Brevet FR2894982A1 — publié le 20070622

La presente invention se rapporte a un procede de preparation d'un anticorps selectif envers les recepteurs de la region Fc des anticorps (FcR) activateurs a motif(s) ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), comprenant les etapes d'obtention d'anticorps monoclonaux a partir d'un hybridome, d'un heterohybridome, ou de toute lignee cellulaire animale, vegetale ou humaine, de remplacement de chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de la region Fc dudit anticorps par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, puis de selection des anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs a motifs ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) est diminuee d'au moins 30%, de preference d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au meme anticorps possedant une region Fc native. La presente invention se rapporte egalement a 1'utilisation d'un anticorps issu du procede de 1'invention dans 1'obtention d'un medicament destine notamment au traitement du cancer et de pathologies infectieuses. Introduction et art anterieur De nombreuses preparations d'anticorps a usage therapeutique, d'origine plasmatique ou biotechnologique, sont actuellement sur le marche, ou en phase de developpement clinique. Leurs proprietes sont exploitees pour obtenir des outils therapeutiques capables de se her de maniere specifique a leur cible, et de recruter de maniere efficace les cellules de 1'immun.ite. - 2 Ces dernieres annees, la recherche s'est orientee sur 1'amelioration de 1'efficacite des anticorps, et plus particulierement vers la manipulation de leur region constante Fc. C'est cette derniere qui est responsable des proprietes > des anticorps, car elle permet la mobilisation des cellules immunitaires effectrices et des molecules du complement. Cette faculte est rendue possible par la presence, sur certaines cellules immunitaires, de glycoproteines, les recepteurs Fc ou FcR. Ces recepteurs sont capables de se her a la region constante des anticorps, en particulier une foil que ces derniers ont fixe, par leur region variable, 1'antigene cible. Au contact de ces cellules, les anticorps declenchent differents mecanismes cellulaires comme la phagocytose et 1'ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity). Toutefois, it existe differentes classes de FcR humains. Ceux-ci sont codes par huit genes humains, tous localises sur he chromosome 1. Certains de ces genes presentent un polymorphisme allelique generant differents allotypes de recepteurs ayant alors differentes proprietes de fixation aux IgG (Hulett M.D. & Hogarth P.M., Advances in Immunology, vol. 57, pp.1-127, 1994) conduisant a des proprietes effectrices differentielles (Carton et al. (2002) Blood, vol. 99, n 3, 754-758). Les principales classes de FcR humains identifiees sont le Fc-yRI (CD64, possedant les isoformes A et B), le recepteur FcyRII (CD32, possedant les isoformes A et B) et le recepteur FcyRIII (CD16, possedant les isoformes A et B). Les recepteurs FcyRI et FcyRIII, ainsi que le recepteur FcyRIIA sont des recepteurs qualifies d' >, car leur activation, par 1'intermediaire des motifs ITAM que leurs sequences ou les sequences de chaines associees comportent, permet le declenchement de fonctions - 3 effectrices comme la lyse des cellules cibles. A 1'inverse, les recepteurs FcyRIIB sont qualifies de recepteurs inhibiteurs >>, car ils inhibent les voies de transduction des recepteurs activateurs par 1'intermediaire de leurs motifs ITIM que leurs sequences comportent et modulent negativement les mecanismes effecteurs comme ceux de 1'ADCC induits par 1'intermediaire des FcR activateurs ou d'autres molecules de surface comme le recepteur B de 1'antigene (BCR) ou des recepteurs de facteurs de croissance comme c-kit. Ainsi, la diversite des recepteurs FcR, notamment 1'existence de FcR activateurs et de FcR inhibiteurs exprimes sur les memes cellules est susceptible de moduler 1'efficacite des anticorps therapeutiques, 1'engagement des FcR inhibiteurs contre-balancant 1'engagement des FcR activateurs. I1 etait donc dans 1'intention du Demandeur de fournir un anticorps therapeutique dont 1'efficacite, c'est-a-dire la capacite a activer les cellules immunitaires effectrices, n'est pas ou peu modulee par la diversite des recepteurs FcR, en particulier par les FcR inhibiteurs. Le Demandeur, dans le document WO 2005/040216, decrit des anticorps dont la sequence primaire est modifiee, presentant un interet particulier en therapie en remplacement des IgG4, ou pour prevenir les rejets de greffe, ou encore comme anti-tetaniques, antidiphteriques ou diriges contre certains agents pathogenes ou toxines derivees. Toutefois, le Demandeur a constate de maniere surprenante 35 que 1'anticorps ainsi modifie a conserve sa capacite a - 4 induire une fonction effectrice dependante des recepteurs activateurs, tandis qu'il ne possede plus la capacite de recruter les recepteurs inhibiteurs. Ainsi, le Demandeur a cherche a mettre au point un procede permettant de fournir des anticorps therapeutiques dont 1'efficacite, c'est-a-dire la capacite a activer les cellules immunitaires effectrices, n'est pas ou peu modulee par la diversite des recepteurs FcR, en particulier par les FcR inhibiteurs. Description detaillee de 1'invention L'invention se rapporte en premier lieu a un procede de preparation d'un anticorps dont la region Fc lie selectivement les recepteurs de la region Fc des anticorps (FcR) activateurs, comprenant