Brevet FR2884920A1 — publié le 20061027

ABX21.FRD DISPOSITIF ET PROCÉDÉ D'ANALYSE MULTIPARAMÉTRIQUE D'ÉLÉMENTS MICROSCOPIQUES L'invention concerne le domaine de l'analyse d'éléments microscopiques, et plus particulièrement les dispositifs dédiés à la caractérisation et au comptage d'éléments microscopiques au moyen d'une lumière. On entend ici par "éléments microscopiques" tout élément de dimensions microscopiques, et notamment des particules ou des cellules biologiques (procaryotes et eucaryotes). Dans le domaine du diagnostic in vitro (notamment le comptage hématologique ou la cytométrie de flux), il est classique d'utiliser des dispositifs de caractérisation et de comptage, reposant sur l'interaction entre une lumière et les différents éléments microscopiques qui constituent un échantillon, afin d'obtenir des informations qualitatives et quantitatives sur ces éléments microscopiques. Parmi les techniques qui sont couramment utilisées, on peut notamment citer celles dites de diffusion, qui regroupent la transmission, la diffraction, la réflexion et la réfraction, et celles dites de photoluminescence qui regroupent la fluorescence et la phosphorescence. Elles permettent séparément ou en combinaison d'obtenir notamment des informations sur la forme, le volume, la taille, la couleur, la densité, la structure, la nature biochimique, ou la granularité. Les caractérisations des éléments biologiques, et principalement des cellules sanguines, obtenues 25 avec les techniques courantes de cytométrie de flux, sont néanmoins basées sur un nombre limité de variables et de possibilités de discrimination cellulaire. Chaque principe de mesure est une méthode physique relativement simple mais la multiplication de ces mesures de façon simultanée induit des interactions qui peuvent perturber ces dernières au point de les rendre inutilisables. Ainsi la mise oeuvre de mesures multiples est limitée par l'aptitude à éviter ces interactions. Dans les analyseurs d'hématologie et les cytomètres de flux présents sur le marché, les éléments sont généralement détectés soit électroniquement par la méthode d'impédancemétrie dite de Wallace Coulter, soit par une méthode optique (diffusion, photoluminescence). Par exemple, on peut déduire un volume et un indice de réfraction des résultats d'une analyse de diffusion selon une seule longueur d'onde et deux angles d'observation différents. Ce mode de détection est par exemple décrit dans le brevet US 4,735,504 de la société TECHNICON Instruments Corp. Le système optique décrit dans ce brevet, utilise les mesures de lumière diffractée selon deux gammes d'angles différents, ce qui permet de séparer les valeurs de volume et d'indice de réfraction des éléments par une comparaison de leurs réponses optiques à celles d'éléments calibrés en volume et indice de réfraction. Le traitement de ces données repose sur la théorie de diffusion de la lumière par une particule sphérique développée par Gustav MIE, et décrite notamment à l'adresse Internet http://en.wikipedia.org/wiki/Mie_scattering . En cytométrie de flux, il est communément admis que la mesure de la diffraction selon une gamme d'angles proches de l'axe optique (FSC (pour forward scatter ) ou diffraction dans l'axe) donne une indication sur le volume des éléments microscopiques analysés. Par ailleurs, la lumière diffusée de manière orthogonale par rapport à l'axe optique (ou side scatter , ou encore diffusion à 90 ) est décrite comme étant représentative de la structure interne des éléments. Ces caractéristiques sont étroitement liées aux angles et longueurs d'onde auxquels les mesures sont faites. Il est rappelé que la fluorescence est un phénomène induit lors du retour à l'état fondamental d'une molécule excitable et excitée par une énergie lumineuse à une longueur d'onde qui lui est propre. L'émission de lumière de fluorescence se fait toujours à une fréquence inférieure à celle d'excitation. L'émission de fluorescence est sensiblement isotrope. La mesure s'effectue généralement en dehors de l'axe d'excitation de la lumière incidente et au travers d'un filtre optique ne transmettant au détecteur que la bande spectrale d'intérêt. Les sondes moléculaires utilisées en fluorescence peuvent être des colorants vitaux ou supravitaux ayant une affinité intrinsèque pour un type particulier de molécules. On peut notamment penser aux colorants intercalants des acides nucléiques comme le thiazole orange, l'auramine O, la pyronine Y ou autres, ou à des sondes immunologiques composées d'un anticorps sur lequel est accroché un marqueur colorant, généralement un fluorochrome seul ou en tandem ou parfois un nano cristal. Ce mode de marquage par la mise en oeuvre de sondes immunologiques s'est largement répandu pour l'identification cytologique et notamment selon les techniques de cytométrie en flux décrites précédemment. Le brevet EP 0 022 670 de la société Ortho Diagnostics Inc. décrit l'identification de différentes cellules en cytométrie de flux par leurs déterminants antigéniques. La technique décrite dans ce brevet a ouvert la porte au très large développement de l'immunophénotypage qui est maintenant reconnu comme une technique d'identification cellulaire sûre et performante. L'analyse cytologique multiparamétrique peut néanmoins se faire sans avoir recours à l'identification antigénique. Ainsi, Howard M. Shapiro a décrit dans le document Combined Blood Cell Counting and Classification with Fluorochrome Stains and Flow Instrumentation J. of Histochem. & Cytochem Vo124. No. 1, pp. 396-411, 1976, une classification générale des cellules du sang au moyen d'un cytomètre multiparamétrique effectuant des mesures d'absorption, de diffraction et de fluorescence, et dans lequel les éléments sont mis en contact avec un mélange de colorants fluorescents spécifiques des acides nucléiques et de protéines. Parallèlement, la multiplication des longueurs d'onde de mesure de fluorescence dans les analyseurs a autorisé l'utilisation d'un nombre croissant de marqueurs et donc d'anticorps, comme indiqué dans le document de John A. Steinkamp A Modular Detector for Flow Cytometric Multicolor Fluorescence Measurements , 1987, Cytometry 8: pp. 353-365, mais a aussi très sérieusement complexifié les appareils et leur mise en oeuvre. L'utilisation conjointe de colorants excités par une seule longueur d'onde présente rapidement des limitations de par les zones de recouvrement spectral de leurs excitations et/ou de leurs émissions de fluorescence. Pour s'affranchir de ces problèmes de recouvrement spectral, on a généralement recours à une méthode de correction appelée compensation qui consiste globalement à réduire le signal de fluorescence de l'élément microscopique analysé de la part proportionnelle de recouvrement spectral d'autre(s) élément(s) microscopique(s), comme indiqué dans le document Spectral Compensation for Flow Cytometry: Visualization Artifacts, Limitations and Caveats , Mario Roederer 2001, Cytometry 45, pp. 194-205. Un problème induit par les compensations réside dans le fait qu'elles sont calculées en valeur moyenne, et que pour une famille donnée de fluorochromes, il n'est pas possible de fixer leurs valeurs une fois pour toutes. Il existe en effet des variations importantes des propriétés physiques des fluorochromes d'une même famille notamment en fonction de l'origine de l'approvisionnement. Un même produit issu de manufacturiers différents peut ainsi conduire à des jeux de compensations différents. Ceci est particulièrement gênant dans le domaine du diagnostic car des sources d'approvisionnement non maîtrisées pourraient conduire à des mesures erronées et donc potentiellement dangereuses. Par exemple, le rendement du transfert PE-TR et la nature de l'anticorps utilisé ne sont pas suffisamment stables pour accepter une compensation