Brevet FR2882151A1 — publié le 20060818

Domaine de l'invention. La présente invention concerne un procédé de détection des interactions entre un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) et l'une des sous-unités G ou G[3y d'une protéine G par transfert par effet de proximité entre les deux membres d'un couple donneur / accepteur et ses applications, telles que notamment le criblage de nouveaux médicaments et l'identification de récepteurs orphelins. Dans la présente description, on désigne par "transfert par effet de prox mité" un transfert d'énergie caractérisé par un signal de FRET (technologie HTRF , CIS BIO INTERNATIONAL), un transfert d'oxygène singulet (technologie Alphascreen , F'erkinElmer, voir par exemple Beaudet et al., Genome Res., 2001 Apr. 11 (4), 600-8), un transfert d'électron (technologie SPA, Amersham Biosciences, voir par exemple Udenfriend et al., Anal. Biochem., 1987, Mar., 161(2), 494-500). Dans les techniques de transfert d'énergie non-radiative de fluorescence couramment dénommées techniques de FRET, la technique de TR-FRET ("rimeResolved Fluorescence resonance energy transfer) permet une mesure de fluorescence en temps résolu et en milieu homogène. La mise en oeuvre de cette technique avec des chélates ou des cryptates de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (voir notamment Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptates as a tool for prDbing molecular interactions in biology , Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique. Cette technique, également connue sous le nom de HTRF (Homogenous Time Resolved IFluorescence), met en oeuvre un premier composé fluorescent donneur et un second composé fluorescent accepteur. Après excitation lumineuse à la longueur d'onde du donneur, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur s'ils sont proches l'un de l'autre; ce transfert d'énergie se caractérise par une émission de lumière par l'accepteur (signal de FRET) qui peut être mesurée à l'aide d'un fluorimètre. Les récepteurs, en particulier les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (ci-après dénommés RCPG) sont impliqués dans de nombreux processus pathologiques. Les RCPG sont des protéines transmembranaires responsables de la reconnaissance et du transfert de l'information de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Ces protéines représentent des cibles thérapeutiques importantes et plus de 50 % des médicaments actuels ciblent ces récepteurs ou leur cascade de transduction. Les mécanismes d'activation des RCPG en présence d'un ligand sont représentés schématiquement sur la figure 1 annexée. La fixation d'un ligand agoniste à un RCPG modifie la structure tertiaire de celui-ci, qui, à son tour, active la protéine G couplée au RCPG. L'activation de la protéine G provoque, suivant le cas, l'activation ou l'inhibition d'un effecteur qui produit un second messager intracellulaire comme l'AMPc ou l'IP3. Dans la présente description, on désigne par "récepteurs orphelins", des récepteurs transmembranaires dont la séquence d'ADN laisse penser qu'il s'agit de RCPG mais dont on ne connaît pas le ligand naturel spécifique. La caractérisation des voies de signalisation (seconds messagers et effecteurs) ainsi que l'identification de ligands pour des RCPG dits "récepteurs orphelins" revêt une importance considérable dans la compréhension dL rôle physiologique de ces RCPG ainsi que pour l'élaboration de nouveaux médicaments. Etat de la technique. Il existe différents procédés pour la détection des interactions récepteurs / protéine G qui utilisent l'un des acteurs du processus d'activation des RCPG, notamment pour la détection de ligands spécifiques. Par exemple, une méthode de détection de ligands utilise un dérivé radioactif non-hydrolysable du GTP, à savoir le GTPy[35S] qui se fixe sur la protéine Ga lorsque le RCPG est activé. Les paramètres cinétiques de la fixation de l'analogue de GTP sont dépendants du type de protéine G. Cette méthode radioactive n'est pas adaptée au criblage à haut débit de médicaments. D'autres méthodes classiques sont basées sur l'activation des effecteurs par les sous-unités des protéines G trimériques activées. Comme indiqué sur la figure 1, l'activation des effecteurs et la productiDn de seconds messagers tels que l'AMPc ou l'IP3 sont produits après la stimulation du RCPG et de la protéine G. Cette méthode s'intéresse donc à des substances produites en aval du processus d'activation du RCPG. Des méthodes, adaptées au criblage à haut débit de médicaments, utilisent des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique, telle que l'activité de la 5-galactosidase ou de la luciférase, dont l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par l'activation du RCPG. Il s'agit des méthodes indirectes de mesure de l'activité du RCPG, qui s'intéressent également aux substances produites en aval du processus d'activation du RCPG. Une autre méthode de détection de ligands se focalise sur la translocation de l'arrestine-GFP. L'arrestine intervient dans la machinerie de régulation qui éteint la voie d'activation déclenchée par la fixation du ligand sur le RCPG. Elle permet de déclencher le processus d'internalisation du récepteur dans la cellule, étape nécessaire à sa dégradation ou à son recyclage sur la membrane cellulaire. La technologie développée par NORAK BIOSCI (Transfluor) utilise de l'arrestine fusionnée à une protéine fluorescente (GFP) (arrestine-GFP) qui est exprimée dans des cellules. Dans les conditions normales, l'arrestine-GFP est distribuée dans le cystosol. Après activation du RCPG, l'arrestine-GFP va interagir avec le RCPG présent à la membrane et stimulé par un agoniste. Sa distribution cellulaire va donc être modifiée. Elle va quitter