Brevet FR2889845A1 — publié le 20070223

Domaine de l'invention La présente invention divulgue une méthode pour dessiner des oligonucléotides utiles en techniques de la biologie moléculaire, aussi bien en tant qu'amorces (primers) pour PCR (réaction en chaîne de polymérisation) que pour d'autres techniques, ou comme des sondes d'identification et/ou quantification. En particulier, on divulgue une méthode pour dessiner des oligonucléotides spécifiques pour l'identification d'une séquence déterminée dans un échantillon métagénomique. Art antérieur Diverses méthodes de la biologie moléculaire requièrent l'utilisation de séquences courtes d'ADN (oligonucléotides) qui satisfont à des conditions physicochimiques et biologiques déterminées pour marquer la présence d'un organisme ou groupe d'organismes déterminé. Parmi ces méthodes, on peut mentionner l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'électrophorèse en gel de gradient dénaturante (DGGE), ou la conjugaison avec des marqueurs spécifiques, tels que des sondes de détection ou de quantification des microorganismes, gènes ou séquences déterminés, et la réaction en chaîne de polymérisation (PCR), où on emploie une paire d'oligonucléotides comme amorces de la réaction. L'application de cette invention peut être faite dans les cas déjà décrits ou dans d'autres cas dans lesquels on a besoin d'oligonucléotides spécifiques. Normalement, les oligonucléotides sont synthétisés artificiellement selon la description de leurs bases constituantes. La détermination des séquences adéquates pour le procédé en question est dénommée dessin d'oligonucléotides D. Selon la procédure invoquée, certaines restrictions thermodynamiques peuvent limiter l'ensemble d'oligonucléotides valides. Les oligonucléotides qui résultent de ce dessin seront complètement identifiés par les séquences nucléotidiques utilisées dans leur synthèse, lesquelles peuvent être caractérisées comme des mots ayant une longueur infinie de l'alphabet {A, C, T, G}. Les méthodes traditionnelles de dessin d'oligonucléotides, parmi lesquelles on peut mentionner le Primer3 (Rozen S, Skaletsky H (2000), Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Dans: Krawetz S, Misener S (editors), Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pages 365-386), permettent le dessin de paires d'oligonucléotides pour amplification par PCR, en validant une série de conditions thermodynamiques. Néanmoins, ces méthodes permettent seulement le dessin d'oligonucléotides pour une séquence particulière, ne considérant pas le cas dans lequel on a besoin de reconnaître plusieurs séquences d'organismes différents. La méthode utilisée traditionnellement dans ce cas exige la réalisation d'un alignement multiple de toutes les séquences qu'on a besoin de reconnaître, en utilisant un logiciel d'ordinateur comme le CLUSTALW (Higgins D., Thompson J., Gibson T. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Cet alignement permet de reconnaître les régions conservées parmi toutes les séquences qu'on a besoin de reconnaître et, en conséquence, de dessiner des oligonucléotides dans ces régions. Néanmoins, réaliser ces alignements est coûteux et il peut être prohibitif quand le nombre de séquences est grand. En outre, l'alignement multiple requiert de déterminer des paramètres de pénalisation dérivés de quelque modèle évolutif des séquences. Le résultat dépend des valeurs choisies pour ces pénalisations et il peut être fragile devant de petits changements dans ces valeurs. D'autres méthodes de dessin d'oligonucléotides ont été développées ces derniers temps, comme par exemple dans le document US2003097223 (Nakae et Ihara, 22/05/2003), qui protège une nouvelle méthode de dessin d'amorces d'ADN. Cette méthode dessine automatiquement des paires d'amorces et ensuite celles-ci sont sélectionnées selon certaines conditions, telles que la longueur des oligonucléotides, le pourcentage du contenu en CG et la Tm (température de fusion). La méthode de la présente invention prend en considération, en plus de ces aspects élémentaires pour dessiner des amorces, que les experts en la matière connaissent bien, l'analyse thermodynamique des oligonucléotides dessinés, ce qui donne un avantage sur la méthode décrite dans US2003097223, puisqu'elle assure la stabilité des amorces dessinées en augmentant les possibilités de succès dans l'emploi de ces amorces. Un autre aspect différent entre le document précédent et l'invention ici présentée est que ce document concerne l'obtention d'amorces utiles pour plusieurs exons d'un génome, alors que dans un aspect de l'invention on cherche à amplifier tous les microorganismes d'un taxon déterminé, ce qui constitue en soi même une différence, mais en plus la stratégie utilisée dans les deux cas pour trouver des amorces ou des oligonucléotides qui reconnaissent plus d'une matrice est différente dans les deux cas, dans le document US2003097223 une pluralité d'amorces est dessinée (indiqué comme le paragraphe 701) par des moyens bioinformatiques à partir d'une base de données qui comprend différents exons (pas 700) et après les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont analysés avec les amorces dessinées et on voit empiriquement quelles amorces amplifient les exons d'intérêt. Au contraire, dans la présente invention on cherche dans la base de données de dessin (qui comprend les séquences d'intérêt) quelles amorces sont présentes dans le maximum de séquences d'intérêt et selon cette information les amorces sont choisies pour être construites et utilisées. Un autre document de l'état de la technique est dans ce cas la publication de Wang et Seed: "A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis" Nucleic Acids Research, 2003, vol 31, N 24: 154 dans lequel un algorithme est validé pour l'identification d'amorces de transcription spécifiques pour PCR et les auteurs ont créé une base de données online avec les amorces qui remplissent lesdites conditions pour des gènes humains et murins. L'algorithme décrit par Wang et Seed est significativement différent de celui décrit dans la présente invention, premièrement parce qu'il ne considère pas la possibilité de choisir un oligonucléotide ou une paire d'amorces communs à un taxon déterminé, mais choisit uniquement des amorces spécifiques pour une seule séquence d'intérêt, et en second lieu, dans le procédé de sélection d'oligonucléotides, on choisit d'évaluer seulement le AG des 5 derniers résidus de l'extrémité 3' et, quand celui-ci est inferieur à -9 kcal/mol, le candidat est rejeté. Dans la présente invention le AG de tout oligonucléotide candidat est évalué et le critère de sélection est beaucoup plus strict; on sélectionne préférablement les oligonucléotides ayant un AGhm;n de -1,5 kcal/mol (AG pour la formation d'épingles). Pour prédire la formation d'épingles, dans la publication on évalue l'autocomplémentarité des séquences et on permet seulement 5 coïncidences (match) non contiguës; de la même façon, pour éviter la formation de dimères d'amorces on évalue la présence d'une séquence complémentaire de 4 des résidus de l'extrémité 3' dans la même amorce (pour éviter des dimères) ou dans l'autre amorce (pour éviter de la réactivité croisée). Dans la présente invention, on a abordé le sujet des structures secondaires d'une façon différente et plus efficace que la simple comparaison de complémentarité des séquences; dans ce cas on évalue la différence d'énergie libre de Gibbs pour toutes les conformations possibles et, par rapport à la plus stable d'entre elles, on détermine si le ou les oligonucléotides sélectionnés sont appropriés à la formation de structures secondaires. Comme il peut être observé, la méthode de l'invention présente des avantages 20 techniques indiscutables par rapport aux autres méthodes existantes dans l'état de la technique. En résumé, jusqu'à présent il n'a pas été divulgué de méthode de dessin d'oligonucléotides rapide et économique qui permette de dessiner des oligonucléotides spécifiques pour une séquence choisie quand ladite séquence se trouve dans un échantillon métagénomique ou qui permette de dessiner des oligonucléotides qui reconnaissent plusieurs séquences d'organismes différents simultanément. Dans cette divulgation, on a résolu ledit problème de la technique existante, en créant une méthode de dessin d'oligonucléotides spécifiques pour une séquence déterminée ou des groupes de séquences, qui ne considère pas seulement l'information du matériel génétique à identifier, mais aussi l'information de tout autre matériel génétique susceptible d'être présent dans un échantillon métagénomique sur lequel on a besoin de travailler. Un autre problème habituel dans le cadre du dessin d'oligonucléotides est de disposer d'un oligonucléotide avec les conditions de spécificité requises, mais inefficace dans la réalisation des procédés de biologie moléculaire. Une explication de cette déficience est la formation de structures secondaires dans l'oligonucléotide (épingles), ou l'autohybridation, ce qui diminue la concentration active en oligonucléotide dans le milieu réactionnel. Dans le cas de la technique PCR, dans laquelle on emploie une paire d'oligonucléotides simultanément, en plus de l'auto-hybridation et de la formation d'épingles, une hybridation croisée entre les deux oligonucléotides peut avoir lieu dans le milieu réactionnel et cela rend la réaction inefficace. Dans le but de surmonter ce problème technique, la méthode de l'invention inclut une étape dans laquelle les oligonucléotides dessinés sont évalués thermodynamiquement pour écarter la formation d'épingles, l'autohybridation ou l'hybridation croisée entre une paire d'amorces. Pour chacune de ces situations, l'énergie libre de Gibbs des différentes conformations possibles est calculée, déterminant ainsi la plus stable d'entre elles, et si ladite conformation plus stable a un AG inférieur à un seuil défini, ledit oligonucléotide est écarté, assurant ainsi la disponibilité des oligonucléotides dessinés. La méthode de la présente invention permet ainsi de résoudre tous les problèmes qui existent dans le cadre du dessin d'oligonucléotides pour les techniques de biologie moléculaire. Résumé de l'invention Comme il a déjà été décrit, la présente invention divulgue une méthode qui peut être utilisée pour identifier une séquence ou un groupe de séquences spécifiques 5 d'ADN ou d'ARN à partir d'un échantillon biologique complexe. Plusieurs méthodes de la biologie moléculaire ont besoin de la présence de séquences courtes d'ADN, appelées oligonucléotides, qui sont artificiellement synthétisées à partir d'une description des ses bases constituantes. La méthode de dessin d'oligonucléotides inclut la sélection ou la construction d'une base de données de séquences de référence nommée base de données d'évaluation , la sélection d'un sous-ensemble de séquences correspondant aux organismes d'intérêt nommée base de données de dessin , la sélection à partir de ces séquences d'oligonucléotides candidats, l'épuration de ces oligonucléotides candidats selon des critères de spécificité d'hybridation et de stabilité thermodynamique, ce qui permet d'obtenir une liste d'oligonucléotides dessinés et optionnellement l'ordre de ceux-ci selon leur spécificité taxonomique. La base de données de séquences de référence peut être construite à partir d'une base de données publique, par exemple à partir d'une base de données publique de gènes 16S. De préférence, la base de données de dessin est construite en sélectionnant les séquences qui correspondent aux gènes d'intérêt dans la base de données de séquences de référence. Ce sous-ensemble de séquences d'intérêt peut être construit selon une classification taxonomique et constituer la base de dessin. De préférence, la sélection des oligonucléotides candidats est faite en considérant toutes les sous-séquences d'une longueur définie existant dans les séquences d'intérêt et les sous séquences inverses- complémentaires de celles-ci. De préférence, l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides seulement ceux qui apparaissent moins de deux fois dans chaque séquence d'intérêt. En particulier, on considère qu'un oligonucléotide apparaît plus d'une fois si la même séquence est répétée ou s'il y a une coïncidence de la plupart des nucléotides de deux séquences possibles, de manière préférée si le nombre de nucléotides de deux séquences qui coïncident est de 85%. L'épuration des oligonucléotides candidats peut également considérer valides ceux qui forment des structures secondaires dont la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à un seuil déterminé, de préférence supérieure à -7 kcal/mol, de manière particulièrement préférée égale à -1,5 kcal/mol. Selon un autre mode de réalisation, l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides ceux qui s'hybrident avec une copie d'euxmêmes en formant des structures dont la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à un seuil défini, de préférence supérieure à -7 kcal/mol. Eventuellement, la méthode selon l'invention comporte une étape supplémentaire d'ordonnancement des oligonucléotides dessinés selon leur spécificité taxonomique. Par exemple, l'ordonnancement est réalisé en cherchant l'oligonucléotide dessiné dans la base de données de séquences de références et le nombre de séquences de chaque groupe taxonomique auxquelles ledit oligonucléotide s'hybride est enregistré. Ou bien l'ordonnancement des oligonucléotides dessinés est réalisé selon leur spécificité taxonomique, selon la Sensibilité de l'oligonucléotide considéré par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sensibilité correspond au rapport des séquences d'intérêt trouvées versus les séquences d'intérêt existantes dans la base de données. L'ordonnancement des oligonucléotides candidats peut également être réalisé selon la Sélectivité de l'oligonucléotide considéré par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sélectivité correspond au rapport du nombre de séquences trouvées qui appartient au taxon d'intérêt. De préférence, l'ordonnancement des oligonucléotides candidats est réalisé selon le produit de la Sensibilité et la Sélectivité de chaque oligonucléotide par rapport au groupe d'intérêt, et en ce qu'on sélectionne les oligonucléotides où ledit produit est le plus élevé. La méthode selon l'invention peut comprendre la construction des oligonucléotides sélectionnés, le marquage desdits oligonucléotides avec une technique de marquage connue, et l'utilisation pour identifier la présence de microorganismes du taxon sélectionné dans un échantillon métagénomique. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'un oligonucléotide dessiné par la méthode selon l'invention pour identifier la présence de microorganismes déterminés dans un échantillon métagénomique. En outre, on divulgue l'extension de cette méthode au cas dans lequel on requiert des paires d'oligonucléotides, comme il peut être le cas de procédés de réaction en chaîne de polymérisation (PCR). Cette variante de la méthode comprend la construction ou sélection d'une base de données de référence nommée base de données d'évaluation , la sélection d'un sousensemble de séquences correspondant aux organismes d'intérêt nommée base de données de dessin , la sélection à partir de ces séquences de deux ensembles d'oligonucléotides candidats, l'épuration de chacun de ces ensembles d'oligonucléotides candidats selon des critères de spécificité d'hybridation et de stabilité thermodynamique, l'obtention d'une liste de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble qui remplit des conditions physiques et thermodynamiques, et l'ordonnancement de ces paires selon la spécificité taxonomique. La base de données de séquences de référence peut être construite à partir d'une base de données publique, par exemple à partir d'une base de données publique de gènes 16S. De préférence, la base de données de dessin est construite en sélectionnant les séquences qui correspondent aux gènes d'intérêt dans la base de données de séquences de référence. Ce sous-ensemble de séquences d'intérêt peut être construit selon une classification taxonomique et constituer la base de dessin. De préférence, la sélection des oligonucléotides candidats est faite en considérant toutes les sous-séquences d'une longueur définie existant dans les séquences d'intérêt et les sous séquences inverses- complémentaires de celles-ci. De préférence, l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides seulement ceux qui apparaissent moins de deux fois dans chaque séquence d'intérêt. En particulier, on considère qu'un oligonucléotide apparaît plus d'une fois si la même séquence est répétée ou s'il y a une coïncidence de la plupart des nucléotides de deux séquences possibles, de manière préférée si le nombre de nucléotides de deux séquences qui coïncident est de 85%. De préférence, on sélectionne un ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble d'oligonucléotides candidats, en considérant que la distance entre la position d'hybridation du premier et du second oligonucléotide dans une séquence déterminée est dans un intervalle préétabli. La sélection de l'ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble d'oligonucléotides candidats peut considérer que la différence des températures de fusion (Tm) prédite pour chaque oligonucléotide est dans un intervalle prédéterminé. La sélection de l'ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble établi à l'étape (c) peut considérer que la structure plus stable qui serait formée par les deux oligonucléotides a une différence d'énergie libre de Gibbs supérieure à un seuil défini, par exemple supérieure à -12 kcal/mol. De préférence, l'ordonnancement par spécificité taxonomique des paires d'oligonucléotides dessinées peut être déterminé par l'intersection des ensembles de séquences dans la base de données de l'étape (a) auxquels chacun des oligonucléotides de la paire s'hybride. Eventuellement, la méthode selon l'invention inclut l'étape d'ordonner les paires d'oligonucléotides dessinés selon leur spécificité taxonomique, selon la Sensibilité de la paire d'oligonucléotides considérée par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sensibilité correspond au rapport des séquences d'intérêt qui contiennent les deux oligonucléotides versus les séquences d'intérêt existantes dans la base de données. Ou bien l'ordonnancement des oligonucléotides candidats est réalisé selon la Sélectivité de la paire d'oligonucléotides considérée par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sélectivité correspond à la proportion de séquences qui contiennent les deux oligonucléotides qui appartiennent au taxon d'intérêt. De préférence, l'ordonnancement des oligonucléotides candidats est réalisé selon le produit de la Sensibilité et la Sélectivité des paires d'oligonucléotides considérées par rapport au groupe de séquences d'intérêt, en sélectionnant les oligonucléotides où ledit produit est plus élevé. La méthode selon l'invention peut comprendre la construction des paires d'oligonucléotides sélectionnées, et leur utilisation en tant qu'amorces dans la technique de PCR pour détecter la présence des microorganismes du taxon sélectionné dans un échantillon métagénomique. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une paire d'oligonucléotides dessinés par la méthode selon l'invention pour identifier la présence de microorganismes déterminés dans un échantillon métagénomique. Description des Figures La Figure 1 montre les résultats de la PCR réalisée avec les paires d'oligonucléotides dessinés par la méthode de l'invention pour réaliser une PCR spécifique pour A. thiooxidans, en amplifiant l'ADNr 16S de 5 échantillons de A. ferrooxidans et de 2 échantillons de A. thiooxidans; le contenu de chaque piste est spécifié dans les exemples, dans le Tableau 5. Description détaillée de l'invention Dessin d'oligonucléotides La méthode de dessin d'oligonucléotides ici décrite prend comme point de départ une base de données de séquences d'ADN ou d'ARN. Suivant les conditions expérimentales à considérer, ces séquences pourront être des génomes complets ou des fragments de chaque génome. Par exemple, on peut considérer toutes les séquences connues d'un gène ou région génomique déterminée. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, on considère une base de données dessinée par nous-mêmes qui contient toutes les séquences connues pour le gène 16S. Une condition que doit remplir la base de données qui va être utilisée est que chaque séquence doit être classifiée taxonomiquement. Un exemple d'une base de données qui peut être utilisée comme information initiale dans la méthode de l'invention est GenBank du NCBI (Benson DA, Boguski MS, Lipman DJ, Ostell J. (1997) GenBank. Nucleic Acids Res. Jan 1; 25(1): 1- 6). Nous appelons cette base de données sélectionnée ou construite la base de données d'évaluation . À partir de cette base de données on prend le sous-ensemble des séquences qui correspondent au ou aux organismes qu'on veut identifier. Nous appelons ce sous-ensemble la base de données de dessin D. Dans quelques cas, en considérant que dans les bases de données publiques on peut trouver des séquences partielles des gènes d'intérêt, il est approprié de normaliser les positions relatives dans chaque séquence, et pour cela chaque séquence de la base de données de dessin est alignée de façon optimale par rapport a une séquence de référence, qui peut être un gène homologue au gène analysé, avec l'algorithme de Needleman-Wunsch (Needleman SB, Wunsch CD. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. Mar; 48(3): 443-53). Dans ce cas, ces séquences alignées constituent la base de données de dessin. Une fois définie la base de données de dessin, on procède à établir l'ensemble d'oligonucléotides contenus dans celle-ci. Cet ensemble d'oligonucléotides est construit en considérant chacune des sous séquences, d'amont en aval appelées mots d'une taille définie (typiquement entre 18 et 50 lettres) contenues dans chaque séquence, ainsi comme dans les sous séquences inverses complémentaires de ceux-ci. On écarte les mots qui apparaissent plus d'une fois dans la séquence, en considérant même un nombre de substitutions dans le mot, ce qui préférablement correspond jusqu'à 15% des lettres contenues dans le mot. Par exemple, dans un mot de 20 lettres, 15% correspond à 3 substitutions, de telle façon que, si un mot de longueur 20 coïncide en 17 ou plus lettres avec un autre mot de la même séquence, tous les deux sont écartés. Ce procédé est réalisé efficacement si l'on suit l'algorithme décrit cidessous, qui prend comme entrées la base de données de dessin, la taille des oligonucléotides à dessiner (n) et le nombre maximum de substitutions de lettres admissible (u). La sélection d'oligonucléotides candidats doit être faite en prenant en considération toutes les sous séquences d'une longueur définie existantes dans les séquences d'intérêts et les sous séquences inverses complémentaires de celles-ci. 15 20 35 Algorithme 1. Pour chaque séquence Si de la base de données de dessin Considérer chaque mot P;; sous séquence de longueur n de Si non vue précédemment. Pour chaque séquence Sk, on définit Ck, qui correspond au nombre de fois que l'oligonucléotide apparaît dans chaque séquence candidate, où l'indice k correspond au numéro de la séquence. CkF 0 Pour chaque mot PkI sous séquence de longueur n de Sk Si le mot PkI coïncide avec P11 dans au moins n-u lettres Ck Ck +1 Si le mot PkI coïncide avec Pij dans exactement n lettres Marquer le mot PkI comme déjà vu Rappeler que Pij hybride dans Sk dans le brin +1 Pour chaque mot P'kl séquence inverse-complémentaire de PkI Si le mot P'kl coïncide avec P;1 dans au moins n-u lettres Ck 4- Ck +1 Si le mot P'kl coïncide avec P1 dans exactement n lettres Marquer le mot PkI comme déjà vu Rappeler que Pij s'hybride dans Sk dans le brin -1 Si Ck est supérieur à 1 Marquer le mot P;; comme écarté Si P;; n'est pas écarté Imprimer le mot P1 comme oligonucléotide candidat dans le brin +1 Considérer chaque mot P'ij séquence inverse-complémentaire de P11 non vue précédemment Pour chaque séquence Sk CkF 0 Pour chaque mot PkI sous séquence de longueur n de Sk Si le mot PkI coïncide avec P';1 dans au moins n-u lettres Ck 4- Ck +1 Si le mot PkI coïncide avec P'11 dans exactement n lettres Marquer le mot PkI comme déjà vu Rappeler que P'ij s'hybride dans Sk dans le brin +1 Pour chaque mot P'kl séquence inverse-complémentaire de Pk, Si le mot P'ki coïncide avec P'ij dans au moins n-u lettres Ck4 Ck+1 Si le mot coïncide avec P';i dans exactement n lettres Marquer le mot comme déjà vu Rappeler que P'ij s'hybride dans Sk dans le brin -1 Si Ck est supérieur à 1 Marquer le mot P'1 comme écarté Si P';i n'est pas écarté Imprimer le mot P';J comme oligonucléotide candidat dans le brin -1 Chacun des mots ou sous séquences générés par l'algorithme décrit est appelé oligonucléotide candidat . Dans cette première requête, on obtient généralement une grande quantité d'oligonucléotides candidats, lesquels sont soumis aux critères de sélection de la méthode. Ces candidats sont ensuite évalués pour leur stabilité thermodynamique. La première évaluation correspond à la détermination de la différence d'énergie libre de Gibbs de la structure secondaire qui a l'énergie la plus basse. Cela veut dire que la différence d'énergie libre de Gibbs est calculée pour toutes les conformations spatiales dans lesquelles l'oligonucléotide s'hybride avec lui-même, jusqu'à trouver la structure avec la différence d'énergie la plus basse, c'est-à-dire, la plus stable. Si cette valeur, qu'on appellera AGhm;n, puisqu'elle définit la différence d'énergie libre de Gibbs dans la formation d'épingles dans l'oligonucléotide, est inférieure à une valeur seuil, définie en première requête comme le meilleur quartile, I'oligonucléotide candidat est écarté. Si l'on désire diminuer davantage le nombre d'oligonucléotides candidats, on peut fixer un AGhm;n plus élevé, qui peut être, par exemple, un AGhm; n de -7 kcal/mol; celui qu'on utilise le plus souvent est un seuil AGhm;n de -1,5 kcal/mol. Pour certains procédés, où la concentration des oligonucléotides dessinés serait très élevée, comme dans la réaction en chaîne de polymérisation (PCR) ou l'hybridation fluorescente in situ (FISH), on doit réaliser une seconde validation, qui requiert d'évaluer la moindre des énergies libres de Gibbs de toutes les structures formées par deux copies d'oligonucléotide candidat. De façon analogue au cas précédent, si cette énergie ne dépasse pas une valeur seuil de AGdm;n, ce qui définit la différence d'énergie libre de Gibbs dans la formation de dimères deI'oligonucléotide, l'oligonucléotide est écarté. Le seuil est défini dans une première requête comme le meilleur quartile et, si l'on désire diminuer davantage le nombre d'oligonucléotides candidats, on peut fixer un AGdm;n plus élevé; celui qu'on utilise préférablement selon l'invention est un seuil AGdm;n de -7 kcal/mol. Les méthodes pour calculer ces énergies minimales sont connues et ont été décrites dans la littérature, par exemple dans: Bommarito S, Peyret N, SantaLucia J Jr. (2000). Thermodynamic parameters for DNA sequences with dangling ends. Nucleic Acids Res. May 1; 28(9): 1929-34, D.H. Mathews, J. Sabina, M. Zuker & D.H. Turner. (1999) Expanded Sequence 15 Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288: 911-940. M. Zuker. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31(13): 3406-15. No L. Hofacker, Walter Fontana, Peter F. Stadler, L. Sebastian Bonhoeffer, Manfred Tacker, & Peter Schuster (1994). Fast Folding and Comparison of RNA Secondary Structures. Monatsh.Chem. 125: 167-188. Tous les oligonucléotides qui n'ont pas été écartés dans l'étape précédente constituent les oligonucléotides dessinés par la méthode et ils sont utiles dans des procédés de biologie moléculaire. Identification des groupes taxonomiques avec les oligonucléotides 30 dessinés. Dans les procédés d'identification, on cherche normalement à marquer la présence d'un groupe taxonomique spécifique dans l'échantillon. Dans ce but, chaque oligonucléotide est recherché dans la base de données d'évaluation, en registrant le groupe taxonomique de la séquence dans laquelle ledit oligonucléotide apparaît. Cette opération produit, pour chaque oligonucléotide, un tableau qui indique le nombre de séquences de chaque groupe taxonomique auxquelles ledit oligonucléotide s'hybride. Ceci permet de calculer, pour chaque oligonucléotide, et groupe taxonomique d'intérêt donné, deux indices de spécificité taxonomique qui sont décrits ci-dessous: Soit N le nombre de séquences du groupe taxonomique d'intérêt présentes dans la base de données d'évaluation. Soit T le nombre de séquences du groupe taxonomique d'intérêt auxquelles ledit oligonucléotide s'hybride; et soit R le nombre total de séquences auxquelles ledit oligonucléotide s'hybride. On appelle Sensibilité le pourcentage de séquences d'intérêt qui sont effectivement trouvées par rapport aux séquences d'intérêt présentes dans la base de données. C'està-dire: Sensibilité = T / N De même, on appelle sélectivité le pourcentage de séquences trouvées qui appartient au groupe d'intérêt. C'est-à-dire: Sélectivité = T / R Par exemple, si le groupe taxonomique d'intérêt est l'espèce Escherichia coli, dans la base de données d'évaluation on a N=80 séquences de cette espèce et l'oligonucléotide s'hybride à R=120 séquences, parmi lesquelles T=60 sont E. coli, alors la Sensibilité de cet oligonucléotide est: Sensibilité = T / N = 60 / 80 = 0, 75 Tandis que la sélectivité est: Sélectivité = T / R = 60 / 120 = 0,5 C'est-à-dire, I'oligonucléotide permet d'identifier 75% des séquences d'E. coll. Parmi toutes les séquences que celui-ci reconnaît, 50% sont d' E. coll. Les oligonucléotides plus adéquats pour des procédés d'identification doivent maximiser simultanément ces deux indices. L'étape suivante dans la méthode objet de cette invention est de choisir l'oligonucléotide qui a la Sensibilité et la Sélectivité maximales simultanément. Ceci peut être obtenu, par exemple, par l'obtention du produit des deux indices pour chaque oligonucléotide et par la sélection de la valeur obtenue la plus élevée; ce produit sera appelé Tasse . L'algorithme suivant décrit la procédure pour calculer ces indices pour un oligonucléotide, ce qui est représenté comme O, en fonction du nombre des lettres contenues dans O (une quantité représentée par n) et du nombre maximal de substitutions admissibles, représenté par u: Algorithme 2. Soit T 0 SoitN -O SoitR -O Pour chaque séquence Si de la base de données de référence Si Si appartient au groupe taxonomique d'intérêt N4-N+1 Pour chaque mot P;j sous séquence de longueur n de Si Si P;j coïncide avec O en plus de n-u lettres RE-R+1 Si Si appartient au groupe taxonomique d'intérêt T4-T+1 Finalement, Sensibilité F- TIN Sélectivité 4-T/R Tasse E T2/(NÉR) Les oligonucléotides dessinés et sélectionnés selon cette méthode sont utiles dans des procédés de biologie moléculaire destinés à déterminer la présence d'un groupe taxonomique d'intérêt dans un échantillon complexe. Généralement, ils sont produits par synthèse chimique et ils peuvent être marqués par n'importe quelle technique de marquage connue, par exemple, par marquage radioactif, fluorescent ou chimioluminescent. Dessin de paires d'oligonucléotides. Un certain type de procédés de biologie moléculaire requiert la présence simultanée de plusieurs oligonucléotides différents. Par exemple, la réaction en chaîne de polymérisation (PCR) requiert la présence simultanée de deux oligonucléotides qui satisfont à des conditions déterminées. La méthode objet de cette invention est complétée dans ce cas par les étapes décrites ci-après. Cette étape complémentaire requiert la définition, en plus des éléments déjà mentionnés, d'une taille minimale et d'une taille maximale du produit de PCR qu'on recherche et une limite pour la différence des températures de fusion (Tm) des deux oligonucléotides. On commence par considérer les oligonucléotides dessinés par l'Algorithme 1. Pour chaque séquence de la base de données de dessin, on considère les paires formées par des oligonucléotides qui s'hybrident dans la séquence, de sorte que le premier oligonucléotide s'hybride dans le brin sens et le second s'hybride dans le brin inverse. On calcule la taille d'amplification comme la différence entre la position d'hybridation du second oligonucléotide moins celle du premier. On écarte les paires d'oligonucléotides dont la taille d'amplification ne correspond pas à l'intervalle préétabli. Pour chaque oligonucléotide on calcule la Tm, en utilisant la méthode décrite par Le Novère N. (2001). MELTING, computing the melting temperature of nucleic acid duplex. Bioinformatics. 2001 Dec; 17(12): 1226-7. Les paires d'oligonucléotides dont la température de fusion dépasse la limite de température préétablie sont écartées, une différence de moins de 4 C étant la différence préférée. Une fois obtenue la liste des paires d'oligonucléotides qui remplissent les conditions établies, au moyen de la méthode décrite, on évalue la stabilité thermodynamique de la paire d'oligonucléotides, en déterminant la structure d'énergie minimale formée par les deux oligonucléotides quand ils s'hybrident entre eux. Si cette énergie, qu'on appelle AGxm;n, puisqu'elle définit la différence d'énergie libre de Gibbs dans l'hybridation croisée entre les oligonucléotides, est inférieure à une limite préétablie, qu'on définit en première requête comme le meilleur quartile, I'oligonucléotide est écarté. En tout cas, ladite limite ne doit pas être inférieure à -12 kcal/mol. La méthode utilisée pour calculer AGxm;n est celle décrite par M. Zuker. (2003) 20 Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13): 3406-15. Les paires d'oligonucléotides qui remplissent les restrictions de taille du produit amplifié, de différence de températures de fusion et de stabilité thermodynamique, doivent être évaluées selon leur spécificité taxonomique. On évalue les mêmes paramètres de Sélectivité et Sensibilité que définis préalablement, mais pour les deux oligonucléotides de la paire. On considère qu'une paire d'oligonucléotides s'hybride dans une séquence d'intérêt si les deux oligonucléotides s'hybrident. C'est-à-dire, l'ensemble des séquences auxquelles la paire d'oligonucléotides s'hybride est l'intersection des ensembles de séquences auxquelles chaque oligonucléotide s'hybride. Quand on a déterminé l'ensemble de séquences auxquelles la paire d'oligonucléotides s'hybride, on calcule pour ladite paire ses indices de Sélectivité et Sensibilité correspondants, et on choisit pour le procédé de biologie moléculaire les paires qui maximisent les deux critères. L'algorithme décrit ensuite permet de déterminer des paires d'oligonucléotides qui satisfont aux conditions décrites. On doit considérer que, dans l'étape de dessin d'oligonucléotides, on a déterminé pour chacun d'entre eux le brin auquel ledit oligonucléotide s'hybride (1 ou -1) et la température de fusion de chacun, dénommée Tm. Algorithme 3. Pour chaque séquence Si de la base de données de dessin Pour chaque oligo Fi) qui s'hybride dans la position j avec Si dans le brin 1 Pour chaque oligo Rik qui s'hybride dans la position k avec Si dans le brin -1 Taille - k -j (taille de la région amplifiée) Si Taille est dans l'intervalle spécifié Si Tm(Fij) ne diffère pas de Tm(R;k) de plus de 2 degrés AGd 4Énergie libre de l'hétérodimère Si AGd > OGdmin Soit T 4-0 Soit NO Soit R4-0 Pour chaque séquence Sm de la base de données de référence Si Sm appartient au groupe taxonomique d'intérêt N4-N+1 Si Sm contient simultanément Fu et Rik R4-R+1 Si Sm appartient au taxon d'intérêt T 4- T+ 1 Sensibilité 4- TIN Sélectivité 4- T/R Tasse± T2/(NÉR) Imprimer F1, Rik, Sensibilité, Sélectivité, Tasse On choisit la paire d'oligos qui maximise la "Tasse" On choisit la paire d'oligonucléotides qui maximise le paramètre "Tasse". Les paires d'oligonucléotides dessinées et sélectionnées selon cette méthode sont utiles dans des procédés de biologie moléculaire, tels que des réactions de PCR, destinés à déterminer la présence d'un groupe taxonomique d'intérêt dans un échantillon complexe. Exemples. Exemple 1. Dessin d'un oligonucléotide spécifique pour des bactéries du genre Leptospirillum. On a obtenu une nouvelle base de données qui comprend seulement les séquences codant pour 16S, sélectionnées de la base de données publique GenBank du NCBI. Cette nouvelle base de données constitue la base de données d'évaluation D. On a sélectionné toutes les séquences qui existent chez les bactéries du genre Leptospirillum, dans ce cas 44 séquences, qui constituent la base de données 20 de dessin D. On a déterminé l'ensemble des oligonucléotides de 20 lettres présents dans chacune des séquences, en écartant ceux qui apparaissaient plus d'une fois dans chaque séquence, avec jusqu'à 3 substitutions, en utilisant l'Algorithme 1. Ces oligonucléotides constituent les "oligonucléotides candidats", ceux qui ont été évalués selon leur stabilité thermodynamique en utilisant l'algorithme décrit par M. Zuker. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acids Res. 31(13) : 3406-15. Tous les oligonucléotides candidats dont le AGh est inférieur à -1,5 kcal/mol ou dont le AGd est inférieur à -7 kcal ont été écartés. Cette analyse a produit un total de 14785 oligonucléotides, qui étaient présents dans au moins une des 44 séquences de la base de données de dessin. Aucun des oligonucléotides n'est présent dans toutes les séquences de dessin. On a considéré les oligonucléotides qui sont présents dans la plupart des séquences. Ceci a réduit notre liste à 12 oligonucléotides, ce qui constitue les oligonucléotides dessinés par la méthode et qui ont les structures suivantes: Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide Oligonucléotide 1: TACAGACTCTTTACGCCCAG 2:CTACAGACTCTTTACGCCCA 3: CCTACAGACTCTTTACGCCC 4: ACCTACAGACTCTTTACGCC 5: CACCTACAGACTCTTTACGC 6:CCACCTACAGACTCTTTACG 7: CTGGGCGTAAAGAGTCTGTA 8: TGGGCGTAAAGAGTCTGTAG 9: GGGCGTAAAGAGTCTGTAGG 15 Oligonucléotide 10: GGCGTAAAGAGTCTGTAGGT Oligonucléotide 11: GCGTAAAGAGTCTGTAGGTG Oligonucléotide 12: CGTAAAGAGTCTGTAGGTGG Exemple 2. Identification de bactéries du genre Leptospirillum dans un échantillon 20 métagénomique. Les 12 oligonucléotides dessinés dans l'exemple 1 ont été recherchés dans la base de données de référence et on a obtenu les valeurs suivantes de Sensibilité et Sélectivité: O1igo N T R Sensibilité Sélectivité Tasse 1 54 37 44 84,1% 68,5% 57,6% 2 68 37r 44 84,1% 54,4% 45,8% 3 66 37 44 84,1% 56,1% 47,1% 4 58 37 44 84,1% 63,8% 53,6% 57 37 44 84,1% 64,9% 54,6% 6 56 37 44 84,1% 66,1% 55,6% 2889845 22 7 54 37 44 84,1% 68,5% 57,6% 8 68 37 44 84,1% 54,4% 45,8% 9 66 37 44 84,1% 56,1% 47,1% 58 37 44 84,1% 63,8% 53, 6% 11 57 37 44 84,1% 64,9% 54,6% 12 56 37 44 84,1% 66,1% 55,6% Tableau 1. N= nombre de séquences du groupe taxonomique d'intérêt présentes dans la base de données d'évaluation; T= nombre de séquences du groupe taxonomique d'intérêt auxquelles I'oligonucléotide s'hybride; et R= nombre total de séquences auxquelles I'oligonucléotide s'hybride Selon ces résultats, on a choisi les oligonucléotides 1 et 7 comme les meilleurs candidats. Les deux ont été synthétisés, marqués par fluorescence avec du Cy5 et utilisés comme sondes pour identifier les bactéries du genre Leptospirillum dans un échantillon métagénomique par la technique de FISH. Pour s'assurer que ce qui est détecté correspond uniquement à Leptospirillum, on a réalisé des contrôles avec des cultures pures de Leptospirillum ferrooxidans, où on a trouvé une détection spécifique. Exemple 3. Dessin d'une paire d'oligonucléotides spécifiques pour des bactéries 15 de l'espèce Sulfobacillus the rmosulfidooxidans. Dans la base de données d'évaluation , obtenue dans l'exemple 1, on a sélectionné les séquences qui existent chez les bactéries Sulfobacillus thermosulfidooxidans, dans ce cas 8 séquences, qui constituent la base de données de dessin . On a déterminé deux ensembles d'oligonucléotides d'entre 19 et 21 lettres présents dans chacune des séquences, en écartant ceux qui apparaissaient plus d'une fois dans chaque séquence, avec jusqu'à 3 substitutions, en utilisant l'Algorithme 1. On a écarté tous les oligonucléotides dont le AGh est inférieur à 1,5 kcal/mol et dont le AGd est inférieur à -7 kcal/mol. Le premier ensemble concerne toutes les sous séquences entre 19 et 21 nucléotides dans les séquences d'intérêt et le second concerne les séquences inverses-complémentaires correspondantes. Ensuite, on a déterminé les paires d'oligonucléotides dont les sites d'hybridation sont à une distance d'entre 200 et 500 nucléotides. Ces paires d'amorces ont été évaluées selon leur stabilité thermodynamique en utilisant les critères décrits par M. Zuker. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31(13): 3406-15, et toutes les paires dont l'énergie d'hybridation croisée AGxm;n est inférieure à -12 kcal/mol. Cette analyse a donné un total de 237223 paires d'oligonucléotides présentes dans les 8 séquences de la base de données de dessin. Ces 237223 paires d'oligonucléotides constituent les paires d'oligonucléotides candidates dessinées par la méthode. Pour chacune de ces paires, on a évalué la spécificité taxonomique dans les termes des indices Sensibilité , Sélectivité et Tasse . Les premières 5 paires d'amorces sélectionnées selon ces critères sont montrées dans le Tableau 2: Amorce sens Amorce inverse Paire 1 GCTTGGCAACAGGCGCTCA GGCTTCCTCCGTCGGTACCG Paire 2 TGAGTGGGGGATATCGGGCC TTTGCAGGGGCTTCCTCCGT Paire 3 AGGCGCTCACAGGGGAGCTC GCGGCTGCTGGCACGTAGTT Paire 4 GGTGAGGAACACGTGAGTG CCGGAGGCTTAAAACCGCT Paire 5 CGGGCTGTGAGTGGGGGAT GGGGCTTCCTCCGTCGGTA Tableau 2. Exemple 4. Autres résultats. Dessin d'amorces pour différents taxons. On a utilisé la méthode décrite ci-dessus pour le dessin de nombreuses paires d'amorces spécifiques pour différents taxons, telles que Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum sp., et Acidiphillum sp. Dans le Tableau 3 on montre les conditions thermodynamiques et de spécificité de 4 paires d'oligonucléotides dessinées par la méthode de l'invention pour réaliser une PCR spécifique pour chacun des microorganismes indiqué dans le tableau, c'est-à-dire, A. ferrooxidans, A. thiooxidans, Leptospirillum sp. et Acidiphillum sp. Ces oligonucléotides sont utiles en tant qu'amorces pour PCR pour lesdits taxons. Dans le Tableau 4 on montre les séquences d'amorces spécifiques sélectionnées. Sens Gh Amorce Inverse Gd Gi, Taille Dimère Sensib Spécificité Org Sp Amorce Tm Gd T,,, G, Amorces d'A. ferrooxidans Min Max Select Raison TH674.5F 62 -3.44 1.53 TH1116.11R 60 0.57 444 444 -9.98 4.00 100.00 4.00 1 1 3.23 Amorces d'A. thiooxidans -0.79 TH1393.1R 62 0.36 250 250 -7.53 20.00 100.00 20.00 1 1 TH1143.9F 68 -2.84 2.18 Amorces de Leptospirillum sp. 1.07 LP1472.1R 58 1.47 241 241 -11.38 18.18 100.00 18.18 8 8 LP1233. 1F 60 -4.49 4.88 Amorces d'Acidiphillum sp. 1.40 AP626.2R 62 373 373 -11. 27 2.63 100.00 2.63 1 1 AP202.6F 62 -2.65 2.27 1.18 Table 3 Amorce Séquence TH674.5F GAATTCCAGGTGTAGCGGTG TH 1116.11 R AACCGCTGCAACTAAGGACA TH1143.9F GGGACTCAGTGGAGACCGCC TH1393.1R GTGTGACGGGCGGTGTGTA LP129.4F GATCTGCCCTGGAGATGGGG LP381.1R CGTTGCTGCGTCAGGGTTG AP112.1F GGTGAGTAACGCGTAGGAA AP363.1R TCGCCCATTGTCCAATATT Tableau 4 Dessin d'amorces spécifiques pour A. thiooxidans utiles dans un échantillon métagénomique Dans une autre étude, nous avons utilisé la méthode de la présente invention pour dessiner des amorces spécifiques pour Acidithiobacillus thiooxidans à utiliser dans un échantillon métagénomique. Des paires d'amorces on été dessinées avec la méthode décrite et on a choisi les 4 paires d'amorces avec les indices Tasse les plus élevés. Des essais de PCR ont été réalisés en utilisant comme matrice I'ADNr 16S de 5 échantillons d'Acidithiobacillus ferrooxidans et de 2 échantillons d'Acidithiobacillus thiooxidans, lesquels ont été amplifiés avec chacune des paires dessinées. Le protocole de PCR était celui-ci: 1.- 95 C pendant 5 minutes 2.-95 C pendant 30 secondes 3.-62 C pendant 30 secondes 4.- 72 C pendant 20 secondes 5.- retourner à l'étape (2) 29 fois de plus 6.- 10 C jusqu'à retirer les tubes Dans la Figure 1 on montre les résultats des PCR; les pistes du gel présenté à la Figure 1 ont les contenus suivants: Piste Échantillon 1 A. ferrooxidans DSM 16786 2 A. ferrooxidans ATCC23270 3 A. ferrooxidans DSM 14882 4 A. ferrooxidans ATCC 19859 A. ferrooxidans ATCC33020 6 A. thiooxidans sp. 7 A. thiooxidans DSM 504 (-) Eau stérile Tableau 5. Comme il peut être observé à la Figure 1, toutes les paires d'amorces dessinées ont amplifié A. thiooxidans, tandis que la Paire d'amorces C amplifie spécifiquement A. thiooxidans, sans amplifier A. ferrooxidans, ce pourquoi la Paire C permettrait de déterminer spécifiquement la présence d'A. thiooxidans dans un échantillon métagénomique, alors que dans cet échantillon on trouve A. ferrooxidans, comme c'est communément le cas. REVENDICATIONS 1. Méthode pour dessiner des oligonucléotides qui peuvent être utilisés dans des procédés de la biologie moléculaire, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes de: a. sélectionner ou construire une base de données de séquences de référence, nommée base de données d'évaluation , b. sélectionner un sous-ensemble de séquences correspondant aux organismes d'intérêt, pour construire une base de données de référence, nommée base de données de dessin , c. sélectionner les oligonucléotides candidats à partir de ces séquences, d. épurer ces oligonucléotides candidats selon des critères de spécificité d'hybridation et de stabilité thermodynamique, e. obtenir une liste d'oligonucléotides qui satisfont à toutes ces conditions, et qui constituent ainsi les oligonucléotides dessinés par la méthode. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape (a) on construit la base de données de séquences de référence à partir d'une base de données publique. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'à l'étape (a) on construit la base de données de séquences de référence à partir d'une base de données publique de gènes 16S. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on construit une base de données de dessin à partir de la base de données publique de séquences de référence définie en (a) en sélectionnant les séquences qui correspondent aux gènes d'intérêt. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on construit un sous-ensemble de séquences d'intérêt selon une classification taxonomique. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (c) la sélection des oligonucléotides candidats est faite en considérant toutes les sous-séquences d'une longueur définie existant dans les séquences d'intérêt et les sous séquences inverses-complémentaires de celles-ci. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (d) l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides ceux qui apparaissent moins de deux fois dans chaque séquence d'intérêt. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'on considère qu'un oligonucléotide apparaît plus d'une fois si la même séquence est répétée ou s'il y a une coïncidence de la plupart des nucléotides de deux séquences possibles. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que le nombre de nucléotides de deux séquences qui coïncident est de 85% ou plus. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (d) l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides ceux qui forment des structures secondaires dont la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à un seuil déterminé. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à -7 kcal/mol. 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que la différence d'énergie libre de Gibbs est de -1,5 kcal/mol. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'à l'étape (d) l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides ceux qui s'hybrident avec une copie d'euxmêmes en formant des structures dont la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à un seuil défini. 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à -7 kcal/mol. 15. Méthode selon quelqu'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle inclut optionnellement l'étape: (f) ordonner les oligonucléotides dessinés selon la spécificité taxonomique. 16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'ordonnancement est réalisé en cherchant I'oligonucléotide dessiné dans la base de données de l'étape (a) et le nombre de séquences de chaque groupe taxonomique auxquelles ledit oligonucléotide s'hybride est enregistré. 17. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend l'ordonnancement des oligonucléotides dessinés selon leur spécificité taxonomique, selon la Sensibilité de l'oligonucléotide considéré par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sensibilité correspond au rapport des séquences d'intérêt trouvées versus les séquences d'intérêt existantes dans la base de données. 18. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'on fait en plus l'ordonnancement des oligonucléotides candidats selon la Sélectivité de l'oligonucléotide considéré par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sélectivité correspond au rapport du nombre de séquences trouvées qui appartient au taxon d'intérêt. 19. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'on fait l'ordonnancement des oligonucléotides candidats selon le produit de la Sensibilité et la Sélectivité de chaque oligonucléotide par rapport au groupe d'intérêt, et en ce qu'on sélectionne les oligonucléotides où ledit produit est le plus élevé. 20. Méthode selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend la construction des oligonucléotides sélectionnés, le marquage desdits oligonucléotides avec une technique de marquage connue, et l'utilisation pour identifier la présence de microorganismes du taxon sélectionné dans un échantillon métagénomique. 21. Utilisation d'un oligonucléotide dessiné par la méthode selon les revendications 15 à 20, pour identifier la présence de microorganismes déterminés dans un échantillon métagénomique. 22. Méthode pour dessiner des paires d'oligonucléotides qui peuvent être utilisés dans des procédés de biologie moléculaire, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de: a. choisir ou construire une base de données de séquences de référence, nommée base de données d'évaluation , b. sélectionner un sous-ensemble de séquences correspondant aux organismes d'intérêt, nommée base de données de dessin , c. sélectionner deux ensembles d'oligonucléotides candidats à partir de ces séquences, d. épurer chacun de ces ensembles d'oligonucléotides candidats selon des critères de spécificité d'hybridation et de stabilité thermodynamique, e. obtenir une liste de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble qui satisfont aux conditions physiques et thermodynamiques, lesquelles constituent les paires d'oligonucléotides dessinées par la méthode, et optionnellement f. ordonner ces paires selon leur spécificité taxonomique. 23. Méthode selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'à l'étape (a) on construit une base de données de séquences de référence à partir d'une base de données publique. 24. Méthode selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'on construit la base de données de séquences de référence à partir d'une base de données publique de gènes 16S. 25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on construit une base de données de dessin à partir de la base de données publique de séquences de référence définie en (a) en sélectionnant les séquences qui correspondent aux gènes d'intérêt. 26. Une méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'à l'étape (b) on construit un sous-ensemble de séquences d'intérêt selon une classification taxonomique. 27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisée en ce qu'à l'étape (c) la sélection d'oligonucléotides candidats est faite en considérant toutes les sous-séquences d'une longueur définie existant dans les séquences d'intérêt et les sousséquences inverses-complémentaires de celles-ci. 28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisée en ce qu'à l'étape (d) l'épuration des oligonucléotides candidats considère valides ceux qui apparaissent moins de deux fois dans chaque séquence d'intérêt. 29. Méthode selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'on considère qu'un oligonucléotide apparaît plus d'une fois si la même séquence est répétée ou s'il y a une coïncidence de la plupart des nucléotides de deux séquences possibles. 30. Méthode selon la revendication 29, caractérisée en ce que le nombre de nucléotides de deux séquences qui coïncident est de 85% ou plus. 31. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 30, caractérisée en ce qu'à l'étape (d) on sélectionne un ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble établi à l'étape (c), en considérant que la distance entre la position d'hybridation du premier et du second oligonucléotide dans une séquence déterminée est dans un intervalle préétabli. 32. Méthode selon la revendication 31, caractérisée en ce que la sélection de l'ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble établi dans l'étape (c), considère que la différence des températures de fusion (Tm) prédite pour chaque oligonucléotide est dans un intervalle prédéterminé. 33. Méthode selon la revendication 31, caractérisée en ce que la sélection de l'ensemble de paires d'oligonucléotides formées par un élément de chaque ensemble établi à l'étape (c) considère que la structure plus stable qui serait formée par les deux oligonucléotides a une différence d'énergie libre de Gibbs supérieure à un seuil défini. 34. Méthode selon la revendication 33, caractérisée en ce que la différence d'énergie libre de Gibbs est supérieure à -12 kcal/mol. 35. Méthode selon l'une quelconque des revendications 22 à 34, caractérisée en ce que l'ordonnancement par spécificité taxonomique des paires d'oligonucléotides dessinées par la méthode est déterminé par l'intersection des ensembles de séquences dans la base de données de l'étape (a) auxquels chacun des oligonucléotides de la paire s'hybride. 36. Méthode selon quelqu'une des revendications 22 à 35, caractérisée en ce que ladite méthode inclut l'étape d'ordonner les paires d'oligonucléotides dessinés selon leur spécificité taxonomique, selon la Sensibilité de la paire d'oligonucléotides considérée par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sensibilité correspond au rapport des séquences d'intérêt qui contiennent les deux oligonucléotides versus les séquences d'intérêt existantes dans la base de données. 37. Méthode selon la revendication 36, caractérisée en ce qu'on fait en plus l'ordonnancement des oligonucléotides candidats selon la Sélectivité de la paire d'oligonucléotides considérée par rapport au groupe des séquences d'intérêt, où la Sélectivité correspond à la proportion de séquences qui contiennent les deux oligonucléotides qui appartiennent au taxon d'intérêt. 38. Méthode selon les revendications 36 et 37, caractérisée en ce qu'on fait l'ordonnancement des oligonucléotides candidats selon le produit de la Sensibilité et la Sélectivité des paires d'oligonucléotides considérées par rapport au groupe de séquences d'intérêt, en sélectionnant les oligonucléotides où ledit produit est plus élevé. 39. Méthode selon quelqu'une des revendications 36 à 38, caractérisée en ce qu'elle comprend la construction des paires d'oligonucléotides sélectionnées, et leur utilisation en tant qu'amorces dans la technique de PCR pour détecter la présence des microorganismes du taxon sélectionné dans un échantillon métagénomique. 40. Utilisation d'une paire d'oligonucléotides dessinés par la méthode selon les revendications 36 à 39, pour identifier la présence de microorganismes déterminés dans un échantillon métagénomique.