Brevet FR2895906A1 — publié le 20070713

PRINCIPE ACTIF ISSU D'ANNONA SQUAMOSA, PROCEDE D'OBTENTION ET UTILISATION COSMETIQUE A VISEE ANTI-AGE La présente invention a trait à un procédé d'obtention d'un principe actif issu d'Annona Squamosa, pour lutter contre le vieillissement de la peau. L'invention se rapporte également au principe actif susceptible d'être obtenu par ce procédé, à son utilisation et aux compositions cosmétiques associées. Le vieillissement cutané est à la fois physiologique, génétiquement programmé, mais aussi lié à l'équilibre hormonal et dépendant de facteurs environnementaux tels que le soleil, la pollution ou encore l'hygiène de vie. Il s'agit d'un phénomène inéluctable qui touche aussi bien femmes et hommes et qui se manifeste notamment par des modifications de la texture cutanée : la 10 peau est plus fine, sèche, ridée et perd son élasticité. L'esthétisme et l'apparence prenant une place de plus en plus importante dans nos sociétés, beaucoup de gens souhaitent modérer et retarder le plus possible ces manifestations visibles du vieillissement de la peau. Actuellement, il existe de nombreux produits qui tentent de masquer les signes 15 du vieillissement cutané. Ces produits ont souvent une action superficielle et ne sont pas efficaces sur tous les types de peaux, en particulier sur les peaux masculines qui sont 25% plus épaisses que celles de femmes. Il subsiste donc un besoin pour un produit avec un pouvoir réparateur élevé capable de contrer les signes du vieillissement et redonner la vigueur d'une peau 20 jeune à tous les types de peau. C'est ce à quoi répond la présente invention en proposant un principe actif issu d'Annona Squamosa qui renforçe la résistance naturelle du derme et restructure la couche cornée, barrière résistante de la peau. La peau est constituée de deux tissus étroitement reliés l'un à l'autre l'épiderme situé en surface, et le derme sous-jacent. Le derme constitue le support solide de la peau. Il est composé de fibroblastes et d'un réseau microfibrillaire, la matrice extracellulaire (MEC), riche en fibres de collagène et en fibres d'élastine qui assurent soutien, extensibilité et résistance. Le derme présente également des fonctions métaboliques, d'échange et de communication intercellulaires essentielles à l'intégrité du tissu cutané. L'homéostasie de la MEC est assurée par l'équilibre métabolique entre la synthèse et la dégradation des fibres de collagène. Lors du vieillissement cutané, cet équilibre est perturbé : l'activité métabolique des fibroblastes est ralentie et le renouvellement des fibres de collagène décroît. La matrice extracellulaire se déstructure et ne peut plus assurer son rôle de support ce qui entraîne une perte rapide de la fermeté et de la tonicité de la peau qui s'affaisse. De fait, le principe actif selon la présente invention se propose de renforcer le rôle de soutien du derme en stimulant la production de collagène, en particulier de collagène I, composant structural majoritaire de la matrice extracellulaire. L'épiderme est la couche superficielle de la peau en contact avec l'extérieur. Formé par plusieurs couches de cellules ayant toutes une morphologie spécifique, il est constitué notamment de kératinocytes qui migrent vers la surface et se différencient pour se transformer progressivement en cornéocytes. La phase terminale de la différenciation conduit à la formation de la couche cornée, barrière résistante et imperméable qui protège la peau des agressions extérieures et assure la résistance mécanique du Stratum Corneum. La cohésion de l'épiderme et le maintien de sa barrière fonctionnelle résultent de l'équilibre entre la différenciation des kératinocytes et le processus de desquamation. Cet équilibre est lié notamment à la caspase-14, protéase proapoptotique, qui intervient à la fois dans la dégradation du noyau lors de la transformation du kératinocyte en cornéocyte, dans la maturation des protéines impliquées dans la cornification du kératinocyte et dans le processus de desquamation. En outre, la prolifération, la migration et la différenciation des kératinocytes sont également dépendants de la communication