Brevet FR2894583A1 — publié le 20070615

L'invention concerne la recherche de la doxycycline dans l'urine ou le plasma humain ou animal. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à la préparation d'un haptène composé de doxycycline liée à l'albumine bovine sérique (BSA) pour permettre la production d'anticorps anti-doxycycline dans le but de détecter la doxycycline par une réaction immunologique. La doxycycline est un antibiotique de la classe des tétracyclines de seconde génération et est utilisée, notamment, pour le traitement et la chimioprophylaxie antipaludique. Il s'agit de la désoxy6 hydroxy-5 tétracycline, de formule brute C22H24N2O8. Depuis 2002, dans les armées, la prévention du paludisme résistant à la chloroquine est assurée en partie par l'utilisation de la doxycycline à raison de 100 mg par jour. Actuellement, la vérification de l'observance de cette chimioprophylaxie repose sur la mise en oeuvre de dosage dans les urines ou le plasma de la doxycycline par des techniques complexes nécessitant un laboratoire équipé de chromatographe liquide à haute performance (HPLC). A l'évidence, ce procédé ne peut être utilisé sur le terrain. Or, pour permettre une gestion adaptée de la molécule, il semble indispensable que les médecins d'unité et l'encadrement disposent d'un test immédiat de suivi de la prise de doxycycline. Il existe des tests immunologiques sous forme de kits pour la détection des tétracyclines, commercialisés notamment sous la marque RIDASCREEN par la société Charm Sciences Inc. Ces tests sont basés sur la reconnaissance d'un antigène par un anticorps. L'antigène provient du couplage de la tétracycline avec une protéine. Cependant, la révélation de l'anticorps se fait par des moyens optiques et nécessite l'emploi d'un spectrophotomètre. En outre, ces kits sont limités à la détection des tétracyclines en général à des fins alimentaires (dans le lait, le miel, la viande) et ne sont pas adaptés à une détection sensible chez l'homme ou l'animal. Enfin, ces kits ne permettent de doser que certaines tétracyclines (tétracycline, chlortétracycline, minocycline, rolitétracycline, oxytétracycline) mais pas la doxycycline. Dans le Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1980, 217, 1, 10-14, Bahjat A., Faraj et Farouk M. Ali décrivent un antisérum contre la tétracycline produit chez des lapins immunisés par un haptène formé de tétracycline conjugué à de la BSA. Cet antisérum est très sélectif, étant donné qu'il ne réagit secondairement qu'avec la chlortétracycline et que sa réactivité secondaire avec d'autres tétracyclines, dont la doxycycline, est négligeable (1 ).La détection est réalisée par marquage radioactif des molécules. L'haptène est préparé par une réaction de Mannich, en mettant en contact la tétracycline avec la BSA, en présence de formaldéhyde. Il est connu d'appliquer la réaction de Mannich à des composés de la famille des tétracyclines, dont la structure générale est représentée sur la figure 1 ci-après, en les faisant réagir avec du formaldéhyde et des acides aminés. Le brevet américain 3 042 716 décrit des dérivés aminoalkylés obtenus par simple mise en contact en milieu aqueux et à température ambiante de ces composés avec du formaldéhyde et un acide aminé tel que la lysine. Les tétracyclines ont en commun un squelette de naphtacène constitué de 4 cycles benzéniques (A, B, C, D). L'alkylation a lieu sur le groupe amide situé en position 2 du cycle A. Ces nouveaux composés présentent une meilleure solubilité et une meilleure absorption gastro-intestinale. Par contre, dans la publication de Bahjat et al., c'est l'atome d'hydrogène situé en position 9 du cycle D qui est 5 impliqué dans la réaction. Il est indiqué que la spécificité de l'antisérum résultant est influencée par divers facteurs, tels que la taille du pont entre l'haptène et la protéine porteuse, les degrés de liberté du site de liaison sur l'haptène. La réactivité de 10 l'anticorps vis-à-vis des autres composés de la famille des tétracyclines par des substituants sur le noyau est directement proportionnelle à leur proximité avec celle de l'haptène. La plus grande affinité de l'anticorps pour l'haptène est pour la zone la plus éloignée du site 15 d'attachement de la protéine. L'introduction d'un groupe hydroxyle en position 5 du noyau B, comme dans la doxycycline (désoxy-6 hydroxy-5 tétracycline), dont la formule développée est représentée sur la figure 2 ci-après, réduit considérablement l'affinité de ces composés pour l'anticorps. 