logicielle définitive comme cela est notamment expliqué dans l'article de Carleton C. Steward and Sigrid J. Stewart Four color compensation , Cytometry, Vol. 38, pp. 161-175, 1999. L'usage de plusieurs longueurs d'onde d'excitation permet d'ouvrir un plus grand choix de colorants et permet de séparer plus facilement les spectres d'émission. Les différentes longueurs d'onde d'excitation sont fréquemment séparées spatialement dans la cuve de mesure offrant en ce cas l'avantage de plusieurs mesures indépendantes comme décrit dans l'article de J. Steinkamp Improved multilaser/multiparameter flow cytometer for analysis and sorting of cells and particles John A. Steinkamp, Robert C. Habbersett, and Richard D. Hiebert; Review of Scientific Instruments Vol 62(11) pp. 2751-2764, November 1991. Le problème de cette méthode réside dans le fait que le décalage spatial induit un déphasage temporel des réponses et que le recalage des informations doit être fait en aval, soit en retardant les informations de manière analogique, soit en recalant les mesures au moyen d'un logiciel. La multiplication des longueurs d'onde d'excitation (notamment des sources laser), ainsi que des mesures de fluorescence et d'autres paramètres optiques, apporte une complexité technologique et une difficulté de mise en oeuvre importante comme cela est par exemple décrit dans l'article intitulé Nine Color Eleven Parameter Immunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry , Martin Bigos 1999, Cytometry 36, pp. 36-45. Le niveau de risque d'erreur dans l'interprétation des résultats croît avec le nombre de paramètres et l'utilisation de ces appareils est réservée à des techniciens très spécialisés au risque d'obtenir des résultats inadaptés et faux, et donc potentiellement dangereux. Une limitation des compensations, dont le niveau de criticité augmente avec le nombre de fluorochromes, concerne la propagation et l'amplification du bruit des mesures de fluorescence et de leurs combinaisons linéaires qui servent à corriger les mesures brutes. Aucun dispositif d'analyse connu n'étant entièrement satisfaisant, l'invention a donc pour but d'améliorer la situation. En particulier, l'invention est destinée à s'affranchir des problèmes de compensation généralement rencontrés dans l'art antérieur. L'invention propose à cet effet un dispositif d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant: É d'une première part, un espace de mesure pour des éléments microscopiques à analyser, É d'une deuxième part, au moins une source délivrant des rayonnements présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et destinés à interagir avec les éléments microscopiques dans l'espace de mesure pour former des rayonnements d'interaction, É d'une troisième part, des moyens de détection chargés de transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction provenant de l'espace de mesure, et É d'une quatrième part, des moyens d'analyse chargés d'analyser les signaux électriques afin de permettre la détermination de données représentatives des éléments microscopiques analysés. On appelle ici rayonnements d'interaction , les rayonnements issus de l'interaction entre le faisceau d'analyse et les éléments microscopiques analysés. Ces rayonnements d'interaction peuvent être notamment des rayonnements de diffusion (réfraction, réflexion, diffraction) et/ou de photoluminescence (fluorescence, phosphorescence). Par ailleurs, on entend ici par rayonnement , une lumière de longueur d'onde comprise entre l'ultraviolet et l'infrarouge, c'est-à-dire entre environ 100 nm (0,1 m) et environ 5000 nm (5 30 m). Le dispositif selon l'invention se caractérise par le fait: - que ses rayonnements codés sont conjugués au niveau de l'espace de mesure, qu'il comprend i) des moyens de codage chargés de coder les rayonnements en amont de l'espace de mesure avec des codes différents, et ii) des moyens de filtrage optique chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion en fonction de leur longueur d'onde, en amont des moyens de détection, et que ses moyens d'analyse comprennent des moyens de décodage chargés de décoder les signaux électriques afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code d'origine. On appelle ici codage , l'action d'appliquer un code (coi) à un rayonnement d'analyse (Ri) avant son interaction avec les éléments microscopiques, en vue de générer le rayonnement d'interaction qui comporte lui-même le code d'origine. En particulier les codes (coi) peuvent être choisis de manière à appliquer une modulation d'impulsions à chaque rayonnement d'analyse. Ces impulsions peuvent être synchrones ou asynchrones. Dans le cas d'impulsions synchrones, toutes les longueurs d'onde interagissent simultanément avec les éléments microscopiques analysés. Dans le cas d'impulsions asynchrones, les longueurs d'onde interagissent séquentiellement avec les éléments microscopiques à analyser. Les moyens de filtrage optique sont agencés, pour une famille de fluorochromes donnée et pour un type de codage donné, de manière à éviter que des compensations soient effectuées. Le dispositif selon l'invention peut comporter des caractéristiques complémentaires qui peuvent être prises séparément ou en combinaison, et notamment: É ses moyens de filtrage optique peuvent être chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande; É ses moyens de codage peuvent être chargés de coder périodiquement et/ou sinusoïdalement en intensité les rayonnements d'analyse; É une partie au moins de ses moyens de codage peut agir au niveau de la source en amont d'une sortie de distribution des rayonnements. Cette partie peut être intégrée dans la source; É une partie au moins de ses moyens de codage peut agir sur les rayonnements en aval de la source afin de constituer les rayonnements d'analyse; É ses moyens de codage peuvent moduler en intensité les rayonnements délivrés par la source, par exemple au moyen d'un modulateur acousto-optique, afin de constituer les rayonnements d'analyse; É la source peut comprendre au moins deux lasers couplés, éventuellement de type monochrome, et/ou au moins une diode électroluminescente, dont les rayonnements d'analyse sont conjugués au niveau de l'espace de mesure. En variante, la source peut comprendre une source de lumière polychromatique sensiblement continue, comme par exemple un laser polychromatique, une lampe à incandescence, ou une lampe à arc; É la source peut délivrer les rayonnements d'analyse selon un mode continu et/ou un mode impulsionnel; É l'intensité de chaque rayonnement d'analyse délivré par la source peut être paramétrable; É ses moyens de détection peuvent comporter une multiplicité de capteurs photosensibles dédiés à la détection de rayonnements d'interaction (représentatifs de diffusion(s) et de fluorescence(s)) induits par les rayonnements d'analyse sur les éléments microscopiques à analyser. En variante, les moyens de détection peuvent comporter une multiplicité de capteurs photosensibles dédiés à la détection de rayonnements d'interaction représentatifs de diffusion(s) et implantés dans un endroit défini par un axe interceptant la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau de l'espace de mesure, cet axe étant orienté par rapport à la direction générale d'un angle compris entre 0 et 360 ; É ses moyens d'analyse peuvent permettre de déduire l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés à partir des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion. En particulier, lorsque les éléments microscopiques appartiennent à un échantillon de sang, les moyens d'analyse peuvent permettre, notamment, de déterminer le contenu intraérythrocytaire en hémoglobine ou le contenu protéique intracytoplasmique des leucocytes; É ses moyens d'analyse peuvent permettre de déduire des signaux résultant