Brevet FR2893942A1 — publié le 20070601

La présente invention concerne des méthodes de criblage permettant de sélectionner, d'identifier et/ou de caractériser des composés capables de moduler la liaison d'un récepteur nucléaire à un ou plusieurs cofacteurs. Les récepteurs nucléaires appartiennent à une famille structurellement et fonctionnellement définie de facteurs de transcription qui sont activés par un ligand et se fixent sur des séquences d'ADN spécifiques, appelées éléments de réponse, situées à proximité des gènes qu'elles régulent. Cette famille comprend les récepteurs nucléaires des hormones stéroïdes dérivées du cholestérol (glucocorticoïdes, oestrogènes, progestérone, etc.) et les récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes, de la vitamine D3 ou de l'acide rétinoïque. La famille des récepteurs nucléaires, qui regroupe plus d'une cinquantaine de gènes différents, comprend également de nombreux récepteurs pour lesquels aucun ligand n'a été décrit et que l'on nomme "récepteurs orphelins". En modulant la transcription de gènes cibles en réponse à leur propre ligand et à d'autres signaux afférents, notamment le recrutement ligand- dépendant de cofacteurs qui peuvent diminuer (co-répresseur) ou accroître (co-activateur) leur activité transcriptionnelle, ils jouent des rôles physiologiques clés dans la régulation du développement et du métabolisme cellulaire, d'où leur implication dans de nombreuses pathologies telles que les pathologies métaboliques, les maladies cardio-vasculaires, le cancer, l'obésité, le diabète, l'infertilité, etc. Le tamoxifène, connu pour inhiber l'activité du récepteur aux oestrogènes (ER), a été largement utilisé dans le traitement et la prévention du cancer du sein. Une étude des effets sélectifs du tamoxifène (effet oestrogène dans l'utérus et effet anti-oestrogène dans le sein) a conduit à l'émergence du concept de Selective ER Modulators ou SERMs. Ce concept a par la suite été étendu aux autres récepteurs nucléaires : les Selective Nuclear Receptors Modulators (SNuRMs) sont des agonistes ou des antagonistes de récepteurs nucléaires (NR) qui induisent une réponse différente en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire (Smith et O'Malley, Endocrine Reviews, 25(1), 45-71, (2004)). Le mécanisme d'action des SERMs et SNuRMs a été beaucoup étudié. Comme la plupart des récepteurs nucléaires, le récepteur aux oestrogènes (ER) interagit avec l'ADN par l'intermédiaire de son domaine de liaison à l'ADN (DNA Binding Domain ou DBD) au niveau d'un élément de réponse spécifique (appelé RE). Le récepteur aux oestrogènes interagit alors avec des protéines coactivatrices pour former un complexe multimérique qui active la machinerie transciptionnelle et augmente l'expression de ses gènes cibles en remodelant l'ADN et en formant des complexes stables de pré-initiation de la transcription . Des expériences utilisant des anticorps dirigés contre différents épitopes ainsi que des expériences de digestion ménagée ont par la suite montré que différentes classes de ligands induisaient une changement conformationel différent de la partie du récepteur se liant au ligand ou Ligand Binding Domain (LBD) . Plus récemment, les régions du LBD qui interagissent avec les coactivateurs ont été identifiées et qualifiées de NR boxes . Ces dernières sont en fait constituées de sillons formés par le rapprochement de différentes hélices du LBD. L'utilisation d'agonistes et d'antagonistes partiels du récepteur aux oestrogènes, comme le raloxifène, a montré que l'orientation d'une des hélices masquait partiellement le sillon de fixation des co-activateurs, ce qui avait pour conséquence un blocage de l'interaction de certains co-activateurs avec le LBD du récepteur nucléaire (Smith et O'Malley, 2004). Grâce à la fixation de ligands SNuRMs qui modulent l'activité des récepteurs nucléaires en permettant notamment le recrutement différentiel de cofacteurs, les récepteurs nucléaires offrent la possibilité de contrôler plus finement l'expression des gènes. Il existe donc un réel intérêt pour le développement de méthodes d'identification de ce type de ligand. La mise en oeuvre de tests de criblage permettant d'identifier des composés SNuRMs utiles pour le recrutement de cofacteurs n'est pas aisée : en effet, la liaison des récepteurs nucléaires avec un ou plusieurs cofacteurs est difficile à mettre en évidence. Des techniques dites GST-pull down classiques, telles que décrites par exemple dans l'article Krogsdam et al, Biochem. J. 363, 157-165 (2002), utilisent des protéines de fusion GST-cofacteur du récepteur couplées à des billes portant du glutathion et incubées avec le récepteur nucléaire (ou une partie du récepteur nucléaire telle que le LBD) marqué radioactivement, en présence ou en absence du ligand à tester. L'interaction est visualisée par autoradiographie. Cette technique présente des désavantages : la purification nécessaire du récepteur nucléaire est difficile à mettre en oeuvre, notamment avec les récepteurs PPAR, LXR et FXR, du fait du faible rendement de purification dû à une accumulation dans les corps d'inclusion bactériens. Ces problèmes de purification conduisent à utiliser des systèmes de transcription et de traduction coûteux. De plus, l'utilisation d'un marquage radioactif présente le désavantage d'être potentiellement dangereux. Enfin, l'absence de sensibilité de ces techniques représente un inconvénient majeur, notamment car certaines interactions, telles que des interactions faibles entre un cofacteur et un récepteur nucléaire comme SRC-1 et PPAR (IJpenberg A et al. EMBO J., May 2004; 23: 2083 - 2091) ne peuvent pas être mises en évidence. Des variantes de ce protocole existent. La demande EP1267171 décrit par exemple une méthode de détection de modulateurs du récepteur PPAR gamma, mettant en oeuvre (i) d'une part un polypeptide comprenant le domaine d'un cofacteur (par exemple SRC-1 ou TIF-2) qui interagit avec le récepteur nucléaire (NID) et qui est lié à de la GST (Glutathion S Transferase), et (ii) d'autre part un polypeptide comprenant le domaine de liaison au ligand (LBD ou Ligand Binding Domain) du récepteur nucléaire (NR) étudié, fusionné à un marqueur polyhistidine (6xHis). Le polypeptide GST-CoF-NID est fixé à des billes portant du glutathion puis incubé en présence de l'autre polypeptide polyHis-NR-LBD. Des Western blots sont ensuite réalisés avec des anticorps anti-polyhistidine. De la même manière que pour les techniques utilisant la radioactivité, le principal désavantage de cette technique réside dans la purification nécessaire du LBD (ou du récepteur nucléaire entier), qui s'avère être difficile à mettre en oeuvre. Les inventeurs de la présente demande proposent ici une alternative aux méthodes de détection connues, qui ne présente pas ces inconvénients. La méthode proposée évite ainsi l'utilisation de la radioactivité et se montre à la fois très sensible et facile à mettre en oeuvre. De plus, le principal avantage de la présente invention réside dans la fixation du récepteur nucléaire sur un support : seul le cofacteur est donc à purifier ce qui rend l'invention plus facile à mettre en oeuvre. La quantité de cofacteur utilisée dans les tests de criblage de la présente demande peut donc être quantifiée de manière précise ce qui permet d'assurer une visualisation plus fine du recrutement différentiel de cofacteurs par le récepteur nucléaire. De plus, cela permet d'assurer la reproductibilité et la comparaison des résultats. Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode d'identification de composés modulant l'interaction d'un récepteur nucléaire avec un ou plusieurs cofacteurs. Cette méthode permet de discriminer les composés utiles pour le recrutement différentiel de cofacteurs et peut être réalisée dans un format de criblage à haut débit de composés, en HTS (High Throughput Screening) ou en MTS (Medium Throughput Screening). L'invention fournit donc une méthode in vitro de criblage de composés modulateurs d'un récepteur nucléaire, comprenant la mise en contact d'un composé test avec (i) un polypeptide désigné NR-LBD fixé à un support solide et 20 comprenant au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR), et (ii) un polypeptide désigné CoF-NID lié à un marqueur et comprenant au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire; 25 et la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID. Le polypeptide NR-LBD comprend au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR). Préférentiellement, il s'agit d'un récepteur nucléaire entier, ce qui permet de se rapprocher au maximum des conditions in 30 vivo. Les récepteurs nucléaires préférentiellement mis en oeuvre sont les récepteurs PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) alpha, bêta et gamma, LXR (Liver X Receptor) alpha et bêta, FXR (Farnesoid X Receptor) et ROR (Retinoid-related Orphan Receptor) alpha, bêta et gamma. Les récepteurs PPAR gamma, LXR alpha et LXR bêta sont tout particulièrement préférés. Le polypeptide CoF-NID comprend au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire. Avantageusement, il s'agit du cofacteur entier. Le cofacteur est préférentiellement choisi parmi les membres de la famille p160 (NCoA1/SRC-1, NCoA2/TIF-2/SRC-2, NCoA3/ACTR/AIBI/pCIP/TRAM-1/SRC-3, etc.), DRIP205/TRAP220/PBP, NCoR/RIP13, SMRT/TRAC2, RIP140, PGC1alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Les cofacteurs SRC-1, TIF-2, DRIP205 et NCoR sont particulièrement préférés. De manière préférentielle, le support porte du glutathion - le polypeptide NR-LBD comprenant alors une Glutathion S-Transférase (GST)- , de la streptavidine ùle polypeptide NR-LBD étant alors biotinylé-, ou tous supports recouverts d'un anticorps dirigé contre un marqueur spécifique, - le polypeptide NR-LBD comprenant alors ce marqueur-, etc. Le support préférentiellement utilisé pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention est une plaque, une bille, ou une puce. Le niveau d'interaction mesuré par la méthode selon l'invention peut être comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle 20 réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur antigénique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. 25 Le marqueur antigénique est préférentiellement choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un 30 domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, de préférence la peroxidase de raifort (HRP). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie. Le test de criblage peut être alors être réalisé, de manière avantageuse, en multiplexe: le composé test est alors mis en contact en même temps avec plusieurs polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux. Dans ce cas, chaque polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent différent. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique, tel que la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase) et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence ou colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé. Dans une variante de l'invention, le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier et la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire. On peut alors sélectionner les composés modulant la liaison d'un récepteur nucléaire à un cofacteur de manière dépendante de l'ADN. La présente invention a aussi pour objet les ligands identifiés par la méthode de criblage décrite ci-dessus, utiles à titre de médicaments. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention, éventuellement en association avec un ou plusieurs autres principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques. Il s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une pathologie dans laquelle les récepteurs nucléaires tels que LXR, PPAR, FXR ou ROR sont impliqués. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus. Récepteurs nucléaires et cofacteurs Les récepteurs nucléaires ont une structure et une organisation communes avec une extrémité amino-terminale variable, un domaine de liaison à l'ADN (DBD pour DNA Binding Domain) et un domaine de liaison au ligand (LBD pour Ligand Binding Domain) à l'extrémité carboxy-terminale. La structure commune des récepteurs nucléaires peut être divisée en différents domaines : le LBD contient notamment un domaine AF-2, responsable de la régulation transcriptionnelle dépendante du ligand au travers de la liaison aux différents cofacteurs. Le domaine AF-2 permet donc le recrutement différentiel des cofacteurs et la dimérisation (homodimérisation ou hétérodimérisation du récepteur avec RXR). Certains récepteurs nucléaires présentent un domaine AF-1 responsable de la régulation transcriptionnelle indépendante dû ligand. Le récepteur nucléaire visé dans l'invention est de préférence choisi parmi les récepteurs PPAR, FXR, LXR et ROR. La famille des récepteurs PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) se composent de trois membres distincts, désignés PPAR alpha, PPAR bêta et PPAR gamma, chacun codé par un gène différent et présentant un profil d'expression différent selon les tissus. Les PPAR activés se trouvent dans la cellule sous forme d'hétérodimères avec les récepteurs de l'acide 9-cis rétinoïque (RXR pour Retinoic acid X receptor) et se fixent sur des éléments de réponse spécifiques de l'ADN, les PPRE (Peroxysome Proliferator Response Element) permettant ainsi le contrôle de la transcription de gènes cibles. Les PPAR sont impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides, PPAR alpha contrôlant l'oxydation des acides gras dans le foie et PPAR gamma contrôlant le stockage des lipides dans l'adipocyte. Au-delà du rôle direct joué par les ligands PPAR sur la régulation des lipides et des glucides, ces molécules ont un spectre d'action pléïotropique dû à la grande diversité des gènes cibles des PPAR. Des découvertes récentes montrent que les PPAR seraient impliqués dans la régulation de l'expression de nombreux gènes participant à des processus biologiques majeurs tels que l'inflammation, l'angiogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose, les activités des Nitric Oxide Synthases (NOS) et des métalloprotéases (MMPs), etc. Ces multiples propriétés font des PPAR des cibles thérapeutiques d'intérêt pour le traitement de maladies comme les maladies métaboliques, l'obésité, le