Brevet FR2876030A1 — publié le 20060407

La présente invention concerne une composition cosmétique ou médicamenteuse renfermant en tant que substance active un ex-trait de cyanobactéries filamenteuses pouvant être prélevée dans les bassins romains d'Evaux-les-Bains. La station thermale d'Evaux-les-Bains accueille des curistes depuis plus d'un siècle, et les vertus anti-rhumatismales, phlébologiques et dermatologiques de ses eaux ne sont plus à démontrer. A partir de cette connaissance préalable, on a eu l'idée conformément à l'invention de rechercher si des microorganismes prélevés dans les bassins d'Evaux-les-Bains pouvaient avoir des propriétés, en particulier des propriétés anti-inflammatoires bénéfiques pour la santé dans le but d'incorporer ces microorganismes ou des extraits de ces microorganismes dans des préparations cosmétiques ou médicamenteuses. On a ainsi, prélevé et recensé dans les bassins d'Evaux-les-Bains différentes espèces d'algues auxquelles on a fait subir de manière empirique des tests d'activité anti-inflammatoire sur un modèle animal in vivo bien connu des spécialistes: l'cedème sur l'oreille de souris à l'huile de croton. On a ainsi pu se rendre compte que l'une des algues testées présentait une activité anti-inflammatoire intéressante comparativement à une substance pharmaceutique anti-inflammatoire de référence: l'indométhacine, testée dans les mêmes conditions. L'algue ainsi isolée a été identifiée par cyto morphologie comme étant de la classe des cyanophycées; le genre et l'espèce ont été également déterminés: la cyanobactérie identifiée est Phormidium molle. Cette identification a été complétée par biologie moléculaire et on s'est ainsi rendu compte que sa séquence génomique 16S comprise entre les bases nucléotidiques 8 et 1522 correspondait à celle jointe en annexe (séquence 1). La présente invention concerne donc une composition cosmétique ou médicamenteuse caractérisée en ce qu'elle renferme en tant que substance active une quantité efficace d'un extrait d'une cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle, ou d'un extrait de celle-ci. Selon l'invention, cet extrait peut avantageusement être un extrait éthanolique ou un extrait dichlorométhane. Selon sa forme galénique, la composition conforme à l'invention renferme en règle générale entre 0.1 et 10 g/l de la cyanobactérie ou de l'extrait de celle-ci. Pour pouvoir évaluer l'activité de différents extraits bruts de 5 polarité variable de Phormidium molle, on a cultivé la cyanobactérie ainsi isolée, en photobioréacteur. L'activité anti-inflammatoire de ces extraits a été analysée sur le modèle de l'oreille de souris à l'huile de croton, comparativement à une molécule anti inflammatoire de référence: l'indométhacine. Ces tests ont été effectués de la manière suivante: Des souris albinos mâles (souche NMRI), pesant de 27 à 33 g, ont été maintenues sous un régime standard avec accès libre à l'eau. Ces souris ont été anesthésiées à l'aide de kétamine HC1 (150 mg/kg i.p.) 5 min avant l'application de la solution d'huile de croton (40 gg dans 10 ml d'acétone par dose) sur la face intérieure de l'oreille gauche. L'oreille droite a été gardée comme contrôle négatif. Après 5 min, 10 l d'une solution contenant la quantité voulue de substance à tester ou contenant 250 g d'indométhacine ont été 20 appliqués sur l'oreille traitée à l'huile de croton. Six heures après cette opération, c'est-à-dire le temps correspondant au maximum de l'oedème, les souris ont été sacrifiées par injection de pentobarbital (60 mg/kg, i.p.) et les oreilles ont été section-nées en suivant l'arête cartilagineuse située à la base de celles-ci. Les oreilles ont ensuite été pesées et l'activité anti-inflammatoire a été calculée en comparant les différences de poids des oreilles traitées et de la série témoin. On a ainsi évalué l'activité anti-inflammatoire de quatre ex-traits de Phormidium molle, à savoir dans l'éthanol, le dichlorométhane, l'eau et une solution d'acide trifluoroacétique à 0,1 ppm dans de l'eau. Ces différents extraits ont été obtenus de la façon décrite ci-dessous, en utilisant à chaque fois la souche algale sous forme lyophilisée. Pour obtenir les extraits éthanolique et dichlorométhane, le même mode opératoire a été utilisé : macération pendant 16 heures d'1 g de lyophilisat dans 100 ml du solvant choisi puis percolation par ce solvant jusqu'à l'obtention de 500 ml d'extrait. Cet extrait a ensuite été évaporé à siccité à l'évaporateur rotatif sous pression réduite. Les extraits suivants ont ainsi été obtenus: ELEth (éthanol) et ELD (dicholorométhane). Pour obtenir l'extrait aqueux ELDec, 1 g de lyophilisat a été extrait à l'eau chaude (70 C) sous agitation