de l'interaction entre les rayonnements d'analyse et deux agents photoluminescents (ou fluorochromes) à des longueurs d'onde différentes, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre les deux agents photoluminescents. L'invention propose également un procédé d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant: É une première étape dans laquelle on illumine des éléments microscopiques placés au niveau d'un espace de mesure au moyen de rayonnements d'analyse conjugués au niveau de l'espace de mesure et présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et des codages selon des codes différents choisis, de manière à former des rayonnements d'interaction, É une deuxième étape dans laquelle on collecte une partie au moins des rayonnements d'interaction, puis on les sépare et filtre en fonction de leur longueur d'onde, É une troisième étape dans laquelle on détecte les rayonnements d'interaction filtrés, puis on les transforme en signaux électriques, et É une quatrième étape dans laquelle on décode les signaux détectés en fonction de leur code d'origine de manière à permettre la détermination de données représentatives des éléments microscopiques analysés. Le procédé selon l'invention peut comporter des caractéristiques complémentaires qui peuvent être prises séparément ou en combinaison, et notamment: É dans la première étape on peut appliquer séquentiellement ou simultanément les rayonnements d'analyse aux éléments microscopiques à analyser; É dans la première étape on peut également procéder à une modulation sinusoïdale de l'intensité des rayonnements d'analyse; É dans la deuxième étape on peut filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande; É dans la quatrième étape, on peut déduire l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés, des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion. En particulier, lorsque les éléments microscopiques appartiennent à un échantillon de sang, on peut déterminer, notamment, le contenu intra-érythrocytaire en hémoglobine ou le contenu protéique intracytoplasmique des leucocytes; É dans la quatrième étape on peut déduire de signaux résultant de l'interaction entre les rayonnements d'analyse et deux agents photoluminescents (fluorochromes) à des longueurs d'onde différentes, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre les deux agents photoluminescents. L'invention est particulièrement bien adaptée, bien que de façon non limitative, au domaine du diagnostic in vitro (notamment cytométrie de flux), et à l'analyse de tout élément microscopique dans un fluide. Elle s'applique notamment à l'analyse biologique, biochimique, chimique, particulaire, morphologique, et en particulier la cytométrie de flux multiparamétrique, l'analyse de particules chargées dans un fluide liquide ou gazeux, et la granulométrie. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée ci-après, et des dessins annexés, sur lesquels: É la figure 1A illustre de façon schématique et fonctionnelle un premier exemple de réalisation d'un dispositif d'analyse optique selon l'invention, et la figure 1B illustre de façon schématique et fonctionnelle un second exemple de réalisation d'un dispositif d'analyse optique selon l'invention dans lequel plusieurs sources sont capables de générer des rayonnements destinés à être conjugués au niveau de l'espace de mesure (CM), É la figure 2A illustre un exemple de codage sinusoïdal, avec éclairages simultanés, pouvant être appliqué aux rayonnements lumineux, la figure 2B illustre un exemple de codage binaire séquentiel, et la figure 2C présente les allures des signaux du codage binaire de la figure 2B, répétés périodiquement, É la figure 3 est un diagramme illustrant trois spectres d'absorption de fluorochromes (SA1 à SA3) correspondant à trois longueurs d'onde d'analyse (k 1 à X3), et trois spectres de fluorescence de ces mêmes fluorochromes (SF1 à SF3), É la figure 4 illustre de façon schématique un exemple de réalisation de la partie du dispositif d'analyse située en amont de la cuve de mesure, dans lequel le modulateur est de type acoustooptique, É la figure 5 illustre de façon schématique un exemple de réalisation de la partie du dispositif d'analyse située en aval de la cuve de mesure et dédiée à la détection et l'analyse de la fluorescence, et É la figure 6 est un diagramme de courbes d'isovolumes et d'isoconcentrations permettant de déterminer le volume et la concentration d'hémoglobine corpusculaire en fonction de sections efficaces de diffusion Cext aux longueurs d'onde d'analyse égales à 488 nm et 976 nm. Les dessins annexés pourront non seulement servir à compléter l'invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. On se réfère tout d'abord aux figures lA et 1B pour décrire deux exemples de réalisation de dispositif d'analyse optique DA, selon l'invention. On considère dans ce qui suit que le dispositif DA est dédié à la caractérisation et au comptage en cytométrie de flux des éléments microscopiques dans un échantillon de sang. Mais, l'invention n'est limitée ni à ce type d'échantillon, ni à la cytométrie de flux. Elle concerne en effet tout type d'échantillon comportant des éléments microscopiques à analyser optiquement par fluorescence et/ou par diffusion lumineuse, et notamment des particules dans un fluide ou des échantillons biologiques. Comme cela est schématiquement et fonctionnellement illustré sur les figures 1A et 1B, un dispositif d'analyse DA, selon l'invention, comporte au moins: É un espace de mesure CM, parfois appelé cuve de mesure (ou zone de mesure, ou encore 15 fenêtre de mesure) au niveau duquel se trouvent (ou passent) les éléments microscopiques de l'échantillon à analyser, É une (ou plusieurs) source(s) S chargée(s) de délivrer des rayonnements Ri présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes X1 à Xn, conjugués au niveau de l'espace de mesure (CM), [dans le cas de la figure 1A une seule source S est utilisée pour délivrer plusieurs longueurs d'onde, tandis que dans le cas de la figure I B trois sources S sont utilisées pour délivrer chacune une longueur d'onde par définition, on considère ici que les différentes sources de la figure 1B constituent des sous-parties d'une source de rayonnements] É des moyens de codage M au moins chargés de coder (moduler) chaque rayonnement lumineux Ri de longueur d'onde Xi avec un code spécifique coi (ici i = 1 à n, par exemple n = 2 ou 3), et éventuellement piloté par un module de contrôle MC, le codage est par exemple du type de celui présenté sur les figures 2A à 2C, É des moyens de filtrage optique FO chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction qui proviennent de l'espace de mesure CM, après avoir éventuellement interagi avec les éléments microscopiques, et dont les longueurs d'onde appartiennent de préférence à des bandes d'analyse de fluorescence Bi qui sont chacune intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse Xi et Xi+l, à l'exception de la dernière (qui possède les plus grandes longueurs d'onde) qui est placée au-delà de la longueur d'onde d'analyse sn qui est la plus grande, li É des moyens de détection DF et/ou DE comportant des capteurs photosensibles (ou photocapteurs) chargés de transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion qui proviennent de l'espace de mesure après avoir éventuellement interagi avec les éléments microscopiques, et É des moyens d'analyse MA comprenant au moins des moyens de décodage DRF et/ou DRE chargés de décoder les signaux électriques qui lui sont transmis par les moyens de détection DF et/ou DE, afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code coi de manière à permettre la détermination des données représentatives des éléments microscopiques analysés. Il est important de noter que le dispositif d'analyse DA peut