Brevet FR2892729A1 — publié le 20070504

PROCEDE DE PREPARATION DE NOUVELLES BOISSONS ALCOOLISEES FONCTIONNELLES AU MOYEN DE PHELLINUS SP. J21 CONTEXTE DE L'INVENTION Domaine de l'invention La présente invention concerne un mutant mycélien de Phellinus sp. et un procédé de préparation de boissons alcoolisées au moyen de celui-ci. Plus particulièrement, la présente invention concerne des procédés de production de mycélium mutant Phellinus sp. J21 à partir de Phellinus sp., en cultivant le mycélium mutant Phellinus sp. J21 dans un milieu nutritif liquide artificiel, en isolant et en purifiant l'alcool déshydrogénase à partir de Phellinus sp. J21 cultivé et en clonant le gène de l'alcool déshydrogénase, ainsi qu'une boisson alcoolisée fonctionnelle préparée en utilisant le mycélium mutant, et un procédé de préparation de la boisson alcoolisée. Etat de la technique Les champignons sont riches en matériaux fibreux, en vitamines, en minéraux, etc., et ils reçoivent ainsi une grande attention en tant qu'aliments de bien-être . Particulièrement, Phellinus sp. est actuellement largement utilisé dans des aliments médicinaux, puisqu'il a été découvert qu'il possède des effets anticancéreux. Parce que la fermentation d'alcools en utilisant des mycéliums de plusieurs espèces de champignons est récemment devenue possible, des études sur l'alcool déshydrogénase (ADH) pour ces champignons sont actuellement présentées. Les boissons alcoolisées procurent dl plaisir aux êtres humains depuis plusieurs milliers d'années. Toutefois, une consommation excessive d'alcool provoque des effets secondaires, tels qu'une stéatose du foie et des lésions hépatiques. Depuis le début de l'histoire de l'humanité, les êtres humains ont brassé des boissons alcoolisées. La plage d'utilisation de ces boissons alcoolisées s'est progressivement élargie ; elles ont été utilisées, par exemple, dans des cérémonies de succession à un trône, dans des cérémonies de mariage et dans des services religieux dédiés aux ancêtres. Dans le cas des pays occidentaux, le vin est utilisé dans les cérémonies à l'église depuis longtemps et parmi les présents que Dieu a offert aux êtres humains, il n'y a rien d'aussi précieux que le vin , a dit Platon. Les boissons alcoolisées coréennes traditionnelles peuvent être généralement divisées en vin de riz non filtré et en vin de riz filtré clair préparés par fermentation, et en liqueur de riz distillée (Soju). L'attrait des boissons alcoolisées coréennes traditionnelles peut se trouver dans les boissons alcoolisées fermentées, dont les éléments typiques, le vin de riz non filtré et le vin de riz filtré clair, représentent des boissons alcoolisées coréennes historiques, brassées en utilisant des levures (le vin de riz japonais (Jeongjong) est le nom modifié du vin japonais Saké , qui est différent du vin coréen traditionnel, un vin de riz filtré clair). Le vin de riz non filtré est une boisson à faible teneur en alcool, brassée par fermentation du riz avec des levures, filtration grossière du matériau alcoolique fermenté à travers un tamis et dilution du matériau filtré avec de l'eau, et il lui a été donné divers noms, y compris Makkoli, Daepo, Wangdaepo, Jeoknaegisul, Moju, Takbegi et Takjubegi. En outre, parce qu'il a été souvent brassé à domicile, son goût et son arôme varient selon l'expérience et le procédé de préparation de la famille. Bien qu'il soit difficile de définir une bonne boisson alcoolisée, les vins de céréales coréens traditionnels doivent être de manière souhaitable plus proches d'une couleur de feuille de bambou, avoir un arôme délicat et être savoureux. Depuis la loi sur la taxation des alcools qui est entrée en vigueur en 1907, la préparation des vins coréens traditionnels a été strictement contrôlée de manière à faire disparaître les vins traditionnels et puis, avec la tendance à l'internationalisation à peu près avant et après les Jeux Olympiques de Séoul en 1988, ils sont redevenus populaires. Toutefois, comme on peut le constater d'après le fait que la Corée est le plus grand importateur de vin du monde, l'influence de cette restriction se fait encore sentir. La fermentation alcoolique