Brevet FR2886944A1 — publié le 20061215

DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est a fabrication d'inocula bactériens destinés à l'agriculture et, plus particulièrement, la bactérisation de résidus de cultures au sol, de matières fertilisantes résiduelles (MRF) et/ou d'engrais organiques (EO) et/ou organo minéraux (EOM). Les secteurs industriels tels que la fermentation à l'état solide ou liquide, ainsi que la formulation et le conditionnement de matières fertilisantes sont concernés. ÉTAT DE LA TECHNIQUE La rusticité et la persistance active de bactéries favorisant la croissance des plantes (ou BFCP, ou encore PGPR en anglais; Bashan 1998), parfois appelée compétence édaphique et/ou saprophytique, voire, en anglais, fitness in soif (Mirleau et a1. 2000), et le facteur clé pouvant déterminer la réussite d'un protocole d'inoculation (de bactérisation) de sols, de résidus de culture au sol, de racines, de semences et, dans le cadre de la présente invention, d'engrais organiques et organo - minéraux (EO/EOM). Or, cette rusticité est un phénomène mal compris étant donnée la complexité des processus biologiques qui la sous-tendent. Sa mise en évidence directe et positive à l'aide de techniques biomoléculaires, qui présupposent souvent le jeu et l'expression de mécanismes relativement simples, ne semble donc pas envisageable. Pourtant, l'importance agronomique et industrielle des BFCP demeure, et l'utilité des techniques pouvant en favoriser l'expression et/ou la sélection (obtention et rétention) est indéniable. Il est donc souhaitable de mettre à disposition une technique permettant de retenir au sein de cultures mères de bactéries telluriques (CMBT) les souches BFCP les plus rustiques et donc, en principe, les mieux adaptées à la vie dans les sols arables. Par ailleurs, le présent inventeur a mis au point une valorisation o agronomique et industrielle additionnelle de ces biomasses BFCP particulièrement bien adaptées à la vie dans les sols (FR 06 00014 et FR 01 15542), ainsi qu'une méthode analytique simple capable de révéler la dominance et la survie de ce type de bactéries malgré la bactéricidité de l'environnement proximal aux EOM enrichis de sels minéraux fertilisants. La biofertilisation à l'aide d'EO/EOM bactérisés avec des BFCP 5 L'accumulation du phosphore en réaction avec le calcium, le fer ou l'aluminium du sol est un phénomène marqué dans beaucoup de sols agricoles (Beauchemin et Simard 1999; Zhang et al. 1995; Giroux 2002; Pellerin 2003). Cette accumulation entraîne une augmentation de la charge polluante de ces i0 sols, et représente donc un sérieux problème agroenvironnemental dans plusieurs cas (Khiari et al. 2000). De plus, les sols riches en phosphore peu ou pas solubles, tant en France qu'au Québec, répondent mal à la fertilisation - P. Ainsi, sur les sols ayant des indices (P/AI)M3 supérieurs à une certaine valeurs critique préétablie pour ce type de sol, la probabilité de réponse aux engrais phosphatés est généralement faible (eg. inférieure à 20% ; Craaq 2003). Dans des sols dit relativement riches en P, l'efficacité des engrais P est donc limitée bien que rien n'indique que le plein potentiel de rendement de la culture n'ait été atteint. En général, l'efficacité agronomique de la fertilisation P sur ces sols, forts répandus dans bon nombre de régions agricoles tempérées tant au Québec qu'en France (Beauchemin et Simard 1999), peut être partiellement améliorée à l'aide de deux techniques: l'utilisation d'EOM (Parent 2003; Khiari et Parent 2003) ; - la bactérisation des rhizosphères à l'aide de BFCP capables de solubiliser 25 certains composés phosphatés minéraux du sol (Rodriguez et Fraga 1999). Cependant, plusieurs problèmes d'ordre technique limitent leur efficacité