effectuer des analyses de fluorescence et/ou de diffusion. Par conséquent, selon les variantes il possède: É soit des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF, mais pas de moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de décodage DRE, É soit des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF, et des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de décodage DRE, É soit encore des moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de 20 décodage DRE mais pas de moyens de filtrage optique FO ni de moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF. Lorsque le dispositif d'analyse DA est dédié à la cytométrie de flux ou au comptage, sa cuve de mesure CM (ou espace de mesure) peut être du type dit "à manchonnage de flux", comme par 25 exemple celle décrite dans le document brevet FR 2653885. Dans l'exemple de la figure I A, la source S est chargée de générer un faisceau de lumière unique constitué de la superposition de n rayonnements Ri de longueurs d'onde respectives a,l à Xn, avec n 2. Dans l'exemple de la figure 1B, chacune des trois sources S est chargée de générer un faisceau de lumière unique constitué d'un rayonnement Ri (R1, R2 ou R3) de longueur d'onde Xi (X1, X2 ou X3). L'intensité de chaque radiation, notée I;, peut être ajustée à une valeur prédéterminée. Cela permet, par exemple, de placer à un niveau prédéterminé l'intensité de fluorescence d'une famille de fluorochromes (ou composés fluorescents) excités par le rayonnement d'analyse Ri de longueur d'onde Xi et d'intensité Ti. On peut également exciter avec une faible intensité une famille de fluorochromes pour laquelle le rendement quantique de fluorescence est très élevé (c'est par exemple le cas de certaines sondes moléculaires comme le thiazole orange). Inversement, lorsque des fluorochromes de rendements quantiques identiques sont simultanément utilisés pour marquer des antigènes exprimés différemment sur une même cellule, on peut égaliser approximativement les niveaux de fluorescence émis par les divers fluorochromes en jouant sur les intensités de leurs rayonnements d'analyse respectifs. En raison de cette possibilité de contrôle des niveaux de fluorescence des éléments microscopiques, la source S est également appelée "synthétiseur-égaliseur" optique. 15 Chacun des n rayonnements Ri d'intensité I; peut aussi être codé en intensité périodiquement et/ou sinusoïdalement par les moyens de codage sur lesquels on reviendra plus loin. Ce codage, qui est par exemple du type de celui illustré sur les figures 2A à 2C, est déterminant car il permet, grâce aux moyens de décodage DRF et/ou DRE, le démultiplexage des rayonnements résultant de l'interaction avec les éléments microscopiques analysés (notamment des mécanismes de fluorescence et/ou de diffusion). Lorsque la source S comprend des lasers, comme par exemple des lasers à semi-conducteurs, ou des diodes électroluminescentes, le codage peut êtreréalisé en jouant sur le courant d'injection, le modulateur M étant alors un générateur électrique capable de délivrer des courants électriques images des codes appliqués à chacun des rayonnements. Lorsque le codage est de type sinusoïdal, le codage consiste notamment à fixer des fréquences de modulation coi qui sont fonction de diverses considérations expérimentales qui seront précisées plus loin. A la sortie du modulateur M on dispose de n rayonnements Ri de longueurs d'ondes Xi choisies et d'intensité I; éventuellement choisies et conjugués dans l'espace de mesure. Dans le cas d'un codage sinusoïdal, l'expression de l'intensité lumineuse I; (en W/m2) est donnée par la relation Al de l'annexe. Le ou les faisceaux de n rayonnements Ri est (sont) focalisé(s) par des moyens optiques non représentés, à l'intérieur de l'espace de mesure (ou de comptage) où ils interagissent avec l'élément microscopique (ici une cellule biologique) préalablement marqué et/ou coloré selon toute technique connue de l'homme de l'art. Sur la figure 3 se trouvent représentés trois spectres d'absorption SA1 à SA3 de trois fluorochromes fictifs correspondant à trois longueurs d'onde d'analyse ?.I à X3, et les trois spectres de fluorescence SF1 à SF3 de ces trois mêmes fluorochromes qui sont détectés par les moyens de détection de fluorescence DF. Les références BI à B3 désignent les trois bandes de longueurs d'onde que les moyens de filtrage optique FO laissent passer. Le nombre de fluorochromes de types différents est ici limité à trois afin de faciliter la description. Mais, l'invention n'est pas limitée à ce nombre. Elle concerne en effet n'importe quel nombre de 15 fluorochromes. Conformément à l'invention et comme on peut l'observer sur la figure 3, la bande BI, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SF1 du premier fluorochrome, est intercalée entre les longueurs d'onde d'analyse ?.1 et a.2, la bande B2, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SF2 du deuxième fluorochrome, est intercalée entre les longueurs d'onde d'analyse a 2 et a 3, et la bande B3, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SF3 du troisième fluorochrome, est placée au-delà de la longueur d'onde d'analyse a 3 (qui est la plus grande des trois). Préférentiellement, à chaque bande Bi correspond un détecteur de fluorescence DFi. L'analyse des spectres d'absorption SAi et de fluorescence SFi permet d'écrire une relation matricielle entre les signaux (photoélectriques) délivrés par les (n=3) détecteurs et les quantités de fluorochromes: [PMo] = Il [C] [Q] + 12 [D] [Q] + I3 [E] [Q]. [PMo] est ici la matrice des signaux photoélectriques délivrés par les (n=3) détecteurs de fluorescence DFi, l'indice o signalant un signal de fluorescence en l'absence de transfert d'énergie. [C], [D] et [E] sont ici les matrices de transfert permettant le calcul des lumières de fluorescence. [Q] est ici la matrice des quantités Ql à Q3 des (n=3) fluorochromes, exprimées en nombre de moles. Les coefficients cu, du et eu des matrices de transfert [C], [D] et [E] sont respectivement données par les relations A2, A3 et A4 de l'annexe. L'examen de la décomposition de la matrice [PMo] et des coefficients associés montre qu'il est possible de déterminer chaque concentration molaire Qi sans combinaison linéaire des signaux de mesure. Avec les conventions d'écriture précitées, les concentrations molaires Qi sont données par les relations A5 à A7 de l'annexe. Dans ces trois relations A5 à A7 les termes PMi(wi) représentent une caractéristique de code wi. Cette caractéristique peut par exemple être l'amplitude crête ou encore la valeur efficace du signal sur un intervalle de temps limité par la durée de l'impulsion lumineuse d'analyse ou encore une caractéristique temporelle du signal telle que le temps de déclin d'une lumière de fluorescence. La détermination directe des concentrations molaires Qi des fluorochromes, sans passer par une combinaison linéaire des mesures, augmente la précision des résultats et donc la précision du diagnostic. On évite donc ainsi l'utilisation de compensations (de combinaison linéaire de différents signaux) pour déterminer la concentration molaire d'un fluorochrome donné. La robustesse de l'invention permet d'éviter les interférences, donc les compensations, elle est donc plus fiable et plus robuste que les méthodes traditionnellement utilisées jusqu'à ce jour. L'invention peut aussi permettre de déterminer le degré de couplage entre deux fluorochromes (ou composés fluorescents) qui correspond au transfert d'énergie (par fluorescence) entre un fluorochrome "donneur" et un fluorochrome "accepteur". Cette détermination du couplage entre deux fluorochromes peut permettre par exemple de mesurer la distance entre épitopes ou encore leur association physique. Compte tenu des conventions d'écritures données ci-avant, les