Brevet FR2874502A1 — publié le 20060303

NOUVEL EXTRAIT DE GRENADE, SON PROCEDE D'OBTENTION ET SESAPPLICATIONS PHARMACEUTIQUES, NUTRACEUTIQUES OU COSMETIQUES L'invention se rapporte au domaine de la pharmacologie cellulaire et tissulaire ainsi qu'aux applications dans les domaines de la santé, du bien être et de la cosmétique. La présente invention a plus particulièrement pour objet un nouvel extrait de grenade comme agent pharmacologique, nutraceutique ou cosmétique ayant une activité sur les protéines des canaux à eau appelées aquaporines. L'invention a également pour objet l'utilisation de ce nouvel agent pharmacologique par voie orale ou topique pour la réalisation de compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques, nutraceutiques ou cosmétiques destinées à réguler et/ou stimuler l'activité des aquaporines et/ou à en rétablir leur fonction sur les mouvements de l'eau et du glycérol dans les tissus. L'invention a, en outre, pour objet un procédé de soin cosmétique mettant en u̇vre ledit extrait pour lutter contre les manifestations inesthétiques résultant des dysfonctionnements des aquaporines de la peau du corps et plus particulièrement du visage.L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention dudit extrait de grenade. On sait que la vie s'est d'abord développée dans l'Océan. En ces temps reculés, les océans ne contenaient pratiquement pas de sel. Les premières formes de vie ont dû développer des stratégies pour maintenir leur équilibre ionique. C'est ainsi que les premiers canaux ioniques sont apparus. Beaucoup plus tard, la migration depuis le milieu aquatique marin vers la terre et l'évolution dans le milieu aérien ont nécessité de nombreuses modifications, afin de préserver l'élément essentiel à la vie : l'eau. En limitant les pertes en eau et en glycérol de la peau, l'épiderme participe à la régulation de l'homéostasie générale de l'organisme et constitue un lieu d'échanges très régulés avec le milieu extérieur. C'est ainsi que la vie a dû mettre en place très précocement les canaux à eau. Dans une peau normale, la teneur en eau de l'épiderme est d'environ 10 à 15% au niveau de la couche cornée et de 60 à 70% au niveau des couches les plus profondes. Lorsque cette teneur baisse en dessous du seuil critique de 10% dans les cellules cornées, la surface épidermique devient sèche, tend à se craqueler et perd l'élasticité qui conditionne la douceur et le velouté d'une peau normale. La perte en eau va entraîner l'augmentation de la synthèse des lipides épidermiques provoquant ainsi une séborrhée réactionnelle(Elias PM, Epidermal lipids, barrier function, and desquamation-J Invest Dermatol. 1983 Jun ; 80 suppl : 44s-49s). Avec le temps, cette hyper production lipidique va s'épuiser pour conduire inévitablement à une peau sèche.Il en résulte des sensations cutanées inconfortables et désagréables, telles que des tiraillements et des démangeaisons, un aspect inesthétique notamment ridé et vieilli de la peau. Les pertes cutanées en eau peuvent être d'origine diverse, héréditaire ou acquise. La régulation de la distribution de l'eau se fait grâce à un ensemble d'hormones dont le chef de file est l'aldostérone. Tous les dysfonctionnements de la sécrétion endocrinienne des stéroïdes : stéroïdes sexuels, gluco- et minéralo- corticostéroïdes vont ainsi interférer avec le fonctionnement des canaux à eau en agissant sur les protéines du canal appelées aquaporines et induire des dysfonctionnements secondaires. En outre, les pertes en eau proviennent parfois d'un dysfonctionnement primaire des aquaporines. Ces protéines voient leur synthèse diminuer avec l'âge, leur fonctionnement s'altérer et leur efficacité diminuer comme beaucoup de systèmes biologiques. Les aquaporines constituent une famille de protéines dont la fonction est de laisser passer sélectivement les molécules d'eau. Egalement dénommées canaux hydriques , elles sont situées dans les membranes cellulaires et jouent ainsi un rôle fondamental dans les mouvements transmembranaires d'eau, dans les tissus animaux ou végétaux où elles sont réparties plus ou moins spécifiquement (Borgnia MJ et al. Functional reconstitution and characterization of AqpZ, the E.coli water channel protein. J Mol Biol. 1999 sep 3; 291(5): 119-79)et al ; 1999). A l'heure actuelle, l'aquaporine identifiée au niveau de la peau des Mammifères, dénommée aquaporine de type 3 (AQP3) a fait l'objet de nombreuses études. La synthèse de cette protéine augmente de manière importante après la naissance. Cette élévation brutale de l'expression de AQP-3 est en corrélation avec le changement de facteur hygrométrique du milieu ambiant et permet ainsi d'empêcher les pertes en eau et de maintenir la peau dans un état d'hydratation normal en milieu aérien. Il a été montré que la délétion génétique de AQP3 entraîne une baisse de perméabilité à l'eau avec un dessèchement très important. Un dysfonctionnement des AQP3 se traduit donc par une altération de l'hydratation et des pertes en eau. (Ma T et al-Impaired Stratum Corneum hydration in mice lacking epidermal water channel aquaporin-3-2002; J. Biol. Chem.; 277(19); pl7147-17153). L'aquaporine de type 3 (AQPS 3) est exprimée au niveau de l'épiderme suivant un gradient de densité. Très présente au niveau de l'assise basale, elle est quasiment absente au niveau de la couche cornée. L'AQPS 3 a la caractéristique de laisser passer de manière spécifique outre les molécules d'eau, les molécules de glycérol qui constituent un élément essentiel dans la mise en place du film hydrolipidique dont on connaît le rôle de barrière très efficace contre les pertes en eau cutanées (Mariko Hara, AS Verkman, Glycerol replacement corrects defective skin hydration, and barrier function in aquaporine-3-deficient mice- PNAS 100 :7360-7365). Elle permet donc d'éviter les pertes d'eau vers l'extérieur, en ramenant l'eau vers l'intérieur.Elle contribue, par régulation interne, à restaurer les réserves et la quantité d'eau nécessaire à la peau en amenant l'eau depuis les compartiments vasculaires jusque dans l'épiderme. Enfin, elle assure une répartition de l'eau par diffusion et osmose des cellules à forte teneur en eau (kératinocytes des couches profondes) vers les cellules à faible teneur en eau (cornéocytes). En préservant le capital hygrométrique cutané, les aquaporines et notamment les aquaglycéroporines jouent ainsi un rôle essentiel dans le maintien de l'aspect rebondi et jeune de la peau. Les mécanismes de régulation du fonctionnement et/ou de l'expression des aquaporines sont spécifiques mais non encore complètement élucidés. Il est connu cependant que l'activité des aquaporines peut être modifiée par différents ligands qui agissent sur la conformation de ces protéines, provoquant leur ouverture ou leur fermeture. Les hormones telles que le ligand naturel aldostérone, la LPH, l'ACTH et les (3-endorphines interviennent dans cette régulation du transit de l'eau par action sur les aquaporines. Certaines hormones sexuelles du type stéroïde, telles que l'oestradiol et la testostérone sont également connues pour interférer avec le ligand naturel sur le récepteur des aquaporines et altérer le fonctionnement des protéines qui agissent sur le passage de l'eau.Les travaux menées par la Demanderesse ont ainsi permis d'observer que l'oestradiol diminue le fonctionnement de l'aquaporine. La testostérone, en revanche, rétablit le fonctionnement de l'aquaporine et augmente le passage de l'eau. De même, l'aldostérone en rendant les épitopes de l'aquaporine plus accessibles, et donc plus sensibles à l'action des autres ligands, augmente l'activité du canal et améliore le passage de l'eau dans l'organisme. L'aldostérone agirait donc sur la disponibilité du canal par un changement de conformation protéique. A long terme, sous l'action de ces différents facteurs de régulation, les aquaporines peuvent présenter certains dysfonctionnements qui se traduisent parfois par des manifestations contradictoires. En effet, certaines femmes présentent, à la fois, une peau sèche et une rétention d'eau. La peau sèche provient d'une absence d'eau induite par la fermeture excessive du canal. De même, si la rétention d'eau peut être la conséquence de l'ouverture excessive du canal elle peut être induite par sa fermeture. Dans ce cas, l'eau du compartiment extravasculaire ne diffuse plus vers les vaisseaux. La sensation de jambes lourdes et la tendance à gonfler sont des manifestations cliniques d'un dysfonctionnement biologique des canaux à eau.En pharmacologie, certains de ces ligands actifs sur les aquaporines, notamment l'antagoniste de l'aldostérone, la spironolactone, sont utilisés pour réguler la répartition de l'eau dans le corps et réduire les manifestations pathologiques liées aux dysfonctionnements des aquaporines. Cependant, la plupart des désordres ressentis par les femmes au cours de leur cycle hormonal sont de l'ordre principalement esthétique sans justifier de démarche thérapeutique. Il est nécessaire alors de pouvoir traiter ces désordres de manière non thérapeutique. D'une manière générale, les dysfonctionnements de AQP3 peuvent apparaître aussi avec la sénescence. Avec l'âge en effet, on observe un ralentissement du renouvellement cellulaire. Ceci s'accompagne d'un effondrement général de la synthèse des protéines et se traduit par un déséquilibre de la balance synthèse/dégradation des protéines, en faveur de la dégradation. Ce déséquilibre affecte alors d'une manière directe le métabolisme des aquaporines qui, en conséquence, voient leur nombre baisser et leur taux d'expression chuter. L'utilisation d'émollients a été proposée pour répondre à toutes sortes de problèmes de régulation de la répartition de l'eau au niveau cutané. Ces agents induisent, en effet, une restauration immédiate de la teneur en eau. Cependant, dans le cas d'un dysfonctionnement des aquaporines, les émollients ne constituent pas une réponse adaptée, dans la mesure où ils ne traitent pas les causes. Il y avait donc un réel besoin d'identifier des substances susceptibles d'agir spécifiquement sur les aquaporines de manière à rétablir la libre circulation de l'eau et ainsi l'aspect jeune et souple de la peau. Une solution, présentée dans le brevet FR 283 1058 (THOREL Jean-Noël), consiste en l'application directe d'aquaporines sur la peau. Aucune précision n'est cependant apportée quant au mode de production, l'origine ou le type d'aquaporine requis. Cette invention, ne peut pas être mise en u̇vre aisément et a certainement un coût de revient élevé. En outre, la pénétration d'un peptide d'un poids considérable à travers les différentes couches de l'épiderme semble peu probable sinon impossible. La Demanderesse vient de constater qu'un extrait de grenade permet d'agir sur les aquaporines et constitue une solution efficace à ce besoin. La Demanderesse a également constaté que ledit extrait selon l'invention possède des propriétés qui en font un remarquable agent naturel cosmétique, nutraceutique ou pharmaceutique. La grenade est le fruit du grenadier : Punica granatum. Elle se présente sous la forme d'une baie à la peau épaisse et rouge-brun. Son jus posséderait des propriétés anti-diurétiques ou adoucissantes, en particulier pour les inflammations oculaires, ou stimulantes pour le cuir chevelu (DE4330597). L'écorce de Grenade a été utilisée dans le domaine médical, notamment pour le traitement des maladies gastro-intestinales. Par sa richesse en tanins, l'écorce de grenade a également été utilisée pour les colorations capillaires comme agent colorant mais aussi pour le maintien de la coloration capillaire (FR2 837 698 Pierre Fabre Dermo-cosmétique SA). La peau de grenade a également été utilisée en usage externe. Ainsi, le brevet FR 2640 135 (Cherkaoui Zhour) décrit son utilisation dans une composition stomatologique pour ses propriétés astringentes et caustiques.Elle a également été utilisée pour ses propriétés cicatrisantes dans une pâte dentifrice (FR2 837 698 Al-Janabi Suhad). La grenade a été utilisée, par ailleurs, sous forme d'extrait à base de propylène glycol, pour ses propriétés stimulantes de la micro-circulation (W02004/004673 Coty B.V.). Les graines sont également utilisées pour leurs propriétés anti-rides sous forme d'extrait dans un alcool polyhydrique (JP20000143491-Pola Chem ind. Inc). Un extrait éthanolique de grenade a été décrit comme agent inhibiteur des protéases plasmiques (JP20032755 Shiseido). Aucune précision ne permet cependant de réaliser cet extrait ou d'en déterminer sa composition. A la différence de l'art antérieur, l'extrait de grenade selon l'invention est obtenu selon un procédé particulier effectué à partir de pulpe de fruit déshydratée. La Demanderesse a, en effet, constaté que cet extrait, produit dans des conditions particulières, constitue un nouvel agent aux remarquables propriétés pharmacologiques et confère de multiples propriétés aux compositions qui en contiennent. Selon un premier aspect de l'invention, la Demanderesse a constaté, de manière très inattendue, que l'extrait de grenade selon l'invention et les compositions qui en contiennent, agissent sur les aquaporines. L'étude présentée dans l'exemple II met en évidence les importantes différences histologiques existant entre des explants de peaux jeunes et âgées. En particulier, l'extrait de peau sénescente n'exprime qu'une très faible présence et/ou activité des aquaporines et présente un aspect atrophié.Le test IV fait, par ailleurs, apparaître qu'avec l'âge, l'expression des aquaporines dans la peau diminue et que l'épaisseur de l'épiderme augmente. Cette étude montre, en outre, que l'extrait de grenade selon l'invention permet de rétablir l'activité des aquaporines, notamment lorsque