59 3,79 4,60 1,55 -22- HSPCA 0,35 0,50 0,50 0,67 IL6 3,31 4,20 3, 32 1,35 CDK2 0,27 0,58 0,53 0,84 PCNA 0,25 0,36 0,49 0,64 TOP2A 0,15 0,22 0,25 0,73 EDN1 0,29 0,54 0,30 0,78 ITGA7 0,47 0,85 0,53 1,06 PLAUR 0,44 0,66 0,42 0,74 SERPINE1 0,25 0,27 0,21 0,71 TIMP1 0,06 0,07 0,06 0,6 ADRB2 4,54 4,36 3,95 1,71 AGTRAP 2,43 2,57 3,93 1,89 CAT 3,45 5,27 10,16 2,06 KCNH2 2,99 3,96 4,73 3,61 LPA 0,28 0,52 0,42 0,77 SLC8A1 0,43 0,82 0,72 1,37 TNNI3 0,19 0,54 0,76 1,56 Les valeurs d'expression sont données par rapport à une expression = 1 dans les cellules H9c2 traitées avec le véhicule (DMSO) On trouve des gènes directement ou indirectement liés au phénomène d'apoptose (BCL2, CASP8, GADD45A..), des gènes impliqués dans la prolifération (CDK2, PCNA...), l'invasion (PLAUR, TIMP1...), l'inflammation (IL6..) ou des protéines de choc thermique (HSPCA,.). On note également l'impact sur des gènes sélectionnés pour rendre compte d'une potentielle ischémie myocardique (TNNI3....). Les gènes directement liés au phénomène d'apoptose sont : AHR, BCL2, BCL2C1, BCL2L2, BID, BIRC3, CASP8, DDIT3, EGR1, GADD45A, HMOX1, MGMT, NFKB1, TNFRSF6. Les gènes pouvant rendre compte d'une potentielle ischémie myocardique et sûrement modèle-dépendant sont repris dans le tableau 8. L'expression des gènes sur-exprimés varie d'un facteur 2,06 (CAT par la loratadine) à un facteur 10,16 (CAT par la d-méquitazine) par rapport aux cellules non-traitées. -23- La répression varie, elle, d'un facteur 2 (PCNA par la d-méquitazine) à une perte presque totale d'expression (TIMP1 par la Méquitazine racémique). En considérant une différence d'un facteur > 2 par rapport à la situation "non- traitée", à la dose de 15 M, la 1-méquitazine induit la dérégulation de 16 gènes, la d-méquitazine celle de 25 gènes, la Méquitazine racémique 24 gènes et la loratadine celle de 6 gènes (Tableau 5). Si l'index de toxicité est établi en fonction du nombre de gènes dérégulés, on peut proposer le classement suivant du plus toxique au moins toxique : d-méquitazine 10 > méquitazine > 1-méquitazine loratadine. Ces index de toxicité sont représentés dans le Tableau 6 ci-dessous. Tableau 6: Index de toxicité des composés à la dose de 15 M. Composé Index de Toxicité méquitazine 24 1-méquitazine 16 d-méquitazine 25 loratadine 6 * L'index de toxicité représente le nombre de gènes dérégulé d'un facteur >2 par le composé par rapport au contrôle (cellules traitées par le véhicule, DMSO 0,15%) 15 En considérant en détail les variations d'expression induites par la Méquitazine, on peut noter que bon nombre des gènes impliqués dans l'apoptose sont dérégulés sous l'action des composés et ceci avec une dérégulation maximale pour l'énantiomère dextrogyre. En particulier, tous les gènes sélectionnés sont 20 surexprimés sous l'action de la d-méquitazine et certains ne le sont que sous l'action de ce composé, par exemple : BID (Wang & al, Genes Dev., 10 : 2859-2869, 1996), inducteur d'apoptose au niveau mitochondrial dans la chaîne signalitique induite par FAS (TNFRSF6), ce dernier etant lui-même surexprimé sous l'action de l'énantiomère dextrogyre, -24- BCL2 (Hockenbery & al, Nature, 348 : 334-336, 1997) et BCL2L2 (Gibson & al, Oncogene, 13 : 665-675, 1996) qui sont des promoteurs de survie lorsque les cellules sont soumises à des conditions de cytotoxicité, AHR (Puga &z; al, Biochem. Pharmacol. 199-207, 2005) bien connu en toxicologie pour son rôle dans la réponse à une toxicité via la régulation de CYPlA1, HMOX1 (Yoshida & al, Europ. J. Biochem. 