Brevet FR2889592A1 — publié le 20070209

L'invention concerne un procédé pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. La prévalence de l'allergie alimentaire dans la population générale est estimée à 8% des enfants de moins de trois ans. Environ 2,5% de la population des Etats-Unis est aujourd'hui affectée par les allergies alimentaires. La fréquence des allergies alimentaires à doublé en cinq ans et celle des urgences allergiques a été multipliée par 5 au cours des 15 dernières années dans les pays développés en général. Le terme allergies tel qu'utilisé ici, concerne un désordre immunologique également appelé allergies de type 1, mais ne concerne en aucun cas les phénomènes d'intolérances alimentaires dues uniquement à des réactions pharmacologiques, métaboliques, ou toxiques dans lesquelles le système immunitaire ne joue aucun rôle. De manière générale, les symptômes induits par les agents allergènes et en particulier les allergènes issus de la nourriture, ont une gravité qui varie beaucoup en fonction de l'organe cible affecté. Les symptômes les moins graves sont souvent restreints à la cavité oropharingée: un gonflement de la langue et des lèvres, ou encore des démangeaisons de la bouche ou de la gorge. Ce type d'allergies alimentaires est généralement nommé syndrome allergique oral (OAS). Des symptômes systémiques, généralement plus sévères peuvent également apparaître. On peut citer à titre d'exemple des urticaires généralisés, les problèmes gastriques, ou encore les chocs anaphylactiques. Dans ce dernier cas, les allergies alimentaires peuvent même être mortelles. La nature des aliments impliqués dans l'allergie alimentaire varie selon les pays, néanmoins, parmi ces allergènes, l'arachide, une plante appartenant à la famille des légumineuses, retient particulièrement l'attention en raison de son importance médicale. L'allergie à l'arachide représente aujourd'hui la deuxième cause d'allergie alimentaire chez l'enfant, et disparaît peu ou pas avec l'âge. De plus, l'arachide est présente dans de nombreuses compositions alimentaires, sans que le consommateur en soit systématiquement informé. Enfin, les manifestations cliniques des allergies dues à l'arachide sont souvent sévères. Ce problème de santé publique est en plus aggravé par les réactions allergiques croisées qui peuvent être induites par la consommation d'autres légumes de la famille des légumineuses. A titre d'exemple, des cas de réactions allergiques croisées ont été rapportés entre l'arachide et le soja, le pois, le lupin, ou encore les lentilles. Les immunoglobulines de type E (IgE) ont été désignées comme responsables de telles réactions allergiques croisées. En effet, des structures antigéniques proches, présentes dans l'arachide et dans d'autres légumineuses, sont reconnues par les mêmes immunoglobulines de type IgE. Le contrôle des réactions allergiques croisées revêt donc une importance considérable, en particulier pour les patients allergiques. Des méthodes de détection des allergies alimentaires ont donc été mises au point. On connaît, à titre d'exemple, des techniques de tests cutanés in vivo avec des extraits d'allergènes alimentaires. Ces tests cutanés peuvent être des prick-tests ( skin prick tests ou SPT), destinés au diagnostic d'une réaction allergique immédiate ou bien des patchtests pour le diagnostic d'une réaction allergique retardée. Ces tests sont parfois précédés d'un contact oral avec l'allergène, de manière à connaître l'agent causal de l'allergie. La détection des allergies alimentaires peut également reposer sur un test de provocation orale en double aveugle contre placebo (test DBPCFC). Des études ont révélé qu'un nombre important d'enfants dont le test cutané est positif n'ont pas de réactivité clinique lors de l'ingestion de l'aliment correspondant, ce qui montre le manque de spécificité des tests de type SPT comme élément prédictif de la réaction clinique. Il faut également tenir compte du fait que la réalisation d'un test DBPCFC peut s'avérer dangereuse pour la personne testée, qui risque de 30 développer un choc anaphylactique. D'autres techniques de tests in vitro ont donc été développées. Il s'agit de tests RAST et ELISA. Ces tests consistent à sélectionner des matières potentiellement allergènes, et à les immobiliser sur une phase solide, par exemple le sépharose, des particules magnétiques ou encore des billes de polystyrène. Après incubation de la phase solide avec un sérum et en particulier un sérum d'un patient, la liaison des anticorps de type IgE est mesurée. Pour cette mesure, les techniques utilisant la radioactivité ou des réactions enzymatiques sont les plus fréquemment utilisées. L'ensemble de ces tests permet de déterminer la quantité ou l'activité des anticorps IgE. Ces tests ne donnent cependant pas d'informations sur l'état allergique du patient, ni sur la pertinence biologique des complexes IgE/allergène observés. Des tests réalisés sur la peau ou in vitro par RAST ou ELISA, sur différents patients peuvent ainsi être accompagnés de symptômes modérés chez certains patients ou beaucoup plus graves chez d'autres. L'allergie clinique peut même être totalement absente, malgré la présence d'un complexe anticorps/allergène. Compte tenu du danger que représentent les réactions allergiques croisées, en particulier avec l'arachide, et la difficulté de diagnostiquer avec certitude quelle composition alimentaire est susceptible de provoquer une telle réaction chez un individu, Il existe un besoin pour des tests de mesure de l'aptitude d'une composition à provoquer une réaction allergique croisée. En particulier, compte tenu de l'importance médicale des allergies à l'arachide, il existe un besoin pour de nouveaux test de l'aptitude d'une composition à provoquer une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. Sommaire de l'invention L'invention concerne un procédé pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) immuniser un mammifère monogastrique par administration orale d'un extrait protéique d'arachide; b) administrer, par voie nasale, la composition à tester audit mammifère immunisé à l'étape a); c) sacrifier le mammifère immunisé obtenu à la fin de l'étape b) ; d) détecter chez ledit mammifère immunisé au moins l'un des paramètres suivants: 2889592 4 (i) la présence d'une inflammation pulmonaire de type allergique; ou (ii) la présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester; ou (iii) l'augmentation du rapport (x)/(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou COU 1, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-y et l'IL-1 R, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; (iv) l'augmentation du rapport pondéral