Brevet FR2876588A1 — publié le 20060421

La présente invention concerne un procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié, en particulier un procédé pour la production d'un échantillon décalcifié d'un agent de remplacement de tissu dur vivant, d'un tissu dur vivant ou de leur composite, auquel des cellules sont fixées, de manière simple à un faible coût. Pour observer au microscope des tissus durs tels que des composites comprenant des supports constitués par des agents de remplacement de tissus durs vivants, auxquels des cellules sont fixées, des tissus durs vivants, etc., des échantillons de 10 ou moins de 10 gm d'épaisseur sont habituellement produits. Ces échantillons ont été produits classiquement en décalcifiant des tissus durs, en les incluant dans de la paraffine, en les débitant en coupes et en les colorant. En particulier, lorsque des constituants d'organismes vivants sont présents en de petites quantités, ce procédé présente cependant une difficulté d'observation des conditions véritables des cellules et des structures globales des tissus durs, car les tissus durs sont trop faibles ou perdus après élimination par dissolution des composés de calcium. Dans un os artificiel, auquel des cellules sont fixées et cultivées, par exemple, il n'existe pas de support suffisant en raison d'une très faible quantité de collagène, etc., après décalcification, ce qui empêche de maintenir suffisamment les conditions des cellules fixées. Des études ont été ainsi effectuées pour proposer un procédé pour inclure un tissu dur dans une résine sans décalcification, et le débiter en coupes et le colorer. Cependant, ce procédé peut produire seulement des coupes ayant une épaisseur atteignant environ 100 m, ce qui nécessite le meulage des coupes, et a ainsi pour résultat un coût élevé de production des échantillons. En outre, ce procédé pose pour problème le fait que le nombre d'échantillons obtenus à partir d'un spécimen de mêmes dimensions est égal ou inférieur à 1/100 de celui d'échantillons décalcifiés. Comme procédé pour la production d'un échantillon sous forme de coupes d'un tissu dur non décalcifié, le document JP 2000-346770 A propose un procédé consistant à inclure un tissu dur non décalcifié dans un monomère à insaturation éthylénique (par exemple, MMA), et un initiateur de polymérisation de type azoïque capable de polymériser le monomère à de basses températures, à polymériser le monomère à insaturation éthylénique et à débiter en coupes le tissu dur. Comme le monomère à insaturation éthylénique présente une excellente capacité de pénétration dans le tissu dur, les échantillons inclus dans ce monomère ont une excellente capacité à être débités en coupes. Cependant, comme un tissu dur inclus est débité en coupes dans le procédé du document JP 2000-346770 A, la structure fine du tissu dur est susceptible d'être dissociée lorsque les coupes sont réalisées si le tissu dur a une grande dureté. En outre, l'inclusion demande 3 à 4 semaines dans ce procédé. Comme procédé pour la production d'un échantillon sous forme de coupes tout en maintenant les conditions convenables d'un tissu, le document JP 2002-31586 A propose un procédé consistant à immerger le tissu dur dans une solution aqueuse de carboxyméthylcellulose, ou d'un agent similaire, à le congeler, à placer l'échantillon inclus congelé résultant sur un bloc de support au moyen d'une solution de glycérol, à fixer un film mince de matière plastique revêtu d'un additif à une surface de l'échantillon et à débiter horizontalement en coupes l'échantillon inclus congelé. Bien que le procédé du document JP 2002-31586 A convienne bien avec un échantillon de tissu mou, il détruit la structure fine d'un tissu dur au cours du débitage en coupes. En outre, il nécessite un appareil de débitage en coupes à congélation, avec pour résultat un coût élevé. En conséquence, un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié de manière simple à un faible coût, tout en maintenant la structure fine du tissu dur. En résultat de recherches approfondies en rapport avec l'objectif précité, les inventeurs ont trouvé que la décalcification après inclusion d'un tissu dur dans une résine permettant la pénétration des liquides peut produire un échantillon de tissu dur décalcifié de manière simple à un faible coût tout en maintenant la structure fine du tissu dur. La