171 : 457-461, 1998) codant pour une Heat Shock Protein (HSP 32) dont l'augmentation est directement corrélée à un stress oxydatif. Il est à noter que l'on observe également une sous-expression de gènes impliqués dans la prolifération tels que CDK2, PCNA, TOP2A, et AGTRAP. Une telle diminution est en accord avec l'augmentation de l'expression des gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire afin de réparer les dommages causés à l'ADN, dont les marqueurs principaux DDIT3 et GADD45A sont particulièrement affectés dans le sens de la surexpression. L'induction d'expression accrue engendrée par la d-méquitazine en ce qui concerne des gènes apoptotiques ou marqueurs de stress oxydatif indique clairement que l'énantiomère dextrogyre est plus toxique que l'énantiomère lévogyre. Ces observations indiquent clairement qu'à la concentration de 15 mM les cellules H9c2 sont soumises à des conditions cytotoxiques. Nous observons une augmentation des gènes bloquant le cycle cellulaire (DDIT3 et GADD45A) ainsi que des gènes impliqués dans la machinerie de mort cellulaire programmée (famille BCL2, Caspases, TNF) et par voie de conséquence une répression des gènes impliqués dans la prolifération (CDK2, PCNA, TOP2A); ex. GADD45A interagit avec PCNA pour arrêter la prolifération cellulaire (Smith et al., 1994). Le fait que les variations d'expression de ces gènes soient moins marquées lorsque les cellules H9c2 sont traitées avec l'énantiomère 1-méquitazine, indique que ce -25- composé induit un stress moins important aux cellules et de ce fait est moins toxique que la Méquitazine racémique et l'énantiomère d-méquitazine. L'expression de KCNH2 (HERG) est induite par la Méquitazine racémique et ses 5 énantiomères. KCNH2 est associé à une augmentation du QT (LQT2 syndrome) et aux torsades de pointes. 4.2 Comparaison de l'impact de l'énantiomère I-méquitazine versus l'énantiomère d-méquitazine sur l'expression de gènes marqueurs de 10 toxicité. Dans un souhait de discriminer l'action des deux énantiomères au niveau génomique, les résultats ont été également analysés indépendamment du contrôle négatif (cellules H9c2 non-traitées). 15 Pour ce faire nous avons considéré l'impact de la Méquitazine racémique et de ses deux énantiornères sur l'expression des gènes sélectionnés comme marqueurs classiques de toxicité en faisant abstraction du type cellulaire. Nous avons retenu les gènes de l'apoptose/nécrose (gènes de la famille BCL2, des Caspases, du Tumor Necrosis Factor ), les marqueurs de stress en réponse à un dommage 20 engendré dans l'ADN des cellules (DDIT3, CHEK2, GADD45A...) ou dû à un stress oxidatif (CAT, PDRX2, SOD2...), des enzymes de détoxification (HMOX1, MGMT, PTGS2....), les protéines de choc thermique (HSPCA, HSPB1....) ou encore les marqueurs de l'inflammation (IL6, MIFI....). 25 Les résultats sont figurés dans le Tableau 7 où sont représentées les valeurs d'expression des gènes sélectionnés et ceci par rapport à une valeur d'expression de 1 pour les cellules traitées avec le mélange racémique. En outre, est aussi exprimé le rapport d'expression énantiomère dextrogyre / énantiomère lévogyre, ceci mettant en évidence l'impact prépondérant de l'énantiomère dextrogyre sur 30 l'expression de ces gènes lorsque ce rapport est supérieur à 1. -26- Il ressort que les variations d'expression induites par l'énantiomère dextrogyre sont majoritaires pour près de trois quart (74%) des gènes retenus. Tableau 7: Expression relative des principaux marqueurs de toxicité d-méquitazine 1-méquitazine Rapport * ADPRT 