celle-ci est diminuée et/ou altérée, en particulier par des phénomènes de sénescence. Le test V effectué in vitro sur des kératinocytes avec des concentrations variables d'extrait montre nettement cet effet de stimulation, dont l'intensité augmente avec la concentration en extrait. L'étude ex vivo (XII) sur une peau âgée montre ainsi qu'une crème contenant de l'extrait de grenade provoque une amplification de l'expression des aquaporines, et permet en particulier de rétablir un profil d'expression d'aquaporines proche du type peau jeune. Une composition contenant de l'extrait de grenade selon l'invention provoque en outre une augmentation du volume et de la profondeur de l'épiderme. Selon l'invention, l'extrait de pulpe de grenade rétablit également les aquaporines dont l'activité est diminuée par influence hormonale. L'étude IX effectuée in vitro sur des kératinocytes montre l'influence de différents ligands sur l'activité des aquaporines, après un contact de 24heures et 48heures. Il ressort des résultats que l'oestradiol provoque une diminution de l'activité des aquaporines à partir de certaines doses, à la différence de la testostérone. Cet effet perdure plus de 48heures. L'extrait de pulpe de grenade selon la présente invention augmente fortement l'expression des aquaporines, et ce, même en présence de concentrations d'oestradiol qui normalement en bloquent l'expression.Ces doses d' stradiol correspondent aux concentrations physiologiques d' stradiol observées dans le sang lors du pic oestrogénique pré-ovulatoire et au cours de la période qui précède les menstruations. Il semble donc que l'extrait selon l'invention se comporte, dans son action sur les cellules, comme un antagoniste de l' stradiol. Cet extrait n'affecte pas et n'est pas affecté par la testostérone. Cette observation est confirmée par le test X effectué sur des fibroblastes. Selon un autre aspect, l'extrait de grenade selon l'invention permet de rétablir les taux tissulaires de collagène. Les femmes, en particulier, subissent des variations de taux hormonal d'oestradiol qui diminuent la synthèse de collagène et augmentent l'activité de la collagénase interstitielle. Cette diminution de synthèse associée à une amplification de l'activité enzymatique de dégradation est vraisemblablement une des raisons majeures de la diminution de l'épaisseur de la peau chez la femme. Au cours du cycle hormonal, la teneur en oestradiol dans le sang varie de 20 à 700 Microg. Les résultats des tests présentés en exemple X montrent, en effet, que, à faible dose, l'oestrogène stimule la synthèse de collagène. A forte dose en revanche, l' stradiol augmente la synthèse des métallo protéinases et en particulier des collagènases.La peau de la femme, soumise aux variations hormonales, présente donc un bilan déficitaire de synthèse de collagène de type 1 et 3. Les résultats obtenus dans ce test montrent également que l'extrait de grenade selon l'invention stimule d'un facteur 4 la synthèse du collagène. Son utilisation permet donc de rétablir la synthèse de collagène dans la peau, et en particulier dans la peau de la femme d'en restaurer la présence. D'une manière générale, l'extrait selon l'invention constitue donc un agent particulièrement intéressant pour lutter contre les effets indésirables des estrogènes sur la peau par son action stimulante à la fois des aquaporines et de la synthèse du collagène. Selon un autre aspect, l'extrait de grenade selon l'invention provoque une augmentation de la communication intercellulaire. Le test de transfert au Jaune Lucifer, présenté dans l'étude VIII, a en effet montré, qu'à la concentration de 10 ou 20Microg/ml, la communication intercellulaire est augmentée dans les cellules épidermiques. Cette augmentation de la communication intercellulaire est liée à l'amélioration de l'environnement cellulaire et, d'une manière plus générale, à une meilleure fonctionnalité des pores transmembranaires. Selon un dernier aspect, l'extrait de grenade selon l'invention est dénué de toxicité cellulaire comme ceci ressort des résultats du test III, où l'extrait est testé à différentes concentrations (5, 10, 20, 50 et 100Microg/ml) sur les fibroblastes et sur les kératinocytes. L'invention concerne donc un nouvel extrait de grenade obtenu par un procédé d'extraction consistant en l'épuisement de la pulpe du fruit déshydraté avec un solvant polaire à température inférieure à 80[deg]C. L'extraction de la pulpe de grenade utilisé dans la présente invention peut être effectuée de diverses manières, notamment par macération, infusion, percolation ou digestion. Afin d'extraire tous les principes actifs, on utilise, selon l'invention, des solvants polaires pour effectuer la macération de la pulpe du fruit après déshydratation. Les solvants apolaires sont exclus pour la réalisation de cet extrait. L'extraction est réalisée à une température inférieure ou égale à 80[deg]C. Ainsi, on utilisera un solvant polaire comme les éthers de glycol ou préférentiellement un solvant polaire ayant un point d'ébullition inférieur à 80[deg]C choisi parmi le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. A titre d'exemple, l'extrait selon l'invention peut être réalisé en faisant macérer un kilogramme de fruit desséché et épépiné dans cinq litres d'éthanol ou d'acétone pendant 24 heures. Après filtration du solvant et concentration, l'opération d'épuisement est répétée plusieurs fois afin de rendre l'extrait final plus concentré en principes actifs. L'extrait de grenade ainsi obtenu selon l'invention peut être utilisé, après étalonnage de son activité et dilution dans un solvant approprié tel que la glycérine, dans des compositions pharmaceutiques et en particulier dermatologiques, dans des compositions alimentaires ou cosmétiques pour stimuler l'expression des aquaporines, et surtout l'activité et/ou l'expression des aquaporines en particulier celle de type 3 au niveau de la peau, pour la synthèse de collagène et pour améliorer la communication intercellulaire notamment quand celle-ci est déprimée par le temps, une activité hormonale, physiologique ou pharmacologique. La présente invention a ainsi pour objet une composition cosmétique, nutraceutique ou pharmaceutique, et en particulier dermatologique destinée à stimuler les aquaporines, contenant l'extrait de grenade selon l'invention, éventuellement associé et/ou combiné à un véhicule cosmétique ou pharmaceutique approprié. Dans les compositions selon l'invention, l'extrait sera préférentiellement présent à une concentration variant de 0.01% à 40% par rapport au poids total de la composition, avantageusement à une concentration d'extrait pur variant de 0,02 à 10 %. Les compositions selon l'invention sont destinées à l'application par voie orale ou à une application par voie topique, en particulier cutanée, chez l'homme et/ou l'animal. Les compositions cosmétiques