les etapes suivantes . a) obtention d'anticorps monoclonaux a partir d'hybridome, d'heterohybridome, ou de toute lignee cellulaire animale, vegetale ou humaine, b) remplacement de chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de la region Fc de 1'anticorps par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, c) selection des anticorps dont la fixation de la region Fc aux FcR inhibiteurs est diminuee d'au moins 30%, de preference d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au meme anticorps possedant une region Fc native. Aux fins de 1'invention, on entend par > tout 35 anticorps, quelle que soit sa specificite et son isotype, -5 a condition quill comporte une region Fc ou une region possedant les memes fonctions et les memes caracteristiques que la region Fc. Ainsi, it peut s'agir d'un anticorps entier ou d'un fragment d'anticorps, par exemple un fragment Fc d'anticorps, ou une molecule de fusion comprenant a 1'une de ses extremit.es une region Fc. De plus, les anticorps mis en Tuvre dans le procede selon 1'invention peuvent etre des IgG, c'est-adire toute IgGl, toute IgG2, toute IgG3 (d'allotypes G3m(s) ou G3m(st)) et toute IgG4, des IgM, des IgE, des IgA ou des IgD, ou encore un melange d'un ou plusieurs entre eux. De plus, les anticorps mis en Tuvre clans le procede de 1'invention peuvent etre monoclonaux ou polyclonaux. Dans le cas ou it s'agit d'anticorps monoclonaux, ces anticorps peuvent etre chimeriques, humanises, humains ou d'origine animale. A 1'issue de 1'etape b), les sequences codant pour 1'anticorps modifie de 1'invention sont exp:rimees dans un systeme biologique adapte (etape b'). Aux fins de 1'invention, on entend par >, un anticorps non modifie selon 1'etape b) du procede de 1'invention, et produit dans le meme systeme de production biologique que 1'anticorps modifie de 1'invention. Le > possede la meme sequence primaire native (en dehors des residus His 310 et His 435, qui ont ete modifie dans 1'anticorps de 1'invention) et ayant ete soumis aux memes modifications post-traductionnelles que 1'anticorps obtenu par le procede de 1'invention, puisqu'il a ete produit dans le meme systeme biologique. Aux fins de 1'invention, les anticorps de 1'etape a) comportent une region Fc native, c'est-a-dire qu'ils possedent des residus histidine en position 310 et 435 (numerotation de Kabat) de leur region Fc. De preference, la region Fc de tels anticorps se lie a la fois aux - 6 recepteurs activateurs et aux recepteurs inhibiteurs. Aux fins de 1'invention, on entend par > toute region Fc non modifiee, par tous procedes chimiques ou biotechnologiques, sur les residus His 310 et His 435. Plus particulierement, on entend par > toute region Fc dont les residus His 310 et His 435 n'ont pas ete remplaces, par des procedes chimiques ou biotechnologiques, un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine. A titre d'exemple, les anticorps mis en Tuvre dans 1'invention, peuvent etre choisis parmi les anti-Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD44, anti CD52, anti CAl25 et anti ProteinC, anti-HLA-DR, les anti-viraux: HBV, HCV, HIV et RSV, et plus particulierement parmi les anticorps du Tableau 1 ciapres Tableau 1 . Centocor anti Ep- cancer colorectal CAM Idec anti CD20 lymphome des cellules B Licencie a Genentech/ purpura thrombocytopenique Hoffman la roche Nom et Societe cible indication marque commerciale de 1'anticorps Edrecolomab PANOREX Rituximab RITUXAN - 7 Trastuzumab HERCEPTIN Palivizumab SYNAGIS Alemtuzumab CAMPATH ibritumomab tiuxetan ZEVALIN Cetuximab IMC-C225 Genentech anti HER2 Carcinome mammaire Licencie a cancer ovarien Hoffman la roche/Immunog en Medimmune RSV Licencie a Abott BTG anti CD52 Leucemies (LLC-B) Licencie a Schering IDEC anti CD20 NHL Licencie a Schering Merck /BMS / anti EGFR Cancers ovariens, Imclone colorectaux, mammaires Bevacizumab AVASTIN Epratuzumab Hu M195Mab MDX-210 BEC2 Mitumomab Oregovomab OVAREX Genentech/ anti Cancers colorectaux Hoffman la VEGFR roche Immumedics/ anti CD22 cancers: Amgen lymphome non hogkinien Protein Anti cancers Design Labs CD33 Immuno- ND cancers Designed Molecules Imclone anti GD3 Cancers (glioblastome, melanome malin, neuroblastome) Altarex anti cancer ovarien CAl25 - 8 Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD3 melanome malin KW-2971 ABX-EGF Abgenix EGF cancers MDX010 Medarex Anti Cancers CD4R XTL 002 XTL ND anti-viral : HCV biopharmaceut icals H11 SCFV viventia ND cancers biotech 4B5 viventia anti GD2 cancers biotech XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV biopharmaceut icals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA cancer de la Prostate TNX-901 TANOX anti IgE Allergies IDEC-114 IDEC inhibitio lymphome non-Hodgkinien n ProteinC Aux fins de 1'invention, on entend par > ou > tout anticorps qui possede la capacite de recruter les FcR activateurs mais qui possede une capacite d'engager les FcR inhibiteurs diminuee, voire nulle. Par FcR activateur on entend designer les FcyRIIIA, FcyRIIIB, FcyRIIA, FcyRIA et FcyRIB, le FcyR, le FcyRI et - 9 1'equivalent humain du FcyRIV decrit chez la souris. Par FcR inhibiteur, on entend designer les Fc-yRIIB. Dans un mode de realisation prefere de l'invention, on selectionne a 1'etape c) les anticorps dont la fixation aux FcyR inhibiteurs est abolie. Ainsi, les anticorps prepares selon le procede de 1'invention possedent une region Fc qui se fixe sur les FcR activateurs mais ne se fixe pas sur les recepteurs inhibiteurs, alors que le meme anticorps produit par le meme systEme biologique mais possedant une region Fc non modifiee selon le procede de 1'invention se fixe, par sa region Fc, aux FcyR activateurs et aux FcyR inhibiteurs. Dans un mode de realisation prefere de 1'invention, on remplace les residus His 310 et His 435 par un residu lysine. Dans un mode de realisation prefere de l'invention, on remplace les residus His 310 et His 435 par mutagenese 20 dirigee ou par evolution moleculaire. Dans un autre mode de realisation, on modifie les residus His 310 et His 435 au moyen d'un traitement chimique, par exemple par traitement par le DEPC (Diethylpyrocarbonate, qui est un agent modifiant les histidines). 