Brevet FR2889065A1 — publié le 20070202

La présente invention concerne une nouvelle méthode pour améliorer l'opération de la cornée par laser, en particulier selon le procédé appelé LASEK. Cette méthode consiste à employer une composition de traitement de la cornée comprenant un composé sélectionné parmi le glycéroformal, l'isopropanol et l'acide palmitoléique ou leur mélange, à une concentration se situant entre 25% et 50% en poids. L'opération de chirurgie réfractive (correction de la myopie, de l'hypermétropie et de l'astigmatisme) dénommée LASEK (Laser Assisted Epithelial Keratomyleusis) est basée sur le principe suivant: - dépôt de quelques gouttes d'éthanol dilué à environ 20% à la surface de la cornée soulèvement de l'épithélium cornéen par un moyen mécanique réalisation du traitement au laser sur la surface cornéenne mise à nu (stroma) - remise en place de l'épithélium soulevé sur le stroma traité. Les inconvénients de cette méthode sont essentiellement liés à la cytotoxicité de l'éthanol qui dépend de la dilution et de son temps de contact. La séparation de l'épithélium cornéen du stroma sous-jacent nécessite l'utilisation d'une concentration et d'un temps d'application susceptibles de produire des réactions cytotoxiques dans les cellules épithéliales, rendant la cicatrisation et la récupération de la transparence longues et difficiles (Fig 1). Pour pallier à cet inconvénient certains proposent des méthodes mécaniques pour dissocier l'épithélium cornéen du stroma [1]. Quelque soit la qualité de ces dispositifs il est impossible d'obtenir une séparation précise au niveau de la membrane basale de l'épithélium sur la totalité de la surface cornéenne en suivant la courbure de la cornée. La couche basale des cellules épithéliales de la cornée est fixée par des hémidesmosomes sur la lame basale (membrane de Bowman, Fig 2). La Figure 2 montre schématiquement l'ancrage des cellules épithéliales (couche basale, cellules basales) sur la membrane basale, et la Figure 3 montre au microscope électronique l'ancrage de la membrane cellulaire épithéliale par des hémidesmosomes (hd). Des méthodes biochimiques d'isolement et caractérisation ainsi que des tomographies au microscope électronique ont rendu possible l'identification et la localisation spatiale des composants de la membrane cellulaire faisant partie des hémidesmosomes, comme le montre la Fiigure 4 (de la référence (12)) où on voit les protrusions macromoléculaires assurant la cohésion entre la membrane cellulaire et la lame basale: E-cadhérines, vinculines et autres. Comme le laisse deviner la Fig.2., ces macromolécules, venant de la membrane cellulaire d'une part, et de la lame basale d'autre part, s'interpénètrent pour former un réseau macromoléculaire dense. Il semble cependant que ces interactions n'impliquent pas de liaisons covalentes dont la rupture nécessiterait des moyens chimiques drastiques, ou encore des protéases comme la trypsine, couramment utilisée pour dissocier les cellules en culture. Les interactions entre ces molécules d'adhésion sont essentiellement de nature ionique (interaction de charges) et le plus souvent des interactions hydrophobes, basées sur l'exclusion de l'eau dans le voisinage de résidus d'aminoacides aliphatiques (hydrophobes) en contact. Les agents capables de dissocier de telles interactions sont les molécules organiques possédant une partie aliphatique, hydrophobe, et un pôle hydrophile pouvant interagir avec les molécules d'eau ainsi qu'avec des résidus d'aminoacides chargés. Une partie importante de ces interactions entre solvants et cadhérines (ou autre structure membranaire) repose aussi sur la compatibilité conformationnelle entre solvant et macromolécule membranaire et surtout de la capacité du solvant d'interagir avec la membrane cellulaire représentant un milieu lipidique complexe. Dans le cadre de l'invention, nous avons élaboré une méthode chimique de séparation de l'épithélium cornéen