Brevet FR2897068A1 — publié le 20070810

Kanamycine kinase II améliorée et utilisations de celle-ci. Introduction La présente invention relève du domaine de l'enzymologie et de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration d'une kanamycine kinase II, une protéine permettant de conférer une résistance à l'antibiotique kanamycine, ainsi que son utilisation. Les antibiotiques sont des substances naturelles produites par des bactéries du sol et certains champignons qui, à faibles concentrations, agissent sur d'autres bactéries pour les détruire ou ralentir leur croissance. Chaque antibiotique possède un mode d'action spécifique. Ils peuvent ainsi : • perturber la formation de la paroi bactérienne : pénicillines, céphalosporines, • inhiber la synthèse protéique : chloramphénicol, tétracycline, aminoglycosides (streptomycine, kanamycine, néomycine...) • bloquer la réplication de l'ADN bactérien : quinolones, ou la synthèse de l'ARN: rifampicine, • modifier le métabolisme énergétique de la bactérie : sulfamides Le mécanisme d'action des aminoglycosides comme la kanamycine, par exemple, repose sur l'inhibition de la synthèse protéique. L'antibiotique se fixe sur la sous-unité 30s du ribosome (au niveau du site de reconnaissance entre le codon de l'ARNm et l'anticodon de 1'ARNt). Sa fixation au ribosome interfère avec la synthèse protéique en provoquant l'introduction de mauvais codons et un arrêt prématuré de la traduction. Pour se protéger de l'action des antibiotiques, certains microorganismes ont développé des mécanismes de résistance. Ces phénomènes de résistance reposent sur trois grands types de mécanismes biochimiques conduisant à l'inefficacité des antibiotiques : • l'inactivation de l'antibiotique lui-même. • la diminution de la perméabilité bactérienne vis-à-vis de l'antibiotique. Celui-ci est intact mais ne peut plus accéder à sa cible au sein de la bactérie, soit parce qu'il ne peut plus pénétrer, soit parce qu'il est exporté activement vers l'extérieur de la bactérie. • la modification de la cible cellulaire elle-même : l'antibiotique ne peut plus la reconnaître et s'y fixer. Le mécanisme de résistance aux aminoglycosides comme la kanamycine est principalement dû à la modification chimique de l'antibiotique. Trois classes d'enzymes bactériennes catalysant la modification des aminoglycosides ont été décrites (Walsh C. Nature. 2000, 406, 775-781 ; Mingeot-Leclercq et al. 43 (4): 727. (1999) : • les aminoglycosides 0-phosphotransférases (kinases; APHs) catalysent l'ajout d'un groupement phosphate sur un groupement hydroxyle de l'antibiotique (réaction de phosphorylation). • Les aminoglycosides nucléotidyltransférases (ANTs) catalysent l'ajout d'un groupement AMP (réaction d'adénylation). • Les aminoglycosides N-acétyltransférases (AACs) qui catalysent l'acétylation d'un groupement NH2 de l'antibiotique. Les molécules modifiées par ces enzymes ne sont plus capables de se fixer à 20 l'ARN cible et ne peuvent plus empêcher la synthèse protéique. La biologie moléculaire utilise largement depuis les années 70, des gènes de résistance à des antibiotiques (du type "inactivation de l'antibiotique") afin de sélectionner les bactéries en laboratoire. Par exemple, les gènes que l'on souhaite 25 multiplier (clonage) sont associés à un gène de résistance à un antibiotique afin de n'autoriser, en présence de l'antibiotique, que la croissance de la bactérie contenant le gène à multiplier. Certains de ces gènes de résistance sont également utilisés pour la sélection initiale en laboratoire des plantes transgéniques. Le gène de la kanamycine kinase de type II fait partie de ces gènes couramment utilisés en biologie moléculaire 30 comme marqueur (le sélection. Dans cette optique, l'obtention d'une kanamycine kinase II permettant d'avoir une résistance à des concentrations de kanamycine supérieures à la protéine sauvage serait très intéressante. En effet, il serait très utile de disposer de plasmides ayant une capacité de sélection plus marquée vis-à-vis de l'antibiotique (ici la kanamycine). Une kanamycine kinase II permettant d'obtenir une résistance à des concentrations de kanamycine supérieures à la protéine sauvage serait donc d'une grande utilité. Résumé de l'invention La présente invention concerne une kanamycine kinase II améliorée permettant d'obtenir une résistance à des concentrations de kanamycine supérieures à la protéine sauvage. Dans un premier aspect, la présente invention concerne une kanamycine kinase II améliorée, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Q15 5 W et S 114H. Dans un second aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion entre une kanamycine kinase II selon la présente invention et un polypeptide d'intérêt. Le polypeptide d'intérêt est une protéine rapporteur ou un polypeptide d'intérêt industriel ou thérapeutique ou un variant de celui-ci. De préférence, le polypeptide d'intérêt est placé à l'extrémité N-terminale de la kanamycine kinase II. Dans un troisième aspect, la présente invention concerne un acide nucléique codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention ou une protéine de fusion comprenant celle-ci. La présente invention concerne également une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide, un phage, un phagemide, et un vecteur viral. Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour sélectionner une cellule transformée/transfectée par un vecteur recombinant. Elle concerne également une méthode de sélection d'une cellule transformée/transfectée par un vecteur recombinant, la méthode comprenant la transfection/transformation d'une cellule par le vecteur recombinant ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée dans un milieu comprenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside ; et la sélection des cellules capables de pousser dans ledit milieu., caractérisée en ce que le vecteur recombinant comprend un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. La cellule peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote, comme une levure, un champignon, ou une cellule mammifère ou de plante. Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter au moins une cellule de plante avec une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape a) ; et c) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome un polynucléotide ou une cassette d'expression selon la présente invention dans un milieu contenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside. Dans un sixième aspect, la présente invention concerne une banque de variants d'un polypeptide d'intérêt, caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide codant l'un des variants du polypeptide d'intérêt fusionné en phase avec un polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Elle concerne également l'utilisation de cette banque de variants d'un polypeptide d'intérêt pour identifier ou sélectionner un variant du polypeptide d'intérêt plus soluble, plus stable ou mieux exprimé. Description des figures Figure 1 : Schéma de la construction pET11-KanK. Figure 2 : Croissance des cellules transformées par un plasmide codant une 25 kanamycine kinase II sauvage ou mutante (Q155W) en fonction de la concentration en kanamycine. Figure 3 : Croissance des cellules transformées par un plasmide codant une kanamycine kinase II sauvage ou mutante (Q155W, S 114H et Q 155 W+S 114H) en fonction de la concentration en kanamycine. 30 Figure 4 : Croissance des cellules transformées par un plasmide codant une kanamycine kinase II mutante Q155W et deux protéines de fusion TA ou TB avec la kanamycine kinase II mutante Q155W en fonction de la concentration en kanamycine. TB et TA signifient respectivement un variant soluble et insoluble de la protéine FE65. Description détaillée de l'invention La présente invention concerne donc une kanamycine kinase II améliorée, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Q155W et S 114H. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne une kanamycine kinase II améliorée, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci comprenant une substitution Q155W. Un exemple de kanamycine kinase II comprenant une substitution Q155W est décrite en SEQ ID No 4. La séquence peut comprendre en outre une autre substitution, de préférence S 114H. Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne une kanamycine kinase II améliorée, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci comprenant une substitution S 114H. Un exemple de kanamycine kinase II comprenant une substitution S 114H est décrite en SEQ ID No 6. La séquence peut comprendre en outre une autre substitution, de préférence Q155W. Par kanamycine kinase II est entendue la protéine de Klebsiella pneumoniae dont le code enzyme est EC 2.7.1.95, le numéro d'accès Genbank est U32991, et le numéro d'accès SwissProt est P00552. La kanamycine kinase II est également appelé aminoglycoside-3'--phospho-transférase-IIa, néomycine-kanamycine phosphotransférase II, APH(3')II, nptll or APH(3')-II. De préférence, la protéine présente la séquence décrite dans la SEQ ID No 2 et un exemple de séquence nucléotidique codant pour celle-ci est décrit dans la SEQ ID No 1. Par fragment fonctionnel est entendu un fragment capable d'assurer une résistance à la kanamycine. Notamment, comme la résistance à la kanamycine est due à la capacité de l'enzyme à transférer sur la kanamycine un groupement phosphate, un fragment fonctionnel est capable de phosphoryler la kanamycine. De préférence, le fragment comprend le site catalytique de l'enzyme en position 190. De préférence, le fragment comprend au moins 100 acides aminés consécutifs. En particulier, un fragment préféré peut comprendre les résidus 23-257 (domaine APH-phosphotransférase). Dans un mode de réalisation préféré, la kanamycine kinase II peut comprendre une délétion de la Méthionine en position 1. Par variant de la kanamycine kinase II est entendu un polypeptide capable d'assurer une résistance à la kanamycine, notamment capable de transférer sur la kanamycine un groupement phosphate, et qui présente au moins 90 % d'identité avec la kanamycine kinase II de Klebsiella pneumoniae ou une séquence de 100, 150 ou 200 acides aminés consécutifs de celle-ci. De préférence, le variant présente au moins 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99% avec celle-ci ou une séquence de 100, 150 ou 200 acides aminés consécutifs de celle-ci. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence ici sont établis, comme indiqué ci-dessus, à l'aide du logiciel BlastX, en utilisant les paramètres par défaut. Par Q155 W est entendu que la glutamine en position 155 dans la séquence décrite SEQ ID No 2, ou en position correspondante dans une autre séquence, est substituée par un tryptophane. Par S 114H est entendu que la sérine en position 114 dans la séquence décrite SEQ ID No 2, ou en position correspondante dans une autre séquence, est substituée par une histidine. Outre la kanamycine, la kanamycine kinase II permet d'assurer la résistance à d'autres antibiotiques du type aminoglycoside. De préférence, les autres antibiotiques du type aminoglycoside sont sélectionnés dans le groupe consistant en la néomycine, la généticine (G418). la paromomycine, la ribostamycine, la butirosine, la néamine, la paromamine, la vistamycine et la gentamicine A et B. Notamment, les antibiotiques de type aminoglycoside sont ceux qui sont