Brevet FR2888117A1 — publié le 20070112

La présente invention est relative au domaine des vaccins; plus particulièrement, l'invention est relative au domaine des vaccins comprenant un adjuvant. Il existe dans l'art antérieur de nombreux vaccins qui contiennent un ou plusieurs adjuvants. Le brevet US 6 299 884 décrit notamment une formulation adjuvante comprenant une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est comprise entre 100 et 1000 nm. Cette émulsion est obtenue au moyen d'un homogénéiseur haute pression (microfluidiseur), au cours d'un procédé de fabrication mettant en oeuvre de hautes énergies mécaniques afin d'obtenir des forces de cisaillement suffisamment importantes pour réduire la taille des gouttes d'huile. Selon cet enseignement, si la valeur minimale de la fourchette des tailles des gouttes obtenues est de 100 nm, la valeur moyenne est nettement plus élevée et se situe au mieux vers 170 nm, plus généralement vers 500nm. Il est souhaitable de pouvoir disposer d'une formulation alternative à celle proposée dans ce brevet, et surtout qui puisse être obtenue par un procédé plus simple (ne nécessitant pas une technologie de cisaillement particulière), et de basse énergie tout en étant reproductible et parfaitement fiable; en outre, la formulation adjuvante doit permettre d'adjuver efficacement les vaccins, en permettant notamment d'augmenter la réponse immunitaire obtenue ou de diminuer la dose d'antigène présente, tout en ne présentant pas de signe de toxicité qui nuirait à son administration en toute sécurité. Pour atteindre ce but, la présente invention a pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau comprenant au moins: - du squalène, un émulsifiant non-ionique comprenant des groupements oxyde d'éthylène, à l'exception des copolymères de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène, - un émulsifiant non ionique hydrophobe, caractérisée en ce que l'émulsion est thermoréversible et en ce que 90% de la population 30 volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 200 nm. Selon l'invention, une telle émulsion est obtenue par un procédé d'inversion de phase par variation de température, ce qui procure un très gros avantage d'un point de vue industriel. Un tel procédé présente toutes les garanties de sécurité et de rentabilité nécessaires à l'industrie pharmaceutique. En outre, grâce à ce procédé, il est possible d'obtenir une émulsion monodisperse dont la taille des gouttelettes d'huile est très faible, ce qui rend l'émulsion ainsi obtenue particulièrement stable et facilement filtrable au moyen de filtres stérilisants dont le seuil de coupure est de 200 nm. Selon une caractéristique particulière, 90% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 160 nm, et même à 150 nm. En outre, grâce au procédé de préparation utilisé, la dispersion des gouttelettes en terme de taille est très faible; en effet, lorsqu'on réalise la courbe de distribution des tailles de gouttes obtenues, on remarque que l'on a une distribution gaussienne très resserrée; si la valeur de d90 est généralement inférieure à 150 nm, la valeur de d50 est elle inférieure à 100 et même 90nm. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'émulsion selon l'invention comprend en outre un alditol; ceci permet d'obtenir une inversion de phase à une température inférieure à celle qui serait nécessaire pour la même composition ne présentant pas d'alditol, ce qui permet de réduire les coûts de production ainsi que les risques de dénaturation thermique des constituants de l'émulsion. Selon un mode particulièrement avantageux, le tensioactif non-ionique hydrophobe de l'invention est un tensioactif à base d'ester de sorbitanne ou d'ester de mannide. De tels tensioactifs présentent l'avantage de pouvoir être utilisés en toute sécurité dans les solutions injectables. Selon un mode particulier de l'invention, l'émulsion comprend en outre un alkylpolyglucoside et un agent cryoprotecteur tel qu'un sucre, en particulier du dodécylmaltoside et du saccharose.. Ainsi, il est possible d'obtenir une émulsion lyophilisable, qui, après lyophilisation et reconstitution, retrouve ses propriétés, notamment granulométriques, c'est-à-dire que l'émulsion lyophilisée puis reconstituée est toujours monodisperse et est constituée de gouttelettes d'huile dont 90% de la population volumique a une taille inférieure à 200nm. Ceci est particulièrement important pour le domaine des vaccins qui doivent parfois pour des raisons de stabilité (soit de certains antigènes, soit de certains adjuvants) être conservés sous forme lyophilisée. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau, caractérisé en ce que l'émulsion est obtenue par un procédé d'inversation de phase par variation de la température. Grâce à un tel procédé, très avantageux d'un point de vue industriel, on obtient une émulsion monodisperse dont la taille des gouttelettes d'huile est très faible, ce qui rend 5 l'émulsion ainsi obtenue particulièrement stable et facilement filtrable au moyen de filtres stérilisants. De nombreux autres avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre. Par composition vaccinale au sens de la présente invention, on entend une composition susceptible d'être administrée à l'homme ou à l'animal afin d'induire une réponse du système immunitaire; cette réponse du système immunitaire pouvant se traduire par une production d'anticorps ou par une activation de certaines cellules, notamment les cellules présentatrices d'antigènes ( par exemple les cellules dendritiques), les lymphocytes T, les lymphocytes B. La composition vaccinale peut être une composition à visée prophylactique ou à visée thérapeutique, ou encore les deux. Cette activation cellulaire peut être mise en évidence par la présence de marqueurs d'activation à la surface des cellules ou par la libération de cytokines. La composition vaccinale selon l'invention peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées ou préconisées pour les vaccins: voie parentérale, voie muqueuse, et se présenter sous diverses formes notamment liquide ou lyophilisée. Elle peut être administrée au moyen d'une seringue ou au moyen d'un injecteur sans aiguille pour injection intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou au moyen d'un spray nasal. Par antigène au sens de la présente invention, on entend tout antigène susceptible d'être utilisé dans un vaccin, qu'il s'agisse d'un germe entier ou d'un antigène sous-unitaire, peu important sa