Brevet FR2893843A1 — publié le 20070601

La présente invention est relative à l'utilisation d'une composition contenant un ecdystéroïde, un dérivé d'ecdystéroïde ou un extrait naturel végétal ou animal en comprenant, pour stimuler les défenses naturelles, telles que la protéine p53, des cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'une exposition aux rayonnements ultraviolets. Les ecdystéroïdes sont des stéroïdes polyhydroxylés porteurs d'un groupement 7-ène-6-one, d'un 14 alpha-OH, et présentant une jonction cis entre les cycles A et B. Ce sont des hormones de mue des insectes, mais on les rencontre aussi fréquemment dans les plantes (Lafont R., Chem.Listy 97,280-281,2003). De nombreux effets sur les mammifères, y compris sur l'homme, ont déjà été mis en évidence : stimulation de la croissance et de la reproduction, de la prolifération et de la différenciation cellulaire, du métabolisme des protéines, glucides et lipides, des systèmes nerveux et cardiovasculaire, de la détoxification du foie et du rein ; - effets anti-inflammatoires et immuno-modulateurs ; effets antibiotiques (Lafont R. et Dinan L. Journal of Insect Science 3 :7,30pp, 2003, consultable en ligne: insectscience.org). Le document CN-86 01 06791-A concerne un produit cosmétique de protection cutanée contenant de la bêta-ecdysone, qui prévient le vieillissement de la peau, en préserve l'hydratation, et élimine l'acné et les taches brunes. Le document WO.90/03778-A concerne des compositions à base de phases lamellaires hydratées ou des liposomes contenant par exemple un ecdystéroïde, et pouvant être utilisées notamment comme compositions cicatrisantes ou anti-rides. Le document WO-94/04132-A concerne une composition cosmétique ou dermatologique contenant par exemple un ecdystéroïde, destinée notamment à donner à la peau un aspect plus lisse et plus doux, à renforcer la fonction de barrière hydrique de la peau, ainsi que la cohésion des cellules de l'épiderme. Le document FR-2801504-A concerne un extrait de la plante Ajuga turkestanica contenant au moins un ecdystéroïde et au moins un iridoïde, ainsi que des compositions cosmétiques le contenant, pour améliorer la différenciation des kératinocytes, ou pour réguler les flux hydriques et la réabsorption de l'eau dans l'épiderme, ou pour hydrater l'épiderme. Le brevet US-6 641 848 est relatif à une composition comprenant une association de saponines tri-terpéniques et d'ecdystéroïdes pour stimuler la synthèse de collagène IV dans la peau. Le document FR-2863378-A est relatif à l'utilisation d'ecdystéroïdes pour la préparation de compositions cosmétiques ou dermatologiques anti-chute des cheveux. Le document FR-863886-A se rapporte à l'utilisation d'un ligand du récepteur de l'ecdystérone pour la préparation d'une composition destinée à maintenir l'homéostasie cutanée. De plus, l'ecdystérone est largement utilisée en sériciculture pour contrôler la mue du ver à soie, et entre dans la composition de très nombreux compléments alimentaires destinés à augmenter la masse musculaire (Lafont R. et al, 2003, déjà cité). Par ailleurs, l'exposition répétée de la peau aux rayonnements ultraviolets entraîne des dommages à l'ADN présent dans les cellules de la peau et des muqueuses, en particulier dans les cellules appelées fibroblastes qui sont responsables du renouvellement des macromolécules constituant la matrice extracellulaire du derme (Goukassian D. et al, The FASEB J. , 14 :1325-34,2000) . Ces dommages sont naturellement réparés. Mais, quand ce n'est pas le cas, cela peut avoir des conséquences graves pour les cellules, et cela peut même entraîner la photocarcinogénèse (Goukassian D.A. et Gilchrest B.A., Rejuvenation Res.7 (3) :175-85,2004). De plus, on sait depuis longtemps que les cellules de la peau exposée au soleil perdent plus vite leur capacité de reproduction (Gilchrest B.A., J Gerontol., 35(4) :537-41,1980). Les cellules qui ne peuvent plus se reproduire sont appelées sénescentes , et sont caractérisées par la forte expression d'une bêta-galactosidase active à pH 6. On trouve plus de cellules exprimant cette bêta-galactosidase aussi bien parmi les kératinocytes ou fibroblastes de la peau de personnes âgées, que dans les cultures de cellules vieillies par repiquages successifs (Dimri G.P. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 :9363-67,1995), ou dans les cultures ayant subi des stress ultra-violets répétés (Chainiaux F. et al, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 34(11) :1331-9,2002). De plus, il a été récemment montré (Debacq-Chainiaux F. et aI, J. Cell. Sci. 118(Pt4) :743-58, 2005) que les fibroblastes perdent avec l'âge une partie de leur capacité de réparation des dommages causés par les rayonnements ultra-violets (UV) (Goukassian D. et al, 2000, déjà cité). Il apparaît donc qu'il serait très intéressant de pouvoir disposer de moyens pour stimuler la réparation naturelle des dommages causés aux cellules cutanées par les rayonnements ultraviolets, de manière à retarder l'apparition de cellules sénescentes qui ont perdu la capacité de se reproduire. Ainsi, l'un des buts de la présente invention est-il de fournir un moyen pour stimuler les défenses naturelles, telles que la protéine p53, des cellules vis à vis des dommages causés aux cellules cutanées par l'exposition aux rayonnements ultraviolets. Ce but, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, est atteint par l'utilisation d'une composition contenant un ecdystéroïde, un dérivé d'ecdystéroïde ou un extrait naturel végétal ou animal en comprenant pour stimuler les défenses naturelles des cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'une exposition aux rayonnements ultraviolets. Avantageusement, l'ecdystéroïde selon l'invention est l'ecdystérone. De préférence, l'ecdystéroïde est sous la forme d'un dérivé tel qu'un dérivé mono- ou multi-acylé et notamment acétylé, un acétonide, un ester de l'acide phosphorique. Avantageusement, l'ecdystéroïde utilisé est contenu dans un extrait végétal tel qu'un extrait de Cyanotis arachnoidea, Cyanotis vaga, Ajuga turkestanica, Ajuga iva, Ajuga decumbens, Serratula coronata, Leuzea (ou Rhaponticum) carthamoides, Paris polyphylla, Pfaffia paniculata, Pfaffia iresinoides, Pfaffia stenophylla, Polypodium vulgare, Polypodium aureum, Polypodium lepidopteris, Silene otites, Cyatula officinalis, Cyatula capitata, Achyrantes aspera, Achyrantes bidentata, Spinacia oleracea, Chenopodium quinoa, ou dans un extrait animal tel qu'un extrait de Bombyx mori. Selon la présente invention, la composition peut aussi comprendre : au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, le resvératrol, le gallate d'épigallocatéchine, la genistéine, la daidzéine, la formononétine, l'équol, un extrait de thé vert ; - au moins un anti-inflammatoire tel qu'un extrait de Glycyrrhiza glabra, l'acide glycyrrhétinique. De préférence, la composition dermatologique ou cosmétique selon l'invention destinée à stimuler la réparation des dommages cellulaires causés à la peau par les expositions aux ultra-violets, contient de 0,001 à 95 % et plus précisément de 0,01 à 1 % en poids d'ecdystérone. Avantageusement, cette composition est plus particulièrement appliquée sur la peau. Elle peut aussi être administrée par voie orale, par exemple sous forme de complément alimentaire. De préférence, on utilise cette composition pour stimuler l'activité de la protéine p53 dans les cellules de la peau ou des muqueuses. Or, il a maintenant été trouvé de façon tout à fait inattendue et surprenante, que si le milieu de culture des fibroblastes soumis à des expositions aux ultra-violets répétées, est supplémenté, avant les irradiations, par l'ajout d'un ecdystéroïde, on diminue de façon très significative le nombre de cellules qui passent à l'état sénescent caractérisé par l'apparition de l'activité bêta-galactosidase qui lui est associée ( Senescence Associated bêta-galactosidase ou SA bêta-gal ). La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, est en particulier relative à des exemples de réalisation de la présente invention qui permettront à l'homme du métier de mieux comprendre celle-ci. L'ecdystéroïde utilisé, en l'occurrence l'ecdystérone, dans les exemples et compositions ci-dessous est contenu dans un extrait végétal tel qu'un extrait de Cyanotis arachnoidea, Cyanotis vaga, Ajuga turkestanica, Ajuga iva, Ajuga decumbens, Serratula coronata, Leuzea (ou Rhaponticum) carthamoides, Paris polyphylla, Pfaffia paniculata, Pfaffia iresinoides, Pfaffia stenophylla, Polypodium