interkératinocytaire médiée par les jonctions GAP. Une jonction GAP est un canal intercellulaire formé de deux hémi-canaux ou connexons, lesquels sont constitués de six sous-unités protéiques transmembranaires appelées connexines, la principale connexine exprimée dans l'épiderme étant la connexine 43. Lorsque la peau vieillit, le métabolisme des cellules épidermiques est perturbé et 15 la différenciation épidermique diminue fortement. C'est pourquoi, le principe actif selon la présente invention se propose d'agir sur la différenciation épidermique en stimulant l'expression de la caspase-14, et en favorisant la cohésion interkératinocytaire par stimulation de l'expression de la connexine 43, composant majeur des jonctions GAP impliquées dans le 20 communication kératinocyte-kératinocyte. Le principe actif selon la présente invention agit donc sur le vieillissement de la peau : - en renforçant la résistance naturelle du derme par stimulation de la synthèse de fibres de collagène, et 25 - en favorisant la différenciation kératinocytaire par stimulation de l'expression de la caspase-14 et de la connexine 43, de manière à améliorer la cohésion de l'épiderme et le contrôle de l'homéostasie de la fonction barrière. Ainsi, en renforçant le rôle physique de soutien du derme et en favorisant la restructuration de l'épiderme, le principe actif selon l'invention prévient et combat les signes du vieillissement de la peau. Il permet d'atténuer les rides et ridules et d'améliorer les propriétés biomécaniques de la peau en augmentant sa fermeté et sa tonicité. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux appréhender les résultats obtenus regroupés en tableaux. 1/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : Le procédé d'obtention du principe actif selon l'invention comprend la succession des étapes suivantes : - solubilisation sélective de poudre d'Annona Squamosa dans l'eau, préférentiellement de graines, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées et/ou successives, 15 - séparation des phases soluble et insoluble, - inactivation enzymatique par traitement thermique, -purification et concentration de la fraction active, et - filtration stérilisante. 20 2/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : 2-1/ Matières sèches : On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C en présence de sable d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. 25 Le taux de matières sèches est compris entre 10 et 60 g/I, plus particulièrement entre 33 et 46 g/I. 2-2/ Mesure du pH : Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante conduit à des valeurs comprises entre 3 et 7 , plus particulièrement entre 4,5 et 5,5. 2-3/ Détermination de la teneur en sucres totaux : On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres 10 réducteurs donnent un composé coloré jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 3 à 21 g/I, préférentiellement de 10 à 16 g/I. 15 2-4/ Détermination de la teneur en protéines Le taux de protéines est obtenu par la méthode de LOWRY. Les résultats donnent une teneur en protéines de 4 à 23 g/I, plus particulièrement 12 à 18 g/I. 2-5/ Caractérisation des carbohydrates 20 Les échantillons sont analysés selon la méthode de Kamerling et al. modifiée par Montreuil et al.. Cette méthode repose sur l'obtention de méthyl-glycosides triméthylsylilés par une méthanolyse suivie d'une pertiméthylsylilation à partir des monosaccharides constituant l'échantillon étudié. 25 Les méthyl-glycosides triméthylsylilés obtenus sont analysés par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats sont exprimés en pourcentage molaire après correction des aires des pics chromatographiques par des facteurs de correction. L'analyse est réalisée par chromatographie liquide haute performance. 2-5-1/ Dosage de sucres simples : Le taux de sucres simples est réparti en 65,7% de glucose, en 10,5% de xylose, en 9,5% de mannose, en 8,5% de galactose, et en 5,8% d'arabinose. 