diabète, les maladies occlusives vasculaires (athérosclérose, etc.), l'ischémie cérébrale, l'hypertension, les maladies liées à une néo-vascularisation (rétinopathies diabétiques, etc.), les maladies inflammatoires et auto-immunes (maladie de Crohn, psoriasis, sclérose en plaques, asthme, etc.), les maladies néoplasiques (carcinogenèse, etc.), etc. Le récepteur orphelin LXR (Liver X Receptor) existe sous deux formes : LXR alpha (NR1 H3) et LXR bêta (NR1 H2). L'expression de LXR bêta est ubiquitaire tandis que LXR alpha est principalement exprimé dans le foie, l'intestin, le rein, le tissu adipeux et les macrophages. Les deux formes de LXR utilisent le récepteur nucléaire RXR comme partenaire d'hétérodimérisation et se fixent à des éléments de réponses nommés LXRE (LXR Response Element), ce qui permet ainsi d'activer la transcription de gènes spécifiques de façon ligand dépendante. II a ainsi été démontré que LXR est activé par une classe spécifique de dérivés oxydés du cholestérol : les oxysterols tels que le 22(R)-hydroxycholesterol et le 24(S),25-epoxycholesterol. LXR régule l'expression de gènes variés dans les macrophages comme les transporteurs ABCs (ABCA1, G1, G5, G8), les apolipoprotéines (ApoE, C-I, C-IV, C-III) et la LipoProtéine Lipase (LPL). LXR présente une activité dans la régulation hépatique de la synthèse d'acides biliaires, participe au maintien de l'homéostasie du cholestérol, régule le métabolisme des acides gras et du glucose et possède une activité anti-inflammatoire. Le récepteur FXR (Farnesoid X Receptor), également connu comme RIP14 ou NR1 H4, a été initialement identifié comme étant le récepteur aux farnesoïdes. Des études supplémentaires ont permis de conclure que FXR est principalement le récepteur des acides biliaires. FXR est exprimé dans le foie, l'intestin, le rein et la glande adrénale. Il agit en formant un hétérodimère avec le récepteur RXR. Récemment, il a été démontré que plusieurs acides biliaires tels que l'Acide ChénoDéoxyCholique (CDCA) ou l'Acide DéoxyCholique (DCA) ainsi que, dans une moindre mesure, l'Acide LithoCholique (LCA), sont les ligands véritables de FXR et que ces composés activent le récepteur FXR. FXR se lie préférentiellement sur un élément de réponse constitué d'une répétition inversée de deux motifs AGGTCA séparés d'un nucléotide. Il se lie également à des répétitions du motif AGGTCA séparées de 2, 4 ou 5 nucléotides (DR-2, DR-4, DR-5). Plusieurs gènes cibles de FXR ont été identifiés tels que SHP, CYP7A1 et CYP8B, impliqués dans la synthèse des acides biliaires. Le récepteur orphelin ROR (Retinoid-related Orphan Receptor) existe sous trois formes : ROR alpha, ROR bêta et ROR gamma. ROR se lie sous forme de monomère, via un élément de réponse RORE composé d'une unique séquence de six paires de bases de motif hémipalindromique AGGTCA, précédée d'une région riche en A/T. Dans certaines conditions, ROR peut également se lier à l'ADN sous forme d'homodimère. Chaque gène ROR génère différents isoformes qui diffèrent seulement au niveau de leur partie amino-terminale : par exemple, ROR alpha possède quatre isoformes. ROR alpha semble impliqué dans le métabolisme lipidique, le contrôle de l'inflammation, le métabolisme osseux et la différenciation des myocytes. Parmi les gènes cibles de ROR alpha, on peut citer les gènes Rev- Erb alpha, IK-Balpha, laminin B1, N-myc, etc. L'expression de ROR bêta est restreinte aux différentes parties du système neuroendocrine telles que la glande pinéale, la rétine et le noyau suprachiasmatique, ce qui suggère un rôle de ROR bêta dans le cycle circadien. ROR gamma est exprimé fortement dans le thymus et joue un rôle important dans la thymopoïèse. Les séquences des ARNm et les séquences protéiques des récepteurs nucléaires humains PPAR, FXR, LXR et ROR sont disponibles sur banques de 5 données Genbank, sous les numéros d'accès suivants: 10 Les LBD ou Ligand Binding Domain représentent les domaines de liaison au ligand du récepteur nucléaire. En ce qui concerne PPAR, FXR, LXR et ROR, ces domaines sont compris entre les résidus : 15 • PPAR: alpha : 281-468, gamma : 318-505, delta : 254-441 • FXR: 215-472 • LXR : alpha : 215-447 ; bêta : 231-461 • ROR : alpha : 305-556; bêta : 211-459; gamma : 269-518. Dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, la séquence du LBD 20 utilisée pour certains récepteurs nucléaires peut inclure une partie de la région charnière comprise entre le DBD et le LBD. Ainsi, ces domaines sont définis par les bornes suivantes : • PPAR: alpha : résidus 180-468; gamma : résidus 209-505 ; delta : résidus 135-441 25 • FXR: résidus 215-472 • LXR : alpha : résidus 207-447; bêta : résidus 213-461 • ROR : alpha : résidus 171-556; bêta : résidus 83 à 459; gamma : résidus 96-518 Il est entendu que ces bornes ne sont pas fixes et qu'une modification des bornes 30 de la séquence utilisée peut être effectuée par l'homme du métier. Les DBD ou DNA Binding domain représentent les domaines de liaison à l'ADN du récepteur nucléaire. • PPAR: alpha : AY206718, Q07869 ; gamma : U79012, P37231 ; delta : AY919140, Q03181 • FXR: NM_005123, NM_021745 et Q96RI1 • LXR : alpha : U22662, Q13133; beta : NM_007121, P55055 • ROR : alpha NM_134261, P35398; bêta BCO51830, Q92753; gamma NM_005060, P51449 L'activité des récepteurs nucléaires est régulée par des cofacteurs, tels que les membres de la famille p160 (SRC-1, TIF-2, ACTR, etc.), DRIP205, NCoR, SMRT, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Ceux-ci peuvent diminuer ou abolir (on parle alors de co-répresseur) ou augmenter (on parle alors de co-activateur) leur activité transcriptionnelle. Les co-activateurs interagissent avec les récepteurs activés et stimulent la transactivation de façon significative sans altérer l'activité transcriptionnelle basale. Les co-activateurs (CoA) permettent entre autres de remodeler la chromatine et de recruter la machinerie trascriptionnelle, alors que les co- répresseurs (CoR) condensent la chromatine et empêchent l'accessibilité à la machinerie transcriptionelle. Plus d'une dizaine de co-activateurs des récepteurs nucléaires ont été clonés depuis dix ans. Un grand nombre interagit avec le domaine AF-2 des récepteurs nucléaires, par l'intermédiaire de séquences peptidiques LXXLL ou LXXLI (L : leucine ; X: acide aminé quelconque ; I : isoleucine), motif connu pour créer une surface hydrophobe capable d'interagir avec le LBD des récepteurs nucléaires. Les co-activateurs présentent la capacité d'activer la transcription lorsqu'ils sont recrutés à proximité d'un site d'initiation de la transcription. Parmi les co-activateurs, on peut citer les membres de la famille p160 DRIP205, RIP140, PGClalpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. De la même manière, les co-répresseurs, tels que NCoR et SMRT, présentent des motifs I/LXXII mis en cause dans l'interaction avec le récepteur. Le NID ou Nuclear receptor Interaction Domain désigne le domaine du cofacteur permettant l'interaction avec le récepteur nucléaire. Ce domaine contient le plus souvent un ou plusieurs motifs LXXLL pour les co-activateurs ou /LXXII pour les co-répresseurs, nécessaire(s) à cette