Brevet FR2892199A1 — publié le 20070420

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine du criblage d'agents biologiquement actifs capables de moduler l'activité protéolytique du protéasome, en particulier d'agents d'intérêt thérapeutique destinés à prévenir ou traiter des cancers, des syndromes inflammatoires, des infections bactériennes ou fongiques, les cachexies musculaires ou des maladies neurodégénératives. ART ANTERIEUR La voie ubiquitine protéasome Au sein des cellules humaines, la concentration de toute protéine résulte de l'équilibre entre sa vitesse de synthèse et sa vitesse de dégradation. La voie ubiquitine-protéasome constitue le mécanisme principal de dégradation des protéines chez les cellules humaines. La dégradation des protéines par la voie ubiquitine-protéasome est un processus biologique très précisément régulé et contrôlé dans le temps. Ce processus comprend dans la grande majorité des cas, deux grandes étapes successives : (i) le marquage des protéines devant être dégradées par l'ajout covalent d'un polymère ubiquitine et (ii) la destruction par le protéasome des protéines ainsi étiquetées, qui vont être clivées en petits peptides inactifs (Glickman and Ciechanover, 2002). On connaît un certains nombre de protéines qui sont détruites par le protéasome sans être modifiées par l'ajout d'un polymère d'ubiquitine. De même, des séquences peptidiques ont été identifiées qui conduisent à la dégradation par le protéasome des protéines qui le contiennent, (comme le motif peptidique FAT10, Hipp et al., 2005) sans intervention de l'ubiquitine. La voie ubiquitine-protéasome joue un rôle fondamental dans un très grand nombre de processus biologiques. En effet, les mécanismes de dégradation des protéines par le protéasome sont impliqués dans des mécanismes cellulaires importants tels que la réparation de l'ADN, le contrôle de l'expression des gènes, la régulation de la progression du cycle cellulaire, le contrôle de la qualité des protéines néosynthétisées, l'apoptose ou la réponse immunitaire (Glickman and Ciechanover, 2002). Des dysfonctionnements de la voie ubiquitine-protéasome provoquant la dégradation anormale de protéines régulatrices sont connus pour être à l'origine de, ou étroitement impliqués dans, plusieurs maladies génétiques et de nombreuses pathologies comme les cancers (colorectal, lymphomes...), les syndromes inflammatoires, les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ou l'atrophie musculaire (cachéxie). Le détournement de la voie ubiquitine-protéasome par des virus et des bactéries pathogènes (induisant la dégradation pathologique de protéines humaines) est à la base de plusieurs stratégies d'infection. Le domaine ubiquitineprotéasome offre donc un potentiel important pour le développement de nouveaux médicaments. Le protéasome Le protéasome présent dans les cellules humaines est un complexe multi-protéique de très grande taille (> 2,4 MDa) qui est retrouvé dans le cytoplasme et le noyau des cellules humaines. Les purifications biochimiques du protéasome présent dans les cellules humaines ainsi que les purifications des protéasomes réalisés à partir d'autres espèces d'organismes eucaryotes, y compris les levures, ont montré que dans tous les organismes eucaryotes, les formes purifiées du protéasome comprennent 2 grandes sous-unités, un coeur protéolytique appelé protéasome 20S et un complexe régulateur 19S qui se lie à chacune des deux extrémités du protéasome 20S (Coux et al., 1996 ; Glickman et Coux, 2001). Le protéasome 20S est une particule en forme de cylindre creux, composée de 28 sous-unités, distribuées en 4 anneaux heptamériques. Les activités peptidases sont présentes à la surface interne du cylindre et s'influencent de manière allostérique. Trois activités protéolytiques ( trypsin-, chymotrypsin- and caspase-like ) ont été associées au protéasome 20S et concourent à la destruction des protéines en peptides inactifs de 3 à 20 acides aminés. Outre le proteasome 20S, le protéasome 26S comprend le complexe régulateur 19S. Ce complexe régulateur 19S de 0, 7 MDa comprend 20 sous-unités environ, et peut être dissocié en 2 grands sous domaines, un couvercle requis pour la reconnaissance des protéines ubiquitinées et une base qui assure la liaison avec le protéasome 20S. Cette base comprend 6 ATPases assemblées sous forme d'anneaux, l'hydrolyse de I'ATP est en effet nécessaire, non seulement pour la dégradation active des protéines ubiquitinées, mais également pour les étapes de dépliement et de linéarisation de ces protéines, étapes qui précèdent la dégradation protéolytique de ces protéines. Des sous unités de la coiffe régulatrices sont impliquées dans la reconnaissance des protéines multi-ubiquitinées alors que d'autres participent aux étapes de déubiquitiination nécessaires au dépliement des protéines devant être dégradées. Des études plus récentes, employant notamment des techniques d'immuno-purification, ont montré que le protéasome cellulaire comprend de nombreuses protéines associées étroitement au protéasome 20S et 19S suggérant fortement que la complexité structurale du protéasome cellulaire est supérieure à celle du protéasome 26S. De telles protéines sont par exemple les protéines humaines PA200 (dont l'homologue chez la levure est la protéine BIm10 de 240 kDa (Schmidt et al., 2005), ou les activateurs PA28c4 ou PA28ay (Wojcik et al.,1998; Ustrell et al. 2002). Les rôles fonctionnels de ces protéines ne sont pas encore entièrement compris, mais ils pourraient s'agir de protéines qui assurent le transfert des protéines ubiquitinées vers le protéasome, de protéines régulant la reconnaissance des protéines ubiquitinées par le protéasome ou d'enzymes comme l'enzyme HuI5 (Leggett et al., 2002), qui sont impliquées dans l'allongement des chaînes de polyubiquitine et serviraient à accroître la vitesse de transfert des protéines vers les sites peptidasiques. On estime que le protéasome cellulaire est responsable de la dégradation de plus de 80% des protéines cellulaires. Protéasome et cancer Il a été récemment mis en évidence que la dégradation des protéines par le protéasome constitue un procédé biologique qui est fondamental pour la survie des cellules cancéreuses. En effet, de nombreuses études ont clairement démontré que de nombreux types de cellules malignes sont plus sensibles aux inhibiteurs du protéasome que les cellules normales. Des essais menés avec des inhibiteurs du protéasome, réalisés soit in vitro, soit in vivo, sur différents modèles de cellules cancéreuses ont démontré que cette classe de molécules possède des propriétés particulières qui en font des candidats attractifs pour développer de nouvelles armes thérapeutiques anti-cancer. Ultimement, l'inhibition de l'activité du protéasome induit l'apoptose, accroit la sensibilité des cellules cancéreuses aux chimiothérapies classiques ainsi qu'aux radiothérapies. De la même façon, il a été observé que l'inhibition du protéasome diminue sensiblement la résistance aux chimiothérapies et aux radiothérapies (Adams, 2004 ; Burger et Seth, 2004). L'inhibition de la dégradation de régulateurs important du cycle et de l'homéostasie cellulaire tels que les protéines p21, p27 et p53 a été impliquée en tant que mécanisme par lequel l'inhibition du protéasome affecte la croissance et la survie des cellules tumorales. De façon importante, il a été également montré que l'inhibition du protéasome bloque l'activation du régulateur cellulaire NF-1(B dont l'activation aberrante est une caractéristique de plusieurs cancers du sang. La caractérisation d'inhibiteurs du protéasome a montré que ces derniers induisaient l'apoptose (Pei et al., 2003), tuaient les cellules tumorales (Beverly et al. 1999), augmentaient la sensibilité aux radiations (Adams et Anderson, 2001) et permettaient de surmonter la résistance aux drogues (Hideshima et al., 2001). De plus, il a été démontré que l'inhibition du protéasome bloque les signaux anti-apoptotiques qui sont déclenchés lors de radiothérapies ou de chimiothérapies. Il faut également souligner que la sensibilité spécifique des cellules malignes vis-à-vis des inhibiteurs du protéasome pourrait résulter de leur prolifération rapide qui est associée à des dysfonctionnement d'un ou plusieurs mécanismes de check-point . Ces altérations ont pour conséquence l'accumulation rapide chez les cellules malignes d'un grand nombre de protéines défectueuses, et ceci de manière beaucoup plus marquée que chez des cellules normales. Cette accumulation rapide et importante de protéines mutantes, et/ou mal repliées est très certainement susceptible d'accroître de manière très significative la dépendance des cellules malignes vis-à-vis d'un protéasome actif et par conséquent, les rendre très sensibles aux inhibiteurs du protéasome (Adams, 2004). Les inhibiteurs du protéasome peuvent être synthétiques ou naturels. 5 grandes familles d'inhibiteurs sont décrites à ce jour : les aldéhydes peptidiques, les peptides vinyl sulfones, les dérivés boroniques de peptides, les dérivés epoxicétones de peptides et les R-lactones. A ce jour cependant, seuls deux composés ont été développés jusqu'aux stades cliniques suite à la démonstration de leur propriété anti-néoplastiques; le bortezomib (anciennement PS-341) développé par la société Millennium (Cambridge, MA, U.S.A.) et le composé NPI-0052 développé par la société Nereus (San Diego, CA, U.S.A.) Le Bortezomib, un dérivé boronique d'un dipeptide, a démontré une réelle efficacité contre un large spectre de lignées cancéreuses, incluant des lignées de cancer du colon, des lignées malignes issues du système nerveux central, des lignées de cancer de la prostate et du sein. Le Bortezomib est le premier inhibiteur du protéasome à avoir été testé en essais cliniques. Les résultats positifs des essais de phase II et de phase III réalisés chez des patients atteints de myélomes et dont les deux premières thérapies avaient échouées, ont démontré l'efficacité du bortezomib et ont conduit à l'approbation de la mise sur le marché du bortezomib par le FDA en 2003 pour le traitement des myélomes réfractaires aux thérapies classiques. Le Bortezomib est commercialisé sous le nom de Velcade . Le Bortezomib inhibe avec une grande spécificité une des 3 activités protéolytiques du protéasome 20S, (l'activité chymotrypsin-like ). Son action induit l'apoptose et ses effets semblent s'exercer aussi bien par l'activation de voies pro-apoptotiques que