Brevet FR2878862A1 — publié le 20060609

La présente invention se rapporte à des polynucléotides isolés à activité promotrice permettant l'expression spécifique de séquences hétérologues d'intérêts dans les cellules des racines des plantes en fonction de l'assise cellulaire et du stade de développement souhaité tout au long de la croissance de la plante ainsi que les plantes transgéniques les comprenant. La maîtrise des ennemis des cultures est une des clefs qui conditionnent l'équilibre alimentaire mondial. La chimie a longtemps fourni l'essentiel de l'effort dans la lutte contre les ravageurs. Récemment, d'autres méthodes sont aussi utilisées comme la lutte biologique et la création de variétés résistantes pour laquelle la transgenèse constitue un outil de choix. De nombreux pathogènes de plantes d'origine virale, bactérienne ou phytoplasmique ne sont pas sensibles aux pesticides actuellement commercialisés. La seule solution consiste alors à utiliser des variétés végétales résistantes. Par ailleurs, certains champignons pathogènes, acariens, nématodes ou insectes peuvent supporter sans dommage de fortes doses de pesticides. La transgenèse élargit ce potentiel d'investigation en permettant d'une part, l'exploitation de gènes issus d'autres variétés, d'autres espèces, voire d'autres genres, d'autre part, par le contrôle quantitatif (moduler l'intensité de l'expression du gène) et qualitatif (faire exprimer le gène dans telle partie de la plante) de leur expression. Les premiers résultats, notamment la création de variétés résistantes à des maladies virales (résistance au court-noué de la vigne), à des nématodes ou à des ravageurs (maïs résistant à la pyrale) sont particulièrement prometteurs. Désormais, pour un grand nombre d'applications, il n'est pas nécessaire que la protéine d'intérêt conférant la propriété agronomique recherchée présente une expression distribuée dans la totalité des organes et/ou des types cellulaires de la plante transformée. Très précocement, la recherche d'une expression plus spécifique du gène d'intérêt a été entreprise et a conduit, par exemple, à l'identification de promoteurs spécifiques de tissus ou d'organe. En particulier, un promoteur dirigeant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt de façon à la fois forte et ciblée dans la racine permettrait de nombreuses applications que l'on peut définir à la fois dans la défense contre les pathogènes telles que des bactéries, des champignons, des nématodes ou des insectes, la résistance au stress (froid, hydrique, stress salin), l'amélioration de la qualité (par exemple: augmenter la teneur en saccharose dans la betterave à sucre), la nutrition (exemple: exprimer un gène de transporteur des nitrates). Il existe dans l'art antérieur de nombreuses demandes concernant des promoteurs pour diriger une expression dans les racines des plantes. Par exemple, la Demande de Brevet canadien CA2425886 intitulée Rootspecific conifer gene promoter and its use se rapporte à une séquence polynucléotidique promotrice dans les racines et dérivée du gène PR10 du pin. La Demande de Brevet canadien CA2228046 intitulée: Root Cortex specific gene promoter se rapporte à un ADN isolé comprenant une séquence promotrice qui dirige la transcription d'un segment d'ADN hétérologue spécifiquement dans le cortex racinaire d'une cellule de plante, exemple de transformation dans la plante du tabac. La Demande WO 03/040322 intitulée: Promoteurs régulant l'expression génique dans les racines de plantes concerne un promoteur isolé du maïs et ses équivalents fonctionnels qui a la particularité de conduire une expression de gènes hétérologues spécifiquement dans les racines afin d'augmenter les caractéristiques agronomiques, horticoles et/ou pesticides d'une plante et les tissus de plantes comprenant les promoteurs selon l'invention; la Demande WO 02/46439 intitulée: Nouveaux promoteurs spécifiques des racines activant l'expression d'une nouvelle kinase de type récepteur de domaine LLR divulgue des acides nucléiques codant pour des régulateurs de transcription de promoteur spécifique de la racine et les acides nucléiques codant pour une nouvelle protéine récepteur kinase LLR, la Demande US 5,633,363 Root preferential promoter fait référence à des fragments promoteurs isolé du mais et plus particulièrement d'une région de 4.7Kb en amont désigné ZRP2 ainsi que ses équivalents fonctionnels qui ont la particularité de conduire une expression de gènes hétérologues spécifiquement dans les racines afin d'augmenter les caractéristiques agronomiques, horticoles et/ou pesticides d'une plante ou encore la Demande US 5,401,836 