Brevet FR2893849A1 — publié le 20070601

La présente invention concerne un procédé d'évaluation du pouvoir colorant de produits sur la peau, plus particulièrement dans le domaine des autobronzants et du maquillage. Elle concerne également des modèles de peaux reconstruites permettant la mise en oeuvre de ce procédé. De nos jours, il est important d'avoir bonne mine et une peau bronzée est toujours signe de bonne santé. Cependant, le bronzage naturel n'est pas toujours souhaitable dans la mesure où il nécessite des expositions prolongées aux rayonnements UV, en particulier aux rayonnements UV-A qui provoquent le brunissement de la peau mais en contrepartie sont susceptibles d'induire une altération de celle-ci, notamment dans le cas d'une peau sensible ou d'une peau continuellement exposée au rayonnement solaire. Il est donc souhaitable de trouver une alternative au bronzage naturel qui soit compatible avec les exigences de telles peaux. On recherche donc des produits cosmétiques destinés au bronzage artificiel de la peau, c'est-à-dire capables de lui conférer artificiellement une coloration proche du bronzage naturel. Il est donc souhaitable de pouvoir évaluer, au cours du développement d'un tel produit, ses capacités de rémanence, le temps d'apparition de la coloration et de prédire la couleur qu'il sera susceptible de conférer à la peau lors de son application par le consommateur. Au sens de la présente invention, on entendra, par composition destinée à la coloration artificielle de la peau , une formulation ayant une affinité particulière pour la peau lui permettant de conférer à cette dernière une coloration durable, non-couvrante (à savoir n'ayant pas tendance à opacifier la peau) et qui ne s'élimine ni à l'eau ni à l'aide d'un solvant, et qui résiste à la fois au frottement et au lavage par une solution contenant des tensioactifs. Une telle coloration durable se distingue donc de la coloration superficielle et momentanée apportée par exemple par un produit de maquillage. Par ailleurs, dans le domaine du maquillage, on cherche à colorer la peau ou les phanères de manière superficielle et momentanée; néanmoins, ces produits doivent avoir une tenue suffisante pour résister au vent ou aux frottements légers, et il existe un besoin de pouvoir évaluer les propriétés colorantes des nouveaux produits, notamment selon la carnation sur laquelle ils seront appliqués. Pour des raisons éthiques et économiques, les premières étapes d'évaluation ne peuvent être réalisées chez l'homme, et il est souhaitable de disposer d'un procédé fiable et reproductible d'évaluation. Il n'existe pas de méthode in vitro permettant une évaluation performante des produits et des formulations qui colorent et/ou maquillent la peau. Les tests actuellement en place utilisent du stratum corneum isolé ou des supports artificiel comme la vitroskin . Les inconvénients sont nombreux. Par exemple, la vitroskin peut reproduire la couleur et la morphologie de la surface de la peau, mais ne permet pas une corrélation avec les observations in vivo chez l'homme. Le stratum corneum isolé par stripping est d'une manipulation délicate et bien que sa composition soit correcte, l'environnement physico chimique n'est pas suffisante pour évaluer par exemple la DHA (DiHydroxyAcétone) qui est la référence en matière de coloration réactive de la peau. Pour le cosméticien, il devenait nécessaire d'avoir une méthode d'évaluation de coloration de la peau par des pigments de maquillage, par des colorants synthétiques ou naturels. En outre, en raison de la mondialisation de marques, des méthodes permettant l'évaluation des composés colorés sur des peaux ethniques seraient particulièrement utiles. Des expiants de peau humaine, issus de la chirurgie esthétique, ne sont pas disponibles en grande quantité et possèdent une variabilité biologique importante. Ils ne sont pas donc adaptés pour l'évaluation industrielle des actifs. Grâce à des techniques permettant l'intégration des mélanocytes, la fabrication des échantillons de peau reconstruite pigmentée est possible mais : 1) les échantillons ne sont pas disponibles en grandes quantités 2) les carnations disponibles sont très limitées 3) la reproductibilité n'est pas, à ce jour, suffisante. 4) le coût est élevé Il existe donc toujours un besoin d'un modèle in vitro produit à un niveau industriel (c'est-à-dire de qualité reproductible et en quantité suffisante pour l'évaluation des actifs au moyen débit), qui soit capable de reproduire, au niveau de la couleur, des caractéristiques des peaux ethniques, des peaux déjà colorées ou des taches pigmentaires et qui soit prédictif de l'effet chez l'homme. Ces buts et d'autres sont atteints par l'utilisation d'un modèle de peau reconstruite selon l'invention. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation du pouvoir colorant d'au moins un produit sur la peau, caractérisé en ce qu'on applique ledit produit à évaluer sur un épiderme reconstruit comprenant au moins des kératinocytes. En effet, il a été montré dans le cadre de la présente invention, que l'utilisation d'un épiderme reconstruit permettait d'évaluer des pigments, des colorants ou des systèmes de coloration active ayant une affinité pour la couche cornée, par application du produit à tester à la surface de la couche cornée. Parmi les avantages du procédé selon l'invention, on peut citer la possibilité d'obtenir une coloration fiable et reproductible par la DHA, qui est le colorant réactif de référence, auquel on peut comparer de nouveaux produits potentiellement colorants. L'épiderme reconstruit utile pour la mise en oeuvre de l'invention comprend de préférence des kératinocytes à au moins deux stades de différenciation, en particulier il comprend un équivalent de stratum corneum. L'équivalent d'épiderme pourra être préparé par des méthodes connues de l'homme du métier, notamment par étalement de culture de kératinocytes sur un support. Les kératinocytes utilisés selon l'invention peuvent provenir de toutes origines, mais sont préférentiellement des kératinocytes d'origine humaine. Ils peuvent être préparés selon n'importe quelle méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique ou la culture de kératinocytes issus de la gaine de follicules pileux normaux ou pathologiques. 30 Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique, selon la méthode décrite dans Régnier et collaborateurs, Frontier of Matrix Biology, Vol.9, 4-35 (Karger, Basel 1981). 35 Le milieu nutritif utilisé peut être tout milieu nutritif connu pour sa capacité à permettre la prolifération et la différenciation des kératinocytes. On peut citer à titre d'exemple le25 milieu Dulbecco modifié Eagle, ou un milieu défini à teneur en calcium variable, tel le milieu décrit par Boyce S.T. et Ham R.G., (J. Tissue Cult. Meth., 1985, 9, 83-93). Il est possible d'utiliser un mélange de plusieurs milieux nutritifs comme par exemple le mélange milieu Dulbecco modifié Eagle/milieu HAM F12 ou milieu de Rheinwald et Green, (CelI, 1975, 6, 331-334). Généralement pour la préparation de l'équivalent d'épiderme, les kératinocytes sont d'abord maintenus immergés dans un milieu nutritif pendant un temps d'incubation de plusieurs jours. Au bout de ce temps d'incubation, la culture est portée à l'interface air/liquide, et l'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir un équivalent de derme supportant un équivalent d'épiderme présentant les couches cellulaires classiques à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours. Le support utilisé selon l'invention peut être l'un quelconque de ceux décrits dans l'art antérieur. A titre d'exemple, on peut citer comme support les lattices mixtes collagène/fibroblastes, le derme préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par exemple les filtres de marque Millipores, les substituts sous- cutanés à base de collagène, le plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire. Préférentiellement, le support est constitué par un substitut sous-cutané à base de collagène. L'équivalent de peau de l'invention peut comprendre tout autre type cellulaire qui pourrait y être incorporé. A titre d'exemple on peut citer des précurseurs de cellules de Langerhans induits ou non et des mélanocytes. Quelque soit le support choisi, le protocole pour sa mise en oeuvre utilisé selon l'invention peut-être l'un quelconque des protocoles décrits dans l'art antérieur. On peut citer par exemple les modèles décrits dans les demandes de brevets EP-A-285471, EP-A-285474, EP-A-789074, EP-A-502172, EP-A-418035, WO-A-9116010, EPA-197090, EP-A-20753, FR-A-2665175, FR-A-2689904. De manière très générale, les modèles de peau reconstruite décrits dans ces documents comprennent des kératinocytes humains associés ou non à d'autres cellules de la peau comme les mélanocytes et/ou les cellules de Langerhans, déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, le produit à évaluer est un agent de coloration réactive. Par produit de coloration réactive on entend un produit peu ou pas coloré mais qui, lors de son application dans des conditions appropriées, réagit in situ pour donner naissance à des composés colorés qui sont fixés durablement à la peau pour lui conférer une coloration artificielle; la réaction in situ comprend généralement une étape de polymérisation, et la formation de mélanines synthétiques. Ce type de produits comprend des produits réagissant avec des constituants de la couche cornée, en particulier avec les fonctions amines des protéines, pour former des dérivés colorés. Il comprend également des produits constitués d'un système à plusieurs