expressions des différents signaux de fluorescence en présence d'un transfert d'énergie sont données par les relations A8 à A10 de l'annexe. Le cas du transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes va être décrit ci-après de façon analytique. Dans ce cas, les expressions des différents signaux photoélectriques données par les relations A8 à A10 de l'annexe peuvent se réécrire sous la forme des relations A11 à A13 de l'annexe. Cela résulte du fait que seuls les coefficients x12 et p12 doivent être pris en compte, les autres coefficients i et pu étant pris égaux à 1. Compte tenu des expressions des relations A2 à A7, on peut alors tirer des relations Al 1 et Al2 de l'annexe les trois relations A14 à A16 de l'annexe. Puis, en éliminant des relations A14 à A16 les concentrations molaires QI à Q3 on peut déterminer le paramètre de transfert d'énergie x12 entre les deux premiers fluorochromes. La formule de ce paramètre de transfert d'énergie x12 est donnée par la relation A17 de l'annexe. La concentration molaire Q1 en présence d'un transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes peut alors être reformulée comme indiqué par la relation A18 de l'annexe. Les concentrations molaires Q2 et Q3 en présence d'un transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes sont alors données par les relations A6 et A7 de l'annexe. Il est important de noter que les relations données ci-avant et dans l'annexe peuvent être étendues au cas où l'on prend également en compte un transfert d'énergie entre les premier et troisième 20 fluorochromes et/ou entre les deuxième et troisième fluorochromes. On a représenté sur la figure 4 une partie amont d'un dispositif d'analyse DA selon l'invention, dans laquelle la source S alimente en lumière (rayonnements) à spectre large, un modulateur M assurant à la fois la sélection des longueurs d'onde d'analyse et le codage en intensité des rayonnements correspondants. La lumière à spectre large (ou lumière blanche, ou lumière polychrome) est ici obtenue à l'aide d'un laser impulsionnel L injecté dans une fibre optique OF micro structurée. Ce type de source S est par exemple décrit par la Demanderesse, dans l'article intitulé "White-light supercontinuum generation in normally dispersive optical fiber using original multiwavelength pumping system", Optics Express, vol. 12, No. 19, september 2004. Le laser L servant de pompe pour la fibre optique micro structurée OF peut par exemple être remplacé par un laser à fibre optique dopée Néodyme ou Ytterbium fonctionnant en régime de modes bloqués (par exemple avec un taux de répétition des impulsions de 50 MHz), suivi d'un amplificateur optique capable de délivrer un flux compatible avec une excitation en régime d'interaction non linéaire de la fibre optique micro structurée OF. La lumière polychrome qui est délivrée par ce type de source S se distingue de celle délivrée par une lampe à incandescence du fait que sa cohérence spatiale est extrêmement élevée (tous les photons du continuum sont émis dans le même mode spatial). Bien entendu, d'autres types de source S peuvent être envisagés. Ainsi, la source peut comprendre au moins deux lasers couplés, éventuellement de type monochrome, et/ou au moins une diode électroluminescente. Elle peut également comprendre d'autres types de source de lumière polychromatique sensiblement continue, comme par exemple une lampe à incandescence ou une lampe à arc. Le faisceau de lumière issu de la fibre optique micro structurée OF est mis en forme à l'aide d'une optique de focalisation 01, de chromatisme corrigé ou de chromatisme nul grâce, par exemple, à une combinaison optique de type catadioptrique (miroirs). Ce faisceau de lumière est focalisé au niveau du modulateur M, qui est ici réalisé sous la forme d'une cellule acousto-optique, dont le chromatisme angulaire est préférentiellement corrigé par superposition spatiale de réseaux de diffraction de pas adapté à la diffraction sous incidence de Bragg. Ces réseaux de diffraction sont créés par la superposition d'ondes acoustiques entretenues par un élément vibrant de type piézoélectrique alimenté par un signal électrique capable d'entretenir n signaux de modulation m;(t) = M; cos2tw;t qui participent à la relation Al de l'annexe donnant l'intensité modulée I;(t). Un tel modulateur acousto-optique M est par exemple celui qui est commercialisé par la société 30 A-A Opto-Electronic. Le modulateur acousto-optique M est ici piloté par l'intermédiaire d'une électronique de commande SF capable de générer simultanément (au moins) 3 fréquences acoustiques (fi, f2, f3), et elle même contrôlée par le module de commande MC (qui peut faire partie d'un système informatique comportant une interface logicielle de contrôle). La bande des fréquences acoustiques est par exemple comprise entre 80 MHz et 150 MHz. Les fréquences sont choisies de manière à permettre la sélection, au sein du continuum de lumière du faisceau, de trois (dans l'exemple décrit) rayonnements quasi-monochromatiques, par exemple de longueurs d'onde égales à 488 nm (bleu), 570 nm (jaune) et 976 nm (infrarouge). L'égalisation des trois rayonnements est obtenue en jouant sur l'intensité du signal acoustique. Plus l'intensité acoustique est importante plus le rendement de diffraction est élevé au sein du modulateur acousto-optique M. En d'autres termes, on peut doser (en jouant sur l'intensité du signal acoustique) la quantité de lumière qui peut passer de l'ordre 0 à l'ordre de diffraction +1. Par rayonnement quasi-monochromatique on entend ici une lumière émise dans une bande spectrale comprise entre 1 et 50 nm de large. Il est important de noter que l'ensemble des paramètres de la source S et du modulateur M peut être paramétrable à distance à l'aide du module de contrôle MC (par exemple de type ordinateur). Ainsi, par l'intermédiaire d'une interface logicielle, l'ensemble des paramètres de la source S, tels que les différentes longueurs d'onde d'analyse et les intensités respectives des rayonnements d'analyse et autres, peuvent être choisis par l'opérateur. Les rayonnements d'analyse Ri, délivrés en sortie du modulateur M, sont par exemple mis en forme par une optique 02 afin d'être focalisés au niveau de la cuve (ou espace) de mesure CM. Les fréquences de modulation coi sont choisies en fonction de divers paramètres, comme par exemple la vitesse de passage de la cellule biologique au niveau de l'espace de mesure CM, la dilution, la taille de la fenêtre optique de l'espace de mesure CM, la bande passante de la partie d'acquisition (moyens de filtrage optique FO, détecteurs DE et/ou DF) du dispositif d'analyse DA. Par exemple, si la cellule biologique à analyser traverse à la vitesse d'environ 1 m/s un faisceau de rayonnement d'analyse possédant un profil gaussien, de largeur à mi hauteur d'environ 30 m, elle va générer une impulsion de rayonnement d'interaction (fluorescence ou diffusion (extinction)) de forme sensiblement gaussienne et de durée sensiblement égale à 30 s. Le spectre en fréquence est alors de forme gaussienne et sa hauteur à mi hauteur est sensiblement de 0,3/30 s, soit environ 10 kHz. Afin d'éviter les phénomènes de diaphonie électronique, il est préférable de choisir un écart minimum de 100 kHz entre deux fréquences de modulation consécutives coi et coi+l. On peut par exemple choisir col égale à 100 kHz, co2 égale à 200 kHz et w3 égale à 300 kHz. Si la durée de passage est d'environ 5 ùs au lieu de 30 s, chaque impulsion de rayonnement d'interaction occupe une bande de fréquence d'environ 200 kHz et donc les fréquences de modulation doivent être au moins séparées de cette fréquence caractéristique: par exemple col = 1 MHz et (1)2 = 1,5 MHz. Il est important de noter que d'autres types de modulateur M peuvent être envisagés. Notamment, le modulateur