Brevet FR2895994A1 — publié le 20070713

Promoteurs de gènes intervenant dans la tolérance au stress salin La salinité est l'un des plus sévères facteurs environnementaux limitant la productivité des cultures agricoles. Bien que la salinité des sols soit largement antérieure à l'agriculture, le problème a été aggravé par les pratiques de l'agriculture, telle que l'irrigation. A l'heure actuelle, environ 20% des surfaces cultivées dans le monde et presque la moitié des surfaces irriguées sont touchées par la salinité. En plus d'un énorme coût financier, la salinité a d'autres impacts sérieux sur l'infrastructure, les réserves en eau, et sur la structure sociale et la stabilité des communautés humaines. Les réponses à la salinisation ont été de deux ordres : (i) introduire une gestion de l'environnement afin de contrôler l'augmentation de sel dans le sol, grâce à l'aménagement de l'irrigation et du drainage, (ii) utiliser l'ingénierie génétique sur les plantes afin d'augmenter leur tolérance au sel. La présente invention concerne le second axe consistant à rechercher et à comprendre les mécanismes qui permettent à certaines plantes de mieux tolérer le sel et le stress en général, pour développer des stratégies rendant les plantes cultivées plus tolérantes au sel ou à d'autres stress. Les plantes fixées à leur substrat sont soumises, tout au long de leur vie, à de nombreuses variations des conditions environnementales auxquelles elles doivent faire face en adaptant leur croissance et leur développement. Les stress abiotiques correspondent à des modifications importantes de facteurs chimiques ou physiques de l'environnement, alors que les stress biotiques sont induits par une interaction entre la plante et un organisme vivant. Les facteurs abiotiques, qui affectent particulièrement les rendements des cultures, sont le stress hydrique (sécheresse ou surplus d'eau), les modifications extrêmes de température, les déficits en éléments minéraux du sol et la forte concentration en sels ou en métaux lourds dans le sol. Le stress salin provoqué par une concentration trop importante en NaCl dans l'environnement de la plante entre donc dans la catégorie des stress abiotiques. Bien que le Na+ soit nécessaire pour quelques plantes, particulièrement pour les halophytes, une forte concentration en NaCl est un facteur limitant, voire toxique, pour la croissance des plantes. Ce phénomène est répandu sur de grandes surfaces arables du monde entier. En réponse aux stress environnementaux, les plantes ont développé un panel de stratégies physiologiques et biochimiques, pour s'adapter ou du moins tolérer les conditions de stress. Ces stratégies sont liées à des modifications de l'expression génique, comme il a été mis en évidence par des changements dans les quantités d'ARNm et de protéines nouvellement synthétisées. Les gènes identifiés codent pour des protéines associées à de nombreuses fonctions telles que la compartimentation des ions, l'équilibre du potentiel redox, la dégradation ou la protection des protéines, la synthèse d'osmolytes. De nombreuses études ont été menées en rapport avec les molécules nommées osmolytes , parce que leur synthèse est 1 augmentée dans grand nombre de stress abiotiques (Hasegawa et al. 2000a et b). Ces molécules peuvent s'accumuler à de forts taux dans la réponse au sel (ou dans le stress osmotique) permettant ainsi de restaurer l'équilibre en eau dans la cellule. Il a été proposé que le génie métabolique puisse jouer un rôle majeur dans l'augmentation de la tolérance des plantes au stress. Il a été montré que des plantes transformées pour exprimer des enzymes conduisant à la synthèse de certains osmolytes étaient plus résistantes au stress salin que des plantes non transformées (Tarczinsky et al., 1993, Shen et al., 1997a et b), confirmant ainsi l'importance des osmolytes. Cependant, certains de ces résultats sont sujet à controverse dans la mesure où les taux d'osmolytes dans les plantes transgéniques étaient trop faibles pour expliquer un effet osmotique (Karakas et al., 1997). Cet effet a donc été attribué à un rôle anti-oxydant plutôt qu'à un rôle purement d'osmolyte. La synthèse de tels osmolytes a lieu dans des tissus sources ou s'appuie sur des molécules dérivant de photoassimilats. Par conséquent, le transport sur des longues distances des photoassimilats dans le phloème est certainement affecté durant le stress salin, bien que peu de données soient disponibles sur ce point (Noiraud et al. 2000). La sève élaborée du phloème transporte également une large gamme d'ions, de métabolites et de macromolécules telles que des protéines et des acides nucléiques, dont un grand nombre est impliqué dans la signalisation. Le phloème peut donc être considéré comme l'acteur majeur de la communication entre tissus dans les plantes vasculaires (Ruiz-Medrano et al., 2001). Cependant, à ce jour, les connaissances sur les gènes spécifiquement exprimés dans le phloème sont peu nombreuses malgré les récents travaux sur différents modèles de plantes (Vilaine et al., 2003). Les connaissances sur les promoteurs de ces gènes, notamment sur leurs propriétés phloème-spécifique et inductible par le stress, sont encore moins nombreuses voire inexistantes. En l'absence de telles connaissances, il n'est donc pas possible de mettre une quelconque séquence codante sous le contrôle d'un promoteur qui permette de n'exprimer cette séquence codante que dans des conditions de stress, préférentiellement dans le phloème. Les présents inventeurs ont maintenant déterminé la séquence de trois promoteurs, dont l'activité est préférentiellement dans les tissus vasculaires et plus particulièrement le phloème, cette activité étant également fonction des conditions de stress de la cellule. Les inventeurs ont également réalisé des constructions à l'aide de ces promoteurs, permettant de n'exprimer des séquences d'intérêt que dans des conditions de stress, préférentiellement dans le phloème. En conséquence, la présente demande concerne, selon un premier aspect de l'invention, une séquence d'acides nucléiques ayant une activité de promoteur transcriptionnel, telle que ladite séquence comprend SEQ ID N 1, 2 ou 3, ou bien un fragment ou des fragments (ou parties) d'au moins l'une de ces séquences. Un fragment ou une partie de SEQ ID N 1, 2 ou 3 est défini comme une séquence comprenant au moins 30 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3. Une partie de SEQ ID N 1, 2 ou 3 peut ne contenir que 30 nucléotides, mais elle peut contenir avantageusement au moins 50 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3, par exemple 2 exactement 50, ou plus de 50, ou bien plus de 75, 80 ou 90. Une partie peut également contenir plus de 100 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3, notamment 120, 150 voire 180 ou 200. Selon la présente invention, des parties de SEQ ID N 1, 2 ou 3 qui sont préférées sont des fragments correspondant à la quasi-totalité de SEQ ID N 1, 2 ou 3, avec uniquement la délétion de 1 à 10, 20, 30 ou 50 nucléotides, aux extrémités 3' et/ou 5' ou bien au sein des séquences SEQ IDN 1,2ou3. II est également envisagé qu'une séquence selon l'invention comprenne au moins deux fragments de SEQ ID N 1, 2 ou 3, l'un au moins desdits fragments ayant une longueur minimale de 30 nucléotides. Les différents fragments peuvent être des fragments issus de séquences distinctes, par exemple un fragment de SEQ ID N 1 et un fragment de SEQ ID N 2, ou bien des fragments de la même séquence. Dans ce derniers cas, les fragments sont de préférence non consécutifs, par exemple séparés de 2, 10, 20 ou 50 nucléotides. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, une séquence selon l'invention comprend ou consiste en l'intégralité de l'une des séquences SEQ ID N 1, 2 ou 3. Par séquence ayant une activité de promoteur transcriptionnel, on entend une séquence présentant une activité promotrice, c'est-à-dire de nature à promouvoir la transcription d'une séquence placée en aval de ladite séquence promotrice, éventuellement en présence de cofacteurs adéquats. Une telle activité de promoteur transcriptionnel peut être testée en clonant une séquence susceptible de présenter une telle activité en amont d'une séquence à transcrire quelconque, en présence d'ARN polymérase et de ribonucléotides. Si on obtient des molécules d'ARN, alors qu'aucune molécule d'ARN n'est obtenue en l'absence de clonage de la séquence à tester, on peut alors en déduire que ladite séquence à tester présente une activité de promoteur transcriptionnel. Un test adéquat est décrit dans la partie expérimentale. Le site d'initiation de la transcription peut se trouver ou bien au sein d'une séquence selon l'invention, ou bien à l'extrémité 3' d'une séquence selon l'invention ou en aval côté 3' d'une séquence selon l'invention. Dans le premier cas, une partie de la séquence selon l'invention est transcrite. En sus de tout ou partie de l'une des séquences SEQ ID N 1, 2 ou 3, une séquence selon l'invention peut également contenir des séquences additionnelles, dans la mesure où elles ne suppriment pas la propriété de promoteur transcriptionnel. De telles séquences additionnelles peuvent notamment être des enhancers , ou d'autres séquences telles que des sites de fixation pour différentes protéines. Ladite activité de promoteur transcriptionnel peut se manifester dans tout type de cellule, in vivo, et/ou également in vitro en solution, en présence d'ARN polymérase et de tous les éléments nécessaires à la transcription, notamment en présence de ribonucléotides. Avantageusement, une séquence selon la présente invention présente une activité promotrice ubiquitaire, c'est-à-dire tant dans des cellules procaryotes qu'eucaryotes, dans des cellules végétales ou animales, ou en présence d'une ARN polymérase d'une de ces cellules. Une 3 séquence selon la présente invention est de préférence active comme promoteur dans des cellules végétales, ou bien en présence d'une ARN polymérase issue d'une cellule végétale. Une propriété préférée d'une séquence selon l'invention est sa capacité à promouvoir la transcription dans une cellule végétale en réponse à un stimulus. Ledit stimulus est de préférence un stimulus lié à un stress. De préférence, l'activité de promoteur transcriptionnel possédée par une séquence selon l'invention est sensible à un stress biotique ou abiotique ; cette activité est induite ou bien augmentée sous conditions de stress biotique ou abiotique. On appelle stress biotique le stress d'une plante qui est induit par une interaction entre la plante et un organisme vivant, par exemple lors d'une attaque de pucerons. Les stress abiotiques quant à eux correspondent à des modifications importantes de facteurs chimiques ou physiques de l'environnement. Les facteurs abiotiques, qui affectent particulièrement les rendements des cultures, sont le stress hydrique (sécheresse ou surplus d'eau), les modifications extrêmes de température, les déficits en éléments minéraux du sol et la forte concentration en sels ou en métaux lourds dans le sol Le stress peut être ressenti au niveau cellulaire, ou au niveau d'un organe de la plante, ou bien au niveau de l'organisme dans son entier. L'activité transcriptionnelle d'une séquence selon l'invention peut également être induite lorsque certaines composantes ou conditions liées au stress sont reproduites. Par exemple, l'activité transcriptionnelle d'une séquence selon l'invention peut être induite suite à la présence de certains facteurs qui sont liés au stress, tels que des protéines de stress. Selon une mise en oeuvre préférée, une séquence selon l'invention présente une activité de promoteur transcriptionnel préférentiellement dans les tissus vasculaires. Des tissus vasculaires tout particulièrement concernés sont le phloème etlou le xylème, mais de préférence le phloème. L'activité de promoteur transcriptionnel présentée par une séquence selon l'invention se manifeste de préférence dans des cellules végétales et tout particulièrement dans des cellules de céleri, Apium graveolens L. Les séquences selon l'invention comprennent SEQ ID N 1, 2 ou 3 ou bien un ou des fragments (ou parties) d'au moins l'une de ces séquences. De préférence, les séquences selon l'invention consistent en l'une des séquences suivantes : SEQ ID N 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou bien elles comprennent l'une de ces séquences. SEQ ID N 4 est une séquence comprenant SEQ ID N 1, SEQ ID N 5 est une séquence comprenant SEQ ID N 2 et SEQ ID N 6 est une séquence comprenant SEQ ID N 3. Selon un second aspect de la présente invention, une séquence selon l'invention peut également être une séquence qui présente au plus 5 mutations ponctuelles par rapport à une séquence telle que définie précédemment selon le premier aspect, c'est-à-dire par rapport à une séquence comprenant SEQ ID N 1, 2 ou 3 ou bien un ou des fragments (ou parties) d'au moins l'une des séquences SEQ ID N 1, 2 ou 3, où ledit fragment comprend au moins 30 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3. 4 Une séquence selon ce second aspect de l'invention peut présenter par exemple une unique mutation par rapport à une séquence selon le premier aspect, mais de préférence au moins deux mutations ponctuelles, voire 3, 4 ou 5 mutations ponctuelles. Par mutation ponctuelle, on entend une seule modification d'un unique acide nucléique, ladite modification pouvant être la suppression d'un acide nucléique par rapport à la séquence sans mutation, ou bien l'addition d'un acide nucléique par rapport à la séquence sans mutation ou bien la modification d'un acide nucléique par rapport à la séquence sans mutation. Par modification d'un acide nucléique, on entend à la fois la substitution d'un acide nucléique par un autre acide nucléique naturel (par exemple substitution de A en G) et la modification chimique d'un acide nucléique naturel (par exemple le remplacement d'une adénine en 2-méthyl adénosine ou en 4-acétylcytidine). Les différents acides nucléiques modifiés susceptibles d'être incorporés dans une séquence selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier. Selon une mise en oeuvre particulière, une mutation peut être introduite afin de supprimer 15 l'activité de promoteur transcriptionnel d'une séquence selon le premier aspect de l'invention, ou bien pour en modifier ses caractéristiques. De préférence, une séquence selon ce second aspect de l'invention présente au plus 5 mutations ponctuelles par rapport à une séquence comprenant un fragment de SEQ ID N 1, 2 ou 3 d'au moins 40 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 50 nucléotides 20 consécutifs. Une séquence selon ce second aspect de l'invention peut également posséder une activité de promoteur transcriptionnel, mais pas nécessairement. Les mutations introduites par rapport à la séquence selon le premier aspect de l'invention peuvent permettre de modifier l'activité de promoteur d'une telle séquence, par exemple en en modifiant son taux d'initiation par seconde, 25 ou bien en en modifiant sa spécificité cellulaire ou les conditions d'initiation de la transcription. Selon un troisième aspect, la présente invention concerne également une séquence d'acides nucléiques qui présente une activité de promoteur transcriptionnel et qui possède au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6. De préférence, le pourcentage d'identité est supérieur à 30 70%, c'est-à-dire au moins 75 ou 80%, mais de préférence au moins 85 ou 90% d'identité, voire au moins 95% d'identité. Des séquences également envisagées présentent 97%, 98%, 99%, voire 99,5% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N 1 à 6. Le pourcentage d'identité entre deux séquences S1 et S2 d'acides nucléiques se calcule en alignant les deux séquences de telle manière à maximiser les séquences communes, 35 éventuellement par l'insertion de trous ( gap ), puis en divisant le nombre total d'acides nucléiques communs par le nombre d'acides nucléiques de la séquence la plus longue. Un fort pourcentage d'identité se traduit également par l'hybridation des séquences S1 et S2 monocaténaires dans des conditions de forte stringence. Les conditions assurant une forte stringence sont bien