Brevet FR2879622A1 — publié le 20060623

PROCÉDÉ IN VITRO DE PRODUCTION D'OVOCYTES OU D'OEUFS PRÉSENTANT UNE MODIFICATION GÉNOMIQUE CIBLÉE L'invention concerne un procédé in vitro pour introduire dans un ovocyte ou un uf une modification génomique ciblée ainsi qu'un procédé pour effectuer une insertion aléatoire dans le génome d'une cellule hôte. La transgénèse est une technique de génétique moléculaire par laquelle de l'ADN exogène est introduit dans le génome d'un organisme multicellulaire et est transmis à la descendance de ce dernier. Cette transmission à la descendance impose l'intégration stable dudit ADN dans le génome de l'embryon et ceci à un stade précoce de développement. À l'heure actuelle, une des techniques de transgénèse les plus utilisées est celle de la micro-injection d'ADN nu dans un uf de mammifères, laquelle conduit, dans un certain nombre de cas, à l'intégration d'une partie des molécules d'ADN microinjectées dans le génome de l'oeuf. D'autres techniques sont utilisables pour la transgénèse, et notamment les techniques d'introduction d'ADN exogène dans une cellule vivante qui sont bien connues de l'homme du métier, notamment l'électroporation, la transfection à l'aide de précipités de phosphate de calcium, de liposomes ou de lipides modifiés tels que la lipofectamine (IN VITROGEN). Dans le cas d'une intégration ciblée d'un ADN exogène dans le génome, il est nécessaire d'utiliser le mécanisme de recombinaison homologue. Dans ce cas, l'ADN exogène doit présenter des séquences d'acides nucléiques homologues avec celles présentes au niveau du site d'intégration ciblé dans le génome. Pour autant ces mécanismes de recombinaison homologue s'opèrent à une fréquence extrêmement faible dans la plupart des organismes. Depuis peu, l'utilisation 2879622 2 d'endonucléases impliquées chez la levure dans le mécanisme de intron homing , lesquelles appartiennent à la famille des méganucléases , a permis d'augmenter de façon importante ces fréquences de recombinaison homologue dans des cultures cellulaires et notamment dans des cellules souches embryonnaires de mammifères (COHEN-TANNOUDJI et a1., Mol. Celi. Biol., vol.18(3), p:1444-1448, 1998). Dans ces cellules, l'induction de l'expression d'une méganucléase exogène entraîne une coupure double brin dans l'ADN génomique au niveau d'une séquence d'acides nucléiques spécifique de taille importante, 18 paires de bases pour la méganucléase I-SceI, suivie d'une recombinaison homologue entre des séquences d'une molécule d'ADN exogène et des séquences homologues encadrant ce site de coupure. Ces méganucléases permettent ainsi de remplacer ou de déléter une séquence d'intérêt dans l'ADN génomique ou encore d'introduire une séquence exogène dans l'ADN génomique et ceci de façon ciblée . De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible, en introduisant une séquence d'acide nucléique exogène et la méganucléase I-SceI dans un uf, qui présente dans son génome un site I-SceI encadré par des séquences homologues à la séquence d'acides nucléiques exogène, d'obtenir un oeuf présentant une modification génomique ciblée correspondant à l'insertion par recombinaison homologue d'une séquence d'acides nucléiques exogène au niveau du site I-SceI génomique. La découverte des inventeurs permet de démontrer que si le mécanisme de recombinaison homologue qui utilise une méganucléase peut être mis en oeuvre in vivo, ledit mécanisme peut également être effectué directement dans des ovocytes ou des ufs avec une efficacité suffisante, et ceci sans compromettre la réalisation du programme de développement dudit organisme. Le procédé des inventeurs permet alors d'obtenir un uf ou un ovocyte présentant une 2879622 3 modification génomique ciblée, et potentiellement d'obtenir directement un organisme génétiquement modifié mature présentant une telle modification génomique ciblée, et ceci dans la totalité de ses cellules. Ladite modification génomique ciblée peut alors correspondre à une délétion ou à une insertion, notamment l'insertion d'une séquence mutée par rapport à la séquence sauvage. La cellule de l'oeuf ou de l'ovocyte contient un cytoplasme important comparé à celui d'une cellule normale ce qui rend difficile l'accès au noyau qui contient le matériel génétique. En outre, la présence d'une membrane (la membrane vitelline) et d'un chorion présents spécifiquement autour des oeufs pour les protéger limite l'accès à la cellule. Ces barrières nécessitent généralement l'utilisation de techniques particulières, comme l'injection directe dans la cellule. La complexité des techniques utilisables limite le nombre d'oeufs qu'il est possible de traiter à quelques centaines d'oeufs par expérience. La faisabilité d'un procédé de modification génomique ciblée au niveau de l'oeuf ou de l'ovocyte nécessitait donc que les évènements induisant une modification génomique ciblée s'opèrent avec une fréquence suffisante pour que l'homme du métier puisse bénéficier d'une espérance raisonnable de réussite dans la mise en uvre d'un tel procédé. De toute évidence, une telle espérance raisonnable de réussite n'existait pas préalablement à la mise en uvre du procédé selon l'invention. En effet, en l'absence de méganucléases, le mécanisme de recombinaison homologue est un processus génétique très rare au niveau de l'oeuf. La fréquence d'une telle recombinaison homologue est vraisemblablement inférieure ou égale à celle observée dans les cellules embryonnaires souches, soit environ un 2879622 4 évènement pour un million de cellules. L'utilisation de méganucléases pour augmenter la fréquence de recombinaison homologue, notamment dans des cellules souches embryonnaires (ES; COHEN-TANNOUDJI et al., 1998, précité) ne permettait pas plus à l'homme du métier de bénéficier d'une espérance raisonnable de réussite. En effet, même si la fréquence de recombinaison homologue est augmentée dans ce cas, celle-ci atteint tout au plus une fréquence de 6 x 10-6, ce qui rendait de toute évidence ladite technique inapplicable à l'oeuf. L'article de COHEN-TANNOUDJI et al. (1998, précité) suggère au contraire à l'homme du métier l'utilisation d'un procédé de recombinaison homologue basé sur des cellules souches embryonnaires en culture, lesquelles présentent l'avantage de pouvoir être obtenues en nombre important et de permettre l'obtention d'animaux transgéniques après injection, dans un embryon au stade blastocyste, des rares cellules bénéficiant de la modification génomique ciblée. Pour autant, l'organisme transgénique obtenu est qualifié de mosaïque dans la mesure où il présente à la fois des cellules dérivées de l'embryon initial et des cellules souches embryonnaires génétiquement modifiées injectées. Il est alors nécessaire d'effectuer des croisements entre les animaux obtenus de façon à obtenir des animaux dont toutes les cellules sont génétiquement modifiées. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir directement des animaux transgéniques dont toutes les cellules présentent la modification génomique ciblée. En outre, et dans le cas d'organismes dont aucune lignée de cellules souches embryonnaires n'a été isolée, l'art antérieur suggérait à l'homme du métier l'isolement de telles cellules et en aucun cas le procédé selon l'invention qui permet l'obtention d'animaux transgéniques directement à partir de l'oeuf pour de tels organismes. 2879622 5 L'article de SEGAL and CAROLL (Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, vol 92, p:806-810, 1995) décrit un mécanisme de recombinaison homologue dans un ovocyte de xénope en présence de méganucléase I-Scel. Pour autant, ladite recombinaison homologue est effectuée au niveau d'un plasmide circulaire qui présente un site I-Sce-I alors qu'aucun site n'existe dans l'ADN génomique pour ladite méganucléase. En outre, si cet article montre l'obtention de recombinaison homologue au niveau dudit plasmide, rien ne permettait de prédire une efficacité suffisante du mécanisme pour l'appliquer à l'ADN génomique. Le plasmide a été injecté en quantités très importantes et simultanément à la méganucléase I-SceI, laquelle est peu stable lorsqu'elle n'est pas fixée sur son site. Cette quantité importante de sites I-Sce I et cette co-injection, qui facilitait la stabilisation de la méganucléase, ne permettait en aucun cas de présager de la fréquence de recombinaison homologue obtenue en présence d'un site rare, car localisé tout au plus à quelques copies dans l'ADN génomique, et de surcroît difficilement accessible du fait de la structure compacte de l'ADN génomique. On pouvait légitimement s'attendre à ce que la structure de la chromatine et la rareté des sites ne permettent pas l'accès de la méganucléase à l'un de ses sites avant qu'elle n'ait été dégradée. En conséquence, un premier objet de l'invention correspond à un procédé in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs de vertébrés non humains possédant une modification génomique ciblée comprenant une étape d'expression d'une endonucléase dans le noyau d'un ovocyte ou d'un uf, caractérisé en ce que ladite endonucléase est introduite de façon exogène et en ce que l'ADN génomique dudit uf ou ovocyte présente au moins un site de reconnaissance pour ladite endonucléase, lequel site de reconnaissance correspond à une séquence d'acides 2879622 6 nucléiques spécifique d'au moins 12 paires de bases permettant: (i) la fixation séquence spécifique de l'endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance, (ii) l'induction consécutive d'une cassure double brin dans l'ADN génomique par ladite endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance ou dans ses régions avoisinantes, de préférence à moins de 100 paires de base dudit site de reconnaissance, puis (iii) la réparation de ladite cassure double brin par un mécanisme de recombinaison homologue. Par oeuf, on entend une cellule unique résultant de la fécondation d'un gamète femelle par un gamète mâle et qui contient toutes les potentialités nécessaires à la formation d'un nouvel organisme. Plus simplement, l'oeuf correspond à un embryon au stade une cellule. Par ovocyte, on entend une cellule germinale femelle 20 obtenue lors de la phase de maturation de l'ovogenèse. À titre d'exemple de vertébrés non humains dont on peut utiliser les oeufs ou les ovocytes dans le procédé selon l'invention, on peut citer les mammifères comme les rongeurs, les ovins, les bovins ou les primates non humains, les reptiles, les amphibiens comme le xénope, les oiseaux comme la poule, les insectes comme la mouche et les poissons comme le poisson zèbre ou Médaka. De préférence, l'oeuf ou l'ovocyte utilisé dans le procédé de l'invention est un oeuf de poisson, et de manière particulièrement préférée un oeuf de poisson zèbre (Danio rerio) ou Médaka (Orizias latipes). Par site de reconnaissance, on entend une séquence d'acide nucléique spécifique qui présente une longueur d'au moins 12 paires de bases à laquelle ladite endonucléase se fixe spécifiquement