intitulée: Brassica regulatory sequence for root-specific or root- abundant gene expression concernant l'isolement d'un promoteur qui montre une expression forte chez Brassica sp. Ce promoteur est utile pour conduire la transcription de protéine hétérologue qui confère une immunité ou a résistance à des pathologies susceptibles de toucher les racines et notamment infection par champignons, bactéries et insectes. Aucune de ces Demandes ne permet d'obtenir une expression de séquences d'intérêt en fonction des besoins et tout particulièrement en choisissant le stade du développement et ciblant précisément l'assise cellulaire ou l'on veut diriger l'expression. Les séquences selon l'invention permettent d'obtenir une expression spécifique de gènes d'intérêts à tous les stades du développement de la plante comme par exemple une expression d'antibiotique ou de protéines à activité herbicide spécifiquement dans les racines à un stade très précoce pour éviter leurs traces au stade adulte et en permettant également une expression très localisée en fonction de l'assise cellulaire ce qui peut avoir une importance en fonction du type d'agriculture. La présente invention. se rapporte par conséquent à une méthode pour diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante caractérisée en que l'on utilise un acide nucléique isolé comprenant un promoteur végétal choisi parmi les séquences suivantes. EAG 96 (SEQ ID N 1), AAJ 3 (SEQ ID N 2), DRM 33 (SEQ ID N 3), DUA 2 (SEQ ID N 4), DSM 153 (SEQ ID N 5) , DYK 138 (SEQ ID N 6), DXP4 (SEQ ID N 7), EAD 29 (SEQ ID N 8), DYC 237 (SEQ ID N 9), DUR17 (SEQ ID N 10), EAF 39 (SEQ ID N 11) et DRW 2 (SEQ ID N 12) De préférence, un acide nucléique selon l'invention se présente sous forme isolée ou purifiée. Le terme isolé au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui à été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique comprend le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. L'invention se rapporte également à une méthode, caractérisée en ce que la séquence est choisie parmi un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide selon l'invention ou encore un acide nucléique de séquence complémentaire à ceux-ci. Selon la présente invention, on entend par % d'identité le pourcentage de nucléotides identiques qui peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquence tel que Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) et le programme FastDB avec les paramètres suivants: Mistmatch penalty: 1.00; Gap penalty: 1.00; Gap Size Penalty: 0.33; joining penalty: 30.0 . Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and synthesis Methods and Applications, pages 127-149, 1988, Ala. R. Liss, Inc, incorporé dans la description par référence. On peut également définir des polynucléotides selon l'invention par leurs propriétés d'hybridation sélective avec l'un des polynucléotides définis par les séquences SEQ ID n 1 à SEQ ID N 12 dans des conditions de fortes stringence telles que définies dans Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11.1 à 11.61. Les différences nucléotidiques que peut comprendre un acide nucléique selon l'invention par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12 peuvent résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs ou non. Font également partie de l'invention des acides nucléiques comprenant tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, ou encore 99,8% d'identité en nucléotides avec les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Selon un autre aspece, l'invention est également relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide hybridant, dans des conditions de fortes stringences, avec les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12 selon l'invention, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. En général, des conditions de forte stringence, pour un polynucléotide donné peuvent être obtenues en opérant à une température inférieure de 5 à 10 C à la température de fusion du duplex constitué par ledit polynucléotide et son complémentaire, dans un milieu de composition donnée A titre d'exemple de conditions d'hybridation de forte stringence utilisables dans un grand nombre de cas, on indiquera les conditions suivantes: Préhybridation: Même conditions que pour l'hybridation Durée: 1 nuit. Hybridation: 5X SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM phosphate de sodium pH 7,7, 5 mM EDTA) 5X Denhardt's (0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% SAB) 0,1% SDS Durée: 1 nuit. Lavages: 2X SSC, 0,1% SDS 10 min 65 C 1X SSC, 0,1% SDS 10 min 65 C 0,5X SSC, 0,1% SDS 10 min 65 C 0,1X SSC, 0,1% SDS 10 