agronomique. L'efficacité agronomique des inocula BFCP est minée par: une insuffisance de carbone à proximité des racines (Lynch et Whipps 1990; Alden et al. 2001), une certaine bactéricidité de certains produits phytosanitaires et une compétence édaphique insuffisamment recherchée (Van Veen et al. 1997). L'efficacité agronomique des EOM est limitée par une faible efficacité pondérale étant donnée leur teneur en matière organique, soit de l'ordre de cinq à six fois leur teneur en P205 (Khiari et Parent 2003). Il a donc été proposé de combiner ces deux stratégies (FR 06 00014). Cependant, la valorisation des EOIEOM par bactérisation-BFCP a été à ce jour limitée du fait de certains freins technologiques, dont l'incompétence des souches BFCP utilisées à la vie dans les sols, notamment en présence de fortes osmolarités à proximité des engrais de démarrage, la difficulté d'obtenir à faibles coûts des formulations solides de celles-ci, et enfin les coûts relativement élevés associés au pelliculage de MRF. PRÉSENTATION DE L'INVENTION Problème technique Bien que les inocula BFCP et les EO/EOM existent séparément, il serait avantageux de les combiner en un seul produit afin d'en faciliter l'utilisation agronomique. Cependant, et à ce jour, cette combinaison a été impossible, d'une part, étant donnée l'absence de cellules BFCP rustiques et véritablement adaptées à la vie dans les sols et capables de résister à un certain stress osmotique, et, d'autre part, étant donnée l'indisponibilité d'inocula BFCP rustiques de ce type formulés à l'état solide et produits économiquement par fermentation à l'état solide. Des cellules BFCP véritablement telluriques et donc suffisamment rustiques pour survivre au stress physico-chimique propre à une telle adjonction sont donc ici indispensables Or, la mise en oeuvre de FR 01 15542 permet d'obtenir ce type de cellules, qui sont non seulement rustiques et bien adaptées à la vie dans les sols, mais aussi capables de mieux résister au stress physico-chimique en présence proximale des granules d'engrais minéraux et organo - minéraux. Solution technique La présente invention concerne donc une méthode de criblage de bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) selon leur rusticité, 5 lesdites BFCP étant diazotrophes et MPS, comprenant: É la mise en culture de pré - cultures de BFCP à température ambiante dans un milieu liquide dépourvu d'azote et de phosphore à l'exception de l'hydroxyapathie, ^ l'application d'une pression osmotique, É l'incubation des cultures pendant une durée suffisante, É la détermination de la densité optique (DO) du milieu à deux instants (DO1 et DO2) ; É la rusticité des bactéries dépendant de la différence (DO2- DO1), De préférence: É la pression osmotique est telle qu'elle entraîne la mort des bactéries les moins rustiques mais pas celle des bactéries les plus rustiques. É la pression osmotique dépend de la concentration en phosphate d'ammonium. É l'osmolarité (osM) du MAP et/ou DAP est comprise entre 0,26 et 2, 8, plus préférentiellement entre 0,58 et 2,8, et particulièrement 1,26. É ladite durée de culture est de 28 jours. É DO1 et DO2 sont mesurés respectivement aux 3e et 28e jours de culture. 25 É lesdites pré - cultures sont diluées au 1/5eme; 1/7eme ou 1/9eme dans le milieu liquide. Avantages apportés 3o L'invention consiste en une méthode analytique innovante permettant de confirmer l'expression des phénotypes rustiques de la part des BFCP candidates concernées. Cette méthode ne nécessite pas l'intervention de techniques biomoléculaires et/ou bioinformatiques, techniques pour l'essentiel inappropriées pour la mise en évidence de phénotypes dont les bases génomiques et métaboliques sont vraisemblablement très complexes (cf. Rüberg et al. 2003), et