et qui permet, après la fixation de 2879622 7 l'endonucléase sur ce dernier, l'induction d'une cassure double brin dans l'ADN par ladite endonucléase. De préférence ledit site de reconnaissance correspond à une séquence d'acide nucléique spécifique d'au moins 16 paires de base, et de manière particulièrement préférée d'au moins 18 paires de bases. Par séquence d'acides nucléiques spécifiques, on entend une séquence d'ADN, de préférence une séquence d'ADN 10 double brin. Selon un mode de réalisation particulier, ladite séquence d'acide nucléique spécifique pour ladite endonucléase correspond à la séquence consensus de fixation déterminée pour ladite endonucléase ou à une séquence dérivée de ladite séquence consensus. En effet, certaines endonucléases sont capables de se fixer à des séquences ne présentant pas une identité parfaite avec leur séquence consensus et d'effectuer, consécutivement à cette fixation, une cassure double brin au niveau de cette dernière ou dans ses régions avoisinantes. Avantageusement, ladite séquence spécifique présente plus de 90% d'identité avec ladite séquence consensus, de préférence plus de 95%, et de manière particulièrement préférée plus de 98% avec ladite séquence consensus. Par pourcentage d'identité, on entend le pourcentage d'acides nucléiques de nature et de position identique entre ladite séquence spécifique et ladite séquence consensus de fixation déterminée pour ladite endonucléase. Selon l'endonucléase utilisée, il est possible d'obtenir une cassure double brin dans l'ADN soit au niveau dudit site de reconnaissance spécifiquement, soit dans les séquences avoisinantes dudit site de reconnaissance, de préférence à moins de 100 paires da bases dudit site de reconnaissance, préférentiellement à moins de 50 paires de 2879622 8 bases, et de manière particulièrement préférée à moins de 20pb. Avantageusement, la cassure double brin induite par 5 l'endonucléase est localisée au niveau de son site de reconnaissance dans l'ADN génomique. Ledit site de reconnaissance peut être présent dans l'ADN génomique des individus sauvages ou il peut avoir été 10 introduit dans ledit ADN génomique par transgénèse. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit site de reconnaissance a été introduit par transgénèse dans l'ADN génomique dudit oeuf ou ovocyte. L'introduction de ce site de reconnaissance dans l'ADN génomique a pu être effectué de façon ciblée ou aléatoire. Avantageusement, ladite introduction par transgénèse a pu être effectuée soit dans ledit ovocyte ou oeuf utilisé dans le procédé selon l'invention, soit dans un ovocyte, un oeuf ou une cellule à partir duquel ou de laquelle un organisme sexuellement mature a pu se développer et dont est issu l' ovocyte ou l' oeuf utilisé dans le procédé selon l'invention Selon un mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, l'introduction dudit site de reconnaissance est effectuée de façon ciblée. Une telle introduction ciblée peut être effectuée par recombinaison homologue selon des techniques bien connues de l'homme du métier. À titre d'exemple, COHEN-TANNOUDJI et al. (1998, précité) décrit l'injection dans le noyau d'un vecteur qui contient un gène de sélection et un site de reconnaissance pour une méganucléase, lesquels sont encadrés par des séquences d'acides nucléiques homologues aux séquences cibles de l'ADN génomique. Après sélection des cellules ayant intégrées la construction de manière stable, 2879622 9 notamment en utilisant un milieu de culture approprié les cellules ayant intégré la construction à la position souhaitée dans l'ADN génomique sont identifiées, notamment par Southern blot ou par PCR. Les taux de recombinaison étant faibles dans ces conditions, le nombre de cellules présentant une insertion ciblée est extrêmement réduit. Avantageusement, l'introduction ciblée du site de reconnaissance pour ladite endonucléase dans l'ADN 10 génomique est effectuée par recombinaison homologue. Selon un deuxième mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, l'introduction dudit site de reconnaissance est effectuée de façon aléatoire. À cette fin, différentes techniques peuvent être utilisées. À titre d'exemple, CHOULIKA et al (1998, Mol. Celi. Biot., vol.15(4), p:1968-1973,1995) décrit l'utilisation d'un vecteur rétroviral pour l'intégration de sites de reconnaissance pour la méganucléase I-Sce I dans l'ADN génomique. La demande PCT WO 03/025183 décrit un autre procédé d'intégration aléatoire de sites de reconnaissance pour la méganucléase I-Sce I dans l'ADN génomique d'un oeuf de poisson en micro-injectant simultanément dans son noyau la méganucléase I-Scel et un fragment d'ADN qui présente un gène rapporteur encadré par deux sites de reconnaissance pour I-Sce I. Il est également possible d'utiliser le procédé d'intégration aléatoire de séquences d'acides nucléiques selon l'invention décrit par la suite. Avantageusement, l'introduction aléatoire du site de reconnaissance pour ladite endonucléase dans l'ADN génomique est effectuée par le procédé d'intégration aléatoire de séquences d'acides nucléiques décrit dans la demande de brevet WO 03/025183 ou par le procédé d'intégration aléatoire de séquences d'acides nucléiques selon l'invention décrit par la suite, de préférence elle est effectuée par le mécanisme d'intégration aléatoire de 2879622 10 séquences d'acides nucléiques selon l'invention décrit par la suite. De nombreuses endonucléases susceptibles de se lier à une séquence spécifique d'au moins 12 paires de bases, d'induire consécutivement une cassure double brin de l'ADN au niveau de ladite séquence spécifique, ou dans ses régions avoisinantes, et finalement d'entraîner la réparation de ladite cassure double brin par un mécanisme de recombinaison homologue sont connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles endonucléases, on peut citer les méganucléases. Les méganucléases constituent une famille d'enzymes qui effectuent une coupure double brin de l'ADN avec une fréquence très faible. En effet, lesdites méganucléases présentent des sites de reconnaissance de 12 à 40 paires de bases alors que les enzymes de restriction classiques présentent des sites de reconnaissance généralement de l'ordre de 4 à 8 paires de bases. La probabilité de présence d'un tel site de reconnaissance dans l'ADN génomique est donc extrêmement faible. Les méganucléases sont également bien caractérisées d'un point de vue structurel et mécanistique. Les méganucléases se répartissent en quatre familles distinctes sur la base de motifs d'acides aminés conservés. La famille dodécapeptide (dodécamère, DOD, DOD, D1-D2, LAGLI6DADG, P1-P2) est la famille la plus importante avec plus de 150 séquences regroupées selon qu'elles possèdent une (I-Ceul, I-Crel) ou deux copies (I-Chul, I-Csml, IDmol, I-Pani, I-Scel, I-Sceil, 1-Scelli, I-SceIV, F- Scel, F-SceII, PI-Aael, PI-Apel, PI-Ceul, PI-Cirl, PI-Ctrl, PIDral, PI- Mavl, PI-Mfil, PI-Mgol, PI-Mjal, PI-Mkal, PI-Miel, PI-Mtul, PI-MtuHI, PIPablil, PI-Pful, PI-Phol, PI-Pkol, PI-Pspl, PI-Rmal, PI-Scel, PI-Sspl, PITful, PI-TIil, PIT1ili, PI-Tspl, PI-TspII, PI-Bspl, PI-Mchl, PI-Mfal, PI2879622 11 MgaI, PI-MgaII, PI-Min I, PI-MmaI, PI-MshI, PI-MsmII, PIMthI, PI- TagI, PI-ThyII) d'un motif conservé de douze acides aminés, le dodécapeptide. Les méganucléases avec un dodécapeptide présentent une masse moléculaire de l'ordre de 20 kDa et agissent sous forme d'homodimère. Les méganucléases avec deux dodécapeptides présentent une masse moléculaire de 25 à 50 kDa, avec de 70 à 150 résidus entre les deux motifs, et sont actives sous forme de monomères. La famille GIG présente un motif conservé complet KSGIY-X10111- YIGS (I-NcrI, I-NcrII, I-Pan II, I-TevI) ou partiel (I-Tevil) et les enzymes de cette famille coupent l'ADN en un site différent de leur site de reconnaissance. La famille HC présente des séquences riches en histidines et en cystéines (I-Popi, I-Dirl, I-HmuI, I-Hm uII) avec généralement une séquence conservée qui correspond approximativement à SHLC-G-G-H-C . La méganucléase la mieux caractérisée pour cette famille est l'enzyme IPpoI. La famille HNH présente une séquence consensus HH-NH-H dans une fenêtre de 35 résidus (I-Teviil) et des propriétés particulières de coupure de l'ADN. Toutefois, différentes méganucléases ont également été identifiées qui n'ont pas pu être associées à ces quatre familles. À l'heure actuelle, ces méganucléases sont au nombre de cinq et correspondent à F-Scel, F- SceII (HO), F- Suvl, F-Tevl et F-TevII. Pour autant, l'ensemble de ces méganucléases est capable d'induire une cassure double brin dans l'ADN présentant un site de reconnaissance, et ceci spécifiquement au niveau de celui-ci ou dans ses régions avoisinantes. 2879622 12 En outre, de nombreuses méganucléases présentent un signal de localisation nucléaire (NLS). Cette séquence protéique permet de faciliter l'entrée de ladite méganucléase dans le noyau et ainsi la recombinaison homologue médiée par celle-ci. La méganucléase I-Scel constitue un exemple d'une telle méganucléase. Pour autant, l'homme du métier peut construire une méganucléase dérivée présentant un tel signal de localisation nucléaire, dans le cas où un tel signal est absent de la méganucléase sauvage, et ceci selon des techniques bien connues de biologie moléculaire de production de protéines recombinantes. Selon un deuxième mode de réalisation préféré du procédé de la présente invention, l'endonucléase utilisée est une méganucléase ou une enzyme dérivée d'une telle méganucléase, lesquelles peuvent être synthétiques. À titre d'exemple de méganucléases, on peut donc citer les méganucléases I-Ceul, I-Crel, I-Chut, I-Csml, I-Dmol, I-Paul, I-Scel, I- Sceil, I-Scella, I-SceIV, F-Scel, FSceli, PI-Aael, PI-Apel, PI-Ceul, PI- Cirl, PI-CtrI, PIDral, PI-Mavl, PI-MM, PI-Mgol, PI-Mjal, PI-Mkal, PI-Miel, PI-Mtul, PI-MtuHI, PI-Pablil, PI-Pful, PI-Phol, PI-Pkol, PI-Pspl, PIRmal, PI-Scel, PI-Sspl, PI-Tful, PI-Tlil, PI- TIilI, PI-Tspl, PI-TspII, PI-Bspl, PI-Mchl, PI-Mfal, PIMgal, PI-MgaII, PI-Minl, PI-Mural, PI-Mshl, PI-MsmII, PIMthl, PI- Tagl, PI-Thyll, I-Ncrl, I-NcrII, I-Panll, I-Tevi, IPopl, I-Dirl, I-Hmul, I-HmuII, I-Tevil, I-Tevili, F-Scel, F-SceII (HO), FSuvl, F-Tevi et F-TevII ou une méganucléase dérivée de l'une d'elles. De préférence, ladite méganucléase est la méganucléase I-Scel décrite dans le brevet US 6,238,924. Par méganucléase dérivée, on entend une protéine recombinante présentant des séquences d'une méganucléase sauvage et qui est capable de reconnaître un site de reconnaissance différent de ladite méganucléase sauvage ou 2879622 13 recombinante et/ou d'effectuer une cassure double brin de l'ADN à une position différente ou selon un mécanisme différent de ladite méganucléase sauvage. Ladite méganucléase dérivée permet également d'entraîner la réparation de ladite cassure double brin par un mécanisme de recombinaison homologue. À titre d'exemple de telles méganucléases dérivées, on peut citer notamment des méganucléases recombinantes dont le domaine de liaison à l'ADN est dérivé d'autres protéines de liaison à l'ADN comme les endonucléases de restriction de type IIS ou les facteurs de transcriptions. À titre d'exemples de telles méganucléases dérivées, on peut également citer des méganucléases recombinantes qui présentent un ou plusieurs sites de localisation nucléaire absents des méganucléases sauvages dont elles sont dérivées. L'endonucléase peut être introduite de façon exogène dans l'oeuf ou l'ovocyte sous différentes formes, à savoir sous la forme d'une protéine ou sous la forme d'une séquence d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans ledit oeuf ou ovocyte. Selon un troisième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'endonucléase est introduite dans l'oeuf ou l'ovocyte sous la forme d'une protéine. Des techniques permettant l'introduction d'une telle endonucléase sous la forme d'une protéine sont connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles techniques, on peut citer notamment la micro-injection. Selon un quatrième mode de réalisation préféré du procédé selon la présente invention, l'endonucléase est introduite sous la forme d'une molécule d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans ledit oeuf ou ovocyte. 