par la répression de voies anti-apoptotiques (Hideshima et al., 2001 ; Beverly et al., 1999). L'apparition de cellules résistantes au Velcade ainsi que la toxicité élevée de ce composé qui limite son application fait qu'il existe un besoin pour le développement de nouveaux inhibiteurs du protéasome. En particulier, les inhibiteurs du protéasome qui sont connus sont des inhibiteurs catalytiques du protéasome ce qui peut expliquer leur toxicité et il serait intéressant de pouvoir développer des inhibiteurs non catalytiques du protéasome. De tels inhibiteurs non catalytiques pourraient être actifs en inhibant l'activité des complexes régulateurs 19S et des protéines associées qui sont nécessaires au fonctionnement du protéasome cellulaire (ie, tel qu'il existe dans les cellules). Il est important de noter que les inhibiteurs qui sont connus et développés à ce jour ont été identifiés grâce à des tests biochimiques in vitro qui rapportent l'activité protéolytique du protéasome purifié vis-à-vis de substrats non naturels tels que des peptides qui diffusent librement dans le cylindre catalytique 20S. De tels tests ne rapportent donc pas l'activité du protéasome cellulaires car ils ne font notamment pas appel aux fonctions des complexes régulateurs associés au protéasome 20S. De manière générale, il existe un besoin d'identifier des composés thérapeutiques qui sont capables d'induire la destruction des cellules malignes. DESCRIPTION DE L'INVENTION Selon l'invention, on a mis au point un procédé de criblage d'agents d'intérêt thérapeutique, qui sont sélectionnés pour leur spécificité d'action sur le protéasome cellulaire. Ce procédé de criblage est réalisé in cellulo et permet, à la différence des tests biochimiques existants, d'identifier des inhibiteurs catalytiques ou non catalytiques du protéasome cellulaire. Le demandeur a montré que, de manière surprenante, il était possible de mimer, dans des cellules de levure, le processus de dégradation, dépendant du protéasome mais indépendant d'une ubiquitination préalable, du régulateur cellulaire humain p21 WAF1/Cip1 par le protéasome, processus qui a lieu naturellement dans les cellules humaines. La protéine p21wAF1/ciel est un régulateur du cycle de division des cellules humaines qui appartient à la famille des inhibiteurs des Cyclin Dependent Kinases , Cdk. La protéine p21wAF1/c'p1 a pour principale fonction de réguler l'activité des complexes Cdk2/cycline, dont l'activation contrôle la progression du cycle cellulaire. La protéine p21 WAF1/ciel est également connue pour réguler la synthèse d'ADN en interagissant avec le facteur PCNA (proliferating cell nuclear antigen), une sous-unité de l'ADN-polymérase 6 essentielle à la réplication chromosomique. La protéine p21wAF1/c'p1 est une protéine peu structurée, très instable (Kriwacki et al., 1996). Il existe deux voies de dégradation de la protéine p21 WAF1/ciel La première dépend de I'ubiquitination et implique I'ubiquitine ligase SCFSkp2. Cette voie est notamment induite lors d'une irradiation des cellules par des rayons UV (Bendjennat et al. 2003 ; Bornstein et al., 2003). La seconde voie ne requiert pas I'ubiquitination de p21 WAF1/Cip1 mais est néanmoins dépendante de l'activité du protéasome. Cette seconde voie de dégradation qui n'implique pas I'ubiquitination de p21wAF1/Cip1 semble, dans les cellules de mammifère, impliquer la protéine Mdm2 qui activerait la dégradation de p21wAF1/ciel en favorisant son interaction physique avec le protéasome (Zhang et al., 2004). La fonction ubiquitine ligase de Mdm2 n'est pas impliquée dans ce mécanisme. Du fait que les cellules de levure n'expriment pas de protéine orthologue ou similaire à la protéine Mdm2 humaine, c'est donc de manière totalement surprenante que le demandeur a montré qu'il était néanmoins possible de mimer, dans des cellules de levure, la dégradation de la protéine p21 WAF1/ciel humaine par le protéasome, selon une voie de dégradation par le protéasome qui n'est pas dépendante d'une étape d'ubiquitination de la protéine p21WAF1/Cip1, préalable à sa dégradation. L'invention a pour objet un procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant : (i) un polypeptide p21 choisi parmi le polypeptide p21 WAF1/Cip1 et le polypeptide p21 [6KR]wAFllciPl ;et (ii) au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat. Le procédé de l'invention consiste en un procédé qui est réalisé in cellulo, du fait que la dégradation de la protéine cible p21 WAF1/Cip1 ou p21 [6KR]wAFllciPl est réalisée et visualisée dans des cellules de levures et non par des réactions réalisées dans un système acellulaire. Dans certains modes de réalisation du procédé de criblage ci-dessus, on utilise des cellules de levure qui expriment une protéine de fusion comprenant une forme mutante de la protéine p21 WAF1/c'p1 chez laquelle les 6 résidus lysine de la protéine p21 sauvage ont été substitués par des résidus arginine. Cette forme mutante de la protéine p21 WAF1/ciel est désignée p2l [6KR]WAF1/cip1. Ces substitutions d'acides aminés suppriment tous les sites potentiels d'ubiquitination sur la protéine. La dégradation du dérivé p2l [6KR]wAFllciPl est donc, du fait de l'absence de sites d'ubiquitination dans sa séquence d'acides aminés, exclusivement et directement dépendante de l'activité protéolytique du protéasome, et indépendante d'une étape d'ubiquitination. Enfin, on a également montré que, dans des cellules de levure, la dégradation du polypeptide p21 (p21 WAF1/Cip1 ou p2l [6KR]WAF1/c'p1) par le protéasome a lieu, même lorsque le polypeptide p21 (p21WAF1/Cip1 ou p21 [6KR]WAF1/ciel) est fusionné à une protéine détectable et notamment à une protéine auto-fluorescente. De façon surprenante, dans les cellules de levure, la dégradation de la protéine fusion est totale, les polypeptides correspondant à la protéine p21 (p21 WAF1/Cip1 ou p2l [6KR]WAF1/Cip1) et à la protéine détectable sont tous les deux dégradés. Ces résultats sont surprenants car des expériences antérieures de biochimie, réalisées in vitro, avaient démontré que lorsqu'une protéine fusion composée de p21 WAF1/Cip1 fusionnée à une protéine auto-fluorescente est mise en présence de protéasome 26S ou 20S, alors seule la partie p21 WAF1/Cip1 est dégradée, la partie correspondant à la partie auto-fluorescente étant libérée sous une forme stable non dégradée (Liu et al., 2003). La dégradation totale de la protéine de fusion p21 (p21 WAF1/Cip1 ou p2l [6KR]WAF1/c'p1), observée dans les cellules de levure, permet de mesurer la quantité de protéine de fusion présente dans les cellules de levure en quantifiant le signal généré par la protéine détectable comprise dans ladite protéine de fusion. Le procédé ci-dessus permet à l'homme du métier de déterminer si un agent candidat à tester est capable de modifier la vitesse de dégradation, ou le degré de dégradation, de la protéine p21 (p21 WAF1/Cip1 ou p2l [6KR]WAF1/c'p1) par le protéasome dans les cellules de levure exprimant la protéine p21 humaine normale ou mutée (p21WAF1/ciel ou p2l[6KR]WAF1/ciel) Le procédé de criblage in cellulo ci-dessus, du fait qu'il met en ceuvre un système artificiel et humanisé de dégradation d'une protéine de fusion cible dans des cellules de levure, permet un criblage d'agents qui agissent de manière spécifique sur l'activité du protéasome cellulaire, telle qu'elle existe dans toute sa complexité dans la cellule, y compris en l'absence d'une étape préalable d'ubiquitination de la protéine cible dans la cellule. De plus, grâce au procédé ci-dessus, on a mis au point un test physiologique de criblage d'agents actifs sur le protéasome, en construisant chez la levure une voie métabolique de dégradation protéique mimant la voie de dégradation par le protéasome du facteur régulateur p21 WAF1/ciel humain. Ainsi, du point de vue de la voie métabolique de dégradation des protéines qui est visée, le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions physiologiques très proches des conditions physiologiques de dégradation des protéines par le protéasome humain. Aux fins de la présente description, un agent qui module l'activité du protéasome englobe, respectivement, (i) un agent qui inhibe ou bloque l'activité du protéasome, en particulier qui inhibe ou bloque l'activité du protéasome indépendante d'une étape d'ubiquitination préalable à la dégradation de la protéine cible, et (ii) un agent qui active ou augmente l'activité du protéasome, en particulier qui active ou augmente l'activité du protéasome indépendante d'une étape d'ubiquitination préalable à la dégradation de la protéine cible. Grâce au procédé ci-dessus, on peut identifier les agents capables d'inhiber la vitesse ou le degré de dégradation intracellulaire du polypeptide p21 WAF' cio ou du polypeptide p21 [6KR]WAF'lc'P1 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents inhibiteurs, qui peuvent être identifiés grâce au procédé de l'invention, du fait qu'ils vont inhiber également l'activité du protéasome dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'inhiber ou de bloquer la prolifération de cellules tumorales, d'inhiber ou bloquer l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des pathologies d'auto-immunité ou encore des cancers, de perturber des mécanismes de contrôle de la mort cellulaire (apoptose). Ainsi, le procédé de criblage in cellulo ci-dessus peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats inhibiteurs pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est supérieure à la valeur témoin de comparaison. Le procédé de l'invention permet aussi d'identifier des agents capables d'augmenter la vitesse ou le degré de dégradation du polypeptide p21 WAF' cio ou du polypeptide p21 [6KR]WAF'/c'P1 par le protéasome des cellules de levure. De tels agents activateurs, du fait qu'ils vont activer également l'activité du protéasome dans les cellules humaines, constituent des agents d'intérêt thérapeutique susceptibles d'induire ou d'augmenter l'activation de l'expression de divers gènes impliqués dans l'inflammation, des pathologies d'auto-immunité ou des cancers. Ainsi, selon ce second aspect, le procédé de criblage in cellulo de l'invention permet de cribler des agents pro-inflammatoires. Certains des agents pro-inflammatoires sélectionnés selon le procédé sont susceptibles de revêtir un intérêt thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés à faible dose ou lorsqu'ils sont administrés pendant une courte durée, par exemple en