et du stroma cornéen utilisant le glycéroformal, l'isopropanol 30 ou l'acide palmitoléique, qui se sont avérés à la fois efficaces pour dissocier l'épithélium cornéen du stroma et d'une toxicité moindre comparée à l'utilisation de l'éthanol. Description Ainsi, la présente invention se rapporte à une solution de traitement de la cornée dans le cadre d'une opération de chirurgie réfractive de la cornée par laser, en particulier une opération LASEK, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé sélectionné parmi le glycéroformal, l'isopropanol et l'acide palmitoléique ou leur mélange, à une concentration se situant entre 10% et 50% en poids de la solution. Avantageusement, la solution comprend entre 40% et 60% ou encore entre 42% et 55%, de préférence 43%, 44% ou 45% en poids de glycéroformal, ou 52% d'isopropanol ou d'acide palmitoléique ou de leur mélange. Parmi ces composés, on utilise de préférence le glycérolformal (GF). Les molécules du GF se présentent sous deux formes différentes, en équilibre en solution: - 5-hydroxy-1,3-dioxane -4-hydroxymetlyl-1,3-dioxolane correspondant à la formule globale de C4H8O3 avec une masse moléculaire de 104,10. Les synonymes utilisés sont: methylidino-glycérol, glycérineformai et séricosol-N. Le GF est soluble dans l'eau, les alcools, l'acétone, les huiles essentielles, l'éther ou le glycérol. Le GF est très stable, aussi bien en milieu acide que basique. Comme base pour la solution, on utilise avantageusement un sérum physiologique stérile, notamment une solution de 0,9% de NaCl. Dans un deuxième aspect, l'invention porte sur une méthode de correction de la vision par laser, notamment les méthodes LASEK ou LASIK, comprenant: a) dépôt de quelques gouttes d'une solution telle que décrite ci-dessus à la surface de la cornée, b) soulèvement de l'épithélium cornéen par un moyen mécanique; c) réalisation du traitement au laser sur la surface cornéenne mise à nu (stroma), et d) remise en place de l'épithélium soulevé sur le stroma. L'étape c) peut être réalisée par tout dispositif laser permettant de corriger la vision par voie LASIK ou LASEK par ablation biodynamique régulée dans la cornée d'un oeil. Les techniques LASIK ou LASEK sont connues de l'homme du métier et décrites dans WO 04/002382 et WO 02/49611 et dans les publications Pallikaris et al., "Laser In-Situ Keratomileusis", Lasers in Surgery and Medicine, volume 10, Pages 463-468 (1990); Carr et al., "Laser In-Situ Keratomileusis ", Ophthalmology Clinics of North America volume 10, pages 533-543 (1997); Gimbel et al., "Indications, Results, and Complications of LASIK", Current Opinion in Ophthalmology, volume 9, pages 3-8 (1998); Farah et al., "Laser In-Situ Keratomileusis: Literature Review of a Developing Technique " Journal of Cataract and Refractive Surgery, volume 24, pages 1059-1063 (1998); and Wilson, "LASIK Surgery", AORN Journal, volume 71, pages 963-983 (2000). On pourra également se référer aux publications dans la partie Références ci-après. Lors de l'étape a), on applique la solution de traitement de l'invention de préférence pendant 10 à 60 secondes, par exemple 30 secondes. Avantageusement, on utilise à cet effet une solution stérile isotonique comprenant de 40% à 45% de glycérolformal. Dans un troisième aspect, l'invention vise un dispositif pour mettre en oeuvre cette méthode comprenant des moyens de correction de la vision par laser, notamment LASEK ou LASIK, et une solution telle que définie cidessus. Dans un quatrième aspect, l'invention vise l'utilisation d'un composé sélectionné parmi le glycéroformal, l'isopropanol et l'acide palmitoléique ou leur mélange pour la préparation d'une solution de traitement de la cornée dans le cadre d'une opération de chirurgie réfractive de la cornée par laser. Plus spécifiquement, ladite solution est préparée de sorte à comprendre une concentration en glycéroformal, isopropanol, acide palmitoléique ou leur mélange se situant entre 