connues de l'homme du métier. En effet, la stringence est définie par les 40 conditions expérimentales de température, de pH et de force ionique permettant l'hybridation 5 moléculaire. Deux paramètres conditionnent notamment la stringence : la température et la concentration en sel. Des conditions de haute stringence correspondent par exemple à une haute température (au-dessus du Tm) et/ou faible force ionique, afin de favoriser les appariements spécifiques. Des conditions de forte stringence peuvent être illustrées, à titre d'exemple, par un milieu ayant les propriétés décrites dans la partie expérimentale. Par séquence selon l'invention , on désigne aussi bien une séquence selon le premier, le deuxième ou bien le troisième aspect de l'invention. Une séquence selon l'invention peut être notamment de l'ADN double brin, mais également de l'ADN simple brin ou bien de l'ADN partiellement double-brin. Par ailleurs, une séquence selon l'invention peut avoir des topologies très variées, il peut également s'agir d'ADN circulaire, éventuellement surenroulé. La présente invention concerne également une séquence complémentaire de l'une des séquences précédemment décrites. Une séquence selon l'invention peut être utilisée dans divers domaines techniques et tout particulièrement en agriculture, notamment dans le secteur des plantes transgéniques. L'invention concerne également des sondes d'acides nucléiques telles que lesdites sondes sont capables de s'hybrider dans des conditions de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1, 2 et 3. Une sonde telle que mentionnée comprend au moins 25 nucléotides, de préférence au moins 30. En règle générale toutefois, les sondes d'acides nucléiques comprennent moins de 150 et même moins de 100, voire moins de 50 acides nucléiques. De telles sondes peuvent permettre d'identifier des séquences homologues à l'une des séquences SEQ ID N 1, 2 ou 3 dans différents organismes, ou bien permettre de détecter la présence de l'une de ces séquences, in vitro ou in vivo. De telles sondes peuvent être des sondes ADN ou ARN, simple ou double brin. Elles peuvent être utilisées par exemple comme amorces dans des expériences de PCR ou bien dans un Southern Blot. La présente invention porte également sur un construit d'ADN, ou construction d'ADN, qui est constitué de ou bien comprend une séquence ayant une activité promotrice telle que décrite précédemment et qui comprend aussi une séquence d'acides nucléiques à transcrire. Le construit selon l'invention est réalisé de telle manière que la séquence d'intérêt à transcrire est située en aval de la séquence promotrice, c'est-à-dire à l'extrémité 3' de la séquence promotrice, et la transcription de la séquence d'intérêt est dirigée par la séquence promotrice. La séquence selon l'invention et la séquence à transcrire peuvent être contiguës ou bien peuvent être séparées par des acides nucléiques intercalaires. Dans ce dernier cas, la séquence intercalaire comprend de préférence moins de 200, voire moins de 50 ou moins de 20 nucléotides. 6 Un construit selon l'invention peut également comprendre des séquences permettant la terminaison de la transcription, voire également des séquences permettant la terminaison de la traduction (codon stop). On dit que la transcription d'une séquence d'acides nucléiques est dirigée par un promoteur quand ledit promoteur permet la transcription de la séquence et qu'il contrôle cette transcription. La séquence d'intérêt est donc transcrite dans des conditions et à un taux qui est fonction du promoteur. Il est donc possible, à l'aide de l'enseignement de l'invention, de placer une séquence d'intérêt sous le contrôle d'une séquence promotrice de l'invention afin que ladite séquence d'intérêt soit transcrite uniquement dans des conditions de stress, par exemple uniquement dans des conditions de stress salin dans des cellules de plantes. Du fait des propriétés spécifiques des séquences promotrices de l'invention, il est donc possible d'obtenir la transcription d'une séquence d'intérêt préférentiellement dans des cellules vasculaires, et préférentiellement dans des conditions de stress. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la séquence promotrice et la séquence d'intérêt à transcrire qui se trouvent au sein dudit construit, sont hétérologues l'une par rapport à l'autre. Par hétérologues, on entend qu'elles proviennent de sources différentes, par exemple d'organismes différents. On dira également que deux séquences sont hétérologues quand l'une au moins des deux séquences est artificielle (c'est-à-dire non présente dans la nature). Le construit comprenant une séquence à transcrire hétérologue par rapport à une séquence promotrice selon l'invention comprend donc un gène chimère ou gène chimérique. De préférence, la séquence à transcrire est autre que la séquence à transcrire naturellement associée à la séquence promotrice selon l'invention. Selon une mise en oeuvre toute préférée, la séquence d'intérêt à transcrire est une séquence codante, qui donc non seulement est à transcrire, mais également à traduire. Il peut s'agir d'une séquence intégralement codante, par exemple une séquence d'ADNc, ou bien d'une séquence partiellement codante, par exemple une séquence comprenant des introns et des exons. La protéine ou le peptide codé par une telle séquence d'intérêt peut être par exemple une protéine de résistance à un herbicide ou à un antibiotique, ou bien un facteur de croissance, un facteur de résistance au stress, une protéine toxique ou létale. En fonction de ses besoins, l'homme du métier saura quelle séquence d'intérêt placer sous le contrôle d'un promoteur selon l'invention. II s'agit de préférence de séquences codant pour des peptides d'intérêt dans le domaine végétal, notamment de peptides ou protéines ayant une activité dans des cellules végétales, ou bien ayant un intérêt nutritionnel ou esthétique. II peut s'agir également de protéines létales, permettant de supprimer toute plante ayant subi un stress. Il peut également s'agir d'une protéine ou d'un peptide permettant la détection de cellules l'exprimant. Par construit d'ADN, dans le cadre de la présente invention, on entend tout support d'ADN non naturel. Un tel construit peut être notamment un vecteur permettant le transfert du construit dans une cellule. Le construit est de préférence un vecteur, par exemple un vecteur viral mais de préférence un vecteur plasmidique ou plasmide. Un plasmide avantageux dans le cadre de 7 la présente invention est le plasmide Ti des agrobactéries, ou un plasmide dérivé du plasmide Ti, ayant conservé les propriétés de transfert d'ADN, mais dépourvu de gènes oncogènes. Un plasmide selon la présente invention peut comprendre, en plus de la séquence promotrice selon l'invention et d'une séquence d'intérêt à transcrire, des gènes de résistance permettant notamment de faire des sélections positives ou négatives. Lesdits gènes de résistances peuvent être des gènes de résistances à des herbicides ou bien à des antibiotiques. Il peut également être avantageux que le construit ou le plasmide selon l'invention comprenne des gènes de résistance bactériens, par exemple pour faciliter des étapes antérieures de multiplication en bactéries. L'invention concerne également une cellule de plante qui a été transformée par une séquence selon l'invention ou par un construit tel que décrit précédemment, notamment par un construit comprenant une séquence à transcrire hétérologue par rapport à une séquence promotrice selon l'invention, quel que soit le moyen employé pour effectuer la transformation. En effet, à l'heure actuelle, des moyens très divers sont connus pour permettre la transformation de cellules par une séquence d'acides nucléiques. On peut citer, à titre d'exemple, la transformation par électroporation, par bombardement et par l'utilisation d'agrobactéries. II est évident que, en fonction du type de cellules à transformer et de l'espèce en question, notamment selon l'espèce végétale, certaines techniques sont préférées à d'autres. L'homme du métier connaît, pour chaque type cellulaire, quelles sont les techniques les plus appropriées pour effectuer une transformation. De même, il est bien connu de l'homme du métier quelles sont les techniques qui permettent d'obtenir une transformation transitoire de la cellule, le matériel génétique transféré étant perdu par la suite, et quelles sont les techniques qui permettent l'intégration de la séquence transférée de manière stable, dans le génome de la cellule. Par génome de la cellule, on entend aussi bien le génome nucléaire que le génome chloroplastique ou mitochondrial. De préférence, il s'agit du génome nucléaire. La cellule peut être tout type de cellule, procaryote ou eucaryote, bien que les cellules eucaryotes soient préférées dans le cadre de la présente invention. Une cellule selon l'invention est également de préférence une cellule végétale, mais il peut également s'agir d'une cellule bactérienne, d'une cellule animale, par exemple de mammifère ou de tout autre type de cellule, par exemple une cellule de levure. De préférence, il s'agit d'une cellule de plante d'intérêt agronomique. La présente invention concerne également une plante transgénique comprenant dans son génome une séquence selon l'invention, ladite séquence étant de nature exogène. On entend par plante transgénique et séquence exogène que la séquence selon l'invention a été transférée de manière délibérée à la plante et que ladite séquence n'était pas présente naturellement auparavant dans la plante. Une plante transgénique selon l'invention peut également comprendre un construit tel que décrit, notamment un construit comprenant une séquence à transcrire hétérologue par rapport à 40 une séquence promotrice selon l'invention. 8 Une plante transgénique selon l'invention comprend donc dans son génome une séquence (ou un construit) de l'invention ; de préférence, ladite séquence (ou construit) est insérée dans le génome nucléaire de toute cellule de la plante, mais l'invention comprend également les situations dans lesquelles la séquence est insérée dans le génome mitochondrial ou dans le génome chloroplastique. Il est également possible de maintenir la séquence ou le construit selon l'invention de manière extrachromosomale. La séquence (ou le construit comprenant ladite séquence) est insérée de préférence de manière stable, bien qu'il soit également envisageable de l'insérer de manière transitoire. La présente invention concerne également des plantes transgéniques comprenant des cellules transformées comme décrites précédemment. De préférence, la totalité des cellules d'une plante transgénique selon l'invention comprend une séquence ou un construit selon l'invention. Il est également envisageable que seules certaines parties de ces plantes comprennent de telles cellules transformées, par exemple lorsqu'il s'agit de plantes chimériques ou du fait de l'excision du transgène dans certaines cellules. L'invention porte aussi sur des parties desdites plantes transgéniques. Des parties particulièrement intéressantes sont notamment les fruits, les fleurs, les racines, les tiges, les feuilles, mais également les semences, les bourgeons, les graines et le matériel de reproduction, dont lematériel de reproduction mâle et le matériel de reproduction femelle, ainsi que le cal, lesdites parties selon l'invention ayant des cellules transformées comprenant une séquence ou un construit selon l'invention. De préférence, elles comprennent un construit comprenant une séquence à transcrire hétérologue par rapport à une séquence promotrice selon l'invention. Lesdites parties sont donc également transgéniques. Une plante transgénique selon l'invention peut être tout type de plantes. Il peut s'agir d'une plante monocotylédone ou bien dicotylédone. De préférence, une plante transgénique présente un intérêt agronomique, il peut s'agir notamment d'une plante céréalière, d'une plante maraîchère, d'un arbre fruitier. De préférence, il s'agit d'une plante autre que le céleri. Parmi les plantes, les plantes des familles suivantes sont particulièrement préférées : les plantes de la famille des Cucurbitacées, Chénopodiacées, Cruciféracées, Poacées, Légumineuses, Apiacées, Rosacées, Valérianacées, Solanacées et Astéracées. Des exemples particulièrement préférés de plantes transgéniques selon l'invention sont la plante de tomate, la plante de melon et la laitue. D'autres plantes préférées sont le céleri, l'oignon, la betterave, le brocoli, le blé, l'asperge, le maïs doux et le colza. Une plante transgénique selon la présente invention peut également contenir dans son génome d'autres transgènes, indépendamment de la séquence selon l'invention, il peut s'agir notamment d'un gène de résistance à une infection virale sous le contrôle d'un promoteur constitutif. Dans ce cas, les différentes transformations peuvent avoir été réalisées simultanément, au cours d'une unique étape de transformation, ou bien séquentiellement. Une plante transgénique selon l'invention peut avoir été régénérée à partir de cellules transformées. Il est également possible d'obtenir une plante selon l'invention par la descendance d'une autre plante transgénique selon l'invention. 9 La présente invention porte également sur un procédé permettant d'obtenir une plante transgénique selon l'invention. Un tel procédé comprend les étapes suivantes : l'obtention d'un construit selon l'invention tel que décrit précédemment, -L'introduction du construit dans une cellule provenant d'une plante d'intérêt et la régénération d'une plante transgénique, à partir des cellules transformées. Un procédé selon l'invention peut bien entendu comprendre de nombreuses autres étapes, précédant ou suivant les étapes mentionnées. Un procédé selon l'invention peut avantageusement également comprendre une étape supplémentaire de croisement de la plante transgénique obtenue avec d'autres plantes, également transgéniques ou non. Des croisements additionnels peuvent bien entendu être réalisés. On peut également réaliser des étapes de multiplication, sexuelle ou asexuelle, en fonction de l'espèce, et obtenir ainsi de la descendance. De préférence, la descendance obtenue à l'issue du procédé est examinée afin de déterminer les plantes de la descendance qui comprennent une séquence ou un construit selon l'invention. Les plantes comprenant une séquence ou un construit selon l'invention peuvent aussi être isolées. De telles plantes, qui comprennent dans leur génome une séquence ou un construit selon l'invention et qui sont issues du procédé tel que décrit, font également partie de l'invention. De préférence, les plantes issues de la descendance et qui comprennent une séquence ou un construit selon l'invention sont déterminées par une étape de sélection. Ladite sélection peut être une sélection en champ ou en serre, ou bien une sélection génétique à l'aide de marqueurs génétiques. La présente invention concerne également l'utilisation d'une séquence ou d'un construit selon l'invention, pour la réalisation de plantes transgéniques, c'est-à-dire dans le domaine du génie génétique. En effet, comme explicité plus haut, une application de la présente invention est l'utilisation de séquences promotrices de l'invention positionnées en amont d'une séquence codante d'intérêt (transgène), afin que la protéine codée par la séquence d'intérêt ne soit exprimée que dans des conditions spécifiques de stress, et préférentiellement dans certains organes vasculaires de la plante transgénique. Par ce biais, le transgène est peu ou pas exprimé dans des conditions normales et son expression est induite uniquement en conditions de stress. Cette caractéristique de l'invention est d'un grand intérêt puisqu'il devient possible de n'exprimer certains transgènes, notamment des gènes de résistance, que lorsque cela s'avère nécessaire, c'est-à-dire en condition de stress. En effet, l'expression constitutive de certains transgènes est parfois inutile, voire néfaste en conditions normales. Grâce à la présente invention, il est donc possible de n'exprimer des transgènes que dans des conditions de stress. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont également découvert une nouvelle protéine, à savoir un nouveau transporteur de mannitol chez le céleri Apium graveolens, dénommé AgMaT3. Par conséquent, la présente demande concerne également un peptide comprenant une séquence qui présente au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID N 8, de préférence au moins 80% d'identité, voire 90% ou même 95% d'identité avec ladite séquence 10 SEQ ID N 8. Des peptides préférés selon cet aspect de l'invention sont des peptides comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID N 11. D'autres peptides préférés sont ceux qui sont codés par tout ou partie de la séquence SEQ ID N 7, 13 ou 14, ou bien par une séquence issue de la séquence SEQ ID N 7, 13 ou 14 du fait de la dégénérescence du code génétique. De préférence, une telle séquence d'acides aminés selon cet aspect de l'invention possède la capacité de transporter le mannitol à travers une bicouche lipidique, notamment dans des cellules végétales. La demande concerne également les séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides tels que décrits précédemment. Selon une mise en oeuvre possible, ladite séquence est en aval d'un promoteur selon l'invention, par exemple SEQ ID N 1. Légende des figures Figure 1 : Cartes des vecteurs de clonage utilisés 1A : Vecteurs pDR 195 et 196 Site Multiple de Clonage de pDR 195 : Xhol-Notl-Sacll-BamHl Site Multiple de Clonage de pDR 196 : Spel-BamHl*-Smal-Pstl-EcoRl-EcoRV-Hindlll-Sall-Xhol-Acc651-Kpn I-BamHI* En gras sont représentées les enzymes qui ne coupent pas ailleurs dans le plasmide et avec *, celles qui coupent deux fois dans le SMC. 1B : Plasmide pBl 101-GUS-R1 R2 (13942 pb) et Plasmide pBl 101-GFP5-R1R2 (13116pb) Figure 2 : Céleris entretenus pendant trois semaines avec de l'eau ou une solution d'engrais (plante témoin) et avec 300 mM NaCl (plante stressée). Figure 3 : Hybridations en Northern d'ARN de parenchyme de stockage, xylème et phloème de pétioles de plantes "témoins" ou "stressées" au NaCl (300 mM, 3 semaines) par des sondes produites à partir des séquences obtenues par la banque soustractive. La quantification a été réalisée grâce à la sonde ribosomique 26S. Abréviations : PaT, Parenchyme Témoin; PaN, Parenchyme NaCl; XT, Xylème Témoin; XN, Xylème NaCl; PhT, Phloème Témoin; PhN, Phloème NaCl. Figure 4: Représentation graphique du niveau d'expression des sondes testées lors de l'hybridation en Northern, en fonction du tissu. Abréviations: AgMaT3, Apium graveolens Mannitol Transporter 3; AgMT2 et 3, Apium graveolens métallothionéines 2 et 3. Figure 5 : Absorption de mannitol (0,55 mM) par les levures RS453 complémentées par pDR (A), ou parAgMaT1/pDR (•), ou bien par trois clones indépendants AgMaT3/pDR (^, O et x), en fonction du temps. La cinétique réalisée avec la souche transformée par le plasmide vide 11 sert de contrôle. Les valeurs correspondent à la moyenne erreur-standard d'une même expérience avec trois répétitions par point. Figure 6: Alignement des séquences nucléotidiques des ADNc d'AgMaT 1, 2 et 3. Les séquences ont été alignées par la méthode Clustal du programme MEGALIGN (DNAstar, Madison, WI). Les résidus identiques à la séquence consensus ont été surlignés. Les codons ATG et stop sont encadrés. Figure 7 : Alignement des séquences protéiques d'AgMaT 1, 2 et 3. Les séquences déduites en acides aminés ont été alignées par la méthode Clustal du programme MEGALIGN (DNAstar, Madison, WI). Les résidus identiques à la séquence consensus ont été surlignés. Les résidus encadrés correspondent aux séquences conservées entre les transporteurs de "sucre" de la famille des MFS (selon NCBI Conserved Domain Search, www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). La méthionine entourée correspond au début de la séquence protéique initialement clonée. Figure 8 : Séquence promotrice et génomique d'AgMaT3 et traduction de la région codante. La séquence peptidique prédite est donnée en utilisant l'abréviation à une lettre. Les résidus en italique correspondent aux séquences conservées de la sous-famille des transporteurs de "sucre" des MFS. Les hélices transmembranaires putatives sont soulignées. La numérotation est basée sur le site d'initiation de la traduction. Figure 9 : Séquence promotrice d'AgMT2 et traduction de la région codante. La séquence peptidique prédite est donnée en utilisant l'abréviation à une lettre. La numérotation est basée 25 sur le site d'initiation de la traduction. Figure 10 : Séquence promotrice d'AgMT3 et traduction de la région codante. La séquence peptidique prédite est donnée en utilisant l'abréviation à une lettre. La numérotation est basée sur le site d'initiation de la traduction. Figure 11 : Emplacement de certains éléments cis (identifiés par analyse informatique) sur les régions promotrices d'AgMaT3 et AgMT 2 et 3, utilisées pour les constructions. Les positions des motifs sont indiquées à partir du site d'initiation de la traduction. Les éléments placés sur le brin complémentaire (-) sont représentés sous la ligne. 35 Figure 12 : Séquence des régions amont 5' utilisées comme promoteurs. Les séquences sont représentées jusqu'au premier ATG correspondant au site d'initiation de la traduction. Les régions clonées en amont des gènes rapporteurs sont soulignées et leur longueur est indiquée entre parenthèse. Les séquences SEQ ID N 1 (AgMaT3), SEQ ID N 2 (AgMT2) et SEQ ID N 3 40 (AgMT3) correspondent aux séquences soulignées, les séquences SEQ ID N 4 (AgMaT3), 30 12 SEQ ID N 5 (AgMT2) et SEQ ID N 6 (AgMT3) correspondent aux séquences en gras ; elles se terminent juste avant le 'A' de l'ATG. Figure 13: coloration GUS des feuilles matures de plantes Arabidopsis exprimant les constructions suivantes : AgMaT3 ::uiad (A, B), AgMT2 ::uiad3 (C, D), AgMT3 ::uiad3 (E, F). Les photographies représentent soit les feuilles entières (A, C, E, barre d'échelle 5mm) soit des sections transversales (B, D, F, barre d'échelle 50pm). Toutes les photographies ont été prises à partir de plantes après un stress salin. Partie expérimentale L'équipe de Bohnert et al. (2001) a mené une étude génomique de grande échelle sur différents organismes (Riz, Mesembryanthemum crystallinum L., Arabidopsis, Maïs, Tabac et Orge) en réponse au stress salin, sur différents tissus (principalement racines et feuilles) à différentes étapes du développement et dans des conditions très variables (concentrations et durée). Cette étude a été poursuivie par des stratégies de mutagénèse insertionnelle et de recherches de QTL (guantitative trait loci), réalisées sur le Riz pour identifier les caractères permettant à cette espèce d'être tolérante au stress salin (Koyama et al., 2001). Des recherches globales ont également été réalisées sur le transcriptome d'Arabidopsis thaliana traité au NaCI (Kreps et al., 2002) et sur le protéome de Riz (Salekdeh et al., 2002) en réponse à une salinisation modérée (100-150 mM NaCI). Ces techniques qui étudient l'ensemble des gènes et protéines exprimés chez la plante lors du stress salin ne sont pleinement exploitables que lorsque l'ensemble du génome de l'espèce étudiée est disponible, ce qui n'est pas le cas du céléri. L'équipe de Masmoudi et al. (2001) a recherché par expression différentielle, des ADNc de racines du Blé dont l'expression est modifiée par un traitement avec 200 mM de NaCl. La technique utilisée est beaucoup plus ciblée (pour étudier les gènes induits dans un organe particulier) mais ne permet pas toujours d'identifier de nombreux gènes. Les présents inventeurs ont donc choisi d'utiliser la technique de banque soustractive permettant à la fois de cloner les gènes spécifiquement induits par le stress salin, et d'obtenir un grand nombre d'ADNc, beaucoup plus représentatifs de l'état transcriptionnel de la plante, lors de cette contrainte environnementale. De plus, il n'y a pas ou peu d'informations sur les localisations tissulaires des différents gènes impliqués dans la tolérance au sel. Le phloème, quant à lui, est un tissu clé dans la redistribution du Na+ entre les différents organes (Lohaus et al., 2000). Il intervient également dans le transport d'osmolytes vers les tissus accumulateurs cibles (Popova et al., 2003). Le myo-inositol et l'ABA sont transportés rapidement dans les tubes criblés, agissant comme des signaux descendants (des feuilles jusqu'aux racines) et activant de nombreux mécanismes nécessaires à la mise en place de la tolérance au stress salin (Nelson et al., 1999). Il est reconnu que le phloème joue un rôle important dans la délivrance de molécules informatives jusqu'à des organes localisés à distance (Ruiz-Medrano et al., 2001). Il apparaissait donc intéressant d'étudier l'expression de gènes lors d'un stress salin dans ce tissu complexe. Les 13 inventeurs ont travaillé sur une banque soustractive construite à partir de phloème de plantes ayant subit un stress salin et de phloème d'une plante témoin (en hydratation normale). La plante la mieux adaptée pour cette étude s'est avérée être le Céleri, modérément sensible à un excès de macroéléments ou un stress salin (De Pascale et al., 2003). Cette tolérance a été mise en relation avec une accumulation de mannitol (osmolyte) aux dépens du saccharose par modification des activités enzymatiques, la mannose-6-phosphate réductase et la mannitol déshydrogénase (Noiraud et al., 2000). Le céleri a un autre avantage car le tissu phloèmien (cellules du parenchyme phloèmien + complexe conducteur) peut être aisément isolé, microchirurgicalement, du reste du faisceau conducteur (Noiraud, 1999). C'est donc la variété Céleri branche Apium graveolens L. Dulce (cultivar Vert d'Elne) qui a été utilisée par les inventeurs. L'objectif est l'identification de promoteurs de gènes induits dans le phloème par un stress salin chez le Céleri par la technique de banque soustractive. Exemple 1 : matériel et méthodes 1. Matériel végétal 1. A. Céleri branche Les pieds de Céleri branche utilisés sont semés et cultivés sur du terreau en serre. Les plantes sont arrosées automatiquement pendant 90 sec toutes les 3 h durant la journée et reçoivent une solution d'engrais (solution Peters 20:20:20 contenant N, P et K à 100 ppm), trois fois par semaine. Une fois par semaine, une pulvérisation du coeur et des jeunes feuilles doit être effectuée avec du nitrate de calcium à 4 gr' en alternance avec du Cosynol SC à 10 gr', afin d'éviter le pourrissement du Céleri (maladie du coeur brun). 1. B. Stress salin (Céleri) Lors de l'application d'un stress salin, deux lots de Céleri branche sont préparés : plantes "témoins" (T) et plantes "stressées" (S). Les pots de 5.4 L sont recouverts d'un film plastique noir afin de limiter l'évaporation. Le stress salin débute à une concentration de 25 mM de NaCl, puis augmente par palier de 25 mM lors de chaque apport (deux fois 500 mL par pot et par jour, matin et soir) en eau ou en engrais jusqu'à atteindre la concentration désirée soit 300 mM NaCl. Les plantes "témoins" sont arrosées de la même façon, niais sans apport de sel. Le stress salin est appliqué pendant trois semaines. Engrais et calcium sont appliqués avec la même fréquence que sur les plantes témoins. 1. C. Récolte et conservation des tissus et organes Après 3 semaines de stress salin, les tissus sont récoltés selon un critère déterminé (âge ou taille) et conservés. Une foliole, les parenchyme, phloème, xylème des pétioles correspondant à la foliole et les racines sont prélevés sur plusieurs plantes et réunis par lots selon le critère établi avant d'être congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80 C. 14 . D. Culture d'Arabidopsis thaliana L'arabette est utilisée pour la transformation végétale par les séquences promotrices des différents gènes étudiés. Les plantes d'Arabidopsis thaliana d'écotype Columbia (Col-0) sont semées et cultivées sur du terreau en serre, en condition de jours courts (jour = 21 C, 8h et nuit = 17 C, 16h) pour le développement des rosettes, puis en jours longs (jour = 21 C, 16h et nuit = 17 C, 8h) pour l'induction de la floraison, jusqu'à la montée de la hampe florale. Les plantes sont arrosées automatiquement, dans leurs soucoupes, pendant 90 sec toutes les 3h durant la journée et reçoivent une solution d'engrais (solution Peters 20:20:20 contenant N, P et K à 100 ppm), trois fois par semaine. II. Matériel biologique pour les approches moléculaires ll. A. Microorganismes hôtes Il. A. 1. Souche de bactéries La souche bactérienne Escherichia coli DHSa (GibcoBRL) est utilisée pour le clonage et l'amplification d'ADN et des fragments de PCR. Ces bactéries sont cultivées à 37 C, avec du milieu dYT solide ou liquide, en présence de l'antibiotique approprié ; ampicilline à 100 gg.mL-1, kanamycine à 100 gg.mL-' ou gentamycine à 50 pg.mL-1. Il. A. 2. Souche de levures La souche de levures RS453 (Sauer et Stadler, 1993) est incapable de se développer sur un milieu sans uracile. Le plasmide pDR portant le gène URA3 est utilisé pour transformer cette souche. Cette souche est cultivée avec du milieu YPD, si elle n'a pas été complémentée, sinon, sur du milieu SC-glucose (sans uracile). Il. A. 3. Souche d'agrobactéries La souche d'agrobactéries utilisée pour la transformation des hampes florales d'Arabidopsis thaliana est Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Elle est cultivée sur du milieu YEB ou dans du milieu LB sous agitation, à 28 C, en présence de rifampicine à 100 g.mL-' et de streptomycine à 200 p.g.mL"'. lt. B. Vecteurs de clonaqe Les cartes des vecteurs de clonage utilisés sont données dans la fig. 1. Le vecteur utilisé pour le clonage des fragments de PCR est le plasmide pGEM-T-Easy (Promega). Les vecteurs d'expression pDR195 ou pDR196 ont été utilisés pour complémenter les souches de levure S. cerevisiae RS453. Ces vecteurs ont été utilisés pour l'expression hétérologue de transporteurs de mannitol de végétaux chez la levure, sous le contrôle du promoteur PMA1. Le plasmide pDONR 207 (Invitrogen) a été utilisé comme vecteur donneur dans le kit "Gateway Technology" (Invitrogen). Les plasmides pBl 101-GUS-R1 R2 et pBl 101-GFP-R1 R2 possèdent les bordures RI et R2 (attRl et attR2) qui permettent le clonage du promoteur d'intérêt en amont des gènes rapporteurs GUS (R-glucuronidase, uidA) ou GFP (Green Fluorescent Protein 5-ER), par recombinaison entre le clone d'entrée et les vecteurs destination pBl (kit "Gateway Technology", 15 Invitrogen). Après l'étape de recombinaison, le vecteur pBl 101 porte les gènes rapporteurs codant GUS ou GFP, sous le contrôle du promoteur étudié, et du terminateur NOS. III. Méthodes Ill. A. Extraction des ARN totaux de tissus végétaux La technique utilisée pour extraire les ARN totaux a été décrite par Kay et al. (1987). Ill. B. Clonage d'ADN par amplification (PCR) Ill. B. 1. Amplification d'ADN Génomique par PCR ng d'ADN sont mis en présence de 50 IaL de milieu réactionnel contenant 250 M de dNTP ; 10 1 !Al d'amorces sens et antisens ; 1 U d'enzyme Taq ADN polymérase "GoTaq" (Promega) et 1X de tampon PCR. Chaque cycle comprend (après une première étape de dénaturation de 1 min à 94 C et suivi d'une dernière étape d'élongation de 5 min à 72 C) : une étape de dénaturation de 15 sec à 94 C ; une étape d'hybridation de 2 min à la température adéquate et une étape d'élongation à 72 C dont la durée est proportionnelle à la taille du fragment à amplifier (1000 bp.min-l). Les couples d'amorces utilisés pour les clonages dans le vecteur pDONR207 sont les suivants : Pour le clonage de la partie promotrice d'AgMaT3 : Amorce 5' 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTG AACAGAAACAATTGTGGATG- 3' Amorce 3' 5'-GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTA ATGTTGAGAA ACAATGGTCG-3' Pour le clonage de la partie promotrice d'AgMT2 : Amorce 5' 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTG ACCCACTATC AACAATGATC-3' Amorce 3' 5'- GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTA TAAGATCGTT GTGGACTCTG-3' Pour le clonage de la partie promotrice d'AgMT3. Amorce 5' 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTT CTTTATTCTG CAGCTAGAGC-3' Amorce 3' 5'- GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTG CTTGAAGTAA GGTGGTATGC-3' Le choix de la température d'hybridation dépend du calcul préalable de la température de fusion (Tm). Les produits d'amplification obtenus sont analysés sur gel d'agarose 1 %. Ill. B. 2. Amplification d'ADN à partir d'ARN inversement transcrits (RT-PCR) Après dénaturation de 6 gg d'ARN totaux à 70 C pendant 10 min, la transcription inverse est menée durant 60 min à 42 C en présence d'amorce oligo(dT)18 2,5 M, de dNTP 500 M et de "M-MLV Reverse Transcriptase" (200U, Promega). Les hétéroduplex ARN/ADNc obtenus sont dénaturés 5 min à 100 C avant qu'une réaction d'amplification par PCR de la région d'ADNc cible ne soit faite en prenant 2 L du milieu de synthèse du premier brin d'ADNc comme matrice 16 III. B. 3. Clonage des fragments de PCR dans le plasmide pGEM-T-Easy Le vecteur du système "pGEM-T-Easy Vector Systems" (Promega) est un vecteur linéarisé adapté au clonage direct des produits de PCR grâce aux résidus thymidine greffés à chacune de ses extrémités 3'. Les produits de PCR sont ligaturés dans 50 ng de plasmide pGEM-T-Easy selon un rapport molaire insert/vecteur de 3, pendant une nuit, à 16 C en présence de 3U d'ADN ligase T4 (kit Promega). 