sensibles à la phosphorylation par la kanamycine kinase II, c'est-à-dire que la phosphorylation les rend inactif. La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Un exemple de polynucléotide codant pour une kanamycine kinase II comprenant une substitution Q 155 W est décrite en SEQ ID No 3. Un exemple de polynucléotide codant pour une kanamycine kinase II comprenant une substitution S 114H est décrite en SEQ ID No 5. La présente invention concerne également une cassette d'expression codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Cette cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression de la kanamycine kinase II, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, le promoteur de l'ARN 35S du CaMV et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996 ; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology). Le polynucléotide peut être de l'ADN, de l'ARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Le polynucléotide peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Les polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthése chimique, la recombinaison, la mutagenèse, etc... La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique codant pour la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression de la kanamycine kinase II améliorée dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure ou un champignon ou un eucaryote supérieur comme une cellule de drosophile, de mammifère ou de plante. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide. La kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention permet la résistance à des concentrations plus élevées de kanamycine ou d'un antibiotique du type aminoglycoside. Par exemple, la concentration de kanamycine dans la culture pourra être supérieure à 150 g/ml, de préférence supérieure à 200, 250 ou 300 .tg/ml. Par exemple, la concentration de kanamycine est comprise entre 150 gg/ml et 1 mg/ml, de préférence entre 200 et 800 .tg/ml, de manière encore plus préférée entre 250 et 500 g/ml. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique codant pour la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention comme marqueur de sélection d'une cellule transformée/transfectée par un vecteur exprimant la kanamycine kinase II améliorée. La cellule hôte peut être un procaryote ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure ou un champignon ou un eucaryote supérieur comme une cellule de drosophile, de mammifère ou de plante. De préférence, la cellule n'est pas une cellule embryonnaire humaine. Ainsi, la présente invention fournit des vecteurs, de préférence des plasmides, présentant une capacité de sélection plus marquée que ceux utilisant la kanamycine kinase II sauvage. En effet, de nombreux vecteurs commerciaux comprennent un gène de résistance à la kanamycine, utile comme marqueur de sélection. La présente invention concerne donc un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide codant la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention utilisé comme marqueur de sélection. Elle concerne également l'utilisation d'un acide nucléique codant pour la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention comme marqueur de sélection d'une cellule transformée/transfectée par un vecteur exprimant la kanamycine kinase II améliorée. En effet, une sélection sur un milieu de culture contenant de la kanamycine est souvent utilisée pour des hôtes procaryotes. De même, une sélection sur un milieu de culture contenant de la néomycine (ou du G418) est souvent utilisée pour des hôtes eucaryotes (de préférence mammifères). La sélection sur néomycine est par ailleurs très souvent utilisée pour sélectionner des transfectants sables. La présente invention concerne donc l'utilisation d'un polynucléotide codant pour une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention pour sélectionner ou marquer une cellule hôte dans laquelle le polynucléotide codant pour une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention a été introduit. Le milieu de sélection sur ou dans lequel la cellule est cultivée comprend de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside. Le milieu comprend une concentration d'antibiotique telle que seules les cellules exprimant la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention peuvent survivre ou se développer. La présente invention concerne une méthode de sélection d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant, la méthode comprenant la transfection/transformation de la cellule hôte par le vecteur recombinant ; la mise en culture de la cellule hôte transfectée/transformée dans un milieu comprenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside ; et la sélection des cellules capables de pousser dans ledit milieu, dans laquelle le vecteur recombinant comprend une cassette d'expression codant pour une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Par transfection ou transformation est entendu l'introduction d'un polynucléotide dans une cellule hôte. Bien entendu, le milieu de culture comprend une concentration suffisamment élevée pour permettre de tuer les cellules hôtes n'exprimant pas la kanamycine kinase II. La transfection ou transformation de la cellule hôte est effectuée par l'une des techniques bien connues de l'homme du métier, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., Virology (1973) 52 : 456-457 ; Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 2745-2752), le DEAE Dextran (Gopal et al., Mol. Cell. Biol., (1985) 5 : 1188-1190), I'électroporation (Tur- Kaspa et al., Mol Cel. Biol, (1986) 6 : 716-718. ; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81 (22), 7161-5), la microinjection