Brevet FR2884259A1 — publié le 20061013

La présente invention concerne un procédé de détection du virus PVY consistant en un test SNP de mutations correspondant à R/K400 et D1E419, la présence d'au moins une desdites mutations étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente pouvant être responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées, en particulier chez la pomme de terre. Le virus de la pomme de terre Y (PVY), appartenant à la famille Potyvirus, est l'un des pathogènes des plantes les plus importants d'un point de vue économique (Milne, 1988; Shukla et al., 1994). Tout d'abord signalé dans les années 1930 chez la pomme de terre (Smith, 1931), le PVY est maintenant distribué dans le monde entier sur de nombreux hôtes différents. Le virus est transmis par des pucerons selon le mode non persistant (Sigvald, 1984) et infecte plusieurs espèces de plantes cultivées appartenant à la famille des Solanacées (De Bokx et Huttinga, 1981; Brunt et al., 1996). Le génome viral est constitué d'une molécule d'ARN monocaténaire de polarité positive d'environ 10 kb de longueur, avec une protéine VPg liée de manière covalente à son extrémité 5' et une queue poly-A à son extrémité 3'. L'ARN viral code une polyprotéine, qui est clivée en 9 produits par trois protéases codées par le virus (Dougherty et Carrington, 1988). Selon l'hôte dont on les a récolté à l'origine, les isolats de PVY ont été classés en quatre souches différentes correspondant aux souches pomme de terre, piment, tabac et tomate. Au sein de la souche pomme de terre, les isolats ont été caractérisés sur la base de leur propriétés biologiques (symptômes et réponses à différentes sources de résistance). Cette caractérisation a permis de définir différents groupes de virus. Ainsi, trois groupes de souches de pomme de terre: PVYN, PVY et PVYc (De Bokx et Huttinga, 1981) ont été identifiées. Ces groupes sont notamment définis par le caractère systémique ou local des symptômes induits sur Nicotiana tabacum et Solanum tuberosum. Les isolats appartenant au groupe PVYN induisent une nécrose des nervures sur les feuilles de N tabacum cv. Xanthi et une très légère marbrure, avec seulement rarement des feuilles nécrotiques sur pomme de terre. Les isolats PVY induisent seulement des symptômes de marbrure et de mosaïque sur tabac et une mosaïque légère à grave et une chute des feuilles sur pomme de terre. Finalement, les isolats PVYc induisent des symptômes de stries nécrotiques sur certains cultivars de pomme de terre. Les isolats PVYN et PVY sont responsables de pertes à haut rendement allant jusqu'à 40 à 70 % dans le cas des pommes de terre. Ainsi, la détection et l'identification efficace des isolats de PVY nécrotiques et non nécrotiques dans les cultures de pomme de terre sont un problème majeur pour les producteurs. La caractérisation des isolats pomme de terre de PVY à tout d'abord reposé sur des tests biologiques. Cependant, une telle approche prend à la fois du temps et de l'espace et n'est pas facilement adaptable soit pour un diagnostic rapide soit pour un test à grande échelle. Puis, pour remplir les besoins en un test fiable et rapide, des tests immuno- enzymatiques en sandwich à double ou triple anticorps (DAS-ou TASELISA), utilisant des anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux (Gugerli et Fries, 1983; Matt et Huttinga, 1987; Oshima et al., 1990; Sanz et al., 1990; Singh et al., 1993; Ellis et al., 1996), une approche par immuno microscopie électronique (Walkey et Webb, 1984) et par agglutination au latex (Berckx, 1967; Tallay et al., 1980) on été développés. Néanmoins, aucun de ces tests ne s'est avérer capable de discriminer les isolats capable ou non d'induire un nécrose (Mac Donald et Singh, 1996; Boonham et Barker, 1998; Ounouna, 2002). En effet, la récente émergence de nouveaux variants de PVYN comprenant les isolats PVYN de la nécrose en tache annulaire sur tubercule (Le Romancer et al., 1994; Kerlan et al., 1999) et les isolats PVYN-W (Chrzanowska, 1991) a souligné les limites des outils sérologiques disponibles. En effet, les anticorps monoclonaux et/ou polyclonaux spécifiques de PVY placent les isolats PVYN-W dans le groupe PVY . De plus, les outils sérologiques ne sont pas capables de faire la distinction entre les isolats PVYNTN et les isolats PVYN. Quatre séquences complètes de PVYN (Robaglia et al., 1989; Jakab et al., 1997; Abdelmaksoud et Gamal Eldin, 2002; Nie et Singh, 2003), deux séquences complètes de PvY' (Thole et al., 1993; Nie et Singh, 2003) et une séquence complète de PVY (Singh et Singh, 1996) (numéro d'accès: PVYN-Fr: Do00441; PVYN-605: X97895; PVYN-Egypte: AF522296; PVYN-Jg: AY166867; PVYNTN-H: M95491; PVYNTN-Tu660: AY16866; PVYO-139: U09509) ont été publiées. En complément des outils sérologiques décrit ci-dessus, des tests moléculaires ont été développés par différentes équipes. Cependant aucun de ces outils n'est capable de caractériser précisément les isolats de PVY inducteurs de nécroses. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des outils moléculaires plus rapides, fiables et plus spécifique pour la détection des virus capable d'induire la nécrose de la plante infectée. En d'autres termes, l'invention apporte pour la première fois un test permettant une telle discrimination entre les différents isolats et plus particulièrement une détection très sensible des PVY selon leurs propriétés biologiques différentes (par exemple, nécrose (YN) ou marbrure (Y )) liées aux propriétés biologiques réelles utilisées dans la classification du PVY. Dans le cadre de nos investigations, nous avons découvert deux mutations chez ces différents isolats directement impliquées dans la nécrose, notamment la nécrose tuberculaire de la pomme de terre, et d'autres plantes de la famille des Solanacées. Cette découverte n'a été rendue possible que par une approche de génétique inverse lors de laquelle des mutations d'acides aminés situés dans la partie carboxy-terminale de la protéine HC-Pro ont été identifiées comme étant responsables de la nécrose. L'invention ouvre désormais la voie à une détection systématique des isolats de PVY nécrotiques et non nécrotiques, ce qui permettra aux producteurs de diminuer très sensiblement le risque de perte de récolte. DESCRIPTION Dans la description, on fera référence à la numérotation correspondant à la séquence NCBI numéro d'accession X97895 (Jakab G., Droz E., Brigneti G. , Baulcombe D. and Malnoe P. Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605, a Swiss necrotic isolate of potato virus Y. J. Gen. Virol. 78 (Pt 12), 3141-3145 (1997)). La séquence nucléotidique et la séquence peptidique sont présentées respectivement aux SEQ ID No 1 et 2. Pour les souches PVY , une séquence de référence est accessible dans NCBI sous le numéro U09509 (Singh M. and Singh R.P., Nucleotide sequence and genome organization of a Canadian isolate of the common strain of potato virus Y (PVYo). Can. J. Plant Pathol. 18, 209-214 (1996) (SEQ ID No 3 et 4), mais la numérotation se fera selon Jakab et al. (1997) par alignement. Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne un procédé de détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, b) amplification RT-PCR d'une région de l'ARN viral de PVY comprenant les codons 738 et 757 (SEQ ID No 1 et 3) correspondant aux acides aminés 400 et 419 respectivement de la protéine HC-Pro (SEQ ID No 2 et 4, fig 7A et 7B), c) détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à R/K400 et D/E419 au moyen i) d'au moins une sonde marquée 30 spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et ii) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent, la présence d'au moins une desdites mutations R/K400 et D/E419 étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées. Grâce à ce procédé, on détecte en un seul test les 4 génotypes/phénotypes suivants: - [R400, D419] (souche incapable d'induire la nécrose) - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, E419] (souche induisant la nécrose) Des exemples de séquences détectées comportant une de ces combinaisons de polymorphismes sont présentés à la figure 6B (SEQ ID No 14 à 19). A titre d'exemple, on peut mettre en oeuvre ce procédé chez la pomme de terre. Dans ce cas, la détection à l'étape d) de souches de PVY [R400, E419] et/ou [K400, D419] et/ou [K400, E419] est une indication que la plante de pomme de terre est contaminée avec une ou plusieurs souche(s) pouvant induire des nécroses tuberculaires (Figure 6A). Dans un mode préféré de réalisation, on utilise comme sonde i) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 (correspondant à R/K400), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon: K (Lysine) : AAA, AAG De préférence, on utilise une sonde comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence capable de s'hybrider avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 7: ctcaaatgaaaatattctac On peut utiliser en outre une sonde i) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AGA avec le polymorphisme G2213. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon: R (Arginine) CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG A ce effet, on peut utiliser une sonde contrôle comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence capable de s'hybrider avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 8: ctcaaatgagaatattcta Avantageusement, la sonde i) et la sonde i) contrôle sont marquées différemment. Egalement dans un mode préféré de réalisation, on utilise comme sonde ii) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon: E (Glutamique) : GAA, GAG De préférence, on utilise une sonde comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2271, notamment avec la SEQ ID No 9 ou SEQ ID No 10 qui sont des sondes spécifiques YN 5'- cgatcacgaaacgcagaca - 3' (SEQ ID No 9) 5'atcacgaaacgcagaca - 3' (SEQ ID No 20) On peut utiliser en outre une sonde ii) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAC avec le polymorphisme C2271. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon: D (Aspartique) : GAT,GAC A ce effet, on peut utiliser une sonde ii) contrôle comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment avec la SEQ ID No 10: 5'accatgaçactcaaa -3' ou avec la SEQ ID No 21: 5'- tgaccatgaçactcaa -3' Avantageusement, la sonde ii) et la sonde ii) contrôle sont marquées différemment. On peut utiliser des sondes telles que décrites ci-dessus comportant un marqueur fluorescent (reporter) et une molécule captant le signal lorsqu'elle se trouve à proximité du marqueur fluorescent (quencher). Les étapes de RT et de PCR ont lieu l'une après l'autre dans le même tube. Lors de l'étape b), la transcription inverse est effectuée avec au moins 2 ou 4 paires d'amorces sens et antisens, plus particulièrement au moins une première paire permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY-N, au moins une deuxième paire permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYo. Ladite première paire d'amorces (FpN et RpN) comprend de préférence une amorce sens FpN et une amorce antisens RpN pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 1 ou 5. L'amorce sens FpN se situe de préférence en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpN se situe de préférence en aval du codon 757 polymorphique. Dans une autre alternative, on met en oeuvre deux premières paires: - FpN l en amont du codon 738 - RpNl en aval du codon 738 - FpN2 en amont du codon 757 - RpN2 en aval du codon 757 Ladite deuxième paire d'amorces (FpO et RpO) comprend de préférence une amorce sens FpO et une amorce antisens RpO pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 3 ou 6. L'amorce sens FpO se situe de préférence en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpO se situe de préférence en aval du codon 757 polymorphique. Dans une autre alternative, on met en oeuvre deux deuxièmes paires: - FpOl en amont du codon 738 - RpOl en aval du codon 738 - FpO2 en amont du codon 757 - RpO2 en aval du codon 757 Ce mode de réalisation préféré n'est pas limitatif. En effet, l'invention vise également un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel l'étape b) comprend l'utilisation de nombreuses paires d'amorces couvrant l'ensemble du spectre des virus PVY. Un exemple de réalisation est illustré à la figure 2. Parmi ces amorces, on peut citer les SEQ ID No 11 et 12. Dans un mode préféré de réalisation, les amorces des deux paires sont choisies parmi: 20 Amorces sens pour YN SEQ ID No 22 F1: 5'ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGT-3' SEQ ID No 23 F2: 5'ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTC-3' SEQ ID No 24 F3: 5'CATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTA-3' Amorces anti-sens pour YN: SEQ ID No 28 R1: 5'-GTGAGCCAAACGAGTCAACTACAT-3' SEQ ID No 29 R2: 5'TTTGTGAGCCAAACGAGTCAACTA-3' SEQ ID No 30 R3: 5'-TTGTGAGCCAAACGAGTCAACT-3' Amorces sens pour YO SEQ ID No 25 F1: 5'-GCAGAGCTGCCTAGTTTATTGGTT-3' SEQ ID No 26 F2: 5'-ATGATGCAGAGCTGCCTAGTTTATT-3' SEQ ID No 27 F3: 5'TGCAGAGCTGCCTAGTTTATTGG-3' Amorces anti-sens pour YO: SEQ ID No 31 R1: 5'GCCAAATGAGTCAACCACATGA-3' SEQ ID No 32 R2: 5'-AGCCAAATGAGTCAACCACATG-3' SEQ ID No 33 R3: 5'-CCAAATGAGTCAACCACATGACA-3' L'invention porte également sur un procédé de sélection sanitaire de plants appartenant à la famille des Solanacées susceptibles d'être contaminés par des souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires, notamment de nécroses tuberculaires chez la pomme de terre comprenant la mise en oeuvre systématique du procédé de détection mentionné ci-dessus sur les semences, plants et/ou plantes susceptibles d'être mis en culture et procéder à la destruction ou mise sous quarantaine desdites semences, plants ou plantes contaminés avec une souche présentant au moins un des polymorphismes correspondant à - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, E419] (souche induisant la nécrose) Le contrôle sanitaire peut être effectué comme mentionné ci-dessus avec des semences, plants et/ou plantes importés dans un territoire donné, par exemple entrant 20 dans l'Union Européenne ou au Canada ou encore provenant de zones à risque. Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit de détection de la présence ou de l'absence du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY . - au moins une sonde marquée i) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et au moins une sonde marquée ii) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) étant telle que décrite ci- dessus et présentant des marqueurs émettant des signaux de fluorescence différents. Le kit peut comprendre également les sondes i) et ii) de contrôle telles que décrites précédemment, les sondes i) et contrôle i) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents, les sondes ii) et contrôle ii) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents. Le kit peut également comprendre des moyens d'extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, par exemple un tampon de broyage et un tampon d'extraction des ARN viraux tels que décrits ci-après. Le Kit peut également comprendre les réactifs nécessaires à l'amplification et/ou un dispositif de détection qualitative et quantitative des signaux de fluorescence. A titre d'exemple, le kit peut comprendre une solution comprenant les amorces pour qu'elles puissent être utilisées à une concentration optimale se situant entre 400 nM et 1200 nM, notamment 800 nM et une solution comprenant les sondes à une concentration se situant entre 100 nM et 300 nM, notamment 200 nM. Dans un autre aspect, l'invention se rapporte à une sonde ou amorce et aux collections de sondes et collection d'amorces mentionnées ci-dessus. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation desdites sondes et amorces et collections de sondes et amorces pour la détection de la présence ou de l'absence du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, notamment chez la pomme de terre et aussi l'aubergine, la tomate, les piments ou le tabac. Ainsi, dans la présente invention, nous proposons un dosage à base de polymorphisme nucléotidique pour la détection des isolats PVYN et PVY , qui cible un marqueur moléculaire spécifique lié à la capacité des membres du groupe de PVYN à provoquer une nécrose. Le protocole développé comprend un mode opératoire rapide pour l'échantillonnage des plantes, un processus d'extraction de l'acide nucléique rapide ("feuille humide") et une réaction de RT-PCR fluorescente en une seule étape (en utilisant au moins deux sondes TagMan ), qui ne nécessitent pas de manipulation post- PCR. De telles caractéristiques font qu'il est possible d'effectuer jusqu'à 96 tests en moins de 3 heures, à partir de l'échantillonnage de la plante jusqu'à la génération des résultats diagnostiques. Le test de diagnostic à base de SNP tel que décrit ci-dessus a permis la détection fiable de 42 isolats de pomme de terre de PVY de 13 pays et a été capable de les assigner de manière correcte dans les groupes PVYN ou PVY . Les échantillons contenant plus de 104 copies de l'ARN de PVYN et/ou PVY ont été efficacement détectés par ce test et ce dernier rend possible la co-détection de PVYN et de PVY dans les infections mixtes. Ce nouvel outil de détection combine une sensibilité élevée des techniques de détection moléculaire avec rapidité (séries de RT-PCR effectuées en environ deux heures), simplicité (pas de kit d'extraction nécessaire pour la préparation de l'échantillon et mode opératoire sans gel) et une compatibilité avec les postes de travail robotiques utilisés pour les dosages sérologiques. Les principales améliorations offertes par ce test pour la détection de PVY sont tout d'abord le choix d'utiliser la technologie SNP, habituellement appliquée pour les dosages de discrimination allélique, les études de ségrégation génique et la cartographie chromosomique d'organismes diploïdes (pour une revue, voir Oefner, 2002). En outre, nous apportons pour la première fois un test permettant de détecter spécifiquement les isolats de PVY qui induisent la nécrose par rapport aux isolats avirulentes grâce à l'identification des caractéristiques des nucléotides polymorphes cités