10% et 60% en poids. La solution peut être réalisée à base de sérum physiologique stérile. Pour la suite de la description, on fera référence aux légendes des figures. Légendes Figure 1: Effet de l'éthanol sur la cornée humaine. la. La couche des cellules basales épithéliales est très altérée (Microscope électronique à transmission; G=4000x) lb. Les cellules sont en grande partie détruites: membrane nucléaire rompue (fléchée). (Microscopie électronique à transmission, G=7900x) l c. Le clivage de la membrane basale semble plus diffus mais non significatif. (Microscopie électronique à transmission, G=57000x) Figure 2: Schéma de l'épithélium cornéen Représentation schématique de la couche épithéliale de la cornée et son insertion sur la lame basale (M.B.) du stroma. Les desmosomes et hemidesmosomes sont visibles. Figure 3: Ultrastructure du contact épithélium stroma Microscopie électronique du contact entre cellules épithéliales de la couche basale (EP) et la lame basale de la cornée (BM), avec la membrane de Browman. Les hémidesmosomes (hd) sont bien visibles. Figure 4: Représentation schématique du contact cellule/cellule 4a. Le contact entre deux cellules par desmosomes est illustré sur cette figure, qui montre le contact étroit entre les protéines membranaires des cellules voisines (surtout c-cadhérines) provenant des cellules. 4b. Des molécules individuelles de cadhérines sont représentées; Figure 5: Effet du glycérol format sur la cornée humaine 5a. La couche des cellules basales de l'épithélium cornéen est en majeur partie préservée (Microscopie électronique à transmission, G=4000x) 5b. La membrane nucléaire (fléchée), la chromatine et le nucléole sont représentatifs d'une cellule non altérée, fonctionnelle (Microscopie électronique à transmission, G=7900x). 5c. Le clivage de la membrane basale est relativement marqué (Microscopie électronique à transmission, G=57000x). Figure 6: Repli de l'épithélium d'une cornée humaine après action du glycérol formai Photographie d'une cornée humaine traitée in vitro d'abord avec le glycérol formal, pour pouvoir ensuite replier l'épithélium cornée de la zone du stroma à traiter. On peut noter la mince couche épithéliale (-') formant un lambeau intact. Figure 7: Innocuité du glycérol formai appliqué sur cornées de lapins Les figures représentent des coupes histologiques de cornées de lapins sur lesquelles le glycérol formal a été appliqué pendant une minute. 7a. Coupe faite 24 heures après l'application du glycérol formal 7b. Coupe faite 48 heures après l'application du glycérol formal Le stroma est marqué par un astérisque. On constate sur les deux coupes l'absence totale de cellules inflammatoires jusqu'à 48 heures après la chirurgie. Figure 8: Représentation schématique d'une hémidesmosome dans la peau Dans la peau les hémidesmosomes (HD) lient l'épiderme sur la lame basale dermoépidermique. Sont représentés schématiquement les collagènes de types I, III, IV et VII, la fibronectine, les intégrines et les filaments intermédiaires, qui participent dans la fixation de l'épiderme sur le derme. Exemple 1: Tests de toxicité cellulaire De nombreuses cellules traitées à l'éthanol sont vacuolées, les noyaux fortement 5 altérées et les cellules nécrosées (Fig 1). Nous avons identifié en revanche que le glycéroformal et l'isopropanol sont capables de relâcher suffisamment les liaisons hemidesmosomiques pour permettre la séparation de la couche épithéliale intacte du stroma cornéen (Fig 5) et qu'il s'est révélé moins toxique sur l'épithélium. Les composés de l'invention ci-dessus mentionnés ont été testés pour leur efficacité sur cornées humaines obtenues de la Banque Française des Yeux. Comme le montre le Tableau I et la Fig 6, après l'application pendant 60 à 120 secondes d'une solution de glycérolformal de 43% (4,13 molaire) on soulève facilement la couche épithéliale intacte. Des tests de cytotoxicité effectués sur cornée humaine et sur culture de