Brevet FR2888585A1 — publié le 20070119

La présente invention se rapporte au domaine de la préparation d'échantillons de fluide biologique, plus particulièrement du sang, en vue de leur analyse biologique. La présente invention se rapporte plus particulièrement au domaine de la microbiologie et propose un procédé et un dispositif pour échantillonner et traiter un volume de sang total en vue d'une analyse bactériologique. Le procédé et le dispositif décrits dans la présente invention sont destinés à prélever un échantillon de sang total, à réduire/éliminer les cellules eucaryotes/humaines présentes dans cet échantillon et à isoler/concentrer les cellules procaryotes/microorganismes éventuellement présents dans cet échantillon en vue de leur détection et/ou identification par des méthodes spécifiques. Parmi ces méthodes, on peut citer O les méthodes de biologie cellulaire comme la culture sur boite de petri, les techniques de détection directe en microscopie et O les méthodes de biologie moléculaire d'analyse de l'ADN et de l'ARN avec, par exemple, la technique dite RFLP (restriction fragment length polymorphisms: polymorphisme de longueur des fragments de restriction) et la technique d'amplification d'ADN ou PCR (polymerase chain reaction: amplification en chaîne par polymérisation) avec en particulier, la méthode de PCR en temps réel. Le sang est normalement stérile. II est essentiel de pouvoir mettre en évidence une éventuelle bactériémie, le retard de prise en charge du patient et donc le retard de diagnostic jouant sur la fréquence des décès. La méthode permettant la détection et l'identification des bactéries présentes dans le sang est donc essentielle. A l'heure actuelle, on utilise des techniques de microbiologie classique comprenant successivement une hémoculture, une première identification visuelle après coloration de Gram puis une subculture en milieu solide pour une identification secondaire et un antibiogramme. Les résultats sont généralement obtenus sous plusieurs jours. Les autres méthodes employées de type biologie moléculaire ne permettent que des identifications précises liées à des indications particulières, par exemple la détection du streptocoque de groupe B pendant la grossesse. Les résultats des tests biologiques réalisés sur des échantillons sanguins sont très dépendants des conditions pré-analytiques. En effet, le type de prélèvement réalisé (veineux ou artériel), l'anticoagulant utilisé, le matériel à disposition influent de façon importante sur la qualité des résultats. De plus, pour une analyse bactériologique, les conditions de test doivent faire appel à des procédures strictes afin d'éviter toute contamination en cours de manipulation, amenant des résultats appelés faux-positifs , par des microorganismes présents dans l'environnement. Ces conditions doivent être encore plus drastiques pour des analyses de biologie moléculaire qui font appel à des réactifs hautement sensibles à des interférences naturellement présentes dans l'environnement. La variabilité des conditions pré-analytiques alliée à la multiplicité des méthodes de détection/identification font du test sanguin bactériologique en biologie moléculaire un paramètre difficilement standardisable. En effet, la préparation des échantillons en vue d'une analyse bactériologique fait habituellement appel à des techniques maison , non standardisées, à réaliser dans un environnement stérile avec du matériel spécifique à cette application. Le dispositif décrit dans la présente invention est une voie de standardisation. C'est un système clos sans risque de contamination de l'échantillon. Le prélèvement se fait directement dans le tube de prélèvement par aspiration sans ouverture de celui-ci et toutes les étapes de préparation sont réalisées au sein du dispositif sans rupture de stérilité. Au laboratoire, la PCR permet généralement une détection par amplification de quelques copies de génome bactérien dans un échantillon. C'est une analyse rapide qui s'effectue en quelques heures et qui permet également de connaître l'espèce de la bactérie mise en cause. Cependant, l'utilisation des méthodes de biologie moléculaire est limitée en partie par la présence de nombreux facteurs dans le sang qui réduisent l'efficacité de l'amplification tels que les Immunoglobulines G dont la concentration plasmatique est de 8 à 18 g/litre, l'heme, l'hémoglobine, 2888585 3 principal constituant des globules rouges et la lactoferrine, présente dans les leucocytes, les fortes concentrations en ADN eucaryotes venant des cellules nucléées sanguines telles que les leucocytes. De ce fait, les volumes analysés sont faibles pour limiter la quantité d'inhibiteurs: avec les méthodes actuellement disponibles sur le marché le volume d'échantillon traitable est de 100pL et il dépasse rarement les 200pL en fonction des kits. Dans le cas des bactériémies symptomatiques ou non symptomatiques la charge bactérienne est très faible et peut être inférieure à 1 bactérie par millilitre de sang. Dans ce cas, il est statistiquement démontré que 200 pL est un volume insuffisant pour détecter ces faibles concentrations. Le dispositif décrit dans la présente invention permet de réduire les facteurs d'inhibition plasmatiques et cellulaires rendant possible une extension de volume jusqu'à 15 mL de sang total et de ce fait, une augmentation de la sensibilité de la méthode. Afin de s'affranchir des facteurs d'inhibition cellulaires, les méthodes PCR sont classiquement effectuées sur du sérum issu de la centrifugation du sang total. En effet, au cours d'une centrifugation, les éléments figurés du sang sont concentrés dans le culot alors que les composés solubles comme ADN et ARN libres restent dans le surnageant qui est prélevé pour analyse. Ce procédé ne peut s'appliquer aux bactéries car leur densité est comparable à celles des éléments figurés du sang et elles sont également retrouvées dans le culot cellulaire. Dans le brevet US-6 869 769, un dispositif, une méthode et un kit sont décrits pour séparer les éléments figurés du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes) des ARN/ADN viraux ou ADN bactériens sur support solide en vue d'une analyse PCR. Ce procédé ne peut être appliqué que 3o sur des volumes de sang extrêmement réduits de l'ordre d'une goutte et ne peut s'appliquer à la recherche et/ou identification des microorganismes dans le cas de bactériémie où la charge en microorganismes est très faible. L'invention vise à pallier les inconvénients et les manques de l'état de la technique en proposant un dispositif et un procédé facilitant l'analyse rapide d'échantillon de fluide biologique dans le domaine de la microbiologie de façon efficace, standardisée, simple avec une exposition réduite de l'utilisateur vis à vis des risques biologiques. Ce procédé et ce dispositif sont particulièrement adaptés à une utilisation en routine dans le secteur hospitalier pour la préparation d'un échantillon sanguin en vue d'une analyse bactériologique en particulier en biologie moléculaire permettant au biologiste et au clinicien d'accéder rapidement à un résultat. A cet effet et selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif de préparation d'un échantillon de fluide biologique en vue de son analyse bactériologique comprenant un récipient pourvu d'une chambre dans laquelle un piston est déplaçable entre une position d'ouverture et une position d'obturation, la chambre comprenant une zone de séparation et un moyen d'introduction d'un fluide dans ladite chambre, ledit moyen d'introduction étant disposé dans la partie supérieure de la chambre et le piston comprenant un moyen d'obturation coopérant avec la zone de séparation de sorte à définir un volume supérieur et un volume inférieur de part et d'autre de ladite zone, le volume supérieur et le volume inférieur communiquant entre eux lorsque le piston est en position d'ouverture et étant isolés l'un de l'autre de façon étanche lorsque le piston est en position d'obturation. Le dispositif décrit dans la présente invention est le lien entre l'échantillon de sang à tester et la plate-forme d'analyse, il fait partie d'une solution globale et standardisée de détection rapide des bactéries dans le sang. Le dispositif comprend différents volumes indépendants mais reliés pouvant contenir des solutions de réactifs prêts à l'emploi. Durant son utilisation en hôpital, le dispositif permet de réaliser différentes étapes séquentielles et intégrées. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un échantillon de fluide biologique en vue de son analyse bactériologique utilisant un dispositif de préparation tel que décrit cidessus, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : introduire le fluide biologique dans la chambre, le piston étant en position d'ouverture; après sédimentation du fluide biologique, déplacer le piston dans sa position d'obturation de sorte à séparer le culot de sédiment du surnageant, ledit culot se trouvant dans le volume inférieur et ledit surnageant se trouvant dans le volume supérieur; mélanger le surnageant avec une solution de réactifs agencée pour favoriser la croissance des microorganismes présents dans ledit surnageant; prélever ledit surnageant en vue de son analyse bactériologique. Plus particulièrement, le dispositif permet de prélever ou de recevoir, de façon stérile, un échantillon de 1 ml minimum à 15 ml maximum de sang total issu d'un tube de prélèvement sanguin standard prélevé sur anticoagulant. Le dispositif associé au tube de prélèvement permettent le prélèvement de l'échantillon par un système d'aspiration (soufflet, poire, piston). Le dispositif permet une incubation dans la chambre pendant un temps allant de 20 minutes à 60 heures, temps pendant lequel les globules rouges sédimentent en culot et les microorganismes se développent. Cette chambre peut être pré remplie avec une première solution de réactifs accélérant la sédimentation des globules rouges et/ou le développement des microorganismes. Le dispositif permet de prélever ou d'isoler 6 à 20mL du surnageant résultant de l'étape précédente sans prélever le culot présent dans le volume inférieur. 10 Le dispositif permet le mélange de ce surnageant à une deuxième solution de réactifs dans la chambre ou après transfert dans une deuxième chambre. L'ensemble est incubé sous agitation pendant 30 minutes à 6 heures temps pendant lequel les plaquettes agrègent et les microorganismes se développent. Le dispositif permet la filtration de la totalité de l'échantillon résultant sur un filtre seringue de porosité supérieure à 5pm à connectique luer (entrée femelle luer-lock , sortie mâle luer ou luer-lock ) pour retenir les agrégats/amas plaquettaires et les globules blancs résiduels et, en ligne, un support de membrane à connectique d'entrée luer-lock femelle constitué de deux parties imbriquées et détachables contenant une membrane filtre de 0,2pm à 1 pm de porosité retenant les bactéries. Un exemple de support de membrane est décrit dans le brevet US2004/0208796. Les bactéries isolées sur cette dernière membrane peuvent alors subir une préparation pour une analyse en biologie moléculaire. Classiquement, un protocole de lyse physique ou chimique ou physico-chimique est appliqué pour casser les cellules et récupérer le matériel génétique à analyser. L'avantage du pré traitement de l'échantillon au moyen du procédé et dispositif décrits dans cette invention est de débarrasser les microorganismes d'intérêt de tous les facteurs d'interférence des tests, facteurs solubles plasmatiques ou facteurs cellulaires. Pour cela, les différentes chambres du dispositif peuvent contenir des solutions de réactifs prêts à l'emploi: La première solution, dans la chambre, est composée de réactifs accélérant la sédimentation des globules rouges et la croissance des microorganismes: -Milieu de culture pour micro organismes; - Polymères; - Agglutinines; Eau osmosée. La deuxième solution dans une autre chambre (ou ajoutée dans la chambre du dispositif), est composée de réactifs permettant l'agrégation des plaquettes et la croissance des bactéries: - Milieu de culture pour micro organismes; - Agent d'agrégation plaquettaire. D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit, faite en référence aux dessins annexés. La figure 1 est une représentation schématique de côté du dispositif selon l'invention. La figure 2 est une représentation schématique en coupe selon l'axe A-A de la figure 1. En référence aux figures, on décrit un dispositif 1 de préparation d'un échantillon de fluide biologique comportant trois pièces principales assemblées définissant un récipient. La partie supérieure 2 du dispositif est associée à la partie inférieure 3 pour former une chambre 4 fermée à sa base par un piston 5 déplaçable entre une position d'ouverture et une position d'obturation dans la partie inférieure 3 du dispositif et qui constitue également le socle 6 du dispositif. La chambre 4 comprend une zone de séparation 7. Le piston 5 comprend un moyen d'obturation 8 coopérant avec la zone de séparation 7 de sorte à définir un volume supérieur 9 et un volume inférieur 10 de part et d'autre de la zone 7. Le volume supérieur 9 et le volume inférieur 10 communique entre eux lorsque le piston 5 est en position d'ouverture et étant isolés l'un de l'autre de façon étanche lorsque le piston 5 est en position d'obturation, comme représenté sur la figure 2. Le piston 5 comprend une tige 11 s'étendant dans le volume inférieur 10, ledit volume inférieur s'étendant de part et d'autre de la tige 11. La tige 11 comprend une protubérance 12 formant un moyen d'obturation 8 prévue à sa partie extrême libre. Les parties supérieure 2 et inférieure 3 sont assemblées au moyen de vis 13 ou peuvent être collées. La partie