présente invention a été menée à bonne fin sur la base de cette découverte. Ainsi, le procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié conformément à la présente invention comprend les étapes consistant à inclure le tissu dur dans une résine permettant la pénétration des liquides et ensuite à le décalcifier. Le tissu dur inclus décalcifié est de préférence réinclus dans une résine. Dans une forme préférée de réalisation de la présente invention, le tissu dur est de préférence un tissu dur vivant, un premier composite comprenant un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant et de cellules, un second composite comprenant le support et le tissu dur vivant, ou un troisième composite comprenant le support, les cellules et le tissu dur vivant. L'agent de remplacement de tissu dur vivant est avantageusement un composé de calcium, plus avantageusement l'hydroxyapatite. Les cellules sont de préférence des cellules motrices, qui sont plus avantageusement au moins un type de cellules choisies dans le groupe consistant en des ostéoblastes, des cellules du type ostéoblaste, des cellules osseuses, des cellules du cartilage, des cellules musculaires et leurs cellules souches, cellules précurseurs et cellules tumorales. Le monomère de la résine permettant la pénétration des liquides est de préférence le (méth)acrylate d'hydroxyalkyle, notamment le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle. La figure 1 est une vue en coupe transversale représentant un fragment de tissu dur déshydraté, qui est immergé dans un liquide d'immersion primaire. La figure 2 est une vue en coupe transversale 5 représentant un fragment de tissu dur ayant subi une immersion primaire, qui est immergé dans un liquide d'immersion secondaire. La figure 3 est une vue en coupe transversale représentant un fragment de tissu dur ayant une immersion secondaire, qui est inclus dans une résine permettant la pénétration des liquides. La figure 4 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon comprenant un fragment de tissu dur inclus. La figure 5 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon inclus, qui est immergé dans un liquide décalcifiant. La figure 6 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon décalcifié. La figure 7 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon décalcifié, qui est réinclus dans une résine. La figure 8 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon réinclus. La figure 9 est une vue en coupe transversale représentant un échantillon réinclus, qui est placé dans un moule et qui est amené à adhérer à un bloc de support. La figure 10 est une vue en coupe transversale représentant l'échantillon réinclus fixé au bloc de support. La figure 11 est une photomicrographie (grossissement: 4 fois) représentant l'échantillon d'hydroxyapatite décalcifié contenant des cellules de l'exemple 1. La figure 12 est une photomicrographie (grossissement: 35 20 fois) représentant une partie de l'échantillon de l'exemple 1. La figure 13 est une photomicrographie (grossissement: 20 fois) représentant une autre partie de l'échantillon de l'exemple 1. La figure 14 est une photomicrographie (grossissement: 5 20 fois) représentant une autre partie de l'échantillon de l'exemple 1. La figure 15 est une photomicrographie (grossissement: fois) représentant l'échantillon de l'exemple 2. La figure 16 est une photomicrographie (grossissement: 10 20 fois) représentant une autre partie de l'échantillon de l'exemple 2. La figure 17 est une photomicrographie (grossissement: 20 fois) représentant une autre partie de l'échantillon de l'exemple 2. La figure 18 est une photomicrographie (grossissement: 10 fois) représentant l'échantillon de l'exemple 3. La figure 19 est une photomicrographie (grossissement: 20 fois) représentant une partie de l'échantillon de l'exemple 3. [1] Tissu dur Les tissus durs pour les échantillons ne sont pas particulièrement limités mais peuvent être, par exemple, un tissu dur vivant, un premier composite formé d'un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant et de cellules, un deuxième composite formé d'un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant et d'un tissu dur vivant, un troisième composite formé d'un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant, de cellules et d'un tissu dur vivant, etc. Le tissu dur peut être n'importe