20 Le but de la présente invention est la mise au point d'un procédé d'identification de la doxycycline dans les urines ou le plasma de l'homme ou de l'animal qui soit utilisable sur le terrain sans nécessiter un appareillage complexe, et qui soit rapide, spécifique, sensible et peu onéreux. 25 Pour ce faire, on a eu l'idée de créer un composé antigénique capable d'induire la production d'anticorps anti-doxycycline. L'invention a pour objet un procédé de fabrication d'un haptène entre un dérivé de la tétracycline et l'albumine bovine sérique par une réaction de Mannich, caractérisé en ce 30 que le dérivé de la tétracycline est la doxycycline et que le procédé comprend les étapes suivantes : a) dissolution de la doxycycline et de l'albumine bovine sérique en présence de formaldéhyde à un pH compris entre 4 et 5, b) incubation du mélange de l'étape précédente à une 5 température comprise entre 25 C et 50 C pendant une durée égale ou supérieure à 12 heures, c) purification et isolement de la doxycycline couplée à la BSA par passage sur une colonne de dessalage du mélange réactionnel de l'étape précédente. 10 Selon un mode de réalisation optimisé, l'incubation est effectuée à une température de 40 C pendant 12 heures. L'étape a) est réalisée à un pH de 4,7. L'invention a également pour objet un procédé d'identification de la doxycycline dans l'urine ou le plasma 15 de l'homme ou de l'animal mettant en oeuvre un haptène tel que ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a)prélèvement d'un échantillon d'urine ou de plasma, 20 b) mise en présence de l'échantillon recueilli avec l'haptène formé entre la doxycycline et l'albumine bovine sérique, c)identification des anticorps anti-doxycycline par la technique ELISA. Comme indiqué dans l'article de Bahjat et al . précédemment 25 cité, dans les mêmes conditions expérimentales, l'identification, par ce procédé, de la doxycycline est 100 fois moins sensible par rapport à la sensibilité de la tétracycline. Il a donc fallu mettre au point des conditions opératoires 30 particulières, telles que l'acidité du milieu et la température, pour obtenir un rendement de couplage entre la doxycycline et la BSA acceptable. Le rendement de couplage a été estimé par le dosage de la doxycycline libre avant et après couplage. La doxycycline possède un hydrogène réactif en position 9 du cycle D. Ce dernier peut réagir avec un acide aminé en présence de formaldéhyde selon une réaction de Mannich. La réaction a lieu en particulier avec les résidus lysine présents en grand nombre (9% des acides aminés)de la BSA. On obtient ainsi un polymère de doxycycline-BSA. Ce polymère est une structure antigénique capable d'induire la production d'anticorps spécifiques anti-doxycycline. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples de réalisation ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif. Exemple de fabrication d'un haptène doxycycline-BSA selon l'invention : On utilise 2mg de BSA cationique lyophilisée riche en lysine connue sous la dénomination commerciale SuperCarrier Immune Modulator fabriqué par la Sté PIERCE. On dissout ce lyophilisat dans 200111 d'eau ultra-pure MilliQ fabriquée par la Sté Millipore. On obtient une solution de BSA à 10mg/1 contenant 0,1 M MES[Acide (N-morpholino)-2 éthanesulfonique], 0,15 M NaCl, des agents de stabilisation, à pH 4,7. On dissout 5mg d'hydrochlorure de doxycycline fabriqué par la Sté SIGMA dans 2001l d'une solution de tampon de liaison comprenant 100 M MES, 0,15 M NaCl, de pH 4,7. On mélange les 2001l de BSA avec les 20011l de doxycycline. On additionne au mélange 5011l d'une solution contenant 37% de 30 formaldéhyde fabriquée par la Sté SIGMA. On incube le mélange réactionnel à 40 C pendant 12 heures. On utilise une colonne de dessalage D-Salt Dextran Plastic Desalting Column fabriquée par la Sté PIERCE et on l'équilibre avec 5ml d'une solution de tampon de purification contenant 6mM PBS, 150mM NaCl, de pH 7,2. On dépose sur la colonne la totalité du mélange réactionnel. On récupère la totalité de l'échantillon dans un l r tube (fraction non tamisée). On dépose successivement, toujours au centre de la colonne, 17 fois 1ml de tampon de purification. On recueille à chaque fois les fractions qui sortent de la colonne dans les tubes numérotés de 2 à 18. On dose la protéine pour identifier les fractions d'intérêt. L'estimation du rendement de ce couplage a été réalisée par chromatographie à haute pression (HPLC). Le calcul du rendement est réalisé par le dosage de la doxycycline libre. Deux séries de couplages ont été réalisées et le dosage de la doxycycline libre dans chaque échantillon a été comparé par rapport à un blanc correspondant à la purification de la doxycycline en l'absence de BSA. Les résultats figurent dans le tableau ci-dessous. 