le cytosol pour être redistribuée à la membrane plasmique (phénomène de translocation) et participer au phénomène d'internalisation (disparition des récepteurs de la surface cellulaire). Au cours du temps, la fluorescence de l'arrestine- GFP accrochée à son récepteur pourra également être mesurée à proximité de vésicules internes (endosomes) à la cellule qui témoignent du phénomène d'endocytose de certains récepteurs. Ces variations de distributions de l'arrestine-GFP se fait grâce à des techniques de microscopie et de traitement de l'image. Pour ces raisons, cette technique n'est pas adapt..e au criblage à haut débit (HTS). Les travaux récents de Janetopoulos et al. [Science (2001) 291: 2408-2411; Methods (2002) 27: 366-373] ont permis de visualiser un signal de FRET entre les sous-unités Ga2-CFP et G[3-YFP chez D. discoideum. Les travaux de Azpiazu et Gautam [JBC(2004) 279 (26) : 27709-27718] montrent des résultats analogues de variation du signal FRET entre Ga-CFP et G[3-YFP dans le modèle de stimulation des récepteurs muscariniques M2 et M3 exprimés dans les cellules CHO. L'équipe de Berlot [JBC (2004) 279 (29) : 30279-30286] a mis en évidence, in vivo et en microscopie, les interactions entre Gfi et G- marquées par des fragments d'une protéine fluorescente (YFP). L'association Glly restaure la fluorescence de la protéine YFP. Ces observations suggèrent que l'activation des protéines G hétérotrimériques peut être analysée par la technique de FRET. Ces techniques montrent de façon indirecte l'activation d'un récepteur par mesure de FRET entre les sous-unités des protéines G mais ne montrent en aucun cas, et de façon directe, l'état d'activation du RCPG mesuré par un signal de FRET spécifique entre lui-même, récepteur d'intérêt, et l'une ou l'autre des sous-unité des protéines G à laquelle il est couplé. Une autre méthode consiste à insérer par biologie moléculaire des protéines fluorescentes (CFP et YFP) dans un RCPG, au niveau de la 3ème boucle intracellulaire et de la partie C-terminale respectivement, et à mesurer, par variation d'un signal de FRET, l'activation du récepteur. Cette méthode est décrite par Vilardaga et al. [Nat. Biotechno%. (2003) 21: 807-812; WO 2004 057333 Al] Elle ne prend pas en compte directement les interactions RCPG-protéines G et les modulations de ces interactions suite à l'activation du RCPG. Une autre méthode consiste à détecter l'oligomérisation des RCPG par la 15 technique de FRET (brevet US 6 824 990 B1). Aucune de ces méthodes ne permet de rendre compte, par mesure d'un signal de FRET, de l'état d'activation précoce d'un récepteur RCPG, dit récepteur d'intérêt, et de l'une ou l'autre des sous-unités des protéines G à laquelle il est couplé. Résumé de l'invention. On a maintenant trouvé, de manière surprenante, qu'il est possible de détecter l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) à un stade précoce du processus d'activation en mesurant le signal de fluorescence basé sur un transfert d'effet de proximité entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou G(3y d'une protéine G. La mesure du signal de transfert d'effet de proximité tient compte de l'état d'activation d'un couple RCPG/ Ga ou d'un couple RCPG/ Gpy donné. Ce signal est donc hautement spécifique puisqu'il est généré par un couple unique composé obligatoirement d'un RCPG d'intérêt et d'une des sous- unités, Ga ou G[iy de la protéine G correspondante. Ce signal du transfert d'effet de proximité peut être modulé, positivement ou négativement, lorsque le récepteur est spécifiquement stimulé par un agent pharmacologique (agoniste, agoniste inverse, antagoniste ou régulateur allostérique). L'invention apporte également un avantage sur le plan de la spécificité de réponse puisqu'elle considère un événement précoce dans la voie d'activation du RCPG d'intérêt. Contrairement aux méthodes déjà connues, elle se situe très en amont de la voie de signalisation des RCPG et tient compte des interactions étroites entre RCPG/protéine G, en l'absence ou en présence d'agents pharmacologiques potentiels. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de détection des interactions entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou Gf3y d'une protéine G, qui comprend les étapes consistant à : Io 1) mettre en contact dans un milieu biologique un récepteur marqué avec un membre d'un couple donneur / accepteur avec une sous-unité Ga ou G5y d'une protéine G marquée avec l'autre membre du couple donneur / accepteur; 2) mesurer le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur. Le procédé de l'invention, qui permet de détecter les interactions entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou G53y d'une protéine G, est particulièrement approprié pour: 1) la mise,en évidence du couplage récepteur / protéine G, 2) l'étude des propriétés des récepteurs; 3) la détection de ligands agonistes ou antagonistes des récepteurs et le 20 criblage de nouveaux médicaments; 4) l'identification de récepteurs orphelins. La mise en contact du récepteur marqué avec l'une des sous-unités Ga ou G5y d'une protéine G peut se faire de différentes manières, par exemple par coexpression dans des cellules d'acides nucléiques codant pour le récepteur d'une part et pour l'une des sous-unités Ga et G(3y d'autre part, ou par reconstitution d'un RCPG fonctionnel (comprenant les sousunités formant le RCPG et les sous-unités des protéines G) obtenu par expression hétérologue d'acides nucléiques codant: pour lesdites sousunités formant le récepteur d'une part et les sous-unités codant pour les sous-unités des protéines G d'autre part, ou après purification à partir d'extraits tissulaires (voir par exemple Florio et al. JBC 1985, vol.260 n 8, pp. 3477-3483; Haga K. et al. JBC 1986, vol.261 n 22, pp. 1010310140; Devesa F. et al. 2002 Eur. J. Biochem, 269, pp 5163-5174; Stenlund et al. Anal. Biochem. 