ci-dessus. Appliquée à des organismes haploïdes (tels que des virus à ARN simple brin), la technologie de l'invention a le potentiel d'identifier des échantillons contenant seulement une (visualisée comme homozygote) soit une combinaison de deux variants (considérées par le test comme hétérozygote) de la séquence polymorphe ciblée. Ainsi, l'invention porte également sur un lot de semences, plants et/ou plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de semences, plants ou plantes contaminés par le PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, E419] (souche induisant la nécrose). Parmi ces lots, l'invention vise des lots de tomates, piments, tabac, poivron et aubergines. De préférence, l'invention vise un lot de plants ou tubercules de pomme de terre, caractérisé en ce que qu'il est dépourvu de plants ou tubercules contaminés avec une souche de PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, E419] (souche induisant la nécrose). Les lots précités sont susceptibles d'être obtenus par la mise en oeuvre du procédé ou 25 du kit décrit ci-dessus. Pour la suite de la description, on fera référence aux légendes des figures. Légendes des figures Figure 1: Séquences encadrant les polymorphismes responsables de la nécrose Figure 2: Séquences de PVYN-605 et de PVY -139 utilisées comme cible dans un test à base de polymorphisme nucléotidique. Sont présentés les sites de liaison pour les amorces sens (FpN et FpO), les amorces anti-sens (RpN et RpO) et les deux sondes TagMan (SondeN et Sonde ). On a indiqué le nucléotide polymorphe A/G2213. L'indicateur spécifique (rapporteur) de la sonde (FAM et Vic pour la SondeN et la Sondé respectivement) est illustré par une carré gris et un cercle respectivement. Les quencheur, molécules de liaison à petit sillon non fluorescentes (MGB [Applied Biosystems]) liées à l'extrémité 3' des sondes fluorescentes, sont indiquées par des étoiles grises. a: les positions des nucléotides données sont comme dans Jakab et al., (1997) . Figure 3: Signal fluorescent brut (CFS) obtenu en utilisant des échantillons de contrôle positif (PVYN, PVY et YN/Y mélangés) et négatif (contrôle sans matrice). A. CFS associé avec des sondes spécifiques de PVYN(FAM) et PVY (Vic). Sont indiquées les valeurs moyennes et écarts types calculés avec quatre réplications de NTC, PVYN- 605 purs et PVY -139 purs. Les valeurs obtenues avec les deux réplicats des échantillons mélangés YN/Y sont listées. B. représentation schématique des données de CFS. Chaque point correspond aux données (FAM; Vic) associées à un des échantillons testés. On a défini quatre zones n'ayant pas de chevauchement selon la nature des échantillons testés. Figure 4: Représentation schématique des données fluorescentes brutes (A) cibles (B) et normalisées (C). Les triangles, les carrés et les cercles correspondent aux échantillons de PVY purs, NTC et PVYN purs. La quantité d'ARN de PVY théorique présente dans chaque échantillon testé est indiquée. FAMt et Vict correspondent aux seuils pour la détection efficace de PVYN et PVY respectivement. Les zones de détection et de caractérisation sont indiquées sur les graphiques bruts (A) et normalisés (C). Figure 5: Représentation graphique de la co-détection de PVYN et de PVY en utilisant des données fluorescentes cibles par SNP. Les limites de détection seuil pour PVYN et PVY sont indiquées par FAMt et Vict, respectivement. La détection simple de PVYN et ou PVY correspond aux zones O et O, respectivement. Les groupes de la zone 0 n'ont pas détecté d'échantillon. Les rapports YN/Y correspondant à 1/100, 1/10, 1, 10/1 et 100/1 sont représentés par des triangles, des cercles, des carrés, des étoiles et des losanges, respectivement. Figure 6: Analyse des propriétés nécrotiques des isolats PVY chimères sur pomme de terre. Figure 7: Sequence PVYN-605 et zone d'intérêt et HC-PRO A -Sequence nucleotidique (codon d'initiation de la traduction en gras, bases polymorphes d'interet en gras italique)B - Sequence en aa de la polyproteine (qui contient la proteine HC-Pro séquence soulignée), aa d'interet en gras. Figure 8: Sequence PVYO-139 et zone d'intérêt et HC-PRO A-Sequence nucleotidique (codon d'initiation de la traduction en gras, bases polymorphes d'interet en gras italique) B - Sequence en aa de la polyproteine (qui contient la proteine HC-Pro séquence souligné), aa d'interet en gras. Exemple 1: Origines des souches de PVY et préparation des échantillons 1. 1 Virus et plantes hôtes On a utilisé dans cette étude 42 isolats de PVY de pomme de terre caractérisés de manière sérologique et moléculaire appartenant aux différents groupes de PVY (PVYN ou PVY ) et variants (YN7" ou YN-W) tableau 1). On a utilisé PVYN-605 (Jakab et al., 1997) et PVY -139 (Singh et Singh, 1996) comme isolats de référence pour les groupes PVYN et PVY respectivement. On les a utilisé pour développer le test alors qu'on a utilisé d'autres isolats de PVY dans le processus d'évaluation du dosage développé. On a maintenu les isolats dans une serre par inoculation mécanique sur Nicotiana tabacum cv. Xanthi. On a utilisé ce dernier comme plante test dans un test biologique pour la caractérisation des isolats PVYN et PVY , sur la base de leur capacité ou leur incapacité à induire des symptômes de nécrose des feuilles. Tableau I: Origine et références des isolats PVY testés dans le cadre de l'invention Souche isolat origine référence N O N-W NTN 605 Switzerland C3VN Scotland Irl Ireland 607 The Netherlands P21 Tunisia B203 France Sp20 Spain Sp125 Spain TVNQ Canada B4 France B7 France B8 France 139 Canada Irl Ireland Sc Scotland N1702 The Netherlands Lw Poland B18 France i-P Poland N242 France B11 France Sp17 Spain B15 France N5 France N10 France N12 France N15 France N324 France N341 France N362 France Lb Lebanon FrOrl France H Hungary CzLukl Czech Republic Sp47 Spain Lx2 Tunisia B6 France B9 France N4 France N18 France May2 France Dk Denmark Jakab et al., 1997 Glais et al., 1996 Glais et al., 1996 Glais et al., 1996 Fakhfakh et al., 1996 Glais et al., 1998 Blanco-Urgoiti et al., 