3 des 10 L du milieu de ligature ont été utilisés pour transformer 200 L de bactéries compétentes. ill. C. Transformation de bactéries Escherichia coli compétentes Les bactéries sont rendues compétentes en présence de CaCl2. Ill. C. 1. Préparation de bactéries compétentes Les bactéries E. coli DH5a sont rendues compétentes selon la méthode décrite par Sambrook et al, (1989). Les bactéries sont alors congelées dans l'azote liquide en aliquots de 200 L et stockées à -80 C. III. C. 2. Transformation des bactéries thermocompétentes La transformation des bactéries E. coli DH5a compétentes est réalisée selon la technique décrite par Sambrook et al, (1989). Le choc thermique se passe à 42 C, pendant 90 sec. L'addition de 800 L de milieu SOCt est suivie d'une incubation à 37 C sous agitation pendant 1 h pour permettre l'expression phénotypique du gène de résistance à l'antibiotique porté par le 2C plasmide. Le milieu de transformation est ensuite étalé sur boîte dYT contenant l'antibiotique approprié. Ces boîtes sont placées à 37 C pendant 16 h. III. D. Analyse de l'ADN plasmidique Ill. D. 1. Minipréparation d'ADN plasmidique 25 Cette extraction repose sur la technique par lyse alcaline des bactéries, adaptée de Sambrook et al. (1989) ; une colonie bactérienne est mise en culture dans 5 mL de milieu dYT contenant l'antibiotique approprié pendant une nuit à 37 C sous agitation. Les cellules provenant de 3 mL de culture sont concentrées par centrifugation de 1 min à 6000 g. Le culot est resuspendu dans 200 L de solution 1 [Tris HCI 25 mM (pH 8) ; EDTA 10 mM ; Glucose 50 mM] supplémentée 30 en lysozyme à 1 mg.mL-' final, puis après vortexage, 400 L de solution 2 [NaOH 0,2 N ; SDS 1 %] et 300 L de solution 3 [acétate de potassium 3 M ; acide acétique glacial 11,5 % (v/v) ; pH 4,8 ] sont successivement ajoutés. Après une incubation de 5 min dans la glace, les débris cellulaires sont sédimentés par une centrifugation de 10 min à 14000 g. Le surnageant est transféré dans un microtube propre où de la RNase A à 100 g.mL-' final est ajoutée avant une 35 incubation à 65 C pendant 15 min. Le surnageant est purifié par une extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1). L'ADN est précipité avec un volume d'isopropanol, rincé à l'éthanol 70 % à deux reprises, séché et repris dans 20 L d'eau. Ill. D. 2. Etablissement de profil de restriction Un microlitre de solution d'ADN plasmidique (0,5 g.L-') est digéré par différentes enzymes de 40 (3U) durant 2h à 37 C. Les produits de restriction sont analysés sur gel d'agarose 1 %. 17 1. E. Séquençaqe et analyse des clones Les clones les plus intéressants sont séquencés. L'alignement des séquences nucléotidiques, la recherche des sites de restriction par les endonucléases, mais aussi la recherche de cadres ouverts de lecture et la traduction des fragments d'ADN en acides aminés ont été effectuées avec le logiciel Mac Molly Tetra (Soft Gene GmbH). Les comparaisons avec les séquences contenues dans les banques de données ont été réalisées grâce au programme BLAST sur le serveur NCBI (http:/lwww.ncbi.nlm.nih.gov). L'analyse des promoteurs et la recherche de boîtes spécifiques de reconnaissance et de fixation de protéines régulatrices de la transcription ont été réalisées sur le serveur PLACE 10 (Higo et al., 1999, http:llwww.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE/signalscan.html). Il!. F. Banque soustractive Cette banque représente tous les gènes dont l'expression est modifiée dans un tissu suite à un traitement donné. Elle a été construite selon les kits "SMART PCR cDNA Synthesis" et "PCRSelect cDNA Subtraction" (Clontech) à partir d'ARN totaux de phloème extraits soit de plantes "témoins", soit de plantes "stressées au NaCl 300 mM" pendant trois semaines. Les ADNc sont directement produits et amplifiés à partir d'ARN totaux, avant digestion enzymatique par Rsal, Les ADNc tester (phloème de plantes "stressées" S) sont divisés en deux et sur chaque sous-lot un adaptateur différent est ligaturé donnant SI et S2. SI et S2 sont hybridés avec l'ADNc 20 driver (phloème de plantes "témoins" T) en excès, puis réunis et soumis à une deuxième hybridation. Les ADNc correspondant à des gènes exprimés à la fois en conditions stressées et témoins vont pouvoir s'hybrider. Seules les ADNc de plantes stressées ne s'étant pas hybridés avec un homologue "témoin" et possédant des adaptateurs différents pourront être amplifiées et clonés. 25 III. F. 1. Clonage de la banque soustractive Les produits de la PCR (fragments de 90 à 900 pb) sont directement clonés dans le vecteur pGEM-T-Easy (Promega), puis dans la souche d'E. col! DH5a. Les colonies obtenues sont réparties sur des plaques de 96 puits, cultivées ainsi dans du milieu dYT liquide et conservées à -80 C (50 % glycérol). 30 III. F. 2. Minipréparation sur plaque Les minipréparations sont réalisées directement sur plaques de 96 puits. La banque est copiée et cultivée sur plaques à puits profonds dans 2 mL de milieu dYT, pendant 16 h à 37 C et sous agitation. Après centrifugation (4000 g pendant 10 min à 4 C), le culot est resuspendu avec 100 L des solutions PI (Resuspension buffer, Qiagen) froide à 50 g.mL-I de RNase A, P2 35 (Lysis buffer, Qiagen), et P3 (Neutralization buffer, Qiagen) froide, sous agitation jusqu'à formation des précipités. Après centrifugation, le surnageant est précipité avec un volumed'isopropanol. Suite à une nouvelle centrifugation, les culots sont lavés à l'éthanol 70 %, puis sont séchés et resuspendus dans du tampon TE (25 L ; Tris 50 mM, EDTA 10 mM), sous agitation. La concentration finale en ADN plasmidique est déterminée par spectrophotométrie. 40 18 III. F. 3. Dépôts sur filtres L'ADN plasmidique, contenu dans chaque puits des plaques à 96 puits, est dénaturé au NaOH (0.4 M final) et déposé sur des membranes de nylon Hybond-N (Amersham ; 8 x 12 cm) à l'aide d'un réplicateur. Les clones plasmidiques (100 ng) sont déposés sur les filtres et fixés aux membranes par incubation à 80 C pendant 2 h. Ill. F. 4. Hybridation et révélation des filtres Les filtres sont placés en préhybridation durant 4 h à 65 C (sonde complexe) ou à 42 C (sonde T7), dans une solution de préhybridation [tampon NaP 0,25 M, pH 7,2 (Na2HPO4, NaH2PO4) ; SDS 6,6 %, EDTA 1 mM, pH 8 et serum albumine bovine 1 % ]. La "sonde complexe" radioactive est produite par transcription inverse sur des ARN totaux représentant les gènes exprimés dans un tissu suite à un traitement donné, à partir d'oligodT20 ancrés. Ces sondes vont donc s'hybrider différentiellement sur les clones déposés sur les filtres. La différence d'intensité entre les signaux provenant des sondes complexes "stressée" et "témoin" permet d'identifier les clones les plus intéressants. Les valeurs relatives obtenues, sont réajustées entre-elles par calibrage avec une sonde T7 interne au plasmide déposé. La première étape de la réaction de reverse transcription est une dénaturation à 70 C pendant 10 min, des ARN et des oligonucléotides ancrés, (dT)20dA, (dT)20dG, (dT)20dC (2 pg de chaque), mélangés. Les formes dénaturées sont conservées par transfert direct dans la glace. Ces ARN sont ensuite dilués dans un mélange préchauffé à 42 C pendant 5 min, composé de tampon de RT 1X (Tris-HCI 50 mM, pH 8,3 ; KCI 75 mM ; MgCl2 3 mM et DTT 10mM), de dNTP (0.8 mM de chaque, excepté pour dATP à 5 M) et de dATP-33P à 2.775 MBq dans 7,5 pi (Amersham). Enfin, 800 U de "MMLV reverse transcriptase" (Promega) sont ajoutés à cette réaction de PCR et le mélange est incubé à 42 C pendant 1 h et à 70 C pendant 15 min, puis refroidi dans la glace (dénature l'enzyme et conserve la linéarisation des ADNc). Afin qu'il ne puisse pas y avoir d'interférences avec l'hybridation de la sonde, l'ARN matrice est détruit par ajout de 8 U de Ribonucléase H (Promega) à 37 C pendant 30 min. La sonde est stockée sur de la glace en attendant la vérification de l'incorporation de dATP-33P. L'élution est réalisée avec de l'eau par fractions de 200 L dont la radioactivité est estimée à l'aide d'un compteur à scintillation (Packard, TRI-CARB 1900 TR). Les fractions contenant la sonde sont rassemblées et sont utilisées comme "sonde complexe" afin d'hybrider les filtres à 65 C pendant une nuit. La quantité d'ADN plasmidique déposée au niveau de chaque spot est calibrée par hybridation avec une sonde T7. Cette sonde est produite à partir de 100 ng d'oligo T7 (20-mer) marqués à leur extrémité (5') par du yATP-33P (1.85 MBq) fixés par réaction de la "T4 polynucleotide kinase" (10U, Promega) dans du tampon kinase 1X (Promega) à 37 C pendant 30 min, puis bloquée sur glace. Les filtres sont hybridés avec le produit de la réaction, une nuit à 42 C. L'hybridation des filtres est réalisée pendant 16 h à 65 C (sonde complexe) ou à 42 C sonde T7), en présence de la sonde radiomarquée diluée dans le tampon d'hybridation (de même composition que le tampon de préhybridation). Les filtres sont ensuite lavés 2 fois 10 min à 65 C ou à 42 C dans du SSC 2X ; SDS 0,1 %, 40 10 min à 65 C ou à 42 C dans du SSC 1X ; SDS 0,1 %, 5 min à 65 C ou à température 19 ambiante dans du SSC 0,5X ; SDS 0,1 %. (SSC1X: NaCl 0,15 M et 0,015 M de citrate de sodium). Les filtres sont emballés dans des sacs plastiques et placés sur des écrans de type "Iow energy" (Kodak, Amersham), pendant six jours à l'intérieur de cassettes d'exposition. Les signaux présents sur les filtres sont ainsi quantifiés par le système Phospholmager (STORM 820, Molecular Dynamics, Amersham) et exprimés en unités relatives. Les valeurs obtenues avec la sonde T7 (sonde interne à chaque plasmide) sont utilisées pour calculer les intensités relatives du signal de chaque spot. 11i. G. Hybridation de type Northern M. G. 1. Electrophorèse et transfert des ARN La technique utilisée pour l'électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose et le transfert des ARN par capillarité sur une membrane de nylon est celle décrite dans Noiraux et al, 2000. Après le transfert, les ARN sont fixés sur la membrane par une incubation à 80 C pendant 2 h. lll. G. 2. Préparation de la sonde La sonde radioactive est préparée à partir d'un fragment ADN d'intérêt. Après digestion enzymatique, l'ADN a été séparé sur gel d'agarose 1 % (Sambrook et al., 1989) du plasmide d'insertion et purifié sur colonne "DNA gel extraction kit" (Millipore). Le culot d'ADN est resuspendu dans de l'eau à une concentration finale de 125 ng/ L. La sonde radioactive est réalisée avec le kit "Prime-a-gene Labeling System" (Promega), basé sur l'hybridation d'un mélange d'hexanucléotides avec le fragment d'ADN à marquer, dénaturé. Les hexanucléotides servent d'amorces au fragment de Klenow qui synthétise un brin complémentaire en incorporant du a32P-dCTP. La synthèse de la sonde s'effectue à 25 C pendant 2 h en présence de 25 ng d'ADN matriciel dénaturé et de 1,51.106 Bq de a32P-dCTP (activité spécifique 220 TBq.mmol-1). A la fin de la réaction, les nucléotides non incorporés sont séparés de la sonde par passage du mélange sur une colonne Sephadex G-50. Les fractions contenant la sonde sont rassemblées, dénaturées à 95 C pendant 3 min, puis stockées dans la glace jusqu'à utilisation. lll. G. 3. Hybridation du Northern La membrane est préhybridée durant 4 h à 65 C dans la solution de préhybridation. L'hybridation est réalisée pendant 16 h à 65 C en présence de la sonde homologue radiomarquée (hybridation Céleri/Céleri). La membrane est ensuite lavée 2 fois 15 min à 65 C dans du SSC 2X ; SDS 0,1 %, 30 min à 68 C dans du SSC 1X ; SDS 0,1 %, 15 min à 68 C dans du SSC 0,5X ; SDS 0,1 %. La membrane est emballée dans un sac plastique et placée sur des écrans pendant 3 heures. 35 Les dépôts d'ARN sont calibrés avec une sonde ribosomique 26S de Céleri, marquée au a32P-dCTP. 111. H. RACE-PCR Les séquences codantes ainsi que les parties 5' et 3' non traduites sont clonées grâce au "Marathon cDNA amplification kit" (Clontech) à partir d'ARN totaux de phloème extraits soit de 40 plantes "témoins T', soit de plantes "stressées S". Les amorces utilisées pour ces clonages sont 20 choisies conformément aux prescriptions du kit. Les produits de PCR sont des ADN complémentaires et sont directement clonés dans le vecteur pGEM-T-Easy (Promega), puis dans la souche d'E. coli DH5a. Ill. 1. RT-PCR en temps réel Les RT-PCR en temps réel ont été réalisées à partir de RT (reverse transcription) sur lesquelles une PCR est pratiquée à partir d'amorces (Invitrogen) et de sondes TaqMan (Applied Biosystems, U.K.). Celles-ci sont choisies dans les régions 3' non traduites des séquences codantes des transporteurs de mannitol testés. Ces régions présentant le moins de similitudes entre elles, le signal obtenu est spécifique de l'expression d'un de ces transporteurs. La RT-PCR quantitative a été réalisée essentiellement comme décrit dans Wagner et al., 2001. Les amorces spécifiques de AgMaT3 sont : 5'- ATA CAG CGG GGA TTA TAG CTT TG -3' et 5'- ATC CGC AGG TAC TCC AAA AAT TT - 3', afin d'amplifier un fragment de 101 paires de bases spécifiques de la région 3' non codante. Le fragment amplifié est vérifié par séquençage. La sonde marquée au FAM est 6 FAM-TAC CCG GTA TAT TCA CTC-MGB (synthétisé par Applied Biosystems). Pour l'amplification de Ag26S (gène contrôle), les amorces utilisées sont : 5'- AGC CGC TGG ACC CTA CCT-3' et 5'- AGT TAT CTT TTC TGT TTA ACA GCC T-3', tandis que la sonde fluorescente est 6 FAM-CTA AGC CGT TTC CAG G-MGB. Les amorces et sondes sont déterminées à l'aide du logiciel Primer Express, v.1.0 (Applied 20 Biosystems). Les fragments sont obtenus par PCR en présence de "TaqMan Universal PCR Master Mix" 1X (Applied Biosystems, Roche), d'amorces 5' et 3' à 0,9 M chacune, de sonde TaqMan 0,2 M et du produit de RT diluée au 1/300e (RT produite à partir de 10 g d'ARN totaux). La fluorescence émise par les sondes TaqMan est détectée grâce au système de détection ABI PRISM 7700 25 (Applied Biosystems). Les signaux sont quantifiés grâce aux amorces et sondes ribosomiques 26S de Céleri. Ceci donne des valeurs Ct définies comme le numéro du cycle auquel la valeur ÈRn (intensité de fluorescence normalisée du colorant rapporteur) dépasse une valeur seuil générée par le logiciel. Ct est donc inversement proportionnel à la concentration de la séquence cible. 30 111. J. Clonage des promoteurs et des séquences génomiques Les séquences génomiques (introns+exons) et les promoteurs de séquences connues, sont obtenus par une technique basée sur la PCR, en s'affranchissant de toutes les étapes de criblage (banque phagique) traditionnellement utilisées. L'ADN génomique est divisé en quatre lots, chacun étant digéré par une enzyme différente. Les enzymes choisies donnent des 35 coupures à bord franc. Selon l'emplacement des sites de restriction, les fragments obtenus seront de taille variable. Des adaptateurs de séquences connues sont ensuite ligaturés aux extrémités des fragments de digestion. Sur chacun des 4 lots, une PCR est réalisée avec une amorce spécifique du gène étudié (GSP1) et une amorce spécifique de l'adaptateur (API). La seconde PCR ou "nested" est pratiquée sur le produit de la première, avec des amorces (GSP2 40 et AP2) plus internes que les premières, afin d'optimiser la spécificité du résultat. Jusqu'à 4 21 fragments de PCR de taille variable sont ainsi obtenus. Le plus long, portant le plus d'informations, est purifié. 