Brevet FR2893952A1 — publié le 20070601

L'invention concerne un procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion, appelée PrP, d'ovin ainsi que des trousses de mise en oeuvre de ce procédé. Elle concerne également un procédé de sélection d'un ovin pour la reproduction, en fonction de sa résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST). La tremblante est une maladie qui affecte les ovins, connue depuis plus de deux siècles en Europe. Elle se manifeste notamment par des troubles du comportement social de l'animal qui a tendance à se mettre à io l'écart, des troubles de son comportement alimentaire et des troubles locomoteurs tels que l'apparition de tremblements et une raideur de l'arrière train. Elle se manifeste en outre généralement par un prurit et une perte de la laine. Des travaux portant sur la transmission expérimentale de la 15 tremblante du mouton ont débuté en 1938 sur des moutons britanniques et ont contribué de façon très importante à montrer l'implication de facteurs génétiques dans la transmission de la maladie. La nature exacte de l'agent de la tremblante comme des autres encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) n'est pas 20 encore définitivement établie mais fait aujourd'hui l'objet d'un quasi consensus scientifique établi sur de nombreuses preuves expérimentales. L'agent transmissible responsable de ces maladies serait une protéine de l'hôte, la PrP (protéine prion), sous une forme anormale, partiellement résistante à la digestion protéolytique, appelée communément PrPres pour 25 "protéine prion résistante". Le pouvoir infectieux associé à ces protéines prions anormales s'est révélé extrêmement résistant aux procédés d'inactivation connus et mis en oeuvre pour inactiver les microorganismes pathogènes "conventionnels" (bactéries, virus, levures). Le gène de la PrP ovine est porté par le chromosome 13 et code un 30 polypeptide de 256 acides aminés. Il est connu depuis longtemps que l'incidence de la tremblante naturelle chez les ovins est liée au polymorphisme du gène de la PrP et en particulier aux polymorphismes des codons 136, 154 et 171 de cette protéine. Selon le NSP britannique (National Scrapie Plan), la majorité de la population de moutons possède l'un des quinze génotypes, dont la liste suit, aux codons 136, 154 et 171: - A136R154R171/A136R154R171, noté ARR/ARR - A136R154R171/A136H154Q171, noté ARR/AHQ -A136R154R171/A136R154H171, noté ARR/ARH - A136R154R171/A136R154Q171, noté ARR/ARQ - A136H154Q171/A136H154Q171, noté AHQ/AHQ -A136H154Q171/A136R154H171, noté AHQ/ARH - A136H154Q171/A136R154Q171, noté AHQ/ARQ - A136R154H171/A136R154H171, noté ARH/ARH -A136R154H171/A136R154Q171, noté ARH/ARQ - A136R154Q171/A136R154Q171, noté ARQ/ARQ - A136R154R171/V136R154Q171, noté ARR/VRQ -A136H154Q171/V136R154Q171, noté AHQ/VRQ - A136R154H171/V136R154Q171, noté ARH/VRQ - A136R154Q171/V136R154Q171, noté ARQ/VRQ -V136R154Q171/V136R154Q171, note VRQ/VRQ. De façon simplifiée les moutons peuvent être classés en 3 groupes en fonction de leur génotype et de leur résistance aux ESSTs.: - les animaux résistants qui ne sont pas (ou extrêmement rarement) infectés, même lorsqu'ils sont placés dans un environnement présentant une incidence élevée de la maladie ou qui présentent une résistance très élevée dans le cadre d'infections expérimentales. Il s'agit des animaux de génotypes ARR/ARR. Notons toutefois, que la découverte récente de cas atypiques de tremblante affectant aussi le génotype ARR/ARR a partiellement remis en cause la résistance quasi absolue qui était couramment associée à ce génotype. les animaux très sensibles manifestant la maladie à un taux élevé d'incidence et des périodes d'incubation courtes. Il s'agit des animaux ayant les génotypes VRQ/VRQ (le génotype réputé le plus sensible), ARQ/VRQ et ARQ/ARQ, et - les animaux qui peuvent manifester la maladie avec une incidence variable et après une longue période d'incubation. Il s'agit des animaux 35 ayant les autres génotypes. Depuis longtemps, les programmes de lutte contre la tremblante du mouton sont basés sur l'abattage total des troupeaux infectés. Mais on constate que les animaux réintroduits sont généralement réinfectés. Cette situation est probablement liée à la forte persistance de l'agent contagieux dans l'environnement des animaux d'élevage et à sa résistance aux techniques de décontamination. Aux USA, des campagnes d'éradication ont été mises en oeuvre depuis 1952, et d'un point de vue global, n'ont pas été couronnées de succès. Seule la politique de l'Islande semble donner de bons résultats dans ce domaine. Mais elle est très coûteuse et io contraignante. En effet, elle repose en particulier sur la division du territoire en zones affectées et zones saines, sur l'abattage total des troupeaux infectés avec la destruction de l'ensemble de l'équipement utilisé pour l'élevage, sur l'élimination du sol autour de la zone d'élevage et sur l'interdiction de réintroduire des animaux sur ladite zone pendant 15 cinq ans. Bien entendu, les animaux utilisés pour repeupler les zones "assainies" proviennent de zones non affectées. La sélection des animaux homozygotes portant l'allèle A136R154R171, même si elle ne peut pas être considérée comme la solution absolue pour éradiquer les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) dans le 20 troupeau ovin, demeure toutefois une stratégie très appropriée pour un contrôle de la propagation de la plupart des souches d'EST y compris de l'agent l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et présente un intérêt économique évident. La Grande-Bretagne, la France et les Pays-Bas ont par exemple 25 déjà commencé la mise en oeuvre de programmes d'enrichissement de la population en animaux résistants dans le but de lutter contre la tremblante. Le programme français comprend ainsi notamment l'élimination des animaux porteurs de l'allèle V136R154Q171 associé à une sensibilité 30 maximale. Sa fréquence élevée au sein de la population représente un facteur de risque important de propagation de la maladie. En conséquence, un mouton portant cet allèle est considéré comme un animal "non agréé". En tant que tel, il ne peut être commercialisé à des fins de reproduction. La mention "génotype sensible à la tremblante" est indiquée sur le certificat délivré par l'UPRA (Union Pour la Promotion des Races Animales) ou par tout autre organisme similaire. Un tel objectif nécessite d'identifier le génotype de la PrP des moutons. Un certain nombre de méthodes basées sur la biologie moléculaire ont déjà été proposées dans ce but. On citera ainsi plusieurs méthodes utilisant la PCR, une méthode dite de pyroséquençage et une méthode permettant une simple détermination colorimétrique après une unique amplification du gène de la PrP par PCR. Cependant ces méthodes qui impliquent toutes une amplification io par PCR, requièrent une mise en oeuvre par des laboratoires spécialisés et sont très coûteuses, ce qui constitue un réel obstacle à leur utilisation à grande échelle. On l'a vu, le génotype A136R154R171/ A136R154R171 est le génotype que l'on souhaite sélectionner chez l'animal destiné à la reproduction. 