2879622 14 Ladite molécule d'acides nucléiques comprend alors une phase ouverte de lecture, codant pour l'endonucléase, sous le contrôle de séquences de régulation permettant l'expression de ladite endonucléase dans l'oeuf ou l'ovocyte. Par molécule d'acides nucléiques, on entend aussi bien des molécules d'ADN, d'ARN que des molécules hybrides ADN/ARN, lesquelles peuvent être sous forme simple brin ou 10 double brin. À titre d'exemple de molécule d'acides nucléiques utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer une molécule d'ARNm codant pour l'endonucléase ou un vecteur d'expression comprenant une phase ouverte de lecture codant pour ladite endonucléase. Par vecteur d'expression, on entend une molécule d'acides nucléiques capable de transporter et de permettre l'expression d'une séquence d'acides nucléiques d'intérêt à laquelle elle est liée de façon opérationnelle. Un tel vecteur d'expression contient une séquence promotrice permettant l'expression de ladite endonucléase dans l'oeuf ou l'ovocyte. À titre d'exemple de tels promoteurs, on peut citer notamment le promoteur de l'al-tubuline ou de l'aactine, ou encore des promoteurs constitutifs forts bien connus de l'homme du métier tels que le promoteur du cytomégalovirus (CMV). Ledit vecteur d'expression pourra en outre contenir d'autres séquences de régulation correspondant à une origine de réplication, un site de fixation au ribosome, un ou plusieurs sites d'épissage, un site de polyadénylation ou un site de terminaison de la transcription. Un vecteur d'expression utilisable dans le procédé selon l'invention peut correspondre, à titre non limitatif, à un YAC (chromosome de levure artificiel), à un BAC 2879622 15 (chromosome bactérien artificiel), à un vecteur viral, à un vecteur plasmidique, à un phagemide, à un cosmide, à un vecteur ARN, à un vecteur dérivé d'un baculovirus, d'un phage, d'un transposon ou d'une molécule d'ARN ou d'ADN, linéaire ou circulaire. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier. À titre d'exemple de vecteurs viraux, on peut citer notamment les rétrovirus, les adénovirus, les parvovirus, les coronavirus, les orthomyxovirus, les rhabdovirus, les paramyxovirus, les picornavirus, les alphavirus, les adénovirus, les herpèsvirus, les poxvirus. De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un vecteur plasmidique. Des techniques pour introduire dans un oeuf ou un ovocyte une molécule d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles techniques, on peut citer la micro-injection, l'électroporation, la transfection à l'aide de liposomes ou de lipides modifiés tels que la lipofectamine (IN VITROGEN), ou encore à l'aide de précipités de phosphate de calcium. De préférence, cette introduction s'effectue par la technique de micro-injection. La modification génomique ciblée introduite à la suite de la recombinaison homologue au niveau du site de cassure double brin de l'ADN peut correspondre soit à une délétion d'une séquence génomique, dans le cas où la recombinaison s'effectue entre deux séquences homologues de l'ADN génomique de part et d'autre du site de cassure, soit à une insertion dans le cas où la recombinaison a lieu, au niveau de régions homologues, entre une séquence d'acide nucléique exogène et l'ADN génomique. Selon un cinquième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, ledit procédé comprend en outre une étape d'introduction, dans l'ovocyte ou l'oeuf, d'une 2879622 16 séquence d'acide nucléique exogène qui présente une homologie avec les séquences d'acides nucléiques localisées en amont et en aval du site de reconnaissance pour l'endonucléase qui est présent dans l'ADN génomique. Par séquence d'acides nucléiques exogène, on entend une séquence d'ADN double brin qui est introduite dans un uf ou un ovocyte, laquelle peut se trouver sous forme linéaire ou circulaire. De préférence, ladite séquence d'acides nucléiques exogène se trouve sous forme circulaire. Selon un mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, ladite séquence d'acide nucléique exogène est dérivée de la séquence génomique, notamment une forme mutée de ladite séquence génomique ou une isoforme de ladite séquence génomique laquelle est issue d'un autre individu ou d'un autre organisme. Dans ce cas, le mécanisme de recombinaison homologue entraîne une insertion de la séquence d'acides nucléiques exogène qui s'apparente à un remplacement de la séquence génomique. Selon un deuxième mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, ladite séquence d'acides nucléiques exogène comprend une séquence d'acides nucléiques d'intérêt qui est encadrée par deux séquences d'acides nucléiques distinctes, lesquelles présentent une homologie avec les séquences d'acides nucléiques localisées en amont et en aval respectivement du site de reconnaissance pour l'endonucléase qui est présent dans l'ADN génomique. Ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt peut correspondre à un gène ou à une séquence régulatrice (comme un promoteur ou un activateur) dont on veut déterminer l'activité et/ou le phénotype associé chez le vertébré transgénique obtenu par le procédé selon l'invention. La 2879622 17 séquence d'acide nucléique d'intérêt peut comprendre un gène rapporteur, comme la béta-galactosidase, la GFP (green fluorescent protein), la RFP (red fluorescent protein), ou un gène de sélection, comme la néomycine phosphotransférase, à l'hygromycine phosphotransférase, l'histidinol déshydrogénase ou la thymidine kinase. L'utilisation d'un tel gène rapporteur de sélection peut permettre de faciliter l'identification des ufs ou des ovocytes présentant la modification génomique ciblée recherchée. De préférence, ledit gène rapporteur ou de sélection ne comporte pas de séquences promotrices associées de façon à identifier les ufs ou les ovocytes présentant le profil d'expression attendu correspondant à la modification génomique ciblée recherchée. Avantageusement, la ou les séquences d'acides nucléiques, qui présentent une homologie avec les séquences d'acides nucléiques localisées en amont et en aval du site de reconnaissance pour l'endonucléase, présentent une longueur d'au moins 50 paire de bases, de préférence d'au moins 100 paire de bases, et de manière particulièrement préférée d'au moins 250 paire de bases. Les dites séquences peuvent présenter une taille supérieure, pour autant une taille de plus de 1 000 paire de bases n'augmente pas l'efficacité de la recombinaison homologue. Avantageusement encore, ladite ou lesdites séquences d'acides nucléiques homologues présentent une identité de séquence d'au moins 80 % avec les séquences d'acides nucléiques localisées en amont et en aval du site de reconnaissance pour l'endonucléase dans l'ADN génomique, de préférence une identité d'au moins 90 %, et de manière particulièrement préférée une identité d'au moins 95 %. L'identité entre deux séquences d'acides nucléiques correspond au pourcentage de nucléotides identiques et localisés à une position identique entre deux séquences d'acides nucléiques. De nombreux programmes ou algorithmes 2879622 18 permettent de calculer des pourcentages d'identité parmi lesquels FASTA ou BLAST. Ces programmes sont notamment disponibles sur le site NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). De préférence, l'homologie est déterminée par le programme BLAST, et de manière particulièrement préférée avec un programme BLAST utilisant la matrice BLOSUM62. Avantageusement, ladite séquence d'acides nucléiques exogène est un vecteur. Par vecteur, on entend une séquence d'acides nucléiques capable de transporter une séquence d'acides nucléiques d'intérêt à laquelle elle est liée. À titre d'exemple de vecteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer, à titre non limitatif, un YAC (chromosome de levure artificiel), un BAC (chromosome bactérien artificiel), un vecteur viral adapté, tel qu'un adénovirus, un vecteur plasmidique, un phagemide ou un cosmide. De préférence le vecteur utilisé est un vecteur plasmidique. Avantageusement, ladite séquence d'acide nucléique 25 exogène ne présente aucun site de reconnaissance pour l'endonucléase. Des techniques pour introduire dans un uf ou un ovocyte une séquence d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles techniques, on peut citer la micro-injection, l'électroporation, la transfection à l'aide de liposomes ou de lipides modifiés tels que la lipofectamine (IN VITROGEN), ou encore à l'aide de précipités de phosphate de calcium. De préférence, cette introduction s'effectue par la technique de micro-injection. 