Brevet FR2875410A1 — publié le 20060324

L'invention concerne des composés de diagnostique destinés à cibler des récepteurs aux chimiokines notamment les récepteurs CXCR4, et l'utilisation de ces composés dans le domaine de l'imagerie médicale. Les chimiokines sont des molécules de la famille des cytokines, qui présentent des propriétés d'activation, en particulier de cellules de la famille des leucocytes faisant intervenir notamment des propriétés chemoattractives, des propriétés de mobilisation du calcium par augmentation du calcium intracellulaire et des propriétés de relargage d'enzymes (exocytose). Ces chimiokines sont connues pour leur rôle éventuel en tant que médiateurs de l'inflammation. Plusieurs chimiokines ont été décrites par référence à leur structure et à leur affinité pour un ou plusieurs récepteurs et par référence à leurs propriétés biologiques, dans une publication de Baggiolini M. et al (Advances in Immunology (1994), vol. 55, pages 97-179). Une publication de Wells T.N.C. etal (Journal of Leukocyte Biology, vol. 59, January 1996, 53-60) décrit la structure tri-dimensionnelle de plusieurs chimiokines et leurs récepteurs spécifiques ou non. De façon générale, ces chimiokines sont caractérisées par la présence dans leur structure primaire, de résidus cystéine conservés (1 à 4 résidus notamment) sur la base desquels plusieurs sous-familles ont été distinguées selon la position des deux premières cystéines. Ces familles comprennent celles des protéines CXC ou des protéines CC. La présence de ces résidus cystéine induit la formation de ponts disulfure. Le rôle déterminant des chimiokines et de leurs récepteurs a été démontré dans la prolifération cancéreuse due aux métastases, notamment des carcinomes pulmonaires, (Muller et al, Nature 410: 50-6 (2001), WO 99/47518). Des cellules malignes issues de tumeurs primaires vont coloniser d'autres tissus en passant par la circulation sanguine ou lymphatique, des chimiokines intervenant dans ce processus. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression et la métastase tumorale (la mobilité, la migration, la prolifération cellulaire, l'adhésion de celles cancéreuses circulantes aux cellules endothéliales) ne sont pas totalement élucidés. Le rôle des récepteurs CXCR4 est toutefois démontré, et des ligands capables de cibler des récepteurs CXCR4 et ainsi d'inhiber la progression tumorale ont été décrits, notamment dans le document US 2004 0132642. L'invention concerne le ciblage de récepteurs CXCR4, non pour le traitement, mais pour le diagnostique d'une pathologie cancéreuse, et en particulier l'évaluation des risques et du stade de la progression des métastases. L'homme du métier connaît pour l'IRM notamment (Imagerie par Résonance Magnétique) un grand nombre de produits de contraste, dits non spécifiques, à base de chélates de métal paramagnétique tel que le Gadolinium, linéaires ou macrocycliques, notamment DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, DO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, TETA-NHS, PCTA, DOTA, M4DOTA, M4DO3A, M4DOTMA, MPDO3A, HBED, EHPG, BFCs. Mais ces composés ne permettent toutefois pas de reconnaître spécifiquement une zone pathologique, et en particulier les métastases tumorales. Par opposition à un produit non spécifique de l'art antérieur (sans ciblage de marqueur biologique), les composés selon l'invention visent à identifier spécifiquement des cibles biologiques (cellules, tissus) présentant une surexpression des récepteurs CXCR4 par rapport à une zone non pathologique. En particulier, les composés selon l'invention sont destinés à cibler des cellules tumorales exprimant les récepteurs CXCR4, et de manière préférée des cellules métastatiques. Ainsi selon un premier aspect, l'invention concerne des composés comprenant d'une part une partie biovecteur de ciblage des CXCR4, et d'autre part une partie de détection (entité signal) capable d'être identifié par une méthode d'imagerie médicale. La partie de détection est typiquement un agent de contraste détectable par imagerie IRM, rayons X, scintigraphie aux rayons gamma, scanner CT, ultrasons, PET, imagerie optique. Dans le cas de l'IRM, un contraste est obtenu grâce à l'administration d'agents de contraste contenant des métaux paramagnétiques ou superparamagnétiques qui ont un effet sur la