15 C'est le seul génotype, parmi les quinze génotypes connus, qui a deux acides aminés R aux positions 171 de la PrP. Ce génotype est noté R/R. Or, on a maintenant découvert qu'il était possible d'identifier l'acide aminé présent à la position 171 de la PrP d'ovin grâce à l'utilisation d'au 20 moins un anticorps qui reconnaît spécifiquement certaines formes alléliques de la PrP. Cette méthode peut être mise en oeuvre sur un fluide biologique du mouton tel que le plasma, le sang, le sérum, le lait, la salive, et l'urine. De plus, cette méthode est facile à mettre en oeuvre, rapide et 25 économique. A cet effet, l'invention propose un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin comprenant les étapes de : a) traitement d'un échantillon de fluide biologique ovin à tester contenant de la PrP avec une solution dénaturante et réductrice, 30 b) immobilisation, éventuellement par l'intermédiaire d'un ligand, de la PrP dénaturée et réduite sur une phase solide, c) mise en contact de la PrP dénaturée, réduite et immobilisée avec au moins un anticorps de détection, et d) détection de la présence éventuelle dudit au moins un anticorps 35 de détection, et dans lequel l'un du ligand et du au moins un anticorps de détection se lie spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171 De préférence la solution dénaturante et réductrice comprend : a) au moins un agent dénaturant choisi parmi : - un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par : • les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le io glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le laurylsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium ; • les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16 15 (hexadécyl-sulfobétaïne), SB 3-18 (octadécyl-sulfobétaïne), CHAPS et CHAPSO et désoxy CHAPS ; • les tensio-actifs non ioniques, tels que le Triton X-100, le Triton X-114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le n-dodécyl-béta-D- 20 glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-alpha-D- glucopyranoside ; • leurs mélanges, et/ou - un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur. 25 L'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine, le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges. Plus préférablement, la solution dénaturante et réductrice comprend un mélange d'agents tensio-actifs ioniques, en particulier 30 d'agents tensio-actifs anioniques, et plus particulièrement de SDS et de sarcosyl. Plus précisément, la solution dénaturante et réductrice contient au moins 0,5 % en poids d'agent tensio-actif par rapport au volume total du mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice, et en particulier supérieure ou égale à 2 % en poids par rapport au volume total du mélange. Préférablement, le au moins un agent réducteur est choisi dans le groupe constitué par constitué par le DTT (dithiothréitol), le TCEP (hydrochlorure de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le Béta mercaptoéthanol, la 2-mercaptoéthylamine ou un de leurs mélanges. Dans ce cas, de préférence, la concentration en agent réducteur est comprise entre 2,5 mM et 100 mM et plus particulièrement comprise entre io 5 mM et 20 mM dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice. Le plus préférablement, la solution dénaturante et réductrice comprend un mélange de sarcosyl, de SDS et de DTT. Quant à la concentration en agent chaotrope, elle est de préférence 15 supérieure ou égale à 1 M, de préférence supérieure ou égale à 3 M. Lorsque l'agent chaotrope est de l'urée, elle est de préférence égale à 8 M. Dans un premier mode de mise en oeuvre du procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin de l'invention, 20 la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture capable de retenir la PrP par liaison affine et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171, cette position étant différente du site épitopique reconnu par l'anticorps de capture. 25 Dans un second mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171 et l'anticorps de détection est un anticorps capable de se lier à la PrP par liaison affine à un site 30 épitopique différent de celui reconnu par l'anticorps de capture. Dans un troisième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand choisi parmi les molécules suivantes : le plasminogène, l'avidine, la streptavidine, les glycose aminoglycans, l'hespéridine, les 35 porphyrines, la streptamicine et la tetracycline, et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. Dans un quatrième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, la PrP dénaturée et réduite est immobilisée directement sur la phase solide, et l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. Dans tous les modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention, de préférence, la phase solide est choisie parmi des plaques de io microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, notamment en polystyrène, polyéthylène ou latex. De préférence la phase solide est une plaque de microtitrage en polystyrène. Egalement, dans tous les modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention, de préférence, l'échantillon de fluide biologique est choisi 15 parmi du sang, du plasma, du sérum, ou du lait. Dans le premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, de préférence, l'anticorps de capture est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5. Dans ce cas, l'anticorps de détection est de préférence choisi parmi 20 l'anticorps 2A11 marqué, l'anticorps 1106 marqué, l'anticorps BAR226 marqué et l'anticorps 12F10 marqué. Mais, de préférence, dans le premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2A11 marqué. 25 Dans le second mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anticorps de capture peut être choisi parmi les anticorps 2A11, 12F10, BAR226, 1106 et en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 marqués. 30 L'invention propose également un procédé de sélection d'un ovin pour la reproduction, en fonction de sa résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre du procédé précédemment décrit. L'invention propose encore une trousse d'identification de génotype 35 en position 171 de la PrP d'ovin comprenant : - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, -une solution dénaturante et réductrice, et - au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106, 2A11 marqués et plus particulièrement le 2A11 marqué. L'invention propose également une trousse d'identification de génotype en position 171 de la PrP d'ovin, caractérisé en ce qu'il 10 comprend : - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106 - une solution dénaturante et réductrice, et - au moins un anticorps de détection choisi parmi les anticorps SAF-15, 15 SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 marqués. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description explicative qui suit et qui est faite en référence aux figures dans lesquelles : 20 -la figure 1 illustre les absorbances relatives, normalisées par rapport au génotype Q/Q, obtenues sur des plasmas de moutons ARR/ARR, c'est-àdire ayant le génotype R/R en position 171 de la PrP, ou ARR/VRQ, c'est-à-dire ayant le génotype R/Q en position 171 de la PrP, ou VRQ/VRQ, c'est-à-dire ayant le génotype Q/Q en position 171 de la PrP. 25 Ces tests, de format ELISA sandwich, sont réalisés après dénaturation et réduction du plasma comme décrit à l'exemple 1. Tous les sandwichs impliquent l'anticorps SAF-34 (anti octa repeat) qui reconnaît indifféremment tous les allotypes en position 171. Selon les cas, l'anticorps SAF-34 est utilisé en tant qu'anticorps de capture (SAF-34) ou en tant 30 qu'anticorps de détection (SAF-34-AChE) ; - la figure 2 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 de la PrP, les acides aminés R/R, ou R/H, ou R/Q, ou H/Q et Q/Q. Ces tests ont été réalisés en utilisant l'anticorps SAF-34 comme anticorps de capture et l'anticorps de 35 détection 2A11 marqué biotine comme anticorps de détection. - la figure 3 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 les acides aminés Q/Q, ou les acides aminés R/Q, ou les acides aminés R/R. Ces tests ont été réalisés en utilisant comme anticorps de capture l'anticorps SAF-34 