Brevet FR2881753A1 — publié le 20060811

La présente invention concerne la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques, notamment dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux cellulosiques ou ligna-cellulosiques. Depuis les années 1970, la transformation de la biomasse lignocellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de nombreux travaux. Les bois de feuillus et les pailles de céréales sont les substrats les plus utilisés. Ils sont constitués pour la plupart d'environ 40 à 50 % de cellulose, 20 à 25 % d'hémicellulose et de 15 à 25 % de lignine. D'autres ressources, cultures forestières dédiées, résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, résidus de l'industrie papetière et des produits de transformation des matériaux cellulosiques et lignacellulosiques sont utilisables. De ces trois polymères, cellulose, hémicellulose et lignine, la cellulose est la principale source de sucres fermentescibles en éthanol car elle est constituée de glucose, ce dernier étant facilement fermenté en éthanol par Saccharomyces cerevisiae dans des procédés industriels éprouvés et performants. Les pentoses contenus dans les hémicelluloses ne sont pas efficacement convertis en éthanol. D'autres microorganismes parmi les genres Saccharomyces, Pichia, Candida, Pachysolen, Zymomonas, Klebs/el/a, Escherichia, peuvent être choisis pour valoriser les sucres monomères issus de la biomasse en éthanol. Le procédé de transformation des matériaux ligna-cellulosiques en éthanol (voir Figure 1) comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique ou chimique, d'une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés et d'une étape de récupération de l'éthanol. L'étape de prétraitement a pour objet de libérer les sucres contenus dans les hémicelluloses sous forme de monomères, essentiellement des pentoses, comme le xylose et l'arabinose, et des hexoses, comme le galactose, le mannose et le glucose, et d'améliorer l'accessibilité de la cellulose engluée dans la matrice de lignine et hémicelluloses. De nombreuses technologies existent: cuissons acides, cuissons aYcalines, explosion à la vapeur, procédés organosolv, etc. L'efficacité du prétraitement se mesure par le taux de récupération des hémicelluloses et par la susceptibilité à l'hydrolyse du résidu cellulosique. Les prétraitements acide en condition douce et par explosion à la vapeur sont les mieux adaptés. Ils permettent une récupération totale des pentoses et une bonne accessibilité de la cellulose à l'hydrolyse. Le résidu cellulosique est hydrolysé, soit par voie acide, soit par voie enzymatique avec l'utilisation d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. Des microorganismes, comme les champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium, produisent ces enzymes, contenant notamment les cellulases et les xylanases, adaptées à l'hydrolyse totale des polymères constituant les végétaux. La voie acide, effectuée à l'aide d'acide fort, acide sulfurique notamment, est efficace mais requiert d'importantes quantités de produits chimiques (acide puis base pour la neutralisation). L'hydrolyse enzymatique ne présente pas cet inconvénient; elle s'effectue par ailleurs dans des conditions douces et est efficace. Par contre, le coût des enzymes reste très élevé. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût: l'augmentation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant les souches hyperproductrices et en améliorant les procédés de fermentation, la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant la phase de prétraitement ou en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes. Au cours de la dernière décennie les principaux travaux se sont attachés à comprendre les mécanismes d'action des cellulases et d'expression des enzymes afin de faire excréter le complexe enzymatique le plus approprié à l'hydrolyse des substrats ligno-cellulosiques en modifiant les souches avec les outils de biologie moléculaire. Le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases est le champignon Trichoderma reesei. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, le complexe enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types d'activités: les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. et Ancireotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et aI, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50). Les améliorations ont permis d'obtenir des souches hyperproductrices, moins sensibles à la répression catabolique sur sucres monomères notamment, glucose par exemple, par rapport aux souches sauvages. Des souches recombinantes ont été obtenues à partir des souches de Trichoderma reesei Qm9414, RutC30, CL847 en clonant des gènes hétérologues, l'invertase d'Aspergillus piger par exemple pour diversifier la source de carbone nécessaire à la production de cellulases, et/ou surexprimant la cellobiase afin d'améliorer le rendement d'hydrolyse enzymatique, les cellobiases étant considérées comme les enzymes limitantes dans la réaction. Ces souches ont conservé leur hyperproductivité et leur aptitude à être cultivées en fermenteur. Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet d'améliorations importantes en vue de l'extrapolation à l'échelle industrielle. Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei et un substrat inducteur qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. La cellulose peut jouer ces deux rôles; cependant, elle est difficile d'utilisation au stade industriel et elle a été remplacée par des sources de carbone solubles, glucose, xylose ou lactose, le lactose jouant également le rôle de substrat inducteur. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme inducteurs, mais ils sont trop onéreux pour être utilisés au stade industriel. On a cependant constaté que les productions de cellulases par Trichoderma reesei, avec des substrats solubles, sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose en "batch". Ceci est dû à l'effet répresseur des sucres facilement assimilables, à forte concentration. L'alimentation en continu des substrats carbonés solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle dans les cultures et en optimisant la quantité de sucre permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité enzymatique (voir le brevet FR-B- 2 555 603). Le lactose reste, dans un procédé de production industriel d'enzymes cellulolytiques, un des substrats les plus appropriés et l'un des molins chers; il reste néanmoins coûteux et représente environ un tiers du prix de revient des enzymes. Malgré tous les progrès réalisés, le coût des enzymes reste un poste important dans la transformation de la biomasse cellulosique en éthanol, de 30 à 50 % ; de plus, dans le cas de l'utilisation de lactose comme source de carbone pour la production de cellulases, le procédé est dépendant d'une source de carbone extérieure. De ce fait l'utilisation de substrats carbonés issus de la filière, les hémicelluloses hydrolysées par exemple, est une voie de progrès irnportante si la source de carbone inductrice est facilement disponible. Description détaillée de l'invention La présente invention concerne l'utilisation du résidu obtenu après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, comme source de carbone inductrice pour la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques avec des souches de champignon cellulolytique, notamment celles appartenant au genre Trichoderma reesei. La source de carbone principale peut être un sucre soluble industriel, par exemple le glucose, le lactose ou le xylose, ou un extrait de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de la biomasse prétraitée. Le résidu peut aussi être utilisé aussi cornme source de carbone totale, c'est-à-dire pour la croissance du microorganisme et l'induction du système d'expression. Cette source de carbone est utilisable par les souches améliorées génétiquement et notamment les souches recombinantes. Un objet de l'invention est de proposer une source de carbone inductrice ou totale facilement disponible, permettant de produire des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques aux activités appropriées à l'hydrolyse de la biomasse cellulosique. Le schéma de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques à partir de résidus de fermentation éthanolique selon l'invention est représenté à la Figure 2. Cette invention permet par ailleurs la valorisation en interne de coproduits non valorisables en éthanol. Une première étape de prétraitement de la biomasse est réalisée pour améliorer la susceptibilité à l'hydrolyse enzymatique de la fraction cellulosique et hydrolyser la fraction hémicellulosique. La méthode la plus appropriée est l'explosion à la vapeur en condition acide. Dans les conditions optimales, de 150 à 250 C pendant quelques minutes, elle transforme les hémicelluloses en monomères en minimisant les pertes, en furfural notamment, le xylose étant le sucre majoritaire. Les sucres libérés peuvent être extraits par lavage en phase aqueuse; le résidu solide de l'extraction ne contient alors que de la cellulose et de la lignine. Après extraction, les