111. J. 1. Extraction de l'ADN génomique Les tissus (folioles jeunes) sont broyés en une fine poudre dans un mortier en présence d'azote liquide. Quinze millilitres de tampon CTAB 2X [CTAB 2 % (plv) ; NaCl 1,4 M ; EDTA 20 mM ; Tris 100 mM (pH 8) ; 8-mercaptoéthanol 0,2 % (vlv)] préchauffé à 60 C sont ajoutés pour 3 à 5 g de poudre broyée et incubent 30 min à 60 C. Les protéines et les débris cellulaires sont éliminés par une extraction au chloroforme/alcool isoamylique [24:1 (vlv)] suivie d'une précipitation à l'isopropanol froid (0,5 volume) et à -20 C pendant 30 min. Si les filaments d'ADN sont visibles, il est alors possible de les attraper et de les laver à l'éthanol 76 % contenant de l'acétate-NH4 10 mM final, pendant 20 min. Sinon, centrifuger 5 min à 5000 g et laver le culot de la même façon. L'ADNg est à nouveau centrifugé et le culot est séché à l'air, puis repris dans 1 mL de tampon TE [Tris 50 mM ; EDTA 10 mM] additionné de RNase A à 10 gg.mL-' final et incube ainsi 30 min à 37 C. L'ADNg est précipité par ajout successif de 1,5 mL de tampon TE, de 0,5 mL de NaCl (5 M) et 2 mL d'isopropanol froid. Après centrifugation à 5000 g pendant 10 min, le culot est lavé à l'éthanol 70 %, séché à l'air et repris dans du tampon TE (50 L). Les quantités d'ADN sont estimées par un dosage spectrophotométrique entre 210 et 310 nm. Une absorbance de 1 à 260 nm correspond à une concentration en ADN de 50 g.mL-1. 20 11L J. 2. Construction de la banque génomique La banque génomique est construite selon le kit "Universal Genome Walker kit" (Clontech) à partir d'ADN génomique. Les amorces utilisées sont choisies conformément aux prescriptions du kit. Les produits de PCR obtenus sont directement clonés dans le vecteur pGEM-T-Easy, puis dans la souche d'E. coli DH5a en vue d'une minipréparation et du séquençage. 25 Ill. K. Transformation d'Arabidopsis thaliana avec un promoteur de Céleri en amont d'un gène rapporteur III. K. 1. Technologie gateway Le profil d'expression des promoteurs a été suivi par transfert de leur séquence en amont d'un 30 gène rapporteur. L'utilisation de la technologie gateway permet le passage d'un fragment d'ADN (complémentaire ou génomique), à partir de son produit de PCR, dans un "vecteur donneur" (pDONR 207) puis dans un "vecteur destination" (pBI-GUS-R1 R2 ou pBI-GFP-R1 R2). Les amorces produites (Invitrogen) pour cloner ces promoteurs contiennent les séquences attB, et sont choisies conformément aux données du kit "Gateway Technology" (Invitrogen). Les PCR 35 ont été réalisées sur de l'ADN génomique obtenu selon le ≈III. J. 1. Après chaque ligature, les plasmides obtenus sont amplifiés dans la souche d'E. coli DH5a. Les plasmides utilisés contiennent le gène ccdB : chez la plupart des bactéries, il est létal. Ainsi, seuls les plasmides ayant effectué la réaction de recombinaison (insertion du fragment d'ADN et excision du gène ccdB) peuvent être amplifiés dans la bactérie. 40 22 Ill. K. 2. Transformation d'Agrobactéries électrocompétentes Ill. K. 2. a. Préparation d'agrobactéries compétentes La préparation des agrobactéries A. tumefaciens LBA 4404 se fait selon Koncz et Schell (1986) afin de préparer des fractions aliquotes de 40 L (concentrations de .3.1010 cellules.mL-1) qui sont stockées à -80 C jusqu'à utilisation. III. K. 2. b. Transformation d'agrobactéries par électroporation Les cuves à électroporation sont placées à 4 C dans de la glace. Une fraction aliquote d'agrobactéries (40 L) est décongelée et 2 .tL de solution d'ADN plasmidique sont ajoutés, le tout est déposé dans les cuves. Les agrobactéries subissent un choc électrique de 5 msec à 15 kV.cm-1. Immédiatement, 960 L de milieu YEB sont ajoutés, puis la suspension est transférée et incubée à 28 C sous agitation pendant 1 h pour permettre l'expression phénotypique du gène de résistance à l'antibiotique porté par le plasmide. Le milieu de transformation est ensuite étalé sur boîte YEB contenant les antibiotiques appropriés, placées à 28 C pendant 16 h. Ill. K. 3. Transformation d'Arabidopsis thaliana La transformation des Arabidopsis se fait selon la méthode décrite par Clough et Bent (1998), les agrobactéries transformées étant cultivées jusqu'à une absorbance de 0,8 à 600 nm puis ensuite utilisées pour transformer les hampes florales d'Arabidopsis thaliana. Ill. L. Etude de l'expression fonctionnelle hétéroloque de transporteurs de plantes chez la levure Saccharomyces cerevisiae III. L. 1. Clonage d'ADNc dans le vecteur d'expression pDR Le vecteur pDR possède le promoteur PMA1et le terminateur ADH qui permettent l'expression de transporteurs dans la levure. La séquence d'ADNc est extraite du vecteur d'amplification (pGEM-T-Easy), par digestion enzymatique, avec les mêmes enzymes de restriction (3U, 2h à 37 C) qui coupent le vecteur pDR, afin de réaliser un clonage orienté. Les produits des digestions sont contrôlés et purifiés sur gel d'agarose 1 %. Le plasmide pDR digéré est ensuite déphosphorylé par l'enzyme Shrimp Alkaline Phosphatase (4U, Promega) 1h à 37 C, empêchant sa recircularisation. Les différentes enzymes sont inhibées après chaque réaction, pendant 15 min à 65 C. La ligature de l'ADNc du transporteur dans pDR est alors possible grâce à la T4-DNA ligase (3U, Promega), une nuit à 16 C, selon un rapport insert/vecteur de 3. Le vecteur préparé est amplifié dans la souche d'E. coli DH5a avant transformation des levures. La préparation des levures compétentes puis leur transformation se fait selon le protocole de Dohmen et al. (1991) III. L. 2. Absorption de polyols par les levures transformées 111. L. 2. a. Préparation des levures pour l'absorption Les levures sont préparées selon la méthode décrite par Noiraud et al. (2001), 111. L. 2. b. Absorption de mannitol et de sorbitol radiomarqués par les levures L'absorption des polyols, manitol et sorbitols radiomarqués, par les levures se mesure selon la méthode décrite par Noiraud et al. (2001), cent pL de suspension de levures sont incubés à 28 C en présence de 100pL d'une solution contenant 1,1 mM de mannitol (0,55mM final) avec 5,8 KBq de mannitol [2-3H] (activité spécifique 6,3.108 kBq.mmol-1). Pour le test d'absorption 23 du sorbitol, les 100 pL de suspension de levure contienent 1,1 mM de sorbitol total (0,55 mM final) avec 16,6 KBq de sorbitol-t4C (activité 1,02.10' kBq.mmor1). Ill. L. 2. c. Dosage des protéines sur levures 500pL de cellules préparées pour l'absorption, lavées et resuspendues dans du SC MES sans uracile sont déposés dans un tube à essai et complétés à 2 mL avec de l'eau. 500pL de NaOH 15% sont ajoutés, et l'ensemble est porté à ébullition pendant 5 min. Après refroidissement, 175 pL de HCL 11,75 N sont ajoutés pour neutraliser la solution et l'ensemble est vortexé. Les protéines sont dosées selon la technique de Bearden (1978), basée sur le changement de couleur du bleu de Coomassie lorsqu'il se lie à une protéine. Exemple 2 1. Stress salin et Céleri Afin de constituer une réserve de tissus pour la construction de la banque soustractive et la production des sondes complexes, du Céleri a été soumis à un stress salin, en modifiant certaines conditions par rapport aux traitements réalisés antérieurement (Noiraud, 1999). Afin de standardiser les conditions de récolte des organes, c'est l'âge réel des feuilles (à partir de la date d'émergence) et non leur aspect général (ex : la taille) qui est pris en compte. Le stress a un effet négatif sur la croissance et le développement des feuilles: une feuille soumise à un stress et une feuille non traitée peuvent paraître identiques, sans avoir le même âge. Sur les neuf plantes de chaque lot ("témoins" et "stressées"), six sont exploitées pour la récolte des tissus et l'extraction d'ARN nécessaires à la confection des banques et des sondes. Seul le phloème des pétioles de feuilles ayant atteint un âge de 3 semaines a été employé pour la construction de la banque soustractive. Ces feuilles ont effectué tout leur développement en condition de stress. Aspect général du stress salin sur les plantes Après un traitement de 3 semaines avec 300 mM NaCl, les plantes sont affectées dans leur croissance. L'observation de l'aspect général des Céleris (fig.2) montre une différence de taille et de volume entre les pieds "stressés" et "témoins", en corrélation avec la baisse de vitesse de croissance et l'absence d'émergence de feuilles chez les plantes traitées au NaCI : Lors du stress salin, le Céleri présente un ralentissement de la croissance et de l'émergence de nouvelles feuilles. L'inhibition de la croissance est une stratégie de tolérance au stress. Cet arrêt est réversible car si les plantes, après 3 semaines de stress salin, sont arrosées avec une solution ne contenant pas de NaCl, très vite la croissance et la vitesse d'émergence des feuilles est rétablie à un niveau identique à celui noté avant le stress salin. Les feuilles les plus externes (les plus âgées) entrent en sénescence plus rapidement, ce qui pourrait indiquer une stratégie pour éliminer les ions toxiques des organes les plus jeunes, en les accumulant et les séquestrant dans des organes sénescents. Cette séquestration dans les vieilles feuilles, représente une stratégie de tolérance au stress salin. Chez le Céleri, il est important de préserver intact le méristème végétatif pour qu'il devienne inflorescentiel. 24 Cette stratégie mise en œuvre doit être coordonnée à l'échelle de la plante entière. Ceci est possible par la mise en route d'un nouveau programme d'expression de gènes. Ce sont ces gènes spécifiquement induits par ce type de stress, qui ont été caractérisés par les inventeurs. Cette étude s'est concentrée sur le phloème qui joue un rôle prépondérant dans les échanges inter-organes de molécules nutritives et de molécules informationnelles. Il. Réalisation d'une banque soustractive Pour identifier des gènes spécifiquement induits par le stress salin, une banque soustractive a été réalisée grâce au kit Clontech PCR-Select cDNA Subtraction qui permet d'identifier les gènes dont l'expression est stimulée dans une condition physiologique donnée (dans ce cas, le stress salin). En théorie, seuls ces gènes sont obtenus en fin d'analyse. Aux ADNc de plantes "stressées", sont soustraits les ADNc correspondant aux gènes exprimés constitutivement à l'état normal. Les cycles de PCR permettent d'amplifier les gènes spécifiques du stress salin. La quantité de tissu de phloeme extrait étant plus limitée qu'à partir de feuilles, une étape supplémentaire d'amplification initiale des messagers a été introduite (kit Smart PCR cDNA synthesis, Clontech). La banque soustractive a été réalisée conformément aux directives du fournisseur (kit Clontech PCR-Select cDNA Subtraction, Clontech). Si une première banque soustractive de phloème a été construite et présentait de bons résultats en relation avec une réponse au stress salin (dont protéines de choc thermique et une sous-unité de la caséine 2C kinase 2), la quantité de clones obtenus était trop faible pour constituer une banque. Une nouvelle banque soustractive de phloème a été réalisée dont les résultats sont détaillés ci-dessous : La taille moyenne des inserts est comprise entre 90 et 900 pb. Les clones obtenus après soustraction et amplification sont ligaturés dans le vecteur pGEM-T-Easy (Promega). Les colonies (les plus grosses, soit 736 parmi environ 750) sont cultivées individuellement sur des 25 plaques de 96 puits. Une réplication a été réalisée en vue d'une conservation après congélation à -80 C, une autre réplique a été cultivée afin d'extraire l'ADN plasmidique par minipréparation. Il. A. Mise au point du système de criblage des banques soustractives Le nombre de clones obtenus par la banque soustractive est beaucoup trop grand (736 pour la banque soustractive phloème) pour pouvoir les analyser indépendamment les uns des autres. 30 Afin d'affiner la recherche, l'ADN plasmidique des clones obtenus a été déposé sur des filtres qui sont hybridé avec des sondes complexes produites à partir d'ARN extraits de tissus "stressés" ou "témoins". Les signaux sont ensuite quantifiés et analysés, et les clones dits positifs (selon le rapport NaCl/témoin) sont retenus. Le radioélément choisi pour le marquage des sondes est le Phosphore 33 avec une concentration de 50 ng.g-1 d'ADN plasmidique. 35 ll. B. Dépôt et hybridations des clones obtenus suite à /a banque soustractive Des filtres en nitrocellulose (96 dépôts) sont été réalisés pour identifier les clones: les minipréparations sont réalisées dans les plaques sur lesquelles ont poussé les bactéries hôtes après réplication de la banque congelée. Ainsi 736 clones indépendants ont pu être déposés sur membrane et analysés. Les membranes sont hybridées avec des sondes complexes 40 réalisées par marquage au 33P suite à une transcription reverse sur des ARN extraits soit de 25 phloème témoin, soit de phloème de plantes stressées. Les marquages radioactifs obtenus sont comptés (Phospholmager,) et comparés. Trente clones ont présenté un signal fort en conditions de stress et leur ADN plasmidique a été séquencé (tableau I). Taille Annotation Homologie (pb) fonctionnelle 500 oxidoreductase, Arabidopsis Zn-binding dehydrogenase 300 no score 90 metallothionein AgMT2 P. brachycarpa 440 chlorophyll alb binding protein of CP29 Tomate 350 14-3-3 family protein Tomate 310 no score 800 NifU-like protein Arabidopsis ou dehydrin Orge 800 beta-galactosidase Arabidopsis 700 hypersensitive-induced reaction protein Orge 320 unknown Arabidopsis 150 no score 600 chlorophyll a/b-binding protein Tomate 170 no score 180 mannitol transporter AgMaT3 Céleri 350 metallothionein AgMT3 Vigne 470 dnaK-type molecular chaperone hsc70 Tomate 660 high molecular weight heat shock protein Pommier 900 lipid transfer protein Arabidopsis 400 fiber annexin Coton 800 RUB1 conjugating enzyme Tomate 900 cinnamyl-alcohol dehydrogenase A. cordata 620 40S ribosomal protein S27 Arabidopsis Tableau I. Séquences d'ADNc obtenues à partir de la banque soustractive de phloème ayant montré un rapport élevé stressé/témoin et lors des hybridations différentielles. La taille 40 approximative de ces fragments est indiquée en paires de bases. L'homologie et le numéro d'accession correspondant ont été obtenus par comparaison avec les bases de données BLAST. 