Brevet FR2887148A1 — publié le 20061222

PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF ANTI-AGE ET PRINCIPE ACTIF OBTENU La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un principe actif issu de Vaccinium vitis idaea ou airelles rouges, pour lutter contre le vieillissement de la peau. L'invention se rapporte également au principe actif susceptible d'être 5 obtenu par ce procédé. Avec l'augmentation de la durée de vie, femmes et hommes ont tendance à vouloir paraître jeunes le plus longtemps possible et cherchent par conséquent à estomper les marques du vieillissement de la peau. Le vieillissement de la peau est un des premiers signes extérieurs du vieillissement. Il résulte d'un certain nombre d'altérations qui surviennent spontanément au cours du temps ou qui sont induites par divers facteurs externes. La peau est constituée de deux tissus étroitement reliés l'un à l'autre l'épiderme situé en surface, et le derme sous-jacent. L'épiderme est formé par plusieurs couches de cellules et notamment par des kératinocytes qui synthétisent de la kératine, une protéine fibreuse qui donne de la dureté à l'épiderme. Le derme est riche en fibres conjonctives de collagène et en fibres d'élastine produites notamment par les kératinocytes de l'épiderme. Ces fibres assurent soutien, extensibilité et résistance et se raréfient progressivement au cours du vieillissement. Les différents facteurs intrinsèques et extrinsèques à l'origine du vieillissement cutané agissent au niveau des tissus constitutifs de la peau notamment: 2887148 2 - en diminuant le métabolisme des cellules épidermiques et dermiques, - en dégradant les fibres de collagène, et -en induisant la formation de radicaux libres responsables d'altérations irréversibles. Pour lutter contre le vieillissement de la peau, il est donc important d'agir simultanément sur tous ces points, ce qui est le cas du principe actif selon la présente invention, obtenu à partir de feuilles et de fruits d'airelles rouges, riche en polyphénols et en oligosaccharides. La capacité de la peau à se régénérer diminue avec l'âge. On constate en effet une forte diminution de la différenciation épidermique corrélée à une importante augmentation de l'activité enzymatique ayant comme conséquence une dégradation excessive et anarchique des fibres de collagène. La peau perd donc son élasticité et sa souplesse et devient plus mince, plus fragile. De fait, le principe actif selon la présente invention se propose de régénérer la peau en augmentant la différenciation épidermique et en limitant l'activité enzymatique. Pour cela, le principe actif selon l'invention agit à la fois en augmentant l'expression d'une enzyme précurseur de la différentiation kératinocytaire, la transglutaminase-1, en stimulant l'expression de la cadhérine-E qui participe au contrôle de la prolifération et de la différentiation des cellules de l'épiderme, et en limitant l'activité de la collagénase responsable de la dégradation des fibres de collagènes. Les radicaux libres constituent une autre cause importante du vieillissement cutané. Ils sont responsables de différents dommages tels que l'oxydation de protéines, l'inactivation d'enzymes, la péroxydation de lipides, ou encore la coupure de chaînes d'ADN de sorte que la qualité des nouvelles cellules de la peau diminue ou que les cellules soient détruites. Les 2887148 3 radicaux libres peuvent être induits par divers types d'agressions et en particulier la pollution atmosphérique et les rayonnements solaires. La présente invention a donc également pour objectif de protéger les cellules de la peau et leur ADN des radicaux libres induits par agression chimique ou rayonnement UV, mais également de détoxifier et de purifier les cellules altérées par une action chélatrice vis-à-vis du fer. Le principe actif selon la présente invention agit donc sur le vieillissement de la peau, à la fois - en régénérant les cellules de l'épiderme et du derme par stimulation de la différentiation cellulaire et inhibition de l'activité de la collagénase. - en protégeant les cellules de la peau et notamment leur ADN, des radicaux libres induits par des stress environnementaux, et - en détoxifiant et en purifiant les cellules de la peau par une action chélatrice des métaux. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux appréhender les résultats obtenus illustrés par des tableaux. 