interaction. Préférentiellement, les séquences des NID utilisées pour la mise en oeuvre des méthodes selon l'invention sont comprises entre les résidus : • SRC-1 : 570 à 782 • TIF-2 : 413 à 812 • ACTR : 601 à 780 • DRIP205 : 514 à 775 12 • NCoR : 1853 à 2440 • SMRT:2131 à 2351 • RIP140 : 476 à 705 • PGC-1 alpha : 1 à 206 • PGC-1 bêta : 1 à 462 • TRRAP : 580 à 900 ou 901 à 1394 • TReP-132: 1 à 456 ou 461 à 1200 • CBP/p300 : 1 à 452. Production des polypeptides Les polypeptides NR-LBD et CoF-NID utilisés dans la méthode de l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme de l'art, 15 notamment par synthèse artificielle et plus particulièrement par synthèse en phase solide ou par toute technique biologique, génétique ou enzymatique. De préférence les polypeptides sont des protéines de fusion, obtenues par expression d'un vecteur d'acide nucléique recombinant exprimant lesdits polypeptides dans un hôte, tel qu'une bactérie, une levure, une cellule d'insecte ou 20 de mammifère. Une production par voie recombinante dans un système bactérien, par exemple dans Escherichia coli, est particulièrement facile à réaliser. Fixation du polypeptide NR-LBD sur un support 25 Le polypeptide NR-LBD est fixé à un support solide qui peut être de toute sorte. Des plaques, notamment des microplaques et en particulier des microplaques de polystyrène ou de polypropylène, des billes paramagnétiques, des particules ou des billes solides peuvent être utilisées. On peut par exemple utiliser des billes (par exemple de Sépharose) ou une 30 plaque recouvertes d'une substance affine à laquelle se fixe le polypeptide NRLBD éventuellement modifié. II est entendu que ces bornes ne sont pas fixes et qu'une modification des bornes 10 de la séquence utilisée peut être effectuée par l'homme du métier. Test de criblage : détection de l'interaction Le polypeptide CoF-NID comprend un marqueur, de préférence sous forme fusionné au domaine NID du cofacteur. Le marquage peut être de type antigénique, fluorescent ou enzymatique. Pour les marquages antigéniques ou enzymatiques, le marqueur antigénique ou l'enzyme sont de préférence clonés en fusion avec le CoF-NID. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polypeptide CoFNID est lié à un marqueur fluorescent pour former le polypeptide CoF-NID-Fluo et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoFNID est effectuée par fluorométrie. Le marquage fluorescent peut être direct ou indirect, le fluorophore étant fixé directement sur le CoF-NID ou par l'intermédiaire d'un autre marqueur. Le marqueur fluorescent peut être par exemple la fluorescéine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (AlloPhycoCyanin), les cyanines ou l'Europium. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le marquage fluorescent est réalisé par l'intermédiaire d'un marqueur préalablement cloné en fusion avec le CoF-NID [Lumio-TagTM (invitrogen), SNAPTM (Covalys), Intéine] et relié à un fluorophore pour former le polypeptide Fluo-CoF-NID. Le marquage fluorescent du CoF-NID se passe de la manière suivante : • Dans le polypeptide Inteine-CoF-NID, l'Inteine est capable de s'autocliver et génère un groupement chimique qui réagit avec une cystéine marquée avec un fluorophore. Le polypeptide CoF-NID marqué avec un groupement cystéine-fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide LumioTM-Tag-CoF-NID, le LumioTM-Tag réagit avec un réactifLumioTM [Lumio-Green TM ou Lumio-Red TM (Invitrogen)], ce réactif devenant fluorescent lors de la formation du complexe. Un polypeptide CoF-NID marqué avec un fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide SNAPTM-Tag-CoF-NID, le SNAPTM-Tag (Covalys) clive les benzylguanines para substituées liées à un fluorophore ou à une biotine et fixe ces groupements de manière covalente. Le polypeptide CoF-NID marqué est ainsi obtenu. 2893942 14 . Dans les trois cas, on obtient un polypeptide CoF-NID-Fluo. La possibilité d'utiliser différentes molécules fluorescentes permet la mise en place d'une analyse d'interaction en multiplexe. Préférentiellement, le test de criblage est réalisé en multiplexe: le composé test est alors mis en contact avec le NR-LBD et plusieurs 5 polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux. Dans ce cas, chaque polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent différent. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID 10 est lié à un marqueur antigénique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. Ce marqueur antigénique peut être tout type de marqueur connu de 15 l'homme du métier et peut être notamment choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou d'une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. La séquence polyHis contient de préférence de 4 à 6 résidus Histidine. Préférentiellement, le marqueur antigénique est une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis). 20 Les anticorps utilisés pour détecter ce marqueur antigénique peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils peuvent être produits par des techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'anticorps commerciaux. Parmi ceux-ci, on peut citer l'anticorps penta-His HRP conjugate (QIAGEN), l'anticorps de lapin anti-6x His Abcam 9108, l'anticorps de lapin -6x His 25 marqué à la HRP (peroxidase de raifort) Abcam 1187, l'anticorps de souris -anti- 5x His Qiagen 34698, l'anticorps de souris -anti-poly-His Sigma H-1029. Les anticorps peuvent être couplés à des marqueurs détectables, connus de l'homme du métier, tels que des enzymes (par exemple la peroxidase de raifort HRP), des marqueurs radioactifs, des agents fluorescents, des particules 30 magnétiques, etc. Préférentiellement, l'anticorps est couplé à la HRP (HorseRadish Peroxydase). L'immunodétection peut être réalisée par n'importe quelle technique adaptée, par exemple un Western Blot, Dot Blot, etc. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, de préférence la peroxidase de raifort (HRP). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique. Préférentiellement, le polypeptide CoF-NID est lié à la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase). La révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID peut notamment être effectuée à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-PhosTM), la mesure de l'interaction étant alors effectuée respectivement par spectrophotométrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence et colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé. Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier et la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire. On peut alors sélectionner les composés qui interfèrent avec la liaison d'un récepteur nucléaire à un cofacteur de manière dépendante de l'ADN. Préférentiellement, l'élément de réponse est biotinylé et fixé à un support (bille, plaque, puce, etc.) portant de la streptavidine. Selon un exemple de réalisation de l'invention, l'élément de réponse au récepteur nucléaire bicaténaire est fixé aux plaques recouvertes de streptavidine. La plaque est alors incubée en présence d'un ligand spécifique et d'un extrait nucléaire de cellules surexprimant le NR, préférentiellement PPAR, LXR ou FXR, et son partenaire d'hétérodimérisation, préférentiellement RXR, marqué avec un marqueur (Tag) antigénique, enzymatique ou fluorescent. Le polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à un autre marqueur antigénique, enzymatique ou fluorescent est ensuite ajouté et l'incubation est prolongée. La révélation de l'interaction NR/RXR et NR/CoF-NID est réalisée par le biais d'une méthode d'immunodétection, enzymatique ou fluorescente. La mise en contact est alors effectuée en présence du partenaire d'hétérodimérisation du récepteur nucléaire (par exemple RXR pour les récepteurs PPAR, LXR et FXR) ce qui permet de montrer que la liaison avec le cofacteur est dépendante de l'hétérodimère. Composé test Les composés susceptibles d'être identifiés à l'aide de la méthode selon l'invention peuvent être des composés de nature, structure et origine variées, notamment des composés biologiques, des composés chimiques, synthétiques, etc. La présente invention peut donc être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être choisis parmi un produit inorganique ou organique et notamment un composé chimique ou biologique. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire. La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection, l'identification ou la caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée en HTS (High Throughput Screening) ou en MTS (Medium Throughput Screening). Pour un criblage à haut débit (HTS ou MTS) ou pour un criblage en multiplexe notamment, on utilise de préférence un support de type plaque ou puce, ledit support portant préférentiellement de la streptavidine et le NR-LBD étant alors biotinylé. Utilisation des composés tests Comme indiqué, l'invention repose sur la mise en évidence de la capacité de ligands SNuRMs à moduler l'activité des récepteurs nucléaires en permettant le recrutement différentiel de cofacteurs, ce qui offre la possibilité de contrôler plus finement l'expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires. Les SNuRMs sont en effet des agonistes ou des antagonistes de récepteurs nucléaires (NR) qui induisent une réponse différente en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire (Smith et O'Malley, 2004). La méthode de criblage selon l'invention permet préférentiellement de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand de référence. Le composé qualifié de SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (coactivateurs) ou de relarguage (co-répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs. L'analyse du profil du ligand SNuRM, c'est à dire de la capacité du composé à recruter de manière différentielle des cofacteurs, permet ensuite de tester ces ligands afin de déterminer les effets physiologiques associés. De plus, la méthode selon l'invention permet la mise en place d'études de type structure/activité : le ligand entraine en effet des modifications de structure du récepteur nucléaire, notamment au niveau du LBD. Ces modifications sont le reflet de l'activité du ligand et du recrutement différentiel de cofacteurs et présentent donc un intérêt majeur. Selon un mode de réalisation de l'invention, le niveau d'interaction mesurée avec la méthode selon l'invention est comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire. Ceci permet de générer un classement. des ligands SNuRMs et,. en fonction des effets physiologiques désirés, de sélectionner la classe de SNuRMs ou les profils de recrutement associés à ces effets désirés. Il est alors avantageux d'utiliser les tests correspondants à ces profils pour trouver les composés SNuRMs possédant ces effets physiologiques recherchés sans effets secondaires indésirables. La présente invention a aussi pour objet les ligands identifiés par la méthode de criblage décrite ci-dessus, utiles à titre de médicaments. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un support. acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention, éventuellement en association avec un ou plusieurs autres principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques. Il s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une pathologie dans laquelle les récepteurs nucléaires tels que LXR, PPAR, FXR ou ROR sont impliqués. On peut citer par exemple le diabète, les dyslipidémies, l'insulino-résistance, les pathologies liées aux dérèglements du métabolisme lipidique et/ou glucidique (hyperlipidémie, hyperglycémie, etc.), les pathologies associées au syndrome X, l'athérosclérose, les maladies cardiovasculaires, l'obésité, l'hypertension, les maladies inflammatoires (asthme, etc.), les maladies prolifératives (cancers, etc.), etc. A titre d'exemple (et de manière non limitative), les autres agents 5 thérapeutiques et/ou cosmétiques, commercialisés ou en développement, peuvent être choisis parmi: des anti-diabétiques, l'insuline, - des molécules hypolipémiantes et/ou hypocholestérolémiantes, 10 - des agents anti-hypertenseurs et les agents hypotenseurs, - des agents anti-plaquettaires, - des agents anti-obésité, - des agents anti-inflammatoires, - des agents anti-oxydants, 15 - des agents utilisés dans le traitement de l'insuffisance cardiaque, des agents utilisés pour le traitement de l'insuffisance coronaire, des anticancéreux, des anti-asthmatiques, des corticoïdes utilisés dans le traitement des pathologies de la peau, 20 des vasodilatateurs et/ou des agents anti-ischémiques. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus. L'invention concerne également une méthode de traitement des pathologies 25 mentionnées ci-dessus comprenant l'administration à un sujet, notamment humain, d'une quantité efficace d'un composé ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-avant. Par traitement, on entend aussi bien le traitement préventif que curatif. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent 30 avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique et bien connus de l'homme du métier. Les modes et voies d'administration ainsi que les doses peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction du patient et de la pathologie. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. FIGURES • Figure 1: schéma de principe de la réaction pull-down avec immunodétection, réalisée avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes portant du glutathion et avec un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis. La révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, la peroxidase de raifort (HRP pour HorseRadish Peroxydase). • Figure 2 : schéma de principe de la réaction pull-down avec détection enzymatique BAP, réalisée avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes portant du glutathion et avec un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP. La révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est réalisée par le biais d'une réaction colorimétrique, luminescente ou fluorescente, en fonction du substrat utilisé pour la BAP. • Figure 3 : schéma de principe de la réaction pull-down ADN-dépendant, réalisé avec l'hétérodimère NR/RXR. L'élément de réponse au récepteur nucléaire bicaténaire est fixé aux plaques recouvertes de streptavidine. La plaque est incubée en présence d'un ligand spécifique et d'un extrait nucléaire de cellules surexprimant le NR pleine longueur et son partenaire RXR marqué avec un marqueur (Tag) antigénique, enzymatique ou fluorescent. Le polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à un autre marqueur antigénique, enzymatique ou fluorescent est ensuite ajouté et l'incubation est prolongée. La révélation de l'interaction NR/RXR et NR/CoF-NID est réalisée par le biais d'une méthode d'immunodétection, enzymatique ou fluorescente. • Figure 4 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et de cofacteurs DRIP205, TIF-2 et SRC-1. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de His-CoF NID purifié (His-DRIP205 NID, His-SRC-1 NID, His-TIF-2 NID) en présence de DMSO (0.1%), de rosiglitazone (10-5 M) et des ligands A, B et C (10"5 M). Les billes sont ensuite lavées et les polypeptides GST-LBD PPAR gamma sont élués en présence de glutathion. L'ensemble est alors fixé sur une membrane de nitrocellulose et le Dot Blot est développé à l'aide d'un anticorps anti-His Tag. • Figure 5 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de LXR alpha et de LXR bêta et des cofacteurs DRIP205 et TIF-2. Le polypeptide GST-LBD LXR alpha ou bêta lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de His-CoF NID purifié (His-DRIP205 NID, His-TIF-2 NID) en présence de DMSO (0.1%), de T0901317 (10-6 M) et de GW3965 (10-6 M). Les billes sont ensuite lavées et les polypeptides GST-LBD LXR alpha et bêta sont éluée en présence de glutathion. L'ensemble est alors fixé sur une membrane de nitrocellulose et le Dot Blot est développé à l'aide d'anticorps anti-His Tag. • Figure 6 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et des cofacteurs TIF- 2 et DRIP205. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de CoF-NIDBAP purifié (DRIP205-NID-BAP, TIF-2-NID-BAP) en présence de DMSO (0.1%) et de différentes concentrations des ligands E et F. Les billes sont ensuite lavées et incubées en présence de Lumi-PhosTM (Pierce), un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre. • Figure 7 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et du corépresseur NCoR. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de NCoR-NID-BAP purifié en présence de DMSO (0.1 %), de différentes concentrations de rosiglitazone et de différentes concentrations de l'antagoniste GW9662. Les billes sont ensuite lavées et incubées en présence de Lumi-PhosTM (Pierce), un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre. EXEMPLES Exemple 1 : Pull-down avec immunodétection 1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID Les protéines de fusion GST-NR-LBD ont été générées en clonant le LBD de chaque récepteur nucléaire (PPAR alpha, bêta et gamma, FXR, LXR alpha, bêta, ROR alpha et gamma) humain en aval de la région codante de la Glutathion STransferase (GST) dans le plasmide pGEX4T. Pour certains NR, la séquence clonée inclut une partie de la région charnière comprise entre le DBD et le LBD. Ainsi, les polypeptides GST-PPAR alpha, GST-PPAR gamma, GST-PPAR delta, GST-LXR alpha, GST-LXR bêta, GST-FXR, GST-ROR alpha et GST-ROR gamma sont générés en clonant respectivement la région comprise entre les résidus 180-468, 209-505, 135-441, 207-447, 213-461, 215-472, 84-468 et 97-518. Les NID des différents cofacteurs utilisés ont été clonés en fusion avec un His-Tag (contenant 6 résidus His (6xHis)). Les cofacteurs utilisés sont de la famille p160 (NCoAl/SRC-1, NCoA2/TIF-2/SRC-2, NCoA3/ACTR/AIBI/pCIP/TRAM-1/SRC-3, etc.), DRIP205/TRAP220/PBP, NCoR/RIP13, SMRT/TRAC2, RIP140, PGClalpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Ainsi, les polypeptides His-SRC-1-NID, His-TIF-2-NID, His-ACTR-NID, His-DRIP205-NID, His-NCoR-NID, His-SMRT-NID, His-RIP140-NID, His-PGC1 alpha-NID, His-PGC1 bêta-NID, His-TRRAP-NID, His-TReP132-NID et His-CBP/p300-NID sont générés en clonant respectivement la région comprise entre les résidus 570 à 782, 413 à 812, 601 à 780, 514 à 775, 1853 à 2440, 2131 à 2351, 476 à 705, 1 à 206, 1 à 462, 580 à 900 ou 901 à 1394, 1 à 456 ou 461 à 1200, 1 à 452. 2- Production des protéines recombinantes CoF-NID Les constructions plasmidiques obtenues sont transfectées dans une souche bactérienne E. coli BL21 qui permet l'expression de ces protéines recombinantes. Les bactéries sont lysées par sonication dans un tampon phosphate (NaH2PO4 50 mM, NaCI 300 mM, Imidazole 10 mM, 10% glycerol, PH 8.0), incubées 30 min sur glace et centrifugées 20 min à 6000 g. Le surnageant est ensuite incubé en présence d'une résine recouverte Nickel-NTA (QIAGEN). L'élution des protéines retenues par la résine en présence de 250 mM d'imidazole permet d'obtenir une fraction purifiée des différents NID de cofacteur. Les protéines sont dosées et conservées à -20 C. 3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Les culots issus des cultures de bactéries BL21 transformées avec les plasmides codant pour les protéines de fusion GST-NR-LBD ont été lysés par sonication dans un tampon de lyse (PBS lx, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, 0.1% NP-40, PH 7.4), incubés 30 min sur glace et centrifugés 20 min à 6000 g. Le lysat clarifié est ensuite incubé pendant 3 heures en présence de billes recouvertes avec du glutathion (Amersham Biosciences). Ces billes sont rincées plusieurs fois dans le tampon de lyse puis stockées à 4 C. La quantité de protéine en fusion avec la GST liée sur les billes est déterminée par SDS-PAGE. 4-Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID en présence du ligand 3 à 15 microgrammes de GST-NR-LBD sont incubés avec différentes quantités de protéines His-CoF-NID en présence ou en absence de ligands spécifiques des différents récepteurs (PPAR alpha : fénofibrate ; PPAR gamma : A, B, C, E, F, rosiglitazone ; PPAR delta : GW501516 ; LXR : T0901317 et GW3965 ; FXR : CDCA (chenodeoxycholate), GW4064 ; ROR : cholesterol sulfate) pendant 2 heures dans un tampon d'interaction (Tris-HCI 15 mM, Glycerol 15%, EDTA 0.1 mM, NP40 0.04%, KC1 75 mM, BSA 0.25 g/l, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, protease inhibitor cocktail tablet (Roche), pH 8.0). L'ensemble est ensuite lavé 4 fois à l'aide du même tampon. 5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID La mise en évidence de l'interaction de la protéine His-CoF-NID avec la protéine GST-NR-LBD est réalisée à l'aide d'une méthode immunologique avec un anticorps anti His-Tag couplé à l'HRP (QIAGEN). Les billes sont rincées 4 fois avec le tampon d'interaction puis additionnées d'un volume de tampon de Laemmli (BIORAD #161-0737) et chauffées 5 min à 95 C. L'extrait est alors déposé sur un gel SDS-PAGE à 12% puis les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose. Dans une autre alternative, les billes lavées sont incubées dans un tampon d'élution (50 mM Tris-HCI, 10% glycérol, 150 mM KCI, EDTA 0.5 mM, Glutathion : 3mg/mI, PH 8.0) pendant 30 min. L'éluat est directement transféré sur membrane de nitrocellulose à l'aide d'un appareil BIO-DOT TM (BIORAD). Dans les deux cas, l'interaction est alors quantifiée par Western-Biot: la membrane de nitrocellulose est alors incubée en présence d'un anticorps anti-His couplé à l'HRP pendant 2 heures dans un tampon TBS (Tris-HCI 20 mM, 500 mM NaCl, 5% de lait écrémé, pH 7,4) puis lavée dans un tampon de lavage (Tris-HCI 20 mM, 500 mM NaCl, Tween 20 0.05%, pH 7,4) 3 fois pendant 10 min. L'activité HRP est alors révélée à l'aide du Kit ECLTM Western blotting detection reagent (Amersham Biosciences), selon les indications du déposant. 