2879622 19 L'introduction de ladite séquence d'acides nucléiques exogène peut se faire de façon différée ou simultanée par rapport à celle de l'endonucléase ou à la molécule d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase. De préférence, leur introduction est simultanée. Selon un sixième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de culture de l'ovocyte préalablement fécondé ou de l'oeuf présentant une modification génomique ciblée dans des conditions adaptées pour permettre le développement du vertébré non humain. Avantageusement, les conditions de culture utilisées 15 permettent le développement à terme du vertébré non humain. Ces conditions de culture, de même que les techniques de fécondation d' ovocytes sont bien connues de l'homme du métier et sont fonction de l'organisme utilisé dans le procédé de l'invention. Selon un septième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, ledit procédé comprend en outre une étape d'identification des oeufs ou des ovocytes présentant la modification génomique ciblée recherchée. Une telle étape d'identification peut alors être effectuée en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Cette étape d'identification peut utiliser, à titre d'exemple, les techniques de Southern ou de PCR, sur l'ADN génomique isolé de l'oeuf ou de l'ovocyte obtenu, utilisant une sonde ou des amorces spécifiques respectivement. Dans le cas où ladite modification génomique ciblée correspond à une insertion d'une séquence d'acides nucléiques exogènes comprenant un gène rapporteur, ladite étape d'identification peut utiliser des techniques de 2879622 20 détection de l'activité dudit gène rapporteur. De telles techniques de détection sont fonction du gène rapporteur utilisé et sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où ladite modification génomique ciblée correspond à une insertion d'une séquence d'acides nucléiques exogènes comprenant un gène de sélection, ladite étape d'identification correspond à une étape de culture dudit ou ovocyte dans un milieu adapté. Les conditions de culture pour une telle étape sont fonction du gène de sélection utilisé et sont bien connues de l'homme du métier. Avantageusement, l'étape d'identification des oeufs ou des ovocytes présentant la modification génomique ciblée recherchée est effectuée sur des cellules issues de l'organisme vertébré non humain obtenu lors du développement desdits oeuf ou des ovocytes après fécondation, de préférence sur des cellules issues de l'organisme vertébré non humain mature. Un deuxième objet de la présente invention correspond à un oeuf ou un ovocyte de vertébré non humain susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention et caractérisé en ce qu'il possède une modification génomique ciblée. Avantageusement, ledit oeuf ou ovocyte n'est pas issu de parents présentant ladite modification génomique ciblée 30 dans leur génome. Les procédés d'intégration aléatoire d'une séquence d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte sont basés sur l'introduction d'un ADN exogène sous forme linéaire ou circulaire dans ladite cellule, notamment par transfection, laquelle aboutira dans certains cas à une intégration 2879622 21 stable dudit ADN exogène dans le génome de ladite cellule hôte. Toutes les cellules présentent des systèmes de maintenance et de réparation de leur ADN. Un des signaux particuliers de stress qui entraîne l'activation de ces systèmes est l'apparition, dans la cellule, d'extrémités libres d'ADN. Deux réponses cellulaires sont alors envisageables en réponse à un tel signal: - la première consiste en la dégradation de cet ADN présentant des extrémités libres. Une telle stratégie est notamment mise en uvre dans le cas où la cellule doit éliminer un ADN viral. Cette réponse est basée sur une activité exonucléasique, notamment 5'-3', qui va entraîner la dégradation de l'ADN en le digérant à partir de ses extrémités libres; - la seconde consiste en une recombinaison des extrémités libres avec le génome cellulaire. Cette recombinaison peut prendre différentes formes, lesquelles aboutissent à l'intégration de l'ADN exogène dans le génome de la cellule. Du fait de l'existence de ces mécanismes de maintenance et de réparation, les procédés ayant pour but d'intégrer un ADN exogène dans le génome d'une cellule hôte, et dans lesquels on introduit une molécule d'ADN nu sous forme double brin circulaire ou linéaire, rencontrent principalement trois types de problèmes. Le premier problème est relatif à la faible efficacité d'intégration de la molécule d'ADN exogène dans l'ADN génomique de la cellule hôte. Cette faible efficacité d'intégration nécessite l'injection d'une quantité importante d'ADN exogène dans la cellule pour obtenir quelques cellules dans lesquelles ladite molécule d'ADN exogène est intégrée dans son génome. L'ADN exogène injecté peut alors se trouver sous deux formes, linéaire ou 2879622 22 circulaire. Toutefois, seul l'ADN linéaire peut être intégré efficacement dans le génome. Le second problème est relatif à l'intégrité de l'ADN exogène intégré dans le génome. Le fragment d'ADN exogène linéaire expose en effet ses extrémités libres aux exonucléases cellulaires avant son arrivée dans le noyau. Cette exposition prolongée résulte en une baisse significative de la probabilité d'intégration de l'ADN exogène intact dans l'ADN génomique de la cellule. Une technique utilisée consiste à linéariser l'ADN exogène de sorte d'obtenir un fragment présentant des extrémités cohésives. Les fragments ainsi linéarisés sont susceptibles de s'apparier entre eux et de limiter ainsi leur dégradation dans le cytoplasme après injection. Une autre solution consiste à placer des séquences d'acides nucléiques neutres de part et d'autre de la séquence d'intérêt de sorte de limiter l'impact d'une dégradation modérée de l'ADN exogène introduit dans la cellule. Le troisième problème est relatif au nombre de copies de l'ADN exogène intégrées dans l'ADN génomique de la cellule. La multimérisation, délibérée ou non, de l'ADN exogène injecté présente l'inconvénient de favoriser une intégration multicopie des fragments d'ADN exogène. De la même manière, l'utilisation d'un ADN exogène sous forme circulaire entraîne également une telle intégration multicopies: on parle de concatémères. Ce profil d'insertion multiple présente deux inconvénients majeurs à savoir une instabilité chromosomique, liée notamment à des mécanismes de recombinaison, et des problèmes de régulation du transgène intégré, suite à l'activation de systèmes de répression de la cellule hôte regroupés sous le terme générique de mécanismes de gene silencing . Pour autant, les procédés d'intégration aléatoire constituent des outils essentiels de la biologie moderne. 2879622 23 L'identification de nouvelles cibles biologiques pour la mise au point de nouveaux traitements dans de multiples maladies nécessite en effet préalablement une meilleure connaissance de la fonction des différents gènes du génome. La souris constitue un modèle de mammifère bien connu et abondamment utilisé. Pour cette espèce, le procédé le plus utilisé de génération d'animaux transgéniques présentant des insertions d'ADN aléatoires est basé sur la micro-injection d'ADN dans le pronucléus d'embryons fertilisés. Ce procédé n'est toutefois que peu efficace pour l'obtention d'animaux transgéniques de grande taille. En outre, et du fait de la rareté des évènements d'intégration, cette intégration s'opère bien souvent à un stade avancé de développement et le transgène inséré est absent d'un grand nombre de cellules de l'organisme mature. On parle alors d'animaux mosaïques , lesquels ne transmettent pas de façon efficace le transgène à leur descendance. Les poissons de laboratoire constituent également un modèle de vertébrés apprécié pour des études de développement notamment. Le poisson zèbre (Danio rerio) ou le médaka (Orizias latipes) constituent ainsi des modèles de prédilection pour l'étude des mécanismes de développement chez les vertébrés. En effet, le temps de génération de ces poissons est de l'ordre de 2 à 3 mois, chaque ponte permet d'obtenir habituellement près d'une centaine d'oeufs. Les études embryologiques sur ces poissons bénéficient en outre de l'avantage de la taille importante et de la transparence des embryons obtenus. Toutefois, ces modèles souffrent encore de l'absence de procédés efficaces permettant l'insertion de transgènes 35 dans son ADN génomique. 2879622 24 Une des méthodes les plus utilisées afin d'obtenir des poissons transgéniques consiste en l'injection de hautes concentrations d'ADN plasmidique (avec environ un million de copies) dans le cytosplasme d'embryon au stade une cellule ( uf). Cette technologie est rapide et efficace du fait de la transparence et de la taille des ufs. Toutefois, cette technologie ne permet qu'une faible intégration de l'ADN exogène dans le génome, le plus souvent à un stade avancé de développement, ce qui aboutit à une faible transmission dudit ADN exogène à la descendance (STUART et al., Development, vol.103, p:403-412, 1988). L'ADN exogène (transgène) persiste alors le plus souvent sous forme non intégrée, transmis alors à une faible partie des blastomères. En outre, lorsqu'un événement d'intégration survient, il s'agit alors le plus souvent d'une insertion d'un grand nombre de copies de l'ADN exogène en tandem (CULP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol.88, p:7953-7957, 1991). Même si de nombreux procédés d'intégration aléatoire ont été développés, la majorité d'entre eux montrent une faible efficacité d'intégration et/ou se montrent inadaptés pour une utilisation dans de nombreux organismes. La demande WO 03/025183 et l'article de THERMES et al. (2002, précité) décrivent un procédé d'intégration aléatoire d'une séquence d'intérêt dans l'ADN génomique, dans lequel on injecte, dans un embryon au stade une cellule, une méganucléase et un ADN exogène circulaire qui présente ladite séquence d'intérêt flanquée par deux sites de reconnaissance pour ladite méganucléase. Ce procédé présente de nombreux avantages parmi lesquels celui d'obtenir une bonne fréquence d'intégration, et ceci de façon précoce au cours du développement, ainsi qu'une intégration d'un nombre réduit de copies de la séquence d'intérêt dans le génome. Le mécanisme d'intégration proposé correspond à une coupure au niveau des sites de 2879622 25 reconnaissance flanquants la séquence d'intérêt, suivie d'une intégration de l'ADN linéarisé in vivo dans l'ADN génomique au niveau d'une cassure double brin. Pour autant, il est encore nécessaire de développer de nouvelles techniques de transgénèse qui permettent d'obtenir une intégration aléatoire avec une fréquence importante et en faible nombre copies. De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la micro-injection, dans un embryon de poisson médaka au stade une cellule, d'une méganucléase et d'un ADN exogène linéarisé, lequel comprend une séquence d'intérêt au sein de laquelle se trouve un unique site de reconnaissance fonctionnel pour ladite méganucléase, permet d'obtenir une intégration de la séquence d'intérêt fonctionnelle avec une fréquence importante et en faible nombre de copies. THERMES et al. (2002, précité) ne décrit pas plus qu'il ne suggère un procédé d'intégration aléatoire d'une séquence d'intérêt sous forme linéarisée et présentant un seul site de reconnaissance pour la méganucléase au sein même de la séquence d'intérêt et pas dans ses régions flanquantes. En outre, au regard du mécanisme d'intégration proposé, rien ne permettait de déduire que ledit procédé permettrait d'obtenir une intégration efficace de la séquence d'intérêt dans l'ADN génomique. Cet article décrit également l'injection de méganucléase et de la construction paact-GFPMI ou paact-GFPDI sous forme linéarisée, lesquelles présentent un seul site de reconnaissance pour la méganuléase. Pour autant, ces sites de reconnaissance ne sont pas fonctionnels puisqu'ils permettent uniquement la fixation de la méganucléase mais pas le clivage par celleci. En outre, les résultats