ou dermatologiques se présentent sous une forme adaptée à l'application topique. On pourra citer à titre d'exemples, les émulsions diverses, notamment huile dans eau et eau dans huile, gel, lotion, crèmes, mousses, huiles, laits ... Ces compositions sont réalisées selon les méthodes classiques de formulation. L'extrait selon l'invention présente une bonne compatibilité avec les autres constituants. Pour la réalisation des émulsions, il sera préférentiellement intégré dans la phase grasse, du fait de sa base polaire. L'extrait de grenade, éventuellement sous la forme d'une composition cosmétique ou nutraceutique en contenant précédemment décrite, peut tout particulièrement être utilisée pour prévenir et/ou réduire les manifestations inesthétiques et/ou inconfortables liées au dysfonctionnement des aquaporines. Elles conviennent bien pour réparer la répartition de l'eau dans les tissus et en particulier dans la peau sénescente, pour prévenir et/ou réduire les manifestations inesthétiques, sensorielles notamment les sensations inconfortables, résultant de l'action des strogènes sur les aquaporines. Les compositions pharmaceutiques se présentent sous une forme adaptée à l'administration orale, et en particulier sous forme de comprimés, de gélules, encapsulés dans des gélules molles, solutions ou suspensions buvables. De manière particulièrement avantageuse, la Demanderesse a constaté qu'en administration orale, l'extrait de grenade permet de contribuer au traitement du dysfonctionnement général des canaux à eau et à améliorer la répartition générale de l'eau dans le corps. En effet, chez les sujets présentant une rétention d'eau notable, l'extrait de grenade a provoqué une augmentation de la diurèse et une diminution des oedèmes. Aucune modification des concentrations ioniques sériques et sanguines, ou des taux de créatinines urinaires et sanguines n'a par ailleurs été observée pendant le traitement.On a toutefois observé une baisse significative de l'aldostérone chez les sujets qui avaient des concentrations sériques très élevées. La composition pharmaceutique peut également être utilisée sur les muqueuses, notamment sous la forme de suppositoires ou d'ovules vaginaux. L'invention a également pour objet l'utilisation de compositions pharmaceutiques pour réaliser un médicament destiné à prévenir et/ou traiter, par application topique ou par voie orale, les manifestations symptomatiques des dysfonctionnements des aquaporines, notamment les jambes lourdes. L'invention a, en outre, pour objet un procédé de soin cosmétique consistant à appliquer sur une zone de peau, de muqueuse et/ou de phanère, une composition cosmétique selon l'invention, pour le soin, le traitement cosmétique et/ou la prévention des manifestations inesthétiques et/ou inconfortables du dysfonctionnement des aquaporines. L'invention concerne enfin un procédé d'obtention de l'extrait de grenade selon l'invention caractérisé en ce que la pulpe du fruit est déshydratée par séchage suivi selon les nécessités d'une lyophilisation, elle est épuisée à l'aide d'un solvant polaire à une température inférieure à 80[deg]C, puis le solvant est filtré et enfin l'extrait est concentré. De plus, si nécessaire, l'extrait concentré peut être dilué dans un solvant approprié afin d'obtenir une solution présentant une activité standardisée sur les aquaporines. L'extrait de grenade selon l'invention et les compositions qui en contiennent ne présentent aucune toxicité et ne provoquent aucune intolérance locale. Ils ne sont pas non plus allergisants. Les exemples suivants sont présentés pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Sauf mention contraire, les concentrations sont données en pourcentage par rapport au poids total de composition. I. PROTOCOLE DE REALISATION DE L'EXTRAIT L'extrait testé dans les études ci-après, a été réalisé selon le protocole suivant : - 1000g de fruit sont lavés, épépinés puis lyophilisés. La partie coriace est éliminée. - La matière végétale est broyée de manière à offrir le meilleur rendement d'extraction. Le diamètre des grains de la poudre varie selon la teneur en principes actif et la maturité des fruits. - La poudre ainsi formée est lavée à l'eau, additionnée éventuellement d'antiseptique, afin d'éliminer une grande partie des sucres. L'eau de lavage est extraite par le moyen le plus approprié. - La matière végétale sous forme de poudre pauvre en sucres obtenue est d'environ 5 à 50g. - Elle est mise à macérer dans 500g d'éthanol. - Le solvant est filtré. - La phase éthanolique est concentrée par évaporation sous vide. Cinq cycles de rinçage-extraction effectués sur cette matière végétale sont suffisants pour épuiser les principes actifs de la plante et effectuer l'ensemble des tests ci-après décrits. Des appareils comme le Kumagawa, ou le Soxhlet peuvent convenir pour autant qu'on opère à des températures inférieures à 80[deg]C et sur des quantités assez réduites. Les techniques modernes d'extraction de l'eau avec capture sur des pièges peuvent être envisagées. II. ETUDE HISTOLOGIQUE COMPAREE DE L'EXPRESSION DES AQUAPORINESAQP-3 SUR DES COUPES DE PEAU JEUNE ET DE PEAU AGEE. Principe : Les immunomarquages sont effectués à l'aide d'un anticorps spécifique dirigé contre l'Aquaporine humaine type 3 (anticorps poly clonal de chèvre ; Tebu). Méthode : Des explants de peau issus d'un individu jeune âgé de 3 ans et des explants de peau âgée extraite d'un individu âgé de 53ans, conservés à -70[deg]C, sont coupés à l'aide d'un cryostat à une épaisseur de 5 Microm, à une température de -20[deg]C. Les coupes ainsi réalisées sont immédiatement fixées sur lames pendant 5 minutes à l'aide d'une solution d'acétone préalablement refroidie à -20[deg]C. Après rinçage dans un bain de tampon PBS, les lames sont prêtes pour les réactions d'immunofluorescence indirecte. La solution d'anticorps est appliquée sur les coupes de peau pendant 30 min, à température ambiante. Après rinçage dans un bain de tampon PBS, les lames sont essuyées, puis les coupes sont incubées dans une autre solution d'anticorps anti-IgG de chèvre conjugué à la fluorescéine pendant 30 min, à température ambiante, et à l'abri de la lumière. Après rinçage avec le tampon PBS, puis montage des lames, un appareil de prise de vue numérique réalise automatiquement des clichés après 2 secondes d'exposition au rayonnement U.V de la lampe. Résultats et conclusion : L'immunomarquage de AQP révèle des différences importantes au niveau de l'intensité de fluorescence entre la peau jeune et la peau âgée. Pour les explants provenant du sujet jeune, la fluorescence est très intense et délimite fortement les kératinocytes. Les cellules germinatives assises sur la jonction dermoépidermique sont les plus marquées. Les cornéocytes restituent très peu de fluorescence. Les cellules ont des contours parfaitement délimités. La qualité, la