min 65 C Par partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur en base inférieure à celle de la séquence selon l'invention et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante. Une partie de polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aussi obtenue par exemple par délétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12 à l'aide des techniques à l'exonucléase III (Ausubel et al., 1989). Un polynucléotide partie du promoteur végétal selon l'invention a avantageusement une longueur en nucléotide allant de 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1200, 1500 ou 2000 nucléotides (ou paires de bases s'il se présente sous la forme double brin). Pour la mise en uvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments de polynucléotides correspondant à une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Une partie de polynucléotide promoteur selon l'invention pourra également être préparée par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du coté 5' et du coté 3', la séquence d'intérêt, par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,965,188. L'activité biologique d'une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples. L'invention concerne également une cassette d'expression recombinante caractérisé en ce qu'elle comprend un promoteur constitué par une séquence polynucléotidique telle que définie précédemment et une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur et dont l'expression est recherchée dans les cellules de la racine d'une plante. De manière avantageuse, un tel acide nucléique comprendra une séquence nucléotidique d'intérêt choisie parmi les séquences codantes de gène interagissant avec des parasites ou des pathogènes tels que les nématodes ou les champignons, comme par exemple un polynucléotide codant pour une protéine à activité herbicide ou antibiotique ou encore les séquences codantes de glucanase, ladite séquence nucléotidique d'intérêt étant placée sous le contrôle d'un polynucléotide promoteur selon l'invention. Il peut également s'agir de séquences d'endochitinases telles que celles décrites dans le Brevet européen 493,581 ou encore de sécuences de gènes agissant sur la teneur en sucre de la plante. A titre d'exemple, les séquences codantes de gènes d'intérêt assurant la protection d'une plante contre d'autres conditions de stress pourront être avantageusement placées sous le contrôle d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, pour le stress hydrique ou salin: gène arskl (Hwang et al, 1995), cDNA pA9 (Winicov, I. Deutch S.E. 1994) ou cDNA Alfin 1 (Bastola, DR et al. 1998). D'autres séquences codantes pourraient être utilisées sous le contrôle des promoteurs selon l'invention, par exemple pour agir sur la teneur en saccharose de la betterave à sucre: gène BvSPS1 (Hesse H. et al. , 1995), ou surexprimer un gène déjà exprimé physiologiquement comme les gènes de transporteurs de nitrate NRT1 ou NRT2 (Crawford, N.L. et al. 1998; Leah R. et al., 1991). L'invention est en outre relative à des fragments nucléotidiques comprenant 10 à 2000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier des fragments ayant une activité promotrice similaire ou identique à l'activité promotrice de la séquence correspondante complète, préférentiellement un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12 ou encore un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec les séquences nucléotidiques selon l'invention ou un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, de tels fragments auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 ou 2000 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide promoteur selon l'invention ou consistant en des fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 ou 2000 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide promoteur selon l'invention. De tels fragments nucléotidiques pourront avantageusement être mis en uvre en tant que sondes ou amorces nucléotidiques aux fins de détection ou d'amplification de la totalité ou d'une partie d'une séquence à activité promotrice spécifique des racines de plantes selon l'invention. Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un polynucléotide promoteur selon l'invention et plus particulièrement comprenant au moins une cassette d'expression selon l'invention. Un tel vecteur recombinant comprendra avantageusement une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle dudit promoteur végétal. Des vecteurs pouvant être utilisés aux fins de la présente invention sont notamment les suivants: vecteur pBIN19 (Bevan et al., 1984, Nucleic Acids Research, vol. 12: 8711- 8721, commercialisé par la Société Clontech, Pale Alto, Californie, USA); vecteur 101 (Jefferson, 1987, PlantMolecular Biology Reporter, vol. 5: 387-405, commercialisé par la société Clontech); vecteur pB1221 (Jefferson, 198, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5: 387--405, commercialisé par la Société CLONTECH) ;vecteur pBIl21 (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5: 387-405, commercialisé par la Société Clontech) ; vecteur pEGFP (Cormack, B.P. et al. 1996; Yang T.T. et al., 1996, commercialisé par la Société Clontech), ou encore le vecteur pC-gus. L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par au moins une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. L'invention concerne particulièrement une cellule hôte recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique à activité de promoteur végétal spécifique des racines de plantes selon l'invention, éventuellement associée à un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier, ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Les cellules hôtes recombinantes préférées selon l'invention peuvent être indifféremment d'origine bactérienne ou végétale. Ainsi, peuvent notamment être utilisées des cellules bactériennes de différentes souches d'E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens. II s'agit également de cellules de plantes transformées par un vecteur conforme à l'invention, tel que des cellules d'Arabidopsis thaliana, de colza, de tabac ou encore de maïs. L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal recombinant caractérisé en ce qu'il comprend des cellules hôtes recombinantes telles que définies ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, celle-ci a trait à une plante transgénique générée à partir d'une cellule hôte recombinante selon l'invention ainsi qu'aux tissus ou parties desdites plantes et également toutes les plantes transgéniques ou parties d'une plante transgénique transformées avec au moins une cassette d'expression selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention. Une plante transgénique selon l'invention peut 15 être notamment un colza, un tabac, un maïs, blé, orge, tournesol ou encore Arabidopsis thaliana. Les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont donc la propriété d'exprimer une séquence nucléotidique d'intérêt spécifiquement au niveau des différents types cellulaires de la racine (de l'extérieur vers l'intérieur: épiderme, cortex, endoderme, péricycle, vaisseau), à tous les stades de développement de la plante. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique exprimant spécifiquement une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine à tous les stades de développement de ladite plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes. a) Obtention d'une cellule hôte recombinante 30 végétale conforme à l'invention; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal selon l'invention. Optionnellement, la méthode selon l'invention comporte une étape de croisement de plantes transgéniques entre elles telles qu'obtenues précédemment ou encore le croisement entre une plante transgénique selon l'invention et une plante de la même espèce et la sélection des plantes issues du croisement ayant conservé le transgène. L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Transformation d'au moins une cellule de 15 plante par un vecteur selon l'invention; b) Culture desdites cellules transformées afin de générer une plante contenant dans son génome une cassette d'expression telle que définie selon l'invention. L'invention se rapporte également à une plante transgénique telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés ci-dessus. De manière préférée, une plante transgénique selon l'invention a non seulement intégré dans son génome un transgène comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal présentement décrit mais exprime ladite séquence nucléotidique d'intérêt majoritairement ou exclusivement dans les cellules constitutives de la racine. Enfin, I'invention concerne aussi les graines obtenues à partir d'une plante transgénique selon l'invention. II s'agit notamment d'une semence d'Arabidopsis thaliana, de colza, de tabac ou de mais ayant incorporé un acide nucléique selon l'invention. La présente invention a également pour objet une méthode pour protéger une plante d'une infection par un parasite comprenant les étapes suivantes: a) Transformation de la plante avec une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendication 3 à 4; b) Sélection de la plante ayant intégré la cassette d'expression. Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une séquence nucléotidique promotrice selon l'invention pour exprimer un gène dans les cellules des racines et, dans un mode particulier de réalisation de l'invention, pour exprimer une séquence d'intérêt à activité herbicide ou antibiotique. L'invention sera en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. EXEMPLE 1: PREPARATION DES TRANSFORMANTS Les séquences promotrices ont été amplifiées par réaction de PCR (polymerase chain reaction) en utilisant les couples d'amorces respectifs décrits ci-dessous (SEQ ID N 13 à SEQ ID N 36). L'ADN (10 à 50 ng) issu d'Arabidopsis thaliana écotype Wassilewskija a été utilisé comme matrice. Les réactions ont été effectuées grâce au kit Expand High Fidelity (Roche) selon le protocole du fournisseur. La PCR a été effectuée avec 30 cycles (55 C 30s pour l'appariement, 72 C d'élongation pendant 3 mn et 94 C pendant 30s). Les fragments d'ADN amplifiés ont été clonés dans le vecteur pGEM- T Easy (Promega). Après vérification des séquences amplifiées, ces dernières ont été clonées dans le vecteur binaire pBI 101 (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6, 3901-3907) en utilisant les sites de restriction introduits dans les oligonucléotides où issus du polylinker de pGEM-T Easy, soit respectivement: SmaI/BamHI (DRM33, AAJ3, DUA2, EAD 29) ; HindIIl/BamHI (DYK 138, DSM 153, DYC 237, EAG 96) et SalI/BamHI (DUR 17, DXP 4, EAF 39, DRW 2). Ce clonage permet d'introduire les divers promoteurs en amont du gène GUS et du terminateur NOS dans un vecteur binaire. Ces vecteurs ont ensuite été introduits par agro-transformation dans des plants d'Arabidopsis thaliana écotype Wassilewskija pour vérification de leur fonctionnalité par la technique d'infiltration sous vide (Bechtold et al, 1993, C.R. Acad. Sci. Paris 316, 1188-1193). Les transformants ont été sélectionnés grâce à la résistance à la kanamycin (50 mg/L) portée par le vecteur pBi101. Pour chaque promoteur, 16 plantes par construction ont été transformées. Le nombre de transformants obtenus a été assez variable (11 (DSM 153), 10 (DRM 33), 16 (DYK 138), 11 (DXP 4), 7 (EAD 29), 2 (DUA2), 4 (AAJ3), 5( DYC237), 10 (DUR17), 3 (DRW2), 6 (EAF 39)). Les profils de coloration se sont avérés reproductibles entre les lignées, mais pouvait présenter un niveau d'expression variable. L'analyse des transformants (expression du gène rapporteur GUS) a été effectuée par coloration histochimiques (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6, 3901-3907) à quatre étapes distinctes de croissance pour étudier le profil d'expression du promoteur tout au long de la croissance de la plante (germination (stade 2 cotylédons), stade rosette (15 jours après germination, plante adulte (3 à 4 semaines) et coloration des embryons). Les plantes sont issues de culture in vitro pour les sélection sur antibiotiques (milieu Hoagland modifié selon Sarrobert et al., 2000, Plant J. 24, 357-367), cultivés en chambre de culture (16h de jour à 24 C et 8h de nuit à 21 C, 150 pmol.m 2.s-1) jusqu'au stade rosette (15 jours après germination), puis les plantes sont repiquées en chambre de culture sur terreau pour le reste de la croissance (16h de jour à 24 C et 8h de nuit à 21 C, 300 }mol. m-2. s-1) . EXEMPLE 2: VISUALISATION DES EXPRESSIONS SPECIFIQUES Figures Les figures 1 à 12 représentent des coupes des plantes transformées comme décrit à l'Exemple 1, permettant de visualiser les colorations obtenues aux différents stades de croissance. Plusieurs stades sont indiqués uniquement dans les cas où la coloration évolue ou se modifie pendant le développement, notamment des jeunes plantules de 8 à 14 jours après semis avec détails (coupe et/ou agrandissement) des diverses zones de la racine et de la partie aérienne. La coloration observée est une coloration GUS 24h. Ces figures 1 à 12 correspondent aux colorations observées pour les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12 respectivement. Figure 1: Profil d'expression du promoteur EAG96 visualisé sur 1 transformant. L'expression spécifique se situe au niveau de l'épiderme, du cortex, et dans la racine mature. On n'observe pas de coloration dans les feuilles, les tiges, les siliques, et l'embryon. Figure 2: Profil d'expression du promoteur AAJ 3 visualisé sur 4 transformants. On observe une coloration sur toute la racine. Elle est très spécifique de la racine sauf pour la zone du méristème primaire. On n'observe pas de coloration dans les parties aériennes. Il s'agit d'un promoteur racine spécifique, constitutif. Figure 3: Profil d'expression du promoteur DRM33 visualisé sur 6 transformants. L'expression GUS touche l'embryon à un stade très