désigne un procédé dans lequel des organismes convertissent en milieu anaérobie des saccharides en éthanol (alcool éthylique). A savoir qu'il s'agit d'une sorte de décomposition non enzymatique de glucides par des micro-organismes qui produit finalement de l'éthanol et du dioxyde de carbone à partir de saccharides ou de polysaccharides, comme montré par l'équation réactionnelle 1 ci-dessous. Equation réactionnelle 1 C6H12O6 -> 2 CH3CH2OH + 2 002 Les boissons alcoolisées fermentées désignent des liqueurs alcoolisées fermentées qui sont appliquées 10 telles quelles ou après filtration, et qui possèdent une faible concentration en alcool mais une teneur élevée en extrait. Les procédés de préparation de boissons alcoolisées fermentées comprennent une fermentation simple et une fermentation complexe. Les 15 boissons alcoolisées à fermentation simple désignent celles obtenues en réalisant une fermentation alcoolique au moyen d'une matière première saccharidique que la levure peut utiliser. Celles-ci comprennent des vins de fruits, tels que du vin de 20 raisin ou du vin de pomme, et du vin à base de lait de jument. Les boissons alcoolisées à fermentation complexe désignent celles obtenues par saccharification d'amidon avec une amylase et soumission de l'amidon saccharifié à une fermentation alcoolique. Ainsi, les 25 boissons alcoolisées fermentées fabriquées en utilisant des céréales sont des boissons alcoolisées à fermentation complexe. La réalisation de la saccharification et de la fermentation dans des procédés distincts est définie comme un procédé de 30 saccharification et de fermentation séparées, auquel la bière appartient. La bière est obtenue par fermentation5 d'une solution de sucre résultant de la saccharification de matière première d'amidon avec une amylase de malt. La réalisation simultanée de la saccharification et de la fermentation est définie comme un procédé de saccharification et de fermentation simultanées. Les boissons alcoolisées produites par le procédé de fermentation simultanée comprennent le vin de riz filtré clair, le vin de riz non filtré et le So-Hong Ju. Le vin de riz filtré clair est préparé par saccharification d'amidon avec de l'amylase de koji tout en fermentant l'amidon. RESUME DE L'INVENTION Les présents inventeurs ont produit un mycélium mutant Phellinus sp. J21 à partir de Phellinus sp., qui est largement utilisé à des fins médicales et ils ont découvert que le mycélium mutant produit de l'alcool déshydrogénase et que l'utilisation du mycélium mutant permet de produire des boissons alcoolisées ayant l'effet d'améliorer la fonction hépatique. En conséquence, un objet de la présente invention est de fournir Phellinus sp. J21 produisant de l'alcool déshydrogénase, une boisson alcoolisée fonctionnelle préparée au moyen de celui-ci et un procédé de 25 préparation de la boisson alcoolisée. Pour atteindre l'objet ci-dessus, dans un mode de réalisation, la présente invention fournit le mycélium mutant Phellinus sp. J21 produisant de l'alcool déshydrogénase préparé à partir de Phellinus sp. 30 Dans un autre mode de réalisation, la présente invention fournit diverses boissons alcoolisées fonctionnelles, telles que la bière, le vin de fruit et le vin filtré clair, qui sont préparées par inoculation d'un milieu artificiel ou d'un milieu naturel avec un mycélium contenant de l'alcool déshydrogénase dérivé de Phellinus sp., qui est riche en matériaux fibreux, en protéines et en vitamines et qui a l'effet de prévenir le cancer, ainsi que des boissons alcoolisées distillées préparées en utilisant ces boissons alcoolisées fermentées. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront plus clairement à la lecture de la description ci-après, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 montre les résultats d'une culture solide et d'une culture liquide de Phellinus sp. dans un milieu artificiel, conduites selon la présente invention, et une photographie au microscope du milieu cultivé. La figure 2 montre les résultats de l'électrophorèse de l'alcool déshydrogénase isolée et purifiée à partir de Phellinus sp. J21 selon la présente invention. La figure 3 montre les résultats du clonage d'ADNc et de l'analyse de la séquence des bases de l'alcool déshydrogénase déduite par une PCR amplifiant l'ARN total isolé de Phellinus sp. J21 selon la présente invention. La figure 4 représente un diagramme montrant la variation de la concentration en alcool avec le temps dans la fermentation alcoolique utilisant Phellinus sp. J21 selon la présente invention. La figure 5 représente un diagramme montrant que l'alcool produit selon la présente invention a été 5 fermenté par Phellinus sp. J21. La figure 6 montre les résultats de l'amplification par PCR réalisée au moyen de combinaisons des amorces 5'-RACE, ph-adh-R3 et ph-adh-R4. M : marqueur ; couloir 1 : produit de PCR 10 obtenu en utilisant une combinaison de S'-RACE et de ph-adh-R3 ; et couloirs 2 à 5 : produits de PCR obtenus en utilisant le produit de PCR du couloir 1 comme matrice et une combinaison de 5'-RACE et de ph-adh-R4. La figure 7 montre les résultats de ,_a comparaison 15 entre un ADNc d'alcool déshydrogénase dérivé de Phellinus sp. J21 selon la présente invention et d'une alcool déshydrogénase dérivée d'une autre espèce connue. P-adh : alcool déshydrogénase dérivée de Phellinus sp. J21 ; et A-adh III : alcool 20 déshydrogénase dérivée d'Agaricus. La figure 8 montre les résultats de la comparaison entre une alcool déshydrogénase dérivée de Phellinus sp. J21 selon la présente invention et d'une alcool déshydrogénase dérivée de Agaricus ; P-adh : 25 alcool déshydrogénase dérivée du mycélium de Phellinus sp. ; et A-adh III : alcool déshydrogénase dérivée d'Agaricus. La figure 9 représente un diagramme montrant un procédé de préparation de vin de riz filtré clair 30 (Yakju) au moyen de Phellinus sp. J21 selon la présente invention. La figure 10 montre l'activité thrombolytique et l'effet inhibiteur de la formation de thrombi d'une boisson alcoolisée fermentée préparée au moyen de Phellinus sp. J21 selon la présente invention. La figure 11 représente un diagramme montrant les résultats de l'analyse des GOT et des GPT chez une souris à laquelle a été administrée une boisson alcoolisée fermentée préparée au moyen de Phellinus sp. J21 selon la présente invention et chez une souris à laquelle a été administrée une autre boisson alcoclisée. La figure 12 représente un diagramme montrant les résultats de l'analyse des taux sériques de cholestérol total et de triglycérides chez une souris à laquelle a été administrée une boisson alcoolisée fermentée préparée au moyen de Phellinus sp. J21 selon la présente invention et chez une souris à laquelle a été administrée une autre boisson alcoolisée (concentration en alcool de 14 %). La figure 13 montre les résultats d'une coloration des tissus hépatiques d'une souris à laquelle a été administrée ane boisson alcoolisée fermentée préparée au moyen de Phellinus sp. J21 et d'une souris à laquelle a été administrée une autre boisson alcoolisée. DESCRIPTION DETAILLEE DU MODE DE REALISATION PREFERE Il sera à présent fait référence en détail au mode de réalisation préféré de la présente invention en référence aux dessins joints. Un mycélium mutant Phellinus sp. J21 de Phellinus sp. a été isolé en irradiant Phellinus sp. avec des UV dans une condition de mortalité de plus de 95 % puis en repiquant la souche irradiée quotidiennement pendant 30 jours. La souche mutante Phellinus sp. J21 a présenté des caractéristiques de période de formation de mycélium raccourcie en culture liquide, de période de fermentation alcoolique raccourcie et de capacité accrue de fermentation alcoolique, en comparaison avec Phellinus sp. existant. La souche mutante Phellinus sp. J21 a été déposée sous le n d'ordre KCTC-10847BP le 13 septembre 2005 auprès de la KCTC (Korean Collection for Type Cultures) qui est une autorité de dépôt internationale en vertu du Traité de Budapest. Dans la présente invention, le mycélium mutant Phellinus sp. J21 qui produit de l'alcool déshydrogénase a été isolé et cultivé, pu=_s le mycélium cultivé a été utilisé pour une fermentation alcoolique commerciale. En outre, l'alcool déshydrogénase (ADH) a été isolée à partir du mycélium mutant Phellinus sp. J21 et l'ADNc de l'ADH a été