vulgare, Polypodium aureum, Polypodium lepidopteris, Silene otites, Cyatula officinalis, Cyatula capitata, Achyrantes aspera, Achyrantes bidentata, Spinacia oleracea, Chenopodium quinoa, ou dans un extrait animal tel qu'un extrait de Bombyx mori. Exemple 1 : Atténuation par un ecdystéroïde des dommages causés à des fibroblastes en culture, par des expositions répétées à un rayonnement ultraviolet. L'ecdystéroïde utilisé est un échantillon d'ecdystérone de pureté supérieure à 90% extrait de Cyanotis arachnoidea, fourni par le Kunming Institute of Botany (Kunming, Yunnan, Chine). Des fibroblastes de derme de la même souche BJ que celle utilisée par Chainiaux F. et al (2002, déjà cité) sont mis en culture par les méthodes classiques. L'absence de cytotoxicité de l'ecdystérone sur une durée de 24h, est vérifiée dans la gamme 0,4 à 250 pg /ml. Pendant 5 jours les fibroblastes sont exposés 1 fois par jour à une dose d'ultra- violets B de 500 mj/cm2. 15 A la suite de chaque irradiation, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant (0,4), 2, 10, 50 et 250 pg /ml d'ecdystérone. Avant chaque nouvelle irradiation, ces milieux sont remplacés par un milieu ne contenant pas d'ecdystérone. Après la dernière irradiation, les cellules sont laissées 72 heures en contact avec du milieu supplémenté en ecdystérone, renouvelé toutes les 24h. Au terme de cette dernière période de contact, l'activité bêta-galactosidase à pH6 (bêta-galactosidase associée à la sénescence ou SA bêta-gal) est évaluée suivant la méthode de Dimri G.P. et al (déjà cité), sur au moins 400 cellules pour chaque concentration en ecdystérone, par colorimétrie, ainsi que par fluorescence au BioAnalyseur. Les valeurs moyennes des pourcentages de cellules exprimant la SA bêta-gal sont les suivantes : Condition Colorimétrie Bio-analyseur Contrôle sans UV 29,1 45,7 UV et Opg/ml d'ecdystérone 41,9 52,5 UV et 0,4 pg/ml d'ecdystérone 47,6 / UV et 2pg/ml d'ecdystérone 50,5 55,1 UV et 10pg/ml d'ecdystérone 37,5 49,2 UV et 50pg/ml d'ecdystérone 31 39,9 UV et 250pg/ml d'ecdystérone 28 31 On constate que : - les dommages causés par les expositions répétées aux rayons ultra-violets B ont entraîné une augmentation significative des fibroblastes présentant l'activité SA bêta- gal caractéristique des cellules qui ne peuvent plus se reproduire (qualifiées de sénescentes ), - le traitement des cellules par l'ecdystérone après les irradiations, a permis une atténuation des dommages causés par les ultra-violets dès la concentration de 10 pg/ml et de façon significative à partir de 50 pg/ml, ce qui se traduit par un nombre de fibroblastes sénescents qui reste égal ou inférieur à celui des cultures n'ayant subi aucune irradiation. Il apparaît ainsi, que l'utilisation d'un ecdystéroïde, permet bien selon l'invention d'atténuer les dommages cellulaires causés par l'exposition aux rayonnements ultraviolets. Exemple 2 : On réalise la même expérience qu'à l'exemple 1 en n'incorporant l'ecdystérone que lors de la période de 72 heures de récupération après les cinq irradiations. Le dosage de l'activité béta-galactosidase donne les résultats suivants : Conditions béta-galactosidase par colorimétrie Contrôle 13,4 1 UV B + Opg/ml d'ecdystérone 44,0 6 UV B + 50pg/ml d'ecdystérone 34,8 3 UV B + 250pg/ml d'ecdystérone 46,3 4 Ainsi on constate que l'ecdystérone n'a pas d'effet strictement réparateur après une série d'exposition à un rayonnement ultra-violet B. Exemple 3 : On réalise la même expérience qu'à l'exemple 1, mais on incorpore l'ecdystérone au milieu de culture des cellules 24 heures avant chaque irradiation aux ultra-violets B (y compris avant la première irradiation) ainsi que pendant la période de 72 heures après les cinq irradiations. Le dosage de l'activité béta-galactosidase dans les cellules donne les résultats suivants : Conditions béta-ga lactosidase par colorimétrie Contrôle 15,8 4 Contrôle + UV 31,6 4 50pg/ml d'ecdystérone 12,1 2 50pg/mI d'ecdystérone + UV 16,5 2 250pg/ml d'ecdystérone 14,0 2 250pg/ml d'ecdystérone + UV 10,2 2 Ainsi, on constate que le traitement des fibroblastes par l'ecdystérone avant les irradiations UV permet d'atténuer l'apparition de cellules sénescentes. Exemple 4 : Une cellule, après avoir subi un stress ayant causé des lésions à l'ADN contenu dans cette cellule, active la protéine p53, appelée gardien du génome , qui induit les processus de réparation des dommages primaires (cf. de Magalhaes J.P. et al, Expert Gerontol. 