obtenus avec ces constructions linéarisées en présence de méganucléase montrent une 2879622 26 efficacité d'intégration comparable à celle obtenue en l'absence de méganucléase. SEGAL and CAROLL (1995, précité) décrit la micro-injection simultanée de méganucléase I-Scel et d'un plasmide circulaire présentant un seul site I-Scel dans le noyau d'un ovocyte de xénope. Pour autant, cet article décrit uniquement un mécanisme de recombinaison homologue au niveau du plasmide lui-même, lequel est purifié à partir de l'ovocyte de 1 à 24 heures après injection de la méganucléase. Cet article ne décrit donc pas plus qu'il ne suggère un procédé d'intégration aléatoire d'une séquence d'acide nucléique linéarisée dans le génome d'une cellule, pas plus qu'un procédé dans lequel l'ADN exogène présente, en plus du site I-SceI, un gène rapporteur ou de sélection permettant d'identifier les cellules ayant stablement intégré l'ADN exogène dans leur génome, avec le site I-SceI. En conséquence, un troisième objet de l'invention correspond à un procédé in vitro d'intégration aléatoire d'une séquence d'acides nucléiques d'intérêt dans l'ADN génomique d'une cellule hôte comprenant les étapes de: (i) expression d'une endonucléase dans le noyau de ladite cellule hôte, (ii) introduction, dans ladite cellule hôte, d'une séquence d'acides nucléiques exogène qui présente des extrémités 5' et 3' libres et un site de reconnaissance unique pour ladite endonucléase qui n'est pas présent au niveau des extrémités de ladite séquence d'acides nucléiques exogène, lequel site de reconnaissance correspond à une séquence spécifique d'au moins 12 paires de bases permettant: (a) la fixation séquence spécifique de l'endonucléase 35 au niveau dudit site de reconnaissance, (b) l'induction consécutive d'une cassure double brin dans l'ADN de ladite séquence d'acides nucléiques 2879622 27 exogène par ladite endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance ou dans ses régions avoisinantes, de préférence à moins de 100 paires de base dudit site de reconnaissance, (c)l'intégration aléatoire de ladite séquence d'acides nucléiques exogène, ou d'une partie de celle-ci, dans le génome de la cellule hôte. Ladite cellule hôte est une cellule eucaryote ou procaryote, de préférence ladite cellule hôte est une cellule eucaryote. À titre d'exemple de cellules eucaryotes utilisables dans le deuxième procédé selon l'invention, on peut citer une cellule de plante, de mammifère, de reptile, d'amphibien, d'oiseau, d'insecte ou de poisson. De préférence, ladite cellule hôte est une cellule de poisson, et de manière particulièrement préférée ladite cellule hôte est une cellule de poisson zèbre ou de médaka. Avantageusement, ladite cellule hôte est sélectionnée dans le groupe comprenant les cellules souches, les cellules somatiques, les gamètes, les blastomères et les ufs. Préférentiellement ladite cellule hôte est un uf ou un ovocyte. De nombreuses endonucléases susceptibles de se lier à une séquence spécifique d'au moins 12 paires de bases et d'induire consécutivement une cassure double brin de l'ADN au niveau de ladite séquence spécifique ou dans ses régions avoisinantes sont connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles endonucléases, on peut citer les méganucléases. Selon un mode de réalisation préféré du deuxième procédé de l'invention, l'endonucléase utilisée est une méganucléase ou une enzyme dérivée d'une telle méganucléase, lesquelles peuvent être synthétiques. 2879622 28 À titre d'exemple de méganucléases, on peut donc citer les méganucléases I-Ceul, I-Crel, I-Chul, I-Csml, I-Dmol, I-Pana, I-SceI, I-Sceli, I-Scelil, I-SceIV, F-SceI, FSceil, PI-Aael, PI-Apel, PI-Ceul, PICirl, PI-Ctrl, PI- Dral, PI-Mavl, PI-MfiI, PI-Mgol, PI-Mjal, PI-Mkal, PIMiel, PI-Mtul, PI-MtuHI, PI-Pabili, PI-Pful, PI-Phol, PI-Pkol, PI-Pspl, PI-Rmal, PI-Scel, PI-Sspl, PI-Tful, PI-TIil, PIT1iII, PI-Tspl, PI-TspII, PI-Bspl, PI-Mchl, PI-Mfal, PIMgal, PI-MgaII, PI-Minl, PI-Mural, PI-Mshl, PI-MsmII, PI- Mthl, PI- Tagl, PI-Thyli, I-Ncrl, I-NcrII, I-Panli, I-Tevi, I-Popi, I-Dira, I-Hmul, I-HmuII, I-Tevil, I-Tevlil, F-SceI, F-SceII (HO), F-Suvl, F-Tevi et F-TevII ou une méganucléase dérivée de l'une d'elles telle que décrite précédemment. De préférence, ladite méganucléase est la méganucléase I-SceI décrite dans le brevet US 6,238,924. L'endonucléase exprimée dans le noyau de ladite cellule hôte peut être exprimée naturellement dans le noyau ou avoir été apportée de façon exogène. Selon un deuxième mode de réalisation préféré du deuxième procédé de l'invention, l'endonucléase a été apportée de façon exogène. L'endonucléase peut être introduite de façon exogène dans la cellule hôte sous différentes formes, à savoir sous la forme d'une protéine ou sous la forme d'une séquence d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans ladite cellule hôte. Selon un mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, l'endonucléase est introduite dans la cellule hôte sous la forme d'une protéine. Des techniques permettant l'introduction d'une telle endonucléase sous la forme d'une protéine sont connues de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée. À titre 2879622 29 d'exemple de telles techniques, on peut citer notamment la microinjection. Selon un deuxième mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, l'endonucléase est introduite sous la forme d'une molécule d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans ladite cellule hôte. Ladite molécule d'acides nucléiques comprend alors une phase ouverte de lecture, codant pour l'endonucléase, sous le contrôle de séquences de régulation permettant l'expression de ladite endonucléase dans ladite cellule hôte. Par molécule d'acides nucléiques, on entend aussi bien des molécules d'ADN, d'ARN que des molécules hybrides ADN/ARN, lesquelles peuvent être sous forme simple brin ou double brin. À titre d'exemple de molécule d'acides nucléiques utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer une molécule d'ARNm codant pour l'endonucléase ou un vecteur d'expression comprenant une phase ouverte de lecture codant pour ladite endonucléase et permettant l'expression de ladite endonucléase dans la cellule hôte. Un tel vecteur d'expression contient une séquence promotrice permettant l'expression de ladite endonucléase dans la cellule hôte. Des séquences promotrices utilisables dans le procédé de l'invention sont connues de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée. Ledit vecteur d'expression pourra en outre contenir d'autres séquences de régulation correspondant à une origine de réplication, un site de fixation de fixation au ribosome, un ou plusieurs sites d'épissage, un site de 2879622 30 polyadénylation ou à un site de terminaison de la transcription. Un vecteur d'expression utilisable dans le procédé selon l'invention peut correspondre, à titre non limitatif, à un YAC (chromosome de levure artificiel), à un BAC (chromosome bactérien artificiel), à un vecteur viral, à un vecteur plasmidique, à un phagemide, à un cosmide, à un vecteur ARN, à un vecteur dérivé d'un baculovirus, d'un phage, d'un transposon ou d'une molécule d'ARN ou d'ADN, linéaire ou circulaire. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier. À titre d'exemple de vecteurs viraux, on peut citer notamment les rétrovirus, les adénovirus, les parvovirus, les coronavirus, les orthomyxovirus, les rhabdovirus, les paramyxovirus, les picornavirus, les alphavirus, les adénovirus, les herpèsvirus, les poxvirus. De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un vecteur plasmidique. Des techniques pour introduire dans un uf ou un ovocyte une molécule d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. À titre d'exemple de telles techniques, on peut citer la micro-injection, l'électroporation, la transfection à l'aide de liposomes ou de lipides modifiés tels que la lipofectamine (IN VITROGEN), ou encore à l'aide de précipités de phosphate de calcium. De préférence, cette introduction s'effectue par la technique de micro-injection. Lorsque l'endonucléase est apportée de façon exogène dans la cellule hôte, celle-ci peut-être apportée préalablement, simultanément ou consécutivement à la séquence d'acides nucléiques exogène qui présente des extrémités 5' et 3' libres et un site de reconnaissance unique pour ladite endonucléase. De préférence, 2879622 31 l'endonucléase est apportée de façon exogène simultanément à ladite séquence d'acides nucléiques exogène. La séquence d'acides nucléiques exogène qui présente des extrémités 5' et 3' libres et un site de reconnaissance unique pour ladite endonucléase correspond à une séquence d'ADN, de préférence à une séquence d'ADN double brin. Les extrémités 5' et 3' libres correspondent chacune indépendamment l'une de l'autre à une extrémité franche ou cohésive. Par extrémité cohésive, on entend une séquence d'ADN double brin dont un brin présente une région 5' ou 3' dépassante, ladite région 5' ou 3' dépassante peut correspondre à une séquence de moins de 10 nucléotides, de préférence de moins de 7 nucléotides, et de manière particulièrement préférée de moins de 5 nucléotides. Une telle séquence d'acides nucléiques exogène peut être obtenue par des techniques connues de l'homme du métier, notamment par purification de séquences d'acides nucléiques, digérés ou non par des enzymes de restriction adaptées, pour présenter des extrémités 5' et 3' libres. Dans le cas où une étape de digestion enzymatique est nécessaire, ladite séquence d'acides nucléiques présente des sites de restriction à la position recherchée. Selon un troisième mode de réalisation particulier du deuxième procédé de l'invention, ladite séquence d'acides nucléiques d'intérêt est incapable de s'intégrer dans le génome de ladite cellule hôte par recombinaison homologue. De préférence, ladite séquence d'intérêt présente moins de 60% d'identité avec l'ADN génomique de ladite cellule hôte, préférentiellement moins de 60% d'identité, et de manière particulièrement préférée moins de 50% d'identité. La séquence d'acides nucléiques exogène présente une longueur comprise entre 100 et 10 000 paires de bases, de 2879622 32 préférence entre 500 et 5 000 paires de bases, et de manière particulièrement préférée entre 1 000 et 3 000 paires de bases. Avantageusement, La séquence d'acides nucléiques exogène qui présente des extrémités 5' et 3' libres est un vecteur linéaire. À titre d'exemple de vecteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer, à titre non limitatif, un YAC (chromosome de levure artificiel), un BAC (chromosome bactérien artificiel), un vecteur viral adapté, tel qu'un adénovirus, un vecteur plasmidique, un phagemide ou un cosmide. Les vecteurs sous forme circulaire sont préalablement linéarisés, notamment par une digestion avec une ou plusieurs enzymes de restrictions adaptées, avant leur utilisation dans le procédé selon l'invention. De préférence le vecteur utilisé est un vecteur plasmidique