25 Le Demandeur a constate de maniere surprenante que la mutation des deux residus histidines particuliers His 310 et His 435 situes a 1'interface CH2/CH3 d'un anticorps par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la 30 glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, et de maniere preferentielle par la lysine, a un impact majeur sur la fixation de 1'anticorps ainsi modifie aux FcR inhibiteurs, et en 35 particulier aux Fc-yRIIB, et a un effet modere sur sa - 10 - fixation aux FcR activateurs, et notamment aux FcyRIIIA. Le Demandeur a mis en evidence que 1'anticorps de 1'invention ainsi modifie ne lie plus ou quasiment plus le recepteur inhibiteur FcyRIIB humain dans un test de liaison in vitro alors que sa fixation aux recepteurs activateurs Fc'yRIIIA et FcyRIIA n' est que tres partiellement inhibee par rapport a 1'antioorps non mute (voir ci-dessous). Cet anticorps mute est un anticorps capable d'engager les recepteurs activateurs (FcTRIIA et FcyRIIIA) impliques dans la cytotoxicite de type ADCC en evitant d'engager le FcyRIIB inhibiteur. Un tel anticorps permet donc d'induire une ADCC contre des cellules cibles (globules rouges, cellules tumorales, cellules alloreactives, cellules infectees par des pathogenes microbiens) sans que cette ADCC ne soit modulee negativement a la suite de 1'engagement du FcyIRIIB. Un tel anticorps permet aussi d'optimiser la presentation antigenique par des cellules dendritiques du fait que les complexes immuns contenant cet anticorps mute ne sont captures que par les FcyR activateurs exprimes sur les cellules dendritiques, sans activer les FcyRIIB inhibiteurs, egalement presents sur ces cellules. Ce comportement > sur les recepteurs activateurs et inhibiteurs est un atout essentiel pour utiliser les anticorps de 1'invention en therapeutique, notamment dans le cadre de pathologies cancereuses ou infectieuses. En effet, un tel anticorps est capable d'induire des mecanismes d'ADCC par l'intermediaire des FcyR activateurs sans que ceux-ci soient down-modules par les Fc-yR inhibiteurs. De plus, le Demandeur a constate qu'un tel anticorps ne recrute que les FcyR activateurs sur les cellules dendritiques et ne recrutent pas les FcyR inhibiteurs a la surface des memes cellules. Or it a ete montre recemment que 1'engagemerit des FcyR - 11 - inhibiteurs a la surface des cellules dendritiques a un effet negatif sur la maturation de ces cellules et sur leur capacite a presenter efficacement un antigene aux lymphocytes T effecteurs, rendant ces cellules dendritiques tolerogenes. Si un tel anticorps complexe a un antigene ne reconnait que les FcyR activateurs exprimes a la surface des cellules dendritiques et non les Fc'yR inhibiteurs, la presentation antigenique par les cellules dendritiques qui en resulte sera optimale et 1'effet d'activation de la reponse immune specifique optimisee. De maniere avantageuse, la region Fc de 1'anticorps issu du procede de 1'invention se fixe aux recepteurs Fc activateurs tandis qu'elle ne se fixe pas aux recepteurs Fc inhibiteurs. De maniere avantageuse, 1'anticorps du procede de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs, notamment les recepteurs Fc inhibiteurs exprimes par les lymphocytes B. De maniere particulierement avantageuse, 1'anticorps du procede de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molecule a la surface des lymphocytes B. De maniere avantageuse, 1'anticorps de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molecule a la surface de cellules tumorales, notamment a la surface de lymphocytes tumoraux B. De maniere avantageuse, 1'anticorps de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs mais lie une molecule a la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B. De maniere avantageuse, 1'anticorps de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs mais lie la - 12 - molecule CD20 a la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B. De maniere particulierement avantageuse, 1'anticorps du procede de 1'invention se fixe au recepteur FcyRIII (isoformes A et B) et /ou au recepteur FcyRIIA et/ou au recepteur FcyRI (isoformes A et B), tandis quill ne se fixe pas aux recepteurs FcyRIIB (isoforme El et B2). Dans un mode de realisation particulier, le recepteur FcyRIIB est le recepteur Fc-yRIIB1. De maniere preferentielle, les recepteurs mis en jeu dans le procede de 1'invention sont des recepteurs humains. Dans un mode de realisation particulier de 1'invention, les recepteurs de la region Fc des anticorps se trouvent sur les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK, les lymphocytes B, les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B. Dans un autre mode de realisation particulier de 1'invention, les recepteurs inhibiteurs de la region Fc des anticorps se trouvent sur des cellules tumorales, telles que des cellules de melanomes malins, des lymphocytes B tumoraux comme les lymphomes, les cellules de LLC-B (leucemie lymphoide chronique B) et les cellules de myelome. De maniere avantageuse, 1'anticorps du procede de 1'invention lie, par sa region variable, la. molecule CD20 a la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B. Un tel anticorps de 1'invention ne recrute pas les recepteurs Fc inhibiteurs, notamment a la surface des lymphocytes tumoraux de LLC-B.35 - 13 - De maniere avantageuse, les anticorps mis en muvre dans le procede de 1'invention sont des anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux peuvent titre produits par tout systeme biologique approprie. On entend par > des lignees cellulaires animale ou vegetale transfectees a 1'aide d'un ou plusieurs vecteurs de maniere a exprimer ledit anticorps, des plantes ou animaux transgeniques non humains, ainsi que tout hybridome, heterohybridome. Parmi les cellules, on peut choisir des cellules provenant de lignees cellulaires, transfectees a 1'aide d'un vecteur comportant le gene codant pour ledit anticorps, par exemple des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des cellules de mammiferes, d'insectes, de plantes, de bacteries ou de levures. Preferentiellement, on utilise des cellules de myelome de rat telle que YB2/0 (ATCC n CRL 1662). On peut egalement utiliser des cellules CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- ou d'autres lignees cellulaires parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, PERC6 ou BHK. Un autre objet de 1'invention est 1'utilisation d'un anticorps dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de sa region Fc a ete remplacee par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, ou un anticorps produit a partir du procede de 1'invention, pour 1'obtention d'un medicament destine a la vaccination anti-infectieuse et anti-tumorale, 1'anticorps de 1'invention etant engage dans un complexe immun qui ne pourra titre fixe que par les RFc'y activateurs des cellules presentant 1'antigene - 14 - (monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules epidermiques de Langerhans, lymphocytes B). De preference, on utilise pour la preparation d'un tel medicament un anticorps dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de sa region Fc a ete remplacee par un residu lysine. Un autre objet de 1'invention se rapporte a 1'utilisation d'un anticorps, dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) est remplace par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, pour 1'obtention d'un medicament destine au traitement du cancer, et plus particulierement au traitement des lymphomes, leucemies, myelomes, sarcomes, tumeurs solides telles que carcinomes mammaires, tumeurs colorectales, tumeurs du pancreas, tumeurs de la prostate, tumeurs stomacales, tumeurs pulmonaires, tumeurs ovariennes, tumeurs du col de 1'uterus, tumeurs oculaires, tumeurs de la thyroide, tumeurs de la sphere ORL mela.nomes malins, tumeurs nerveuses telles que glioblastome, et neuroblastomes. De preference, on utilise pour la preparation d'un tel medicament un anticorps dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de sa region Fc a ete remplacee par un residu lysine. Un autre objet de 1'invention est 1'utilisation d'un anticorps, dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) est remplace par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la phenylalanine, la serine ou la threonine, pour 1'obtention d'un medicament destine au traitement - 15 - des maladies infectieuses telles que 1'infection par le VIH, le VHB, le VHC, le VRS (virus respiratoire syncytial), le virus SRAS, les rotavirus, les virus de la grippe, la variole, les infections bacteriennes telles que les infections dues au bacille de Koch, aux meningocoques, a Criptoccocus neoformans, a Clostridium, aux bacteries responsables du Botulisme, de 1'Anthrax (charbon), le tetanos, la tuberculose, et les infections a enterocoques. De preference, on utilise pour la preparation d'un tel medicament un anticorps dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de sa region Fc a ete remplacee par un residu lysine. Enfin, un dernier aspect de 1'invention se rapporte a une composition d'anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est diminuee d'au moins 30%, de preference d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% ou de 100% par rapport au meme anticorps possedant une region Fc native. De preference, la composition de 1'invention est une composition dont la region Fc des anticorps possede une capacite de fixation aux recepteurs inhibiteurs abolie par rapport au meme anticorps possedant une region Fc native. De maniere particulierement avantageuse, la composition de 1'invention est une composition d'anticorps anti-CD20. D'autres aspects et avantages de 1'invention seront decrits dans les exemples qui suivent, qui doivent etre consideres comme illustratifs et ne limitent pas 1'etendue de 1'invention. - 16 - Description des figures Figure 1 : Effet de la modification par le Diethylpyrocarbonate des histidines de 1'AcM anti-RhD T125(YB2/0) sur la capacite de 1'anticorps a recruter les RFc-y humains. Figure 2 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de 1'AcM anti-RhD T125(YB2/0) en lysines sur la capacite 10 de 1'anticorps a fixer les RFcy humains. Figure 3 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de 1'AcM anti-RhD T125(YB2/0) sur la capacite de 1'AcM a induire une production d'IL-2 dependante des RFcyIIIA 15 humains. Figure 4 : Comparaison de la fixation de T125(YB2/0), du double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et de T125(CHO) aux RFcyIIIA et RFcyIIB humains. 20 Figure 5 : Effet de la mutation des histidines 310 et 435 de 1'anticorps monoclonal anti-RhD T125(YB2/0) sur la capacite de 1'anticorps monoclonal a induire une ADCC dependante des RFcyIIIA humains par rapport a 1'anticorps 25 wild-type produit dans YB2/0 et a 1'anticorps wild-type produit dans CHO. Figure 6 : Representation en surface des structures cristallographiques des fragments Fc de T125(YB2/0) en 30 presence de Zinc (A) et du double mutant: T125 H310KH435K(YB2/0) (B). Exemples - 17 - Exemple 1 : Obtention d'un anticorps portant la double mutation His310-435Lys La lignee YB2/0 (myelome de rat, lignee ATCC n CRL 1662) transfectee et produisant l'anticorps EMAB5 (decrit dans le document WO 2005/040216), qui est une IgGl('y) humaine dirigee contre 1'antigene Rh(D), a ete adaptee a la culture en milieu sans serum. EMAB5 a ete purifie par chromatographie d'affinite sur 10 Sepharose-proteine A. Par HPCE-LIF, it a ete montre que la structure glycanique majoritaire est un oligosaccharide de type biantenne, contenant environ 25 % de fucose. 15 Preparation du fragment Fc : L'anticorps purifie EMAB5 est dialyse une nuit contre du tampon Tris 50 mM, pH 8,0. La solution d'anticorps, ajustee a 50 mM CaC12 et 10 mM cysteine, est incubee 30 min a 37 C avant d'ajouter la solution de trypsine (1 20 mg/ml) dans un rapport enzyme/substrat de 1/25. Apres 5 h d'incubation a 37 C, la reaction est arretee par 1'addition de diisopropyl fluorophosphate (1 mM final). L'hydrolysat est dialyse une nuit contre du tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8. 25 Pour la purification du fragment Fc, 1'hydrolysat dialyse est mis en contact avec de 1'Affarose-proteine L a raison de 1 ml de gel pour 3,6 mg d'anticorps. Apres 4 h d'incubation a temperature ambiante sous agitation, le gel est monte en colonne et lave par le tampon Imidazole 30 50 mM, pH 7,8. L'effluent et le tampon de lavage qui contiennent les fragments Fc sont reunis, concentres par centrifugation sur Vivaspin 20 en utilisant les conditions decrites par le fabricant. 35 Mutagenese dirigee - 18 - Le vecteur d'expression contenant 1'ADNc codant la sequence d'acides amines de la chaine lourde de 1'anticorps anti-Rh(D) EMAB5, a servi de matrice pour la realisation d'une double mutagenese dirigee realisee par PCR ( AAG. La chaine lourde de 1'anticorps mute a pour sequence 15 nucleotidique la sequence SEQ ID NO : 1, et pour sequence peptidique SEQ ID NO : 2 (les acides amines mutes apparaissent sur la sequence SEQ ID NO : 2 en position 338 et 463 respectivement pour les acides amines Lys310 et Lys435). La numerotation tient compte des sequences 20 leaders (338 et 463) ou non (dans ce dernier cas, c'est la numerotation dite de Kabat qui a ete utilisee : 310 et 435). Les cellules YB2/0, co-transfectees par electroporation 25 avec le vecteur mute EMAB5-H-K338-K463-1 et le vecteur EMAB5-dhfr-K-SpeI codant pour la chaine Legere de 1'anticorps EMAB5, sont cultivees en milieu RPMI additionne de 5% de SVF dialyse, 0,5% de G418 et 25 nM de Methotrexate (MTX). Les clones secretant les plus forts 30 taux d'IgG humaines sont cultives en plaques de 24 puits en milieu sans MTX. Les surnageants, recoltes apres 7 jours de culture, sont utilises pour faire les essais decrits ci-dessous. - 19 - Exemple 2 : Effet de la modification des histidines de 1'interface CH2/CH3 d'une IgGl monoclonale anti-RhD par le Diethylpyrocarbonate (DEPC) sur les interactions IgGl/RFcy humains. Afin d'etudier 1'impact d'une modification des histidines d'une IgGl humaine sur les interactions IgGl/RFcy humains, 1'anticorps monoclonal anti-RhD, T125(YB2/0) a ete traite par le Diethylpyrocarbonate (DEPC). Le DEPC modifie les residus histidines par la creation d'une liaison covalente entre un atome d'azote du cycle de 1'histidine et un atome de carbone de la molecule de DEPC. Les anticorps monoclonaux traites ou non par le DEPC sont fractionnes sur une colonne de proteine A- Sepharose. L'histidine 435 etant importante a la fixation des IgG a la proteine A, la fraction d'anticorps monoclonaux traitee par le DEPC et non retenue sur proteine A correspond a des IgGl dont au moins les His435 ont ete modifiees. Les anticorps monoclonaux T125(YB2/0) non traites ou traites par le DEPC et non retenus sur proteine A ont ete compares pour leur fixation aux differents types de RFcy humains (Figure 1). La fixation de 1'anticorps monoclonal anti-RhD, T125(YB2/0), traite ou non par le diethylpyrocarbonate (DEPC) aux RFcyIIIA (A), RFcyIIA (B), RFc'yIIBl (C) et RFcyI (D) humains (hRFcy) a ete analysee par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcyIIIA (A), K562 (B), IIA.1.6-huRFcyIIBl (C) et Tf2-13 (D) sont i_ncubees avec differentes concentrations de T125(YB2/0) traite ou non par le DEPC. La fixation de 1' anticorps monoclonal est detectee par des F(ab')2 de souris anti-IgG (H+L) humaines couples au FITC). T125(YB2/0) se fixe aux RFcyIIIA a faible concentration (des 0,05 g/ml) et presente une fixation tres importante a 0,5 pg/ml (95% de - 20 - cellules positives). Lorsque cet anticorps monoclonal est traite par le DEPC, sa fixation est diminuee a forte concentration (entre 1 et 5 g/ml) (environ 90% de reduction a 1 g/ml) et devient marginale a faible concentration (entre 0,025 g/ml et 0,05 g/ml) (Figure IA). Le traitement par le DEPC induit egalement une reduction