Brevet FR2887884A1 — publié le 20070105

DOMAINE TECHNIQUE: La présente demande de brevet est relative à des épitopes de la protéine HBSP, et à leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE: Le virus de l'hépatite B de la famille des Hepadnaviridae est un virus enveloppé à ADN partiellement double brin de 3,2 kb qui possède 4 ORF à partir desquelles sont transcrits des ARNm de différentes tailles. L'ARNm prégénomique de 3,5 kb code pour les protéines de capside (HBc, HBe), et pour la polymérase (Pol), tandis que les ARNm de 2,4 kb, 2,1 kb codent les trois protéines d'enveloppe (HBs), et celui de 0,7 kb la protéine X (HBx) (Seeger and Mason, 2000). De plus, d'autres ARNm issus de l'épissage alternatif de l'ARNm prégénomique ont été mis en évidence et seraient encapsidés dans des particules virales défectives (Rosmorduc et al., 1995). Récemment, une nouvelle protéine virale, HBSP (hepatitis B spliced protein), traduite à partir de l'ARN épissé de 2,2 kb, majoritairement présent au sein de ces particules défectives, a pu être identifiée (Soussan et al., 2000). Suite à cet épissage, la protéine HBSP est constituée en sa partie N-terminale des 46 premiers acides aminés de la polymérase du VHB, et de 65 acides aminés codés dans une autre phase de lecture, appartenant de manière propre à HBSP en sa partie C-terminale. La protéine HBSP est détectée par immunohistochimie dans des biopsies de foie de porteurs chroniques du VHB (Soussan et al., 2000), et 30 à 40 % d'entre eux possèdent des anticorps dirigés contre la protéine (Soussan et al., 2003). RÉSUME DE L'INVENTION: La présente demande de brevet est relative à des épitopes de la protéine HBSP, et à leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique. Elle propose notamment des peptides ou polypeptides, mono- ou polyépitopiques, qui sont capables d'induire une réponse immunitaire dirigés contre le VHB, et notamment une réponse immunitaire cellulaire, de préférence une réponse T (T CD4+, TCD8+), notamment une réponse T CD8+. Des peptides ou polypeptides selon l'invention sont notamment capables d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou une induction et/ou stimulation de la différentiation de cellules T CD8+ en CTL, et plus particulièrement en CTL capables de lyse spécifique. Les peptides et polypeptides selon l'invention comprennent au moins un fragment 10 de HBSP, ou au moins un analogue d'un fragment, ou sont constitués d'un tel fragment ou analogue. La présente invention est également relative aux épitopes de cette protéine, aux oligonucléotides ou polynucléotides codant les peptides, polypeptides et épitopes selon l'invention, aux vecteurs portant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, aux cellules hôtes transfectées, infectées et/ou transformées par un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou par un tel vecteur. La présente invention est également relative aux applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives des produits selon l'invention. Les peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention trouvent en effet des applications d'intérêt tout particulier pour une immunisation thérapeutique et/ou préventive et/ou palliative contre une maladie ou un état lié à une infection ponctuelle ou chronique par le virus de l'hépatite B (VHB). La présente invention est particulièrement relative aux objets visés par les revendications de la demande telle que déposée. PRÉSENTATION DES FIGURES: Figures 1A, 1B et 1C: (A) Schéma du génome du VHB et des différents transcrits. (B) En (B), est représenté l'épissage de l'ARNm prégénomique de 3,5 kb du VHB qui permet la synthèse de la protéine HBSP. (C) En (C), sont présentées les constructions des plasmides pcDNA3.1 HBSP (insertion de séquence codant les 111 acides aminés de HBSP); pCMV.S2S et pCMV.B10-HBSP (insertion de séquence codant les acides aminés 39 à 111 de HBSP). Figure 2: Test ELISPOT réalisé sur 9 souris HHD immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Le nombre de spots par million de splénocytes est calculé en soustrayant la médiane des puits contrôle (milieu) à la médiane des puits testés (avec peptide). Un nombre minimum de 20 spots par million de splénocytes est considéré positif. Figure 3: Test de cytotoxycité réalisé sur 6 souris HHD immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Après stimulation des splénocytes pendant sept jours avec les peptides HBSP A2-1, HBSP A2-2 et Pol A2-2, ces cellules effectrices ont été mises en présence de cibles autologues chargées avec le peptide spécifique ou contrôle. Les graphes montrent le pourcentage de lyse spécifique à différents rapports effecteurs/cibles, c'est-à-dire le pourcentage obtenu en soustrayant la lyse de la cible contrôle à la lyse de la cible spécifique. Le résultat est positif lorsque le pourcentage de lyse spécifique est supérieur à 10 % pour deux rapports consécutifs. Figure 4: Test ELISPOT réalisé sur deux séries de 6 souris HLA-B*0702 (A à F et G à L) immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP et sacrifiées lors d'expériences indépendantes. Comme dans les autres essais ELISPOT, le nombre de spots est calculé en soustrayant la médiane des puits contrôle à celle des puits stimulés et considéré comme positif lorsqu'il est supérieur à 20 par million de splénocytes. Figure 5: Test de cytotoxicité réalisé sur les souris HLA-B*0702 mettant en évidence la forte lyse spécifique (pourcentage de la lyse de la cible spécifique moins le pourcentage de la lyse de la cible contrôle) en réponse à la stimulation par HBSP B7-1. Le graphe ne représente pour la stimulation par HBSP B7-1 que 5 souris sur 11 testées, et pour la stimulation par Pol B7-1, que 6 souris sur 12 testées. Figure 6: Sécrétion d'IFN-y observée par test ELISPOT ex vivo chez des splénocytes de souris HHD immunisées par le vecteur pCMV.B10-HBSP. La réponse spécifique de la protéine HBs est importante (pep 5 et pep 10). La réponse spécifique de HBSP est essentiellement dirigée contre le 15mers 64-78, et pour la souris I, contre le 15mers 59-73. Figure 7: Mise en évidence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de HBs-5 et HBs-10 chez les souris HHD immunisées par le vecteur pCMV.B10HBSP, mais pas de HBSP A2-1 et de HBSP A2-2. Figure 8: Marquage intracytoplasmique réalisé pour la stimulation par le peptide HBSP 79-93. Le graphe de gauche montre la sécrétion d'IFN-y par les cellules CD8+ présentes dans le milieu. Le graphe de droite représente la sécrétion d'IFN-y par les cellules CD8+ présentes dans le puits stimulé par le peptide 79-93. Figure 9: le graphe du haut montre la sécrétion d'IFN-y ex vivo dans un test ELISPOT en réponse aux peptides dérivés de la protéine HBSP, et de 4 peptides dérivés de HBs chez des souris HLA-B*0702 immunisées par le vecteur pCMV.B10-HBSP. Le graphe du bas représente les résultats après stimulation secondaire avec les peptides 15mers 39-53, 59-73, 64-78, et 79-93. Figure 10: Mise en évidence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de HBSP B7-1, et du 15mers 79-93. Aucune souris ne répond à la stimulation par HBs 62 et HBSP 39-53. Figure 11: séquences nucléotidiques codant le fragment 39 à 111 de HBSP (SEQ ID NO:1), et codant la protéine HBSP complète (SEQ ID NO:2), et séquence protéique complète de HBSP (SEQ ID NO:3). Figure 12: séquences de peptides, polypeptides et épitopes selon l'invention (tableau 2, présentant les SEQ ID NO:4 à 16). DESCRIPTION DETAILLÉE: La présente invention est relative à des peptides ou polypeptides mono- ou polyépitopiques qui sont capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB. Les peptides ou polypeptides selon l'invention peuvent être des peptides ou polypeptides naturels, ou des fragments de protéine ou polypeptide naturel, ou bien être des peptides ou polypeptides recombinants, ou bien être des peptides ou polypeptides synthétiques. Toute technique de synthèse connue de la personne du métier peut être utilisée. Des exemples de techniques de synthèse, telles que la synthèse en phase solide de type Merrifield, peuvent être par exemple trouvées dans l'ouvrage Solid Phase Peptide Synthesis (J.M. Steward & J.D. Young, 1969, Ed. W.H. Freeman Co., San Francisco), ou Peptide synthesis (M. Bodansky et al. 1976, John Wiley & Sons, 2"d Edition). Les peptides ou polypeptides mono- ou poly-épitopiques selon l'invention comprennent au moins un fragment de HBSP, ou au moins un analogue d'un fragment, ou sont constitués d'un tel fragment ou analogue. La séquence protéique complète de HBSP est constituée de 111 acides aminés, présentés en figure 11 (SEQ ID NO:3). Une séquence nucléotidique codant la protéine complète est présentée sous SEQ ID NO:2 en Figure 11. La présente demande de brevet est relative à des peptides ou polypeptides mono- ou poly-épitopiques, capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, qui: - sont constitués de 6 à 80 acides aminés, et comprennent au moins un fragment ou analogue parmi: - un fragment de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein) d'au moins 6 acides aminés, et d'au plus 80 acides aminés, - un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 80 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, ou bien qui sont constitués d'un tel fragment ou analogue. De préférence, ledit fragment de HBSP et ledit analogue conservateurs sont chacun, indépendamment l'un de l'autre, constitués de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 16 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés. Avantageusement, ledit fragment de la protéine HBSP est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Avantageusement, ledit analogue conservateur est un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et d'au plus 25 acides aminés, préférentiellement au plus 20 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 9 à 20 ou de 9 à 15 acides aminés. La présente demande vise en tant que tels lesdits fragments et analogues. Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut être constitué d'un seul fragment ou analogue. II peut également être constitué de plusieurs fragments ou analogues, par exemple au moins deux, ou au moins trois fragments et/ou analogues. Un polypeptide ou polypeptide selon l'invention peut contenir ces fragments de manière contiguë ou non contiguë : ils peuvent être dans un état de contiguïté/non contiguïté différent de celui dans lequel ils se trouvent dans la protéine native HBSP, ou au contraire se trouver dans le même état de contiguïté/non contiguïté que dans la protéine HBSP native complète. Ces fragments peuvent être placés dans le même ordre, ou au contraire dans un ordre différent, de celui dans lequel ils se trouvent dans la protéine HBSP native complète. Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut ainsi être constitué de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 16 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés. Avantageusement, ledit peptide ou polypeptide selon l'invention est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, de 6 à 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut en outre être associé, couplé ou fusionné à une ou des séquences aminoacides qui ne dérivent pas de HBSP. Par exemple, il peut être associé, couplé ou fusionné à une ou des séquences aminoacides qui ne dérivent pas de HBSP, et qui ont la capacité à augmenter l'immunogénicité du peptide ou polypeptide, et/ou bien qui ont la capacité de diriger le peptide ou polypeptide vers des cibles biologiques particulières, par exemple des cibles cellulaires avantageuses pour le traitement, la palliation et/ou la prévention d'une maladie ou d'un état lié à une infection, à VHB ponctuelle ou chronique. Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut par exemple être associé, couplé ou fusionné à une ou des autres séquences aminoacides qui dérivent de VHB, mais qui ne dérivent pas de HBSP. Par exemple, ledit peptide ou polypeptide peut être associé, couplé ou fusionné à une séquence ou partie de séquence de protéine d'enveloppe de VHB, par exemple une séquence ou partie de séquence de protéine S. Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 111 de HBSP (jonction entre la séquence commune avec la polymérase, et la partie originale de la séquence de HBSP), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 63 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 53 de HBSP (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. La séquence de SEQ ID NO:16 (LPNDPRPPV), qui est identique à la séquence qui s'étend des positions 45 à 53 de la protéine HBSP complète, est un exemple de sous-fragment conservateur de la séquence de SEQ ID NO:15. Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 47 à 111 de HBSP (partie originale de la séquence de HBSP), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sousfragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi être constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: a) 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), b) 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), c) 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6) d) 54 à 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), e) 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), f) 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), g) 59 à 73 (P-15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), h) 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), i) 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), j) 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), ou parmi les sous-fragments conservateurs d'au moins 6 acides aminés de l'une de ces séquences a) à h), préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Les séquences de SEQ ID NO:5 et NO:6 sont des exemples de sous-fragments conservateurs du fragment de SEQ ID NO:4. Les séquences de SEQ ID NO:8 et NO:9 sont des exemples de sous-fragments conservateurs du fragment de SEQ ID NO:7. La présente demande vise en tant que tels lesdits fragments et analogues. Certains desdits fragments sont mono-épitopiques, d'autres sont polyépitopiques, d'autres encore correspondent à des épitopes. Ainsi, le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 79 à 93 de HBSP (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4) contient deux épitopes, à savoir: - APVFPSHHL (HBSP B7-1; positions 83 à 91; SEQ ID NO:5), et VFPSHHLGL (positions 85 à 93; SEQ ID NO:6). Le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 54 à 68 de HBSP (RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7) contient au moins deux épitopes CD8+, à savoir: - KPARLLLKA (SEQ ID NO:9), qui est reconnu dans le contexte A2 et B7, - DPAKPARLL (SEQ ID NO:8), qui est reconnu dans le contexte B7. Avantageusement, le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 54 à 68 de HBSP (RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7) contient également au moins un épitope reconnu par les lymphocytes T CD4+ de patients VHB+ ; ce fragment contient donc également au moins un épitope restreint par une molécule HLA de classe Il (telle que HLA-DR, HLA-DP, etc.). Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 1 à 46 de HBSP (partie de la séquence de HBSP qui est commune à celle de la polymérase), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 1 à 38 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 15 à 29 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14) de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ladite réponse immunitaire est avantageusement une réponse à médiation cellulaire (réponse T et/ou NK). Ledit peptide ou polypeptide selon l'invention est de préférence capable d'induire une réponse T (T CD8+ et/ou TCD4+). Ledit peptide ou polypeptide est alors capable d'induire l'activation et/ou la différentiation de cellules T (T CD8+ et/ou T CD4+). De préférence, ledit peptide ou polypeptide est capable d'induire une réponse T CD8+ et/ou CD4+, notamment d'induire l'activation de cellules T CD8+ et/ou T CD4+, et/ou la différentiation de cellules T CD8+ en CTL. Ladite activation de cellules T se traduit alors par exemple par l'induction d'une production de cytokines (telles que de l'IFN-gamma). Ladite différentiation de T CD8+ se traduit alors par exemple par une différentiation de T CD8+ en CTL, et plus particulièrement en CTL capables de lyse spécifique. Ledit fragment ou, le cas échéant, ledit analogue conservateur, est de préférence restreint par le CMH, avantageusement par HLA (HLA de classe I, telle que HLAA, HLA-B, HLA-C, HLA-F, HLA-G, HLA-H, et/ou HLA de classe Il, telle que HLAD, par exemple HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DS, HLA- DZ). Ledit fragment ou, le cas échéant, ledit analogue conservateur, peut par exemple être restreint par une molécule HLA de classe I, telle que une molécule HLA-A, HLA-B, ou HLA-C, HLA-F, HLA-G, HLA-H, plus particulièrement HLA-A (HLA-A1, HLA-A2, par exemple HLA-A2), HLA-B (HLAB1, HLA-B2, HLA-B3, HLA-B4, HLAB5, HLA-B6, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B9, par exemple HLA-B7, et plus particulièrement HLA-B0702, HLA-B0703, HLA-B0704, HLA-B0705, HLA-B1508, HLA-B3501, HLA-B3502, HLA-B3503, HLA-B51, HLA-B5301, HLA-B5401, HLAB5501, HLA-B5502, HLA-B 5601, HLA-B5602, HLA-B6701 et HLAB7801). L'invention vise ainsi plus particulièrement un peptide ou polypeptide, mono- ou poly-épitopique, capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou T CD4+ dirigée contre VHB, caractérisé en ce que: - il est constitué de 6 à 80 acides aminés, et en ce que - il comprend au moins un, ou est constitué d'un fragment ou analogue parmi: - un fragment de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein) d'au moins 6 acides aminés, et d'au plus 80 acides aminés, - un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 80 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et /ou CD4+ dirigée contre VHB, et en ce que - ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: a) b) c) d) e) f) g) h) i) J) k) I) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), de 54 à 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), de 59 à 73 (P-15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), ou est un sous-fragment conservateur de l'une de ces séquences a) à m), ledit sous-fragment conservateur étant constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de l'une de ces séquences a) à m) (par exemple, 6, 7 ou 8 acides aminés), et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB. De préférence, ledit fragment de HBSP et ledit analogue conservateurs sont chacun, indépendamment l'un de l'autre, constitués de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés. Avantageusement, ledit fragment de la protéine HBSP est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Avantageusement, ledit analogue conservateur est un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et d'au plus 25 acides aminés, préférentiellement au plus 20 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 9 à 20 ou de 9 à 15 acides aminés. Des exemples d'analogues conservateurs comprennent notamment ceux qui 15 résultent de la délétion et/ou de la substitution conservative d'un ou plusieurs acides aminés d'un fragment selon l'invention. Par exemple, les quatre premiers acides aminés N-terminaux et les deux derniers acides aminés C-terminaux de la séquence de SEQ ID NO:4 (positions 79 à 93) peuvent être délétés (il en résulte la séquence de SEQ ID NO:5). Par exemple, les six premiers acides aminés N-terminaux de la séquence de SEQ ID NO:4 (positions 79 à 93) peuvent être délétés (il en résulte la séquence de SEQ ID NO:6). Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO:5 (qui est restreinte par HLA-B7), on peut substituer l'acide aminé L en position 9 par A, I, M, V, F, W ou Y, sans changer la reconnaissance du peptide par les lymphocytes T. Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO:9 (qui est restreinte par HLA-A2), on peut substituer l'acide aminé L en position 2 par V, M, I, T ou A, sans changer la reconnaissance du peptide par les lymphocytes T. Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO:9 (qui est restreinte par 30 HLA-A2), on peut substituer l'acide aminé I en position 9 par V, M, L, T ou A, sans changer la reconnaissance du peptide par les lymphocytes T. Avantageusement, ce peptide ou polypeptide est restreint par une molécule HLA de classe 1 et/ou de classe Il. Ce peptide ou polypeptide peut être caractérisé par le fait qu'il est capable d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou T CD4+, et/ou une différentiation de cellules T CD8+ en CTL. Comme précédemment indiqué, ce peptide ou polypeptide peut comprendre un 5 desdits fragments ou analogues, ou bien au moins deux desdits fragments ou analogues. II peut par ailleurs être associé, couplé ou fusionné à une protéine ou fragment de protéine autre que HBSP (fragment d'au moins 6 acides aminés), par exemple une protéine ou fragment de protéine de VHB autre que HBSP, par exemple une protéine ou fragment de protéine d'enveloppe de VHB, par exemple une protéine S ou un fragment de protéine S. L'invention vise bien entendu les séquences a) à m) ci-dessus mentionnées en tant que telles, ainsi que leurs fragments conservateurs en tant que tels, tels que 15 ci-dessus définis. Certaines de ces séquences sont mono-épitopiques (par exemple, les séquences b), c), e), f), h), j), k), I) ci-dessus mentionnées), d'autres sont poly-épitopiques (par exemple, séquence a) ci-dessus mentionnées). Les séquences a), b), c), e), g), I) et m) sont restreintes par HLA-B (SEQ ID NO:4, 5, 6, 8, 15, 16), et les séquences f), h), i), j) et k) sont restreintes par HLAA (SEQ ID NO:9, 11, 12, 13, 14). La séquence mentionnée sous d) ci-dessus (SEQ ID NO:7) est à la fois restreinte par HLA-A et par HLA-B, et est en outre restreinte par une molécule HLA de 25 classe II. L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-A. Ils sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins un fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: i. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT; SEQ ID NO:7), ii. de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), iii. de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), iv. de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), v. de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), vi. de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à vi., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à vi., préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, par exemple 6, 7, ou 8 acides aminés consécutifs (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, et plus particulièrement à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-B. Ils sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins un fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: i. de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), ii. de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), iii. de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), iv. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT; SEQ ID NO:7), v. de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), vi. de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), vii. de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), viii. de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à viii., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à viii., préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, par exemple 6, 7, ou 8 acides aminés consécutifs (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, et plus particulièrement à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par une molécule HLA de classe II. Ils sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins fragment de HBSP est constitué d'une séquence RDPAKPARLLLKAT (positions 54 à 68 de HBSP; SEQ ID NO:7), ou parmi les sous-fragments conservateurs de cette séquence, lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD4+ dirigée contre VHB. L'invention vise également les épitopes capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, qui sont constitués d'un fragment de 6 à 15 acides aminés de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein), de préférence de 9 à 15 acides aminés, notamment de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Sont plus particulièrement visés les épitopes de HBSP (Hepatitis B spliced protein), qui sont choisis parmi: A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs de l'une des séquences a) à m) suivantes: a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), d) de 54 à 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), g) de 59 à 73 (P-15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), k) de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou 10 CD4+ dirigée contre VHB, ou B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB. Certains des épitopes de HBSP selon l'invention sont restreints par HLA-B. C'est notamment le cas des épitopes de HBSP (Hepatitis B spliced protein), qui 20 sont choisis parmi: A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs, notamment de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés, de l'une des séquences suivantes: - de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), - de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), de 83 à 91 (APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), -de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), - de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), - de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, ou B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB. L'invention vise également les épitopes de la protéine HBSP, qui sont restreints par une molécule HLA de classe I (par exemple, HLA-B), qui sont constitués d'une des séquences suivantes: - VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP; SEQ ID NO:6), - APVFPSHHL (positions 83 à 91 de HBSP; SEQ ID NO:5), - DPAKPARLL (positions 55 à 63 de HBSP; SEQ ID NO:8), - LPNDPRPPV (positions 45 à 53 de HBSP; SEQ ID NO:16), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B. D'autres épitopes de HBSP selon l'invention sont restreints par HLA-A. C'est notamment le cas des épitopes de HBSP (Hepatitis B spliced protein), qui sont choisis parmi: A. les qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides 30 aminés consécutifs de l'une des séquences suivantes: - de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7) , - de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), - de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), - de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), - de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), - de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14),et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, ou B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB. L'invention vise également les épitopes de la protéine HBSP, qui sont restreints par une molécule HLA de classe I (par exemple, HLA-A), qui sont constitués d'une des séquences suivantes: - KPARLLLKA (SEQ ID NO:9; positions 58 à 66 de HBSP), - LLLKATLCI (SEQ ID NO:11; positions 62 à 70 de HBSP), - TLCIPHVAV (SEQ ID NO:13; positions 67 à 75 de HBSP), LLDEEAGPL (SEQ ID NO:14; positions 13 à 21 de HBSP), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A. L'invention propose également une méthode pour produire un épitope de HBSP capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement un épitope restreint par une molécule du CMH, avantageusement une molécule HLA, et notamment par une molécule HLA de classe 1 et/ou une molécule de classe II, comprenant: la sélection parmi: A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs de l'une des séquences a) à m) suivantes: a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), d) de 54 à 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), g) de 59 à 73 (P-15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), k) de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), ou parmi B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérive d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, d'un peptide qui est capable d'induire une réponse T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, par exemple d'induire une activation de cellules T (production de cytokines, telles que IFN-gamma), et/ou d'induire la différentiation de T CD8+ en CTL (lyse-spécifique). Des exemples de telles méthodes sont notamment décrites dans les exemples qui suivent. Pour produire des épitopes restreints par HLA-B, la sélection peut par exemple s'opérer parmi les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs, notamment de 9 à 15 acides aminés (par exemple, 6, 7, 8, 9 ou 10) de la séquence RTEIAPVFPSHHLGL (positions 79 à 93 de HBSP; SEQ ID NO:4). Une telle sélection permet notamment d'identifier l'épitope APVFPSHHL (HBSP B7-1; positions 83 à 91 de HBSP; SEQ ID NO:5), et l'épitope VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP; SEQ ID NO:6). La présente demande est également relative aux mimotopes des épitopes de 5 HBSP. Des méthodes pour construire des mimotopes d'un épitope donné sont connues dans l'art antérieur. Un exemple de telles méthodes est par exemple décrit dans la demande WO 86 06487 au nom de Commonwealth Serum Laboratories Commission (US 4 833 092 dont le contenu est incorporé par référence; EP 220 245 B1). De tels mimotopes peuvent avantageusement être de taille inférieure à celle de l'épitope qu'ils miment. Ils peuvent comprendre dans leur séquence des acides acides aminés alpha et/ou des acides aminés beta. La présente demande est également relative aux anticorps dirigés contre un épitope de HBSP, de préférence aux anticorps spécifiques d'un ou plusieurs desdits épitopes, qui ne se lient pas à une séquence de la protéine HBSB qui ne serait pas épitopique (c'est-à-dire séquence de HBSP qui ne serait pas capable d'induire une réponse immunitaire contre VHB). De tels anticorps peuvent être notamment produits par immunisation d'un mammifère contre un peptide ou polypeptide selon l'invention, et isolement d'un anticorps spécifique produit. Des anticorps monoclonaux peuvent être produits (Kdhler et Milstein 1975, Nature 256:495-497). La présente invention est également relative aux oligonucléotides et aux polynucléotides qui codent un peptide ou polypeptide selon l'invention, ou un épitope selon l'invention. Ce codage s'effectue de préférence selon le code génétique universel, en tenant compte de la dégénérescence de ce code. Des exemples d'oligonucléotides ou polynucléotides selon l'invention comprennent notamment ceux de SEQ ID NO:19 à 31 (cf. Figure 11 présentant en SEQ ID NO:2 la séquence nucléotidique codant la protéine complète de HBSP, et sur laquelle on peut relever les positions nucléotidiques correspondant aux peptides selon l'invention; cf. également Tableau 3 ci-dessous). Tableau 3: Positions Séquence peptidique Positions par Séquence nucléotidique par rapport à ou polypeptidique rapport à la (SEQ ID NO:) la séquence (SEQ ID NO:) séquence protéique de nucléotidique HBSP de HBSP (SEQ ID (SEQ ID NO:3) NO:2) de 79 à 93 RTEIAPVFPSHHLGL de 235 à 279 CGGACG (SEQ ID NO:4) GAAATTGCAC CTGTATTCCC ATCCCATCAT CTTGGGCTT (SEQ ID NO:19) de 83 à 91 APVFPSHHL de 247 à 273 GCAC CTGTATTCCC (SEQ ID NO:5) ATCCCATCAT CTT (SEQ ID NO:20) de 85 à 93 VFPSHHLGL de 253 à 279 GTATTCCC (SEQ ID NO:6) ATCCCATCAT CTTGGGCTT (SEQ ID NO:21) de 54 à 68 I RDPAKPARLLLKATL de 160 à 204 C (SEQ ID NO:7) GGGACCCTGC AAAACCTGCA CGACTCCTGC TCAAGGCAAC TCTA (SEQ ID NO:22) de 55 à 63, DPAKPARLL de 163 à 189 GACCCTGC AAAACCTGCA CGACTCCTG (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:8) de 58 à 66 KPARLLLKA de 172 à 198 AAACCTGCA (SEQ ID NO:9) CGACTCCTGC TCAAGGCA (SEQ ID NO:24) de 59 à 73 PARLLLKATLCIPHV de 175 à 219 CCTGCA (SEQ ID NO:10) CGACTCCTGC TCAAGGCAAC TCTATGTATC CCTCATGTT (SEQ ID NO:25) de 62 à 70 LLLKATLCI de 184 à 210 CTCCTGC (SEQ ID NO:11) TCAAGGCAAC TCTATGTATC (SEQ ID NO:26) de 64 à 78 LKATLCIPHVAVQNL de 190 à 234 C TCAAGGCAAC (SEQ ID NO:12) TCTATGTATC CCTCATGTTG CTGTACAAAA CCTT (SEQ ID NO:27) de 67 à 75 TLCIPHVAV de 199 à 225 AC (SEQ ID NO:13) TCTATGTATC CCTCATGTTG CTGTA (SEQ ID NO:28) de 13 à 21 LLDEEAGPL de 37 à 63 TTGT (SEQ ID NO:14) TAGACGAAGA GGCAGGTCCC CTC (SEQ ID NO:29) de 39 à 53 EDLHLQLPNDPRPPV de 115 à 159 GAAGAT (SEQ ID NO:15) CTGCATCTCC AGCTTCCCAA TGATCCTCGA CCACCAGTA (SEQ ID NO:30) De 45 à 53 LPNDPRPPV de 133 à 159 CTTCCCAA (SEQ ID NO:16) TGATCCTCGA CCACCAGTA (SEQ ID NO:31) La présente invention est également relative aux vecteurs qui comprennent au moins un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, et aux cellules hôtes transfectées, infectées ou transformées par au moins un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, ou par au moins un vecteur selon l'invention. Des vecteurs appropriés comprennent notamment les vecteurs viraux intégratifs (rétrovirus, virus adéno-associé, lentivirus, etc.) ou non intégratifs (adénovirus, alphavirus, virus Herpes simplex, etc.), les plasmides, les phages, les YAC (Yeast Artificial Chromosome), et de manière générale tout vecteur d'expression. Un vecteur d'expression avantageux permet la production d'un épitope, peptide ou polypeptide selon l'invention in vitro et/ou in vivo. Un vecteur portant une séquence nucléotidique codant la protéine HBSP complète, et un vecteur portant une séquence nucléotidique codant le fragment 39-111 de la protéine HBSP ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 Paris Cedex 15, France) : leurs numéros respectifs de dépôt sont CNCM 1-3467 et CNCM I-3468. En sus dudit au moins un oligonucléotide ou polynucléotide, un vecteur selon l'invention peut donc en outre comprendre un ou plusieurs éléments parmi: région de régulation de la transcription (telles que promoteur, amplificateur, site de liaison du ribosome (RBS), signal polyA), signal de terminaison, origine de réplication procaryote ou eucaryote, gène de résistance (pour la sélection), gène codant pour une étiquette de type Myc, His,Tag ou Flag. La construction d'un vecteur approprié est réalisable par la personne du métier, en fonction des objectifs poursuivis. Par exemple, le choix d'un promoteur approprié peut être en fait en fonction du type d'expression souhaité, par exemple une expression constitutive ou une expression transitoire ou une expression inductible, ou une expression forte ou faible, ou un promoteur à spécificité cellulaire ou à spécificité liée au stade de développement. Plus particulièrement, un promoteur tissu-spécifique peut être choisi en fonction de l'organe qui doit recevoir le produit. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur d'un vecteur selon l'invention est le promoteur du CMV (cytomegalovirus). Ledit vecteur peut par ailleurs également comprendre une ou des séquences qui permettent une expression conditionnelle, telles que des séquences du système Cre/Lox ou analogue. Pour des applications qui visent l'expression in vivo du peptide ou polypeptide codé, et plus particulièrement pour des applications thérapeutiques, et/ou palliatives, et/ou préventives, notamment vaccinales, on choisira un vecteur d'expression adapté à une expression in vivo dans la cellule ou l'organisme hôte concerné, tel que par exemple un rétrovirus, et plus particulièrement un lentivirus. II a par exemple été construit un vecteur lentiviral dérivé de VIH-1 (pTRIP-CMVHBSP) qui exprime HBSP. Pour les applications thérapeutiques, et/ou palliatives, et/ou préventives, notamment vaccinales, une administration d'ADN nu (ADN non porté par un vecteur) ou d'ADN plasmidique peut par ailleurs être réalisée (injection dans les cellules musculaires par exemple) ; cf. Loirat et al., 2000; Malmassari et al., 2005, dont les contenus sont incorporés par référence). Cet ADN nu ou plasmidique peut par ailleurs être associé, couplé ou fusionné à une molécule de ciblage cellulaire et/ou à une molécule stimulant la réponse immunitaire. Il peut par ailleurs être associé à un ou plusieurs éléments facilitant la transfection, tels que liposome, polymère, conjugué. La présente invention est également relative aux cellules génétiquement modifiées comprenant un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention. Une cellule peut être infectée, transformée ou transfectée par un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, ou par un vecteur selon l'invention selon des méthodes connues de la personne du métier, par exemple par transfection chimique (phosphate de clacium, lipofectamine), les techniques lipidiques (liposome), l'électroporation, la photoporation, l'utilisation de vecteurs viraux, etc. L'infection, transformation ou transfection peut être réalisée sur un organisme unicellulaire ou pluricellulaire. Dans le cas d'organismes pluricellulaires, tels qu'un mammifère, et plus particulièrement un être humain, elle peut être réalisée in vivo ou ex vivo. Tout type de cellule que la personne juge appropriée peut être utilisé. Il peut s'agir de cellules procaryotes ou eucaryotes, telles que des cellules de mammifères, par exemple des cellules humaines ou des cellules de mammifère non-humain, de préférence des cellules somatiques. Parmi les cellules particulièrement intéressantes dans le cadre d'une immunisation thérapeutique, préventive ou palliative, on peut notamment citer les cellules du système immunitaire, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC). Ces cellules peuvent par exemple être des cellules APC impliquées dans la reconnaissance du CMH de classe I, et plus particulièrement du HLA de classe I, telles que des cellules dendritiques (DC), or dans la reconnaissance du CMH de classe Il, et plus particulièrement du HLA de classe II, telles que les macrophages et les lymphocytes B. L'invention vise ainsi plus particulièrement les cellules APC, et plus préférentiellement les cellules dendritiques (DC), telles qu'une cellule de Langerhans, qui ont été transfectées, infectées ou transformées par un oligonucléotide, polynucléotide ou vecteur selon l'invention. La présente invention est également relative aux applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives des produits selon l'invention. Les peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention trouvent en effet des applications d'intérêt tout particulier pour une immunisation thérapeutique et/ou préventive et/ou palliative contre une maladie ou un état lié à une infection ponctuelle ou chronique par le virus de l'hépatite B (VHB). Les produits selon l'invention peuvent en effet prévenir et/ou traiter et/ou pallier une hépatite B, c'est-à-dire l'infection au VHB en ellemême, mais aussi prévenir et/ou traiter et/ou pallier les maladies et états pathologiques induits par une telle infection, tels que carcinome hépatocellulaire, ou, dans le cas d'une infection chronique à VHB, fibrose. Pour les applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives, les produits selon l'invention peuvent être utilisés sous forme libre, ou bien forme complexée ou polymérisée ou conjuguée ou autrement physiquement associée. Les peptides ou polypeptides selon l'invention peuvent par exemple être utilisés sous forme de lipopeptides, les oligonucléotides ou olynucléotides selon l'invention peuvent par exemple être utilisés sous forme de liposomes. De tels composés qui comprennent, en sus d'un produit selon l'invention (peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention), une composante non protéique ou nucléotidique, telle que par exemple une composante lipidique, sont visés par la présente demande. Pour les applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives, les produits selon l'invention peuvent être utilisés en association, pour une administration simultanée ou différée, avec un ou plusieurs autres principes actifs, tel qu'un autre principe actif anti-VHB et/ou un autre principe actif anti-Virus de l'hépatite (anti-VH), par exemple anti-VHC. La présente demande est donc relative à une composition pharmaceutique, et notamment à une composition pharmaceutique adaptée à une administration in vivo (notamment par injection), ou à une application in vitro ou ex vivo, qui comprend au moins un: - peptide ou polypeptide selon l'invention, éventuellement sous forme de lipopeptide ou lipopolypeptide, - épitope selon l'invention, éventuellement sous forme de lipopeptide, - mimotopeselon l'invention, - oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, éventuellement sous forme de liposome, - vecteur selon l'invention, cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène selon l'invention, chacun de ces produits pouvant se trouver sous forme sous forme libre, ou bien forme complexée ou polymérisée ou conjuguée ou autrement physiquement associée. Une telle composition peut en outre comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. II peut s'agir d'un véhicule sous forme de solution ou d'émulsion physiologiquement acceptable, ou d'un excipient pharmaceutiquement acceptable (y compris de l'eau, des sels, du dextrose, du glycérol, de l'éthanol, et des combinaisons de ces excipients). Une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être destinée à une administration systémique ou topique. Elle peut être destinée à une administration sous-cutanée (s.c.), intradermique (i.d.), intramusculaire (i.m.) or intravéneuse (i.v.) par injection, par voie orale, par voie intranasale, par inhalation. La quantité de principe actif selon l'invention à administrer (dosage de la composition) dépend du sujet à traiter, y compris de son état physiologique, de l'état de son système immunitaire, de la voie d'administration prévue, et de la taille et/ou du poids du patient. Des exemples de doses appropriées comprennent notamment de 1 microgramme à 2,5 milligrammes, pour des injections de vecteur ADN destinées à un être humain, mais peuvent être modifiées et adaptées par la personne du métier en fonction des circonstances. II peut s'agir d'une composition vaccinante, ou d'une composition de thérapie ou palliation par immunisation. Lorsqu'elle destinée à une administration à l'homme pour vaccination, elle peut en outre comprendre un adjuvant de vaccination, et plus particulièrement un alun, ou 20 un adjuvant CpG ODN. Elle peut en outre comprendre un fragment protéique ou polynucléotide de VHB autre que ceux de la présente invention, par exemple un fragment de VHB autre qu'un fragment de HBSP, par exemple une protéine d'enveloppe, telle que la protéine S, ou un fragment d'une telle protéine, ou un oligonucléotide, ou polynucléotide codant une telle protéine ou un tel fragment de protéine, ou un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou une cellule hôte transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide. Par exemple, une telle composition peut, en sus d'un produit selon l'invention, comprendre un ou plusieurs antigènes HBs, préférentiellement sous forme de particules portant un ou plusieurs antigènes HBs, telles que les particules chimères décrites dans les brevets US 5 324 513 (dont le contenu est ici incorporé par référence), et dans le brevet EP 156 712. Les particules chimères décrites dans ces brevets, et notamment telles que définies en revendication 1 du 2887884 30 brevet EP 156 712 B1 ou du brevet US 5 324 513, comprennent des polypeptides qui portent les sites immunogènes de l'antigène HBs et du récepteur de l'albumine humaine polymérisée du virus de l'hépatite B. Les peptides ou polypeptides selon l'invention ont la propriété de fusionner avec ces particules chimères. Une composition pharmaceutique selon l'invention peut donc avantageusement comprendre des particules portant les sites immunogènes de l'antigène HBs, et des peptides ou polypeptides selon l'invention, éventuellement fusionnés à ces particules. Une telle composition peut en outre comprendre un ou plusieurs autres principes actifs, par exemple un autre principe actif anti-VHB et/ou un autre principe actif anti-Virus de l'hépatite (anti-VH), par exemple antiVHC. Les produits selon l'invention peuvent en outre être utilisés pour activer et/ou 15 différencier des lymphocytes T (T CD8+ et/ou T CD4+), et plus particulièrement des lymphocytes T CD8+, et/ou pour induire ou faciliter la maturation de cellules APC, et plus particulièrement de cellules dendritiques (DC). La présente invention est ainsi également relative à une méthode pour activer et/ou différencier un lymphocyte T (T CD8+ et/ou T CD4+), et plus particulièrement un lymphocyte T CD8+, qui comprend la mise en contact (in vitro, in vivo ou ex vivo) dudit lymphocyte T avec au moins un élément parmi: - peptide ou polypeptide selon l'invention, - épitope selon l'invention, - mimotope selon l'invention, - oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, - vecteur selon l'invention, - cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC) selon l'invention. Les cellules T mis en oeuvre peuvent être issues de lignées cellulaires, ou bien être les cellules T d'un donneur (par exemple un patient souffrant d'une infection au VHB ou d'un état pathologique lié à une telle infection, ou bien donneur HLA-compatible). Cette mise en contact est de préférence réalisée dans des conditions de nutrition, d'atmosphère, de température, et de temps de contact, qui permettent l'activation et/ou la différentiation des lymphocytes T mis en contact. Les lymphocytes T ainsi activés et/ou différenciés constituent des cellules effectrices efficaces pour lutter contre l'installation et/ou le développement et/ou la résurgence d'une infection par VHB, et/ou d'une maladie ou état pathologique lié à une telle infection, tel que carcinome hépatocellulaire et/ou fibrose. La présente invention est également relative à une méthode pour induire et/ou stimuler la maturation de cellules APC, et plus particulièrement de cellules dendritiques (DC), qui comprend la mise en contact (in vitro, in vivo ou ex vivo) de ladite cellule APC avec au moins un élément parmi: peptide ou polypeptide selon l'invention, - épitope selon l'invention, mimotope selon l'invention, - oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, - vecteur selon l'invention, - cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC) selon l'invention. Les cellules APC mises en oeuvre peuvent être issues de lignées cellulaires, ou bien être les cellules APC d'un donneur (par exemple un patient souffrant d'une infection au VHB ou d'un état pathologique lié à une telle infection, ou bien donneur HLA-compatible). Cette mise en contact est de préférence réalisée dans des conditions de nutrition, 25 d'atmosphère, de température, et de temps de contact, qui permettent la maturation des cellules APC. Les cellules APC ainsi obtenues présentent un peptide, polypeptide, épitope ou mimotope selon l'invention à leur surface. Elles constituent des cellules qui ont la capacité d'activer et/ou différencier les cellules T (CD4+, CD8+), et particulièrement les cellules T CD8+, permettant ainsi de produire des cellules T efficaces contre l'installation et/ou le développement et/ou la résurgence d'une infection par VHB, et/ou d'une maladie ou état pathologique lié à une telle infection, tel que carcinome hépatocellulaire et/ou fibrose. Les cellules T et/ou les cellules APC obtenues par une méthode selon l'invention peuvent être avantageusement administrées à un organisme en besoin d'un tel traitement, et plus particulièrement à un mammifère humain ou non-humain, à qui l'on souhaiterait administrer un traitement thérapeutique et/ou préventif et/ou palliatif contre l'hépatite B, l'hépatite B chronique, un carcinome hépatocellulaire, et/ou une fibrose. La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratifs seulement, et ne limitent l'invention en aucune façon. EXEMPLES: Nous avons étudié la réponse immunitaire lymphocytaire T induite par la protéine HBSP en utilisant un modèle de souris transgéniques pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) humain de classe I (souris HHD ou HLA-A*0201 et souris HLA-B*0702). Nous avons choisi ces deux modèles de souris transgéniques pour les molécules de classe I humaine, d'une part car la molécule HLA-A*0201 est exprimée par 50% des Caucasiens (Gulukota and DeLisi, 1996) et que l'allèle HLA-B*0702 est porté par 15-20 % des humains (Rohrlich et al., 2003), et d'autre part car ces modèles ont été validés par de nombreuses études chez l'homme. Deux constructions ont été réalisées afin de pouvoir être injectées sous forme d'ADN à ces souris. A partir du plasmide pcDNA3.1-HBSP codant pour la protéine dans son intégralité, nous avons sous- cloné la séquence de HBSP allant des acides aminés 39 à 111 à l'intérieur d'un plasmide codant pour les protéines moyennes (M) et petites (S) de l'enveloppe du virus de l'hépatite B. A la place de la séquence préS2 de la protéine M, nous avons inséré la séquence de HBSP dans la même phase de lecture. La protéine est alors fusionnée à la protéine S de l'enveloppe créant une protéine chimère et peut être sécrétée sous forme de particules portant l'antigène HBs. Nous avons immunisé ces souris par injection intramusculaire d'ADN plasmidique codant pour la protéine HBSP dans son intégralité (pcDNA3. 1HBSP) ou dans sa partie originale c'est à dire dépourvue de la partie polymérase (pCMV.B10-HBSP). Outre les cellules musculaires, des cellules présentatrices de l'antigène ou CPA professionnelles telles que les cellules dendritiques ou les macrophages recrutées par l'inflammation et la régénération cellulaire provoquées par l'injection intramusculaire de cardiotoxine cinq jours avant la vaccination, sont présentes au niveau du site d'injection du plasmide. Ainsi, lors de l'immunisation des souris, l'ADN peut entrer dans ces cellules, être transcrit, puis traduit, permettant ainsi l'expression de la protéine HBSP. Le découpage de la protéine in vivo va permettre la présentation de peptides issus de la protéine par les molécules de classe I du CMH des souris à des lymphocytes T CD8+, et donc dans cette étude par les molécules humaines HLA-A*0201 ou HLA-B*0702. II y aura également présentation de peptides aux lymphocytes T CD4+ dans le contexte des molécules de classe Il murines. II a été montré récemment que les cellules dendritiques permettraient une présentation croisée, phénomène appelé crosspresentation de la protéine directement sous sa forme native. Des peptides de 15 acides aminés chevauchant de 10 acides aminés qui couvrent la séquence peptidique correspondant à l'insert du plasmide pCMV. B10-HBSP ont été synthétisés. Nous avons alors cherché la présence de lymphocytes T spécifiques de la protéine HBSP, à l'aide de tests fonctionnels qualitatifs comme le test de relargage de chrome qui vise à caractériser des lymphocytes cytotoxiques spécifiques d'un domaine antigénique de la protéine et quantitatifs comme I'ELISPOT qui permet de déterminer le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-y en réponse à la stimulation par un peptide. Dans cette étude, nous avons pu identifier au sein de la protéine HBSP des peptides restreints par la molécule HLA-A*0201 possiblement épitopiques, ainsi qu'un épitope inducteur de fortes réponses T restreint par la molécule HLA- B*0702. Bien qu'il existe un vaccin efficace contre le virus de l'hépatite B, le réservoir de porteurs chroniques de ce virus reste important puisqu'il inclut 400 millions de personnes dans le monde (Ganem and Prince, 2004). De plus, l'infection par le virus de l'hépatite B est l'une des causes majeures du carcinome hépatocellulaire et demeure donc un problème de santé publique. Les traitements disponibles à l'heure actuelle reposent sur des antiviraux (la lamivudine ou l'alpha-interféron et depuis peu l'adéfovir), mais, bien qu'ils diminuent la charge virale de manière importante, ils induisent fréquemment des résistances surtout en ce qui concerne la lamivudine (Ganem and Prince, 2004). La découverte de nouveaux antiviraux et de nouvelles stratégies thérapeutiques sera donc particulièrement importante pour l'avenir des porteurs chroniques du VHB. Quatre-vingt quinze pour cent des adultes infectés par le VHB guérissent spontanément grâce à une réponse immunitaire forte et efficace qui contrôle totalement le virus dans l'organisme. Malheureusement, cinq à dix pour cent d'entre eux vont développer une hépatite chronique. Chez ces patients, la fréquence de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques d'antigènes viraux est basse, et insuffisante à induire la guérison. De plus, les anticorps anti-HBs (protéine de surface du virus) sont complexés aux antigènes présents dans le sérum, et sont inefficaces. L'étude de la réponse immune dirigée contre la protéine HBSP et la mise en évidence de réponses T spécifiques nous semblent particulièrement importantes dans la mesure où cette protéine est impliquée dans la fibrogenèse chez les porteurs chroniques du VHB. Ainsi, la caractérisation immunologique de cette nouvelle protéine virale nous permettra de mieux comprendre comment cette protéine est reconnue par l'hôte et contribue à la pathogenèse du virus de l'hépatite B. I. Matériel et méthodes 1. Plasmides La séquence en acides aminés de la protéine HBSP consiste en une fusion des 46 premiers acides aminés de la polymérase, et de 65 acides aminés 25 correspondant à une séquence totalement originale. pcDNA3.1 HBSP: la séquence complète de HBSP du génotype A du génome du virus de l'hépatite B a été insérée entre les sites de restriction Hind III et Xho I du pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen). Ce plasmide sera appelé pcDNA3-HBSP. Ce plasmide a été déposé auprès de la C.N.C.M. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 Paris Cedex 15, France). Son numéro de dépôt CNCM est: 1-3467. pCMV.S2S: Ce plasmide code les protéines moyenne (M) et petite (S) de l'enveloppe virale du virus de l'hépatite B, et permet la sécrétion de particules portant l'antigène HBs (Michel et al., 1995) pCMV.B10-HBSP: nous avons sous cloné la séquence de HBSP des acides aminés 39 à 111 et l'avons insérée en phase à la place de la séquence préS2 dans le plasmide pCMV.S2S (Firat et al., 1999). Ce plasmide a été déposé auprès de la C.N.C.M. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 Paris Cedex 15, France). Son numéro de dépôt CNCM est: 1-3468. Ces constructions plasmidiques sont présentées en Figure 1C. Afin de pouvoir être injectés aux souris, les plasmides ont été préparés avec les colonnes de purification Quiagen (endofree plasmid kit; Quiagen, Hilden, Allemagne) et aliquotés à 1 mg/mL en PBS endotoxin free (Sigma). 2. Peptides Des peptides treize 15-mers chevauchant de 10 acides aminés qui couvrent la séquence de la protéine HBSP ainsi que la jonction avec la séquence de la polymérase insérée dans la plasmide pCMV.B10-HBSP, soit des acides aminés 39 à 111, ont été synthétisés en qualité immunograde. Des peptides épitopiques de 9 acides aminés ont été prédits à l'aide des programmes informatiques Bimass (http://thr.cit.nih.gov/) et SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/), et synthétisés par Neosystem (tableau 1). Ils ont tous été solubilisés dans de l'eau stérile pH 4,5 ou 50% Acétonitrile, à 1 mg/mL. Tableau 1: Position et affinité des peptides épitopiques prédits pour se fixer à 30 HLA-A*0201 ou HLA-B*0702. Pour les deux programmes de prédiction, les plus hauts scores correspondent à la plus haute affinité prédite. Nom du Séquence Position Restriction Affinité prédite peptide Bimass/SYFPEITHI Pol A2-1 RLLLLDEEA 10 HLA-A2 9/19 SEQ ID NO:17 Pol A2-2 LLDEEAGPL HLA-A2 7,7/24 SEQ ID NO:14 HBSP A2-1 LLLKATLCI ' 62 HLA-A2 65, 5/25 SEQ ID NO:11 HBSP A2-2 TLCIPHVAV 67 HLA-A2 69,5/24 SEQ ID NO:13 LPRLADEDL ' 25 HLA-B7 800/22 Pol B7-1 SEQ ID NO:18 APVFPSHHL 83 HLA-B7 360/25 HBSP B7-1 SEQ ID NO:5 3. Lignées cellulaires RMA-87: lignée lymphocytaire murine TAP+ exprimant la molécule HLA-B*0702 après transfection, cultivée en RPMI 1640 (Invitrogen), L-glutamine 2mM (Invitrogen), pénicilline 100 U/mL (Invitrogen), streptomycine 100 pg/mL (Invitrogen), G418 500 pg/mL (PAA laboratories), 10 % SVF (sérum de veau foetal, PAA laboratories). RMA-S HHD: lignée lymphocytaire murine TAP- exprimant la molécule HLAA*0201 après transfection cultivée en RPMI 1640, L-glutamine 2 mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 pg/mL, 10 % SVF (PAA laboratories) . 4. Souris Les souris HHD ou HLA-A*0201 (Pascolo et al., 1997) expriment une molécule du CMH de classe I transgénique composée de la (32microglobuline humaine liée de manière covalente en sa partie C-terminale à la partie N-terminale d'une chaîne lourde chimérique aux domaines a1-a2 HLA-A*0201, et aux domaines intracytoplasmiques et transmembranaires a3 H2Db. Les gènes murins H-2Db et de la j32-microglobuline ont été invalidés par recombinaison homologue. Les souris HLA-B7 ou HLA-A*0702 sont invalidées génétiquement pour les molécules de classe I murines et sont transgéniques pour la molécule HLAB*0702 (Rohrlich et al., 2003). 5. Immunisation Des souris femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été immunisées par deux injections intramusculaires à 3 semaines d'intervalle avec les plasmides pCDNA3.1 HBSP, pCMV.B10-HBSP ou pCMV.S2S, dans des expériences indépendantes. Toutes les souris ont été anesthésiées par administration intrapéritonéale d'une solution de pentobarbital sodique à 75 mg/kg (Sanofi, France). Cinq jours avant immunisation, 50pL de cardiotoxine (Latoxan, France) sont injectés dans le muscle tibialis anterior de chacune des pattes postérieures de la souris afin de permettre une dégénération suivie d'une régénération musculaire et une inflammation au site d'injection de l'ADN. Les souris sont sacrifiées entre sept et dix jours après la deuxième injection. 6. Obtention des splénocytes Les souris sont sacrifiées par asphyxie au CO2. Les splénocytes sont obtenus en écrasant les rates au travers d'un filtre en nylon aux pores de 70 pm de diamètre (Becton Dickinson, France). Après un lavage avec 15 mL de milieu HBSS (Invitrogen), L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 pg/mL, 5% SVF (PAA laboratories), les globules rouges sont lysés à +4 C grâce à une solution de NH4CI (8,3 g/L, tamponné tris pH 7,2). Les cellules sont alors lavées deux fois avec le même milieu, comptées et resuspendues à la concentration désirée et dans le milieu adéquat de l'expérience réalisée. 7. Test enzyme-linked immunospot ELISPOT Le test ELISPOT permet de quantifier, parmi les splénocytes, les cellules sécrétrices d'IFN-gamma spécifiques de l'antigène. Une plaque multi puits à fond en membrane de nitrocellulose (Millipore, Molsheim, France) est recouverte par 50 pl par puits d'une solution à 5 pg/ml d'anticorps monoclonal anti- IFN-y (Rat anti-mouse IFN-y, Pharmingen) dans du tampon carbonate (pH 9,6) et mise une nuit à 4 C. Les plaques sont saturées en milieu 10% SVF pendant 2 heures à 37 C, 5% CO2 puis lavées trois fois en milieu sans sérum avant de distribuer les peptides à 4 pg/mL sous 100pL de milieu alpha MEM (Invitrogen) complet soit 10 % SVF (Myoclone), L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 pg/mL, acides aminés non essentiels (1X), pmercaptoéthanol 50 nM, pyruvate sodium 1 mM, hepes 10mM. Les splénocytes, obtenus comme indiqué précédemment, resuspendus dans du milieu alpha MEM complet et un million de cellules sont distribuées sous 100 pL dans les puits de la plaque Elispot et mis à incuber 24 heures à 37 C, 5% CO2. Chaque peptide est testé en triplicate. Cinq lavages en PBST (PBS 1X, Tween 0,05%) sont effectués de manière à éliminer les cellules et 50 pL d'anticorps biotinylé (Rat anti-mouse IFNy, Becton Dickinson) dilué au 1/500ème en PBST sont ajoutés dans les puits pendant 1H30 à température ambiante. Les plaques sont à nouveau lavées cinq fois en PBST et incubées pendant 1 heure avec de la streptavidine conjuguée à de la phosphatase alcaline diluée au 1/1000ème en PBST. Les plaques sont révélées par ajout des substrats 5-bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) et nitroblue tetrazolium (NBT) (Promega, Madison, WI). Le nombre de spots est déterminé par un compteur automatique Zeiss ELISPOT et rapporté en nombre de cellules formant un spot par million de splénocytes (SFC/million splénocytes). Le nombre de cellules T spécifiques sécrétant de I' IFN-y après stimulation spécifique est obtenu à partir de la valeur médiane pour chaque triplicate en soustrayant la médiane du nombre de spots obtenus pour les puits contrôles où il y a seulement le milieu. La réponse mesurée est considérée positive si la médiane des spots est supérieure à 20 et si le nombre de spots pour la stimulation spécifique est supérieur à deux fois le bruit de fond obtenu pour les puits contrôle. 8. Mise en culture des splénocytes La mise en culture des splénocytes des souris HHD s'effectue en présence de cellules stimulatrices autologues (voir paragraphe suivant). On distribue donc 5 106 cellules dans chaque puits sous 1mL. Par contre, pour les souris HLA-B*0702, 10 millions de cellules sont mises en culture directement avec 10 pg par mL de peptide dans le puits. Cette mise en culture a pour but d'amplifier le nombre de cellules spécifiques du peptide mis en leur présence, afin de réaliser sept jours après, un test fonctionnel dit de cytotoxicité. 9. Préparation de cellules stimulatrices autologues pour mise en culture des splénocytes Afin d'améliorer la stimulation de splénocytes des souris HHD immunisées mis en culture pendant sept jours, on prépare des lymphocytes B autologues de souris non immunisées, que l'on active avec du LPS les trois jours précédents la mise en culture. Ainsi, les cellules de souris HHD non immunisées obtenues comme indiqué précédemment, sont mises à incuber 3 jours à 37 C, 5% CO2 dans des flasques de 50 mL de RPMI, 10% SVF (PAA laboratories), L-glutamine 2 mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 pg/mL, 25 pg/mL de LPS (Sigma, 5 mg/mL), 7 pg/mL de sulfate de dextran (Pharmacia, 7 mg/mL). Le jour de la mise en culture des splénocytes des souris immunisées (voir paragraphe précédent), les cellules stimulatrices autologues sont lavées en milieu HBSS, 5 % SVF, L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 pg/mL comptées et centrifugées pendant 10 minutes à 1600 rpm. Le culot cellulaire est irradié à 10000 rads pendant 30 minutes. Les cellules sont ensuite lavées, resuspendues à une concentration de 5 106 cellules par mL en alpha MEM complet avec le peptide à 10 pg/mL et mises à incuber avec les splénocytes de souris immunisées dans un rapport 1/1. 10. Test de cytotoxicité Afin de mettre en évidence la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+, activés par un peptide défini, on met en présence les splénocytes stimulés 7 jours avec le peptide, cellules dites effectrices, avec des cellules cibles préparées comme suit. Préparation des cibles Des cellules exprimant le même CMH que les splénocytes des souris immunisées, cultivées au laboratoire (voir paragraphe lignées cellulaires) sont incubées avec du peptide à 10 pg/mL à une concentration de 10 millions de cellules par mL pendant 2 heures à température ambiante. Pour les cellules RMAS HHD, la veille, il est nécessaire de les mettre dans des boîtes préalablement conditionnées en CO2 à une concentration de 106 cellules par mL dans du milieu RPMI, Lglutamine 2mM, pénicilline 1000/mL, streptomycine 100pg/mL, betamercaptoéthanol 50nM, pyruvate sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1X, hepes 10 mM, sans sérum, à température ambiante toute la nuit. Les cellules cibles sont ensuite marquées avec 10 i.tCu de chrome 51 par million de cellules (Perkin Elmer, 5mCu/mL) et incubées pendant 1 heure dans un bain marie à 37 C. Puis, elles sont lavées trois fois, comptées, suspendues à 200000 cellules par mL en milieu CRT (RPMI 1640, Lglutamine 2 mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 dag/mL, 10 % SVF (PAA laboratoires), hepes 10 mM, diluées au 1/4 et distribuées sous 100pL, soit 5000 cellules au final, dans tous les puits de la plaque correspondante 96 puits à fond rond (Falcon), après avoir déposé les cellules effectrices. Préparation des splénocytes effecteurs Les splénocytes en culture sont comptés, lavés, et resuspendus en milieu CRT à 5 millions par mL pour avoir un premier rapport effecteurs/cibles de 100/1. Plan de plaque (tableau 2) 0 % de lyse 100 % de lyse 100/1 33/1 10/1 3/1 pL de milieu CRT sont distribués dans les puits 0% de lyse et les 9 derniers des lignes suivantes (voir plan au dessus). On distribue 150 pl d'effecteurs dans les trois premiers puits de la 2ème ligne de la plaque à partir desquels trois dilutions successives au 1/3 sont effectuées directement dans la plaque. Six puits témoins négatifs ne reçoivent que 100 pL de cibles et 100 pL de milieu tandis que dans six autres puits, on met dans 100 pL de cibles et 100 pL de solution de lyse (triton 5%, SDS 1%) afin d'avoir le niveau de lyse maximale. Les plaques sont centrifugées 1 minute à 1000 rpm afin de mettre en contact les cellules, puis incubées pendant 4 heures à 37 C, 5% CO2. On récolte ensuite 50 pL du surnageant de chaque puits après centrifugation des plaques 5 minutes à 1000 rpm que l'on met avec 100 pL de scintillant dans des plaques de comptage (Perkin Elmer, France) à microbeta. La radioactivité est alors mesurée dans un compteur microbeta (ref). Le pourcentage de lyse est obtenu par la formule suivante: Moyenne nombre de cpm des 3 puits - moyenne des cpm dans les 6 puits 0 % / moyenne cpm 100 % - moyenne cpm 0 % On calcule la lyse spécifique en soustrayant le pourcentage de lyse obtenu pour la cible non spécifique à celui obtenu pour la cible spécifique. Le résultat est positif lorsque le pourcentage de lyse spécifique est supérieur à 10 % pour deux rapports Effecteurs/cibles consécutifs. 11. Marquage intracellulaire II est réalisé pour caractériser les cellules sécrétrices d'IFN-y en réponse à la stimulation par les peptides. Les splénocytes sont incubés avec le peptide à 2 pg/mL en milieu alpha MEM complet additionné de TCGF (T Cell Growth Factor) au 1/20 pendant 3 à 4 jours. La veille du marquage, le milieu est remplacé par de l'alpha MEM complet. Au minimum 200000 de ces splénocytes préalablement restimulés in vitro sont distribués dans 4 puits d'une plaque 96 puits à fond rond. Les cellules de deux puits sur 4 sont incubées pendant une heure à 37 C, 5% CO2 avec le peptide à 4 pg/mL sous 100 pL d'alpha MEM complet, tandis que les deux autres puits ne reçoivent pas de peptide (puits milieu). Puis, on bloque la sécrétion d'IFN-y avec de la brefeldine A à 4 pg/mL (1mg/mL, Sigma) sous 100 pL dans tous les puits, pendant 4 heures à 37 C, 5% CO2. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois en solution FACS (PBS 1X, azide 0. 1%, BSA 1%). Le marquage de surface est réalisé sur les cellules d'un puits ayant reçu du peptide et un puits milieu par l'addition de 50 pL d'anticorps de surface, à savoir anti-CD4 FITC (IgG2b, k, BD Biosciences) et anti-CD8 APC (IgG2a, k, BD Biosciences) dilués au 1/50 en solution FACS. Les deux autres puits sont incubés avec 50 pL des isotypes contrôles (BD Biosciences) également dilués au 1/50 en solution FACS. Deux lavages sont à nouveau effectués après une incubation de 30 minutes à +4 C, puis les cellules sont fixées en solution FACS formaldéhyde 2% 30 minutes minimum. Après fixation, les cellules sont lavées deux fois en solution FACS, puis une fois en solution FACS saponine 0,05% afin de perméabiliser la membrane pour effectuer le marquage intracellulaire. Celui-ci s'effectue parl'ajout pendant 30 minutes à +4 C de 50 pL d'anticorps anti-IFN-yPE ou son contrôle isotypique (BD Biosciences) dilués au 1/100 en solution FACS saponine 0,05%. Enfin, les cellules sont lavées deux fois en solution FACS saponine 0,05%, une fois en solution FACS et fixées en solution FACS formaldéhyde 1%. Les cellules peuvent être conservées à +4 C avant que l'acquisition des données au FACS Calibur (BD Biosciences) ne soit réalisée. II. Résultats 1. Immunisation des souris HHD (HLA-A*0201) par le vecteur pcDNA3.1-HBSP Des protocoles de vaccination ADN ont été mis au point pour d'autres protéines virales (HBs, HBx) du VHB dans des souris transgéniques pour les molécules HLA humaines (Loirat et al., 2000; Malmassari et al., 2005). Cette approche a donc été utilisée pour caractériser la réponse immunitaire T spécifique de HBSP. Nous avons procédé à deux injections intramusculaires d'ADN distantes de trois semaines d'intervalle afin d'induire une réponse immune chez la souris. Celles-ci ont été sacrifiées sept à dix jours après la seconde injection et des tests fonctionnels différents ont été effectués, soit directement ex vivo sur les splénocytes frais, soit après mise en culture in vitro. a. Mise en évidence des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma (test EL/SPOT et marquage intracellulaire) Nous n'avons pas pu mettre en évidence des lymphocytes T sécrétant de l'IFN-y en réponse à la stimulation courte ex vivo de 24 heures par les peptides HBSP A2-1, HBSP A2-2, et Pol A2-2. Cependant, nous avons obtenu une sécrétion d'interféron gamma en réponse à un groupe constitué des peptides 15mers couvrant les acides aminés 39 à 78 de la protéine HBSP chez la souris n 1 (figure 2). Lors du test individuel de chacun de ces peptides chez trois souris, il s'est avéré que la souris 8 répondait fortement au peptide 64- 78 (figure 2). Nous avons alors procédé à une stimulation secondaire avec ce peptide en présence de TCGF pendant 4 jours, puis effectué un marquage de surface et intracellulaire pour les molécules CD4, CD8 et IFN-y. Cependant, nous n'avons pas pu phénotyper par cette technique les lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma, quel que soit le peptide testé. Cf. Figure 2. b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique Pour augmenter la fréquence de lymphocytes CD8+ spécifiques d'un peptide donné de HBSP, nous avons mis en culture les splénocytes pendant sept jours après prélèvement de la rate en présence de cellules présentatrices chargées avec le peptide à une concentration de 10 g/mL. Nous avons testé la réponse obtenue pour les peptides épitopiques prédits par le programme informatique (voir matériel et méthodes). Ainsi, nous avons pu détecter la présence de lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser spécifiquement des cellules cibles autologues chargées avec les peptides suivants: HBSP A2-1 dans une proportion de 3/6, HBSP A2-2 dans une proportion de 1/6 et Pol A2-2 dans une proportion de 1/6 souris testées (voir figure 3). Cependant ces réponses restent faibles. Cf. Figure 3. 2. Immunisation des souris HLA-B*0702 par le vecteur pcDNA3.1-HBSP Dans un modèle de souris transgénique pour la molécule HLA de classe I humaine HLA-B*0702, nous avons cherché la présence de lymphocytes T spécifiques des peptides épitopiques restreints par ce CMH et prédits par les programmes Bimass et SYFPEITHI que nous avons fait synthétiser au préalable. a. Mise en évidence de lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma (test 25 ELISPOT et marquage intracellulaire) Les souris HLA-B*0702 ont été immunisées par deux injections de 100 pg d'ADN dans le muscle tibialis anterior de la souris, puis les souris ont été sacrifiées entre sept et dix jours après le rappel afin de mettre en évidence des lymphocytes T spécifiques de HBSP. Nous avons pu établir la présence de lymphocytes sécrétant de l'interféron gamma en réponse à la stimulation par différents groupes de peptides 15mers (figure 4). La souris H possède 90 cellules productrices d'interféron gamma par million de splénocytes en réponse au mélange de peptides 15mers 69-93, contenant la séquence du peptide 9mers HBSP B7-1 et 75 cellules par million en réponse à HBSP B7-1. Nous avons également pu établir une réponse de l'ordre de 40 cellules productrices d'IFN-y pour un million de splénocytes en réponse à la stimulation par le groupe de peptides 39-63 chez une souris sur douze testées, la souris L. Les splénocytes sont mis en culture en stimulation peptidique en plus du test ELISPOT, afin de procéder à un test plus qualitatif, visant à mettre en évidence la fonction cytotoxique des lymphocytes T spécifiques de HBSP. Cette mise en culture s'effectue sans cellules stimulatrices autologues mais nécessite un nombre important de cellules, c'est pourquoi, tous les peptides 15 mers n'ont pas pu être testés individuellement dans ces tests ELISPOTS. Cf. Figure 4. b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur les mêmes 12 souris que celles du test ELISPOT, dont les résultats sont rapportés dans la figure 4, dans deux expériences indépendantes. Ils ont révélé la présence de lymphocytes T spécifiques du peptide HBSP B7-1. La stimulation par ce peptide conduit à un enrichissement des splénocytes en culture en lymphocytes T capables de lyser de manière importante des cibles autologues chargées avec ce peptide mais pas avec un peptide contrôle (issu de la protéine core du virus de l'hépatite B) et ce chez toutes les souris testées (figure 5). Ceci est observé pour 11 souris sur 11 testées. Au contraire, aucune réponse cytotoxique n'a pu être détectée contre le peptide prédit dans la partie polymérase du virus, Pol B7-1 chez toutes les souris testées. 25 3. Immunisation des souris HLA-A*0201 par le vecteur pCMV.10-HBSP a. Construction d'un second vecteur ADN Afin d'augmenter l'immunogénicité de la protéine HBSP, nous avons fusionné la séquence originale HBSP, à la séquence de la petite protéine S du VHB, dans un vecteur pCMV.B10. Ce vecteur dérive du vecteur pCMV-S2S codant pour les protéines d'enveloppe du VHB moyennes (S2S ou M) et petites (S) et permet la formation de particules portant l'antigène HBs pouvant être sécrétées. Le vecteur pCMV.B10 contient dans la partie préS2 un polylinker en phase avec la séquence codant pour la protéine S. Ainsi, l'insertion dans ce vecteur de la séquence originale de HBSP permet de créer une protéine chimérique, pouvant être éventuellement sécrétée. La protéine HBSP possédant une demi-vie faible, la fusion avec la petite protéine d'enveloppe pourrait ainsi contribuer à la stabilité de la protéine HBSP. Après avoir construit le vecteur pCMV.B10-HBSP, nous avons immunisé des souris HLA-A*0201 comme pour le pcDNA3-HBSP. Nous avons alors procédé à la recherche de lymphocytes T spécifiques de HBSP, ainsi que de la petite protéine S d'enveloppe du VHB, également codée par ce vecteur. Dans ce but, nous avons utilisé trois tests différents, c'est-à-dire l'ELISPOT pour quantifier des lymphocytes sécréteurs d'interféron gamma, le marquage intracellulaire pour phénotyper ces derniers, et le test de cytotoxicité. b. Mise en évidence de lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma (test ELISPOT) La réponse aux peptides prédits situés dans la région de la polymérase ne peut pas être étudiée, puisque le vecteur ne code pas pour la partie N terminale de la protéine HBSP. Nous avons testé tous les peptides 15 mers couvrant l'insert HBSP, et nous avons trouvé des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma spécifiques du peptide 64-78 chez 4 souris sur 5. Le peptide 59-73 est quant à lui réactif pour la souris I soit une souris sur 5 (voir figure 6) . Le marquage intracellulaire réalisé sur les splénocytes activés ne nous a pas permis de phénotyper les cellules sécrétant de l'IFN-y en réponse aux peptides 64-78 et 59-73. Nous avons pu mettre en évidence chez toutes les souris des lymphocytes T sécrétant de l'IFN-y en réponse à la stimulation par le peptide 5 de séquence GLSPTVWLS (acides aminés 348-357) de la protéine S, et chez quatre souris sur 5 en réponse à la stimulation par le peptide 10 de séquence FLLTRILTI (acides aminés 183-191). Cette réponse est forte puisque l'on a de 40 à 180 cellules productrices d' IFN-y en réponse au peptide 5, et 55 à 250 cellules en réponse au peptide 10. Il est à noter que les résultats ne sont pas rapportés par rapport au nombre de lymphocytes T CD8+. Mais, une souris HLA-A*0201 possède en moyenne 2 à 3 % de lymphocytes T CD8+, soit 30000 pour 106 splénocytes. Par exemple, la souris J qui possède 120 cellules productrices d'interféron gamma en réponse à la stimulation par le peptide 10 a donc 4 lymphocytes T spécifiques du peptide 10 de l'HBs producteurs d'interféron gamma pour 1000 lymphocytes T CD8+. c. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique L'immunisation par le vecteur pCMV.B10-HBSP permet d'induire une réponse contre des peptides de la protéine S, fortement immmunogénique. En effet, deux peptides dérivés de la protéine S sont reconnus dans le contexte HLAA*0201: le peptide 5 et le peptide 10 qui seront appelés HBs-5 et HBs-10 respectivement. Ces peptides ont été testés afin d'avoir un contrôle positif, et ainsi, de vérifier si les souris ont bien été immunisées. Sur la figure 7, nous pouvons observer le pourcentage de lyse spécifique obtenu pour chaque stimulation des expériences réalisées. À chaque fois, toutes les souris ont eu une réponse positive de 35 à 50 % de lyse spécifique dirigée contre le peptide HBs-5 et 3 souris sur 4 testées ont répondu à la stimulation par le peptide HBs-10. Par contre, les faibles taux de lyse observés en réponse à la stimulation par HBSP A2-1, détectables lors de l'immunisation par le vecteur pcDNA3-HBSP ne le sont plus, tandis que ceux qui sont observés pour le peptide HBSP A2-2 restent très bas, uniquement pour le rapport 100/1 chez la souris A. Cependant ce résultat ne peut pas être considéré positif puisqu'il faut un pourcentage de lyse spécifique pour deux rapports consécutifs (figure 7). 4. Immunisation des souris HLA-B7 par le vecteur pCMV.B10-HBSP a. Sécrétion d'interféron gamma (test ELISPOT et marquaqe intracellulaire) Des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma spécifiques de HBSP B71 ont pu être mis en évidence dans deux souris sur six testées, à une fréquence de 25 et 28 cellules productrices d'interféron pour un million de splénocytes (figure 8). Comme pour les souris HLA-A*0201, les résultats ne sont pas rapportés par rapport au nombre de lymphocytes T CD8+. Cependant, une souris HLA-B*0702 possède en moyenne 12 % de lymphocytes T CD8+, soit 120000 pour 106 splénocytes, soit environ 1 lymphocyte T spécifique de HBSP B7-1 et producteur d'interféron gamma pour 4000 lymphocytes T CD8. De plus, nous pouvons observer sur la figure une sécrétion d'interféron gamma en réponse au peptide 15 mer 79-93, qui contient HBSP B7-1 (position 83) chez quatre souris sur six testées (souris n 7, n 8, n 10 et n 11). La souris n 9 est à la limite de la positivité, on observe 20 cellules productrices d'IFN-y pour un million de splénocytes, ce qui correspond au seuil que nous avons défini. Des lymphocytes spécifiques des peptides 15mers 39-53 et 64-78 ont également été mis en évidence chez respectivement deux souris (souris n 7 et n 10) et une souris (souris n 8) sur six testées. La réponse obtenue avec le peptide 64-78 est de toute évidence une réponse murine, puisque nous l'avons également détectée chez les souris transgéniques pour la molécule HLA-A*0201. Lors d'une stimulation secondaire effectuée sur les splénocytes en culture de trois souris, nous avons pu confirmer la présence de lymphocytes T sécréteurs d'interféron gamma spécifiques du peptide 79-93 chez les souris n 7 et n 10 testées pour ce peptide, mais pas pour le 15-mer 39-53, ni pour le 64-78. Cependant, il est à noter, pour ce dernier, que la souris 9 testée secondairement avait eu des réponses faiblement positives lors du premier ELISPOT (voir figure 9). Parallèlement à cet ELISPOT secondaire, nous avons réalisé un marquage intracellulaire qui a révélé que les cellules sécrétant del' IFN-y en réponse à la 20 stimulation par le peptide 79-93 sont de phénotype T CD8+. Pour tester la réponse immunitaire spécifique de la protéine S, également codée par le vecteur pCMV.B10-HBSP, nous disposions de trois peptides 9mers nommés SB7-1, SB7-2 et SB7-3, ainsi que d'un 15mers, HBs 62, contenant la séquence d'un peptide prédit. Tous ces peptides ont été prédits par les programmes Bimass et SYFPEITHI. De plus, le peptide SB7-1 de séquence CPGYRWMCL est reconnu dans le contexte des molécules de classe I du chimpanzé (Bertoni et al., 1998) et le peptide SB7-2 (Bertoni et al., 1998) est également reconnu dans ce contexte et a été mis en évidence chez des patients atteints d'hépatite aiguë (Bertoni et al., 1997). Aucune réponse positive n'a pu être mise en évidence, cependant, on peut noter que la réponse au peptide SB7-1 est plus élevée que pour les autres peptides. b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique Les lymphocytes ont une forte réponse spécifique du peptide HBSP B7-1 avec un pourcentage de lyse spécifique important de l'ordre de 60 % chez toutes les souris testées (6/6). Pour rappel, le pourcentage de lyse spécifique s'obtient en soustrayant le pourcentage de lyse des cibles autologues chargées avec un peptide contrôle au pourcentage de lyse des cibles chargées avec le peptide HBSP B7-1. Nous avons également pu mettre en évidence la présence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du 15mer 79-93 chez deux souris sur trois testées avec une lyse spécifique variant de 30 à 40 % à un rapport de 100 cellules effectrices contre une cellule cible. Ce peptide contient donc un épitope T CD8+ capable d'activer des lymphocytes T produisant de l'interféron gamma (figure 9) et cytotoxiques (figure 10). Il s'agit vraisemblablement de HBSP B7-1 dont la séquence est inclue dans ce peptide. Nous avons stimulé avec le 15mers 39-53, qui avait induit une sécrétion d'IFN-y, les splénocytes de deux souris, mais nous n'avons pas pu induire de lyse spécifique, comme l'atteste la figure 10. III. Discussion Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre des peptides issus de la protéine HBSP. Ainsi, dans le contexte des molécules HLA-A*0201, la réponse observée n'a pas été très forte, mais elle révèle toutefois la présence d'épitopes T reconnus spécifiquement par les lymphocytes T CD8+ de la souris transgénique pour la molécule humaine HLA-A*0201. Les épitopes décrits dans cett étude se localisent à la fois dans la partie de la polymérase du virus en ce qui concerne le peptide nommé POL A2- 2, et dans la partie originale de HBSP, pour les peptides HBSP A2-1 et HBSP A2-2. Il est remarquable que selon le plasmide d'immunisation, nous n'ayons pas obtenu la même réponse. En effet, à l'aide du vecteur exprimant la protéine HBSP fusionnée à la petite protéine HBs du VHB, nous ne détectons pas la réponse contre HBSP A2-1, mais conservons la réponse contre HBSP A2-2, ceci alors que l'épitope HBSP A2-1 semblait susciter une réponse plus forte de la part des souris immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Ainsi, la réponse contre la protéine HBs semble prendre le pas sur celle spécifique de HBSP. Ce résultat n'est pas étonnant car de nombreux travaux ont suggéré la compétition épitopique entre les protéines virales, et notamment exprimées à partir d'un même vecteur, sous le contrôle du même promoteur (Fissolo et al., 2005). Dans le contexte des souris exprimant la molécule HLA-B*0702, les résultats obtenus sont très encourageants. En effet, la présence de lymphocytes T CD8+ capables de lyser jusqu'à 60% des cibles chargées spécifiquement avec le peptide HBSP B7-1 a pu être mise en évidence chez toute les souris testées, que la protéine soit fusionnée ou pas avec HBs. Dans le contexte HLA-B*0702, il ne semble pas y avoir de compétition pour l'activation des lymphocytes T par des peptides issus de HBs ou de HBSP. Ainsi, la forte réponse contre le peptide prédit HBSP B7-1 suggère l'identification d'un épitope capable d'activer fortement in vitro des lymphocytes T de HBSP. Nous avons également pu montrer que les lymphocytes T de la rate des souris immunisées par l'une ou l'autre des deux constructions codant pour HBSP utilisées dans cette étude, produisaient de l'interféron gamma en réponse à une stimulation courte par ce peptide. Toutefois cette sécrétion reste faible et ne se retrouve pas chez toutes les souris. Ceci nous amène à penser que la fréquence de lymphocytes T effecteurs circulants spécifiques du peptide 9mers HBSP B7- 1 est faible, et difficile à détecter sans stimulation. La stimulation courte ex vivo des splénocytes par le peptide 15mers 79-93 qui contient la séquence du 9mers HBSP B7-1, permet l'activation de cellules T CD8+ sécrétant de l'interféron gamma. Par contre, ce 15mers ne permet pas d'activer aussi fortement des lymphocytes T d'une culture in vitro de splénocytes. En effet, la lyse spécifique de cellules cibles autologues chargées avec le 15mers par rapport aux cibles chargées avec un peptide contrôle est de 30 à 40 % à un rapport de 100 cellules effectrices contre une cellule cible. Les résultats obtenus avec le peptide 9mers HBSP B7-1 et le 15mers 79-93 suggèrent que le 9mer n'est pas optimal pour stimuler des lymphocytes T effecteurs circulants qui ont été activés in vivo, alors que le 15mers permet la sécrétion d'IFN-y par ces lymphocytes. Ceci suggère que les lymphocytes sont activés par un peptide légèrement différent de HBSP B7-1, mais contenu dans le 15-mers 79-93. La stimulation in vitro par le 9mers permet, quant à elle d'activer des lymphocytes T cytotoxiques alors que le 15mers est moins optimal, puisque le pourcentage de lyse spécifique est plus faible. Cette réponse est peut-être liée à l'affinité moindre in vitro d'un peptide de 15 acides aminés pour une molécule HLA de classe I telle que HLA-B*0702. Pour vérifier cette hypothèse, il sera nécessaire de procéder à des expériences complémentaires en testant notamment des cibles et des effecteurs respectivement chargés et stimulés par le 9mers et le 15mers, et inversement. De plus, il faudra tester des peptides de 9acides aminés décalés de 1 acide aminé afin de déterminer le peptide qui nous donnera une réponse optimale chez les souris transgéniques pour la molécule HLA-B*0702 humaine, à la fois pour les fonctions de sécrétion d'interféron gamma en réponse à une courte stimulation peptidique ex vivo, et de cytotoxicité. En plus des réponses à ces peptides, nous avons identifié dans un test ELISPOT la capacité stimulatrice de la sécrétion d'interféron gamma du 15mer 39-53. Après un marquage intracytoplasmique de cytokines, il s'est avéré que les cellules sécrétrices d'interféron gamma en réponse à ce 15mers étaient de phénotype T CD8+. Or ce 15mer contient un épitope T CD8+ prédit pour la fixation à la molécule HLA B*0701, mais que nous n'avons pas encore fait synthétiser. Afin de voir si ce peptide pouvait stimuler in vitro des lymphocytes T, un test de cytotoxicité a été réalisé dans lequel nous n'avons pas pu observer de lyse spécifique. Néanmoins, cette expérience ayant été réalisée sur deux souris seulement, il s'agit peutêtre d'un épitope reconnu plus faiblement que HBSP B7- 1 ce qui expliquerait la réponse négative chez ces souris. De plus, un peptide 15mers n'est certainement pas le meilleur outil à la stimulation in vitro des lymphocytes T spécifiques d'un peptide 9mers. Cette explication nous est suggérée par les résultats obtenus lors de la stimulation par l'épitope défini de neuf acides aminés HBSP B7-1 et le 15mer 79-93 qui contient cette séquence, comme nous l'avons discuté plus haut. Ces résultats constituent la première approche de la recherche d'épitopes reconnus par les lymphocytes T au sein de la protéine HBSP du VHB. Ils contribuent ainsi à la connaissance de cette protéine en apportant un éclairage immunologique aux travaux, davantage orientés sur l'étude moléculaire, déjà effectués sur cette protéine. La réponse immunitaire spécifique du VHB permet d'éliminer des hépatocytes infectés et de maintenir un équilibre entre la réplication virale et l'atteinte hépatique de l'hôte. La présence d'anticorps spécifiques de la protéine HBSP a été corrélée avec la fibrose chez les porteurs chroniques du virus de l'hépatite B. Cette protéine virale est probablement impliquée dans le processus de fibrogenèse, et notamment dans une cascade d'activation mettant en cause le TGFI31. La meilleure connaissance de l'implication de cette protéine dans ce processus de pathogenèse virale, couplée à une étude clinique chez les porteurs chroniques du virus visant à définir la réponse immunitaire spécifique de la protéine HBSP dans le cadre d'une infection réelle, seront essentielles. Notamment, il faudrait définir la cinétique d'apparition des anticorps spécifiques de cette protéine par rapport à la survenue de la fibrose ou si celle-ci apparaît avant la protéine. Cependant, il est probable que la protéine soit synthétisée dès le début de l'infection. En théorie, une immunothérapie basée sur un vecteur vaccinal portant des séquences de la protéine HBSP pourrait contribuer à l'atténuation des atteintes du foie chez des porteurs chroniques du VHB possédant des anticorps spécifiques de HBSP et présentant une fibrose hépatique. IV. Conclusion et perspectives Les résultats obtenus chez les deux types de souris montrent que la protéine HBSP est produite à partir de nos vecteurs, et que le découpage in vivo de cette protéine active in vivo des lymphocytes T spécifiques de peptides dérivés de HBSP qu'ils sont capables de reconnaître. En effet, la stimulation ex vivo leur permet de sécréter de l'interféron gamma et la stimulation longue in vitro d'acquérir une fonction cytotoxique. Dans le contexte HLA-A*0201, nous avons identifié des peptides activant des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Ces peptides avaient tous été prédits par les programmes informatiques Bimass et SYFPEITHI. La stimulation à l'aide des peptides HBSP A2-1, HBSP A2-2 et Pol A2-2 permet d'induire une réponse cytotoxique des lymphocytes T CD8+ spécifiquement activés mais qui reste faible. Parmi les autres peptides prédits pour la fixation à HLA-A*0201 qui n'ont pas été synthétisés ni testés, il en existe peut-être un ou plusieurs capables d'induire de meilleures réponses cytotoxiques. Nous avons d'ores et déjà comme candidat, le 15mers 59-73 qui active des lymphocytes T produisant de l'IFN-y. Dans le contexte HLA-B*0702, nous avons détecté une réponse immune cytotoxique particulièrement forte, lors de la stimulation in vitro avec le peptide HBSP B7-1 prédit pour la fixation à HLA-B*0702. Cependant, ce peptide ne paraît pas optimal dans la mesure où il ne permet pas d'activer fortement la sécrétion d'IFN-y ex vivo. Nous allons donc définir le peptide optimal et continuer à effectuer la recherche des peptides de HBSP se fixant à HLA-B*0702, en testant dans un premier temps le peptide prédit contenu dans le 15mers réactif 39-53. Des souris transgéniques pour les molécules de classe I et de classe II humaines peuvent être produites (Pajot et al., 2004a; Pajot et al., 2004b, dont les contenus sont incorporés par référence). Ces souris sont invalidées génétiquement pour les molécules de souris. Nous envisageons d'étendre notre étude à la réponse des lymphocytes T CD4 + contre la protéine HBSP. Ce modèle nous permettra de travailler dans les deux contextes du CMH humain, et d'éliminer les réponses des lymphocytes T CD4+ activés par des peptides présentés par une molécule du CMH de classe Il murin. A ce travail chez la souris, fera suite une étude chez des porteurs chroniques du virus de l'hépatite B, et notamment chez des patients HLAB*0702, au vu des résultats obtenus avec le peptide HBSP B7-1. Ce travail permettra de mieux comprendre la réponse immune spécifique de la protéine HBSP lors de l'infection par le VHB, et le rôle qu'elle joue dans la pathogenèse. II nous permettra également de mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la protéine HBSP. Les peptides 59-73 (PARLLLKATLCIPHV; P-15-V; SEQ ID NO:10) et 54-68 25 (RDPAKPARLLLKATL; R-15-L; SEQ ID NO: 7) ont été identifiés chez les patients humains infectés par le VHB. Bibliographie Bain, C., Parroche, P., Lavergne, J. P., Duverger, B., Vieux, C., Dubois, V., Komurian-Pradel, F., Trepo, C., Gebuhrer, L., Paranhos-Baccala, G., et al. (2004). Memory T-cell-mediated immune responses specific to an alternative core protein in hepatitis C virus infection. J Virol 78, 10460-10469. Bertoni, R., Sette, A., Sidney, J., Guidotti, L. G., Shapiro, M., Purcell, R., and Chisari, F. V. (1998). Human class I supertypes and CTL repertoires extend to chimpanzees. J Immunol 161, 4447-4455. Bertoni, R., Sidney, J., Fowler, P., Chesnut, R. W., Chisari, F. V., and Sette, A. (1997). Human histocompatibility leukocyte antigen-binding supermotifs predict broadly cross-reactive cytotoxic T lymphocyte responses in patients with acute hepatitis. J Clin Invest 100, 503-513. Cardinaud, S., Moris, A., Fevrier, M., Rohrlich, P. S., Weiss, L., Langlade-Demoyen, P., Lemonnier, F. A., Schwartz, O., and Habel, A. (2004) . Identification of cryptic MHC I-restricted epitopes encoded by HIV-1 alternative reading frames. J Exp Med 199, 1053-1063. Firat, H., Garcia-Pons, F., Tourdot, S., Pascolo, S., Scardino, A., Garcia, Z., Michel, M. L., Jack, R. W., Jung, G., Kosmatopoulos, K., et al. (1999). H-2 class knockout, HLA-A2.1-transgenic mice: a versatile animal model for preclinical evaluation of antitumor immunotherapeutic strategies. Eur J Immunol 29, 3112-3121. Fissolo, N., Riedl, P., Reimann, J., and Schirmbeck, R. (2005). DNA vaccines prime CD8+ T cell responses to epitopes of viral antigens produced from overlapping reading frames of a single coding sequence. Eur J Immunol 35, 117-127. Ganem, D., and Prince, A. M. (2004). Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences. N Engl J Med 350, 1118-1129. Gulukota, K., and DeLisi, C. (1996). HLA allele selection for designing peptide vaccines. Genet Anal 13, 81-86. Loirat, D., Lemonnier, F. A., and Michel, M. L. (2000). Multiepitopic HLAA*0201-restricted immune response against hepatitis B surface antigen after DNA-based immunization. J Immunol 165, 4748-4755. Malmassari, S., Lone, Y. C., Zhang, M., Transy, C., and Michel, M. L. (2005). In vivo hierarchy of immunodominant and subdominant HLA-A*0201restricted T-cell epitopes of HBx antigen of hepatitis B virus. Microbes Infect 7, 626-634. Mayrand, S. M., and Green, W. R. (1998). Nontraditionally derived CTL epitopes: exceptions that prove the rules? Immunol Today 19, 551-556. Michel, M. L., Davis, H. L., Schleef, M., Mancini, M., Tiollais, P., and Whalen, R. G. (1995). DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5307-5311. Pajot, A., Michel, M. L., Fazilleau, N., Pancre, V., Auriault, C., Ojcius, D. M., Lemonnier, F. A., and Lone, Y. C. (2004a). A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I/class II-knockout mice. Eur J Immunol 34, 3060-3069. Pajot, A., Pancre, V., Fazilleau, N., Michel, M. L., Angyalosi, G.,Ojcius, D. M., Auriault, C., Lemonnier, F. A., and Lone, Y. C. (2004b). Comparison of HLA-DR1-restricted T cell response induced in HLA-DR1 transgenic mice deficient for murine MHC class II and HLA-DR1 transgenic mice expressing endogenous murine MHC class II molecules. Int Immunol 16, 1275-1282. Pascolo, S., Bervas, N., Ure, J. M., Smith, A. G., Lemonnier, F. A., and Perarnau, B. (1997). HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med 185, 2043-2051. Rohrlich, P. S., Cardinaud, S., Firat, H., Lamari, M., Briand, P., Escriou, N., and Lemonnier, F. A. (2003). HLA-B*0702 transgenic, H-2KbDb double-knockout mice: phenotypical and functional characterization in response to influenza virus. Int Immunol 15, 765-772. Rosmorduc, O., Petit, M. A., Pol, S., Capel, F., Bortolotti, F., Berthelot, P., Brechot, C., and Kremsdorf, D. (1995). In vivo and in vitro expression of defective hepatitis B virus particles generated by spliced hepatitis B virus RNA. Hepatology 22, 10-19. Schirmbeck, R., Riedl, P., Fissolo, N., Lemonnier, F. A., Bertoletti, A., and Reimann, J. (2005). Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class Irestricted epitopes. J Immunol 174, 4647-4656. Seeger, C., and Mason, W. S. (2000). Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64, 51-68. Soussan, P., Garreau, F., Zylberberg, H., Ferray, C., Brechot, C., and Kremsdorf, D. (2000). In vivo expression of a new hepatitis B virus protein encoded by a spliced RNA. J Clin Invest 105, 55-60. Soussan, P., Tuveri, R., Nalpas, B., Garreau, F., Zavala, F., Masson, A., Pol, S., Brechot, C., and Kremsdorf, D. (2003). The expression of hepatitis B spliced protein (HBSP) encoded by a spliced hepatitis B virus RNA is associated with viral replication and liver fibrosis. J Hepatol 38, 343-348. Abréviations AA: acides aminés ADN: acide désoxyribonucléique ARNm: acide ribonucléique messager APC: allophycocyanine BCIP: 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate BSA: bovine serum albumine (sérum albumine bovine) CMV: cytomégalovirus CMH: complexe majeur d'histocompatibilité CTL: cytotoxic T lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique) Elispot: enzyme linked immunospot (immuno-spot par liaison enzymatique) FACS: fluorescence activated cell sorter (trieur de cellule activée par fluorescence) FITC: fluoresceine isothiocyanate (isothiocyanate de fluorescéine) HBSP: hepatitis B spliced protein (protéine épissée de l'hépatite B) HHD: human human Db(Db humain humain) HLA: human leucocyte antigen (complexe majeur d'histocompatibilité humain) IFN: interféron Ig: immunoglobuline LPS: lipopolysaccharide ORF: open reading frame (phase ouverte de lecture) Pb: paire de bases PBS: phosphate buffer saline (tampon phosphate) PBST: phosphate buffer saline tween 0,05% PE: phycoérythrine NBT: nitroblue tetrazolium (tétrazolium de nitrobleu) TAP: transporter associated protein (protéine associée à transporteur) TCGF: T cell growth factor (facteur de croissance des cellules T) TGF331: transforming growth factor (facture de croissance transformant) VHB: virus de l'hépatite B REVENDICATIONS 1. Peptide ou polypeptide, mono- ou poly-épitopique, capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, caractérisé en ce que: - il est constitué de 6 à 46 acides aminés, et en ce que - il comprend au moins un, ou est constitué d'un fragment de HBSP ou analogue parmi: - un fragment de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein) d'au moins 6 acides aminés, et d'au plus 15 acides aminés, - un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 20 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, et en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), d) de 54 à 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL; SEQ ID NO:7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), g) de 59 à 73 (P-15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), k) de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), ou est un sous-fragment conservateur de l'une de ces séquences a) à m), ledit sous-fragment conservateur étant constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de l'une de ces séquences a) à m), et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB. 2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est restreint par une 5 molécule HLA de classe I. 3. Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il est capable d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou une différentiation de cellules T CD8+ en CTL. 4. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un desdits fragments ou analogues. 5. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 15 caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux desdits fragments ou analogues. 6. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est en outre fusionné à une protéine d'enveloppe de VHB, ou à un fragment d'au moins 6 acides aminés d'une telle protéine. 7. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-B, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: i. de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO:4), ii. de 83 à 91 (HBSP B7-1; APVFPSHHL; SEQ ID NO:5), iii. de 85 à 93 (VFPSHHLGL; SEQ ID NO:6), iv. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT; SEQ ID NO:7), v. de 55 à 63 (DPAKPARLL; SEQ ID NO:8), vi. de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO:10), vii. de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV; SEQ ID NO:15), viii. de 45 à 53 (LPNDPRPPV; SEQ ID NO:16), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à viii., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à viii., et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB. 8. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-A, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP: i. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT; SEQ ID NO:7), ii. de 58 à 66 (KPARLLLKA; SEQ ID NO:9), iii. de 62 à 70 (HBSP A2-1; LLLKATLCI; SEQ ID NO:11), iv. de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL; SEQ ID NO:12), v. de 67 à 75 (HBSP A2-2; TLCIPHVAV; SEQ ID NO:13), vi. de 13 à 21 (Pol A2-2; LLDEEAGPL; SEQ ID NO:14), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à vi., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à vi., et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB. 9. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par une molécule HLA de classe II, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué de la séquence RDPAKPARLLLKAT (positions 54 à 68 de HBSP; SEQ ID NO:7), ou parmi les sous-fragments conservateurs de cette séquence, lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD4+ dirigée contre VHB. 10. Épitope de la protéine HBSP, ledit épitope étant restreint par HLA-B, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une des séquences suivantes: VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP; SEQ ID NO:6), -APVFPSHHL (positions 83 à 91 de HBSP; SEQ ID NO:5), - DPAKPARLL (positions 55 à 63 de HBSP; SEQ ID NO:8), - LPNDPRPPV (positions 45 à 53 de HBSP; SEQ ID NO:16), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à être restreint par HLA-B, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à être restreint par HLA-B. 11. Épitope de la protéine HBSP, ledit épitope étant restreint par HLA-A, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une des séquences suivantes: KPARLLLKA (SEQ ID NO:9; positions 58 à 66 de HBSP), -LLLKATLCI (SEQ ID NO:11; positions 62 à 70 de HBSP), - TLCIPHVAV (SEQ ID NO:13; positions 67 à 75 de HBSP), - LLDEEAGPL (SEQ ID NO:14; positions 13 à 21 de HBSP), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à être restreint par HLA-A, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à être restreint par HLA-A. 12. Oligonucléotide ou polynucléotide qui code un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou un épitope selon la revendication 10 ou 11, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code. 13. Oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il a pour séquence une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO:19 à SEQ ID NO:31. 14. Vecteur comprenant un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 12 ou 13. 15. Cellule présentatrice d'antigène (CPA) transfectée, infectée ou transformée par un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 12 ou 13, ou par un vecteur selon la revendication 14. 16. Composition pharmaceutique à effet immunisant destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une maladie et/ou d'un état lié à une infection par VHB, et plus particulièrement à une infection chronique de VHB, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément parmi: - les peptides et polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, - les épitopes selon la revendication 10 ou 11, les oligonucléotides ou polynucléotides selon la revendication 12 ou 13, les vecteurs selon la revendication 14, - les cellules présentatrices d'antigène selon la revendication 15. 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des particules portant les sites immunogènes de l'antigène HBs. 18. Composition selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une hépatite B. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une hépatite B chronique. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une fibrose. 21. Méthode pour activer et/ou différencier un lymphocyte T CD8+ et/ou CD4+, qui comprend la mise en contact in vitro dudit lymphocyte T avec au moins un élément parmi: - un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, - un épitope selon la revendication 10 ou 11, - un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 12 ou 13, - un vecteur selon la revendication 14, - une cellule présentatrice d'antigène selon la revendication 15. 22. Méthode pour induire et/ou stimuler la maturation d'une cellule dendritique, qui comprend la mise en contact in vitro de ladite cellule dendritique avec au moins un élément parmi: - un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, - un épitope selon la revendication 10 ou 11, - un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 12 ou 13, - un vecteur selon la revendication 14, -une cellule présentatrice d'antigène selon la revendication 15.