IgGl/IgG2a, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; la détection d'au moins l'un des paramètres (i), (ii) ou (iii) ci-dessus étant indicative de l'aptitude de la composition testée à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. L'invention concerne également un mammifère monogastrique non humain utilisable pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide, ledit mammifère monogastrique non humain étant caractérisé en ce que: (i) il possède des anticorps plasmatiques d'isotype IgE dirigés à l'encontre d'antigènes contenus dans un extrait protéique d'arachide; (ii) il possède une inflammation pulmonaire de type allergique modérée; (iii) il possède un rapport entre l'expression ou la production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou CCL11, et l'expression ou la production d'une cytokine choisie parmi IFN- y et l'IL-1 R élevé, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; (iv) il possède un rapport pondéral IgGl/IgG2a élevé, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée. Description des fiqures: Fiqure 1: Niveau des anticorps de souris traitées oralement ou nasalement par des extraits d'arachide. Des souris ont été oralement (en blanc) ou nasalement (en noir) immunisées avec des extraits protéiques d'arachide + CT au jour 0 et au jour 7. Des échantillons de plasma ont été collectés au jour 14. Figure 1A: Les réponses IgG spécifiques d'arachide et les réponses des sous-classes IgG ont été analysées par ELISA. Figure 1 B: Les réponses anticorps IgE spécifiques d'arachide sont totales et ont été déterminées sur des échantillons déplétés en IgG par ELISA. Les échantillons ont été dilués au 1/256ième pour déterminer les réponses IgE spécifiques d'arachide. Des dilutions en série ont été utilisées pour déterminer le niveau total d'anticorps anti-IgE. Tous les résultats proviennent d'au moins cinq expériences avec cinq souris par groupe et ont été exprimés comme une moyenne un écart type. Fiqure 2: Hyper réactivité respiratoire après seconde immunisation nasale de souris préalablement immunisées oralement 25 ou nasalement. Figure 2A. L'augmentation de pause (index Penh basal) a été mesurée six heures après la seconde administration d'arachide à des souris préalablement immunisées nasalement ou oralement avec de l'arachide. Figure 2B. Hyper activité respiratoire en fonction de doses croissantes de métacholine. Pour chaque dose, l'index Penh a été mesuré chaque minute pendant 7 minutes. Les témoins incluent des souris pseudo-immunisées et pseudo-sensibilisées. Les valeurs sont exprimées comme des moyennes pour quatre souris. Fiqure 3: Recrutement cellulaire dans les poumons et le BALF de souris oralement ou nasalement immunisées avec l'arachide. Les souris ont été immunisées par la voie nasale (5 pl/narine) ou orale (250 pl) avec des extraits protéines d'arachide + CT en tant qu'adjuvants au jour 0 et au jour 7. Panel A: Les tissus pulmonaires (en haut) et le BALF (en bas) ont été collectés 10 jours après immunisation et avant la seconde immunisation. Panel B: Le tissu pulmonaire (en haut) et le BALF ont été collectés le jour 17 après seconde administration d'extrait d'arachide par voie nasale les jours 15 et 16. Des coûts pistologiques ont été colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (grossissement x 40) et des préparations de type cytospin de BALF ont été colorées au GIEMSA (grossissement x 20). Le BALF de souris immunisées nasalement a été dilué dix fois avec le cytospin. Panel C: Score d'inflammation pulmonaire sur des coupes histologiques. La densité des infiltrations périvasculaires et péribronchiques a été déterminée de manière aléatoire sur une échelle de 9 points. (1 = infiltration minimale, 9 = infiltration maximale) Fiqure 4: Observation du nombre d'éosinophiles pulmonaires La présence d'éosinophiles pulmonaires présents dans des souris ayant subi une seconde immunisation nasale après une première immunisation par voie orale ou nasale avec des extraits d'arachide a été observée. La présence d'éosinophile a été déterminée par activité peroxydase cyanide résistante de coupes histologiques préalablement traitée avec KCN (grossissement x 100 et x 200). FIGURE 5: Expression des cytokines dans les poumons et le BALF de souris immunisées oralement ou nasalement avec des extraits d'arachide. 2889592 7 Figure 5A: expression relative des ARNm de différentes cytokines déterminée par RTTCR dans le tissu pulmonaire total avant (en pointillés) et après seconde administration nasale d'extrait d'arachide (en blanc et en noir). Figure 5B: expression relative des ARNm de différentes cytokines déterminée par RTTCR dans des cellules TCD4+ pulmonaires collectées après seconde administration d'extrait d'arachide à des souris immunisées préalablement par la voie orale (en blanc ou nasal (en noir)) . Tous les résultats ont été normalisés par rapport à l'expression du gène de lactine-13 pour corriger les différences de concentration d'ADNc des échantillons de départ. Les points sont calculés selon la formule suivante: (valeur cytokine valeur actine R). Les différences de valeur au 15 delà de deux cycles sont considérées comme pertienentes. Les valers sont représentatives de trois expériences réalisées séparément. Figure 5C: Expression des cytokines dans le BALF collecté avant (hachuré) et après seconde immunisation nasale par des extraits d'arachide (non hachuré). Les taux de cytokine ont été déterminés par ELISA. Les taux de IL-5, IL-10, IL-13, TNF-a et IFN-y sont en-dessous des seuils de détection. (ND). FIGURE 6: Fréquence des cellules MAC-1 dans les poumons de 25 souris immunisées mucosalement avec des extraits d'arachide. Des tissus pulmonaires ont été collectés au jour 17 sur des souris oralement ou nasalement immunisées avec des extraits protéiques d'arachide et soit immunisées une seconde fois nasalement avec des extraits protéiques d'arachide aux jours 15 et 16 (B) soit non-immunisées (A).) Après digestion des tissus à la collagénase et purification sur gradient discontinu de Percol, les cellules sont collectées à l'interface 75%-20% et analysées par cytométrie de flux. FIGURE 7: Inflammation pulmonaire après seconde immunisation nasale avec des antiqènes sans rapport avec l'arachide. Les souris ont été immunisées nasalement ou oralement avec des extraits protéiques d'arachide + CT en tant qu'adjuvant au jour 0 et au jour 7 puis immunisées une seconde fois nasalement avec du PBS, OVA ou des antigènes respiratoires (Der f) au jour 15 et au jour 16. Les tissus pulmonaires ont été collectés au jour 17 et l'inflammation a été mesurée sur des coupes colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (grossissement x 40). Description