et comme anticorps de détection l'anticorps 2A11 marqué AChE, - la figure 4 illustre l'influence de la présence ou l'absence d'un agent réducteur qui est le dithiothréitol ainsi que de l'absence d'un agent dénaturant qui est l'urée, dans la composition de la solution dénaturante. Ces tests ont été réalisés en utilisant en tant qu'anticorps de détection io l'anticorps 2A11 marqué biotine et en tant qu'anticorps de capture l'anticorps SAF-34. L'invention a pour objet un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin, dans lequel on traite un fluide biologique ovin à tester, contenant de la PrP, avec une solution dénaturante et 15 réductrice, on immobilise la PrP dénaturée et réduite et on met en contact la PrP dénaturée et réduite avec ou moins un anticorps se liant spécifiquement à la PrP d'ovin ayant une forme allélique particulière en position 171 et on détecte la présence éventuelle de l'anticorps à la PrP. Dans le contexte de l'invention, un 'fluide biologique" peut être 20 notamment du sang, du plasma, du sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, de la salive, du lait etc... Selon un mode de réalisation préféré, ce fluide biologique est choisi parmi du sang, du sérum, du plasma et du lait. Ce fluide biologique contient de la PrP. 25 Le terme 'anticorps" se réfère à tout anticorps entier ou à un fragment fonctionnel d'un anticorps comprenant ou consistant en au moins un site de combinaison antigénique, permettant au dit anticorps de se lier à au moins un déterminant antigénique d'un composé antigénique. A titre d'exemple de fragments d'anticorps on peut citer les fragments 30 Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment), etc... Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique. La production d'anticorps monoclonaux ou de sérums polyclonaux monospécifiques utiles dans le cadre de l'invention relève de techniques 35 conventionnelles, qui sont détaillées plus loin. Le terme 'spécifiquement, quand il se réfère à une reconnaissance spécifique de, ou à une liaison spécifique à, une forme allélique particulière en position 171 de la PrP d'ovin par un anticorps, signifie que l'anticorps interagit avec la forme allélique particulière de manière préférentielle par rapport aux autres formes alléliques possibles, permettant de différencier et discriminer les différentes formes alléliques possibles entre elles. Des constantes d'association supérieures à 108 L.mol-1 sont préférables. Les anticorps utilisés dans la présente invention sont des anticorps io spécifiquement dirigés contre la protéine prion , et, pour cette raison, sont des anticorps préférentiellement monoclonaux ou des anticorps polyclonaux monospécifiques, c'est à dire qu'ils ne reconnaissent pas d'autre protéine. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode 15 classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par Kdhler et Milstein, (1975). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues (Harlow et al. (1988)). Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés en immunisant un mammifère (par exemple une souris, un rat, un lapin, voire un être 20 humain, etc...) et en utilisant la technique de fusion lymphocytaire conduisant à des hybridomes (Kôhler et Milstein, 1975). Des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique cloné à partir d'un hybridome. On peut également 25 produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux (par exemple, fUSE5 pour E. co/i, Scott et al. (1990)). Ces derniers constituent des banques et présentent des fragments scFv à leur surface. Des protocoles de 30 construction de ces banques d'anticorps sont décrits dans Marks et al. (1991). Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un antigène de nature peptidique selon les modes opératoires usuels. D'une manière générale, on peut utiliser, par exemple, comme immunogène, un polypeptide, en particulier recombiné, ou un oligopeptide. Selon un protocole classique, des lapins sont immunisés avec l'équivalent de lmg de l'immunogène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, on évalue la capacité de l'anti-sérum à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T. On le purifie ensuite par chromatographie io sur colonne échangeuse d'ions constituée de carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps recueillies par élution sont ensuite ajustées à la concentration souhaitée par des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, en utilisant du DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG. 15 Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité (ou d'immunoadsorption) en utilisant des peptides à titre ayant servi à l'immunisation et immobilisés en phase solide. L'antisérum est mis en contact avec un tel peptide immobilisé en phase solide pendant une 20 durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le peptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide. Comme anticorps approprié se liant spécifiquement à une forme allélique particulière en position 171 de la PrP, on citera les anticorps 25 2A11, 1106, BAR226, 12F10, V5 et V61. Cependant, on préférera utiliser comme anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme particulière en position 171, l'anticorps 2A11, l'anticorps 1106, l'anticorps BAR226 ou l'anticorps 12F10. On préférera, plus particulièrement, utiliser l'anticorps 2A11. Cet 30 anticorps a été produit selon le protocole décrit dans J. Brun et ai; Neuroscience Research 48, 2004, 75-83, en immunisant des souris Prpoio avec de la PrP recombinante bovine. Cet anticorps se lie à la séquence 171-179 (QVYYRPVDQ) de la PrP bovine et présente de fortes réactions croisées avec la PrP de la plupart des espèces mammifères qui partagent 35 le même épitope (mouton, chèvre, chat, lapin, souris, cochon et hamster) mais pas avec la PrP humaine qui présente la séquence (QVYYRPMDE). Il a également été montré que son affinité était fortement augmentée lorsque la PrP est réduite et dénaturée, très probablement en raison de la proximité de l'épitope avec le premier résidu de sérine impliqué dans un pont disulfure de la PrP. En outre, une analyse par immunohistochimie montre que l'immunoréactivité est grandement augmentée après un traitement à la protéinase K. Il a été en outre montré que l'anticorps 2A11 se lie spécifiquement aux formes alléliques de la PrP de mouton portant un résidu de glutamine io (Q) ou d'histidine (H) en position 171 alors qu'aucune immunoréactivité n'est observée avec l'allèle ARR. Autrement dit, l'anticorps de 2A11 ne se lie pas au résidu R. Donc une absence de liaison entre l'anticorps 2A11, utilisé aussi bien comme anticorps de détection que comme anticorps de capture, et la protéine 15 PrP, absence de liaison qui se traduit par une densité optique nulle ou proche de nulle, dans le procédé d'identification de l'invention, prouve que le génotype en position 171 de la PrP contenue dans le fluide biologique étudié est le génotype R/R, c'est-à-dire le génotype A136R154R171/ A136R154R171 20 Comme de plus l'anticorps 2A11 se lie de façon quantitativement différente et préférentielle au résidu Q en position 171 de la PrP, par rapport au résidu H, si une liaison entre l'anticorps 2A11 et la protéine PrP est détectée, il sera possible de discriminer, selon l'intensité du signal obtenu (qui se traduit par la DO), entre un fluide biologique provenant 25 d'un mouton homozygote Q/Q et un fluide biologique provenant d'un mouton hétérozygote Q/H, ou homozygote H/H. De la même façon les animaux hétérozygotes porteurs d'un seul allèle R en position 171 (R/Q ou R/H) produiront un signal encore plus faible puisque la moitié de la PrP contenue dans l'échantillon n'est pas 30 reconnue par