linéarisé. Par site de reconnaissance unique pour l'endonucléase présent dans la séquence d'acides nucléiques exogène, on entend une séquence d'acides nucléiques spécifique qui présente une longueur d'au moins 12 paires de bases à laquelle ladite endonucléase se fixe et qui permet, après la fixation de l'endonucléase sur cette dernière, l'induction d'une cassure double brin dans l'ADN par ladite endonucléase. De préférence ledit site de reconnaissance correspond à une séquence d'acide nucléique spécifique d'au moins 16 paires de base, et de manière particulièrement préférée d'au moins 18 paires de bases. Par séquence d'acides nucléiques spécifique, on entend une séquence d'ADN, de préférence une séquence d'ADN double brin. Selon un mode de réalisation particulier, ladite séquence d'acide nucléique spécifique pour ladite endonucléase correspond à la séquence consensus de fixation déterminée pour ladite endonucléase ou à une séquence 2879622 33 dérivée de ladite séquence consensus. En effet, certaines endonucléases sont capables de se fixer à des séquences ne présentant pas une identité parfaite avec leur séquence consensus et d'effectuer, consécutivement à cette fixation, une cassure double brin au niveau de cette dernière ou dans ses régions avoisinantes. Avantageusement, ladite séquence spécifique présente plus de 90% d'identité avec ladite séquence consensus, de préférence plus de 95%, et de manière particulièrement préférée plus de 98% avec ladite séquence consensus. Par pourcentage d'identité, on entend le pourcentage d'acides nucléiques de nature et de position identique entre ladite séquence spécifique et ladite séquence consensus de fixation déterminée pour ladite endonucléase. Selon l'endonucléase utilisée, il est possible d'obtenir une cassure double brin dans l'ADN soit au niveau dudit site de reconnaissance spécifiquement, soit dans les séquences avoisinantes dudit site de reconnaissance, de préférence à moins de 100 paires de bases dudit site de reconnaissance, préférentiellement à moins de 50 paires de bases, et de manière particulièrement préférée à moins de 20pb. Avantageusement, la cassure double brin induite par l'endonucléase est localisée au niveau de son site de reconnaissance dans l'ADN. Ledit site de reconnaissance unique n'est pas présent au niveau des extrémités 5' et 3' libres de ladite séquence d'acides nucléiques exogène, de préférence ledit site de reconnaissance est positionné à plus de 50 paires de bases des extrémités 5' et 3' libres, préférentiellement à plus de 100 paires de bases, et de manière particulièrement préférée à plus de 250 paires de bases. 2879622 34 Avantageusement, l'ADN génomique de ladite cellule hôte comprend moins de 5 copies dudit site de reconnaissance pour l'endonucléase, de préférence moins de 2 copies, et de manière particulièrement préférée ledit génome ne contient aucun site de reconnaissance pour ladite endocucléase. La séquence d'acides nucléiques exogène peut comprendre une séquence d'acides nucléiques d'intérêt. Une telle séquence d'acide nucléique d'intérêt peut correspondre à un gène ou une séquence régulatrice dont on veut déterminer l'expression et/ou le phénotype chez le vertébré transgénique obtenu par le procédé selon l'invention. Selon un quatrième mode de réalisation préféré du deuxième procédé selon l'invention, la séquence d'acides nucléiques exogène comprend un gène rapporteur sous le contrôle d'une séquence promotrice permettant l'expression dudit gène rapporteur dans la cellule hôte. Des gènes rapporteurs utilisables dans le procédé selon l'invention sont connus de l'homme du métier, à titre d'exemple, on peut citer la béta-galactosidase, la GFP (green fluorescent protein), la RFP (red fluorescent protein). Des séquences promotrices permettant l'expression dudit gène rapporteur dans la cellule hôte sont connus de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée dans le procédé selon l'invention. Selon un cinquième mode de réalisation préféré du deuxième procédé selon l'invention, la séquence d'acides nucléiques exogène comprend un gène de sélection sous le contrôle d'une séquence promotrice permettant l'expression dudit gène de sélection dans la cellule hôte. 2879622 35 Des gènes de sélection utilisables dans le procédé selon l'invention sont connus de l'homme du métier, à titre d'exemple, on peut citer la néomycine phosphotransférase, à 1 ' hygromycine phosphotransférase, 1'histidinol déshydrogénase ou la thymidine kinase. Des séquences promotrices permettant l'expression dudit gène de sélection dans la cellule hôte sont connus de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée dans le procédé selon l'invention. Avantageusement, le site unique de reconnaissance pour l'endonucléase est présent entre le gène de sélection ou le gène rapporteur et sa séquence promotrice ou dans une séquence intronique dudit gène de sélection ou rapporteur, de préférence le site unique de reconnaissance pour l'endonucléase est présent entre le gène de sélection ou le gène rapporteur et sa séquence promotrice. Selon un septième mode de réalisation préféré du deuxième procédé de l'invention, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de culture de la cellule hôte obtenue. Ces conditions de culture sont bien connues de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée dans le procédé de l'invention. L'étape de culture est effectuée pendant un temps suffisant pour permettre l'intégration aléatoire de la séquence d'acide nucléique exogène dans l'ADN génomique de la cellule hôte. Ce temps est fonction de la cellule hôte utilisée et peut être déterminé simplement par l'homme du métier. 2879622 36 Dans un mode de réalisation particulier dudit mode de réalisation préféré, la cellule hôte correspond à un ovocyte, préalablement fécondé, ou à un oeuf, et l'étape de culture permet le développement de l'organisme non humain issu de ceux-ci, de préférence ladite étape de culture permet le développement d'un organisme mature. Ces conditions de culture et potentiellement de fécondation sont bien connues de l'homme du métier et sont fonction de la cellule hôte utilisée dans le procédé de l'invention. Selon un huitième mode de réalisation préféré du deuxième procédé selon l'invention, ledit procédé comprend en outre une étape d'identification des cellules hôtes présentant une insertion aléatoire de la séquence d'acides nucléiques exogène dans leur ADN génomique. Une telle étape d'identification peut alors être effectuée en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Cette étape d'identification peut utiliser, à titre d'exemple, les techniques de Southern ou de PCR, sur l'ADN génomique isolé de la cellule hôte obtenue, utilisant une sonde ou des amorces spécifiques respectivement. Dans le cas où ladite séquence d'acides nucléiques exogène comprend un gène rapporteur sous le contrôle d'une séquence promotrice permettant son expression dans la cellule hôte, ladite étape d'identification peut utiliser des techniques de détection de l'activité dudit gène rapporteur. De telles techniques de détection sont fonction du gène rapporteur utilisé et sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où ladite séquence d'acides nucléiques exogène comprend un gène de sélection sous le contrôle d'une séquence promotrice permettant son expression dans la 2879622 37 cellule hôte, ladite étape d'identification correspond à une étape de culture de ladite cellule hôte dans un milieu adapté. Les conditions de culture pour une telle étape sont fonction du gène de sélection utilisé et sont bien connues de l'homme du métier. Avantageusement, l'étape d'identification des cellules hôtes présentant une insertion aléatoire de la séquence d'acides nucléiques exogène dans leur ADN génomique est effectuée après une étape de culture. De préférence, et dans le cas où la cellule hôte est un uf ou un ovocyte, l'étape d'identification est effectuée sur des cellules issues de l'organisme non humain, de préférence mature, obtenu après l'étape de culture dudit ovocyte, préalablement fécondé, ou dudit uf dans des conditions de culture permettant le développement dudit organisme. Un quatrième objet de la présente invention est une composition pour transformer stablement une cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle comprend: (i) une endonucléase sous forme protéique ou une molécule d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans le noyau de ladite cellule hôte, et (ii) une séquence d'acide nucléiques qui présente des extrémités 5' et 3' libres et un site de reconnaissance unique pour ladite endonucléase qui n'est pas présent au niveau des extrémités de ladite séquence d'acides nucléiques exogène, lequel site de reconnaissance correspond à une séquence d'acides nucléiques spécifique d'au moins 12 paires de bases permettant: (a) la fixation séquence spécifique de l'endonucléase 35 au niveau dudit site de reconnaissance, (b) l'induction consécutive d'une cassure double brin dans l'ADN de ladite séquence d'acides nucléiques par 2879622 38 ladite endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance ou dans ses régions avoisinantes, de préférence à moins de 100 paires de base dudit site de reconnaissance, et (c)l'intégration aléatoire de ladite séquence d'acides nucléiques, ou d'une partie de celle-ci, dans le génome de la cellule hôte. L'endonucléase présente dans la composition selon 10 l'invention est telle que décrite précédemment. La molécule d'acides nucléiques permettant l'expression de ladite endonucléase dans le noyau de la cellule hôte est telle que décrite précédemment. Ladite séquence d'acides nucléiques correspond à la séquence d'acides nucléiques exogène décrite précédemment. Par transformer stablement, on entend une intégration stable dans l'ADN génomique d'une séquence d'acides nucléiques exogènes, laquelle est transmise à la descendance de ladite cellule hôte. De préférence, ladite transformation stable correspond une utilisation pour la transgénèse. Ladite composition peut donc être utilisée pour transformer stablement une cellule hôte, et de préférence pour la transgénèse. Préférentiellement, ladite composition est utilisée pour intégrer de façon aléatoire une séquence d'acides nucléiques exogène dans l'ADN génomique d'une cellule hôte. Ladite composition peut comprendre en outre d'autres agents actifs comme des agents de stabilisation ou encore des agents permettant de transformer une cellule hôte, tels qu'un précipité de phosphate de calcium, des liposomes ou de lipides modifiés, notamment la lipofectamine (IN VITROGEN). 