détaillée de l'invention Compte tenu de l'importance médicale des allergies alimentaires croisées impliquant l'arachide, les inventeurs se sont attachés à mettre au point un procédé pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. En particulier les inventeurs ont cherché à mettre au point un test de détection d'allergie croisée avec l'arachide, qui soit physiologiquement très proche des situations cliniques rencontrées par les individus, et dont les résultats soient donc transposables aux situations physiologiques réelles rencontrées par ces individus. Les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, l'administration orale d'arachide à une souris, suivie d'une instillation nasale d'une composition à tester, permet de mettre en évidence des réactions allergiques croisées potentielles entre la composition à tester et l'arachide comme cela est illustré dans les exemples 1, 2 et 5. L'invention concerne donc un procédé pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) immuniser un mammifère monogastrique par administration orale d'un extrait protéique d'arachide; 2889592 9 b) administrer, par voie nasale, la composition à tester audit mammifère immunisé à l'étape a); c) sacrifier le mammifère immunisé obtenu à la fin de l'étape b) ; d) détecter chez ledit mammifère immunisé au moins l'un des paramètres suivants: (i) la présence d'une inflammation pulmonaire de type allergique; ou (ii) la présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester; ou (iii) l'augmentation du rapport (x)/(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou COU 1, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-y et l'IL1 R, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; (iv) l'augmentation du rapport pondéral IgGl/IgG2a, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée, la détection d'au moins l'un des paramètres (i), (ii) ou (iii) ci-dessus étant indicative de l'aptitude de la composition testée à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. Par mammifère monogastrique, on entend un mammifère dont l'estomac est constitué d'une seule cavité. De préférence, le mammifère monogastrique, est choisi parmi un rongeur, le porc, le cheval et l'âne. En particulier, le rongeur est choisi parmi la souris, le rat, le cobaye et le lapin. De manière tout à fait préférée, la souris appartient à une lignée choisie parmi les lignées C57B1/6, BALB/c ou C3H. De plus, classiquement, le veau pré-ruminant est physiologiquement assimilé à un mammifère monogastrique. De manière à éviter toute contamination des animaux, ceux-ci peuvent être nourris avec des aliments stériles, et avantageusement maintenus dans un environnement stérile, par exemple dans des enceintes à flux laminaire horizontal. Préalablement à l'utilisation des animaux dans le procédé, il est préférable de vérifier que ceux-ci ne sont pas contaminés par des pathogènes microbiens. De manière générale, le bon état des colonies de souris est établi par des tests, connus de l'homme du métier, recommandés par les bonnes pratiques de laboratoire. L'extrait protéique d'arachide destiné à être administré, peut être obtenu par toute technique connue d'extraction protéique, telle qu'un traitement au bicarbonate d'ammonium d'extraits d'arachide préalablement dégraissés. Le dégraissage de l'arachide s'effectue d'une manière classique par mélange avec de l'acétone, et ne sera donc pas décrit en détail. Avant immunisation, la concentration en protéines des échantillons est déterminée classiquement, par exemple par la technique de Bradford. De préférence, à l'étape a), on immunise le mammifère monogastrique par administration orale d'une combinaison d'un extrait protéique d'arachide et d'un composé adjuvant de l'immunité. De préférence, l'adjuvant de l'immunité est choisi parmi la toxine de choléra (CT), l'entérotoxine labile de E. coli (LT) ou tout autre adjuvant tel qu'une cytokine, ou un composé chimique capable d'induire des réponses de type Th2 spécifiquement dirigées contre les antigènes co- administrés par les voies orale ou nasale. En particulier, l'immunisation de l'animal peut être réalisée par une composition immunogène comprenant un extrait protéique d'arachide, un composé adjuvant de l'immunité et un excipient destiné à la voie orale tel que les capryl caproyl macrogol glycérides comme le Labrasol de la société GATTEFOSSE. De préférence, l'étape b) d'administration nasale de la composition à tester est effectuée dans un intervalle de temps allant du Jour 12 au Jour 20, avantageusement du Jour 14 au Jour 18, et préférentiellement du Jour 15 au Jour 16, suivant l'étape a) d'immunisation orale. L'aptitude de la composition testée à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide peut être déterminée selon un ou plusieurs paramètres choisis parmi: (i) la présence d'une inflammation pulmonaire, 2889592 11 (ii) la présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester ou (iii) l'augmentation de l'expression ou de la production de certaines cytokines associées à l'allergène, et en particulier, l'augmentation du rapport (x) /(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou COU 1, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-y et l'IL-1 R, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; La détermination de la présence d'une inflammation pulmonaire peut être réalisée en observant des coupes histologiques des poumons des animaux traités. Pour quantifier l'inflammation des poumons, les coupes peuvent être codées et des notes attribuées en fonction de l'importance de l'inflammation péribronchique et périvasculaire. L'importance de l'inflammation peut être aisément déterminée en fonction de l'épaisseur de la couche de cellules inflammatoires autour des bronches. L'inflammation pulmonaire peut être quantifiée selon l'échelle décrite ciaprès. Une note de 1 est donnée pour les coupes qui ne montrent pas de signe d'inflammation. Les coupes sont notées de 2 à 4 lorsque les bronches sont entourées par une fine couche de cellules inflammatoires (2: peu de bronches entourées par des cellules inflammatoires, 3: plus de bronches entourées par des cellules inflammatoires, etc). Les coupes sont notées 5 à 7 selon le nombre de bronches qui ont été entourées par une couche épaisse de cellules inflammatoires. Enfin, lorsque l'inflammation a atteint l'aire interstitielle, les coupes sont notées 8 ou 9 en fonction de la sévérité. Ainsi, on considère qu'une inflammation pulmonaire de type allergique, attribuable à la composition à tester, est présente lorsque une valeur moyenne 3 peut être attribuée à une coupe histologique pulmonaire. De préférence, à l'étape d), la présence d'une inflammation pulmonaire