relaxivité des protons de l'eau. Dans le cas de la scintigraphie, le contraste est obtenu par la localisation spécifique d'un composé radiopharmaceutique émettant des rayons gamma ou beta. L'invention utilisera pour le ciblage des récepteurs CXCR4 des biovecteurs appropriés, choisis notamment parmi des anticorps ou des petites molécules telles que des peptides, des sucres ou des molécules organiques. Selon un mode de réalisation, la partie signal comprend au moins un chélate, un grand nombre de chélates pouvant être utilisés. On pourra utiliser notamment un chélate linéaire parmi: EDTA, DTPA diéthylènetriaminopentaacétique acide, N-[2-[bis(carboxyméthyl)amino]-3(4- ethoxyphenyl)propyl]-N-[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-glycine (EOBDTPA), N,N-bis[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-glutamique acide (DTPAGLU), N,N-bis[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-lysine (DTPA-LYS), des dérivés mono- ou bis-amide du DTPA, tels que N,N-bis[2[carboxyméthyl[(méthylcarbamoyl)méthyle]amino]éthyle] glycine (DTPA-BMA), 4carboxy-5,8,11-tris(carboxyméthyl)-1-phenyl-2-oxa-5,8,11-triazatridecan13-oic acide (BOPTA), On pourra utiliser notamment un chélate macrocyclique parmi 1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetic acide (DOTA), 1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triacetic acide (DO3A), 10-(2-hydroxypropyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triacetic acide (HPDO3A) 2-methyl-1,4, 7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetic acide (MCTA), ( alpha, alpha ', alpha ", alpha '")-tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1, 4,7,10- tetraacetic acide (DOTMA), 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca- 1 (15), 1 1,13-triene-3,6,9-triacetic acide (PCTA). On pourra aussi utiliser des dérivés dans lesquels un ou plusieurs groupes carboxyliques sont sous forme d'un sel, ester, amide correspondant; ou un composé correspondant dans lequel un ou plusieurs groupes carboxyliques sont remplacés par un groupe phosphonique et/ou phosphinique tel que 4-carboxy-5,11-bis(carboxyméthyl)-1-phényl-12- [(phénylméthoxy)méthyl]-8(phosphonométhyl)-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-oic acide, N,N'[(phosphonométhylimino)di-2,1-ethanediyl]bis[N-(carboxyméthyl)glycine], N, N'[(phosphonométhylimino)di-2,1-ethanediyl]bis[N-(phosphonométhyl)glycine], N,N'-[(phosphinométhylimino)di-2,1-ethanediyl]bis[N-(carboxyméthyl) glycine], 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10tetrakis[méthylen(méthylphosphonique)]acide, or 1,4,7,10tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis[méthylen(méthylphosphinique)] acide. On peut aussi utiliser un chélate parmi: DOTA gadofluorines, DO3A, HPDO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, M4DOTA, M4DO3A, PCTA et leurs dérivés 2benzyl-DOTA,alpha- (2-phenethyl) 1,4,7,10 tetraazacyclododecane-1-acetic4,7,10-tris (méthylacétique) acide, 2benzylcyclohexyldiethylenetriaminepentaacetic acide, 2-benzyl-6methylDTPA, 6,6"-bis [N, N, N", N"tétra (carboxyméthyl)aminométhyl)-4'- (3amino-4-methoxyphenyl)-2,2' : 6', 2"-terpyridine, N,N'-bis-(pyridoxal-5phosphate) éthylènediamine- N, N'- diacétique acide (DPDP) et éthylènedinitrilotétrakis (méthylphosphonic) acide (EDTP). De manière plus large, le ou les chélates formant l'entité signal pourront répondre à la formule du document WO01/60416. Le couplage de chélates avec des biovecteurs est connue l'art antérieur, et fait généralement intervenir un lien chimique (linker) tel que décrit dans le document WO01/60416. La structure et la nature chimique du linker sont définies pour permettre le couplage chimique entre le biovecteur et le ou les chélates utilisés. Dans le cas de l'IRM, la relaxivité de ces chélates en imagerie Ti est typiquement de l'ordre de 4 à 20 mMol-lGd-1s1. On rappelle que la relaxivité longitudinale r1 d'un produit de contraste paramagnétique donne la mesure de son efficacité magnétique et permet d'apprécier son influence sur le signal enregistré. En imagerie médicale IRM, les produits de contraste modifient le temps de relaxation des protons, et l'augmentation de la relaxivité obtenue permet d'obtenir un signal plus élevé. Les chélates sont choisis de manière à former des complexes stables avec des ions de métal paramagnétique de nombre