2003, 316, 24:3-250 and Park PSH.2004 FEBS Letters, 567, 344-348) dans des membranes plasmatiques artificielles. Avantageusement, lorsque le RCPG mis en oeuvre est un récepteur connu, la mise en contact est réalisée dans un premier temps, en présence d'un ligand naturel dudit RCPG qui déclenche l'activation dudit récepteur, puis en présence d'un agent pharmacologique potentiel ou toute autre molécule à tester, susceptible de moduler l'activité dudit récepteur. Lorsque le RCPG est un récepteur orphelin, la mise en contact est réalisée en présence d'un ligand naturel d'un récepteur connu qui permettra, s'il y a interaction, d'identifier ledit récepteur orphelin. La mise en évidence d'un agent pharmacologique potentiel ou toute autre molécule à tester, susceptible de moduler l'activité dudit récepteur orphelin est effectuée comme! indiqué ci-dessus pour un récepteur connu. Les membres du couple donneur / accepteur mis en oeuvre dans le procédé de l'invention sont choisis selon le mode de transfert par effet de proximité que l'on souhaite mesurer. Ainsi, si le transfert par effet de proximité est un transfert d'énergie par fluorescence, le couple donneur / accepteur sera constitué d'un fluorophore donneur d'énergie et d'un fluorophore accepteur d'énergie. Les fluorophores appropriés aux fins de l'invention sont des molécules fluorescentes, choisies parmi les protéines fluorescentes ou de fluorophores organiques. Des exemples de ces molécules fluorescentes sont les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPYs, tels que par exemple les dérivés de difluoroboradiazaindacènes, les fluoresoines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptates de terre rare, les nano-cristaux de type Quantum dots, les protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, Ila R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyaninE!s, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ou encore les composés fluorescents décrits dans WO 2003/104685. L'homme du métier est à même de choisir les couples donneurs / accepteurs photocompatibles appropriés pour des mesures de FRET ou TR- FRET. Dans le cas d'un transfert d'oxygène singulet, on utilisera par exemple comme couple donneur / accepteur les réactifs associés à la technologie Alphascr2en commercialisés par la société Perkin Elmer (voir Beaudet et al., Genome Res., 2001 Apr. 11 (4), 600-8). Si le transfert par effet de proximité est un transfert d'électrons, on ut lisera comme couple donneur / accepteur, ceux décrits dans Anal. Biochem., 1987, Mar., 161(2), 494-500. Le récepteur mis en oeuvre dans le procédé de l'invention est avantageusement un RCPG connu, tel que le récepteur muscarinique, le récepteur à la vasopressine, le récepteur au GABA (acide gamma-aminobutyrique) ou un RCPG dont on veut caractériser la fonction, à savoir un récepteur orphelin. Les séquences d'ADN codant pour ces récepteurs peuvent être amplifiées par PCR selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier (voir Sarnbrook et al. ci-après) ou sont disponibles dans le commerce (Invitrogen). Les sous-unités Ga et G(3y à mettre en oeuvre dans le procédé de l'invention peuvent être les sous-unités Gi, Gs, Gq ou G12/G13, G14, G15, G16 ou des protéines G chimériques (avec une structure de type Gqx (x pouvant être i, o essentiellement) (voir Conklin et al. Nature, 1993, v363 pp274-6; Milligan and Rees Trends Pharmacol Sci., 1999, v20 pp118-24) dont les séquences et les propriétés sont connues de l'homme du métier. Les séquences d'ADN codant pour des sous-unités peuvent être amplifiées par PCR selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier (voir Sarnbrook et al. ci-après) ou sont disponibles dans le commerce (Invitrogen). Le marquage du récepteur et de l'une des sous-unités Ga ou G(3y est réalisé soit directement par une ou plusieurs liaisons covalentes selon des techniques bien connues de l'homme du métier (Janetopoulos et al., Methods (2002) 27: 365-373 et Vilardaga et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21: 807-812 par exemple), soit indirectement par l'intermédiaire de partenaires de liaison de type étiquette ("tag") / anticorps antiétiquette (anti-tag), antigène / anticorps, avidine ou streptavidine / biotine; haptène / anticorps. La mesure du signal de transfert d'effet de proximité est effectuée selon les méthodes classiques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans les articles mentionnés précédemment. Par exemple, les variations du signal de FRET peuvent être mesurées de manière quantitative par des détecteurs de fluorescence classiques couramment utilisés, par l'homme du métier, dans les laboratoires spécialisés dans le criblage à haut débit (RUBYSTAR, BMG labtech). La mesure des variations du signal de FRET permet de rendre compte directement de l'état d'activation ou d'inactivation d'un RCPG et présente donc une solution adaptée à la recherche de molécules modulant la fonction de ces récepteurs dans un criblage à haut débit. Avantageusement, l'étape 1) du procédé de l'invention est réalisée par transfection des cellules avec un acide nucléique codant pour un récepteur et: avec Io un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gjiy d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou Gpy étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur. Selon une variante de mise en oeuvre, l'étape 1) du procédé consiste à mettre en contact des préparations de cellules transfectées avec un acide nucléique codant pour un récepteur et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou G13y d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou Gf3y étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur, avec une substance à tester. Avantageusement, l'étape 2) du procédé de l'invention est réalisé comme suit: 1) on mesure le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur en l'absence de ligand, d'agents pharmacologiques dudit récepteur et de molécules à tester (signal basal) ; 2) on compare éventuellement au signal basal le signal obtenu en présence 25 d'un ligand spécifique de ce RCPG qui va déclencher l'activation de ce récepteur (signal de référence) ; 3) on compare aux signaux basaux et de référence, le signal obtenu en présence d'agents pharmacologiques ou de molécules chimiques qui sont susceptibles de moduler l'activité dudit récepteur. Selon une variante préférée de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le couple donneur / accepteur est un couple constitué d'un fluorophore donneur et d'un fluorophore accepteur et le signal mesuré est le signal de FRET émis après excitation lumineuse du milieu de mesure à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore donneur. La présente invention a également pour objet les cellules transfectées avec une séquence d'acide nucléique codant pour un RCPG et avec une séquence d acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou G13y de la protéine G correspondante, le récepteur RCPG et la sous-unité Ga ou G[3y étant couplés l'un avec un fluorophore donneur et l'autre avec un fluorophore accepteur. L'invention a également pour objet les préparations membranaires de cellules transfectées telles que définies ci-dessus, qui sont obtenues selon les procédés classiques bien connus de l'homme du métier. Enfin, l'invention a pour objet une trousse qui comprend les préparations de 10 cellules transfectées telles que définies ci-dessus, ainsi que les moyens néces;;aires pour la mesure du signal de FRET. Description détaillée de l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence à la technique de FRET sans pour autant limiter la présente demande à cette seule 15 technique. a) Les préparations de cellules transfectées. Dans la présente description, on désigne par "préparation de cellules transfectées", les cellules transfectées elles-mêmes, les cellules transfectées perméabilisées selon les procédés connus de l'homme du métier et illustrés par l'exemple 1 ainsi que les préparations membranaires de cellules transfectées ou les préparations membranaires obtenues par reconstitution dans des membranes plasmiques artificielles des récepteurs et des sous-unités Ga et G13y. Les cellules peuvent être transfectées de manière stable, c'est-à-dire que les séquences codant pour le récepteur ou les sous-unités Ga ou G[3y sont intégrées 25 dans l'ADN génomique des cellules. Les cellules peuvent également être transfectées de manière transitoire à l'aide d'un vecteur d'expression de type plasmide contenant la séquence d'acide nucléique codant pour le récepteur et la séquence d'acide nucléique codant pour l'une des sous-unités Ga ou G13y. Les techniques de transfection des cellules, bien connues de l'homme du métier, sont décrites par exemple dans l'ouvrage de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2"d edition; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Les cellules utilisées sont des cellules eucaryotes, telles que par exemple les cellules HEK 293 ou COS. 2882151 i0 La transfection peut également être effectuée par expression hétérologue dans des membranes plasmiques artificielles. Enfin, l'invention peut être mise en oeuvre sur des préparations membranaires de cellules transfectées, dont la préparation relève des connaissances générales de l'homme du métier, et comprend essentiellement des étapes d'éclatement des cellules par tampon hypo-osmotique, sonication, polytron, et récupération des fractions membranaires d'intérêt. Ces préparations membranaires peuvent être en outre enrichies par des étapes additionnelles de centrifugation différentielles ou par gradient de sédimentation. io b) Les fluorophores. Les fluorophores (composés fluorescents) donneurs ou accepteurs qui conviennent aux fins de l'invention sont des substances fluorescentes choisies par exemple parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPYs, les fluorescéines, les fluorophores connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptates de terre rare, des quantum dots, des protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrin, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665. Les fluorophores donneurs peuvent être l'un quelconque des fluorophores ci-dessus qui, lorsqu'ils sont excités à une longueur d'onde donnée, transfèrent de l'énergie à un fluorophore accepteur. Les fluorophores accepteurs sont l'un quelconque des fluorophores cidessus, 25 capable d'émettre un signal de FRET lors du transfert d'énergie à partir du fluorophore donneur. La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. De manière générale, pour que le FRET ait lieu, le spectre d'excitation de l'accepteur doit recouvrir au moins en partie le spectre d'émission du composé donneur, et les dipôles de transition des composés donneurs et accepteurs doivent être parallèles. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notarnment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2"d edition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer. De préférence, le fluorophore donneur est un complexe de terre rare, en particulier de terbium ou d'europium. s Avantageusement, le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate, de préférence un cryptate à motif pyridine. Des chélates de terres rares sont décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777D'autres chélates sont composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909). Les cryptates de terres rares sont décrits notamment dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 601 113 et la demande WO 01/96 877. Parmi ces cryptates, on préfère tout particulièrement les cryptates à motif 15 trisbipyridine, éventuellement substitués par des motifs carboxylates, ou les cryptates pyridine bisbipyridine de formule: Lorsque le fluorophore donneur est un complexe de terre rare, le fluorophore 20 accepteur est avantageusement choisi parmi les cyanines ou l'allophycocyanine, éventuellement réticulée. c) Le couplage des fluorophores. Comme indiqué précédemment, les fluorophores sont couplés au récepteur ou aux sous-unités Ga ou G[3y, soit directement par une ou plusieurs liaisons covalentes, soit indirectement par l'intermédiaire de partenaires de liaison dE type étiquette ("tag") / anticorps anti- étiquette (anti-tag), antigène / anticorps, avidine ou streptavidine,/ biotine; haptène / anticorps. Le couplage direct des fluorophores peut être réalisé : 1) par expression d'une protéine de fusion entre ledit récepteur, ladite sous-unité Ga, ou ladite sous-unité GRy et une protéine fluorescente; ou 2) par expression d'une protéine de fusion entre ledit récepteur, ladite sous- unité Ga, ou ladite sous-unité G(iy et une protéine ayant une activité enzymatique irréversible (couramment dénommée enzyme suicide) qui transfère le fluorophore sur le RCPG, la sous-unité Ga, ou la sous-unité GRy; 3) par épissage avec une intéine. Cette technique de couplage par épissage avec une intéine est décrite par lo exemple dans The Journal of Biological Chemistry, vol. 273, n 26, pp 15887-15890, 26 juin 1998 et J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181. Le couplage indirect des fluorophores peut être réalisée: 1) par l'intermédiaire d'un couple "ligand-récepteur" ou "tag / antitag". 2) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité G5y natifs , dans ce cas les composés fluorescents sont conjugués à un anticorps reconnaissant spécifiquement ledit récepteur, la sous-unité Ga, ou la sous-unité G5y; ou 3) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité G[3y couplés à une protéine fluorescente ou à une enzyme suicide qui transfère le fluoropho-e sur ledit RCPG, ladite sous-unité Ga, ou la sous-unité G5y. 4) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité G5y portant différentes étiquettes (TAGs), dans ce cas les composés fluorescents sont conjugués à des anticorps dirigés spécifiquement contre lesdites étiquettes (TAGs). Ces méthodes de couplage direct et indirect de fluorophores utilisent les techniques d'ADN recombinant bien connues de l'homme du métier. Le couplage direct d'un fluorophore par expression d'une protéine de 'Fusion entre le RCPG, la sous-unité Ga ou la sous-unité G[3y avec une protéine ayant une activité enzymatique irréversible utilise avantageusement, comme protéine à activité enzymatique irréversible, une 06-alkylguanine-DNA alkyl transférase (AGT) (voir WO 02/083937) ou une déhalogénase. Dans ce cas, les cellules sont transfectées avec un acide nucléique codantpour le RCPG, avec un acide nucléique codant pour la sous-unité Ga ou la sous-unité G5y et avec un acide nucléique codant pour ladite protéine à a Vtivité enzymatique irréversible. Elles sont ensuite mises en présence du substrat spécifique de laclite protéine à activité enzymatique, qui est lié de façon covalente à un fluorophore que l'on veut coupler au récepteur ou à l'une des sous-unités Ga ou GRy. Dans le couplage indirect d'un fluorophore par l'intermédiaire d'un couple "ligand-récepteur" ou "tag / antitag", on fait exprimer une protéine de fusion entre le récepteur, la sous-unité Ga ou la sous-unité G13y et une séquence peptidique dite "étiquette" ou "tag", les composés fluorescents étant dans ce cas conjugués à un anticorps reconnaissant spécifiquement l'étiquette. On utilise les séquences peptidiques couramment utilisées en biologie moléculaire, telles que par exemple les étiquettes "Myc" ou "FLAG" mentionnées ci-après. Le terme "'couple ligand-récepteur" désigne deux partenaires de liaison tels que les couples: haptène/anticorps; DNP/ anticorps anti-DNP, dans lequel DNP représente le dinitrophénol; GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la glutathion S-transférase; biotine/avidine; 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines; Myc/anticorps anti-Myc dans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 de la protéine Myc humaine; FLAG /anticorps anti-FLAG dans lequel FLAG est un peptide ayant les 8 acides aminés ci-après DYKDDDDK; HA/anticorps anti-HA dans lequel FIA est un épitope de l'hémagglutinine d'Influenza, constitué des 9 acides aminés ci-après YPYDVPDYA. D'autres couples peuvent être utilisés. Les séquences d'ADN des couples couramment dénommés en langue anglaise "tag/antitag" sont bien connues de l'homme du métier. Ces séquences sont incluses dans des plasmides ou mises en fusion, par PCR, avec les ADN codant pour les protéines d'intérêt. d) La mesure du signal de FRET. Le signal de FRET peut être mesuré de différentes façons: mesure de la fluorescence émise par le donneur seul, par le donneur et l'accepteur ou encore mesure de la variation de la polarisation de la lumière transmise dans le milieu due au FRET. On peut aussi inclure la mesure du FRET en observant la variation de durée de vie au niveau du donneur ce qui est facilité par l'utilisation d'un donneur à durée de vie de fluorescence longue tel que les complexes de terre rare (notamment sur de l'appareillage simple comme des lecteurs de plaques). De façon préférée, on mesurera le signal de FRET en temps résolu (signal TRFRET). Au sujet de la mesure du signal de FRET ou du signal de TR-FRET, on pourra avantageusement se référer aux documents