de type allergique est détectée par comptage des éosinophiles sur une coupe histologique du tissu pulmonaire dudit mammifère. En effet, les poumons normaux ne contiennent pas ou peu d'éosinophiles. La présence d'éosinophiles parmi les cellules recrutées dans les poumons permet donc de qualifier une inflammation pulmonaire, comme étant de type allergique. De manière classique, la présence d'éosinophiles dans les coupes tissulaires est déterminée par l'activité peroxydase cyanide-résistante, des éosinophiles. La présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester est indicative d'une réaction allergique. La présence d'anticorps peut être détectée de manière classique, par une méthode immuno-enzymatique du type ELISA. Une méthode immuno-enzymatique inclut les tests de type ELISA mais également les tests de type RIA. En particulier, l'augmentation de l'expression d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, CCL11, l'IFN-y et l'IL-10 peut être détectée comme cela est décrit dans l'exemple 5, par quantification de l'ARN messager correspondant dans un échantillon de tissu pulmonaire dudit mammifère. La quantification de l'ARN peut être réalisée par PCR quantitative en temps réel. Cette technique est fondée sur les mêmes principes que la PCR classique c'est-à-dire dénaturation, hybridation, puis extension. A la différence d'une PCR classique, la PCR quantitative en temps réel utilise une sonde fluorescente qui permet la quantification et la caractérisation de l'amplicon formé en temps réel. Cette technique permet de réaliser une quantification relative des ARNm contenus dans les échantillons testés par rapport à un gène de référence non régulé, par exemple le gène de l'actine B. Il est également possible de réaliser une quantification absolue c'est à dire une détermination en nombre de copies par rapport à un témoin. Alternativement, la quantification des ARN d'intérêt peut être réalisée par une technique de PCR classique par compétition ou encore par la technique dite de Northern Blot . La présence de facteurs stimulant une réponse de type TH2, est également indicative d'une réaction allergique. Ces facteurs sont l'ensemble des cytokines et chémokines favorisant le développement des cellules de type TH2 et en particulier l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou le CCL11. 2889592 13 A l'inverse, il existe des facteurs, favorisant le développement des cellules de type TH1. Il s'agit en particulier de l'IL12, de IFN-y et l'IL-1 R Par conséquent la comparaison du niveau d'expression ou de production d'une cytokine, spécifique d'une réponse de type TH2, par rapport à une cytokine spécifique d'une réponse de type TH1, est suffisante pour détecter une réaction allergique. Une telle comparaison permet d'éviter d'avoir recours à des analyses quantitatives coûteuses, et est donc particulièrement bien adaptée à la détection d'une réaction allegique. De préférence, la composition à tester consiste en une composition destinée à l'alimentation de l'homme ou d'un mammifère monogastrique non humain. Les compositions à tester peuvent être tout type de composition alimentaire, et en particulier, les oeufs, les produits laitiers, les légumes, les fruits, la viande, les poissons, les crustacés, les mollusques, les huiles, les graisses, les céréales, les condiments, les produits élaborés, et de manière générale leurs dérivés. L'invention concerne également un mammifère monogastrique non humain utilisable pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide, ledit mammifère monogastrique non humain étant caractérisé en ce que: (i) il possède des anticorps plasmatiques d'isotype IgE dirigés à l'encontre d'antigènes contenus dans un extrait protéique d'arachide; (ii) il possède une inflammation pulmonaire de type allergique modérée; (iii) il possède un rapport (x)/(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou COU 1, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-y et l'IL1 R, élevé, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; (iv) il possède un rapport pondéral IgGl/IgG2a élevé, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée. La détermination de la présence d'une inflammation pulmonaire peut être réalisée comme cela a été décrit ci-dessus en observant et en codant des coupes histologiques pulmonaires des animaux traités en fonction de l'épaisseur de la couche de cellules inflammatoires autour des bronches. Ainsi, on considère qu'une inflammation pulmonaire de type allergique, modérée, est présente lorsque une valeur moyenne 3 peut être attribuée à une coupe histologique pulmonaire de l'animal. L'invention est en outre illustrée sans pour autant y être limitée par les exemples suivants. EXEMPLES MATERIELS ET METHODES GENERAUX. 20 Extraits de léqumineuses et d'arachide Les extraits protéiques d'arachide ont été obtenus comme cela a été décrit précédemment, par traitement au bicarbonate d'ammonium d'extraits d'arachide préalablement dégraissés. Brièvement, 200g d'arachides sèches sont mélangés et mixés avec 600 ml d'acétone et incubés sur la nuit à 4 C sous agitation. Ce mélange est ensuite centrifugé 20' à 2000 tr/min et le surnageant est remplacé par de l'acétone. La procédure de dégraissage nécessite trois incubations dans de l'acétone. Les culots résultants sont séchés sur la nuit à température ambiante. Les protéines sont ensuite extraites par incubation sur la nuit dans 800 ml de bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 8 sous agitation. Le mélange est ensuite décanté sur la nuit à 4 C, et le surnageant est centrifugé pendant 20 minutes à 2000 tr/min à 4 C. La concentration des protéines a été déterminée en utilisant le kit BCA (Pierce Chemical Co. ; Rockford, IL). Les farines de lupin, de pois et de soja ont été fournies par la Coopérative Agricole de Noëlle Ancenis (CANA, France). Les extraits protéiques ont été préparés par incubation sur la nuit des farines de légumes dans 800 ml de bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 8 de la manière indiquée pour l'arachide. Les extraits protéiques d'arachide et de légumineuses ont été dialysés sur des membranes dont les mailles retiennent les protéines de taille supérieure à 3 kDa, contre de l'eau distillée et ensuite les extraits protéiques ont été lyophilisés ou concentrés et conservés à -20 C jusqu'à utilisation. Pour déterminer la répartition des protéines contenues dans l'extrait d'arachides et de légumineuses, 30 pg d'extraits protéiques ont été ajoutés à un tampon Tris HCI 1M, glycérol, SDS et R-mercaptoéthanol, puis chauffés pendant cinq minutes à 90 C avant d'être déposés sur des gels de polyacrylamide à 10% (BioRad, Hercules, CA). Après migration (1 h