Brevet FR2887775A1 — publié le 20070105

L'invention concerne le domaine de la cosmétique et de la pharmaceutique, notamment le domaine de la dermatologie. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de levures en tant qu'agent actif inducteur de la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique. Les protéines SIRT font partie de la famille des Sirtuines, ce sont des protéines nucléaires, NAD+ dépendantes, jouant un rôle important dans la désacétylation des histones. Les gènes SIR (Silent Information Régulators) , codant pour les protéines SIR, ont, pour la première fois, été décrits chez S. cerevisiae en 1979 (Rine J et Al., Genetics 1979). Plus tard, il a été démontré qu'une surexpression de la protéine SIR2P, chez C. elegans, permettait d'augmenter la durée de vie de cet organisme (Tissenbaum et AL, Nature 2001). Cette étude émettant ainsi l'hypothèse selon laquelle ces protéines seraient liées à la longévité. La protéine SIRT1 est la sirtuine humaine la mieux caractérisée, interagissant avec de nombreux régulateurs de la transcription. La protéine humaine SIRT1 a été décrite comme étant impliquée dans la régulation de p53 (Cheng HL et Al. Proc Nad Acad Sci U S A. 2003) ; et, plus récemment, comme un modulateur de la sénescence cellulaire (Langley E et Al., EMBO J 2002). D'autres protéines humaines Sir ont été découvertes (SIRT2, SIRT3, SIRT4-7). La protéine humaine SIRT2 a été peu étudiée, quelques études ont cependant démontré son rôle dans le contrôle de l'activité mitotique (Dryden SC et Al., Mol Cell Biol. 2003) ainsi que son implication dans la régulation de la protéine p53 (Vaziri H et Al., Cell. 2001). A ce jour, les sirtuines désacétylases sont considérées comme une famille d'enzymes occupant un rôle important dans la régulation de la mort cellulaire et dans son cycle de vie (Porcu M and Chiarugi A., Trends Pharmacol Sci., 2005). Il a récemment été démontré que cette protéine est présente de manière significative dans la peau et qu'elle occupe un rôle très important. Il a en effet été démontré que la protéine SIRT, et plus précisément la protéine SIRT1, était exprimée dans les cellules de la peau et que son expression était en relation avec les différents stress que rencontrent les cellules cutanées. Il a notamment été mis en évidence que l'induction de l'expression de cette protéine, par différents agents, permettait de protéger les cellules et de mieux les aider à lutter contre le stress et le vieillissement intrinsèque de celles-ci. La protéine SIRT1 occupe ainsi une fonction très importante dans le vieillissement et la protection cellulaire. Ainsi, une augmentation de son expression permet à la peau de mieux résister au stress qui l'entoure, c'est-à-dire de mieux lutter contre les phénomènes d'oxydation et donc, plus généralement, de mieux lutter contre le vieillissement. Plus globalement, l'induction de l'expression de cette protéine dans les cellules de la peau apporte une amélioration générale des mécanismes de protection cellulaire et permettrait d'augmenter la durée de vie cellulaire. La présence de cette protéine au niveau de la peau, ainsi que les bénéfices de sa surexpression, met donc en perspective de nouveaux modes d'action et de nouveaux moyens afin d'améliorer la survie cellulaire, et notamment la survie cellulaire des cellules cutanées; mais aussi, plus généralement des moyens afin d'améliorer les propriétés de la peau. Par améliorer les propriétés de la peau, on entend tous les moyens destinés à conserver ou à rétablir un bon fonctionnement de la peau ou encore tout moyen qui sert à préserver ou à améliorer son apparence et/ou son aspect. Ainsi une augmentation de la synthèse des protéines SIRT permettra à la peau de prévenir les manifestations cutanées du vieillissement, d'être mieux protéger contre les agressions extérieures et contre les stress auxquels elle est soumise. Par ailleurs, et selon plus une vision plus globale de l'invention, une induction de SIRT permettra d'avoir des effets anti-inflammatoires et anti- irritants tout comme une action positive sur la régénération tissulaire et sur la cicatrisation par une action, par exemple, sur l'augmentation de la synthèse de protéines constitutives de la matrice extra-cellulaire. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un extrait de levures, en tant qu'agent actif inducteur de la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau. Cet actif pourra être utilisé seul ou en association avec au moins un autre agent actif, dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou dermopharmaceutique et/ou dermatologique. En effet, par leur activité inductrice de la synthèse des protéines SIRT, ces extraits de levures 25 présentent des activités biologiques spécifiques qui les rendent directement utilisables dans des préparations ou compositions cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques. L'utilisation d'un extrait de levures, dans le domaine de la cosmétique, a déjà été décrit dans de nombreux brevets, notamment au niveau des soins de la peau, ainsi que le décrit le brevet FR 2 826 576. Toutefois, son utilisation en tant qu'agent activateur de la synthèse des protéines SIRT n'a pas encore été exposée. A ce jour, très peu d'utilisations de composés inducteurs de synthèse de protéines de la famille des SIRT, dans les cellules de la peau, ont été décrites. Parmi ces composés susceptibles