nature; l'antigène peut en effet être un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un polysaccharide, un glycolipide, un lipopeptide...etc La formulation selon l'invention est particulièrement adaptée aux antigènes viraux; on a en effet obtenu de particulièrement bons résultats avec des antigènes du cytomegalovirus humain, du virus de l'immunodeficience humaine, et de la grippe. En ce qui concerne les antigènes du virus de la grippe, il est possible d'utiliser des antigènes provenant d'une seule souche virale, ou d'un mélange de différentes souches. Il est possible d'utiliser des antigènes issus de virus cultivés de façon traditionnelle sur oeufs, ou sur cellules. Grâce à l'invention, on a remarqué qu'on pouvait, que ce soit pour une seule souche ou pour un mélange de souches, obtenir une réponse satisfaisante du système immunitaire tout en réduisant très fortement la quantité d'antigènes présente dans la dose vaccinale. Ceci peut être d'un intérêt particulièrement grand dans le cas de la préparation d'un vaccin contre une pandémie de grippe, où il faut pouvoir produire dans un délai très court, des quantités très importantes de doses vaccinales. Selon l'invention, l'émulsion huile dans eau comprend du squalène qui est une huile provenant à l'origine du foie de requin; c'est une huile dont la formule chimique brute est C30HSO, comprenant 6 double-liaisons, cette huile est métabolisable et présente des qualités permettant son utilisation dans un produit pharmaceutique injectable. Il existe également du squalène d'origine végétale extrait de l'huile d'olive. On a notamment obtenu de bons résultats en utilisant le squalène fourni par la société Fluka qui est d'origine animale. Les quantités de squalène utilisées pour la préparation d'une émulsion concentrée sont avantageusement comprises entre 5 et 45 % ; cette émulsion concentrée est ensuite diluée pour préparer des doses vaccinales dans lesquelles la quantité de squalène est comprise entre 0,5 et 5%. . Selon l'invention, l'émulsion comprend un émulsifiant hydrophile non ionique comportant des groupements oxydes d'éthylène, à l'exception des copolymères de polyoxyéthène et de polyoxyéthylène qui ne conviennent pas. Un émulsifiant qui convient peut notamment être un tensioactif constitué par un éther de polyoxyéthylèneglycols et d'alcools gras encore appelés alkyl- éthers polyoxyéthylénés ou macrogols ethers. De façon non exhaustive, on peut citer comme émulsifiants appartenant à cette catégorie ceux qui sont connus sous la dénomination BRIJ et qui sont commercialisés par la Société ICI America's Inc., ou encore certains des produits connus sous la dénomination d' EumulginTM commercialisés par la Société Cognis. On a ainsi obtenu de bons résultats avec le produit BRIJ 56. Un composé particulièrement adapté et préféré en raison de son origine semisynthétique est le polyoxyéthylène (12) éther cétostéarylique, fourni par la Société COGNIS sous la dénomination d' EumulginTM B1. Selon l'invention, la composition vaccinale comprend également un tensioactif non- ionique hydrophobe; il doit s'agir d'un tensioactif pouvant être utilisé dans l'industrie pharmaceutique; parmi les tensioactifs convenant à cet égard, on peut citer les tensioactifs à base d'ester de sorbitanne ou d'ester de mannide; les tensioactifs à base d'ester de sorbitanne sont obtenus par réaction d'un acide gras et de mélange d'esters partiels de sorbitol et ses mono et di-anhydres; il peut s'agir d'un mono, d'un di ou d'un tri-ester, ou même d'un mélange; ce sont des tensioactifs hydrophobes dont la balance hydrophilie-lipophilie (HLB) est inférieure à 9. Il s'agit notamment des tensioactifs commercialisés par la Société ICI America's Inc. sous la dénomination de SPAN , ou par la Société Cognis sous la dénomination de DehymulsTM, ou par la Société ICI sous la dénomination de ARLACELTM; comme exemples de tensioactifs convenant particulièrement bien, on peut citer le monooléate de sorbitanne, commercialisé sous la dénomination de Dehymuls SMO TM ou de SPAN 80. Parmi les tensioactifs à base d'ester de mannide, on peut citer le mannide monooléate commercialisé par la Société SIGMA, ou par la Société SEPPIC sous la dénomination de Montanide 80TM Les quantités de squalène et de chacun des tensioactifs utilisés sont avantageusement choisies de manière à obtenir un mélange dont le diagramme de phases comporte une phase de courbure moyenne nulle (type microémulsion ou phase lamellaire) pour laquelle les tensions interfaciales sont extrêmement basses. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition vaccinale comprend, en outre, un alditol tel que notamment le glycérol, l'érythritol, le xylitol, le sorbitol ou le mannitol. On a notamment obtenu de bons résultats avec le mannitol commercialisé par la Société ROQUETTE Frères. Les quantités d'alditol utilisées lors du processus de préparation, peuvent varier entre 1 et 10 %, lorsque l'on souhaite préparer une émulsion qui sera conservée à l'état liquide. Cependant, dans le cas d'une émulsion destinée à être lyophilisée, les quantités d'alditol seront augmentées, et pouffant être de l'ordre de 20%. Selon une caractéristique de l'invention, la composition vaccinale comprend en outre un cryoprotecteur qui permet la lyophilisation de l'émulsion obtenue; parmi les cryoprotecteurs, les sucres sont particulièrement préférés, et notamment le saccharose. En outre, l'émulsion selon l'invention peut comprendre un alkyl polyglycoside qui est un tensioactif à tête sucre; il peut notamment s'agir de décyl-D galactoside uronate de sodium, ou selon un mode préféré de dodécyl (3 maltoside disponible auprès de la Société Fluka. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la phase aqueuse de l'émulsion est constituée par un tampon, tel que les solutions de Dulbecco tamponnées au Phosphate (D-PBS, sans calcium ni magnésium). Grâce au procédé de préparation de la composition vaccinale selon l'invention par une inversion de phase obtenue en faisant varier la température, on obtient très facilement, de façon très reproductible, une émulsion directe huile dans eau dont la taille des gouttelettes d'huile est très homogène; la valeur de d90 (en volume) est inférieure à 200 nm, et en général proche de 150 nm, en même temps que la valeur de d50 est inférieure à 80 nm. On peut ainsi, après qu'elle ait été diluée, effectuer une filtration stérilisante de l'émulsion obtenue. De telles émulsions dont la taille des gouttes est homogène et très petite, sont stables dans le temps. Ainsi, on a pu remarquer qu'une émulsion préparée selon l'invention et stockée à 4 C, conservait après 2 ans, un profil monodisperse, avec une valeur de d50 de 90 nm et une valeur de d90 de 116, ce qui prouve la très grande stabilité de l'émulsion. La mesure de la taille des gouttes peut se faire par différents moyens, et notamment par des granulomètres à diffraction LASER, tels que les appareils Beckman Coulter de la gamme LS (notamment le LS230). Le principe de mesure de ces appareils est basé sur l'analyse de l'intensité de la lumière diffusée par les particules en fonction de l'angle (détecteurs de grands, moyens et petits angles) lorsque l'échantillon est éclairé par un faisceau LASER. Cette analyse se fait au moyen de modèles mathématiques choisis selon la taille et la nature du matériau utilisé. Dans le cas de mesure de taille de particules submicroniques, il faut appliquer un modèle optique particulier (théorie de Mie) prenant en compte les indices de réfraction de l'échantillon (ici 1,495 pour le squalène) et de son milieu (ici 1,332 pour l'eau) ; il faut également être capable de détecter les faibles intensités émises par les particules très fines, ce qui nécessite une cellule supplémentaire de détection pour la mesure aux grands angles de la diffusion différentielle des intensités polarisées ( système PIDS chez Coulter qui permet une mesure dès 40 nm). Aux fins de description del' invention, les paramètres de d50 et d90 mentionnés dans la présente demande de brevet, sont des valeurs volumiques; la valeur de d50 signifie la valeur de 50% de la population volumique des gouttes. Le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de la manière suivante: on prépare une émulsion grossière huile/eau concentrée par incorporation de la phase aqueuse (solution tamponnée de polyol comprenant le tensioactif non-ionique à groupements polyoxyéthylène) dans la phase huileuse (squalène, et tensioactif à base d'ester de sorbitanne). On obtient alors une émulsion huile dans eau non calibrée, qui manifeste rapidement son instabilité. Cette émulsion est chauffée jusqu'à obtention d'une inversion de phase, c'est-à-dire l'obtention d'une émulsion eau dans huile. La transition ou inversion de phase peut être suivie par conductimétrie. La température à laquelle se produit le changement de courbure traduisant le passage d'un type d'émulsion à un autre est la température d'inversion de phase. Une fois cette température d'inversion de phase atteinte, et donc en présence d'une émulsion eau dans huile, on arrête le chauffage et on refroidit le mélange. L'émulsion eau/huile va alors à nouveau s'inverser pour donner lieu à nouveau à une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est cette fois très homogène et petite; l'émulsion obtenue est alors très stable. Cette émulsion concentrée peut alors être diluée par une solution comprenant l'antigène vaccinal, et être stockée à +4 C. Cette émulsion est thermoréversible, ce qui signifie que si elle est portée à une température supérieure à la température d'inversion de phase, elle va devenir une émulsion eau dans l'huile. De façon avantageuse selon l'invention, la formulation de l'émulsion est choisie pour avoir une température d'inversion de phase qui soit comprise entre 45 et 80 C, et plus particulièrement entre 50 et 65 C. Ainsi, on évite de chauffer à des températures trop élevées qui risqueraient d'induire des dégradations chimiques des constituants ou une évaporation de la phase aqueuse, et on évite également de provoquer une nouvelle inversion de phase lors d'un stockage ultérieur, soit durant la phase de préparation de la composition vaccinale, c'est-à-dire avant d'être incorporée à la solution antigénique, soit ultérieurement lors du stockage de la composition vaccinale avant son utilisation. Un tel procédé peut être mis en oeuvre de différentes façons. En effet, il est possible, ainsi que cela vient d'être décrit de mélanger d'un côté le squalène avec le tensioactif à base d'ester de sorbitanne et d'un autre côté la solution tamponnée de polyol avec le tensioactif à groupements oxydes d'éthylène; d'homogénéiser chacun des mélanges, et de les réunir ensuite afin d'obtenir l'émulsion brute qui sera alors chauffée puis refroidie. Alternativement, les mélanges préparés séparément peuvent être chauffés à une température légèrement supérieure à la température d'inversion de phase, avant d'être rassemblés pour donner une émulsion inverse eau dans huile qui sera refroidie jusqu'à obtention de l'émulsion submicronique huile/eau. Ces opérations peuvent être réalisées dans des réservoirs séparés pour une préparation en lots. Il est également possible d'utiliser un procédé en ligne. Le procédé de fabrication de l'émulsion en ligne consiste en un mélange à chaud des deux phases aqueuse et huileuse préalablement préparées séparément, au travers d'un mélangeur statique thermostaté suivi d'un refroidissement en ligne au travers d'un échangeur thermique réfrigéré connecté en sortie du mélangeur statique, puis de la récupération finale de l'émulsion selon l'invention dans un récipient approprié (flacon ou réacteur). On a utilisé un mélangeur statique constitué d'une succession d'éléments de mélange composés de lames croisées et inclinées par rapport à l'axe du tube dans lequel ils sont introduits. L'énergie nécessaire au mélange est fournie par les pompes qui véhiculent les fluides et le mélange est réalisé sans pièce mobile, au travers des éléments de mélange par la séparation, le déplacement et la réunion successive des constituants du mélange. Le procédé de fabrication en ligne est mis en oeuvre selon la manière suivante: on prépare séparément la phase aqueuse (solution tamponnée comprenant le tensioactif non-ionique à groupements polyoxyéthylène) et la phase huileuse (squalène, et tensioactif non ionique hydrophobe) dans deux flacons ou réacteurs. Les deux phases sont chauffées sous agitation à une température légèrement supérieure à la température d'inversion de phase. Les deux phases sont alors introduites dans un mélangeur statique thermostaté au moyen de 2 pompes, dont les débits sont régulés de manière à obtenir la composition de l'émulsion selon l'invention. L'émulsion inverse eau dans l'huile est obtenue durant le passage des deux phases dans le mélangeur statique. L'émulsion inverse est ensuite refroidie par passage en ligne au travers d'un échangeur thermique réfrigéré connecté en sortie du