l'anticorps 2A11. C'est donc bien l'existence d'une éventuelle liaison entre la PrP de l'échantillon et l'anticorps spécifique qui est détectée dans le procédé d'identification de l'invention. Il a ainsi été possible de concevoir un simple test de type 35 immunologique permettant de mettre en évidence une claire différence entre les animaux sur la base du génotype exprimé. Selon un premier mode de réalisation, ce test permet d'identifier les animaux ARR/ARR. Selon un second mode de réalisation, ce test permet d'identifier les animaux hétérozygotes (R/(Q,H)) par rapport aux autres génotypes (Q/Q, Q/H, H/H). Le procédé de l'invention comprend la mise en contact de l'échantillon de fluide biologique avec une quantité appropriée d'une solution dénaturante et réductrice. Avantageusement, ladite solution comprend: io a) au moins un agent dénaturant choisi parmi : - un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par : • les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de 15 sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le laurylsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium; • les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), SB 3-18 (octadécyl-sulfobétaïne), CHAPS et 20 CHAPSO et désoxy CHAPS; • les tensio-actifs non-ioniques, tels que le Triton X-100, le Triton X-114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le ndodécyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n- 25 octyl-alpha -D-glucopyranoside ; • les mélanges de ces tensio-actifs, et/ou - un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur. Parmi les agents réducteurs pouvant être utilisés dans la présente 30 invention, on peut citer notamment le DTT (dithiothréitol), le TCEP (hydrochlorure de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le Béta mercaptoéthanol, la 2ùmercaptoéthylamine ou un mélange de ceux-ci.L'agent réducteur est généralement présent dans le mélange 35 constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice à une teneur allant de 2,5 mM à 100 mM et plus particulièrement à une teneur allant de 5 mM à 20 mM. L'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine, le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges. Les agents chaotropes sont présents à une concentration supérieure ou égale à 1 M, de préférence supérieure ou égale à 3 M. L'agent chaotrope préféré est l'urée à une concentration égale à 8 M. io Le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice est généralement chauffé à une température allant de 37 C à 100 C, en particulier de 50 C à 70 C et plus particulièrement à 60 C environ, pendant 5 minutes à une heure, en particulier entre 7 et 20 minutes et plus particulièrement environ 15 10 minutes. Ces conditions sont sélectionnées afin de répondre à des exigences contradictoires qui sont d'altérer suffisamment la PrP pour que l'épitope formé par l'acide aminé en position 171 soit démasqué mais de ne pas altérer trop la PrP pour que l'épitope puisse encore être reconnu par 20 l'anticorps. De plus ce traitement ne doit pas affecter la fixation ultérieure de l'anticorps. Selon un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend un mélange d'agents tensio-actifs, notamment un mélange d'agents tensio-actifs ioniques, en particulier un mélange d'agents tensio-actifs 25 anioniques et plus particulièrement un mélange de SDS et de sarcosyl. La concentration en agents tensio-actifs dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice est généralement supérieure ou égale à 0,5 % en poids par rapport volume total du mélange, en particulier supérieure ou égale à 2% en poids par 30 rapport au volume total du mélange. Ainsi, la solution dénaturante et réductrice comprend au moins un agent dénaturant qui peut être un agent tensio-actif et/ou un agent chaotrope et au moins un agent réducteur. Le traitement de la PrP par cette solution à la fois dénaturante et réductrice est indispensable pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, comme cela sera démontré à l'exemple 4. Généralement, on laisse la solution contenant l'anticorps spécifique de l'acide aminé en position 171 en contact avec la phase solide sur laquelle est immobilisée la PrP au moins 10 mn, en particulier environ une heure, à une température pouvant aller de 4 à 50 C, et en particulier de 37 C. Il est bien évident que la méthode de détection du marquage sur la io phase solide dépend du marqueur utilisé. Il s'agit de méthodes bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple un marquage à la biotine. Par exemple dans un tel cas, on révèle la présence éventuelle de biotine immobilisée sur le support en ajoutant une solution de conjugué streptavidine-peroxydase que l'on laisse réagir pendant environ 10 à 30 15 minutes à une température d'environ 37 C. Enfin, la présence d'une activité peroxydase liée au support est révélée par l'addition d'un substrat chromogénique, par exemple de la tétraméthylbenzidine, que l'on laisse réagir environ 30 minutes à 20 C. On mesure finalement l'absorbance à 450 et à 620 nm. 20 Quant à l'immobilisation de la protéine prion dénaturée et purifiée, il peut s'agir d'une immobilisation directe sur la phase solide ou d'une immobilisation indirecte. La phase solide peut être une plaque de microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, notamment en polystyrène, polyéthylène ou latex 25 De préférence la phase solide est une plaque de microtitrage en polystyrène. Dans le cas de l'immobilisation de la PrP directement sur la phase solide, la protéine prion, qui comme toutes les protéines se fixe sur la plaque, doit être purifiée (dénaturée) pour éliminer le plus possible de 30 protéines non désirées de l'échantillon, avant d'immobiliser la protéine PrP elle-même. De plus, la protéine prion doit être réduite. Ensuite, on fait réagir l'anticorps de détection qui sera marqué directement ou indirectement. Dans le cas de l'immobilisation indirecte de la PrP sur la phase solide, l'immobilisation peut s'effectuer par l'intermédiaire d'un anticorps ou d'un autre ligand spécifique qui n'est pas un anticorps. Ainsi, l'immobilisation indirecte peut s'effectuer par l'intermédiaire d'un anticorps, dit anticorps de capture, qui est capable de retenir la PrP par liaison affine, ou à l'aide d'un anticorps se liant spécifiquement à une forme particulière de l'allèle en position 171, ou encore par l'intermédiaire d'un ligand qui n'est pas un anticorps. Ce ligand peut être une molécule telle que le plasminogène, l'avidine, la streptavidine, les glycose io aminoglycans, l'hespéridine, les porphyrines, la streptamicine et la tetracycline. Dans le cas où la PrP est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand ou d'un anticorps capable de retenir par liaison affine la PrP, on fait réagir la protéine PrP ainsi immobilisée avec un anticorps se liant spécifiquement 15 à une forme particulière de l'allèle 171, qui est marquée directement ou indirectement. En revanche, dans le cas où l'immobilisation de la PrP sur la phase solide se fait par l'intermédiaire d'un anticorps se liant spécifiquement à une forme particulière de l'allèle en position 171, la protéine PrP 20 immobilisée est ensuite mise à réagir avec un anticorps capable de la retenir par liaison affine. Dans ce cas, c'est cet anticorps qui est marqué directement ou indirectement. Puis, dans tous les cas, l'anticorps marqué est détecté. 25 Le procédé de l'invention est avantageusement mis en oeuvre sous la forme d'un dosage immunologique de type sandwich, tout particulièrement de type ELISA. Dans un tel cas, il convient d'utiliser à la fois un anticorps dit de capture et un anticorps dit de détection pouvant se lier simultanément à la protéine PrP purifiée et réduite. 