donc difficilement réductibles et explicables via de simples mécanismes de transcription adnéique. Tableau 1: Titre cellulaire (moyenne pour les 9 BS essayés) des cellules témoins azm et des cellules rustiques AZM selon la concentration de phosphate d'ammonium mono-basique (MAP) des pré - mélanges biosolides / MAP I BFCP (soit AZM ou azm). L'indice iMPS (i.e. D02-D01, ou dt28-3 ), est io évalué selon l'invention. Concentration osmolarité cellules x e9 I g MAP (% p/p) MAP (osM) azm AZM AZMIazm iMPS (dt28-3) 0 0 10 10 1 -0.300 4 0.26 4 9 2 -0.175 7.7 0.58 1 8 8 -0.050 14.3 1.26 0.1 5 50 0.120 2.8 0.033 2 61 0.070 II est important de noter qu'il est impossible à ce jour de discerner (cribler) autrement avec certitude entre ces deux souches, ou encore entre elles et les autres BFCP MPS du sol, à l'aide d'outils biomoléculaires et génomiques puisque ces biomasses bactériennes sont apparentées, hormis leur rusticité. En effet, et hormis leurs actions in situ sur la croissance des plantes, les souches édaphiquement compétentes issues de FR 01 15542 sont difficilement repérables et/ou distinguables des souches apparentées qui le sont moins. Le stress osmotique provoqué par la MAP s'avère ici utile en ce sens qu'il permet de mettre en évidence cette plus grande compétence. Dans les faits, la pression osmotique assure la dominance des souches les plus rustiques, et plus particulièrement ici les AZM, réintroduites dans le sol selon la présente invention. La dissolution du phosphore tel que détecté par la clarification initiale des milieux JM, agit ici comme un trait rapporteur pour les cellules capables de diazotrophie, diazotrophie qui est elle, par définition des BFCP-AZM, associée à la rusticité supposée de ces cellules. Si, en réponse au stress osmotique, les cellules non rustiques sont éliminées, seules les cellules (AZM) rustiques pourront être soumises à une carence d'azote et de phosphore caractéristique des milieux JM, et contribuer à densifier (i.e. augmenter la densité apparente) de ces milieux. Pour vérifier que ce sont bien les cellules les plus rustiques (i.e. AZM) réintroduites par inoculation qui résistent, et non les autres types de cellules, en principe mois rustiques, voire les cellules témoins avec azm elles aussi réintroduites par inoculation, il s'agit simplement d'inclure des témoins non inoculés et des témoins inoculés avec des cellules témoins tels io que définis dans le brevet FR 01 15542. Dans la mesure où les témoins non inoculés et inoculés (azm) ne provoquent pas d'augmentation sensible de la densité apparente des milieux JM en fonction de l'augmentation du stress osmotique en vigueur dans les pré - mélanges avec MAP, la densification des milieux JM associés aux pré - mélanges inoculés à l'aide des BFCP supposément rustiques ne peut être attribuable qu'à la résistance desdites cellules audit stress osmotique. Références Alden, L., R. Demoling et E Baath. 2001. Rapid method of determining factors limiting bacteria growth in soit. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1830-1838. Antoun, H., C. J. Beauchamp; N. Goussard; R. Chabot et R. Lalande. 1998. Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: effect on radishes (Raphanus sativus L.). Plant and Soil. 204: 57-67. Bashan, Y. 1998. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture. Biotechnol. Adv. 16: 729-770. Beauchemin, S. et R.R. Simard. 1999. Degré de saturation en P du sol: revue de quelques indices et de leur utilité pour la gestion du P au Québec, Canada. Can. J. Soil. Sci. 79: 615-625. Chabot, R. C.J. Beauchamp, J.W. Kloepper et H. Antoun. 1998. Effet of phosphorus on root colonization and growht promotion of maize by biomuninescent mutants of phosphate solubilizing Rhizobium Ieguminosarum biovar phaseoli. Soil Biol. Biochem. 