6- Résultats Cette méthode permet de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand de référence. Le composé qualifié de SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (co-activateurs) ou de relarguage (co-répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs. Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et les cofacteurs DRIP205, TIF-2 et SRC-1, présentés sur la figure 4, montrent un recrutement différentiel de cofacteurs en fonction du ligand utilisé (A, B, C ou rosiglitazone). En effet, les ligands A, B, C et la rosiglitazone induisent un recrutement de DRIP205 équivalent tandis que le recrutement de SRC-1 est au moins 4 fois plus faible avec les ligands B et C par rapport au recrutement induit par le ligand A et la rosiglitazone. De plus, nous constatons que le ligand C induit un recrutement 2 fois plus faible de TIF-2 en comparaison avec le ligand B. Ces 4 ligands induisent donc un recrutement différentiel des cofacteurs. Ils peuvent donc être considérés comme des modulateurs sélectifs des récepteurs PPAR (ligands désignés SPPARM , pour Selective PPAR Modulators). Les résultats des expériences réalisées avec les récepteurs nucléaires LXR alpha et LXR bêta et avec les cofacteurs TIF-2 et DRIP205, en présence des ligands T0901317 et GW3965, sont présentés sur la figure 5. On constate, pour LXR alpha, que le T0901317 entraîne un recrutement légèrement supérieur à GW3965, quel que soit le cofacteur et que le recrutement de DRIP205 par les 2 ligands est moindre que celui de TIF-2. Pour LXR bêta, le recrutement des 2 cofacteurs DRIP205 et TIF-2 semble être similaire pour les 2 ligands. De la même manière que pour LXR alpha, le recrutement de DRIP205 est moindre que celui de TIF-2. Exemple 2 : Pull-clown avec détection enzymatique 1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID Le clonage de protéines NR-LBD et CoF-NID est effectué de la manière décrite clans l'exemple 1, le CoF-NID étant cette fois cloné en fusion (C Terminal) avec la 25 Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP) dans le plasmide pRSET (CoF-NID-BAP). 2- Production des protéines recombinantes CoF-NID-BAP Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1. 30 3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1. 4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID-BAP en présence du ligand Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1, les billes étant lavées dans un tampon Tris-HCI, KCI 100 mM Ph 8.0. 5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID Les rinçages après incubation sont réalisés dans un tampon Tris-HCI additionné de KCI. Les billes sont alors incubées à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-PhosTM): • Pendant 3 heures dans une solution de pNPP (SIGMA substrat coloré à 10 mM / Tris-HCI 100 mM PH 8.0) • Pendant 1 heure dans une solution de FDP (Euromedex, substrat fluorescent) à 30 microM ; ou • Pendant 30 min dans une solution de Lumi-PhosTM WB (Pierce), l'interaction relative de chaque cofacteur avec le récepteur nucléaire étant alors mesurée respectivement par spectrophotométrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence. 6- Résultats Cette méthode permet de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand agoniste de référence (qualifié de full agonist ). Le composé ligand SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (co-activateurs) ou de relarguage (co- répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs. Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et les cofacteurs DRIP205 et TIF-2, présentés sur la figure 6, montrent un recrutement différentiel des cofacteurs avec les ligands E ou F. En effet, les ligands E ou F induisent un recrutement de DRIP205 tandis que le recrutement de TIF-2 n'est observé qu'avec le ligand E. Ce dernier peut donc être considéré comme un modulateur sélectif du récepteur PPAR. Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et avec le corepresseur NCoR en présence de différentes concentrations de rosiglitazone sont présentés sur la figure 7. On constate, sur la figure 7A, que la rosiglitazone est capable d'induire la libération de NCoR du complexe PPAR gamma-NCoR. D'autre part, la figure 7B montre que, contrairement à la rosiglitazone (agoniste), un antagoniste de PPAR gamma (GW9662) est capable d'induire une augmentation de l'interaction entre PPAR gamma et NCoR. Cette méthode permet donc de mettre en évidence l'activité agoniste inverse d'un ligand. Exemple 3 : Pull-down avec détection enzymatique à moyen débit (MTS). 1- Clonaqe des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID-BAP Les protéines de fusion NR-LBD biotinylées (Biotin-NR-LBD) ont été générées en clonantle LBD de chaque récepteur nucléaire (PPAR alpha, bêta et gamma, FXR, LXR alpha, bêta, ROR alpha et gamma) humain dans le plasmide pRSET en aval de la région codante de la séquence BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein) de la protéine BCCP/FabE (X14825, AA 70-156) d'Esherichia coli permettant la biotinylation de la protéine (Biotin-LBD) lors de l'expression. Les séquences codantes des NR-LBD sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1. Ces protéines sont produites et purifiées de la manière décrite dans l'exemple 1. 2- Production des protéines recombinantes CoF-NID-BAP Les polypeptides CoF-NID-BAP sont clonés et produits de la manière décrite dans l'exemple 2. 3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Des plaques 96 puits recouvertes avec de la streptavidine (Pierce) sont incubées avec le polypeptide Biotin-NR-LBD purifié dans un tampon de liaison (Tris-HCI 20 mM, NaCl 150 mM, 0.05% Tween 20 pH 7.2) pendant 2 heures. La plaque est alors rincée en utilisant le même tampon. 4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID-BAP en présence du ligand Les plaques sont ensuite incubées avec différents CoF-NID-BAP dans le tampon d'interaction de la manière décrite dans l'exemple 2. 5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID La plaque subit alors une nouvelle série de lavage et l'interaction avec chaque cofacteur est mesurée de la manière décrite dans l'exemple 2. La mesure de l'interaction du NR avec différents cofacteurs permet ainsi une mise en oeuvre de l'invention à plus haut débit. Exemple 4: Pull-down avec détection par fluorescence en multiplexe à moyen débit (MTS). 1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID Les Biotin-NR-LBD sont clonés de la manière décrite dans l'exemple 3. Les CoF-NID sont clonés avec différents marqueurs permettant un marquage fluorescent ultérieur: Intein, LumioTM-Tag (Invitrogen) et SNAPTM-Tag (Covalys). Pour le système Intein, le polypeptide CoF-NID est cloné en fusion avec l'intéine. Pour le système LumioTM (Invitrogen), le polypeptide CoF-NID est cloné en fusion avec un marqueur comportant 6 résidus (Cys-Cys-Pro-Gly-Cys) (LumioTM-Tag). Pour le systéme SNAPTM (Covalys), le CoF-NID est cloné en fusion avec le SNAPTM-Tag. La production et la purification des protéines sont décrites dans l'exemple 3. 