Brevet FR2887249A1 — publié le 20061222

OH t-Bu HO t-Bu La présente invention concerne un composé D-Glucopyranose 1-[3,5-bis(1,1diméthyléthyl)-4-hydroxybenzoate] et ses dérivés. Elle s'applique plus particulièrement, mais non exclusivement, à la préparation et l'utilisation de ces composés pour la préparation de médicaments pour le traitement et/ou la prévention des infections par des virus enveloppés et notamment, chez l'homme, de celui de l'herpès, du Sida, de la grippe des hépatites B et C, de la dengue, de l'ébola et, chez l'animal, de la maladie d'Aujewsky chez le porc par exemple. L'action de ces dérivés est particulière. Ils n'interviennent pas en bloquant la 20 reproduction virale à la façon des virustatiques mais en dilacérant la membrane lipido-protéique virale. Ce sont des virucides. Les virus de l'herpès et du sida comme beaucoup d'autres (hépatites B & C, grippe, SRAS, Ebola etc.) sont des virus entourés d'une enveloppe lipidique contrairement à d'autres - tel celui de la polyomyélite qui en est dépourvu - dénommés pour cela, virus nus. Virus enveloppés ou virus nus sont des organismes acellulaires, totalement tributaires pour leur survie de la cellule qu'il parasite. Les virus ne possèdent ni système générateur d'énergie (ATP) ni de machinerie de synthèse protéique. Bien que les acides nucléiques viraux codent pour des protéines, la synthèse de celles-ci s'effectue sur les ribosomes de la cellule-hôte. Les virus en sont donc réduits à utiliser les voies métaboliques de la cellule et les capacités de synthèse de ses usines de synthèse chimique que sont les ribosomes. Les virustatiques (Trithérapie) en rendant impossible l'accès aux voies métaboliques virales perturbent aussi celles de la molécule parasitée que le virus emprunte. On s'explique mieux la très mauvaise tolérance biologique de ces thérapeutiques qui bloquent la réplication virale sans pour autant tuer les virus. Elle en limite considérablement son efficacité et son utilisation. Tenant compte du caractère parasitaire du virus qui le rend incapable de survivre hors d'une cellule vivante eucaryote, la présente invention vise à lui en interdire l'entrée. Deux approches sont alors possibles: masquer le site de fixation de la cellule-hôte, éliminer l'enveloppe lipidique du virus qui contient le système de navigation et les protéines d'adsorption sur la membrane de la cellule-hôte. Dans le premier cas il existe un risque de perturbation des échanges métaboliques de la cellule-hôte avec l'extérieur, alors que la lyse de l'enveloppe virale n'apporte que des avantages. Elle tend à détruire le virus en l'écorchant vif, ce qui le rend incapable de se diriger vers le site de fixation et surtout élimine les protéines responsables de l'adsorption du virus sur la membrane de la cellule-hôte. Virus et cellule ne peuvent fusionner, le virus n'entrant pas dans la cellule meurt. Il meurt sans aucune interférence sur le génome viral, par une action mécanique en quelque sorte, limitant les risques de mutations virales qu'engendre au contraire le mode d'action des virustatiques. Cette indifférence vis à vis du patrimoine génétique du virus explique l'efficacité de ces virucides sur les virus mutants résistants aux différents virustatiques nouveaux mis sur le marché. MODE D'ACTIVITE Le mode d'action des virucides de structure di-ter-butyl tel que le BHT (butylhydroxytoluène) a été démontré par expérimentation clinique à double insu contre placebo, chez l'homme, par la disparition ou l'avortement des 2887249 -3- crises herpétiques par simple application d'un topique dès l'apparition des premiers symptômes. Contrairement aux molécules agissant sur l'ADN, qui induisent un retard de croissance, le BHT n'intervient pas dans la synthèse virale. Il fallait rechercher ailleurs l'origine des propriétés du BHT, en effet, BRUGH M Jr; dans un article paru dans Science , démontrait deux points: Premièrement, que des poulets recevant une alimentation contenant 200 ppm de BHT étaient prémunis contre l'infection inoculée par le virus de la maladie de Newcastle (VMN). Il constatait une diminution de la séroconversion proportionnelle à la dose de BHT administrée. Prolongeant son expérimentation par des cultures de cellules embryonnaires de poulet pré-traitées par 25pg/ml de BHT, il découvre que la production de virus est réduite de 65%. - Deuxièmement, que le BHT inhibait aussi bien le développement des virus à ARN (VMN) que les virus à ADN (VHS). Il évoquait comme raison de cet effet, une altération possible de l'enveloppe du virus par les propriétés hydrophobes du BHT, bien que l'effet agoniste du VMN sur l'agrégation des