tant qu'agents inducteurs d'une réponse immune précoce, telle que l'induction d'une réaction de résistance non spécifique à l'infection ou encore telle que l'activation des cellules présentatrices de l'antigène, pour l'initiation d'une réponse immunitaire spécifique d'un antigène, qu'elle soit à médiation humorale ou à médiation cellulaire. Certains autres agents pro-inflammatoires sélectionnés selon le procédé de criblage in vitro de l'invention peuvent consister en des principes actifs connus, notamment des principes actifs de médicament, dont un effet pro-inflammatoire indésirable est identifié, et pour lesquels des précautions d'emploi particulières vis-à-vis de la santé humaine devront être observées. De manière similaire, certains des agents sélectionnés selon le procédé sont susceptibles d'avoir des activités pro-apoptotiques. Ainsi, selon un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle (d) qui consiste à sélectionner positivement les agents candidats activateurs, pour lesquels la quantité de protéine détectable mesurée à l'étape (b) est inférieure à la valeur témoin de comparaison. Comme on l'aura compris, l'agent modulant l'activité du protéasome peut être de toute nature. Ledit agent peut être tout composé organique ou minéral, et peut être soit un agent d'origine naturelle, soit un agent produit, au moins en partie, par synthèse chimique ou biologique. Ledit agent peut être notamment un peptide ou protéine. Ledit agent englobe aussi toute molécule déjà connue pour posséder un effet biologique, notamment un effet thérapeutique, ou à l'inverse un effet toxique démontré ou suspecté pour l'organisme. Dans le procédé de l'invention, une fois que la protéine de fusion, comprenant le polypeptide p21 WAF1/Cip1 ou le polypeptide p21 [6KR]WAF1/ciPl fusionné à une protéine détectable, est exprimée dans les cellules de levure, la dite protéine de fusion est reconnue et subit une protéolyse qui est effectuée par le protéasome. La quantification de la protéine détectable contenue dans la cellule de levure, à un instant donné, permet de déterminer le degré de dégradation de ladite protéine de fusion p21 WAF1/ciplprotéine détectable ou p21 [6KR]WAF1/ciel ùprotéine détectable, à cet instant donné. Un polypeptide p21 WAF1/ciel selon l'invention consiste en un polypeptide possédant au moins 90% d'identité en acides aminés avec le polypeptide p21 WAF1/Cip1 de séquence SEQ ID N 1. Un polypeptide p21 WAF1/ciel selon l'invention peut consister en le polypeptide p21 WAF1/ciel de séquence SEQ ID N 1. Un polypeptide p21 [6KR]WAF1/c'p1 selon l'invention consiste en un 35 polypeptide possédant au moins 90% d'identité en acides aminés avec le polypeptide p21 [6KR]WAF'lci 1 de séquence SEQ ID N 2. Un polypeptide p21 [6KR]WAF'lc1Pl selon l'invention peut consister en le polypeptide p21 [6KR]WAF'lc'p' de séquence SEQ ID N 2. Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels (A, T, G, C et U). Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases , complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G. Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 d'identité avec un second acide nucléique de référence, possèdera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence. Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 % d'identité avec un second polypeptide de référence, possèdera au moins 90 %, de préférence au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou entre deux séquences de polypeptide, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique, ou un résidu d'acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d'acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles, ou le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles.. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentaged'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS = default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES = hide D. Selon l'invention on a montré que la sensibilité du procédé de criblage décrit ci-dessus est accrue lorsque, préalablement à la mise en contact des cellules de levure avec l'agent à tester, on stoppe l'expression de la protéine p21 cible dans les cellules de levure, c'est à dire soit la protéine de fusion p21waFlicpl-protéine détectable, soit la protéine de fusion p21 [6KR]waFlicp'_ protéine détectable. Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré du procédé ci-dessus, l'étape (a) comprend elle-même les étapes suivantes : (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 et au moins une protéine 35 détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) avec l'agent candidat à tester. L'arrêt de l'expression de la protéine de fusion p21 WAF1lc'Pl-protéine détectable, à un moment choisi, peut être facilement réalisé par l'homme du métier, en utilisant, pour transformer les cellules de levure, une cassette d'expression dans laquelle le polynucléotide codant ladite protéine de fusion est placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et dont l'activation, ou à l'inverse la répression, est induite par un agent inducteur. De nombreux promoteurs inductibles actifs dans des cellules de levure sont connus par l'homme du métier, dont certains d'entre eux sont décrits plus loin dans la description, y compris dans les exemples. Dans la pratique, la protéine de fusion p21-protéine détectable est rapidement reconnue et dégradée par le protéasome dans les cellules de levure. Les conditions optimales de mise en ceuvre du procédé de criblage selon l'invention sont les conditions dans lesquelles on induit une accumulation intracellulaire d'une grande quantité de la protéine de fusion p21-protéine détectable qui est exprimée dans les cellules de levure. Plus la quantité intracellulaire de protéine de fusion p21-protéine détectable est grande au début de l'étape a) du procédé, plus la valeur du signal généré par la protéine détectable est élevée et peut être mesurée avec une grande précision au moment de l'étape b) du procédé. Ainsi, plus la quantité intracellulaire de la protéine de fusion p21-protéine détectable est grande au début de l'étape a), plus les variations de quantité de cette protéine de fusion peuvent être mesurées avec précision, à l'étape b) du procédé. Pour obtenir l'accumulation d'une grande quantité intracellulaire de la protéine de fusion p21-protéine détectable dans les cellules de levure, il est avantageux de placer la séquence codant ladite protéine de fusion sous le contrôle d'un promoteur répressible fort et d'utiliser des souches de levure possédant plusieurs copies d'un polynucléotide comprenant (i) un promoteur répressible fort, (ii) un acide nucléique codant la protéine de fusion p21-protéine détectable. La présence de plusieurs copies du polynucléotide codant d'intérêt permet l'obtention d'un fort signal de détection de la protéine détectable, à l'étape a) du procédé. Ces conditions de fort signal permettent de quantifier avec une grande sensibilité la protéine détectable pendant toute la durée du procédé, au fur et à mesure de la dégradation de la protéine de fusion p21- protéine détectable par le protéasome. De manière évidente, plus le signal détectable de départ est fort, meilleure est la sensibilité des mesures lors de la mise en ceuvre du procédé. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, on utilise des cellules de levures dans lesquelles la ou les copies du polynucléotide codant la protéine de fusion p21-protéine détectable est (sont) intégrée(s) dans le chromosome. Ce mode de réalisation avantageux permet l'accumulation intracellulaire de la protéine de fusion p21-protéine détectable à un niveau élevé dans toutes les cellules de levure cultivées pour la mise en ceuvre du procédé. Ce mode de réalisation du procédé de criblage de l'invention constitue un avantage, par rapport à l'utilisation de cellules de levures transformées par des plasmides dans chacune desquelles une ou plusieurs copies du polynucléotide codant la protéine de fusion p21-protéine détectable est (sont) insérée(s). En effet, lorsque les cellules de levures qui expriment la protéine de fusion p21-protéine détectable consistent en des cellules contenant un ou plusieurs vecteurs recombinants, en particulier un ou plusieurs plasmides recombinants, dans lesquels est insérée au moins une copie du polynucléotide codant la protéine de fusion p21-protéine détectable, il peut arriver que la transmission desdits vecteurs recombinants d'intérêt ne se réalise pas de manière homogène, avec les générations successives de cellules de levure. Dans certains cas, le niveau d'expression intracellulaire de la protéine de fusion p21-protéine détectable serait hétérogène au sein de l'ensemble des cellules de levure cultivées, ce qui serait susceptible de réduire la sensibilité du procédé de criblage de l'invention. Description des modes de réalisation préférés du procédé de criblaqe Les modes de réalisation préférés du procédé de criblage de l'invention sont décrits ci-dessous, notamment en relation avec la description des aspects fonctionnels et structurels des divers moyens permettant la mise en ceuvre dudit procédé. De manière générale, la protéine détectable qui est comprise dans la protéine de fusion p21-protéine détectable peut être de toute nature, dès lors que sa présence, peut être spécifiquement détectée dans les cellules de levure avant sa protéolyse, et que la présence de formes protéolysées de la protéine détectable, notamment de fragments peptidiques produits par protéolyse de ladite protéine détectable, ne sont pas détectées par le moyen de détection spécifique qui est choisi. Comme cela se comprend aisément, l'activité protéolytique du protéasome est suivie, selon le procédé de l'invention, en mesurant son effet sur la stabilité de la protéine de fusion p21-protéine détectable. Grâce à l'expression dans les cellules de levure du facteur p21 sous forme de protéine fusion, la dégradation de la protéine fusion contenant p21 peut être suivie en temps réel, par détection de la protéine détectable non protéolysée. Préférentiellement, la protéine de fusion p21-protéine détectable comporte une forme mutante du polypeptide p21 WAF1/Cip1 chez laquelle les 6 résidus lysine de la protéine p21 ont été substitués par des résidus arginines, qui est désignée p2l [6KR]WAF1/Cip1. La stabilité de la protéine de fusion p21 [6KR]WAF1/Cip1_protéine détectable dépend exclusivement de l'activité protéolytique du protéasome et n'implique pas