constante pendant 2 heures. L'extrait a ensuite été filtré puis concentré par évaporation sous pression réduite. Pour obtenir l'extrait trifluoroacétique ELC, on a procédé de la façon suivante: 500 mg de lyophilisat ont été introduits dans un tube Falcon de 50 ml et additionnés de 40 ml de solution d'acide trifluoroacétique à 0,1 ppm dans de l'eau. Le tube Falcon a alors été placé dans un congélateur à -32 C durant 12 heures. La solution a ensuite été décongelée à température am-15 biante, centrifugée à 5000 rpm et filtrée. Le filtrat a été lyophilisé alors que le résidu a été à nouveau soumis à une congélation / décongélation dans les conditions susmentionnées. On a pu constater que trois séries de congélations / dé-20 congélations permettent d'obtenir des extraits plus riches tant sur le plan quantitatif que qualitatif. Lors de la mise en oeuvre du modèle de l'oedème à l'huile de croton sur oreille de souris, il est important que le solvant utilisé pour dé- poser les substances à tester sur l'oreille s'évapore le plus rapidement possible. A cet effet, les extraits testés ont été mis en solution ou en suspension dans un mélange DMSO (diméthyl sulfoxyde) / éthanol / acétone (1: 2: 2). L'indométhacine qui constitue la molécule de référence a été 30 quant à elle mise en solution dans du Tris HCL 0,15 M. Ces tests ont permis d'aboutir aux résultats rassemblés dans le tableau ci-dessous: 2876030 4 Dose dème Ecart-type Inhibition Extrait ('/p) (%) (%) ( g/oreille) Témoin croton 40 75,8 0,9 ELC 800 52,0 7,3 31,4 ELDec 400 47,8 11,4 36,9 ELD 400 19,2 6,4 74,6. ELEth 400 21,3 5,5 71,9 Indométhacine (référence) 250 43.8 16.7 43.3 Ce tableau permet de mettre en évidence l'activité anti-inflammatoire des extraits testés, et en particulier des extraits éthanolique ELEth et dichlorométhane ELD. L'invention concerne par suite également l'utilisation d'une cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle ou d'un extrait de celle- ci pour la préparation d'une composition cosmétique ou médicamenteuse présentant une activité anti-inflammatoire. A titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif sont décrites ciaprès deux formules centésimales contenant la cyanobactérie io Phormidium molle ou l'extrait ELD obtenu à partir de celle-ci. Formule 1 DENOMINATION INCI Water (Evanum aqua) Glycérin Caprylic/Capric Triglycéride Beta Sitosterol Cetearyl Glucoside, Cetearyl Alcohol Hydrogenated Palm Oil Polyacrilamide (and) C13-C14 Isoparaffin nd) Laureth-7 Citric Acid Triethanolamine Capryloyl Glycine P-Anisic acid Levulinic acid Caprylic/Capric glycerides Phenoxyethanol (and) Methyl paraben d) Butyl paraben (and) Ethyl paraben (and) Propyl paraben Tocopherol Parfum Sodium dehydroacetate Phormidium molle (extrait ELD) Méthylparaben Propylparaben Sorbic acid 60.99 5,00 15,00 0,10 6,00 5,00 2,50 0,01 1,35 1,00 0,30 0,50 0,15 0,50 0,10 0,10 0,10 1,00 0.15 0.05 0.10 CARBOMER 0.300 METHYLPARABEN 0.150 PARFUM (fragrance) 0.100 SORBIC ACID 0.100 PROPYLPARABEN 0.050 Formule 2 INCI nomenclature WATER (EVANUM AQUA) 71.200 CETEARYL ALCOHOL/CETEARYL 5. 000 GLUCOSIDE 3.000 CAPRYLIC/CAPRIC TRIGLYCERIDE TRIETHANOLAMINE à 50% 2. 100 MACADAMIA (MACADAMIATERNIFOLIA) 2.000 SEED OIL 2.000 GLYCERIN MINERAL OIL (PARAFFINUM LIQUIDUM 1.000 TOCOPHERYL ACETATE 2.000 METHYLENE BIS-BENZOTRIAZOLYL 2.000 TETRAMETHYLBUTYLPHENOL 1.500 CYCLOMETHICONE/DIMETHICONOL PHORMIDIUM.MOLLE 2.000 BEESWAX (CERA ALBA) 1. 000 CL 75125 1.000 ASCORBIC ACID (pulvérulent) 1.000 METHYLMETHACRYLATE 1. 000 CROSSPOLYMER 1.000 DIMETHICONE/DIMETHICONOL PHENOXYETHANOL/METHYLPARABEN/ 0.500 PROPYLPARABEN/ETHYLPARABEN/BUT YLPARABEN/ISOBUTYLPARABEN Selon l'invention on a également évalué l'activité antiproliférative d'extraits de Phormidium molle in vitro par des tests qui ont été réalisés sur des lignées de cellules tumorales issues d'un cancer bron- cho-pulmonaire de type épidermoïde non à petites cellules . Ces cancers broncho-pulmonaires se caractérisent par un temps de doublement particulièrement long pouvant atteindre plusieurs mois; cette caractéristique fait qu'ils sont très résistants aux traitements actuels qui ciblent en priorité les cellules à croissance rapide de sorte que malgré des progrès récents, leur traitement reste décevant, les taux de réponse faibles et les récidives nombreuses. Il serait par suite souhaitable de pouvoir disposer de nouvelles stratégies thérapeutiques mieux adaptées à ces tumeurs de croissance lente. Dans ce contexte, les chercheurs ont développé expérimentalement différents modèles cellulaires de cancers broncho-pulmonaires de type épidermoïde non à petites cellules . L'un des premiers modèle cellulaire de ce type de cancer, qui est utilisé dans un grand