cellules épithéliales humaines ont confirmé la non-toxicité du glycérolformal > l'absence de cellules mortes prenant le colorant vital (bleu Trypan). Quant à l'isopropanol, il est légèrement plus toxique que le glycérolformal, mais nettement moins que l'éthanol. Tableau I: Effet d'une incubation de 10 minutes avec l'éthanol, l'isopropanol et le glycérolformal sur la survie des cellules épithéliales cornéennes de 4ème passage. Concentration (M) % cellules mortes S.D. témoin 12,8 éthanol 4,35 83,8 18,5 éthanol 2,175 45,0 6,5 éthanol 1,08 48, 4 5,2 isopropanol 4,35 71,1 15,1 isopropanol 2,175 44,2 8,9 isopropanol 1, 08 43,4 9,3 glycérolformal 4,35 51,1 10,5 glycérolformal 2,175 31,6 7,1 glycérolformal 1,08 3 0,3 4,6 Exemple 2: Test d'irritation sur la cornée du lapin Nous avons comparé la toxicité du glycérolformal et de l'éthanol sur la cornée de lapin vivant en appliquant une solution de 43% sur la cornée, et en observant les réactions après quelques minutes et jusqu'à 48 heures. On dépose sur la cornée d'un oeil de lapin anesthésié quelques gouttes d'éthanol ou de GF à des concentrations croissantes et on observe l'oeil en le comparant au côté non traité, pour détecter une éventuelle irritation pouvant se manifester par larmoiement, injection des capillaires ou autres réactions d'intolérance. Aucun signe d'irritation n'a été constaté jusqu'à 48 heures après l'application du produit GF. Une étude histologique a été effectuée sur les cornées traitées au GF et prélevées après 1 minute, 24 et 48 heures. Comme le montre la Fig. 5, la lame basale est intacte et on ne note aucune infiltration de cellules inflammatoires, même après 48 heures. Exemple 3: Modalité d'utilisation en clinique Le mode d'emploie du GF pour l'opération LASEK est adapté de celui utilisé avec l'éthanol (voir réf.(1)). Par exemple, on dispose quelques gouttes de la solution à 45%, dilué dans du sérum physiologique (NaCl 0,9% stérile) sur la cornée à l'aide du couteau de trépan de Hana qui permet de localiser l'emploi du solvant au centre de la cornée. Après l'application de ce trépan on rabat l'épithélium, on effectue le traitement au LASER, puis on rabat l'épithélium et on applique un pansement en attendant la cohésion qui doit s'établir rapidement entre l'épithélium et la membrane basale de la cornée. Le GF ne lèse pas les cellules épitheliales (Fig.-s 5 et 7). De plus, la readhésion et la re-épithélialisation s'effectuent rapidement et sans complication. La couche basale des cellules épitheliales de la cornée adhère à la membrane basale par des hémidesmosomes (Fig 7a). Par contre les cellules épitheliales sont soudées les unes sur les autres par des desmosomes (Fig 7b). Ces complexes adhésifs mettent en oeuvre des molécules transmembranaires de différente nature, en particulier des ccadhérines, du vinculine et des collagènes de type IV, VII et XIII (2,3). Ces molécules s'interpénètrent et interagissent dans l'espace intercellulaire sans toutefois établir des liaisons covalentes (Fig 8)- L'interaction entre ces molécules membranaires d'ancrage est basée surtout sur des conformations complémentaires au niveau des contacts, renforcés par des interactions hydrophobes entre séquences peptidiques riches en aminoacides aliphatiques et aussi par des interactions électrostatiques entre aminoacides chargés positivement et négativement. D'après une étude approfondie (2) les résidus tryptophane en bout de chaîne N-terminale jouent un rôle important, confirmant l'importance des interactions hydrophobes. Il existe toutefois une différence essentielle entre hemidesmosome et desmosome. La Figure 8 montre schématiquement la structure d'une hemidesmosome. A la différence avec les desmosomes, le contact au niveau des hémidesmosomes n'est pas entre c-cadhérines des deux cellules épithéliales en contact, mais entre les constituants membranaires des cellules épithéliales de la couche basale et les constituants macromoléculaires de la lame