précoce mais pas les réserves de la graine. L'expression est visible dans la racine mais pas dans la coiffe (partie de l'apex qui touche la racine). L'expression est visible dans la partie centrale différenciée mais pas dans la zone méristematique hors l'épiderme. L'expression est légère dans certains transformants pour la partie aérienne mais elle n'est pas systématique. Les feuilles semblent touchées dans les tissus conducteurs dans toute la plante. On retrouve les tissus conducteurs dans toute la plante. L'expression est majoritairement racinaire. On observe une coloration dans les cotylédons que l'on ne retrouve pas dans les feuilles âgées. Figure 4: Profil d'expression du promoteur DUA2 visualisé sur 2 transformants. On observe une coloration dans l'embryon au stade cordiforme, mais rien dans les fleurs et l'hypocotyle. Il s'agit d'un promoteur à très forte expression dans la racine. Figure 5: Profil d'expression du promoteur DSM153 visualisé sur 11 transformants. On observe une coloration forte dans l'Apex, qui continue dans la racinesauf dans l'épiderme et dans les parties âgées. On n'observe pas d'expression dans les siliques ni dans les tiges. On observe une expression faible à la base des fleurs. On observe parfois une expression dans les feuilles jeunes dans certains transformants mais pas dans les feuilles âgées. Il s'agit d'un promoteur racinaire fort. Figure 6: Profil d'expression du promoteur DYK138 visualisé sur 13 transformants. On observe une coloration dans les stomates et la partie hydathode. On observe une coloration dans les feuilles âgées, dans l'embryon, et dans les siliques. On observe une coloration dans toute la racine. Figure 7: Profil d'expression du promoteur DXP4 visualisé sur 9 transformants. On observe une coloration visible dans toute la graine de façon très homogène. Cependant, on peut remarquer que l'expression est très forte dans la zone de division ainsi que dans le méristème foliaire et racinaire. On observe une coloration sur toute la racine sauf dans l'épiderme et le cortex. 15 20 25 Figure 8: Profil d'expression du promoteur EAD29 visualisé sur 6 transformants. On observe une expression dans la columelle, le cylindre central, l'embryon, sur toutes les assises sauf le cortex et l'épiderme. On n'observe pas de coloration dans les parties aériennes, à l'exception du cotylédon et des feuilles (stades 1 et 2). On observe une expression légère dans les hydathodes, et le méristème apical dans certains transformants. Figure 9: Profil d'expression du promoteur DYC237 visualisé sur 2 transformants. On observe une expression GUS dans l'épiderme, les columelles, le méristème, les zones d'élongation et de différenciation, ainsi que dans la racine à tous les stades. Figure 10: Profil d'expression du promoteur DUR17 visualisé sur 6 transformants. On observe une expression constitutive dans toutes les assises à tous les stades sauf au niveau du cylindre central. Figure 11: Profil d'expression du promoteur EAF39 visualisé sur 4 transformants. On observe une coloration du xylème jusqu'au péricycle face et nulle part ailleurs. La coloration forme un éventail. Le signal diffuse à travers des cellules. Figure 12: Profil d'expression du promoteur DRW2 visualisé sur 2 transformants. On observe une coloration dans toute la racine dans les parties jeunes, et le cylindre central dans les parties âgées, ainsi que dans l'embryon. 18 Résultats Table 1: Profils d'expression d'un gène d'intérêt en fonction du promoteur utilisé et selon la localisation cellulaire et le stade de développement de la plante. (Stade 1) (Stade 2) (Stade 3) (Stade 4) Germination des Jeunes plantules Plantes en serre Plantes adultes cotylédons stade rosette avec les fruits DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 Méristème DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 primaire EAD29 EAD29 EAD29 EAD29 DUA2 DUA2 DUA2 DUA2 AAJ3 AAJ3 AAJ3 AAJ3 DYC237 DYC237 DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 Méristème DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 secondaire EAD29 EAD29 EAD29 EAD29 DUA2 DUA2 DUA2 DUA2 AAJ3 AAJ3 AAJ3 AAJ3 DYC237 DYC237 DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DRM33 DRM33 DRM33 DRM33 DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 Zone EAD29 EAD29 EAD29 EAD29 d'élongation EAG96 EAG96 DUA2 DUA2 DUA2 DUA2 DRW2 DRW2 DRW2 DRW2 DYC237 DYC237 DYC237 DYC237 EAF39 EAF39 DUR17 DUR17 DUR17 DUR17 DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DRM33 DRM33 DRM33 DRM33 Zone de DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 différenciation DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 EAD29 