mélangeur statique. L'émulsion eau dans huile va alors s'inverser au travers de l'échangeur thermique réfrigéré pour donner lieu à une émulsion huile dans eau, qui sera réceptionnée dans un flacon ou réacteur et dont les caractéristiques sont identiques à celles de l'émulsion obtenue par un procédé en batch. Les exemples qui suivent illustrent différents modes de réalisation de l'invention. Exemple 1: Préparation d'une émulsion concentrée de squalène. On mélange dans un bécher 3,71g d'EumulginTM B1 et 33,9g d'une solution de mannitol à 10% en tampon PBS, que l'on homogénéise sous agitation à environ 30 C. Dans un autre récipient, on mélange 2,89g de DehymulsTM SMO et 19,5g de squalène que l'on agite magnétiquement. Lorsque des phases homogènes sont obtenues dans chacun des récipients, on incorpore la phase aqueuse à la phase huileuse qui est maintenue sous agitation à 30 C. Lorsque l'incorporation est terminée, on chauffe l'émulsion brute obtenue jusqu'à ce que la température atteigne 58-60 C, tout en maintenant l'agitation. On cesse ensuite le chauffage mais on maintient l'agitation jusqu'à ce que la température atteigne la température ambiante. On a alors une émulsion huile dans eau, dont la taille des gouttelettes d'huile est centrée autour de 80 nm, et dont la composition en masse est la suivante: - 32,5 % de squalène, 6,18 % de polyoxyéthylène (12) cétostéaryétherl, 4,82 % de monooléate de sorbitanne, - 6 % de mannitol Exemple 2: Composition vaccinale contre le SIDA. On prépare des compositions vaccinales comprenant comme antigène une protéine TAT III B détoxifiée. La protéine TAT a été détoxifiée par une réaction d'alkylation en milieu alcalin par utilisation d'iodoacétamide dans les conditions suivantes: nombre de micromoles d'iodoacétamide = 200 X nombre de micromoles de TAT + nombre de micromoles de DTT. Cette protéine détoxifiée et son procédé de préparation sont décrits en détails dans la demande WO99/33346 où elle est identifiée sous le terme de TAT carboxyméthylée. Cet antigène TAT recombinante est conservé en solution, en présence de tampon TRIS 50mM, pH 7,5 à -70 C. Les compositions vaccinales à administrer sont préparées à partir de solutions concentrées, afin d'obtenir des doses d'immunisation de 200111 ayant les compositions quantitatives suivantes: pour la composition ayant uniquement l'antigène: 20 g de TAT en tampon 30 TRIS 50mM, NaCl 100 mM à pH 7,5. pour la composition selon l'invention: É 20 g de TAT, É 5 mg de squalène 10- É 0,75 mg de Dehymuls SMO, É 0,94 mg d' Eumulgin B1, É 0,91 mg de mannitol. On dispose de 2 groupes de 6 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui l'on injecte une des compositions préparées par voie sous-cutanée, à raison d'une dose de 20O 1 par souris; les injections sont réalisées à JO et à J21. On prélève des échantillons sanguins au sinus retro-orbital à J14 pour l'appréciation de la réponse primaire et à J34 pour la réponse secondaire. La détermination du taux d'IgGl et d'IgG2a spécifiques est effectuée grâce à des tests ELISA standardisés. Les souris sont sacrifiées à J37; on prélève leur rate et on isole les splénocytes. Les résultats obtenus en ce qui concerne les réponses humorales sont récapitulés dans le tableau ci-dessous, où les taux d'IgG sont exprimés en unités arbitraires ELISA (loglO). Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquée dans le tableau est le titre géométrique 15 moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris. Composition IgGl IgG2a IgGl IgG2a Rapport vaccinale à J14 à J14 à J34 à J34 IgGl/IgG2a à J34 Tat 2,6 1,2 4,4 3,0 25 Tat+ PIT 3,5 2,5 5,7 5,0 5 Les résultats obtenus montrent que l'émulsion selon l'invention permet d'accroître globalement la réponse humorale et tend en outre à favoriser la réponse T helper de type 20 1 car la réponse IgG2a est plus augmentée que la réponse IgGl. En ce qui concerne la réponse cellulaire, on a pu mettre en évidence, par dosage ELISPOT après restimulation avec de la protéine TAT recombinante des splénocytes prélevés, une nette augmentation du nombre de cellules produisant l'interféron y lorsque les splénocytes proviennent de souris immunisées avec une préparation selon l'invention ( 486 spots par 106 cellules contre 39 par 106 pour la préparation contenant l'antigène seul) . De même, le dosage des cytokines dans les surnageants de culture a montré la plus grande sécrétion à la fois d'interféron y ( 5028 pg/ml contre 1940 pg/ml) et d'Interleukine 5 ( 5365 pg/ml contre 2394 pg/ml). Il- Exemple 3: Préparation d'une composition vaccinale contre les infections à cytomegalovirus humain. On prépare des compositions vaccinales comprenant à titre d'antigène vaccinal une protéine recombinante dérivée d'une glycoprotéine d'enveloppe de la souche Towne du Cytomegalovirus (CMV) dénommée gB dont les séquences nucléotidique et protéique sont décrites dans le brevet USP 5,834,307. Cette protéine recombinante est produite par une lignée CHO recombinante transfectée par un plasmide dénommé pPRgB27clv4 qui contient un gène modifié de la gB. En effet, pour faciliter la production de cette protéine recombinante par la lignée CHO le gène de la gB a été modifié au préalable en supprimant la partie du gène qui code pour la région transmembranaire de la protéine gB correspondant à la séquence d'acides aminés comprise entre la Valine 677 et l'Arginine 752 et en introduisant 3 mutations ponctuelles de sorte que le site de clivage existant dans la gB native a été supprimée. En définitive la protéine recombinante produite par la lignée CHO recombinante correspond à une protéine gB tronquée dépourvue de site de clivage et de région transmembranaire dénommée gBdTM. La construction du plasmide pPRgB27clv4 et la production de la protéine gB tronquée (gBdTM) par la lignée CHO recombinante sont décrites dans US 6,100,064. La purification de la protéine gB tronquée est réalisée sur colonne chromatographique d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal 15D8 décrit par Rasmussen L et al. ( J. Virol. (1985) 55: 274280). A partir d'une composition stock à 0.975 mg/ml d'antigène gB ainsi obtenu et maintenu en tampon phosphate, de l'émulsion selon l'invention concentrée telle que décrite à l'exemple 1, et d'une émulsion de l'art antérieur obtenue par microfluidisation, on prépare des doses de compositions immunisantes de 50 1 ayant les compositions suivantes: 2 gg de gB en tampon citrate à pH 6, (groupe appelé gB seule) 2 g de gB; 1, 075mg de squalène; 0,133 mg