basale: larninine, collagène de type IV et autres (Fig. 8) Il apparaît de nos expériences que le GF- ainsi que d'autres solvants testés, comme l'isopropanol - dissocient sélectivement les contacts par hémidesmosomes et n'attaquent que lentement (ou pas du tout) les contacts par desmosomes. Cette attaque différentielle est à ramener à la différence de composition macromoléculaire de ces deux types de contacts cellulaires. Pour dissocier ces interactions les solvants doivent posséder des résidus aliphatiques pour interagir et relâcher les interactions hydrophobes et aussi des groupements polaires, pour dissocier les liaisons hydrogènes et électrostatiques. Il y a à cet égard une différence entre les hémidesmosomes qui fixent la couche basale des cellules épithéliales sur la lame basale et les desmosomes qui scellent les cellules épithéliales les unes sur les autres. Les hémidesmosomes assurent une interaction forte entre les constituants des lames basales, collagènes de type IV, VII et XIII, laminine, nidogène et perlecan et les protéines membranaires des cellules épithéliales des couches basales, essentiellement les intégrines. Pour les desmosomes entre cellules épithéliales voisines on ne fait intervenir que les cadhérines et vinculines des deux cellules voisines. Nos expériences ont montré que le solvant préconisé pour cette application, le GF, exerce un effet rapide et sélectif au niveau des hémidesmosomes, mais respecte davantage l'intégrité des desmosomes. En effet, comme le montre la Fig. 6, après application du GF sur une cornée humaine (obtenue de la Banque Française des Yeux) on peut soulever la couche épithéliale intacte, confirmant le clivage sélectif des hémidesmosomes entre la couche basale des cellules épithéliales et la lame basale. Les desmosomes entre les cellules épithéliales sont restés intacts. Exemple 4: Comparaison des différents solvants La méthodologie ci-dessus décrite et en particulier la culture des cellules épithéliales en multicouche sur matrigel (un bon substitut aux membranes basales) a permis d'identifier d'autres molécules capables de dissocier la couche des cellules épithéliales de la cornée de la lame basale. L'isopropanol est efficace à la concentration allant de 50 à 55%, par exemple 52% (8,26 M). L'aide (acide-cis-9-hexadécanoique) présente la capacité de dissocier l'épithélium cornéen du stroma par exemple à la concentration de 10 mg/ml en 60 secondes. Ces résultats sont présentés dans les Tableaux II et III ci-après. Tableau II Solvant Temps de contact Facilité de Qualité de (seconde) dissociation l'épithélium Ehtanol 60 ++++ ++ Glycérol formai 60 ++++ ++++ Acide 60 +++ ++ Tableau III. Conditions de dissociation de la couche épithéliale des cornées humaines reçues de la Banque Française des Yeux avec les solvants organiques. Le nombre des + indique l'efficacité du solvant. solvant concentration temps (sec) facilité de qualité de d'application dissociation l'épithélium % M ethanol 20 4,13 30 ++ + 4,13 60 +++ ++(+) isopropanol 26 4,13 120 + + 52 8,26 60 ++++ ++ glycérol- 43 4,13 60 +++ ++ + formai 43 4,13 120 ++++ ++++ Conclusion Au vu des résultats précités, le glycérolformal présente de nombreux avantages et résout les problèmes liés à l'utilisation de l'éthanol dans le cadre des opérations de chirurgie oculaire. Notamment, le glycérolformal est utile pour effectuer en plus grande sécurité l'opération LASEK. REFERENCES 1. Taneri S, Feit R, Azar DT, Safety, efficacy and stability indices of LASEK correction in moderate myopia and astigmatism. 