30 Par anticorps de capture, on entend un anticorps, ou une partie d'anticorps, de préférence fixé(e) sur une phase solide qui est capable de retenir un antigène présent dans un échantillon biologique soit par liaison affine simple soit par liaison affine en reconnaissant un site épitopique particulier. Lorsque l'antigène est immobilisé par un anticorps de capture, l'anticorps de détection doit être capable de se lier à un site épitopique encore accessible différent de celui reconnu par l'anticorps de capture. Le terme "marqué" se réfère aussi bien à un marquage direct (par le biais d'enzymes, radioisotropes, fluorochromes, composés luminescents, etc.) qu'à un marquage indirect, par exemple par le biais d'anticorps eux-mêmes marqués de manière directe ou à l'aide de réactifs d'une "paire d'affinité" marquée, telle que, mais non exclusivement la paire avidine marquée-biotine, etc. io Ainsi la présente invention a notamment pour objet un procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP comprenant les étapes consistant : à traiter un échantillon de fluide biologique à tester, de manière à dénaturer et à réduire la PrP contenue dans ledit échantillon, 15 à mettre en contact ledit échantillon traité avec une phase solide sur laquelle est immobilisé un anticorps dit anticorps de capture, à laver la phase solide obtenue à l'étape précédente, à mettre en contact ladite phase solide lavée avec une solution d'anticorps marqué dit anticorps de détection, 20 à laver la phase solide obtenue à l'étape précédente, puis à détecter la présence éventuelle de marquage sur la phase solide, l'un des anticorps reconnaissant de manière spécifique la PrP quel que soit le variant allélique en position 171 de la PrP, l'autre anticorps se liant de manière spécifique à la PrP d'ovin ayant un variant allélique particulier en 25 position 171. Comme anticorps reconnaissant de manière spécifique la PrP quel que soit le variant allélique en position 171 de la PrP, on citera en particulier les anticorps capables de reconnaître spécifiquement le motif octapeptide répété tel que ceux décrits dans la demande de brevet 30 WO 01/35104. Parmi ces anticorps, on peut citer en particulier, ceux choisis dans le groupe constitué par les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37 décrits dans la demande WO01/35104. On peut encore citer l'anticorps 3B5 décrit dans Krasemann et al. Krasemann, S., Groschup, M.H., Harmeyer, S., Hunsmann, G. and Bodemer, W. (1996a) Generation of monoclonal antibodies against human prion proteins in PrP "0 mice. MolecularMedec/ne, 2, 725-734. On préféra tout particulièrement l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5. Comme anticorps reconnaissant de manière spécifique un variant allélique particulier de la PrP en position 171, on citera l'anticorps 2A11. On citera encore l'anticorps 12F10 décrit dans Krasemann, S., Jurgens T. and Bodemer, W. (1999) Generation of monoclonal antibodies against prion proteins an unconventional nucleic acid based immunization strategy. Journa/ of Biotechno/ogy, 73, 119-129, et l'anticorps 1106 décrit io dans Krasemann, S., Groschup, M.H., Hunsmann, G. and Bodemer, W. (1996b) Induction of antibodies against human prion proteins (PrP) by DNA-mediated immunization of PrP "0 mice. J. Immun/. Methods, 199, 109-118. On citera encore les anticorps V5 et V61 décrits dans Moudjou et al, 15 Journal of Virology, sept. 2004, page 9270-9276. Il va de soi qu'il est à portée de l'homme du métier de produire ou de se procurer des anticorps monoclonaux, de spécificité épitopique similaire ou identique à celle décrite pour les anticorps ci-dessus, et qui conviennent à la mise en oeuvre de la présente invention. 20 Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. I - FIGURES 25 La figure 1 illustre les résultats des tests réalisés sur des plasmas de moutons ARR/ARR, ou ARR/VRQ, ou VRQ/VRQ. Ces tests de format ELISA sandwich sont réalisés après dénaturation et réduction du plasma comme décrit à l'exemple 1. Tous les sandwichs impliquent l'anticorps SAF-34 (anti octa repeat) qui reconnaît 30 indifféremment tous les allotypes en position 171. Selon les cas, l'anticorps SAF-34 est utilisé en tant qu'anticorps de capture (SAF-34) ou en tant qu'anticorps de détection (SAF-34 marqué à l'acétylcholinestérase de gymnote, SAF-34 AChE). La figure 2 illustre la répartition des densités optiques (DO) 35 obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 de la PrP, les acides aminés R/R, ou R/H, ou R/Q, ou H/Q ou Q/Q, et obtenues en utilisant l'anticorps SAF-34 comme anticorps de capture et l'anticorps 2A11 marqué biotine comme anticorps de détection. La figure 3 illustre la répartition des densités optiques (DO) obtenues sur des plasmas de moutons ayant en position 171 les acides aminés Q/Q, ou les acides aminés R/Q, ou les acides aminés R/R, et obtenues en utilisant comme anticorps de capture l'anticorps SAF-34 et comme anticorps de détection l'anticorps 2A11 marqué AChE. La figure 4 illustre l'influence de la présence, ou l'absence d'un agent réducteur, qui est le dithiothréitol, ainsi que de l'absence d'agent dénaturant, qui est l'urée, dans la composition de la solution dénaturante, lorsqu'on utilise en tant qu'anticorps de détection 2A11 marqué biotine et en tant qu'anticorps de capture l'anticorps SAF-34. II - EXEMPLES Matériels Obtention et caractérisation des anticorps monoclonaux 20 spécifiques du motif octapeptide répété (SAF). On a préparé les anticorps SAF- 15, 31, 32, 33, 34, 35 et 37, spécifiques du motif octapeptide répété comme décrit dans la demande de brevet WO 01/35104. Synthèse et marquage du peptide 79-92 de la PrP humaine 25 Un peptide représentatif du motif octapeptide répété de la PrP, par exemple le motif G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G- Q-G-(NH2), correspondant à la séquence 79-92 de la PrP humaine, a été synthétisé à l'aide d'un synthétiseur automatique (Milligen 9050, Waters, Milford, MI). Le peptide a été couplé de façon covalente avec l'acétylcholinestérase de gymnote 30 (AChE) par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, le succinimidyl 4-( ftbmaléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Calbiochem, France), comme décrit précédemment pour d'autres peptides ou protéines (McLaughlin et al., 1987, Grassi et al., 1989). Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol introduit dans le peptide avec la fonction 35 maléimide qui a été fixée sur l'AChE par réaction avec le SMCC. Le groupement thiol a été introduit dans le peptide par réaction avec le succinimidyl S- acétylthioacétate (SATA) comme décrit précédemment (McLaughlin et al., 1987). Le couplage a été obtenu en faisant réagir l'AChE-SMCC avec un excès de peptide thiolé. - Immunisation et préparation des anticorps monoclonaux Une préparation de 'Scrapie-assoc/ated fibrils" (SAFs, préparation de PrPres) a été obtenue à partir de cerveaux de hamster infectés (souche de tremblante 263 K) comme décrit précédemment (Lasmezas et al., 1997). Cette préparation a été inactivée par traitement à l'acide formique avant immunisation des souris. Des souris invalidées (knock-out) pour le gène de la PrP (souris Pr) "0 ) ont été immunisées avec ces préparations de SAF et des cellules d'hybridome ont été préparées comme décrit précédemment (Grassi et al., 1988, 1989). Le criblage des surnageants de culture a été réalisé comme décrit ci-dessous. 57 hybridomes ont pu être identifiés et stabilisés ; ils ont été appelés SAF-1 à SAF-90. Tous ces anticorps se sont avérés reconnaître les SAF immobilisés sur des plaques de microtitrage alors qu'une minorité d'entre eux ont démontré une capacité à reconnaître des conjugués peptide-AChE. Parmi ces derniers, sept reconnaissent clairement le motif octapeptide répété (réaction avec le peptide 79-92 couplé à l'AChE) ;il s'agit des anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 et SAF-37. Après clonage et expansion sous la forme de liquide d'ascite, les anticorps monoclonaux ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de Protéine A Sépharose et conservés à -20 C jusqu'à utilisation. L'isotype des anticorps a été déterminé par immunodiffusion radiale selon la technique d'Ouchterlony. - Criblage des surnageants de culture d'hybridome La présence d'anticorps spécifiques de la PrP dans les surnageants de culture d'hybridome a été mise en évidence de deux façons, en testant soit leur capacité à lier des conjugués peptide-AChE (et notamment le peptide 79-92-AChE) soit des SAFs de hamster. Dans le premier cas, le criblage a été réalisé dans des plaques contenant un anticorps anti-IgG de souris immobilisé comme décrit précédemment (Créminont et al., 1993, Frobert et al., 1991). En résumé, 100 pl de surnageants de culture et 100 pl de conjugué Peptide-AChE ont été mis à réagir une nuit à 4 C dans des plaques contenant des anticorps de chèvre anti-IgG de souris immobilisés. Après lavage des plaques 200 pl de réactif d'Ellman (Ellman et al., 1961) ont été rajoutés dans les puits afin de détecter la présence d'AChE fixée sur la phase solide. Dans le deuxième cas, des plaques contenant une préparation de SAF immobilisée ont été préparées en faisant réagir 50 pl d'une solution à 2 pg/ml dans un tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4, pendant une nuit à température ambiante . Après lavage, les plaques ont été saturées avec le tampon EIA (tampon phosphate 100 mM, pH7,4 contenant du NaCl 150 mM, 0,1% de la sérum albumine io bovine (BSA) et de l'azoture de sodium 0,01%) pendant une nuit à 4 C et ont été conservées à cette température jusqu'à leur utilisation. La liaison des anticorps monoclonaux sur les SAFs immobilisés a été mise en évidence à l'aide d'anticorps de chèvre anti-IgG de souris marqués à l'AChE comme décrit précédemment (Negroni et al., 1998). 15 Marquage des anticorps monoclonaux par l'AChE. Les anticorps monoclonaux marqués par l'AChE sont préparés par couplage de fragments Fab' réduits avec la forme tétramérique de l'enzyme par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, le succinimidyl 4-( N maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, 20 Calbiochem, France), comme décrit précédemment (Grassi et al., 1989). Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol porté par le fragment Fab' réduit avec la fonction maléimide qui a été fixée sur l'AChE par réaction avec le SMCC. Obtention de l'anticorps monoclonal 3B5, 1106 et 12F10 25 Les anticorps monoclonaux 3B5, 1106 et 12F10 ont été obtenus après immunisation de souris "knock-out" pour la PrP avec de la PrP humaine recombinante et criblés selon différentes techniques comme décrit dans Krasemann et al. 3B5 est un anticorps dirigé contre la PrP humaine recombinante et 30 reconnaît le peptide 79-92. 1106 est un anticorps qui reconnaît un épitope conformationel non identifié. 12F10 est un anticorps dirigé contre la PrP humaine recombinante et reconnaît le peptide 142-160. 35 Obtention de l'anticorps monoclonal Bar226 L'anticorps Bar-226 a été obtenu par immunisation de souris "knock-out" pour le gène de la PrP avec de la PrP recombinante (allotype ARQ) comme décrit dans C. Feraudet, N. Morel, S. Simon, H. Volland, Y. Frobert, C. Creminon, D. Vilette, S. Lehmann, J. Grassi (2005) Screening of 145 anti PrP Monoclonal antibodies for their capacity to inhibit PrPSc Replication in Infected Cells J. Bio% Chem.,280, 11247-11258. Obtention de l'anticorps monoclonal 2A11 L'anticorps monoclonal 2A11 est préparé selon le protocole décrit io dans Brun et al; J. Neuroscience Research 48, 2004, 75-83. Conjugué : Anticorps monoclonal 2A11 ù biotine Un conjugué de l'anticorps monoclonal 2A11 marqué à la biotine est préparé selon le protocole décrit par Greg T. Hermanson en 1996. Conjugué : Streptavidine marqué à la peroxydase 15 Un conjugué de streptavidine marqué à la peroxydase est préparé selon le protocole décrit par Greg T. Hermanson en 1996. Fluides biologiques Les fluides biologiques utilisés étaient des sérums ou des plasmas de moutons de races Cheviot, Romanov, Casserarde et Manech. 20 Température ambiante La température ambiante est définie comme une température comprise entre 18 C et 30 C, inclus. EXEMPLE 1 25 Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R, ou R/Q ou Q/Q en position 171. 65 pl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 65 pl de solution dénaturante et réductrice composée d'urée 30 8M et de DTT 10mM. On chauffe ensuite le mélange pendant 30 minutes à 50 C. 100 pl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est soit l'anticorps 12F10, soit l'anticorps BAR233, soit l'anticorps BAR226, soit l'anticorps 35 SAF-34, soit l'anticorps 1106. On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tampon phosphate 10"2 M, pH 7,4 et du Tween 20 0,05 %. Après lavage, on dépose 100 pl par puits d'anticorps de détection qui est soit l'anticorps SAF-34 marqué par l'AChE lorsque l'anticorps de capture est l'anticorps 12F10 ou BAR233 ou BAR226 OU 1106, soit l'anticorps BAR 224 marqué par l'AChE, soit l'anticorps 2A11 marqué à la biotine, soit l'anticorps BAR 208 marqué à la biotine, à 3 pg par litre d'anticorps par rapport au mélange final ainsi obtenu. Les puits sont laissés à incuber une heure à 37 C. On effectue ensuite cinq lavages avec la solution de lavage contenant du tampon phosphate 10-2 M, pH 7,4 et du Tween 20 à 0,05 Io en poids par rapport au poids total de la solution de lavage. Quand les anticorps marqués sont l'anticorps 2A11 et l'anticorps Bar-208 marqués à la biotine, la présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition d'un conjugué streptavidineperoxydase à 0,2 pg/ml de mélange final Dans ce cas, on laisse incuber 30 minutes à 37 C. On effectue alors 5 lavages avec une solution de lavage contenant du tampon phosphate 10-2 M, pH 7,4 et du Tween 20 à 0,05 % en poids par rapport au poids total de la solution de lavage. 100 pl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB) en tant que chromogène sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. On dépose 100 pl de solution d'acide sulfurique 1N, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits. L'absorbance est mesurée à 450 nm et 620 nm. Pour les anticorps marqués à l'AChE, après ajout de 200 pl de réactif d'Ellman (Ellman et al., 1961) dans les puits, la présence d'AChE fixée sur la phase solide est détectée par mesure de I'absorbance à 414 nm. Les résultats obtenus sont représentés en figure 1. On voit clairement à partir de la figure 1 que les couples d'anticorps de capture/anticorps de détection 12F10/SAF-34-AChE, BAR 226/SAF-34- AChE, 1106/ SAF-34-AChE, SAF-34/2A11-biotine permettent de différencier nettement les animaux ayant le génotype R/R en position 171 des animaux ayant le génotype R/Q et des animaux ayant le génotype Q/Q à cette même position. On constate également que les autres couples anticorps de capture/anticorps de détection ne permettent pas de discriminer entre les différents génotypes en position 171 de la protéine prion PrP. On voit également clairement en figure 1 que l'anticorps SAF-34 qui est un anticorps ne se liant pas à une forme allélique spécifique en position 171, peut être utilisé aussi bien en tant qu'anticorps de capture qu'en tant qu'anticorps de détection. Lorsqu'il est utilisé en tant qu'anticorps de détection, il est marqué par AChE. On constate également clairement à partir de la figure 1 que le couple permettant d'identifier avec la plus forte discrimination les animaux de génotype R/R des animaux de génotype R/Q et des animaux de génotype Q/Q en position 171 est le couple SAF-34/2A11 marqué biotine. En effet, l'anticorps 2A11 ne se lie pas du tout à la forme allélique R en position 171 de la PrP. EXEMPLE 2 Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/H ou R/Q ou H/Q ou Q/Q, en position 171 de la PrP. 75 pl de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 75 pl de solution dénaturante et réductrice composée de 2 0/0 en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de sarcosyl, de 2 % en poids, par rapport au volume total de la solution dénaturante et réductrice, de dodécylsulfate et de dithiothréitol à 10 mM. On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 60 C. 100 pl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps SAF-34. On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCl 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids de Tween 20, par rapport au poids total de la solution de lavage. La solution de lavage est tamponnée à pH neutre ou légèrement alcalin et contient un détergent neutre/non ionique à faible concentration (Tween 20 à 0,01 %). Après lavage, on dépose 100 pl par puits d'anticorps de détection qui est l'anticorps 2A11 conjugué biotine, qui est présent à une concentration de 3 pg par litre d'anticorps par rapport au poids total du mélange final ainsi obtenu. Les puits sont laissés à incuber une heure à 37 C. On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage 10 précédemment décrite. La présence de l'anticorps marqué sur la phase solide est révélée par l'addition du conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels", à 0,2 pg/ml de mélange final. On laisse incuber 30 minutes à 37 C. 15 On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment décrite. 100 pl du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB), en tant que chromogène, sont déposés dans chaque puits. 20 On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. On dépose 100 pl de solution d'acide sulfurique 1N, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits. L'absorbance (densité optique) est mesurée à 450 et 620 nm. 25 Les résultats obtenus sont représentés en figure 2. La figure 2 représente la répartition des densités optiques obtenues sur les plasmas de chaque catégorie de génotypes de moutons. Comme on le voit en figure 2, le couple d'anticorps SAF-34/2A11 marqué biotine permet d'obtenir une excellente discrimination entre les 30 différents génotypes de moutons. EXEMPLE 3 Dans cet exemple, l'agent dénaturant est un agent chaotrope, plus 35 précisément de l'urée 8 M. Des échantillons de plasma ont été prélevés sur des moutons ayant le génotype R/R ou R/Q ou Q/Q en position 171 de la PrP. 65 pI de chaque échantillon de plasma de moutons ont été mélangés à 65 pl de solution dénaturante et réductrice composée d'urée 8 M et de dithiothréitol 10 mM. On chauffe ensuite le mélange pendant 10 minutes à 60 C. Puis, on ajoute 130 pl de tampon EIA (Enzyme Immuno Assay) contenant un tampon phosphate de potassium 1 M, pH 7,4, NaCI 0,15 M, et 0,1 % en poids, par rapport au volume total du tampon EIA, d'albumine io sérique bovine (BSA). 100 pl du mélange obtenu sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitrage contenant un anticorps de capture qui est l'anticorps SAF34. On laisse le mélange incuber une heure à 20 C. 15 On effectue ensuite trois lavages des puits avec une solution de lavage contenant du tris 0,01 M, NaCI 0,3 M, pH 7,4, et 0,1 % en poids, par rapport au volume total de la solution de lavage de Tween 20. Après lavage, on dépose 100 pl par puits d'anticorps de détection, qui est l'anticorps 2A11 marqué biotine, le conjugué anticorps 2A11- 20 biotine étant à une concentration de 0,5 pg/ml par rapport au mélange final ainsi obtenu. Les puits sont laissés à incuber une heure à + 4 C. On effectue ensuite trois lavages avec la solution de lavage précédemment décrite. 25 Après lavage, on dépose 100 pl par puits de conjugué streptavidine-peroxydase décrit au paragraphe "Matériels" à une concentration de 0,1 pg/ml dans la solution finale. On laisse incuber 30 minutes à +20 C. On effectue cinq lavages avec la solution de lavage précédemment 30 décrite. 100 pI du substrat de la peroxydase plus 2 ml de solution de tétraméthylbenzidine (TMB) en tant que chromogène sont déposés dans chaque puits. On laisse incuber 30 minutes à température ambiante dans 35 l'obscurité. On dépose 100 pl de solution d'acide sulfurique IN, en tant que solution d'arrêt, dans chaque puits. L'absorbance est mesurée à 450 et 620 nm. Les résultats obtenus sont représentés en figure 3. En comparant les figures 2 et 3, on constate que le couple d'anticorps SAF-34/2A11 permet d'obtenir une excellente discrimination entre les différents génotypes des moutons, quelque soit la composition de la solution dénaturante et réductrice. EXEMPLE 4 Cet exemple avait pour but d'évaluer l'importance de la présence d'un agent réducteur et d'un agent dénaturant dans la solution dénaturante et réductrice utilisée. Pour cela, des plasmas de moutons ayant le génotype Q/Q ou R/Q ou R/R en position 171 de la PrP ont été testés selon le protocole de l'exemple 3, c'est-à-dire avec une solution contenant en tant qu'agent dénaturant de l'urée 8 M et en tant qu'agent réducteur du DU 10 mM. Les mêmes plasmas de moutons ont été testés avec une solution contenant uniquement un agent dénaturant, qui est l'urée 8 M. Ces mêmes échantillons ont également été traités avec une solution ne contenant qu'un agent réducteur, le DU 10 mM. La densité optique de chacun de ces plasmas a été mesurée à 450-620 nm. Les résultats obtenus sont illustrés en figure 4 où les colonnes blanchesreprésentent les densités optiques obtenues sur les plasmas traités avec une solution contenant un agent dénaturant et un agent réducteur, les colonnes en pointillés représentent les densités obtenues sur les échantillons de fluide biologique traité avec une solution contenant uniquement un agent dénaturant et ne contenant pas d'agent réducteur et les colonnes à hachures croisées représentent les densités optiques obtenues sur les échantillons traités avec une solution contenant un agent réducteur et ne contenant pas d'agent dénaturant. Comme on le voit en figure 4, la présence combinée d'un agent réducteur et d'un agent dénaturant (agent tensio-actif et/ou agent chaotrope) est absolument nécessaire pour discriminer les différents génotypes. Il est à noter que l'anticorps 2A11 ne se liant pas à la forme allélique R en position 171 de la PrP, les résultats obtenus ne montrent pas de différence entre les tests réalisés avec une solution dénaturante comprenant ou non un agent réducteur. Les mêmes essais qu'aux exemples 1 à 4 ont été réalisés sur des sérums de moutons. Des résultats similaires ont été obtenus. Une fois le génotype en position 171 de la protéine identifié, on io pourra sélectionner les moutons destinés à la reproduction. De préférence, on sélectionnera les moutons ayant le génotype R/R, qui sont les plus résistants à la tremblante. Ainsi, on pourra, selon le programme, sélectionner les moutons mâles et femelles ayant ce génotype pour ne produire que des moutons 15 de génotype R/R ou sélectionner uniquement les moutons mâles ayant le génotype R/R et les laisser se reproduire avec les femelles de tous génotypes. Avantageusement, le procédé de l'invention pourra être mis en oeuvre grâce à des trousses. 