Brevet FR2897940A1 — publié le 20070831

La présente invention concerne un procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu corporel vivant ou d'un tissu dérivé d'un corps vivant de manière corrraode et nette, ainsi qu'un agent de coloration utilisé dans ce procédé. L'obtention d'images en coupe transversale de tissus d'un corps vivant a une extrême importance dans le domaine de la biologie médicale. Des images en coupe transversale de tissus extraits de corps vivants ont pu être obtenues auparavant par fixation chimique, déshydratation, débitage en coupes et coloration. L'élaboration d'un système d'imagerie confocale et la prévalence d'un microscope à balayage laser confocal ont permis l'observation non invasive de cellules et de tissus lors de l'observation de coupes d'échantillons biologiques avec des cellules en couches multiples enchevêtrées et des tissus conjonctifs. Des endoscopes médicaux équipés d'un système d'imagerie confocale incorporé ont été récemment élaborés. L'observation d'images fluorescentes dans un système optique confocal fait intervenir des modes opératoires pour la coloration d'un tissu d'un corps vivant et d'un échantillon qui en est dérivé avec un colorant fluorescent. Lorsqu'un tissu de corps vivant est observé avec un microscope à balayage confocal et un endoscope médical équipé de ce microscope, un réactif pour coloration doit être biologiquement sûr. La fluorescéine a été utilisée classiquement comme agent de contraste fluorescent qui est sûr pour les corps vivants en fondoscopie et procédés similaires, dans lesquels une solution aqueuse de cet agent est injectée par voie intraveineuse (document non-brevet 1). En variante, un tissu peut être coloré en saupoudrant directement un réactif pour coloration sur la surface du tissu, sans passage par des vaisseaux sanguins tels que les veines. Le procédé comprenant l'aspersion directe de la surface d'un tissu avec une solution colorante est un moyen efficace pour colorer des organes extraits. Dans la coloration d'un tissu in vivo également, ce procédé, par comparaison avec le procédé de coloration impliquant une injection intraveineuse et une perfusion, a pour avantage de permettre de réduire l'influence d'une solution colorante sur les corps vivants car le procédé nécessite seulement une petite quantité de la solution colorante et ne comporte aucune perfusion du colorant à un site qui ne nécessite pas de perfusion dans les corps vivants. La solution de fluorescéine répandue sur la surface d'un tissu d'un corps vivant pénètre la région interne du tissu, et une partie de la solution persiste sous forme d'un volume de liquide sur la surface du tissu. Si le tissu est irradié avec de la lumière d'excitation dans cet état, la molécule de fluorescéine ayant pénétré et la molécule de fluorescéine restant sur la surface du tissu émettent une fluorescence, ce qui brouille la distinction entre les sites colorés et non colorés. En conséquence, dans le procédé comprenant l'étape consistant à répandre l'agent colorant sur la surface du tissu, une molécule de fluorescéine libre restant sur le site non coloré a dû être éliminée par lavage. Le colorant libre peut être éliminé par lavage de l'échantillon de tissu coloré plusieurs fois avec un tampon ou une solution approprié. Cependant, l'échantillon à observer présente une surface très délicate et doit être lavé avec précaution pour éviter la déformation ou l'altération de l'échantillon et la dénaturation du tissu. Ainsi, les modes opératoires de lavage doivent être effectués doucement et soigneusement. En outre, un lavage excessif provoque également le détachement du tissu coloré (décoloration). D'autre part, lorsqu'un échantillon de tissu extrait est coloré sans effectuer de fixation chimique et est observé avec un microscope à balayage confocal, l'autolyse du tissu ainsi qu'une dénaturation des cellules ou des protéines se produisent au cours des modes opératoires de lavage, ce qui pose le problème de l'obtention d'un échantillon ayant un état différent de celui de l'échantillon dans le corps vivant. [Document non-brevet 1] Gaestroenterology, 127 (3), 706-713, 2004 Un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu de manière précise et nette par des modes opératoires commodes, et un agent colorant utilisé dans ce procédé. Ainsi, le présent inventeur a focalisé son attention sur la fluorescéine et a effectué