ci-après incorporés dans la présente description à titre de références: - Mathis G. "Rare Earth Cryptates and Homogeneous Fluoroimmunoassays 5 with Human Sera", Clin. Chem. (1993) 39, n 9, 1953-1959; - Mathis G. "Probing Molecular Interactions With Homogeneous Techniques Based on Rare Earth Cryptates and Fluorescence Energy Transfer", Clin. Chem. (1995) 41, n 9, 1391-1397; H.Bazin et al., "rime resolved amplification of cryptate emission,a versatile 10 technology to probe biomolecular interactions", Reviews in Molecular Biotechrology (2002) 82, 233-250; - ainsi qu'aux brevets ou demandes de brevets ci-après EP 321:353; EP 232 348; EP 539 477; EP 539 435; EP 569 496; EP 1 161 685; EP 1 166 119; WO 20044013348. Enfin, on notera que la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie pourra être améliorée en utilisant les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur. Ainsi, lorsqu'on utilise les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur, on procède comme suit: (i) on excite le milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde X1, X1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit fluorophore donneur est excité, et (ii) on mesure la fluorescence émise à la longueur d'onde 23 dans un plan de polarisation différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, 23 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore accepteur. La mesure du signal émis à la longueur d'onde d'émission du fluorophore accepteur dans un plan différent (c'est-à-dire non parallèle) du plan de polarisation de la lumière excitatrice, permet de favoriser la mesure du signal émis par les espèces fortement dépolarisées, et en particulier le signal de l'accepteur engagé dans le transfert d'énergie. Le plan dans lequel est effectué la mesure est préférentiellement le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans peuvent également convenir. Selon un aspect préféré, la technique utilisant les propriétés de polarisation comprend en outre les étapes suivantes: (iii) mesure de la fluorescence émise à la longueur d'onde 22, 22 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore donneur, et (iv) correction du signal émis par le fluorophore accepteur à la longueur c'onde X3 par le signal émis par le fluorophore donneur à la longueur d'onde 2,2. Cette correction peut par exemple consister en un calcul du ratio de l'intensité de la fluorescence mesurée à la longueur d'onde 23 par celle mesurée à la longueur d'onde 22. Dans le cas où l'on effectue une mesure de fluorescence à la longueur c'onde d'émission du donneur (22), cette mesure peut être effectuée dans un plan pa-allèle ou différent, de préférence orthogonal au plan de la lumière excitatrice. Selon un second mode de réalisation, les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur sont utilisées pour améliorer la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie, dans un procédé visant à déterminer la variation de polarisation due au transfert d'énergie. Comme le premier procédé décrit ci-dessas, ce procédé permet d'améliorer la sélectivité de la mesure, qui sera ainsi mieux corrélée au phénomène de transfert d'énergie que l'on veut détecter. Ce second mode de réalisation comprend les étapes suivantes: (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde U, U étant la longueur d'onde à laquelle ledit fluorophore donneur est excité, (ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It,1)u émise à la longueur d'onde X2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, 22 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore donneur, (iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl)u émise à la longueur d'onde 22 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It1/), émise à la longueur d'onde 23 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, 23 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore accepteur, (v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl)2,3 émise à la longueur d'onde 23 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur selon la formule suivante: [(lt//)Â3 - (It//)X2 x A)] - G[(lt1)a3 - (It1)a.2 x B)] [(lt//))3 (lt//)x2 x A)] + nG[(It1) x3 (ltl)x2 x B)] dans laquelle: - A représente le facteur de proportionnalité entre la fluorescence émise aux longueurs d'onde X2 et 23 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, - B représente le facteur de proportionnalité entre la fluorescence émise aux 10 longueurs d'onde 22 et 2,3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, n= 1 ou 2. Lorsque n = 1, on parle de mesure de polarisation; lorsque n = 2, il est question d'anisotropie. - G est un facteur permettant de corriger la différence de sensibilité de la détection dans les plans parallèle et orthogonal. Ce facteur est soit fourni par le constructeur, soit aisément déterminable par l'homme du métier en mesurant la polarisation de substances de polarisation connue. Dans une mise en oeuvre particulière, G est compris entre 0,1 et 2, de préférence G est compris entre 0,8 et 1,2, et en particulier G=1; et (vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie. Selon un mode préféré de mise en oeuvre, A et B sont calculés de la manière 25 suivante: A = (Id11)13 / (Id11)a2 B = (Id 1),,3 / (Idl)x2 (Id/13, (Ic1I1)u, (Id1), 3, (Idl)u correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde X2 ou X3, dans les plans parallèles ou différents du plan de polarisation de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit fluorophore donneur mais ne contenant pas le fluorophore accepteur. Comme dans le premier procédé décrit, les mesures effectuées dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice sont effectuées préférentiellement dans le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convent., du moment que le plan choisi n'est pas le plan parallèle au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer la sélectivité de la mesure d'un phénomène de transfert d'énergie entre un composé donneur et un composé accepteur. Cela est particulièrement avantageux dans le cas Dù la sélectivité spectrale entre le donneur et l'accepteur n'est pas optimale, c'est-à-dire dans les cas suivants: - cas où les spectres d'émission du donneur et de l'accepteur se chevauchent. io Les procédés selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le cas où 5nm - cas où une excitation parasite directe de l'accepteur est possible à la longueur d'onde d'excitation du donneur (X1). Dans un aspect préféré, les fluorophores donneur et accepteur on.: une polarisation élevée, en particulier supérieure à 50 mP, de préférence supérieure à 100mP. Les composés donneur et accepteur dont la polarisation intrinsèque est inférieure à 50 mP peuvent être couplés ou adsorbés à des molécules porteuses (molécules organiques, protéines, peptides, anticorps, ou autres molécules telle que décrites ci-après), ce qui aura pour effet d'augmenter la polarisation apparente du fluorophore et permettra de l'utiliser dans les procédés selon l'invention. Dans un autre aspect préféré, les fluorophores donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur X1, aucune émission de l'accepteur n'est détectée à la longueur c'onde d'émission du donneur X2. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs mais non limitatifs ci-après. 2882151 18 EXEMPLE 1 Des étiquettes ont été insérées par PCR au niveau des parties C-term nales des deux sous-unités GB1 et GB2 (étiquette Myc: EQKLISEEDL), après le résidu E916 pour GB1 et après le résidu E793 pour GB2, formant le récepteur fonctionnel GABAB, ainsi qu'entre les résidus V93 et E94 dans la sous-unité a de la protéine Go (étiquette FLAG: DYKDDDDK). Les différentes constructions sont exprimées dans des cellules HE. K293 transfectées de façon transitoire par électroporation (électroporateur BioRad) à raison de 10 millions de cellules par conditions expérimentales, choc électrique à 260 volts pour une capacitance de 1 mF. Les cellules sont ensuite reprises en milieu de culture DMEM complet contenant 10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont alors réparties à raison de 100 000 cellules/puits dans une plaque de 96 puits. 24 heures après électroporation, les cellules sont ensuite incubées, après rinçage en tampon PBS, pendant au moins 5 heures à 4 C (pour atteindre un état d'équilibre) avec un mélange d'anticorps anti-Myc (3 nM final) et anti-FLAG (1 nM final), marqués à l'AlexaFluor647 (molecular probes) (accepteur) et marqués au cryptate d'europium (PyridineBispyridine PBP) (donneur), respectivement. Le milieu réactionnel contenant les anticorps est le suivant: 5mM HEPES, 11mM EGTA, 2mM MgCl2, 10mM NaCl, 120mM KCI, 1mM CaCl2, pH 7.3, Triton X100 0.01%). Ce milieu a une composition isoosmotique par rapport au milieu intracellulaire. La faible concentration en Triton X100 assure une perméabilisation ménagée des cellules qui permet aux anticorps d'accéder aux épitopes intracellulaires sans avoir à fixer les cellules au préalable. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 2 annexée. Les mesures de signal de FRET, représentées par le signal 3,665 (émission à 665 nm de l'accepteur corrigé du bruit de fond), entre les étiquettes Myc en C-terminal de GB1 ou GB2 et la protéine Go-FLAG, mettent en évidence une interaction spécifique entre les deux protéines. Le signal de FRET peut être mesuré de façon quantitative sur un lecteur de fluorescence (Rubystar). A titre de comparaison, on a également mesuré le signal de FRET de cellules transfectées avec la même quantité finale de plasmides que dans les Doints expérimentaux. Dans cette condition, appelée "mock", le plasmide ne contient pas de séquences codantes pour l'une ou l'autre des protéines GB1, GB2 ou Go. EXEMPLE 2 Les séquences codantes pour les enzymes SNAPTag et HaloTag ont été insérées, respectivement, par biologie moléculaire, au niveau de la partie C-Terminale des sous-unités GB1 ou GB2 (formant le récepteur fonctionnel GABAB), ainsi qu'au niveau de boucles identifiées dans les sous-unités Gpy de la protéine Go. Ces constructions ont été exprimées dans les cellules HEK293 transfectées de façon transitoire comme indiqué dans l'exemple 1. 24 heures après transfection, les cellules sont incubées dans une étuve à 37 C, 5% CO2, pendant 30 minutes avec du milieu de culture contenant 5 pM de chaque substrat spécifique des enzymes lo SNAPTag et HaloTag, marqués avec un fluorophore accepteur (A) et marqués avec un fluorophore donneur (D), respectivement. Après lavages les cellules sont à nouveau incubées 30 minutes dans leur milieu de culture dans une étuve à 37 C, 5% CO2 avant de réaliser la détection du signal. Le résultat des activités enzymatiques SNAPTag et HaloTag est une incorporation, de manière covalente, des fluorophores donneur et accepteur sur le RCPG fonctionnel d'intérêt et sur la sous-unité Gray de la protéine Go, respectivement. Les mesures de signal peuvent être réalisées de manière quantitative à l'aide d'un lecteur de fluorescence (RubyStar) ou de façon qualitative et semi quantitative à l'aide d'un microscope à épifluorescence. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection des interactions entre un récepteur coupé aux protéines G (RCPG) et l'une des sous-unités Ga ou G[3y d'une protéine G, qui comprend les étapes consistant à : 1) mettre en contact un récepteur marqué avec un membre d'un couple donneur / accepteur avec une sous-unité Ga ou G13y d'une protéine G marquée avec l'autre membre du couple donneur / accepteur; 2) mesurer le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur. io 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée par transfection de cellules avec un acide nucléique codant pour un récepteur et avec un acide nucléique codant pour une sousunité Ga ou GRy d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou G(3y étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée soit en présence d'un ligand naturel du RCPG, soit en présence d'un agent pharmacologique potentiel ou d'une molécule à tester. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la mesure du transfert par effet de proximité est réalisée comme suit: 1) on imesure le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur en l'absence de ligand, d'agents pharmacologiques dudit récepteur et de molécules à tester (signal basal) ; 2) on compare éventuellement au signal basal le signal obteru en 25 présence d'un ligand spécifique de ce RCPG qui va déclencher l'activation de ce récepteur (signal de référence) ; 3) on compare aux signaux basaux et de référence, le signal obtenu en présence d'agents pharmacologiques ou de molécules chimiques qui sont susceptibles de moduler l'activité dudit récepteur. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les membres du couple donneur / accepteur sont des fluorophores, en ce que le transfert de proximité est un transfert d'énergie de fluorescence et en ce que la mesure du transfert d'énergie est effectuée par la mesure du signal fluorescent résultant d'un transfert entre le donneur et l'accepteur (signal de FRET). 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur sont choisis parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPY, les fluorescéines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptates de terre rare, des quantum dots, des protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, Ila R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce clue le fluorophore donneur est un complexe de terre rare. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le complexe de terre rare est un complexe de terbium ou d'europium. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le cryptate de terre rare est un cryptate ayant un motif pyridine. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le cryptate a un motif pyridine. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le fluorophore accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les cyanines, les rhodamines, Des squaraines, les BODIPYs, les fluorescéines, les Alexas. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le fluorophore accepteur est une protéine fluorescente verte (GFP) ou l'un de ses variants la protéine fluorescente jaune (YFP) ou la protéine fluorescente bleue (CFP), les protéines fluorescentes extraites de coraux. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, caractér sé en ce que le couplage entre le récepteur RCPG ou la sous-unité Ga ou Gl3y et le fluorophore donneur ou le fluorophore accepteur est un couplage direct par liaison covalente ou un couplage indirect. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par fusion avec une séquence protéique ayant une activité enzymatique irréversible ("suicide") ou par épissage à l'aide d'une intéine. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le récepteur RCPG, la sous-unité Ga ou les sous-unités Gpy comportent en fusion une séquence peptidique appelée étiquette extra-cellulaire ou intracellulaire pour le RCPG et intracellulaire pour la sous-unité Ga ou les sous-unités Gpy, et en ce que le couplage par liaison indirecte est réalisé par l'intermédiaire d'anticorps reconnaissant spécifiquement lesdites étiquettes portées par ledit récepteur RCPG, ladite sous-unité Ga ou lesdites sous-unités Gfiy. 17. Préparation de cellules transfectées de façon stable ou transitoire avec un acide nucléique codant pour un RCPG et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gray de la protéine G correspondante, le récepteur RCPG et la sous-unité Ga ou GRy étant couplés l'un avec un fluorophore donneur et l'autre avec un fluorophore accepteur. 18. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 17, caractérisée en ce que le fluorophore donneur est un complexe de terre rare. 19. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 18, caractérisée en ce que le complexe de terre rare est un complexe de terbiurn ou d'europium. 20. Préparation de cellules transfectées selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisée en ce que le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptete. 21. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 20, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est un cryptate ayant un motif pyridine. 22. Préparation de cellules transfectées selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les cyanines, les rhodamines, les squaraines, les BODIPYs, les fluorescéines, les Alexas. 23. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 22, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est la protéine fluorescente jaune (YFP) ou la protéine fluorescente verte (GFP). 24. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 23, caractérisée en ce que le couplage entre le récepteur RCPG ou la sousunité Ga ou G[3y et le fluorophore donneur ou le fluorophore accepteur est un couplage direct par liaison covalente. 25. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 24, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par fusion. 26. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 25, caractérisée en ce que le récepteur RCPG comporte une étiquette extracellulaire ou intra-cellulaire et en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par l'intermédiaire de l'anticorps reconnaissant l'étiquette extra-cellulaire ou i 1tra- cellulaire dudit récepteur.