Brevet FR2889705A1 — publié le 20070216

La présente invention concerne des milieux sélectifs de culture bactérienne comportant, dans un milieu inorganique minimum, du gentisate ou au moins un précurseur de gentisate. Elle concerne également des procédés d'enrichissement de culture bactérienne et/ou d'isolement de culture bactérienne mettant en oeuvre de tels milieux, ainsi que l'association d'au moins un précurseur de gentisate et d'au moins un inhibiteur pour l'enrichissement et/ou l'isolement de culture bactérienne, notamment de Salmonella, et l'utilisation du gentisate ou l'un de ses précurseurs, notamment le 3-hydroxybenzoate à cet effet. De nombreuses bactéries, notamment Salmonella, peuvent être responsables de pathologies chez l'homme, notamment de toxi-infections alimentaires, et sont très fréquemment rencontrées. II existe de nombreux milieux destinés à la recherche de ces bactéries dans divers échantillons (cliniques, alimentaires, environnementaux). Toutefois, leur isolement et identification reste un travail fastidieux qui nécessite enrichissement(s), isolement, tests biochimiques et antigéniques. Les milieux commercialisés sont généralement sensibles ou spécifiques, mais rarement les deux. De plus, aucun d'entre eux ne s'est montré efficace pour le dénombrement des Salmonella, en particulier. Le milieu sélectif idéal doit permettre à une cellule de bactérie de la souche à cultiver ou identifier de donner une colonie et doit inhiber les 30 autres espèces bactériennes. De plus, si l'inhibition des autres bactéries est insuffisante, une réaction colorée dans le milieu peut aider à distinguer les colonies de la souche à cultiver ou identifier des autres colonies. Pour évaluer l'intérêt d'un milieu sélectif, on peut évaluer le taux de recouvrement ( efficiency of plating ), défini comme la proportion entre le nombre de colonies sur le milieu testé et le nombre de colonies sur un milieu riche de référence (4). Un milieu utile selon l'invention permet à la fois un taux de recouvrement proche de 1 pour la souche à cultiver ou identifier, notamment les Salmonella; et un taux de recouvrement proche de 0 pour les espèces différentes de la souche à cultiver ou identifier. La Demanderesse a maintenant mis en évidence qu'un tel milieu peut être proposé, sur la base d'un milieu inorganique minimum, par l'entremise d'une nouvelle source de carbone et d'énergie: le gentisate ou l'un de ses précurseurs, notamment le 3-hydroxybenzoate (3-HB). D'autres avantages de ces milieux notamment par rapport aux milieux connus, et pour des utilisations particulières apparaîtront à la lecture de la description et des exemples qui suivent. Les bactéries du genre Salmonella sont des bacilles à Gram négatif, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Ce genre est phylogénétiquement proche de Escherichia et Citrobacter. Il comprend deux espèces, S. enterica, espèce habituelle (plus de 2200 sérotypes), et S. bongori, espèce rare. S. enterica est subdivisée en plusieurs sousespèces: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, et indica, elles-mêmes subdivisées en sérotypes. Les sérotypes cités ici réfèrent à Salmonella enterica subsp enterica. Les Salmonella enterica subsp. enterica sont des parasites intestinaux des animaux à sang chaud et de l'Homme; les autres sous-espèces contaminent préférentiellement les animaux à sang froid (reptiles, batraciens). Au sein de la sous-espèce enterica, on distingue des sérotypes strictement humains (Typhi), des sérotypes strictement animaux (Gallinarum) mais la plupart des sérotypes sont ubiquistes (Typhimurium, Enteritidis...) et contaminent l'homme, les volailles, les oeufs, les bovins... On retrouve également ces bactéries dans les eaux de surface et eaux usées. Les Salmonella sont responsables de plusieurs types de pathologies humaines dont les fièvres typhoïde et paratyphoïde (sérotypes Typhi et Paratyphi A,B,C) qui sont, en France, essentiellement des cas importés de zone d'endémie; les salmonelloses mineures: gastro-entérites, toxi-infections alimentaires sporadiques ou collectives (TIAC), Salmonella étant l'agent le plus fréquemment isolé dans les toxi- infections alimentaires; ou encore les manifestations extra-digestives chez des sujets à risques comme les sujets immunodéprimés. L'acquisition d'une salmonellose se fait par ingestion d'eau et d'aliments contaminés. Les aliments le plus souvent mis en cause sont les oeufs et préparations à base d'oeufs, les produits de charcuterie, les volailles, les produits laitiers et les viandes. Cette contamination peut être liée à des pratiques hygiéniques défectueuses: matières premières contaminées (portage intestinal par les animaux à sang chaud), environnement contaminant (équipement, personnel des restaurations collectives, des circuits de fabrication), erreur dans le processus de fabrication, délai important entre préparation et consommation ou rupture de la chaîne du froid, par exemple. A titre indicatif, en 2003, 10472 souches de Salmonella d'origine humaine ont été rapportées et enregistrées au Centre National de référence des Salmonella. La recherche des germes, et notamment de ces germes de Salmonella dans les aliments et l'environnement (eau) est donc un enjeu de santé publique, car Salmonella enterica est le principal agent de toxi-infection alimentaire collective (TIAC) en France. A titre d'exemple, les Salmonella sont isolées de coprocultures (salmonelloses mineures et majeures), hémocultures ou autres liquides biologiques (fièvres typhoïdes, bactériémies, salmonelloses invasives), échantillons environnementaux et produits destinés à la consommation humaine ou animale. Par ailleurs, la plupart des Salmonella sont prototrophes mais quelques sérotypes, adaptés à un hôte particulier (Typhi, Paratyphi A, Gallinarum) sont auxotrophes pour un ou plusieurs facteurs de croissance. Dans le cas de prélèvements monomicrobiens (sang), des géloses ordinaires telles que Trypto-caséine-soja (TCS2), Drigalski suffisent à l'isolement des Salmonella. Les coprocultures et échantillons alimentaires et environnementaux étant polymicrobiens (flore commensale du tube digestif, bactéries de l'environnement), leur isolement spécifique requiert l'utilisation de milieux sélectifs contenant des inhibiteurs et des substrats capables respectivement d'inhiber la flore environnante et différencier les Salmonella des autres germes, tout particulièrement de Citrobacter, Escherichia coli et Proteus. Usuellement, la recherche de Salmonella en mélange polymicrobien nécessite plusieurs étapes, à savoir pré-enrichissement en milieu non- sélectif (6 à 20h), réalisé dans de l'eau peptonnée; enrichissement en milieu sélectif liquide (24h) ; bouillon Müller-Kauffmann au tétrathionate, ou bouillon au sélénite (additionné ou non de cystine ou novobiocine), ou encore bouillon Rappaport-Vassiliadis; isolement sur milieux sélectifs gélosés à partir des bouillons enrichis (24-48h) : Xylose-Lysine-Désoxycholate (XLD), Hektoen, par exemple, puis confirmation par identification biochimique et antigénique, ce qui nécessite généralement au moins 3 jours de manipulation. Parmi les milieux gélosés sélectifs comme pour Salmonella on peut citer les milieux Hektoen, Salmonella-Shigella (SS), xylose-Iysinedésoxycholate (XLD), xylose-lysine-Tergitol 4 (XLT4), Novobiocine-vert brillant-glucose (NBG) ou Novobiocine-vert brillant-glycérol-lactose (NBGL) et Rambach. De plus, plusieurs milieux chromogéniques ont été développés plus récemment: SM-ID (SalMonella-Identification), CSE (Chromogenic Salmonella esterase), ABC, CHROMagar, SCM (Salmonella Chromogenic Medium). Certains de ces milieux exercent un effet inhibiteur sur la flore commensale. Les sels biliaires ou le désoxycholate de sodium affectent la croissance des germes à Gram positif. Le vert brillant (colorant antiseptique), la novobiocine et la cefsulodine (antibiotiques), et le Tergitol 4 (détergent), inhibent la flore Gram positif, et certaines bactéries Gram négatif. Ces produits, éventuellement associés, s'opposent à l'envahissement de la gélose par Proteus spp et sont usuellement utilisés à des doses de l'ordre de 0,33 à 12,5 mg (vert brillant), 1 à 2 mg (Tergitol 4), mg (cefsulodine), 20 mg (novobiocine), 1 g (désoxycholate) et 5 à 9 mg (sels biliaires) par litre de milieu. Par ailleurs, dans le cas des Salmonella, l'absence de production d'acide à partir de certains sucres comme le lactose, saccharose, glycérol, ou salicine, est mise à profit dans les milieux Hektoen, SS, XLD, XLT4, NBG, NBGL. Les Salmonella n'acidifiant pas le milieu, présentent une coloration distincte des autres entérobactéries capables de cultiver (Citrobacter, E.coli, Enterobacter, Shigella...). Dans ces mêmes milieux, la combinaison du thiosulfate de sodium et du citrate de fer ammoniacal donne une coloration noire aux colonies de Salmonella par production de sulfure d'hydrogène. La discrimination Salmonella-flore associée est de ce fait bonne, sauf pour Proteus sp., qui produit également du H2S. La perception des Salmonella lactose ou saccharose + n'est pas correcte. Ces milieux ne permettent toutefois pas un bon isolement de Salmonella Typhi et Paratyphi A, produisant peu ou pas de H2S. XLD est le moins inhibiteur et permet un taux de recouvrement important des Salmonella. Le milieu Rambach, intéressant pour l'isolement et le dénombrement des Salmonella dans les crustacés, permet de mettre en évidence deux propriétés spécifiques du genre Salmonella: la production d'acide à partir du propylène-glycol et l'absence de (3-galactosidase (révélée par un substrat chromogène, le X-13-Gal ou 5-bromo-4-chloro-3-p-indolyl-Dgalactopyranoside). Ainsi, les colonies de Salmonella enterica nontyphiques apparaissent de couleur rose fuchsia, permettant un repérage rapide vis-à-vis de la flore associée. Cependant, les sérotypes Typhi et Paratyphi A donnent des colonies incolores difficilement détectables et certaines colonies de Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii peuvent être rouges, couleur proche ce qui peut induire des difficultés d'appréciation dans le repérage. Les milieux chromogéniques, plus récents, permettent une meilleure discrimination entre Salmonella et la flore associée. Ils contiennent des substrats chromogènes qui mettent en évidence des activités enzymatiques spécifiques de Salmonella, y compris des sérotypes Typhi et Paratyphi A. Ainsi, SM-ID met en évidence la fermentation du glucuronate et l'absence de R-galactosidase, donnant des colonies de Salmonella roses à rouges. CSE permet la détection