EAD29 EAD29 EAD29 EAG96 EAG96 r- DU DUA2 DUA2 DUA2 DUA2 AAJ3 AAJ3 AAJ3 AAJ3 DRW2 DRW2 DRW2 DRW2 DYC237 DYC237 DYC237 DYC237 EAF39 EAF39 DUR17 DUR17 DUR17 DUR17 DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DRM33 DRM33 DRM33 DRM33 DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 EAD29 EAD29 EAD29 EAD29 Racine EAG96 EAG96 EAG96 EAG96 Mature DUA2 DUA2 DUA2 DUA2 AAJ3 AAJ3 AAJ3 AAJ3 DRW2 DRW2 DRW2 DRW2 DYC237 DYC237 DYC237 DYC237 EAF39 EAF39 DUR17 DUR17 DUR17 DUR17 DSM153 DSM153 DRM33 DRM33 DYK138 DYK138 Cotylédon EAD29 EAD29 DUA2 DUA2 DRW2 DRW2 Hypocotyle DXP4 DXP4 DSM153 DSM153 DSM153 DSM153 DRM33 DRM33 DYK138 DYK138 DYK138 DYK138 Feuilles DXP4 DXP4 DXP4 DXP4 EAD29 EAD29 DUA2 DUA2 DRW2 DRW2 Fleurs DXP4 DXP4 Stomate DYK138 DYK138 DUA2 DUA2 DRM33 DRM33 DYK138 DYK138 Embryon DXP4 DXP4 EAD29 EAD29 DUA2 DUA2 promoteurs selon l'invention permet de cibler tous les stades du développement de la plante ainsi que toutes les assises en fonction de l'endroit ou l'on souhaite exprimer un gène d'intérêt. Les DRW2 DRW2 DUR17 résultats montrent que le groupe des DUR17 REVENDICATIONS 1. Méthode pour diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante, caractérisée en que l'on utilise un polynucléotide isolé comprenant un promoteur végétal choisi parmi les séquences suivantes: a) un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi parmi les séquences suivantes: EAG 96 (SEQ ID N 1), AAJ 3 (SEQ ID N 2), DRM 33 (SEQ ID N 3), DUA 2 (SEQ ID N 4), DSM 153 (SEQ ID N 5) , DYK 138 (SEQ ID N 6), DXP4 (SEQ ID N 7), EAD 29 (SEQ ID N 8), DYC 237 (SEQ ID N 9), DUR17 (SEQ ID N 10), EAF 39 (SEQ ID N 11) et DRW 2 (SEQ ID N 12) ; ou b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a). 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polynucléotide isolé comprend un promoteur végétal choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à 12. 3. Cassette d'expression recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend: - un promoteur constitué par une séquence polynucléotidique telle que définie dans la revendication 1 ou 2; et - une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur et dont l'expression est recherchée dans les cellules de la racine d'une plante. 4. Cassette d'expression selon la revendication 3 caractérisée en ce que ladite séquence d'intérêt est choisie parmi un polynucléotide codant pour une protéine à activité herbicide ou antibiotique. 20 5. Vecteur recombinant comprenant au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 3 à 4. 6. Cellule hôte transformée par au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 3 ou 4 ou un vecteur recombinant selon la revendication 5. 7. Plante transgénique ou partie de plante transgénique générée à partir d'une cellule selon la revendication 6. 8. Plante transgénique ou partie d'une plante transgénique transformée avec au moins une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 3 à 4. 9. Plante transgénique selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les plantes des espèces suivantes: Arabidopsis thaliana, colza, tabac, maïs, blé, orge, tournesol. 10. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon la revendication 6; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle de la séquence polynucléotidique telle que définie dans la revendication 1. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes additionnelles suivantes: d) Croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) Sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène. 12. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Transformation d'au moins une cellule de plante par un vecteur selon la revendication 5; b) Culture desdites cellules transformées afin de générer une plante contenant dans son génome une cassette d'expression telle que définie selon l'une des revendications 3 à 4. 13. Plante transgénique susceptible d'être obtenue en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12. 14. Graines obtenues à partir d'une plante transgénique selon l'une des revendications 7 à 9 ou 13. 15. Méthode pour protéger une plante d'une infection par un parasite comprenant les étapes suivantes: a) Transformation de la plante avec une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendication 3 à 4; b) Sélection de la plante ayant intégré la cassette d'expression. 16. Utilisation d'une séquence nucléotidique promotrice telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour exprimer un gène dans les cellules des racines. 17. Utilisation d'au moins un polynucléotide telle que définie dans l'une des revendications 1 ou 2 pour exprimer une séquence d'intérêt à activité herbicide ou antibiotique.