2-5-2/ Degré de polymérisation Le tableau ci-dessous montre que la fraction glucidique du principe actif selon la présente invention comprend essentiellement du glucose, du xylose, du mannose, du galactose et de l'arabinose sous forme de monosaccharides, d'oligosaccharides et de polysaccharides de degré de polymérisation supérieur ou égal à 7. Degré de Taux de carbohydrates polymérisation (%) Monosaccharides 1 60,6 Oligosaccharides 5 1,7 Oligosaccharides et polysaccharides > 7 41,7 2-6/ Caractérisation de la fraction protéique La masse molaire des différentes espèces moléculaires présentes dans le principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est déterminée par FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). Des marqueurs permettent de servir d'étalons et on constate que le principe actif selon l'invention est composé d'une fraction peptidique de 20 masse moléculaire inférieure à 29 KDaltons. 3/EVALUATION DE L'EFFET ANTI-AGE DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION 3-1/ Eudes in vitro 3-1-1/Evaluation de l'effet sur la synthèse de collagène Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur l'expression des ARNm (Acide Ribonucléique messager) codant pour le collagène I. L'étude est réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction ou Amplification en chaîne par Polymérase) quantitative sur des fibroblastes humains normaux (provenant de donneurs masculins). A JO les fibroblastes humains normaux sont ensemencés et incubés à 37 C. A J2, les cellules sont traitées avec le principe actif selon l'invention à 0,25%, 0,50% et 1% ou avec de la vitamine C à 1 g/ml, molécule de référence, avant d'être incubées à 37 C. A J4, les cellules sont récupérées et les ARN (AcideRiboNucléique) totaux sont extraits. Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus sont analysés. Les résultats obtenus, exprimés en pourcentage d'ARNm (ARN messager) du collagène I exprimés, sont présentés dans le tableau suivant : Taux d'ARNm du collagène I (%) Témoin 100 Vitamine C à 1 g/ml 200 Principe actif selon l'invention à 0,25% 103 Principe actif selon l'invention à 0,50% 124 Principe actif selon l'invention à 1% 138 On constate que le principe actif selon l'invention augmente la synthèse des ARNm du collagène I de 38% sur fibroblastes humains normaux. 3-1-2/Evaluation de l'effet sur la différenciation kératinocytaire Le but de cette étude est d'évaluer la capacité du principe actif selon l'invention à augmenter l'expression des ARNm codant pour la caspase-14, protéine impliquée dans la différenciation terminale des kératinocytes. L'étude est réalisée par PCR quantitative sur des kératinocytes humains normaux (provenant de donneurs masculins) selon le protocole opératoire qui suit. A JO, les cellules sont ensemencées puis incubées à 37 C. A J3, les kératinocytes sont traités avec le principe actif selon l'invention à 0,50% et 1% ou avec du Nacétylglucosamine à 75mM, molécule de référence, avant d'être incubés à 37 C. A J6, les cellules sont récupérées et les ARN totaux extraits. Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus sont analysés. Les résultats sont exprimés dans le tableau qui suit en pourcentage d'ARNm de caspase-14 : Taux d'ARNm de caspase-14 (%) Témoin 100 N-acetylglucosamine 75mM 276 Principe actif selon l'invention à 0,50% 201 Principe actif selon l'invention à 1% 264 Ces résultats montrent que le principe actif selon l'invention dosé à 1% augmente la synthèse des ARNm de caspase-14 de 164% sur fibroblastes humains normaux. 3-1-3/Evaluation de l'effet sur la cohésion interkératinocytaire L'objectif de l'étude est d'évaluer la capacité du principe actif selon l'invention à augmenter l'expression des ARNm codant pour la connexine-43, composant majeur des jonctions GAP, responsables de la cohésion et de la communication cellule-cellule. L'étude est réalisée par PCR quantitative sur des kératinocytes humains normaux (provenant de donneurs masculins). Le protocole opératoire est le suivant. A JO, les kératinocytes sont ensemencés puis incubés à 37 C. A J3, les kératinocytes sont traités avec le principe actif selon l'invention à 0,50% et 1% ou avec du Nacétylglucosamine à 75mM, molécule de référence, avant d'être incubés à 37 C. A J6, les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits. Les ARN sont reverses-transcripts