directe (Harland et al., J Cell Biol (1985) 101 : 1094-1095), les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al., Methods Enzymol (1987) 149 : 157-76 ; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 3348-3352), l'utilisation de canon à gène (Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P, p. 97-105), infection par Agrobacterium pour les cellules de plantes. Un gène de résistance à des concentrations très élevés d'antibiotique pourrait se révéler très utile lorsqu'une très forte concentration de cellules, en particulier de bactéries, est utilisée. En effet, dans le domaine de l'évolution des protéines, il est souvent nécessaire de préparer un très grand nombre de mutants d'un polypeptide. Ainsi, des concentrations extrêmement élevées de bactérie sont utilisés (par exemple, >109 bactéries/ml de milieu). Ces concentrations impliquent l'utilisation de fortes concentrations d'antibiotique, qui à ce jour, ne pouvaient être mis en oeuvre par défaut d'un gène de résistance à un antibiotique suffisamment puissant. La kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention permettra la mise en culture de cellules hôte, en particulier des hôtes bactériens, dans des milieux à très haute concentration d'antibiotique. Ainsi, la présente invention concerne des milieux de culture comprenant une forte concentration d'antibiotique de type aminoglycoside. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique est la kanamycine. Le milieu de culture comprend plus de 100 ou 150 .tg/ml, de préférence plus de 200, 250 ou 300 gg/ml. Par exemple, la concentration d'antibiotique peut être comprise entre 150 g/ml et 1 mg/ml, de préférence entre 200 et 800 g/ml, de manière encore plus préférée entre 250 et 500 g/ml. Par ailleurs, la sélection par la kanamycine ou la paromycine est la sélection la plus couramment utilisée pour la sélection de cellules de plante, notamment pour la préparation de plantes transgéniques. Par exemple, l'introduction de la cassette d'expression dans la bactérie Agrobacterium est souvent réalisée en utilisant comme vecteur le plasmide Ti (ou T-DNA), qui peut être transféré dans la bactérie par exemple par choc thermique. La cassette d'expression d'une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention est insérée entre les bordures gauche et droite de l'ADN de transfert (T-DNA) d'un plasmide Ti désarmé pour le transfert dans des cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens. La présente invention concerne donc un procédé d'obtention d'une plante transformée caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter au moins une cellule de plante avec une cassette d'expression ou avec un vecteur recombinant exprimant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention ; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape a) ; et c) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome une cassette d'expression selon l'invention dans un milieu contenant un antibiotique du type aminoglycoside, de préférence la kanamycine ou la paromycine. De préférence, la cassette d'expression ou le vecteur recombinant comprend en outre un polynucléotide d'intérêt. La méthode peut en outre comprendre les étapes supplémentaires suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes homozygotes pour le polynucléotide d'intérêt. La présente invention concerne en outre une protéine de fusion comprenant un polypeptide d'intérêt ou un variant de celui-ci et une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci. Le polypeptide d'intérêt peut être attaché à l'extrémité N-terminale ou C-terminale de la kanamycine kinase II. Facultativement, la protéine de fusion peut comprendre un espaceur polypeptidique entre le polypeptide d'intérêt et la kanamycine kinase II. L'espaceur peut comprendre entre 2 et 15 résidus neutres, de préférence 7 à 10 résidus, ne comprenant pas de site de clivage par les protéases. Il est également préférable qu'il soit flexible et hydrophile (Sieber V., Methods Mol Biol., vol.230, p.45-55, 2003 ; Brevet US 6,448,087). Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide d'intérêt est attaché à l'extrémité N-terminale de la kanamycine kinase II. La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour une protéine de fusion selon la présente invention, les vecteurs d'expression comprenant ces polynucléotides, et l'utilisation de ceux-ci pour sélectionner une cellule transformée/transfectée. Le polynucléotide d'intérêt peut être un gène marqueur ou rapporteur. En effet, la littérature décrit plusieurs protéines de fusion comprenant un marqueur de sélection et une protéine rapporteur. Ces protéines de fusion présentent l'avantage de sélectionner les cellules transformées/transfectées et de permettre la détection de ces cellules. Ainsi, la présente invention concerne une protéine de fusion entre une protéine rapporteur et une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention, ainsi que les polynucléotides codant une telle protéine de fusion, les vecteurs d'expression comprenant ces polynucléotides, et l'utilisation de ceux-ci pour sélectionner et/ou détecter une cellule transformée/transfectée. Par exemple, la protéine rapporteur peut être sélectionnée dans le groupe consistant en, une protéine fluorescente comme GFP (Ref : AAC53684), YFP (Ref. : AAQ96629), CFP (Ref : AAQ96626), EGFP (Ref : AAY25376), DsRed (Ref : Q9U6Y8), une enzyme dont l'activité peut être aisément détectée comme la luciférase (Ref : AAC79853), la 13-glucuronidase (Ref : AAO84032), la phosphatase alcaline (par ex. SEAP, Ref : AAB64404) ou la (3-galactosidase, un antigène reconnu spécifiquement par un anticorps ou de manière générale, tout peptide ou polypeptide capable d'être reconnu par un ligand spécifique. De préférence, la protéine rapporteur est placée à l'extrémité N-terminale de la kanamycine kinase II. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide codant une protéine de fusion entre un polypeptide codé par un ADNc et la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention pour préparer une banque d'ADNc. En effet, l'utilisation de cette protéine de fusion permet de sélectionner les ADNc correctement clonés, notamment qui permettent l'expression du polypeptide codé par l'ADNc. Ainsi, la présente invention concerne une banque d'expression d'ADNc, dans laquelle les ADNc sont clonés de manière à obtenir une protéine de fusion entre le polypeptide codé par l'ADNc et la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, la banque d'expression est adaptée à une expression dans un hôte procaryote, de préférence E. coli. Cette banque comprend donc la séquence d'un ADNc fusionné en phase avec un polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. La présente invention comprend en outre une méthode de préparation d'une banque d'ADNc comprenant le clonage des ADNc en phase avec un polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention puis une sélection des clones montrant une résistance à la kanamycine ou un autre antibiotique du typeaminoglycoside. De préférence, l'ADNc est introduit en amont du polynucléotide codant la kanamycine kinase II selon la présente invention. Un exemple de méthode est décrit en détail dans Davis et Benzer (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2128-2132), le contenu de ce document étant incorporé par référence. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide codant une protéine de fusion entre un polypeptide d'intérêt et la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention pour préparer une banque de mutants du polypeptide d'intérêt. De façon alternative, une banque de mutants du polypeptide d'intérêt peut être modifiée dans une premier temps, pour être ensuite intégrée dans une construction, résultant ainsi en une banque de mutants du polypeptide d'intérêt fusionnés à la kanamycine kinase II améliorée. Le polypeptide d'intérêt peut être par exemple une cytokine, une enzyme, ou tout autre polypeptide/protéine présentant un intérêt industriel ou thérapeutique. Les protéines de fusion selon la présente invention sont utiles comme système de sélection pour identifier des variants plus solubles d'une protéine ou d'un polypeptide d'intérêt. Il a en effet été observé que lorsqu'on fusionne une protéine ou un polypeptide d'intérêt à une protéine rapporteur, la conformation de l'une et de l'autre sont liées. Une conformation incorrecte de la protéine située du côté NH2 est ainsi corrélée à une conformation également incorrecte de la protéine localisée à l'extrémité COOH. L'inverse n'est généralement pas vrai : c'est la conformation de l'extrémité NH2 de la protéine qui influe sur l'ensemble. La conformation de la protéine étant mise en place de façon concomitante à sa synthèse, et celle-ci ayant lieu de l'extrémité NH2 vers l'extrémité COOH, on peut comprendre que la conformation globale de la protéine dépend de la conformation acquise par le premier segment synthétisé. Ces effets de conformation lors de la synthèse sont parfois décrits sous le terme de nucléation . La kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention est donc utile pour développer une technique simple permettant de sélectionner de façon sensible et fiable les mutants de solubilité, de stabilité ou d'expression présents dans une banque. La présente invention concerne donc une technique permettant d'obtenir des mutants d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt présentant une solubilité ou une stabilité améliorée ou associés à un niveau d'expression supérieur. Le procédé selon l'invention est caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène codant la protéine ou le peptide d'intérêt fusionné en phase avec un polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention, et par l'utilisation comme crible sélectif d'un milieu solide ou liquide contenant une concentration de kanamycine stringeante. Les variants exprimés sous une forme soluble permettent à la bactérie de survivre en présence de kanamycine ou d'un autre antibiotique du type aminoglycoside. De manière surprenante, contrairement au système de fusion avec la CAT, cette sélection directe par survie est remarquable en ce qu'on obtient une discrimination très nette entre les différents variants de la protéine, ce qui permet la sélection directe des clones exprimant les variants solubles ou mieux exprimés de la protéine ou du peptide d'intérêt. L'utilisation de la kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention permet l'utilisation de concentration plus importante de kanamycine ou d'un autre antibiotique du type kanamycine, et par conséquent une sélection plus rapide et stringeante des variants solubles ou mieux exprimés. Ainsi, la présente invention concerne un procédé d'obtention de variants solubles, stables ou mieux exprimés d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt, caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène codant pour ladite protéine ou ledit peptide d'intérêt fusionnés au polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention dans un vecteur d'expression, et par la sélection des gènes mutants correspondant à des protéines ou des peptides plus solubles, plus stables ou mieux exprimées par culture des bactéries transformées par ladite banque de vecteurs d'expression dans un milieu de culture contenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside. En particulier, le vecteur d'expression est un vecteur d'expression procaryote. Facultativement, celui-ci peut comprendre les éléments permettant également une expression dans un hôte eucaryote. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend : i) Génération de mutants d'un gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt ; ii) Préparation d'une banque de mutants par clonage des mutants obtenus en i) en phase avec le polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention dans un vecteur d'expression ; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii) ; et iv) Sélection, en utilisant un milieu de culture contenant de la kanamycine, des bactéries ayant été transformées par un vecteur comprenant un mutant correspondant à une protéine ou un peptide d'intérêt mutant(e) plus soluble, plus stable ou mieux exprimé(e) que la protéine d'intérêt de départ. De préférence, les mutants sont générés à l'étape i) par mutagenèse aléatoire. Dans une alternative également préférée, les mutants sont générés à l'étape i) par recombinaison de gènes. Dans un autre mode de réalisation, le procédé comprend : i) Fabrication d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt fusionné en phase avec le polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention ; ii) Génération d'une banque de mutants du gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt sur le vecteur d'expression obtenu en i) ; iii) Transformation de bactéries compétentes par la banque de mutants obtenue en ii). iv) Sélection, en utilisant un milieu de culture contenant de la kanamycine, des bactéries ayant été transformées par un vecteur comprenant un mutant correspondant à une protéine ou un peptide d'intérêt mutant(e) plus soluble, plus stable ou mieux exprimé(e) que la protéine d'intérêt de départ. De préférence, les mutants sont générés à l'étape ii) par mutagenèse massive. Facultativement, le gène codant pour la protéine ou le peptide d'intérêt et le polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention sont séparés par un espaceur ne changeant pas la phase de lecture. De préférence, les bactéries sont transformées par électroporation ou par choc thermique. Le milieu de culture contenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside peut être solide ou liquide. De préférence, le milieu de culture contient une quantité de kanamycine ou d'un autre antibiotique du type aminoglycoside stringeante. De préférence, l'antibiotique utilisé est la kanamycine. La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un vecteur d'expression codant une protéine de fusion entre un mutant d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt et le polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention pour sélectionner un variant de cette protéine ou de ce peptide, de préférence présentant une solubilité ou une stabilité améliorée ou une expression augmentée. Le procédé de l'invention est un procédé d'obtention ou de sélection de mutants d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt plus solubles, plus stables ou mieux exprimés chez les bactéries, caractérisé par le fait qu'il contient les étapes suivantes dans cet ordre ou dans un ordre différent : i) On construit un plasmide contenant le gène d'intérêt, fusionné au polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. L'ensemble est placé sous la dépendance d'un promoteur bactérien. ii) On introduit des mutations au niveau du gène d'intérêt. iii) On transforme des bactéries compétentes avec ces constructions. iv) On sélectionne, en utilisant une concentration stringeante de kanamycine d'un autre antibiotique du type aminoglycoside, les mutants ayant acquis une solubilité, une stabilité ou un niveau d'expression augmentés. En particulier, les étapes i) et ii) peuvent être inversées. Dans un mode de réalisation particulier, on peut éventuellement réaliser une étape supplémentaire iii)bis avant l'étape iv) afin de présélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide. On utilise alors la résistance à un antibiotique autre que la kanamycine, tel que l'ampicilline. Dans ce mode de réalisation, le vecteur utilisé devra contenir en outre une cassette d'expression contenant le gène de résistance à l'antibiotique retenu (l'ampicilline par exemple), et le promoteur en permettant l'expression. Lors de l'étape i), le polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention peut être fusionné à la protéine en N-terminal ou en C-terminal de la protéine d'intérêt. Dans un mode de réalisation préféré, ce gène de résistance est fusionné en C-terminal de la protéine d'intérêt, la conformation générale de la protéine étant principalement gouvernée par son extrémité NH2. L'introduction des mutations à l'étape ii) peut être réalisée en utilisant l'une des méthodes de mutagenèse existantes. Dans un premier mode de réalisation, on utilise la mutagenèse aléatoire. Dans un deuxième mode de réalisation, on utilise la recombinaison d'ADN pour générer la diversité (US 6 132 970 ; Stemmer WP. et al, Nature, vol.370, p.389-391, 1994 ; Aguinaldo AM. et al, Methods Mol Biol., vol.192, p.235-239, 2002 ; Zhao H. et al, Nat Biotechnol., vol.16, p.258-261, 1998 ; Shao Z. et al, Nucleic Acids Res., vol.26, p.681-683, 1998 ; Kawarasaki Y. et al, Nucleic Acids Res., vol.31, 2003 ; US 5 965 408 ; WO 00 09 679 ; WO 02 48 351). Dans un troisième mode de réalisation, on peut utiliser la mutagenèse dirigée pour générer la diversité. Dans un quatrième mode de réalisation, on peut utiliser Massive Mutagenesis (FR2813314). Lors de l'étape iii), la transformation peut être réalisée selon différentes techniques et principalement en utilisant une approche par choc thermique ou par électroporation. C'est