diverses études. De la fluorescéine dissoute en solution aqueuse présente une fluorescence à un pH alcalin et ne présente presque pas de fluorescence dans une solution acide. Ainsi, la fluorescéine a été utilisée classiquement sous forme d'une solution alcaline et l'observation de la fluorescence a été effectuée dans des conditions alcalines. Cependant, le présent inventeur a trouvé d'après diverses études que, de manière totalement inattendue, la fluorescéine liée à un tissu présente une fluorescence nette dans des conditions acides malgré le fait que la fluorescéine ne présente presque pas de fluorescence dans une solution acide. En conséquence, si un tissu traité avec de la fluorescéine est placé dans des conditions acides au cours de l'observation de fluorescence, seule la fluorescéine liée au tissu est capable sélectivement d'effectuer une coloration par fluorescence, tandis que la fluorescéine non liée au tissu ne présente presque pas de fluorescence. En conséquence, le présent inventeur à trouvé qu'une image colorée par fluorescence nette et précise d'un tissu pouvait être obtenue sans effectuer de procédures complexes de lavage. D'après ces découvertes, la présente invention a été menée à bonne fin. Plus précisément, la présente invention propose un procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu, comprenant le traitement d'un tissu avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, puis par l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. La présente invention propose également un agent de coloration fluorescent pour un tissu, comprenant une solution qui comprend de la fluorescéine ou un de ses sels, pour le traitement d'un tissu, suivi de l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. La présente invention propose en outre l'utilisation d'une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels pour la production d'un agent colorant fluorescent pour un tissu, pour le traitement d'un tissu, suivi de l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. Suivant le procédé de coloration de la présente invention, une image colorée nette et précise peut être obtenue car seule la fluorescéine liée à un tissu est capable sélectivement de provoquer une coloration par fluorescence. A ce propos, la fluorescéine est généralement hautement dépendante du pH et sa propriété de fluorescence tend à s'amplifier encore à des valeurs de pH plus élevées. Seule une molécule de fluorescéine qui a pénétré dans la région interne d'un tissu d'un corps vivant et qui s'est liée au tissu émet une fluorescence intense par coloration du tissu du corps vivant dans des conditions préalablement inenvisageables, les conditions d'observation de fluorescence choisies étant des conditions acides. Dans ces conditions, une molécule de fluorescéine libre n'émet pas de fluorescence. En conséquence, une image colorée par fluorescence du tissu d'un corps vivant peut être observée sans effectuer de procédures complexes et invasives telles qu'un lavage après coloration et une perfusion. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée qui suit, en regard des dessins 35 annexés sur lesquels : la figure 1 est un diagramme représentant la dépendance de l'émission de fluorescence de la fluorescéine vis-à-vis du pH ; la figure 2 est un diagramme représentant une image colorée par fluorescence du gros intestin traité avec une solution de fluorescéine à pH 4,0, puis l'observation par fluorescence ; et la figure 3 est un diagramme représentant une image colorée par fluorescence du gros intestin traité avec une solution de fluorescéine à pH 9,0, puis l'observation par fluorescence. DESCRIPTION DETAILLEE DES FORMES DE REALISATION PREFEREES Dans un procédé de la présente invention, un tissu est traité avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. Dans ce contexte, le tissu comprend un tissu d'un corps vivant et un tissu dérivé d'un corps vivant (tissu extrait). Le tissu d'un corps vivant comprend le tissu de l'oesophage, de l'estomac, du duodénum, de l'intestin grêle, du gros intestin, du rectum, de la cavité buccale ou le tissu de la lumière d'organes internes. Le tissu dérivé d'un corps vivant comprend un tissu dérivé de ces tissus d'un corps vivant et comprend en outre un tissu dérivé de divers organes et tissus musculaires. La fluorescéine ou son sel utilisé dans la présente invention comprend la fluorescéine, la