de 76% et de 64% de la fixation de T125 (YB2/0) aux RFcyIIA (a 50 g/ml et 100 g/ml, respectivement) (Figure 1B). De meme, la fixation de T125(YB2/0) traite par le DEPC aux RFc-yIIBl est reduite : a 50 g/ml., la fixation de T125(YB2/0) traite par le DEPC est marginale alors qu'environ 40% de cellules sont positives pour la meme concentration de T125(YB2/0) non traite (Figure 1C). En revanche, la modification de 1'AcM par le DEPC a un effet modere sur sa fixation aux RFcyI. Le traitement par le DEPC induit une reduction de 15% de la fixation de T125(YB2/0) aux RFc-yI a 0,5 g/ml et 1 g/ml. (Figure ID). En conclusion, le blocage des histidines presentes dans T125(YB2/0) par le DEPC diminue sa fixation aux RFcyIIIA (Figure IA), RFcyIIA (Figure 1B), RFcyIIB (Figure 1C) et, dans une moindre mesure, aux RFcyI humains (Figure 1D). Exemple 3 : Effet des mutations des residus His435 et His310 d'une IgGl monoclonale anti-RhD sur les interactions IgGl/RFcy humains. Les resultats precedents indiquent que la modification des residus His d'une IgGl monoclonale affecte ses interactions avec les RFcy humains. Cependant le traitement par le DEPC ne permet pas de determiner quelles sont les His qui ont ete modifiees. Les etudes structurales ont montre 1'importance des 35 residus His435 et His31 situes de part et d'autre de la - 21 - region charniere des IgGl dans les interactions IgGl/RFc'y. Nous avons donc etudie 1'effet de la mutation des His435 et His310 de T125(YB2/0) en lysine sur la fixation de 1'anticorps monoclonal aux RFcy humains (Figure 2). La fixation de 1'anticorps monoclonal T125(YB2/0) ou du double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys aux RFcyIIIA (A), RFcyIIA (B), RFcyIIBl (C) et RFcyI (D) humains (hRFcy) a ete analysee par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcyIIIA (A), K562 (B), IIA.1.6-huRFcyIIBl (C) et Tf2-13 (D) sont incubees avec differentes concentrations de T125(YB2/0) ou du double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys. La fixation des AcM est detectee par des fragments F(ab')2 de souris anti-IgG (H+L) humaines couples au FITC). La fixation du double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys aux RFc-yIIIA humains exprimes par les cellules Jurkat-CD16 par rapport a celle de 1'anticorps monoclonal non mute est legerement diminuee (Figure 2A). Cette fixation est egalement diminuee lorsque les experiences sont faites avec des cellules indicatrices (K562) exprimant le RFcyIIA humain (Figure 2B). Par contre, la mutation des His310 et His43s de T125(YB2/0) abolit completement la fixation de cet anticorps au RFc-yIIBl humain (Figure 2C). La fixation de T125(YB20) His3lOLys/His435Lys aux RFcyI humains n'est pas affectee (Figure 2D). Exemple 4 : Effet des mutations des residus His435 et His310 d'une IgGl monoclonale anti-RhD sur ses proprietes 30 effectrices Nous avons analyse l'effet de la mutation des His310 et His435 de T125(YB2/0) sur 1'une des fonctions effectrices activatrices de cet anticorps. - 22 - Les capacites du double mutant et de 1'anticorps monoclonal non mute a induire une production d'IL-2 par les cellules Jurkat-huRFcyIIIA RFcyIIIA+ ont ete comparees par ELISA (Figure 3). Afin de normaliser les resultats issus de trois experiences differentes, la production d'IL-2 induite par differentes doses d'anticorps monoclonal est rapportee en pourcentage de celle induite par 10 g/ml de T125(YB2/0). Cette dose de T125(YB2/0), correspond a la production maximale d'IL-2 detectee dans toutes les experiences realisees. La production d'IL-2 induite par 1, 5 et 10 g/ml de T125(YB2/0) mute est reduite de 61%, 53%, et 54%, respectivement, par rapport a la liberation d'IL-2 induite par les memes doses de 1'anticorps monoclonal non mute (Figure 3). Les cellules Jurkat-huRFcyIIIA (RFcyIIIA+) sont stimulees pendant 15h a 37 C par differentes concentrations de T125(YB2/0) ou du double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys, en presence de fragments F(ab')2 de lapin anti-IgG (H+L) humaines permettant 1'agregation des anticorps monoclonaux humains anti-RhD. La production d'IL-2 par les cellules JurkathuRFcyIIIA est ensuite detectee par ELISA. La production d'IL-2 induite en presence de differentes concentrations des deux AcM est rapportee en pourcentage de celle induite par 10 4g/ml de T125(YB2/0)). Ces resultats indiquent que la modification des His310 et His435 de 1'interface CH2/CH3 d'une IgGi monoclonale diminue partiellement la fixation de cet AcM aux RFcyIIIA humains ainsi que sa capacite a induire une production de cytokine dependante de ces RFcy activateurs. Neanmoins, 1'anticorps monoclonal double mutant T125(YB20) His310Lys/His435Lys est encore capable de recruter les RFcyIIIA activateurs et d'induire des fonctions effectrices activatrices dependantes de ces recepteurs.35 - 23 - Exemple 5 : Comparaison des profils d'engagement des RFc'y humains de T125(YB2/0), du double mutant T125(YB2/0) His3lOLys/His435Lys et de T125(CHO). Les experiences precedentes montrent que 1'anticorps monoclonal double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys est un anticorps capable d'engager les recepteurs activateurs (RFcyIIA et RFcyIIIA), mais dont la capacite a fixer les RFcyIIB inhibiteurs est abolie. Afin de mieux caracteriser le comportement de cet anticorps monoclonal, nous avons compare sa fixation aux RFcyIIIA et RFcyIIB humains a celle de T125(CHO) dont les proprietes structurales et le profil d'engagement aux differents types de RFcy ont ete precisement definis (Figure 4). (A) et (C), la fixation des AcM T125(YB2/0), T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et T125(CHO) aux RFcyIIIA (A), et RFcyIIB1 (C) humains a ete analysee par immunofluorescence indirecte. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcyIIIA (A), ou IIA.1.6-huRFcyIIBl (C) sont incubees avec differentes concentrations de T125(YB2/0), T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et T125(CHO). La fixation des anticorps monoclonaux est detectee par des fragments F(ab')2 de souris anti-IgG (H+L) humaines couples au FITC. (B) et (D), les capacites des anticorps monoclonaux T125(YB2/0), T125 (YB2/0) His310Lys/His435Lys et T125 (CHO) a inhiber la fixation des anticorps 3G8-PE (anti-RFcyIIIA/IIIB humains) (B) ou AT10-FITC (anti-RFcyIIA/IIB humains) (D) ont ete comparees. Les cellules indicatrices Jurkat-huRFcyIIIA (B) ou IIA.1.6-huRFcyIIBl (D) sont incubees avec differentes concentrations de T125(YB2/0), ou de T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys ou de T125(CHO), puis avec 40 ng/ml de 3G8-PE (B) ou 40 ng/ml d'AT10-FITC (D), respectivement. Le pourcentage d'inhibition de la fixation de 3G8-PE ou d'AT10-FITC en fonction de la - 24 - concentration des anticorps monoclonaux competiteurs est calcule: T125(CHO), qui est plus fucosyle que T125(YB2/0), est capable d'induire des fonctions inhibitrices dependantes des RFcyIIBl. En revanche, it ne lie que faiblement les RFcyIIIA humains et est un mauvais inducteur des fonctions activatrices dependantes des RFcyIIIA. Les experiences d'immunofluorescence indirecte montrent que, bien que la fixation de 1'anticorps monoclonal double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys aux RFcyIIIA soit legerement diminuee par rapport a celle de T125(YB2/0), sa fixation reste tress superieure a celle de T125(CHO) (Figure 4A). Nous avons confirme cette difference de fixation aux RFcyIIIA humains entre le double mutant de T125(YB2/0) et T125(CHO) par des experiences de competition en utilisant 40 ng/ml de 3G8-PE, qui bloque les sites de liaison des RFcyIIIA et RFcyIIIB humains (Figure 4B). Des concentrations d'environ 15 g/ml pour T125(YB2/0) et de 40 g/ml pour T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys sont requises pour induire une inhibition de 50% de la fixation de 1'anticorps monoclonal 3G8-PE aux RFcyIIIA exprimes a la surface des cellules Jurkat-huRFcyIIIA. Par contre, une dose de T125(CHO) superieure a 100 g/ml (environ 130 g/ml) est necessaire pour atteindre 50% d'inhibition de la fixation de 3G8-PE. Les experiences d'immunofluorescence indirecte montrent que la fixation du double mutant T125(YB20) His310Lys/His435Lys aux cellules indicatrices IIA.1.6-huRFcyIIBl (RFcyIIBl+) est completement abolie, tandis que celle de T125(CHO) est maintenue malgre une diminution de la capacite de ce dernier AcM a se fixer aux RFc'yIIBl par rapport a T125(YB2/0) (Figure 4C). De meme, quelle que soit la concentration testee, le double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys est incapable - 25 - d'inhiber la fixation de 40 ng/ml de 1'anticorps AT10-FITC (AcM anti-RFcyIIA/RFcTIIB humains) aux cellules IIA.1.6-huRFcyIIBl, alors que T125(CHO) est capable d'induire une inhibition de la liaison de 1'anticorps AT10-FITC aux RFcyIIB1, bien que celle-ci soit inferieure a celle induite par T125(YB2/0) (Figure 4D). Ainsi, ces experiences d'immunofluorescence montrent que le double mutant T125 (YB20) His310Lys/His435Lys a un comportement different de celui de T125(CHO), en termer d'interactions avec les RFcy : T125(YB20) His310Lys/His435Lys recrute efficacement les RFcyIIIA activateurs. En revanche, cet anticorps monoclonal est incapable d'engager les RFcyIIB. Exemple 6 : Comparaison de 1'ADCC obtenue avec 1'anticorps T125(YB2/0), 1'anticorps double mutant T125(YB2/0) His310Lys/His435Lys et 1'anticorps T125(CHO). La capacite a induire une lyse ADCC des hematies Rhesus positives induite par differents anti-D en presence de cellules mononucleees (source de cellules effectrices) et de Tegeline (250O g/ml) a ete comparee pour differents anticorps anti-D. L'anticorps AD1 est 1'anticorps temoin negatif. L'anticorps T125 a ete exprime clans deux types cellulaires differents : YB2/0 (donnant. 1'anticorps T125(YB2/0) et CHO (donnant 1'anticorps T125(CHO)). Par ailleurs, 1'anticorps T125 a ete mute pour remplacer chacun de ses residus His 310 et His 435 par des residus lysine (T125(YB2/0) His3lOLys/His435Lys ). Les resultats apparaissent a la figure 5 : 1'anticorps mute Histidine (H310K H435K) induit une ADCC des hematies Rhesus positives, legerement inferieure a celle obtenue - 26 - avec 1'anticorps non mute T125(YB2/0), mais tres superieure a AD1. A noter que dans ces conditions experimentales, 1'anticorps temoin anti-D exprime dans CHO n'induit pas ou tres peu d'ADCC (resultats non presentes). Exemple 7 : Impact structural de la mutation des histidines 310 et 435 en Lysine La comparaison des structures cristallographiques des fragments Fc de T125(YB2/0) et de T125 H310K-H435K(YB2/0) (cf exemple 6) montre que les mutations des histidines 310 et 435 en lysines n'ont pas modifie la conformation generale du fragment Fc. Dans le document WO 2005/040216 (qui est incorpore ici par reference), le Demandeur montre que les anticorps non mutes, portant donc les residus His 310 et His 435, possedent la capacite de fixer des cations Zinc (Zn2+). Le fragment Fc portant les lysines a perdu sa capacite a fixer les cations Zn2+ ; cependant, la