Brevet FR2893327A1 — publié le 20070518

La présente invention concerne un ensemble de types de prényl-transférase provenant d'Hevea brasiliensis et un amas de gènes codant pour ladite enzyme. Jusqu'à présent, les gènes de l'isopentényl- diphosphate-isomérase (IPP-isomérase), de la farnésyldiphosphate-synthase, de la prényl-diphosphate-synthase à chaîne courte du type trans, de la géranylgéranyldiphosphate-synthase et de la prényl-diphosphate-synthase du type cis ont été isolés d'Hevea Brasiliensis, et l'analyse fonctionnelle des enzymes codées par ces gènes a été effectuée. Comme pour certaines des prényl-diphosphatesynthases du type trans provenant d'animaux et de procaryotes, la corrélation entre la séquence d'aminoacides et la longueur en nombre d'atomes de carbone du produit (trans-prényl-diphosphate) a été élucidée. En ce qui concerne les documents connus qui ont été publiés dans le passé, ces documents comprennent la demande de brevet sur l'IPP-isomérase d'Hevea brasiliensis (publication de brevet japonais N 2000-200276), la publication scientifique sur le clonage de l'IPP-isomérase provenant d'Hevea brasiliensis (Soo Kyung Oh et al., J. Plant Physiol. 157(2000) 549-557), la publication scientifique sur le clonage de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase provenant d'Hevea brasiliensis (A. Takaya et al., Biochimica et Biophysica Acta 1625(2003) 214-200), et la publication scientifique sur le clonage de la cis-prényl-transférase provenant d'Hevea brasiliensis (K. Asawatreratanaku Eur. J. Biochem. 270(2003) 4671-4680). L'enzyme, qui agit en catalysant la ligation de l'isopentényl-diphosphate (IPP) avec un substrat allylique de manière séquentielle, est désignée généralement sous le nom de prényl-transférase, car elle assure la ligation de manière séquentielle du motif isoprène. En outre, le terme "prényl-transférase" désigne de manière générale un concept d'enzyme catalysant la réaction de condensation entre l'IPP et un isoprényl-diphosphate (C5n) (substrat allylique) et la synthèse d'un isoprényl-diphosphate nouveau (C5n+1) auquel a été ajouté un motif isoprène supplémentaire. Le terme "prényl-transférase" désigne un amas d'enzymes synthétisant divers isoprényl-diphosphates tels que le géranyl-diphosphate (GPP : C10), le farnésyldiphosphate (FPP : C15), le géranylgéranyl-diphosphate (GGPP : C20), le géranyl-féranyl-diphosphate (GFPP : 25) et l'hexaprényl-diphosphate. La prényl-transférase sert de précurseur de base de divers terpénoïdes par ligation du motif isoprène et est située dans la voie principale de la biosynthèse des terpénoïdes. Les isoprényl-diphosphates qui sont produits par diverses prényl-transférases sont représentés sur la figure 1. De la manière précitée, le terme "prényl-transférase", conformément à la présente invention, désigne de manière générale les enzymes catalysant la réaction d'addition d'un motif isoprène, comprenant toutes les enzymes telles que la géranyldiphosphate-synthase, la farnésyl-diphosphate-synthase, la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, la géranyl-farnésyl-diphosphate-synthase et l'hexaprényl-diphosphate-synthase. L'analyse concernant l'armas de gènes de prényltransférase provenant d'Hevea brasiliensis n'a pas été encore suffisamment élucidée. L'objectif de l'invention consiste à isoler l'amas de gènes de prényl-transférase provenant d'Hevea brasiliensis et à analyser les séquences de nucléotides des gènes respectifs constituant l'amas de gènes précité. La séquence considérée comme étant incorporée à l'amas de gènes de prényl-transférase est spécifiée par une analyse syntactique de l'information sur les fragments de gènes obtenue par analyse EST (des marqueurs de séquence d'expression) d'Hevea brasiliensis et de l'information correspondant à la base de données de gènes connue, et ledit homologue de gène est obtenu par clonage d'un ADNc complet. L'amas de gènes de la présente invention codant pour des prényl-transférases est un amas de gènes codant pour un groupe d'enzymes impliquées dans la biosynthèse du squelette isoprène du caoutchouc naturel. En conséquence, des plantes utiles dans la pratique et qui produisent une grande quantité de caoutchouc naturel peuvent être produites par transformation de plantes, notamment de plantes productrices de caoutchouc, par l'amas de gènes obtenu dans la présente invention. Plus spécifiquement, il peut être escompté d'augmenter la quantité de caoutchouc naturel produite en produisant un Hevea brasiliensis transformé en introduisant l'amas de gènes de la présente invention. Maintenant, ici, l'expression "améliorer la productivité du caoutchouc" désigne l'augmentation de la quantité de caoutchouc produite en introduisant le gène de prényl-transférase de la présente invention. La figure 1 est une figure représentant des isoprénoïde-diphosphates qui sont produits par divers types de prényl-transférases. L'ARN total a été extrait du latex de l'arbre classique et du xylème de la branche de l'année en cours d'Hevea brasiliensis de manière à préparer des banques d'ADNc. Une analyse de séquence en une passe exhaustive a été effectuée sur ces banques. 