M peut être au moins en partie intégré dans la source S ou bien être au moins en partie en aval de celle- ci. Le modulateur M peut également être placé au moins en partie en amont de la source M, par exemple de manière à contrôler son courant d'alimentation. La partie du dispositif d'analyse DA, située en amont de la cuve de mesure CM et décrite ci-avant en référence à la figure 4, peut être couplée à une partie aval du type de celle illustrée sur la figure 1A ou I B. Dans ce cas, une partie des rayonnements d'interaction résultant de la diffusion parvient au niveau du détecteur DE où elle est convertie en signaux électriques traités par le module d'analyse MA. Sur la figure 1A, le détecteur DE est, à titre d'exemple, orienté selon une direction moyenne à environ 45 de la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau de l'espace de mesure CM. Mais, l'angle de cette direction moyenne peut prendre n'importe quelle valeur comprise entre 0 et 360 en fonction du type d'information désiré. Le détecteur DE transmet ces signaux photoélectriques au décodeur (ou démodulateur) DRE du module d'analyse MA, afin qu'il les décode. Ce démodulateur DRE est par exemple agencé sous la forme d'étages de filtrage (décodage), par exemple de type analogique. En variante, les signaux photoélectriques pourraient être numérisés et l'opération de filtrage (décodage) pourrait être réalisée de façon numérique, en temps réel ou en différé (après enregistrement). A la sortie du démodulateur DRE on dispose des trois signaux de diffusion SE(X1=488 nm), SE(X2=570 nm) et SE(X3=976 nm). Les valeurs des signaux de diffusion SE(488 nm) et SE(976 nm) permettent de déterminer les sections efficaces de diffusion Cext(488 nm) et Ce,t(976 nm) qui sont nécessaires à la détermination des indices de réfraction et des volumes des globules rouges. La conversion des signaux de diffusion en sections efficaces est par exemple réalisée par un procédé d'étalonnage utilisant des microbilles calibrées en indice de réfraction et volume. Ces microbilles peuvent par exemple être en latex ou provenir d'émulsions. La partie des rayonnements d'interaction résultant de la fluorescence traverse une optique de mise en forme avant de parvenir au niveau des moyens de filtrage optique FO. Les rayonnements d'interaction sont alors filtrés en longueurs d'onde afin que ne soient conservés que ceux dont les longueurs d'onde appartiennent aux n (ici n=3) bandes de détection Bi. Sur la figure 1A les moyens de détection de fluorescence DF sont tous regroupés au niveau d'un même endroit. Dans ce cas, les moyens de filtrage optique FO constituent un filtre multi-bandes. 15 Comme illustré sur la figure 5, on peut utiliser des moyens de séparation LS afin de séparer spectralement les rayonnements d'interaction de fluorescence en au moins deux parties. Pour ce faire, on peut par exemple utiliser une lame séparatrice LS, éventuellement de type dichroïque. On définit ainsi (au moins) deux voies de détection et d'analyse de fluorescence, permettant d'obtenir sur une voie les signaux de fluorescence d'un premier type de fluorochromes fluorescent dans la première bande de filtrage optique BI du filtre optique FOI, et sur une seconde voie les signaux de fluorescence d'un second type de fluorochromes fluorescent dans la seconde bande de filtrage optique B2 du filtre optique FO2. Le dispositif de la figure 5 peut par exemple être utilisé pour la quantification des acides nucléiques (ARN+ADN) et la détection d'un antigène membranaire. On utilise ici deux rayonnements d'analyse Rl(co1) et R2(w2) présentant des longueurs d'onde ?d et X2 respectivement égales à 488 nm et 560 nm, afin de détecter les fluorescences des deux fluorochromes (thiazole orange et PE) permettant de marquer respectivement les acides nucléiques et l'antigène membranaire des leucocytes. Les deux rayonnements R 1(w l) et R242) sont obtenus à l'aide du dispositif décrit précédemment en référence à la figure 4. La première bande de détection B1 est centrée sur) 3 (530 nm) et dispose par exemple d'une largeur spectrale de 30 nm, tandis que la seconde bande de détection B2 est centrée sur X4 (670 nm) et dispose par exemple d'une largeur spectrale de 40 nm. Conformément à l'invention, 13 est comprise entre ?.l et 2, et X4 est plus grande que 2. Les rayonnements d'interaction filtrés par le premier filtre optique FOI parviennent au niveau d'un premier détecteur de fluorescence DF1 où ils sont convertis par des photodétecteurs en signaux électriques transmis à un premier décodeur (ou démodulateur) de fluorescence DRFI du module d'analyse MA, chargé de les démoduler selon la première fréquence de modulation col afin de délivrer le signal PM 1(w 1). Les rayonnements d'interaction filtrés par le second filtre optique FO2 parviennent au niveau d'un second détecteur de fluorescence DF2 où ils sont convertis par des photodétecteurs en signaux électriques transmis à un second décodeur (ou démodulateur) de fluorescence DRF2 du module d'analyse MA, chargé de les démoduler selon la première et la seconde fréquences de modulation col et w2, afin de délivrer le signal PM2(wl) et le signal PM2(w2). Les démodulateurs de fluorescence DRF 1 et DRF2 sont par exemple agencés sous la forme d'étages de filtrage analogique, de type passe-bande butterworth centrés sur les fréquences de 20 modulation. Dans les conditions d'excitation précitées, les quantités de fluorochromes (ou concentrations molaires) QI et Q2 se calculent au moyen des relations A5 et A6, dont les coefficients clé et d22 sont définis par A2 et A3. La concentration molaire Q2 peut être extraite du signal de fluorescence PM2, délivré par le second détecteur de fluorescence DF2, par le second démodulateur DRF2 au moyen d'un filtre de type passe bande centré sur la fréquence w2. En effet, comme indiqué précédemment, en raison de la diaphonie optique entre fluorochromes, PM2 comprend deux composantes fréquentielles, PM2(w2), qui correspond à la valeur efficace ou la valeur crête à crête de l'impulsion électrique filtrée autour de la fréquence w2, et PM2(w1), qui correspond à la diaphonie optique. On a donc PM2 = PM2(w 1) + PM2(w2). Ces composantes fréquentielles PM2(w 1) et PM2(w2), qui sont définies par les relations A15 et A16 de l'annexe, peuvent être séparées au moyen d'un simple filtre passe bande centré sur la fréquence w2. La concentration molaire Q1 peut être extraite directement du signal de fluorescence PMI qui est égal à PM 1(0) 1). Dans une configuration qui ne comporte pas de moyen de séparation LS, et qui correspond aux situations dans lesquelles x12 = 1, les signaux délivrés par l'unique détecteur PM de fluorescence sont donnés par la relation A19 que l'on peut reformuler sous la forme de la relation A20 de l'annexe. Par démodulation, on peut extraire du signal PM les signaux PM(col) et PM(co2) qui sont donnés par les relations A21 et A22 de l'annexe. La relation A21 permet de calculer Q2, et le report de Q2 dans la relation A22 permet de déterminer QI. L'exemple décrit ci-avant peut être étendu à n'importe quel nombre de fluorochromes avec un niveau plus ou moins complexe de diaphonie optique. Dans un deuxième exemple d'application, le dispositif d'analyse DA, selon l'invention, permet de mesurer l'indice de réfraction des cellules contenues dans un échantillon de sang total. Dans le cas des cellules de la lignée érythrocytaire, cet indice de réfraction est reconnu comme étant représentatif de la concentration en hémoglobine corpusculaire. En effet, d'un point de vue optique, le globule rouge est constitué d'une membrane "bicouche lipidique" d'environ 7 nm d'épaisseur et d'indice de réfraction voisin de 1,46. Le contenu intracellulaire contient plusieurs composés solides dissous en phase aqueuse dont l'hémoglobine (= 34g/dl), les sels ( 