composants, réagissant in situ, en particulier par polymérisation et formation de composés colorés, qui sont retenus au niveau de l'épiderme. En particulier, le procédé selon l'invention peut comporter les étapes consistant à (i) appliquer sur au moins un épiderme reconstruit le produit à tester, (ii) laisser en contact pendant un temps permettant le développement de la coloration. On peut ensuite comparer la coloration de l'épiderme reconstruit ainsi traité à celle d'un épiderme témoin n'ayant pas été contact avec un produit colorant. Le temps de contact à l'étape (ii) sera notamment compris entre 5 min et 48 heures, généralement inférieur à 24 heures, voire inférieur ou égal à 6 heures, par exemple d'environ 1 à 4 heures. Dans une variante du procédé, après l'étape (ii), on comparera en outre la coloration obtenue avec celle d'un épiderme reconstruit traité par un colorant connu, tel que la DHA, dans des conditions similaires. Pour obtenir une coloration satisfaisante avec la DHA et des composés analogues, les inventeurs ont mis en évidence que dans le procédé selon l'invention l'étape (ii) doit être effectuée dans des conditions d'hygrométrie contrôlée. Selon l'une des variantes du procédé, l'étape (ii) effectuée à une humidité relative comprise entre 50 % et 90%. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le produit à évaluer est un produit présentant une coloration propre et destiné à se déposer, au moins partiellement, à la surface de la peau humaine, ou dans le cas du test, de l'épiderme reconstruit. Il peut ainsi s'agir de produits destinés à la coloration superficielle et momentanée apportée par exemple par un produit destiné au maquillage, tels que les pigments et colorants. Le procédé selon l'invention permet ainsi la quantification de la force colorante et de la tenue de la couleur de colorants ou pigments destinés au maquillage, qu'ils soient dans des classes de couleur vert-bleu, rouges, ou orange-jaune. On observe une forte corrélation entre les tests in vitro et in vivo. Selon un autre aspect de l'invention, le procédé permet d'évaluer la rémanence d'une coloration cutanée. La procédé comporte alors les étapes suivantes: - application du produit à tester sur au moins un épiderme reconstruit, - lavage d'au moins un épiderme reconstruit sur lequel le produit à tester a été appliqué, comparaison de la coloration de l'épiderme reconstruit ayant subi un lavage avec la coloration d'un épiderme reconstruit sur lequel le produit à tester a été appliqué et n'ayant pas subi d'étape de lavage. Le procédé selon l'invention est ainsi également adapté à l'évaluation de l'efficacité de produits de démaquillage. Avantageusement, le produit à évaluer sera appliqué sur un épiderme reconstruit ayant subi une étape de coloration préalable, afin de lui apporter une couleur analogue à celle d'une peau humaine de phototype déterminé, d'une peau ethnique, ou d'une peau présentant des irrégularités de pigmentation telles que des taches pigmentaires. Le procédé d'évaluation peut ainsi comprendre (a) une première étape de coloration in situ de l'épiderme reconstruit, et (b) une étape dans laquelle le ou les produits à évaluer sont appliqués sur l'épiderme reconstruit obtenu à l'issue de l'étape (a). Le procédé est également adapté à l'évaluation d'association d'au moins deux produits, qui sont alors appliqués simultanément ou de façon séquentielle à l'étape b. il permet notamment l'identification de formules fixateurs pour des produits ne présentant pas une rémanence suffisante. Dans tous les cas, l'épiderme reconstruit peut subir une première étape de pré-coloration in situ, avant l'application du ou des produits à évaluer. En effet, de manière inattendue, il a été montré dans le cadre de l'invention que l'application d'agents de coloration réactive sur un épiderme reconstruit conduit à la formation d'une coloration stable, dont la teinte peut être adaptée à celle des différentes carnations humaines, et qui est plus homogène que celle obtenue par des systèmes intégrant des mélanocytes. Cette étape de pré-coloration peut être obtenue par application d'au moins un produit choisi parmi les actifs réagissant avec les constituants de l'épiderme, plus particulièrement du stratum corneum (tels que les fonctions amines libres de peptides, les lipides ou les glucides), et les systèmes donnant lieu à une polymérisation directe in situ (et donc formation de pigments). En particulier, la pré-coloration peut être obtenue par un système choisi parmi la Dihydroxy-acétone (DHA), l'érythrulose et les systèmes comprenant au moins un précurseur de colorant ou de mélanine et au moins un catalyseur. Avantageusement, la pré-coloration de l'épiderme reconstruit pour la mise en oeuvre de l'invention est obtenue par application d'une quantité efficace