16 407 séquences EST ont été ensuite obtenues à partir de la banque d'ADNc préparée à partir de latex et 16 305 séquences EST provenant de la banque d'ADNc ont été obtenues à partir du xylème avec une grande précision (total 32 442). Sur les séquences partielles obtenues, une analyse de groupement basée sur la similarité entre les séquences et une analyse d'annotation basée sur la comparaison avec des gènes connus ont été effectuées, ainsi, une base de données d'EST d'Hevea brasiliensis a été construite. Dans la base de données d'EST obtenue, les inventeurs 35 ont trouvé des séquences EST qui sont considérées comme codant pour la géranyl-diphosphate-synthase et la géranylgéranyl-diphosphate-synthase. En ce qui concerne ces séquences, les inventeurs ont déterminé la séquence 3'-terminale par 3'-RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) et ont obtenu des ADNc complets. Un gène codant pour la géranyl-diphosphate-synthase est représenté par les nucléotides numéros 1 à 1074 dans la SEQ ID N 1 dans la liste des séquences. La partie correspondant aux nucléotides numéros 126 à 1043 dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 1 dans la liste des séquences correspond au cadre de lecture ouvert. Une séquence d'aminoacides déduite de la géranyl-diphosphatesynthase obtenue à partir de la séquence de nucléotides du cadre de lecture est représentée par les aminoacides numéros 1 à 306 dans la SEQ ID N 2 dans la liste des séquences. A ce propos, la géranyl-diphosphate-synthase est une enzyme qui catalyse la réaction de biosynthèse du géranyl-diphosphate en utilisant de l'isopentényldiphosphate et du diméthylallyl-diphosphate comme substrat. Un gène codant pour la géranylgéranyl-diphosphate- synthase est représenté par les nucléotides numéros 1 à 1662 dans la SEQ ID N 3 dans la liste des séquences. La partie correspondant aux nucléotides numéros 181 à 1098 dans la liste de séquences de nucléotides dans la SEQ ID N 3 dans la liste des séquences correspond au cadre de lecture ouvert. Une séquence d'aminoacides déduite de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase obtenue à partir de la séquence de nucléotides du cadre de lecture est représentée par les aminoacides numéros 1 à 306 dans la SEQ ID N 4 dans la liste des séquences. A ce propos, la géranylgéranyl-diphosphate-synthase est une enzyme qui catalyse la réaction de biosynthèse du géranylgéranyldiphosphate en utilisant de l'isopentényl-diphosphate et du diméthylallyl-diphosphate comme substrat. Un gène codant pour le géranylgéranyl-diphosphate obtenu à partir d'un autre clone est représenté par les nucléotides numéros 1 à 1278 dans la SEQ ID N 5 dans la liste des séquences. La partie correspondant aux nucléotides numéro 54 à 1043 dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 5 dans la liste des séquences correspond au cadre de lecture ouvert. Une séquence 5 d'aminoacides déduite de la géranylgéranyl-diphosphatesynthase obtenue à partir de la séquence de nucléotides du cadre de lecture est représentée par les aminoacides numéros 1 à 330 dans la SEQ ID N 6 dans la liste des séquences. A ce propos, la géranylgéranyl-diphosphate- synthase est une enzyme qui catalyse la réaction de biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant de 1'isopentényl-diphosphate et du diméthyllalyl-diphosphate comme substrat. Un gène codant pour la géranylgéranyl-diphosphate- synthase obtenue à partir d'un autre clone est représenté par les nucléotides numéros 1 à 1181 dans la SEQ ID N 7 dans la liste des séquences. La partie correspondant aux nucléotides numéros 54 à 1037 dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 7 dans la liste des séquences correspond au cadre de lecture ouvert. Une séquence d'aminoacides déduite de la géranylgéranyl-diphosphatesynthase obtenue à partir de la séquence de nucléotides du cadre de lecture est représentée par les aminoacides numéros 1 à 328 dans la SEQ ID N 8 dans la liste des séquences. A ce propos, la géranylgéranyl-diphosphatesynthase est une enzyme qui catalyse la réaction de biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant de 1'isopentényl-diphosphate et du diméthylallyl-diphosphate comme substrat. Suivant des techniques de formation d'ADN recombinant, un site particulier de l'ADN initial peut être soumis à une mutation artificielle, sans modifier les propriétés fondamentales de l'ADN ou bien de manière à améliorer ces propriétés. En ce qui concerne les gènes ayant des séquences de nucléotides naturelles fournies conformément à la présente invention, ou même des gènes ayant des séquences de nucléotides différentes de la séquence naturelle, on peut effectuer des insertions, délétions et substitutions artificielles de la même manière, et ces gènes peuvent être modifiés de manière à avoir des propriétés égales ou supérieures à celles des gènes naturels. En outre, la présente invention comprend ces gènes mutés. Plus précisément, un gène consistant en une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 1 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en un gène dans lequel un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 nucléotides dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 1 a été substitué. En outre, un tel gène présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 1. Même un tel gène est également inclus dans le cadre de la présente invention, tant que le gène code pour une protéine ayant les fonctions de la géranyl-diphosphate-synthase, assurant la biosynthèse du géranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. En outre, un tel gène s'hybride avec le gène représenté dans la SEQ ID N 1 dans des conditions drastiques. De même, un gène consistant en une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 3 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en un gène dans lequel un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 nucléotides dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 3 a été substitué. En outre, un tel gène présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 3. Même un tel gène est également inclus dans le cadre de la présente invention, tant que le gène code pour une protéine ayant les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyldiphosphate comme substrat. En outre, un tel gène s'hybride avec le gène représenté dans la SEQ ID N 3 dans des conditions drastiques. De même, un gène consistant en une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 5 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en un gène dans lequel un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 nucléotides dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 5 a été substitué. En outre, un tel gène présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 5. Même un tel gène est également inclus dans le cadre de la présente invention, tant que le gène code pour une protéine ayant les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyldiphosphate comme substrat. En outre, un tel gène s'hybride avec le gène représenté dans la SEQ ID N 5 dans des conditions drastiques. De même, un gène consistant en une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 7 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en un gène dans lequel un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 nucléotides dans la séquence de nucléotides dans la SEQ ID N 7 est substitué. En outre, un tel gène présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence de nucléotides représentée dans la SEQ ID N 7. Même un tel gène est également inclus dans le cadre de la présente invention, tant que le gène code pour une protéine ayant les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyldiphosphate comme substrat. En outre, un tel gène s'hybride avec le gène représenté dans la SEQ ID N 7 dans des conditions drastiques. L'homme de l'art peut choisir des conditions pour l'hybridation ad libitum. Une membrane sur laquelle une molécule d'ADN ou d'ARN à tester a été transférée et une sonde marquée peuvent être hybridées dans un tampon d'hybridation approprié. Le tampon d'hybridation peut être composé de SSC 5 x avec 0,1 % en poids de N-lauroylsarcosine, 0,02 % en poids de SDS, 2 % en poids de réactif de blocage pour l'hybridation de nucléotides et 50 % en poids de formamide, par exemple. Comme réactif de blocage pour l'hybridation de nucléotides, par exemple le réactif de blocage disponible dans le commerce pour l'hybridation de nucléotides peut être dissous dans une solution de tampon (pH 7,5) constituée de 0,1 M d'acide maléique et 0,15 M de NaCl pour porter la concentration du réactif de blocage à 10 %. Le SSC 20 x peut être constitué d'une solution de NaCl 3 M et d'acide citrique 0,3 M. Le SSC peut être utilisé de préférence à une concentration de SSC de 3 à 6 x, et plus avantageusement à une concentration de SSC de 4 à 5 x. L'hybridation peut être effectuée à une température de 40 à 80 C, avantageusement de 50 à 70 C, et plus avantageusement à une température de 55 à 65 C. Le lavage peut être effectué en utilisant un tampon de lavage après incubation pendant plusieurs heures ou une nuit. Le lavage peut être effectué de préférence à température ambiante et plus avantageusement à la température d'hybridation. Le tampon de lavage peut être constitué d'une solution de SSC 6 x + 0,1 % en poids de SDS, de préférence d'une solution de SSC 4 x + 0,1 % en poids de SDS, plus avantageusement d'une solution de SSC 2 x + 0,1 % en poids de SDS, encore plus avantageusement d'une solution de SSC 1 x + 0,1 % en poids de SDS et de préférence constitué d'une solution de SSC 0,1 x + 0,1 % en poids de SDS. La membrane peut être lavée avec un tel tampon de lavage et la molécule d'ADN ou molécule d'ARN hybridée avec la sonde peut être identifiée par le marqueur utilisé pour la sonde. En outre, ici, une protéine consistant en une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 2 a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en une protéine dans laquelle un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 aminoacides dans la séquence d'aminoacides dans la SEQ ID N 2 a été substitué En outre, une telle protéine présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 2. Même une telle protéine est incluse dans le cadre de la présente invention, tant que la protéine a les fonctions de la géranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. De même, une protéine consistant en une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 4 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en une protéine dans laquelle un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 aminoacides dans la séquence d'aminoacides dans la SEQ ID 1\1 4 a été substitué. En outre, une telle protéine présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 4. Même une telle protéine est incluse dans le