son ubiquitination préalable. Selon la nature de la protéine détectable fusionnée à p21 (p21 WAF1/Cip1 ou p21 [6KR]WAF1/c'p1) la dégradation de la protéine fusion peut être suivie par des techniques connues en soi, notamment des techniques de mesure de fluorescence à l'aide, soit d'un cytomètre de flux, soit d'un lecteur de microplaques, soit d'un fluorimètre, soit grâce à un microscope à fluorescence, ou encore par des techniques colorimétriques, enzymatiques ou immunologiques. A titre illustratif, la protéine détectable peut être choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente ou une protéine ayant une activité enzymatique. Lorsque la protéine détectable consiste en un antigène, elle peut être tout type d'antigène, dès lors que des anticorps spécifiques de cet antigène sont déjà accessibles ou, alternativement, peuvent être préparés, selon toute technique d'obtention d'anticorps, notamment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, dans ce cas, la protéine détectable consiste en un antigène de faible taille, qui n'est pas susceptible d'interférer avec la reconnaissance de la protéine p21 (p21 WAF1/ciel ou p21 [6KR]WAF'IciPl ) par le protéasome. Ainsi, préférentiellement, on utilise, comme antigène, un peptide ayant une chaîne de 7 à 100 acides aminés de longueur, mieux de 7 à 50 acides aminés de longueur, et encore mieux de 7 à 30 acides aminés de longueur, par exemple 10 acides aminés de longueur. A titre illustratif, on peut utiliser l'antigène HA de séquence [NH2-YPYDVPDYACOOH] SEQ ID N 7, ou encore un antigène FLAG de séquence [NH2-DYKDDDDK-0O0H] SEQ ID N 8 (monomère FLAG) ou de séquence [NH2-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-0O0H] SEQ ID N 9 (trimère FLAG) Dans ce cas, on utilise, pour quantifier la protéine détectable à l'étape (b) du procédé, un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'antigène compris dans la protéine de fusion, cet anticorps étant marqué directement ou indirectement. La quantification est alors réalisée par mesure du signal détectable produit par les complexes formés, dans les cellules de levure, entre l'anticorps marqué et la protéine de fusion p21-antigène. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant. Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, elle est notamment choisie parmi la protéine mAG, la protéine GFP ou l'un de ses dérivés, la protéine YFP ou l'un de ses dérivés, et la protéine dsRED. Parmi les protéines dérivées de la protéine GFP, on peut utiliser notamment l'une quelconque des protéines connues sous les noms GFPMut3 (Cormack et al. (Gene (1996) 173_: 33-38)), Venus (Nagai et al., (Nat. Biotechnol. (2002) 20:87-90)) ou Sapphire (Zapata-Hommer and Griesbeck, BMC Biotechnol. (2003) 3:5). La protéine à fluorescence intrinsèque peut aussi être choisie parmi les protéines auto-fluorescentes originaires de divers organismes, autres que Aequorea victoria. Notamment, la protéine à fluorescence intrinsèque peut être choisie parmi les protéines suivantes : - la protéine CopGFP originaire de Pontellina plumata, et décrite par D.A. Shagin et al.(2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine TurboGFP, un variant de CopGFP ; et décrite par D.A. Shagin et al., 2004 (Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine PhiYFP originaire de Phialidium sp. ; et décrite par D.A. Shagin et al.( 2004, Mol. Biol. Evol. 21:841-850) ; - la protéine AcGFP originaire de Aequorea coerulescens, ainsi que ses variants, et décrite par N.G. Gurskaya, (2003, Biochem. J. 373:403-408) ; et - la protéine DsRed originaire de Discosoma sp. ; et décrite par M.V. Matz et al (1999, Nature Biotech. 17:969-973). Préférentiellement on utilisera, dans la protéine fusion p21-protéine détectable, la protéine mAG, aussi appelée monomeric Azami-Green , originaire du corail de Galaxeidae; et décrite par Karasawa et al. (Karasawa et al., J. Biol. Chem. 2003 278:34167-34171). Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à fluorescence intrinsèque, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure du signal de fluorescence qui est émis par la protéine de fusion p21-protéine fluorescente à l'aide de tout dispositif adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la protéine détectable est une protéine fluorescente, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine. Lorsque la protéine détectable consiste en une protéine à activité enzymatique, ladite protéine détectable est choisie notamment parmi la luciférase et la R-lactamase. Dans ce cas, on quantifie la protéine détectable à l'étape (b) du procédé par mesure de la quantité du ou des composés produits par la conversion du substrat par l'enzyme. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est coloré, la mesure peut être réalisée par colorimétrie. Lorsque le produit de l'activité enzymatique est fluorescent, on mesure l'intensité du signal de fluorescence qui est émis par ledit produit, à l'aide de tout dispositif de mesure de la fluorescence adapté. Ainsi, à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide p21WAF'/C'p' consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N 3, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 5. La protéine de séquence SEQ ID N 3 consiste, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable mAG allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 226, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 227 jusqu'à l'acide aminé en position 228 et (iii) le polypeptide p21 WAF'/c'p' allant de l'acide aminé en position 229 jusqu'à l'acide aminé en position 392. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 5 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable mAG allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 678, (ii) la séquence codant un peptide espaceur allant du nucléotide en position 679 jusqu'au nucléotide en position 684 et (iii) la séquence codant le polypeptide p21 'c'p' allant du nucléotide en position 685 jusqu'au nucléotide en position 1179 (codon stop compris). Selon un autre mode de réalisation préféré, la protéine comprenant le polypeptide p21 [6KR]wAFllciPl consiste en la protéine de séquence en acides aminés SEQ ID N 4, qui peut être codée par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 6. La protéine de séquence SEQ ID N 4 consiste, de l'extrémité NH2-terminale vers l'extrémité COOH-terminale, respectivement en (i) la séquence de la protéine détectable mAG allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 226, (ii) un premier peptide espaceur allant de l'acide aminé en position 227 jusqu'à l'acide aminé en position 228 et (iii) le polypeptide p21 [6KR]wAFllciPl allant de l'acide aminé en position 229 jusqu'à l'acide aminé en position 392. L'acide nucléique de séquence SEQ ID N 6 consiste, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement en (i) la séquence codant la protéine détectable mAG allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 678, (ii) la séquence codant un peptide espaceur allant du nucléotide en position 679 jusqu'au nucléotide en position 684 et (iii) la séquence codant le polypeptide p2l [6KR]wAFllciPl allant du nucléotide en position 685 jusqu'au nucléotide en position 1179 (codon stop compris). Dans les polynucléotides de séquence SEQ ID N 5 codant la protéine de fusion comprenant p21 WAF''c'p' et de séquence SEQ ID N 6 codant la protéine de fusion comprenant p21 [6KR]WAF'lc'p', l'identité des bases nucléiques a été adaptée de manière à inclure, dans ces séquences nucléiques, les codons qui sont préférentiellement utilisés dans les cellules de levure. Selon encore un autre aspect, le procédé de criblage selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend : (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 (p21 WAF'/C'p' ou p21 [6KR]WAF'lCip1) et (ii) une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; Le polynucléotide ci-dessus peut consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 5 ou en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 6. Acides nucléiques, vecteurs d'expression et cellules de levure transformées préférés selon l'invention. On a synthétisé selon l'invention des acides nucléiques, lesquels, lorsqu'ils sont introduits dans des cellules de levure, provoquent l'expression de la protéine de fusion p21-protéine détectable, c'est à dire des acides nucléiques codant la protéine de fusion p21 WAF'lC'p'-protéine détectable et des acides nucléiques codant la protéine de fusion p21 [6KR]WAF'lc'p'-protéine détectable. Chacun des acides nucléiques synthétisés comprend une séquence codante, qui est aussi désignée cadre de lecture ouvert ou ORF qui code la protéine de fusion p21-protéine détectable d'intérêt. Des exemples illustratifs des acides nucléiques selon l'invention sont les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 5 (p21 WAF'lC'p'-protéine détectable ) et SEQ ID N 6 (p21 [6KR]WAF'lc'p'-protéine détectable), dont la structure a été décrite précédemment dans la description. Chacun des acides nucléiques comprend aussi une séquence régulatrice comprenant un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure. Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur fonctionnel dans les cellules de levure consiste en un promoteur répressible, c'est à dire un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. Lorsque l'agent inducteur est ajouté dans le milieu de culture des cellules de levure, il induit la répression ou le blocage de l'expression de la séquence codant la protéine d'intérêt placée sous son contrôle. Ce promoteur répressible est avantageusement choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL1, GAL10, MET3, MET25, PHO5, PHO87 et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisae. La séquence du promoteur du gène GAL1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4 : 1440-1448). La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genet. (1987) 210 (2) : 307-313). La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871). La séquence du promoteur du gène PHO5 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809). La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Skala et al., Yeast (1995) 14:1421-1427. La séquence du promoteur du gène CUP1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341). Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique ou le polynucléotide qui code la protéine de fusion p21-protéine détectable comprend la séquence régulatrice GAL 1. Cette séquence active l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de galactose. Par contre cette séquence réprime l'expression du cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 lorsque les cellules de levure sont cultivées en présence de glucose. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, l'expression de la protéine fusion comprenant le polypeptide p21 est réalisée de manière temporaire durant l'essai de criblage. Après avoir été induite durant un temps fixé pouvant varier de 20 minutes à 24 heures, l'expression de la protéine contenant p21 est spécifiquement stoppée (dans une expérience connue par l'homme du métier sous le nom de promoter shut off ) avant d'exposer les cellules aux molécules devant être criblées. Cet arrêt de l'expression est obtenu par l'addition dans le milieu de culture d'une molécule pouvant réprimer l'activité du promoteur contrôlant l'expression de la protéine fusion p21-protéine détectable, ou bien encore par l'élimination de la présence, dans le milieu de culture, d'un agent ou d'une molécule requise pour l'activation dudit promoteur. Ainsi, lorsque la protéine de fusion p21-protéine détectable est exprimée sous le contrôle du promoteur du gène GAL 1, alors l'expression de ce promoteur est réprimée en ajoutant du glucose à la concentration finale de 2 dans le milieu de culture. L'arrêt de la néo-synthèse de la protéine de fusion comprenant p21 permet de mesurer sa stabilité en temps réel, en déterminant par exemple la fluorescence des cellules de levure au cours du temps après l'arrêt de synthèse, dans le mode de réalisation dans lequel ladite protéine de fusion contient une protéine détectable à fluorescence intrinsèque, comme la mAG ou une protéine dérivée de la GFP. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 et au moins une protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une telle cassette d'expression peut être caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21WAF'Ic'p' et le polypeptide p21 [6KR]wAFVCp' Une telle cassette d'expression peut notamment être caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21wAF'icp' de séquence SEQ ID N 1 et le polypeptide p21 [6KR]wAF'icp' de séquence SEQ ID N 2. Une telle cassette d'expression peut notamment comprendre ou consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 5 selon l'invention, qui code la protéine de fusion mAG- p21wAFI'c'p1 de séquence SEQ ID N 3. Une telle cassette d'expression peut aussi comprendre ou consister en l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 6 selon l'invention, qui code la protéine de fusion mAG- p21 [6KR]wAF'icp' de séquence SEQ ID N 4. Selon un mode de réalisation préféré d'une telle cassette d'expression, la séquence régulatrice comprend un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure, et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur, tel qu'un promoteur choisi parmi les promoteurs CUP1, GAL1, GAL10, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure recombinantes possèdent l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion p21-protéine détectable sous une forme intégrée dans leur génome, comme cela est illustré dans les exemples Dans encore un autre mode de réalisation du procédé de criblage selon l'invention, les cellules de levure sont transformées par l'acide nucléique ou le polynucléotide comprenant la séquence codant la protéine de fusion p21-protéine détectable qui se présente sous une forme non intégrée dans les chromosomes, par exemple sous la forme de vecteurs fonctionnels dans les cellules de levure et qui portent au moins une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de levure. De manière générale, pour la mise en ceuvre du procédé de criblage de l'invention, il est avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire, notamment une bonne perméabilité membranaire pour les agents à tester par le procédé. Pour la mise en ceuvre du mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention dans lequel l'expression de la protéine fusion est réalisée sous le contrôle d'un promoteur répressible, il est également avantageux d'utiliser des cellules de levures qui possèdent une bonne perméabilité membranaire pour les composés inducteurs vis-à-vis desquels lesdits promoteurs répressibles sont sensibles. Ainsi, dans un autre mode de réalisation préféré du procédé de criblage de l'invention, on utilise des souches de levure dont le génome comprend une à plusieurs mutations qui augmentent la perméabilité aux produits à tester, telles que des mutations inactivant les gènes PDR1 et PDR3, deux gènes codant des facteurs transcriptionnels qui chez la levure contrôlent l'expression de transporteurs insérés dans la membrane plasmique (Vidal et al., 1999, Nourani et al., 1997). Préférentiellement, on utilise des souches de levure possédant le fond génétique de la souche W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis et al. (1990), ou tout autre souche caractérisée de la dite levure Saccharomyces cerevisiae. La transformation des cellules de levure par de l'ADN exogène est préférentiellement réalisée en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, notamment la technique décrite par Schiestl et al. (1989). Les constructions des différentes souches de levure ont été réalisées en employant des techniques de génétique (croisement, sporulation dissection des asques et analyse phénotypique des spores) connues et décrites notamment par Sherman et al. (1979) et les techniques de génétique inverse décrites notamment par Rothstein (1991). Conformément à l'invention, les levures sont transformées préférentiellement par des plasmides construits selon des techniques de biologie moléculaire classiques, notamment selon les protocoles décrits par Sambrook et al. (1989) et Ausubel et al. (1990-2004). Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression telle que définie dans la présente description. Un premier vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSYAQ6- p2lwt qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de la souche de levure CYS343. Un second vecteur conforme à l'invention est le vecteur pCSYAQ6-p21 [6KR] qui est décrit dans les exemples, et qui a servi à la construction de la souche de levure CYS344. La présente invention est également relative à une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide p21 (p21 WAF1/cipl ou p2l [6KR]WAF1/ciel ) et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une souche de levure recombinante selon l'invention peut consister en une souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide p21 wAF1/ciel de séquence SEQ ID N 1 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. Une souche de levure recombinante selon l'invention peut consister en une souche de levurerecombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide p21 [6KR]wAF1/Cip1 de séquence SEQ ID N 2 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. En particulier, l'invention est relative à une souche de levure recombinante conforme à la définition ci-dessus, qui consiste en la souche de levure CYS343, qui exprime la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21wAF1'Cip1 et la protéine détectable mAG, c'est à dire la protéine de fusion de séquence SEQ ID N 3. En particulier, l'invention est relative à une souche de levure recombinante conforme à la définition ci-dessus, qui consiste en la souche de levure CYS344, qui exprime la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 [6KR]wAF1/Cip1 et la protéine détectable mAG, c'est à dire la protéine de fusion de séquence SEQ ID N 4. L'invention concerne aussi une trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 (p21wAF1/Cip1 ou p2l[6KR]wAF1lc'p1 ) telle que définie ci-dessus. L'invention est aussi relative à une trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome, une cassette d'expression codant la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 (p21wAF1/Cip1 ou p2l[6KR]wAF1/Cip1) telle que définie ci-dessus. Préférentiellement, la trousse ou kit ci-dessus comprend des cellules de levure recombinantes de la souche de levure CYS343 ou des cellules de levure recombinantes de la souche de levure CYS344. Le procédé de criblage selon l'invention, permet de visualiser l'activité du protéasome vis-à-vis d'une protéine cible humaine dans des cellules de levure, et plus précisément vis-à-vis d'une protéine cible p21, c'est à dire soit la protéine cible consistant en une protéine de fusion comprenant la protéine p21wAF1/Cip1 humaine fusionnée à une protéine détectable, soit la protéine mutée p21 [6KR]wAF1/Cip1 fusionnées à une protéine détectable. Ce procédé est particulièrement avantageux pour cribler des molécules ou agents aptes à agir sur les pathologies associées à une dégradation excessive ou insuffisante des protéines cellulaires, tels que certains cancers, les syndromes inflammatoires et immuns, les infections fongiques, bactériennes et virales ou certaines maladies du système nerveux central. Les principaux avantages du procédé de criblage de l'invention sont notamment les suivants : - la simplicité de mise en oeuvre: l'activité du protéasome tel qu'il existe dans les cellules est visualisée simplement grâce à l'expression contrôlée du facteur humain sauvage ou mutant p21 WAF1/Cip1 dans les cellules de levure. De plus, lorsque le facteur p21 WAF1/Cip1 est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine à fluorescence intrinsèque, telle que la mAG ou la GFP, l'activité du protéasome vis-à-vis du facteur p21 WAF1/Cip1 ou p2l [6KR]WAF1/Cip1 est directement mesurée par la quantification de la fluorescence émise par la protéine hybride. De même lorsque le facteur p21 WAF1/Cip1 ou du facteur p2l [6KR]WAF1/Cip1 est exprimé en tant que protéine hybride en fusion avec une protéine telle que la luciférase, l'activité du protéasome vis-à-vis du facteur p21 WAF1/Cip1 ou du facteur p21 [6KR]WAF1/Cip1 est directement mesurée par la quantification de la luminescence émise par la protéine hybride en présence d'un substrat comme la fluorescéine. - l'adéquation avec un contexte thérapeutique: l'activité du protéasome est suivie selon un test fonctionnel réalisé dans des cellules entières. Le procédé de criblage in cellulo selon l'invention permet donc de sélectionner des molécules capables d'activer ou d'inhiber l'activité du protéasome dans un contexte semblable à celui de leur usage thérapeutique final. - la spécificité: bien que réalisé