Brevet FR2891149A1 — publié le 20070330

La présente invention est relative à une composition pharmaceutique à activité cicatrisante comprenant au moins un dérivé de dextrane soluble et au moins un facteur de croissance dérivé des plaquettes ainsi qu'à son utilisation pour la préparation d'un médicament à action cicatrisante, notamment pour le traitement des ulcères. Les facteurs de croissance sont une catégorie de polypeptides ayant des propriétés régulatrices de nombreux paramètres de la vie cellulaire (tels que la prolifération, la différenciation, la survie). Ces facteurs sont sécrétés par de multiples types de cellules. Les facteurs de croissance exercent leurs divers effets en se liant et en activant une sous-famille distincte de récepteurs cellulaires de surface ayant une activité intrinsèque de type tyrosine kinase. Une famille particulière de facteurs de croissance est celle des facteurs de croissance ayant une affinité particulière pour l'héparine ("Heparin Binding Growth Factors" : HBGFs) qui joue le rôle de médiateur entre ce type de facteurs de croissance et leurs récepteurs. La famille des HBGFs comprend notamment les Platelet-Derivated Growth Factors (PDGFs). Les PDGFs sont des facteurs de croissance libérés par les plaquettes lors de la coagulation sanguine, capables de promouvoir la croissance de différents types de cellules (Ross R. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1974, 71, 1207; Kohler N. & Lipton A., Exp. Cell Res., 1974, 87, 297). Il est maintenant connu que le PDGF est produit par un certain nombre de cellules autres que les plaquettes et qu'il est mitogène pour la plupart des cellules dérivées du mésenchyme, i.e. les cellules sanguines, musculaires, osseuses et cartilagineuses, ainsi que les cellules du tissu conjonctif (Raines E.W., in "Biology of PlateletDerivated Growth Factor", 1993, Westermark, B. et C. Sorg, Ed. Basel, Kerger, p. 74). De nombreux articles tendent également à démontrer que le PDGF issu des macrophages se comporte comme un agent chémotactique et mitogène pour les cellules musculaires lisses, qu'il contribue à l'épaississement myointimal des parois artérielles caractéristique de l'artériosclérose (Ross R. et al., Science, 1990, 248, 1009). Les activités du PDGF incluent en outre et notamment la stimulation de la libération des granules par les monocytes neutrophiles (Tzeng D.Y. et al., Blood, 1985, 66, 179), la facilitation de la synthèse stéroïdienne par les cellules de Leydig (Risbridger G.P., Mol. Cell. Endocrinol., 1993, 97, 125), la stimulation de la phagocytose neutrophile (Wilson E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1987, 84, 2213), la modulation de l'expression et de la sécrétion de la thrombospondine (Majak R.A. et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8821), et la post- régulation du gène ICAM-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires (Morisaki N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612). Compte tenu de ses diverses propriétés, l'utilisation de PDGFs recombinants dans le domaine pharmaceutique a déjà été envisagée. La cicatrisation des ulcères, tout comme la cicatrisation en général, est un processus se déroulant principalement en trois grandes phases. Le processus de cicatrisation commence par une première phase inflammatoire au cours de laquelle le flux et le flot sanguins augmentent autour du site d'ulcération. S'il se produit un saignement à partir de vaisseaux sanguins endommagés, les plaquettes envahissent le site d'ulcération et permettent la coagulation afin d'arrêter le saignement. Les plaquettes libèrent également des PDGFs qui vont envoyer des signaux aux cellules avoisinantes déclenchant leur prolifération, c'est-à-dire la deuxième phase du processus de cicatrisation. La troisième phase, finale, du processus de cicatrisation est la phase de remodelage. Or les ulcères de diabétiques présentent la particularité de cicatriser très lentement et parfois de façon incomplète car le processus de cicatrisation ne se déroule pas normalement, certainement parce que le flux sanguin au niveau de la peau est réduit chez les diabétiques. Ceci