atomique 21-29, 42-44, or 58-70, notamment Gd (III), Dy (III), Fe (III), Mn (III) and Mn (II). Dans le cas de la scintigraphie, le métal est un radionucléide, notamment 99Tc, 117Sn 1111n 97Ru 67Ga 68Ga 89Zr, 177Lu, 47SC 105Rh. 188Re 60Cu 62Cu, 64Cu 67Cu 99Y, 159Gd, 149Pr, 166Ho. Selon une réalisation, le métal est un radionucléide pour l'imagerie PET. Selon un autre mode de réalisation, la partie signal est de type nanoparticule superparamagnétique SPIO ou USPIO. De préférence, la particule est une particule d'oxyde ou d'hydroxyde de fer, notamment de magnétite (Fe3O4), maghémite (y-Fe2O3), ou d'autres atomes de transition. La taille est inférieure à 100-150 nm, de préférence de diamètre hydrodynamique entre 5 et 60 nm. Selon un autre mode de réalisation, la partie signal est de type émulsion nanoparticulaire, contenant ou non des perfluorocarbones, telle que des particules décrites dans le document WO 03/062198, US 5 958 371, US 5 080 885, US 6 403 056. Les nanoparticules en émulsion sont typiquement couplées à un grand nombre de chélates, par exemple 10 000 à 100 000 DTPA par particule. Différentes émulsions de perfluorocarbone sont rappelées dans le document US 6 676 963 (perfluorodecalin, perfluorooctane, perfluorodichlorooctane, perfluoro-n-octyl bromide, perfluoroheptane, perfluorodecane, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluortributylamine, perfluorodimethylcyclohexane, perfluorotrimethylcyclohexane, perfluorodicyclohexyl ether, perfluoro-nbutyltetrahydrofuran). On pourra utiliser des lipides/surfactants destinés à former un recouvrement extérieur des nanoparticules de couplage du ou des ligands de ciblage de CXCR4, comprenant notamment des phospholipides, des acides gras, du cholestérol, ou d'autres dérivés, le cas échéant conjugués à des PEG. Différentes techniques peuvent être utilisées pour coupler de manière covalente la partie de ciblage de CXCR4, et éventuellement d'autres molécules organiques dont les chélates cités précédemment, aux composés de la couche de recouvrement, par exemple avec la formation d'amides ou de liens sulfure. De manière plus large, les biovecteurs de ciblage de CXCR4 peuvent être greffés ou encapsulés dans un système de transport approprié pour une reconnaissance biologique efficace sur le plan diagnostique. De tels systèmes peuvent être des liposomes, micelles, vésicules, microgeis, particules lipidiques à multicouches, polymères de saccharides et/ou d'oxyde d'éthylène. L'invention concerne l'utilisation d'une composition selon la présente invention pour le diagnostique d'une pathologie associée à une surexpression ou une sous-expression de récepteurs à des chimiokines. L'invention concerne aussi l'utilisation des composés décrits précédemment pour le diagnostique de maladies associées à une sur- expression ou une sous-expression de CXCR4 par rapport à un tissu sain, de préférence le diagnostique de tumeurs notamment la détection de métastases tumorales. L'invention concerne aussi l'utilisation des composés décrits précédemment pour la préparation d'une composition diagnostique destinée au diagnostique de maladies associées à une sur-expression ou une sousexpression de CXCR4 par rapport à un tissu sain, de préférence le diagnostique de tumeurs, notamment des métastases tumorales. Des exemples d'administration de compositions pour l'imagerie médicale sont décrits dans l'art antérieur, par exemple dans le document WO 0226776. L'agent de diagnostic est administré en quantité suffisante pour une imagerie satisfaisante. En IRM, on utilisera par exemple une dose d'ion métallique de 0,02 à 1,5 mmole/kg de poids corporel. Des véhicules pharmaceutiquement physiologiquement acceptables permettant de former des compositions diagnostiques (produits de contraste) comprenant les composés décrits précédemment sont connus de l'art antérieur. On utilisera par exemple des sels (sodium, calcium, méglumine), des agents de contrôle du pH (acide acétique, citrique, fumarique, des antioxydants. Selon une réalisation préférée, le biovecteur est un bicyclam tels que le composé AMD3100 directement biocouplable ou un de ses dérivés décrits dans: Bioconjugate Chem, 2004, 15,413-423; The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2003, vol 278, n 47, 47136-47144; J. Med.Chem, 1999,42,229-241; Chemical Reviews,2003,vol 103,n 