0.7 g/dl) et une minorité de composés organiques ( 0,2 g/dl). L'indice de réfaction peut s'écrire sous la forme donnée par la relation A23. La concentration (en mmol/dl) peut être ramenée à une concentration massique (g/dl) connaissant la masse molaire de l'hémoglobine (M= 66 500 g/mol). La masse moyenne d'hémoglobine dissoute dans le globule rouge est de 12 pg. Soit une concentration moyenne de 33 g/dl ou encore 5 mmol/1. Sur sang total la mesure d'hémoglobine doit être corrigée du facteur d'hématocrite qui se situe entre environ 40% et 55% chez l'homme, et environ 35% et 45% chez la femme. Ce facteur d'hématocrite est ici pris égal à 0,42 (valeur moyenne) ; par exemple, une concentration moyenne d'hémoglobine corpusculaire de 5 mmol/1 donne une concentration moyenne d'hémoglobine totale de 2,1 mmol/1 pour une mesure réalisée sur sang total. Compte tenu de ce qui précède et de la relation A23, l'indice de réfraction d'un globule rouge peut s'écrire: n(980 nm) = 1,34+ 0,0019 * Hb (concentration corpusculaire g/dl), pour une longueur d'onde d'analyse de 980 nm, et n(488 nm) = 1.35 + 0,0016 * Hb (concentration corpusculaire g/dl), pour une longueur d'onde 15 d'analyse de 488 nm. Le domaine de validité de ces formules sera pris pour une concentration corpusculaire en hémoglobine (en g/dl) variant de 25 à 50 g/dl. La partie imaginaire de l'indice de réfraction aux longueurs d'onde d'analyse égales à 980 nm et 488 nm peut être déterminée numériquement au moyen des relations suivantes: x(980 nm) = 1,47 *10 "5 *Hb, et x(488 nm) = 3,7.10 -5 * Hb. La concentration d'hémoglobine corpusculaire peut être déterminée à partir de la mesure du coefficient d'extinction à deux longueurs d'onde. Pour ce faire, on peut partir de l'approche géométrique, développée par A. G. Borovoi, qui permet de calculer la section efficace de diffusion Cext d'un globule rouge sphérisé dont l'expression est donnée par la relation A24 de l'annexe. On peut construire un diagramme des courbes d'isovolumes et d'isoconcentrations, du type de celui illustré sur la figure 6, permettant de déterminer le volume et la concentration d'hémoglobine corpusculaire en fonction des sections efficaces de diffusion CeXt aux longueurs d'onde d'analyse (ici 488 nm et 976 nm). A un couple de mesure Ce,d(488 nm) et Cex1(976 nm) correspond sur ce diagramme une sphère unique de concentration en hémoglobine et de volume donnés. L'obtention du contenu en hémoglobine et son suivi peuvent s'avérer particulièrement utiles. C'est notamment le cas pour le suivi d'anémies et de carences en fer. La charge en hémoglobine corpusculaire moyenne est en effet particulièrement utile à suivre lors des fortes demandes médullaires qui sont induites par les traitements aux hormones de croissance ("r-Hu EPO therapy"). Le suivi des réticulocytes et de leur contenu en hémoglobine en thérapie cellulaire peut s'avérer également utile, comme indiqué dans le document de Carlo Brugnara Iron Deficiency and Erythropoiesis: New Diagnostic Approaches , Clinical Chemistry 49: 10, 2003, pp. 1573-1578. Grâce à l'invention, il est désormais possible d'effectuer des mesures simultanées de contenu en hémoglobine (via les mesures de diffusion) et d'autres mesures (via les mesures de fluorescence), sans interférence entre elles, et avec un risque d'erreur réduit en raison du mode de traitement. Dans ce cas, le contenu en hémoglobine peut être avantageusement complété par une mesure de fluorescence de l'ARN intra érythrocytaire permettant d'isoler les érythrocytes jeunes, ou réticulocytes, des éléments matures. Une ou plusieurs longueurs d'onde de fluorescence peuvent être simultanément utilisées pour des marquages additionnels permettant d'autres identifications spécifiques potentiellement utiles, telles que l'identification ou la mise en évidence: É des hématies contenant de l'hémoglobine foetale (HbF), ou É des hématies infestées par un parasite de la malaria, ou É des récepteurs de la transférine (CD71), ou É de l'expression de la glycophorine A (CD235a), comme cela est notamment décrit dans l'article de Flans J. Tanke " Reticulocytes and Mature 25 Erythrocytes ", Flow Cytometry in Hematology, ISBN 0-12-432940-3. Les applications de l'invention sont nombreuses aussi bien sur les cellules nucléées (leucocytes et autres) que sur la lignée érythroïde ou les éléments thrombocytaires (marquage de l'activation ou de l'immaturité plaquettaire). Par ailleurs, l'invention n'est pas seulement utile dans le cas d'éléments figurés du sang ou de la moelle osseuse mais peut également être adaptée à toute suspension cellulaire biologique, qu'elle soit eucaryote ou procaryote. Dans ce qui précède on a principalement décrit l'invention sous la forme d'un dispositif d'analyse. Mais, l'invention peut être également considérée sous la forme d'un procédé d'analyse pouvant être mis en oeuvre par le dispositif d'analyse décrit, ainsi que par ses variantes. Des applications du procédé, autres que la cytométrie en flux, peuvent être envisagées pour des utilisations in vivo ou in vitro. Par exemple, on peut adapter ce procédé à un dispositif réalisant le balayage d'un tapis cellulaire (frottis, coupes de tissus, notamment), ou d'une suspension cellulaire. L'invention ne se limite pas aux modes de réalisation de dispositif et de procédé d'analyse optique décrits ci-avant, seulement à titre d'exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l'homme de l'art dans le cadre des revendications ci-après. ANNEXE * I, (t) _ I,o (1 + M, cos(21rco,t) où i = 1 à n, I,0 est l'intensité maximale du rayonnement Ri, M; est la profondeur (ou l'amplitude) de modulation (généralement comprise entre 0 à 1), coi est la fréquence de la modulation appliquée au rayonnement Ri, et t est le temps. (Al) * C11 = a11Tjl IFl1 c12 = 0 C21 = al1i11F12 C22 = a21r121F22 C31 = a1M11F13 C32 = a21TI21F32 C13 = 0 C23 = 0 C33 = a31 x131 I3F33 (A2) d11=0 d12=0 d13=0 (A3) d21 = 0 d22 = a22122F22 d23 = 0 d31 = 0 d32 = a22122F32 d33 = a32132F33 e11=0 e12=0 ei3=0 (A4) e21 = 0 e22 = 0 e23 = 0 e31 = 0 e32 = 0 e33 = a33133F33 où a;j est le coefficient d'absorption molaire du composé i à la longueur d'onde 2j, i- est le rendement de fluorescence du composé i dans la bande de détection Bj, F;j est le facteur de pondération compris entre 0 et 1 et traduisant le fait que seule une partie du spectre de fluorescence du composé i est filtrée dans la bande de détection Bj. * QI = c11 PMI (col) Q2 = d22 PM2 (02) Q3 = e33 PM3 ((03) (A5) (A6) (A7) * PMI= K12 * K13 * PMIO (A8) PM2 = K23 *PM20 + P12(1-K12)K13 PM10 (A9) PM3 =PM30+ P13(1-Ki3) K13 PMIO + P23 (l-K23)PMIO (A10) où i est un coefficient de couplage phénoménologique constant, compris entre 0 et 1, et représentant le transfert d'énergie d'un fluorochrome i vers un fluorochrome j, et pq est un coefficient représentant le rendementquantique avec lequel la lumière transférée, issue du fluorochrome i, est convertie en lumière de fluorescence par le fluorochrome j. * PMI = K12 * PMIO (Al 1) PM2 = PM20 + p12(1-K12) PM10 (Al2) PM3 = PM30 (A13) * PM1(co1) = K12 al Ir111IjFnQl (A14) PM2((02) = a22122I2F22Q2 (A15) PM2((0l)=a21121I1F22Q2+alIniIIIF12QI +P12(1-K12)a1Irl11IIFiIQI (A16) (A17) PMl((ol) P12 + F * x12 (121712111 PM2(wl) + PM2(w2) + p,2 PM1(wl) a22iz212 * QI =(l/K12c,III)PM1(w1) (A18) * PM= PM0, (Al 9) a,, rPM0, + 1 a12a22 a22,/ 1 * PM = (al i+a21)Q1 + a22Q2 * PM((w2) = a221122I2F22 Q2 (A20) (A21) * PM(col) = a21g21I,F22Q2 + al In, 1I1(FI I+FI2)QI (A22) * m(Hb,X) = n(Hb,X) - i x(Hb,X) (A23) où n(Hb,X) = n (a.) + a(X)*Hb est la partie réelle de l'indice de réfraction, n (1) est l'indice de réfraction du solvant pur, fonction de la longueur d'onde, a(X) est le coefficient incrémental de l'indice de réfraction propre à l'hémoglobine et fonction de la longueur d'onde, x(Hb,X) _ 13(X)*Hb est la partie imaginaire de l'indice de réfraction, et 13(1) est le coefficient d'absorption molaire. * Cext = 7ta2Qext (A24) avec: z Q om, =2 -4e-Ptanfl c fl sin(p J 3) - 4e P cos(p 2)6)+4 cos f cos(2/3), m = n-ik: indice de réfraction complexe du globule rouge, p = 2x(n-1) : paramètre donnant l'écart de phase, x =2na/X, a: rayon de la sphère, et tan 13 =x/(n-1). 