cadre de la présente invention, tant que la protéine a les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. De même, une protéine consistant en une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID 1\1 6 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en une protéine dans laquelle un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 aminoacides dans la séquence d'aminoacides dans la SEQ ID 1\1 6 a été substitué. En outre, une telle protéine présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID 1\1 6. Même une telle protéine est incluse dans le cadre de la présente invention, tant que la protéine a les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. De même, une protéine consistant en une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 8 dans la liste des séquences a été éliminée par délétion, substituée ou ajoutée consiste en une protéine dans laquelle un nombre non supérieur à 20, avantageusement non supérieur à 10, plus avantageusement non supérieur à 5 aminoacides dans la séquence d'aminoacides dans la SEQ ID N 8 a été substitué. En outre, une telle protéine présente une homologie non inférieure à 95 %, avantageusement non inférieure à 97 %, plus avantageusement non inférieure à 99 % avec la séquence d'aminoacides représentée dans la SEQ ID N 8. Même une telle protéine est incluse dans le cadre de la présente invention, tant que la protéine a les fonctions de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase, qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. L'amas de gènes de la présente invention codant pour la prényl-transférase peut être introduit dans des plantes telles qu'un arbre à caoutchouc pour augmenter son expression, de sorte que le taux d'expression des produits de gènes de prényl-transférase peut être accru dans lesdites plantes. La voie dans laquelle diverses prényltransférases sont impliquées est connue en tant que voie impliquée dans la production du caoutchouc naturel en catalysant la réaction d'addition du squelette isoprène du caoutchouc naturel. En conséquence, l'augmentation de la quantité de caoutchouc produite dans un arbre à caoutchouc peut être prévue en produisant ledit arbre à caoutchouc transformé par le gène de prényl-transférase. La plante destinée à l'introduction du gène de la présente invention n'est pas limitée à Hevea brasiliensis, des exemples d'autres plantes pouvant être le guayule, le cassave, le tournesol, la laitue, l'arbre à caoutchouc indien et similaires, mais les plantes cibles à transformer ne sont pas limitées à ces plantes, et des transformants dans lesquels le gène de la présente invention a été introduit peuvent être produits dans diverses plantes. En particulier, conformément à la présente invention, il est préférable de transformer des plantes productrices de caoutchouc, telles qu'Hevea brasiliensis, afin d'améliorer la qualité du caoutchouc obtenu à partir desdites plantes productrices de caoutchouc. On sait que des plantes productrices de caoutchouc sont réparties dans une large gamme de familles comprenant les Asteraceae, Moraceae, Euphorbiaceae, Asclepiadaceae et Apocynaceae. Comme procédé pour la production de transformants, on peut utiliser les procédés habituels connus dans ce domaine. Comme promoteur utile pour activer le gène introduit, le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur couramment utilisé dans ce domaine, par exemple, peut être utilisé et placé en amont du gène de la présente invention, qui doit être transduit. Dans de nombreux cas, un certain promoteur est requis afin de parvenir à une expression suffisante du gène étranger introduit. Le promoteur préféré n'est pas limité au promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, et divers promoteurs couramment utilisés dans ce domaine peuvent également être utilisés. En outre, un promoteur spécifique des conduits à latex est de préférence utilisé pour augmenter la production du caoutchouc. En outre, les vecteurs qui peuvent être utilisés dans la présente invention peuvent comprendre, mais à titre non limitatif, des vecteurs tels que pIG121-Hm, pBIl2, pBI221, pBIN19, pCC22, pGA482, pPCV001, pCGN1547, pJJ1881, pPZP111, pGreen0029, pBIl01, pBI121 et pYLTAC7. Des plantes transgéniques peuvent être préparées en introduisant ces vecteurs dans un Agrobacterium, par exemple, de manière à obtenir un cal ou une plantule infecté et, ainsi, des graines provenant de ces plantes transgéniques peuvent être obtenues. En outre, le procédé de transformation pour l'introduction du gène végétal de la présente invention dans des plantes n'est pas limité au procédé utilisant de l'Agrobacterium, divers procédés couramment utilisés dans ce domaine, comprenant le procédé utilisant un canon à particules et le procédé d'électroporation, pouvant être également utilisés. En outre, un exemple dans lequel un gène étranger est introduit dans un arbre à caoutchouc à des fins de transformation est décrit dans la publication de brevet japonais N 1996-116977. En conséquence, l'homme de l'art peut produire une plante transgénique, dans laquelle le gène de la présente invention a été introduit, en effectuant des modifications appropriées par référence à la description de la publication de brevet japonais N 1996-116977. EXEMPLES (Matières) Le latex et le xylème de la branche de l'année en cours