répartition et l'intensité de fluorescence reflètent une expression importante d'aquaporines caractérisant une peau jeune. Celles-ci sont donc très concentrées et très nombreuses dans les membranes des explants du sujet jeune. La peau provenant du sujet jeune, présente de nombreuses couches cellulaires. Les explants provenant du sujet âgé montre une fluorescence moins intense et plus diffuse, de plus, la fluorescence des cellules germinatives n'affecte pas l'ensemble du contour cellulaire. Les contours des cellules se distinguent mal et le marquage présente un aspect en fer à cheval ouvert vers le derme. Cette image de la fluorescence montre qu'il n'existe que peu d'aquaporines ou qu'elles sont mal exprimées. Les épitopes étant occupés par d'autres ligands empêchant la fixation de l'anticorps. Tout ceci caractérise la peau âgée. Dans les membranes des cellules des explants du sujet âgé, les aquaporines sont donc peu nombreuses voire absentes ou fixent mal les anticorps dirigés contre elles. Pour la peau provenant du sujet âgé, on observe un épiderme atrophié. III. EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE : CYTOCOMPATIBILITE Principe : Le test XTT est basé sur la transformation du sel de tétrazolium XTT [2,3-bis(2-méthoxy4nitro-5-sulfophenyl)-H-tetrazolium-5-carboxanilide sel interne] par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en un sel de formazan jaune-orange hydrosoluble. Cette solution ainsi formée est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de microplaques (Metertech) à une longueur d'onde de 450 nm. La densité optique révélée est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes (lorsqu'il y a une cytotoxicité plus ou moins importante) et à l'activité mitochondriale (lorsqu'il n'y a pas de cytotoxicité). Matériels : - Fibroblastes de peau humaine : FPH (préparés au laboratoire). - Extrait éthanolique de grenade - Lignée kératinocytaire humaine : HaCaT. - Milieu de culture : Milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau f tal et des antibiotiques (pénicilline et streptomycine). - Boites de culture : Flasquettes de 25 cm et micro plaques 96 puits (Falcon). - Lecteur de micro plaques (Metertech) - XTT : solution à 1 mg/ml de tampon PBS contenant 1% de tampon PMS. - Tampon PBS stérile sans calcium ni magnésium. - Trypsine-EDTA (Life Technologies). - Compteur de cellules : Coulter-Counter ZM (Beckman/Coulter) Protocole : Les cellules en culture confluente sont trypsinées à l'aide de la solution trypsine-EDTA puis comptées au Coulter-Counter. Elles sont ensuite ensemencées à une densité de 40.000 cellules/puits dans 200Microl de milieu de culture. Après une nuit d'incubation à 37[deg]C dans une étuve à C02, les surnageants de culture sont éliminés, puis remplacés avec du milieu de culture neuf (200Microl/puits) contenant différentes concentrations d'extraits. Après 48 heures d'incubation, les surnageants sont éliminés et une quantité de 100 Microl de la solution XTT est rajoutée dans chaque puits pendant 2 heures à 37[deg]C. Les microplaques sont alors placées dans le Metertech pour la lecture des densités optiques à 450nm. Résultats : Conclusion : Les résultats montrent que, jusqu'à la concentration de lOOug/ml de milieu de culture, l'extrait alcoolique de grenade ne présente aucune toxicité sur les 2 types cellulaires humains d'origine cutanée qui sont les kératinocytes (HaCat) et les fibroblastes (FPH). Aux concentrations testées, l'extrait de grenade est donc parfaitement biocompatible et cytocompatible. IV. EFFET DE L'AGE SUR L'EXPRESSION DES AQUAPORINES ET EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE Principe : L'intensité du signal fluorescent et l'épaisseur de la peau de sujets âgés de 33 à 59 ans ont été mesurées avant et après traitement avec de l'extrait de grenade. Résultats : Conclusion : Avec l'âge, l'expression des aquaporines diminue comme l'épaisseur de l'épiderme. L'extrait de grenade selon l'invention rétablit la fluorescence des canaux à eau lorsque celle ci est diminuée par l'âge. V. EFFET DE LA CONCENTRATION DE L'EXTRAIT DE GRENADE SURL'EXPRESSION DES CANAUX A EAU AQP-3 PAR LES KERATINOCYTES HUMAINS. - Principe : Les canaux à eau sont objectivés à l'aide de la technique d'immunofluorescence indirecte en utilisant un anticorps spécifique anti-aquaporine type 3 (TEBU réf. Sc-9885 qui est un anticorps polyclonal de chèvre). Matériels et méthodes : Les cellules utilisées dans ce test in vitro sont des kératinocytes humains HaCat. Elles sont ensemencées dans des puits sur lame (lame à 16 puits) à une densité de 40 000 cellules dans 200Microl de milieu de culture/puits. Après une nuit d'incubation à 37[deg]C dans un incubateur à CO2, les cultures sont rincées avec du PBS stérile, puis du milieu de culture neuf contenant de l'extrait de Grenade est rajouté dans chaque puits, sauf dans le puits témoin où le milieu de culture est ajouté seul, sans aucun extrait. Quatre échantillons sont ainsi réalisés : - trois échantillons de kératinocytes traités chacun avec des concentrations croissantes d'un extrait de grenade (5ug/ml, 10Microg/ml, 15ug/ml) - un échantillon de contrôle qui constitue le témoin négatif. Après 72 heures d'incubation à 37[deg]C dans un incubateur à C02, les surnageants sont éliminés, les cultures sont rincées avec du tampon PBS stérile et les cellules sont ensuite fixées à l'aide de méthanol (200ul/puits) à -20[deg]C pendant 5 minutes. Les cellules sont alors rincées avec du PBS stérile puis placées dans le réfrigérateur à + 4[deg]C. Une quantité de 150 (il de l'anticorps en solution sont rajoutés dans chaque puits. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, les puits sont rincés 3 fois avec du PBS. Une quantité de 150Microl de la solution d'anticorps anti-IgG de chèvre conjugués à la fluorescéine est rajoutée dans chaque puits. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, les puits sont rincés 3 fois avec du PBS, ensuite les lames sont montées puis observées au microscope à fluorescence. Des clichés sont pris après un temps d'exposition de 2 secondes et observés. Résultats et conclusion: On observe que le témoin négatif présente une très légère fluorescence verte au niveau du contour des kératinocytes. Les autres échantillons ayant reçu l'extrait de grenade présentent une fluorescence dont l'intensité augmente avec la concentration d'extrait reçu, traduisant une augmentation de l'expression des aquaporines. Avec un traitement contenant 5ug/ml d'extrait de grenade, l'intensité est plus marquée que le témoin. Au-delà de lOug/ml d'extrait de grenade, l'intensité de la fluorescence est beaucoup plus forte et les contours cellulaires s'observent nettement. L'utilisation de l'extrait de grenade selon l'invention stimule l'expression des aquaporines de type 3 par les kératinocytes en culture. VI. EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE Principe : La prolifération cellulaire est évaluée par la technique de comptage direct à l'aide d'un compteur de cellules. Matériels : - Fibroblastes de peau humaine : FPH (préparés au laboratoire). - Extrait éthanolique de grenade. - Lignée kératinocytaire humaine : HaCaT. - Milieu de culture : Milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau f tal et des antibiotiques (pénicilline et streptomycine). - Boites de culture : Flasquettes de 25 cm et plaques 24 puits (Falcon). - Tampon PBS stérile sans calcium ni magnésium. - Trypsine-EDTA (Life technologies). - Compteur de cellules : Coulter-Counter ZM (Beckman/Coulter) Protocole : Le test de prolifération cellulaire est réalisé dans des plaques à 24 puits (Falcon) avec une faible densité cellulaire de départ afin de permettre aux cellules de proliférer sans difficulté (élimination du problème d'inhibition de contact observé dans une culture confluente). Les cellules en culture confluente sont trypsinées, puis ensemencées à une densité de 40.000 cellules/puits dans 1 ml de milieu de culture. Elles sont ensuite mises en incubation à 37[deg]C dans un incubateur à CO2 pendant une nuit, pour leur permettre de bien adhérer au plastique. Après élimination des surnageants, les concentrations de l'extrait de grenade en solution dans le milieu de culture sont ajoutées. Après 72 heures de culture, les cellules sont mises en suspension par trypsination, puis numérées à l'aide du compteur de cellules. Résultats : Conclusion : Les tests de prolifération montrent que l'extrait de grenade produit un effet inhibiteur dosedépendant, aussi bien sur des cultures de kératinocytes (HaCaT) que sur des cultures de fibroblastes (FPH). Cette inhibition de la prolifération est statistiquement significative à partir d'une concentration de 10Microg/ml de milieu de culture. Il est intéressant de noter une réduction de la prolifération sans réduction de l'activité mitochondriale. Ceci signifie que le produit n'aura aucun effet excessif sur la croissance tumorale. VII. EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE SUR LA SYNTHESE DES PROTEINES PARLES FIBROBLASTES DE DERME HUMAIN EN CULTURE. Principe : Cette étude a pour objectif de déterminer l'effet direct de l'extrait de grenade sur la synthèse de protéines par les fibroblastes. Pour ce faire, les protéines des fibroblastes sont dosées après contact avec des extraits de grenade plus ou moins concentrés selon l'invention. Matériels et protocole : Le dosage des protéines est réalisé à l'aide d'un kit commercialisé sous le nom de BC Assay kit (Interchim réf.). Il s'agit d'un test colorimétrique basé sur la réduction des ions Cu2+ en Cu+ par les liaisons peptidiques des protéines. L'acide bi-cinchoninique (BC) chélate les ions Cu+ avec une très forte spécificité pour former un complexe soluble coloré en violet. La réaction est mesurée par l'absorbance du complexe Cu+ final à une longueur d'onde de 562 nm. La densité optique est directement proportionnelle à la concentration en protéines, avec une partie linéaire entre 5-20ug/ml et 1-2 mg/ml. La gamme étalon est réalisée à partir d'une solution standard de Sérum Albumine Bovine (BSA) à 2 mg/ml. La courbe étalon est tracée à l'aide de 7 points de densité optique (DO) correspondants à 7 concentrations différentes de protéines : 0,20, 100, 250, 500, 750Microg/ml et 1 et 2 mg/ml. On définit une courbe DO= f [concentration en protéines] telle que y= 0.008x + 0.0623 Les cellules utilisées dans ce test sont des fibroblastes de derme humain, préparés à partir d'un prélèvement sain de la peau de visage issue d'une chirurgie plastique effectuée sur une femme âgée de 60 ans. Les cellules ainsi obtenues sont cultivées dans un milieu de culture classique contenant 10% de sérum de veau f tal et des antibiotiques. Pour ce qui concerne le présent test, les cellules ont été utilisées en P-5. Après trypsination et comptage des cellules à l'aide du Coulter-Counter ZM, 50.000 cellules dans un volume de 200Microl sont ensemencées dans chaque puit d'une micro plaque à 96 puits. Les cellules sont alors incubées pendant 48 heures en l'absence (puits contrôle) ou en présence d'extrait de grenade. Après élimination des surnageants et rinçage des tapis cellulaires, les protéines sont dosées suivant le protocole du kit. Résultats : Les résultats en Microg de protéines/ml : Comme on peut le constater sur les résultats obtenus ci-dessous, les deux concentrations de l'extrait de grenade (5Microg/ml et 20Microg/ml) testées ne montrent aucun effet sur la synthèse des protéines par les fibroblastes en culture après 48 heures d'incubation. - Conclusion : Plusieurs hypothèses peuvent être évoquées devant ces résultats. La synthèse des protéines aquaporines n'est pas affectée par l'extrait de grenade qui n'agit ainsi que sur la conformation de la structure du canal lorsque celle-ci est affectée. Les protéines constituant les canaux à eau sont en trop petites quantités pour que leurs variations par rapport à l'activité cellulaire propre soient détectables. VIII. EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE SUR LA COMMUNICATIONINTERCELLULAIRE But : L'effet de l'extrait de grenade sur la communication cellulaire est évalué à l'aide de la technique de transfert du Jaune-Lucifer entre les cellules épidermiques en culture, à la suite d'un accrochage réalisé sur le tapis cellulaire. Méthodes : Le marqueur utilisé est le Jaune Lucifer (L.Y) : il s'agit d'un marqueur fluorescent auquel les membranes cytoplasmiques sont imperméables. Le L.Y. a été solubilisé dans le milieu de culture à une concentration de 2 mg/ml. Les kératinocytes préalablement ensemencés à confluence sur des lames à chambres (lame à 8 chambres) sont rincés avec du PBS stérile puis incubés soit en présence du milieu de culture uniquement (culture témoin) soit en présence du milieu de culture supplémenté en Extrait de grenade (10 ou 20ug/ml). Après une nuit d'incubation à 37[deg]C dans un incubateur à C02, le tapis cellulaire est coupé au milieu avec une lame stérile et immédiatement après, 100Microl de la solution de L.Y sont rajoutés par chambre.Après une minute d'incubation, les tapis cellulaires sont rincés avec du PBS stérile puis fixés grâce à une solution froide de méthanol, pendant 5 min à -20[deg]C. Après rinçage avec du PBS, les lames sont ensuite montées puis observées au microscope à fluorescence. Résultats et conclusion: Les résultats montrent que, sur des cultures non traitées par l'extrait de grenade, le LY n'a pratiquement pas diffusé dans les cellules à partir de la coupure, alors que, sur les cultures traitées avec l'extrait de grenade, on observe une fluorescence intracellulaire de part et d'autre de la coupure. Ceci signifie que le marqueur est transféré plus facilement d'une cellule à l'autre. Ainsi, il apparaît que la communication intercellulaire se fait