28 REVENDICATIONS 1. Dispositif (DA) d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant un espace de mesure (CM) pour des éléments microscopiques à analyser, au moins une source (S) propre à délivrer des rayonnements présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et destinés à interagir avec lesdits éléments microscopiques dans ledit espace de mesure (CM) pour former des rayonnements d'interaction, des moyens de détection (DE, DF) agencés pour transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction provenant dudit espace de mesure (CM), et des moyens d'analyse (MA) agencés pour analyser lesdits signaux électriques de manière à permettre la détermination de données représentatives desdits éléments microscopiques analysés, caractérisé : en ce que lesdits rayonnements codés sont conjugués au niveau dudit espace de mesure (CM), en ce qu'il comprend i) des moyens de codage (M) agencés pour coder lesdits rayonnements en amont dudit espace de mesure (CM) avec des codes différents (coi), et ii) des moyens de filtrage optique (FO, LS) agencés pour filtrer sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion en fonction de leur longueur d'onde, en amont desdits moyens de détection (DE,DF), et en ce que lesdits moyens d'analyse (MA) comprennent des moyens de décodage (DRE, DRF) agencés pour décoder lesdits signaux électriques afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code d'origine. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits rayonnements d'analyse (Ri) délivrés par ladite source (S) sont appliqués séquentiellement auxdits éléments microscopiques à analyser. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits rayonnements d'analyse (Ri) délivrés par ladite source (S) sont appliqués simultanément auxdits éléments microscopiques à analyser. 4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits moyens de filtrage optique (FO, LS) sont agencés pour filtrer sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande. 5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend au moins deux lasers propres à délivrer des rayonnements conjugués au niveau dudit espace de mesure (CM). 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits lasers sont de type monochrome. 7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend au moins une diode électroluminescente. 8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend une source de rayonnement polychromatique. 9.Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite source de rayonnement polychromatique (S) est choisie dans un groupe comprenant au moins un laser polychromatique à spectre sensiblement continu, une lampe à incandescence, une lampe à arc. 10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite source (S) est agencée pour délivrer lesdits rayonnements d'analyse selon un mode continu et/ou un mode impulsionnel. 11.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'intensité (Ii) de chaque rayonnement d'analyse (Ri) délivré par ladite source (S) est paramétrable. 12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lesdits moyens de codage (M) sont agencés pour moduler en intensité lesdits rayonnements d'analyse. 13.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'une partie au moins desdits moyens de codage (M) est agencée pour agir sur les rayonnements en aval de ladite source (S) de manière à constituer lesdits rayonnements d'analyse. 14.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'une partie au moins desdits moyens de codage (M) est agencée pour agir au niveau de ladite source (S) en amont d'une sortie de distribution des rayonnements d'analyse. 15.Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite partie des moyens de codage (M) est intégrée dans ladite source (S) . 16.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que lesdits moyens de codage (M) comprennent un modulateur acousto- optique propre à moduler lesdits rayonnements délivrés par ladite source (S) de manière à constituer lesdits rayonnements d'analyse. 17.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdits moyens de détection (DE,DF) comportent une multiplicité de capteurs photosensibles adaptés à la détection de rayonnements d'interaction. 18.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdits moyens de détection (DE,DF) comportent une multiplicité de capteurs photosensibles adaptés à la détection de rayonnements d'interaction et implantés dans un endroit défini par un axe l0 interceptant la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau du passage obligé, cet axe étant orienté par rapport à la direction générale d'un angle compris entre 0 et 360 . 19.Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un système informatique (MC) comportant une interface logicielle de contrôle. 20.Procédé d'analyse d'éléments microscopiques, caractérisé en ce qu'il comprend: i) une première étape dans laquelle on illumine des éléments microscopiques au niveau d'un espace de mesure (CM) au moyen de rayonnements d'analyse conjugués au niveau dudit espace de mesure (CM) et présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et des codages selon des codes différents choisis, de manière à former des rayonnements d'interaction, ii) une deuxième étape dans laquelle on collecte une partie au moins desdits rayonnements d'interaction, puis on les sépare et filtre en fonction de leur longueur d'onde, iii) une troisième étape dans laquelle on détecte lesdits rayonnements d'interaction filtrés, puis on les transforme en signaux électriques, et iv) une quatrième étape dans laquelle on décode lesdits signaux détectés en fonction de leur code d'origine de manière à permettre la détermination de données représentatives desdits éléments microscopiques analysés. 21.Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que dans la première étape on applique séquentiellement lesdits rayonnements d'analyse (Ri) auxdits éléments microscopiques à analyser. 22.Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que dans la première étape on applique simultanément lesdits rayonnements d'analyse (Ri) auxdits éléments microscopiques à analyser. 23.Dispositif selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que dans la deuxième étape on filtre sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande. 24.Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que dans la quatrième étape on déduit des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion, l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés. 25.Procédé selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce que dans la quatrième étape, en présence d'un échantillon de sang total, on détermine la concentration en hémoglobine corpusculaire des cellules de la lignée érythrocytaire à partir dudit 'indice de réfraction. 26.Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en ce que dans la quatrième étape on déduit de signaux résultant de l'interaction entre lesdits rayonnements d'analyse et deux fluorochromes différents, spatialement proches, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre lesdits fluorochromes. 27.Utilisation du dispositif et du procédé d'analyse selon l'une des revendications précédentes dans un domaine choisi dans un groupe comprenant l'analyse biologique, biochimique, chimique, particulaire, morphologique, et en particulier la cytométrie de flux multiparamétrique, l'analyse de particules chargées dans un fluide liquide ou gazeux, et la granulométrie.