11. C. Résultats et interprétation biblioqraphique des clones positifs en relation avec le stress et 45 le phloème Parmi les 30 clones positifs, des séquences ont pu être identifiées qui présentent des similitudes avec des gènes dont le rôle dans les stress a été documenté (notamment protéines Numéro BLAST d'accession E-value NP_173786 5,1 AAC62510 le-04 CAA43590 3e-43 P93211 3e-58 NU 93953 le-05 AAD02257 0,001 T00787 2e-35 AAN17454 6e-44 AAK31144 le-05 S14305 6e-23 AAG43998 2e-20 CAB85630 2e-09 JC4786 2e-76 AAF34134 5e-40 NU 77181 3e-13 T31428 le-58 AAG23847 5e-54 P42495 2e-69 NP_l91670 2e-33 600 60S ribosomal protein L30 Lupin 049884 le-55 650 60S ribosomal protein L28 Arabidopsis NP_l 94670 7e-41 450 no score 250 no score 250 no score 640 no score 26 de choc thermique, HSP, déhydrines et métallothionéines). Trois séquences sont identiques et appartiennent au même gène et 8 autres ne correspondent à rien de connu. Parmi les 21 restantes, 3 séquences sont plus particulièrement étudiées. IL C. 1. AgMaT3, un troisième transporteur de mannitol chez le Céleri ? La séquence partielle trouvée est très similaire aux 2 autres transporteurs de mannitol identifiés chez le Céleri: AgMaT1 et AgMaT2 (Noiraud et al., 2001 a). La séquence partielle isolée dans la banque soustractive phloème est légèrement différente et a été nommée AgMaT3. Des transporteurs comme AgMaT3 pourraient jouer un rôle important dans la tolérance au stress salin en permettant le transport dans la plante d'osmoprotectants comme le mannitol. Ce transporteur représente un bon candidat en réponse au stress salin, dans le phloème. Il. C. 2. Les métallothionéines Quatre séquences correspondent à des métallothionéines (MT). Deux sont parfaitement identiques et appartenaient à la région 3' d'AgMT2 (Apium graveolens métallothionéine 2). Une troisième séquence est également homologue à AgMT2, mais située en amont des deux précédentes. Une quatrième séquence correspond également à une métallothionéine mais celle-ci est homologue à AgMT3. Ces dénominations sont attribuées selon Vilaine et al. (2003). Les métallothionénines sont de petites protéines de faible masse moléculaire, riches en cystéines et capables de fixer des métaux (Zn, Cd), trouvées chez toutes les espèces tant animales que végétales et chez les Procaryotes. Elle sont également impliquées dans les réponses aux stress tels que les traitements avec des ions métalliques, le choc thermique (Hsieh et al., 1995), la carence en glucose et en saccharose (Chevalier et al., 1995) ou en cas de fortes concentrations de celui-ci (Chatthai et al., 1997), les faibles températures (Reid et Ross, 1997), la blessure et l'infection virale (Choi et al., 1996). ll. D. Analyse complémentaire des clones L'analyse de la banque soustractive a mis en évidence un certain nombre de séquences induites par le stress salin. Si ces banques ont été réalisées à partir d'ARN provenant de phloème, ceci n'exclut pas que les gènes identifiés soient également exprimés dans d'autres tissus. C'est pourquoi la localisation des séquences obtenues est précisée par northern reverse pour valider leur spécificité phloème. Les trente clones présentant les signaux les plus positifs suite à l'analyse de la banque sur filtre sont déposés sur des minifiltres hybridés par de nouvellessondes complexes, produites à partir d'ARN extrait de phloème ou de xylème de pétioles de Céleris "témoins" ou "stressées" (PhT et PhN ou XT et XN, respectivement). Dix clones sont retenus à l'issue de cette analyse comme spécifiquement induits par le stress salin, avec pour certains d'entre eux un fort rapport phloème/xylème (tableau Il). 27 Taille Annotation fonctionnelle Homologie BTAST E- Rapport Rapport (pb) (n d'accession) value stress/contrôle phloème/xylème 500 oxidoreductase, Zn-binding Arabidopsis 5.1 30.8 5.6 dehydrogenase NP_173786 350 14-3-3 family protein Tomate P933211 3e-58 13.0 0.3 440 chlorophyll a/b-binding Tomate 3e-43 10.1 0.4 protein CAA43590 350 metallothionein AgMT3 Vigne 2e-09 10 6.8 CAB85630 700 hypersensitive-induced Orge 6e-44 4.2 3.8 reaction protein AAN17454 650 NifU-like protein ou dehydrin Arabidopsis le-05 3.3 0.7 NP_193953 310 No score 2.8 0.4 90 metallothionein AgMT2 P. brachycarpa le-04 2.4 1 AAC62510 180 mannitol transporter Céleri 2e-20 2.7 1 AgMaT3 AAG43998 800 beta-galactosidase Arabidopsis 2e-35 2.3 1 T00787 Tableau Il. Séquences d'ADNc obtenues après les hybridations différentielles à partir de la banque soustractive de phloème avec les sondes complexes. La taille approximative de ces fragments est indiquée en paires de bases. Les clones sont classés selon la spécificité de leur expression durant un stress salin dans le phloème. Seuls les clones ayant un rapport supérieur à 2 sont insérés dans ce tableau. Le rapport entre phloème et xylème est calculé après hybridation avec des sondes complexes obtenues à partir d'ARN extraits du phloème et du xylème de plantes stressées par du sel. Les criblages sont normalisés grâce à une sonde T7 (sonde interne du plasmide utilisé pour le clonage de la banque). Parmi les clones intéressants se trouvent le transporteur de mannitol AgMaT3 et la métallothionéine MT2. On trouve également la métallothionéine MT3, dont le signal dans le phloème témoin est nul mais dont le rapport Phloème/xylème est élevé. Afin d'affiner ces résultats, des "Northern blot" ont été réalisés en déposant des ARN extraits de phloème, xylème et parenchyme de stockage de pétioles de Céleris "témoins" ou "stressés". Les membranes sont hybridées avec des sondes radiomarquées réalisées à partir des séquences sélectionnées pour leur spécificité tissulaire (les inserts des clones testés sont extraits par digestion et purifiés avant marquage). Les résultats de ces hybridations sont présentés sur la fig. 3. Ces hybridations sont quantifiés grâce à une sonde ribosomique 26S de Céleri et les intensités sont mesurées par le système de révélation (Phospholmager : STORM 820). Les valeurs obtenues sont ramenées en pourcentage; le 100 % pour l'expression de chaque sonde dans le phloème "témoin" (PhT)), les comparaisons sont réalisées à partir de ce tissu (fig.4). 28 La sonde AgMaT3 s'est fixée plus spécifiquement sur le phloème "stressé" (PhN, 225 %), confirmant les précédents résultats. L'expression d'AgMaT3 est également stimulée par le stress salin dans le parenchyme de stockage (PaN, 171 %), et dans le xylème. Les résultats du Northern confirment que AgMaT3 est un gène dont l'expression est régulée par le stress salin. Les 2 métallothionéines AgMT2 et AgMT3 sont été et réagissent assez différemment. AgMT3 est principalement exprimé dans le phloème et cette expression est très fortement stimulée suite à un stress salin (224 %). La stimulation de l'expression d'AgMT2 dans le phloème suite au stress salin est moins forte (133 %). L'expression de ces 2 métallothionéines est principalement observée dans le phloème chez les plantes témoins et stressées (même si elle est également stimulée dans le xylème suite au stress salin, l'expression reste largement inférieure à celle mesurée dans le phloème. Les métallothionéines sont donc spécifiques du phloème et leur expression, surtout pour AgMT3, est effectivement induite par le stress salin. 11. E. Conclusion Le but de cette première partie était d'identifier des gènes dont l'expression est induite (ou stimulée) lors d'un stress salin dans le phloème de Céleri. La réalisation de la banque soustractive a nécessité une mise au point pour obtenir un maximum de clones : l'étape finale d'amplification de la banque n'a pu être réalisée qu'en utilisant une souche de bactéries différente de celle préconisée par le fournisseur du kit. Les premières analyses sur un nombre réduit de clones choisis au hasard ont montré que la soustraction était efficace. Le grand nombre de clones obtenus a conduit les inventeurs à chercher un système permettant de contrôler l'efficacité de la soustraction. Les minifiltres réalisés ont permis de tester plus de 700 clones pour leur capacité à hybrider de façon préférentielle des ARN provenant de phloème de plantes stressées que de plantes témoins. La normalisation du signal était réalisée par la sonde T7 présente sur le plasmide de clonage. Les clones donnant de façon reproductible les signaux les plus intenses ont été séquencés et soumis à une analyse informatique (tableau 1). Pour affiner ces résultats et vérifier si les séquences identifiées étaient bien spécifiques du phloème et du stress salin, les 29 plasmides correspondant ont été redéposés sur une nouvelle membrane et soumis à des hybridations avec des sondes radiomarquées réalisées à partir de phloème de plantes stressées ou non mais aussi de xylème des mêmes plantes, ne gardant que les séquences présentant une spécificité et induits par le stress salin. Un nombre limité de séquences a ainsi été sélectionné avant une dernière vérification sur Northern, incluant le parenchyme de stockage comme tissu supplémentaire. De ces résultats, il apparaît clairement que les 2 métallothionéines ainsi que le transporteur de mannitol AgMaT3 présentent les profils les plus intéressants. Les différents résultats obtenus ont amené les inventeurs à poursuivre les travaux par l'identification de promoteurs des gènes intéressants, à savoir les métallothionéines 2 et 3 et le nouveau transporteur de mannitol AgMaT3. L'étape suivante est donc la recherche du promoteur de ces gènes, à l'aide d'une banque génomique et le suivi de leur activation dans les différents organes et tissus de la plante, lors 40 d'un stress salin. 29 III. Caractérisation de AgMaT3, un nouveau transporteur de mannitol du Céleri L'analyse de la banque soustractive de phloème a permis de retenir trente clones présentant un signal fort en conditions de stress sur les 736 clones déposés sur les membranes. Une séquence partielle (181 bp) a été retenue car elle correspondrait à un transporteur de mannitol un composé qualifié de "soluté compatible" en réponse au stress salin. Aujourd'hui, 2 transporteurs de mannitol ont été identifiés chez le céleri: AgMaTI et AgMaT2 (Noiraud et al., 2001 a et b). Ill. 1. RACE-PCR sur la séquence partielle d'AgMaT3 Une RACE-PCR est réalisée sur des ADNc produits à partir d'ARN polyA extraits de phloème stressé, auxquels des adaptateurs ont été ligaturés, afin d'amplifier les parties 5' et 3'. Ces séquences d'ADNc 5' et 3' sont amplifiées par PCR entre des amorces choisies sur la séquence partielle de 181 pb (issue de la banque soustractive phloème), et des amorces spécifiques des adaptateurs selon les directives du kit "Marathon cDNA Amplification" (Clontech). Ces amorces sont choisies de telle sorte que les fragments 5' et 3' puissent se chevaucher et s'aligner afin de reconstituer la séquence d'ADNc complète. Une fois les séquences 5' et 3' obtenues, de nouvelles amorces sont dessinées afin d'amplifier l'intégralité de l'ADNc AgMaT3. (amorce 5' ; 5' GAC TAG TCC CAA GAA TCT GAG TTC ACC-3' et amorce 3' ; 5'- CCG CTC GAG CAT CAC AAA GCT ATA ATC C-3' L'ADNc d'AgMaT3 a une longueur totale de 1796 pb. II renferme un cadre ouvert de lecture de 1443 pb. Cette séquence a globalement la même taille que les deux autres transporteurs de mannitol (1766 pb pour AgMaT9 et 1781 pb pour AgMaT2). Ill. 2. Analyse de la séquence peptidique déduite de l'ADNc AqMaT3 Les 1443 pb du cadre ouvert de lecture de l'ADNc AgMaT3 codent une protéine de 481 acides aminés, plus courte que celles codées par AgMaT1 (513 aa) et AgMaT2 (524 aa). AgMaT3 montre 82 % et 73 % de similitude avec AgMaT1 et AgMaT2, respectivement. Cette taille plus courte est en fait due à un artefact de clonage. En effet, en utilisant de nouvelles amorces (amorce 5' : 5'-AGC TTC GAC CAT TGT TTC TC-3' et amorce 3' 5'- CCG CTC GAG CAT CAC AAA GCT ATA ATC C-3'), les auteurs de la présente invention sont parvenu à cloner un nouvel ADNc, de longueur supérieure. La séquence correspondant à la protéine la plus longue a été nommée AgMaT3, la séquence correspondant à la protéine la plus courte étant rebaptisée AgMaT3'. III. 3. Analyse de la nouvelle séquence nucléotidique de l'ADNc AqMaT3 L'analyse informatique de la séquence génomique d'AgMaT3 a mis en évidence un nouvel ATG (donnant un cadre ouvert de lecture de 1572 bp, SEQ ID N 14). En prenant cet ATG comme point de départ de la traduction (fig. 6 et 8) la protéine codée est plus longue (524 aa, SEQ ID N 8) que celle obtenue par RACE-PCR (481 aa). L'alignement des séquences protéiques AgMaT1, AgMaT2 et AgMaT3 prouve que ce résultat paraît beaucoup plus vraisemblable, avec une meilleure homogénéité quant à la longueur et à l'alignement de ces trois séquences (fig.6). 30 III. 4. Analyse de la nouvelle séquence peptidique déduite de l'ADNc AqMaT3 Les 1572 pb du cadre ouvert de lecture de l'ADNc AgMaT3 codent une protéine de 524 acides aminés, de même taille que celles codées par AgMaT2 et légèrement plus longue qu'AgMaTl (518 aa) (fig.7). La similitude entre ces trois transporteurs est forte, mais nuancée par des portions protéiques différentes (fig.7, espaces non grisés où les acides aminés ne trouvent d'homologue dans aucune des deux autres séquences étudiées), indiquant donc que ces transporteurs de mannitol sont bien distincts et notamment dans les parties N et C terminales. La protéine AgMaT3 de 524 acides aminés a une masse moléculaire théorique de 56 670 Da. Le point isoélectrique de cette protéine a été estimé à 8,3, valeur proche de celles déterminées pour AgMaTI et AgMaT2 (8,3 et 8,4 respectivement). Ill. 5. Caractérisation fonctionnelle de la protéine AgMaT3 Expression hétérologue dans la levure L'analyse des séquences protéiques montre qu'AgMaT3 présente de fortes homologies avec les deux autres transporteurs de mannitol. Les ADNc d'AgMaT3 et d'AgMaT3' sont clonés séparément dans le vecteur navette pDR 196, puis servent à complémenter la souche RS453. Après transformation, les levures possédant le plasmide AgMaT3/pDR sont isolées sur milieu SC glucose pour leur prototrophie à l'uracile, le gène URA3 étant porté par le plasmide. Afin de vérifier que le transport de mannitol était réalisé par AgMaT3, la cinétique d'absorption de [3H]-mannitol de la souche complémentée par le plasmide contenant ou non l'ADNc AgMaT3 ou AgMaT3' a été suivie. Trois clones indépendants sont testés correspondant à 3 évènements de transformations avec AgMaT3/pDR chez la levure. L'absorption de mannitol marqué au tritium a été suivie en fonction du temps (fig.5). Les levures exprimant le plasmide AgMaT3/pDR absorbent beaucoup plus de mannitol que les levures transformées avec pDR. Les valeurs d'absorption à 3 min sont très proches de celles notées pour AgMaTI dans les mêmes conditions de mesure. Ce résultat indique donc que AgMaT3 est un transporteur de mannitol. On notera que les résultats obtenus lors de l'absorption de mannitol par les levures AgMaT39pDR/RS453 indiquent que ce transporteur est fonctionnel alors que la protéine est délétée d'une quarantaine d'acides aminés. Ill. 6. Clonaqe de la séquence génomique AgMaT3 Le clonage des séquences génomiques est réalisé sur le même principe que celui des promoteurs, avec le kit "Universal Genome Walker" (Clontech) utilisant des amorces orientées en sens inverse de celles qui ont permis de séquencer le promoteur. La séquence codante d'AgMaT3 est entrecoupée par deux introns de 264 et 805 pb (fig. 8). La séquence génomique partielle représente 2772 pb, à partir du codon ATG. Les exons déduits de cette séquence génomique correspond parfaitement aux séquences d'ADNc sauf au niveau de l'initiation de la traduction. Présence d'un site de polyadénylation AATAAA en position 2822 (ou 179 pb après le codon stop) sur le brin sens (+) de la séquence génomique d'AgMaT3 (fig. 8). 31 Ill. 7. Analyse de l'expression d'AgMaT3 dans différents tissus de Céleri ayant subi ou non un stress salin Cette analyse est réalisée par RT-PCR en temps réel sur différents tissus (xylème, phloème, feuilles, et parenchyme) de plantes traitées ou non au NaCl 300 mM pendant trois semaines, 5 afin d'étudier le niveau d'expression et leur stimulation en réponse au stress. Les valeurs obtenues avec la sonde AgMaT3 sont normalisées par la sonde ribosomique 26S de Céleri. Une différence de 3,42 Ct (voir M4 Ct dans le tableau III) entre phloème "témoin" et "stressé" indique qu'il faut 3,42 cycles supplémentaires pour obtenir le signal dans le phloème témoin de même intensité que dans le phloème "stressé" ; L'expression d'AgMaT3 est plus 10 importante dans le phloème des plantes traitées au NaCl. De plus, les cycles de PCR permettant une amplification exponentielle, une différence de 3,42 Ct correspond à 23,42, soit 10,70 fois plus de transcrits AgMaT3 dans le phloème de plantes "stressées" que des "témoins". Ce résultat confirme ceux précédemment obtenus dans la banque soustractive et par Northern (fig.3 et tableau II). 15 Tissu testé o Ct AgMaT3 - 26S oM Ct Phloème Témoin 19,72 3,42 PhN>PhT Phloème NaCl 16,31 Feuilles Témoins 19,05 0,58 FN XT Xylème NaCl 18,72 Parenchyme Témoin 17,50 1,03 PaN>PaT Parenchyme NaCl 16,47 Tableau III. Résultats obtenus par RT-PCR en temps réel avec la sonde AgMaT3, dans différents tissus (phloème, xylème, parenchyme, feuilles) de plantes témoins ou traitées au NaCl (300 mM pendant 3 semaines). Ces résultats ont été corrigés par les valeurs de la sonde 20 ribosomique standard 26S de Céleri. Ct correspond au nombre de cycles nécessaires pour percevoir un signal d'intensité donné. à Ct est la différence entre les moyennes des Ct (moyennes des répétitions pour une sonde analysée dans un tissu donné) obtenus pour la sonde AgMaT3 après soustraction de la moyenne des Ct obtenus pour la sonde 26S. 4a Ct correspond à la comparaison (différence entre deux a Ct ) entre les différents tissus. Plus la 25 valeur de Ct est élevée, plus il a fallu de cycles pour obtenir un signal et donc moins il y avait de transcrits dans ce tissu. III. 8. Conclusion sur AgMaT3 Les informations obtenues lors de l'absorption de mannitol en fonction du temps ainsi que les 30 alignements des séquences nucléotidiques et protéiques permettent de conclure qu'AgMaT3 code un troisième transporteur de mannitol chez le Céleri branche. Les études par RT-PCR en temps réel et par Northern confirment que l'expression d'AgMaT3 est spécifique du stress salin. Ce transporteur de mannitol jouerait donc un rôle important dans la tolérance au stress salin. 32 IV. Recherche de promoteurs et expression hétérologue chez A. thaliana Pour rechercher des promoteurs spécifiquement induits par le stress salin dans le phloème, il était souhaitable de pouvoir disposer d'un système performant de clonage de promoteurs (les étapes de criblage d'une banque génomique sont particulièrement lourdes). De plus, une première tentative de recherche de promoteur du gène AgMaT1, à partir d'une banque génomique dans un phage X, avait été sans succès (Cyril Maingourd, 2001). Dans l'optique de recherche de plusieurs promoteurs, il devenait nécessaire d'utiliser une technique plus rapide. C'est pourquoi la technique d'amplification par PCR de régions promotrices à partir des séquences ADN (Universal GenomeWalker kit, clontech) a été utilisée. La recherche de séquences promotrices chez le Céleri a été effectuée sur les gènes choisis : AgMaT3 codant le nouveau transporteur de mannitol et les deux gènes de métallothionéines (AgMT 2 et AgMT 3). IV. A. Banque génomique et clonage de promoteurs L'ADN génomique de Céleri est séparé en quatre lots sur lesquels on fait agir quatre enzymes de restriction différentes, EcoRV, Dral, Sspl et Hpal, laissant des extrémités à bord franc, des adaptateurs spécifiques y étant ligaturés. On obtient ainsi 4 fractions différentes sur lesquelles sont réalisées des PCR avec une amorce spécifique de la séquence à amplifier (choisie proche du codon ATG de début de traduction) et une amorce spécifique de l'adaptateur. Les fragments obtenus sont de taille variable avec un profil particulier à chaque digestion. Seuls les fragments amplifiés les plus longs sont retenus pour le clonage et le séquençage. Quelques mises au point sont nécessaires pour l'obtention de cette banque quant au choix des enzymes de restrictions (une des enzymes conseillées par le fournisseur ne coupant pas l'ADN de Céleri) et du matériel utilisé. Pour chaque gène étudié, une région promotrice en amont de l'ATG est clonée dans un vecteur intermédiaire (pDONR 207) puis transférée dans un vecteur d'expression binaire (pBi-GUS-R1 R2 et pBi-GFP-R1 R2) par le système Gateway (Invitrogen). Ceci permet l'étude de l'expression de gènes rapporteurs (GUS ou GFP) sous contrôle des promoteurs décrits, après transformation de plants d'Arabidopsis. Les constructions réalisées ont servi à transformer les agrobactéries. Après vérification de la présence des plasmides dans les agrobactéries, des plantes d'Arabidopsis sont transformées selon la technique décrite dans la partie Matériels et Méthodes. IV. B. Promoteur du gène codant le transporteur de mannitol AgMaT3 Le promoteur d'AgMaT3 représente 589 pb en amont de l'ATG (fig. 8, SEQ ID N 4). Les régions promotrices d'AgMaT 9 et AgMaT 2 ont également été clonées et font 844 et 383 pb en amont de l'ATG. Ces trois séquences contiennent de nombreuses répétitions AIT caractéristiques des régions promotrices. Les sites de liaison de facteurs de transcription en réponse à différents stimulus sont recherchés grâce au logiciel PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/sigscan/). Seuls les éléments cis régulés par le signal sucre et la lumière sont analysés. La position des cassettes est indiquée par rapport au site d'initiation de la traduction (codon ATG). Les protéines régulatrices peuvent se fixer sur le brin sens, noté (+) ou sur son complémentaire, le brin anti-sens, noté (-). 33 IV. B. 1. Réponse à la lumière La boîte GATA (GATABOX, S000039), requise pour une régulation par la lumière (Teakle et al., 2002) a été identifiée 7 fois dans le promoteur d'AgMaT3 (en -299 (-), -289 (-), -269 (+), -264 (+), -254 (-), -154 (+) et -77 (+)). Le site de liaison GT-1 (GT1 CONSENSUS, S000198) (Terzaghi et Cashmore, 1995) est présent 5 fois en amont d'AgMaT3 (-392 (-), -291 (-), -264 (+), -201 (-) et -154 (+)). La séquence GATAA (I-BOX, S000199), très conservée en amont de gènes régulés par la lumière aussi bien chez les mono- et dicotylédones (Terzaghi et Cashmore, 1995), est retrouvé 3 fois en amont d'AgMaT3 (en -290 (-), -264 (+) et -154 (+)). La "Tbox" (TBOXATGAPB, S000383, ACTTTG), impliquée dans l'activation de gènes par la lumière, a été trouvée dans le promoteur d'AgMaT3 en -455 (-). La transcription en réponse à la lumière du gène psaDb de Tabac dépend de l'élément Inr ("initiator" INRNTPSADB, S000395, CITTCANT(CIT)2, élément présent 2 fois en amont d'AgMaT3 (-387 (+) et -189 (-)). IV. B. 2. Réponse aux sucres Les sucres sont maintenant considérés comme des molécules capables de réguler l'expression de nombreux gènes. La boîte PYRIMIDINEBOXOSRAMYIA (CCTTTT, S000259), de réponse à la gibbérelline et également impliquée dans la répression par les sucres (Morita et al., 1998) est présente dans la séquence promotrice d'AgMaT3, deux fois (-398 (+) et -219 (-)). L'élément TATCCA (TATCCAOSAMY, S000403), site de fixation de protéines MYB (Lu et al., 2002) est présent une seule fois dans le promoteur d'AgMaT3 (-299 (+)). L'élément "W-box" (WBOXHVISOI, S000442, TGACT), site de liaison du facteur de transcription SUSIBA2 (sugar signaling in barley, inductible par le sucre), est identifié à trois reprises dans le promoteur d'AgMaT3 (-419 (-), -367 (-) et -74 (-)). Ces éléments suggèrent une régulation par les sucres (glucose, saccharose). IV. C. Promoteurs d'AgMT2 et 3 Les métallothionéines ont été trouvées à la fois induites dans le phloème et en cas de stress salin, mais aussi en cas d'attaque par les pucerons et les virus (Fanchon Divol, 2003). Les résultats de la présente analyse du stress salin ont montré que les métallothionéines AgMT2 et AgMT3 sont spécifiquement exprimées en réponse à ce stress (fig. 3). Les régions promotrices représentent 1319 et 648 pb et ont été clonées en amont des gènes rapporteurs (GUS et GFP) des vecteurs pBi, pour AgMT2 et AgMT3 (fig. 9 et 10). IV. D. Analyse des cassettes de réponse au stress L'analyse informatique des promoteurs a révélé de nombreux éléments-cis potentiels liés à des stress abiotiques. IV. D. 1. Réponse à des stress abiotiques L'acide abscissique (ABA) est présent chez toutes les plantes supérieures. Cette phytohormone intervient dans plusieurs événements du développement des graines et régule l'expression de nombreux gènes en réponse aux stress environnementaux comme la déshydratation, le sel et le froid (Busk et Pages, 1998). L'analyse des promoteurs d'AgMaT3, AgMT2 et AgMT3 a mis en évidence des éléments cis-régulateurs ABRE (ABA-responsive element), sur lesquels de 34 nombreux ABF (ABRE binding factor, membres d'une sous-famille de protéines bZIP) se lient en réponse à une voie de signalisation ABA dépendante (Kang et al., 2002), afin d'induire l'expression d'un grand nombre de gènes (Choi et al., 2000). Chez Arabidopsis, l'induction du gène rd22 par l'ABA et la déshydratation fait intervenir des facteurs de transcription MYC et MYB (Abe et al., 2003 et 1997) se liant sur sites spécifiques CANNTG (MYCCONSENSUAT, S000407) ou CITAACGITG (MYB2CONSENSUSAT, S000409), A/TAACCA (MYBIAT, S000408). La séquence CANNTG (S000407) est également le site de liaison d'ICE (inducer of CBF expression) qui régule la transcription des gènes codant un CBF, en réponse au froid (Chinnusamy et al., 2003). Le site S000407 est présent en amont d'AgMaT3 (-550 (+/-), fig. 8 et 11) et d'AgMT2 (-369 (+1-) et -158 (+l-), fig. 9 et 11). Ce site n'a pas été identifié dans le promoteur d'AgMT3 (fig. 10 et 11). La séquence S000409 a été analysée en amont du gène AgMT2 en -820 (+), d'AgMT3 en -575 H. S000408 est présent dans le promoteur AgMT2 en - 642. Un facteur de transcription MYB d'Arabidopsis, induit par la déshydratation et le stress salin (Urao et al., 1993) reconnaît et se lie à la séquence consensus TAACTG (MYB2AT, S000177). Celle-ci a été caractérisée en amont d'AgMT3 en -575 (+). La séquence CNGTTG/A (MYBCORE, S000176) représente le site de fixation de MYB qui est également induit par le stress hydrique chez A. thaliana. Cette séquence est identifiée dans le promoteurs d'AgMT2 en -820 (-) et AgMT3 (-575 (-) et -563 (-)). L'expression thermorégulée d'un gène hs (heat shock) de Soja (Rieping et Schoffl, 1992) est régulée via un élément HSE du promoteur (heat shock element), mais cette activité requiert des séquences additionnelles : des boîtes CCAAT (CCAATBOXI, S000030). Celles-ci sont présentes en amont du gène AgMaT3 (-176 (+)). Cette boîte n'est pas présente en amont d'AgMT3 alors qu'elle a été identifiée six fois dans le promoteur d'AgMT2 en -1280 (-), -834 (-), -1263 (-), -693 (-), -1057 (-) et -624 (+). IV. D. 2. Réponse à des stress biotiques De nombreuses voies de signalisation en réponse aux stress biotiques et abiotiques sont entrecroisées. Les éléments de liaisons de facteurs de transcriptions en réponse à des attaques pathogènes et à la blessure ont également été retenus comme candidats potentiels lors de l'induction par le stress salin. Quelques-uns d'entre eux ont été énumérés lorsque leurs motifs ont été détectés sur les promoteurs d'AgMaT3, AgMT2 et AgMT 3. L'expression de nombreux gènes de défense sont régulés par l'intermédiaire d'éléments cis tels que la boîte GCC (GCCCORE, GCCGCC, S000430), identifiée en -284 (-) en amont d'AgMaT3. Le motif AG (AGATCCAA, AGMOTIFNTMYB2, S000444) est un élément suffisant pour conférer une réponse à la blessure et suite à un traitement éliciteur (Sugimoto et al., 2003). Le motif S000444 a été retrouvé dans le promoteur d'AgMT3 en -452. Les éléments les plus importants en réponse aux stress biotiques sont les boîtes W, sites de fixation des protéines WRKY (superfamille de facteurs de transcription, impliqués dans la régulation de programmes physiologiques variables comme la défense contre un pathogène, la sénescence et le développement des trichomes (Eulgem et al., 2000)). Elles se lient aux boîtes W séquence palindromique TGAC comme la "WB box" (WBBOXPCWRKYI, TTTGACT, S000310), présente en amont d'AgMaT3 en -74 (-) et d'AgMT2 en -169 (+). 35 Le gène NPR1 d'Arabidopsis, régulateur positif de la résistance inductible contre les maladies, contient dans son promoteur la séquence IN-box" (VVBOXATNPRI, TTGAC, S000390), site de fixation de WRKY induites par une infection pathogène ou un traitement à l'acide salicylique (Yu et al., 2001). Celui-ci a été identifié trois fois dans les promoteur d'AgMaT3 (-418 (-), -366 (-) et - 73 (-)), d'AgMT2 en -168 (+) et d'AgMT3 en -496. Ces éléments ont été placés en fonction de leur emplacement sur les régions promotrices d'AgMaT3 d'AgMT2 et d'AgMT3 (fig. 11). La séquence promotrice d'AgMT2 comporte peu de sites de liaison MYB, MYC ou en réponse à l'ABA mais pas moins de cinq éléments HSE sur le brin (-) et un sur le brin (+), ainsi qu'un élément LTRE. L'expression de ces promoteurs en amont d'un gène rapporteur, dans les tissus et organes de la plante, est donc intéressante à suivre lors d'un stress salin. IV. E. Analyse fonctionnelle des régions promotrices par expression hétérologue chez A. thaliana Chaque séquence identifiée et clonée chez le Céleri a été placée en amont de deux gènes rapporteurs GUS et GFP, afin de suivre leur expression chez A. thaliana. Le clonage a été réalisé en utilisant la technologie "gateway' (Invitrogen) entre les bordures droite et gauche d'un vecteur pBI. Les régions en amont de l'ATG qui ont été clonées pour chacun des gènes sont montrées dans la fig. 12. Les longueurs des régions clonées sont 548 (AgMaT3), 649 (AgMT3) et 1319 paires de bases (AgMT2). Toutes les séquences clonées incluent le site putatif d'initiation de la transcription (situé en position 541 pour AgMaT3, en position 1502 pour AgMT2 et en position 639 pour AgMT3). La transformation effective des plantes est doublement vérifiée, par germination en présence de kanamycine et par contrôle PCR avec des amorces spécifiques NPT-II. Pour toutes les expériences, deux contrôles sont ajoutés : une lignée CoI10 non transformée et des plantes transformées par le gène uiad sous le contrôle du promoteur AtPP2-1 (Dinant et al, 2003), qui donne un fort signal dans le phloème. Les expériences sont répétées sur 5 plantes pour chaque construit de promoteur. La survie des plantes est testée après un traitement au NaCl à des concentrations comprises entre 50 et 250 mM. La concentration idéale pour induire une réponse au stress salin, sans être létal pour la plante, ni empêcher le développement d'une hampe floral et la production de graines, a été déterminée à 100 mM. La réponse est suivie par une inspection visuelle de la coloration des feuilles avant et après un stress salin et de la section transversale pour vérification de la coloration du phloème. L'observation générale des feuilles des plantes contrôles (non soumises au stress) ne fait apparaître, après coloration de GUS, aucune coloration spéciale sauf dans le cas de AtPP2-1 et AgMT2. Dans tous les cas, la coloration est limitée aux nervures. Pour AtPP2-1 et AgMT2, toutes les nervures sont colorées positivement (type I à IV, fig. 13C) alors que dans le cas de AgMaT3 et AgMT3, seules les nervures majeures (type I) sont colorées (fig. 13A et E). Dans tous les cas, les nervures dans les pétioles sont également colorées. De plus, les jeunes feuilles et celles matures sont colorées de façon identique. Pour déterminer la localisation exacte de l'expression de GUS dans les faisceaux vasculaires, des sections transversales sont réalisées sur du matériel congelé. Pour les plantes montrant 36 une forte coloration (AtPP2-1 et AgMT2 fig. 13D), la coloration bleue est évidente dans les cellules du phloème mais également parfois dans les cellules environnantes. Cela peut être dû à la diffusion de la coloration, du fait qu'il a déjà été montré que la coloration GUS est limitée aux cellules du phloème dans le cas de AtPP2-1 (Dinant et al 2003). Pour les construits AgMaT3 (fig. 13B) et AgMT3 (fig. 13F), la coloration est aussi évidente dans les cellules du phloème, confirmant ainsi l'identification initiale des ADNc correspondant comme spécifiques des cellules du phloème. Une coloration est également détectée des les cellules parenchymes du xylème. Parmi ces cellules se trouvent vraisemblablement des cellules associées aux vaisseaux (VAC vessel-associated cells ), qui sont considérées comme très similaires du point de vue de la fonction aux cellules comparables du phloème (Fromard et al, 1995). L'induction par un stress salin peut être soit spécifique du présent test, soit faire partie d'une réponse de la plante au stress d'ordre plus général. Afin de tester cette hypothèse, des groupes de 5 plantes provenant des mêmes transformants ont été soumis à un stress osmotique (absence d'arrosage pendant 4 jours), à un stress au froid (4 jours à 4 C), à un stress à la chaleur (4 jours à 30 C) et à un stress par blessure (feuilles pincées avec une pince 3 fois de suite, en prenant soin d'éviter les nervures majeures. Les plantes ont été récoltées le jour suivant le stress. Un groupe de 5 plantes indépendantes a été utilisés comme contrôle. Les plantes sont colorées comme pour le stress salin. Toutes les plantes (excepté pour les stress hydrique et salin) sont arrosées deux fois par jour avec 10mL d'eau du robinet ou une solution d'engrais (une fois pendant la période de stress). Les feuilles (totalement matures ou les jeunes pousses) sont échantillonnées à la fin de la période de stress et utilisées pour la coloration histochimiques GUS (Jefferson et al, 1987). D'autres groupes de feuilles sont congelées dans l'azote liquide et stockées à -80 C jusqu'aux tests GUS fluorimétriques (Jefferson et al, 1987). Pour les plantes AgMT2, il a été difficile d'observer une différence entre les différents stress, dans la mesure où la coloration est déjà particulièrement intense dans les plantes contrôles. Toutefois, aucune différence n'a été observée dans le profil de coloration. Dans le cas de AgMaT3, toutes les formes de stress donnent des profils de coloration similaires, à l'exception du stress hydrique et du stress par blessure où aucun signal n'a été détecté, bien que les plantes soient toujours en bonne santé. Dans les plantes AgMT3, la coloration GUS est évidente dans toutes les formes de stress, à l'exception du stress par blessure. Les réponses au stress par blessure utiliseraient une voie de signalisation différente et ne conduisent pas à l'activation des gènes étudiés. Les résultats sont très semblables à ceux obtenus avec le céleri. Aussi bien la région 5' de AgMT3 que celle de AgMaT3 conduisent à l'expression du gène rapporteur dans le phloème (et dans une certaine mesure également dans le xylème), mais uniquement dans les plantes stressées et non dans les plantes contrôles. Dans le cas de AgMT2, une expression importante a été observée dans le phloème de plantes Arabidopsis transformées, et ce même dans des conditions de contrôle. Un point intéressant est le fort taux d'expression de la fusion entre le 37 promoteur AgMT2 et GUS dans Arabidopsis dans toutes les nervures de la feuille (fig. 13C), ce qui indique que le profil d'expression est spécifique du phloème. Exemple 3 : transformation de Brassica et de tomates. Protocole de tranformation Brassica: Dérivé de Brasileiro et al, 1992 et de Bethomieu (thèse de doctorat ; Obtention de Choux transgéniques tolérants aux noctuelles par transformation génétique avec un gène codant pour une endotoxine de Bacillus thuringiensis). 