d'au moins un précurseur de colorant choisi parmi les composés comportant au moins un cycle aromatique ayant au moins deux groupes hydroxyles portés par deux atomes de carbone consécutifs du cycle aromatique et d'une quantité efficace d'un système catalytique, enzymatique ou chimique. Le système catalytique peut ainsi comprendre un premier constituant choisi parmi les sels et oxydes de Mn(ll) et/ou de Zn(ll) et leurs mélanges et un second constituant choisi parmi les hydrogénocarbonates alcalins, les hydrogénocarbonates alcalino-terreux et leurs mélanges. Selon un autre mode de réalisation, le système catalytique est un système enzymatique, en particulier il peut être choisi parmi la tyrosinase, laccase, polyphénoloxydase, peroxydase. Les précurseurs de colorants adaptés pourront être choisis par l'homme du métier parmi les ortho-diphénols, en particulier les polyphénols; par exemple de bons résultats sont obtenus par application de L-DOPA et d'un système catalytique. On observe la formation d'eumélanine synthétique, qui résiste au lavage. D'autres systèmes utilisables comme composition de pré-coloration selon l'invention sont par exemple décrits dans les brevets EP 12298992 ou EP 1229890. Les précurseurs de colorant peuvent ainsi être choisis parmi : les flavanols comme la catéchine et le gallate d'épichatéchine, - les flavonols comme la quercétine, - les anthocyanidines comme la péonidine, - les anthocyanines, par exemple l'oenine, les hydroxybenzoates, par exemple l'acide gallique, les flavones comme la lutéoline, les iridoïdes comme l'oleuropéine, ces produits pouvant être osylés (par exemple glucosylés) et /ou sous forme d'oligomères (procyanidines) ; les hydroxystilbènes, par exemple le tétrahydroxy-3,3',4,5'-stilbène, éventuellement osylés (par exemple glucosylés) ; - la 3,4-dihydroxyphénylalanine et ses dérivés ; - la 2,3-dihydroxyphenylalanine et ses dérivés ; - la 4,5-dihydroxyphenylalanine et ses dérivés ; - le 4,5-dihydroxyindole et ses dérivés ; - le 5,6-dihydroxyindole et ses dérivés ; - le 6,7-dihydroxyindole et ses dérivés ; - le 2,3-dihydroxyindole et ses dérivés ; les dihydroxycinnnamates tels que l'acide caféique et l'acide chlorogénique ; - les hydroxycoumarines ; - les hydroxyisocoumarines ; -les hydroxycoumarones; - les hydroxyisocoumarones; - les hydroxychalcones ; - les hydroxychromones ; - les anthocyanes ; - les quinones ; - les hydroxyxanthones ; et - les mélanges de ceux-ci. Lorsque les précurseurs de colorant présentent des formes D et L, les deux formes peuvent être utilisées dans les compositions selon l'invention. Les précurseurs de colorants peuvent être des extraits de plantes, fruits, agrumes, légumes et des mélanges de ces extraits, qui contiennent de nombreux polyphénols tels que définis précédemment. Parmi les extraits de plantes, on peut citer les extraits de rose et de thé. Parmi les extraits de fruits, on peut citer les extraits de pomme, de raisin (en particulier de pépins de raisin) et de banane. Parmi les extraits de légumes, on peut citer l'extrait de pomme de terre. Suivant les parties de fruits utilisés, par exemple pulpe ou pépins de raisin, la coloration obtenue est différente. On peut également utiliser des mélanges d'extraits de plantes et/ou de fruits tels que des mélanges d'extraits de pomme et de thé et des mélanges d'extraits de raisin et de pomme. Les polymères formés en particulier avec la catéchine, l'acide gallique et leurs dérivés (tannins) ont des propriétés antimicrobiennes par emprisonnement des microorganismes lors de la polymérisation. Ces tannins ont également des propriétés astringentes inhérentes pour la peau. La quantité de précurseur de colorant dans la composition finale doit être suffisante pour obtenir une coloration visible. Cette quantité peut varier dans de larges mesures en fonction de la nature du précurseur et de l'intensité voulue pour la coloration. En général, on obtiendra une coloration convenable lorsque la quantité de précurseur de colorant est telle que la teneur en précurseur de colorant dans la composition de coloration finale est d'au moins 10 micromoles par millilitre de composition finale. Les précurseurs de colorants d'oxydation préférés selon l'invention sont les dihydroxyphénylalanines et leurs dérivés et les dihydroxyindoles et leurs dérivés. La quantité de précurseur de mélanine et le temps d'application seront adaptés par l'homme du métier en fonction de l'intensité de coloration souhaitée; à titre indicatif, elle pourra varier de 0,1 à 50mg de composition de pré-coloration par cm2 d'épiderme reconstruit, notamment d'environ 1 à 15 mg/cm2. on peut ainsi obtenir aussi bien des épidermes dont la teinte correspond à celle d'une peau de phototype IV, qu'à une peau de type noire africaine. Selon un autre mode de réalisation, l'étape de