Brevet FR2873714A1 — publié le 20060203

La présente invention concerne un milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles comprenant du tétrathionate ou un de ses sels et au moins un sel de magnésium, ainsi qu'un procédé de détection de salmonelles dans un échantillon mettant en oeuvre ledit milieu d'enrichissement sélectif. Les salmonelles sont à l'origine de maladies animales transmissibles à l'homme par l'alimentation notamment et dont le développement peut induire des effets pathogènes. Elles sont la source d'accidents, notamment alimentaires, recensés depuis longtemps. Leur détection est donc très importante, notamment dans l'industrie alimentaire, au niveau du contrôle des eaux, ou en médecine. Différents procédés permettent la mise en évidence de la présence de salmonelles à partir d'un échantillon suspecté. Certains de ces procédés comprennent une étape de développement des salmonelles éventuellement présentes, par la mise en contact dudit échantillon avec un milieu d'enrichissement spécifique des salmonelles. Les milieux d'enrichissement, liquides, semi-solides ou solides ensemencés avec un produit polymicrobien renfermant des salmonelles, permettent d'augmenter la croissance et la proportion des salmonelles, et ensuite de les détecter dans un échantillon. Depuis de très nombreuses années, trois familles de formules de milieux d'enrichissement sont généralement utilisées contenant respectivement comme agent sélectif soit du sélénite (depuis 1936), soit du tétrathionate, éventuellement formé extemporanément à partir de thiosulfate et de solution d'iodo-iodurée (depuis 1923), soit un sel de magnésium à concentration élevée (depuis 1956). Cependant, les milieux d'enrichissement de salmonelles disponibles sur le marché ont des efficacités variables en fonctions de divers facteurs tels que les souches à détecter, le type d'échantillon ou la flore compétitive qui se trouve dans ces échantillons. De plus, actuellement l'un des principaux axes de recherche et de développement technologique porte sur la rapidité de détection des salmonelles. Ainsi, les techniques les plus récentes de puces à ADN permettent non seulement de procéder à des tests de présence/absence mais aussi de quantifier la présence bactérienne éventuelle. Cependant ses techniques sont complexes à mettre en oeuvre, coûteuses et ne donnent pas d'indications sur la viabilité des bactéries. D'où un délai supplémentaire dans la détection. Ainsi, il existe actuellement un besoin pour une technique de détection des salmonelles qui soit efficace et ne présente pas de variation de l'efficacité en fonctions de divers facteurs et qui permette une détection rapide des salmonelles vivantes. De manière surprenante et inattendue, l'inventeur a montré que deux agents sélectifs des salmonelles, le tétrathionate et un sel de magnésium sont compatibles entre eux qu'ils peuvent être combinés pour obtenir un milieu d'enrichissement efficace et robuste, avec des performances améliorées par rapport aux méthodes classiques d'enrichissement sur milieu sélectif. En outre, un intérêt supplémentaire de la méthode décrite est que le délai total pour la mise en évidence de la présence ou de l'absence de salmonelles à partir de l'échantillon testé peut être réduit à 44 h maximum tandis que les méthodes traditionnelles nécessitent un premier délai de 48 h (24 h de culture en milieu de revivification puis 24 h de culture en milieu sélectif) avant une étape d'isolement sur milieu sélectif (18-24 h), soit un total de 66 à 72 h. Un objet de la présente invention est donc un milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles caractérisé en ce qu'il comprend du tétrathionate ou un de ses sels, et au moins un sel de magnésium. Dans le milieu d'enrichissement de l'invention, le sel de magnésium est utilisé à une concentration suffisante pour créer une forte pression osmotique dans ledit milieu. Ainsi, tout autre composé ayant un effet similaire sur la pression osmotique en milieu aqueux pourrait également être utilisé en remplacement ou en complément du sel de magnésium. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit sel de magnésium est présent dans le milieu d'enrichissement de l'invention à une concentration comprise entre 0,1 et 50 g/1, de préférence 2 et 40 g/1 et plus préférentiellement encore entre 7 et 35 g/1. Le sel de magnésium est choisi de préférence parmi le carbonate de magnésium, le chlorure de magnésium ou le sulfate de magnésium. Selon un mode préféré de réalisation de la présente invention, le tétrathionate ou l'un de ses sels est présent dans le milieu d'enrichissement de l'invention à une concentration comprise entre 0,1 et 40 g/1, de préférence 0,5 et 30 g/1 et plus préférentiellement encore entre 1 et 25 g/1. Le sel de tétrathionate est choisi de préférence parmi le tétrathionate de potassium ou le tétrathionate de sodium quel(s) que soi(en)t le(s) sel(s) de magnésium utilisé(s). La présente invention a également pour objet un procédé de détection de salmonelles dans un échantillon comprenant les étapes suivantes: revivification des salmonelles par incubation dudit échantillon dans un bouillon de revivification, enrichissement des salmonelles par incubation d'une portion aliquote du milieu de revivification dans un milieu d'enrichissement sélectif des salmonelles, et isolement des salmonelles, caractérisé en ce que le milieu d'enrichissement sélectif utilisé pour l'étape d'enrichissement est tel que défini selon la présente invention. L'étape de revivification (ou pré-enrichissement) est l'étape permettant la croissance et la multiplication de salmonelles, y compris de celles en dormance. Cette étape permet également aux bactéries stressées de récupérer leur stabilité. Dans le cadre du procédé de détection de salmonelles de la présente invention, la durée de cette étape est considérablement réduite (environ 4 h selon l'invention contre environ 24 h selon l'art antérieur) en raison de la qualité de l'étape d'enrichissement subséquente. En effet, le milieu d'enrichissement de l'invention permet un enrichissement en salmonelles du milieu revivifié tel que l'étape de revivification n'a pas besoin d'être réalisée au-delà d'environ 4 h pour jouer pleinement son rôle. Il est à souligner que cette étape de revivification n'a aucun caractère obligatoire et est facultative dans le cadre de la présente invention. Elle présente toutefois un intérêt particulier quand le procédé de l'invention est mis en oeuvre dans le domaine de l'agroalimentaire car la sécurité alimentaire recherchée nécessite une détection fiable des salmonelles éventuellement présentes dans l'échantillon testé, y compris des salmonelles en dormance. L'étape d'isolement des salmonelles est, quant à elle, réalisée de façon classique bien connue de l'homme du métier. Compte tenu de la forte teneur en salmonelles obtenue dans le milieu à l'issue de l'étape d'enrichissement, cette étape d'isolement n'a pas besoin d'être sélective (c'est-à-dire de permettre une détection de salmonelles par rapport à d'autres bactéries) et peut être seulement spécifique des salmonelles. Cette étape d'isolement peut par exemple être réalisée par des méthodes immunologiques ou PCR mais également par des méthodes très spécifiques telles que celles réalisées sur milieux gélosés de détection de salmonelles (Hektoen agar, etc). Dans un mode particulier de réalisation dudit procédé, l'étape d'isolement comprend un mode opératoire d'analyse choisi dans le groupe consistant en des analyses immunologiques enzymatiques, des analyses d'hybridation de sondes d'acides nucléiques, des analyses en culture pure, des analyses utilisant des indicateurs biochimiques notamment révélés par des méthodes colorimétriques et des analyses d'immunoimmobilisation. On peut citer comme exemple d'analyse d'isolement la technique. Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour tester des échantillons alimentaires, des boissons, des échantillons environnementaux solides, liquides tels que l'eau, ou aérien ou des échantillons cliniques. L'invention ne se limite pas à la seule description ci-dessus et l'exemple ci- après est uniquement illustratif. EXEMPLE: Comparaison d'un milieu d'enrichissement liquide ne contenant que le tétrathionate au titre de facteur sélectif avec un milieu d'enrichissement liquide contenant du tétrathionate et un sel de magnésium conformément à l'invention. Chaque échantillon est constitué de 25 ml de yaourt ensemencés dans un cas avec un mélange de 100 Salmonella et de 1 000 000 E. coli et dans un autre cas de 100 Salmonella et de 1 000 000 Citrobacter de telle sorte que les salmonelles sont dans une proportion de 1 pour 10 000 par rapport à la flore compétitive. 1. Revivification Chaque échantillon est mélangé à 225 ml d'un bouillon de revivification de formule (en grammes par litre d'eau) : peptone 5; NaCl 5; carbonate de calcium 10. Le mélange est mis à incuber à 37 C pendant 4 h. 2. Enrichissement ml du susdit mélange sont récupérés dans un récipient et l'on ajoute: - soit, dans le cas du milieu témoin , 0,38 g d'un supplément de formule (en grammes par litre d'eau) : bile 8; carbonate de calcium 10; Vert brillant 0,07 et tétrathionate 20, soit, dans le cas de l'invention, 0,31 g d'un supplément de formule (en grammes par litre d'eau) : bile 8; carbonate de calcium 10; Vert brillant 0,07; tétrathionate 3 et chlorure de magnésium 10 (Tableau 1). Tableau 1 En gll Bile Carbonate Vert Tétrathionate Chlorure de de calcium brillant magnésium Milieu 8 10 0,07 20 - témoin Milieu selon 8 10 0,07 3 10 l'invention L'enrichissement est réalisé par une incubation du milieu à 37 C pendant 22 h. 3. Isolement Environ 10 microlitres de la culture obtenue en 2. sont isolés sur milieu d'isolement différentiel et, après 18-24 h d'incubation à 37 C, la flore Salmonella d'une part et la flore compétitive d'autre part sont dénombrées (Tableau 2). Tableau 2 Proportion Salmonella l flore compétitive Mélange Salmonella Mélange Salmonella et E. coli et Citrobacter Milieu témoin 85 % 1 % Milieu selon l'invention 100 % 80 % 7 REVENDICATIONS 1. Milieu d'enrichissement sélectif de salmonelles caractérisé en ce qu'il comprend du tetrathionate ou un de ses sels et au moins un sel de magnésium. 2. Milieu selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'il comprend le sel de magnésium à une concentration comprise entre 0,1 et 50 g/l, de préférence 2 10 et 40 g/1 et plus préférentiellement encore entre 7 et 35 g/1. 3. Milieu selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le sel de magnésium est choisi parmi le carbonate de magnésium, le chlorure de magnésium et le sulfate de magnésium. 4. Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il comprend le sel de tétrathionate à une concentration comprise entre 0,1 et 40 g/1, de préférence 0,5 et 30 g/1 et plus préférentiellement encore entre 1 et 25 g/l. 5. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le sel de tétrathionate est choisi parmi le tétrathionate de potassium et le tétrathionate de sodium. 6. Procédé de détection de salmonelles dans un échantillon comprenant 25 les étapes suivantes: enrichissement des salmonelles par transfert d'une portion aliquote du milieu de revivification incubé dans un milieu d'enrichissement sélectif et incubation, et isolement des salmonelles, caractérisé en ce que le milieu d'enrichissement sélectif utilisé pour l'étape d'enrichissement est tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape d'enrichissement est précédée d'une étape de revivification par ensemencement de l'échantillon sur un milieu de revivification, et incubation, 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que l'étape d'isolement comprend un mode opératoire d'analyse choisi dans le groupe consistant en des analyses immunologiques enzymatiques, des analyses d'hybridation de sondes d'acides nucléiques, des analyses en culture pure, des analyses utilisant des indicateurs biochimiques notamment révélés par des méthodes colorimétriques et des analyses d'immunoimmobilisation.