in cellulo dans la cellule, le procédé de criblage selon l'invention est spécifique, car il repose sur l'expression, dans un organisme hétérologue à l'organisme humain, de la protéine humaine p21. Les molécules sélectionnées grâce au procédé de criblage de l'invention seront spécifiques de l'activité du protéasome, et ne seront donc pas des molécules sélectionnées en raison, par exemple, de leur capacité à interférer avec l'une des nombreuses voies de signalisation induisant la dégradation du facteur p21WAF1/Cip1 dans les cellules humaines. En effet, lors de la mise en ceuvre du procédé de criblage selon l'invention, la dégradation de p21 WAF1/ciel ou de p21 [6KR]WAF1/ciel par le protéasome est induite par une voie métabolique tout à fait artificielle et totalement reproductible, comme par exemple, l'ajout de glucose pour bloquer l'activité du promoteur GAL1, lorsque p21WAF1/ciel ou p21 [6KR]WAF1/ciel est exprimé sous le contrôle de ce promoteur. - L'emploi de la protéine p21 [6KR] WAF1/ciel dont les 6 résidus lysine de la protéine native p21 WAF1/ciel ont été substitués par des résidus arginine, supprimant les sites internes d'ubiquitination, assure de plus que les molécules sélectionnées selon l'invention n'interfèrent pas avec les autres composant de la voie ubiquitine-protéasome comme les ubiquitine ligases, les enzymes de conjugaison de l'ubiquitine et l'enzyme d'activation de l'ubiquitine. - la stabilité des souches de levure recombinantes: les techniques d'intégration dans un endroit choisi d'un chromosome de levure et de remplacement ciblé de gènes permettent la construction de souches de levures recombinantes exprimant la protéine de fusion contenant soit p21 WAF1/ciel, soit p21 [6KR]WAF1/ciel à partir des chromosomes de la levure. Ces souches de levure recombinantes sont donc génétiquement stables et peuvent être multipliées et conservées indéfiniment. - la rapidité de croissance et de criblage: la levure est un micro-organisme à croissance rapide et rendement élevé. En particulier, le procédé de criblage de l'invention est préférentiellement réalisé en cultivant les cellules de levure dans un milieu de culture complet, dans lequel la croissance des cellules de levure est particulièrement rapide et le rendement particulièrement élevé, ce qui permet l'obtention d'une grande quantité de cellules de levure recombinantes pour la réalisation simultanée d'un nombre important de tests de criblage. - le faible coût: la levure est un microorganisme dont la culture, le stockage et la caractérisation sont peu onéreux, - l'automatisation du procédé de criblage de l'invention: la levure est un microorganisme dont la culture, réalisée dans un faible volume de milieu, à température basse, en atmosphère classique, dans l'air, est tout particulièrement adapté à l'automatisation (robotisation) des procédés de criblage. Les procédés de criblage selon l'invention sont utiles notamment pour sélectionner et caractériser des agents actifs tels que des agents anticancéreux, anti-inflammatoires, anti-viraux, des agents contre des infections fongiques, bactériennes ou des agents contre les maladies du système nerveux central. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente les cartes des plasmides recombinants codant une protéine de fusion p21-protéine détectable. La Figure 1A représente un schéma du plasmide pCSYAQ6-p21 comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion mAG-p21. La Figure 1B représente un schéma du plasmide pCSYAQ6-p21-6KR comprenant une cassette d'expression codant la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]. La Figure 2 représente la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés de la protéine p21 [6KR]WAF1lcip1. La Figure 3 représente des clichés d'immuno-empreintes ( Western Blotting ) illustrant la dégradation des protéines de fusion comprenant p21 WAF1/Cip1 ou p21 [6KR]WAF1/Cip1 fusionnée avec mAG, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé MG132. Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes suivantes : CYS343 (Figure 2A) et CYS344 (Figure 2B). La Figure 4 illustre les résultats d'une analyse au microscope d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WAF1/ciPl dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS344. La Figure 3A illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS344 cultivées en présence de glucose et au temps 0, 60 minutes, 120 minutes et 180 minutes (du haut vers le bas de la figure) après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion. La Figure 3B illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS344 cultivées en présence de glucose et au temps 0, 60 minutes, 120 minutes et 180 minutes (du haut vers le bas de la figure) après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion. La Figure 5 illustre la quantification, par cytométrie de flux des cellules de levure de chacune des souches CYS343 et CYS344, du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132. La Figure 4A illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-p21 WAF1lc1Pl produite par la souche CYS343, en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132. La Figure 4B illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WAF'lc1Pl produite par la souche CYS344, en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132. EXEMPLES EXEMPLES 1 A 3. A. MATERIEL ET METHODES DES EXEMPLES 1 A 3. A.1. Récapitulatif des séquences de polynucléotide utilisées Dans les descriptions qui suivent La séquence de la protéine p21 Waf1/cip1 est celle déposée à la banque de données EMBL, numéro d'accession BC001935.1 La séquence de la protéine p21 [6KR]Waf'laP est celle déposée à la banque de données EMBL, numéro d'accession BC001935.1 dont les 6 résidus 25 Lysine ont été transformés en résidus Arginine. La séquence du gène mAG (monomeric Azami-Green) du corail Galaxeidae codant pour la protéine fluorescente désignée ci-après sous le terme mAG est celle déposée à GenBankTM/EBI Data Bank avec le numéro d'accession AB108447. 30 La séquence du plasmide pRS306 est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur PRS306 , numéro d'accession UO3438. La séquence du promoteur du gène GAL1 de la levure S. cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent est entièrement comprise dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, identificateur SCGALI O , 35 numéro d'accession K02115. La séquence du promoteur du gène GAL1 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Johnston et Davis (Mol. Cell. Biol. (1984) 4 (8) : 1440-1448). La séquence du promoteur du gène MET3 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Cherest et al. (Mol. Gen. Genet. (1987) 210 (2) : 307-313). La séquence du promoteur du gène MET25 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite dans Kerjan et al. (Nucleic Acids Res.(1986) 14(20) : 7861-7871). La séquence du promoteur du gène PHO5 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Feldmann et al. (EMBO J. (1994) 13(24) : 5795-5809). La séquence du promoteur du gène THI4 de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite Skala et al., Yeast (1995) 14:1421-1427. La séquence du promoteur du gène CUPI de la levure S. cerevisiae, susceptible d'être utilisée selon l'invention peut consister en celle décrite par Karin et al. (PNAS (1984) 81(2) : 337-341). A.2. Conventions utilisées Les descriptions sont faites en utilisant la nomenclature et les règles typographiques en usage dans la communauté des biologistes spécialistes de la levure Saccharomyces cerevisiae. - le nom de la forme sauvage d'un gène est donné en majuscule italique ; exemple : GAL 1. - le nom d'une forme mutante d'un gène est donné en minuscule italique, le numéro d'allèle si il est connu est précisé à la suite d'un tiret ; exemple cupl-1. - le nom d'un allèle inactivé d'un gène est donné en minuscule suivi de 2 fois deux points suivi du nom du gène inactivant ex pprl::TRP1 (dans cet exemple le gène inactivé pprl a été interrompu par le gène actif TRP1). Alternativement, le nom d'un gène inactivé peut être donné par le symbole delta ; exemple gal4A35 - le nom de la protéine est celui du gène qui la code est donné en minuscule, excepté la première lettre qui est en majuscule ex Ga14 (alternativement on peut utiliser le même symbole suivi d'un p ; exemple Gal4p). A.3. Remarques préliminaires concernant la construction des plasmides L'ensemble des plasmides a été construit par des techniques de biologie moléculaire classiques selon des protocoles décrits par Sambrook et al. (in Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition, (1989), Cold Spring Harbor, N. Y.) et Ausubel et al., (in Current Protocols in Molecular Biology, (1990-2004), John Wiley and Sons Inc, N.Y.). Le clonage, la propagation et la production d'ADN plasmidiques ont été réalisés dans la souche d'Escherichia coli DH1OB. EXEMPLE 1 : Construction des plasmides permettant l'expression chez la levure des protéines de fusion mAG-p21wAF''cip' et mAG-p21[K6R1wAF'icip' Les plasmides suivants permettent l'expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae de dérivés de la protéine humaine p21wAnIciPi ou de la protéine humaine mutante p21 [6KR]WAF'Ic'p1 fusionnés à la protéine fluorescente mAG du corail Galaxeidae. Un fragment de 614 paires de bases (pb) correspondant au promoteur du gène GAL1 (pGAL1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) pGAL1(Asp)Forw de séquence 5'-GCTGGGTACCTTAATAATCATATTACATGGCATTA-3' [SEQ ID N 10], et (ii) pGAL1(Xho)Rev de séquence 5'-CGACCTCGAGTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3' SEQ ID N 11]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Asp7181 et Xhol et inséré dans le plasmide navette S.cerevisiae-E.coli pRS306 préalablement digéré par les enzymes Asp7181 et Xhol, produisant le vecteur pRS306-pGAL1. Un fragment de 678 paires de bases (pb) correspondant à un variant du gène codant pour la protéine fluorescente monomérique Azami Green (mAG) 35 du corail Galaxeidae, dont la séquence est optimisée pour l'expression en levures, a été obtenu par digestion enzymatique par les enzymes de restriction Xhol et EcoRI à partir du vecteur pPCR-Script-mAG. Le fragment obtenu a été inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1 préalablement digéré par les enzymes Xhol et EcoRl, produisant le vecteur pRS306-pGAL1-mAG. Un fragment de 340 paires de bases (pb) correspondant au terminateur du gène ADH1 (tADH1) de la levure Saccharomyces cerevisiae a été amplifié par Polymérase Chain Reaction (PCR) à partir d'ADN génomique d'une souche sauvage de S.cerevisiae X2180-1A, en utilisant les oligonucléotides suivants : (i) TermADH1(NotlBstXI)5' de séquence 5'-GGCGGCGGCCGCCACCGCGGTGGGCGAATTTCTTATGATTTATG-3' [SEQ ID N 12] et (ii) TermADH1(Sacl)3' de séquence 5'-GGCGGAGCTCTGGAAGAACGATTACAACAG-3' [SEQ ID N 13]. Le fragment obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Sac! et Notl et inséré dans le plasmide pRS306-pGAL1-mAG préalablement digéré par les enzymes Sac! et Notl, produisant le vecteur pCSYAQ6. Le gène codant pour la protéine p21WAF'/C'p' dont la séquence a été optimisée pour l'expression dans en levure, a été purifié à partir du plasmide pPCR-Script-p21 WAF1/Cipl [wt] par digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Notl. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSYAQ6 préparé par une digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Notl. Le vecteur produit a été appelé pCSYAQ6-p21 [wt], dont le schéma est illustré sur la Figure 1A. Le gène codant pour la protéine p2l [6KR]WAF'lc'p', dont la séquence a été optimisée pour l'expression dans en levure, a été purifié à partir du plasmide pPCR-Script-p21 WAF1/Cipl [6KR] par digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Notl. Le fragment a été cloné dans le plasmide pCSYAQ6 préparé par une digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Notl. Le vecteur produit a été appelé pCSYAQ6-p21 [6KR], dont le schéma est illustré sur la Figure I B. Construction des souches de levure CYS343 et CYS344 Pour l'obtention de la souche de levure CYS343, le plasmide pCSYAQ6- p21 [wt]. décrit ci-dessus a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stul . L'enzyme Stul clive le plasmide pCSYAQ6-p211 [wt] à une position unique localisée dans 35 la séquence du gène URA3. Le plasmide pCSYAQ6-p21 [wt] linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour l'obtention de la souche de levure CYS344, le plasmide pCSYAQ6-p21 [6KR] décrit ci-dessus a été linéarisé en utilisant l'enzyme Stul . L'enzyme Stul clive le plasmide pCSYAQ6-p21 [6KR] à une position unique localisée dans la séquence du gène URA3. Le plasmide pCSYAQ6-p21 [6KR] linéarisé s'intègre au locus URA3 situé sur le bras gauche du chromosome 5 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Les souches de levure CYS343 et CYS344 ont été obtenues comme décrit ci-dessus, conformément au protocole général décrit par Rohthstein (1991). Les génotypes respectifs des souches de levure selon l'invention sont indiqués dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Génotype des souches de levure Saccharomyces cerevisiae construites pour les besoins de la présente invention. Souche Génotype CYS262 MATa, his3, leu2, ura3, trpl, pdrl , pdr3 CYS343 Mat-a, his3, leu2, trp1, ura3::pGAL1-mAG-p21(wt]::URA3, pdr1A, pdr3A CYS344 Mat-a, his3, leu2, trp1, ura3::pGAL1-mAG-p21(6KR]::URA3, pdr1A, pdr3A EXEMPLES 2 A 6 : Mise au point du procédé de criblage selon l'invention. EXEMPLE 2: Séquences nucléotidique et protéique de la forme mutante du facteur humain p21[6KR1wAF'Icip' exprimé dans les cellules de levure. La séquence d'acides aminés codant la protéine de fusion comprenant le protéine p21 [6KR]WAF'/c'p' consiste en le polypeptide de séquence SEQ ID N 4 qui peut être codé par le polynucléotide de séquence SEQ ID N 6, dont l'identité des codons a été spécifiquement adapté à une expression optimale dans les cellules de levure. La séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés de la protéine p21 [6KR]WAF'Ic'p1 sont représentées sur la Figure 2. Sur la Figure 2, les 6 résidus lysine (K) qui ont été remplacés par des résidus arginine (R) sont surlignées en noir, ainsi que les codons correspondants. Les codons optimisés pour l'expression du facteur p21 [6KR]WAFllcip1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae sont surlignés en gris. EXEMPLE 3: Dégradation par le protéasome cellulaire des facteurs humains p21 WAF'/C'p' et p21 [6KR1wAF''cip' exprimés dans les cellules de levure (Résultats d'immuno-empreinte) La dégradation, par le protéasome des cellules de levure recombinées des souches CYS343 et CYS344, des protéines de fusion comprenant p21 WAF1'Cip1 ou p21 [6KR]WAFllcip1 fusionnée avec mAG, a été suivie par une technique d'immuno-empreinte, en présence ou en l'absence d'un agent inhibiteur du protéasome, le composé Mg132. A. Matériel et Méthodes Toutes les souches de levure employées ont été cultivées et analysées de manière identique. Les cellules ont été cultivées en milieu minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 pM d'un inhibiteur connu du protéasome, le Mg132. Les résultats sont présentés sur la Figure 3 (Figure 3A et Figure 3B). La Figure 3A présente les résultats obtenus avec la souche de levure 25 recombinante CYS344. Les protéines totales sont préparées avant l'ajout de galactose (0), 60 et 120 minutes après l'ajout de galactose (+ galactose 0, 60, 120) et 30, 60 et 120 minutes (+ glucose, 30, 60, 120) après l'ajout de glucose. La Figure 3B présente les résultats obtenus avec la souche de levure 30 recombinante CYS343. Les protéines totales sont préparées avant l'ajout de galactose (0), 60 et 120 minutes après l'ajout de galactose (+ galactose 0, 60, 120) et 30, 60, 120 et 150 minutes (+ glucose, 30, 60, 120, 150) après l'ajout de glucose. Ces protéines sont analysées par la technique d'immuno-empreinte 35 ( Western blotting ) en employant un anticorps reconnaissant la partie p21wAF'ic'p' des protéines de fusion (indiquée mAG- p21WAF'ic~p' ou mAG-p21 [6KR]wAF'ic'p' sur la Figure 3). La présence de MG132 dans la culture est indiquée + MG132 sur la Figure 3. Un contrôle de la quantité de protéines déposée dans chaque puits est réalisé en analysant les mêmes protéines à l'aide d'anticorps reconnaissant la Lysyl-ARNt-synthase de levure (indiquée LysRS sur la Figure 3). Clichés de gels d'immuno-empreinte ( Western blotting ) révélés avec des anticorps anti-p21 et des anticorps anti-Lys. B. Résultats Les résultats sont illustrés pour les souches de levure recombinantes suivantes : CYS343 (Figure 3A) et CYS344 (Figure 3B). Les résultats présentés sur la Figure 3A illustre par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]wAF'icp' dans laquelle les 6 résidus Lysine du facteur p21wAF''c'p' ont été remplacés par des résidus Arginine. Les résultats présentés sur la Figure 3B illustre, par une analyse biochimique de type Western blotting, la dégradation de la protéine de fusion mAG-p21 [wt] wAFl iPl dans des cellules de levure. Sur la Figure 3A et la Figure 3B, on observe que la présence de galactose (indiquée + Galactose sur la Figure 3) durant la totalité du temps de culture provoque une induction continue de la production de la protéine de fusion comprenant p21 [6KR]wAF'icP1 (Figure 3A) ou comprenant p21 [wt]wAF'icp' (Figure 3B), qui pallie la dégradation des protéines de fusion par le protéasome qui a simultanément lieu dans les cellules de levure. Sur la Figure 3A et la Figure 3B, on observe que la culture des cellules en présence de glucose (indiquée + Glucose sur la Figure 3), du fait que la production de la protéine de fusion n'est plus induite, permet de visualiser la dégradation de la protéine de fusion par le protéasome. Sur la Figure 3A et la Figure 3B, on observe que la culture des cellules en présence de glucose et d'un inhibiteur du protéasome, le composé MG132 (indiquée + Glucose + 50 pM MG132 sur la Figure 3) permet d'inhiber la dégradation de la protéine de fusion qui est observée en l'absence du composé MG132.35 EXEMPLE 4 : Dégradation de la protéine mAG- p21 [6KRlwAFllcipI (microscopie d'épifluorescence) L'exemple 4 illustre les résultats d'une analyse au microscope d'épifluorescence, de la dégradation de la protéine de fusion mAG- p21 [6KR]WA"lc'Pl dans des cellules de levure de la souche recombinante CYS344. A. Matériel et Méthodes Les cellules de levure de la souche CYS344 ont été cultivées en milieu 10 minimum en présence de galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 pM d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132. 15 Les cellules sont observées au microscope à épifluorescence (microscope à fluorescence Nikon Eclipse équipé d'un filtre Omega XF116). Toutes les images ont été enregistrées en employant une caméra Hamamastu en employant des réglages identiques et analysées avec le logiciel LUCIA G, juste avant l'ajout de glucose (0 minutes), et 60, 120 et 180 20 minutes (60, 120, 180 minutes ) après l'ajout de glucose. La présence de MG132 dans la culture est indiquée + MG132 . B. Résultats Les résultats sont représentés sur la Figure 4 (Figure 4A et Figure 4B). 25 La Figure 4A illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS344 cultivées en présence de glucose et au temps 0, 60 minutes, 120 minutes et 180 minutes (du haut vers le bas de la figure) après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion. La Figure 4B illustre les résultats d'épifluorescence obtenus avec les cellules de la souche CYS344 30 cultivées en présence de glucose et au temps 0, 60 minutes, 120 minutes et 180 minutes (du haut vers le bas de la figure) après l'arrêt de l'induction de l'expression de la protéine de fusion. Sur la Figure 4A et la Figure 4B, la colonne de gauche représente les clichés de microscopie à fluorescence permettant de localiser dans les cellules 35 l'expression de la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WA"icpl . Sur la Figure 4A et la Figure 4B, la colonne de droite représente une visualisation des mêmes cellules, en lumière visible. Sur la Figure 4A, on observe une réduction progressive du signal de fluorescence avec la durée de culture, au fur et à mesure de la progression de la dégradation de la protéine de fusion par le protéasome (colonne de gauche), alors que la densité cellulaire dans le champ observé est identique (colonne de droite). Sur la Figure 4B, on observe un maintien de l'intensité du signal de fluorescence avec la durée de culture (colonne de gauche), alors que la densité cellulaire dans le champ observé est identique (colonne de droite), ce qui illustre le blocage de l'activité de dégradation de la protéine de fusion par le protéasome, blocage qui est induit par l'inhibiteur MG132. EXEMPLE 5 : Déqradation de la protéine mAG-p21 [6KR1wAFllcipI (quantification par cytomètrie de flux) L'exemple 5 illustre un quantification, par cytométrie de flux des