d'activer la synthèse des protéines SIRT de la peau, on peut citer différentes molécules dont, par exemple, les polyphénols. Plus particulièrement, on peut citer: des dérivés de trans-stilbène (resveratrol, piceatannol), des dérivés des chalcones (isoliquiritigenine, butéine), des dérivés de flavones (fisteine, luteoline, quercetine). Ainsi, le principal objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un nouveau composé capable d'induire la synthèse des protéines SIRT. L'invention concerne l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un extrait de levures, en tant qu'agent actif inducteur de la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique. Préférentiellement selon l'invention, les composés activeront une classe de protéines SIRT particulière, les protéines SIRT1. Par agent actif inducteur ou activateur de la synthèse des protéines SIRT, on entend un agent actif apte à induire la synthèse des protéines SIRT dans les cellules de la peau. C'est à dire apte à augmenter la quantité de ces protéines dans les cellules, mais plus particulièrement, on entend essentiellement désigner tous les agents actifs susceptibles de favoriser la production endogène des protéines SIRT; et tout particulièrement les molécules impliquées dans le contrôle positif des précurseurs tels que l'ADN ou l'ARN. Le terme "extrait" désigne toute substance isolée, obtenue à partir de la matière première que constituent les levures. L'agent actif peut se définir comme étant une molécule ou un ensemble de molécules susceptibles d'apporter des modifications ou des modulations au fonctionnement d'un système biologique. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de levures est un extrait de levures du genre Kluyveromyces; d'un manière préférentielle l'extrait selon l'invention est préparé à partir de levures de l'espèce Kluyveromyces lactis et/ou de Kluyveromyces marxianus. L'extrait de levures du genre Kluyveromyces doit s'entendre comme un extrait de levures appartenant au genre Kluyveromyces. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de levures d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Kluyveromyces. Selon une méthode de réalisation de l'invention actuellement préférée, l'extrait de levures est un extrait aqueux. Par extrait aqueux, on entend tout ensemble de composés soluble dans l'eau ou dans tout solvant constitué totalement ou partiellement d'eau. Les extraits selon l'invention sont notamment des extraits aqueux purifiés. On peut en particulier citer des solvants aqueux. Par solvant aqueux on entend tout solvant constitué totalement ou partiellement d'eau. On peut citer l'eau elle-même, les solvants hydroalcooliques en toutes proportions ou encore les solvants constitués d'eau et d'un composé comme le propylène glycol ou le butylène glycol en toutes proportions. Cet extrait peut être obtenu par dissolution dans l'eau, l'alcool ou l'éther, puis par concentration de cette solution en faisant intervenir l'évaporation ou la distillation. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de levures est un extrait composé en grande partie de composés de nature peptidique. Par composés de nature peptidique, on entend désigner tous composés de nature protéique, tels que les fragments de protéines, les peptides mais aussi les acides aminés libres. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Par ailleurs, selon un autre caractéritique, l'extrait de levures contient des composés de faible poids moléculaire. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de levures contient une quantité de composés de nature peptidique représentant entre 30 et 70 % du poids total de l'extrait sec, plus particulièrement cette quantité est comprise entre 40 et 50 % du poids total de l'extrait sec. Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée 15 pour préparer l'extrait selon l'invention. Ainsi, dans une première étape, les levures sont mises en culture de manière classique dans un milieu adapté à leur développement, de préférence en présence de lactose. Elles sont récoltées par centrifugation puis mises en suspension dans une solution tampon, préférentiellement un tampon phosphate. Dans une seconde étape, ces cellules sont éclatées à l'aide d'une presse de french ou à l'aide d'un broyeur à bille, la majorité des composants membranaires insolubles étant écartés par centrifugation ou par filtration. Un filtrat riche en protéines peut être alors recueilli et remis en solution. Une fraction, riche en composés de nature peptidique, peut alors être isolée par précipitation en milieu alcoolique ou par une solution saline. Les composants solubles et les acides nucléiques sont ainsi écartés. Selon une variante du procédé d'obtention de l'extrait selon l'invention, une étape de dialyse ainsi qu'une étape d'hydrolyse par un cocktail de protéases peuvent être ajoutées afin d'obtenir une fraction riche en composés de nature peptidique. Une étape supplémentaire de purification par un procédé de type chromatographique peut être envisagée. Selon un autre mode de réalisation de l'extrait de levure selon l'invention, l'étape d'hydrolyse peut être réalisée directement sur les levures récoltées après centrifugation ou sur les fractions obtenues après éclatement cellulaire. Des étapes de filtrations et de stérilisation sont par la suite réalisées. L'utilisation de l'extrait selon l'invention apte à activer la synthèse des protéines SIRT1 dans les cellules de la peau, sera fera préférentiellement sous la forme d'une composition adaptée à l'administration par voie topique externe, principalement sur la peau, les muqueuses et/ou les phanères, comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. La quantité efficace de principe actif correspond à la quantité nécessaire pour obtenir le résultat désiré. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif précité est utilisé, dans les compositions, à une concentration comprise entre 0, 00001 % et 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,001 % et 10 % environ en poids par rapport au poids total de la composition finale. Ces extraits, aptes à activer la synthèse endogène des protéines SIRT, pourront être utilisés, d'une manière plus générale afin de traiter des affections dermatologiques. Par affections dermatologiques, on entend toutes les maladies affectant la peau et ayant ou non des conséquences visibles. A ce titre, on peut citer par exemple: des désordres liés à des problèmes de différenciations et de proliférations cellulaires, des problèmes liés à la kératinisation, des troubles inflammatoires ou allergiques, des troubles liés aux fonctions sébacées, des proliférations dermiques ou épidermiques (bénignes ou malignes) ; des désordres cutanés dus à une exposition aux rayonnements U.V., des pathologies associées au vieillissement chronologique ou actinique. Ainsi selon un autre aspect, les composés selon l'invention, tels que décrit précédemment, destinée à activer la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, pourront être utilisés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des affections dermiques. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'agent actif précité est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables comme l'eau, l'éthanol, le propanol ou l'isopropanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés ou tout mélange de ces solvants. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'agent actif précité est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbés sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisés dans ou fixés sur, tout vecteur cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. Quelle que soit la forme de l'invention, la composition selon l'invention peut être ingérée, injectée ou appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps), les cheveux, les ongles ou les muqueuses. Selon le mode d'administration, la composition selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées. Préférentiellement, les compositions selon la présente invention se présenteront sous une forme galénique adaptée à l'administration par voie topique cutanée. Elles couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau, les poils ou les cheveux. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de traitement cosmétique pour les soins de la peau destiné à augmenter la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, caractérisé par le fait que l'on applique sur la peau une composition contenant l'agent actif tel que défini précédemment, afin d'obtenir l'action désirée. Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. Le procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être mis en oeuvre notamment en appliquant les compositions cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions, par exemple: application de crèmes, de gels, de sérums, de lotions, de laits, de shampooings ou de compositions anti-solaires, sur la peau ou sur les cheveux, ou encore application de dentifrice sur les gencives. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des 20 exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1: Mise en évidence de l'effet de l'extrait selon l'invention sur les fibroblastes. Le but de l'étude est de déterminer l'influence de l'extrait de levure sur la synthèse des protéines SIRT1 par les fibroblastes, par la technique d'immunofluorescence et par la technique de western-blotting. Les techniques d'immunofluorescence et de western-blot sont des techniques semi-quantitatives qui permettent d'apprécier le taux des protéines présentes dans les cellules. Des fibroblastes humains sont maintenus en culture à 37 C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Pour les études d'immunofluorescence, les fibroblastes ont été cultivés sur des lames 8 puits; pour le western-blot, les cellules ont été cultivées dans boîtes de 100 mm de diamètre. Les cellules sont ensuite incubées durant 24 ou 48 heures avec l'extrait selon l'invention mis en solution à 0,5 %; une condition contrôle ne contenant pas d'extrait est réalisée. É Etudes par immunofluorescence Après élimination des surnageants et rinçage des cultures, les cellules sont fixées avec du méthanol pendant 4 minutes à 4 C puis rincées avec du tampon PBS. Des anticorps de lapin anti-SIRT1 humaine, dilués à 1/100, sont alors ajoutés (Santa Cruz Biotechnology). L'incubation dure 3 heures à température ambiante; les surnageants sont ensuite éliminés et les cellules sont rincées au PBS. Puis un anticorps secondaire (anti-lapin, Molecular Probes), couplé à un marqueur fluorescent (Alexa 488) est additionné. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, les surnageants sont éliminés et les cellules sont rincées au PBS. Les lames sont alors montées puis examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). La quantité de protéines SIRT1, synthétisées par les cellules, est proportionnelle à l'intensité de la fluorescence. Les résultats ainsi obtenus démontrent une augmentation significative de l'expression des protéines SIRT1 au niveau du noyau de la cellule après application de l'extrait selon l'invention durant 24 et 48 heures. Par ailleurs, plus la concentration d'extrait appliquée au niveau des cellules est importante, plus l'intensité est élevée. Etudes par Western-blot Les cellules sont lavées et scrapées à l'aide d'un tampon d'extraction (20mM Tris, 150mM NaCl, IOmM EDTA, 0,2 % Triton X100) et d'un cocktail d'inhibiteur de protéases (Sigma). Les protéines ainsi extraites sont centrifugées à 4 C à 10000 rpm durant 10 minutes et les échantillons ainsi obtenus sont stockés à -80 C. Après standardisation des échantillons avec un kit de dosage de protéines BCA (Pierce), les lysats cellulaires sont séparés par électrophorèse sur un gel NuPAGE 4-12% (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (PAL corporation). Les membranes sont incubées toute une nuit avec un anticorps de lapin anti-SIRT1 humaine (Santa Cruz Biotechnology), dilué à 1/200, suivi par une incubation avec un anticorps anti-lapin IgG-peroxydase, dilué à 1/5000, (Beckman Coulter). La révélation est effectuée avec un substrat chemiluminescent. Afin d'évaluer quantitativement les protéines exprimées dans les cellules, les bandes présentes dans le gel sont quantifiées en utilisant un logiciel ChimiImager (Alpha Innotech Corporation, USA). La quantité des protéines est exprimée en pourcentage d'intensité lumineuse, comparée à la condition contrôle, c'est-à-dire comparée aux cellules qui n'ont pas reçu l'extrait selon l'invention. intensité % Incubation durant 24 heures Incubation durant 48 heures Contrôle 100 100 Extrait à 0,5 % 117.5 276 Les résultats, présentés dans le tableau ci-dessus, nous permettent de conclure que l'ajout de l'extrait selon l'invention dans le milieu de culture des fibroblastes a pour effet d'augmenter la synthèse des protéines SIRT1 par les cellules. Cette stimulation a été observée de manière importante. En effet, lorsque les cellules sont incubées en présence de la composition contenant l'extrait selon l'invention, on assiste au bout de 24 ou de 48 heures à une augmentation de l'intensité de la fluorescence, par rapport aux cellules non traitées, traduisant ainsi une stimulation de la synthèse de protéines SIRT1, cette augmentation étant vraisemblablement dose- dépendante. Exemple 2: Mise en évidence ex vivo de l'effet selon l'extrait selon l'invention. Des études ex vivo ont permis, par immunomarquage, de mettre en évidence l'expression des protéines SIRT1 sur des échantillons de peau. Des échantillons de peau humaine sont mis en culture à l'interface air/liquide. L'extrait selon l'invention est appliqué topiquement sur ces échantillons, au niveau de l'épithélium, puis les échantillons sont incubés durant 24 heures. Ces échantillons de peau sont ensuite fixés avec du formaldéhyde puis inclus dans la paraffine. Des coupes de 2 à 3 m sont alors réalisées. L'immunomarquage est effectué après différentes étapes de lavage et d'incubation de ces coupes. L"immunomarquage proprement dit est réalisé avec un anticorps polyclonal de lapin anti-SIRT1 humaine (IBL Co), dilué au 1/50, puis avec un anticorps secondaire (anti-lapin, Molecular Probes), couplé à un marqueur fluorescent. Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope). Les résultats obtenus démontrent que les peaux traitées avec l'extrait selon l'invention expriment une quantité de protéines SIRT1 nettement supérieure aux peaux non traitées avec l'extrait. Ainsi, l'extrait selon l'invention permet, au niveau cutané, d'augmenter l'expression des protéines SIRT1. 9 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un extrait de levures, en tant qu'agent actif 5 inducteur de la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, dans ou pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'extrait de levures est un extrait de levures du genre Kluyveromyces. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'extrait de levures est préparé à partir de levures de l'espèce Kluyveromyces lactis et/ou de l'espèce Kluyveromyces marxianus. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications prédédentes caractérisée en ce que l'extrait de levures est un extrait de nature peptidique. 5. Utilisation selon la revendications 4 caractérisée en ce que l'extrait de levures contient une quantité de composés de nature peptidique représentant entre 30 et 70 % du poids total de l'extrait sec, plus particulièrement cette quantité est comprise entre 40 et 50 % du poids total de l'extrait sec. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les protéines SIRT sont des protéines SIRT1. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la composition contient des excipients cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables. 8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisé en ce que les excipients sont adaptés à une 30 administration topique externe. 9. Procédé de traitement cosmétique de la peau destiné à augmenter la synthèse endogène des protéines SIRT dans les cellules de la peau, caractérisé par le fait que l'on applique sur la peau une composition contenant l'agent actif tel que défini selon les revendications 1 à 8.