1/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION: Le procédé d'obtention du principe actif selon l'invention consiste en la 20 succession des étapes suivantes: - solubilisation d'une poudre de feuilles d'airelles rouges, Vaccinium vitis idaea, et de fruits entiers congelés, à raison d'au moins 50g/l dans une solution aqueuse, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) ou successive(s), 25 - séparation des phases soluble et insoluble par tout moyen adapté, notamment par centrifugation, - inactivation des activités enzymatiques, - filtration et collecte du filtrat, et - filtration stérilisante du filtrat obtenu. 2/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION: 2-1/ Matières sèches: On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matières sèches est compris entre 20 et 100 g/I, plus particulièrement entre 40 et 60 g/I. 2-2/ Mesure du pH: Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante conduit à des valeurs comprises entre 3 et 8, plus particulièrement entre 4,5 et 5,5. 2-3/ Détermination de la teneur en sucres totaux: On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356) . En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon allant de 25 pg/ml à 100 pg/ml, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 10 à 50 g/I, préférentiellement de 22 à 34 g/I. 2-4/ Dosage des composés phénoliques Les composés phénoliques forment en présence de ferricyanure de potassium des composés colorés, l'intensité de cette coloration étant proportionnelle à la quantité de composés phénoliques. 2887148 5 En se rapportant à une gamme étalon d'acide gallique, en l'occurrence une gamme couvrant de 40 à 120 mg/I, on peut déduire la quantité de composés phénoliques. Les résultats donnent de 1 g/I à 10 g/I de composés phénoliques, principalement de 3 g/I à 5 g/I. Ces composés peuvent être caractérisés. La chromatographie liquide haute pression donne comme composition en polyphénols - de 0,3 à 3 % de composés hydroxybenzoïques, plus particulièrement 1,3 %, - de 5 à 20 % de composés hydroxycinnamiques, plus particulièrement 13,8%, - de 2 à 25 % de phénols, plus particulièrement 12,5 %, - de 10 à 40 % de flavanols, plus particulièrement 25,9%, et - de 10 à 40 % de flavonols, plus particulièrement 26,6 %. L'analyse du principe actif par Chromatographie Liquide à Haute Pression (CLHP) montre qu'il est composé principalement de composés hydroxybenzoïques, de composés hydroxycinnamiques, de flavanols, flavonols et phénols. 3/EVALUATION DE L'EFFET ANTI-AGE DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION 3-1/ Evaluation de l'effet détoxifiant Cette étude a pour objectif de déterminer le pouvoir chélateur vis-à-vis des métaux et plus particulièrement du fer, du principe actif selon l'invention. Les métaux tels que le fer sont des éléments toxiques connus qui peuvent induire des réactions d'irritation et des allergies cutanées. Ce sont les kératinocytes, localisés dans l'épiderme, qui stockent ces métaux qui agissent en interférant avec le métabolisme enzymatique et en lysant l'ADN et les lipides cellulaires. Pour évaluer le pouvoir chélateur du principe actif selon l'invention visà-vis des ions métalliques, on quantifie le taux de métal libre, présent 5 dans les kératinocytes par dosage spectrométrique. Le dosage est réalisé à l'aide d'un kit colorimétrique. Vis-à-vis du fer, le tableau suivant montre que le principe actif à 1% selon l'invention présente une forte activité chélatrice de 81% : Activité chélatrice du fer (%) Principe actif selon l' invention à 0,5% 27% Principe actif selon l' invention à 1% 48% Principe actif selon l' invention à 2% 81% 3-2/ Evaluation du potentiel anti-radicalaire du principe actif selon l'invention 3-2-1/ Effet protecteur après agression chimique: L'objectif de cette étude est de déterminer l'activité antioxydante du principe actif selon l'invention sur des kératinocytes artificiellement soumis à une agression chimique. L'agression chimique des cellules entraîne la formation de radicaux libres responsables de la mort cellulaire. L'activité anti-oxydante du principe actif est donc déterminée par évaluation de la viabilité cellulaire. L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains. Les cultures cellulaires sont incubées en présence de 0,5%, 1% et 2% du principe actif et sont agressées chimiquement par une solution hypoxanthine (160 pg/ml) - xanthine oxydase (10 mU/ml). On évalue la viabilité des kératinocytes par mesure spectrophotométrique. Les résultats sont récapitulés dans le tableau suivant: Efficacité (%) Témoin 100 Témoin agressé 0 Principe actif selon l' invention à 0,5% 44 Principe actif selon l' invention à 1% 62 Principe actif selon l' invention à 2% 78 On observe que le principe actif selon la présente invention dosé à 2% présente une activité anti-radicalaire de 78%. 