peut entraîner des infections bactériennes sérieuses au niveau des ulcères, pouvant s'étaler et nécessitant parfois l'amputation du pieds ou de la jambe. C'est pourquoi il existe actuellement sur le marché, en particulier sur le marché américain, un médicament à base de PDGF-BB humain recombinant correspondant à la dénomination commune internationale "becaplermin", vendu sous la dénomination commerciale Regranex . Ce médicament est indiqué pour le traitement des ulcères des membres inférieurs de diabétiques. Il se présente sous la forme d'un gel à application topique et permet de promouvoir la cicatrisation des ulcères. Il permet en particulier, tout comme le PDGF endogène, de favoriser la prolifération cellulaire et donc la formation de nouveaux tissus. Le PDGF-BB recombinant humain ou beclapermin est obtenu selon un procédé de préparation mettant en oeuvre une technologie à l'ADN recombinant par insertion du gène codant pour la chaîne B du PDGF-BB dans une levure, Saccharomyces cerevisiae. Cette technique est délicate, longue et coûteuse et a pour conséquence de conduire à l'obtention d'un médicament lui-même onéreux pour les patients. Le Regranex est disponible en gel vendu en tubes de 2, 7,5 ou 15 grammes, chaque gramme de gel renfermant 100 g de becaplermin. La quantité de gel à appliquer dépend bien entendu de la surface de l'ulcère, cependant, le coût moyen d'un traitement d'une durée de vingt semaines est excessivement élevé (de l'ordre de 1400 dollars américains). Les Inventeurs se sont donc donnés pour but de trouver un principe actif permettant de potentialiser l'activité du PDGF-BB et de réduire les doses administrées et par voie de conséquence les risques toxicologiques et ainsi accéder à des traitements moins onéreux pour les patients diabétiques atteints d'ulcères des membres inférieurs. Ils ont en particulier découvert, et ainsi que cela est démontré ci-après dans les exemples illustrant la présente demande, que l'utilisation de certains dérivés de dextrane solubles convenablement sélectionnés permet d'augmenter de façon synergique l'activité du PDGF-BB, en particulier dans le cadre du traitement des ulcères des membres inférieurs de patients diabétiques. La présente Invention a donc pour objet une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend à titre de principes actifs, 20 dans un support pharmaceutiquement acceptable: - au moins un facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), et - un moins un dérivé de dextrane soluble répondant à la formule (I) suivante: DMCaBbSuc (I) dans laquelle: - D représente une chaîne polysaccharidique, de préférence constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques, -MC représente des groupes méthylcarboxylique, - B représente des groupes Nbenzylméthylènecarboxamide, - Su représente des groupes sulfates (sulfatation des fonctions hydroxyle libres, portées par les unités glucosidiques), - a, b et c représentent le degré de substitution (ds), respectivement des groupements MC, B et Su avec i) a strictement supérieur à 0; ii) b est tel que: soit b est supérieur ou égal à 0,3 et c est compris entre 0,1 et 0,5; soit b est strictement inférieur à 0,3 et c répond à l'équation (1) suivante: c 8,5 b' - 5,41 b + 0,86 (1). Ces dérivés de dextrane de formule (I), ainsi que leur procédé de préparation sont décrits de façon plus générale dans la demande de brevet WO 99/29734. Ces dérivés de dextrane de formule (I) sont trivialement appelés DMCBSu et sont considérés comme étant des copolymères constitués de sous-unités fictives R-OX, X pouvant être un groupement méthylcarboxylique (MC), benzylamide (B) ou sulfate (S). La chaîne polysaccharidique est donc considérée comme étant constituée de 300 % de sous-unités fictives R-OH, au lieu de 100 % d'unités glucosidiques. Ainsi, un dextrane méthylcarboxylique (DMC) avec un degré de substitution (ds) de 0,6 en groupements méthylcarboxyliques contient 0,6 groupement substitué (R-MC) et 2,4 groupements hydroxyle libre (R-OH), par unité glucosidique. Selon l'Invention, D présente de préférence une masse molaire comprise entre 1 000 et 2 000 000 Da, et encore plus particulièrement inférieure à 70 000 Da. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, les dérivés de dextrane sont choisis parmi les composés de formule (I) dans lesquels b est supérieur ou égal à 0,35. Dans ce cas, et selon une forme de réalisation tout particulièrement préférée de l'Invention, les dérivés de dextrane sont choisis parmi les composés de formule (I) dans lesquels a est compris entre 0,5 et 0,8, et c est compris entre 0,1 et 0,5. Parmi de tels dérivés de dextrane de formule (I), on peut en 30 particulier citer les composés dans lesquels a = 0,66; b = 0,38 et c est compris entre 0,2 et 0,4. Les dérivés de dextrane de formule (I) dans lesquels = 0,66 b = 0,38 et ç = 0,29 sont particulièrement préférés. La quantité de dérivés de dextrane de formule (I) présente au sein de la composition pharmaceutique conforme à l'Invention est de préférence comprise entre 0,5 et 100 mg/g et encore plus préférentiellement entre 5 et 50 mg/g de composition. Selon l'Invention, les PDGFs sont de préférence choisis parmi les PDGFs recombinants humains comportant deux chaînes B (rhPDGF-BB). De tels PDGFs peuvent être obtenus selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier ou bien directement achetés dans le commerce par exemple auprès de la société Research Diagnostic Inc. (USA). La quantité de PDGFs présente au sein de la composition pharmaceutique conforme à l'Invention est de préférence comprise entre 1 et 200 g/g de composition et encore plus préférentiellement entre 10 et 100 g/g de composition. Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'Invention, le rapport pondéral dérivés de dextrane de formule (I)/PDGFs est compris entre 100 et 1000 et encore plus préférentiellement entre 300 et 700. La composition pharmaceutique conforme à l'Invention est de préférence une composition à application topique pouvant se présenter sous la forme de gels, de crèmes, de sprays ou de patchs, la présentation sous forme de gels étant particulièrement préférée. La nature des excipients pouvant être présents au sein de la composition pharmaceutique conforme à l'Invention est choisie en fonction de sa forme de présentation selon les connaissances générales de l'Homme du métier, c'est- à-dire du galéniste. Ainsi, lorsque la composition conforme à l'Invention se présente sous la forme d'un gel, celui-ci est de préférence un gel de cellulose tel que par exemple un gel de carboxyméthylcellulose (CMC). La composition pharmaceutique conforme à l'Invention peut en outre renfermer un ou plusieurs additifs tels que ceux choisis parmi les charges, les conservateurs tels que le parahydroxybenzoate de méthyle, le parahydroxybenzoate de propyle ou le m-crésol, les anti-oxydants, les agents stabilisants tels que le chlorhydrate de L-lysine, les agents acidifiants et alcalinisants, les opacifiants, etc... Lorsqu'elles sont administrées de façon topique, les compositions pharmaceutiques conformes à l'Invention sont tout particulièrement destinées au traitement des ulcères, de préférence aux ulcères des membres inférieurs de patients diabétiques. Les Inventeurs ont en effet constaté que l'utilisation d'une telle composition permet d'améliorer et d'accélérer la cicatrisation des ulcères et ce avec des compositions renfermant des quantités de PDGFs moindres que les compositions disponibles actuellement sur le marché (telle que par exemple le médicament commercialisé sous la dénomination Regranex ) du fait d'un effet de synergie entre les dérivés de dextrane de formule (I) et les PDGFs. Ainsi, un autre objet de l'Invention est donc l'utilisation d'au moins une composition pharmaceutique telle que décrite précédemment, c'est-à- dire renfermant au moins un dérivé de dextrane de formule (I) tel que décrit ci-dessus et au moins un facteur de croissance dérivé des plaquettes, pour la préparation d'un médicament à action cicatrisante, destiné au traitement des ulcères par voie topique, et en particulier au traitement des ulcères des membres inférieurs de patients diabétiques. Dans ce cas, ledit médicament est de préférence destiné à être administré en cure de 2 à 10 semaines à raison de 1 à 2 applications par jour sur la partie lésée. Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, laquelle se réfère à un exemple de mise en évidence de la potentialisation de l'effet prolifératif d'un PDGF-BB avec un dérivé de dextrane de formule (I) ainsi qu'à la figure 1 annexée qui représente la quantité de thymidine tritiée incorporée par des fibroblastes de derme humain (en Dpm x 10), après stimulation de la prolifération par du PDGF- BB seul à une concentration allant de 0,1 à 100 g/ml (courbe en trait pointillé) ou en présence d'un dérivé de dextrane de formule (I) (courbe en trait plein) à une concentration de 1 g/ml. Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Mise en évidence de la potentialisation de l'effet prolifératif d'un PDGF-BB avec un dérivé de dextrane de formule (I) 1) Mode opératoire Une culture,primaire de fibroblastes de derme humain (Human Dermal Fibroblast adult (HDFa), société Cascade Biologies) a été réalisée à une température de 37 C dans du milieu aMEM (Milieu Essentiel Minimum, société Gibco) avec Glutamax, sans ribo/desoxyribonucléotides, complémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF, société Dutscher) et 1 % de pénicilline-streptomycine (société Gibco) dans une atmosphère saturée en humidité et enrichi en CO2 (5%). Le milieu a été renouvelé tous les 4 jours. Les fibroblastes humains ont été utilisés entre les passages 1 et 5. Une dilution de la suspension cellulaire dans le milieu de culture a ensuite été réalisée pour ensemencer des boites de culture à une densité de 5 000 cellules/puits pour des plaques de 196 puits (société Nunc). Pour chaque lot de cellules, l'effet de la potentialisation de l'effet du PDGF-BB par un DMCBSu de masse molaire 52 000 g/mole dans lequel a = 0,63; b = 0,38 et c = 0,29 (préparé selon le procédé décrit dans la demande internationale WO 99/29734), à différentes concentrations, a été vérifiée par incorporation de thymidine tritiée (5000 cellules/puits dans 100 l). Pour ce faire, après 24 heures de sevrage, les fibroblastes ont été stimulés par addition de PDGF-BB (Research Diagnostic Inc.), à différentes concentrations allant de 0,1 à 100 g/ml, en présence ou non d'un dérivé de dextrane de formule (I) pour lequel a = 0,63; b = 0,38 et c = 0,29, à une concentration de 1 g/ml. L'incorporation de la thymidine tritiée (à 52 Ci/mmol, société Amersham Biosciences) a été effectuée 18 heures après la stimulation par le PDGF-BB en présence ou non du dérivé de dextrane, par addition d'une solution à 50 Ci/ml, soit 0,5 Ci/puits. Après 6 heures d'incubation (soit 24 heures de stimulation), le milieu de culture a été aspiré, les cellules ont été fixées pendant une heure à 4 C par addition de 100 gl/puits d'acide trichloroacétique à 10 % (ATCA). Les puits ont ensuite été rincés trois fois par 100 gl d'eau ultra pure et les cellules ont été lysées pendant une nuit à 4 C par 100 l de NaOH 100 mM. La radioactivité a été récupérée dans des fioles de comptage, les puits ont été rincés par 100 pl de NaOH 100 mM et la radioactivité a été comptée après addition de 1 ml de liquide de scintillation (Zinsser Analytic), sur un compteur automatique vendu par la société Beckman (LS 6000 TA). Pour toutes les expériences, chaque condition de stimulation a été réalisée en triplicate. 2) Résultats Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 1 annexée sur laquelle la quantité de thymidine tritiée incorporée par les fibroblastes (en Dpm x 103), est exprimée en fonction de la concentration en PDGF-BB en g/ml, en présence du dérivé de dextrane (courbe en trait plein) à une concentration de 1 1g/ml ou en absence du dérivé de dextrane (courbe en trait pointillé). L'ED50 correspond à la concentration en PDGF-BB ou en l'association PDGFBB + dérivé de dextrane nécessaire pour avoir 50 % de prolifération des fibroblastes humain. Le ratio R est le rapport pondéral idéal entre les quantités pondéral de PDGF-BB et de dextrane à utiliser. Ce ration R est calculé comme suit: R = ED50 (PDGF-BB) / ED50 (PDGF-BB + DMCBSu) Ces résultats montrent que lorsque le PDGF-BB est utilisé seul, il est nécessaire d'en employer 6 g/ml pour obtenir 50 % de prolifération, alors que lorsque l'association PDGF-BB + dérivé de dextrane de formule (I) est utilisée, la quantité de PDGF-BB présente au sein de l'association pour avoir également 50 % de prolifération n'est que de 2 g/ml démontrant ainsi l'effet de potentialisation du dérivé de dextrane de formule (I), le ratio R, dans ce cas, étant égal à 3. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend à titre de principes actifs, dans un support pharmaceutiquement acceptable: - au moins un facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), et - un moins un dérivé de dextrane soluble répondant à la formule (I) suivante: DMCaBbSu, (I) dans laquelle: - D représente une chaîne polysaccharidique, - MC représente des groupes méthylcarboxylique, - B représente des groupes N-benzylméthylènecarboxamide, - Su représente des groupes sulfates, - a, b et c représentent le degré de substitution (ds), respectivement des groupements MC, B et Su avec i) a strictement supérieur à 0; ii) b est tel que: soit b est supérieur ou égal à 0,3 et c est compris entre 0,1 et 0,5; soit b est strictement inférieur à 0,3 et c répond à l'équation (1) suivante: c__>8,5b2-5,41b+0,86 (1)- 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que D est constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que D présente une masse molaire comprise entre 1 000 et 2 000 000 Da. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les dérivés de dextrane sont choisis parmi les composés de formule (I) dans lesquels b est supérieur ou égal à 0,35. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée par le fait que 30 les dérivés de dextrane sont choisis parmi les composés de formule (I) dans lesquels a est compris entre 0,5 et 0,8, et c est compris entre 0,1 et 0,5. 10 15 20 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les dérivés de dextrane de formule (I) sont choisis parmi les composés dans lesquels a = 0,66; b = 0, 38 et c est compris entre 0,2 et 0,4. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée par le fait que les dérivés de dextrane de formule (I) dans lesquels a = 0,66; b = 0,38 et c = 0,29. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité de dérivés de dextrane de formule (I) est comprise entre 0,5 et 100 mg/g de composition. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée par le fait que la quantité de dérivés de dextrane de formule (I) est comprise entre 5 et 50 mg/g de composition. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les PDGFs sont choisis parmi les PDGFs recombinants humains comportant deux chaînes B. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité de PDGF est comprise entre 1 et 200 g/g de composition. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée par le fait que la quantité de PDGF est comprise entre 10 et 100 g/g de composition. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que rapport pondéral dérivés de dextrane de formule (I)/PDGFs est compris entre 100 et 1000. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que c'est une composition à application topique se présentant sous la forme de gels, de crèmes, de sprays ou de patchs. 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'un gel de cellulose. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle renferme un ou plusieurs additifs choisis parmi les charges, les conservateurs, les anti-oxydants, les agents stabilisants, les agents acidifiants et alcalinisants et les opacifiants. 17. Utilisation d'au moins une composition pharmaceutique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'un médicament à action cicatrisante. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée par le fait que le médicament est destiné au traitement des ulcères par voie topique. 19. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée par le fait que le médicament est destiné au traitement des ulcères des membres inférieurs de patients diabétiques. 20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisée par le fait que ledit médicament est destiné à être administré en cure de 2 à 10 semaines à raison de 1 à 2 applications par jour sur la partie lésée.