lequel de ceux-ci. (1) Tissu dur vivant Les tissus durs vivants peuvent être des os, des dents, des articulations, des calculs, etc. Le tissu dur vivant peut contenir des tissus mous tels que des tissus fibreux, du cartilage, etc. (2) Premier composite Le premier composite comprend un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant et de cellules, et peut être utilisé non seulement comme matériau d'obturation et/ou de réparation de défauts, mais également comme matériau pour la différenciation et la prolifération de cellules. L'agent de remplacement de tissu dur vivant peut consister généralement en matériaux durs utilisés pour les os artificiels, les racines dentaires artificielles, des charges pour le tissu osseux, etc., consistant habituellement en composés de calcium. Les composés de calcium peuvent être des apatites telles que l'hydroxyapatite, la fluoroapatite et le carbonate d'apatite, le phosphate dicalcique, le phosphate tricalcique, le phosphate tétracalcique, le phosphate octacalcique, etc. L'agent de remplacement de tissu dur vivant peut contenir des matières molles. Les matières molles peuvent être des matières connues de haut poids moléculaire telles que des protéines (collagène, albumine, fibrine, etc.) ; des polymères synthétiques (acide polylactique, acide polyglycolique, poly--caprolactone, etc.) ; des polysaccharides (amidon, acide alginique, etc.), et des matières similaires. Des exemples d'agents de remplacement de tissu dur vivant formés d'un composite de matières dures et de matières molles peuvent être des composites de composés de calcium et de collagène. Dans les composites, le collagène peut être réticulé. Les cellules fixées au support constitué par l'agent de remplacement de tissu dur vivant ne sont pas limitées du moment qu'elles peuvent être cultivées sur le support. Les cellules peuvent être, par exemple, des cellules motrices, des cellules hépatiques, des fibroblastes, des cellules urinaires (par exemple, des cellules rénales, des cellules de la vessie, etc.), des cellules respiratoires (par exemple, des cellules pulmonaires, des cellules alvéolaires, etc.), des cellules nerveuses, des cellules digestives (par exemple, des cellules de l'estomac, des cellules de l'intestin grêle, des cellules du gros intestin, etc.), des cellules du système circulatoire (par exemple, des cellules cardiaques, des cellules des vaisseaux sanguins, etc.), des cellules du système reproducteur, etc. Des cellules souches, des cellules précurseurs et des cellules tumorales de ces types cellulaires peuvent également être utilisées. Parmi ces cellules, les cellules motrices (ou leurs cellules souches, cellules précurseurs et cellules tumorales) sont préférables. Les cellules motrices peuvent être, par exemple, des ostéoblastes, des cellules du type ostéoblaste, des cellules osseuses, des cellules du cartilage, des cellules musculaires, etc. Les cellules fixées au support peuvent être cultivées pendant une période de temps désirée. Cela permet d'évaluer la rapidité avec laquelle les cellules prolifèrent dans l'agent de remplissement de tissu dur vivant introduit dans un organisme vivant. (3) Deuxième composite Le deuxième composite comprend un support constitué de l'agent de remplacement de tissu dur et/ou mou vivant précité et du tissu dur vivant précité. (4) Troisième composite Le troisième composite comprend un support constitué de l'agent de remplacement de tissu dur et/ou mou vivant précité, des cellules précitées et du tissu dur vivant précité. Les cellules fixées au support peuvent être cultivées pendant une période de temps désirée. [2] Production de l'échantillon Le procédé de la présente invention pour la production d'échantillons est expliqué en détail ci-dessous par référence aux dessins annexés, sans intention de restreindre la présente invention aux procédés indiqués. (1) Etape de fixation Pour stabiliser le tissu dur avant décalcification, il est préférable de fixer la forme extérieure, la structure interne, etc. du tissu tel quel. La fixation de la forme extérieure, etc. du tissu est effectuée en immergeant le tissu dur dans un fixateur avant décalcification. Le fixateur peut être le formaldéhyde, le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, etc. Ces fixateurs peuvent être mélangés à de l'oxyde d'osmium, de l'acide acétique, de l'acide phosphorique, de