à 100 mV), les gels sont colorés au bleu de Coomassie, et les images ont été analysées par le logiciel Kodak 1 D 3.0. Les extraits protéiques des gels ont une répartition identique à celle des extraits commerciaux. (Greer laboratories, Lenoir, NC). SOURIS Des souris femelles de type C57BL/6 ont été obtenues auprès du Centre de Recherche sur le Cancer Frederick (National Cancer Institute, Frederick, MD). Les souris ont été maintenues dans des enceintes à flux laminaire horizontal, et n'étaient pas contaminées par des pathogènes microbiens comme cela a été déterminé par criblage des anticorps plasmatiques et histopathologies tissulaires réalisés sur des souris témoins . Toutes les souris ont reçu une nourriture stérile et de l'eau en quantité non limitée. Les études ont été réalisées en accord avec les directives émanant du NIH et de l'Université d'Alabama à Birmingham, de manière à éviter la douleur et le stress des animaux. IMMUNISATION MUCOSALE Les souris âgées de 8 à 12 semaines ont été immunisées deux fois à une semaine d'intervalle, avec l'extrait protéique d'arachide + toxine cholérique (CT) en tant qu'adjuvant. Les immunisations nasales ont été réalisées avec des souris anesthésiées en administrant 100 pg d'extrait d'arachide et 1 pg de CT dans un volume total de 10 pl avec 5 pl placé dans chaque narine. Les souris étaient privées de nourriture pendant deux heures, et ont été traitées oralement avec du bicarbonate de sodium avant l'immunisation orale avec 1 mg d'extrait d'arachide et 15 pg de CT en tant qu'adjuvant dans 250 pl de PBS. Certaines expériences incluent une souris contrôle immunisée avec de l'ovalbumine en tant qu'antigène à la place de l'arachide (Sigma Chemical, Saint Louis, MO). Les souris ont ensuite été immunisées soit nasalement avec 100pg d'OVA + 1 pg de CT, soit oralement avec un 1 mg d'OVA + 15 pg de CT. Les échantillons plasmatiques ont été récoltés au Jour 7 et au Jour 14 pour analyse des réponses anticorps anti-arachide. Différentes doses de CT (5 pg, voie nasale, ou 60 pg, voie orale) et d'arachide (25, 50 ou 200 pg; voie nasale, ou 2000pg, voie orale) ont également été testées dans des expérimentations séparées. SENSIBILISATION NASALE AVEC DE L'ARACHIDE OU D'AUTRES PROTEINES. Dans le but d'induire une inflammation allergique, les souris nasalement ou oralement immunisées avec de l'arachide ont été immunisées une seconde fois par la voie nasale (challenge nasal) au jour 15 et au jour 16 avec 200 pg d'extrait d'arachide dans un volume total de 100 pl. Plus précisément, les souris anesthésiées ont absorbé 25pl d'extrait d'arachide par narine, deux fois, à 5-10 minutes d'intervalle. Pour analyser les réactions croisées avec d'autres protéines in vivo, les souris ont été sensibilisées les jours 15 et 16 avec des extraits protéiques sans lien avec l'arachide, en l'occurrence 200pg d'OVA, ou 40 pg d'extraits protéiques de Dermatophagoides farinae (Der f) ou de Blatte/la germanica (blatte) à la place de l'extrait d'arachide. 17 CONCENTRATION PLASMATIQUE DES ANTICORPS Les concentrations plasmatiques des anticorps spécifiques d'arachide ont été mesurées par ELISA. Brièvement, des plaques 96 puits (Falcon) ont été recouvertes avec 50 pg/pl d'extrait protéique d'arachide dans du PBS et incubées sur la nuit à 4 . Après blocage avec un mélange BSA, PBS-1 %, des dilutions en série du sérum ont été ajoutées et incubées sur la nuit à 4 C. Les anticorps d'isotype IgG anti-arachide ont été détectés avec 0,3pg/ml d'anticorps de chèvre anti-souris spécifique de chaînes lourdes y, couplées à la peroxydase (Southern Biotechnology Associates, [SBA], Birmingham, AL). Pour l'analyse des sous-classe IgG, des anticorps monoclonaux biotinylés de rat anti-souris de type yl (clone G1-7,3), y2a (clone R19-15), y2b (clone R12-3) ou y3 (clone R40-82) spécifiques de chaînes lourdes (BD-PharMingen, San Diego CA) et couplés à la peroxydase conjuguée à la streptavidine ont été employés à 0,5 ou 1 pg/ml. La réaction colorimétrique a été développée par l'addition d'acide 2,2'- azino-bis (3)-éthylbenzylthiazoline-6-sulfonique (Sigma) et H2O2. Le point final du titrage a été exprimé comme l'inverse du loge de la dilution donnant une densité optique à 415 nanomètres (DO415) Pour déterminer si le plasma de souris sensibilisées à l'arachide réagit à des antigènes protéiques sans rapport avec l'arachide, , les échantillons de plasma ont été ajoutés dans des plaques de type ELISA recouvertes avec des extraits protéiques de OVA (1 mg/mL), Der f (10 pg/mL) ou blatte (10pg/mL). Pour détecter la réponse IgE totale et la réponse IgE spécifique d'arachide, les échantillons de dilution plasmatiques ont été tout d'abord incubés sur la nuit à 4 C dans des plaques recouvertes de protéine G (Reacti-Bind Plates, Pierce, Rockford, IL). La concentration totale en IgE a été mesurée en utilisant des sérums déplétés en IgG en utilisant le kit BD OptEIA Set mouse IgE kit selon les instructions du fabriquant (BD Biosciences, San Diego, CA). Des fractions aliquotes d'échantillons déplétés en IgG ont été ajoutés aux plaques ELISA recouvertes avec des extraits protéiques d'arachide pour déterminer le niveau d' IgE spécifique d'arachide après addition d'IgE de rat anti- souris (clone R35-92; BDPharMingen) et de streptavidine poly-HRP (Research diagnostics, Flanders, NJ) HISTOLOGIE ET EVALUATION DES NIVEAUX D'INFLAMMATION PULMONAIRE Les poumons ont été fixés dans un tampon de formaline à 10%, enveloppés de paraffine et coupés par section de 5pm d'épaisseur. Les sections ont ensuite été déparaffinisées, réhydratées, et incubées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) pour l'évaluation de l'inflammation. La présence d'éosinophiles dans les coupes tissulaires a été déterminée par activité peroxydase cyanide- résistante. Brièvement, les coupes de poumons ont été incubées pendant 1 minute à température ambiante dans 10 mM de KCN pH 6,5. Les coupes ont été ensuite rincées dans du PBS et incubées pendant 15 minutes avec le substrat peroxydase DAB (3,3'-diaminobenzine) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Après lavage dans le PBS, les coupes tissulaires ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline. Les éosinophiles qui expriment une activité peroxydase cyanide résistante ont été colorés en brun foncé. Pour quantifier l'inflammation des poumons, les coupes ont été codées et des notes ont été attribuées pour les inflammations péribronchiques et périvasculaires. Une note de 1 a été attribuée aux coupes qui ne montrent pas de signe d'inflammation. Les coupes ont été notées de 2 à 4 lorsque les bronches étaient entourées par une fine couche de cellule inflammatoire (2: peu de bronches entourées