2,30 1,55 1,48 AHR 2,27 1,54 1,47 AKT1 1,03 1,15 0,89 ANXA5 1,39 0,94 1,48 APAF1 1,31 1,17 1,12 BAX 1,34 1,22 1,09 BCL2 2,53 1,90 1,34 BCL2L1 1,15 1,00 1,15 BCL2L2 1,81 1,50 1,21 BID 1,43 1,01 1,42 BIRC3 1,38 1,16 1,19 CASP1 1,36 1,07 1,27 CASP3 0,82 0,92 0,89 CASP8 1,21 1,10 1,10 CASP9 0,89 0,90 0,98 CYCS 1,58 1,25 1,26 EGR1 1,22 1,08 1,13 NFKB 1 0,91 1,13 0,80 TNFSF5 1,20 1,43 0,84 TNFRSF1A 0,77 1,17 0,66 TNFRSF1B 0,93 0,77 1,21 TNFRSF6 1,80 1,31 1,37 CHEK2 1,58 1,14 1,38 DDIT3 2,17 1,12 1,94 GADD45A 2,41 1,61 1,50 HSPAlA 1,24 1,32 0,94 MLH1 1,04 1,31 0,79 TP53 0,80 0,80 1,00 -27- CCL2 0,91 0, 93 0,98 HIF1A 1,45 0,95 1,54 IL6 1,06 1,27 0,84 MIF1 1,33 0,94 1,41 CAT 2,94 1,53 1,92 COMT 1,28 1,24 1,03 FMO4 0,95 0,62 1,53 HMOX1 2,11 1,30 1,63 MGMT 1,42 1,13 1,26 PDRX1 1,91 1,44 1,32 PDRX2 1,01 0,96 1,05 SOD2 2,09 1,35 1,55 Les valeurs d'expression sont données par rapport à une expression = 1 dans les cellules H9c2 traitées avec la Méquitazine racémique.. * Le rapport représente le rapport d'expression d-méquitazine versus 1-méquitazine Le fait que les variations d'expression de ces gènes soient moins marquées lorsque les cellules sont traitées avec l'énantiomère lévogyre indique que ce composé induit un stress moins important à ces cellules et de ce fait présente une toxicité moindre tant par rapport au racémate que par rapport à l'énantiomère dextrogyre. 4.3 Comparaison de l'impact de l'énantiomère lévogyre versus l'énantiomère dextrogyre sur l'expression de gènes biomarqueurs d'une ischémie myocardiaque. Dans l'optique de mettre en évidence un effet différentiel spécifique des énantiomères en ce qui concerne une toxicité cardiovasculaire, 6 gènes ont été sélectionnés comme bio-marqueurs d'une ischémie myocardiaque. En particulier, parmi les gènes retenus, on peut citer : KCNH2 est un gène associé au syndrome du QT long congénital (De Bruin & al. 20 Pharmacoepidemiol. Drug Saf. 2005), -28- EDG2 récepteur de l'acide lysophosphatidique est considéré comme marqueur de l'infarctus du myocarde (Pastinen & al. Human Molec. Genet. 7 : 1453-1462, 1998), ADRB2 dont les antagonistes (beta-bloquants) constituent une classe de médicaments utilises en cardioprotection (Baker, Br. J. Pharmacol. 317-322, 2005), TNNI3, gène de le Troponine I cardiaque, en tant que marqueur du risque de développement de maladies cardiaques (Mogensen & al, J. Am. Coll. Cardiol., 44, 12. 2315-2325, 2004). Selon un modèle identique à l'exemple précédent, on a aussi évalué la variation d'expression de ces gènes en fonction de leur exposition à l'un ou à l'autre des énantiomères. Le Tableau 8 met en évidence la dérégulation des gènes sélectionnés par les composés. Le rapport d'expression dextrogyre/lévogyre est aussi reporté. Tableau 8 : Gènes biomarqueurs d'une ischémie myocardique et dérégulés d'un facteur >2 par au moins un composé Méquitazine 1-méquitazine d-Méquitazine Loratadine Rapport* ADRB2 4,54 4,36 395 1,71 0,91 beta 2 adrenergic receptor' AGTRAP _ 3,93 1,89 11,53 angiotensin II 2,43 2,57 !RC-associated protein KCNH2 potassium cnannel2,99 voltage gated (herg) EDG2 endothelial differentiation 0,28 gene 2 SLC8A1 ncx 1 exhanger TNNI3 troponin 0,43 0,19 s, 4,73 3,61 1,19 0,52 0,42 0,77 0,81 0,82 0,72 1,37 0,88 0,54 0,76 1,56 1,41 * Le rapport représente le rapport d'expression de la d-méquitazine versus la 1-méquitazine20 -29- On constate que l'énantiomère dextrogyre affecte à la hausse l'expression d'un nombre majoritaire de gènes et ceci dans une ampleur non négligeable. Ceci témoigne donc d'un toxicité