fluorescéine sodique et la fluorescéine potassique, la fluorescéine et les sels de sodium de fluorescéine étant particulièrement préférables. Parmi ces agents, la fluorescéine et un sel disodique de fluorescéine (uranine) sont particulièrement préférables. La fluorescéine présente une fluorescence verte (excitation à 490 nm) à environ 520 nm et est donc excitée convenablement avec la lumière d'un laser à Ar (488 nm, 514 nm). Une solution aqueuse d'uranine est une solution d'un colorant acide ayant au niveau intramoléculaire un squelette xanthène qui, bien qu'étant présent en petites quantités, émet de la fluorescence verte par exposition à la lumière. Le maximum d'absorption du colorant uranine est de 450 à 490 nm, bien qu'il diffère en fonction des solvants. De préférence, le moyen pour le traitement du tissu de la présente invention est l'application de la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels au tissu ou bien l'immersion du tissu dans la solution. Dans ce contexte, l'application est préférable dans le cas où un tissu d'un corps vivant est utilisé comme tissu à traiter. Le moyen d'application comprend la pulvérisation, l'aspersion et les moyens similaires. Lorsqu'un tissu dérivé d'un corps vivant est utilisé comme tissu, l'application ou immersion est utilisée. La quantité de solution à appliquer peut être une quantité qui permet d'étaler la solution sur la totalité du tissu à traiter. La partie traitée doit seulement être placée dans des conditions acides à pH inférieur à 7 au cours de l'observation de fluorescence et, ainsi, la solution utilisée peut être une solution basique à pH non inférieur à 7 ou une solution acide à pH inférieur à 7. Lorsqu'une solution basique à pH non inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est utilisée, le tissu est traité avec la solution, et la partie traitée peut être ensuite observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à pH inférieur à 7. En variante, lorsqu'une solution acide à pH inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est utilisée, le tissu est traité avec la solution et peut être observé directement par fluorescence. La solution à pH non inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est préparée en ajoutant une substance basique, par exemple l'hydroxyde de sodium, l'acétate de sodium, le phosphate acide de sodium ou la glycine, qui ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur non inférieure à 7, à une solution aqueuse comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. De préférence, le pH est de 7 à 10, de manière particulièrement préférable de 7 à 8. De préférence, le pH est ajusté avec un tampon, plus avantageusement avec, par exemple, du phosphate de sodium, du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, du chlorhydrate de lysine ou du chlorhydrate d'arginine. La solution à pH inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est préparée en ajoutant une substance acide, par exemple l'acide phosphorique, l'acide chlorhydrique, l'acide carbonique, un acide inorganique ou un acide organique non toxique (par exemple l'acide acétique ou l'acide citrique) qui ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur inférieure à 7, à une solution aqueuse comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. Le pH préférable est de 4 à 6,5, de manière particulièrement appréciée de 6 à moins de 7. De préférence, le pH est ajusté avec un tampon, plus avantageusement avec, par exemple, une solution tampon acide non toxique comme une solution de phosphate de sodium, d'acétate de sodium, de citrate de sodium ou de carbonate de sodium. La concentration en fluorescéine de la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est avantageusement de 0,001 mg/ml à 50 mg/ml, plus avantageusement de 0,1 à 10 mg/ml. La fluorescéine à concentration non inférieure à 10 mg/ml est présente sous forme d'une solution qui est aisément déposée à un pH non inférieur à 5. La fluorescéine à concentration non supérieure à 0,001 mg/ml a une faible propriété de coloration. Comme décrit ci-dessus, la partie traitée du tissu à colorer est placée dans des conditions acides à pH inférieur à 7 par lavage avec une solution acide ou traitement avec une solution acide à pH inférieur à 7, comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. En conséquence, la fluorescéine libre n'émet pas de fluorescence, tandis que seule