et les ADN complémentaires sont analysés. Les résultats, présentés dans le tableau suivant, montrent que le principe actif selon l'invention dosé à 1% augmente la synthèse des ARNm de la connexine 43 de 42% sur kératinocytes humains normaux : Taux d'ARNm de connexine 43 (%) Témoin 100 N-acetylglucosamine 75mM 175 Principe actif selon l'invention à 0,50% 128 Principe actif selon l'invention à 1% 142 3-2/ Etudes in vivo 3-2-1/Evaluation de l'effet sur les propriétés biomécaniques de la peau Cette étude a pour objectif de quantifier l'efficacité du principe actif selon l'invention formulé à 4% en émulsion contre placebo sur les propriétés biomécaniques de la peau. L'étude est réalisée sur des volontaires sains de sexe masculin, d'âge compris entre 34 et 77 ans. Les mesures sont réalisées au niveau du visage à l'aide d'un cutomètre. Le cutomètre est un appareil de mesure qui aspire la peau et permet de calculer divers paramètres caractéristiques des propriétés mécaniques cutanées : - La tonicité de la peau est appréciée par le paramètre -X qui correspond à la tonicité ou rétractation élastique ; si X diminue, la tonicité augmente. - La fermeté est appréciée par le paramètres -RO qui correspond à la fermeté ou élongation totale ; si RO diminue, la fermeté augmente. L'étude est réalisée selon le protocole opératoire qui suit. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau du visage de chaque volontaire, une destinée au placebo, l'autre à l'émulsion contenant le principe actif obtenu, et on mesure les propriétés biomécaniques de la peau sur ces deux zones. Entre JO et J27, l'actif et le placebo sont appliqués biquotidiennement. A J28, on mesure les propriétés mécaniques de la peau sur les mêmes zones qu'à JO. a. Tonicité de la peau Les résultats obtenus pour le paramètre X sont les suivants : 10 Ces résultats montrent qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'invention augmente la tonicité de la peau de 25%. b. Fermeté de la peau 15 Les résultats obtenus pour le paramètre RO sont les suivants : Ces résultats montrent qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes et en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'invention augmente la fermeté de la peau de 12%. Placebo Principe actif selon l'invention JO J28 JO J28 Moyenne des volontaires 0,654 0,712 0,679 0,556 Variation (Principe actif/placebo en %) -25 Placebo Principe actif selon l'invention JO J28 JO J28 Moyenne des volontaires 1,124 1,097 1,141 0,975 Variation (Principe actif/placebo en %) -125 3-2-2/Etude des propriétés anti-rides Le but de cette étude est de quantifier l'efficacité anti-rides du principe actif selon l'invention formulé à 4% en émulsion contre placebo. L'étude est réalisée sur des volontaires sains de sexe masculin, d'âge compris entre 34 et 77 ans. L'efficacité anti-rides est mesurée par l'intermédiaire d'empreintes siliconées réalisées au niveau des pattes d'oie des volontaires. L'analyse de ces empreintes à l'aide d'un prof ilomètre muni d'un analyseur d'images permet d'obtenir trois paramètres : le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. L'étude est réalisée selon le protocole ci-dessous. A JO, on détermine deux zones cutanées symétriques au niveau des pattes d'oie, une destinée à être traitée par le placebo, l'autre par le principe actif, et on prend les empreintes sur ces deux zones. Entre JO et J27, le principe actif et le placebo sont appliqués deux fois par jour. A J28, les empreintes sont prises sur les deux zones étudiées. Les résultats obtenus pour le principe actif par rapport à ceux obtenus pour le placebo sont exprimés en pourcentage dans le tableau qui suit . Variation/Placebo (%) Nombre de rides -9 Surface totale ridée -9 Longueur totale -12 On constate qu'après 28 jours d'applications biquotidiennes en comparaison au placebo, le principe actif obtenu selon l'invention formulé à 4% en émulsion diminue à la fois le nombre de rides, la surface totale ridée et la longueur totale des rides. 