érythrocytes de poulet - propriété membranaire connue de ce virion - ne soit pas modifiée, ce qui lui paraissait contradictoire.. Cette hypothèse reprise par REIMUND et CUPP suggérait qu'une modification de la géométrie des enveloppes lipidiques des virus devait empêcher ceuxci de se fixer sur la membrane de la cellule-hôte. WINSTON, pourtant, mettra en évidence par microscopie électronique l'altération de la membrane lipidique, voire sa rupture sous l'effet d'un traitement par le BHT. BAMFORD démontrera que cette altération de l'enveloppe virale entraîne l'élimination d'une protéine (P3) responsable de l'adsorption du virus sur la membrane de la cellule-hôte. Il restait à démonter le mécanisme physico-chimique de ces réactions. ALOIA, par des études de résonance de spin électronique sur la composition des enveloppes lipidiques, révèle la fluidité membranaire des virus à enveloppes et du VIH en particulier sous l'effet de la chaleur ou du BHT. En 2887249 -4- modifiant la composition lipidique des enveloppes et le rapport cholestérol/phospholipides, le BHT en diminue la rigidité membranaire, désorganisant sa structure. Cette désorganisation, associée à la perte du pouvoir d'adsorption empêchent toute reconnaissance et toute fixation du virus sur la membrane de la cellule-hôte. ALOIA confirmera expérimentalement qu'une incubation durant 30 minutes à 37 C dans 320 pg/ml de BHT provoque une diminution de l'infectiosité virale sur les cultures de lymphocytes H9, d'un facteur logarithmique de 4. Avec AVF1 (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzoate d'octaoxyéthylèneglycol), 10 molécule dérivée du BHT, on parvient à diminuer de 7 log l'infectiosité du VIH. En résumé, le mode d'activité du BHT est complexe: o virucide, la lyse de l'enveloppe lipido-protéinique s'explique par les propriétés hydrophobes du BHT. En favorisant la liaison avec les protéines transmembranaires de l'enveloppe virale elles entraînent une modification du rapport cholestérol/phospholipide responsable des perturbations structurales de l'enveloppe, de sa déhiscence et de l'expulsion des protéines d'adsorption du virus. o inhibiteur de fusion par incapacité de repérage et de fusion sur le site de fixation cellulaire. Sans action cytopathique pour la cellule, le BHT, aux doses efficaces, est atoxique pour l'organisme, il ne vise que la membrane codée par le virus et non celle de la cellule-hôte. Par ces réactions complexes, virus et membrane ne sont plus compatibles. Clef et serrure étant modifiées, le virus ne peut plus ouvrir la porte d'entrée de la cellule-hôte pour aller s'y reproduire. Il meurt phagocyté. Les propriétés lipophiles du BHT et son mode d'activité spécifique, précis et limité ont conduit à penser que le groupement phenyl-di-tert- butyl devait jouer le rôle d'un pôle prépondérant. Aussi était-il impératif, pour nous, de rendre plus disponible la molécule sans dénaturer sa structure. A cet effet, l'invention propose la préparation d'un composé DGlucopyranose 1-[3,5-bis(1,1-diméthyléthyl)-4-hydroxybenzoate] défini par la formule suivante: OH OH t-Bu HO t-Bu Le procédé de préparation du composé D-Glucopyranose 1-[3,5-bis(1, 1diméthyléthyl)-4-hydroxybenzoate] comprend les étapes suivantes: la formation du chlorure de l'acide 3,5-di-t-butyl-4- hydroxybenzoïque, une réaction d'estérification par réaction entre le chlorure d'acide obtenu et le D-glucopyranose. Le composé selon l'invention ainsi que ses éventuels dérivés et sels d'addition à un acide minéral ou organique pharmaceutiquement acceptable pourront être présentés dans une composition comprenant au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Cette composition pourra se présenter par exemple sous forme de comprimés, gélules, dragées, solutions ou suspensions buvables, émulsions, suppositoires. Outre les excipients inertes, non toxiques et pharmaceutiquement acceptables, tels que l'eau distillée, le glucose, le lactose d'amidon, le talc, les huiles végétales, l'éthylène glycol..., les compositions ainsi obtenues pourront également contenir des agents de préservation. D'autres principes actifs pourront être ajoutés dans ces compositions tels que l'acide 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzoïque (BG4) ou le 3,5-ditert-butyl-4-hydroxybenzoate d'octaoxyéthylèneglycol (AVF1) ou un de leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. La quantité de composé selon l'invention et d'autres éventuels principes actifs dans de telles compositions pourra varier selon les applications, l'âge et le poids du malade. La synthèse de l'acide 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzoïque (BG4), de même que ses halogénures, notamment les bromure et chlorure, a été 15 décrite dans la demande EP 0 269 981. Cet acide a été proposé pour préparer des médicaments antiviraux destinés au traitement des maladies liées à une infection d'un individu par les virus du type à enveloppe lipidique et plus particulièrement les virus de l'herpès, ou du SIDA. Le composé de la présente invention présente plusieurs avantages notamment par rapport au BHT et à l'acide 3,5-di-t-butyl-4- hydroxybenzoïque (BG4) : une meilleure solubilité dans l'eau qui facilite l'élaboration de préparation galénique plus adaptée pour un médicament, une activité virucide à de plus faibles concentrations, un effet pro drogue. Un exemple de préparation d'un composé selon l'invention sera décrit ciaprès, à titre d'exemple non limitatif. Le procédé de préparation d'un kilogramme environ du composé DGlucopyranose 1-[3,5-bis(1,1-diméthyléthyl)-4-hydroxybenzoate comprend les étapes suivantes: La première étape comprend la synthèse du chlorure d'acide Dans un ballon sont dissous, sous agitation, 700 grammes d'acide 3,5-di-tbutyl-4-hydroxybenzoïque dans 1400 ml de dioxane. Puis, 450 grammes de chlorure de thionyle (3 équivalents) sont introduits et le mélange est chauffé à 80 C pendant 3 heures. Le contrôle de l'avancement de la réaction est réalisé par chromatographie sur couche mince (CCM). Une fois la réaction terminée, le chlorure de thionyle en excès est éliminé par 10 évaporation sous vide puis le mélange est repris dans 1400 ml de dioxane. La deuxième étape comprend une estérification Dans un ballon sont dissous 360 grammes de D-glucopyranose dans 500 ml de dioxane, puis 170 ml de pyridine sont ajoutés. La solution obtenue lors de la première étape est introduite dans le ballon puis le mélange est agité à 50 C pendant 3 heures. Le contrôle de l'avancement de la réaction est réalisé par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant un mélange toluène/acide formique/acétone, du phtalate de para-anisidine comme révélateur, le rapport frontal ou RF étant de 0,05. Une fois la réaction terminée, les solvants sont éliminés par évaporation sous vide. Puis le produit brut est repris dans un mélange eau/acétate d'éthyle (10 litres au total). Après décantation et lavage de la phase organique par de l'eau acidulée, cette dernière est concentrée. Le produit ainsi obtenu est recristallisé par un mélange éthanol / eau (20 litres) puis filtré sur fritté et séché. Le composé RDW031 de masse moléculaire 412,54 g.mor1 est obtenu avec une pureté de 98% contrôlée par chromatographie en phase liquide (HPLC) puis caractérisé par RMN du proton à 400 MHz dans du chloroforme deutéré. Le composé RDW031 de la présente invention présente plusieurs avantages par rapport au BHT et à l'acide 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzoïque (BG4) : - Une meilleure solubilité dans l'eau qui facilite l'élaboration de préparation galénique plus adaptée pour un médicament Solubilité '/z H 0, 84g/litre (pas de 1,08g/litre (pas de à 100 c désolubilisation à température désolubilisation à ambiante température ambiante Solubilité'/2 H Non mesurable 40mg /litre à 23 c Essai N 2 Solubilité 12 H insoluble 1,2g /litre à 23 c Mode 250 mg ( léger excès) de RDW031 lot RV41 opératoire + 100ml H20 agité pendant 48H. On obtient une suspension qui est ensuite filtré puis concentré sous vide et pesée. Essai n 3 Solubilité après 0,13g/litre 1,23 g/litre 48H d'agitation pH = 5,6 Remarque: formation d'une fine à 23 c suspension blanche *centrifugation pH= 5,9 Mode 1g (excès de BG4, l g (excès de RDW31 lot RV41) provenance SIGMA- + 100mI H2O agité pendant ALDRICH) + 100mI H2O 48H. On obtient une suspension agité pendant 48H. On qui est ensuite filtré, comme le opératoire obtient une suspension trouble persiste, la suspension qui est ensuite filtré. Le est centrifugée puis le filtrat est évaporé sous surnageant est évaporé puis vide puis pesé pesé Une activité virucide à de très faible concentration, Un effet pro drogue:DGlucopyranose 1-[3,5-bis(1,1-diméthyléthyl)-4-hydroxybenzoate] et l'acide 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzoïque, forme sous laquelle il se décompose, forme un équilibre fortement actif, les deux molécules ayant un fort pouvoir virucide (réduit de 5 log la virulence d'une culture de VIH) Etudes virologiques sur VHS (Virus Herpes Simplex) Résultats des essais réalisés dans le laboratoire du Pr. Chiron, (Faculté de Pharmacie de Tours) : Solution à 0,946 g/I dans l'eau RDW 031 essai n 4 code: 04/179 0,946 g/1 (eau) mg/m temps de contact min min min min Réduction exprimée en log L'activité virucide de