2. Pallikaris IG, Naoumidi II, Kalyvianaki MI, Katsanevaki VJ, Epi-LASIK: comparative histological evaluation of mechanical and alcohol-assisted epithelial separation. J Cataract Refract Surg, 2003, 29, 1496-501 3. Browning AC, Shah S, Dua HS, Maharajan SV, Gray T, Bragheeth MA Alcohol debridement of the corneal epithelium in PRK and LASEK: an electron microscopic study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003, 44, 510-3 4. Dreiss AK, Winkler von Mohrenfels C, Gabier B, Kohnen T, Marshall J, Lohmann 15 CP, Laser epithelial keratomileusis (LASEK) : histological investigation for vitality of corneal epithelial cells alter alcohol exposure. Klin Monbatsbl Augenheiikd, 2002, 219, 365-9 (discussion 369) 5. Rokita-Wala I, Gierek-Ciaciura S, Mrukwa-Kominek E, Obidzinski M, Vital 20 changes in corneal structure alter LASEK during the early postoperative period. I Katedry i Kliniki Okulistyki Slaskiej Akademii Medcznej w Katowicach 6. Kim SY, Sah WJ, Lim YW, Hahn TW, Twenty percent alcohol toxicity on rabbit corneal epithelial cells: electron microscopic study. Cornea, 2002, 21, 388-92 7. Dastjerdi MH, Soong HK, LASEK (laser subepithelial keratomileusis). Curr Opin Ophthalmol, 2002, 13, 261-3 8. Zhou X, Wu L, Dai J, Zhu R, The epithelial-flap abnormality of laser epithelial 30 keratomileusis. Zhonghua Yan Ke Za Zhi, 2002, 38, 69-71 9. Nakamura K, Kurosaka D, Bissen-Miyajima H, Tsubota K, Intact corneal epithelium is essential for the prevention of stromal haze after laser assisted in situ keratomileusis. Br J Ophthalmol, 2001, 85, 209-13 10. Stein HA, Stein RM, Price C, Salim GA, Alcohol removal of the epithelium for excimer laser ablation: outcomes analysis. J Cataract Refract Surg, 1997, 23, 1160-3 (Erratum in: J Cataract Refract Surg, 1998, 24, 294 11. Carones F, Fiore T, Brancato R, Mechanical versus alcohol epithelial removal during photorefractive keratectomy. J Refract Surg, 1999, 15, 556-62 12. He W, Cowin P, Stokes LD, Untangling desmosomal knots with electron tomography. Science, 2003, 302, 109-13 REVENDICATIONS 1. Solution de traitement de la cornée dans le cadre d'une opération de chirurgie réfractive de la cornée par laser, en particulier une opération LASEK, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé sélectionné parmi le glycéroformal, l'isopropanol et l'acide palmitoléique ou leur mélange, à une concentration se situant entre 10% et 60% en poids de la solution. 2. Solution selon la revendication 1, comprenant entre 40% et 50% ou encore entre 42% et 55%, de préférence 43% ou 45% en poids de glycéroformal. 3. Solution selon la revendication 1, comprenant 52% d'isopropanol ou d'acide palmitoléique ou de leur mélange. 4. Solution selon la revendication 1 à base de sérum physiologique stérile, notamment une solution de 0,9% de NaCl. 5. Dispositif pour la mise en oeuvre d'une méthode de correction de la vision par laser, notamment les méthodes LASEK ou LASIK, comprenant: a) dépôt de quelques gouttes d'une solution de traitement définie selon l'une des revendications 1 à 4 à la surface de la cornée, b) soulèvement de l'épithélium cornéen par un moyen mécanique; c) réalisation du traitement au laser sur la surface cornéenne mise à nu (stroma), et d) remise en place de l'épithélium soulevé sur le stroma; comprenant des moyens de correction de la vision par laser, notamment LASEK ou LASIK, et une solution selon l'une des revendications 1 à 4. i 6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel l'étape a) de la méthode comprend l'application de la solution de traitement pendant 10 à 60 secondes, par exemple 30 secondes. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisée en ce que la solution de traitement est une solution stérile isotonique comprenant de 40% à 45% de glycérolformal. 8. Utilisation d'un composé sélectionné parmi le glycéroformal, l'isopropanol et l'acide palmitoléique ou leur mélange pour la préparation d'une solution de traitement de la cornée dans le cadre d'une opération de chirurgie réfractive de la cornée par laser. 9. Utilisation selon la revendication 8 pour la préparation d'une solution comprenant une concentration en glycéroformal, isopropanol, acide palmitoléique ou leur mélange se situant entre 10% et 60% en poids. 10. Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que la solution est à base de sérum physiologique stérile.