2879622 39 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. EXEMPLE 1: Insertion aléatoire d'un site I-SceI dans le 5 génome de Médaka 1) Construction pa1TI-EGFP-I: La construction pa1TI-GFP-I a été obtenue en insérant, dans le plasmide pa1TI-EGFP (Goldman et al., Transgenic Res., vol.10(1), p:21-33, 2001; HIEBER et al., J. Neurobiol., vol.37(3), p:429-440, 1998)), un site de reconnaissance pour la méganucléase I-SceI entre le promoteur de l'al-tubuline du poisson zèbre et le gène rapporteur de l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent protein). Dans une première étape, la construction pa1TI-EGFP a été digérée par l'enzyme BamHI (BIOLABS) et la construction digérée a ensuite été purifiée. La construction pa1TI-EGFP digérée par BamHI a ensuite été déphosphorylée, puis purifiée de nouveau. Enfin, une réaction de ligature a été effectuée entre la construction pa1TI-EGFP, digérée par BamHI et déphosphorylée, et un oligonucléotide double brin contenant le site ISceI (en caractère gras) ainsi que des extrémités libres cohésives, compatibles avec le site BamHI digéré (oligonucléotide sens (SEQ ID NO: 1) : 5'-GATCATAGGGATAACAGGGTAATA-3'; oligonucléotide anti-sens (SEQ ID NO: 2) : 5'-GATCTATTACCCTGTTATCCCTAT-3'). L'insertion et l'orientation du site de reconnaissance pour I-SceI au niveau du site BamHI, entre la séquence promotrice de l'al tubuline et celle de la phase ouverte de lecture de EGFP, et la conservation du cadre de lecture ont été contrôlées par séquençage. 2) Construction pact-GFPI2: La construction pact-GFPI2 a été obtenue comme décrit dans THERMES et al. (Mechanisms of Development, vol. 118, p:91-98, 2002). L'insertion et l'orientation des deux 2879622 40 sites de reconnaissance fonctionnels pour la méganucléase I-Scel, en amont du promoteur de l'a-actine du poisson-zèbre et en aval du gène rapporteur de la GFP (Green Fluorescent Protein) respectivement, a été contrôlée par séquençage. 3) Linéarisation des constructions pa1TI-EGFP-I et pact-GFPI2: Le transgène a1TI-EGFP-I sous forme linéarisé a été obtenu par digestion de la construction pa1TI-EGFP-I par les enzymes XhoI et AflII (BIOLABS). Le fragment XhoI-AflII contenant le transgène a ensuite été purifié sur colonne QIAEX II (QIAGEN), puis filtration sur colonne Elutip-D (SCHLEICHER AND SCHUELL). Le transgène act-GFPI2 sous forme linéarisé a été obtenu par digestion de la construction pact-GFPI2 par la méganucléase I-Scel (ROCHE DIAGNOSTICS). Le fragment I-scel-I-SceI contenant le transgène a ensuite été purifié comme précédemment. 4) Micro-injection des transgènes et de la méganucléase I-Scel Différents ADN ont été injecté, en présence ou en l'absence de méganuléase I-Scel, dans un oeuf de médaka au stade une cellule selon le protocole décrit dans Thermes et al. (2002, précité). Dans les expériences réalisées, le transgène a1TI- EGFP-I a été injecté sous forme linéaire (fragment XhoIAflil) et le transgène act- GFPI2 sous forme linéaire (fragment IsceI-I-SceI) ou circulaire (pact- GFPI2). 5) Expression des transgènes dans l'oeuf (FO) : Pour suivre l'expression des transgènes dans les oeufs micro-injectés, la fluorescence des embryons a été observée sous une loupe LEICA MZFLIII équipée d'une lampe U.V. 2879622 41 (excitation à 370-420 nm) et d'un filtre d'émission à 455 nm pour la GFP. Dans des expériences préliminaires dans lesquelles le plasmide pa1TI-EGFP seul, et sous forme circulaire, a été micro-injecté dans l'oeuf au stade une cellule, les résultats ont montré que la fluorescence de la GFP est détectable dans le SNC pendant la neurogenèse et jusqu'à l'éclosion (9 jours post-fécondation, st.39). Plus précisément, ces expériences d'expression transitoire de la construction pa1TI-EGFP ont révélé que le promoteur de l'altubuline de poisson-zèbre est activé au niveau du système nerveux central chez le médaka, principalement dans des cellules en cours de prolifération. L'activité spécifique de la construction apparaît donc similaire à celle décrite chez le poisson zèbre dans GOLDMAN et al. (2001, précité). Pour le transgène a1TI-EGFP-I, les résultats ont montré un profil d'expression similaire à celui de la construction pa1TI-EGFP dans l'oeuf. Le profil d'expression du transgène act-GFPI2 est quant à lui similaire à celui observé dans THERMES et al. (2002, précité). La proportion d'embryons exprimant les transgènes dans 25 les différentes expériences de micro-injection est décrite dans le tableau I ci-dessous. Tableau I ADN Méganucléase Expression Expression I-Scel négative positive (%) (%) transgène forme act-GFPI2 linéaire - 49 51 act-GFPI2 circulaire 50 50 act-GFPI2 circulaire + 16 84 a1TI-EGFP-I linéaire + 10 90 2879622 42 En l'absence de méganucléase, on observe que près de 50% des embryons qui survivent à la micro-injection ne montrent pas de fluorescence. En revanche, lorsque les différents transgènes sont micro-injectés en présence de méganucléase, on observe une augmentation importante de la proportion d'embryons exprimant la GFP. Ainsi, les résultats montrent, qu'en présence de méganucléase I-Scel, les embryons négatifs pour l'expression du transgène a1TIEGFP-I représentaient environ 10 % de l'ensemble des embryons injectés (12 %, n = 116), soit une proportion inférieure à celle obtenue avec le transgène act-GFPI2 (16%). L'expression transitoire du transgène à la génération FO est donc fortement amélioré par la coinjection de la méganucléase. 6) Transmission du transgène à la descendance: Les poissons de la génération FO exprimant le transgène ont été sélectionnés en tant que potentiel fondateur. Ces derniers ont été élevés jusqu'à leur maturité sexuelle et ont alors été croisés avec des partenaires sauvages. Les embryons de la descendance (Fi) ont été analysés pour leur expression des transgènes. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-dessous. Tableau II ADN I-SceI Taux de FO Taux Erreur transgé- moyens de Standard, niques trans- Sm (%) (fondateurs mission en %) en F1 (%) Transgène forme act-GFPI2 linéaire - 5,9 (2/35) 15,1 17,7 act-GFPI2 circulaire - 15,6 (5/32) 17,6 22,2 act-GFPI2 circulaire + 30,5 (11/36) 48,4 9,1 a1TI-EGFP I linéaire - 0 (0/17) a1TI-EGFP I linéaire + 21 (4/19) 30 12,5 2879622 43 Les résultats montrent que, dans le cas des injections contrôles (sans co-injection avec I-Scel), la majorité des poissons testés n'étaient pas positifs pour la GFP. Ceci implique que le transgène était absent des cellules de la lignée germinale en F0. Dans le cas du transgène act-GFPI2, lequel est encadré par deux sites de reconnaissance I-SceI, on observe que près de 30% des individus ont intégré le transgène de façon stable dans leur génome. Le mécanisme proposé correspond à celui décrit dans THERMES et al. (2002, précité) selon lequel la méganucléase permettrait l'intégration dans le génome d'un transgène encadré par deux sites de reconnaissance pour celle-ci. Selon le modèle proposé, le transgène serait excisé par la méganucléase, laquelle protègerait les extrémités libres et permettrait ensuite l'intégration aléatoire du transgène excisé dans le génome. De façon surprenante, on observe que parmi les 19 embryons co- injectés avec le transgène a1TI-EGFP-I et IScel, et testés pour la transmission, 4 (soit 21 %, n = 19) généraient des descendants exprimant la GFP. Il semble donc que le modèle proposé dans THERMES et al. (2002, précité) ne rende pas compte du mécanisme d'insertion du transgène en présence de la méganucléase puisque la présence d'un unique site de reconnaissance pour celle-ci, lequel n'est pas localisé à proximité immédiate des extrémités, permet également une intégration stable du transgène dans le génome avec une fréquence importante. Les 4 individus fondateurs obtenus par l'intégration du transgène a1TI-EGFP-I ont été nommés F0.19I, F0.25I, F0.34I et F0.36I. Les individus F1 issus de ces fondateurs présentaient une fluorescence verte uniforme dans le SNC, alors observable dès le début de la neurogenèse, au stade early-neurula (25hpf, st.17). Dans le cas du fondateur F0.25I, les individus F1 issus de celui-ci présentaient 2879622 44 plusieurs niveaux d'expressions de la GFP. On a pu distinguer, par ordre de fluorescence croissante, des individus exprimant faiblement, moyennement ou fortement la GFP (nommées F0.25-1, F0.25-2 et F0.25-3, respectivement). De telles variations en F1 peuvent être dues à la ségrégation de différents concatémères du transgène intégrés dans le génome, en F0, en trois sites d'intégration génétiquement distincts. Ces embryons (F1) ont été élevés jusqu'à l'éclosion et seuls ceux faiblement et moyennement fluorescents ont éclos et ont donné naissance à des poissons adultes sexuellement mâtures. La transmission du transgène aux générations suivantes (i.e. F2, F3 et F4) est demeurée uniforme ce qui confirme l'intégration stable du transgène. Le taux moyen de transmission des individus fondateurs a été estimé en suivant l'expression des transgènes dans la descendance des individus F1 positifs. Les taux obtenus étaient très variables et inférieurs à 50 %. Dans le cas du transgène a1TI-EGFP-I, la moyenne était de 30 12,5 %. Un seul des quatre poissons fondateurs (F0.191) atteignait alors de façon significative 50 % de transmission, ce qui correspond au pourcentage d'une transmission hémizygote. Dans ce cas, il est probable que le transgène se soit intégré en FO au niveau d'un site unique et dans toutes les cellules de la lignée germinale. En définitive, les résultats montrent une nette amélioration de l'efficacité d'intégration du transgène dans la lignée germinale en présence de deux ou d'un seul site I-SceI. 7) Analyse de l'intégration du transgène dans le génome: L'ADN génomique a été extrait à partir de poissons transgéniques adultes F1, en utilisant de la protéinase K et du phénol selon le protocole décrit dans SAMBROOK et al. (CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989). 2879622 45 7-A. transgène a1TI-EGFP-I: Pour les expériences de Southern-blot avec le transgène a1TI-EGFP-I, l'ADN génomique a été digéré par Sacl ou Notl, séparé sur un gel d'agarose 0.8 % (TAE lx) et transféré par capillarité sur une membrane de nitrocellulose, laquelle a été hybridée avec une sonde spécifique marquée aléatoirement avec des nucléotides radioactifs (32P). Cette sonde correspond à la séquence de l'EGFP. L'hybridation au transgène a été révélée phospho- imager après plusieurs heures d'exposition à un film d'argent. Les résultats sont présentés dans la figure 1. Pour la lignée F0.19, la digestion par Sacl (site présent à l'extérieure de la région reconnue par la sonde) révèle la présence de deux bandes intenses de tailles proches de 4kb et de plusieurs bandes de tailles inférieures (2kb et environ 3kb). Les deux bandes d'environ 4kb correspondent probablement à des insertions du transgène en tandem direct et en tandem inverse de type I respectivement (FIGURE 2A et 2B, respectivement). Pour les bandes de taille inférieure (2kb et environ 3kb) , celles-ci correspondent très probablement à des fragments de jonction entre l'ADN intégré et l'ADN génomique. L'intensité des deux bandes de 4kb, par rapport aux fragments de jonction, indique la présence de ces deux types de tandems en grand nombre dans le génome et dans des proportions comparables. Pour les lignées F0.25-1 et -2, les résultats montrent la présence d'une seule des deux bandes diagnostiques à 4kb (FIGURE 1, flèche). La comparaison avec le profil en F0.19 indique qu'il s'agit vraisemblablement d'une forme de concatémère en tandem inverse de type I (FIGURE 2B). La faible intensité de ces bandes suggère la présence d'un nombre réduit de copies du transgène dans ces lignées. Ces résultats ont été confirmés pour ces trois lignées par des digestions A gel (extérieur à la région reconnue par la sonde; données non montrées) et BamHI (pas de sites dans le transgène; données non montrées). L'utilisation de la digestion NotI a permis d'analyser les lignées pour la présence de la forme tandem inverse de type II (figure 2C). Les résultats montrent que seule la lignée F0.19 présente de telles intégrations (FIGURE 1, étoile). L'analyse de l'ADN génomique de la lignée F0.36 a 10 révélé un profil de digestion équivalent à celui de l'ADN de la lignée F0.19 (données non montrées). En conséquence, les deux lignées F0.25 présentent un profil d'insertion avec des concatémères simples et en 15 faible nombre de copie (tandems inverse de type I). 