cardiaque plus marquée pour l'énantiomère dextrogyre par rapport au lévogyre et ceci d'autant plus que les patients susceptibles de recevoir un traitement à base de Méquitazine présentent un déterminisme génétique ou physiologique représentatif d'une sensibilité cardiaque. Il ressort que l'utilisation d'un mélange enrichi en énantiomère lévogyre de la méquitazine pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les affections de nature allergique chez des populations de patients à risque, en particulier des patients présentant ou susceptibles de présenter une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradycardie ou du syndrome du QT long congénital présente un intérêt capital. EXEMPLE 2 : EVALUATION DE LA TOXICITE AIGUË CHEZ LE RAT û 15 DETERMINA.TION DE LA DL50 La toxicité aiguë a été évaluée chez des rats mâles et femelles par administration orale de dose croissante de méquitazine (racémique, énantiomère d ou énantiomère 1) afin de déterminer la dose léthale pour 50% de la population 20 évaluée. Mâles Femelles Racémique 920 mg/kg 670 mg/kg d-méquitazine 780 mg/kg 420 mg/kg 1-méquitazine 1210 mg/kg 1210 mg/kg Il ressort de ce test que la 1-méquitazine présente une toxicité aiguë bien plus faible que la d-méquitazine et que le mélange racémique. 25 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un mélange d'énantiomères du 10-(l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl)-10H-phénothiazine (Méquitazine) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S), pour la préparation d'un médicament antihistaminique destiné à prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de toxicité cellulaire, notamment la toxicité tissulaire et/ou organique. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit mélange enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S) permet de prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques de cardiotoxicité. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit mélange enrichi en l'énantiomère de configuration absolue (S) permet de prévenir ou traiter des affections allergiques, tout en limitant les risques d'ischémie myocardique, de prolongation de l'intervalle QT ou QTc, d'arythmie cardiaque, notamment les torsades de pointes, de cardiomyopathie, d'hypertrophie cardiaque ou d'infarctus du myocarde, de trouble diastolique ou de dysfonction systolique. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les métabolites de la Méquitazine sont choisis parmi la forme hydroxylée ou la forme S-oxydée suivante :-31- Forme hydroxylée OH Forme S-oxydée 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sel de la Méquitazine est le chlorhydrate de méquitazine. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le ratio massique entre l'énantiomère (S) et l'énantiomère (R) dans le dit mélange est supérieur à 95 : 5 ((S) : (R)), de préférence supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5:0,5. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en l'énantiomère (S). 15 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les affections allergiques sont choisies parmi la rhinite allergique, la rhinite vasomotrice, la rhinite spasmodique, la conjonctivite allergique, l'oedème de Quincke, l'urticaire, les allergies médicamenteuses, les affections dermatologiques prurigineuses. 20 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, chez des patients choisis parmi des patients présentant une cardiopathie, des troubles électrolytiques, une bradicardie ou atteints du syndrome du QT long congénital. 10