de l'arbre classique Hevea brasiliensis PRIM 600 cultivé à Cikampek, Indonésie, ont été utilisés comme échantillon végétal. Le latex a été mis en suspension dans une quantité égale de tampon d'échantillon 2x (Tris-HC1 0,1 M, LiCl 0,3 M, EDTA 0,01 M, 10 % de SDS) immédiatement après prélèvement du latex. En outre, la souche YKO Heterozygous Essential Strain Collection-Glycerol Stocks (Open Biosystems, Inc) proposée commercialement a été utilisée comme souche de levure mutante. (Extraction de l'ARN d'Hevea brasiliensis) L'ARN a été extrait du latex et du xylème respectivement par les modes opératoires suivants. Immédiatement après prélèvement, l'échantillon (équivalent à 25 ml de latex) mis en suspension dans une quantité égale de tampon d'échantillon 2 x (Tris-HC1 0,1 M, LiCl 0,3 M, EDTA 0,01 M, 10 % de SDS) a été centrifugé et la phase supérieure constituant la couche de caoutchouc a été séparée. Puis une quantité de 1,5 équivalent de solution de CTAB 2 x (2 % de bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB), 1 % de 2-mercaptoéthariol, 0,1 M de Tris-HC1 (pH 9,5), 1,4 M de NaCl, 20 mM d'EDTA) a été ajoutée. Après incubation à 65 C pendant 10 minutes, un traitement avec un mélange chloroforme/alcool isoamylique a été effectué (répété deux fois). Une quantité égale au quart de solution de LiCl 10 M a été ajoutée à la phase aqueuse recueillie et mélangée, puis le mélange a été mis en incubation à -20 C pendant 2 heures (précipitation sélective de l'ARN). Le mélange a été centrifugé, le précipité dissous dans une quantité appropriée de TE, puis centrifugé, et le surnageant a été recueilli (et les polysaccharides ont été éliminés). En outre, la fraction a été traitée avec du phénol, un mélange phénol/chloroforme, un mélange chloroforme/alcool isoamylique, puis une précipitation sélective de l'ARN au moyen de LiCl a été de nouveau effectuée. Le précipité a été purifié avec de l'éthanol à 70 % et dissous dans de l'eau traitée au DEPC, après séchage sous pression réduite. Ainsi, l'ARN total dérivé du latex a été obtenu. En outre, le phloème de la branche de l'année en cours a été pelé avec un couteau pour obtenir environ 1 g de xylème et il a été broyé dans un mortier avec un pilon tout en refroidissant avec de l'azote liquide. L'ARN total dérivé du xylème a été obtenu en utilisant le kit RNeasy Plant Mini Kit (marque commerciale déposée, Qiagen). La solution d'ARN obtenue a été quantifiée par des mesures de densité optique et la valeur obtenue a été confirmée par électrophorèse. Une quantité de 450 pg d'ARN a été obtenue à partir de 25 mg de latex, et 110 pg d'ARN ont été obtenus à partir de 1 g de xylème. (Préparation de banques d'ADNc d'Hevea brasiliensis) Les banques d'ADNc ont été préparées à partir des échantillons d'ARN dérivés du latex et du xylème d'Hevea brasiliensis par le procédé G-Capping à Hitachi Instruments Service Co., Ltd. Le procédé G-Capping est un procédé permettant d'obtenir des ADNc complets en un pourcentage élevé. La banque d'ADNc dérivée du latex a une dimension de 35 banque de 1,7 x 105, le pourcentage de segments d'insertion est de 71 % (24 échantillons/électrophorèse sur gel 15 d'agarose), et le pourcentage d'ADNc complet est de 82 % (vis-à-vis des clones avec un segment d'insertion). La dimension de la banque d'ADNc dérivée du xylème est de 2,9 x 105, et le pourcentage de segmentsd'insertion est de 80 % (24 échantillons/électrophorèse sur gel d'agarose) et le pourcentage d'ADNc complet est de 87 % (vis-à-vis des clones avec un segment d'insertion). (Analyse de séquence, analyse de groupement et analyse d'annotation des séquences EST) Au Genome Information Science Laboratory of Kitasato Institute for Life Sciences of Kitasato University, une analyse poussée de séquence en une passe a été effectuée sur approximativement 20 000 clones des banques d'ADNc dérivées du latex et du xylème d'Hevea brasiliensis, respectivement. D'après l'information de séquence obtenue par l'analyse de séquence, des clones sans segment d'insertion et des clones dont il était impossible de déterminer la séquence ont été éliminés, ce qui a permis d'obtenir une information de séquence de grande précision. La banque d'ADNc provenant du latex et la banque d'ADNc provenant du xylème ont donné respectivement 16 407 séquences EST et 16 305 séquences EST avec une grande précision (total 32 442). Les séquences partielles obtenues ont été soumises à une analyse de groupement sur la base de la similitude entre les séquences et une analyse d'annotation sur la base de la comparaison avec des gènes connus, ce qui a permis de construire une base de données d'EST d'Hevea brasiliensis. Un groupement VISUALBIO du logiciel NTT a été utilisé pour l'analyse de groupement. L'analyse d'annotation a été effectuée par une recherche d'homologie en utilisant NCBI BLAST. La base de données utilisée pour la recherche était nr (toutes traductions CDS de GenBank non redondantes + PDB + SwissProt + PIR (Base de données de séquences de peptides). 