position de la chaine laterale de ces residus ainsi que leur encombrement se superposent avec ceux des residus histidines du fragment Fc de T125(YB2/0). Cette donnee est importante pour une utilisation de ce type d'anticorps en therapeutique humaine puisque cela suggere que la fixation de 1'anticorps T125 H310K-H435K(YB2/0) aux RFcn, et donc son catabolisme, ne seront pas modifies. Par contre, la mutation des residus histidines 310 et 435 en lysines a un impact sur 1'orientation des domaines CH2 du fragment Fc. En effet, la comparaison des structures cristallographiques des fragments Fc de T125(YB2/0) (en presence de Zinc) et du double mutant T125 H310KH435K(YB2/0) montre que ce dernier presente une - 27 - conformation plus fermee dans laquelle les deux domaines CH2 sont plus proches l'un de l'autre parr rapport aux domaines CH2 du fragment Fc de T125(YB2/0). Cette difference de conformation pourrait etre a l'origine de l'impact des mutations H310K et H435K sur la fixation de l'anticorps aux RFcy humains (cf exemples 3, 4 et 5). Revendications 1. Procede de preparation d'un anticorps dont la 5 region Fc lie selectivement les recepteurs de la region Fc des anticorps (FcR) activateurs, comprenant les &tapes suivantes . a) obtention d'anticorps monoclonaux a partir d'hybridome, d'heterohybridome, ou de toute 10 lignee cellulaire animale, veg&tale ou humaine, b) remplacement de chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) de la region Fc dudit anticorps par un residu choisi parmi la lysine, 1'alanine, la glycine, la valine, la leucine, 15 1'isoleucine, la proline, la methionine, le tryptophane, la ph&nylalanine, la serine ou la thr&onine, c) selection des anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est diminuee d'au moins 30%, de 20 preference d'au moins 50%, 70%, 80% ou encore d'au moins 90% par rapport au meme anticorps possedant une region Fc native. 2. Procede selon la revendication 1, caracterise 25 en ce qu'a 1'etape c), on selectionne les anticorps dont la fixation aux FcR inhibiteurs est abolie. 3. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 ou 2, caracterise en ce que ledit residu 30 choisi est la lysine. 4. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que 1'anticorps issu de 1'etape b) est exprime dans YB2/0 35 (ATCC n CRL 1662). - 29 - 5. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que ladite region Fc dudit anticorps selectionne a 1'etape c) se fixe aux recepteurs Fc activateurs tandis qu'elle ne se fixe pas aux recepteurs Fc inhibiteurs. 6. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que ledit anticorps se fixe au recepteur FcyRIII (isoformes A et B) et /ou au recepteur FcyRIIA et/ou au recepteur FcyRI (isoformes A et B), tandis quill ne se fixe pas au recepteur FcyRIIB (isoforme Bl et B2). 7. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdits recepteurs sont des recepteurs humains. 8. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdits recepteurs de la region Fc des anticorps se trouvent sur les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B. 9. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdits recepteurs inhibiteurs de la region Fc des anticorps se trouvent sur des cellules tumorales, comme les cellules de melanomes malins, les lymphocytes B tumoraux comme les lymphomes et les LLC-B et les cellules de myelome. 10. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que ledit anticorps lie 'la molecule CD20 a la surface de lymphocytes tumoraux de LLC-B. 2894982 - 30 - 11. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdits residus sont remplaces par mutagenese dirigee ou par 5 evolution moleculaire. 12. Utilisation d'un anticorps, dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) est remplace par un residu lysine, pour 1'obtention d'un 10 medicament destine a la vaccination anti-infectieuse et anti-tumorale, ledit anticorps etant engage dans un complexe immun qui ne pourra etre fixe que par les RFc-y activateurs des cellules presentant 1'antigene (monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules 15 epidermiques de Langerhans, lymphocytes B). 13. Utilisation d'un anticorps, dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) est remplace par un residu lysine, pour 1'obtention d'un 20 medicament destine au traitement du cancer. 14. Utilisation selon la revendication 13, pour 1'obtention d'un medicament destine au traitement d'un cancer choisi parmi les lymphomes, leucemies, myelomes, 25 sarcomes, tumeurs solides telles que carcinomes mammaires, tumeurs colorectales, tumeurs du pancreas, tumeurs de la prostate, tumeurs stomacales, tumeurs pulmonaires, tumeurs ovariennes, tumeurs du col de 1'uterus, tumeurs oculaires, tumeurs de la thyroide, 30 tumeurs de la sphere ORL melanomes malins, tumeurs nerveuses telles que glioblastome, neuroblastomes. 15. Utilisation d'un anticorps, dont chacun des residus His 310 et His 435 (numerotation de Kabat) est 35 remplace par un residu lysine, pour 1'obtention d'un- 31 - medicament destine au traitement des maladies infectieuses telles que 1'infection par le VIH (virus de 1'immunodeficience humaine), le VHB (virus de 1'hepatite B), le VHC (virus de 1'hepatite C), le VRS (virus respiratoire syncytial), le virus SRAS (virus de la pneumonie atypique), les rotavirus, les virus de la grippe, la variole, les infections bacteriennes telles que les infections dues au bacille de Koch, aux meningocoques, a Criptoccocus neoformans, a Clostridium, la tuberculose, et les infections a enterocoque.