notamment la taille de la diversité à obtenir qui orientera sur l'une ou l'autre de ces deux approches : la technique par électroporation permet en effet d'obtenir un nombre de transformants supérieur. De même, différents types de bactéries peuvent être utilisés tels que E. coli, Streptomyces, Bac illus et Thermus thermophilus. Le choix se fera selon les conditions de culture, la protéine à exprimer et la quantité à produire. Dans le mode de réalisation le plus classique, c'est E. Coli qui est le plus souvent utilisé. A l'étape iv), on aura préalablement déterminé la concentration stringeante de kanamycine ou d'un autre antibiotique du type aminoglycoside à ajouter. Cette concentration sera déterminée par des tests utilisant la construction plasmidique contenant le gène d'intérêt non mutant fusionné au polynucléotide codant une kanamycine kinase II améliorée selon la présente invention. La concentration stringeante sera suffisamment élevée pour ne plus permettre aux bactéries transformées par cette construction de pousser, ou pour ne leur permettre qu'une croissance ralentie. Dans ces conditions, les bactéries exprimant un variant plus soluble auront un taux de croissance accéléré. Dans un premier mode de réalisation, les cultures de la banque de mutants transformés seront faites en milieu liquide : la sélection des mutants les plus solubles se fera alors selon la vitesse de pousse. Dans un deuxième mode de réalisation, elles peuvent aussi se faire en milieu solide : la sélection se fera en fonction du nombre et de la taille des colonies. Exemples Exemple 1 Le gène codant pour la kanamycine kinase II (APH(3')-IIa) a été cloné dans les sites Ncol et NotI du vecteur pET 11 (Novagen) derrière le promoteur T7 pour donner la construction appelée pET11-KanK (Figure 1). Une banque de mutants de la kanamycine kinase a ensuite été construite grâce à la technologie Massive Mutagenesis (FR2813314); une diversité totale a été introduite sur chaque position. 3 tours de mutagenèse ont été réalisés pour obtenir une banque avec une diversité finale de 5.106 clones. La souche utilisée était E. coli DH10B. Le séquençage de 24 clones pris au hasard a mis en évidence un nombre moyen de mutations par molécule de 2,5. De plus, il n'y avait pas de biais majeur dans les séquences. La banque a ensuite été transformée dans la souche E. coli BL21(DE3) pour permettre l'expression de la kanamycine kinase et étalée sur différents milieux : milieux non sélectifs : ampicilline 100 g/ml et kanamycine 25 gg/ml pour estimer l'efficacité de transformation de la banque milieu de sélection : kanamycine 300 g/m1 pour permettre la sélection de mutants résistants à des concentrations élevées en kanamycine Le nombre de clones après transformation a été estimé à 1.1o' par dénombrement sur milieu ampicilline. Le milieu contenant 300 gg/ml de kanamycine a permis de sélectionner 170 clones. Après minipréparation des plasmides isolés de 12 d'entre eux, une étape de séquençage a été réalisée grâce aux oligos T7pro et T7ter. La séquence des 12 clones a permis de mettre en évidence une seule et unique mutation sur la position 155 où un résidu glutamine est remplacé par un résidu tryptophane. CAG ù TGG Gln (Q) ù* Trp (W) Ce mutant Q155W a ensuite été reconstruit sur la matrice pET11-KanK par mutagénèse dirigée. La croissance en milieu liquide de ce mutant en présence de différentes concentrations en kanamycine a alors été comparée à celle du WT. Brièvement, des concentrations croissantes de kanamycine sont ajoutées à des cultures d'E.coli BL21(DE3) transformées par pET 11, pET 11-KanK et pET 11-KanK Q 155 W diluées jusqu'à une DO600nm de 104. Après 15h de croissance à 37 C, les DO des différentes cultures ont été mesurées. Le résultat est présenté dans la Figure 2. La structure de la kanamycine kinase II étant connue (Nurizzo et al., 2003), on peut placer la mutation dans la structure de l'enzyme. Le résidu Q155 est placé sur une boucle flexible (résidus 151-166) qui borde la cavité de fixation du substrat kanamycine. Sur cette boucle, sont également présents des résidus cruciaux pour l'activité de l'enzyme comme D159 et E160. La proximité de ce résidu par rapport au site actif peut donc expliquer une augmentation de l'activité de l'enzyme. Une nouvelle banque a ensuite été construite avec le mutant pET11-KanK Q155W comme matrice de départ. Le protocole suivi est le même que lors de la première étape de mutagenèse (3 tours successifs, séquençage 24 clones pour le contrôle qualité). Après transformation en BL21(DE3), la banque a été sélectionnée sur 1 mg/ml de kanamycine pour isoler des variants encore résistants à la kanamycine que le Q155W. Après séquençage de quelques clones repiqués sur milieu sélectif, une nouvelle mutation apparaît : la sérine 114 est mutée en Histidine. TCC ù> CAC Ser (S) ù> His (H) Ce nouveau mutant a été construit par mutagenèse dirigée sur une matrice pET 11-KanK (simple mutant S114H) et sur une matrice pET 11-KanK_Q 155 W (double mutant Q155W, S114H). Le résultat du test de croissance en milieu liquide des différents mutants et du WT est présenté sur la Figure 3. L'EC50 pour chaque clone a été définie comme la concentration de kanamycine pour laquelle la DC) mesurée correspond à 50% de la DO maximale. Dans ces conditions (dilution 10-6 pour l'inoculum de départ), le calcul des EC50 est le suivant : EC50 ( g/ml) Facteur d'amélioration / WT pET11-KanK (WT) 47 pET 11-KanK::Q 15 5 W 170 3,6 pET 11-KanK:: S 114H 320 6,4 pET11-KanK::Q155W,S114H 720 14,4 Le facteur d'amélioration est important. En effet, il est compris entre 3 et 7 pour les mutants simples et est supérieur à 14 pour le mutant double: l'effet des deux mutations semble sub-additif. 