1998 Blanco-Urgoiti et al., 1998 Mc Donald and Kristjansson, 1993 From this report From this report From this report Singh and Singh, 1996 Glais et al., 1998 Glais et al., 1998 Glais et al., 1998 Glais et al., 1998 From this report Glais et al., 1998 Glais et al., 1998 Glais et al., 2002 Blanco-Urgoiti et al., 1998 From this report From this report From this report From this report From this report From this report From this report From this report Glais et al., 1996 Glais et al., 1996 Glais et al. , 1996 Glais et al., 1996 Blanco-Urgoiti et al., 1998 From this report Fromthis report From this report From this report From this report From this report From this report 1.2 Préparation de l'échantillon On a extrait le jus brut des plantes de N. tabacum sains ou infectées par PVY en pressant les feuilles (0,5 g) dans une presse à cylindre, en présence de 1 mL de tampon de broyage froid (PBS; 0,05 % (v/v) de Tween 20). On a immédiatement utilisé ces échantillons pour effectuer un test ELISA ou une extraction des acides nucléiques. On a effectué un mode opératoire d'extraction "par feuilles humides" rapide adapté de Robert et al., 2000, en utilisant trois disques de feuille (0,2 cm2 chacun récoltés en utilisant un bouchon de microtube comme dispositif de perforation) de chaque plante. On a incubé le matériau récolté pendant 15 min à 95 C dans 100 L de tampon de broyage et on l'a placé à 4 C pendant 10 min. Après une étape de centrifugation (8 000 g pendant 5 min), on a récolté le surnagent, on l'a transféré dans un nouveau tube et on l'a dilué 10 fois dans de l'eau sans RNase. On a stocké les extraits à- 20 C jusqu'à utilisation. 1.3 Dosage par méthode immunoenzymatique. (ELISA) On a réalisé une détection de PVY dans une plante en utilisant un protocole DAS- ELISA. On a rempli les puits des plaques de microtitrage avec 1 g/mL d'anticorps polyclonal de PVY (FNPPPT-INRA, France) dans un tampon carbonate (pH 9,6) pendant 2 h à 37 C. Entre chaque étape du protocole ELISA, on a lavé les plaques trois fois avec un tampon PBST (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20). On a ajouté 100 L des jus bruts de plante dans les puits et on les a laissés jusqu'au lendemain à 4 C. On a dilué les anticorps monoclonaux de souris conjugués à une phosphatase alcaline et dirigés contre le PVYN [Bioreba, Suisse] ou le PVY ' [Adgen, Royaume-Uni] au 1/1000 ou au 1/2000 respectivement, dans un tampon de broyage complété avec 0,2 % d'ovalbumine (p/v). Selon la spécificité attendue de la détection, on a ajouté 100 L de l'un de ces anticorps monoclonaux aux puits de la plaque pendant 2 heures à 37 C. On a rempli les puits de la plaque avec 100 de phosphate de p-nitrophényle (1 mg/mL) dans un tampon substrat (diéthanolamine à 1 N, pH 9,6). Après incubation pendant 1 heure à température ambiante, on a lu l'absorbance des échantillons à 405 nm en utilisant un lecteur de plaque de microtitrage (Titertek Multiscan [MCC]). 1.4 Préparation des standard d'ARN viral pour les test par SNP On a extrait l'acide nucléique total de 100 L de jus brut pris dans des plantes infectées par PVYN-605 ou PVY -139, en utilisant un mode opératoire de phénol/chloroforme et on l'a remis en suspension dans 50 L d'une eau sans nucléase. On a réalisé une transcription inverse de l'ARN viral avec 3 U de transcriptase inverse AMV [Promega], 10 pmoles de l'oligonucléotide 5 '9702GTCTCCTGATTGAAGTTTAC9682_ 3' (SEQ ID No 13) (positions nucléotidiques selon l'isolat PVYN-605)220 nmoles de dNTP, 20 U de RNasin [Promega] et 10 L de l'extrait d'acide nucléique total. On a effectué la réaction selon les instructions du fabricant de l'enzyme dans un volume final de 20 L. On a ensuite amplifié par PCR la région de l'ADNc correspondant à une partie des gènes HC-Pro/P3 de PVYN-605 ou PVY 139 en utilisant 2,5 U de la polymérase AmpliTaq [Applied Biosystems], 40 pmoles de l'amorce avant 5'-aacgtgtttctcgcgatgctaattaacattggcgaggagg-3' (SEQ ID No 11 correspondant à nt 2079 à 2108 de PVY -139 et comprenant un site Nrul) et l'amorce inverse 5'agccatcagtataccaggggataatattgatagaatcaac-3' (SEQ ID No 12 correspondant à nt de 2592 à 2561 PVY -139, et comprenant un site BstZ171), nmol de dNTP, 75 nmol de MgCl2, 10 L d'ADNc et on a ajusté un volume final de 50 L avec de l'eau stérile. On a fait des cycles de réaction avec un cycleur thermique Hybaid Express pendant 40 cycles de 94 C pendant 1 min, 52 C pendant 1 min et 72 C pendant 1 min. On a cloné séparément les produits de la PCR correspondant aux séquences de PVYN ou PVY dans les sites NruI et BstZ171 dans d'un vecteur pBluescript modifié (pMTlink), dans lequel la cassette de clonage multiple de pBluescriptKS [Statagene] a été remplacée entre les sites KpnI et SacI par une courte séquence nucléotidique, comprenant les sites de restriction unique KpnI-NruI- BstZ171-SacI. On a utilisé les plasmides résultants pMTNBN et PMTNB pour produire des produits de la transcription de l'ARN viral correspondant aux nucléotides 2086 à 2591 de PVYN-605 et PVY -139 respectivement. On a séparément linéarisé 1 gg de pMTNBN et PMTNB par Sacl, on l'a purifié en utilisant un protocole d'extraction par phénol/chloroforme et on Pa remis en suspension dans 5 L d'eau sans nucléase. On a généré les produits de la transcription de dARN de PVY en présence de 15 U de TARN polymérase T3 [Promega], 10 mM de rNTP et 5 mM de dithiotreitol pendant 3 heures à 37 C. On a complété le processus de la transcription in vitro par la digestion du plasmide en utilisant une ADNase I dépourvue d'activité ARNase pendant 15 min à 37 C. On a extrait les produits de transcription viraux en utilisant la procédure d'extraction au phénol/chloroforme, de l'alcool isoamylique, on les a précipités et mis en suspension dans 100 L d'eau sans ARNase. On a déterminé la concentration d'ARN final (gg/gL et copies/.LL) par spectrophotométrie. On a effectué des dilutions des produits de la transcription in vitro de PVYN et PVVY afin d'obtenir des solutions contenant 108, 10', 106, 105, 104, 103 ou 102 copies de TARN viral produit in vitro dans 