la fluorescéine liée au tissu émet de la fluorescence. L'observation de la fluorescence peut être mesurée par irradiation avec une lumière d'excitation. De préférence, l'image colorée par fluorescence est observée avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale. Le système d'imagerie confocale comprend un microscope à balayage confocal et un endoscope avec un système d'imagerie confocale. Un agent colorant fluorescent de la présente invention comprend seulement une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels lorsque la solution est une solution acide à pH inférieur à 7. D'autre part, l'agent colorant fluorescent comprend une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels en association avec une solution acide à pH inférieur à 7 (pour le lavage) lorsque la solution est une solution basique à pH non inférieur à 7. Exemples La présente invention est décrite ensuite plus spécifiquement par référence à des exemples. Exemple 1 Emission de fluorescence, dépendant du pH, de la fluorescéine Le pH d'une solution aqueuse de fluorescéine sodique (1 mg/ml) a été ajusté avec une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M, avec ensuite la mesure à une longueur d'onde d'excitation de 490 nm et une longueur d'onde de fluorescence de 530 nm. Un lecteur de microplaques (produit par Corona, MTP-800AFC) a été utilisé lors de la mesure de fluorescence. Comme le montrent les résultats représentés sur la figure 1, l'intensité de fluorescence de la fluorescéine devient plus forte à des valeurs de pH plus élevées. Exemple 2 Test de coloration au moyen de fluorescéine sodique sur du gros intestin de rat Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles), fixés avec une solution de formaldéhyde ont été utilisés pour observer une différence de propriété de coloration en fonction du pH. Les gros intestins ont été lavés pendant 10 secondes avec du sérum physiologique tamponné avec un phosphate (137 mol/1 de NaCl, 8,1 mmol/l de Na2HPO4, 2,7 mmol/l de KC1, 1,57 mol/1 de KH2PO4, appelé ci-après STP (-)) et ont été ensuite immergés dans des solutions de fluorescéine sodique (produite par Sigma, F6377, appelée ci-après F-Na) ajustées et diluées à 1 mg/ml avec des solutions tampons acide, alcaline et neutre. Les solutions tampons neutre et alcaline et la solution tampon acide utilisées étaient une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0), une solution tampon au borate 0,1 M (pH 9,1) et une solution tampon au NaH2PO4 0,4 M (pH 4,65), respectivement. Après un lavage supplémentaire pendant 10 secondes avec du STP (-), les gros intestins résultants ont été fixés avec une solution tampon acide à 10 % de formaldéhyde et ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica Microsystems, TCS-SP2). Bien que tous les échantillons de tissus aient été convenablement colorés, la F-Na diluée avec les solutions tampons à pH 7,0 et 9,0 ont présenté un fond plus intense et étaient donc impropres à l'observation des cellules. Exemple 3 Différence de perméation et de propriété de fluorescence du colorant en fonction des variations du pH du solvant Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles) ont été extraits et soumis à un test de coloration. De la F-Na (produite par Sigma, F6377) a été ajustée à 1 mg/ml et diluée avec une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0), une solution tampon au borate 0,1 M (pH 9,1) et une solution tampon au NaH2PO4 0,4 M (pH 4,65) pour préparer leurs solutions respectives à 0,1 mg/ml, dans lesquelles les tissus ont été ensuite immergés pendant 1 minute. Après un lavage supplémentaire pendant 10 secondes avec du STP (-), les tissus résultants ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica, 5 10 15 20 25 30 35 Microsystems, TCS-SP2). Les résultats sont présentés sur le tableau 1. [Tableau 1] Solvant pH Intensité de fluorescence examinée Etat de l'image observée (netteté de l'image fluorescente) -visuellement (indiquée dans cinq rangées) Fluorescéine libre Fluorescéine dans dans le volume de la région interne liquide du tissu Solution de 4,65 1 3 Nette NaH2PO4 0,4 M Solution 7,0 5 3 Pas nette mais le tampon au tissu est phosphate de identifiable Na 0,1 M Solution 9,1 4 3 Le -volume de liquide tampon au présente une borate de Na fluorescence plus 0,1 M intense Exemple 4 L'observation de la coloration des tissus a été effectuée dans la plage de pH de 4 à 7 dans des conditions isotoniques de F-Na (produite par Sigma, F6377). Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles) ont été extraits. Ils ont été lavés avec du sérum physiologique tamponné avec un phosphate (137 mol/1 de NaCl, 8,1 mol/1 de Na2HPO4, 2,7 mol/1 de KC1, 1,5 mol/1 de KH2PO4, 4,4 mol/1 de CaC12.2H20, 1,6 mol/1 de MgC12.6H20, appelé ci-après STP (+), et ils ont été ensuite colorés par immersion pendant 1 minute dans une solution de F-Na (à 0,1 mg/ml) ajustée à chaque pH. Les gros intestins colorés ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica, Microsystems, TCS-SP2). Ici, un test témoin utilisant du sérum physiologique a été effectué en même temps. Cela est dû au fait que du sérum physiologique a été utilisé comme solvant pour la F-Na utilisée dans l'injection intraveineuse et des opérations similaires. Les conditions d'imagerie pour le microscope à balayage confocal comprenaient un diamètre d'ouverture confocale de 1,00 airy, et deux types de lentille consistant en des lentilles à immersion dans l'huile 20x et 63x ont été utilisés. Le microscope a été programmé pour corriger automatiquement une valeur de gain et l'observation a été effectuée à la luminance optimale. La solution de fluorescéine Na/eau désionisée a été ajustée à 5 mg/ml et diluée à 0,1 mg/ml avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique à chaque pH et du sérum physiologique. Les gros intestins ont été immergés dans les solutions colorantes ajustées, puis ont été lavés avec du STP (+) et observés. Les résultats sont présentés sur le tableau 2. [Tableau 2] pH de la solution Intensité de fluorescence examinée Etat de l'image tampon à l'acide observée citrique-acide (netteté de phosphorique l'image fluorescente) visuellement (indiquée dans cinq rangées) Fluorescéine libre Fluorescéine dans la dans le volume de région interne du liquide tissu 4,0 1 3 Nette 5,0 1 4 Nette 6,0 2 4 Nette 7,0 3 4 Pas nette, mais le tissu est identifiable Sérum 3 4 Le volume de physiologique liquide présente une fluorescence plus intense Exemple 5 Des coupes des gros intestins utilisés dans l'exemple 4 ont été observées et le degré de perméation d'une solution colorante a été observé. La fluorescéine sodique a été ajustée à 0,1 mg/ml de la même manière que dans l'exemple 4, par dilution avec des solutions à des pH de 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 et du sérum physiologique. 25 30 35 L'imagerie a été effectuée avec un microscope à fluorescence (produit par ZEISS, LSM510) dans des conditions d'imagerie comprenant un diamètre d'ouverture de 1,0 et Max, et des lentilles 20x et 40x ont été utilisées. L'observation des coupes a montré qu'une partie de l'ordre de 50 pm dans la cellule épithéliale est colorée convenablement et une fluorescence intense est observée dans cette partie. Lors de l'observation utilisant les solutions colorantes avec des valeurs de pH variables, aucune différence significative n'a été observée quant au degré de perméation dans les tissus. Comme le montrent les exemples 1 à 5, la fluorescéine sous forme libre et la fluorescéine sous forme liée à un tissu émettent toutes deux une fluorescence dans des conditions alcalines, tandis que seule la forme liée à un tissu émet de la fluorescence dans des conditions acides. Exemple 6 L'observation a été effectuée à une concentration 20 variable à un pH constant fixé à 6,0. La concentration de F-Na (produite par Sigma, F6377) a été fixée à 10, 1,0, 0,1, 0,01 ou 0,001 mg/ml. Après ajustement à chaque concentration avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique (pH 6,0), 25 l'observation a été effectuée avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica Microsystems, TCS-SP2). Les conditions d'imagerie pour les microscopes à balayage confocal comprenaient un diamètre d'ouverture confocale de 1,00 airy, et deux types de lentille, 30 consistant en des lentilles à immersion dans l'huile 20x et 63x, ont été utilisés. Le microscope a été programmé pour corriger automatiquement une valeur de gain et l'observation a été effectuée à la luminance optimale. Bien que l'image colorée ait été confirmée avec les 35 faibles concentrations en F-Na, à savoir de 0,01 à 0,001 mg/ml, une image nette n'a pu être obtenue en raison d'une faible luminance. En résultat, une image nette mettant en évidence la perméabilité du tissu a été obtenue dans l'intervalle de 5 0,1 à 10 mg/ml. Exemple 7 Des coupes des gros intestins utilisés dans l'exemple 6 ont été observées et le degré de perméation d'une solution colorante a été observé. 