pré-coloration comprend le traitement de l'épiderme reconstruit par un précurseur de coloration choisi parmi le dihydroxyindole (DHI) et l'acide dihydroxyindole carboxylique ( DHICA). La coloration est formée par oxydation, et peut être obtenue par simple contact à l'air, ou peut être accélérée par des oxydants chimiques, tels que H2O2. Selon une variante de l'invention la coloration de l'épiderme est modulée par addition d'au moins un acide aminé présentant un groupement thiol à l'étape de pré-coloration. Il peut être introduit sous forme d'acide aminé, par exemple la cystéine, en particulier la L-cystéine, ou sous forme de peptides comprenant de tels acides aminés, par exemple des tripeptides comme le glutathion. Selon un autre aspect, la pré-coloration peut également être modulée par addition de sels de fer di ou trivalents. Ainsi, des carnations très variées (carnation noire et carnation asiatique, par exemple) peut être reproduites. Les proportions relatives d'acide aminé à groupement thiol et de précurseur de colorant d'oxydation dans les compositions de l'invention peuvent varier dans de larges mesures en fonction de la coloration voulue. Généralement, le rapport molaire acide aminé/précurseur de colorant variera de 0,001 à 50, de préférence de 0,01 à 5, et mieux de 0,05 à 2,5. En général, la teneur en acide aminé à groupe thiol dans la composition finale est d'au moins 0,01 micromole par millilitre, de préférence au moins 0,1 micromole/ml. En faisant varier la nature des précurseurs de colorant et des acides aminés de la composition et la proportion relative d'acide aminé et de précurseur de colorant, on peut obtenir toute une palette de teintes. A cet effet, les proportions de précurseurs de mélanine, en particulier d'ortho-diphénols, et d'acides aminés à groupement thiol seront adaptées à la teinte finale souhaitée, pour augmenter la composante rouge ou au contraire jaune de la pigmentation, afin d'obtenir des carnations de type asiatique ou différents phototypes. De préférence, dans les compositions de pré-coloration qui sont appliquées sur l'épiderme reconstruit, la cystéine est présente à des concentrations inférieures ou égales à 80% (en molarité), notamment entre 0 et 20%. Les rapports entre la concentration molaire de précurseurs de mélanine tels que les ortho-diphénols, en particulier la L-DOPA et les composés à groupements thiols pourront varier entre 1: 0 et 1:3, notamment jusqu'à environ 1:2. Par exemple, pour des ratios de l'ordre de 1:1 ou 1:2, on obtiendra une coloration proche de celle d'une peau asiatique. Selon encore une variante de l'invention, la coloration de l'épiderme reconstruit est obtenue par action de L-DOPA, de cystéine et d'un système catalytique comportant un ou des métaux de transition ( par exemple : Fe et Cu) en milieu alcalin (soude ou ammoniaque) avec oxydation à l'air ou chimique (peroxyde d'hydrogène). 30 35 La teinte et l'intensité de la coloration pourront être adaptées par référence au système de mesure colorimétrique (L*, a*, b*). Par exemple, on entend par peau claire , des peaux non bronzées dont on peut définir les caractéristiques colorimétriques par leur angle ITA tel que défini dans la publication de A. Chardon et al. Skin Colour Typology and Suntanning Pathways et présentée au 16th IFSCC congress oct 8-10 1990 de New-York, et in Int. J. Cosm. Sci.13 191-208 (1991). Les peaux claires telles que définies dans cette classification ont un angle ITA compris entre 35 et 55. Dans le système de mesure colorimétrique (L*, a*, b*) : L* représente la luminance ou clarté, a* représente l'axe rouge-vert (-a*= vert, +a*= rouge) et b* représente l'axe jaune-bleu (-b*=bleu, +b*=jaune). Ainsi, a* et b* expriment la nuance de la peau. AL* traduit l'assombrissement de la couleur : plus le AL* est négatif, plus la couleur s'est assombrie avec : AL* = L* peau non colorée ù L* peau colorée Le rapport Aa*/Ab* traduit l'équilibre rouge/jaune et donc la nuance avec : Aa* = a* peau non colorée ù a* peau colorée Ab* = b* peau non colorée ù b* peau colorée Selon un autre aspect, la pré-coloration comprend l'application de colorants ou de pigments synthétiques ou naturels. Parmi les avantages et applications du procédé selon l'invention on peut citer • Evaluation de colorants rouge pour peau noire (modèle mélanine foncée) • Evaluation de colorants bleus induisant un effet éclaircissant pour peau asiatique (modèle melanine intermédiaire) • Evaluation de l'effet couvrant d'une formulation pour cacher des taches pigmentées (des taches du vieillissement, par exemple) ou des colorations de la peau (tatouage) L'invention a également pour objet des épidermes reconstruits susceptibles d'être utilisés dans le procédé et pouvant être obtenus après l'étape de pré-coloration décrite ci-dessus. Elle comprend ainsi