2,5 L. Exemple 2: Conception d'une amorce et d'une sonde et détection SNP On a choisi le nucléotide 2213 de PVY (numéroté selon Jakab et al., 1997), signalé comme étant impliqué dans la nécrose des nervures du tabac de l'isolat PVYN-605 (Balme-Sinibaldi et al. , 2004), pour définir deux sondes marquées par FAM-(SondeN) ou Vic(Sonde ) de TagMan -MGB, [Applied Biosystems] correspondant aux séquences de PVYN-605 ou PVY -139 respectivement (figures 1 et 2). On a conçu les paires d'amorce sens (Fp) et anti-sens (Rp) (figure 2) qui encadrent les séquences ciblées par la sonde pour PVYN-605 (FpN et RpN) et PVY -139 (FpO et RpO) en utilisant le logiciel Primer Express [Applied Biosystems]. Test SNP utilisant des sondes fluorescentes TagMan On a effectué des réactions de SNP basés sur la technologie TagMan dans un volume final de 25 L en utilisant le kit One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit [Applied Biosystems], selon les instructions du fabricant. On a effectué des réactions de RT- PCR en une seule étape, réalisées avec 2,5 L d'extraits de "feuilles humides provenant de plantes saines ou infectées, ou en utilisant des produits de la transcription in vitro, en utilisant le système ABI Prism 7700 Sequence Detection System [Applied Biosystems]. On a effectué la transcription inverse de l'ARN viral à 48 C pendant 30 minutes. On a effectué la PCR avec une polymérase hot-start AmpliTaq [Applied Biosystems] et en utilisant une étape d'activation enzymatique (10 min à 95 C), suivie de cycles de dénaturation/hybridation/extension (15 s à 95 C; 1 min à 60 C). Pour chaque échantillon, on a lu les signaux de fluorescence correspondant à FAM, Vic et au contrôle interne ROX de Applied Biosystems au point final du programme de RTPCR. On a mathématiquement transformé les données obtenues (fluorescence brute) en utilisant le logiciel SDS vl.7 [Applied Biosystems], afin de produire des données correspondant au signal fluorescent du composant cible (FAMm et Vicm) et les données fluorescentes normalisées (FAMn et Vien). On a répliqué le test SNP et le mode opération de validation complet dans au moins trois expériences indépendantes. Exemple 3: Détection de PVYN-605 et PVY -139 dans des échantillons purs et mélangés en utilisant un dosage de SNP suivant l'exemple 2. Selon les recommandations du fabricant et en prenant en compte les protocoles connus de RT-PCR en temps réel publiés au préalable (Fabre et al. 2003; Roberts et al. 2000), on a testé les deux sondes TagMan (SondeN et Sonde ) et les paires d'amorce (FpN et RpN; FpO et RpO) à différentes concentrations allant de 50 nM à 900 M. Les signaux fluorescents récoltés à la fin des réactions de PCR étaient optimaux quand chaque sonde était inclus à 200 nM et les quatre amorces à 800 nM. On a effectué trente-deux cycles de PCR dans toutes les expériences de détection pour éviter le clivage non spécifique des sondes observées dans les expériences utilisant plus de 35 cycles de PCR. On a effectué le test SNP sur la base de quatre répétitions, y compris un contrôle sans matrice (NTC) ou des produits de la transcription de l'ARN virale in vitro (106 PVYN ou 106 PVY copies/réaction) et avec duplication des échantillons mélangés contentant PVYN et PVY (106 de chaque type d'ARN). On a enregistré des signaux fluorescents bruts (CFS) associés à chaque sonde à la fin de la réaction de RT- PCR en une seule étape (figure 3). Pour les échantillons NTC, CFS correspond au niveau fluorescent de base du système (0,782 0,024 et 0,424 0,008 pour la fluorescence de FAM et de Vic respectivement), produit par les sondes non clivées (figure 3A). Quand on a testé les échantillons contenant les produits de la transcription de l'ARN, les CFS associés à une sonde ont augmenté selon le type d'ARN présent dans les échantillons testés (SondeN (signal FAM) et Sondé (signal Vic) pour PVYN et PVY respectivement),. Ce résultat prouve l'hybridation hautement spécifique des sondes à leurs cibles d'ARN et l'absence de tout niveau significatif d'interaction non spécifique. Dans les échantillons mélangés YN/Y , à la fois les signaux fluorescents de FAM et de Vic ont augmenté de manière significative quand on les compare aux données NTC, ce qui reflète la liaison et le clivage de deux sondes au cours de la réaction de PCR. La représentation graphique des données des signaux fluorescents bruts (figure 3B) illustre à la fois la distinction de quatre zones correspondant à chaque d'échantillon testé et dans ces zones, la variation du niveau fluorescent enregistré pour chaque réplication. Exemple 4: Test de la sensibilité du test SNP de PVYNio On a produit et testé des fractions issues de dilutions en série contenant de 10' à 103 copies d'ARN/2,5 L, de transcript in vitro de PVYN et PVY en utilisant le protocole de test SNP, afin de déterminer la limite de détection de ce nouveau procédé (figure 4). Une bonne corrélation a pu être observée entre la quantité virale décroissante dans les échantillons testés et la baisse du signal fluorescent, à la fois pour PVYN et PVY (figure 4A). On a détecté de manière efficace les trois dilutions les plus concentrées et on les a identifiées comme un type PVYN ou PVY par le dosage SNP (figure 4A) ; 10', 106 et 105 fractions dans les zones de PVYN et PVY ). Cependant, quand on a testé les échantillons contenant seulement 104 et 103 molécules d'ARN, les données fluorescentes obtenues étaient soit proches (104) soit non distinguables (103) de celles associées aux échantillons NTC. Les variations de ces données pour les réplications de NTC (figures 3A et 3B) fait qu'il est difficile d'identifier clairement le seuil fluorescent qui délimite la détection de PVY positive de la détection de PVY négative. Afin de résoudre ce problème, le logiciel SDS sofware [Applied Biosystems] permet des transformations mathématiques du signal fluorescent brut en données fluorescentes cibles (figure 4B) et en données fluorescentes normalisées (figure 5C). Ces données permettent de déterminer de manière précise la dilution du critère d'évaluation du