30 Fraction Série 1 Série 2 Blanc sans BSA ( g/ml) ( g/mi) ( g/ml) 1 0,00 0,00 0 2 0,00 0, 00 0 3 0,00 1,18 0 4 1,36 2,24 2,23 3,63 4,64 145,579 6 25,14 3,72 451,355 7 41,34 30,56 626,279 8 15,86 36,84 1170, 285 9 23,82 10,80 1045, 282 9,85 28,24 684,039 11 18,21 9,13 277,967 12 12,51 50,16 111,416 13 55,82 66,24 34,145 14 41,07 51,88 16,174 39,44 44,56 7,183 16 38,88 28,88 5,044 17 19,85 19,20 2,924 18 23,93 13,14 1,875 Total Le rendement varie entre 81% et 87,5%, comme indiqué dans le 5 tableau ci-après. Série Quantité de Rendement doxycycline libre (%) ( l) 1 370,73(+/-10%) 81, 0 2 401,41(+/-10%) 87, 5 Blanc sans BSA 4580 370,73 401,41 4581,777 On a ensuite cherché à valider l'hypothèse d'une réponse anti-doxycycline en immunisant des souris, selon le protocole décrit ci-dessous. Essai d'immunisation : On a procédé à un essai d'immunisation sur un lot de souris. Les souris ont reçu chacune 4 injections intra-péritonéales, à un mois d'intervalle, de 5004l d'une suspension contenant 1004g/ml de BSA-doxycycline et de l'alun à 50% en volume. L'analyse de la réponse après la dernière injection a été faite à partir d'un test ELISA de la manière suivante. Une plaque de micro-titration a été sensibilisée avec une solution contenant 104/ml sous 5O41/puits de BSA-doxycycline en présence de tampon carbonate/bicarbonate durant 12 heures à 4 C. Les sérums des souris immunisées ont été incubés pendant 2 heures à 37 C sous une dilution de 1/500, 1/1000 ou 1/1500 seuls ou en présence d'une solution de doxycycline de concentration décroissante à partir de 4011g/ml, respectivement, 40, 20, 10, 54g/ml. Enfin, la révélation a été faite par un anti-corps anti-souris conjugué à la peroxydase. Les résultats sont illustrés sur la figure 3 ci-après où les T+ représentent les témoins positifs sans doxycycline libre et les T- représentent les témoins négatifs, c'est-à-dire les puits non sensibilisés. La chute de la réponse en présence de doxycycline libre (évaluée en densité optique DO) montre qu'au décours des immunisations, on a obtenu une réponse anti-doxycycline spécifique chez la souris, ce qui valide la construction et l'hypothèse. Exemple de préparation de solutions pour le dosage urinaire de la doxycycline chez l'homme : On rappelle que la doxycycline est utilisée dans la 5 prophylaxie du paludisme résistant à la chloroquine à la posologie de 100mg/jour. Pour une prise de 200mg, le pic sérique est de 34g/ml. La concentration résiduelle à 24 heures est de 1 g/ml. La demivie sérique est de 16 à 24 heures. 10 La liaison aux protéines est supérieure à 85%. La concentration urinaire est 10 fois plus élevée que la concentration dans le sang au même instant. On prépare des solutions de doxycycline de dilution croissante contenant respectivement 100, 85, 75, 60, 50, 25, 15 20, 104g/ml, à partir d'une solution mère obtenue en dissolvant 10,8mg de doxycycline HC1 dans 10ml d'eau ultra-pure MilliQ fabriquée par la Sté Millipore. Les solutions filles sont aliquotées par volume de 2ml et mises à -80 C. 20 La préparation des échantillons d'urine se fait par centrifugation des urines à 4000 tours/mn pendant 5 minutes, puis dilution au 1/20 (5O41 d'échantillon dans 1ml d'eau ultra-pure). On injecte 804l des dilutions au 1/20 préparées précédemment 25 dans un chromatographe HPLC. REVENDICATIONS 1-Procédé de fabrication d'un haptène entre un dérivé de la tétracycline et l'albumine bovine sérique par une réaction de Mannich, caractérisé en ce que le dérivé de la tétracycline est la doxycycline et que le procédé comprend les étapes suivantes : a) dissolution de la doxycycline et de l'albumine bovine sérique en présence de formaldéhyde à un pH compris entre 4 10 et 5, b) incubation du mélange de l'étape précédente à une température comprise entre 25 C et 50 C pendant une durée égale ou supérieure à 12 heures, c) purification et isolement de la doxycycline couplée à la 15 BSA par passage sur une colonne de dessalage du mélange réactionnel de l'étape précédente. 2-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température de 40 C pendant 20 12 heures. 3-Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée à un pH de 4,7. 25 4-Utilisation de l'haptène fabriqué selon les revendications 1 à 3 à l'identification de la doxycycline dans l'urine ou le plasma de l'homme ou de l'animal.