7-B. transgène act-GFPI2: L'analyse des lignées transgéniques obtenues avec ce transgène est décrite dans THERMES et a1. (2002, précité) . Les résultats montrent là encore des profils d'insertion avec un faible nombre de copies du transgène (de une à huit copies) dans l'ADN génomique des différentes lignées testées. En conclusion, l'utilisation de la méganucléase I-Scel et de constructions présentant un ou deux sites de reconnaissance pour celle-ci permet d'obtenir, dans la majorité des lignées analysées, un gène rapporteur intégré de façon stable dans le génome sous forme d'une copie simple ou d'un faible nombre de copies. Ces deux techniques d'insertion aléatoire constituent donc des techniques de premier ordre par rapport aux techniques habituellement utilisées en transgénèse dans lesquelles on observe des insertions en grand nombre dans le génome (HACKETT, Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Elsevier, p:207-240, 1993; IYENGAR et al, Transgenic Res., vol.5, p:147-166, 1996). 8) Intégrité des sites I-Scel intégrés: Dans le cas où il est envisagé d'utiliser les lignées transgéniques obtenues pour effectuer de la recombinaison homologue avec la méganucléase I-Scel, et permettre notamment l'intégration ciblée d'un gène d'intérêt, il est important que le(s) site(s) I-Scel intégré(s) dans le génome soi(en)t fonctionnel(s). Afin de tester in vitro l'intégrité des sites I-Scel intégrés dans le génome des les lignées F0.25-1, -2, F0.19 et F0.36, l'ADN génomique de ces lignées a été purifié. Ledit ADN génomique a ensuite été amplifié par PCR à l'aide d'amorces spécifiques positionnées de part et d'autre du site de reconnaissance pour I-Sce I (figure 3A). Le fragment d'ADN amplifié présente une longueur de 500 paires de bases. Les produits de PCR obtenus ont ensuite été digérés par l'enzyme 1-Scel (ROCHE DIAGNOSTICS) selon les instructions du fabricant, et finalement déposés sur un gel d'électrophorèse. Les résultats sont présentés dans la figure 3B. La migration sur gel des produits de la réaction révèle la présence d'une bande à environ 500 pb, correspondant à l'ADN non coupé, et de deux autres bandes de taille inférieures 200 et 300 pb (ADN coupé, FIGURE 3A et 3B). La présence de la bande à 500pb peut résulter d'une digestion enzymatique incomplète ou bien de la présence de sites I-Scel mutés. Dans tous les cas, les résultats montrent que les 4 lignées analysées possèdent des sites IScel fonctionnels non mutés, lesquels sont en nombre variable en fonction de la lignée analysée. EXEMPLE 2: Insertion ciblée d'un transgène dans le génome d'une lignée transgénique de médaka présentant un site I- Scel 1) Construction de réparation (CR): Dans le but d'intégrer un transgène dans le génome de médaka de façon ciblée, nous avons testé la technique de réparation de brèche. Pour cela, nous avons utilisé un deuxième transgène contenant le gène traceur de la mRFP1 (monomeric red fluorescent protein) entouré depart et d'autre par des séquences d'au moins 500 pb parfaitement homologues aux régions entourant le site I-Scel du transgène a1TI-EGFP-I (CR, Construction de Réparation). La région homologue en 5' correspond à la séquence intronique du promoteur a1TI, ce qui écarte ainsi toute possibilité d'expression de la mRPF1 sous forme épisomale. Pour réaliser cette construction, le fragment SacINotI du plasmide p1TI-EGFP (1.7 kb), correspondant aux régions d'homologie situées de part et d'autre du site IScel, a été purifié et cloné dans le vecteur pCRIITOPO (Invitrogen) linéarisé par une digestion Saci-NotI. Le plasmide RH obtenu a été contrôlé par séquençage. Parallèlement, le fragment BamHI-EcoRI du plasmide mRFP1-pRSETB (Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.99(12), p:7877-82, 2002) , correspondant à l'ORF de la mRFP1, a été sous cloné dans le plasmide p1TI-EGFP, entre les sites BamHI et NotI, à la place de l'EGFP. La construction obtenue a servi de matrice pour amplifier la séquence mRFP1polyA par PCR en y ajoutant un site BglII à chaque extrémité (amorce sens (SEQ ID NO: 3) : 5 ' - G A A G A T C T C T T A A G C A T G G C C T C C T C C G A G G A C - 3 ' ; amorce antis e n s ( S E Q I D N O 4): 5'CCTAGATCTGCTAGCATACATTGATGAGTTTGGAC-3'). Le produit de PCR obtenu a été cloné dans le plasmide pCRII-TOPO (Invitrogen) et la séquence a été contrôlée par séquençage. Le fragment mRFP1-polyA a ensuite été isolé en effectuant une digestion BglII de cette construction. 2879622 49 Finalement, la construction de réparation (CR) a été générée en introduisant le fragment mRFP1-polyA (digestion Bg1II) au niveau du site BamHI de la construction RH. Une construction contrôle pa1TI-mRFP1-EGFP a été générée en introduisant ce même fragment mRFP1- polyA dans la construction p1TI-EGFP. 2) Micro-injection de la construction de réparation et 10 de la méganucléase I-Scel La construction de réparation a été co-injectée sous forme circulaire avec de la méganuléase I-Scel dans un oeuf de poisson zèbre ou médaka au stade une cellule selon le protocole décrit dans Thermes et al. (2002, précité). Les oeufs utilisés étaient issus des lignées de poissons transgéniques (F3; F0.25-1 et -2, F0.19 et F0.36) La construction de réparation (CR) a été injectée sous forme circulaire à une concentration finale d'environ 10ng/l, après amplification avec un kit Midiprep (Qiagen) et filtration (filtre 0.2 m). Afin de vérifier l'expression correcte de la mRFP1, la construction contrôle pa1TI-mRFP1-EGFP a été injectée seule dans un oeuf de médaka au stade une cellule selon le même protocole. L'injection de celle-ci a conduit à une bonne expression de la mRFP1 dans l'embryon, sans traces de fluorescence verte. 3) Expression de la mRFP1 dans l'oeuf (FO) : Pour suivre l'expression des transgènes au cours dans les oeufs micro-injectés, la fluorescence des embryons a été observée sous une loupe LEICA MZFLIII équipée d'une lampe U.V. (excitation à 580-590 nm) et d'un filtre d'émission à 607 nm pour la mRFP1. 2879622 50 Les embryons injectés ont été observés à la loupe pour leur fluorescence verte et rouge (en particulier), vers les stades 28 (30 somites, 64 hpf) et 32 (fin de somitogenèse, 4 jours post-fécondation). Ces expériences ont permis d'isoler un embryon mRFP1 positif issu de la lignée F0.25-1 (expression faible de la GFP et intégration du transgène sous forme de concatémères simples). La fluorescence rouge est détectée uniquement dans le SNC: elle est faible mais uniforme, suggérant une répartition égale du transgène dans les premiers blastomères. Dans la mesure où (i) ce profil d'expression correspond à celui obtenu avec la construction pa1TI-mRFP1-EGFP et où (ii) la construction de réparation ne présente pas un promoteur de l'al tubuline fonctionnel, il est possible de conclure que le gène mRFP1 s'est intégré spécifiquement, et par recombinaison homologue, en amont du promoteur de l'a1 tubuline et au niveau d'au moins un des sites I-SceI préalablement intégrés dans le génome de la lignée F0.25-1. Les résultats montrent donc qu'il est possible d'obtenir l'insertion spécifique (par recombinaison homologue) d'un transgène co- injecté avec une méganucléase dans le génome d'un uf de médaka qui présente quelques copies d'un site de reconnaissance pour une telle méganucléase. 51 REVENDICATIONS 1) Procédé in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs de vertébrés non humains possédant une modification génomique ciblée comprenant une étape d'expression d'une endonucléase dans le noyau d'un ovocyte ou d'un oeuf, caractérisé en ce que ladite endonucléase est introduite de façon exogène et en ce que l'ADN génomique dudit oeuf ou ovocyte présente au moins un site de reconnaissance pour ladite endonucléase, lequel site de reconnaissance correspond à une séquence spécifique d'au moins 12 paires de bases permettant: ( i) la fixation séquence spécifique de l'endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance, (ii) l'induction consécutive d'une cassure double brin dans l'ADN génomique par ladite endonucléase au niveau dudit site de reconnaissance ou dans ses régions avoisinantes, de préférence à moins de 100 paires de base dudit site de reconnaissance, puis (iii)la réparation de ladite cassure double brin par un mécanisme de recombinaison homologue. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit site de reconnaissance présent dans l'ADN 25 génomique a été introduit par transgénèse. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite endonucléase est une méganucléase. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la modification génomique ciblée au niveau du site de cassure correspond à une délétion ou à une insertion. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'introduction, dans 2879622 52 l'ovocyte ou l'oeuf, d'une séquence d'acides nucléiques exogène qui présente une homologie avec les séquences d'acides nucléiques localisées en amont et en aval du site de reconnaissance pour l'endonucléase présent dans l'ADN génomique. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oeuf ou l'ovocyte de vertébré non humain est un oeuf ou un ovocyte de mammifères, de reptiles, d'amphibiens, d'oiseaux, d'insectes ou de poissons. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de culture de l'ovocyte préalablement fécondé ou de l'oeuf présentant une modification génomique ciblée dans des conditions adaptées pour permettre le développement du vertébré non humain. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification des oeufs ou des ovocytes présentant la modification génomique ciblée recherchée. 9) uf ou ovocyte de vertébré non humain susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 8, caractérisé en ce qu'il possède une modification génomique ciblée. 10) uf ou ovocyte selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit oeuf ou ovocyte n'est pas issu de parents présentant ladite modification génomique ciblée dans leur génome.