10 La concentration de fluorescéine sodique a été fixée à 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 ou 0,001 mg/ml, comme dans l'exemple 6. Après ajustement à chaque concentration avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique (pH 6,0), l'imagerie a été effectuée avec un microscope à 15 balayage confocal (produit par ZEISS, LSM510) dans des conditions d'imagerie comprenant un diamètre d'ouverture confocale de 1,0 et Max, et des lentilles de 20x et 40x ont été utilisées. En résultat, lors de l'observation avec des 20 concentrations variables de fluorescéine sodique, les solutions colorantes de plus fortes concentrations ont donné une concentration plus foncée du chorion de la membrane muqueuse. [Tableau 3] 25 Concentration Chorion de la Cellule Noyau Gobelet (mg/ml) membrane muqueuse épithéliale 10 +++ +++ 1,0 ++ +++ 0,1 ++ +++ 0,01 + +++ 0,001 + +++ - - + : Plus le nombre de signes + augmente, plus le tissu est coloré avantageusement - : Non coloré 30 35 Exemple 8 Observation de la propriété de coloration de la fluorescéine sodique avec un microscope à fluorescence Après coloration avec de la fluorescéine sodique (appelée ci-après F-Na), l'observation a été effectuée avec un microscope à fluorescence (produit par Leica Microsystems, DM IRB). Des intestins grêles de lapin, fixés avec une solution de formaldéhyde, ont été utilisés comme échantillons et observés dans des conditions de pH de 4,0 à 9,0. 10 La F-Na a été ajustée à 1 mg/ml avec du sérum physiologique et a été réajustée à 0,01 mg/ml par dilution avec un tampon à l'acide phosphorique 0,1 M à chaque pH. La solution colorante ajustée à chaque pH a été appliquée aux intestins grêles de lapin fixés au formaldéhyde, sans 15 effectuer de procédures de lavage. L'excès de solution colorante a été éliminé par adsorption avec du papier-filtre, puis l'observation a été effectuée avec un microscope à fluorescence. L'objectif utilisé avait un grossissement de 40x. En résultat, la solution colorante à pH 4,0 a coloré 20 les villosités d'intestin grêle de lapin, même sans effectuer de procédures de lavage après coloration, et à donné une image colorée nette. Cependant, lorsque l'observation a été effectuée directement après coloration avec la solution colorante à pH 9,0, de la fluorescence a 25 été émise par un liquide à l'extérieur du tissu plutôt qu'à partir des villosités, et une image non nette a été obtenue. La solution tampon à l'acide phosphorique 0,1 M (pH 9,0) utilisée dans la dilution a nécessité des modes opératoires de lavage pour l'élimination de la solution fluorescente voisine. 30 Exemple 9 Coloration par perfusion intestinale de fluorescéine sodique Dans des corps vivants, les organes digestifs sécrètent constamment du mucus, le mucus sécrété étant absorbé dans les organismes et digéré. Pour vérifier les 35 avantages de la présente invention dans un environnement similaire à l'utilisation dans un endoscope, la propriété de coloration de la fluorescéine sodique pour le gros intestin d'un corps vivant a été observée. La coloration du gros intestin des corps vivants à deux valeurs de pH dans les régions acide et alcaline et également l'observation avec un microscope à balayage confocal (produit par I.eicaMicrosystems, TCS-SP2) ont été effectuées. Une souris (âgée de 9 semaines, mâle) a été soumise à l'injection, sous anesthésie, de 500 .il de F-Na (pH 4, 1 mg/ml) par la partie supérieure du gros intestin en utilisant une seringue (Terumo de câlibre 27, 0,4 mm). Au bout de 10 minutes, le gros intestin a été extrait et l'intérieur de l'intestin a été lavé avec du STP (+). Le site extrait du gros intestin a été obtenu en prélevant de 5,5 à 6,5 cm à partir du caecum. Comme le montre la figure 2 (valeur de gain de 480 V, approximativement 0,1 pm à partir de l'épithélium), la structure du tissu a été observée nettement en utilisant de la F-Na à pH 4,0, et la cellule en gobelet était non colorée. En outre, une solution colorante de F-Na à pH 9,0 (1 mg/ml, 500 pl) a été utilisée pour effectuer l'observation. La solution colorante à pH 9,0 a provoqué une faible différence de luminance de fluorescence entre le site coloré et un volume de liquide contenant de la F-Na libre et a donné une image non nette du