par des cellules inflammatoires, 3: plus de bronches entourées par des cellules inflammatoires, 4 encore plus de bronches entourées par des cellules inflammatoires). Les coupes ont été notées 5 à 7 selon le nombre de bronches qui ont été entourées par une couche épaisse de cellules inflammatoires. Enfin, lorsque l'inflammation a atteint l'aire interstitielle, les coupes ont été notées 8 ou 9 en fonction de la sévérité. CYTOMETRIE DE FLUX Les tissus pulmonaires ont été dissociés par digestion à la collagenase de type V (Sigma) dans du milieu RPMI 1640 (Cellgrow Mediatech, Washington, D.C.) pour obtenir des préparations de cellules isolées. Les cellules mononucléaires ont été collectées à l'interface 20-75% d'un gradient discontinu de Percoll et marqué avec des anticorps anti-CD3, anti-CD3, anti-CD4, anti-B220, anti-CD11c, anti-MAC-1 ou anti-CMH de classe II (BD PharMingen). Après lavage et fixation, les échantillons ont été analysés par cytométrie de flux. PURIFICATION DES CELLULES T CD4+ Les tissus pulmonaires ont été dissociés par digestion à la collagenase de type V (Sigma) dans du milieu RPMI 1640 (Cellgro Mediatech, Washington, DC) pour obtenir des préparations de cellules isolées. Les cellules mononucléaires ont été collectées et lavées dans du RPMI. Les cellules T CD4+ ont été séparées en utilisant un trieur de cellules automatisé de type MACS selon le protocole fourni par le fabriquant (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Brièvement, les suspensions de cellules isolées ont été incubées avec un anticorps anti-CD4 biotinylé (BDPharMingen) pendant 30' à 4 C et lavées avec du PBS contenant 2 mM de EDTA et 0,5% de BSA. Des microbilles conjuguées à la streptavidine (Miltenyi Biotech) ont ensuite été ajoutées aux cellules. Après 30 minutes d'incubation à 4 C, les cellules ont été lavées et les cellules T- CD4+ ont été purifiées par sélection positive en utilisant le trieur automatique de type MACS. QUANTIFICATION DES ARNm DE CYTOKINE/CHEMOKINE PAR PCR EN TEMPS REEL. Le tissu pulmonaire a été dissocié par digestion avec de la collagénase de type V (Sigma) dans du RPMI 1640 (Cellgro Mediatech, Washington, D.C.), pour obtenir des préparations composées de cellules isolées. Les cellules mononucléaires ont été prélevées, lavées dans du RPMI et les ARN ont été isolés en utilisant du STAT-60 en suivant les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée avec la reverse transcriptase de type superscript II Reverse transcriptase, et avec des oligomères hexamériques randomisés de type poly(DT). La PCR en temps réel (LightCycler, Roche, IN) a été réalisée avec des amorces générées avec le logiciel oligo (Plymouth, MN), et avec le système de détection SYBER green selon les instructions du fabricant. Chaque point est déterminé selon la formule suivante: 20 (valeur cytokine valeur actine R). La valeur calculée est ensuite utilisée pour calculer le log du taux d'ARNm d'une cytokine donnée. Cette formule permet de normaliser tous les résultats par rapport à l'expression du gène de l'actine R pour corriger toutes les différences dans la concentration en ADNc. Les courbes de fluorescence ont été tracées selon la méthode des dérivées secondes maximum (Roche Molecular Biochemicals LightCycler software, Version 3.5). Cette méthode donne une relation inverse entre la valeur de chaque point de la courbe et le niveau d'ARNm. Par conséquent, les échantillons avec les valeurs les plus faibles contiennent les niveaux d'ARNm les plus élevés. LAVAGE BRONCHOALVEOLAIRE ET CYTOSPIN Les fluides issus du lavage bronchoalvéolaire (BALF) ont été obtenus grâce à la cannulation de la trachée, en infusant 0,6 ml de RPMI 1640 à travers un cathéter de calibre 22 à travers les poumons, suivi par aspiration de ce fluide dans une seringue. Un volume de 0,4 ml de fluide a été récolté. Des fractions aliquotes ont été centrifugées et les surnageants ont été collectés et conservés à -70 C jusqu'à analyse. Les culots cellulaires ont été soumis à cytospine puis colorés au Giemsa (Sigma Diagnostics, St-Louis, MO). DETECTION DE CYTOKINE PAR ELISA Des cytokines ont été détectées dans les surnageants de BALF by 35 ELISA. Les dosages ont été réalisés sur des plaques de type Nunc MaxiSorp Immunoplates (Nunc, Napersville, IL) recouvertes d'anticorps monoclonaux Interféron-y anti-souris (clone R4-6A2), IL-4 (clone BVD4-1 Dl 1), IL-5 (clone TRFK5), IL-6 (clone MP5-20F3), IL-10 (clone JES5-2A5) (BD PharMingen) ou IL-13 (R & D systems, Minneapolis, MN) dans 0,1 M de tampon bicarbonate de sodium à pH 9,5. Après blocage, des taux standard de cytokine et des dilutions en série des surnageants ont été ajoutés en double. Les plaques ont été lavées et incubées avec un anticorps secondaire biotylinlé Interféron-y anti-souris (clone XMG-1,2), IL-4 (clone BVD6-24G2), IL-5 (clone TRFK4), IL-6 (clone MP5-32C11), IL-10 (clone JES5-16 E3) (BD PharMingen) ou un anticorps monoclonal IL-13 (R & D systems), suivi par l'ajout d'anticorps de chèvre anti-biotine Ab couplé à la peroxydase (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La couleur a été développée avec ABTS. Des courbes standard ont été générées en utilisant rIFN-y, rlL-5, rlL-6, rIL-10 (Genzyme, Cambridge, MA), rIL-4 (Endogen Corp., Boston, MA) et rlL-13 (R & D systems) murine. Les tests ELISA ont permis de détecter 10 pg/ml de IL-5, 3 pg/ml de IL-4, 5 pg/ml de IL-6 et 20 pg/ml de IFN-y et IL-10. Le kit ELISA quantikine (R &D systems) a été utilisé pour la détection d'IL-1 R. HYPER REACTIVITE RESPIRATOIRE L'augmentation de pause (Penh), est un index sans dimension qui reflète les changements dans l'amplitude de la courbe de pression représentant le temps d'expiration. Cet index a été mesuré six heures après la dernière immunisation nasale avec de l'arachide, dans des souris qui ont été placées dans un plethysmographe barométrique selon une méthode décrite par Hamelmann et al., 1997). Des doses croissantes de métacholine (0, 10 et 20 mg/ml) ont été administrées par nébulisation. Pour chaque dose, l'index Penh a été mesuré toutes les minutes sur sept minutes. Les contrôles incluent des souris pseudo-immunisées. STATISTIQUES Les résultats présentés sont des moyennes pondérées d'un écart-35 type. La pertinence statistique (p EXEMPLE 1 Réponse sérique murine après administration orale ou nasale d'un extrait protéique d'arachide. Le niveau plasmatique d'anticorps anti-arachide a été comparé entre des souris auxquelles un mélange extrait protéique d'arachide + toxine 10 cholérique (CT) a été administré oralement ou nasalement. Les deux voies d'administration mucosales entraînent une augmentation des anticorps d'isotype IgG anti-arachide. (Figure 1). Les souris traitées par la voie nasale possèdent des niveaux de réponses plasmatiques de type IgG supérieures à des souris immunisées par la voie orale (figure 1 A). Les souris traitées nasalement avec les extraits d'arachide + CT présentent une réponse anticorps IgG1 forte suivie d'une réponse IgG 2b et par des niveaux significatifs de IgG 2a et IgG3 (figure 1 b). Les souris traitées par la voie orale avec les extraits d'arachide + CT présentent également un niveau d'anticorps plasmatique IgG 1 antiarachide important, mais plus faible que le niveau mesuré après immunisation nasale (figure 1 b). De plus, les souris traitées oralement avec les extraits d'arachide + CT présentent des niveaux similaires d'IgG 2b et IgG 3 et des niveaux plus faibles d'IgG 2a (figure 1 b). Contrairement aux réponses plasmatiques de type IgG, des niveaux d'anticorps anti-arachide IgE plus importants ont été mesurés dans les souris traitées oralement (figure 2a). Ce résultat est en accord avec le niveau important d'anticorps d'isotype IgE totaux des souris traitées par la voie orale (figure 2B). L'ensemble de ces résultats suggère que des réponses anticorps différentes ont été induits après administration orale ou nasale des extraits d'arachide + CT. EXEMPLE 2: Hyper réactivité allerqique après seconde immunisation 35 nasale. L'index Penh de souris ayant subi une première immunisation orale ou nasale par l'arachide a été mesuré six heures après une seconde immunisation par un extrait d'arachide par voie nasale. Les souris immunisées oralement ou nasalement présentent une hyperréactivité allergique avec un index Penh basal de 1,1 0,31 et 1,36 0,72 respectivement qui est significativement plus élevée que l'index Penh de souris contrôle (0,57 0,06) (figure 2A). De plus, les souris ayant subi une première immunisation par voie orale ou nasale présentent des index Penh élevés lors d'une seconde immunisation par la métacholine (figure 2B) . Les souris immunisées nasalement possèdent un index Penh plus élevé que les souris ayant subi une première immunisation orale bien que la différence soit non significative statistiquement. EXEMPLE 3: La deuxième immunisation nasale (sensitisation) induit une forte inflammation pulmonaire. Les poumons de souris immunisées oralement ne possèdent pas de signe d'inflammation lorsqu'elles sont analysées dix jours après l'immunisation (score moyen 1, figures 3A et 3C). En revanche, les poumons de souris immunisées nasalement avec des extraits d'arachide plus CT possèdent une inflammation modérée (score moyen 3,3, figures 3A et 3C). De plus, la densité de cellule est plus élevée dans le BALF de souris immunisées nasalement (20 x 104 cellules par ml) par rapport à des souris immunisées oralement (1 à 9 104) figure 3A. Le BALF des deux groupes de souris contient surtout des cellules mononucléaires. Le BALF de souris immunisées oralement contient peu de lymphocytes et peu de macrophages alors que le BALF de souris immunisées nasalement contient des cellules de tailles plus importantes qui peuvent être des lymphocytes activés ou des macrophages (figure 3A). Après immunisation par un extrait d'arachide, les souris ayant subi une seconde immunisation à la fois par la voie orale et la voie nasale montrent des inflammations pulmonaires qui sont significatives lorsqu'on les compare à des souris contrôles n'ayant pas subi de seconde immunisation (figures 3B et 3C). L'inflammation pulmonaire est significativement plus 2889592 24 élevée dans les souris ayant subi une immunisation nasale par rapport aux souris ayant subi une immunisation orale (inflammation moyenne de 7,3 et 5,1 respectivement, figures 3B et 3C). De plus, le BALF des deux groupes montre un changement drastique de la composition cellulaire après administration nasale d'extrait d'arachide avec un recrutement important de cellules polymorphonucléaires. Cependant, la densité cellulaire dans le BALF de souris immunisées nasalement est encore plus forte (de dix fois: 400 x 104 cellules/ml) par rapport à ce qui observé dans le BALF de souris immunisées oralement (30 x 104 cellules/ml) (figure 3B). EXEMPLE 4: Observation du taux d'eosinophile pulmonaire La coloration de coupe histologique pulmonaire à la peroxydase cyanide-résistante, permet d'observer un grand nombre d'eosinophile dans les poumons de souris ayant subi une immunisation par voie orale par des extraits d'arachide +CT (figure 4). En revanche, les souris immunisées nasalement possèdent un taux important de neutrophile pulmonaire, et un taux d'eosinophile moins important (figure 4). Aucun eosinophile n'a été détecté dans les poumons de souris immunisées avec du PBS ou non immunisées. EXEMPLE 5: Réponse cytokine et chemokine dans les poumons de souris avant et après administration nasale d'extrait d'arachide. Avant la deuxième administration nasale (challenge nasal), les souris ayant subi une première administration ou orale d'extrait d'arachide plus CT possèdent des niveaux de cytokine Th1 et Th2 similaires. Des taux de ARNm IL-1 R importants suivis par des taux moyens de CCL-11 et IL-17 et des taux faibles de IL-5, IL-13 et IFN-y et -4 ont été mesurés dans les poumons des deux groupes (figure 5A). En revanche, une augmentation significative d'IL-4, d'IFNy et CCL11 ARNm a été détectée après seconde immunisation nasale de souris préalablement immunisées par la voie orale ou nasale (figure 5A). On observe que l'augmentation des cytokines de type Th2 associées (IL-4, A CP nasale/orale = 2,33) et CCL-11 (A CP 2889592 25 orale/nasale = 1,30) et plus important dans des souris immunisées oralement alors que l'augmentation de cytokines associées à Th1 (IL-17 est plus élevée (A CP nasale/orale = 2,27) dans des souris immunisées nasalement. Puisque l'ARNm des cytokines associées aux lymphocytes TCD4+ sont les plus régulées après la deuxième immunisation nasale, la contribution des cellules TCD4+ a été étudiée. Des cellules TCD4+ pulmonaires purifiées provenant de souris immunisées nasalement expriment des taux d'ARNm significativement plus élevés pour les réponses de type Th1 (IFN-y (figure 5B). D'autre part, des taux d'ARNm associés à une réponse de type Th2 (cytokines IL-4 et CCL11 ont été observés dans les cellules TCD4+ pulmonaires de souris immunisées oralement (figure 5B). Avant la seconde immunisation, le BALF de souris oralement ou nasalement immunisées avec des extraits d'arachide possèdent des taux d'IL-4 et d'IL6 faibles et similaires, et le taux d'IL-1 R est en-dessous du seuil de détection (figure 5C). La seconde administration nasale d'extrait d'arachide augmente de manière significative la sécrétion d'IL-4 dans le BALF de souris préalablement immunisées oralement mais non nasalement. En revanche, seules