un épiderme reconstruit caractérisé en ce qu'il comporte au moins des kératinocytes à différents stades de différenciation, et en ce que ledit épiderme est au moins partiellement coloré, ladite coloration pouvant être obtenue par action de L-DOPA, de cystéine et d'un système catalytique. Le système catalytique peut notamment être choisi parmi les systèmes comprenant au moins un hydrogéno-carbonate alcalin et un sel ou oxyde de Zn ou de Mn, les systèmes catalytiques comportant au moins un métal de transition en milieu alcalin, et les systèmes catalytiques enzymatiques. Elle comprend également un épiderme reconstruit caractérisé en ce qu'il comporte au moins des kératinocytes à différents stades de différenciation et en ce que ledit épiderme est au moins partiellement coloré, ladite coloration pouvant être obtenue par oxydation par un composé choisi parmi le dihydroxyindole (DHI) et l'acide dihydroxyindole carboxylique ( DHICA). D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Dans ces exemples on se référera à la figure en annexe qui représente la rémanence des mélanines synthétiques sur Episkin Exemple 1 Des kits des épidermes reconstruits vendus par la société EPISKIN (Lyon, France) sont réceptionnés après 13 jours de culture et conservés sur gélose à température ambiante durant 24 heures. Les nacelles son déposées sur du papier Wathman et l'application de 20 microlitres des solutions suivantes sont appliqués en topique (étalement à une spatule): • 0.5% L-DOPA ou • 0.375% L-DOPA + 0.125% L-Cystéine hydrochloride monohydrate ou • 0.25% L-DOPA + 0.25% L-Cystéine hydrochloride monohydrate ou • 0.125% L-DOPA + 0.3755% L-Cystéine hydrochloride monohydrate Ensuite, 20 microlitres du système catalytique (500 L NaHCO3 1M +511L MnCl2 100mM) sont appliqués (étalement à une spatule) à chaque échantillon. Le témoin est constitue par un épiderme subissant une application topique de 40 microlitres de l'eau milliQ. Après une pose de deux heures dans une enceinte climatique thermostatée à 34 C, une 5 mesure de la couleur est réalisée en système colorimétrique tridimensionnel CIE (Commission Internationale de l'Eclairage) L*a*b* (Minolta 300 Spectrocolorimètre). L* a* b* C In vivo* Carnation 64,43 10,18 22,96 25,14 Caucasienne 4,18 0,69 2,66 2,45 N=8 Carnation 60,36 11,27 23,12 2,3 25,79 2,5 Asiatique 5,19 1,58 N=3 Carnation Africaine 42,94 + 12,92 17,59 21,92 3,9 N = 8 8,45 1,15 4,28 In vitro EPISKIN Témoin 84,24 0,44 0,08 20,71 20,71 0, 42 0,27 0,27 0.5% L-DOPA 53,73 6,26 0,88 19,74 20,76 3,65 0,35 0,42 0.375% L-DOPA 63,54 4,19 + 0,31 22,60 22,99 0.125% L-cystéine 1,02 0,160,20 0.25% L-DOPA 66,59 4,10 0,39 23,52 23,89 0.25% L-cystéine 1,38 0,61 0,63 0.125% L-DOPA 76,10 3,18 0,28 24,43 24,64 0.375% L-cystéine 0,62 0,36 0,34 *Les mesures in vivo sont prises de l'avant bras. 10 L = luminance a = composant rouge-vert b = composant jaune-bleu C = saturation Application du L-dopa à la surface d'une peau reconstruite dans la présence d'un système catalytique donne suite à la formation de la mélanine synthétique. La couleur résultante est modifiée par un ajout d'un acide aminé (L-cystéine). Ainsi, la couleur du support peut être modifiée afin de reproduire à plus près des carnations ethniques. Exemple 2 Des kits des épidermes reconstruits vendus par la société EPISKIN (Lyon, France) sont réceptionnés sur gélose après 13 jours de culture. 10 Application de vingt microlitres de 0.375% L-DOPA + 0.125% L-Cystéine hydrochloride monohydrate ou de 0.125% L-DOPA + 0.3755% L-Cystéine hydrochloride monohydrate est réalisé en topique. Ensuite, vingt microlitres du système catalytique (500 L NaHCO3 1M +511L 15 MnCl2 100mM) sont appliqués à chaque échantillon. L'étalement se fait pendant 1 h avec des disques de nylon. Après avoir éliminé l'excès de la surface des épidermes, les échantillons sont mises en culture durant 48h ( Milieu de différenciation vendu par EPISKIN). Le témoin est constitue par un épiderme subissant une application topique de 40 microlitres de l'eau milliQ. Une première mesure de la couleur est réalisée en système L*a*b* (Minolta 300 25 Spectrocolorimètre). Les échantillons sont ensuite lavés en gel douche Neutralia 10% en nacelle (3ml dessous et l ml dessus par puits de plaque Episkin), en agitant 30 secondes dans un sens puis 30 secondes dans l'autre sens. Un rinçage à l'eau milliQ est réalisé de la même façon. Puis les échantillons sont séchés en laissant 15 min à l'air libre et une mesure de la couleur en système L*a*b* est prise. Un deuxième lavage et une mesure de 30 la couleur sont réalisés de la même façon. Les résultats sont représentés sur la figure 1 en annexe Delta E = une mesure du développement de la couleur en tri dimensions = racine carrée 35 (delta L2 + delta a2+ delta b2) 20 Application de L-dopa / L-cystéine à la surface d'une peau reconstruite dans la présence d'un système catalytique donne suite à la formation de la mélanine synthétique qui résiste aux lavages. Exemple 3 Des kits des épidermes reconstruits vendus par la société EPISKIN (Lyon, France) sont réceptionnés sur gélose après 13 jours de culture. 10 Application de vingt microlitres de 0.5% L-DOPA (Peau noire ) 0.375% L-DOPA + 0.125% L-Cystéine hydrochloride monohydrate (Peau marronne , type asiatique) ou de 0.125% L-DOPA + 0.3755% L-Cystéine hydrochloride monohydrate (Peau rousse ) est réalisé en topique. 15 Ensuite, vingt microlitres du système catalytique (500 L NaHCO3 1M +5 L MnCl2 100mM) sont appliqués à chaque échantillon. Le témoin est constitue par un épiderme subissant une application topique de 40 microlitres de l'eau milliQ. L'étalement se fait pendant 1 h avec des disques de nylon. Après avoir éliminé l'excès de 20 la surface des épidermes, les échantillons sont mises en culture durant 48h ( Milieu de différenciation vendu par EPISKIN). Un maquillage des épidermes est ensuite réalisé en triplicata. Trois colorants (rose fluorescent, rouge et bleu ; formules maison), sont appliqués à 3 mg/cm2. L'étalement se 25 fait pendant l h avec des disques de nylon. Après une pose d'une heure, une mesure de la couleur est réalisée en système colorimétrique tridimensionnel CIE (Commission Internationale de l'Eclairage) L*a*b* (Minolta 300 Spectrocolorimètre). Mesures Spectrocolorimètriques L* a* b* C* h delta E** Témoin 80,92 4,07 18,84 19,28 77,82 Peau Rousse 73,14 5,24 21,81 22,44 76,48 delta -7,78 1,18 2,97 3,16 -1,34 8,41 Peau Marron , 64,55 6,98 21,90 22,98 72,32 30 type asiatique delta -16,37 2,91 3,06 3,71 -5,50 16,90 Peau Noire 60,29 6,92 20,05 21,21 70,96 delta -20,63 2,85 1,21 1,93 -6,85 20,86 Témoin + rose 49,81 66,27 1,57 66,29 1,36 delta -31,11 62,21 -17,27 47,02 -76,46 71,66 Rousse + rose 45,19 57,13 3,53 57,23 3,54 delta -35,72 53,06 -15,31 37,96 -74,28 65,77 Marron (asiatique) + 40,44 49,72 6,30 50,12 7, 22 rose delta -40,47 45,65 -12,54 30,84 -70,60 62,29 Noire + rose 35,86 34, 17 7,60 35,01 12,54 delta -45,06 30,11 -11,24 15,73 -65,28 55,34 Témoin + rouge 54,98 52,55 37,02 64,28 35,17 delta -25,94 48,48 18,18 45,01 -42,65 57,91 Rousse + rouge 49,60 50,43 36,50 62,25 35,89 delta -31,31 46,36 17,66 42,98 -41,92 58,67 Marron (asiatique) + 44,14 38,66 27,73 47,57 35,65 rouge delta -36,78 34,59 8,89 28,30 -42,17 51,26 Noie + rouge 42,15 36,84 26,25 45,23 35,48 delta -38,76 32,77 7,41 25,96 -42,34 51,29 Témoin + bleu 46,88 -38,00 -22,64 44,24 210,79 delta -34,03 -42,07 -41,49 24,96 132,97 68,18 Rousse + bleu 46,56 -39,42 -14,33 41,95 199,98 delta -34,36 -43,49 -33,17 22,67 122,16 64,60 Maron (asiatique) + 38,16 -26,09 -7,64 27,19 196,32 bleu delta -42,75 -30,16 -26,48 7,91 118,50 58,64 noir bleu 1 h00 37,77 -18,14 -4,73 18,75 194,61 -43,15 -22,21 -23,57 -0,53 116,79 53,95 **Delta E = racine carrée (delta L2 + delta a2+ delta b2) Pour chaque colorant testé, le test décrit ci-dessous permet d'évaluer la force colorant (delta C), la nuance de la couleur obtenue (delta a / delta b) et le développement de la couleur en tri dimensions. De plus, ce modèle permet l'évaluation des composés colorés sur des épidermes qui, au niveau de la couleur, mime des peaux ethniques. Exemple 4 Des kits des épidermes reconstruits vendus par la société EPISKIN (Lyon, France) sont réceptionnés après 13 jours de culture et conservés sur gélose à température ambiante durant 24 heures. Les nacelles sont déposées sur du papier Wathman et 20 microlitres d'une solution de 5% DHA en 90% éthanol sont appliqués en topique (étalement à une spatule). Le témoin est constitue par un épiderme subissant une application topique de 20 microlitres de l'eau milliQ. Après une pose de 24 heures dans une enceinte climatique thermostatée à 34 C et à 84% humidité relative, une mesure de la couleur est réalisée en système colorimétrique tridimensionnel CIE (Commission Internationale de l'Eclairage) L*a*b* (Minolta 300 Spectrocolorimètre). Mesure de la montée de la couleur sur EPISKIN suite à une application du DHA à 5% Delta L Delta a Delta b a/ b Delta e -4,96 3,16 9,3 0,34 11,0 Cette expérience montre que la peau reconstruite, maintenus dans des conditions d'hygrometrie spécifiques est réactive vis-à-vis de la DHA.15 Revendications 1- Procédé d'évaluation du pouvoir colorant d'au moins un produit sur la peau, caractérisé en ce qu'on applique ledit produit à évaluer sur un épiderme reconstruit comprenant au moins des kératinocytes et en ce qu'il comporte une étape de comparaison de la coloration avec un épiderme choisi parmi un épiderme témoin n'ayant pas été en contact avec le produit à tester, ou un épiderme reconstruit sur lequel le produit à tester a été appliqué et ayant subi un lavage. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un produit à évaluer est un produit qui agit par coloration directe de la peau. 3- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le produit à évaluer est un système a plusieurs composants réagissant in situ. 4- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (i) appliquer sur au moins un épiderme reconstruit le produit à tester, (ii) laisser en contact pendant un temps compris entre 5 min et 48 heures, (iii) comparer la coloration de l'épiderme reconstruit à celle d'un épiderme témoin n'ayant pas été contact avec un produit colorant. 5- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape (ii) est effectuée à une humidité relative comprise entre 50 % et 90%. 6- Procédé d'évaluation du pouvoir colorant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit à évaluer est un produit coloré destiné à se déposer, au moins partiellement, à la surface de la peau et/ou de l'épiderme reconstruit. 30 7- Procédé d'évaluation selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend (a) une première étape de coloration in situ de l'épiderme reconstruit, et (b) une étape dans laquelle le ou les produits à évaluer sont appliqués sur l'épiderme reconstruit obtenu à l'issue de l'étape (a). 35 8- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que le produit à évaluer est un produit destiné au maquillage.25 9- Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: application du produit à tester sur au moins un épiderme reconstruit, lavage d'au moins un épiderme reconstruit sur lequel le produit à tester a été appliqué, - comparaison de la coloration de l'épiderme reconstruit ayant subi un lavage avec la coloration d'un épiderme reconstruit sur lequel le produit à tester a été appliqué et n'ayant pas subi d'étape de lavage. 10- Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'une partie au moins de l'épiderme reconstruit est soumis à une première étape de pré-coloration par polymérisation in situ. 11-Procédé d'évaluation selon la revendication 10, caractérisé en ce que la pré-coloration est obtenue par application d'au moins un produit choisi parmi les actifs réagissant par polymérisation et les actifs réagissant avec les constituants du stratum corneum. 12-Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la pré-coloration est obtenue par un système choisi parmi la Dihydroxy-acétone (DHA), l'érythrulose, les systèmes comprenant au moins un précurseur de mélanine et au moins un catalyseur. 13- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la pré-coloration de l'épiderme reconstruit est obtenue par application d'une quantité efficace d'au moins un précurseur de colorant choisi parmi les composés comportant au moins un cycle aromatique ayant au moins deux groupes hydroxyles portés par deux atomes de carbone consécutifs du cycle aromatique et une quantité efficace d'un système catalytique comprenant un premier constituant choisi parmi les sels et oxydes de Mn(ll) et/ou de Zn(ll) et leurs mélanges et un second constituant choisi parmi les hydrogénocarbonates alcalins, les hydrogénocarbonates alcalino-terreux et leurs mélanges. 14- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape de pré-coloration comprend en outre l'application d'au moins une quantité efficace d'au moins un acide aminé comportant au moins un groupement thiol. 15- Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que l'étape de pré-coloration comprend en outre l'application d'au moins un composé choisi parmi la cystéine, le glutathion et les sels de fer di ou trivalents. 16- Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que la cystéine est appliquée sur l'épiderme reconstruit à des concentrations comprises entre 0 et 80% en poids par rapport au poids de la composition de pré-coloration. 17-Epiderme reconstruit susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins des kératinocytes à différents stades de différenciation, et en ce que ledit épiderme est au moins partiellement coloré, ladite coloration pouvant être obtenue par action de L-DOPA, de cystéine et d'un système catalytique. 18- Epiderme reconstruit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le système catalytique est choisi parmi les systèmes comprenant au moins un hydrogéno-carbonate alcalin et un sel ou oxyde de Zn ou de Mn, les systèmes catalytiques comportant au moins un métal de transition en milieu alcalin, et les systèmes catalytiques enzymatiques. 19- Epiderme reconstruit susceptible d'être utilisé dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte au moins des kératinocytes à différents stades de différenciation et en ce que ledit épiderme est au moins partiellement coloré, ladite coloration pouvant être obtenue par oxydation par un composé choisi parmi le dihydroxyindole (DHI) et l'acide dihydroxyindole carboxylique ( DHICA).