dosage SNP dans la gamme (104 à 105) pour PVYN et PVY . Exemple 5: Co-détection de PVYN et PVY en mélange dans un échantillons (mimant une co-infection) En utilisant des fractions contenant entre 104 et 108 de produits de la transcription in vitro de PVYN ou PVY [NrulBsZ171], on a préparé plusieurs fractions mélangées, en créant des échantillons avec des rapports de YN/Y de 1/100 à 100/1 (tableau 2 et figure 5). On a testé ces fractions comme des échantillons inconnus dans un dosage SNP comprenant NTC, des échantillons de contrôle de PVYN purs (106 produits de la transcription) et de PVY purs (106 produits de la transcription). Les données fluorescentes bruts obtenues à partir des échantillons purs (FAM=1,753 et Vic=1,276 pour PVYN et PVY , respectivement) étaient équivalentes à celles obtenues dans les échantillons mélangés contenant 106 copies des deux types d'ARN (rapport 1/1; PVYN et PVY à 106 copies; FAM=1,653 et Vic=1,198). Ceci illustre que la détection simple et la co-détection de PVYN et/ou PVY dans des échantillons contenant des quantités similaires d'ARN ciblée étaient efficaces pour les deux cibles. Comme précédemment démontré, la quantité d'ARN de PVY présente dans les échantillons tests influence directement le niveau fluorescence brute. Les fractions contenant 108 copies des deux types d'ARN de PVY étaient associées à des valeurs de CFS élevées (proches de 2,000), alors que les fractions contenant seulement 104 copies d'ARN de PVY ont produit des données de CFS (FAM=0,860 et Vic=0, 563) proches de celles attendues pour le contrôle négatif (NTC; FAM=0,754 et Vic=0,427). L'utilisation des données fluorescentes cibles (tableau 2) avec le seuil de détection de FAMt et Vict (figure 5) fait qu'il est facile de distinguer la détection simple d'une co-détection. En prenant en compte les observations, on a efficacement caractérisé les fractions avec des quantités d'ARN de PVY allant de 105 à 108 à un rapport de YN/Y de 1 comme des échantillons mélangés. Quand on a testé les fractions contenant un type d'ARN de PVY en excès (rapport=l/100, 1/10, 10/1 ou 100/1), le CFS pour une quantité constante d'un type d'ARN de PVY est réduit selon l'excès de l'autre type d'ARN de PVY (PVYN=106: FAMm était 1, 216, 0,970, 0,798, 0,454 et 0,68 pour les échantillons contenant 104, 105, 106, 10' et 108 PVY , respectivement).. Exemple 6: Validation du test SNP sur une large gamme d'isolats de PVY On a validé le test SNP développé en utilisant une large gamme d'isolats de PVY comprenant trente-sept isolats européens, deux isolats africains, deux isolats nord-américain et un isolat du proche orient, appartenant aux groupes PVYN et PVY , comprenant des variants PVYNTN et PVYN-W (tableau 1). On a caractérisé les propriétés biologiques et sérologiques des quarante-deux isolats en utilisant les observations des symptômes sur N. tabacum cv. Xanthi et des tests ELISA (tableau 3). Tous les résultats étaient en accord avec les résultats attendus. On a préparé des extraits de feuilles humides provenant de N. tabacum cv. Xanthi infectées par ces isolats de PVY et on les a testées en utilisant le test SNP développé. Les données fluorescentes cibles et les résultats diagnostiques de SNP associés à chaque échantillon testé sont présentés dans le tableau 3. Tous les 42 isolats de PVY testés ont pu être correctement assignés par le test SNP dans leur groupe de PVY respectif. Les variants PVYNTN et PVYN-W ont été correctement caractérisés comme membres du groupe PVYN. Comme on s'y attendait, aucun des échantillons testés provenant de notre collection d'isolats de PVY n'a été identifié par le test SNP comme un échantillon coinfecté. 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Procédé de détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, b) amplification RT-PCR d'une région de l'ARN viral de PVY comprenant les codons 738 et 757 (SEQ ID No 1 et 3) correspondant aux acides aminés 400 et 419 respectivement de la protéine HC-Pro (SEQ ID No 2 et 4, fig 7A et 7B), c) détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à R/K400 et D/E419 au moyen i) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et ii) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent, caractérisé en ce que la présence d'au moins une desdites mutations R/K400 et D/E419 est une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en un seul test, on détecte les 4 génotypes/phénotypes suivants: - [R400, D419] (souche incapable d'induire la nécrose) - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, E419] (souche induisant la nécrose). 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il est effectué chez la pomme de terre. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la détection à l'étape d) de souches de PVY [R400, E419] et/ou [K400, D419] et/ou [K400, E419] est une indication que la plante de pomme de terre est contaminée avec une ou plusieurs souche(s) induisant des nécroses tuberculaires. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise comme sonde i) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 (correspondant à R/K400), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la sonde i) comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 7: ctcaaatguaaatattctac 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'on utilise en outre une sonde i) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AGA avec le polymorphisme G2213. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde i) contrôle comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 8: ctcaaatgagaatattcta 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que la sonde i) et la sonde i) contrôle sont marquées différemment. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on utilise comme sonde ii) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la sonde ii) comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2271, notamment avec la séquence 5'- cgatcacgaaacgcagaca - 3' (SEQ ID No 9) ou 5'- atcacgagacgcagaca - 3' (SEQ ID No 20). 