10 Exemple 2 Les gènes codant pour un variant soluble (TB) et un variant insoluble (TA) de la protéine FE65 ont été introduits dans le plasmide pET11. La construction a été faite de façon à fusionner ladite protéine à la kanamycine kinase possédant la mutation Q155W. 15 On a obtenu les constructions suivantes: - pET11_KanK:Q155W : plasmide pET11 dans lequel est clonée la séquence de la kanamycine kinase mutée sur la position 155 (Q155W) - pETI l_TA-KanK:Q155W : plasmide pET11 dans lequel est clonée le variant insoluble de FE65 fusionné à la séquence de la kanamycine kinase mutée sur la 20 position 155 (Q155W) - pETI l_TB-KanK:Q155W : plasmide pET11 dans lequel est clonée le variant soluble de FE65 fusionné à la séquence de la kanamycine kinase mutée sur la position 155 (Q155W) Des bactéries E. Coli BL21 DE3 ont ensuite été transformées par choc 25 thermique, puis incubées en milieu liquide contenant de l'ampicilline à l00 1/ml à 37 C pendant 12h. Après 12h de culture, 10"6 UOD ont été utilisées pour ensemencer des cultures contenant une concentration variable de kanamycine (gamme d'antibiotique5 kanamycine allant de 40011g/ml à 12,51ag/ml). On a incubé les cultures et mesuré la DO au spectrophotomètre à 600nm, de façon à mesurer la croissance bactérienne. On a alors constaté une différence de résistance d'un facteur 4 entre le variant soluble (demi-résistance = 156 g / ml) et le variant insoluble (demi-résistance = 39 g / ml) (Figure 4). Ces résultats ont démontré que le gène de résistance à la kanamycine muté sur la position 155 est utilisable comme rapporteur de la solubilité d'une protéine lui étant fusionnée. La différence d'un facteur 4 entre le variant soluble et insoluble montre que le système est d'un grande sensibilité. Description des SEQ ID Nos SEQ ID No 1 : polynucléotide codant la KK. SEQ ID No 2 : séquence aa de la KK. SEQ ID No 3 : polynucléotide codant KK Q155W SEQ ID No4:KKQ155W SEQ ID No 5 : polynucléotide codant KK S 114H SEQ ID No 6 : KK S 114H Revendications 1- Kanamycine kinase II améliorée, un variant ou un fragment fonctionnel de celle-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant 5 en Q155W et S114H. 2- Protéine de fusion entre une kanamycine kinase II selon la revendication 1 et un polypeptide d'intérêt. 10 3- Protéine de fusion selon la revendication 2, dans laquelle le polypeptide d'intérêt est une protéine rapporteur ou un polypeptide d'intérêt industriel ou thérapeutique ou un variant de celui-ci. 4- Protéine de fusion selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle le polypeptide 15 d'intérêt est placé à l'extrémité N-terminale de la kanamycine kinase H. 5- Acide nucléique codant une kanamycine kinase [I améliorée selon la revendication 1 ou une protéine de fusion selon l'une des revendications 2 à 4. 20 6- Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 5. 7- Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon la revendication 5 ou une cassette d'expression selon la revendication 6. 25 8- Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur est sélectionné parmi un plasmide, un phage, un phagemide, et un vecteur viral. 9- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 5, d'une cassette d'expression selon la revendication 6 ou d'un vecteur selon la revendication 7 ou 8 pour 30 sélectionner une cellule transformée/transfectée par un vecteur recombinant. 21 10- Méthode de sélection d'une cellule transformée/transfectée par un vecteur recombinant, la méthode comprenant la transfection/transformation d'une cellule par le vecteur recombinant ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée dans un milieu comprenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside ; et la sélection des cellules capables de pousser dans ledit milieu. caractérisée en ce que le vecteur recombinant comprend un acide nucléique selon la revendication 5 ou une cassette d'expression selon la revendication 6. 11- Utilisation selon la revendication 9 ou méthode selon la revendication 10, dans laquelle la cellule transformée/transfectée est une cellule procaryote ou une cellule eucaryote, comme une levure, un champignon, ou une cellule mammifère ou de plante. 12- Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter au moins une cellule de plante avec une cassette d'expression selon la revendication 6 ou avec un vecteur selon la revendication 7 ou 8; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape a) ; et c) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon la revendication 5 ou une cassette d'expression selon la revendication 6 dans un milieu contenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside. 13- Banque de variants d'un polypeptide d'intérêt, caractérisée en ce qu'elle comprend un polynucléotide codant pour l'un des variants du polypeptide d'intérêt fusionné en phase avec un acide nucléique selon la revendication 5. 14- Utilisation d'une banque de variants d'un polypeptide d'intérêt selon la revendication 13 pour identifier ou sélectionner un variant du polypeptide d'intérêt plus soluble, plus stable ou mieux exprimé. 30 15- Procédé d'obtention de variants solubles d'une protéine ou d'un peptide d'intérêt, caractérisé par la génération d'une banque de mutants du gène codant pour ladite protéine ou ledit peptide d'intérêt fusionnés à un acide nucléique codant une kanamycine kinase II améliorée selon la revendication 5 dans un vecteur d'expression,25et par la sélection des gènes mutants correspondant à des protéines ou des peptides plus solubles par culture des bactéries transformées par ladite banque de vecteurs d'expression dans un milieu de culture contenant de la kanamycine ou un autre antibiotique du type aminoglycoside.5