30; 1615-1618. Craaq (Centre de référence en agriculture et agroalimentaire du Québec). 2003. Guide de référence en fertilisation (1 er édition). Craaq, 2875 Boul. Laurier, Sainte Foy, Qc G1 V 2M2. Giroux, M. 2002. Évolution des teneurs en phosphore dans les sols selon la fertilisation, la richesse en P et le type de sol. Colloque sur le phosphore Une gestion éclairée. OAQ et APAQ, Drummondvill, Qc, 6 nov. 2002. Khiari, L. et L.É. Parent. 2003. Les engrais organo - minéraux à valeur ajoutée, pour une meilleure fertilisation intégrée des agrosystèmes. Colloque Association québécoise des spécialistes en sciences du sol (Aqsss), 17ième congrés, Université de Sherbrooke, Qc, 9-11 juin 2003. Kumar, V. and N. Narula. 1999. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants. Biol. Fertil. Soils. 28: 301-305. Lynch, J.M. et J.M. Whipps. 1990. Substrate flow in the rhizosphere. Plant and Soit 129: 1-10. Miller, K.J. et J.M. Wood. 1996. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Microbiol 50:101-136. Mirleau, P., S. Delorme, L. Philippot, J. M. Meyer, S. Mazurier et P. Lemanceau. 2000. Fitness in soit and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiol. Ecol. 34: 3544. Parent, L.É. 2003. Les engrais organo - minéraux comme solution commerciale aux surplus de biomasses. Colloque en agro-environnement de l'Irda, Drummondville, jeudi le 13 novembre 2003. Pellerin, A. 2003. Études agro-environnementales sur des sols cultivés en mais-grain (Zea mays L.) au Québec. Thèse de doctorat, Département des sols et de génie agroalimentaire, Université Laval, Québec, Ca. Rodriguez, H. et R. Fraga. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their rote in plant growht promotion. Biotechnol. Adv. 17: 319-339. Rüberg, S. Z-X. Tian, E. Krol, B. Linke, F. Meyer, Y. Wang, A. Pühler, S. Weidner et A. Becker. 2003. Construction and validation of a Sinorhizobium meliloti whole genome DNA microarray: genome-wide profiling of osmoadaptive gene expression. J. Biotechnol. 106: 255-268. Van Veen et al. 1997. Fate and activity of microoganisms introduced into soi/. MMBR 61:121-135; Zhang, T.Q., A.F. MacKenzie et B.C. Liang. 1995. Modifications à long terme des teneurs en P et en K extractibles sans la solution Mehlich-3 dans un loam argilo-sableux sous culture continue de maïs. Can. J. Soit Sci. 75: 361-67. s REVENDICATIONS, 1. Méthode de criblage de bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP) selon leur rusticité comprenant: la mise en culture de pré cultures de BFCP à température ambiante dans un milieu liquide dépourvu d'azote et de phosphore à l'exception de l'hydroxyapathie, l'application d'une pression osmotique, - l'incubation des cultures pendant une durée suffisante, - la mesure de la densité optique (DO) du milieu à deux instants (DO1 et D02) ; - la rusticité des bactéries dépendant de la différence (D02-DO1). is 2. Méthode de criblage de BFCP selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'osmolarité est comprise entre 0,26 et 2,8, plus préférentiellement entre 0,58 et 2,8, et particulièrement 1,26. 3. Méthode de criblage de BFCP selon la revendication 1 caractérisée en ce 20 que ladite durée de culture est de 28 jours. 4. Méthode de criblage de BFCP selon la revendication 1 caractérisée en ce que DO1 et D02 sont mesurés respectivement aux 3e et 28e jours de culture. 5. Méthode de criblage de BFCP selon la revendication 1 caractérisée en ce que la température ambiante est une température comprise entre 4 et 32 C, plus préférentiellement entre 15 et 27 C, et particulièrement entre 20 et 22 C. 6. Méthode de criblage de BFCP selon la revendication 1 caractérisée en ce que lesdites pré - cultures sont diluées au 115eme; 1/7eme ou 1/9eme dans le milieu liquide.