2- Marquage des protéines recombinantes CoF-NID 25 Le marquage fluorescent du CoF-NID se réalise de la manière suivante : • Dans le polypeptide Inteine-CoF-NID, l'Inteine s'autoclive sous certaines conditions et génère un groupement chimique qui réagit avec une cystéine marquée avec un fluorophore. Le polypeptide CoF-NID marqué avec un groupement cystéine-fluorophore est ainsi obtenu. 30 • Dans le polypeptide LumioTM-Tag-CoF-NID, le LumioTM-Tag réagit avec un réactif LumioTM (Lumio-Green TM ou Lumio-Red TM (Invitrogen)), ce réactif devenant fluorescent lors de la formation du complexe. Un polypeptide CoF-NID marqué avec un fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide SNAPTM-Tag-CoF-NID, le SNAPTM-Tag (Covalys) clive les benzylguanines para substituées liées à un fluorophore ou à une 5 biotine. Le polypeptide CoF-NID marqué est ainsi obtenu. Dans les trois cas, on obtient un polypeptide CoF-NID-Fluo et la possibilité d'utiliser différentes molécules fluorescentes permet la mise en place d'une analyse d'interaction en multiplexe. 3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 3. 4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID en présence du 15 ligand Les plaques sont ensuite incubées avec plusieurs CoF-NID marqués avec des fluorophores différents au sein d'un même puit (multiplexage) dans le tampon d'interaction puis rincées de la manière décrite dans l'exemple 2. 20 5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID-Fluo L'interaction relative de chaque cofacteur avec le récepteur nucléaire est alors mesurée par fluorimétrie. L'excitation et l'émission varient en fonction du fluorophore à détecter. 25 Exemple 5: Méthode de détection de l'interaction du récepteur avec le cofacteur en présence d'ADN (élément de réponse de gènes cibles du NR considéré) 1- Clonage des protéines recombinantes NR et CoF-NID 30 Les NR sont clonés en pleine longueur dans le plasmide pcDNA3. RXR est cloné en phase avec un marqueur immunogène en N-terminal, luminescent ou permettant un marquage fluorescent. 10 Les CoF-NID sont clonés et produits de la manière décrite dans les exemples 1 à 4. 2- Marquage des protéines recombinantes CoF-NID (CoF-NID-Fluo) et des lysats 5 nucléaires Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 4. 3- Synthèse des éléments de réponse (RE) au NR Des oligonucléotides complémentaires correspondants à différents RE issus des 10 séquences de différents promoteurs de gènes cibles sont rendus bicaténaires dans un tampon d'hybridation (Tris-HCI 250mM, 125 mM KCI, MgCl2 2mM, DTT 10mM, PH8.0). Des plaques 96 puits recouvertes avec de la streptavidine (Pierce) sont incubées avec chaque oligonucléotide double-brin dans un tampon de liaison. La plaque est alors rincée en utilisant le même tampon. 15 4-Interaction des protéines NR avec l'ADN et les CoF-NID en présence du ligand Les plaques sont alors incubées en présence d'un lysat nucléaire de cellules préalablement transfectées à l'aide des plasmides pcDNA3-RXR (partenaire d'hétérodimerization de PPAR, LXR et FXR) pleine longueur marqués et pcDNA3- 20 NR pleine longueur en présence de ligands spécifiques des récepteurs nucléaires considérés dans un tampon HEPES [ 20 mM HEPES, KCL 150 mM, MgCl2 5 mM, Triton 0.1%, NP40 0.1%, Gelatin 0.1%, benzamidine 1 mM, protease inhibitor cocktail tablet (Roche), pH 8.0] pendant 2 heures. Puis les polypeptides CoF-NID sont ajoutés et l'incubation est prolongée d' 1 h. Les plaques sont ensuite rincées 25 dans le même tampon. 5- Quantification de l'interaction ADN / NR et ADN / NR / CoF-NID L'interaction du NR avec RXR et avec les polypeptides CoF-NID est mesurée de la manière décrite dans les exemples 1 à 4. 30 REVENDICATIONS 1. Méthode in vitro de criblage de composés modulateurs d'un récepteur nucléaire, comprenant la mise en contact d'un composé test avec : (i) un polypeptide désigné NR-LBD fixé à un support solide et comprenant au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR), et (ii) un polypeptide désigné CoF-NID lié à un marqueur et comprenant au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire; et la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le récepteur nucléaire est choisi parmi les récepteurs PPAR, LXR, FXR et ROR. 3. Méthode selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le 20 cofacteur est choisi parmi les membres de la famille p160, DRIP205, NCoR, SMRT, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le cofacteur est un membre de la famille p160 choisi parmi SRC-1, TIF-2, et ACTR. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support porte du glutathion, le polypeptide NR-LBD comprenant alors une Glutathion S-Transférase (GST) ou de la streptavidine, le polypeptide NR-LBD étant alors biotinylé. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support est une plaque, une bille ou une puce. 25 30 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le niveau d'interaction mesuré est comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur antigénique, la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF- 10 NID étant alors effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit marqueur antigénique est choisi parmi une une séquence d'acides aminés polyhistidine 15 (polyHis), un élément cMyc, Flag ou un fragment de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. 10. Méthode selon la revendication 9, comprenant la mise en contact du composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné 20 à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NRLBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti- 25 polyHis couplé à un marqueur détectable. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée 30 par fluorométrie. 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit marqueur fluorescent est la fluoresceine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (Allophycocyanin), les cyanines ou l'Europium. 13. Méthode selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que le marqueur fluorescent est lié au polypeptide CoF-NID par le biais d'un autre marqueur, tel que l'inteine, le LumioTM-Tag ou le SNAPTM-Tag. 14. Méthode selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'elle est réalisée en multiplexe : le composé test est alors mis en contact en même temps avec plusieurs polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux. 15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique et en ce que la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique. 16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit marqueur enzymatique est la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase). 17. Méthode selon la revendication 16, comprenant la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence ou colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé. 18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est le cofacteur entier. 5 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire. 10