39(9) : 1379-89, 2004). On a évalué la stimulation de l'expression de la protéine p53 dans les fibroblastes de l'Exemple 1 soumis à des expositions répétées de rayons ultra-violets comme dans l'Exemple 1 : on a ajouté 250 mg/I d'ecdystérone au milieu de culture 24h avant chaque exposition ainsi qu'après la dernière exposition. Une première culture témoin a été soumise aux mêmes traitements par 250 mg/l d'ecdystérone, mais n'a pas été irradiée aux ultra-violets. Une seconde culture témoin a subi les mêmes expositions aux ultra-violets que les cultures traitées, mais en absence totale d'ecdystérone. 6 heures après la dernière irradiation, on a extrait les protéines des fibroblastes et évalué leur teneur au moyen du système Micro BCA kit de la société Pierce. Puis on a incubé 5pg de protéines nucléaires dans une microplaque recouverte d'un oligonucléotide portant la séquence d'ADN spécifique susceptible de lier le facteur de transcription p53. Enfin, la teneur en protéine p53 liée a été évaluée par colorimétrie au moyen 25 d'un anti-corps spécifique de cette protéine et d'un anticorps conjugué à la peroxydase (test TransAM de Active Motif, Rixensart, Belgique). Les résultats obtenus sont les suivants : p53 Conditions 6h. après la dernière irradiation (en u. d'absorbance à 450nm) Opg/ml d'ecdystérone 1 250pg/ml d'ecdystérone 6 Opg/ml d'ecdystérone + UV 9 250pg/ml d'ecdystérone + UV 16 On a ainsi trouvé de façon surprenante que le traitement à l'ecdystérone en l'absence d'UV a multiplié par 6 la teneur des fibroblastes en protéine p53. On a aussi confirmé que les expositions aux ultra-violets, en absence d'ecdystérone, ont multiplié par 9 la teneur des fibroblastes en protéine p53. Enfin, il a été montré que les fibroblastes exposés aux ultra-violets en présence d'ecdystérone exprimaient 16 fois plus de protéine p53 que les cellules témoin , donc ni traitées ni exposées. Cet exemple permet de mettre en évidence de façon surprenante que l'ecdystérone stimule la protéine de défense p53 nécessaire à la prévention des dommages causés par les rayonnements ultra-violets tels que l'apparition de cellules sénescentes ayant perdu la capacité de se reproduire. Composition N 1 : Crème cosmétique stimulant les défenses naturelles. On procède comme pour la réalisation d'une émulsion classique huile dans eau, c'est-à-dire qu'on mélange sous agitation à 85 C une phase hydrophobe et une phase aqueuse contenant chacune des matières premières destinées à conférer au produit les propriétés d'usage habituelles : stabilité, sécurité, étalement facile, toucher final agréable, etc. On refroidit sous agitation, et, lorsque la température est descendue à 45 C, on ajoute 0,1 % en poids d'ecdystérone. Cette crème est appliquée sur le visage, le cou et les mains, de préférence le matin pour que le principe stimulant les défenses naturelles ait le temps de pénétrer jusqu'aux cellules vivantes, afin d'être en contact en milieu de journée quand les intensités d'irradiation UV solaires sont à leur maximum. Composition N 2 : Crème cosmétique de stimulation des défenses naturelles et de protection antioxydante. On réalise comme ci-dessus une émulsion huile dans eau contenant de l'alpha-tocophérol ainsi que de l'acétate d'alpha-tocophérol ; et lors du refroidissement, à 45 C, on rajoute l'ecdystérone et du phosphate de vitamine C en quantité suffisante pour arriver aux concentrations en poids dans la composition finale de : -ecdystérone 0,1 % - alpha-tocophérol 0,05 % - acétate d'alpha-tocophérol 0,2 - phosphate de Vitamine C, sel de Mg 0,2 %. Cette formulation est une crème de jour. Composition N 3 : Crème cosmétique de stimulation des défenses naturelles et de protection filtrante. On réalise comme pour la Composition N 1, une émulsion huile dans eau avec un ajout d'oxyde de titane, puis un extrait alcoolique sec de Leuzea carthamoides est rajouté sous agitation à 45 C à raison de 2 % en poids. Le facteur de protection SPF est égal à 6. Le produit est destiné à être appliqué le matin sur les zones de peau non couvertes, et si possible l'application doit être