Brevet FR2895993A1 — publié le 20070713

Composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques et procédé de stabilisation La présente invention concerne une nouvelle composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, en particulier d'acides nucléiques, permettant leur conservation plusieurs mois sans nécessairement devoir les conserver à basse température. Les procédés les plus utilisés en biologie sont ceux permettant d'amplifier l'information présente dans les séquences d'acides nucléiques, comme les techniques dérivées de la PCR. La quantification et la détection des informations présentes dans les séquences d'acides nucléiques ont de multiples applications, comme par exemple l'identification de marqueurs biologiques avec des applications potentielles en terme de diagnostic, pronostic ou suivi de patient. Une bonne procédure d'extraction et de purification des acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques (biopsie, sang, ...) est essentielle à l'obtention de l'information résultant d'expériences de biologie moléculaire. Les procédures d'analyse des échantillons biologiques comprennent généralement un ensemble d'étapes pour l'obtention d'acides nucléiques purs, pour procéder ensuite à des analyses de biologie moléculaire : Etape 1 : Lyse des cellules. Etape 2 : Dégradation des protéines (inactivation, protéolyse). Etape 3 : Elimination des protéines et des contaminants (lysat cellulaire...). Etape 4 : Récupération de l'ADN ou ARN. Etape 5 : Stockage (si nécessaire). Etape 6 : Expérience de biologie moléculaire (PCR, PCR quantitative...). Les quatre premières étapes sont effectuées de façon séquentielle (différentes manipulations et différents réactifs). Ces quatre étapes doivent également être effectuées dans un même espace temps du fait de l'impossibilité d'arrêter le processus, au risque de changer le rendement de la réaction (ce qui ne permettrait pas alors d'avoir une manipulation d'acides nucléiques normalisée entre chaque échantillon traité). Ces étapes généralement automatisées nécessitent un appareillage associé et sont réalisées avec des solutions standard commercialisées généralement sous forme de kits. Il existe également des kits et procédures commercialisés permettant une stabilisation des acides nucléiques avant ou juste après l'étape de lyse cellulaire (Etape 1). Ces kits et procédures permettent une stabilisation courte de quelques heures à température ambiante, à plusieurs jours pour un stockage à températures contrôlées. De tels kits et procédures sont décrits dans les documents accompagnant la commercialisation de ces produits, comme les kits SideStepTM de la société Stratagene, RNAlaterTM de la société Quiagen, PAXgeneTM de la société PreAnalytix, ou encore dans la demande de brevet WO 2005/093065. Une autre approche pour stabiliser les acides nucléiques consiste à appliquer l'échantillon biologique sur une carte en cellulose traitée, permettant la lyse des cellules et la conservation d'ADN sur le long terme, mais rendent difficile l'analyse semiquantitative, et conduisent au final à un rendement d'extraction faible en acides nucléiques (Etape 4). De tels kits et procédures sont décrits dans les documents accompagnant la commercialisation de ce produit, nommé FTA, de la société Whatman. En outre, le stockage des acides nucléiques récupérés nécessite une conservation à température contrôlée, de l'ordre de -20 C, pour éviter toute dégradation. La présente invention concerne donc une nouvelle composition permettant de mettre en oeuvre une méthode simplifiée de stabilisation et de stockage d'échantillons biologiques. Elle permet en particulier de réduire les étapes 1 et 2 décrites ci-dessus en une unique étape. En plus de l'avantage apporté par la simplification des étapes de lyse de cellules et de dégradation des protéines, il est possible de conserver sur une longue période