cellules de levure de chacune des souches CYS343 et CYS344, du signal de fluorescence émis par ces cellules, au cours du temps de culture, respectivement (i) pendant l'induction de la production de la protéine de fusion en présence de galactose et (ii) en présence de glucose après arrêt de la production de la protéine de fusion. Les cellules de levure ont été cultivées en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de protéasome MG132. Les résultats sont illustrés par les courbes présentées sur la Figure 5. La Figure 5A illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-p21 WAF1Ici 1 produite par la souche CYS343, en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132. La Figure 5B illustre une quantification en cytométrie de flux (FACS) de la fluorescence émise par la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WAF'Ic'P1 produite par la souche CYS344, en présence et en absence de l'inhibiteur du protéasome MG132. A. Matériel et Méthodes Toutes les cellules ont été cultivées en milieuminimum en présence de 35 galactose comme source de carbone pendant 120 minutes. A l'issue de ces 120 minutes, du glucose 2 % est ajouté à la culture, en présence et en absence de 50 pM d'un inhibiteur connu du protéasome, le MG132. La fluorescence émise par les cellules a été quantifiée en employant un cytomètre flux FacsCalibur (Beckton-Dickinson), juste avant l'ajout de galactose (10), 1 et 2 heures après l'ajout de galactose (I1 et 12) et 1, 2 et 3 heures (Dl, D2 et D3) après l'ajout de glucose. La présence de Mg132 dans la culture est indiquée + MG132 . La fluorescence est rapportée en unités arbitraires B. Résultats Les résultats des Figures 5A et 5B montrent que la protéine de fusion est activement produite par les souches de levure CYS343 et CYS344, lorsque les cellules sont cultivées en présence de galactose (temps Io, I1 h, 12h/D0). Les résultats des Figures 5A et 5B montrent que la protéine de fusion, qui s'est accumulée dans les cellules en présence de galactose, est progressivement dégradée au cours du temps de culture en l'absence de galactose et en présence de glucose, en l'absence du composé MG132 (Temps D1 h, D2h, D3h). Les résultats des Figures 5A et 5B montrent que, en présence de l'inhibiteur du protéasome MG132, la dégradation de la protéine de fusion est fortement inhibée (Temps D1 h, D2h, D3h). EXEMPLE 6 : localisation, dans les cellules de levure des protéines de fusions mAG-p21 [6KR1wAF'icip' Dans l'exemple 6, on a déterminé la localisation, dans les cellules de levure de la souche CYS344, de la protéine mAG-p21 [6KR]WAF'icip'. Des cellules de levures de la souche CYS344 comprenant un polynucléotide permettant l'expression de la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WAF'Ic1Pl sous le contrôle du promoteur GAL1 ont été cultivées en présence de galactose 2 % pendant 2 heures et ont été ensuite observées en microscopie à fluorescence. La position du noyau a été révélée en employant un indicateur coloré spécifique du noyau, le Hoescht 333-42. On a réalisé des clichés de microscopie en lumière visible et des clichés de microscopie à fluorescence permettant de colorer l'ADN des noyaux cellulaires avec le colorant Hoechst 333-42 (clichés non représentés). On a superposé les clichés de microscopie en lumière visible et les clichés de microscopie à fluorescence (non représenté). On a observé une co-localisation des noyaux cellulaires et de la protéine de fusion mAG-p21 [6KR]WAF'icip'. REFERENCES Adams (Nature Reviews Cancer (2004) 4 :349-360) Adams et Anderson (Cancer Res. (2001) 61 :3071-3076) Ausubel et al. 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Procédé in cellulo pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un agent candidat à tester avec des cellules de levure recombinantes qui expriment dans leur noyau une protéine de fusion comprenant : (i) un polypeptide p21 choisi parmi le polypeptide p21 WAF'~C'p' et le polypeptide p21 [6KR]WAF'lc'p' ;et (ii) au moins une protéine détectable. b) quantifier ladite première protéine détectable dans les cellules de levure, à la fin d'au moins une période de temps prédéterminée après la mise en contact de l'agent candidat avec lesdites cellules ; c) comparer la valeur obtenue à l'étape (b) avec une valeur témoin obtenue lorsque l'étape (a) est réalisée en l'absence de l'agent candidat. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend les étapes suivantes : (a1) cultiver les cellules de levure qui expriment dans leur noyau ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 et au moins une protéine 20 détectable ; (a2) stopper l'expression de ladite protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 et au moins une protéine détectable par les cellules de levure ; (a3) mettre en contact les cellules de levures obtenues à la fin de l'étape (a2) 25 avec l'agent candidat à tester. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la protéine détectable comprise dans la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 est choisie parmi un antigène, une protéine fluorescente et une 30 protéine ayant une activité enzymatique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine fluorescente choisie parmi la protéine mAG ou l'un de ses dérivés, et la protéine GFP ou l'un de ses dérivés. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi la luciferase et la R-lactamase. 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine détectable consiste en un antigène choisi parmi le peptide Ha et le peptide Flag. 10 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la protéine comprenant le polypeptide p21 WAF1/C'p1 consiste en la protéine de séquence SEQ ID N 3. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la 15 protéine comprenant le polypeptide p21 [6KR]WAF'lc1P consiste en la protéine de séquence SEQ ID N 4. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est un antigène, on quantifie ladite 20 première protéine détectable par détection des complexes formés entre ladite protéine et des anticorps la reconnaissant. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine fluorescente, on 25 quantifie ladite protéine détectable par une mesure du signal de fluorescence émis par ladite protéine. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), lorsque la première protéine détectable est une protéine ayant une activité 30 enzymatique, on quantifie ladite protéine détectable par une mesure de la quantité de substrat transformé par ladite protéine.5 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les cellules de levures recombinantes sont transformées avec un polynucléotide qui comprend : (a) un cadre de lecture ouvert codant (i) la protéine de fusion comprenant le polypeptide p21 (p21 WAF'/C'p' ou p21 [6KR]WAF'lCip1) et (ii) une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert; 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence régulatrice contenue dans le premier polynucléotide comprenne un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce le promoteur sensible à l'action d'un agent inducteur consiste en un promoteur répressible fonctionnel dans les cellules de levure choisi parmi CUP1, GAL1, GAL10, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisae. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit polynucléotide codant la protéine de fusion comprend la séquence régulatrice GAL 1, qui active l'expression du cadre de lecture ouvert codant ladite protéine de fusion. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent le polynucléotide sous une forme insérée dans leur génome. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les cellules de levure recombinantes possèdent dans leur génome une forme inactivée d'un ou plusieurs gènes contrôlant l'expression de protéines transporteurs insérées dans la membrane plasmique. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le ou les gènes inactivés sont choisis parmi les gènes PDR1 et PDR3. 19. Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules de levure comprenant un polynucléotide codant qui comprend un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide p21 et au moins une protéine détectable, et une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. 20. Cassette d'expression fonctionnelle selon la revendication 19, caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21 WAF'/c'p' et le polypeptide p2l [6KR]WAFIicp'. 21. Cassette d'expression fonctionnelle selon la revendication 20, caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21 WAFI/c'p1 de séquence SEQ ID N 1 et le polypeptide p21 [6KR]WAFIicp' de séquence SEQ ID N 2. 22. Cassette d'expression selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que la séquence régulatrice contenue dans ledit polynucléotide comprend un promoteur fonctionnel dans les cellules de levure et qui est sensible à l'action d'un agent inducteur. 23. Cassette d'expression selon la revendication 22, caractérisée en ce le promoteur inductible fonctionnel dans les cellules de levure est choisi parmi CUP1, GAL1, GAL 10, MET3, MET25, PHO5, et THI4 de la levure Saccharomyces cerevisi . 24. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 19 à 23. 25. Vecteur d'expression selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pCSYAQ6-p21 [wt]. 26. Vecteur d'expression selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pCSYAQ6-p21 [6KR].35 27. Souche de levure recombinante comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un polynucléotide qui comprend (a) un cadre de lecture ouvert codant la protéine de fusion comprenant un polypeptide p21 et au moins une protéine détectable, et (b) une séquence régulatrice fonctionnelle dans des cellules de levure qui dirige l'expression dudit cadre de lecture ouvert. 28. Souche de levure recombinante selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21 WAF1/c'p1 et le polypeptide p21 [6KR]WAF'/cp' 29. Souche de levure recombinante selon la revendication 28, caractérisée en ce que le polypeptide p21 est choisi parmi le polypeptide p21 WAF'/c'p' de séquence SEQ ID N 1 et le polypeptide p21 [6KR] WAF'/c'p' de séquence SEQ ID N 2. 30. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 19 à 23. 20 31. Trousse ou kit pour le criblage d'agents modulant l'activité du protéasome, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de levures recombinantes comprenant, sous une forme insérée dans leur génome une cassette d'expression selon l'une des revendications 19 à 23. 15