9. On choisira notamment des composés capables de cibler des récepteurs CXCR4 choisis parmi les composés suivants: HN NH HJN 1,,NrNH HN.,V,NH AMD3100 H r H AMD 3329 X N' X = S, R = H X = 0, R = H s soa- AMD3106 AMD3108 CNN N HN / NH HN NH AMD2763 AMD2849 NH N'''-"---/N HN NN/ NH HN 287541 0 Selon une autre réalisation le biovecteur est un peptide de ciblage de CXCR4 tel que le peptide synthétique TN14003 décrit dans Cancer Research, 64,4302-4308,15 juin 2004. On pourra aussi utiliser le composé non peptidique KRH-1636 décrit dans PNAS, avril 2003, vol 100, n 7,4185-4190, ou des anticorps capables de cibler des récepteurs CXCR4, des composés décrits dans US 6 667 320, US 2004/0157818 (Yanaka et aI), US 2004/0134642 (USA government), US 2004/0102428, US2004/0037825 (Bond et al), US 2004/0019058, US 2003/0220482 (vMIP-11), US 2003/0091569 (Gerritsen et al),US 2002/0039993 (SDF1), US2002/0077339 (Bridger et al), 2004/0009171 (Genentech). De manière plus globale, les inventeurs ont étudié l'utilisation pour l'IRM de processus inflammatoires ou cancéreux, de composés dont le biovecteur est capable de cibler spécifiquement des récepteurs d'autres chimiokines que les récepteurs CXCR4. Le biovecteur peut notamment être une chimiokine ou un agoniste ou un antagoniste ou un dérivé de chimiokines des familles CC, CXC, CX3C, C. Selon une réalisation par exemple le biovecteur est un antagoniste de la chimiokine SDF-1 (stroma cell derived factor 1) tel que ceux décrits dans The EMBO journal, vol 16, n 23,6996-7007,1997 ou le CTCE-9908, ou de manière générale des structures peptidomimétiques ou tronquées de SDF-1. Les chimiokines IL-8, MCP-1, MIP-1 notamment sont utiles dans le cadre de l'invention. De plus, l'expression de plusieurs récepteurs de chimiokines, dont les récepteurs CXCR3, CCR7, CCR10, est démontrée dans les cellules de mélanomes, ainsi que l'expression de récepteurs CXCR1 et CXCR2 pour le carcinome du colon. Le couplage entre le biovecteur est réalisé de manière appropriée, typiquement à l'aide d'un lien chimique. Les composés bis-macrocycliques (AMD 3100 et analogues) peuvent être conjugués à des marqueurs fluorescents, paramagnétiques ou radioactifs. Pour cela il est possible d'utiliser une des fonctions amine secondaire des cycles azotés, les autres fonctions amine étant protégées par un groupement adapté préalablement introduit lors de la synthèse des hétérocycles. Ces groupements sont choisis parmi les groupes protecteurs appropriés des fonctions amines comme les amides, les carbamates. Le composé macrocyclique peut alors être lié au marqueur via la fonction amine secondaire libre à l'aide d'une réaction de couplage peptidique, typiquement par condensation sur un isothiocyanate, par réaction sur un ester de l'acide squarique, par alkylation. Il est également possible d'introduire entre l'azote hétérocyclique et le marqueur un segment de liaison qui permet d'éloigner les deux parties actives de la molécule. Ces segments de liaison sont obtenus par réaction de motifs hétérobifonctionnels de taille et de nature chimique variable comme des chaînes polyméthyléniques, des oligoéthylèneglycols, un aminoacide, un peptide, un noyau aromatique. Ces liens hétérobifonctionnels possèdent une fonction réactive avec la fonction amine secondaire à l'une de leur extrémité comme une fonction acide carboxylique éventuellement activée sous forme d'ester, un halogénure d'alkyle, un ester de l'acide squarique; et une autre fonction réactive disponible à l'autre extrémité pour recevoir le marqueur. Parmi les fonctions possibles on peut citer la fonction amine, la fonction acide carboxylique, un thiol, un groupement maléimide, un ester de l'acide squarique. On peut trouver des exemples de segments de liaison hétérobifonctionnels (heterobifonctionnal cross-linkers) dans Bioconjugate Techniques-Greg.T. Hermanson-Academic Press-1996-p228-286. Lorsque la conjugaison des deux entités actives est réalisée, on procède à la déprotection des fonctions bloquées selon les protocoles appropriés de la chimie (voir Protective Groups in Organic Synthesis-second edition-T.W.Green, P.G.M.Wuts-JOHN WILEY SONS-1991 et Protecting Groups-3rd edition-P.J.Kocienski-THIEME2004). Le demandeur a mis au point les protocoles biologiques suivants pour mesurer l'efficacité des produits. Affinité / spécificité in vitro pour CXCR-4: TEST bioloqique N 1: test de fixation basé sur une reconnaissance, par l'entité signal vectorisée, d'une cellule exprimant la protéine cible (HL-60). La spécificité de reconnaissance est évaluée grâce à des expériences de compétition montrant un rôle inhibiteur direct d'un excès de vecteur libre sur la fixation du prototype testé. La spécificité est également être validée par comparaison avec des dosages obtenus avec la molécule de référence non vectorisée. La cible cellulaire choisie est la cellule pro-myéloïde humaine HL-60 décrite dans la littérature comme fortement positive pour CXCR-4 [R. Môhle et al. : The chimiokine receptor CXCR-4 is expressed on CD34+ hematopoietic progenitor and leukemic cells and mediates transendothelial migration induced by stromal cell-derived factor-1 Blood 12: 4523-4530 (1998)]. Modèle de fixation sur cellules HL-60: Cellules: HL-60 Délais: Temps d'incubation en présence du produit test: cinétique de 0,5h 30 à 4 h à 37 C. Contrôles: Vérification du taux d'expression en CXCR-4 des HL-60 par cytométrie en flux. Incubation des cellules en présence de la molécule de référence non vectorisée. Spécificité : Inhibition de la fixation des prototypes par un excès de vecteur libre ou comparaison avec les résultats obtenus avec la molécule de référence non vectorisée. Résultats: Quantités de Fe ou de Gd présentes dans les culots cellulaires après dosage par ICP-AES ou ICP-MS respectivement (quantités rapportées en million de cellules ou en mg de protéines). L'analyse des résultats prend en compte la quantité de Fe ou de Gd trouvée avec les particules vectorisées rapportée à celle détectée: 1/ en présence du contrastophore non vectorisé 2/ en présence du prototype vectorisé et d'un excès de ligand (x100). Ces résultats permettent de déterminer l'apport du vecteur sur le mécanisme de reconnaissance et la spécificité de reconnaissance est étudiée par les expériences de compétition avec excès de vecteur libre. Affinité / spécificité in vitro pour CXCR-4: TEST biologique N 2: test de fixation basé sur une reconnaissance, par l'entité signal vectorisée, d'une cellule exprimant la protéine cible avec, comme contrôle, la même cellule mais négative pour le récepteur. La spécificité de reconnaissance est évaluée grâce à des expériences comparant les résultats obtenus sur cellules positives à ceux obtenus sur cellules négatives. La cible cellulaire choisie est la cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) négative pour l'expression de CXCR-4. Modèle de fixation / internalisation sur cellules CHO: Cellules: CHO positives et négatives pour le récepteur humain CXCR-4 Délais: Temps d'incubation en présence du produit test: cinétique de 0,5h à 2 h à 37 C. Contrôles: Incubation des cellules en présence de la molécule de référence non vectorisée. Spécificité : Comparaison des différents groupes (cellules CHO positives et 30 négatives/produit vectorisé et produit de référence) 10 REVENDICATIONS 1. Composé comprenant d'une part une partie de ciblage des récepteurs CXCR4 choisi parmi: un peptide, un peptidomimétique et, un bicyclam, et d'autre part une partie de détection capable d'être identifié par une méthode d'imagerie médicale choisi parmi un chélate linéaire ou macrocyclique d'ion de métal paramagnétique ou de radionucléide, des nanoparticules superparamagnétiques de diamètre inférieur à 100 nm, de préférence entre 5 et 50 nm ou des nanoparticules en émulsion. 2. Composé selon la revendication 1 dans lequel la partie de détection est choisie parmi les composés DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, DO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA, TETA, PCTA et leurs dérivés. 3. Composition diagnostique comprenant un composé selon l'une des revendications précédentes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 4. Utilisation d'un composé selon les revendications 1 ou 2 pour la préparation d'un agent de diagnostique d'une pathologie associée à une surexpression ou une sous-expression de récepteurs à des chimiokines. 5. Utilisation d'un composé selon les revendications 1 ou 2 pour la préparation d'un agent de diagnostique d'une pathologie associée à une sur-expression ou une sous-expression de récepteurs CXCR4, de préférence le diagnostique de tumeurs, notamment des métastases tumorales.