les échantillons ainsi traités. L'utilisation de la composition selon l'invention apporte également un avantage économique important, en particulier du fait que le stockage peut être réalisé à température ambiante. La présente invention concerne donc une composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, cette composition comprenant (A) un détergent (B) un agent chaotrope, et (C) une peptidase. Outre ces trois constituants, la composition selon l'invention peut comprendre (D) un agent de dénaturation et de solubilisation doux. La composition selon l'invention peut être conservée sous forme solide ou encore en solution aqueuse. Elle sera employée sous forme aqueuse pour la stabilisation d'échantillons biologiques. Dans ce cas, elle pourra comprendre un tampon (E) de manière à stabiliser le pH, de préférence compris entre 4 et 5, plus préférentiellement 4,5. Par solution, on entend selon l'invention une composition aqueuse comprenant outre de l'eau, les constituants (A) à (C) et le cas échéant l'agent de dénaturation (D) et/ou le tampon (E) sous la forme d'une solution vraie, ou encore d'une suspension, ou d'une émulsion, ou de toute autre forme physique résultant du mélange des différents constituants dans l'eau. De manière avantageuse, lorsque la composition selon l'invention est une solution de stabilisation prête à l'emploi, elle comprend outre de l'eau, les composants (A) à (E) en proportions suivantes : détergent (A) : de 1/4 à 1/6 en volume du volume total de la solution, de préférence 1/5 en volume. agent chaotrope (B) : de 5 à 6 M (mole/1), de préférence 5,9 M. -peptidase (C) : de 15 à 30 mg/ml, de préférence 20 mg/ml. agent dénaturant (D) : de 0 à 15 mM, de préférence entre 5 et 10 mM, plus préférentiellement 10 mM. tampon (E) : pour ajuster le pH entre 4 et 5, plus préférentiellement à 4,5. Dans la composition sous forme solide, les proportions des constituants (A) à (E) sont appropriées pour permettre la préparation d'une solution telle que définie ci-dessus. La solution de stabilisation selon l'invention est avantageusement préparée en ajoutant à une quantité déterminée d'eau, les constituants (A), (C) et le cas échéant (D), puis à ajuster le pH par l'ajout du tampon (E) avant d'ajouter la peptidase (C). Pour son utilisation dans un procédé de stabilisation selon l'invention, la composition pourra être préparée de manière extemporanée, chacun de ses constituants étant mélangé pour la préparation de la composition aqueuse. Bien entendu, des pré-mélanges de constituants pourront être préparés et conservés, par exemple le détergent (A), l'agent chaotrope (B) et le cas échéant l'agent de dénaturation (D) d'une part, et la peptidase (C) d'autre part. Le pré-mélange, comprenant le détergent (A), l'agent chaotrope (B) et le cas 20 échéant, l'agent de dénaturation (D) et/ou le tampon (E), est également appelé Mélange 1 dans la présente demande de brevet. Ces pré-mélanges peuvent être sous forme liquide, une solution de pré-mélange, ou encore sous forme solide. Les formes solides des pré-mélanges, comme la composition de stabilisation selon l'invention, peuvent être préparées en ajoutant les différents composants 25 purs en proportions appropriées pour la préparation de la solution de stabilisation, ou encore en préparant une solution comprenant les différents constituants dans les proportions appropriées, puis en éliminant l'eau de manière substantielle par tout moyen approprié, par exemple par des techniques usuelles de lyophilisation. Au Mélange 1 lyophilisé, pourra être ajoutée la peptidase (C) également 30 lyophilisée. Ce pré-mélange de stabilisation lyophilisé pourra être conservé à température contrôlée, vers 4 C. Additionné à une quantité appropriée d'eau, il permettra la préparation extemporanée de la solution stabilisatrice selon l'invention. L'invention concerne donc également un kit de stabilisation