3-2-2/ Effet photoprotecteur Le but de cette étude est de déterminer l'activité photoprotectrice du principe actif selon l'invention sur des kératinocytes artificiellement soumis à des irradiations UVB. L'irradiation d'UVB sur des cellules entraîne la formation de radicaux libres responsables de la mort cellulaire. L'activité anti-oxydante du principe actif est donc déterminée par évaluation de la viabilité cellulaire. L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains. Les cultures cellulaires sont irradiées avec une lampe UV, à une intensité en UVB de 0,13J/cm2, et en présence de 0,1%, 0,25% 0,50% et 1% du principe actif selon l'invention. Après irradiation, les cellules sont gardées à 37 C pendant 24 heures en atmosphère humide. On évalue la viabilité des kératinocytes par mesure spectrophotométrique. Les résultats obtenus sont exprimés dans le tableau suivant en pourcentage par rapport à un témoin: Efficacité/témoin (%) Principe actif selon l'invention 0,10% 31 Principe actif selon l'invention 0,25% 47 Principe actif selon l'invention 0,50% 63 Principe actif selon l'invention 1% 75 Ces résultats montrent que le principe actif selon l'invention testé à 1% permet de protéger à 75% les cellules contre des radicaux libres induits par UVB. 3-2-3/ Effet protecteur de l'ADN L'ADN, support de l'information génétique, est une macromolécule hélicoïdale présente dans le noyau des cellules qui joue notamment un rôle fondamental dans la maintenance des fonctions cellulaires. Lorsque des cellules sont soumises à des irradiations UVB, leur ADN est endommagé et elles ne fonctionnent plus correctement. Cette étude a pour objectif d'évaluer la capacité du principe actif selon l'invention à lutter contre des altérations de l'ADN de kératinocytes causées par irradiation UVB. L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains. On évalue l'état de l'ADN par électrophorèse, après extraction. Le protocole expérimental est le suivant: - A JO les kératinocytes sont incubés à 37 C pendant une heure, avec principe actif selon l'invention à 1%. Après 1 heure d'incubation les cellules sont irradiées avec une intensité en UVB de 180mJ/cm2, en présence du principe 2887148 9 actif selon l'invention. Les cellules sont à nouveau incubées à 37 C. - A J1, après 24 heures d'incubation, l'ADN est extrait des cellules. Les cassures des brins d'ADN sont visualisées par électrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats obtenus montrent que le principe actif selon l'invention à 1% protège à 39% l'ADN des kératinocytes des dommages induits par irradiation UVB, par rapport à un témoin irradié. 3-3/ Evaluation de l'effet régénérant 3-3-1/ Effet sur la différenciation des kératinocytes a - étude de la transglutaminase-1 L'objectif de cette étude est de déterminer l'effet du principe actif selon l'invention sur l'expression des ARN messagers (ARNm) codant pour la transglutaminase-1, marqueur de la différentiation kératinocytaire. Cette étude est réalisée sur des kératinocytes humains. Les cellules sont incubées pendant 48 heures à 37 C en présence du principe actif selon l'invention dosé à 0,5%. Après incubation, on extrait l'ARN total des cellules. L'ARN est ensuite mis en présence de reverse transcriptase afin d'obtenir son ADN complémentaire qui est ensuite analysé par PCR. Les résultats obtenus, exprimés par rapport à un témoin standard (la (3actine) sont présentés dans le tableau suivant 20 25 2887148 10 Taux d'ARNm (%) Témoin 100 Principe actif selon l'invention 0,5% 118 Ces résultats montrent que le principe actif selon l'invention agit sur la différenciation des kératinocytes en augmentant l'expression de la transglutaminase-1. b - étude de l'expression des cadhérines-E Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse des cadhérines-E impliquées dans la régulation de la différenciation kératinocytaire. L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains. Les cellules sont incubées pendant 48 heures à 37 C en présence du principe actif selon l'invention dosé à 0,5%. Après incubation, on extrait l'ARN total des kératinocytes, puis on récupère l'ADN complémentaire par intervention d'une reverse transcriptase. L'ADN complémentaire obtenu est analysé par RT-PCR. Les résultats obtenus, exprimés par rapport à un témoin standard (la (3actine) sont présentés dans le tableau suivant Taux d'ARNm (%) Témoin 100 Principe actif selon l'invention 0,5% 120 On observe que, dosé à 0,5%, le principe actif selon l'invention augmente l'expression des cadherines-E qui jouent un rôle dans la différentiation kératinocytaire. 3-3-2/ Effet sur le réseau de collagène Le but de cette étude est d'évaluer l'activité anti-collagénase du principe actif selon l'invention. Le FALGPA (FurylAcryloyl-Leucine-Glycine-Proline-Alanine) est un substrat spécifique de la collagénase. Plus il y a de collagénase plus le FALGPA est hydrolysé. La réaction d'hydrolyse du FALGPA induit une diminution de l'absorbance à 324nm. Ainsi, il est possible d'évaluer l'activité anticollagénase d'un produit en observant une inhibition de la diminution de l'absorbance à 324nm. L'étude est réalisée à partir du protocole suivant -on mélange 2mL de FALGPA avec 400 L du principe actif selon l'invention dosé à 1%, 2% ou 5% ou avec 400 L d'eau distillée. - on mesure l'absorbance à 324nm, - on ajoute 20 L de solution de collagénase, et - on mesure l'absorbance à 324nm après 10 minutes de réaction. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activité anticollagénase dans le tableau suivant: Activité anti-collagénase (%) Principe actif selon l'invention 1% 31 Principe actif selon l'invention 2% 47 Principe actif selon l'invention 5% 75 2887148 12 Ces résultats montrent que dosé à 2%, le principe actif selon l'invention limite de 47% l'activité de la collagénase. 3-4/ Effet synergique du principe actif selon l'invention Cette étude a pour objectif de déterminer l'activité photoprotectrice du principe actif selon l'invention en comparaison à l'activité photoprotectrice d'extrait de fruits d'airelles seul et d'extrait de feuilles d'airelles seul. L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains artificiellement soumis à des irradiations UVB. Les cellules sont irradiées avec une lampe UV, à une intensité en UVB de 0,6J/cm2, en présence: - d'extrait de fruits d'airelles à 0,25%, 0, 50%, 1% et 2%, - d'extrait de feuilles d'airelles à 0,05%, 0,10%, 0,25% et 0, 5%, - du principe actif selon l'invention à 0,10%, 0,25%, 0,50% et 17o. Après irradiation, les cellules sont conservées à 37 C pendant 6 heures en atmosphère humide. On détermine l'activité photoprotectrice par évaluation de la viabilité des kératinocytes par mesure spectrophotométrique. Les résultats obtenus sont exprimés dans le tableau suivant en pourcentage par rapport à un témoin: 2887148 13 Extrait de fruits Extrait de Principe actif d'airelles feuilles d'airelles selon l'invention 0,05% 8 0,10% 38 11 0,25% 4 59 27 0,50% 10 70 53 1% 23 66 2% 64 On observe que testés à 0,5%, la protection des kératinocytes contre les radicaux libres induits par irradiation UVB augmente de: - 10% avec l'extrait de fruits d'airelles, 70% avec l'extrait de feuilles d'airelles, et - 53% avec le principe actif selon l'invention. 14 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif pour lutter contre le vieillissement de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - solubilisation d'une poudre de feuilles de Vaccinium vitis idaea, et de fruits entiers, à raison d'au moins 50g/l dans une solution aqueuse, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) ou successive(s), séparation des phases soluble et insoluble, - inactivation des activités enzymatiques, - filtration et collecte du filtrat, et - filtration stérilisante du filtrat obtenu. 2. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par les paramètres suivants: - taux de matières sèches compris entre 20 et 100 g/I, 15 - pH compris entre 3 et 8, - teneur en sucres totaux comprise entre 10 et 50 g/I. - teneur en composés phénoliques comprise entre 1 et 10 g/I, et Composition en polyphénols: É de 0,3 à 3 % de composés hydroxybenzoïques, É de 5 à 20 % de composés hydroxycinnamiques É de 2 à 25 % de phénols, É de 10 à 40 % de flavanols, É de 10 à 40 /G de flavonols. 10 2887148 15 3. Principe actif selon la revendication 2, caractérisé par les paramètres suivants: - taux de matières sèches compris entre 40 et 60 g/I, - pH compris entre 4,5 et 5,5, - teneur en protéines comprise entre 22 et 34g/l, - teneur en composés phénoliques comprise entre 3 et 5 g/I, et Composition en polyphénols: É 1,3% de composés hydroxybenzoïques, É 13,8% de composés hydroxycinnamiques É 12, 5% de phénols, É 25,9% de flavanols, É 26,6% de flavonols.