cloné. Phellinus sp. J21 a été cultivé dans un milieu liquide à 25 C pendant 6 jours et le mycélium a été recueilli à partir du milieu cultivé par centrifugation et rompu par sonication, à partir de quoi l'ADH a été ensuite isolée et purifiée par une chromatographie en plusieurs étapes. L'enzyme purifiée a présenté une masse moléculaire d'environ 46 kDa par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. En outre, le mycélium (Phellinus sp. J21) cultivé 30 dans les mêmes conditions que ci-dessus a été recueilli, lyophilisé avec de l'azote liquide, puis parfaitement rompu avec un pilon et l'ADN total a été isolé du mycélium rompu. L'ARN total isolé a été soumis à une RT-PCR pour cloner l'ADNc de l'ADH afin de déterminer la séquence des bases de l'ADH. L'ADNc cloné de Phellinus sp. J21 présente une taille de 1 137 pb codant pour 379 acides aminés. L'ADNc de l'ADH a été converti en une séquence d'acides aminés et comparé à l'ADH d'Agaricus précédemment connue et, en conséquence, a présenté une identité de 68 % avec la séquence d'acides aminés de l'ADH d'Agaricus. En outre, l'analyse BLAST de l'ADH clonée a montré qu'elle est très similaire à l'ADH III. Dans la présente invention, le mycélium mutant Phellinus sp. J21 qui produit de l'alcool déshydrogénase a été isolé à partir de Phellinus sp. riche en substances bénéfiques pour la santé et le mycélium mutant isolé a été cultivé dans un milieu liquide et utilisé pour produire des boissons alcoolisées. Spécifiquement, le procédé ci-dessus comprend les étapes consistant à : 1) préparer Phellinus sp. J21 à partir de Phellinus sp. ; 2) cultiver le Phellinus sp. J21 dans un milieu nutritif ; et 3) mélanger du Koji (détaillé ci-dessous), du riz cuit à la vapeur et de l'eau dans un rapport pondéral de 2/3/5 et cultiver le mycélium cultivé avec le mélange pour produire de l'alcool. Le Koji ci-dessus est fabriqué en inoculant du riz cuit à la vapeur avec Aspergillus oryzae pour saccharifier le riz cuit à la vapeur. Après la saccharification du riz cuit à la vapeur par inoculation avec Aspergillus oryzae, a été ajouté du Phellinus sp. J21, remplaçant la levure comme source de fermentation alcoolique, et le mélange a été fermenté à 25 C pendant 11 jours pour produire une boisson alcoolisée ayant une concentration en alcool atteignant un maximum de 16, 7 Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, les fonctionnalités d'une boisson alcoolisée fermentée préparée en utilisant Phellinus sp. J21 ont été analysées et, en conséquence, une activité thrombolytique et un effet retardant la formation de thrombi ont été démontrés. En outre, dans un test animal utilisant la boisson alcoolisée fermentée inventive de la présente invention, la boisson alcoolisée a montré qu'elle induit de faibles taux de GOT et de GPT comparativement à une boisson alcoolisée classique ayant la même concentration en alcool (14 %) et a également montré qu'elle induit des taux sériques faibles de cholestérol et de lipides neutres. En outre, dans les résultats de l'analyse du tissu hépatique des animaux, le foie d'un rat auquel a été administrée la boisson alcoolisée classique (14 %) a montré des sites inflammatoires partiels, tandis que le foie d'un rat auquel a été administrée la boisson alcoolisée fermentée préparee en utilisant Phellinus sp. J21 a montré des résultats similaires à ceux d'un groupe témoin auquel a été administré du sérum physiologique. Dans la présente invention, la fermentation alcoolique a été obtenue avec succès à un niveau industriel en utilisant le mycélium mutant Phellinus sp. J21 ayant un effet anticancéreux. En outre, la boisson alcoolisée fermentée selon la présente invention a une fonction thrombolytique et un effet d'inhibition des dommages de la fonction hépatique et peut ainsi contribuer à une bonne santé. Ci-après, la présente invention va être décrite plus en détail en référence à des exemples. Toutefois, il sera évident pour tout homme du métier que ces exemples ne sont donnés qu'à des fins illustratives et que la portée de la présente invention telle que définie dans les revendications annexées n'est pas limitée à ou par ces exemples. Exemple 