d'une manière plus facile et plus rapide. IX. EFFET DE DIFFERENTS LIGANDS SUR L'EXPRESSION DES AQUAPORINES DESKERATINOCYTE ET EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE Principe : Cette étude in vitro a pour objectif de déterminer l'effet induit par chaque ligand sur l'expression des aquaporines AQP-3. Elle consiste à mettre les différents ligands en contact avec des kératinocytes humains et à observer l'activité des aquaporines après des temps de contacts variables. Protocole : Cette étude est effectuée selon un protocole identique à celui de l'étude V portant sur l'effet de la concentration de grenade sur l'expression des canaux à eau AQP-3 par les kératinocytes humains . Différents ligands sont ainsi testés: - un témoin négatif réalisé avec l'excipient. - l'extrait de grenade selon l'invention à la concentration de 2 et 10 Microg / ml - l'oestradiol à la concentration de 10-7 M - la testostérone à la concentration de 10-7M - un mélange d' stradiol à 10-7 et d'extrait de grenade à 10Microg par ml - un mélange de testostérone à 10-7 et d'extrait de grenade à 10 Microg par ml. Le résultat sur l'expression des aquaporines est de même observé par immunomarquage à l'aide d'un anticorps spécifique dirigé contre l'aquaporine type 3 humain (anticorps polyclonal de chèvre ; Tebu). Résultats : Les résultats sont quantifiés par fluorimétrie. Conclusion : On observe que l'oestradiol à la concentration de 10-7 M diminue l'activité des aquaporines, de manière constante, à 24h et 48h d'environ 25%. Au contraire, la testostérone active l'expression des aquaporines à 24 heures d'un facteur 2,4. Cette expression n'est plus que de 1,5 après 48 heures de contact. L'extrait de grenade induit une augmentation de l'activité des aquaporines par rapport au témoin, équivalente à celle de la testostérone 10-7 M. Au contraire de la testostérone cette amélioration persiste à 48 H. L'action combinée de l' stradiol et de l'extrait de grenade annule l'effet délétère de l'estradiol sur l'expression des aquaporines. Dans cette combinaison l'extrait de grenade maintient son activité à 48H. L'action combinée de la testostérone et de l'extrait de grenade, ne modifie en rien l'action de l'extrait seul ou de la testostérone seule. L'effet se maintient bien dans le temps. Il apparaît donc que l'extrait selon l'invention provoque une augmentation physiologique de l'activité des aquaporines, peu différentes de celle de la testostérone naturelle. L'extrait de grenade antagonise l'action bloquante de l' stradiol sur les aquaporines et rétabli leur activité, la maintenant au niveau de celle de la testostérone naturelle. Cet effet est stable et se maintient longtemps. X. EFFET DE L'EXTRAIT SELON L'INVENTION SUR LA SYNTHESE DECOLLAGENE DES FIBROBLASTES Principe : Les kératinocytes sont mis en contact avec différents ligands. Le milieu neuf d'incubation des kératinocytes est récupéré et utilisé pour conditionner des fibroblastes sur lesquels on mesure l'activité des métalloprotéinases et la synthèse de collagène. Protocole : Les kératinocytes sont incubés pendant 6 heures avec le ligand puis sont rincés plusieurs fois avec du milieu neuf afin d'en éliminer le ligand. Ils sont ensuite laissés 24 heures à incuber dans un milieu neuf de culture. Ce milieu ainsi préparé est alors prélevé et ajouté à des fibroblastes en culture depuis 48heures. Deux ligands sont testés à différentes concentrations : l' stradiol (20pg, 150pg, 700pg) et l'extrait de grenade selon l'invention (2u.g et 10Microg). Un témoin négatif est effectué contenant l'excipient. L'activité des métalloprotéinases (proMMPI) est alors dosée selon la méthode classique ELISA commercialisé en KIT . La synthèse de collagène est mesurée classiquement par fluorimétrie. Résultats : Les résultats sont indiqués en unités de densité optique: Conclusion : Les résultats montrent que l'oestradiol augmente la synthèse des collagènes de types 1 et 3. A forte dose, supérieure à 150pg, cependant, l' stradiol augmente la synthèse de métalloprotéinases et en particulier les collagènases. La teneur moyenne d'oestradiol dans le sang chez une femme varie de 20 à 700pg, le taux le plus élevé étant atteint peu avant la ponte ovulaire. Le bilan global de l'action de l' stradiol devient déficitaire (diminution d'environ 50% de la synthèse globale à 150pg et de 10% de la synthèse globale à 700pg d' stradiol) ce qui signifie que l' stradiol tend à diminuer l'épaisseur de l'épiderme par son action d'amplification de l'activité des métalloprotéinase. L'extrait de grenade selon l'invention en revanche, quelle que soit la dose testée, diminue l'expression des métalloprotéinases et augmente la synthèse de collagène. L'extrait de grenade selon l'invention stimule donc la synthèse globale de collagène. Avec l'ajout de 10 Microg d'extrait de grenade, cette synthèse est augmentée d'un facteur 4 par rapport au témoin. XI. EFFET DE L'EXTRAIT DE GRENADE SUR L'EXPRESSION DES RECEPTEURS AL'ALDOSTERONE (MCR) DE KERATINOCYTES HUMAINS EN CULTURE- COMPARAISON AVEC LA SPIRONOLACTONE But : L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'extrait de grenade et de la spironolactone, qui est un antagoniste de l'aldostérone, sur l'expression des récepteurs des minéralocorticoïdes dont l'implication dans les mouvements d'eau est bien connue. Protocole : Les cellules utilisées dans l'expérimentation sont issues d'une lignée kératinocytaire humaine appelée HaCaT, possède le même phénotype que les cellules de l'épiderme. Les cultures cellulaires confluentes sont trypsinées, puis ensemencées sur des lames contenant 16 puits, à une densité de 40.000 cellules/puits. Après une nuit d'incubation à 37[deg]C dans une étuve à C02, les surnageants de culture sont éliminés pour être remplacés avec du milieu neuf avec différents traitements : - 2 puits contrôle. - 2 puits contenant de la spironolactone (10Microg/ml de milieu de culture). - 2 puits contenant de l'extrait de grenade (10Microg/ml de milieu de culture). - 2 puits contenant de l'extrait de grenade + spironolactone (lOug de chaque / ml de milieu de culture). Après 48 heures d'incubation, les tapis cellulaires sont rincés puis fixés à l'aide d'une solution d'acétone pendant 2 minutes à -20[deg]C. Une quantité de 100 1 d'une solution d'anticorps dirigés spécifiquement contre les récepteurs d'aldostérone, sont alors placés dans chaque puit. Après 30 min d'incubation à température ambiante, les puits sont rincés plusieurs fois avec du tampon PBS. Une quantité de 100Microl d'une autre solution d'anticorps conjugué à la fluorescéine est ajoutée et laissée 30 min à incuber, à température ambiante, à l'abri de la lumière. Les puits sont ensuite rincés avec du PBS, puis les lames sont montées à l'aide de quelques gouttes de glycérine et des lamelles. Les lames ainsi préparées sont observées au microscope à fluorescence. Résultats et