les souris immunisées nasalement possèdent une augmentation significaive de la sécrétion d'IL-1 (3 et d'IL-1-6 dans le BALF après seconde immunisation nasale par u n extrait d'arachide (figure 5C). EXEMPLE 6: Une seconde immunisation par voie nasale induit un recrutement important de macrophaqes pulmonaires. Du fait que le taux d'IL-6 est très important dans le BALF de souris immunisées nasalement, le phénotype des cellules qui contribuent à la réponse pulmonaire après seconde immunisation nasale a été étudié en détail. La seconde immunisation nasale induit un recrutement d'un nombre important de macrophages dans les poumons des souris immunisées oralement et nasalement (figure 6). En fait, le pourcentage de macrophages pulmonaires augmente d'environ 9% avant la seconde immunisation jusqu'à 30% après la seconde immunisation dans des souris préalablement immunisées oralement. Les macrophages représentent également plus de 60% de cellules pulmonaires après la seconde immunisation nasale de souris préalablement immunisées nasalement. En particulier, 30% des macrophages recrutés dans les poumons des souris immunisées oralement expriment de hauts niveaux de molécules du CMH de classe II. Par comparaison, seuls 10% des macrophages recrutés après la seconde immunisation nasale expriment de hauts niveaux de CMH de classe II dans les poumons de souris immunisées nasalement. EXEMPLE 7: Inflammation pulmonaire de souris immunisées avec de l'arachide ou des antiqènes non liés à l'arachide. Des souris nasalement ou oralement immunisées avec des extraits d'arachide réagissent différemment à une seconde immunisation avec des protéines sans rapport avec l'arachide in vivo. En fait, de faibles niveaux d'inflammations pulmonaires ont été observés lorsque des souris immunisées oralement ont subi une seconde immunisation avec OVA, Der f ou des protéines de type Blatte (figure 7). En revanche, une seconde immunisation par voie nasale avec de la nourriture ou des antigènes environnementaux sans rapport avec l'arachide induisent une inflammation pulmonaire importante dans des souris ayant subi une première immunisation nasale avec des extraits d'arachide. REVENDICATIONS 1. Procédé pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a) immuniser un mammifère monogastrique par administration orale ou nasale d'un extrait protéique d'arachide; b) administrer, par voie nasale, la composition à tester audit mammifère immunisé à l'étape a) ; c) sacrifier le mammifère immunisé obtenu à la fin de l'étape b) ; d) détecter chez ledit mammifère immunisé au moins l'un des paramètres suivants: (i) la présence d'une inflammation pulmonaire de type allergique; ou (ii) la présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester; ou (iii) l'augmentation du rapport (x)/(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou COU 1, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-y et l'IL- 1 R, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée; (iv) l'augmentation du rapport pondéral IgGl/IgG2a, par rapport à un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape a) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée, la détection d'au moins l'un des paramètres (i), (ii) ou (iii) ci-dessus étant indicative de l'aptitude de la composition testée à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mammifère monogastrique est choisi parmi un rongeur, le veau pré-ruminant, le porc, le cheval et l'âne. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le rongeur est choisi parmi la souris, le rat, le cobaye et le lapin. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la souris appartient à une lignée choisie parmi les lignées C57BL/6 et BALB/c. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'à l'étape a) on immunise le mammifère monogastrique par administration orale d'une combinaison d'un extrait protéique d'arachide et d'un composé adjuvant de l'immunité. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'adjuvant de l'immunité est choisi parmi la toxine de choléra (CT), l'entérotoxine labile de E. col/ (LT). 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape b) d'administration nasale de la composition à tester est effectuée dans un intervalle de temps allant du Jour 12 au Jour 20, avantageusement du Jour 14 au Jour 18, et préférentiellement du Jour 15 au Jour 16, suivant l'étape a) d'immunisation orale. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape d), la présence d'une inflammation pulmonaire de type allergique est détectée par comptage des oesinophiles sur une coupe histologique du tissu pulmonaire dudit mammifère 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la présence d'anticorps plasmatiques d'isotype IgE reconnaissant un ou plusieurs antigènes contenus dans la composition à tester est détectée par une méthode immuno- enzymatique du type ELISA. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'augmentation de l'expression d'une cytokine choisie parmi IL-4, IL-5, IL- 10, IL-13 CCL11, l'IFN-y et IL113 est détectée par quantification de l'ARN 29 2889592 messager correspondant dans un échantillon de tissu pulmonaire dudit mammifère. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la composition à tester consiste en une composition destinée à l'alimentation de l'homme ou d'un mammifère monogastrique non humain. 12. Mammifère monogastrique non humain utilisable pour tester l'aptitude d'une composition à provoquer, chez un mammifère monogastrique, une réaction allergique croisée avec un allergène dérivé de l'arachide, ledit mammifère monogastrique non humain étant caractérisé en ce que: (i) il est immunisé par administration orale ou nasale d'un extrait protéique d'arachide, (ii) il possède des anticorps plasmatiques d'isotype IgE dirigés à l'encontre d'antigènes contenus dans un extrait protéique d'arachide; (iii) il possède une inflammation pulmonaire de type allergique; (iv) il possède, après administration par voie nasale de ladite composition à tester, un rapport (x)/(y) dans lequel: (x) représente le niveau d'expression ou de production d'une 20 cytokine choisie parmi l'IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 ou CCL11, et (y) représente le niveau d'expression ou de production d'une cytokine choisie parmi IFN-'y et I'IL-1 1i, plus élevé que celui d'un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape (i) mais auquel la composition à tester n'a 25 pas été administrée; (v) il possède après administration par voie nasale de ladite composition à tester un rapport pondéral IgG1/IgG2a plus élevé que celui d'un mammifère monogastrique de la même espèce immunisé selon l'étape (i) mais auquel la composition à tester n'a pas été administrée.