1 - Isolement, culture et recueil du mycélium mutant Phellinus sp. J21 de Phellinus sp. La forme d'un mycélium isolé et cultivé à partir de Phellinus sp. est illustrée sur la figure 1. En résumé, des carpophores de Phellinus sp. ayant une taille donnée ont été prélevés et soumis à une culture stationnaire sur une plaque YMD (7,5 % de dextrose, 4,5 % d'extrait de malt, 5 % d'extrait de levure, 0,01 % de biotine, 0,05 de MgC12, 0,01 de FeSO4, 2 % de gélose, pH 7,0) à 25 C pendant 6 jours. Le bord du mycélium de Phellinus sp. provenant de la plaque YMD cultivée a été découpé en 4 à 5 morceaux de gélose ayant une taille d'environ 0,5 cm x 0,5 cm et les morceaux découpés ont été inoculés dans du YBM (7,5 % de dextrose, 4,5 % d'extrait de malt, 5 % d'extrait de levure, 0,01 % de biotine, 0,05 % de MgC12, 0,01 % de FeSO4r pH 7,0) dans un flacon triangulaire de 250 ml et cultivés sous agitation à 25 C et à 100 tr/min pendant 6 jours. Le mycélium cultivé a été utilisé pour isoler l'ARN total pour l'isolement de l'alcool déshydrogénase et le clonage de l'ADNc de l'alcool déshydrogénase. La forme du mycélium isolé de Phellinus sp. est illustrée sur la figure 1. Le mycélium isolé (Phellinus sp.) a. été irradié avec des UV dans une condition de mortalité de plus de 95 % (254 nm, 30 min), puis repiqué quotidiennement pendant 30 jours afin d'isoler Phellinus sp. J21. La souche mutante a été cultivée sous agitation dans un milieu YMD à 25 C et à 100 tr/min pendant 6 jours et a été utilisée pour isoler l'ARN total pour l'isolement de l'alcool déshydrogénase et le clonage de l'ADNc de l'alcool déshydrogénase. Les conditions de culture optimales dans un milieu artificiel pour produire de l'alcool en utilisant Phellinus sp. J21 sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Dextrose 7,5 % Conditions nutritives Peptone 4,5 % Extrait de levure 5,0 % Biotine 0,01 6 MgC12 0,05% FeSO4 0,01 % I pH 7,0 Température 25 C Conditions physiques Aération 100 tr/min (200 ml de milieu/flacon de 500 ml) Concentration finale en 7,74 % alcool 20 Isolement et purification de l'alcool déshydrogénase Le mycélium Phellinus sp. J21 isolé a été filtré à travers de la gaze, mélangé avec 20 mM de Tris-HC1 (pH 8,0) contenant 10 % de glycérol, dans un rapport de 2/1 (v/v) et rompu avec un sonicateur (Branson Sonifer 250, Etats-Unis). La solution résultante a été centrifugée à 4 C et à 13 000 tr/min pendant 20 minutes et le surnageant a été dialysé à travers une membrane de dialyse en utilisant 20 mM de tampon Tris-HC1 (pH 8,0) et utilisé comme solution de coenzyme. La solution de coenzyme a été séparée et purifiée en plusieurs étapes à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions DEAE Sephadex A-50, d'une colonne Sephadex G-200 et d'une colonne Sephadex G-75. 48,6 U/mg de l'enzyme isolée et purifiée ont été finalement obtenues à un rendement de 3,5 % (voir le tableau 2). Tableau 2 Etape Protéines Activité Activité Grossissement Rendement totales totale spécifique (fois) ( ) (mg) (unités) (unités/mg) Extrait 633,0 7 330,0 12,4 1,00 100,0 exempt de cellules Echange 64,3 1 516,8 23, 6 1,90 20,7 d'ions DEAE A-50 Filtration 11,3 354,2 31,3 2,52 4,8 sur gel Sephadex G-200 Filtration 3,5 sur gel 5,25 255,4 48,6 3,'32 Sephadex G-75 Mesure de la masse moléculaire de l'enzyme L'enzyme purifiée a été soumise à une électrophorèse SDS-PAGE à 90 V pendant 2 heures et colorée avec de l'argent pour confirmer la bande de la protéine et sa masse moléculaire a été calculée sous la forme d'une valeur Rf par un graphique logarithmique. La masse moléculaire de l'enzyme ADH purifiée a été déterminée comme étant d'environ 46 000 Da. L'électrophorèse et la masse moléculaire de l'alcool déshydrogénase dérivée de Phellinus sp. J21 sont présentées sur la figure 2. Isolement de l'ARN total Le mycélium Phellinus sp. J21 a été cultivé dans un milieu liquide pendant 6 jours et le mycélium cultivé a été recueilli et lyophilisé avec de l'azote liquide et parfaitement rompu avec un pilon. 