sucres libérés sont utilisés pour la production d'enzymes comme source de carbone principale ou valorisés en éthanol par fermentation avec les souches appropriées. La fraction cellulosique, débarrassée ou non de la fraction hémicellulosique hydrolysée et le cas échéant de la lignine, est hyclrolysée par les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques produites par les souches spécialisées, les cellulases de Trichoderma reesei étant les plus efficaces et les plus appropriées lorsque les substrats carbonés sont issus de la biomasse cellulosique ou lignocellulosique. Le matériau à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 25 % de matière sèche, de préférence 10 à 20 %, le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40 et 60 C, de préférence entre 45 et 50 C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par ajout des cellulases; la quantité habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures selon l'efficacité du prétraitement, la composition du mélange de cellulases et la quantité d'enzymes ajoutées. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution sucrée est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation; elle est utilisée pour la fermentation éthanolique. Lorsque la fraction cellulosique a été débarrassée des hémicelluloses hydrolysées à l'étape de traitement, le glucose est le sucre majoritaire retiré dans cette étape. Le résidu de la fermentation éthanolique, après séparation de l'éthanol, est utilisé comme source de carbone inductrice ou comme source de carbone principale pour la production d'enzymes. La concentration de ce résidu est ajustée pour obtenir la concentration en source de carbone la mieux adaptée au procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. En général, l'éthanol est séparé du moût de fermentation par distillation et le résidu est constitué des vinasses de distillation. Les souches utilisées pour la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques sont des souches de champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, de préférence appartenant à l'espèce Trichoderma reesei. Les souches industrielles les plus performantes sont les souches appartenant à l'espèce Trichoderma reesei, modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation- sélection, comme par exemple la souche IFP CL847 (brevet français FR-B-2 555 803) ; les souches améliorées par les techniques de recombinaison génétique peuvent être également utilisées. Ces souches sont cultivées en fermenteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes. Selon sa nature, le substrat carboné choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le fermenteur avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation de ce dernier pour avoir une concentration initiale de 20 à 35 g.L-' ; la source inductrice peut ne pas être ajoutée dans cette phase. Une solution aqueuse contenant le substrat choisi pour la production des enzymes est préparée à la concentration de 200-250 g.L-' ; cette solution doit contenir le substrat inducteur. Elle est injectée après l'épuisement du substrat initial de façon à apporter une quantité optimisée, comprise entre 35 et 45 mg.g-' de cellules ("fed batch"). La concentration résiduelle en sucre dans le milieu de culture est inférieure à 1 g.L-' pendant cette phase de "fed batch". Parmi les exemples qui suivent, les Exemples 1 à 3 sont donnés à titre indicatif et les Exemples 4 et 5 illustrent l'invention. Exemple 1: Production d'enzymes sur lactose La production de cellulases est effectuée en fermenteur agité mécaniquement. Le milieu a la composition suivante: KOH 1,66 g.L-1, H3PO4 85 % 2 mn-1, (NH4)2SO4 2,8 g. L-', MgSO4, 7 H2O 0,6 g.L-1, CaCL2 0,6 g.L-', MnSO4 3,2 mg.L-1, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mgr', CoCl2 4,0 mgr', FeSO4, 7 H2O 10 mg.L-1, Corn Steep 1,2 g. L', anti-mousse 0,5 mL.L-1. Le fermenteur contenant 1,75 L de milieu rninéral et 70 g de lactose est stérilisé à 120 C, puis ensemencé avec 0,25 litre d'une précullture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847. Le milieu de la préculture, additionné de phtalate de potassium à 5 g.L-' pour contrôler les variations de pH, est identique à celui du fermenteur. La croissance du champignon en préculture est faite sur lactose, à la concentration de 30 g.L-1. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours et est effectuée entre 27 et 30 C sur une table d'agitation. Après 46 heures de croissance, le substrat initial du fermenteur est épuisé et la solution de lactose à 250 g.L-' est injectée en continu au débit de 4,5 mL.h-' jusqu'à 142 heures. La température est régulée à 27 C pendant la phase de croissance de la biomasse, puis à 25 C jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé à 5 pendant la phase de croissance, puis à 4 jusqu'à la fin de la culture par addition d'une solution d'ammoniaque qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des protéines excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue au-dessus de 15 à 20 % par action sur l'aération et l'agitation. La production d'enzymes est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Folin (Lowry), après séparation du mycélium par filtration ou centrifugation. Les activités cellulolytiques sont déterminées par la méthode de l'activité papier filtre (UPF: unité papier filtre) pour une activité globale et l'activité cellobiase, activité considérée comme limitante du processus d'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique. L'activité UPF est mesurée sur papier Whatman n 1 à la concentration initiale de 50 g.L-' ; on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique à analyser qui libère l'équivalent de 2 g. L-' de glucose (dosage colorimétrique) en 60 minutes. L'activité cellobiase est mesurée sur cellobiose à la concentration de 20 mM; on détermine la prise d'essai qui libère 0,5 g.L-' de glucose (dosage enzymatique) en 30 minutes. Les activités en U.mL-' sont exprimées en micromoles de glucose libérées par minute et par millilitre de solution enzymatique. Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants: Substrat consommé g.L-' 79,6 Biomasse g.L-' 13,5 Protéines mg. mL-' 37,8 UPF U.mL-' 22,1 Cellobiases U.mL-' 25,2 Exemple 2: Production d'enzymes sur xylose La production d'enzymes est menée dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 1. Le fermenteur contenant 1,75 L de milieu minéral avec 40 g de xylose pur est ensemencé avec 0,25 litre d'une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847. Le substrat carboné de la préculture est le glucose à la concentration de 20 g.L-' Après 27 heures de croissance, après l'épuisement du substrat initial, la solution de xylose à 200 g.L-' est injectée en continu au débit de 5 mL.h-' jusqu'à 164 heures. Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants: Substrat consommé g.L-' 63,7 Biomasse g.L-' 15,3 Protéines mg. mL-' 6,1 UPF U.mL-' 1,7 Cellobiases U.mL-' 1,9 Exemple 3: Production d'enzymes sur un mélanqe lactose-xylose à 25-75 % respectivement Dans cet exemple, le lactose est utilisé comme substrat inducteur et injecté uniquement dans la phase de production d'enzymes, après l'épuisement du xylose initial. La fermentation est conduite dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 2. La solution de substrat injectée pour la production d'enzymes est remplacée par un mélange de lactose et de xylose à la concentration de 200 g.L-1, la concentration en lactose étant de 50 g.L-1. L'injection est stoppée à 164 heures. Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants: Substrat consommé g.L-' 62,7 Biomasse g.L-' 11,9 Protéines mg. mL-' 34,2 UPF U.mL-' 10,1 Cellobiases U.mL-' 8,7 Exemple 4: Production d'enzymes sur xylose en utilisant le résidu produit par fermentation éthanolique d'un hydrolysat enzymatique partiel d'un matériau cellulosique traité et dépentosé, comme source inductrice La fermentation est conduite dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 2. La production de biomasse est faite en "batch" avec 20 g.L-' de xylose. La production d'enzymes est faite en "fed batch" avec une solution préparée à partir d'un résidu dans lequel on ajoute du xylose. La solution de résidu, référencée H1, est préparée de la façon suivante: 6 kg de matériau solide humide, obtenu après traitement de paille de blé par explosion à la vapeur en condition acide et extraction des pentoses, soit 1,4 kg de matière sèche traitée et lavée, sont repris dans 0,75 litre de tampon acétate de sodium 0,5 M à pH 4,8 et 0,75 litre d'une solution de cellulases commerciales, soit 30 g de protéines. Après une hydrolyse enzymatique de 24 heures, réalisée dans un réacteur agité mécaniquement et maintenu à 50 C. La suspension est séparée par centrifugation. La fraction liquide récupérée contient 92 g.L-' de glucose, 10,3 g.L-' de xylose, 1.0 g.L-' d'arabinose. Une fermentation éthanolique est faite sur cette fraction par Saccharomyces cerevisiae. L'inoculum, d'un volume de 0,4 L, est préparé en fiole agitée sur glucose avec une levure de boulangerie. Le glucose de l'hydrolysat est totalement fermenté en éthanol. Le moût obtenu est débarrassé des protéines et de la levure par chauffage à 100 C et centrifugation. Après concentration sous vide, on obtient 0,85 L de la vinasse H1 débarrassée de l'éthanol. La solution de substrat, d'un volume de 1,5 L, utilisée pour la production d'enzyme, est préparée à partir de cette vinasse avec ajout de xylose pour obtenir une concentration finale en substrat carboné de 200 g.L-'. La fermentation est conduite dans les mêmes conditions que pour les Exemples 1 à 3. La fermentation est stoppée à 136 heures. Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats indiqués dans le tableau ci-dessous. Les protéines sont précipitées par l'acide trichloracétique afin d'éviter la réaction colorée indésirable liée aux impuretés du résidu. Substrat consommé g.L-' 59,0 Biomasse g.L-' 12,0 Protéines mg.mL-' 33,6 UPF U.mL-' 10,5 Cellobiases U.mL-' 4,5 Exemple 5: Production d'enzymes sur xylose en utilisant le résidu produit par fermentation éthanolique d'un hydrolysat poussé d'un matériau cellulosique traité et dépentosé, comme source inductrice Comme dans l'Exemple 4, la production de biomasse est faite en "batch" avec 20 g.L-' de xylose. La production d'enzymes est faite en "fed batch" avec une solution de substrat préparée à partir de vinasses dans lesquelles on ajoute du xylose. Dans le cas présent, la solution de vinasses, référencée H2, est préparée de la même façon que pour H1 mais l'hydrolyse est prolongée jusqu'à 48 heures avec un ajout d'enzymes, identique au premier ajout, après 24 heures d'hydrolyse. L'hydrolysat contient 110,8 g.L-' de glucose, 11,8 g.L-' de xylose. La vinasse H2, après élimination de l'éthanol et concentration, est utilisée pour préparer 1,5 L d'une solution de substrat à 200 en sucres totaux. La fermentation est conduite dans les mêmes conditions que pour l'Exemple 4; la fermentation est stoppée à 158 heures. Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants: Substrat consommé g.L-' 62,5 Biomasse g.L-' 14,5 Protéines mg. mL-' 28,0 UPF U.mL-' 10,0 Cellobiases U.mL-' 4,7 REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par un microorganisme cellulolytique caractérisé en ce qu'il utilise le résidu de la fermentation éthanolique d'hydrolysats enzymatiques de matériaux cellulosiques ou ligno-cellulosiques. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit résidu est utilisé comme source de carbone pour la croissance du microorganisme cellulolytique et la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le résidu est utilisé comme source de carbone inductrice en complément d'autres sources de carbone utilisées pour la croissance du microorganisme cellulolytique. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le résidu est utilisé comme unique source de carbone pour la croissance du microorganisme cellulolytique et la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel le microorganisme cellulolytique est choisi parmi les champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium et Schizophyllum. 6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel le microorganisme cellulolytique appartient à l'espèce Trichoderma reesei. 7.. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 dans lequel les matériaux cellulosiques ou ligno-cellulosiques sont choisis parmi les pailles, le bois, les cultures forestières, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière et les produits de transformation des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques. 8. Procédé de production d'éthanol à partir de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques comprenant les étapes suivantes: 1) le prétraitement chimique et/ou physique d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique; 2) l'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité utilisant des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques; 3) la fermentation éthanolique par un micro-organisme alcooligène approprié de l'hydrolysat issu de l'étape (2) et obtention d'un moût de fermentation; et 4) la séparation du micro-organisme alcooligène utilisé dans l'étape (3), la séparation/purification de l'éthanol et l'obtention d'une phase aqueuse constituant un résidu; ledit procédé étant caractérisé en ce que ledit résidu est utilisé pour produire les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques utilisées dans l'étape (2) par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Procédé selon la revendication 8 dans lequel, dans l'étape (4), l'éthanol est séparé du moût de fermentation par distillation et le résidu est constitué des vinasses de distillation.