de l'activité C8-estérase (par l'utilisation du SLPA-octanoate, substrat chromogène), donnant des colonies rouge-violacé. ABC détecte l'activité a-galactosidase de toutes les Salmonella (colonies bleues; substrat X-a-Gal) et l'activité R-galactosidase des nonSalmonella (colonies noires; substrat 3,4-cyclohexeno-esculétine ou CHEGal). CHROMagar donne des colonies de Salmonella mauves (mise en évidence de l'activité estérase), les autres entérobactéries apparaissant bleues ou incolores (activité (3-galactosidase). Enfin, SCM détecte l'activité caprylatestérase des Salmonella, donnant des colonies magenta, grâce au Magenta- cap ou 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate. Les colonies de nonSalmonella apparaissent bleues (activité 13-galactosidase; X-(3-GAL). Ces milieux peuvent être utilisés pour la recherche de certaines bactéries, notamment Salmonella, dans divers prélèvements cliniques mais aussi dans les denrées alimentaires, les produits pharmaceutiques, les échantillons environnementaux. Ils sont le plus souvent conseillés comme milieux d'isolement après une phase d'enrichissement, pour améliorer la sensibilité de la méthode. Jusqu'ici, aucun milieu de ces milieux connus n'a toutefois pu être utilisé comme milieu sélectif de façon satisfaisante, et il persiste un besoin pour un tel milieu. En effet, comme indiqué ci dessus, avec les techniques actuellement existantes, l'isolement de Salmonella requiert l'utilisation de plusieurs milieux sélectifs contenant des inhibiteurs et des substrats capables respectivement d'inhiber la flore environnante et différencier Salmonella des autres germes, tout particulièrement Citrobacter, Escherichia et Proteus. Au contraire, les milieux selon l'invention peuvent remplir les deux buts que sont l'utilisation d'un seul milieu sélectif et de rechercher notamment Salmonella sans multiplier les étapes. De façon plus précise, les milieux de l'invention mettent en oeuvre du 3HB, ses dérivés et/ou d'autres précurseurs du gentisate. Le 3-HB est un composé aromatique non azoté, cité en tant que substrat carboné dans des milieux de culture, par Veron (1) parmi 146 substrats étudiés, sans que ce 3-HB soit utilisé en présence d'inhibiteur, les solutions décrites comportant 100 g/1 de substrat. De plus, la publication de Moscoso-Vizcarra (2) décrit les voies métaboliques d'assimilation du 3-HB par les entérobactéries. Enfin, le brevet américain US 5,824,552 décrit une méthode de culture de cellules animales et notamment un milieu stimulant la croissance des cellules, dont la source de carbone est le glucose. La méthode décrite dans ce document met en oeuvre un milieu de culture contenant des composés benzoïques, notamment des dérivés de l'acide hydrobenzylique parmi lesquels le 3-HB à des concentrations inférieures à 50 tag/ml, les cellules mises en culture, exclusivement animales, ne consommant pas ce composé durant leur culture. En effet, le dérivé de l'acide hydrobenzylique n'est pas une source de carbone et d'énergie nécessaire au maintien en vie et à la multiplication des cellules animales; dans les exemples, il est ainsi systématiquement ajouté une source de carbone, le glucose. On distingue usuellement les notions de source de carbone et de facteur de croissance. Une source de carbone et d'énergie, dans un milieu de culture, est catabolisée par les bactéries, ou autre organisme vivant, ce qui donne l'énergie nécessaire aux synthèses ainsi que les matériaux moléculaires. La masse des bactéries obtenue à la fin de la croissance est proportionnelle à la quantité de source de carbone disponible. Par ailleurs, les facteurs de croissance sont des substances qu'un organisme ne peut synthétiser, et les besoins quantitatifs sont très variables d'une souche à l'autre. On distingue d'une part les acides aminés, incorporés tels quels dans les protéines si l'acide aminé était source de carbone il serait catabolisé et ses carbones se retrouveraient n'importe où et il en est de même pour les purines et les pyrimidines incorporées dans les acides nucléiques et d'autre part les vitamines qui entrent dans la constitution des coenzymes, et sont recyclables, et dont de très petites quantités sont nécessaires. La présente invention concerne un milieu de culture bactérienne pour une souche à cultiver comportant, dans un milieu inorganique minimum, au moins un précurseur de gentisate et/ou du gentisate, en tant que source de carbone et d'énergie. Selon l'invention, au contraire de l'enseignement du brevet US 5,824,552, le 3-HB, ses précurseurs ou dérivés et/ou d'autres précurseurs du gentisate ou leur(s) dérivé(s) constitue(nt) une source de carbone et d'énergie pour les bactéries à cultiver. Ainsi, selon l'invention, la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate et/ou leur(s) dérivé(s) est telle qu'il(s) constituent une source de carbone et d'énergie effective. A ce titre, et selon une variante de la présente invention, le 3-HB est utilisé à une concentration finale minimale de 0,1 g/I, de préférence 0,5 g/I environ, et de façon encore préférée de 1 g/I environ, c'est-à-dire environ 1000 pg/mI dans le milieu. De telles concentrations sont donc au moins 2 fois, de préférence 10, et de façon encore préférée 20 fois supérieure à la concentration connue de l'art antérieur. Les milieux de la présente invention ne permettent d'ailleurs pas la culture de cellules animales. Dans une forme particulière de réalisation de l'invention, le milieu comporte en outre au moins un inhibiteur de la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone. Selon une forme de l'invention, et notamment lorsque le milieu est sous forme liquide et/ou pour certaines applications, il n'est pas nécessaire d'adjoindre un inhibiteur pour que le milieu selon l'invention soit enrichissant. C'est pourquoi l'invention concerne aussi, dans une forme de réalisation, des milieux de culture sous forme liquide et sans inhibiteur. Elle concerne aussi des milieux de culture sous forme semi-solide ou gélifiée et dans des conditions inhibitrices, c'est-à-dire que l'inhibition peut être provoquée aussi bien par la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie que par les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, les conditions de pH et/ou les conditions de température. L'invention concerne également un procédé d'enrichissement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention. Elle concerne aussi un procédé d'isolement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention. Elle concerne aussi un procédé de culture d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'invention mis en oeuvre dans des conditions inhibitrices. Ces conditions inhibitrices peuvent être choisies parmi la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie, les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, le contrôle du pH et/ou le contrôle de la température. Enfin, l'invention concerne l'association du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie, avec au moins un inhibiteur, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, l'inhibiteur agissant sur la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie. Elle concerne aussi l'utilisation du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie, dans des conditions inhibitrices, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, lesdites conditions agissant sur la croissance des bactéries qui sont différentes de la souche bactérienne à cultiver et qui assimilent ladite source de carbone et d'énergie. Comme cela apparaît dans les exemples, de façon plus simple que par les procédés mis en oeuvre avec les milieux connus, les milieux selon l'invention permettent la culture et aussi l'isolement des souches bactériennes, et notamment des souches de Salmonella, y compris des sérotypes auxotrophe dont Typhi, et Paratyphi, etc. La séléctivité de ces milieux est comparable ou améliorée par rapport à celle des milieux connus. Les milieux de l'invention peuvent permettre un taux de recouvrement des Salmonella souvent supérieur à celui des milieux commercialisés, et cette supériorité est accentuée lorsque les bactéries sont stressées. Les milieux de l'invention présentent en outre l'avantage de nécessiter des quantités moindres d'inhibiteur(s) par comparaison avec les milieux usuels. De plus, ils permettent, spécifiquement la détection de souches de Salmonella soumises à un stress. En ce qui concerne la détection de bactéries stressées, le taux de recouvrement de Salmonella soumises à un stress s'est avéré, avec le milieu de l'invention, au moins équivalent à la gélose TCS. Les milieux de l'invention présentent de ce fait un grand intérêt dans la recherche et le dénombrement des Salmonella ayant subi un stress. En effet, les bactéries sont soumises à divers stress dans leur environnement et dans les matières qu'elles contaminent: variations de température (congélation, chauffage, notamment avec les produits alimentaires), manque de nutriments, taux d'humidité, stress oxydation, stress osmotique, par exemple, et, comme pour de nombreuses bactéries à Gram négatif, ces conditions défavorables peuvent induire le passage des Salmonella notamment à l'état de bactéries viables non cultivables qui les rend indétectables sur des milieux de culture standards, sauf à certaines conditions favorables qui permettent aux bactéries d'être revivifiées. Les bactéries viables non cultivables ne sont pas détectables, mais pourraient conserver et recouvrer leur pouvoir infectieux dans des conditions favorables telles que la lumière intestinale. La capacité du milieu selon l'invention à revivifier certaines bactéries, dont les Salmonella, viables non cultivables présente surtout un intérêt pour la recherche desdites bactéries dans les aliments et l'eau, en s'affranchissant de la phase de pré-enrichissement préconisée par la norme NF EN ISO 6579. Comme souche bactérienne à cultiver on peut citer toute souche susceptible d'utiliser la source de carbone et d'énergie selon l'invention, c'est-à-dire toute souche assimilant le 3-HB et/ou le gentisate et/ou leurs précurseurs et dérivés. De telles souches sont notamment Citrobacter spp. dont diversus et freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, mais aussi, Escherichia coli, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, Serratia marcescens ou Serratia fonticola. De plus, les entérobactéries et Pseudomonas spp et Burkholderia cepacia peuvent être citées. Ainsi on cite particulièrement selon l'invention, à titre de bactérie à cultiver, isoler ou enrichir, les