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'on utilise en outre une sonde ii) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAC avec le polymorphisme C2271. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la sonde ii) contrôle comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment avec la SEQ ID No 10: 5'- accatgaçactcaaa - 3' ou avec la SEQ ID No 21: 5'- tgaccatgaéactcaa -3' 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la sonde ii) et la sonde ii) contrôle sont marquées différemment. 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans les sondes comporte un marqueur fluorescent (reporter) et une molécule captant le signal lorsqu'elle se trouve à proximité du marqueur fluorescent (quencher). 16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lors de l'étape b), la transcription inverse est effectuée avec au moins 2 paires d'amorces sens et antisens. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la transcription inverse est 30 effectuée au moins avec une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, et au moins une deuxième paire d'amorces peluiettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY . 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la première paire d'amorces (FpN et RpN) comprend une amorce sens FpN et une amorce antisens RpN pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 1 ou 5. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'amorce sens FpN se situe 10 en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpN se situe en aval du codon 757 polymorphique. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre deux premières paires: - FpN1 en amont du codon 738 - RpN l en aval du codon 738 - FpN2 en amont du codon 757 - RpN2 en aval du codon 757 21. Procédé selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisé en ce que la deuxième paire d'amorces (FpO et RpO) comprend de préférence une amorce sens FpO et une amorce antisens RpO pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 3 ou 6. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'amorce sens FpO se situe en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpO se situe en aval du codon 757 polymorphique. 23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre deux 30 deuxièmes paires: - FpOl en amont du codon 738 -RpOl en aval du codon 738 - FpO2 en amont du codon 757 - RpO2 en aval du codon 757 24. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce les amorces des deux paires sont choisies parmi: Amorces sens pour YN SEQ ID No 22 F1: 5'-ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGT-3' SEQ ID No 23 F2: 5'ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTC-3' SEQ ID No 24 F3: 5'CATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTA-3' Amorces anti-sens pour YN: SEQ ID No 28 R1: 5'-GTGAGCCAAACGAGTCAACTACAT-3' SEQ ID No 29 R2: 5'TTTGTGAGCCAAACGAGTCAACTA-3' SEQ ID No 30 R3: 5'-TTGTGAGCCAAACGAGTCAACT-3' Amorces sens pour YO SEQ ID No 25 F1: 5'-GCAGAGCTGCCTAGTTTATTGGTT-3' SEQ ID No 26 F2: 5'-ATGATGCAGAGCTGCCTAGTTTATT-3' SEQ ID No 27 F3: 5'TGCAGAGCTGCCTAGTTTATTGG-3' Amorces anti-sens pour YO: SEQ ID No 31 R1: 5'GCCAAATGAGTCAACCACATGA-3' SEQ ID No 32 R2: 5'-AGCCAAATGAGTCAACCACATG-3' SEQ ID No 33 R3: 5'-CCAAATGAGTCAACCACATGACA-3' 25. Procédé de sélection sanitaire de plants de la famille des Solanacées susceptibles d'être infectées par une ou plusieurs souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires, notamment de nécroses tuberculaires chez la pomme de terre, comprenant la mise en oeuvre systématique du procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 24 sur les semences, plants et/ou plantes susceptibles d'être mis en culture et procéder à la destruction ou mise sous quarantaine desdites semences, plants ou plantes contaminés avec une souche présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400, E419] (souche induisant la nécrose) 26. Kit de détection de la présence ou de l'absence d'isolats du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY . - au moins une sonde marquée i) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et au moins une sonde marquée ii) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) étant définies selon l'une des revendications 5 à 6 et 10 à 11 respectivement, et présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent. 27. Kit de détection selon la revendication 25 comprenant en outre les sondes i) et ii) de contrôle telles que définies selon l'une des revendications 7 à 8 et 12 à 13 respectivement, les sondes i) et contrôle i) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents, les sondes ii) et contrôle ii) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents. 28. Kit de détection selon la revendication 26 ou 27 comprenant une solution comprenant les amorces à une concentration optimale se situant entre 400 nM et 1200 nM, notamment 800 nM et une solution comprenant les sondes à une concentration se situant entre 100 nM et 300 nM, notamment 200 nM. 29. Sonde ou collection de sondes définie(s) selon l'une des revendications 5 à 15. 30. Amorce ou collection d'amorces définie(s) selon l'une des revendications 17 à 24. 31. Utilisation d'une sonde et d'une amorce ou des collections selon la revendication 29 et 30 respectivement pour la détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, notamment chez la pomme de terre, l'aubergine, la tomate, les piments et le tabac. 32. Lot de semences, plants et/ou plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de semences, plants ou plantes contaminés avec une souche de 10 PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, E419] (souche induisant la nécrose). 33. Lot de plants ou tubercules de pomme de terre, caractérisé en ce que qu'il est dépourvu de plants ou tubercules contaminés avec une souche de PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [Raoo, E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [Kaon, E419] (souche induisant la nécrose) . 34. Lot selon la revendication 32 ou 33 susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 24 et 25 ou du kit selon l'une des revendications 26 à 28.