Brevet FR2895262A1 — publié le 20070629

L'invention concerne l'inhibition de la réponse immunitaire anti-FVIII par blocage de l'endocytose du FVIII (Facteur VIII) par les cellules capables d'endocyter l'antigène du système immunitaire. Domaine de l'invention L'hémophilie A est une affection héréditaire liée à une anomalie du chromosome X, qui se traduit par une incapacité à coaguler chez les personnes atteintes. Cette maladie est le résultat de mutations sur le gène d'une protéine intervenant dans la coagulation, le facteur VIII (FVIII), qui déterminent soit une absence totale du FVIII dans le sang, soit un déficit partiel. L'hémophilie A est la plus commune des déficiences affectant la coagulation sanguine : elle touche en France 1 homme sur 5000, et représente 80% des patients atteints d'hémophilie. L'autre type d'hémophilie, l'hémophile B, touche 20% des patients atteints d'hémophilie ; elle est causée par une déficience en un autre facteur de coagulation, le facteur IX. Le traitement actuel de l'hémophilie (de type A ou B) consiste à administrer par voie intraveineuse le facteur de coagulation déficient ou manquant: En France, le FVIII destiné au traitement des hémophiles est: disponible sous forme de médicaments dérivés du sang fournis par le Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) ou des laboratoires pharmaceutiques internationaux, ainsi que sous forme de médicaments recombinants issus du génie génétique. En effet, l'ADN codant pour le FVIII a été isolé et exprimé dans des cellules de mammifères (Wood et al., Nature (1984) 312 : 330-337), et sa séquence en acides aminés déduite à partir de l'ADNc. Le FVIII sécrété est une glycoprotéine de masse moléculaire de 300 Kda (2332 acides aminés) jouant un - 2 rôle clé dans l'activation de la voie intrinsèque de la coagulation. Le FVIII inactif est constitué de six domaines : Al (résidus 1-372), A2 (résidus 373-740), B (résidus 741-1648), A3 (résidus 1649-2019), Cl (résidus 2020-2172), et C2 (résidus 2173-2332), de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale. Après sécrétion, le FVIII interagit avec le facteur von Willebrand (VWF) qui le protège des protéases plasmatiques. C'est sous cette forme que le FVIII circule dans le sang. Le FVIII se dissocie du VWF après clivage par la thrombine. Ce clivage aboutit à l'élimination du domaine B et à l'activation du FVIII sous la forme d'un hétérodimère constitué du domaine Al, du domaine A2 et de la chaîne légère A3-Cl-C2. C'est sous cette forme que le FVIII circule dans le plasma. Cet hétérodimère est constitué d'une chaîne lourde (Al, A2) et d'une chaîne légère (A3, Cl, C2). Lorsqu'il est perfusé à un patient hémophile, le FVIII se fixe sur le VWF dans la circulation sanguine du patient. Le FVIII activé agit comme cofacteur du facteur IX activé, accélérant la conversion du facteur X en facteur X activé. Le facteur X activé convertit la prothrombine en thrombine. La thrombine convertit alors le fibrinogène en fibrine et un caillot se forme. Le problème majeur rencontré lors de l'administration de FVIII est l'apparition chez le patient d'anticorps dirigés contre le FVIII, appelés anticorps inhibiteurs . Ces anticorps neutralisent l'activité procoagulante du FVIII, qui est rendu inactif dès qu'il est perfusé. Ainsi, le facteur de coagulation administré est détruit avant d'avoir pu enrayer l'hémorragie, ce qui constitue une complication grave de l'hémophilie, le traitement devenant inefficace. De plus, certains patients non hémophiles génétiquement - 3 peuvent développer des inhibiteurs contre le FVIII endogène : il s'agit d'une hémophilie acquise. Les mécanismes par lesquels les anticorps anti-FVIII interfèrent avec la fonction du FVIII sont nombreux, et incluent l'interférence dans le clivage protéolytique du FVIII et dans l'interaction du FVIII avec différents partenaires comme le facteur Von Willebrand (VWF), les phospholipides (PL), le facteur IX, le facteur X activé (FXa) ou l'APC (Activated Protein C). La première étape dans l'initiation d'une réponse immunitaire spécifique du FVIII est l'endocytose du FVIII par des cellules présentatrices d'antigène. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d'antigène (CPA) les plus puissantes, et l'un des rares types de CPA capable d'activer les cellules T naïves primaires. Les CD sont donc capables d'initier une réponse immunitaire spécifique de l'antigène (1,2). Les CD endocytosent l'antigène par l'intermédiaire d'un récepteur ou par macropinocytose ; l'endocytose médiée par un récepteur étant avantageuse pour les CD in vivo. La surface de la CD présente nombre de récepteurs endocytiques dont la plupart est dépendante d'ions bivalents, principalement le calcium (Figure 1). De nombreux récepteurs endocytiques, en raison de leurs domaines de reconnaissance hydrocarbonés (DRH), sont spécifiques de résidus sucrés présents sur les antigènes et sont nommés récepteurs lectine de type C (RLC). Les résidus mannose sur un antigène peuvent ainsi être reconnus par une série de RLCs, sensibles au mannose, sur la surface de la cellule dendritique qui comprend le récepteur mannose (MR, CD206), le récepteur DC-SIGN (CD209), la dectine, DEC-205 (CD205). Le mannan est un ligand pour ces RLCs sensibles au mannose, en particulier pour MR et DC- - 4 SIGN (3-5). La molécule DC-SIGN des cellules dendritiques se fixe aux molécules ICAM-3 des lymphocytes T. Cette interaction spécifique semble jouer un rôle important dans l'initiation de la synapse immunologique entre les cellules dendritiques et. les LT. L'activation des lymphocytes est inhibée par un anticorps bloquant anti-DC-SIGN. La molécule de FVIII contient 25 séquences consensus (Asn-Xxx-Thr/Ser) qui sont des sites potentiels de glycosylation liés à l'N, dont 20 ont été montrées être glycosylées (6). Certaines glycosylations liées à l'N sont recombinant maintenues sur le FVIII-BDD (FVIII dépourvu de domaine B, Refacto, Wyeth) (7). A la fois le FVIII dérivé du plasma et le FVIII recombinant ont montré des profils de glycosylation semblables avec les résidus se terminant par un galactose ou un mannose (8, 9). Le FVIII et le FVIII-BDD sont ainsi des ligands 20 candidats pour les RLCs sur la surface de la cellule dendritique. Art antérieur Il existe plusieurs traitements permettant d'atténuer 25 les conséquences de la réponse immunitaire anti-FVIII, comme par exemple les traitements impliquant la desmopressine qui est une hormone synthétique stimulant la production de FVIII, les agents promoteurs de la coagulation comme les concentrés de 30 complexes prothrombiques ou les concentrés de complexes prothrombiques activés, le facteur VIIa recombinant et les perfusions de quantités importantes ou intermédiaires de FVIII pour induire une tolérance. Toutefois, ces méthodes restent très coûteuses et peu 35 efficaces. Une autre stratégie de lutte contre les anticorps - 5 inhibiteurs du FVIII, plus récente, envisage l'administration d'anticorps anti-idiotypiques (anticorps ayant la capacité d'interagir avec la région variable d'autres anticorps) neutralisant les anticorps inhibiteurs (Saint-Rémy JM et al. (1999) Vox Sang ; 77 (suppl 1) : 21-24). Du fait de la complexité de l'analyse in vivo de cette réponse immunitaire polyclonale, des équipes ont isolé des anticorps monoclonaux dirigés contre certains domaines du FVIII. Ainsi, un anticorps humain monoclonal de type IcrG4kappa, LE2E9, a été isolé. Cet anticorps est dirigé contre le domaine Cl du FVIII et inhibe l'activité cofacteur du FVIII et sa liaison au VWF (Jacquemin et al. (2000) Blood 95:156-163). De la même façon, un anticorps monoclonal humain dirigé contre le dcmaine C2 du FVIII, nommé BO2C11 (IgG4kappa), produit à partir d'un répertoire de cellules B mémoire d'un patient atteint d'hémophilie A avec inhibiteurs, a été isolé (Jacquemin et al. Blood 1998 Jul 15;92(2):496- 506). BO2C11 reconnaît le domaine C2 du FVIII et inhibe sa liaison au VWF et aux phospholipides. Il inhibe complètement l'activité procoagulante du FVIII natif et activé. Un autre exemple d'anticorps monoclonal est l'anticorps BOIIB2, dirigé contre le domaine A2 du FVIII. L'anticorps BOIIB2 inhibe à 99% l'activité du FVIII. En se liant au domaine A2, il peut interférer et inhiber la fixation du FIXa qui possède un site de fixation de faible affinité dans cette région du FVIII et dès lors inhiber l'activité enzymatique du FIXa. Le deuxième mode d'action envisageable est son interférence dans l'équilibre entre la forme hétéro-dimère (A2:A1 et A3:C1:C2) du FVIII et la forme hétéro-trimère (A2 et Al et A3:C1:C2) du FVIII en accélérant la dissociation du domaine A2 de ces complexes les rendant non - 6 fonctionnels. (Ananyeva NM et al (2004) Blood Coagul Fibrinolysis. Mar;15(2):109-24. Revue). Toutefois, la réponse immunitaire anti-FVIII est polyclonale, et les anticorps inhibiteurs du FVIII développés par un patient ne sont pas nécessairement tous dirigés contre un seul domaine du FVIII. Un traitement consistant en l'administration d'anticorps anti-idiotypiques dirigés contre des anticorps anti-FVIII dirigés contre un seul domaine du FVIII ne pourrait neutraliser que de façon partielle la réponse immunitaire anti-FVIII développée chez le patient. Aucun traitement n'est disponible pour agir avant 15 l'apparition de la réponse immunitaire anti-FVIII et ainsi l'éviter. Résumé de l'invention Pour pallier à de tels inconvénients de l'art 20 antérieur, le Demandeur a observé de façon surprenante qu'il est possible de bloquer l'endocytose du FVIII par les cellules du système immunitaire capables d'endocyter l'antigène et, par voie de conséquence, d'inhiber la formation d'anticorps inhibiteurs anti- 25 FVIII et d'augmenter la demi-vie du FVIII. Légende des Figures Figure 1 : représentation schématique du FVIII et des récepteurs de la membrane des CDs 30 Figure 2a : Mesure de la différence entre les conditions 37 C et 4 C de l'internalisation du FVIII-BDD (-CD-) et du FVIII pleine longueur (- 1,-) . Figure 2b : Mesure de l'internalisation du FVIII et 35 du FVIII-BDD en fonction du temps à 4 C ou 37 C - 7 Figure 2c : Mesure de l'internalisation relative du FVIII (%) en présence de milieu, EDTA, mannan ou galactose. Figure 2d : Mesure de l'internalisation relative (%) du FVIII, du FVIII-BDD, du dextran et du ly en présence ou non de mannan Figure 2e : Mesure de l'inhibition de l'internalisation (%) du FVIII, du FVIII-BDD et du dextran en fonction d'une concentration croissante de mannan Figure 2f : Mesure de l'internalisation de l'a2M en présence ou non de RAP ou de mannan Figure 3a : Mesure de l'internalisation relative (%) du FVIII et du FVIII-BDD en présence d'anticorps anti-MR et anti-DC-SIGN Figure 3b : Mesure de l'internalisation (%) du FVIII par les cellules HD420 en fonction de la concentration en FVIII (MM) Figure 3c : Mesure de l'intensité de liaison aux constructions CTLD1-3 et CTLD4-7 en fonction de la concentration en FVIII, FVIII-BDD et mannan ( g/ml) Figure 3d : Mesure de l'inhibition en % de la liaison du FVIII et du FVIII-BDD aux constructions CTLD1-3 et CTLD4-7 en fonction de la concentration ( g/ml) en mannan Figure 4a : Mesure de la prolifération des cellules T CD4+ (cpm) en fonction du rapport T CD4+:CD. Figure 4b : Mesure de l'activation du clone TCD4+ humain anti-FVIII D9E9 par mesure de la production d'IFN-gamma Figure 5a : Mesure de l'inhibition de l'activité pro-coagulante du FVIII (%) Figure 5b : Mesure de l'inhibition de la liaison du FVIII au VWF (%) par le mannan Figure 6 : Western-blot de la détection des sucres 20 25 30 35 -8 sur le FVIII Figure 7 : Western-blot de la détection du FVIII par CTLD(4-7)-Fc Figure 8 : Mesure de l'inhibition de l'internalisation du FVIII (%) après traitement ou non par l'Endo-Fl Figure 9 : Mesure de la liaison du CTLD(4-7)-Fc au FVIII-BDD (DO 492 nm) en fonction de la concentration en VWF Description détaillée de l'invention L'objet principal de la présente invention est un composé capable d'inhiber l'interaction du Facteur VIII avec les cellules capables d'endocyter l'antigène et l'endocytose du Facteur VIII par lesdites cellules. En effet, le Demandeur a montré que certains composés sont capables d'inhiber l'endocytose du FVIII par les cellules dendritiques comme le mannan et le FVIII démannosylé. Le Demandeur a également montré que le mannan inhibe ainsi la prolifération des cellules T spécifiques du FVIII sans bloquer l'activité pro-coagulante du FVIII ni l'interaction du FVIII avec le VWF. En particulier, ce composé peut être capable d'inhiber l'interaction du FVIII avec un récepteur présent sur les cellules capables d'endocyter l'antigène et responsable de l'endocytose du FVIII par lesdites cellules. L'objet de la présente invention comprend donc aussi bien des composés autres que le FVIII qui bloquent les récepteurs sur les cellules responsables de l'endocytose du FVIII, qu'une molécule de FVIII modifiée, pleine longueur ou un fragment de celle-ci, dont la capacité de liaison avec les cellules responsables de son endocytose est plus faible que celle du FVIII natif. Ainsi, chacun de ces deux types de composé inhibe l'endocytose du FVIII par les cellules du système immunitaire capables d'endocyter - 9 - l'antigène. Dans le cas d'une molécule de FVIII modifiée ou d'un fragment de celle-ci, ledit composé de FVIII inhibe sa propre interaction et sa propre endocytose par les cellules capables de l'endocyter : il s'agit donc d'un FVIII modifié ou d'un fragment de celui-ci dont l'endocytose est diminuée par rapport au FVIII natif. De manière préférée, ce FVIII est modifié par rapport au FVIII natif au niveau de sa glycosylation. Dans une forme préférée de l'invention ledit récepteur est spécifique pour le mannose et de manière particulièrement préférée ledit récepteur spécifique pour le mannose est le récepteur mannose CD206 ou le récepteur DC-SIGN CD209 (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3(ICAM-3)-grabbing nonintegrin). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lesdites cellules capables d'endocyter l'antigène sont des cellules présentatrices d'antigène, par exemple des cellules dendritiques ou des lymphocytes B. Le composé selon l'invention est alors capable d'inhiber l'endocytose du FVIII par les cellules présentatrices d'antigène, donc d'inhiber la présentation de peptides du FVIII qui initie la réponse immunitaire. Par conséquent, le composé selon l'invention inhibe alors la production d'anticorps anti-FVIII et diminue l'immunogénicité du FVIII. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lesdites cellules capables d'endocyter l'antigène sont choisies parmi les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules endothéliales sinusoïdales du foie, les cellules de Kupffer du foie. Ces cellules endocytent le FVIII dans le but de l'éliminer. Le composé selon l'invention en inhibant - 10 - l'endocytose du FVIII par ces cellules diminue cette voie d'élimination du FVIII, augmente la quantité de FVIII circulant donc augmente la demi-vie du FVIII. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un composé selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIII exogène. En particulier, ce médicament est destiné à diminuer l'immunogénicité du FVIII exogène chez les patients hémophiles et/ou à augmenter la demi-vie du FVIII exogène chez les patients hémophiles. Dans ce cas, le médicament est administré avec du FVIII exogène ou un fragment de celui-ci pour son 15 activité pro-coagulante. En particulier, le mannan est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIII exogène, en diminuant l'immunogénicité du FVIII exogène chez les 20 patients hémophiles et/ou en augmentant la demi-vie du FVIII exogène chez les patients hémophiles. Un objet supplémentaire de l'invention est l'utilisation d'un FVIII modifié ou d'un fragment de 25 ce:ui-ci dont l'endocytose par les cellules capables d'endocyter l'antigène est diminuée par rapport au FVIII natif pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles En particulier, ce FVIII ou fragment de FVIII est 30 démannosylé. Dans ce cas, ledit médicament consiste en un FVIII moins immunogène que le FVIII natif, dont la demi-vie est: augmentée par rapport au FVIII natif, mais qui a pleinement conservé son activité pro-coagulante. 35 Un objet supplémentaire de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon l'invention et un ou plusieurs - 11 - adjuvant(s) et/ou excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s). Les exemples suivants illustrent l'invention sans en 5 limiter la portée. Exemple 1 : Préparation de CDs humaines dérivées de monocytes Des CDs ont été préparées à partir de monocytes comme 10 décrit précédemment (29) avec un changement de milieux de culture. En bref, des cellules mononuclées ont été isolées à partir de couches leucoplaquettaires ( buffy coats ) héparinées de donneurs adultes sains par adhérence aux boîtes de culture cellulaire en 15 plastique en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum AB humain, de la glutamine et des antibiotiques 20 pendant 60 minutes. été éliminées par 3 monocytes adhérents VIVO 15 (Cambrex supplémenté avec antibiotiques et d'interleukine Les cellules non-adhérentes ont lavages doux avec du milieu. Les ont été cultivés dans du milieu X- Bio Sciences, Paris, France) 1% de sérum AB humain, des en présence de 500 UI/ml 4 humaine recombinante (rhIL-4), R&D 25 Systems (Lille, France) stimulation des colonies humain recombinant et 1000 UI/ml de facteur de de macrophages granulocytaire (rhGM-CSF), Immunotools (Friesoythe, Allemagne). La moitié du milieu, y compris tous les suppléments, a été remplacée tous les deux jours. Après 5 jours de culture, les cellules 30 non-adhérentes et peu adhérentes correspondant à la fraction enrichie en CD ont été récoltées, lavées et utilisées pour des expériences subséquentes. Exemple 2 : Conjugaison du FVIII humain recombinant 35 pleine longueur et du FVIII humain recombinant délété du domaine B avec la fluorescéine Du FVIII humain recombinant pleine longueur (1000 UI, Kogenate, Bayer) ou du FVIII humain recombinant délété - 12 - du domaine B (FVIII-BDD) (1000 UI, Refacto, Wyeth) ont été solubilisés dans l'eau et dialysés contre du tampon bicarbonate (pH 9.2) contenant du CaC12, 5mM à 4 C suivi par le couplage à la fluorescéine 5- isothiocyanate (isomère I, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) pendant 7-8 heures à 4 C. Le FVIII marqué a ensuite été dialysé contre du milieu RPMI 1640 pour éliminer la FITC non couplée. Le FVIIIFITC a été quantifié par la méthode Bradford en utilisant de l'albumine sérique bovine en tant que standard. Exemple 3 : Liaison des constructions du récepteur mannose au FVIII en ELISA Les constructions du récepteur mannose, CTLD(4-7)-Fc et CR-FNII-CTLD(1-3)-CR-Fc ont été gracieusement donnés par le Dr Luisa Martinez-Pomares, School of Molecular Medical Sciences, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, UK. La liaison des constructions au FVIII humain recombinant pleine longueur et au FVIII humain recombinant délété du domaine B a été testée soit directement en mesurant la liaison aux plaques ELISA recouvertes avec les ligands (le mannan a été utilisé comme contrôle positif) ou indirectement par des tests d'inhibition. Les plaques ELISA (Nunc ; MAXISORP) ont été recouvertes durant la nuit avec des dilutions sériées des formes du FVIII (en commençant à 50 g/ml) dans du NaCl 154 mM. Pour tous les lavages, le tampon TTBS (Tris-HC1 10 mM, pH 7.5, Ca2+ 10 mM, NaCl 154 mM et 0,05% de Tween-20) a été utilisé. Les sites non-réactifs ont été bloqués par du tampon TBS (TTBS sans Tween-20) contenant 3% de BSA. Les plaques ont ensuite été incubées avec les constructions à 2 ou 10 gg/ml pendant 2h à température ambiante dans du tampon TTBS contenant 3% de BSA. La liaison des constructions du MR a été détectée en utilisant un anticorps murin spécifique de la partie Fc des IgG humaines conjuguée à la HRP (clone JDC-10, - 13 - Southern Biotechnology Associates, Inc. AL, E-U). L'activité de la HRP a été révélée avec le substrat OPD (o-phénylènediamine, Sigma). L'absorbance a été mesurée à 492 nm. Pour les tests d'inhibition, les plaques ont été recouvertes avec chaque forme de FVIII (5,56 g/ml). Différentes concentrations de mannan ont été incubées avec 10 pg/ml de la construction CTLD(4-7)-Fc pendant 30 min à température ambiante avant l'incubation avec les plaques recouvertes de FVIII. L'absorbance a été mesurée comme décrit ci-dessus. Résultats : Figures 3c et 3d Le récepteur mannose contient 8 domaines lectine de type C (CTLDs) . les CTLDs 4 à 7 présentent une affinité pour les architectures mannosylées pas les CTLDs 1 à 3. Comme montré à la Figure 3c, le mannan montre une liaison spécifique au CTLD(4-7)-Fc. A la fois le FVIII et le FVIII-BDD montrent une interaction dose-dépendante spécifiquement avec le CTLD(4-7)-Fc alors qu'ils ne se lient pas à la construction CTLD(1-3) indiquant que la glycosylation (probablement la mannosylation exposée) en dehors du domaine B du FVIII permet à la molécule d'interagir avec le MR. Le mannan pré-incubé avec le CTLD(4-7)-Fc inhibe la liaison des deux formes du FVIII au CTLD(4-7)-Fc de façon dose-dépendante. Ceci pourrait refléter la situation des CDs où les MR sur les CDs sont saturés avec le mannan, inhibant ainsi l'endocytose du FVIII. Exemple 4 : Test in vitro de l'internalisation du FVIII par des CDs humaines dérivées de monocytes Matériel et méthodes Les CDs obtenues dans l'Exemple 1 (0,4x105 cellules/puits de plaque de 96 puits avec 100 l/puits) ont été incubées avec différentes doses (0,029, 0,057, 0,143 et 0,358 M) de ligands conjugués fluorescents (FVIII-FITC, BDD-FVIII-FITC) obtenus dans l'Exemple 2 dans le milieu X-VIVO pendant 0, 15, 60 et - 14 - 120 min à 4 C ou à 37 C. Après la période d'incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS froid et analysées par cytométrie en flux. Pour étudier l'implication de récepteurs dans l'internalisation, les cellules ont été préincubées perdant 30 min à 37 C avec 0, 0,001, 0,01, 0,1 et 1 mg/ml de mannan (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) avant l'ajout des ligands conjugués à la fluorescéine. En plus du FVIII-FITC et du FVIII- BDD-FITC, l'î2-macroglobulin-MA (cx2M) humaine conjuguée à la FITC de Biomac (Leipzig, Allemagne), le dextran-FITC (poids moléculaire 40 000) de Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas) et le Lucifer Yellow (LY-CH) de Sigma-Aldrich ont été utilisés. L'étude de l'internalisation du FVIII a également été réalisée en présence de 20 pg/ml d'anticorps monoclonal antirécepteur mannose (PAM-1, isotype IgGl) ou d'anticorps monoclonal anti-DC-SIGN (AZN-Dl, isotype IgGl) ou d'IgG1,k murine conjuguée au PE-Cy (BD Pharmingen, France). Pour étudier si DC- SIGN est impliqué dans l'endocytose du FVIII, la lignée HD-420 de lymphocytes B transformée par EBV sauvage et transfectée ou non par DC-SIGN a été incubée avec différentes concentrations de FVIII-FITC (0, 0,036, 0,072 et 0,143 M) pendant 2 heures dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de SVF (sérum de veau foetal) et des antibiotiques. L'analyse a été faite comme pour les CDs. Résultats Figure 2a,b Les CDs internalisent le FVIII pleine longueur et le FVI:II-BDD proportionnellement à la dose et au temps. Les valeurs AMFI calculées représentent le marquage différentiel des CDs positives au FVIII après 2 heures d'incubation à 37 C et 4 C. Les résultats démontrent que l'internalisation du FVIII est un processus actif. Une période d'incubation de 2 heures et une concentration en ligand de 0,143 pM ont été choisies - 15 - pour les expériences ultérieures. Figure 2c L'internalisation du FVIII par les CDs immatures a été significativement réduite en pré-incubant les cellules avec de l'EDTA 5mM (58,1 11,1% et 62,4 11,4% d'inhibition pour le FVIII pleine longueur et le FVIII-BDD respectivement), révélant ainsi un rôle des récepteurs dépendants des ions bivalents. Les récepteurs possibles du FVIII sur les CDs (c'est-à-dire CD91/LRP, ASGPR, récepteurs pour le mannose) ont été étudiés en utilisant des ligands compétiteurs spécifiques. La protéine associées au récepteur (RAP) de 38 kD bloque l'endocytose des ligands par les membres de la famille des récepteurs des LDL tel que CD91/LRP. Un excès de RAP n'a pas permis d'empêcher l'endocytose du FVIII par les CDs. De même, le D-galactose, ligand compétiteur pour le récepteur lectine de type C ASGPR, n'a pas significativement réduit l'internalisation du FVIII, indépendamment de la présence ou de l'absence du domaine B. Par contre, l'ajout de mannan (1 mg/ml) a significativement réduit l'endocytose du FVIII (35,0 10,0% et 41,3 17,2% d'inhibition pour le FVIII pleine longueur et le FVIII-BDD respectivement ; p Figure 2d La spécificité du mannan pour les RLCs sensibles au mannose a été confirmée en utilisant le dextran, un ligand typique des RLCs sensibles au mannose, et le lucifer yellow (ly), dont l'internalisation procède exclusivement par macropinocytose indépendante de tout récepteur. L'internalisation du dextran a été bloquée à 80% en présence de mannan alors que celle de ly n'a pas été affectée. - 16 - Figure 2e L'effet neutralisant du mannan sur l'internalisation de l'antigène est proportionnelle à la dose pour le FVIII, le FVIII-BDD et le dextran, quelle que soit la concentration en antigène. De façon intéressante, une concentration de saturation semblable de mannan a été atteinte pour les différents antigènes (100 g/ml), suggérant que l'endocytose sensible au mannan de ces antigènes procède par des récepteurs sensibles au mannose semblables. Figure 2f Le FVIII peut interagir avec différents récepteurs 15 endocytiques. L'cx2M activée, une protéine mannosylée qui cible spécifiquement le récepteur endocytique CD91/LRP, a été utilisée en tant qu'antigène modèle. Il a été déterminé que l'expression de résidus mannosylés sur 20 l'cx2M n'influence pas l'internalisation de l'antigène lorsque d'autres récepteurs endocytiques sont impliqués. Ainsi, l'internalisation de l'î2M a été complètement inhibée en présence d'un excès de RAP alors que le mannan n'a montré aucun effet. 