bactéries choisies parmi Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, les Escherichia coli et autres entérobactéries Selon l'invention, les souches Salmonella sont plus particulièrement visées. Il s'agit selon l'invention de façon encore préférée de tous les sérotypes ou sérovars de Salmonella enterica et notamment les sérotypes Typhimurium, Enteriditis, Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Virchow, Hadar, Agona, par exemple, à l'exception du sérotype Gallinarum. Par milieu inorganique minimum selon l'invention, on entend un milieu ne contenant pas d'aliments organiques carbonés assimilables. En l'absence de ces aliments, aucune bactérie ne peut cultiver, et si une source de carbone et d'énergie unique y est rajoutée, seules les bactéries capables de l'assimiler peuvent cultiver. Par exemple, le milieu inorganique M70, utilisé par Véron (1) pour étudier l'assimilation de diverses sources d'énergie, est un tel milieu minimum. Il est constitué de trois solutions inorganiques: une solution d'oligo-éléments, une solution Phosphore-Calcium-Magnésium et la base azotée et sera décrit ci-après. Toutefois, tout autre milieu inorganique minimum, ne contenant sensiblement pas d'aliment organique carboné assimilable par la souche à 20 cultiver, est utilisable selon l'invention. Comme source de carbone ou d'énergie assimilable par la souche bactérienne à isoler, identifier ou dénombrer, on utilise selon l'invention principalement le 3-hydroxybenzoate, ses dérivés, ou tous autres précurseurs ou dérivés du gentisate ou ses dérivés tels qu'ils peuvent être mis en oeuvre dans la voie de transformation suivante: 3-HB ou autre précurseur du gentisate > gentisate méthylpyruvate -* furmarate et pyruvate de gentisate. Le gentisate (2,5-dihydroxybenzoate), composé issu du métabolisme du 3-HB, est en effet lui aussi assimilable par certaines souches bactériennes telles que les Salmonella. Ainsi, on peut aussi utiliser le gentisate à titre de source de carbone et d'énergie, ou en mélange avec un précurseur de gentisate. Et, à titre de précurseur du gentisate, on peut citer le 3HB ainsi que ses dérivés. Parmi les dérivés, on peut citer toute forme chimique ou substance susceptible de se trouver sous forme de gentisate, de 3-HB, au pH final du milieu, capable de se transformer spontanément ou par l'entremise d'un catalyseur ou d'une enzyme ou de conditions physicochimiques ou par transformation bactérienne, en gentisate ou en 3-HB. On peut envisager aussi tout produit naturel ou synthétique riche en 3-HB, par exemple un polymère synthétique se dégradant en 3-HB ou en gentisate. Selon l'invention, les concentrations en gentisate et/ou en 3-HB sont supérieures à 0,1 g/I, de préférence environ 0,5 g/I. Par ailleurs, elles sont de préférence inférieures à 5 g/I, de préférence environ 2 g/I. Ainsi, de préférence de l'ordre de 0,1 à 5 g/I de 3-HB, de façon préférée, elles sont de l'ordre de 0,5 g/I à 2 g/I, de façon encore préférée de l'ordre de 0,8 à 1,2 g/I. En outre, les milieux de l'invention peuvent comporter un ou plusieurs inhibiteurs. Ils permettent d'améliorer la sélectivité du milieu. Toutefois, pour l'enrichissement, par exemple, un milieu liquide (sans gélose) selon l'invention peut ne pas comporter d'inhibiteur. A titre d'inhibiteur, on peut citer les sels biliaires, le désoxycholate de sodium, les détergents, les antibiotiques, certains sels de thallium, dont le sulfate thalleux, ainsi que les colorants, et leurs mélanges. Comme détergent, on peut citer par exemple le Tergitol 4 et le Tween 20. Comme antibiotique, on peut citer la novobiocine, la cefsulodine et leurs mélanges. Comme exemple de colorants, on peut citer les colorants du type triphénylméthane, notamment le diaminotriphénylméthane, et aussi en particulier le vert brillant et le vert malachite, le violet de gentiane, la fuchsine acide, ainsi que leurs mélanges. Toutefois, d'autres inhibiteurs peuvent convenir, qui inhibent la 30 croissance des souches bactériennes non recherchées, notamment celles qui assimilent la source de carbone et d'énergie de l'invention. L'inhibiteur peut ainsi être choisi parmi les inhibiteurs de la flore Gram positif et/ou des bactéries Gram négatif distinctes de la souche bactérienne à cultiver. Un avantage particulier des milieux selon l'invention réside dans le fait que, compte tenu de la nature du milieu de base inorganique minimum, les doses d'inhibiteurs utilisées peuvent être très réduites dans certains cas par rapport aux doses utiles dans les milieux connus, par exemple dans le milieu de Kristensen, le milieu au vert brillant (usuellement12, 5mg) et le miliu novobiocine-vert brillant-glycérol-lactose (usuellement 7 mg/I). Parmi les inhibiteurs préférés, on peut citer le vert brillant et le sulfate thalleux et leurs associations. Le sulfate de thallium a pour objet d'inhiber les bactéries à Gram négatifs aérobies strictes, comme Pseudomonas et les Burkholderia et le vert brillant des entérobactéries comme E.coli. Les doses préférées sont par exemple d'environ 1 à 3 mg/I de vert brillant, de préférence environ 1,5 à 2,5 mg/I, et de 0,02 à 0, 002 g/I de sulfate thalleux, de préférence 0,008 à 0,015 g/I, de préférence environ 0,01 g/I. De plus, selon un aspect de l'invention, on peut ajouter au milieu minimal au moins un facteur de croissance. Les facteurs de croissance accélèrent la revivification et sont utiles notamment pour la croissance des sérotypes auxotrophes. C'est ainsi le cas notamment, pour certaines souches bactériennes auxotrophes, comme le sont Salmonella Enteridis 64K,ou Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A ou encore le sérotype Gallinarum. Cependant, si l'on souhaite n'isoler que les souches transmises par les aliments, il n'est pas indispensable d'utiliser un tel facteur de croissance. On peut par exemple réaliser un simple préenrichissement, sans utiliser de facteur de croissance. La concentration optimale d'un facteur de croissance ou de l'association de plusieurs facteurs doit être suffisamment faible pour que la croissance bactérienne soit insignifiante en l'absence d'une autre source de carbone et d'énergie utilisable, comme le 3-HB ou tout autre précurseur de gentisate. Ainsi, la concentration est minimale pour éviter qu'il constitue une source de carbone, ce qui diminuerait la séléctivité. Elle est selon l'invention choisie pour être inférieure à la concentration permettant la croissance sans autre source de carbone. A titre de facteur de croissance, on peut utiliser par exemple un facteur de croissance choisi parmi les acides aminés, les vitamines, les purines, les hydrolysats de protéines et les extraits de levure, et leurs mélanges. On peut utiliser tout produit capable de fournir au milieu les aminoacides nécéssaires. Par exemple, on peut utiliser un hydrolysat de caséine, usuellement appelé casaminoacide, mais d'autres hydrolysats de protéine ou mélanges d'aminoacides sont également utilisables, éventuellement supplémentés de cystéine, particulièrement de L-cystéine. Par exemple, on peut utiliser de 0 à 200 mg/I de milieu de casaminoacide, de préférence jusqu'à environ 100 mg/I, de façon encore préférée environ 50mg/I, en présence de 0 à 200 mg/I de L-cystéine HCI monohydrate, de préférence jusqu'à environ 100 mg/I, de façon encore préférée environ 25 à 52 mg/I, soit 18 à 36mg/I de milieu de Cystéine pure. De plus, les milieux de l'invention peuvent comporter des substrats chromogènes, qui permettent de mettre en évidence des activités enzymatiques spécifiques des souches cultivées ou isolées. L'ajout d'un tel substrat qui met en évidence une activité spécifique de la souche à étudier permet d'améliorer la discrimination Salmonella/ non-Salmonella. A titre de substrat chromogène, on peut citer les substrats du type du bromure de l'acide 4-[2-(4-octonoyloxy-3,5-diméthoxyphényl)-vinyl]quinolinium-1-propan-3-yl-carboxylique (SLPA-octanoate), le 5-bromo-4chloro-3-indoxyl-caprylate (X-caprylate), le 5-bromo-4-chloro-3indoxylalpha-D-galactopyranoside (X-alpha-D-gal) ou, pour colorer des espèces non-Salmonella, le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside (X-beta-D-gal ou X-gal), par exemple. Le radical 5bromo-4-chloro-3- indoxyl (X, couleur bleue après hydrolyse) peut être remplacé par 3-indoxyl (Y, autre couleur bleue après hydrolyse) ou 5bromo-6-chloro-3-indoxyl (Magenta, couleur magenta après hydrolyse) ou 6chloro-3-indoxyl (Salmon, couleur rose après hydrolyse) ou 5-iodo-3indoxyl (lodo, couleur pourpre après hydrolyse) ou N-méthylindoxyl (Green, couleur verte après hydrolyse) ou 4-méthylumbelliféryl (4-MU, fluorescence bleue après hydrolyse), indoxyl étant ici synonyme d'indolyl. Ainsi, selon l'invention, on peut utiliser notamment un substrat chromogène choisi parmi les substrats X-caprylate, X-alpha-D- galactopyranoside, X-beta-D- galactopyranoside ou X-galactopyranoside, où X- représente le groupe 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-, X- pouvant être remplacé par 3-indoxyl-, 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl-, 6-chloro-3-indoxyl- , 5-iodo-3-indoxyl-, N-méthylindoxyl- ou 4-méthylumbelliféryl-, et leurs mélanges. Les substrats peuvent être ajoutés à la gélose fondue ou avant stérilisation à l'autoclave. Leur concentration dépend du milieu et de l'intensité de la coloration souhaitée, des produits et des utilisations et des modes de détection des couleurs générées. Elle peut être choisie de l'ordre de 100mg/I environ. A titre d'exemple, pour les chromogènes comportant le groupe 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- la concentration peut être de l'ordre de 0,05 à 2 g/I de milieu, de préférence environ 0,1 g/I. Pour les substrats du type du 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate et du 5bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-galactopyranoside, à titre d'exemple, la concentration peut être choisie entre environ 0,1 et environ 0,4 g/I. Bien entendu, les concentrations dans les divers constituants cités cidessus dépendent des constituants spécifiques, des conditions d'utilisation et de mise en oeuvre, et l'homme de l'art adaptera. Les milieux de l'invention sont préparés de façon usuelle par dissolution et/ou addition à un milieu de base défini ci-dessus des additifs cidessus. La façon d'incorporer les additifs au milieu ou base n'est pas restrictive. Les additifs solubles dans l'eau sont ajoutés en solution aqueuse stérile, mais les additifs peuvent aussi être ajoutés en solution dans un solvant aqueux adéquat. A titre d'exemple, on peut citer