d'échantillons 35 biologiques comprenant les constituants de la composition, isolés ou en pré-mélanges dans des proportions adaptées pour la réalisation d'une solution selon l'invention, prête à l'emploi. Le kit peut en outre comprendre un récipient, par exemple un tube à échantillon, une plaque ou un laboratoire sur puce, dans lequel sera traité puis conservé l'échantillon biologique mélangé à la solution selon l'invention. Le laboratoire sur puce ou Lab on Chi') est avantageusement un consommable sur un support de type puce , ladite puce comprenant des réactifs lyophilisés répartis à sa surface ou dans des volumes appropriés ménagés dans ledit support, le mélange se faisant de manière extemporanée avec le passage de l'échantillon à analyser. De manière avantageuse, les volumes appropriés ou les réactifs lyophilisés sont répartis de manière normée sur le support, plaque ou puce . De préférence, les quantités de chaque constituant dans les pré-mélanges et dans le kit selon l'invention sont des quantités dites prêtes à l'emploi , c'est à dire appropriées pour permettre d'obtenir une solution de stabilisation comprenant les proportions préférées de chaque constituant exposées ci-dessus, sans avoir à effectuer de nouveaux dosages. Par détergent (A) , on entend selon l'invention tout composé pour lequel la balance hydrophile/hydrophobe est sensiblement équilibrée et qui permet la lyse de la membrane bi-lipidique des cellules. De tels détergents peuvent être neutres, anioniques, cationiques ou encore zwitterioniques et sont bien connus de l'homme du métier. On citera notamment les composés suivants : Nom Formule CMC [] utile CHAPS 4 -10mM SDS p- Na} ` te :.o"Sâ 8,3 > 10mg/mg protéine Acide déoxycholique FtC. ÇNCN O- Na' 1-4 (force ionique) 1 mg/mg de lipides H Digitonine HO aN Hv n-octyl glucoside 14,5 46 mM Ho OH n-docdécyl maltoside 0,18mM 10-20mM Nonidet P40 0,25mM 1-10mM C9H oùH 9 CH3 CH3 H3Cùf-CH2 s{CH2CH2O}-H N H3 H3 Triton X100 -0,2mM 1-5mM Zw3-12 3,6mM 15-30mM oo Ho oH De manière préférentielle, le détergent (A) est un détergent non ionique, considéré comme un détergent d'activité moyenne non dénaturant, souvent utilisé dans des applications biochimiques pour solubiliser les protéines, lyser les cellules, et ne possédant pas forcement de propriété antimicrobienne. De préférence, le détergent non ionique est un détergent de la série Triton X , produit par polymérisation de l'octylphénol avec l'oxyde d'éthylène, plus préférentiellement le Triton X-100 (Triton X-100 est un produit de Union Carbide. Triton est une marque déposée de Rohm and Haas Company, philadelphia, PA, USA). D'autres détergents non ioniques comme Igepal et Nonidet peuvent avantageusement être employés dans la composition selon l'invention. Par agent chaotrope (B) , on entend selon l'invention un agent permettant de séparer/isoler les acides nucléiques de leur partie protéique permettant de protéger les acides nucléiques des protéines pouvant les endommager, notamment les DNAses et RNases. De tels agents chaotropes sont bien connus de l'homme du métier, et plus particulièrement les sels de guanidine (Cox, R.A., The use of Guanidinium Chloride in the Isolation of Nucleic Acids, Methods in Enzymology, 12B, 120-129 (1968); Data for Biochemical Research, 3rd ed., Dawson, R.M.C, et al., Oxford University Press (New York, NY: 1986), pp. 322-323), en particulier le thiocyanate (SCN-) de guanidium, le chlorure (Cr) de guanidium ou le sulfate (SO42")de guanidium. De manière préférée, le sel de guanidium est le chlorure de guanidium. Les peptidases (C) sont des protéases ou enzymes protéolytiques, enzymes qui clivent les liaisons peptidiques des protéines. Ce processus est appelé clivage protéolytique. Ces peptidases sont bien connues de l'homme du métier (http://www.expasy.ch/cgi-bin/lists?peptidas.txt ou http://merops.sanger.ac.uk/). De manière préférentielle, la peptidase est la Protéinase K. La protéinase K est une protéase à Sérine végétale stable et très réactive (Ebling, W., et al. Eur. J. Biochem. 