inférieure 3 comprend une rainure de guidage 14 et le piston 5 comprend un ergot 19, ledit ergot étant disposé dans ladite rainure. Le piston 5 se trouve en position d'obturation lorsque l'ergot 19 est disposé à l'une des partie extrêmes de la rainure 14, comme représenté sur les figures, et en position d'ouverture lorsque l'ergot 19 est disposé à l'autre partie extrême de la rainure 14. Avantageusement, le dispositif est en verre siliconé ou en matière plastique non adhérent pour les cellules par exemple, en polypropylène ou en polyacrylique de type polyméthacrylate de méthyle. Le matériaux du dispositif doit être compatible avec une stérilisation, de préférence par irradiation 13 ou y. La protubérance 12 de l'obturateur 8 est préférentiellement en élastomère de façon à assurer une obturation étanche s'adaptant au diamètre du dispositif. Les différentes étapes du procédé en relation avec la structure du dispositif sont détaillées ci-après. Au cours de la première étape, l'échantillon est introduit par la partie supérieure 2 du dispositif par l'intermédiaire de moyens d'introduction du fluide dans la chambre 4. Les moyens d'introduction sont par exemple formé par une connexion Luer 15. Un corps de pompe équipée d'une aiguille protégée capable de percer les bouchons caoutchouc des tubes de prélèvement est vissé sur la connexion Luer 15 sur la partie supérieure du dispositif. Le corps de pompe est maintenu dans un élément de réception 16 associé à la partie supérieure du récipient. L'élément de réception est par exemple formé par 3o une jupe de diamètre supérieur au diamètre du corps de pompe accueillant le tube. La jupe est percée de deux fenêtres 17 qui permettent la manipulation (vissage dévissage) des objets se positionnant sur le Luer 15. Le tube de prélèvement contenant le sang est positionné bouchon vers le bas et est guidé sur l'aiguille dans le corps de pompe. En exerçant une pression verticale sur le tube, le bouchon caoutchouc est percé et l'aiguille se retrouve au contact du liquide biologique. Une aspiration du contenu du tube est créée en actionnant le piston 5 en tirant sur le socle 6. Ce piston 5 a une course définie au moyen de l'ergot qui coulisse dans la rainure 14 permettant l'aspiration du liquide. Quelques aller-retour du piston (mouvements de haut en bas) permettent le remplissage de la chambre 4 et, dans le cas de la présence d'une première solution de réactifs, le mélange du sang avec la première solution de réactifs. Le piston 5 est immobilisé en position d'ouverture au 1 o moyen de l'ergot 19 retenu dans la partie basse de la rainure 14. Le dispositif est alors posé sur son socle 6 pendant un temps allant de 20 minutes à 60 heures. Avantageusement, le dispositif est placé dans une enceinte thermorégulée entre 30 C et 37 C afin de faciliter la croissance des micro-organismes. Pendant cette période d'incubation, les globules rouges sédimentent dans le volume inférieur 10. Le culot est d'autant plus compact et irréversible que le sang a été mélangé et est incubé avec la première solution de réactifs contenant des agglutinines. La zone de séparation 7 comprend un goulot d'étranglement 18 dont la forme facilite la sédimentation avant le passage dans le volume inférieur 10. Le volume inférieur 10 s'étend sous le goulot d'étranglement 18 et le moyen d'obturation 8 est agencé pour boucher ledit goulot 18 lorsque le piston 5 est en position d'obturation de sorte à isoler le volume inférieur 1 0 du volume supérieur 11. Le goulot 18 présente par exemple une forme annulaire sensiblement tronconique s'étendant dans le volume supérieur 4. Cette forme garantit une agglutination maximale avant le passage dans le volume inférieur 10. L'utilisation d' agglutinines permet d'obtenir un culot dense avec exclusion 3o des liquides et une perte moindre de bactéries au sein du réseau de globules rouges sédimentés. Après incubation, le piston 5 est débloqué de sa position d'ouverture par rotation du socle 6 et est délicatement poussé de façon à ce que l'ergot 19 coulisse dans la rainure 14 jusqu'à sa position d'obturation. Le piston 5 est immobilisé en position d'obturation au moyen 2888585 10 de l'ergot 19 retenu dans la partie extrême de la rainure 14. Le piston 5 entraîne le moyen d'obturation 8 qui vient boucher de façon hermétique le goulot 18 isolant dans le volume inférieur 10 le culot de globules rouges. Le volume supérieur 9 contient la partie plasmatique, les plaquettes sanguines, les globules blancs et les bactéries. Plus le temps d'incubation est long plus la concentration en bactéries est élevée. L'étape suivante est caractérisée par l'introduction d'une deuxième solution de réactifs possédant des propriétés d'agrégation plaquettaire. Le corps de pompe positionné à la première étape sur l'élément de réception 16 est dévissé manuellement, grâce aux fenêtres 17 permettant un accès direct au corps de pompe, et éliminé. Une seringue avec embout Luer et contenant la deuxième solution de réactifs est positionnée et vissée à sa place. La solution est introduite dans le volume supérieur 9. Une agitation par retournement du dispositif est appliquée permettant à la solution d'être mélangée au surnageant issu de l'étape précédente. Le dispositif 1 est alors placé horizontalement sur un agitateur à bascule, à la perpendiculaire de l'axe d'agitation pendant 30 minutes à 6 heures. Avantageusement, l'agitateur portant le dispositif est placé dans une enceinte thermorégulée entre 30 C et 37 C afin de faciliter la croissance des micro-organismes. Pendant cette période d'incubation, les plaquettes agrègent dans le volume supérieur 9. Plus le temps d'incubation est long plus la concentration en bactéries est élevée. L'étape suivante peut être réalisée de différentes façon: Selon une première réalisation, à la fin de l'incubation, le dispositif est retourné, piston 5 vers le haut et jupe vers le bas, seringue toujours en place, et un bouchon 19 d'une prise d'air 20 est légèrement dévissé et le contenu du volume supérieur 9 est aspiré dans la seringue, le dispositif est remis en position droite, piston 5 vers le bas et jupe vers le haut et la seringue est alors dévissée, un premier filtre de porosité supérieure à 5 pm est positionné par connexion Luer sur ladite seringue connecté lui-même en ligne à un support de membrane contenant une membrane, deuxième filtre, de 0.2pm à l pm de porosité, le contenu de la seringue passe séquentiellement au travers du premier filtre qui retient les agrégats 2888585 11 plaquettaires et les globules blancs, et du deuxième filtre qui retient les micro-organismes. Le support du deuxième filtre est ouvert et la membrane est récupérée pour analyse des micro organismes retenus. Un exemple de support de filtre est donné dans le brevet US-2004/0208796. Selon une deuxième réalisation, à la fin de l'incubation, la seringue positionnée à l'étape précédente est dévissée et un premier et un deuxième filtres en ligne sont insérés à sa place au niveau de la connexion Luer 15 protégée par la jupe, un premier filtre de porosité supérieur à 5 pm placé directement au contact de la jupe et un deuxième filtre de 0.2 pm à 1 pm de porosité inséré dans un support (exemple US- 2004/0208796) et situé en ligne du premier filtre, le dispositif est retourné, piston 5 vers le haut et jupe vers le bas et le support de filtre est connecté à une source de vide, le bouchon 19 de la prise d'air 20 est légèrement dévissé, le vide est appliqué, le contenu du volume supérieur 9 passe séquentiellement au travers du premier filtre qui retient les agrégats plaquettaires et les globules blancs, et du deuxième filtre qui retient les micro-organismes. Le dispositif et le premier filtre sont détachés du support de filtre, le support du deuxième filtre est ouvert et la membrane est récupérée pour analyse des micro organismes retenus. Avantageusement, il est possible de prélever 1 mL de filtrat à la fin de l'étape de filtration, pour cela, le dispositif est retourné, piston 5 vers le haut et jupe vers le bas seringue toujours en place, le bouchon 19 de la prise d'air 20 est légèrement dévissé et une partie du volume contenu dans le volume supérieur 9 est aspiré dans la seringue, le dispositif est remis en position droite, piston 5 vers le bas et jupe vers le haut et la seringue est alors dévissée et l'étape d'analyse peut se dérouler. Ce volume de filtrat contient les éventuels micro organismes intègres et pourra être utilisé comme échantillon destiné à l'antibiogramme. L'intérêt du procédé et du dispositif décrits dans la présente invention est d'isoler et de concentrer les microorganismes d'un échantillon sanguin en quelques heures. Deux protocoles sont proposés, dans le premier, la 2888585 12 première incubation dure 20 minutes et la deuxième incubation dure 4 heures à 35-37 C et dans le second protocole, appelé protocole nuit la première incubation dure plus de 12 heures à 35-37 C et la deuxième incubation dure 30 minutes. Les microorganismes sont isolés et concentrés en un temps minimum de 4 heures 20 minutes à partir d'un échantillon de 1 à 15 mL de sang total sur une membrane de filtration. Cette membrane peut alors être traitée par exemple pour une analyse de biologie moléculaire. Les exemples proposés ont été réalisés avec des solutions de réactifs: Première solution: 9 millilitres dans la chambre 4, elle est composée de réactifs accélérant la sédimentation des globules rouges et la croissance des bactéries: TSB, Coeur-Cervelle (25%, 75%) ; PEG 35 000 1% (w/v) ; Lectin 6.66pg/mL; Eau osmosée. Deuxième Solution: 1,2 millilitre ajouté dans la chambre 4, elle est composée de réactifs permettant l'agrégation des plaquettes et la croissance des bactéries: TSB, Coeur-Cervelle (25%, 75%) ; - CD9 45mg / litre. Exemple 1: Elimination des globules rouges et des plaquettes 3 à 5 millilitres de sang total sont prélevés dans le dispositif 1 contenant 9 millilitres de la première solution de réactifs comme décrit précédemment. Le dispositif est placé 30 minutes sur son socle 6 en position verticale à température ambiante. Le culot de globules rouges (GR) formé est isolé par action au niveau du piston 5. Le surnageant (SN) est récupéré. Une numération des globules rouges et des plaquettes dans le surnageant (GR dans SN et PLT dans SN) est effectuée avec un compteur cellulaire 2888585 13 (Micros 60, ABX, France). Pour un des échantillons, la procédure est poursuivie par ajout de la deuxième solution de réactifs, incubation sous agitation pendant la nuit (environ 16 heures) puis filtration supérieure à 5pm de la totalité du surnageant. Une numération des plaquettes (PLT) dans le filtrat est effectuée avec un compteur cellulaire (Micros 60, ABX, France). Les résultats sont résumés dans le tableau 1. Le nombre de GR dans l'échantillon (GR dans l'ech) est calculé en partant d'une concentration de GR théorique de 4x106/pl. De même, le nombre de PLT (PLT dans l'ech) est calculé à partir d'une valeur théorique de 300x103/pl. Après sédimentation et isolement des GR, le nombre de globules rouges résiduels dans le surnageant est divisé par 50 à 100 et le nombre de plaquettes résiduelles par 5. Après agrégation plaquettaire et filtration, ce nombre est divisé par 10. Dans cet exemple, le procédé et le dispositif permettent une réduction de environ 2 LOG de globules rouges et de environ 1 LOG de plaquettes. Exemple 2: récupération des micro organismes Un échantillon de sang total est contaminé expérimentalement avec 4 souches bactériennes: Staphylococcus epidermidis (SE), Staphylococcus aureus (SA), Escherichia coli (EC) et Pseudomonas aeruginosa (PA) à environ 100 bactéries/ml. Un volume de sang est introduit dans le dispositif 1 et incubé dans la chambre 4 avec 9 mL de la première solution de réactifs. Le dispositif est placé 30 minutes sur son socle 6 en position verticale à température ambiante. Le culot de globules rouges formé est isolé par action au niveau du piston 5. Le surnageant (SN) est récupéré. 3o La procédure est poursuivie par ajout de la deuxième solution de réactifs et incubation sous agitation 4 heures dans une enceinte thermorégulée à 35 37 C. Une numération de bactéries sur boite de pétri est réalisée en début de l'incubation à 35-37 C, à T0, et après 2 heures d'incubation, à T2H, et après 4 heures d'incubation, à T4H. Les colonies sur les boites de pétri sont comptées 24 à 48 heures après dépôt. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. L'incubation de 4H permet une croissance significative des bactéries dont le nombre est multiplié par 25 pour SE qui est connue en tant que bactérie de pousse lente, jusqu'à 9000 pour EC qui est connue en tant que bactérie de pousse rapide. Ces concentrations sont compatibles avec une méthode de détection en biologie moléculaire. Tableau 1 Ech Vol d'ech GR dans PLT dans SN (mL) GR dans le PLT dans le PLT dans sanguin (mL) l'ech l'ech SN SN le filtrat 1 4 16x109 12x108 7 2,8x108 4, 3x108 2 4 16x109 12x108 7 2,8x108 5,6x108 3 5 2x1010 15x108 >7 2x108 7, 4x108 4 4.5 18x109 14x108 >7 2x108 6,2x108 3 12x109 9x108 7 2x108 1, 2x108 6 3.5 14x109 11 x108 7 2x108 3,5x108 108 7 4 16x109 12x108 7 2x108 3,3x108 Tableau 2 SE SA EC PA TO 40 60 130 450 T2H 220 350 1450 1020 T4H 1000 6000 1190000 49000 Résultats exprimés en nombre de colonies / mL de surnageant 2888585 15 REVENDICATIONS 1. Dispositif de préparation d'un échantillon de fluide biologique en vue de son analyse bactériologique comprenant un récipient pourvu d'une chambre (4) dans laquelle un piston (5) est déplaçable entre une position d'ouverture et une position d'obturation, ledit dispositif étant caractérisé en ce que la chambre (4) comprend une zone de séparation (7) et un moyen d'introduction (15, 16) d'un fluide dans ladite chambre, ledit moyen d'introduction étant disposé dans la partie supérieure (2) de la chambre (4) et en ce que le piston (5) comprend un moyen d'obturation (8) coopérant avec la zone de séparation (7) de sorte à définir un volume supérieur (9) et un volume inférieur (10) de part et d'autre de ladite zone, le volume supérieur (9) et le volume inférieur (10) communiquant entre eux lorsque le piston (5) est en position d'ouverture et étant isolés l'un de l'autre de façon étanche lorsque le piston (5) est en position d'obturation. 2. Dispositif de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone de séparation (7) comprend un goulot d'étranglement (18), le volume inférieur (10) s'étendant sous ledit goulot d'étranglement, le moyen d'obturation (8) étant agencé pour boucher ledit goulot lorsque le piston (5) est en position d'obturation de sorte à isoler le volume inférieur (10) du volume supérieur (9). 3. Dispositif de préparation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le goulot (18) présente une forme annulaire sensiblement tronconique s'étendant dans le volume supérieur (9). 4. Dispositif de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le piston (5) comprend une tige (11) s'étendant dans le volume inférieur (10), ledit volume inférieur s'étendant autour de ladite tige, ladite tige comprenant une protubérance (12) formant moyen d'obturation (8) prévue à sa partie extrême libre. 2888585 16 5. Dispositif de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le récipient comprend une rainure de guidage (14), le piston (5) comprenant un ergot (19), ledit ergot étant disposé dans ladite rainure, le piston (5) se trouvant en position d'obturation lorsque l'ergot (19) est disposé à l'une des partie extrêmes de la rainure (14) et en position d'ouverture lorsque l'ergot (19) est disposé à l'autre partie extrême de la rainure (14). 6. Dispositif de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le moyen d'introduction du fluide est formé par un connecteur Luer (15) disposé au-dessus de la chambre (4) et destiné à recevoir un récipient contenant le fluide à introduire dans ladite chambre. 7. Dispositif de préparation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen d'introduction du fluide comprend en outre un élément de réception (16) du récipient contenant le fluide à introduire, ledit élément étant associé à la partie supérieure (2) du récipient. 2o 8. Dispositif de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le récipient comprend une partie inférieure (3) et une partie supérieure (2), la zone de séparation (7) étant prévue dans la partie inférieure (3), lesdites parties étant associées l'une à l'autre de sorte à former la chambre (4). 9. Dispositif de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la chambre (4) contient une première solution de réactifs agencée pour accélérer la sédimentation du fluide biologique et la croissance des microorganismes présents dans l'échantillon de fluide 3o biologique à préparer. 10. Procédé de préparation d'un échantillon de fluide biologique en vue de son analyse bactériologique utilisant un dispositif de préparation (1) 2888585 17 selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : introduire le fluide biologique dans la chambre (4), le piston (5) étant en position d'ouverture; après sédimentation du fluide biologique, déplacer le piston (5) dans sa position d'obturation de sorte à séparer le culot de sédiment du surnageant, ledit culot se trouvant dans le volume inférieur (10) et ledit surnageant se trouvant dans le volume supérieur (9) ; mélanger le surnageant avec une solution de réactifs agencée pour favoriser la croissance des microorganismes présents dans ledit surnageant; prélever ledit surnageant en vue de son analyse bactériologique. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le fluide biologique est mélangé avec une première solution de réactifs agencée pour accélérer la sédimentation du fluide biologique et la croissance des microorganismes présents dans l'échantillon de fluide biologique lorsqu'il est introduit dans la chambre (4). 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation et de filtration du surnageant après l'étape de mélange avec une solution de réactifs agencée pour favoriser la croissance des microorganismes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'une quantité comprise entre 1 mL et 15 mL de fluide biologique est introduite dans la chambre (4). 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé 3o en ce que le fluide biologique est du sang total, le culot de sédiment étant des globules rouges.