de Montane VG 85 et 0,125 mg de TweenTM80 en tampon citrate à pH 6, (groupe appelé avec émulsion de l'art antérieur ) - 2 g de gB; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de Dehymuls SMO; 0,235 mg d'Eumulgin B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. (groupe appelé avec émulsion de l'invention ) On dispose de 3 groupes de 10 souris Outbred OF1 femelles, âgées de 8 semaines que l'on immunise 2 fois, à JO et à J21 par voie sous-cutanée, par une des compositions indiquées ci-dessus ( chaque groupe de souris reçoit les 2 fois la même composition) On prélève à J20 et J34 au sinus retro-orbital des échantillons sanguins qui sont utilisés pour déterminer les concentrations en anticorps de type IgGI et IgG2a spécifiques de l'antigène gB. Les dosages sont réalisés grâce à des tests ELISA; les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-dessous, et sont exprimés en loglo des titres ELISA. Les valeurs indiquées sont les valeurs moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. J20 J34 Ratio à J34 Nature des Groupes IgGI IgG2a IgGI IgG2a IgGl/IgG2a gB seule 2,474 2,094 3,801 2,941 137 gB + émulsion de l'art antérieur 4, 0632,980 5,493 4,185 143 gB + émulsion selon l'invention 4,615 3,914 5, 615 4,854 14 Ces résultats montrent l'efficacité de l'émulsion selon l'invention qui permet une plus grande induction d'anticorps à la fois ceux de type IgGI et IgG2a, avec en outre, par rapport à l'émulsion selon l'art antérieur l'obtention du résultat recherché dans le cadre d'un vaccin contre le cytomégalovirus humain, qui est d'orienter la réponse immunitaire vers une réponse TH1 (dont un indicateur est le taux d' IgG2a) , tout en maintenant la réponse de type TH2 (dont un indicateur est le taux d' IgGI) à un niveau suffisant. Exemple 4: Composition vaccinale contre la grippe. On dispose d'antigènes de virus grippal obtenus selon le procédé décrit aux exemples de la demande WO9605294, à l'exception du fait que la souche virale utilisée est la souche A/New Caledonia H1N 1. - 13 - A partir de cette préparation d'antigènes, de l'émulsion concentrée obtenue à l'exemple 1, et d'une suspension d'aluminium fournie par REHEIS sous la dénomination A1O0H Rehydra, on prépare des doses d'immunisation de 500 qui ont la composition indiquée ci-après, où les quantités d'antigènes de la grippe sont exprimés en poids d'hémagglutinine HA. soit l g de HA en tampon PBS, soit 5 g de HA en tampon PBS, soit 1 g de HA et 60 g d'hydroxyde d'aluminium, soit 1 g de HA; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg 10 d' EumulginTM B; 0,21 mg de mannitol; le tout en tampon PBS. On dispose de 8 groupes de 5 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO les compositions préparées selon la répartition suivante: un groupe reçoit la composition ayant 1 g de HA par voie souscutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 11.tg de HA par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 5 g de HA par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 5 g de HA par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 11.ig de HA et 60 g d'aluminium par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la même composition ayant 1 g de HA et 60 g d'aluminium par voie intra-dermique, un groupe reçoit la composition ayant 1 de HA et l'émulsion selon l'invention par voie sous-cutanée, un groupe reçoit la composition ayant 11.tg de HA et l'émulsion selon l'invention 25 par voie intra-dermique. On prélève sur chacune des souris des échantillons sanguins à J7, J14, J27, J41, J56, J77 et J105. Les sérums des souris immunisées sont testés d'une part par la technique ELISA afin 30 d'évaluer leur teneur en anticorps totaux induits contre la souche grippale A/H1N1 du vaccin trivalent. Les titres anticorps sont exprimés en unités ELISA arbitraires en valeur loglO, avec un seuil de détection à 1,3 loglO. Ces sérums sont testés d'autre part par la technique IHA (inhibition d'hémaglutination) pour déterminer leur teneur en anticorps fonctionnels contre la souche grippale A/H1N1. Les titres anticorps sont exprimés en inverse de dilution en valeur arithmétique, avec un seuil de détection à 5. Les résultats obtenus sont repris dans les tableaux ci-après, dans lesquels les valeurs indiquées représentent la moyenne des titres des souris de chaque groupe. Titres ELISA: Groupe de Voie J14 J28 J41 J56 J105 souris d'immunisation HA 1 g sous-cutanée 2,838 3,288 3,556 3,581 3,535 HA 5 g sous-cutanée 3, 203 3,642 3,836 3,732 3,844 J HA 1 g + sous-cutanée 2,860 3,363 ^ 3,843 3,951 3,982 A1O0H HA 1 g + souscutanée 4,043 4,511 4,753 4,723 4,681 émulsion HA 1 g intradermique 2,174 2,814 3,143 3,075 2,735 HA 5 g intradermique 1 2,839 3,297 3,496 3,549 3, 479 HA 1 g + intradermique 2,654 3,004 3,137 3,020 2,724 A1O0H HA 1 g + intradermique 4,134 4,692 4,895 4,911 4,823 émulsion Titres IHA: Groupe de Voie J14 J28 J41 J56 J105 souris d'immunisation HA 1 g sous-cutanée 5 6 5 40 23 HA 5 g sous-cutanée 5 9 20 HA 1 g + sous-cutanée 5 15 23 121 160 A1OOH HA 1 g + sous-cutanée 6 160 368 422 485 émulsion HA 1 g intradermique 5 5 5 23 8 FIA 5 g intradermique 5 8 10 HA 1 g + intradermique 5 5 5 26 7 A1O0H HA 1 g + intradermique 7 557 1640 1557 1844 émulsion Ces résultats montrent l'intérêt de la présente invention; en effet, l'hydroxyde d'aluminium qui est un adjuvant bien connu et largement utilisé dans l'art antérieur ne permet pas d'augmenter l'immunogénicité des antigènes de la grippe avec la même rapidité et la même force que la formulation selon l'invention; on constate aussi que la composition selon l'invention est particulièrement efficace, que ce soit par voie sous-cutanée, ou par voie intradermique. Exemple 5: Composition vaccinale contre la grippe. On veut évaluer chez des souris, l'intérêt de la présente invention pour diminuer la quantité d'antigène vaccinal lorsque qu'il s'agit d'un vaccin contre la grippe contenant comme antigènes 3 souches de virus grippal, et qui serait administré par voie intradermique. A cette fin, on dilue l'émulsion concentrée de l'exemple 1 par du tampon PBS afin d'obtenir une émulsion à 5% de squalène, que l'on va encore diluer pour moitié par une composition comprenant les antigènes. - 16 - On dispose en effet d'une composition comprenant du virus grippal provenant de 3 souches virales différentes obtenues de la manière décrite dans la demande de brevet WO9605294, les 3 souches étant ici la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2), la souche B/Jiangsu. Une