16 Dans la base de données d'EST obtenue, les séquences EST qui sont considérées comme codant pour la prényldiphosphate-synthase et la prénylprényl-diphosphatesynthase ont été trouvées. (Détermination des séquences à l'extrémité 3'-terminale par 3'-RACE) Les séquences à l'extrémité 3'-terminale ont été déterminées par 3'-RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) sur chaque séquence obtenue par les analyses ci-dessus pour obtenir des ADNc complets. Pour l'analyse 3'-RACE, une série 3'-Full RACE Core Set (Takara Bio Inc.) a été utilisée. Une amorce oligo-dT a été utilisée pour la transcription inverse. Pour l'amplification par PCR, une amorce oligo-dT et une amorce sens ayant une identité de séquence avec une partie de séquences connues ont été utilisées. Les fragments amplifiés ont été obtenus par transcription inverse et PCR, puis les fragments ont été soumis à un clonage TA dans le vecteur pT7Blue, opération réussie d'après l'analyse de séquence. Les séquences obtenues de cette manière sont les suivantes : (1) la séquence de nucléotides du gène de la géranyl-diphosphate-synthase (SEQ ID N 1 dans la liste des séquences), (2) la séquence de nucléotides du gène de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase (SEQ ID N 3 dans la liste des séquences), (3) la séquence de nucléotides du gène de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase provenant d'un autre clone (SEQ ID N 5 dans la liste des séquences) et (4) la séquence de nucléotides du gène de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase provenant d'un autre clone (SEQ ID N 7 dans la liste des séquences). En outre, les séquences d'aminoacides déduites des protéines obtenues à partir des cadres de lecture ouverts de ces séquences de nucléotides sont les suivantes : (1) la séquence d'aminoacides de la géranyl-diphosphate-synthase (SEQ ID N 2 dans la liste des séquences), (2) la séquence 17 d'aminoacides de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase (SEQ ID N 4 dans la liste des séquences), (3) la séquence d'aminoacides de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase provenant d'un autre clone (SEQ ID N 6 dans la liste des séquences) et (4) la séquence d'aminoacides de la géranylgéranyl-diphosphate-synthase provenant d'un autre clone (SEQ ID N 8 dans la liste des séquences). (Confirmation fonctionnelle par l'activité enzymatique) Parmi les séquences obtenues par le mode opératoire précité, en ce qui concerne le gène candidat de géranylgéranyl-diphosphatesynthase représenté dans la SEQ ID N 3, les inventeurs ont produit une protéine recombinante à partir du gène, ont conduit une réaction enzymatique en utilisant la protéine recombinante et ont analysé le produit de réaction pour confirmer la fonction du gène. Tout d'abord, un gène candidat de géranylgéranyldiphosphate-synthase provenant d'Hevea brasiliensis a été inséré en cadre dans le vecteur pColdI (Takara) pour produire un plasmide d'expression. A ce propos, divers plasmides d'expression disponibles dans le commerce, autres que le vecteur pColdl, tels que les vecteurs pGEX et pET, peuvent également être utilisés comme plasmide d'expression. La souche de E. coli BL21 (DE3) a été transformée par le plasmide d'expression, et les transformants ont été sélectionnés dans une plaque d'un milieu sélectif contenant de l'ampicilline. A ce propos, comme souche de E. coli à utiliser pour l'expression de la protéine recombinante, on peut utiliser diverses souches de E. coli qui sont disponibles dans le commerce, par exemple Origami, Rosetta et Rosetta-gami' (Novagen). La souche de E. coli transformée a été transplantée sur un milieu à base de gélose LB contenant 50 pg d'ampicilline, et a été cultivée à 37 C avec agitation par secousses. Le milieu de culture a été refroidi à 15 C, quand la valeur de OD600 a atteint 0,4, puis il a été laissé pendant 30 minutes. Du IPTG a été ajouté pour atteindre la concentration finale de 0,1 mM, et le milieu a été en outre mis en incubation avec agitation par secousses pendant 24 heures à 15 C. A ce propos, les conditions d'induction telles que la température de culture et la concentration d'IPTG peuvent être modifiées de différentes manières. Après incubation, les corps cellulaires ont été recueillis et dissociés pour obtenir la protéine recombinante. Par ailleurs, le gène candidat de géranylgéranyl- diphosphate-synthase provenant d'Hevea brasiliensis a été inséré en cadre dans le vecteur de transfert pVL1393 (Takara) pour L'expression de la protéine en utilisant un système de baculovirus d'insecte afin de produire un plasmide d'expression. A ce propos, non seulement le vecteur pVL1393, mais également divers vecteurs de transfert disponibles dans le commerce, tels que pAcAB3, peuvent également être utilisés. Les baculovirus de 2,5 x 106 cellules, telles que des cellules de Sf-9, ont été utilisés pour ensemencer la surface d'une fiole de 25 cm2 pour culture cellulaire, en la laissant déposer pendant 30 minutes à température ambiante. Après confirmation que les cellules se sont fixées à la fiole, le milieu a été remplacé par 1 ml de milieu sans sérum. La cellule Sf-9 a été transfectée avec le vecteur de transfert dans lequel avait été inséré le gène candidat de géranylgéranyl-diphosphate-synthase et l'ADN génomique de baculovirus, en utilisant le procédé de lipofection. L'ADN a été absorbé aux cellules pendant 1 heure à température ambiante avec agitation périodique par secousses, 5 ml de milieu contenant 5 % de sérum de foetus bovin ont été ajoutés et l'ensemble a été cultivé à 28 C pendant 4 jours. Une fois la culture achevée, le surnageant contenant le virus a été recueilli et