47, 91, (1974)). La protéinase K n'a aucun effet d'hydrolyse sur les acides nucléiques (Sweeney, P.J. and Walker, J.M., Burrell, M.M., Enzymes of molecular biology). Elle hydrolyse les protéines de toutes origines en quelques heures avec une préférence pour les liaisons peptidiques situées après les acides aminés hydrophobes (leucine, par exemple). La protéinase K est utilisée dans les techniques de préparation et de purification des acides nucléiques pour digérer les tissus/cellules, membranes, etc. Par agent de dénaturation (D) on entend selon l'invention un agent conduisant à la dénaturation protéique, plus particulièrement résultant de la modification (disruption) de la conformation native (conformation biologiquement active) d'une protéine, sans rupture de liaison peptidique (hydrolyse) par modification d'un ou plusieurs paramètres physico-chimiques de son environnement. On peut dire que les agents dénaturants "déroulent" les protéines globulaires. L'agent dénaturant (D) permet donc d'altérer l'activité des enzymes présentes dans l'échantillon biologique, comme les DNAses ou les RNAses qui seraient susceptibles de dégrader les acides nucléiques dans les échantillons biologiques. De tels agents dénaturants sont bien connus de l'homme du métier comme l'urée, agent dénaturant préféré pour la composition selon l'invention. Les tampons (E), employés dans le domaine de la biologie sont bien connus de l'homme du métier. Ils ont de préférence les caractéristiques suivantes : solubles dans 30 l'eau, sans interférence avec les processus biologiques et de préférence non toxiques. On pourra citer les tampons suivants : Tampon pKa H3PO4 / NaH2PO4 (pKa1) 2.12 Glycine (pKal) 2.34 Citric acid (pKal) 3.13 Acetic acid 4.75 Citric acid (pKa2) 4.76 MES 6.15 Cacodylic acid 6.27 H2CO3 / NaHCO3 (pKal) 6.37 Citric acid (pKa3) 6.40 Bis-Tris 6.50 ADA 6.60 Bis-Tris Propane (pKal) 6.80 PIPES 6.80 ACES 6.90 Imidazole 7.00 BES 7.15 MOPS 7.20 NaH2PO4 / Na2HPO4 (pKa2) 7.21 TES 7.50 HEPES 7.55 HEPPSO 7.80 Triethanolamine 7. 80 Tricine 8.10 Tris 8.10 Glycine amide 8.20 Bicine 8.35 Glycylglycine (pKa2) 8.40 TAPS 8.40 Bis-Tris Propane (pKa2) 9.00 Borie acid (H3BO3 / Na2B4O7) 9.24 CHES 9.50 Glycine (pKa2) 9.60 NaHCO3 / Na2CO3 (pKa2) 10.25 CAPS 10. 40 Piperidine 11.12 Na2HPO4 / Na3PO4 (pKa3) 12.67 Il est entendu que le pH de la solution préparée peut être ajusté, outre par l'usage du tampon, avec l'addition d'une quantité appropriée d'acide, comme l'acide chlorhydrique. De manière avantageuse, le tampon selon l'invention est un tampon Tris HC1 (mélange tris (hydroxymethyl) aminomethane et HC1), ou encore un tampon à base d'acide citrique ou d'acide acétique. Il est entendu qu'au regard de l'usage de la solution de stabilisation selon l'invention, l'eau employée pour sa préparation sera de préférence de l'eau traitée de manière à éliminer toute contamination biologique et plus préférentiellement biologique, organique et minérale, plus particulièrement de l'eau distillée ou de l'eau permutée, telle que préconisée selon les bonnes pratiques de laboratoire. L'eau employée pour la préparation de l'échantillon liquide peut également être l'eau contenue dans l'échantillon biologique prélevé, par exemple lorsque cet échantillon est un prélèvement sanguin. De manière plus préférentielle, la composition selon l'invention est une solution 15 aqueuse de stabilisation comprenant outre de l'eau les constituants suivants : Triton X-100 guanidine-HC1 Protéinase K Urée 20 Tris HC1 1/5 du volume final (v/v) 5,9M 20mg/ml 10mM ajustement pH 4,5 à 25 C Le pH est généralement ajusté par l'ajout du tampon et le cas échéant de l'acide avant d'ajouter la peptidase au pré-mélange. L'invention concerne donc également un pré-mélange, ou Mélange 