un milieu comprenant, dans le milieu de Véron, ou tout autre milieu synthétique minimum, nécessitant une source de carbone et d'énergie et outre du 3 HB à raison de 0,2 à 2g/l, de préférence 0,5 à 1,5 g/I, de façon préférée environ 1 g/I, des casaminoacides à raison de 0 à 100mg/I, de préférence 50 à 100 mg/I, de façon préférée environ 50 mg/I, de la L-cystéine sous forme chlorhydrate monohydrate à raison de 0 à 100 mg/I, de préférence 26 à 52 mg/I, de façon préférée environ 26mg/I, du vert brillant AcBg-14 à raison de 1 à 2, 5 mg/I, de préférence environ 1,5 mg/I, et du sulfate de thalleux à raison de 0 à 0,025g/l, de préférence 0,01 à 0,025 g/I, de façon préférée environ 0,01 g/I. Les milieux de culture peuvent se présenter selon l'invention sous forme liquide ou encore sous une forme solide, dans le cas où un véhicule gélifié est utilisé, en fonction de leur utilisation ultérieure. Ainsi, pour l'enrichissement de culture, le milieu est usuellement sous forme liquide, alors que pour l'isolement et l'identification, celui-ci se présente usuellement sous forme solide ou semi-solide, usuellement sur gélose. Toutefois, tout autre véhicule gélifié usuel est utilisable selon l'invention. Les milieux selon l'invention peuvent être utilisés dans les mêmes conditions de pH et température que les milieux usuels. Ces milieux de culture sont notamment utile pour l'isolement spécifique des Salmonella et d'autres bactéries Gram négatif, et peuvent être utilisés à la recherche de germes dans de nombreux prélèvements. Par le choix des inhibiteurs appropriés, on peut envisager l'inhibition des bactéries Gram négatif aérobies strictes et des entérobactéries comme E. coil. Sans inhibiteurs de cette bactérie, ils peuvent en outre être utiles à l'enrichissement de certaines souches bactériennes, notamment E. coli, en plus de celui de Salmonella. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples ci dessous. EXEMPLES I Matériel et Méthodes SOUCHES ETUDIEES souches bactériennes ont été utilisées: 34 Salmonella enterica subsp. enterica, 13 entérobactéries non-Salmonella, et 8 non-entérobactéries, toutefois voisines par leur habitat et certaines caractéristiques culturales et biochimiques. Elles proviennent des collections de l'Unité de Biodiversité des Bactéries Pathogènes Emergentes de l'Institut Pasteur (BBPE), du Centre National de Référence des Salmonella (CNR), ou du Centre Collaborateur OMS pour les Salmonella (CCOMS). Il s'agit, pour certaines, de souches types ou de souches historiques de Kauffmann. Les souches sont conservées en gélose de conservation décrite plus loin. Après réensemencement sur gélose Trypto-caséine-soja (TCS) ou Drigalski, l'identité et la pureté des souches a été confirmée par les tests adéquats. Pour l'étude, une culture-mère de chacune de ces souches est obtenue sur gélose TCS en pente, conservée à température ambiante, et des repiquages réguliers sont réalisés. De plus, pour une partie des souches, leur capacité à utiliser le 3-20 hydroxybenzoate (3-HB) comme substrat carboné a été étudiée en inoculant des galeries d'identification Biotype-100 (BioMérieux). La liste des souches est détaillée dans les tableaux I, Il et Ill cidessous où figurent également leur provenance, leur capacité à utiliser le 3-HB, et les essais pour lesquels elles ont été utilisées. Une gélose de conservation de composition suivante a été utilisée: Peptone de caséine de viande E2 10g Chlorure de sodium 3 g Extrait de viande 4 g Bacto agar 12 g NaOH pH = 7,2 Eau distillée Qsp 1 I Tableau I: Souches de Salmonella enterica subsp. enterica ESSAIS2 Utilisation Mise au du 3-HB point du Evaltionua- milieu Enteritidis 64K (ATCC 13076) CCOMS + + 297/67 CCOMS + + + 1281/04 CNR + + 1299/04 CNR + - + 1384/04 CNR + - + 1397/04 CNR + - + 1538/04 CNR + - + Typhimurium LT2 (ATCC 43971) BBPE + + + 58.58T (ATCC 13311) CCOMS + + + 1327/04 CNR + - + 1333/04 CNR + - + 1366/04 CNR + - + 1400/04 CNR + - + 1526/04 CNR + - + Virchow 41K CCOMS + - + 1396/04 CNR + - + Hadar 473K CCOMS + - + 1368/04 CNR + - + Typhi Ty2 (ATCC 19430) CNR + + + 57K CCOMS + + - 2963/03 CNR + - + Newport 50K CCOMS + - + 1363/04 CNR + - + 1534/04 CNR + - + Infantis 158K CCOMS + - + Brandenburg 24K CCOMS + - + Derby 20K CCOMS + - + AÉona 1137/72 CCOMS + -+ Heidelberg 16K CCOMS + + Napoli 173K CCOMS + + Dublin 65K CCOMS + + Indiana 573K CCOMS + + Sérotype Souche Source Paratyphi B 5K Java CCOMS + - + Gallinarum 9727/03 CNR - - + 1 Symboles: +, utilisation du 3-HB; -, non-utilisation. 2 Symboles: +, utilisation de la souche au cours de l'essai; -, souche non testée. Tableau II: Souches d'Entérobactéries ESSAIS2 Utilisation Mise au Source du 3-HB1 point du milieu Souche Evalua- tion Escherichia coli 54.8T (ATCC 11775) E. col/ 0103 H I8 E. coli 0103 PMK1 E. coli 0103 PMK3 E. colt 0103 PMK4 Citrobacter freundii 57.32T Citrobacter koseri (diversus) 82.94T Enterobacter aerogenes 60.86T Enterobacter cloacae 60.85T Klebsiella pneumoniae SB107 Klebsiella oxytoca SB136 Proteus mirabilis PR14 Serratia marcescens 103235 BBPE - + BBPE - + BBPE + + BBPE + + BBPE + + BBPE + + BBPE + + BBPE + + BBPE - + -, souche non + + + + BBPE BBPE BBPE BBPE 1 Symboles: +, utilisation du 3-HB; -, non utilisation. 2 Symboles: +, utilisation de la souche au cours de l'essai; testée. + + + 22 Tableau Ill: Souches des non-Entérobactéries ESSAIS2 Source Utilisation Mise au Evalua- du 3-HB1 point du tion milieu Staphylococcus aureus 65.8T BBPE ND3 + Enterococcus faecalis BBPE ND + 103015T Bacillus cereus 66.24T BBPE ND + Pseudomonas aeruginosa BBPE _ + LMG 1242 T Pseudomonas aeruginosa BBPE + Burkholderia cepacia LMG BBPE + + - 6889 Burkholderia cepacia 103277 BBPE + + + Symboles: +, utilisation du 3-HB; - , non utilisation. 2 Symboles: +, utilisation de la souche au cours de l'essai; -, souche non testée. ND: non déterminée A) MILIEU DE BASE: COMPOSITION, PREPARATION Le milieu inorganique M70 de Véron (1), a été utilisé comme base, le 3-HB y étant ajouté comme unique source de carbone et d'énergie, et de l'extrait de levure comme facteur de croissance, pour les souches auxotrophes. Ce milieu d'étude a été préparé à partir de trois solutions distinctes suivantes: solution d'oligo-éléments (0E) : Souche H3PO4 1,9600 g FeSO4, 7H2O 0,0556 g ZnSO4, 7H2O 0,0287 g MnSO4, 4H2O 0,0223 g CuSO4, 5H2O 0, 0025 g Co(NO3)2, 6H2O 0,0030 g H3BO3 0,0062 g Eau distillée stérile Qsp 1000 ml La solution obtenue par dissolution a été stérilisée par filtration stérilisante (filtre de 0,22p). Elle a été conservée au réfrigérateur, à +4 C. Pour des raisons pratiques, il est également possible de préparer cette solution dix fois plus concentrée des mêmes composants. Cette solution OE rentre dans la composition de la solution A décrite ci-après. Solution A: CaCl2, 2H2O MgSO4, 7H2O KH2PO4 K2HPO4 Solution d'oligoéléments OE Acide 3-hydroxybenzoïque (Fluka)* Extrait de levure (Difco)* Eau distillée stérile *Non présent dans le milieu M70 original. 0,0147 g 0,123 g 0,680 g 2,610 g ml (ou 1 ml d'une solution dix fois concentrée) 1,0 g 0,1 g Qsp 500 ml Après dissolution complète des différents composés, le pH de la solution A a été ajusté à 7,2. A ce pH, l'acide 3-hydroxybenzoïque est neutralisé et se trouve sous forme de 3hydroxybenzoate. La solution a alors été stérilisée par filtration stérilisante sur un filtre de 0,22 p ou en l'autoclavant 20 minutes à 110 C. Un aspect trouble de la solution à la sortie de l'autoclave ne modifie pas la qualité du milieu. solution B: NaCl 7 g (NH4)2SO4 1 g Agar (Difco) 15 g Eau distillée Qsp 500 ml Le pH de cette solution est ajusté à 7,2. Elle a ensuite été chauffée sur une plaque chauffante jusqu'à dissolution complète de I'agar. Elle a été 10 autoclavée 20 minutes à 110 C. Après stérilisation, les solutions A et B ont été maintenues à une température de 50-60 C, en évitant une prise en masse de la solution de gélose B. Elles ont ensuite été mélangées aseptiquement, donnant ainsi un litre de milieu. Après homogénéisation, celui-ci a été coulé en boîtes de Petri (20 ml dans des boîtes rondes de 9 mm de diamètre, 70 ou 80 ml dans des boîtes carrées 12*12 cm). Les boites ont été conservées à +4 C jusqu'à utilisation. Pour obtenir la forme liquide, on mélange: NaCl (NH4)2SO4 CaCl2, 2H20 MgSO4, 7H20 KH2PO4 K2HPO4 Solution OE 3-hydroxybenzoate casaminoacides Lcystéine HCI H2O Vert brillant AcBg-14 20 25 30 7g 1g 0,0147 g 0,123 g 0, 680 g 2,610 g ml (ou 1 ml de concentré x 10) 1g 0,05 g 0,026 g 0,0015 g Sulfate thalleux Eau distillée 0,01 g qsp 1 litre pH 7,2 B) MILIEU SELECTIF DE SALMONELLA SELON L'INVENTION Les produits incorporés dans le milieu de culture ci-dessus sont ajoutés à la solution A sous un faible volume d'une solution concentrée stérile de ces produits. 1.1 Inhibiteurs 1.1.1 Produits L'activité inhibitrice de différents produits sur des bactéries listées plus haut, a été testée dans le but de réduire la croissance des non-Salmonella. L'effet inhibiteur a été testé pour des concentrations croissantes de produit. II s'agit des produits suivants utilisés dans les gammes de concentration respectives dans le milieu final. Vert brillant AcBg-14 certifié commercialisé par Sigma (B-4014) : 0,25 à 5 mg/I (et 5 à 25 mg/I) Sulfate thalleux comm. par Fluka (88290) : 0,05 à 1 g/I 1.1.2 Méthode d'étude Le pouvoir inhibiteur des différents produits a été déterminé par une technique de gradient: le milieu de culture contenant l'inhibiteur est coulé en boîte de Petri carrée (12*12 cm) de façon à créer un gradient de concentration au sein de la gélose. 1.1.2.1 Préparation des milieux Les solutions A et B sont préparées comme décrit plus haut. Par ailleurs, des solutions stock des différents inhibiteurs ont été préparées en eau distillée et stérilisées par filtration sur filtre unitaire de 0,22p (ex: 25 mg de vert brillant dans 10 ml d'eau) . A la solution A, a été ajouté l'inhibiteur sous un volume minimum. On a préparé ainsi une solution A à la plus faible concentration d'inhibiteur testée (ex: 0,25 mg/I de vert brillant soit 0,1 ml de la solution stock pour 1 litre de milieu) et une autre à la plus forte concentration (ex: 5 mg/I de vert brillant soit 2 ml pour 1 litre de milieu). Pour reproduire le gradient, on a coulé en pente une première couche concentrée de gélose (40 ml). Après séchage, une deuxième couche diluée (40m1) a été coulée par-dessus. La gélose obtenue a été mise à sécher sous hotte pendant 30 minutes environ et ensemencée dans l'heure. 1.1.2.2 Méthode d'inoculation A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, une suspension bactérienne de chaque souche testée a été préparée dans 5 ml d'eau distillée stérile. Cette suspension a été calibrée à 0.5 MacFarland, à l'aide d'un densitomètre. L'ensemencement a été réalisé en strie à l'aide d'une cese de 1 pl, du côté le plus concentré vers le plus dilué. Les boites ont alors été mises à incuber à 37 C pendant 48h à 4 jours. En parallèle, deux témoins ont été ensemencés: un TCS, témoin de culture, et un milieu M70 dépourvu d'inhibiteur, pour différencier l'effet de l'inhibiteur de celui du milieu minimum. L'ensemencement et l'incubation ont été réalisés dans les mêmes conditions. La lecture des résultats a été faite à 18, 24, 48h et 4 jours. On a noté : la densité de culture (0, absence, à +++, très bonne) et longueur de la strie à partir du bord dilué, de laquelle on a déduit la concentration inhibitrice pour chaque souche testée, par approximation. Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.1.). 1.2 Facteurs de croissance 1.2.1 Produits Trois facteurs de croissance ont été testés, en complément de l'extrait de levure, aux concentrations suivantes respectives: L-cystéine (sous forme de chlorhydrate monohydrate; Prolabo) : 18 et 36 mg/I de cystéine pure (soit 26 et 52 mg/I de cystéine, HCI, H2O) Casamino-acides (Difco) : 25, 50, 100, 200 et 300 mg/I (hydrolysat de caséine). Ont été étudiés l'effet de la L-cystéine seule, et celui des casaminoacides seuls, ou associés à la cystéine. 1.2.2 Méthode d'étude 1.2.2.1 Préparation des milieux Les solutions A et B ont été préparées et stérilisées comme décrit ci-dessus. Des solutions stocks concentrées des deux acides aminés ont été préparées et stérilisées par filtration sur filtre unitaire de 0,22 p. Elles ont été conservées à +4 C et à l'abri de la lumière. Un faible volume de ces solutions a été ajouté à la solution A (de façon à obtenir la quantité finale désirée) puis A est mélangée à B. Les casamino-acides ont été directement incorporés à la quantité voulue dans la solution A, avant stérilisation. Pour chaque facteur de croissance testé, 70 ml des milieux ainsi constitués (35 ml de A supplémenté + 35 ml de B) sont coulés dans des boites de Petri carrées 12*12 cm, puis séchés sous hotte. Ces boîtes ont été conservées à +4 C jusqu'à utilisation. De plus, des milieux M70 supplémentés en facteurs de croissance (aux quantités testées) mais dépourvus de 3-HB ont été préparés. Par comparaison de ces cultures avec celles des milieux contenant de 3-HB, on a déterminé les concentrations de facteur(s) de croissance pour lesquelles la croissance reste insignifiante en l'absence de source carbonée. 1.2.2.2 Méthode d'inoculation A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, une suspension bactérienne de chaque souche testée a été préparée dans 5 ml d'eau distillée stérile. Cette suspension a été calibrée à 0.5 MacFarland, à l'aide d'un densitomètre. Chaque suspension a été ensemencée en cadran à l'cese de 1 pI. Une boite subdivisée en 6 cadrans permet l'étude de 6 souches par boite. En parallèle, des témoins ont été inoculés: un TCS (témoin de culture), un témoin M70/3-HB sans facteur de croissance. Les boîtes ont été mises à incuber à 37 C pendant 48h voire 4 jours. La lecture a été réalisée à 24, 48h voire 4 jours, en notant la densité de culture (0, absence, à +++, très bonne), par comparaison aux témoins. Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.2.). 1.3 Concentrations d'inhibiteurs utiles Pour des taux définis de facteurs de croissance, on a déterminé les concentrations en inhibiteur utilisables par l'évaluation du taux de recouvrement ou efficiency of plating (eop) du milieu aux concentrations suivantes: vert brillant: 1 1,5 2 2,5 mg/I; sulfate thalleux: 0,01 et 0,025 g/l; les deux associés. Il s'agit d'une méthode de dénombrement en surface. 1.3.1 Préparation des milieux Les milieux ont été préparés comme décrits ci-dessus, supplémentés en facteurs de croissance et en inhibiteurs. Ils ont été coulés en boite de Petri rondes de 9 cm (20 ml par boite). Des témoins dépourvus d'inhibiteurs ont également été préparés. Les boîtes ont été conservées à +4 C jusqu'à utilisation, et séchées sous hotte. 1.3.2 Méthode d'inoculation A partir d'une culture de 24h sur gélose TCS en pente, un bouillon TCS a été ensemencé à l'aide d'une cese et mis à incuber 18h à 30 ou 37 C. Ce bouillon a été alors dilué de dix en dix dans 9 ml d'eau distillée stérile jusqu'à la dilution 10-7. Pour obtenir la dilution 10-1, on dilue 1 ml au bouillon initial dans 9 ml d'eau distillée; pour obtenir la dilution 10-2, 1 ml de la dilution 10-1 est dilué dans 9 ml d'eau distillée, etc. Cette dilution dans l'eau est suffisante pour éviter l'apport de nutriments du bouillon initial lors de l'inoculation du milieu minimum. Les dilutions 10-4 à 10"6 ou 10-5 à 10* Pour obtenir la dilution 10-1, on dilue 1 ml du bouillon initial dans 9 ml d'eau distillée; pour obtenir la dilution 10-2, 1 ml de la dilution 10-1 selon les souches, ont été ensemencées, à raison de 100p1, sur les différents milieux et les témoins TCS et M70/3-HB sans inhibiteurs. Ces 100 pl ont été étalés au râteau stérile sur toute la surface de la boite, jusqu'à absorption complète, pour un ensemencement homogène. L'opération a été effectuée en duplicat. Les boites ont été mises à incuber 48h à 37 C. Le dénombrement des colonies a été fait après 24h et 48h. Pour chaque duplicat dont le nombre de colonies était compris entre 15 et 300, la moyenne des colonies a été calculée et comparée à la moyenne obtenue sur TCS. L' efficiency of plating (eop) a été déterminée en calculant le rapport du nombre des colonies dénombrées sur le milieu testé sur le nombre des colonies dénombrées sur TCS. Par ailleurs, ont été relevées la vitesse de culture et la taille des colonies. Les résultats sont donnés ci-dessous (II) (1.3.). 1.4 Milieu sélectif de l'invention et comparaison avec d'autres milieux 1. 4.1 Milieu M70 au 3-hydroxybenzoate (M70/3-HB) selon l'invention Il s'agit du milieu de base M70/3-HB ci-dessous auquel ont été ajoutés le ou les inhibiteurs, le ou les facteurs de croissance, aux concentrations suivantes. Ce milieu a été préparé en boites de Petri rondes (9 cm de diamètre soit 20 ml de milieu) et conservé à +4 C jusqu'à utilisation. Le milieu M70/3-HB optimisé comprend, en plus du milieu de base décrit au paragraphe I A, des casamino-acides (0,050 g/I), de la L-cystéine (sous forme de chlorhydrate monohydrate; 26 mg/I), du vert brillant AcBg-14 (1, 5 mg/I), et du sulfate thalleux (0,01 g/I). Les casamino-acides (50 mg de poudre) et la L-cystéine (5 ml d'une solution stock à 5,2 mg/mi de L-Cys, HCI, H2O) sont ajoutés à 500 ml de solution A non stérile (qsp 1 litre de milieu). Le vert brillant (1,5 ml d'une solution stock stérile à 1 mg/ml) et le sulfate thalleux (1 ml d'une solution stock stérile à 0,01 g/ml) sont additionnés à la solution A stérile. La gélose coulée obtenue est translucide et bleu ciel. 1.4.2 Conditions de culture Pour une croissance optimale en nombre et en taille des Salmonella, et une inhibition des autres espèces, le milieu inoculé doit être incubé pendant 48h à 37 C. Préparation On prépare une solution A de composition: CaCl2, 2H2O 0,0147 g MgSO4, 7H2O 0,123 g KH2PO4 0,680 g K2HPO4 Solution d'oligo-éléments * Acide 3-hydroxybenzo'ique (Fluka) Extrait de levure (Difco) Casaminoacides (Difco) L-cystéine, HCI, H2O (Prolabo) Vert brillant AcBg-14 (Sigma) Sulfate thalleux (Fluka) Eau distillée stérile 2,610 g ml (ou 1 ml d'une solution dix fois concentrée) 1,0 g 0,1 g 0,050 g 0,026 g soit 5 ml d'une solution à 3,6 mg/mi 0,0015 g soit 1,5 ml d'une solution à 1 mg/mi 0,010 g soit 1 ml d'une solution à 0,01 g/ml Qsp 500 ml la solution d'oligo-éléments* ayant la même composition que celle qui est décrite cidessus dans le milieu de base. Solution B: cette solution est identique à celle qui est décrite plus haut pour le milieu de base. Sous agitation magnétique on a dissous les constituants de la solution A, exceptés le vert brillant et le sulfate thalleux; on a ajusté le pH à 7, 2 0,2 à 25 C. On a stérilisé la solution obtenue par filtration sur un filtre Stéricup 0,22p. On a ajouté 1,5 ml d'une solution stock stérile de vert brillant à 1,5 mg/ml et 1 ml d'une solution stock stérile de sulfate de thallium à 0,01 g/ml, ces solutions stocks ayant été préparées séparément et stérilisées par filtration sur filtres unitaires de 0,22p. On a préparé la solution B dans un flacon stérile de 1 litre en dissolvant les produits sous agitation magnétique et en ajustant le pH à 7,2 0,2 à 25 C. La solution obtenue a été chauffée sur plaque chauffante, jusqu'à ce que la gélose soit complètement dissoute. On a stérilisé cette solution à l'autoclave, pendant 20 minutes à 110 C. Maintenus à une température de 50 à 60 C, 500 ml de A ont été mélangés aux 500 ml de B. On a alors coulé en boites de Petri, les boîtes coulées obtenues étant bleues et translucides. Avant inoculation, les boîtes ont été séchées, par passage 15 à 30 minutes sous hotte ou à l'étuve. On a conservé et stocké les boîtes au réfrigérateur (12h à température ambiante). On a réalisé la culture des Salmonella et l'inhibition des autres espèces par incubation du milieu inoculé pendant 48h à 37 C. 1.4.3 Autres milieux L'évaluation du milieu final a été réalisée par comparaison au TCS et aux milieux connus sélectifs des Salmonella suivants. Hektoen Enteric agar commercialisé par BioRad (64584) ou Merck (1.11681) Salmonella-Shigella agar ou SS Merck commercialisé par (1.07667) XyloseLysine-Désoxycholate agar ou XLD par Merck (1.05287) Xylose-LysineTergitol 4 agar ou XLT4 par Merck (1.13918) Rambach agar commercialisé par Merck (1.07500) Trypto-caséine-soja (TCS) commercialisé par BioRad. Ces milieux ont été préparés selon les instructions des fabricants. Ils ont été coulés en boites de Petri rondes (20 ml par boîte) et conservés à +4 C jusqu'à utilisation, et la composition des différents milieux est la suivante: Hektoen enteric agar Peptones 15 g Saccharose 14 g Lactose 14 g Salicine 2 g Chlorure de sodium 5 g Thiosulfate de sodium 5 g Citrate ferrique ammoniacal (III) 1,5 g Sels biliaires 2 g Bleu de bromothymol 0, 05 g Fuschine acide 0,08 g Agar 13,5 g Eau distillée Qsp 1 I Salmonella Shigella agar (SS) Peptones 10g Lactose 10 g Bile de boeuf desséchée 8,5 g Citrate de sodium 10 g Thiosulfate de sodium 8,5 g Citrate ferrique 1 g Vert brillant 0,0003 g Rouge neutre 0,025 g Agar 12 g Eau distillée Qsp 1 Xylose-Lysine-Désoxycholate (XLD) D-xylose 3,5 g L-lysine 5 g Lactose 7,5 g Saccharose 7,5 g Chlorure de sodium 5 g Extrait de levure 3 g Désoxycholate de sodium 2,5 g Thiosulfate de sodium 6,8 g Citrate de fer ammoniacal 0,8 g Rouge de phénol 0,08 g Agar 13,5 g Eau distillée Qsp 1 1 Xylose-Lysine-Tergitol 4 (XLT4) Protéose peptone 1,6 g Extrait de levure 3 g L-lysine 5 g D-xylose 3,75 g Lactose 7,5 g Saccharose 7,5 g Citrate de fer III ammoniacal 0,8 g Thiosulfate de sodium 6,8 g Chlorure de sodium 5 g Rouge de phénol 0,08 g Agar 18 g Supplément Tergitol 4 4,6 ml Eau distillée Qsp 1 I Rambach agar Peptone 8 g Chlorure de sodium 5 g Désoxycholate de sodium 1 g Mélange chromogène 1,5 g Propylène 10,5 g Agar 15 g Eau distillée Qsp 1 1 Trypto-caséine-soja (TCS) Hydrolysat trypsique de caséine 15g Peptone de soja 5 g Chlorure de sodium 5 g Agar 15g Eau distillée Qsp 11 1.5 Méthode d'évaluation Inoculation L'évaluation du milieu M70/3-HB a été réalisée en comparant I' efficiency of plating de ce milieu par rapport à celle des autres milieux, selon la méthode de dénombrement ci-dessus. Pour un maximum de souches, à partir d'un bouillon de 18h, des dilutions en eau distillée stérile ont été réalisées. Les dilutions 10-4 à 10-7 sont ensemencées par étalement au râteau sur les 7milieux, en duplicat. Après 24 à 48h d'incubation à 37 C, les colonies sur chacune des boîtes ont été dénombrées et l'aspect et la taille des colonies a été relevée. L' efficiency of plating a été déterminée par rapport à la gélose TCS. 1.6 Essai sur des bactéries stressées Deux souches de Salmonella enterica subsp. enterica; de Sérotype Enteritidis 1299/04 et de Sérotype Typhimurium 1366/04 ont été soumises à un stress réalisé comme indiqué cidessous. L'efficacité du milieu M70/3-HB a été étudiée sur ces souches stressées en évaluant I' efficiency of plating , comparée aux divers autres milieux. 1.6.1 Epreuve de stress Un bouillon TCS a été ensemencé et incubé 18h à 37 C. Sous hotte, 50 pl de ce bouillon ont été déposés sur deux lamelles en verre, dégraissées, stériles (50 pl par lamelle). Les deux lamelles ont été séchées sous le flux de la hotte jusqu'au séchage complet. Les lamelles séchées ont été mises dans 10 ml d'eau distillée stérile et le tout a alors été vortexé. 1.6.2 Dénombrement Un dénombrement de la suspension obtenue ci-dessus a été réalisé sur les différents milieux, à partir des dilutions 10-2 à 106 (réalisée avec la même technique que 3.3 et 4.3). L' efficiency of plating de chaque milieu par rapport au TCS a été calculée. Les résultats sont présentés II (1.5) Résultats des taux de recouvrement Les tableaux suivants présentent le nombre total de colonies dénombrées sur les duplicats des différents milieux (nombre boite 1 + nombre boite 2) , pour un même volume de suspension inoculé. abieau iv: Denomorement aes aimoneua kresuiiais a 4an/ TCS INV. Hektoen SS XLD XLT4 Rambac h Entdis 297/67 176 186 87 160 267 128 140 Entdis 1281/04 180 205 218 210 209 23 85 338 336 415 364 388 256 331 Entdis 1299/04 185 216 172 159 194 48 106 Entdis 1384/04 205 232 - 217 228 73 167 Entdis 1397/04 220 194 - 193 201 20 132 Entdis 1538/04 198 175 - -239 57 118 266 265 245 262 247 229 233 Tm LT2 197 131 42 164 154 112 109 324 251 217 272 316 74 211 Tm 58.58T 151 106 3 0 29 9 2 Tm 1327/04 187 216 195 214 188 21 122 Tm 1333/04 168 205 171 157 184 8 90 296 267 293 251 288 219 231 Tm 1366/04 294 348 307 281 326 20 142 Tm 1400/04 202 237 213 169 218 11 102 Tm 1526/04 129 124 71 113 51 50 108 234 211 122 154 214 123 149 Virchow 41K 207 202 54 78 165 114 98 Virchow 1396/04 317 356 188 99 341 95 190 Hadar473K 125 101 5 22 24 45 62 Hadar1368/04 308 331 218 306 329 256 331 316 402 338 232 315 298 284 445 284 17 232 871 69 22 TyphiTy2 524 76 111 411 70 350 131 Typhi 2963/03 796 799 90 650 404 354 6 108 91 29 88 91 36 66 Newport 1363/04 204 169 211 262 251 220 101 Newport 1534/04 231 299 50 280 310 241 219 Infantis 158K 248 280 7 116 176 204 260 Brandenburg 171 149 56 153 241 118 157 24K 856 547 49 99 498 56 135 Derby 20K 486 182 432 200 309 657 598 Agona 1137/72 210 127 14 43 268 40 59 406 223 9 53 353 17 96 Heidelberg 16K 306 340 547 49 306 320 416 764 676 48 78 86 261 311 Napoli173K 179 293 695 114 301 851 930 84 30 102 112 69 108 Dublin 65K 130 144 151 48 121 109 67 Indiana 573K 87 101 76 139 157 136 132 Paratyphi B 5K 87 58 16 50 53 72 77 Java Gallinarum 319 - 235 278 293 260 141 9727/03 Tableau IV: Dénombrement des non-Salmonella (résultats à 48h) TCS INV. Hektoen SS XLD XLT4 Rambach Citrobacter koseri 140 166 40 58 75 17 102 C.freundii 194 0 0 47 127 11 43 Escherichia con 136 0 2 17 132 0 112 PMK3 _ Enterobacter 302 125 14 0 44 0 0 aerogenes Enterobacter 287 333 146 287 319 271 298 cloacae Klebsiella oxytoca 204 192 116 194 190 39 79 Serratia 169 0 58 126 108 5 65 marcescens Burkholderia 59 0 0 0 0 0 0 cepacia Tableau V: Dénombrement des bactéries stressées (résultats à 48h) TCS INV. Hektoen SS XLD XLT4 Rambach Avant stress 185 216 172 159 194 48 106 Entdis Après stre0s) (dilution 50 58 36 38 34 6 20 1299/04 Après stre0s) (dilution 541 566 269 342 402 38 208 Avant stress 294 348 307 281 326 20 142 Tm Après stress (dilution 94 104 50 15 54 1 35 1366/04 0 Après stre0s) (dilution 829 774 466 370 569 26 449 Il Résultats 1. 1 Inhibiteurs 1.1.1 Vert brillant L'activité du vert brillant a été étudiée sur les souches: S. enterica sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Typhimurium LT2, Typhimurium 58.58T, Enteritidis 64K, Enteritidis 297/67; Escherichia coli 54.8T, E. coli 0103 HI8, E. coli 0103 PMK1, E. coli 0103 PMK3, E. coli 0103 PMK4, Citrobacter freundii 57. 32T, C.koseri 82.94T, Enterobacter aerogenes 60.86T, Pseudomnas aeruginosa LMG 1242T, Staphylococcus aureus 65.8T, Enterococcus faecalis 103015T, Bacillus cereus 66.24T. Deux gradients de concentration ont été préparés et testés: de 0,25 à 5 mg/I et de 5 à 25 mg/I. Après 48h à 4 jours d'incubation, on a constaté que les souches du sérotype Enteritidis sont capables de cultiver en présence de concentrations de vert brillant supérieures à 5 mg/I, que Escherichia coli 54.8T et HI8 ont été inhibées dès 0,25 mg/I, Enterobacter aerogenes a été inhibé au-delà de 3,8 mg/I. La souche de Pseudomonas aeruginosa, non-utilisatrice de 3-hydroxybenzoate, n'a donné que des microcolonies, non affectées par le vert brillant. Enfin, la concentration inhibitrice avoisine: 2,5 à 3 mg/I, pour les souches de sérotypes Typhimurium et Typhi 1,5 à 2 mg/I, pour les souches de Escherichia coli 0103 PMK1, PMK3, PMK4 3 à 3,5 mg/I, pour les souches de Citrobacter. On a conclu que la concentration de vert brillant optimale se situe entre 1 et 2,5 mg/I, pour permettre l'inhibition des E. coli sans affecter les Salmonella. 1.1.2 Sulfate de thallium Le sulfate de thallium (thalleux) a été étudié en vue d'inhiber les Pseudomonas spp. et Burkholderia cepacia. Son activité a été testée sur les souches suivantes: S. enterica sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Typhimurium LT2, Typhimurium 58.58T, Enteritidis 64K, Enteritidis 297/67; et Escherichia coli 0103 H18, E. coli 0103 PMK1, E. coli 0103 PMK3, E. coli 0103 PMK4, Citrobacter freundii 57.32T, C. koseri 82.94T, Enterobacter aerogenes 60.86T, Pseudomonas aeruginosa LMG 1242T, P. aeruginosa 9310577, Burkholderia cepacia LMG 6889, B. cepacia 103277, Staphylococcus aureus 65.8T, Enterococcus faecalis 103015T, Bacillus cereus 66.24T. Deux gradients ont été préparés et testés: 0,05 à 1 g/1 et de 0 à 0,25 g/1. On a constaté que les Pseudomonas et Burkholderia ont été inhibés en présence de sulfate de thallium, quelle que soit la concentration et que toutes les autres bactéries sont inhibées pour des concentrations allant de 0,1 g/I (Typhi, Escherichia coli 0103) à 0,5-0,6 g/I (Enterobacter aerogenes, Typhimurium et Enteritidis). Par ailleurs, Typhi Ty2 et Typhimurium LT2 ont très bien cultivé à la concentration de 0,025 g/I et moyennement bien à 0,05 g/1 (résultats obtenus par inoculation en cadran de géloses M70/3-HB supplémentées en sulfate de thallium à 0,025 ou 0,05 ou 0,1 g/I). A ces mêmes concentrations, aucune culture n'a été observable pour Pseudomonas et Burkholderia. La concentration optimale de sulfate de thallium est inférieure à 0,025 g/I, pour inhiber Pseudomonas et Burkholderia et ne pas affecter la croissance des Salmonella. 1.2 Facteurs de croissance On a testé l'influence d'une supplémentation en cystéine, et/ou casamino-acides, la cystéine ayant été étudiée sur Typhi Ty2, Typhi 57K, Enteritidis 64K et Enteritidis 297/67 (cette dernière n'est pas auxotrophe), seuls et associés, aux concentrations suivantes: L-cystéine, HCI, H2O: 26 et 52 mg/I (soit 18 et 36 mg/I de cystéine) On a constaté que la cystéine favorise la croissance des Typhi, mais 5 n'a pas d'influence sur Enteritidis 64K, et que l'effet est identique pour 18 et 36 mg/I (Tableau VI). Tableau VI: Essai des acides aminés: résultats à 48h Témoin Cys 18 Cys 36 M70 Typhi Ty2 - ++ ++ Typhi 57K - + + Entendis + + + 64K - - -Entendis ++ ++ ++ 297/67 Culture: - très faible; faible; + moyenne; ++ bonne. Par ailleurs, l'influence des casamino-acides a été testée pour des concentrations de 25, 50, 100, 200, 300 mg/I et en association à 26 mg/I de L-cystéine, HCI, H2O. Les souches utilisées étaient: S. enterica sérotypes Typhi Ty2, Typhi 57K, Enteritidis 64K et Enteritidis 297/67, Typhimurium LT2; et Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii 57.32T, C. koseri 82.94T, Escherichia co/i 54.8T, E. co/i H18, E. coli 0103 PMK3, Klebsiella pneumoniae SB107. Cet essai a été réalisé sur le milieu M70 avec et sans 3-HB. Les résultats à 48h d'incubation sont présentés cidessous. (Tableau VIII) Tableau VII: Essais des casamino-acides: résultats à 48h I u") co cc J a) -t) i I co @ ô o m z 2 d Cl) 111 a) L[) M70 (ni 3HB ni - - - - - - - - - - - CAA) CAA25 - - - - - - - - - - - - CAA25+3HB - ++ ++ ufc* - ++ _ _ ++ - CAA50 - - -/ -/ -/ - - - - - - / CAA50+3HB - - ++ ++ 0 - ++ ++ - CAA100 -/ -/ ' -/ - - _ -PI: - kt -/ -/ CAA100+3HB _ ++ ++ ufc* -/ +++ -/ -/ ++ -/ CAA200 -/ - / -/ CAA200+3HB -/ + ++ ++ ufc* +++ -/ -/ ++ CAA300 _/ ', _/ _/ CAA300+3HB + _/ + ++ ++ 0 +++ -/ -/ ++ CAA50+Cys+3HB + -/ + ++ _/ ++ ++ -/ CAA100 + + + ++ ++ ++ _/ + Cys+3HB 3HB: 3-hydroxybenzoate; CAA: casamino-acides; Cys: L-cystéine, HCI, H2O Culture: 0 nulle; - très faible; faible; + moyenne; ++ bonne; + ++ très bonne. *Ufc: unité formant colonie On a conclu que l'addition de cystéine à 50 mg/I aux casaminoacides permet une bonne culture des souches, y compris les Typhi, sans favoriser celle des souches nonutilisatrices de 3-HB. 1.3 Milieu M70 au 3-hydroxybenzoate (M70/3-HB) On a étudié le milieu M70 comportant deux inhibiteurs: le vert brillant et le sulfate de thallium, en présence des facteurs de croissance suivants: les casamino-acides à 50 mg/I associés à 26 mg/I chlorhydrate de L-cystéine monohydrate (18 mg/I de L-cystéine). On a évalué le taux de recouvrement des Salmonella en fonction des différentes concentrations de vert brillant associé ou non au sulfate de thallium, par dénombrement des bactéries cultivables sur le milieu en comparaison avec une gélose TCS. On a utilisé les souches suivantes, utilisatrices de 3-HB: Typhimurium LT2, Typhi Ty2, Citrobacter freundii 57.32T, Escherichia coli 0103 PMK3, Enterobacter aerogenes 60.86T, et Burkholderia cepacia 103277. Le vert brillant a été étudié seul à différentes concentrations 1; 1,5; 2 et 2,5 mg/I. Cet essai confirme l'activité inhibitrice de ce colorant sur Escherichia coli, à partir de 1,5 mg/I. Les moyennes du nombre de colonies dénombrées (essai réalisé en duplicat), l' efficiency of plating (rapport de la moyenne des colonies sur le milieu testé, sur la moyenne sur TCS) et la taille des colonies sont données dans le tableau ci-dessous (Tableau VIII). Au-delà de 1,5 mg/I, le nombre et la taille des colonies dénombrées a diminué pour les Salmonella et Enterobacter aerogenes, attestant d'un effet inhibiteur. Citrobacter freundii a cultivé difficilement, donnant des microcolonies de diamètre très inférieur à 1 mm, et sa culture a été considérée comme négative. Il en a été de même pour Burkholderia cepacia qui ne peut être dénombré que jusqu'à 1,5 mg/I. Tableau VIII: Taux de recouvrement pour des concentrations croissantes de vert brillant (VB) (résultats à 48h) TCS Témoin VB 1 VB 1,5 VB 2 VB 2,5 M70/3- mg/1 mg/1 mg/1 mg/I HB 1 a ND d 0,89 0,89 0,92 0,63 Typhimurium (101) b (90) (89,5) (93) (64) LT2 2-5 mm _ 1-3mm 1-3mm Une concentration de sulfate de thallium de 0,01 g/I, rajoutée à 1,5 mg/I de 5 vert brillant, semble donc suffisante pour rendre le milieu M70/3-HB encore plus sélectif. Tableau IX: Taux de recouvrement du milieu en présence d'une association vert-brillant (VB) et sulfate de thallium (ST) (résultats à 48h) Témoin ST ST VB 1,5 VB 1,5 TCS M70/3- VB 1,5 + ST + ST HB 0,01 0,025 0,01 0,025 la 0,96 0,91 1,03 0,93 0,76 0,84 Typhimurium (11b'S) (110) (104) (117,5) (107) (86,5) (96,5) LT2 3-6c 2-3 mm 1.4 Evaluation du milieu final Comparaison avec des milieux connus On a comparé l'efficacité du milieu à mettre en évidence les bactéries, avec celle de 5 milieux commercialisés: Hektoen, Salmonella-Shigella, XLD, XLT4, et Rambach. Les résultats obtenus à 48h pour les Salmonella sont exposés dans le Tableau X. Les moyennes des taux de recouvrement sur M70/3-NB a varié selon les souches et les sérotypes de 0,46 (Typhi Ty2) à 1,30 (Heidelberg) , avec une moyenne de 0,94 et une médiane de 0,96. Le diamètre des colonies après 48h s'est échelonné de 1 à 2,5 mm. Pour les autres milieux, les moyennes et médianes (et écarts maxima) des taux de recouvrement sont respectivement de 0,28 et 0,21 (0,02 à 0,87) sur Hektoen BioRad, 0,92 et 0,98 (0,21 à 1,23) sur Hektoen Merck, 0,72 et 0,84 (0 à 1,60) sur SS, 0,97 et 0,98 (0,11 à 1,96) sur XLD 0,44 et 0,36 (0,04 à 1,56) sur XLT4 et 0,63 et 0,60 (0,01 à 1,52) sur Rambach. Le diamètre des colonies sur ces différents milieux a varié de 2 à 5 mm après 48h d'incubation. Dans le Tableau X, sont reportés les intervalles de confiance à 95 (soit 5 % d'erreur) des taux de recouvrement de chaque souche testée, sur chacun des milieux. Ceux-ci ont été calculés selon la formule mise au point par Williams en 1968 pour estimer l'intervalle de confiance de l' efficiency of plating (oep) (5). L'intervalle de confiance pour 5 % d'erreur est défini comme tel: eop 1,966, où 6 est l'écart-type (erreur standard). L'erreur standard correspond à la racine carrée de la variance, définie par la formule suivante: = X1 (X1+X2) / X23 X1: le nombre total de bactéries dénombrées sur le milieu 1 (somme 5 des bactéries dénombrées sur les deux boîtes du duplicat) X2: le nombre total de bactéries dénombrées sur le milieu 2 En prenant toujours X1 Les valeurs de X sont reportées en annexe (Tableau, Tableau IV, Tableau V) . Le milieu M70/3-HB a été le plus efficace pour 22 essais sur 43 (soit 18 souches sur 31) : toutes les souches de Typhimurium, les 2 souches de Virchow, les 2 souches de Hadar, 1 Typhi, 1 Newport, Infantis, Derby, et Napoli. Salmonella Gallinarum n'a pas été cultivable. Par comparaison des moyennes des taux de recouvrement, la différence entre le milieu M70/3-HB et TCS n'est pas significative (loi Normale 5 % : u=1,86; p>0,05). De même, XLD permet de mettre en évidence un nombre équivalent de Salmonella (u=0,45; p>0,05; NS), ainsi qu'Hektoen Merck (test de Student 5 % : t=1,392; p>0,05; NS). Les autres milieux ont des taux de recouvrement significativement inférieurs au taux de M70/3-HB et TCS (p Les colonies de Salmonella ont présenté une coloration noire sur les milieux Hektoen, SS, XLD, XLT4 (production d'H2S en 24h) et roses sur Rambach (utilisation du propylène glycol). Les deux souches de Typhi et la souche de Gallinarum apparaissent incolores sur tous les milieux. Hadar 173K et Napoli 473K, ont donné également des colonies incolores sur Hektoen, SS, XLD, et XLT4 et roses sur Rambach. Tableau X: Taux de recouvrement des Salmonella (résultats à 48h) MHOB/3 Hektoen SS XLD XLT4 Ra hbac Entdis 0,86à 0,36-0,62 0,72- 1,39-0,56- 0,620,98 297/67 1,26 0,49 0,13 1,10 1,65 0,90 0,80 0,18 1,06 0,20 b 0,91 0,19 1,52 0,13 0,73 0,17 0,96-1,32 1,05- 1,00- 0,99- %;- Entdis ,, ,' 1,21 0, 16 1,16 0,17 0,13 0,06 _ 1,17 0,17 1281/04 0 84-1 14 1,11-0,94- 1,02- 0, 64- 0 83-1,13 1,22 1,28 0,88 ' 1,35* 099 0,15 1,23 0,12 1,08 0,14 1,15 0, 13 0,76 0,12 0,98 0,15 Entdis 1,00-1,34 0,74-1,12 0,68-0,86- 0,18- 0,43-0, 71 1299/04 1,17 0,17 0,93 0,19* 0,8600,18 1, 5,20,19 0,26 0,08 0,57 0,14 Entdis 0,96-1,30 0,88- 0,94- 0,26- 0,64_0,98 * 1384/04 113 017 1,24 1,28 0,46 081 017 1,06 0,18 1,11 0,17 0,36 0,10 Entdis 0,71-1,05,71- 0,74- 0, 47-0,73 0 _* %I53 1397/04 0,88 0,17 ' ' ' 0,60 0,13 0 88 0,17 0,91+0,17 0, 09+0,04 0,70-1,06 * 0,93- 0,18- 0,40-0,68 088 018 -" 1,25 0,34 0,54 0,14 Entdis 1,09 0,16 0,26 0,08 1538/04 0,83-1,17 0,76-1,08 0,81- 0,77- 0,710,73-1,03 1,00 0,17 0 92 0 16* 1,15 1,09 1,01 0,88 0,15 0,98 0,17 0,93 0, 16 0,86 0,15 0,51-0,81 0,14-0,28 0,66- 0,62-0,44- 0,42-0,68 0,66 0,15 0, 21 0,07 1,00 0,94 0,70 0,55 0,13 Tm LT2 0,83 0,17 0,78 0,16 0,57 0,13 0, 64-0,90 0,55-0,79 00,70- 0,83- 0,17-0,54-0,76 0,77 0,13 0,67 0,12* ,98 1; 13 0,29 0,65 0,11 0,84 0,14 0,98 0,15 0,23 0,06 Tm 0,53-0,87 0-0,04 0,080,02- 0-0,03 58.58T 0,70 0,17 0,02 0,02 0 07 0,0610,04 0,01 0,02 0,16?0, 08 Tm 0,99-1,33 0,85-1,23 0,97-0,80- 0,06- 0 50-0,80 1327/04 ' 1,16 0,17 1,04 0,19* 1,31 1,20 0,16 0,65 0,15 1,14 0,17 1,00 0,20 0,11+0,05 0,73- 0, 90- 0,02- 1,05-1,39 0,81-1,23 1,13 0,40-0,68 1 1,22 0,17 1,02+0,21* 1,28 0,54 0,14 0 0,07 Tm 0,93 0,20 1,09 0,19 0,05 0,03 1333/04 0,75-1,05 0,831,15 0,71- 0,81-0,61- 0 65-0,91 0,90 0,15 0,99 0,16* 0,8590,14 0,97,10,16 0,74 0,13 0,78 0,13 MHOB/3 Hektoen SS XLD XLT4 Ra hbac Tm 1,05-1,31 0,891,19 0,80-0,97- 0,04-010 0,38-0,58 1366/04 1,18 0,13 1,04 0,15* 0,9610,16 1,11,?0,14 0,07 0,03 0,48 0,10 Tm, 1,01-1,33 0,87-1,23 0,67- 0,90- 0,020,38-0,62 1,01 1,6 08 1400/04 1,17 0,16 1,05 0,18* 0,84 0,17 1,08?0,18 0, 0500,03 0,50 0,12 0,72-1,20 0,39-0,71 0,66- 0,27- 0,26- 0 63-1,05 02, Tm 0,96 0,24 0,55 0,16* 0, 810,22 0, 050,13 0,3950,13 0,84 0,21 1526/04 0,530,74-0,42- 0,73-1,07 0,41-0,63 0,51-0,77 0,79 1,08 0,64 0,90 0,17 0,5210, 11 0,66 0,13 0,91-10,17 0,53 0,11 0,64 013 Virchow 0,79-1,17 0,18-0,34 %88 040,36-0,58 41 K 0,98 0 19 0,26 0,08 0,96 0,68 0,47-10,11 0,38 0,10 0, 80 0,16 0,55 0,13 Virchow 0,98-1,26 0,48-0,70 Ï 0,24- 0,94- %230 49-0 71 1396/04 1,12 014 0,59 0,11 0,330,07 1,08?0,14 0,30 0,07 0,60 0,11 Hadar 0, 60-1,02 0-0,08 0,10- 0,11- 0,24- 0 35-0 65 473K 081 021 0,04 0,04 0,18?0, 08 0,19?0,08 0,3640,12 0,50 0,15 0,93-1,21 0,59-0,83 0,760,84-0,69- 0, 93-1,21 Hadar 1,08 0,83,90,14 1,07 0,14 1,07 0,14 0,71 0,12 0,92 0,16 0, 9910,15 1368/04 1,15-1,39 ' 0,93-1,21 %15 1,16 1,09 0 76-1,04 1,27 0,12 1, 07 0,14* 0,90 0,14 0,73 0,12 1,00 0,16 0,94 0,15 0,54-0,74 0,02-0,06 0,44- 1,90- 0,12- 0,03-0,07 Typhi 0,64 0,10 0,04 0,02 0,260,08 1,600,06 111 0, 05 0,02 Ty2 0,42-0,50 0,73- %268 0,23 0,27 0,06 0,6 0,1,37 0,85 0,12 0, 32 0,06, 1,27 0,10 0,18 0,05 Typhi 10,90-1,10 0,09-0,13 0,74-0,45- %350-0, 02 2963/03 1,00 0,10 0,11 0,02 0,8290,08 0,550,06 0,40,06 0,01 0,01 0,60- 1,08 0,16-0,38 01,5804- 01,6107- 00,20460,42-0,80 Newport 084 0,24 0, 27 0,11 0,81, 0,231I0,84 0,23 0,33 0,13 061 0,19 1363/04 0,79-1,13 0,69-0, 99 %340,66-0,96 0,96 0,17 0,84 0,15* 0 09 0 8,90 14 n 65,70 19 0,81 0,15 1,21- 0,87- I 0,77-1,13 1534/04 1,29 0,13 0,22 0,07 1,35 1,43 1,21 0,95 0, 18 Newport 1,16-1,42 0,15-0,29 1,07- MHOB/3 Hektoen SS XLD XLT4 Ra hbac 1, 21 0,14 1,34 0,13 1,04 0,17 Infantis 0,98-1,28 0,01-0,05 0,37- %'80 88-1 22 158K 1,13 015 003 0,02 50,97 1,05 0,17 0,47 0,10 0,71 0,14 0,82 0,15 Branden- 0 68-1 06 0 23-0 43 0,69- 1,27-0,53- 0,72_1,12 burg 24K il 0, 87 0,19 0,33 0,10 1,09,55 0,85 092 020 0,89 0,20 1,41 0,14 0,69 0,16 0,57- 0,71 0,04-0,08 %' 0,0,13-0,19 0,64 0,07 0,06 0 02,140,64 0,09 0,16 0,03 Derby 0,12 0,02 0,58 0,06 0,07 0,02 20K 0,81-1,01 0,65-0,83 0,23- 0,58- 0, 25- 0,41-0,53 03 04 0,91 0,10 0,74 0,09* ! 0, 8,30,05 0,66' 0,08 ' 0,030, 05 0,47 0,06 0,13- 1,14- 0,13- Agona 0,47-0,73 0,03-0,10 0,20-0,36 0,27 1, 42 0,25 0,28 0,08 1137/72 0,60 0,13 0,07 0,04 0,20 0,07 1,28 0,14 0,19 0, 06 0,46-0,64 0,01-0,03 0,09- 0,75-0,02- 0 19-0,29 0,17 0,99 0,06 Heidelbe 0,55 0,09 0,02+0,01 0,13 0,04 0,87 0,12 0,04 0,02 0,24 0,05 rg 16K 0,810,92- 1,63- 0,10- 1 0 I 19-1,41,81-1,11 1,11* 1,20 1,79 0,20 130 0,11 0, 96 0,15 1,06 0,14 1,71 0,08 0,15 0,05 0,96 0,15 %82 0 90,79-0,97 0,04-0, 08 0' 0,36-0,46 14 0'39 0,88 0,09 0,06 0,02 0,41 0,05 Napoli 0,10 0,02 0, 11 0,03 0,34 0,05 173K 0,97-1,15 0,18* %99 0,0,30-,040 106 009,,0,90 0,16 0,35 0,05 0,21 0,03 0,34 0,05 0,82 0,08 0,13 0,03 0,42-0,74 0,13-0,29 0, 52- 0,58-0,33- 0,55_0,93 0,88 0,96 0,61 074 0,19 0,58 0,16 0,21 0,08 Dublin 0,70 0,18 0,77 0,19 0,47 0,14 65K 0,42-0,80 0,98-1,40 1,13- 1,210,29- 0 88-1,34 0,61 0,19 1,19 0,21* 1,250,19 1,39 0,18 0,404'50,15 1, 11 0,23 Indiana 0,91-1,41 0,60-1,14 1,43- 1,65- 1,39- 1 34-1 70 d 77 AnG A 70. f f 573K 1,16 0,25 0,87 0,27 1,52 0,18 1,60 0,17 1,80 0,15 1, 56 0, 17 Paratyphi 0,45-0,89 0,08-0,28 0,37- 0,40- 0,57- ' 0,62-1,16 B 5K 0, 67 0,22 0,18 0,10 0,77 0,82 1,09 0,89 0,27 Java 0,57 0,20 0,61 0,21 0, 83 0,26 Gallina- 0'73- 0,77- 0,69- 0,62-0,86,.-, A7 0,35-0,43 rum 0** 0, 74 0,12 0,95 0,44 0,09 9727/03 0,87 0,14 0,92 0,15 0,82 0,13 a: Intervalle de confiance (5 % d'erreur) de I' efficiency of plating b: Taux moyen de recouvrement écart de confiance à 95 *: Hektoen Merck ** : Microcolonies de Gallinarum sur M70/3-HB (diamètre Les autres milieux sont plus ou moins inhibiteurs vis-à-vis de ces souches, avec de faibles taux de recouvrement (variables selon les souches et les milieux) ; ils donnent à 48h des colonies dont le diamètre varie de 3 à 5 mm. Les colonies observées diffèrent des colonies de Salmonella par leur coloration. En effet, Hektoen, SS, XLD, et XLT4 permettent de différencier les colonies noires des bactéries productrices d'H2S (Salmonella, Proteus) des colonies de souches non productrices d'H2S qui apparaissent incolores à jaunes. Sur Rambach, milieu chromogénique, les colonies de non-Salmonella apparaissent bleu-violet par présence d'une béta-galactosidase, alors que les colonies de Salmonella sont roses à rouges. Tableau XI: Taux de recouvrement des non-Salmonella (résultats à 48h) M70/3 Hektoen* SS XLD XLT4 Rambach HB C.koseri 1,00- 1 -0 0,28-0,54 0,39-0,69 0,06-0,18 0 92 0>19>39 54-0, 38 1,19 0,19b 0,29 0,10 0,41 0,13 0,54 0,15 0,12 0,06 0,73 0,19 freundii 0** 0 0,16-0,32 0,49-0,69 0,03-0,09 0,15-0,29 C.freundii 0,24 0,08 0,64 0, 15 0,06 0,03 0,22 0,07 E.coli PMK3 0** 0-0,03 0,07-0,19 0,64-1,20 0,61-1, 03 0,01 0,02 0,13 0,06 0,97 0,23 0,82 0,21 E.aerogenes 0,32-0,50 0,03-0, 07 0 0,10-0,20 0 0 0,41 0,09 0,05 0,02 0,15 0,05 E.cloacae 1,02-1,30 0,410,61 0,84-1,16 0,97-1,25 0,78-1,10 0,88-1,20 1,16 0,14 0,51 0,10 1,00 0, 16 1,11 0,14 0,94 0,16 1,04 0,16 K.oxytoca F 0,75-1,13 0,44-0,70 0,79-1, 11 0,75-1,11 0,12-0,26 0,29-0,49 0,94 0,19 0,57 0,13 0,95 0,19 0,93 0,18 0,19 0,07 0,39 0,10 S.marcescens 0** 0,24-0,44 0,58-0,92 0,49-0,89 0-0,06 0,27-0,49 0,34 0,10 0,75 0,17 0,64 0,15 0,03 0,03 0,38 0,11 B.cepacia 0 0 0 0 0 0 : Intervalle de confiance (5 % d'erreur) del' efficiency of plating b: Taux moyen de recouvrement écart de confiance à 95 *: Hektoen BioRad ** : Microcolonies sur M70/3-HB (diamètre Tableau XII: Taux de recouvrement de Salmonella préalablement soumises à un stress (résultats à 48h) SS XLD M70/3- HB Hektoen* XLT4 Rambach Entdis Avant 1,00- 0,68- 0,86- 1,34h 0,74-1,02 1,04 1,24 1299/04 stress 1,17 0,17 0,93 0,19 0,86 0,18 1,05 0,19 0,18-0,34 0, 26 0,08 0,43-0,71 0,57 0,14 Après 044- 038- 002- stress, 0,83-1,49 0,41-1, 03 019-0,61 ' (dilution 1,16 0,33 0,72 0,31 1,08 0,98 0,22 0,40 0,21 4) 0, 76 0,32 0,68 0,30 0,12 0,10 Après 0,54- 0,64- 0,05-stress 0,94-1,16 0,430,57 0,32-0,44 0,72 0,84 0,09 (dilution 1,05 0,11 0,50 0,07 0,38 0,06 103) 0,63 0,09 0,74 0, 10 0,07 0,02 0,80- 0,97- 0,04-Avant 1,05-1,31 0,89-1, 19 0,38-0,58 1,12 1,25 0,10 stress 1,18 0,13 1,04 0,15 0,48 0,10 0,96 0, 16 1,11 0,14 0,07 0,03 Après 0,07- 0,38- Tm stress 0,86-1,36 0,35-0,71 0, 25 0,76 0-0,03 0,23-0,51 1366/04 (dilution do n 1,11 0,25 0,53 0,18 0, 16 0,09 0,57 0,19 0,01 0,02 0,37 0,14 Après 0,40-0,62- 0,02- stress 0,841,02 0,50-0,62 0,48-0,60 0 50 0'76 0,04 (dilution 0,93 0,09 0,56 0,06 0, 54 0,06 0 3) 0,45 0,05 0,69 0,07 0,03 0,01 a: Résultats précédents (Tableau X) b: Intervalle de confiance (5 % d'erreur) de I' efficiency of plating C: Taux moyen de recouvrement écart de confiance à 95 % *: Hektoen Merck 54 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1). Véron M. Nutrition et taxonomie des Enterobacteriaceae et bactéries voisines. I. 5 Méthode d'étude des auxanogrammes. Ann. Microbiol. Inst. Pasteur 1975; 126A: 267-274. (2). Véron M., Le Minor L. Nutrition et taxonomie des Enterobacteriaceae et bactéries voisines. 10 II. Résultats d'ensemble et classification III. Caractères nutritionnels et différenciation des groupes taxonomiques Ann. Microbiol. Inst. Pasteur 1975; 126B: 111-147. (3). Moscoso-Vizcarra M., Popoff M. Voies de dissimilation des acides benzoïques par les entérobactéries. Ann. Microbiol. Inst. Pasteur 1977; 128A: 199-204. (4). Williams T. Interval estimates for effiency of plating. J. Gen. Virol. 1968; 2: 13-18. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture bactérienne pour au moins une souche à cultiver comportant, dans un milieu inorganique minimum, au moins un précurseur de gentisate et/ou du gentisate ou leurs dérivés, en tant que source de carbone et d'énergie. 2. Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que la souche bactérienne à cultiver est choisie parmi Salmonella sp. dont Salmonella enterica subsp indica, Salmonella enterica subsp arizonae, Salmonella bongori, Salmonella enterica subsp diarizonae, Salmonella enterica subsp enterica, Salmonella enterica subsp houtenae, Salmonella enterica subsp salamae, les Escherichia col/ et autres entérobactéries. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche bactérienne à cultiver est choisie parmi les sérotypes ou sérovars de Salmonella enterica et notamment les sérotypes Typhimurium, Enteriditis, Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Virchow, Hadar et Agona. 4. Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la souche bactérienne est une souche de Salmonella, notamment une souche de Salmonella stressée. 5. Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le précurseur de gentisate est choisi parmi le 3-hydroxybenzoate et/ou leurs dérivés et leurs mélanges. 6. Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le précurseur de gentisate est le 3-hydroxybenzoate. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est supérieure à 0,1 g/I. 8. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est supérieure à 0,5 g/I. 9. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est inférieure à 5 g/I. 10. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est inférieure à 2g/l. 11. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la concentration en précurseur de gentisate et/ou gentisate ou leur(s) dérivé(s) est comprise entre 0,8 et 1,2 g/I. 12. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un inhibiteur de la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie. 13. Milieu selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'inhibiteur est choisi parmi les inhibiteurs de la flore Gram positif et/ou des bactéries Gram négatif distinctes de la souche bactérienne à cultiver. 14. Milieu selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi les sels biliaires, le désoxycholate de sodium, les détergents, les antibiotiques, les colorants et leurs mélanges. 15. Milieu selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi les colorants du type triphénylméthane, notamment diaminotriphénylméthane, le vert brillant, le vert malachite, le violet de gentiane, la fuchsine acide et leurs mélanges. 16. Milieu selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel le ou les inhibiteurs sont choisis parmi le sulfate thalleux et le vert brillant et leurs mélanges. 17. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 16 sous forme gélifiée. 18. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 16 sous forme liquide. 19. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 11 sous forme liquide sans inhibiteur. 20. Milieu selon l'une des revendications 1 à 19 comportant de plus un facteur de croissance choisi parmi les acides aminés, les vitamines, les purines, les hydrolysats de protéines et les extraits de levure, et leurs mélanges. 21. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 20, dans lequel la souche à cultiver est auxotrophe et le milieu comporte un facteur de croissance distinct d'une souche de carbone. 22. Milieu selon l'une des revendications 1 à 21 comportant de plus un facteur de croissance est un hydrolysat de protéine, notamment un hydrolysat de caséine, éventuellement supplémenté de L-cystéine. 23. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 22, dans lequel la concentration en facteur de croissance est inférieure à la concentration permettant la croissance de ladite souche sans autre source de carbone. 24. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 23, comprenant en outre au moins un substrat chromogène choisi parmi les substrats Xcaprylate, X-alpha-D-galactopyranoside, X-beta-D-galactopyranoside ou Xgalactopyranoside, où X- représente le groupe 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-, X- pouvant être remplacé par 3-indoxyl-, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-, 6chloro-3-indoxyl-, 5-iodo-3-indoxyl-, N-méthylindoxyl- ou 4méthylumbelliféryl-, et leurs mélanges. 25. Milieu selon l'une des revendications 1 à 24, dans lequel le substrat chromogène est choisi parmi le 5-bromo-4-chloro-3-indolylcaprylate et le 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-a-D-galactopyranoside et leurs mélanges. 26. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 25, dans lequel la concentration en substrat chromogène est de 0,1 à 0,4 g/l. 27. Procédé d'enrichissement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26. 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel la souche est du type Salmonella ou E. coll. 29. Procédé d'isolement d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26. 30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel la souche est du type Salmonella, notamment une souche stressée de Salmonella. 31. Procédé de culture d'une souche bactérienne dans un milieu selon l'une des revendications 1 à 26 mis en oeuvre dans des conditions inhibitrices. 32. Procédé de culture d'une souche bactérienne selon la revendication 31 dans lequel les conditions inhibitrices sont choisies parmi la présence d'un inhibiteur de croissance des bactéries différentes de la souche à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie, les conditions de salinité, les conditions d'aérobiose, le contrôle du pH et/ou le contrôle de la température. 33. Association du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3-hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, avec au moins un inhibiteur, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, l'inhibiteur agissant sur la croissance des bactéries différentes de la souche bactérienne à cultiver et assimilant ladite source de carbone et d'énergie. 34. Utilisation du gentisate ou ses dérivés et/ou au moins un précurseur de gentisate ou leurs dérivés, notamment du 3- hydroxybenzoate, en tant que source de carbone et d'énergie, dans des conditions inhibitrices, pour la culture bactérienne d'au moins une souche à cultiver, lesdites conditions agissant sur la croissance des bactéries qui sont différentes de la souche bactérienne à cultiver et qui assimilent ladite source de carbone et d'énergie.