utilisé comme culture concentrée de virus. Comme la culture concentrée de virus contenait également des non-transformants, elle a été purifiée par analyse sur plaque. La cellule Sf-9 (2,5 x 106 cellules) a été infectée avec le virus recombinant purifié et ensuite cultivée en suspension pendant 72 heures à 28 C. Une fois la culture cellulaire achevée, les cellules ont été recueillies et dissociées pour obtenir la protéine recombinante soluble. En utilisant la protéine soluble ainsi obtenue, l'activité enzymatique de la géranylgéranyl-diphosphatesynthase a été déterminée en utilisant la méthode décrite dans la littérature (Oh (2000), J. Plant Physiology, 157, page 535). Concrètement, une quantité appropriée de la protéine recombinante soluble a été ajoutée à une solution réactionnelle contenant 50 mM de tampon au phosphate (pH 7,4), 5 mM de MgC12, 5 mM de KF, 5 mM d'iodoacétamide, 0,1 % (en poids/volume) de Triton X-100, 10 pM de 14C-IPP et 5 pM de FPP, puis le mélange a été soumis à la réaction pendant 4 heures à 30 C. Le produit de réaction a été extrait par du butanol et a été ensuite mis en incubation pendant une nuit à 37 C pour l'hydrolyse au moyen de phosphatase acide de pomme de terre (Sigma). Le produit de la réaction d'hydrolyse a été soumis à une extraction avec de l'hexane, et la phase obtenue a été développée sur une plaque de CCM à phase inversée en utilisant un solvant de développement consistant en acétone:H20 dans le rapport 9:1. La plaque de CCM a été exposée à une plaque d'imagerie, et la radioactivité a été analysée en utilisant un analyseur d'image BAS1500 (Fuji). Les produits de réaction radioactifs ont été identifiés par comparaison avec des échantillons de référence qui ont été visualisés avec de l'iode (par exemple le farnésol, le géranylgéraniol). La protéine recombinante du gène candidat a été exprimée de la manière décrite ci-dessus, l'activité en tant que prényltransférase a été déterminée au moyen de IPP marqué au 14C, le produit de réaction a été soumis à une analyse supplémentaire ; ainsi, les inventeurs ont tenté d'identifier la fonction du gène représenté dans la SEQ ID N 3. En résultat, parmi les séquences d'EST dérivées d'Hevea brasiliensis, concernant le gène de géranylgéranyl-diphosphate-synthase représenté dans la SEQ ID N 3, la fonction du gène a pu être identifiée au moyen de l'activité enzymatique. Conformément à la présente invention, un amas de gènes codant pour divers types de prényl-transférase d'Hevea brasiliensis a été obtenu, et les séquences de nucléotides de ces gènes ont été déterminées. Les prényl-transférases sont impliquées dans la biosynthèse du squelette isoprène du caoutchouc naturel. En conséquence, une amélioration de la productivité du caoutchouc peut être escomptée en transformant des plantes par l'amas de gènes obtenu dans la présente invention. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Protéine, caractérisée en ce qu'elle consiste en une séquence d'aminoacides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence d'aminoacides représentée par les aminoacides numéros 1 à 306 indiqués dans la SEQ ID 1\1 2 dans la liste des séquences, (b) une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de ladite séquence d'aminoacides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre aminoacide, ou bien une autre séquence d'aminoacides est ajoutée à ladite séquence d'aminoacides (a), la protéine de la séquence d'aminoacides (b) ayant la fonction de géranyl-diphosphatesynthase qui assure la biosynthèse du géranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl- diphosphate comme substrat. 2. Gène, caractérisé en ce qu'il code pour la protéine suivant la revendication 1. 3. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les nucléotides numéros 126 à 1043 indiqués dans la SEQ ID 1\1 1 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranyldiphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 4. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les 35 nucléotides numéros 1 à 1074 indiqués dans la SEQ ID N 1 dans la liste des séquences,(b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranyldiphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranyldiphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 5. Plante transgénique, caractérisée en ce que la productivité du caoutchouc dans la plante est améliorée en introduisant le gène suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4 dans ladite plante. 6. Procédé pour améliorer la productivité du caoutchouc dans une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction du gène suivant l'une quelconque des revendications 2 à 4 dans ladite plante. 7. Protéine, caractérisée en ce qu'elle consiste en une séquence d'aminoacides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence d'aminoacides représentée par les aminoacides numéros 1 à 306 indiqués dans la SEQ ID N 4 dans la liste des séquences, (b) une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de ladite séquence d'aminoacides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre aminoacide, ou bien une autre séquence d'aminoacides est ajoutée à ladite séquence d'aminoacides (a), la protéine de la séquence d'aminoacides (b) ayant la fonction de géranylgéranyldiphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényldiphosphate et le diméthylallyl--diphosphate comme substrat. 