1, permettant de réaliser une solution comprenant : 25 Triton X-100 1 /5 du volume final (v/v) guanidine-HC1 5,9M Urée 10 mM Tris HC1 ajustement pH 4,5 à 25 C De manière préférentielle, le Mélange 1 est un lyophilisat d'une solution comprenant les composants (A), (B), (D) et (E) dans les proportions ci-dessus. L'invention concerne aussi un kit de stabilisation comprenant d'une part le Mélange 1 ci-dessus, et d'autre part une quantité appropriée de protéinase K, permettant la réalisation d'une solution de stabilisation comprenant 20 mg/ml de cette peptidase. Les techniques de prélèvement d'échantillons biologiques, de traitement, de récupération de l'ADN ou de l'ARN et tout usage ultérieur des échantillons stabilisés (PCR, PCR quantitative, etc.), restent inchangés par rapport aux techniques antérieures. La solution de stabilisation selon l'invention permet simplement de simplifier le procédé en combinant la lyse des cellules et la dégradation des protéines en une seule étape. Elle permet surtout de conserver les échantillons ainsi traités pendant plusieurs mois sans nécessité de contrôler la température de stockage. Les échantillons peuvent être stockés. à température ambiante, de préférence inférieure à 30 C, plus préférentiellement inférieure ou égale à 25 C. Ainsi, les échantillons traités dans la solution stabilisatrice selon l'invention peuvent être stockés plus de 12 mois à 25 C. Bien entendu, ils pourront être stockés dans un environnement à température contrôlée, de 4 C environ, permettant une conservation encore plus longue, jusqu'à au moins 18 mois. L'invention concerne donc aussi un procédé de préparation d'échantillons biologiques stabilisés, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de : mélange d'un échantillon biologique stabilisé avec une composition de stabilisation selon l'invention, incubation du mélange pour permettre la lyse cellulaire et la dégradation des protéines, et le cas échéant, stockage du mélange stabilisé obtenu précédemment. Les conditions d'incubation sont des conditions usuelles pour l'homme du métier, avantageusement à une température supérieure à 30 C, plus préférentiellement supérieure à 50 C, avantageusement d'environ 70 C. La durée de l'étape d'incubation dépendra de la température d'incubation. Pour une température de 70 C, l'incubation sera effectuée entre 15 et 40 minutes, avantageusement de 40 minutes. L'échantillon biologique employé dans le procédé selon l'invention comprend tout échantillon biologique prélevée sur un organisme, vivant ou non, notamment à partir de sang total frais, de sang congelée, des tissus de moelle osseuse, des cellules buccales, des cultures cellulaires, des échantillons liquides etc L'étape d'incubation est réalisée lorsque la composition de stabilisation selon l'invention comprenant l'échantillon sont sous une forme liquide. De manière préférentielle, la composition selon l'invention employée dans le procédé est une composition aqueuse. Selon un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, la composition est sous une forme solide, par exemple sous forme lyophilisée à laquelle on ajoute un échantillon biologique sous forme liquide, par exemple du sang ou tout autre échantillon liquide, de l'eau étant éventuellement ajoutée pour obtenir le volume souhaité. Selon un autre mode particulier de l'invention, on ajoute à un prémélange selon l'invention l'échantillon biologique liquide, puis on complète, si nécessaire, le volume avec de l'eau, puis on ajoute la peptidase (C). L'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention aux différentes possibilités offertes par la composition selon l'invention. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé de stabilisation peut être mis en oeuvre dans une application de type haut débit . Dans une application haut débit, automatisée, la solution Mélange 1 sous forme liquide peut être déposée en fond de plaque (96/384 puits ou d'autres formats standardisés utilisés pour la collection d'échantillons biologiques) puis la protéinase (C) y est ajoutée. L'échantillon biologique peut y être ensuite ajouté de façon systématique et normalisée. Cela est également possible avec l'ajout dans l'ordre inverse, de la protéinase (C) puis du Mélange 1 . Le même procédé peut être mis en oeuvre avec un Mélange 1 lyophilisé en fond de plaque (stockable et transportable à température ambiante) auquel il faut ajouter la protéinase (C), voire avec le Mélange 1 et la protéinase (C) lyophilisés en fond de plaque pré-remplie. Les échantillons stabilisés selon l'invention peuvent ensuite être traités de manière usuelle pour extraire l'ADN, en particulier l'ADNg ou l'ARN contenu dans l'échantillon 25 biologique selon différentes méthodes : kit d'extraction utilisant une colonne de silice. kit d'extraction utilisant une colonne d'affinité (Anion-exchange methods). kit d'extraction utilisant une méthode d'extraction par des solvants organiques. kit d'extraction utilisant une méthode de gradient de densité de chlorure de césium. 30 kit d'extraction utilisant une méthode de précipitation (Desalting method). kit d'extraction utilisant des billes magnétiques, notamment enrobées de silice. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. La Figure 1 représente le schéma général de préparation des échantillons stabilisés 35 avec le procédé et la solution selon l'invention. Les Figures 2 à 4 représentent les résultats des tests de conservation des échantillons biologiques stabilisés. Matériel Solution de Stabilisation Mélange 1 (tampon de lyse) - Triton X-100 1/5 du volume final (v/v) guanidine-HC1 5,9M Urée 10 mM Tris HC1 ajustement pH 4,5 à 25 C Mélange 2 (protéinase K) - - Protéinase K 20mg/ml Matériels supplémentaires : Un tube de 5mL pour dissoudre la Protéinase K lyophilisée si nécessaire. Un tube Eppendorf (un tube pour un échantillon). Méthode 1- Lyse cellulaire Déposer 1 volume d'échantillon dans un tube Eppendorf, ajouter 1 volume de tampon de lyse (Mélange 1) et 1/5 de volume de protéinase K (Mélange 2). 2- Homogénéisation et incubation Vortexer vigoureusement pendant au moins 30 secondes et incuber pendant 40 minutes à 70 C. 3- Stockage ou envoi de l'échantillon Une fois l'incubation terminée, bien veiller à identifier et conditionner l'échantillon en l'entourant de parafilmTM par exemple. Par précaution, le maintenir dans un endroit non directement exposé aux rayons solaires (UV pouvant endommager l'ADNg). Cet échantillon peut ensuite être stocké, ou envoyé indifféremment à 4 C ou 25 C. La période de conservation est supérieure à 12 mois. 4- Tests de conservation La figure 4 reprend les photo-radiogrammes des gels à 180 jours pour les contrôles de haut poids moléculaire et d'amplification de gènes de contrôle pour des échantillons conservés à 4 C (Figure 4.A), et à 30 jours à température ambiante (Figure 4.B). Le gène de contrôle est 1'HPRT pour les échantillons conservés à 4 C et à température ambiante. a. Migration sur gel d'agarose 0,8 à 1% après purification : vérification de l'absence de smear (qui indiquerait une dégradation de l'ADNg) et à l'inverse, de la présence d'une bande de très haut poids moléculaire 35 supérieur à 15 Kb (Fig. 4.1 Haut PM). b. Test de PCR sur gène contrôle, exemple HPRT, Actine... (Fig. 4.2 Gène de Contrôle) : montre qu'après stabilisation puis purification, les réactions enzymatiques sont possibles. c. Analyse spectrométrique (Fig 2 et 3) Conservation à 4 C Les résultats d'analyse spectrométrique sont reproduits sur la figure 2. Ils montrent que la qualité des échantillons est satisfaisante après trois mois de conservation dans la 5 solution de stabilisation selon l'invention à 4 C. Conservation à température ambiante Les résultats d'analyse spectrométrique sont reproduits sur la figure 3. Ils montrent que la qualité des échantillons est satisfaisante après un mois de conservation dans le tampon de lyse à T C ambiante. 10 Précautions d'emploi Exercer les précautions normales requises pour manipuler tous les réactifs de laboratoire. Utiliser des gants. 15 Éviter le contact du tampon de lyse avec la peau, les yeux, ou les membranes muqueuses. Si le contact se produit, laver immédiatement avec une grande quantité d'eau. Des brûlures peuvent se produire si la surface touchée n'est pas traitée. Si le réactif se renverse, diluez avec de l'eau avant d'essuyer. Utiliser seulement les réactifs et tampons préconisés dans ce kit. 20 Revendications 1. Composition pour la stabilisation d'échantillons biologiques, cette composition comprenant : (A) un détergent (B) un agent chaotrope et (C) une peptidase, et le cas échéant (D) un agent de dénaturation et de solubilisation doux et/ou (E) un tampon (E) de manière à stabiliser le pH d'une solution comprenant les composés (A) à (D), de préférence à un pH compris entre 4 et 5, plus préférentiellement 4,5. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les composants (A) à (E) en proportions suivantes : détergent (A) : de 1/4 à 1/6 en volume du volume total de la solution, de préférence 1/5 en volume. - agent chaotrope (B) : de 5 à 6 M (mole/1), de préférence 5,9 M. - peptidase (C) : de 15 à 30 mg/ml, de préférence 20 mg/ml. - agent dénaturant (D) : de 0 à 15 mM, de préférence entre 5 et 10 mM, plus préférentiellement 10 mM. tampon (E) : pour ajuster le pH entre 4 et 5, plus préférentiellement à 4,5 pour la préparation d'une solution aqueuse. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le détergent (A) est un détergent non ionique, de préférence le Triton X-100. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent chaotrope (B) est un sel de guanidine, de préférence le chlorure de guanidium. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la peptidases (C) est la Protéinase K. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que 35 l'agent de dénaturation (D) est l'urée. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le tampon (E) est choisi parmi le Tris HC1, l'acide citrique ou l'acide acétique.30 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme solide ou en solution aqueuse. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle 5 est sous une forme lyophilisée. 10. Composition de pré-mélange pour la préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend le détergent (A), l'agent chaotrope (B) et le cas échéant l'agent de dénaturation (D) et/ou le tampon (E). 11. Kit de stabilisation d'échantillons biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend les constituants (A) à (E) de la composition selon l'une des revendications 1 à 9, isolés ou en pré-mélanges dans des proportions adaptées pour la réalisation d'une solution de stabilisation prête à l'emploi. 12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend d'une part un pré-mélange selon la revendication 10 et d'autre part la peptidase (C). 13. Kit selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que les 20 constituants (A) à (E), isolés ou en pré-mélanges sont sous une forme lyophilisée. 14. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend un récipient, par exemple un tube à échantillon, une plaque ou un laboratoire sur puce, dans lequel sera traité puis conservé l'échantillon biologique mélangé à la solution de stabilisation selon 25 l'invention. 15. Procédé de préparation d'échantillons biologiques stabilisés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de : mélange d'un échantillon biologique préalablement prélevé avec une composition de 30 stabilisation selon l'une des revendications 1 à 8, incubation du mélange pour permettre la lyse cellulaire et la dégradation des protéines, et le cas échéant stockage du mélange stabilisé obtenu précédemment. 10 15