nombre de laboratoires de cancérologie et a été proposé par le National Cancer Institute (NCI) correspond à la lignée A 549 (adénocarcinome d'épithélium pulmonaire réf. Collection ATCC n CCL 185). Un autre modèle expérimental développé par le laboratoire de pharmacologie marine du Dr. Roussakis de l'université de Nantes, à partir d'une biopsie prélevée chez un malade, est décrit dans la publication Roussakis, C., Gratas, C., Audouin, A.F., Le Botreff, J. Dabouis, C., Andre, M.J., Moyon, E., Vo, N.H., Pradal, G. & Verbist, J.F. (1991). Study of in vitro drug sensitivity on a newly established cell line from a primary bronchial epidermoid carcinoma of human origin (NSCLCN6). Anticancer Res, 11, 2239-44. Cette lignée cellulaire dénommée NSCLC-N6-L16 a la particularité de présenter de fortes similitudes avec les caractéristiques des tumeurs primaires in situ des patients et en particulier de posséder un temps de doublement très long (48 heures in vitro et 12 jours in vivo chez la souris nude) ce qui la rapproche de ce qui est observé in situ. Dans le cadre de l'invention, on a réalisé des tests de cyto toxicité sur ces deux lignées cellulaires de façon à évaluer l'action de différents extraits de Phormidium molle sur la prolifération des cellules cancéreuses, et à déterminer si ces extraits permettent de diminuer de façon significative cette prolifération. Lors de ces tests, on a déterminé la concentration inhibant 50 % de la prolifération cellulaire (CI50). Il est à noter que l'on considère en règle générale qu'un ex-trait brut présentant une activité intéressante possède une CI50 comprise entre 20 et 70 gg/ml. On a ainsi réalisé à partir d'un lyophilisat de Phormidium molle deux extractions respectivement dans l'éthanol et dans le dichlorométhane. Ce protocole utilisé pour les extractions de la cyanobactérie correspond à celui préconisé par le NCI pour le screening des activités anti cancéreuses à partir d'extraits naturels. Sur les premières séries d'expériences, l'extrait brut éthanolique ne semble révéler aucune activité. En revanche, l'extrait dichlorométhane a révélé une activité antiprolifératrice: en effet, les CI50 évaluées lors de ces tests ont été de 45,7 2 gg/ml pour la lignée NSCLC-N6 et de 65,5 8,2 g/ml pour la lignée A549; ces valeurs correspondent à celles d'extraits bruts actifs. L'extrait dichlorométhane ayant révélé une activité anti- prolifératrice a ensuite été soumis à une semi purification par fractionne-ment sur colonne de silice (chromatographie sur colonne). Les différentes fractions ont été séparées par passage de solvants d'élution de polarité croissante; les différentes molécules ont donc été séparées en fonction de leur affinité pour le solvant ou la silice (phase stationnaire polaire). On a ainsi obtenu quatre sous extraits F1, F2, F3 et F4. Le détail du fractionnement effectué dans le cadre de cette semipurification ainsi que les CI50 en gg/ml observées sur les lignées NSCLCN6 et A549 sont précisés dans le tableau ci-dessous: CI50 en gg/ml Fraction Solvant NSCLC-N6 A549 F1 CH2C12 100 % - - F2 CH2C12 / Acétone 70: 30 32 0,1 30,7 0,7 F3 CH2C12 / Acétone 30: 70 - - F4 Méthanol 100 % 14,8 1,3 19,5 1,1 II résulte de ce tableau que les fractions F2 et F4 présentent une activité intéressante. Il est à noter qu'à ce stade de purification chaque fraction contient encore un grand nombre de molécules inactives pouvant masquer 5 l'activité réelle du ou des principes actifs. Compte tenu de ces résultats, l'invention concerne égale-ment l'utilisation d'une cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle ou d'un extrait de celle-ci pour la préparation d'une composition médicamenteuse présentant une activité anti proliférative. REVENDICATIONS 1 ) Composition cosmétique ou médicamenteuse, caractérisée en ce qu' elle renferme en tant que substance active une quantité efficace d'une 5 cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle, ou d'un extrait de celleci. 2 ) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que 10 l'extrait est un extrait éthanolique. 3 ) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait est un extrait dichlorométhane. 4 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu' elle renferme entre 0.1 et 10 g/1 de la cyanobacteria ou de l'extrait de celle-ci. 5 ) Utilisation d'une cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle, ou d'un extrait de celle-ci pour la préparation d'une composition cosmétique ou médicamenteuse présentant une activité anti-inflammatoire. 6 ) Utilisation d'une cyanobactérie d'eau douce: le Phormidium molle, ou d'un extrait de celle-ci, pour la préparation d'une composition médicamenteuse présentant une activité antiproliférative.