8. Gène, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide suivant la revendication 7. 9. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une 35 séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants :(a) une séquence de nucléotides représentée par les nucléotides numéros 181 à 1098 indiqués dans la SEQ ID N 3 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranylgéranyl-diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 10. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une 15 séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les nucléotides numéros 1 à 1662 indiqués dans la SEQ ID N 3 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une 20 partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de 25 géranylgéranyl--diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 11. Plante transgénique, caractérisée en ce que la 30 productivité du caoutchouc dans la plante est améliorée en introduisant le gène suivant l'une quelconque des revendications 8 à 10 dans ladite plante. 12. Procédé pour améliorer la productivité du caoutchouc dans une plante, caractérisé en ce qu'il 35 comprend l'introduction du gène suivant l'une quelconque des revendications 8 à 10 dans ladite plante.24 13. Protéine consistant en une séquence d'aminoacides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence d'aminoacides représentée par les aminoacides numéros 1 à 330 indiqués dans la SEQ ID N 6 5 dans la liste des séquences, (b) une séquence d'aminoacides dans laquelle une partie de ladite séquence d'aminoacides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre aminoacide, ou bien une autre séquence d'aminoacides est ajoutée à ladite 10 séquence d'aminoacides (a), la protéine de la séquence d'aminoacides (b) ayant la fonction de géranylgéranyldiphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényldiphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 15 14. Gène, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide suivant la revendication 13. 15. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les 20 nucléotides numéros 54 à 1043 indiqués dans la SEQ ID N 5 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien 25 une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranylgéranyl-diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 30 l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 16. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les 35 nucléotides numéros 1 à 1278 indiqués dans la SEQ ID N 5 dans la liste des séquences,(b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranylgéranyl-diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 17. Plante transgénique, caractérisée en ce que la productivité du caoutchouc dans la plante est améliorée en introduisant le gène suivant l'une quelconque des revendications 14 à 16 dans ladite plante. 18. Procédé pour améliorer la productivité du caoutchouc dans une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction du gène suivant l'une quelconque des revendications 14 à 16 dans ladite plante. 19. Protéine consistant en une séquence d'aminoacides 20 de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence d'aminoacides représentée par les aminoacides numéros 1 à 328 indiqués dans la SEQ ID N 8 dans la liste des séquences, (b) une séquence d'aminoacides dans laquelle une 25 partie de ladite séquence d'aminoacides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre aminoacide, ou bien une autre séquence d'aminoacides est ajoutée à ladite séquence d'aminoacides (a), la protéine de la séquence d'aminoacides (b) ayant la fonction de géranylgéranyldiphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant l'isopentényldiphosphate et le diméthylallyl--diphosphate comme substrat. 20. Gène, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide suivant la revendication 19. 35 21. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants :(a) une séquence de nucléotides représentée par les nucléotides numéros 54 à 1037 indiqués dans la SEQ ID N 7 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranylgéranyl- diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 22. Gène, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de nucléotides de (a) ou (b) suivants : (a) une séquence de nucléotides représentée par les nucléotides numéros 1 à 1181 indiqués dans la SEQ ID N 7 dans la liste des séquences, (b) une séquence de nucléotides dans laquelle une partie de ladite séquence de nucléotides (a) est éliminée par délétion ou substituée par un autre nucléotide, ou bien une autre séquence de nucléotides est ajoutée à ladite séquence de nucléotides (a), la séquence de nucléotides (b) codant pour la protéine ayant la fonction de géranylgéranyl-diphosphate-synthase qui assure la biosynthèse du géranylgéranyl-diphosphate en utilisant 1'isopentényl-diphosphate et le diméthylallyl-diphosphate comme substrat. 23. Plante transgénique, caractérisée en ce que la productivité du caoutchouc dans la plante est améliorée en introduisant le gène suivant l'une quelconque des revendications 20 à 22 dans ladite plante. 24. Procédé pour améliorer la productivité du caoutchouc dans une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction du gène suivant l'une quelconque des revendications 20 à 22 dans ladite plante.