1. Semis et Germination Les graines sont désinfectées 25 minutes sous agitation dans une solution de bayrochiore (3 comprimés/litre d'eau déminéralisée) avant d'être rincées à l'eau stérile puis séchées sur buvard. Stérilisées, elles sont semées dans des tubes sur un milieu de germination M1 (4.4 g/1 de MS 5519 (Sigma), 20g/l de saccharose et 8g/I d'agar-agar (pH 5.8)). Les graines sont cultivées 15 jours à 20 C (photopériode de 16h) pour obtenir des plantules au stade 2-3 feuilles. 2. Culture des bactéries On utilise 2 Agrobactéries: la C 58pMP90 contient le plasmide pSCV avec le T-DNA comportant la cassette d'expression du gène reporter (gène GUS), sous le contrôle des séquences promotrices de la présente invention (sélection Kanamycine :50 pg/mL; Rifampicine :20 pg/mL), la seconde contenant le t-DNA tumorigène (pT182-139) (sélection Kanamycine :50 pg/mL; Rifampycine :50 pg/mL et Gentamycine :20 pg/mL) Les bactéries sont pré-cultivées dans 20m1 de milieu LB (Luria Bertani de Difco) contenant les antibiotiques de sélection plus 1 ml de glycérol-stock de la bactérie. Ces pré-cultures sont mises sous agitation (200 rpm), à 28 C pendant 24h. Les cultures sont réalisées en ajoutant 1 ml de la pré-culture à 20 ml de milieu LB contenant les antibiotiques de sélection. Les cultures sont mises sous agitation (200rpm), à 28 C, durant une nuit. 3. Préparation des bactéries Si la densité optique à 600nm des 2 cultures d'agrobactéries après une nuit n'est pas de 1, elles sont centrifugées 10mn à 4000rpm. Le culot bactérien est repris avec un volume suffisant du milieu liquide M4 contenant 0.88 g/1 de MS 5519 et 10g/l de saccharose (pH 5.8) afin d'arriver à la DO recherchée. Les 2 bactéries sont mélangées suivant le ratio Bact 2/Bact 1: 1/6 4. Inoculation des plantes et repiquage Les plantules sont inoculées au moyen d'une pince à griffes DEMARTEL 20 cm, trempée dans le mélange bactérien et utilisée pour blesser la tige en trois points différents, au-dessus des cotylédons. Les plantules inoculées sont cultivées à une température de 20 C (photopériode 16h) jusqu'à apparition des tumeurs aux points de blessure. Les tumeurs sont repiquées sur un milieu M2 contenant 4.4 g/1 de MS 5519, 30g/l de saccharose, 8g/l d'agar-agar, 400mg/I d'antibiotique (Augmentin) (pH 5.8) 5. Régénération des bourgeons Environ 1 mois après le repiquage des tumeurs, les bourgeons apparaissent. Lorsqu'ils ont une taille de 3 à 4 cm, ils sont isolés et mis en tubes sur un milieu M3 contenant 4.4 g/l de MS 5519, 40 30g/l de saccharose, 8g/l d'agar-agar (pH 5.8) 200mg/l d'antibiotique (Augmentin) (pH 5.8). 38 Les tumeurs sont fragmentées et repiquées sur milieu M2 pour régénérer d'autres bourgeons. Des plantules sont enracinées 3 à 4 semaines après isolement des bourgeons sur milieu M3. 6. Acclimatation des plantes Les plantules sont transférées en godets de terreau et maintenues à 22 C et 80% d'humidité relative pendant une semaine. Elles sont ensuite conduites comme des plantes issues de semis (température 20 C et hygrométrie ambiante), rempotées dans des pots de culture pour la production de graines. Les siliques arrivent à maturité en 5 mois. Protocole de transformation Tomate (système de transformation binaire): Dérivé de Filatti et al, 1987. 1/ Semis et germination Les graines, placées dans un carré de moustiquaire fermé par des agrafes, sont désinfectées dans une solution de bayrochlore (2 à 3 pastilles par litre d'eau distillée et quelques gouttes de Tween) durant 20 minutes. Elles sont ensuite rincées trois fois pendant 15 minutes dans de l'eau distillée stérile, puis séchées rapidement dans du papier buvard. Les graines stérilisées sont semées dans des bocaux sur un milieu de germination TI (MS 6899, Sigma) comprenant 2,2 g/l de MS 6899, 2m1/l de Vitamines de Nitsh & Nitsh, 1965, 30g/l de saccharose (pH 5.9, ajusté avec KOH), et 8g/l d'agar-agar. Les boites sont laissées 24 heures à l'obscurité, dans une étuve à 26 C. Placées à la lumière, les cotylédons se développent. Ils sont utilisables 7 à 8 jours après le semis. 2/ Préculture des expiants sur TT2 solide Un expiant est découpé par cotylédon et placé ensuite sur le milieu T2 de préculture comprenant 4,4 g/1 de MS 6899 2ml/l de Vitamines de Nitsh & Nitsh, 0,9 mg/I de Thiamine, 200mg de Potassium dihydrogenophosphate (KH2PO4), 30g/l de saccharose (pH 5.9, ajusté avec KOH), 8g/l d'agar-agar, 0,2mg/l de 2,4-D (Sigma), 0,lmgll de Kinétine (Sigma), 200pmol/l d'Acétosyringone (Aldrich). La face inférieure des expiants est posée contre le milieu. Les boites sont laissées à la lumière, à 26 C pendant 24h. 3/ Préparation des bactéries : On utilise l'agrobactérie EHA 105 contenant le plasmide pB1101 avec le T-DNA comportant la cassette d'expression du gène de sélection (gène de résistance à la kanamycine) et le gène rapporteur (gène Gus de la béta-glucuronidase, sous le contrôle des séquences promotrices selon la présente invention). (antibiotique Kanamycine :50 pg/mL; Rifampicine :50 pg/mL) Une pré-culture des bactéries est faite dans un tube Falcon de 50ml, par ensemencement de 1 ml de glycérol-stock de la bactérie dans 10 ml de milieu de culture de milieu LB ou TP (Yeast- Tryptone de Difco) contenant les antibiotiques de sélection. Ces pré-cultures sont mises sous agitation (250 rpm), à l'obscurité, à 28 C pendant 24h. Les cultures sont réalisées en ajoutant 1 ml de la pré-culture à 20 ml de milieu LB ou YT contenant les antibiotiques de sélection. Les cultures sont mises sous agitation (250rpm), à l'obscurité, à 28 C pour la nuit. Le lendemain matin, la DO à 600nm d'un ml de culture bactérienne est mesurée. Si différente de 2, les 39 cultures sont centrifugées pendant 10mn à 3000 RPM. Le surnageant est éliminé et le culot bactérien re-suspendu avec un volume adéquat de milieu T2 liquide. 4/ Coculture : A 28,5ml de milieu de coculture (milieu T2 liquide avec seulement l'acétosyringone, sans Kinétine ni 2,4-D) par boîte de Pétri, sont ajoutés 2,5m1 de solution bactérienne à la DO600nR, 2. Les expiants sont prélevés sur le milieu de préculture et ajoutés dans les boites de Petri pour incuber avec les bactéries durant 30 minutes. Les expiants sont ensuite séchés sur du papier buvard stérile puis replacés sur le même milieu T2 solide ayant servi pour la préculture. Les boites sont placées à l'obscurité, à 26 C pendant 48h. 5/Lavage des expiants ; Environ 150mL de milieu de lavage liquide MS 6899 est mis dans chaque pot stérile (usage unique) et on y fait tremper 50 expiants au maximum (milieu T3 : 4,4g/L de MS 6899, 2mUL de vitamines de Nitsh &Nitsh, 30g/L de Saccharose et 400mg/L d'Augmentin (pH 5.9 ajusté avec KOH)). Après une dizaine de minutes de trempage on récupère les expiants à l'aide d'une pince et on les sèche rapidement sur du papier buvard stérile. 6/ Repiquaqe des expiants en milieu de régénération : Les expiants sont repiqués sur milieu T3 solide coulé en boîtes de Petri hautes. Milieu T3 solide : 4,4g/l de MS 6899, 2 mlll de vitamines de Nitsh &Nitsh, 30g/l de Saccharose, 8g/l d'Agar-agar, 2mg/I de Zéatine (Sigma), 500mgll d'Augmentin (600mgIl lorsqu'on utilise la bactérie LBA4404), 100mg/I de Kanamycine (Sigma). A l'issue de 2 semaines à la lumière à 26 C, les expiants sont coupés en deux afin de différencier les événements de transformation (les 2 extrémités d'un même expiant sont considérées comme distinctes) et les repiquer sur un milieu T3 neuf. Le nombre d'expiants ayant régénéré 21 jours après la coculture est compté. 7/Préparation du milieu de développement Les bourgeons sont séparés de l'expiant primaire 4 à 6 semaines après la coculture et placés sur milieu sélectif T4 (2,2gIl de MS 6899, 2 ml/l de vitamines de Nitsh &Nitsh, 20g/l de Saccharose, 8g/l d'Agar-agar, 0,5mg/l de Zéatine (Sigma), 300mg/l d'Augmentin (600mgIl lorsqu'on utilise la bactérie LBA4404), 50mg/l de Kanamycine (Sigma). 8/ Enracinement des bourgeons transformés : Lorsque les bourgeons atteignent quelques centimètres de haut, ils sont repiqués en gros pots TPS sur le milieu d'enracinement T5 : 2,2g/l de MS 6899, 2 ml/l de vitamines de Nitsh &Nitsh, 20g/l de Saccharose, 2,5g/I de Phytagel, 0,5mgll d'AIA (Sigma), 300mg/l d'Augmentin (600mg/l lorsqu'on utilise la bactérie LBA4404), 50mg/l de Kanamycine (Sigma). Les plantules synthétisant de la chlorophylle et développant des racines sont considérées comme transformées. Après détermination du taux de ploïdie de chaque plantule par cytométrie de flux ou comptage des amyloplastes, les plantules diploïdes sont acclimatées puis plantées en serre. 9/Acclimatation-Plantation en serre Les plantules bien développées sont enracinées en godets de 10 cm, sur du Steckmedium. Elles sont recouvertes pendant deux semaines d'un film plastique afin de maintenir une forte 40 hygrométrie. Les plantules sont alors plantées en pots de 7 litres remplis de Pouzzolane.40 Les séquences SEQ ID identifiées dans la présente demande sont les suivantes : SEQ ID N 1 : séquence promotrice issue du gène AgMaT3 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 2: séquence promotrice issue du gène AgMT2 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 3: séquence promotrice issue du gène AgMT3 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 4: séquence 5' complète issue du gène AgMaT3 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 5 : séquence 5' complète issue du gène AgMT2 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 6: séquence 5' complète issue du gène AgMT3 d'Apium graveolens ; SEQ ID N 7: séquence complète du gène AgMaT3 ; SEQ ID N 8 : protéine putative AgMaT3 déduite de la séquence d'ADN correspondante ; SEQ ID N 9: séquence complète du gène AgMT2 ; SEQ ID N 10 : protéine putative AgMT2 déduite de la séquence d'ADN correspondante ; SEQ ID N 11: séquence complète du gène AgMT3 ; SEQ ID N 12 : protéine putative AgMT3 déduite de la séquence d'ADN correspondante ; 15 SEQ ID N 13 : séquence du gène AgMaT3, sans la partie promotrice ; SEQ ID N 14 : ADNc codant pour la protéine AgMaT3 (SEQ ID N 8). 41 Bibliographie Abe H., et al., 2003. 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Séquence d'acides nucléiques comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID N 1, 2 ou 3, telle que : ladite séquence d'acides nucléiques présente une activité de promoteur transcriptionnel, et ladite partie comprend au moins 30 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3. 2. Séquence selon la revendication 1, où ladite partie comprend au moins 50 nucléotides consécutifs de SEQ ID N 1, 2 ou 3. 3. Séquence selon la revendication 1 ou 2, présentant une activité de promoteur transcriptionnel dans les cellules végétales. 4. Séquence selon la revendication 3, où ladite activité de promoteur transcriptionnel est induite par un stress biotique ou abiotique. 5. Séquence selon la revendication 3 ou 4, où ladite séquence présente une activité de promoteur transcriptionnel préférentiellement dans les tissus vasculaires, notamment dans le phloème et/ou le xylème. 6. Séquence selon l'une des revendications 3 à 5, présentant une activité de promoteur transcriptionnel dans des cellules de céleri (Apium graveolens L.). 7. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. 8. Séquence d'acides nucléiques présentant par rapport à une séquence selon la revendication 1, moins de 5 mutations ponctuelles. 9. Séquence d'acides nucléiques présentant une activité de promoteur transcriptionnel et ayant au moins 70% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N 1, 2 et 3, de 35 préférence au moins 80% d'identité, de préférence 90% d'identité. 10. Séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 9, où ladite séquence est de l'ADN double-brin ou de l'ADN simple brin. 40 11. Séquence d'acides nucléiques complémentaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 10. 12. Séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 11 pour une utilisation dans des plantes transgéniques. 4445 13. Sonde d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec SEQ ID N 1, 2 ou 3 dans des conditions de forte stringence, ladite sonde ayant au moins 25 nucléotides. 14. Construit d'ADN consistant en ou comprenant une séquence promotrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et une séquence d'intérêt à transcrire en aval, tel que la transcription de ladite séquence à transcrire soit sous le contrôle de la séquence promotrice. 15. Construit selon la revendication 14, où ladite séquence promotrice est hétérologue par rapport à la séquence d'intérêt à transcrire. 16. Construit selon la revendication 14 ou 15, où ladite séquence d'intérêt est une séquence codante. 17. Construit selon l'une des revendications 14 à 16, où ledit construit est un vecteur. 18. Construit selon l'une des revendications 14 à 17, où ledit construit est un plasmide. 19. Cellule de plante transformée par un construit selon l'une des revendications 15 à 18. 20 20. Cellule selon la revendication 19 où ladite séquence est intégrée dans le génome de la cellule. 21. Plante transgénique comprenant dans son génome une séquence selon la 25 revendication 1 exogène par rapport à la plante. 22. Plante selon la revendication 21 où ladite séquence est insérée dans le génome nucléaire sous forme stable. 30 23. Plante selon la revendication 21 où ladite séquence est insérée dans le génome mitochondrial ou chloroplastique. 24. Plante transgénique comprenant des cellules selon la revendication 19 ou 20, ou partie d'une telle plante, notamment semences, matériel de reproduction, graines, racines, 35 fleurs ou fruits, lesdites parties étant transgéniques. 25. Plante selon la revendication 21, où ladite plante est une monocotylédone. 26. Plante selon la revendication 21, où ladite plante est une dicotylédone. 27. Plante selon la revendication 21, où ladite plante est une plante d'intérêt agronomique et notamment une plante de la famille des Cucurbitacées, Chénopodiacées, Cruciféracées, Poacées, Légumineuses, Apiacées, Rosacées, Valérianacées, Solanacées ou Astéracées. 45. Plante selon la revendication 21, où ladite plante est une plante de tomate, une plante de melon ou une laitue. 29. Procédé de préparation d'une plante transgénique comprenant : a. L'obtention d'un construit selon l'une des revendications 14 à 18 ; b. L'introduction du construit dans une cellule provenant d'une plante d'intérêt, c. La régénération d'une plante transgénique, d. Optionnellement, la prolifération de la plante pour obtenir une descendance. 30. Plante selon la revendication 21, obtenue à l'issue de l'étape d) du procédé selon la revendication 29. 31. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ou bien d'un construit selon l'une des revendications 14 à 18, pour la réalisation de plantes transgéniques. 46