RDW031 sur l'herpès dans l'exemple cidessus débute pour des concentrations beaucoup plus faibles (0,009 %) que celle nécessaire à l'efficacité de BG 4 sur le VHS (0,5 %) (FR 2 668 931) RDW 031 Concentrations à étudier hypothèse: 10 mg / 8 ml (vérification de la solubilité) solution-mère: 33,47 mg / 24,10 ml (x 1, 11 C) soit 11,11 mg / 8 ml dilutions pur 1/2 1/5 1/20 mg/ml 1,25000 0, 62500 0,25000 0, 06250 temps de contact min - 3,68 0,00 - min - - - 0,21 min - - - - min - - - dilutions 1/50 1/200 1/500 1/1000 mg/ml 0,02500 0, 00625 _ 0,00250 0,00125 temps de contact _ min - - - - min 0,31 - _ - _ -min - 1,06 _ 1, 06 - min - _ 1,15 0,31 - Réduction exprimée en log Exprimé en Mol les comparaisons sont en faveur de la nouvelle molécule RDW 031 qui agit à des concentrations inférieure d'un log pour une activité inhibitrice sensiblement identique: BG 4: de 0. 5 % à 1% soit de 0,04 à 0,02 Mol, AVF1: de 0,5 % à 1 % soit de 0,0083 à 0. 166 Mol (8,3x10"3 à 1,66x10"2 Mol) RDW031 actif dès la concentration de 0, 0625 % soit 0,0015 Mol (1,5x10-3 Mol) Il est bon de rappeler bien que le BHT, qui jouit il est vrai d'une très faible toxicité, et reste pour cela une molécule de référence, n'agit sur les virus enveloppés qu'à des concentrations de 8 à 10 % c'est à dire à des concentrations molaires de 0,3 à 0,4 Mol 100 fois plus forte que celle de RDW 031. Ainsi, le D-Glucopyranose 1-[3,5-bis(1, 1-diméthyléthyl)-4hydroxybenzoate] est une molécule nouvelle alliant une meilleure solubilité, une activité virucide plus importante à des doses plus faibles que le celle du BHT et du BG4. Comme ces molécules, son pôle hydrophile entraîne une désagrégation 20 de l'enveloppe virale du virus de l'herpès simplex (VHS) et reste sans effet sur les virus de la poliomyélite (virus nu). Son activité intéresse l'ensemble des virus enveloppés et tout particulièrement le virus du Sida sur lequel les études prometteuse sont en cours dans des présentations pharmaceutiques différentes: comprimés pelliculés pour administration orale en association voire en substitution des anti-protéases lorsqu'elles sont mal supportées. La très faible cytotoxicité et sa grande marge thérapeutique facilite l'utilisation chez les enfants. Sans interférence sur le génome viral et humain c'est éventuellement une médication de première intention chez la femme enceinte. Toutes les études effectuées sur le rat n'ont jamais montré de conséquences détectables sur les descendances ni remarqué d'effet mutagène, ce qui est attendu pour des actifs virucides sans interférence sur le génome viral ou humain. L'invention constitue une avancée sérieuse dans la lutte contre les virus enveloppés et tout particulièrement du Sida. On peut espérer une éradication des virus par disparition des charges virales ce qui n'est pas accessible aux virustatiques actuels qui bloque partiellement la réplication virale sans pouvoir tuer le virus. Les échecs thérapeutiques obligent la multiplication des associations médicamenteuses. Seuls des virucides peuvent éliminer totalement les colonies virales et permettre la renaissance de la lignée blanche, des lymphocytes CD 4 notamment et de restituer les défenses immunitaires de l'organisme que le VIH paralyse. Dès la fin des phases pharmaco-toxicologiques réglementaires les études chez l'homme démarreront. Dès à présent les essais cliniques sur la grippe porcine et aviaire vont être entrepris. Ils orienteront les études ultérieures. -12-Revendications 1. Composé D-Glucopyranose 1-[3,5-bis(1,1-diméthyléthyl)-4hydroxybenzoate défini par la formule: /OH t-Bu HO t-Bu OH OH 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de dérivés ou sels 10 d'addition à un acide minéral ou organique pharmaceutiquement acceptables. 3. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des 15 revendications précédentes et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 4. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications 1 et 2, au moins de l'acide 3,5-di-t-butyl4-hydroxybenzoïque ou un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 2887249 -13- 5. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications 1 et 2, au moins du 3, 5-ditert-butyl-4-hydroxybenzoate d'octaoxyéthylèneglycol ou un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 6. Composition selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une des formes suivantes: comprimés, gélules, dragées, solutions ou suspensions buvables, émulsions, 10 suppositoires. 7. Utilisation du composé selon l'une des revendications 1 à 2 pour la préparation de médicaments pour le traitement et/ou la prévention des infections par des virus enveloppés.