100 mg du mycélium rompu ont été traités selon la procédure du test de RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) pour isoler l'ARN total. L'ARN total a été quantifié avec un spectrophotomètre en UV et soumis à une RT-PCR pour le clonage de l'ADNc de l'alcool déshydrogénase. Exemple 2 - Clonage de l'ADNc et analyse de la séquence des bases de l'alcool déshydrogénase A partir de 3 pg de l'ARN total du mycélium Phellinus sp. J21, le ler brin d'ADNc a été synthétisé en utilisant la transcriptase inverse III (Invitogen) et un oligo dT-adaptateur dans le kit CapFishingTM Fulllength cDNA Premix (Seegene). La région terminale en 5' du ler brin d'ADNc synthétisé a été ligaturée avec la 5'-RACE fournie dans le kit CapFishingTM Full-length cDNA Premix (Seegene) et ensuite soumise à une PCR. L'amplification par PCR a été réalisée en utilisant des amorces (ph-adh-1 directe et ph-adh-2 inverse) conçues par les présents inventeurs et une amorce 3'-RACE fournie par Seegene, permettant de synthétiser ainsi le 2nd ADNc. Ces amorces ont été conçues en utilisant la base de données BLAST en référence à des régions de séquences de bases hautement conservées. Les produits de la PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 % (figure 3). Comme on s'y attendait, il a été montré que la taille du produit de la PCR en utilisant le jeu des amorces ph-adh-1. directe et ph-adh-2 inverse est d'environ 960 pb et que la taille du produit de la PCR en utilisant le je.1 des amorces ph-adh-1 directe et 3'-RACE est de 1 160 pb (figure 3). Chacun des produits attendus de la PCR a été amplifié et soumis à une électrophorèse et la bande d'ADN souhaitée a été alors excisée du gel. Le produit de la PCR séparé (960 pb) a été cloné dans un vecteur T et analysé pour établir la séquence des bases d'ADN. Afin de construire une amorce de séquençage sur la base de la séquence des bases d'ADN obtenue pour le fragment de 960 pb et pour obtenir des informations sur la séquence des bases de la région en 3', le fragment de 1160 pb a été analysé pour établir une séquence partielle des bases directement sans clonage du produit de la PCR dans un vecteur. Pour obtenir des informations sur la séquence des bases de la région en 5' de l'ADNc de l'ADH de Phellinus sp., la séquence des bases analysée (960 pb) a été utilisée pour concevoir les amorces ph-adh-R3 et ph-adh-R4 et une amplification par PCR a été réalisée en utilisant chacun d'un jeu d'amorces ph-adh-R3 et 5'-RACE et d'un jeu d'amorces ph-adh-R4 et 5'-RACE. Dans ce cas, la réaction d'amplification par PCR a été réalisée pendant 35 cycles de dénaturation à 94 C pendant 30 s, d'hybridation à 55 C pendant 30 s et d'extension à 72 C pendant 1 min. 1 pl du produit de la PCR obtenu en utilisant le jeu d'amorces ph-adh-R3 et 5'-RACE a été soumis à une amplification par PCR nichée en utilisant le jeu d'amorces ph-adh-R4 et 5'-RACE pour obtenir finalement un fragment d'environ 460 pb (figure 6), puis la séquence des bases de la région en 5' de l'ADN de Phellinus sp. J21 a été déterminée. La taille totale de l'ADNc de l'ADH de Phellinus sp. J21 cloné de la SEQ ID NO: 9 est de 1 137 pb codant pour 379 acides aminés de la SEQ ID NO : 10. Les amorces utilisées dans cet exemple sont présentées dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Amorces Séquences Cligo dT-adaptateur 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT(T)18-3' (SEQ ID NO : 1) 5'-RACE 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3' (SEQ ID NO : 2) 3'-RACE 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3 (SEQ ID NO : 3) Ph-adh-1 directe 5'-TGTCACACTGATGACTACAC-3' (SEQ ID NO 4) Ph-adh-4 directe 5'-TCCCTTCCAACTGGTCACTG-3' (SEQ ID NO : 5) Ph-adh-2 inverse 5'-TGGTGGGTGACGAATTCATC-3' (SEQ ID NO 6) Ph-adh-R3 inverse 5'-ACCTTGACGACGGAGACATC-3' (SEQ ID NO : 7) Ph-adh-R4 inverse 5'-GCGGCCTTGAGTAGCTCTGA-3' (ÈQ ID NO 8) Analyse de la séquence des bases de l'ADNc de l'ADH de Phellinus sp. J21 L'ADNc d.e l'ADH de Phellinus sp. J21 a été comparé à d'autres types de gènes d'ADH dans la base de données BLAST et il s'est avéré qu'il a une haute similarité avec l'ADH III. En outre, il a été comparé à de l'ADN de levure bourgeonnante, de levure fissipare, de C. elegans, de poisson zèbre et humain, et des identités de 57,6 55,0 51,8 57,2 % et 49,7 respectivement, avec ces gènes ont été observées. L'arbre phylogénétique de ces gènes est présenté sur la figure 7. En outre, l'ADNc de l'ADH de Phellinus sp. J21 a été comparé à l'ADH III d'Agaricus rapportée dans l'art et une identité de 68 % avec l'ADH III d'Agaricus a été observée (figure 8). Exemple 3 - Fermentation alcoolique et production d'une boisson alcoolisée en utilisant le mycélium Phellinus sp. J21 Un procédé concret de production d'une nouvelle boisson alcoolisée au moyen du mycélium Phellinus sp. J21 préparé dans l'exemple 1 est représenté sur la figure 9. Comme il est montré sur la figure 9, du riz (matière première) a été traité à la vapeur, inoculé avec A. oryzae de Koji et cultivé à 25 à 30 C pendant 3 jours pour fabriquer de la levure. Au cours de cette période, la saccharification de l'amidon s'est produite. Dans la présente invention, la fermentation de l'amidon a été réalisée en inoculant l'amidon saccharifié avec le mycélium Phellinus sp. J21 à la place de Saccharomyces sake généralement utilisé dans la fermentation du vin de riz filtré clair, puis en fermentant l'amidon à 25 C pendant 14 jours (voir la figure 9). La concentration en alcool de la boisson alcoolisée produite par l'addition du mycélium contenant de l'alcool déshydrogénase dérivée de Phellinus sp. J21 à du Koji a été de 16, r % à 11 jours après la fermentation. Exemple expérimental 1 Phellinus sp. de type sauvage et le mycélium mutant Phellinus sp. J21 préparé dans l'exemple 1 ont été comparés l'un à l'autre en ce qui concerne leurs caractéristiques et les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 Phellinus sp. de type Exemple 1 sauvage (Phellinus sp. J21) Temps de production de 3 à 4 jours 1 à 2 jours la biomasse Activité alcool 23,2 U/mg 31,0 U/mg déshydrogénase Production d'alcool 11 à 13 % 16 à 18 % Couleur de la biomasse Jaune Jaune foncé sur la plaque Comme on peut le voir dans le tableau 4 ci-dessus, le mycélium mutant Phellinus sp. J21 est supérieur en 20 terme d'activité alcool déshydrogénase au Phellinus sp. de type sauvage et, par conséquent, il permet une production d'alcool élevée. Exemple expérimental 2 - Activité thrombolytique et effet inhibiteur de la formation de thrombi de la boisson alcoolisée fermentée au moyen de Phellinus sp. J21 Afin de mesurer l'activité thrombolytique, selon le procédé de plaque à la fibrine de Haverkata-Trass, 20 unités de thrombine dans 0,2 M de tampon borate (pH 7,8) ont été ajoutées goutte à goutte à,et bien mélangées avec 10 ml d'une solution de fibrinogène à 0, 2 % dans une solution de gélatine à 2 et le mélange a été versé sur une boîte de Petri pour constituer un film de fibrine. 100 dal de la boisson alcoolisée fermentée produite en utilisant le mycélium Phellinus sp. J21 ont été absorbés sur un disque de papier et laissés à reposer sur la plaque à 37 C pendant 18 heures. Au fur et à mesure que la fibrine a été dissoute par l'enzyme, la surface dissoute a été mesurée pour déterminer l'activité relative. Afin de tester l'effet inhibiteur de la formation de thrombi, 200 pl de la boisson alcoolisée fermentée produite au moyen du mycélium Phellinus sp. J21 ont été mélangés avec 200 pl de thrombine (12, 5 unités/ml) et laissés à reposer à 37 C pendant 5 min, auxquels 800 pl de fibrine à 0,33 % ont été ajoutés et parfaitement mélangés. Le temps de coagulation du mélange a été observé et les résultats sont présentés sur la figure 10. Dans les résultats du test, la boisson alcoolisée fermentée produite au moyen du mycélium Phellinus sp. J21 a montré une activité thrombolytique et un effet inhibiteur de la formation de thrombi. Exemple expérimental 3 - Analyse des taux de GOT et de GPT chez des souris auxquelles ont été administrées la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 et une autre boisson alcoolisée Des souris blanches Sprague-Dawley mâles en bonne santé âgées de 8 semaines ont été utilisées après avoir été acclimatées à un environnement de laboratoire en utilisant un régime alimentaire libre pendant 2 semaines. Afin d'élucider les fonctionnalités, il a été administré oralement à chacune des souris, soit 3 ml de la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 