conclusion: Sur l'échantillon de contrôle, une fluorescence des récepteurs aux minéralocorticoïdes est d'intensité moyenne, elle permet de visualiser assez nettement le contour des kératinocytes. L'addition de spironolactone provoque une extinction presque totale de l'expression des récepteurs d'aldostérone. L'extrait de grenade entraine une augmentation de l'intensité de la fluorescence traduisant une stimulation très significative de l'expression de ces récepteurs. Ce résultat montre que l'extrait de grenade favorise la circulation de l'eau au niveau cutané par deux mécanismes synergiques à la fois en induisant l'expression des canaux à eau et en rétablissant l'expression des récepteurs de minéralocorticoïdes. XII. EFFET D'UNE CREME CONTENANT DE L'EXTRAIT DE GRENADE SUR L'EXPRESSION DES AQP-3 DE CULTURES EX VIVO DE PEAU HUMAINE But : Cette étude a pour objectif de déterminer l'effet de l'extrait de grenade incorporé dans une crème, sur l'expression des canaux à eau par des explants de peau humaine en culture. Méthodes : La peau est issue d'un prélèvement sain d'une femme âgée de 57 ans à la suite d'une chirurgie plastique. Après élimination des graisses et rinçage dans le tampon phosphate stérile, le prélèvement est découpé à l'aide d'une lame stérile en petits morceaux de 3mm environ : Une première partie est immédiatement congelée à -70[deg]C pour servir de témoin à temps TO. Une deuxième partie est traitée avec la crème placebo puis incubée (épiderme vers le haut) dans un milieu de culture à composition définie : Témoin T-7jours. Une troisième partie est traitée avec la crème placebo puis incubée (épiderme vers le haut) dans un milieu de culture à composition définie : Témoin T-12 jours. Les deux dernières parties sont traitées avec de la crème contenant l'extrait de grenade puis incubées séparément, pendant 7 et 12 jours, dans le même milieu à composition définie. Il est à noter que les crèmes sont appliquées tous les 2 jours sur la surface de l'épiderme, à l'aide d'une spatule stérile. Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 jours. A la fin de l'incubation, les explants sont rincés puis congelés à -70[deg]C au moins une nuit. Les explants sont coupés à l'aide d'un cryostat à une épaisseur de 5Microm puis congelés à -70[deg]C, jusqu'à la mise en u̇vre des immunomarqueurs. Ces immunomarquages sont effectués à l'aide de la technique d'immunofluorescence indirecte, en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre l'aquaporine type 3.Les lames sont observées au microscope à fluorescence et un appareil de prise de vue numérique réalise automatiquement des clichés après 2 secondes d'exposition au rayonnement de la lampe. La composition de la crème n'a en soi aucune importance pour peu que les excipients en euxmêmes n'induisent pas d'activité négative ou positive sur l'expression des aquaporines. Toutes les mesures sont à considérer par rapport au témoin constitué de la crème sans extrait de grenade. Résultats : Les observations sont présentées dans le tableau ci-dessus : Conclusion : Les explants de peau ayant été traités avec la crème contenant l'extrait de grenade montrent : -d'une part, une stimulation importante de l'expression des canaux à eau au niveau de l'épiderme. -d'autre part, un épaississement du tissu épidermique dépassant ainsi, à certains endroits, 10 assises cellulaires. Cet effet de l'extrait de grenade a été observé, aussi bien après 7 jours, qu'après 12 jours de traitement sur plusieurs sujets. Des clichés en coloration classique Hématoxyline Eosine Safran montrent un rétablissement des contacts cellulaires avec disparition des tracés inter kératinocytaires. La peau apparaît avec un profil sain et jeune par rétablissement des ondulations de la jonction et avec une meilleure cohésion cellulaire. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un extrait de grenade caractérisé en ce que l'on épuise la pulpe de fruit par un solvant polaire, par macération, infusion, digestion ou percolation à une température inférieure ou égale à 80 [deg]C, dans lequel on filtre le solvant, on concentre et on répète l'opération d'épuisement plusieurs fois afin de rendre l'extrait final plus concentré en principes actifs susceptibles d'amplifier l'expression des aquaporines et on concentre l'extrait après filtration. 2. Procédé d'obtention d'extrait de Grenade selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'extraction de la pulpe du fruit est effectuée à l'aide d'un solvant polaire. 3. Procédé d'obtention d'un extrait de grenade selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le solvant polaire est choisi parmi le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. 4. Extrait de grenade obtenu de la pulpe de fruit produit par le procédé de la revendication 1. 5. Procédé d'extraction d'un extrait de grenade selon la revendication 1 caractérisée en ce que les aquaporines sont des aquaglycéroporines. 6. Compositions cosmétiques, nutraceutiques ou pharmaceutiques destinées à amplifier l'expression des aquaporines et des glycéroaquaporines caractérisées en ce qu'elles renferment de l'extrait de grenade obtenu selon l'une des revendications 1 à 5, en association ou en mélange avec un diluant ou un véhicule inerte, non toxique cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. 7. Compositions cosmétiques nutraceutiques ou pharmaceutiques selon la revendication 6 dans laquelle l'extrait de grenade est présent à une concentration variant de 0.01 % à 40 % par rapport au poids total de la composition. 8. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 6 ou 7 destinées à l'administration orale ou topique. 9. Utilisation en cosmétique ou en nutraceutique d'un extrait de grenade obtenu selon les revendications 1 à 5 pour prévenir et/ou réduire les manifestations inesthétiques et/ou inconfortables liées au dysfonctionnement des aquaporines ou à un trouble de l'expression des canaux à eau. 10. Utilisation cosmétique ou nutraceutique d'un extrait de grenade obtenu selon les revendications 1 à 5 ou d'une composition en contenant selon l'une des revendications 6 à 8 pour améliorer la répartition de l'eau dans les tissus, pour réduire et/ou prévenir les manifestations inesthétiques de l'action de certaines hormones sexuelles du type stéroïde sur les aquaporines. 11. Utilisation des compositions selon les revendications 6 à 8 pour réaliser un médicament destiné à prévenir et/ou traiter, par application topique ou par voie orale, les manifestations des dysfonctionnements des aquaporines. 12. Procédé de soin cosmétique consistant à appliquer sur une zone de peau, de muqueuse et/ou de phanère, une composition selon l'une des revendications 6 à 8, pour le soin, le traitement cosmétique et/ou la prévention des manifestations inesthétiques et/ou inconfortables du dysfonctionnement ou des troubles de l'expression des aquaporines.