tissu, comme dans l'observation précédente effectuée avec différentes valeurs de pH (figure 3). Exemple 10 Différence de propriété de coloration en fonction du pH de la solution de lavage lors de la coloration avec de la fluorescéine sodique De la fluorescéine sodique (appelée ci-après F-Na) émet une fluorescence intense en solution aqueuse à pH non inférieur à 7. Lors de la coloration de la surface d'un tissu avec une solution aqueuse de F-Na à pH non inférieur à 7, la molécule de F-Na présente dans la région interne du tissu et la molécule de F-Na présente dans un volume de liquide sur la surface du tissu présentent toutes deux une propriété de fluorescence et rendent donc difficile l'observation du tissu coloré. La F-Na présente dans le volume de liquide peut être éliminée par lavage de la surface du tissu. Cependant, la F-Na présente dans la région interne du tissu est égalementéluée en raison de modes opératoires de lavage, donnant un effet de coloration réduit. Ainsi, après la coloration d'un tissu avec une solution aqueuse de F-Na à pH non inférieur à 7, une petite quantité d'une solution acide à pH inférieur à 7 a été appliquée (par aspersion) au tissu pour supprimer ainsi la propriété de fluorescence de la F-Na libre qui n'a pas participé à la coloration. Puis l'observation après coloration a été effectuée. Les résultats sont présentés sur le tableau 4. [Tableau 4] pH de la solution pH 9,0 -> pH 7,0 -~ pH 4,0 - de coloration -3 pH pH 4,0 pH 4,0 pH 7,0 de la solution de lavage Région interne du Colorée et Colorée et Colorée et tissu apparition d'une apparition d'une apparition d'une fluorescence fluorescence fluorescence Partie constituée Aucune fluorescence Aucune fluorescence Aucune fluorescence du volune de liquide Chorion de la Colorée et Colorée et Colorée mais image membrane muqueuse apparition d'une apparition d'une nonnette fluorescence fluorescence Visibilité de la Les contours des Les contours des Ta forme d's forme des cellules cellules dans le cellules dans le cellules est tissu épithélial tissu épithélial identifiable mais peuvent être peuvent être le contraste est identifiés identifiés faible Visibilité de la La crypte est La crypte est La crypte ne peut forme des cryptes observée nettement observée nettement être identifiée en en raison du fort en raison du fort raison de la contraste entre le contraste entre le fluorescence émise volume de liquide volume de liquide par le volume de et la région et la région liquide interne du tissu interne du tissu Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans 35 sortir de son cadre. 25 30 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu, caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'un tissu avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, et ensuite l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. 2. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7. 3. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à un pH inférieur à 7. 4. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant. 5. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution. 6. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale. 7. Agent colorant fluorescent pour un tissu 35 comprenant une solution qui comprend de la fluorescéine ou un de ses sels, caractérisé en ce qu'il est destiné autraitement d'un tissu et ensuite à l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. 8. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7. 9. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à pH inférieur à 7. 10. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant. 11. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution. 12. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale. 13. Utilisation d'une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la production d'un agent colorant fluorescent pour un tissu destiné au traitement d'un tissu et ensuite à l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. 14. Utilisation suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la solution comprenant de lafluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7. 15. Utilisation suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution à un pH inférieur à 7. 16. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant. 17. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution. 18. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale.