Brevet FR2893618A1 — publié le 20070525

La présente invention a pour objet de nouveaux complexes métalliques d'onium quaternaire qui ont des propriétés pharmacologiques intéressantes, notamment pour le traitement des cancers. La présente invention concerne également un procédé pour l'obtention de 5 complexes métalliques d'onium quaternaire ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant. La grande majorité des patients atteints de cancers subissent une chimiothérapie. Le choix judicieux de l'agent anti-tumoral approprié ou du mélange d'agents anti-tumoraux appropriés est un défi continuel face à l'évolution de la 10 réponse de la tumeur au traitement. Ces dernières années, la médecine mitochondriale s'est développée à partir de la découverte selon laquelle les maladies cancéreuses sont associées à un dysfonctionnement des mitochondries. La première génération de composés capables de cibler les mitochondries a 15 été développée par Madar et al. [(1999): Enhanced uptake of (11C TPMP) in canine brain tumor: PET studies. J. Nuc. Med. 40, 1180-5]. Il s'agit de dérivés du phosphonium marqués avec le fluor F-18. Des études précliniques sur des cellules et des modèles tumoraux ont montré que les dérivés de phosphonium marqués permettent de détecter des tumeurs solides et de différencier leur malignité de 20 l'inflammation. Ces dérivés s'accumulent intensément dans le néoplasme mais très peu dans l'inflammation [Madar I et al (2001): Enhanced accumulation of [3H] triphenyl methyl phosphonium (TPMP) in breast tumors in vivo: comparison with MIBI. JNM 42, 278P ; Madar I et al (2002 Feb.): Preferential accumulation of (3H)tetraphenyl phosphonium in non small cell lung carcinoma in mice: comparison 25 with 99mTc-MIBI. J. Nucl. Med. 43(2), 234-8]. Il a aussi été démontré par Guo et al. [(2001): Allelic losses in Ora Testdirected biopsies of patients with prior upper aerodigestive tract malignancy. Clin. Cancer Res. 7, 1963-8] que les sondes mitochondriales détectent les cellules modifiées génétiquement bien avant que l'histologie traditionnelle puisse identifier 30 une anomalie cellulaire. En utilisant la tomographie d'émission de positrons (PET), les dérivés de phosphonium mentionnés ci-dessus ont permis de mesurer la réponse de la tumeur à la chimiothérapie. Ces dérivés de phosphonium sont d'excellents outils pour développer des agents anti-tumoraux apoptotiques car ils permettent de tester leur mécanisme d'action et d'évaluer l'efficacité directement chez les patients. D'autre part, les sels de tétraphénylphosphonium cationiques lipophiles sont des nouveaux agents anticancéreux potentiellement utiles dans le traitement de la néoplasie. Le chlorure de tétraphénylphosphonium (TPP) est le composé de base de la série des sels de tétraphénylphosphonium mentionnée ci-dessus, qui inclut notamment le chlorure de (triphénylphosphonium méthyl) benzaldéhyde (médicament A) et le chlorure de [4-hydrazinocarboxy-1-butyl] tris-(4-diméthylaminophényl) phosphonium (médicament B). Ces composés inhibent sélectivement in vitro la croissance de lignées cellulaires de différents carcinomes (sein, colon, pancréas, rein et hypopharynx) comparativement à celle de lignées de cellules non altérées (cellules épithéliales de rein de singe ou de rat) [Rideout, D et al (1989): Phosphonium salts exhibiting selective anticarcinoma activity in vitro. Anti-Cancer Drug Design 4, 265-280 ; Rideout, D et al (1994): Mechanism of inhibition of FaDu hypopharyngeal carcinoma cell growth by tetraphenylphosphonium chloride. Int. J. Cancer 57, 247-253]. Il semble que ces médicaments s'accumulent au niveau intracellulaire en fonction du potentiel mitochondrial de la membrane cellulaire. On pense que les potentiels membranaires plasmatiques hautement négatifs caractéristiques des cellules néoplasiques sont responsables de l'accumulation et de la toxicité des sels de phosphonium dans les cellules malignes [Lampidis T. J. et al (1985): Selective killing of carcinoma cells in vitro by lipophilic-cationic compounds: a cellular basis. Biomed. Pharmacother. 39, 220-226]. On pense aussi que la toxicité mitochondriale est responsable de la cytotoxicité de ces composés. L'inhibition de la respiration mitochondriale a été démontrée avec le TPP [Rideout, D et al (1989): Phosphonium salts exhibiting selective anticarcinoma activity in vitro. Anti-Cancer Drug Design 4, 265-280]. Les autres dérivés de phosphonium ont apparemment un mécanisme d'action similaire car les profils de sensibilité déterminés avec des cellules tumorales sont très semblables. Afin que le traitement par chimiothérapie soit efficace, il convient de disposer de médicaments qui se fixent plus sélectivement sur les cellules néoplasiques que sur les cellules normales ou cellules saines et qui présentent une grande cytotoxicité pour les cellules malignes à des doses qui n'induisent pas d'effets secondaires trop importants pour l'organisme. On sait que les ions métalliques, tels que les ions de gallium, palladium, ruthénium, rhodium, cérium, lanthanium et vanadium, sont des agents antitumoraux efficaces. A cet effet, on peut citer par exemple le brevet EP 0 059 148 qui décrit l'utilisation du chlorure de gallium comme agent anticancéreux ; le brevet EP 0 599 881, qui décrit des complexes du gallium utiles comme agents anticancéreux. On peut également citer les articles ci-après : - Bode AM, Dong Z. 2002. The paradox of arsenic: molecular mechanisms of cell transformation and chemotherapeutic effects. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(1): 5-15 24. - Collery P, Keppler B, Madsoulet C, Desoize B. 2002. Gallium in cancer treatment. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):283-296. - Desoize B, Madoulet C. 2002. Particular aspects of platinum compounds used at present in cancer treatment. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):317-325. 20 - Evangelou AM. 2002. Vanadium in cancer treatment. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):249-265. - Katsaros N, Anagnostopoulou A. 2002. Rhodium ans its compounds as potential agents in cancer treatment. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):297-308. - Melendez E. 2002. Titanium complexes in cancer treatment. Crit. Rev. Oncol. 25 Hematol. 42(3):309-315. - Richardson DR. 2002. Iron chelators as therapeutic agents for the treatment of cancer. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):267-281. - Tiekink ERT. 2002. Gold derivatives for the treatment of cancer. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 42(3):225-248. 30 On a maintenant trouvé des complexes métalliques qui peuvent combiner plusieurs ions métalliques dans une seule molécule. Ces complexes sont des complexes métalliques d'onium quaternaire qui ont des propriétés pharmacologiques très intéressantes. En particulier, ils sont très sélectifs et présentent une activité anti-tumorale analogue, voire supérieure, aux ions métalliques correspondants. Les complexes métalliques d'onium quaternaire selon l'invention répondent à la formule générale : [(R)L M' Xm]2+ [M"Z" . 2M,,,YP M,,,Wq]z (I) dans laquelle : - R est un onium quaternaire choisi parmi les phosphoniums, les ammoniums quaternaires, l'isothiouronium ou le sulfonium ; - M' représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 4 ; - M" représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 2 ou 3 ; - M"' représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 3 ; - X, Y, Z et W identiques ou différents, sont des ions halogénures, de préférence des ions chlorures ; - m est égal à 0, ou bien est un nombre entier égal à 2 ou plusieurs fractions dont la somme est égale à 2 ; -Lestégal à2ou4; - n, p, q sont des nombres entiers égaux à 3 ou 4 ou des fractions dont la somme est 3 ou 4. De préférence, M' est choisi parmi les métaux suivants : silicium, titanium, germanium, zirconium, vanadium, étain, hafnium. M" lorsqu'il a un degré d'oxydation de 2, peut être un métal des groupes IIA, VIII, IB et IIB de la classification périodique de Mendeleeff ; lorsqu'il a un degré d'oxydation de 3, il peut être choisi parmi les métaux des groupes IIIB, VIII et IIIA de la classification périodique de Mendeleeff. De préférence, M" est choisi parmi Fe, Co, Sn, Pd et Pt. M"' a un degré d'oxydation de 3 et peut être choisi parmi les métaux des groupes IIIB, VIII et IIIA de la classification périodique de Mendeleeff. Des exemples de métaux appropriés pour M"' sont Ce, V, Cr, Fe, Co, Gr, Ce et V. De préférence, R est choisi parmi les : - phosphonium quaternaire de formule ùP+(R1)3 dans laquelle R1 est un phényle ou un groupe diméthylamino ; - ammonium quaternaire de formule (R2)4N+_ dans laquelle R2 est un groupe alkyle en C1-C6, en particulier un méthyle, un butyle, un pentyle ou l'hexyle ; - sulfonium de formule (R3)3S+_ dans laquelle R3 est un alkyle en C1-C4, ou un alkylsulfonium de formule : [CH5__CH3] R , dans laquelle R est un résidu hydrocarboné d'un acide gras en C6-C24 ; - isothiouronium de formule S+ûC(NR4)2 dans laquelle R4 est un hydrogène ou un alkyle en C1-C4 ou de formule : + ~~N H RùSùC. NH2 , dans laquelle R est un résidu hydrocarboné d'un acide gras en C6_C24, de préférence R est octyle, lauryle ou dodécyle. Parmi les composés de formule (I) ci-dessus, on préfère tout particulièrement to ceux dans lesquels R est un triphényl phosphonium de formule ûP+(C6H5)3• Parmi ces composés, ceux dans lesquels M' est le germanium, M" est le vanadium et M"' est le cérium sont particulièrement préférés. Ces complexes, qui sont capables de complexer les ions métalliques, sont de préférence des agents tensioactifs cationiques qui possèdent un HLB (équilibre 15 hydrophile / lipophile) d'au moins 7, déterminé par le log du coefficient de partition octanol-eau, c'est-à-dire le coefficient de distribution du composé testé entre la phase huileuse et la phase aqueuse. Les complexes métalliques d'onium quaternaire selon l'invention sont des composés pharmaceutiquement acceptables, dont la toxicité peut être contrôlée par 20 un ajustement de la dose et du schéma d'administration. Les complexes selon l'invention peuvent être obtenus par le procédé qui consiste : 1) à faire réagir un précurseur d'onium avec un composé de formule M'Xm dans un mélange eau / éthanol, à température ambiante. 25 2) à faire réagir au reflux l'halogénure résultant avec un composé de formule M"Zn et un composé de formule M"'YP et éventuellement avec un composé de formule M"'Wq dans un mélange alcool / eau. Selon une variante de mise en oeuvre du procédé, on procède à une évaporation du mélange eau / éthanol à la fin de l'étape 1). Le précurseur d'onium à mettre en oeuvre dans le procédé de l'invention est choisi parmi les phosphines de formule HP(RI)3, les amines de formule (R2)3NH ; les dérivés du soufre susceptibles de donner les ions sulfonium ci-dessus ainsi que les isothiourées de formule HSûC(NR4)2' En général, le complexe obtenu est cristallisé dans le même mélange alcool/eau, qui est de préférence le mélange méthanol / eau. Dans les complexes selon l'invention, les métaux M', M" et M"' sont choisis parmi les métaux connus pour leurs propriétés pharmaceutiques, en particulier leurs propriétés anti-tumorales. De préférence, les métaux M', M" et M"' sont choisis to parmi les métaux suivants : germanium, gallium, palladium, ruthénium, rhodium, cérium, lanthanium ou vanadium. Les composés de l'invention sont des "métallosurfactants" qui sont capables de former des micelles dans l'eau lorsque les groupes alkyle sont des résidus hydrocarbonés d'acides gras, en particulier des groupes dodécyle. 15 L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent à titre de principe actif un complexe selon l'invention en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, approprié pour une administration orale ou parentérale. Les composés de l'invention peuvent être administrés à des doses variables en 20 fonction de l'état du patient et de la tumeur à traiter ; ces doses peuvent être par exemple de 10 à 60 mg par kg et par jour. La présente invention va maintenant être décrite plus en détail par les exemples illustratifs ci-après. 25 EXEMPLE 1 : Synthèse du bis(triphénylphosphine) germane t is(tétrachlorocérate) (tétrachlorovanadate). On a ajouté, lentement et sous agitation, 0,125 g (0,6 mmole) de chlorure de germanium (GeCI4) à 0,65 g (0,23 mmol) de triphénylphosphine dans 20 ml d'acétone. Après 30 minutes d'agitation, on a ajouté un mélange de 0,6 mmol de 30 VCI3 et de 0,18 mmol de CeCI3.7H2O, dissous dans 2 ml d'un mélange méthanol/eau (1:1 v/v). Le mélange résultant a été porté au reflux pendant une heure, puis concentré et enfin refroidi lentement pour donner des cristaux qui ont été filtrés et lavés avec un mélange méthanol / éther (1:10 v/v). Les cristaux obtenus ont été séchés et on a obtenu 1,2 g de bis(triphénylphosphonium) germane tris(tétrachlorocérate) (tétrachiorovanadate) de formule : ++ V CI4 CeCI4-CeCI3 CecI3 Ge Ce composé sera dénommé ci-après "composé AB9". Les caractéristiques physico-chimiques du produit ainsi obtenu sont les suivantes : 1.637,77 - poids moléculaire - spectre IR 687,66 cm-1 (GeûP) -spectroscopie de masse 51(42),77(39),183(26%),277(100%) - H-1 RMN 7,22-7,69 (m,30 H,Ar-H) - adsorbance ultraviolette dans 255 nM une solution de DMF - analyse élémentaire : . calculé C 26,4 ;H 1,97;CI 34,64;P 3,78;Ce 25,67;V 3,11 . trouvé C 26,1 ;H 2,23;Cl 34,44;P 3,20;Ce 25,89;V 3,07 EXEMPLE 2 : Synthèse du bis(triphénylphosphine) dichlorogermane bis(trichlorocérate) (tétrachlorovanadate). On a ajouté, lentement et sous agitation, 0,6 mmole de chlorure de germanium à 1,2 mmole de triphénylphosphine dans 20 ml d'acétone. Après évaporation du solvant, le bis(triphénylphosphonium) dichlorogermane ainsi obtenu a été dissous dans un mélange méthanol/eau (1:1 v/v). A ce composé dissous, on a ajouté un mélange de VCI3 (0,0006 mol) et de CeCI3 (0,0018 mol) en solution dans un mélange méthanol/eau. Le mélange a été chauffé au reflux pendant une heure, concentré et refroidi lentement pour donner un précipité qui a été filtré et lavé avec un mélange éthanol/éther (1:10 v/v). Le produit a été séché et on a obtenu 0,91 g de bis(triphénylphosphonium) dichlorogermane, tétrachlorocérate, tétrachlorovanadate, bis(trichlorocérate) répondant à la formule : ++ V Cl 4_ CeC14 CeCI3 Ceci3 TESTS PHARMACOLOGIQUES * Effets inhibiteurs La lignée de cellules cancéreuses d'ascites d'Ehrlich (cellules CAE) utilisée dans la présente étude, a été fournie par l'Institut National du Cancer au Caire (Egypte) et maintenue dans des souris femelles de type Swiss albinos, par is transplantation intrapéritonéale hebdomadaire de 2,5 x 106 cellules tumorales par souris. Les cellules CAE ont été obtenues par aspiration à l'aide d'une aiguille dans des conditions aseptiques. Les cellules ont été testées pour leur viabilité et les cellules mortes ont été mises en évidence par coloration selon la technique de 20 Lazurus et al. Cancer (1996) Chemother.Res. 50:543. Le fluide ascitique a été dilué dans du sérum physiologique stérile de manière à ce que 0,1 ml de fluide contienne 2,5 x 106 cellules comptées microscopiquement en utilisant un haemocytomètre. Le composé AB9 a été testé in vitro par mélange dans une série de tubes à 25 essais de 0,1 ml de cellules tumorales, 0,8 ml de milieu RPMI 1640 (milieu contenant 1% de I-glutamine, 10% de sérum de veau foetal et 1% de streptomycine) et 0,1 ml de composé à tester à différentes concentrations (correspondant à 10, 20, 25, 50 et 95 g/ml). Les tubes à essais ont été incubés à 37 C pendant deux heures puis 5 centrifugés. Le surnageant a été séparé des cellules par aspiration et les cellules ont été colorées par du bleu de trypan. Le pourcentage de cellules non viables (CNV) a été calculé par l'équation suivante : nombre de cellules non viables % de CNV = / 100 total de cellules _ 10 On a obtenu une augmentation du pourcentage de CNV dépendant de la dose de composé testé. On a ainsi obtenu 10, 40, 80, 100 % de CNV à des doses respectives de 10, 20, 25, 50, 95 gg / ml. On a également testé le composé AB9 sur d'autres lignées cellulaires et déterminé les concentrations inhibitrices à 50 % (CI 50 %). 15 Les lignées cellulaires utilisées sont les lignées 0251 ; Hela et Hepg 2. Des monocouches de cellules ont été incubées avec le composé AB9 pendant 48 heures à 37 C sous une atmosphère chargée à 5 % en CO2 selon le protocole décrit par Skehan P., Storeng R. et al. (1990), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug testing. J. Nat1. Cancer Institute 82: 1107-1112. 20 On a obtenu les résultats ci-après : • lignée cellulaire U251 (lignée de cellules tumorales du cerveau) : CI50 = 0,0041 mol / I • lignée cellulaire Hela (lignée de cellules cancéreuses de l'utérus) : CI50 = 0,0078 'mol / I 25 • lignée cellulaire Hepg 2 (lignée de cellules cancéreuses du foie) : CI50 = 0, 0085 !mol / I * Tests in vivo sur les tumeurs solides ou les ascites d'Ehrlich. Des souris femelles de type Swiss albinos (20-25 g) ont été utilisées dans les tests suivants. Elles ont été placées dans des cages spéciales avec un accès libre à 30 des rations alimentaires et à de l'eau. • Détermination de la dose létale 50 % (DL 50). Pour déterminer la dose non toxique, on a identifié les doses qui provoquent une toxicité aiguë en procédant comme suit : - des souris femelles de type Swiss albinos ont été traitées avec différentes concentrations du composé AB9 allant de 15 à 120 mg/kg de poids corporel en solution dans 0,1 ml de CMC et de sérum physiologique stérile en quantité appropriée. Ces concentrations ont été injectées par voie intrapéritonéale chez 6 souris pour chaque concentration. On a déterminé les doses responsables de toxicité aiguë par analyse des probabilités et la dose non toxique de 25 mg/kg de poids corporel a été choisie pour l'étude in vivo ci-après. L'analyse de probabilité selon la méthode de Hardison et al. "Nine functions for probability distribution" SUGI supplemental library users's guide (1983) ; Sas institute Inc.;Cary, NC., a été utilisée pour calculer la dose létale 50 % (DL 50) chez la souris et la mortalité enregistrée a été détectée 40 jours après le traitement. • Etude de la survie. Un groupe de 20 souris n'ayant pas été inoculées avec les cellules tumorales a reçu la même concentration de CMC et de sérum physiologique. Elles ont servi de 20 souris témoins et permis de calculer le taux de survie. Quatre vingt souris ont été inoculées avec 2,5.106 cellules tumorales dans 0,1 ml de sérum physiologique stérile par voie intramusculaire dans la patte avant droite ou par voie intrapéritonéale et ont les a laissées pendant 10 jours jusqu'à ce que le diamètre des tumeurs atteigne 10 mm3 environ. 25 On a ensuite réparti ces souris en quatre groupes : Groupe I : groupe de souris porteuses de tumeurs solides auxquelles on a injecté du CMC et du sérum physiologique ; Groupe II : groupe de souris porteuses de tumeurs solides auxquelles on a injecté le composé AB9 en solution dans du CMC et du sérum physiologique ; 30 Groupe III : groupe de souris porteuses de tumeurs ascitiques auxquelles on a injecté du CMC et du sérum physiologique ; Groupe IV : groupe de souris porteuses de tumeurs ascitiques auxquelles on a injecté le composé AB9 en solution dans du CMC et du sérum physiologique. On a comparé la survie des différents groupes de souris et on a constaté : - une augmentation du pourcentage de souris survivantes chez les souris traitées avec le composé AB9 par rapport aux souris témoins : 30 % des souris sont mortes le 21ème jour dans le groupe témoin alors qu'aucune souris n'est morte dans le groupe des souris porteuses de tumeurs solides et traitées par le composé AB9. La différence est hautement significative (p REVENDICATIONS 1. Complexes métalliques d'onium quaternaire répondant à la formule : [(R)L M' Xm]2+ [M"Zn . 2M,,,Yp . M,,,Wq]z (I) dans laquelle : - R est un onium quaternaire choisi parmi les phosphoniums, les ammoniums quaternaires, l'isothiouronium ou le sulfonium ; - M' représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 4 ; - M" représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 2 ou 3 ; - M"' représente au moins un métal ayant un degré d'oxydation de 3 ; - X, Y, Z et W identiques ou différents, sont des ions halogénures, de préférence des ions chlorures ; - m est égal à 0, ou bien est un nombre entier égal à 2 ou plusieurs fractions dont la somme est égale à 2 ; -Lestégalà2ou4; - n, p, q sont des nombres entiers égaux à 3 ou 4 ou des fractions dont la somme est 3 ou 4. 2. Complexes selon la revendication 1, caractérisés en ce que M' est Ge. 3. Complexes selon la revendication 1, caractérisés en ce que M" est Va. 4. Complexes selon la revendication 1, caractérisés en ce que M"' est Ce. 5. Complexes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'il est le bis(triphénylphosphine) germane tris(tétrachlorocérate) (tétrachlorovanadate). 6. Complexes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'il est le bis(t iphénylphosphine) dichlorogermane bis(trichlorocérate) tétrachloro(vanadate) tétrachlorocérate. 7. Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.