25 Indirectement, ces résultats suggèrent que les parties mannosylées présentes sur le FVIII sont uniques et rendent le FVIII plus attractif pour les cellules présentatrices d'antigène (CPA) que d'autres antigènes mannosylés. 30 Figures 3a et 3b Plusieurs récepteurs sur la surface des CDs et d'autres CPAs sont sensibles au mannan, comprenant le récepteur mannose MR (CD206) et DC-SIGN (CD209). 35 L'anticorps PAM-1 (anti-MR) a inhibé l'internalisation du FVIII de 20,22% et celle du FVIII-BDD de 37,35%, indiquant ainsi l'implication du MR dans l'endocytose du FVIII. Le fait que l'effet du mannan sur - 17 - l'endocytose du FVIII ait été plus prononcée que celle de l'anticorps monoclonal anti-MR peut être expliqué par le fait que l'internalisation du FVIII par les CDs implique plusieurs récepteurs sensibles au mannan non encore caractérisés. D'autre part, l'inhibition accrue avec le mannan peut résulter du fait que le MR présente plusieurs domaines de reconnaissance hydrocarbonés (CDRs) : l'inhibition est donc plus efficace par le mannan polyhydrocarboné que par l'anticorps PAM-1 qui n'est dirigé que contre le 4ème CDR du MR. L'anticorps AZN-Dl (anti-DC-SIGN) n'a pas inhibél'internalisation du FVIII par les CDs immatures, alors que celle du FVIII-BDD a été inhibée de 17,6%. L'expression du DC-SIGN par des cellules B transfectées n'a pas permis d'augmenter l'endocytose du FVIII. Ces données suggèrent que le DC-SIGN joue un rôle mineur dans l'internalisation du FVIII par les CDs 20 humaines. Exemple 5 : Test in vitro de la prolifération des cellules T CD4+ autologues Les CDs de l'Exemple 1 ont été incubées avec du mannan 25 (1 mg/ml) pendant 30 min à 37 C. Du FVIII dialysé contre du milieu RPMI-1640 (Kogenate, Bayer) a été ajouté (40 pg/ml, 0,143 M) pendant 2 heures. Les cellules ont ensuite été lavées et incubées avec du LPS (1 pg/0,5 million de cellules) dans du milieu 30 complet pendant 48 heures. Les cellules ont ensuite été lavées et mises en culture (RPMI-1640, supplémenté avec 10% de sérum masculin humain AB dans des plaques de culture cellulaire de 96 puits à fond rond avec 200 pl par puits) avec des cellules T CD4+ autologues 35 obtenues des PBMC du donneur correspondant en utilisant le kit d'isolation cellulaire MACS (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne). Le nombre de cellules T CD4+ a été conservé constant dans chaque - 18 - puits (100000 cellules/puits) alors que le nombre de CDs variait (5000, 10000 et 15000 CDs en triplicate) donnant un rapport cellule T:CD de 20:1, 10:1, 6,6:1. Après 4 jours de culture, 0,5 Ci de thymidine tritiée a été ajouté à chaque puits. Les cellules ont été récoltées après 16 heures et la radioactivité incorporée a été comptée. Résultats : Figure 4a Le mannan réduit jusqu'à 40% l'endocytose du FVIII par 10 les CDs humaines. Figure 4a : Les CDs selon l'Exemple 1 sont incubées seules ou avec du mannan avant l'ajout de FVIII. Après la maturation en présence de LPS, les CDs sont incubées avec des cellules T helper CD4+ autologues. 15 Le mannan réduit la prolifération des cellules T à des niveaux comparables à ceux des contrôles négatifs. Exemple 6 : Test in vitro de l'activation des clones de cellules T spécifiques du FVIII 20 Après lavage, les CDs de l'Exemple 1 ont été resuspendues dans du milieu DMEM:F12 (1:1) contenant 10% de SVF et 10000 CDs ont été apportées dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 96 puits à fond rond. Après l'incubation avec le mannan (1 mg/ml) 25 dans chaque puits pendant 30 min, les CDs ont été cultivées avec 5000 D9E9 (clone de cellule T spécifique du FVIII) dans du milieu DMEM:F12 (1:1) contenant 10% de SVF et 20 U/ml de rhIL-2 avec différentes doses de FVIII pleine longueur ou de 30 FVIII-BDD (10, 8, 6, 4, 2 g/ml) pendant 20 heures à 37 C. De même que les cellules D9E9, les lignées LE2E9 et BO2C11 de cellules B transformées par EBV ont été cultivées en présence de 10 pg/ml de FVIII pleine longueur ou de FVIII-BDD. Les conditions contrôle ont 35 été conservées en absence de FVIII, D9E9 ou CDs. En tant que contrôle négatif, du hrFIX (Benefix, Baxter) a été incubé avec les cellules à des concentrations isamolaires du FVIII. Les surnageants ont été récoltés - 19 - à la fin de la période d'incubation et testés pour leur production d'IFN-y en utilisant le Duo Set IFN-'y humain (DY285, R&D Systems) conformément aux instructions du fabricant. Résultats : Figure 4b Le FVIII induit une activation dose-dépendante des cellules D9E9 qui est inhibée jusqu'à 84% en présence de mannan (B). La prolifération des cellules T est spécifique, comme indiqué par l'absence de prolifération en présence de FIX (A). Le mannan n'empêche pas l'activation des cellules D9E9 par les cellules B autologues pulsées avec du FVIII, LE2E9 (C). Ceci suggère que l'effet potentiel du mannan pour diminuer l'immunogénicité du FVIII peut seulement être exploité thérapeutiquement dans une situation où les cellules B spécifiques du FVIII n'ont pas encore été stimulées (c'est-à-dire chez des patients précédemment non traités), ou n'ayant pas encore développé d'inhibiteur après traitement. Conclusion : La diminution de l'internalisation du FVIII induite en présence de mannan résulte en une présentation amoindrie des peptides dérivés du FVIII aux cellules T CD4+ et par conséquent en une plus faible activation des lymphocytes T. Exemple 7 : Test de coagulation Du plasma humain normal a été incubé avec un volume identique de mannan (0 à 4000 mg/ml) pendant 2 heures à 37 C. L'activité résiduelle du FVIII a été mesurée dans un test de coagulation en une étape en utilisant la prothrombine placentaire humaine en tant qu'activateur (Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Allemagne) et du plasma dépourvu en FVIII (Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Allemagne) en tant que substrat et un Fibrintimer (Sysmex CA500, Dade Behring). Les dilutions ont été faites dans le tampon - 20 - Owren-Koller (Diagnostica Stago, Asnières, France). Résultats : Figure 5a Le mannan ne bloque pas l'activité pro-coagulante du FVIII. Exemple 8 : ELISA pour la liaison du FVIII au VWF Les plaques ELISA (Nunc, Roskilde, Danemark) ont été recouvertes de VWF (VWF, Willefactin, LFB, Les Ulis, France) à 2 g/ml par puits dans du PBS (pH 7,4) à 37 C pendant 1 heure. Les plaques ont été saturées avec du PBS contenant 1% de lait écrémé et 0,1% de tween 20 pendant 1 heure à 37 C. Le FVIII (0,3 g/ml) a été préincubé seul ou avec du mannan (0,01 à 4 mg/ml) ou avec du BO2C11 (IgG anti-FVIII monoclonale humaine) (0,05 à 40 g/ml) dans du tampon de blocage pendant 1 heure à 37 C puis ajouté à des puits recouverts de VWF et incubé pendant 1 heure à 37 C. Une IgG anti-FVIII monoclonale murine (mAb6) (3 g/ml) a été incubée à 37 C pendant 1 heure. Les réactivités ont: été révélées avec des anticorps IgG anti-souris de lapin couplés à la streptavidine peroxydase (Jackson Laboratories) et leur substrat. Les valeurs de liaison ont été corrigées par la liaison non-spécifique dans les puits contenant du VWF seul et ont été exprimées en pourcentage de la liaison résiduelle du FVIII. Aucune liaison du FVIII n'a été observée sur les puits non recouverts. Résultats : Figure 5b Le mannan ne perturbe pas l'interaction du FVIII avec 30 le VWF. Exemple 9 : Etude de l'internalisation du FVIII démannosylé Dans un premier temps, le FVIII-BDD est incubé avec 35 trcis différentes endoglycosidases : EndoFl, EndoF2 et EndoF3 (Sigma). Les FVIII-BDD non traité, traité avec l'EndoFl, l'EndoF2 et l'EndoF3, sont séparés par SDS-PAGE et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les - 21 - sucres sont détectés avec un kit de détection des glycoprotéines (Sigma), en utilisant la HRP en tant que contrôle positif. L'EndoFl est la seule endoglycosidase capable de couper efficacement les résidus de sucre sur le FVIII-BDD (cf. Figure 6). Dans un deuxième temps, le FVIII-BDD est déglycosylé avec l'EndoFl selon les instructions du fabricant, séparé par SDS-PAGE et révélé par Western blot. 3,7 pg de FVIII-BDD sont chargés dans chaque puits de gels SDS-PAGE à 7,5% et transférés en membranes de nitrocellulose. Celles-ci sont ensuite révélées en utilisant 10 pg/ml de la construction CTLD(4-7)-Fc et une IgG anti-humaine conjuguée à la phosphatase alcaline (gauche) ou le protogold (droite) (cf. Figure 7).. La modification du poids moléculaire du FVIII-BDD après l'incubation avec l'EndoFl confirme une déglycosylation efficace de l'EndoFl. L'incubation du FV:=II-BDD avec l'EndoFl résulte en la perte de la reconnaissance du FVIII par la construction CTLD(4-7)- Fc, indiquant une élimination des résidus mannosylés. Enfin, l'inhibition de l'internalisation du FVIII-BDD marqué FITC démannosylé a été mesurée. Le FVIII-BDD conjugué FITC traité ou non à l'EndoFl (0,143 M) est incubé avec des CDs selon l'Exemple 1 (4 x 105 cellules/puits de 100 l) dans du milieu X-VIVO sans sérum à 37 C ou à 4 C. Préalablement, les cellules ont éventuellement été pré-incubées avec du mannan (1 mg/ml) pendant 30 min à 37 C. Après 2 heures d'incubation, les cellules sont lavées et les intensités de florescence moyenne (mfi) sont mesurées par FACS. L'internalisation du FVIII-BDD est exprimée par rapport à la mfi calculée en présence de FVIII seul non traité (cf. Figure 8). L'inhibition de l'internalisation du FVIII-BDD était initialement de 45 + 7% avec le mannan sans déglycosylation. Elle est de 23,5 14,4% après incubation avec l'EndoFl. Elle est encore diminuée de 32% en présence de mannan (résultats non présentés), - 22 - indiquant que le FVIII traité par l'EndoFl est partiellement internalisé de façon dépendante du récepteur mannose. Ceci peut être expliqué soit : -par le fait que le traitement du FVIII-BDD par l'EndoFl n'ôte que partiellement les résidus mannosylés, - soit par le fait que l'EndoFl laisse des résidus N-acétylglucosamines qui sont également des ligands du récepteur mannose. Exemple 9 : Etude de l'influence du VWF sur la reconnaissance du FVIII par le récepteur mannose Des plaques ELISA sont recouvertes de FVIII-BDD (5,56 gg/ml, 0,033 M). Le VWF (0 à 1 M) est incubé avec 10 g/ml de la construction CTLD(4-7)-Fc pendant 30 min à température ambiante et ajouté au FVIII-BDD immobilisé. La liaison de la construction au FVIII-BDD est révélée en utilisant un anticorps anti-Fc humain de souris conjugué à la HRP et le substrat OPD (cf. Figure 9). L'ajout de VWF soluble empêche CTLD(4-7)-Fc d'interagir avec le FVIII immobilisé de façon limitée (43% d'inhibition en excès de rapports VWF:FVIII), suggérant ainsi que le VWF interfère seulement partiellement avec la reconnaissance des résidus sucres sur le FVIII par le récepteur mannose. - 23 - BIBLIOGRAPHIE 1. Banchereau, J., et R. M. Steinman, 1998, Dendritic cells and the control of immunity. 5 Nature 392:245. 2. Trombetta, E.S., et I. Mellman, 2005, Oeil biology of antigen processing in vitro and in vivo, Annu Rev Immunol 23:975 10 3. Sallusto, F., M. Cella, C. Danieli et A. Lanzaecchia, 1995, Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major 15 histocompatibility complex class II compartment : downregulation by cytokines and bacterial products, J Exp Med 182:389. 4. Geijtenbeek, T.B., R. Torensma, S. J. van Vliet, 20 G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, et C. G. Figdor, 2000, Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses, Cell 100:575. 25 5. Keler, T., V. Ramakrishna, et M. W. Fanger, 2004, Mannose receptor-targeted vaccines, Expert Opin Biol Ther 4 :1953. 30 6. Lenting PJ, Neels JG, van den Berg BM, Clijsters PP, Meijerman DW, Pannekoek H, van Mourik JA, Mertens K, van Zonneveld AJ., 1999, The light chain of factor VIII comprises a binding site for low density lipoprotein receptor-related protein, 35 J Biol Chem. 274:23734. 7. Sandberg H, Almstedt A, Brandt J, Gray E, Holmquist L, Oswaldsson U, Sebring S, Mikaelsson - 24 - M., Structural and functional characteristics of the B-domain-deleted recombinant factor VIII protein, r-VIII SQ, 2001, Thromb Haemost. 85:93. 8. Kaufman RJ, Wasley LC, Dorner AJ. Synthesis, processing, and secretion of recombinant human factor VIII expressed in mammalian cells, 1988, J Biol Chem 263:6352. 9. Hironaka T, Furukawa K, Esmon PC, Fournel MA, Sawada S, Kato M, Minaga T, Kobata A., Comparative study of the sugar chains of factor VIII purified from human plasma and from the culture media of recombinant baby hamster kidney cells, 1992, J Biol Chem. 267:8012. REVENDICATIONS 1. Composé capable d'inhiber l'interaction du Facteur VIII avec les cellules capables d'endocyter l'antigène et l'endocytose du Facteur VIII par lesdites cellules, lequel composé est soit un composé présentant une aptitude à se lier à des récepteurs présents sur lesdites cellules et responsables de l'endocytose du Facteur VIII par lesdites cellules pour ainsi bloquer les récepteurs, soit est un FVIII modifié ou un fragment de celui-ci dont l'endocytose par les cellules capables d'endocyter l'antigène est diminuée par rapport au FVIII natif. 2. Composé selon la revendication 1, présentant une aptitude à se lier auxdits récepteurs 15 qui sont spécifiques pour le mannose. 3. Composé selon la revendication 2, présentant une aptitude à se lier auxdits récepteurs qui sont le récepteur mannose CD206 ou le récepteur DC-SIGN CD209 (dendritic cell-specific intercellular 20 adhesion molecule 3(ICAM-3)-grabbing nonintegrin). 4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, présentant une aptitude à se lier auxdits récepteurs présents sur lesdites cellules, lesdites cellules capables d'endocyter 25 l'antigène étant des cellules présentatrices d'antigène (APCs). 5. Composé selon la revendication 4, présentant une aptitude à se lier auxdits récepteurs présents sur lesdites cellules APCs, lesdites APCs 30 étant les cellules dendritiques ou les lymphocytes B. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, présentant une aptitude à se lier auxdits récepteurs présents sur lesdites cellules, lesdites cellules capables d'endocyter 35 l'antigène étant choisies parmi les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules endothéliales -26 - sinusoïdales du foie, les cellules de Kupffer du foie. 7. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIII exogène. 8. Utilisation selon la revendication 7, ledit médicament étant destiné à diminuer l'immunogénicité du Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles. 9. Utilisation selon la revendication 7, ledit médicament étant destiné à augmenter la demi-vie du Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles. 10. Utilisation du mannan pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIII exogène. 11. Utilisation du mannan selon la revendication 10, ledit médicament étant destiné à diminuer l'immunogénicité du Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles. 12. Utilisation du mannan selon la revendication 10, ledit médicament étant destiné à augmenter la demi-vie du Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles. 13. Utilisation d'un FVIII modifié ou d'un fragment de celui-ci dont l'endocytose par les cellules capables d'endocyter l'antigène est diminuée par rapport au FVIII natif pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles. 14. Utilisation de FVIII démannosylé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles. 15. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et un ou plusieurs adjuvant(s) et/ou excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s)