telle composition vaccinale trivalente est une composition classique pour un vaccin contre la grippe et correspond au vaccin commercialisé dans l'hémisphère Nord lors de la campagne grippe 2004. Les quantités d'antigènes de chacune des souches virales sont appréciées par leur quantité d'hémagglutinines HA. Les doses d'immunisation préparées, de volume 501.tl, ont les compositions indiquées ci-10 après: 0,33 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 1,31 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 5,25 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 10,5 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 21 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS à pH 7,4; 0,33 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4; 1,31 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg 20 de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0,230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4; 5,25 g de HA de chacune des souches virales; 1,25 mg de squalène; 0,185 mg de DehymulsTM SMO; 0,235 mg d'EumulginTM B1 et 0, 230 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. On dispose de 8 groupes de 10 souris BALB/c femelles âgées de 6 à 8 semaines à qui on administre par voie intradermique (face interne de l'oreille) une des compositions préparées, à raison d'une composition par groupe. 3 semaines après l'immunisation, on prélève des échantillons sanguins et on dose par ELISA pour chacun des groupes, les IgG induites contre chacune des souches virales; on effectue en outre, pour chacun des groupes, un test d'inhibition de l'hémagglutinine contre chaque souche virale. Les résultats obtenus, sont représentés dans le tableau ci-dessous sous forme de moyennes pour chacun des groupes; les résultats ELISA sont exprimés en loglo d'unités arbitraires, et les résultats IHA sont les titres moyens arithmétiques des inverses de dilution. Nature H 1N 1 H3N2 B Composition ELISA IHA ELISA IHA ELISA IHA 0,33 g HA _ 3,51 35 4,38 243 4,28 25 1,31 g HA 3,96 65 4,74 640 4,35 32 5,25 g HA 4,16 92 5,05 970 4,62 53 10,5 g HA 4,38 197 5,18 1810 4,71 130 21 g HA 4,63 - 260 5,37 2389 4,98 184 0,33 g HA 4,27 226 5,20 2389 4, 91 149 +émulsion 1,31 g HA 4,46 279 5,37 3880 4,95 171 + émulsion 5,25 g HA 4,68 394 5,58 5487 5,12 22 +émulsion Ces résultats permettent de mettre en évidence l'intérêt particulier de l'invention pour réduire la quantité d'antigènes; en effet, grâce à l'émulsion selon l'invention, on peut pour une même réponse immunitaire induite, abaisser de façon très importante la quantité d'antigènes présente dans la dose d'immunisation. Exemple 6: Composition vaccinale contre la grippe trivalente chez des individus non naïfs. On veut tester l'efficacité de l'émulsion de l'invention dans le cas d'un vaccin contre la grippe qui serait administré à des personnes dont l'organisme a déjà été au contact d'antigènes du virus de la grippe, ainsi que cela est fréquemment le cas, soit parce que les personnes ont déjà été en contact avec le virus de la grippe, soit parce qu'elles ont déjà été précédemment vaccinées avec un vaccin anti-grippal. Selon les informations publiées par C.W. Potter dans Vaccine, 2003, 21:940-5, il est possible d'utiliser comme modèle animal pour faire ce test, des souris BALB/c préalablement immunisées par voie intramusculaire par un vaccin trivalent. On prépare donc des doses d'immunisation de 50 l comprenant soit uniquement du tampon PBS, soit du vaccin trivalent de la campagne 2004, c'est-à-dire un vaccin comprenant la souche A/New Caledonia (H 1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu, à raison de 5 g de HA de chacune des souches, en tampon PBS à pH 7,4. On dispose de 6 groupes de 7 souris BALB/c; on immunise 3 groupes avec les doses 10 comprenant uniquement du tampon, et 3 autres avec le vaccin trivalent, par voie intramusculaire. On prépare en outre, à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 mentionnée ci-dessus des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions 15 suivantes: tampon PBS seul, - 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS - 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de 20 DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. Chacune des compositions ainsi préparée est utilisée pour immuniser à J34 par voie intradermique (dans la face interne de l'oreille) à la fois un groupe de souris ayant reçu au préalable uniquement du tampon PBS, et un groupe de souris ayant reçu une dose de vaccin trivalent. On prélève à J56 un échantillon sanguin de chacune des souris, et on effectue un dosage des anticorps produits contre la souche H1N1 (A/New Caledonia) grâce à un test 30 d'inhibition de l'hémagglutinine. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après et représentent les valeurs moyennes obtenues pour chaque groupe de souris ayant suivi le même protocole d'immunisation. Identification Nature de la dose Nature de la dose Titre IHA vis-à-vis Groupe de souris pour le priming im pour le boost id de la souche H1N1 A PBS PBS 5 B PBS Vaccin trivalent à 59 0,3 g HA/souche C PBS Vaccin trivalent à 320 0,3 g HA/souche + émulsion D Vaccin trivalent à PBS 145 gg HA/souche E Vaccin trivalent à Vaccin trivalent à 476 gg HA/souche 0,3 g HA/souche F Vaccin trivalent à Vaccin trivalent à 861 g HA/souche 0,3 g HA/souche + émulsion Ces résultats montrent tout l'intérêt de l'invention même chez des individus non naïfs vis-à-vis de l'antigène administré. En effet, contrairement aux observations de C.W. Potter lors de l'utilisation de ce modèle qui, lui, n'avait pu montrer qu'un faible effet adjuvant des Iscoms lorsqu'ils étaient utilisés pour immuniser des souris pré-infectées ou pré-vaccinées par des antigènes de la grippe, ici on voit que l'émulsion selon l'invention permet d'augmenter de façon significative la réponse induite, que les souris immunisées soient des souris naïves, ou des souris ayant déjà été immunisées par du vaccin grippe. Exemple 7: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant de faibles 15 doses d'antigènes On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New 2888117 - 20 - Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,111g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,4 g de FIA de chacune des souches virales en tampon PBS, 1,6 g de FIA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,1 gg de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4, 0,4 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 On dispose de 6 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). Dans chaque groupe, on administre à nouveau par voie intradermique à la moitié des souris à J29, une 2nde dose ayant la même nature que la lère dose administrée. On prélève des échantillons sanguins à J22 et à J43 afin de déterminer les quantités d'anticorps induits. Les dosages d'anticorps sont effectués par ELISA pour les anticorps induits à J22 et à J43, vis-à-vis de l'ensemble des souches administrées: H1N1, H3N2 et B, et par IHA vis-à-vis de la souche H1N1 uniquement à la fois à J22, et à J43. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après, où les titres exprimés sont les moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. En ce qui concerne les résultats à J43, les moyennes ont été réalisées séparément à l'intérieur d'un même groupe, pour les souris ayant reçu 2 doses de vaccin et celles n'en ayant reçu qu'une. -21 - Composition Titre ELISA Titre Titre ELISA Titre IHA Titre IHA vaccinale H1N1 à J22 ELISA B à J22 H1N1 à J22 H1N1 à J43 H3N2 à J22 Souris Souris Boostées non boostées 0,1 tg HA 3,467 4,131 4,063 57 95 80 0,4 g HA 3, 816 4,527 4,313 73 226 80 1,6 g HA 4,069 4,831 4,750 147 1280 135 6,3 g HA 4,534 5,298 4,947 320 1522 320 0,1 g HA 4,200 5,015 4,807 207 2153 538 + émulsion - 0,4 g HA 4,612 5,482 5,001 453 2560 640 + émulsion Composition Titre ELISA Titre ELISA Titre ELISA vaccinale HINI à J43 H3N2 à J43 B à J43 Souris Souris non Souris Souris non Souris Souris non Boostées boostées Boostées boostées Boostées boostées 0,1 tg HA 3,833 3, 425 4,782 4,174 4,479 3,911 0,4 tg HA 4,385 3,599 5,250 4,354 5,053 4,079 1,6 g HA 4,906 3,876 5,526 4,779 5,458 4,487 6,3 gg HA 5,287 4,176 6,073 5,033 5,678 4,773 0,1.tg HA 5,210 4,523 5,990 5,264 5,723 4,943 + émulsion 0,4 g HA 5,394 4,790 6,171 5,640 5,962 5,144 + émulsion Ces résultats montrent que grâce à l'émulsion selon l'invention, même avec de faibles doses d'antigènes, on obtient des réponses humorales très importantes. Ainsi, les résultats obtenus avec uniquement 0,4 tg de HA de chacune des souches virales, on obtient de bien meilleures réponses en utilisant l'émulsion selon l'invention qu'en - 22 - utilisant une dose de 6,3 g de HA seule. En outre, on remarque que même chez les individus n'ayant pas reçu de dose de rappel, le système immunitaire continue à induire des anticorps alors que cela n'est pas le cas pour les individus ayant reçu les antigènes vaccinaux non adjuvés. Exemple 8: Composition vaccinale contre la grippe trivalente On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New Caledonia (H 1N 1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,1.tg de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,4 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 1,6 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,1 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d' EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4, 0,4 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4. On dispose de 6 groupes de 8 souris C57BL/6J femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). On prélève des échantillons sanguins à J23 afin de déterminer les quantités d'anticorps induits. Les dosages d'anticorps sont effectués par ELISA et par IHA pour les anticorps induits vis-à-vis de l'ensemble des souches administrées: H1N1, H3N2 et B. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après, où les titres exprimés sont 30 les moyennes obtenues pour chaque groupe de souris. - 23 - Composition ELISA ELISA ELISA IHA IHA IHA H1N1 H3N2 B H1N1 H3N2 B 0,1 g HA 2,924 3,506 3,920 26 174 95 0,4 g HA 3,673 4,227 4,431 135 269 147 1,6 g HA 3,948 4,593 4,786 160 381 190 6,3 g HA 4,446 5,106 5,190 587 1174 453 0,1 g HA 4,456 5,192 5,064 349 1974 320 + émulsion 0,4 g HA 4,659 5,337 5,174 761 2348 494 + émulsion A nouveau, les résultats obtenus montrent tout l'intérêt de l'émulsion selon l'invention grâce à laquelle il est possible de réduire très fortement les quantités d'antigènes présents. En effet, on peut globalement considérer qu'avec uniquement 0,11ag de HA adjuvé par l'émulsion selon l'invention, on obtient d'aussi bons résultats qu'avec une quantité de 6,3.tg de HA. Exemple 9: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant une émulsion 10 selon l'invention ou selon l'art antérieur. On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 ( la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0,3 g de HA; 0,21 mg de squalène; 0,031 mg de DehymulsTM SMO; 0,040 mg 20 d'EumulginTM B1 et 0,039 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 0,7%), - 24 - 0,3 g de HA; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 2,5%) 0,3 g de HA; 0,645 mg de squalène; 0,075mg de TweenTM 80; 0,075mg de 5 SpanTM 85 (émulsion selon l'art antérieur obtenue par microfluidisation). On dispose de 5 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). Pour évaluer la quantité d'anticorps induits, on effectue des prélèvements sanguins à J21 sur lesquels on détermine par IHA (inhibition de 1'hémagglutination) l'activité contre la souche A/H1N1, la souche A/H3N2, la souche B. Les résultats obtenus pour chaque groupe de souris sont représentés dans le tableau ci-après. Composition testée IHA contre IHA contre IHA contre H1N1 H3N2 B 0,3 g HA 26 174 8 6,3 g HA 247 905 73 0,3 g HA + émulsion invention à 95 640 37 0,7 % 0,3 g HA + émulsion invention à 269 1974 73 2,5 % 0,3 g HA + 135 987 57 émulsion art antérieur Ces résultats montrent qu'avec une émulsion obtenue selon l'invention grâce à un procédé de préparation très simple d'inversion de phase au moyen d'un changement de température, on obtient un adjuvant qui est aussi bon, et même légèrement meilleur que l'émulsion de l'art antérieur obtenue en utilisant des taux de cisaillement très importants. - 25 - Exemple 10: Composition vaccinale trivalente contre la grippe comprenant une émulsion selon l'invention à différentes concentrations On prépare à partir de l'émulsion concentrée de l'exemple 1, et d'une composition vaccinale comprenant les 3 souches virales de la campagne 2004 (la souche A/New Caledonia (H1N1), la souche A/Wyoming (H3N2),et la souche B/Jiangsu) des doses d'immunisation de 30 l ayant les compositions suivantes: 0,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 6,3 g de HA de chacune des souches virales en tampon PBS, 0, 3 g de HA de chacune des souches virales; 0,12 mg de squalène; 0,018 mg de DehymulsTM SMO; 0,023 mg d'EumulginTM B1 et 0,022 