soit 3 ml d'une autre boisson alcoolisée deux fois par jour pendant 10 jours, puis le sérum isolé du sang de chaque animal a été analysé pour établir les taux de GOT et de GPT. Les résultats sont présentés sur la figure 11. Comme on peut le voir sur la figure 11, les souris auxquelles a été administrée la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 présentent des taux inférieurs de GOT et de GPT par rapport aux souris auxquelles a été administrée L'autre boisson alcoolisée. Exemple expérimental 4 - Mesure des taux sériques de cholestérol et de lipides neutres (triglycérides) chez des souris auxquelles a été administrée la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 Les taux sériques de cholestérol total et de triglycérides chez des souris auxquelles il a été administré soit la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 soit une autre boisson alcoolisée (14 %) ont été analysés et les résultats sont présentés sur la figure 12. Comme on peut le voir sur la figure 12, les souris auxquelles a été administrée la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 ont des taux de cholestérol total et de triglycérides inférieurs aux souris auxquelles a été administrée l'autre boisson alcoolisée (14 %). Exemple expérimental 5 - Effet de la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 sur le tissu hépatique de souris L'effet de la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 sur le tissu hépatique de souris est montré sur la figure 13. Du tissu hépatique a été isolé à partir de chacune des souris blanches auxquelles il a été administré par voie orale soit la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 (14 % d'alcool) soit une autre boisson alcoolisée (14 % d'alcool), puis il a été coloré. Le tissu hépatique des souris auxquelles a été administrée l'autre boisson alcoolisée (14 %) présentait une inflammation partielle interne, tandis que le tissu hépatique des souris auxquelles a été administrée la boisson alcoolisée fermentée dérivée de Phellinus sp. J21 ne présentait aucun site d'inflammation interne et avait un aspect similaire à celui du tissu hépatique de souris auxquelles a été administré du sérum physiologique. Comme cela a été décrit ci-dessus, selon la présente invention, des boissons alcoolisées fonctionnelles ayant une activité thrombolytique et un effet réducteur des dommages de la fonction hépatique SR 28897 KR/SG 2892729 23 provoqués par l'alcool sont produites. En conséquence, la présente invention peut présenter un intérêt en matière de santé publique. Bien qu'un mode de réalisation préféré de la 5 présente invention ait été décrit à des fins illustratives, l'homme du métier comprendra que diverses modifications, additions et substitutions sont possibles, sans s'écarter de la portée et de l'esprit de l'invention. SR 28897 KR/SG REVENDICATIONS 1. Mycélium mutant Phellinus sp. J21 (n d'ordre KCTC 10847BP) dérivé de Phellinus sp. 2. Procédé de préparation d'une boisson alcoolisée, 5 comprenant les étapes consistant à : 1) irradier Phellinus sp. avec des UV à 254 nm pendant 30 minutes et repiquer la souche irradiée quotidiennement pendant 30 jours pour préparer Phellinus sp. J21 (n d'ordre KCTC 10847BP) tel que 10 défini à la revendication 1 ; 2) cultiver le Phellinus sp. J21 dans un milieu nutritif ; et 3) mélanger du Koji, du riz cuit à la vapeur et de l'eau dans un rapport pondéral de 2/3/5 et cultiver le 15 mycélium cultivé avec le mélange. 3. Boisson alcoolisée préparée en utilisant un mycélium Phellinus sp. J21 selon le procédé selon la revendication 2. 4. Boisson alcoolisée selon la revendication 3, qui est choisie dans le groupe constitué par la bière, le vin de fruit et le vin de riz filtré clair. 25 5. Utilisation d'une boisson alcoolisée selon la revendication 3 pour la préparation d'un médicament destiné à réduire les dommages de la fonction hépatique, présentant une activité thrombolytique et destiné à inhiber la formation de thrombi et à induire des taux 20 4 SR 28897 KR/SGde GOT et de GPT, des taux sériques de cholestérol et de lipides neutres inférieurs à ceux généralement induits par une boisson alcoolisée.