4/ COMPOSITION COSMETIQUE INCLUANT LE PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant le principe actif selon la présente invention dans différentes formes galéniques, notamment gel, émulsion,.... Il convient alors d'analyser la stabilité des formes galéniques incluant le principe actif selon l'invention, ceci dans des proportions comprises entre 0,1 et 10 %. La stabilité est caractérisée par une absence de précipitation de l'actif, une absence de crémage et une absence de déphasage. On peut citer des formulations ayant montré une stabilité physique incluant 5% 15 de principe actif selon l'invention. - Carbopol : 0,5% avec Triéthanolamine : qsp pl-I=6,5 - Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% - Eau:93,8% - Sépigel 305: 2,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% - Eau:92,3% - Montanov 202: 3,0% - Isopropyl palmitate : 12,0% - Phénonip : 0,7% - Sépigel 305: 2% Gel limpide : 20 Gel opaque : 25 Gel émulsionné : - Principe actif : 5,0% - Eau : 77,3% Emulsion non ionique : - Montanov 202 : 3,0% - Simulsol 165: 2,0% - Isopropyl palmitate : 20,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif : 5,0% - Eau : 69,3% Emulsion anionique : - Acide stéarique : 7,0% - Triethanolamine : 3,5% - Isopropyl palmitate : 20,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% - Eau:63,8% Emulsion cationique : - Quaternium-82 : 5,0% - Alcool cétylique : 3,0% -Isopropyl palmitate : 15,0% - Phénonip : 0,7% - Principe actif 5,0% - Eau : 71,3% De plus, des tests ont montré la compatibilité du principe actif avec les matières premières utilisées en cosmétique. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir d'Annona Squamosa pour incorporation à une composition cosmétique destinée à lutter contre le vieillissement cutané. 2. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir d'Annona Squamosa selon la revendication 1, pour lutter contre l'apparition des rides et améliorer les propriétés biomécaniques de la peau. 3. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir d'Annona Squamosa selon la revendication 1, pour stimuler la synthèse des fibres de collagène 1 et renforcer le rôle de soutien du derme. 4. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir d'Annona Squamosa selon la revendication 1, pour stimuler la synthèse de la caspsase-14 et augmenter la différenciation épidermique. 5. Utilisation d'un principe actif obtenu à partir d'Annona Squamosa selon la revendication 1, pour stimuler la synthèse de la connexine 43 et favoriser la cohésion interkératinocytaire. 6. Procédé d'obtention d'un principe actif pour lutter contre le vieillissement cutané, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - solubilisation d'Annona Squamosa dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanées et/ou successives, - séparation des phases soluble et insoluble, - inactivation enzymatique, - purification et concentration de la fraction active, et - filtration stérilisante. 7. Procédé d'obtention selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de solubilisation consiste en une solubilisation sélective de poudre de graines de d'Annona Squamosa dans l'eau. 8. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'inactivation des enzymes est assurée par traitement thermique. 9. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 6, 7 ou 8, caractérisé par les paramètres suivants - taux de matières sèches compris entre 10 et 60 g/I, - pH compris entre 3 et 7, - teneur en sucres totaux comprise entre 3 et 21 g/I, et - teneur en protéines comprise entre 4 et 23 g/I. 10. Principe actif selon la revendication 9, caractérisé par les paramètres suivants : - taux de matière sèche compris entre 33 et 46 g/I, - pH compris entre 4,5 et 5,5, - teneur en sucres totaux comprise entre 10 et 16 g/I, - teneur en protéines comprise entre 12 et 18 g/I, - fraction peptidique de masse moléculaire inférieure à 29 Kbaltons, et - présence de carbohydrates sous forme de glucose, de xylose, de mannose, de galactose et d'arabinose. 11. Composition cosmétique incluant le principe actif selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un gel limpide, d'un gel opaque, d'un gel émulsionné, d'une émulsion non ionique, d'une émulsion anionique ou d'une émulsion cationique et en ce que le principe actif est dosé entre 0,1% et 107..