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 0,4%), 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,299 mg de squalène; 0,044 mg de DehymulsTM SMO; 0,057 mg d'EumulginTM B1 et 0,055 mg de mannitol en tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 1%) 0,3 g de HA de chacune des souches virales; 0,75 mg de squalène; 0,11 mg de DehymulsTM SMO; 0,143 mg d'EumulginTM B1 et 0,138 mg de mannitol en 20 tampon PBS à pH 7,4 (émulsion à 2,5%) On dispose de 5 groupes de 8 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui on administre à JO par voie intradermique (face interne de l'oreille) une dose de 30 l d'une des compositions indiquées ci-dessus (1 composition par groupe). Pour évaluer la quantité d'anticorps induits, on effectue des prélèvements sanguins à J21 sur lesquels on détermine par ELISA les anticorps anti-H1N1, les anticorps anti-H3N2 et les anticorps anti-B. Les résultats obtenus sont indiqués en loglo d'unités arbitraires dans le tableau ci-après, qui indique pour chaque groupe de souris la moyenne des résultats obtenus sur chacune des souris. Composition testée Anti-HiN1 Anti-H3N2 Anti-B 0,3 g HA 3,864 4,594 4,406 6,3 g HA 4,478 5,041 5,053 0,3 g HA + 4,053 4,827 4,545 émulsion invention 0,4% 0,3 g HA + 4,312 5,074 4,733 émulsion invention à 1% 0,3 g HA + 4,425 5,200 4,840 émulsion invention à 2,5% Ces résultats confirment à nouveau que, quelle que soit la souche évaluée, l'émulsion selon l'invention permet avec une dose très faible d'antigènes, d'avoir une réponse du système immunitaire très importante. Exemple 11: Préparation d'une composition lyophilisable On procède comme à l'exemple 1, mais en utilisant de l'eau au lieu du tampon; l'émulsion obtenue est ensuite diluée avec une solution aqueuse comprenant du mannitol, du saccharose et du dodécylmaltoside, afin d'obtenir une émulsion dont la composition finale est la suivante: 5% de squalène, 0, 95% de polyoxyéthylène cétostéaryl éther, 0,75% de monooléate de sorbitanne 3% de mannitol, 2% de dodécylmaltoside, 6% de saccharose Cette émulsion a été lyophilisée et conservée 3 mois à 4 C; puis après reconstitution, on a constaté que ses propriétés étaient conservées, notamment ses qualités d'émulsion monodisperse, avec une valeur de d90 égale à celle mesurée avant lyophilisation. Cette émulsion peut-être diluée au %2 avec une solution comprenant des antigènes vaccinaux afin de donner une composition vaccinale selon l'invention. REVENDICATIONS 1.Composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau comprenant au moins: du squalène, un tensioactif non ionique comprenant des groupements oxyde d'éthylène, à l'exception des copolymères de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène, un tensioactif non ionique hydrophobe, caractérisée en ce que l'émulsion est thermoréversible et en ce que 90% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 200 nm. 2. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que 90% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 160 nm. 3. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que 90% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 150 nm. 4. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que 50% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 100 nm. 5. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que 50% de la population volumique des gouttes d'huile a une taille inférieure à 90 nm. 6. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce 25 qu'elle comprend en outre au moins un alditol. 7. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce le tensioactif non ionique hydrophobe est un tensioactif à base d'ester de sorbitanne ou de mannide. 8. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le tensioactif comprenant des groupements oxyde d'éthylène est le polyoxyéthylène(12) cétostéarylether. - 28 - 9. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'alditol est choisi parmi le glycérol, l'érythritol, le xylitol, le sorbitol, le mannitol. 10. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce 5 que le tensioactif non ionique hydrophobe est le monooléate de sorbitanne. 11. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité de squalène est comprise entre 0,5 et 5 %. 12. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la quantité de tensioactif comprenant des groupements oxyde d'éthylène est comprise entre 0,02 et 0,95 %. 13. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce 15 que la quantité de tensioactif non ionique hydrophobe est comprise entre 0,015 et 0,75%. 14. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend: 2,5 % de squalène, 0,47 % de polyoxyéthylène (12) cétostéaryétherl, 0,37 % de monooléate de sorbitanne, 0,46 % de mannitol. 15. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce 25 qu'elle comprend en outre un alkylglycoside. 16. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un cryoprotecteur. 17. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'antigène vaccinal est un antigène viral. - 29 - 18. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'antigène vaccinal est un antigène de la grippe. 19. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que 5 l'antigène vaccinal de la grippe est un antigène monovalent. 20. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'antigène vaccinal est un ensemble de 3 souches de virus de la grippe inactivés et fragmentés. 21. Utilisation d'une composition selon une des revendications précédentes pour la préparation d'un vaccin destiné à être administré par voie intra-musculaire. 22. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 20, pour la 15 préparation d'un vaccin destiné à être administré par voie intra-dermique. 23. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 20, pour la préparation d'un vaccin destiné à être administré par voie souscutanée. 24. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 20, pour la préparation d'un vaccin destiné à être administré contre la grippe. 25. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 20, pour la préparation d'un vaccin destiné à être administré contre le SIDA. 26. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 20, pour la préparation d'un vaccin destiné à être administré contre les pathologies à Cytomegalovirus humain. 27. Procédé de préparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et une émulsion huile dans eau, caractérisé en ce que l'émulsion huile dans eau est obtenue par un procédé d'inversion de phase par variation de la température.