renouvelée en milieu de journée. Composition N 4 : Gel cosmétique de stimulation des défenses naturelles pour peaux sensibles. On réalise un gel acrylique aqueux titré à 0,1 % en poids d'ecdystérone et contenant en outre 2 % en poids d'extrait hydroglycolique de Scutellaria baicalensis. Composition N 5 : Gel dermatologique de stimulation des défenses naturelles. On réalise un gel acrylique aqueux contenant 0,2 % en poids d'ecdystérone. Ce gel est appliqué le matin et en cours de journée sur les zones de peau exposées. Composition N 6 : Complément alimentaire pour stimuler les défenses naturelles de la peau avant toute exposition au soleil. On réalise par les techniques classiques des comprimés dosés à 15 mg d'ecdystérone par comprimé, d'une formulation de poudre comprenant 20% en poids d'ecdystérone. Ces comprimés sont à prendre avec un peu d'eau au cours des repas du matin et de milieu de journée, à raison de un à deux comprimés par prise suivant l'intensité et la durée d'ensoleillement attendue. Composition N 7 : Complément alimentaire pour stimuler les défenses naturelles de la peau avant toute exposition au soleil. On réalise des capsules contenant 15mg d'un extrait de Cyanotis arachnoidea comprenant environ 90% en poids d'ecdystérone, et le solde, soit environ 10% en poids, étant constitué par une enveloppe en gélatine. Ces capsules sont à prendre comme les comprimés de la composition N 6. Composition N 8 Complément alimentaire pour préparer la peau à l'exposition au soleil. On réalise des capsules contenant une formulation de poudre à 20% en poids d'ecdystérone dosée à 10 mg d'ecdystérone, 15 mg d'extrait de thé vert et 25 mg de vitamine C par capsule. La dose quotidienne conseillée est de 2 à 4 capsules par jour en deux prises le matin et en milieu de journée avec un peu d'eau au moment du repas. Composition N 9 : Boisson pour stimuler les défenses naturelles de la peau avant toute exposition au soleil. On réalise une boisson à base de lait de soja contenant 20 % en poids de jus d'épinard concentré, et 0,05 % en poids d'ecdystérone. Cette boisson est présentée en doses de 100 ml. II est conseillé d'en boire une dose le matin et une dose en milieu de journée au moment des repas. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une composition contenant un ecdystéroïde, un dérivé d'ecdystéroïde ou un extrait végétal ou animal le comprenant pour stimuler les défenses naturelles des cellules contre les conséquences de leur exposition aux rayonnements ultra-violets. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ecdystéroïde est de l'ecdystérone. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ecdystéroïde est sous la forme d'un dérivé tel qu'un dérivé mono- ou multi-acylé et notamment acétylé, un acétonide, un ester de l'acide phosphorique. 4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ecdystéroïde utilisé est contenu dans un extrait végétal tel qu'un extrait de Cyanotis arachnoidea, Cyanotis vaga, Ajuga turkestanica, Ajuga iva, Ajuga decumbens, Serratula coronata, Leuzea (ou Rhaponticum) carthamoides, Paris polyphylla, Pfaffia paniculata, Pfaffia iresinoides, Pfaffia stenophylla, Polypodium vulgare, Polypodium aureum, Polypodium lepidopteris, Silene otites, Cyatula officinalis, Cyatula capitata, Achyrantes aspera, Achyrantes bidentata, Spinacia oleracea, Chenopodium quinoa, ou dans un extrait animal tel qu'un extrait de Bombyx mori. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle comprend aussi : - au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, le resvératrol, le gallate d'épigallocatéchine, la genistéine, la daidzéine, la formononétine, l'équol, un extrait de thé vert ; au moins un anti-inflammatoire tel qu'un extrait de Glycyrrhiza glabra, l'acide glycyrrhétinique. 6. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,001 à 95 % en poids d'ecdystérone. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,01 à 1 % en poids d'ecdystérone. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition est destinée à une application topique. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition est destinée à être ingérée. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition stimule l'activité de la protéine p53 dans les cellules de la peau ou des muqueuses.