20 Dans un premier mode de réalisation, la trousse de l'invention comprendra: - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5, 25 - une solution dénaturante et réductrice, et - au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106, 2A11 marqués et plus particulièrement le 2A11 marqué. Dans un second mode de réalisation, la trousse de l'invention 30 comprend : - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106 - une solution dénaturante et réductrice, et au moins un anticorps de détection choisi parmi les anticorps SAF-15, 35 SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 marqués. De préférence, dans les trousses de l'invention, la phase solide est une plaque de microtitrage, de préférence en polystyrène. De préférence, dans le premier mode de réalisation de la trousse de l'invention, l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2A11. Egalement de préférence, dans les trousses de l'invention, la solution dénaturante contient du dodécylsulfate de sodium, du dithiothréitol et du sarcosyl. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) traitement d'un échantillon de fluide biologique ovin à tester contenant de la PrP avec une solution dénaturante et réductrice, b) immobilisation, éventuellement par l'intermédiaire d'un ligand, de la PrP dénaturée et réduite sur une phase solide, c) mise en contact de la PrP dénaturée, réduite et immobilisée avec au moins un anticorps de détection, et d) détection de la présence éventuelle dudit au moins anticorps de détection, et dans lequel l'un du ligand et du au moins un anticorps de détection se lie spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution dénaturante et réductrice comprend : a) au moins un agent dénaturant choisi parmi : un agent tensio-actif choisi dans le groupe constitué par : • les tensio-actifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarcosyl (lauroyl sarcosine), le cholate de sodium, le glycocholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium, le caprylate de sodium, le 1-décanesulfonate de sodium, le laurylsulfate de sodium et le laurylsulfate de lithium ; • les tensio-actifs zwitterioniques, tels que SB 3-10 (décyl-sulfobétaïne), SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), SB 3-18 (octadécyl-sulfobétaïne), CHAPS et CHAPSO et désoxy CHAPS ; • les tensio-actifs non ioniques, tels que le Triton X-100, le Triton X-114, le Tween 20, le Tween 80, le Brij 35 (polyoxyéthylène 23 lauryléther), le nonidet P-40, le n-décyl-béta-D-glucopyranoside, le n-dodécyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-béta-D-glucopyranoside, le n-octyl-alpha-D- glucopyranoside ;• leurs mélanges, et/ou - un agent chaotrope, et b) au moins un agent réducteur. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent chaotrope est choisi parmi l'urée, la guanidine, l'hydrochlorure de guanidine et le thiocyanate de guanidine ou un de leurs mélanges. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications io précédentes, caractérisé en ce que ladite solution dénaturante et réductrice comprend un mélange d'agents tensio-actifs ioniques, en particulier d'agents tensio-actifs anioniques et plus particulièrement de SDS et de sarcosyl. 15 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la solution dénaturante et réductrice contient au moins 0,5 % en poids d'agent tensio-actif par rapport au volume total du mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice, et en particulier supérieure ou égale à 2 % en poids par 20 rapport au volume total du mélange. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ledit au moins un agent réducteur est choisi dans le groupe constitué par le DTT (dithiothréitol), le TCEP (hydrochlorure de 25 Tris(2-carboxyéthyl)phosphine), le DTE (dithio érythritol), le béta mercaptoéthanol, la 2-mercaptoéthylamine ou un de leurs mélanges. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel la concentration en agent réducteur est comprise entre 2,5 mM et 30 100 mM et plus particulièrement comprise entre 5 mM et 20 mM dans le mélange constitué par l'échantillon à traiter et la solution dénaturante et réductrice. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 35 précédentes, caractérisé en ce que ladite solution dénaturante etréductrice comprend un mélange de sarcosyl, de dodécylsulfate de sodium et de dithiothréitol. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration dans la solution dénaturante et réductrice, de l'agent chaotrope est supérieure ou égale à 1 M, de préférence, supérieure ou égale à 3 M. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications, caractérisé 10 en ce que l'agent chaotrope est l'urée à une concentration égale à 8 M. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture 15 capable de retenir la PrP par liaison affine et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171, cette position étant différente du site épitopique reconnu par l'anticorps de capture. 20 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps de capture se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171 et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps 25 capable de se lier à la PrP par liaison affine à un site épitopique différent de celui reconnu par l'anticorps de capture. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée par 30 l'intermédiaire d'un ligand choisi parmi choisi parmi les plasminogènes, l'avidine, la streptavidine, les glycose aminoglycans, l'hespéridine, les porphyrines, la streptamicine et la tetracycline et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. 35 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape b) la PrP dénaturée et réduite est immobilisée directement sur la phase solide, et dans lequel à l'étape c) l'anticorps de détection est un anticorps se liant spécifiquement à la PrP ayant une forme allélique particulière en position 171. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la phase solide est choisie parmi des plaques de microtitrage, des billes, des tubes, en polymère, notamment en io polystyrène, polyéthylène ou latex, et de préférence la phase solide est une plaque de microtitrage en polystyrène. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon de fluide biologique est du sang, du 15 plasma, du sérum, ou du lait. 17. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, 13 à 17, caractérisé en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi l'anticorps 2A11 marqué, l'anticorps 1106 marqué, l'anticorps BAR226 marqué et l'anticorps 12F10 marqué. 25 19. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est l'anticorps SAF-34 ou l'anticorps 3B5 et l'anticorps de détection est l'anticorps 2A11 marqué. 30 20. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'anticorps de capture est choisi parmi les anticorps 2A11, 12F10, BAR226, 1106 et en ce que l'anticorps de détection est choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 marqués. 20 21. Procédé de sélection d'un ovin pour la reproduction, en fonction de sa résistance aux encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 22. Trousse d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin comprenant : - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-10 34, SAF-35, SAF-37, 3B5, - une solution dénaturante et réductrice, et au moins un anticorps de détection, en particulier choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106, 2A11 marqués et plus particulièrement l'anticorps 2A11 marqué. 15 23. Trousse d'identification du génotype en position 171 de la PrP d'ovin, caractérisé en ce qu'il comprend : - une phase solide sur laquelle est immobilisée au moins un anticorps de capture choisi parmi les anticorps 12F10, BAR226, 1106, 20 - une solution dénaturante et réductrice, et - au moins un anticorps de détection choisi parmi les anticorps SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35, SAF-37, 3B5 marqués.