l'acide picrique saturé, un alcool, etc. Un tel mélange peut être, par exemple, un fixateur de Karnovsky comprenant du glutaraldéhyde et du tétraoxyde d'osmium, un fixateur de Bouin comprenant du formaldéhyde, de l'acide picrique saturé et de l'acide acétique cristallisable, une solution tampon au paraformaldéhyde/acide phosphorique (neutre), etc. Un fragment de tissu dur coupé suivant une forme prédéterminée est immergé dans un fixateur. Le temps et la température d'immersion sont choisis convenablement en fonction des types de fragment de tissu dur, du fixateur, etc. Afin que le fixateur pénétrant dans un échantillon ne présente pas un gradient de concentration, le fixateur est de préférence agité. Après fixation de la forme extérieure, de la structure interne, etc. du tissu dur, l'échantillon est lavé pour éliminer le fixateur. L'échantillon est de préférence lavé avec un courant d'eau. (2) Etape de déshydratation L'échantillon fixé est déshydraté. La déshydratation améliore la capacité de pénétration d'une résine, permettant la pénétration des liquides, dans le fragment de tissu dur. La déshydratation est effectuée en immergeant un échantillon dans un solvant organique hydrophile tel que l'éthanol et l'acétone sous agitation. Le temps et la température d'immersion peuvent être choisis convenablement en fonction des types et des dimensions du fragment de tissu dur. Au cours de l'étape de déshydratation, le solvant organique est de préférence remplacé plusieurs fois. Dans ce cas, il est préférable d'utiliser des pluralités de solutions aqueuses contenant différentes concentrations d'un solvant organique, en passant successivement d'une solution à concentration la plus faible à une solution à concentration la plus forte (par exemple 100 % de solvant organique). (3) Etape d'immersion primaire Pour inclure le fragment de tissu dur déshydraté la dans une résine permettant la pénétration des liquides, il est préférable que le fragment de tissu dur la soit tout d'abord immergé dans un liquide mixte (liquide d'immersion primaire) 2a comprenant un monomère d'une résine permettant la pénétration des liquides et un solvant organique de la manière représentée sur la figure 1, de telle sorte que le liquide d'immersion primaire 2a pénètre dans le fragment de tissu dur la. L'expression "résine permettant la pénétration des liquides" désigne une résine qui permet à un liquide (un liquide de décalcification, un liquide déshydratant, un monomère liquide d'inclusion, etc.) de pénétrer dans un fragment de tissu dur lb après inclusion du tissu dur lb dans la résine de la manière représentée sur la figure 4, par exemple. Les monomères utilisés dans l'étape d'immersion primaire peuvent être identiques à ou différents de ceux utilisés dans l'étape d'immersion secondaire et une étape d'inclusion tant qu'ils peuvent former des résines permettant la pénétration des liquides, bien que les mêmes monomères soient préférables. Les détails concernant le monomère de la résine permettant la pénétration des liquides sont décrits ci-dessous. Le solvant organique peut être l'éthanol, l'acétone, etc. Bien que cela ne soit pas particulièrement limité, la concentration du monomère dans le liquide d'immersion primaire 2a est de préférence comprise dans l'intervalle de 30 à 70 % en masse. Le temps d'immersion primaire peut être choisi convenablement en fonction des dimensions du fragment de tissu dur la, etc. La température d'immersion primaire peut être la température ambiante. L'immersion primaire peut être effectuée sous vide. (4) Etape d'immersion secondaire Après l'immersion primaire, le fragment de tissu dur lb est de préférence immergé dans un liquide d'immersion secondaire 2b comprenant un monomère et un initiateur de polymérisation, sans solvant organique. Le temps d'immersion secondaire peut être généralement compris dans la limite de 24 heures, et est compris de préférence dans l'intervalle de 16 à 22 heures. La température d'immersion secondaire peut être la température ambiante. A ce propos, le monomère utilisé dans l'immersion secondaire peut être identique au monomère utilisé dans l'immersion primaire. Le monomère de la résine permettant la pénétration des liquides est de préférence un monomère durcissable en une brève période de temps et capable de former une résine à forte transmittance de la lumière, permettant la pénétration des liquides, qui n'est pas détériorée pendant une longue période de temps. De tels monomères peuvent être des acides (méth)acryliques et leurs dérivés, en particulier des (méth)acrylates ou des (méth)acrylates d'hydroxyalkyle, en particulier des (méth)acrylates d'hydroxyalkyle. Les (méth)acrylates d'hydroxyalkyle préférés comprennent le (méth)acrylate de 2-hydroxyméthyle, le (méth)acrylate de 2hydroxyéthyle, le (méth)acrylate de 2-hydroxypropyle, le (méth)acrylate de 2-hydroxybutyle, etc. Parmi ceux-ci, le (méth)acrylate de 2-hydroxyméthyle et le (méth)acrylate de 2- hydroxyéthyle sont préférables et le (méth)acrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA) est particulièrement préférable. Les (méth)acrylates peuvent être le (méth)acrylate de méthyle, le (méth)acrylate d'éthyle, le (méth) acrylate de propyle, etc. Ces monomères peuvent être utilisés seuls ou en association. Le monomère peut contenir un plastifiant si nécessaire. Le plastifiant peut être, par exemple, un hydroxyéther. Les monomères disponibles dans le commerce des résines permettant la pénétration des liquides comprennent les Technovit 7100 et 8100 disponibles auprès de Heraeus Kulzer d'Allemagne, l'Historesin Plus disponible auprès de Leica Microsystems d'Allemagne, le JB-4 disponible auprès de Polyscience des Etats-Unis d'Amérique, etc. L'initiateur de polymérisation est de préférence le peroxyde de benzoyle (BPO, LUCIDOLe) ou un initiateur similaire. Des monomères disponibles dans le commerce tels que le Technovit sont accompagnés par les initiateurs de polymérisation correspondant le mieux. La quantité d'initiateur de polymérisation utilisée peut être modifiée convenablement en fonction des associations avec les monomères et, dans le cas où du HEMA est combiné avec du BPO, le rapport HEMA/BPO est compris de préférence dans l'intervalle de 100/0,5 à 100/1,5, par exemple égal à 100/1 en masse. Le liquide d'immersion secondaire peut contenir un catalyseur auxiliaire qui peut être, par exemple, un catalyseur capable d'engendrer des ions chlorure. Des monomères disponibles dans le commerce tels que le Technovit sont accompagnés de catalyseurs auxiliaires correspondant le mieux. (5) Etape d'inclusion De la manière représentée sur la figure 3, avec le fragment de tissu dur ic ayant subi l'immersion secondaire placé dans une cavité 4a d'un moule 4 (par exemple, Histoform disponible auprès de Heraeus Kulzer), un liquide d'inclusion 2c comprenant le liquide d'immersion secondaire (le monomère de la résine permettant la pénétration des liquides plus l'initiateur de polymérisation) et un accélérateur de durcissement est introduit dans la cavité 4a, qui est ensuite obturée hermétiquement par une plaque de recouvrement 5. Dans ce cas, pour empêcher la pénétration de l'air, qui peut entraver la solidification du liquide d'inclusion 2c, la cavité 4a est remplie avec le liquide d'inclusion 2c jusqu'à une hauteur en alignement avec la surface supérieure 4b de la cavité de moule 4a, de telle sorte qu'il n'existe aucun intervalle entre le liquide d'inclusion 2c et la plaque de recouvrement 5. L'accélérateur de durcissement peut être une solution de dérivés d'acide barbiturique, d'amines aromatiques, de N,N-diméthylaniline dans le styrène, etc. Des monomères disponibles dans le commerce tels que le Technovit sont accompagnés d'accélérateurs de durcissement correspondant le mieux. Avec l'accélérateur de durcissement, le monomère peut être polymérisé à une température relativement basse. En particulier dans un système utilisant du BPO comme initiateur de polymérisation, un dérivé d'acide barbiturique comme accélérateur de durcissement, et un catalyseur auxiliaire capable d'engendrer des ions chlorure, le monomère peut être totalement polymérisé en le laissant à température ambiante pendant environ une heure, puis, avec ensuite un réchauffement à 35-45 C pendant environ une heure. En conséquence, lorsque le monomère est réchauffé à l'état représenté sur la figure 3, il est polymérisé en donnant un échantillon (échantillon inclus) l0a comprenant un fragment de tissu dur le inclus dans une résine 2d permettant la pénétration des liquides, de la manière représentée sur la figure 4. (6) Etape de décalcification Pour décalcifier le fragment de tissu dur ld inclus dans la résine 2d permettant la pénétration des liquides, l'échantillon l0a comprenant le fragment de tissu dur ld et la résine 2d est de préférence immergé dans un liquide de décalcification 6 comprenant un acide organique, un acide inorganique et/ou un agent chélatant, de la manière représentée sur la figure 5. Des exemples spécifiques de liquide de décalcification 6 comprennent une solution aqueuse d'acide formique ayant une concentration d'environ 5 à 10 % en masse, une solution aqueuse d'acide nitrique ayant une concentration d'environ 5 à 8 % en masse, une solution aqueuse d'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA) ayant une concentration d'environ 10 % en masse, etc. Le liquide de décalcification 6 contenant un acide organique peut contenir du formaldéhyde ou un alcool. Le liquide de décalcification 6 contenant de l'acide formique peut contenir en outre de l'acide chlorhydrique ou de l'acide citrique. L'échantillon 10a comprenant le fragment de tissu dur ld inclus dans la résine 2d permettant la pénétration des liquides est de préférence immergé dans le liquide de décalcification 6 pendant 3 à 30 jours, bien que cela soit variable en fonction des dimensions du fragment de tissu dur ld, etc. Le liquide de décalcification 6 pénètre dans le fragment de tissu dur ld inclus pour éliminer par dissolution les composés de calcium. Le liquide de décalcification 6 est utilisé de préférence en une quantité égale ou supérieure à 10 fois celle du fragment de tissu dur ld inclus, en volume. Si nécessaire, le liquide de décalcification 6 peut être agité ou agité par secousse, ou bien une tension peut être appliquée au liquide de décalcification 6, pour réduire le temps de décalcification. Un échantillon 10b comprenant le fragment de tissu dur décalcifié résultant le (représenté sur la figure 6) est de préférence lavé avec de l'eau, un alcool, un liquide constitué d'un mélange eau-alcool, etc. (7) Etape de réinclusion avec une résine Le fragment de tissu dur décalcifié le (représenté sur la figure 6) comporte des pores qui persistent après élimination par dissolution des composés de calcium. En conséquence, les pores du fragment de tissu dur décalcifié le sont de préférence remplis de nouveau d'une résine 2d, bien que cela ne soit pas indispensable. Du moment qu'ils peuvent pénétrer dans les pores du fragment de tissu dur décalcifié le, les monomères de la résine de réinclusion ne sont pas particulièrement limités, mais ils peuvent être de préférence identiques aux monomères précités des résines permettant la pénétration des liquides. Le traitement de réinclusion avec la résine permettant la pénétration des liquides est de préférence effectué, comme ci-dessus, en lavant un échantillon 10b comprenant le fragment de tissu dur décalcifié le, en le soumettant à une déshydratation, une immersion primaire et une immersion secondaire, en le plaçant dans une cavité 4a d'un moule 4 de la manière représentée sur la figure 7, en chargeant un liquide d'inclusion dans la cavité 4a, en le réchauffant dans les mêmes conditions que dans l'étape (5) pour polymériser le monomère. (8) Etape de fixation au bloc de support Un échantillon 10c comprenant le fragment de tissu dur décalcifié réinclus 1f (représenté sur la figure 8) est de préférence fixé à un bloc de support, de telle sorte qu'il puisse être débité en coupes par un microtome, etc. A cette fin, de la manière représentée sur la figure 9, par exemple, il est préférable de charger l'échantillon réinclus 10c dans la cavité 4a du même moule 4 que cidessus, de maintenir un bloc de support creux 7 ayant un trou 7a communiquant avec la surface de support 7b (par exemple "Histoblock" disponible auprès de Heraeus Kulzer) au-dessus de la surface supérieure 4b de la cavité de moule 4a, dans laquelle l'échantillon réinclus 10c est placé, et d'introduire un adhésif 8 (par exemple "Technovit 3040" disponible auprès de Heraeus Kulzer comprenant principalement du méthacrylate de méthyle) dans le bloc de support 7. L'adhésif 8 remplit un intervalle entre la surface supérieure 4b de la cavité de moule 4a et la surface de support 7b du bloc de support 7, en formant ainsi une couche d'adhésif 8a liant l'échantillon réinclus 10c à la surface de support 7b. Ainsi, de la manière représentée sur la figure 10, l'échantillon réinclus 10c est fixé fermement au bloc de support 7. 2876588 15 (9) Production d'une coupe mince Le fragment de tissu dur décalcifié réinclus 1f de l'échantillon 10c fixé au bloc de support 7 est débité en coupes avec un microtome, etc. pour obtenir un échantillon (une coupe mince) pour l'observation au microscope. La coupe mince a de préférence une épaisseur de 0,5 à 10 m. La coupe mince résultante est ainsi amenée à flotter sur l'eau pour un traitement d'extension, placée sur une lame de verre, etc. et séchée. Après coloration, une lamelle couvre-objet, etc. est placée hermétiquement sur celle-ci pour obtenir un échantillon de tissu décalcifié. La présente invention est expliquée plus en détail par les exemples cidessous, sans envisager d'y limiter la présente invention. Exemple 1 Des ostéoblastes primaires obtenus à partir du tissu osseux de la boîte crânienne d'un rat nouveau-né ont été fixés à de l'hydroxyapatite ayant un diamètre de 5 mm, une épaisseur de 2 mm et une porosité de 50 % avant de fixer les cellules, et ont été cultivés. L'hydroxyapatite portant lescellules fixées a été immergée dans une solution tampon à 4 % en masse de formaldéhyde/acide phosphorique maintenue à température ambiante pendant une semaine, pour fixer le tissu cellulaire à l'hydroxyapatite. L'échantillon fixé a été lavé avec un courant d'eau, immergé dans des solutions aqueuses d'éthanol à 70 % et 96 %, respectivement, en volume à température ambiante pendant 2 heures pour chaque immersion, puis a été immergé dans de l'éthanol anhydre à température ambiante pendant 1 heure pour sa déshydratation. L'échantillon déshydraté a été immergé dans un liquide d'immersion primaire 2a comprenant comme ingrédient principal du Technovit 7100 constitué principalement de HEMA et renfermant un catalyseur auxiliaire capable d'engendrer des ions chlorure, et de l'éthanol anhydre en des proportions égales en volume, à température ambiante pendant 2 heures. Le fragment de tissu dur ayant subi l'immersion primaire lb a été ensuite immergé dans un liquide d'immersion secondaire 2b à température ambiante pendant 20 heures, et l'éthanol anhydre a été éliminé. Le liquide d'immersion secondaire 2b comprenait comme ingrédient principal du Technovit 7100 et un initiateur de polymérisation, qui était un durcisseur I (BPO ayant une teneur en eau de 20 % en masse) du Technovit 7100, en un rapport (ingrédient principal/durcisseur I) de 100/1 en masse. Le fragment de tissu dur le imprégné du liquide d'immersion secondaire 2b a été chargé dans une cavité 4a d'un moule d'inclusion 4 (Histoform disponible auprès de Heraeus Kulzer) de la manière représentée sur la figure 3, et un liquide d'inclusion 2c comprenant comme ingrédient principal du Technovit 7100, l'initiateur de polymérisation précité et un accélérateur de durcissement, qui était un durcisseur II du Technovit 7100 contenant des dérivés d'acide barbiturique, en un rapport (liquide d'immersion secondaire/durcisseur II) de 15/1 en volume, a été introduit dans la cavité 4a, de telle sorte que le fragment de tissu dur le soit immergé dans le liquide d'inclusion 2c. Après l'avoir laissé à température ambiante pendant 1 heure, le fragment de tissu dur le dans le liquide d'inclusion 2c a été réchauffé à 37 C pendant 1 heure, pour polymériser l'ingrédient principal Technovit 7100. Un échantillon 10a comprenant le fragment de tissu dur ld inclus dans une résine 2d formée de Technovit 7100 a été retiré du moule 4 et immergé dans une solution aqueuse à 5 % en masse d'acide formique à température ambiante pendant 5 jours de la manière représentée sur la figure 5, pour décalcifier le fragment de tissu dur ld. Un échantillon 10b comprenant un fragment de tissu dur décalcifié le a été lavé avec un courant d'eau, déshydraté successivement avec une solution aqueuse à 70 % en volume d'éthanol, une solution aqueuse à 96 % en volume d'éthanol, et de l'éthanol anhydre, et a été réinclus dans la résine Technovit 7100 en utilisant le liquide d'immersion primaire, le liquide d'immersion secondaire et le liquide d'inclusion précités, de la manière indiquée cidessus. L'échantillon réinclus 10c a été fixé à un bloc de support 7 (Histoblock disponible auprès de Heraeus Kulzer) avec un adhésif 8 (Technovit 3040 disponible auprès de Heraeus Kulzer) de la manière représentée sur la figure 9. L'échantillon réinclus 10c fixé au bloc de support 7 (voir la figure 10) a été débité en coupes de 4 gm d'épaisseur au moyen d'un microtome, et la coupe mince résultante a été étalée sur de l'eau distillée, placée sur une lame de verre et séchée à 60 C pendant 15 minutes. Puis elle a été colorée avec de l'hématoxiline-éosine (HE), et une lamelle couvre-objet y a été appliquée hermétiquement. L'échantillon en coupe résultant d'hydroxyapatite décalcifiée contenant les cellules a été observé au microscope optique. Les figures 11 à 14 sont des photomicrographies de l'échantillon de tissu. La figure 11 représente le tissu total de l'échantillon à un grossissement de 4 fois et les figures 12 à 14 sont des photographies agrandies (grossissement: 20 fois) de chaque partie du tissu représenté sur la figure 11. Il est manifeste d'après les figures 11 à 14 qu'une structure tissulaire fine est nettement observée dans l'échantillon produit par le procédé de la présente invention, ce qui suggère que la structure fine totale du tissu dur a été maintenue à l'état non dissocié. Exemple 2 Un échantillon sous forme de coupe d'hydroxyapatite décalcifiée contenant des cellules a été produit de la manière indiquée dans l'exemple 1, à l'exception de l'utilisation d'hydroxyapatite ultraporeuse (HAp-S) ayant un diamètre de 5 mm, une épaisseur de 2 mm, et une porosité de 85 % avant de fixer les cellules, hydroxyapatite à laquelle des ostéoblastes clonaux disponibles dans le commerce [cellules HOS (d'ostéosarcome humain)] ont été fixés et cultivés. Les figures 15 à 17 sont des photomicrographies optiques de l'échantillon résultant. Exemple 3 Un échantillon sous forme de coupe d'hydroxyapatite décalcifiée contenant des cellules a été produit de la manière indiquée dans l'exemple 2, à l'exception de sa coloration avec du bleu de toluidine. Les figures 18 et 19 sont des photomicrographies optiques de l'échantillon résultant. De la manière représentée sur les figures 15 à 19, même lorsque l'hydroxyapatite ultraporeuse a été utilisée, une structure tissulaire fine a été nettement observée comme dans le cas de l'utilisation de l'hydroxyapatite ayant la porosité habituelle (exemple 1). La présente invention décalcifiant un tissu dur après inclusion dans une résine permettant la pénétration des liquides, elle peut produire un échantillon de tissu dur décalcifié de manière simple à un faible coût tout en maintenant la structure fine du tissu dur. Le procédé de la présente invention ayant une telle caractéristique convient particulièrement à la production d'échantillons de tissus durs décalcifiés d'os artificiels, etc. auxquels des cellules, etc. sont fixées et cultivées. Il va de soi que la présente invention n'a été écrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié, caractérisé en ce qu'il comprend l'inclusion dudit tissu dur dans une résine permettant la pénétration des liquides et ensuite sa décalcification. 2. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit tissu dur inclus décalcifié est réinclus dans une résine. 3. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit tissu dur est un tissu dur vivant, un premier composite comprenant un support constitué d'un agent de remplacement de tissu dur vivant et de cellules, un deuxième composite comprenant ledit support et ledit tissu dur vivant, ou un troisième composite comprenant ledit support, lesdites cellules et ledit tissu dur vivant. 4. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 3, caractérisé en ce que ledit agent de remplacement de tissu dur vivant est constitué d'un composé de calcium. 5. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 4, caractérisé en ce que ledit composé de calcium est l'hydroxyapatite. 6. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellule motrices. 7. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites cellules motrices consistent en au moins un type de cellules choisi dans le groupe consistant en des ostéoblastes, des cellules du type ostéoblaste, des cellules osseuses, des cellules du cartilage, des cellules musculaires et leurs cellules souches, cellules précurseurs et cellules tumorales. 8. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite résine permettant la pénétration des liquides est un polymère de (méth)acrylate d'hydroxyalkyle. 9. Procédé pour la production d'un échantillon de tissu dur décalcifié suivant la revendication 8, caractérisé en ce que ledit (méth)acrylate d'hydroxyalkyle est le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle.