Brevet FR2881435A1 — publié le 20060804

La présente invention se rapporte au domaine de la biologie animale. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de développement in vitro d'embryons aviaires à partir d'ovocytes aviaires prélevés lors de leur transit dans l'oviducte ou d'embryons prélevés avant oviposition c'est à dire à des stades précoces de développement, comprenant les étapes d'hydratation de l'albumen de l'oeuf si nécessaire dans un milieu d'hydratation comprenant du glucose de sorte que le volume d'albumen et la concentration en glucose dans l'albumen soient physiologiquement compatibles avec un développement embryonnaire ultérieur puis facultativement de fertilisation in ro vitro des ovocytes prélevés et de développement in vitro de l'embryon. Le procédé selon l'invention, combiné aux techniques de transfert nucléaire, de micro-injection de matériel génétique, d'injection de cellules animales, est particulièrement utile à l'obtention d'animaux aux caractéristiques agronomiques particulières ou d'animaux destinés à la production de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou vétérinaire. La maîtrise des techniques d'ovulation in vitro, de fécondation in vitro et de développement in vitro des oiseaux, et notamment des espèces aviaires constitue un important enjeu économique. En effet, les oiseaux, et notamment les espèces aviaires d'élevage, sont susceptibles d'être utilisés pour la production en large quantité dans les oeufs de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou vétérinaire. Par ailleurs, une telle maîtrise permettrait d'accélérer le développement d'espèces aviaires d'élevage aux performances agronomiques particulières ce qui constituerait un avantage économique important. Les différentes techniques d'ovulation in vitro, de fécondation in vitro et les techniques de modification génétique des embryons sont relativement bien maîtrisées chez les mammifères. Or les différences dans la biologie du développement des mammifères et des oiseaux ne permettent pas de transposer directement aux oiseaux nos connaissances acquises et les techniques développées chez les mammifères, notamment la souris. Chez la poule, dans les conditions physiologiques normales, la fécondation par les spermatozoïdes du coq a lieu dans le tractus génital cinq à dix minutes après l'ovulation. Le développement embryonnaire commence immédiatement après la fécondation. La première division cellulaire a lieu trois heures après la fécondation. Au moment de la ponte ou oviposition, soit vingt à vingt-six heures en moyenne après l'ovulation, l'embryon a déjà atteint le stade X de la classification d'Eyal-Giladi (Eyal-Giladi and Kochan 1976, From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick . "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337). A ce stade, l'embryon comprend alors déjà en moyenne 30 000 à 50 000 cellules. L'embryon de poussin provient du disque germinal qui correspond à une petite région du cytoplasme localisée au pôle animal de l'ovum (familièrement désigné le jaune de l'oeuf). Durant le premier tiers de son développement, to l'embryon est posé à la surface du jaune pendant que les membranes extra-embryonnaires se développent et se vascularisent autour du jaune. Ensuite, l'embryon se développe en puisant dans les réserves alimentaires de l'oeuf. Classiquement, le développement de l'embryon est divisé en trois phases, comme cela est défini ci-après: I)La phase I correspond à la période de développement embryonnaire comprise entre la fertilisation de l'ovocyte et l'oviposition. Cette phase débute dans l'oviducte et se termine par la formation du blastoderme au moment de l'oviposition. - La première étape de la phase I est réalisée dans l'infundibulum de l'oviducte par la formation de la membrane péri-vitelline externe de l'oeuf. Cette membrane est légèrement plus épaisse que la membrane périvitelline interne. - L'oeuf pénètre ensuite dans le magnum où sont sécrétées les protéines constituant l'albumen. L'ceuf séjourne dans le magnum pendant environ trois heures. - L'oeuf poursuit ensuite son développement dans l'isthme de l'oviducte, dans lequel a lieu la synthèse et le dépôt des deux membranes coquillières qui entourent l'albumen. L'oeuf séjourne dans l'isthme pendant environ une heure. - L'ceuf pénètre dans l'utérus dans lequel il séjourne environ dix-neuf à vingt heures. L'albumen double alors de volume par absorption du liquide utérin. Durant son séjour dans l'utérus, l'ceuf subit des divisions cellulaires successives qui donnent naissance à un amas cellulaire organisé en feuillet simple qui recouvre la cavité sub-blastodermique. Au cours du séjour de l'ceuf dans l'utérus, deux évènements vont se succéder, respectivement (a) le plumping qui correspond à l'hydratation des protéines de l'albumen. Le plumping débute au moment de l'entrée de l'ceuf dans l'utérus (soit cinq heures après l'ovulation) et se prolonge jusqu'à dix heures après l'ovulation, et; (b) la minéralisation lente de la coquille. Cet événement de minéralisation comporte trois phases successives: (i) une phase d'initiation qui s'étend de cinq à dix heures après l'ovulation. Cette phase d'initiation correspond au dépôt de cristaux de carbonate de calcium de façon sphérolitique à partir des noyaux mamillaires. Au cours de cette phase d'initiation de la minéralisation, l'oeuf est encore mou; (ii) une phase de calcification qui s'étend de dix à vingt-deux heures après l'ovulation. Cette phase est rapide et intense et correspond au moment où se forme la couche palissadique; et (iii) une phase de terminaison caractérisée par l'arrêt de la minéralisation et la formation d'une cuticule organique contenant des pigments responsables de la couleur de l'oeuf. A la fin de la Phase I, l'oeuf est expulsé par des contractions péristaltiques du vagin, ce qui constitue l'événement de l'oviposition. Pour les poules pondant pendant de longues durées (plusieurs mois) jusqu'à un oeuf par jour, l'ovulation suivante a lieu 10 à 45 minutes après l'oviposition, et le cycle est ainsi répété. II)- La phase II correspond à la morphogenèse embryonnaire. La phase Il débute durant les trois premiers jours de l'incubation de l'oeuf et correspond aux stades 1 à 18 HH définis par Hamburger et Hamilton (1951, J. Morph., volume 88: 49-67). III)- La phase III correspond à la croissance embryonnaire. Cette phase s'étend sur les dix-huit derniers jours de l'incubation de l'oeuf, et correspond aux stades 18 à 45 HH selon Hamburger et Hamilton (1951). Au stade 20, l'embryon a une longueur de 10 mm et le blastoderme extraembryonnaire s'étend autour du jaune jusqu'à son équateur. De nombreuses équipes de recherche travaillent au développement de techniques de transgenèse aviaire. Des poulets transgéniques dont la modification est transmise de façon stable à la descendance ont été obtenus par injection de vecteurs rétroviraux dans la cavité sub-germinale de blastodermes de poulet d'oeufs fraîchement pondus (US5,162,215; Bosselman et a1., 1989 Science 243:533-534; Thoraval et al., 1995 Transgenic Res. 4:369). La transgenèse utilisant les vecteurs rétroviraux bien que permettant une intégration efficace n'est pas sans inconvénient car la taille du transgène reste limitée, les vecteurs rétroviraux peuvent être instables (délétions, réarrangements), le site d'insertion n'est pas ciblé, le taux d'expression du transgène reste faible et il existe un risque potentiel d'infection virale des descendants, ce qui constitue un obstacle réglementaire important. Le transfert de gène médié par le sperme (SMGT, pour sperm mediated gene transfer ) a également été expérimenté pour obtenir des o oiseaux transgéniques (Baumgartner et al. 1986, Theor. Appl. Genet 72:264; W003/024199). A ce jour, cette technologie demeure faiblement efficace compte tenu des rares évènements d'intégration chromosomique observés. La micro-injection directe d'ADN dans un oeuf constitue une technologie classiquement utilisée pour la production d'animaux transgéniques notamment chez les mammifères tels les rongeurs. Compte-tenu de la biologie du développement des oiseaux, la mise en oeuvre de la microinjection d'ADN soulève des difficultés expérimentales importantes. La situation la plus favorable pour limiter le mosaïcisme consiste à injecter l'ADN au stade 1 cellule. L'accès à un ovocyte juste fertilisé, avant amphimixie des pronucléi mâle et femelle, nécessite le sacrifice de la poule. La micro-injection de l'ADN dans le pronucléus mâle, comme cela se pratique en mammifère, est impossible en raison de la polyspermie et de l'impossibilité de déterminer quel sera le noyau de spermatozoïde qui fusionnera avec le noyau de l'ovocyte. L'ADN ne peut qu'être microinjecté dans le cytoplasme ce qui ne représente pas la situation la plus favorable en raison de la présence d'une activité DNAse. Sang et Perry (1989, Mol Reprod Dev 1:98) ont montré que l'ADN injecté dans le disque germinal avant la première division cellulaire était progressivement perdu lors des 7 premiers jours de développement de l'embryon receveur. Love et al (1994, Biotechnology 12:60) sont les premiers à obtenir des poules transgéniques produites par micro-injection d'ADN et transmission germinale. Néanmoins, jusqu'à aujourd'hui, toutes les tentatives ont donné des résultats limités avec un grand nombre d'animaux mosaïques, et une faible efficacité (faible pourcentage de transmission germinale, faible taux d'expression du transgène). De plus, la technologie reste lourde à mettre en oeuvre. En effet, cette technologie de microinjection d'ADN nécessite de maîtriser au préalable la poursuite du développement de l'embryon en absence d'albumen, de membranes coquillières et de coquille. Perry (1988, Nature 311:70; EP0295964) a été la première à développer un système de développement in vitro d'oeuf fécondé naturellement ou par insémination artificielle et prélevé par intervention chirurgicale après sacrifice de la poule. Selon ce procédé, l'embryon est incubé dans de l'albumen et la coquille d'un oeuf étranger. Perry a ensuite amélioré sa technique en prélevant l'oeuf fécondé sans nécessiter le sacrifice préalable de la poule (WO90/13626) par induction d'une expulsion prématurée par traitement hormonal avec une prostaglandine. Naito et al. to (1990, J. Exp. Zoology 254: 322-326) a amélioré le système de culture de Perry pour atteindre des taux d'éclosion de 34%. EP476946 décrit également un système simplifié in vitro de culture d'embryons d'oiseaux collectés aux stades 32 (6 à 7 h après ovulation) à 100 cellules. Si ces approches ont l'avantage d'éviter le sacrifice de la poule, le nombre de cellules constituant ts l'embryon sera à l'origine d'un mosaïcisme important. Enfin d'autres méthodes de culture in vitro d'oeufs fécondés ont été proposés, voir Ono et al. 1994 (Dev.Biol. 161:126-130), Ono et al. 1996 (Comp.Biochem.Physiol. 113A:287- 292), Kamihira et al. 1998 (Dev.Growth Differ. 40:449-455). Néanmoins le taux d'éclosion obtenu avec ces différentes techniques demeurent très bas. Différentes tentatives de modifications génétiques de l'oeuf embryonné ont été réalisées à des stades plus tardifs du développement embryonnaire, au stade blastodermique X (Eyal Giladi, 1976) qui correspond au stade auquel les oeufs sont pondus. Pour ce faire, Il a fallu développer des techniques permettant d'accéder à l'embryon à travers la coquille, puis de colmater le trou d'accès pour éviter la perte de l'albumen, la dessiccation et les contaminations bactériennes ou virales. Ainsi, des complexes liposome-DNA ont été injectés dans la cavité subgerminale de blastodermes au stade X (Rosenblum et Chen, 1995 Transgenic Res. 4:192; Inada et al. 1997 reprod. Nutr. Dev. 37:13; Maruyama et al., 1998 Poultry Sci 77:52). D'autres technologies ont été utilisées telles le bombardement de micro-particules ou l'injection de plasmide d'ADN dans l'embryon suivi d'une électroporation in ovo (Muramatsu et al.,1997 Biochem Biophys. Res. Commun. 230:376). Afin d'augmenter les chances de transfecter de l'ADN exogène directement dans les cellules germinales, différents groupes de recherche ont ciblé les cellules PGC par transfection in ovo. Watanabe et al. (1994, Mol. Reprod. Dev. 38:268) ont injecté des complexes liposomes-DNA dans les veines marginales de l'embryon au stade 11-15 EG. Li et al. (1995 Transgenic Res. 4:26;) ont transfecté des PGC dans le croissant germinal de l'embryon en utilisant le bombardement de micro-particules. Cependant à ce jour, le rendement de ces méthodes de transfection in ovo demeure relativement faible. Un des désavantages des différentes stratégies précédemment énumérées est leur incapacité à conserver le transgène, à le transmettre et à l'exprimer de manière stable et à des taux d'expression élevé dans les cellules filles. La transgenèse utilisant des intermédiaires chimériques permettrait de Io surmonter ces désavantages mais nécessite de disposer d'une source de cellules donneuses capables de contribuer à la formation de chimères transmettant le transgène à la descendance. De telles cellules doivent pouvoir être manipulées génétiquement en culture tout en conservant leur propriétés. Les cellules primordiales germinales (PGC) et les cellules souches ts embryonnaires totipotentes ou pluripotentes de poulet sont susceptibles d'avoir ces propriétés. Des résultats encourageants ont été obtenus avec la technologie de formation de chimères à partir de PGC (Vick et al. 1993 Proc. R. Soc. Lond. B 251:179). Néanmoins, cette technologie de formation de chimères à partir de PGC nécessite la maîtrise de culture des PGC afin de pouvoir les modifier génétiquement in vitro. La technologie de formation des chimères à partir de cellules blastodermiques au stade X EG apparaît également prometteuse (voir Petitte et al., 1990 Development 108:185; Carscience et al. 1993 Development 117: 669). Cependant, à ce jour des chimères somatiques et de la lignée germinale n'ont pu être obtenues qu'à partir de cellules blastodermiques fraîchement isolées et donc non modifiées génétiquement. La capacité à maintenir en culture les populations de cellules blastodermiques totipotentes demeure difficile (Etches et al., 1996 Mol. Reprod.Dev. 45:291; Pain et al. 1996 Development 122:2339). Les différentes approches technologiques développées en transgenèse aviaire à ce jour ne donnent pas satisfaction. Les conditions physiologiques particulières dans lesquelles se développe l'embryon d'oiseau et les difficultés qu'elles soulèvent au plan expérimental sont probablement la cause principale des échecs répétés auxquels ont, jusqu'à ce jour, abouti la majorité des tentatives: oeuf télolécithe entouré de plusieurs enveloppes (coquille, membranes coquillières, albumen) qui rendent l'accès au noyau particulièrement malaisé. - quantités considérables de vitellus empêchant d'une part la visualisation s directe du noyau de l'ovocyte sous microscope et rendant d'autre part cet ovocyte particulièrement fragile et difficile à manipuler. - Contact étroit entre cellules embryonnaires ouvertes et vitellus pendant les premières heures du développement de l'embryon (jusqu'aux stades 5-6 de la classification de Eyal-Giladi (1976). - Présence d'une activité DNAase I et II dans le disque germinal, croissante au cours de la maturation ovocytaire. Cette activité est susceptible d'être impliquée dans la régulation de la polyspermie chez la caille et il est possible qu'elle soit responsable de la rapide dégradation des fragments de DNA introduits dans les oeufs fécondés. - Rôle fondamental de l'albumen et de la coquille dans le développement embryonnaire. - Stade avancé de développement de l'embryon qui compte entre 30000 et 50000 cellules à l'oviposition; même si les cellules isolées à partir d'un embryon à oviposition peuvent être cultivées in vitro, amplifiées et modifiées, les difficultés rencontrées pour la transmission germinale des caractères, innés ou acquis par la modification, de ces cellules semblent suggérer qu'à ce stade de développement les cellules souches embryonnaires aviaires présentes dans l'oeuf ne sont pas totipotentes ou ont perdu leur totipotence et/ou qu'elles sont peu nombreuses, rendant leur isolement difficile. Les différentes techniques de développement in vitro d'un embryon de poulet jusqu'à l'obtention d'un poussin vivant impliquent une étape de fertilisation in vivo, c'est-à-dire par accouplement naturel ou par insémination artificielle. En d'autres termes, les techniques in vitro de développement de l'embryon de poulet accessibles à l'homme du métier ne permettent pas aujourd'hui un contrôle de l'étape de fertilisation de l'oeuf. Or la possibilité du contrôle de l'étape de fertilisation de l'oeuf est essentielle à la maîtrise des manipulations génétiques de l'embryon. Il existe donc clairement un besoin urgent de disposer d'un procédé in vitro complet de développement d'embryons aviaires à partir d'ovocytes aviaires prélevés lors de leur transit dans l'oviducte s ou d'embryons prélevés avant oviposition à des stades précoces de développement. Un tel procédé éviterait le sacrifice systématique de la poule et permettrait de faciliter les différentes approches de transgenèse. C'est le problème que se propose de résoudre la présente invention en fournissant un procédé in vitro de développement d'un embryon d'un oiseau dans son propre albumen à des stades de développement embryonnaire précoces. En effet, de manière surprenante les inventeurs ont démontré la possibilité de réaliser un développement embryonnaire complet in vitro d'un oeuf embryonné aux stades précoces du développement (entre 3H00 et 14H00 o post-ovulation) sans la nécessité d'incuber l'oeuf dans de l'albumen exogène. Les inventeurs ont en effet mis en évidence le rôle prépondérant du volume de l'albumen et de la concentration en glucose de l'albumen dans le développement de l'oeuf embryonné aux stades précoces du développement, c'est-à-dire entre 3H00 et 14H00 post-ovulation. Cette découverte permet d'envisager la maîtrise de la maturation et du développement de l'ovocyte et de l'oeuf embryonné à des stades de développement au cours desquels l'ceuf possède une coquille molle. La capacité à manipuler des oeufs à coquille molle permet de surmonter les difficultés précédemment évoquées rencontrées au niveau expérimental et permet en outre d'envisager la réalisation de la transgenèse et du clonage aviaire. Enfin, de manière surprenante, les inventeurs ont également démontré la possibilité de réaliser avec succès la fécondation in vitro d'ovocytes d'oiseau, notamment de poule, à un stade de développement des ovocytes largement postérieur au stade de développement auquel ils sont naturellement fécondés par accouplement naturel ou par insémination artificielle dans l'oviducte. Ainsi, alors que l'événement de fécondation naturelle d'un ovocyte de poule par les spermatozoïdes a lieu dans le pavillon de l'oviducte à peine 30 minutes après l'ovulation, et qu'il était admis dans l'art antérieur (Bernard SAUVEUR, 1988; Reproduction des volailles et production d'ceufs ; Editions INRA (449), p. 49) que la seconde membrane péri-vitelline qui se dépose dans l'infundibulum autour de l'ovocyte aux environs de 30 minutes après l'ovulation empêche la capacitation des spermatozoïdes ainsi que leur pénétration dans l'ovocyte, les inventeurs ont maintenant démontré que, dans des conditions appropriées, il est possible de féconder un ovocyte au stade oeuf mou, c'est-à- dire, âgé de 3H00 jusqu'à 14H00 post-ovulation, c'est- à-dire à un stade de développement pour lesquelles les deux membranes péri-vitellines sont présentes. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé in vitro de développement d'un embryon d'un oiseau dans son propre albumen caractérisé 5 en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'un ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation, de manière préférée 3h00 et 14h00 et caractérisé en ce qui le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; o b) facultativement mise en contact du dit ovocyte non- fécondé entouré de son propre albumen de l'étape a) avec une quantité appropriée de spermatozoïdes dans des conditions appropriées permettant d'obtenir un ovocyte fécondé ; c) incubation du dit ovocyte d'oiseau fécondé, de l'étape a) ou b), entouré de son propre albumen à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. Selon l'invention, on entend par embryon d'oiseau , au sens de l'invention, un embryon aux différents stades de son développement depuis le stade zygote (stade 1 cellule avec les deux génomes parentaux) jusqu'à l'éclosion. Ainsi, selon l'invention, on désigne embryon d'oiseau aussi bien un ovocyte fécondé que les différents stades multicellulaires du développement de l'embryon de la phase 1 à la phase III telles que précédemment décrites, en particulier un embryon allant des stades I à x du développement de l'embryon tel que définis par Eyal Giladi (1976) et 1 à 45 du développement de l'embryon tel que définis par Hamburger et Hamilton (1951). Par développement d'embryon , on entend désigner que l'embryon est capable de passer avec succès tout ou partie des étapes successives du développement embryonnaire aviaire telles que définies par Eyal-Giladi (étapes 30 I à x EG) et Hamburger et Hamilton (étapes 1 à 45 HH). Par temps post-ovulation on entend désigner le temps écoulé depuis la libération du jaune de l'oeuf à partir de l'ovaire. Pratiquement, on détermine avantageusement le moment de l'ovulation comme se situant au temps 30 minutes après la dernière ponte ou oviposition . Le moment de la dernière ponte peut être déterminé aisément, soit par observation directe, soit de manière automatisée, par exemple en utilisant des cages munies d'un dispositif de détection de la ponte et d'enregistrement de l'heure de ponte, disponible dans le commerce. Le dit ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation est obtenu par la mise en oeuvre d'un technologie choisie parmi un traitement chimique ou biologique, de préférence hormonal et l'intervention chirurgicale. Les hormones utilisées pour provoquer l'ovulation artificielle sont de préférence les prostaglandines, de la vasopressine ou des composés analogues. De o préférence, les ovocytes au stade de développement compris entre 3h00 et 6h30 sont prélevés par intervention chirurgicale. Les ovocytes au stade de développement compris entre 6h30 et 24h00, de préférence 6h30 et 14h00 sont expulsés par injection de prostaglandine. Les ovocytes d'oiseau (3h00-24h00 post-ovulation) selon l'invention sont entourés d'albumen, dont le degré d'hydratation et la concentration en glucose varie avec le stade du développement embryonnaire. Avant 3h00 post-ovulation, le dit ovocyte n'est pas entouré d'albumen. Celui-ci commence à se déposer à partir de 3h00 post-ovulation. Selon un premier mode de réalisation, le dit ovocyte d'oiseau fécondé ou non-fécondé selon l'invention est au stade de développement compris entre environ 3h00 et environ 24h00 post-ovulation (ce qui correspond à l'ceuf pondu). De manière préférée, le dit ovocyte d'oiseau fécondé ou non-fécondé selon l'invention est au stade de développement compris entre environ 3h00 et 14h00. Selon un premier mode de réalisation, le dit ovocyte d'oiseau fécondé ou non-fécondé selon l'invention est au stade de développement compris entre environ 6h30 et environ 12h00 post-ovulation. Selon un second mode de réalisation, le dit ovocyte d'oiseau, fécondé ou nonfécondé, est au stade de développement compris entre environ 12h00 et environ 14h00 post-ovulation. Lorsque le dit ovocyte obtenu est au stade de développement compris entre les temps 3 heures et 14 heures postovulation, de préférence entre les temps 3 heures et 12 heures postovulation, le dit procédé de développement in vitro d'embryon d'oiseau comprend une étape supplémentaire d) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. En effet, au cours de la formation de l'oeuf, on assiste à une augmentation progressive du volume de l'oeuf et notamment un augmentation 35 du volume de l'albumen dans l'oeuf ou dans l'ovocyte non fécondé, pour Il atteindre au bout de quelques heures de développement un certain volume maximal, correspondant à une valeur plateau . Par exemple, cette augmentation atteint un plateau chez la poule, 15H00 après l'ovulation; le volume d'albumen dans l'oeuf est alors d'environ 40 ml (cf Figure N 1); ce volume pouvant néanmoins varier légèrement selon les races de poules et les individus. Selon l'invention, l'étape d) de réhydratation, a pour objet d'hydrater l'albumen afin d'atteindre le volume d'albumen correspondant à la valeur plateau . L'hydratation est arrêtée lorsque cette valeur plateau est atteinte. Cette étape d'hydratation est facultative et dépend du stade de développement embryonnaire concerné. Ainsi, à des stades précoces de développement, compris entre environ 3H00 et 14H00 post-ovulation, et de préférence 3H00 et 12H00 l'étape d'hydratation est indispensable afin d'atteindre un volume d'albumen physiologiquement compatible avec un développement embryonnaire ultérieur. Au delà de 12H00 post-ovulation, l'étape d'hydratation est facultative étant donné que l'oeuf fécondé ou l'ovocyte a atteint un volume d'albumen suffisant pour permettre un développement embryonnaire ultérieur. II est bien entendu à la portée de homme du métier de déterminer, en fonction de l'espèce aviaire, de la sous-espèce ou de la race, le volume d'albumen correspondant à la valeur plateau . De même, les inventeurs ont constaté au cours du développement embryonnaire le rôle prépondérant de la concentration de glucose dans l'albumen. Au cours du développement, on assiste à une augmentation de la concentration en glucose dans l'albumen (cf figure N 1) pour atteindre au bout de quelques heures de développement un certaine valeur maximale plateau . Par exemple, cette valeur maximale plateau chez la poule, est atteinte entre 14H00 et 24H00 après l'ovulation et est d'environ 3,5 g/L. Cette valeur peut varier légèrement selon les sous-espèces ou races de poule. II est bien entendu à la portée de homme du métier de déterminer, en fonction de l'espèce aviaire ou de la sous-espèce ou race, la concentration maximale en glucose de l'albumen. A titre d'exemple de techniques utilisées, on peut citer la technique décrite dans Simon et Leclercq, 1982 ( Longitudinal Study of adiposity in Chickens selected for high or Low Abdominal Fat Content: Futher Evidence of a glucose- lnsulin Imbalance in the Fat Line. " by Jean SIMON and Bernard LECLERCQ, The Journal of Nutrition, Vol. 112, October 1982 The American Institute of Nutrition ) où la mesure du glucose est basée sur la réaction enzymatique de la glucose oxydase. C'est à partir de la consommation d'oxygène mesurée par une électrode spécifique que l'on détermine la concentration de l'échantillon en glucose. s Selon l'invention, l'étape de réhydratation d) a également pour objet d'augmenter la concentration en glucose de l'albumen afin d'atteindre la concentration correspondant à la valeur maximale plateau . L'hydratation en présence de glucose est arrêtée lorsque cette valeurplateau est atteinte. Cette étape d'hydratation en présence de glucose est facultative et dépend du stade de développement embryonnaire concerné. Ainsi, à des stades précoces de développement, compris entre 3H00 et 14H00 post-ovulation, et de préférence 3H00 et 12H00, l'étape de réhydratation en présence de glucose est indispensable afin d'atteindre une concentration en glucose dans l'albumen physiologiquement compatible avec un développement embryonnaire ultérieur. Au stade environ 12H00-14h00 post-ovulation et au-delà, l'étape de réhydratation en présence de glucose est facultative étant donné que l'oeuf fécondé ou l'ovocyte présente un volume d'albumen et une concentration de glucose notamment suffisants pour permettre un développement embryonnaire ultérieur. II est bien entendu que l'étape de réhydratation pour augmenter le volume d'albumen et l'étape d'augmentation de la concentration en glucose sont de préférence réalisées simultanément. Néanmoins, il peut être envisagé de ne réaliser que l'étape d'augmentation du volume d'albumen ou que l'étape d'augmentation de la concentration en glucose. Il peut être également envisagé de réaliser l'étape d'augmentation du volume d'albumen et l'étape d'augmentation de la concentration en glucose de manière successive ou décalée dans le temps. De manière préférée, l'étape de réhydratation est réalisée pour augmenter le volume d'albumen ainsi que la concentration en glucose dans 3o l'albumen, pour des ovocytes aux stades de développement compris entre 3H00 et 14H00 post-ovulation, de préférence 3H00 et 12H00. Pour des ovocytes aux stades de développement compris entre 12H00 et 24H00 postovulation, cette étape est facultativement omise. L'étape de réhydratation d) est arrêtée lorsque le volume d'albumen 35 réhydraté et la dite concentration en glucose dans l'ovocyte, fécondé ou no- fécondé, correspondent aux valeurs physiologiques normales après la réhydratation naturelle de l'albumen dans l'espèce aviaire considérée. Chez la poule les dites valeurs physiologiques normales sont environ 40 ml d'albumen et environ 3,4g1L de glucose dans le dit albumen. De préférence, l'étape de réhydratation a une durée limitée afin de favoriser la viabilité de l'embryon. De préférence cette durée est comprise entre 1 et 5 heures, de préférence entre 2 et 4 heures, de manière préférée entre 2,5 et 3,5 heures, de manière encore plus préférée pour une durée d'environ 3 heures. La composition du milieu de réhydratation est idéalement une composition saline similaire en composition au fluide biologique naturellement absorbé par l'albumen dans l'utérus. Le milieu d'hydratation est de préférence un milieu de culture de base de préférence complémenté en glucose de sorte que la concentration en glucose dans le dit milieu permette d'atteindre la valeur maximale plateau pendant la durée de la période de réhydratation. Le milieu de réhydratation peut comprendre en outre des antibiotiques (par exemple pénicilline-streptomycine). Par milieu de culture de base, on entend désigner un milieu de culture cellulaire comprenant les composants nécessaires et suffisants à la survie et à la croissance cellulaire, sans qu'une complémentation dudit milieu soit nécessaire par des facteurs trophiques, des cytokines ou des hormones par exemple. A titre d'exemple de milieu de base, on peut citer le milieu MEM (Minimum Eagle's Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium), BT88, HAM-F12, MacCoy, RPMI1640 ou des mélanges de ceux-ci. La concentration en glucose dans le milieu d'hydratation est comprise entre 4 g/L et 10 g/L, avantageusement entre 5 g/L et 9 g/L et préférentiellement de 7 g/L à 8 g/L. De manière préférée, la concentration en glucose dans le milieu de réhydratation est d'environ de 7,5 g/L. Le procédé selon l'invention se caractérise en ce que la dite température des étapes d'incubation c) et de réhydratation d) sont comprises entre 38 et 42 C, de préférence entre 39 C et 41 C. la température étant maintenue sensiblement constante, de préférence à +1- 1 C et encore mieux +/0,5 C, durant toute la durée du procédé. De manière préférée, la dite température est d'environ 41 C. Quelle que soit la température du milieu de culture choisie, dans la gamme de température ci-dessus, il est essentiel que ladite température choisie soit maintenue constante durant la totalité des étapes c) et d). Par température constante, on entend selon l'invention une température qui varie d'au plus 1 C, et de manière tout à fait préférée d'au plus 0,5 C, par rapport à la température de référence choisie. En effet, les inventeurs ont montré que si la température d'immersion de l'ovocyte fécondé ou non fécondé n'est pas constante dans le temps, c'est-à-dire si celle-ci varie de plus de 1 C, par rapport à la température choisie, les fonctions physiologiques de l'ovocyte peuvent être altérées et empêcher sa survie ainsi que le développement subséquent d'un embryon. L'étape c) comprend de préférence les sous-étapes suivantes: cl) incubation du dit ovocyte fécondé à une température de 41 C pendant 10 environ 20 heures; puis c2) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. Selon un mode préféré de réalisation, lorsque l'ovocyte, fécondé ou nonfécondé est âgé de 3h00 à 6h30, la dite incubation de l'étape c) est réalisée en milieu liquide, telle par exemple dans un milieu de culture cellulaire de base de type MEM ou DMEM sans adjonction de glucose dans le milieu. Lorsque l'ovocyte fécondé ou non-fécondé est âgé de 6h30 à 24h00, de préférence 6h30 àl4hOO, l'ovocyte est pourvu d'une coquille molle, et il est recommandé de réaliser l'étape d'incubation c) de préférence à sec dans un récipient type mortier ou verre à pied. Comme cela a déjà été mentionné ci-dessus, on procède de préférence à l'étape d) de réhydratation lorsque l'ovocyte fécondé ou non fécondé est âgé de 6h30 à 24h00. La présente invention fournit également un procédé in vitro d'obtention d'oiseaux comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon d'oiseau par le procédé selon l'invention précédemment décrit; b) transfert de l'embryon entouré de son propre albumen, obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon d'un angle maximum de 30 par heure. L'incubation est poursuivie jusqu'au stade 44 HH environ. d) incubation à environ 37,5 C, sans retournement dans des conditions appropriées d'hygrométrie, de gaz carbonique, etc...pour permettre l'éclosion de l'oeuf. Ces conditions sont bien connues de l'homme du métier. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le ou les ovocytes d'oiseau obtenus à l'étape a) sont des ovocytes préalablement et naturellement s fécondés in vivo ou par insémination artificielle. Alternativement, le procédé selon l'invention rend pour la première fois possible la fécondation in vitro d'ovocytes aviaires à des stades tardifs du développement compris entre 3H00 et 24H00 post-ovulation, de préférence entre 3h00 et 14H00 post-ovulation. Le procédé selon l'invention comprend o donc en outre une étape de fécondation in vitro, par mise en contact dans un milieu de culture approprié du ou des dits ovocytes obtenus à l'étape a) avec une quantité appropriée de spermatozoïdes, puis l'étape de récupérer les ovocytes fécondés. L'étape de fécondation in vitro peut être réalisée après l'étape a) et avant, pendant ou après l'étape b) de réhydratation et avant l'étape d'incubation c). De manière surprenante, les inventeurs ont en effet montré que les spermatozoïdes sont capables de féconder des ovocytes plus de 3 heures après l'ovulation, et même jusqu'à au moins 14 heures après l'ovulation et au maximum avant 24 heures post-ovulation. A ces stades de développement, vocyte possède des membranes vitellines internes et externes. Il était auparavant expressément admis que les spermatozoïdes étaient incapables de passer à travers les membranes vitellines de l'ovocyte. Afin de réaliser la fécondation in vitro des ovocytes obtenus au stade de développement compris entre 3h00 et 24h00 post-ovulation, de préférence 3h00 et 14h00 post-ovulation, les spermatozoïdes aviaires, prélevés selon des techniques bien connues de l'homme du métier, sont mis en contact avec le ou les ovocytes matures par addition de la solution contenant les spermatozoïdes directement à la surface de l'ovocyte. La solution contenant les spermatozoïdes possède de préférence une densité supérieure au milieu de culture. Cette densité supérieure peut être obtenue en ajoutant des composants à forte densité dans la solution, tels par exemple du polyéthylène glycol (PEG) ou des polymères de dextran. Selon un premier mode de réalisation, les spermatozoïdes proviennent du sperme d'un animal, ou d'un mélange de spermes issus de plusieurs mâles. 35 Lorsqu'il proviennent du même mâle, les spermatozoïdes proviennent de plusieurs prélèvements successifs à partir du mâle. Les prélèvements peuvent être, dans certains cas, conservés sous forme congelée, puis facultativement rassemblés avant leur mise en contact avec l'ovocyte mature. Afin de réaliser la fécondation in vitro, le sperme est dilué. A titre d'exemple, les spermatozoïdes de coq sont de préférence dilués à raison d'un rapport de 1/100 à 1/1000 en volume, mieux d'un rapport d'environ 1/200 à 1/600 en volume, dans une solution tampon saline, telle que du PBS ( Phosphate Buffered Saline ) dépourvu d'ions calcium et magnésium. Le taux de dilution de la solution de spermatozoïdes utilisée pour réaliser la fécondation in vitro dépend du stade de développement des ovocytes utilisés. Cette solution de spermatozoïdes est utilisée à une température comprise entre 18 C et 25 C, de préférence entre 19 C et 23 C et de manière tout à fait préférée à 20 C. De préférence, les spermatozoïdes sont mis en contact localement avec le disque germinal de l'ovocyte mature. Alternativement, les spermatozoïdes sont dilués dans un milieu de culture identique au milieu de culture contenant l'ovocyte, puis sont laissés en contact avec ce dernier pendant une durée d'au moins cinq minutes, de préférence d'au moins dix minutes, avant l'élimination de ces spermatozoïdes, par exemple par des rinçages successifs du récipient de culture avec un milieu de culture approprié, par exemple un milieu de base de type DMEM. Dans l'étape de fécondation, chaque ovocyte est mis en contact avec un nombre de spermatozoïdes compris entre 1 et 10 milliard, de préférence entre 1000 et 10 000 000. De manière tout à fait préférée, le rendement du procédé d'obtention in vitro d'ovocytes fécondés chez la poule est optimal lorsque le nombre de spermatozoïdes qui est mis en contact avec un ovocyte mature est compris entre 100 000 et 200 000. Des ovocytes prélevés de 3 à 12 heures après l'ovulation sont mis en contact de préférence avec une solution de spermatozoïdes dilué à raison d'un rapport 1/400 à 1/800 en volume, mieux de 1/500 à 1/700 en volume et encore mieux une dilution d'environ 1/600. De préférence, dans ce cas, la fécondation in vitro est réalisée de préférence à la suite de l'étape a) et avant l'étape d) de réhydratation. Pour des ovocytes prélevés de 12 heures à 24 heures, de préférence 12 à 14 heures, après l'ovulation; on utilise alors de préférence une solution de 35 spermatozoïdes à une dilution de 1/100 à 1/300 en volume, mieux de 1/150 à 1/250 en volume et encore mieux une dilution d'environ 1/200 en volume. A ce stade de maturation, l'ovocyte et un nombre élevé de spermatozoïdes est nécessaire pour le succès de la fécondation in vitro. De préférence, dans ce cas, l'étape d) de réhydratation est de préférence omise et la fécondation in vitro est réalisée entre les étapes a) et c). Selon un autre mode préféré de réalisation de l'étape a) du procédé, les ovocytes sont désinfectés préalablement à leur hydratation dans le milieu de culture approprié. Préférentiellement la désinfection des ovocytes est réalisée avec une solution aqueuse d'hypochlorite de sodium (Eau de Javel) . On utilise to avantageusement une solution aqueuse d'hypochlorite de sodium ayant un degré chlorométrique allant de 12 Chl (38,04 g/1 de CL2 actif) à 48 Chl (152,16 g/L de Cl2 actif). Juste après la ponte, l'oeuf est désinfecté par passages successifs dans un bain eau de javel (0,15% chlore actif) + eau distillée à 41 C puis eau distillée à 41 C. Il est ensuite essuyé à l'aide de papier absorbant puis mis dans un sac à échantillon et incubé à 41 C. Le procédé selon l'invention est particulièrement utile pour permettre la compréhension du développement embryonnaire aviaire à différents stades. C'est également un des objets de la présente invention de fournir un procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau obtenu par transfert nucléaire caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) obtention in vitro d'un ovocyte d'oiseau non fécondé au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation, de préférence compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation et caractérisé en ce que le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; b) facultativement, énucléation ou destruction du noyau du dit ovocyte obtenu à l'étape a) ; c) fusion d'une cellule aviaire donneuse de noyau avec le dit ovocyte de l'étape a) ou b) ou insertion d'un noyau de cellule aviaire donneuse de noyau dans le dit ovocyte de l'étape a) ou b) dans des conditions permettant d'obtenir un embryon. d) facultativement, activation de l'embryon obtenu à l'étape c) ; e) incubation du dit embryon, entouré de son propre albumen, à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. De préférence l'étape e) comprend les sous-étapes suivantes: f) incubation du dit embryon à une température de 41 C pendant environ 20 heures; puis g) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise 5 entre 52 et 76 heures. Au sens de l'invention, l'embryon obtenu à l'étape c) du procédé cidessus, qui résulte de la fusion d'une cellule aviaire donneuse de noyau avec l'ovocyte obtenu à l'étape a) ou à l'étape b), peut être appelé embryon chimère . to En outre, lorsque le dit ovocyte d'oiseau non fécondé est au stade de développement compris entre les temps 3 heures et 14 heures postovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte comprise entre les étapes a) et e) et telle que précédemment décrite. De préférence l'étape de réhydratation de l'albumen est réalisée par un incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L. L'invention fournit également un procédé in vitro d'obtention d'oiseaux chimères comprenant les étapes suivantes: développement in vitro d'un embryon d'oiseau obtenu par le procédé in vitro précédent de développement d'un embryon d'oiseau par transfert nucléaire; transfert de l'embryon entouré de son propre albumen obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'oeuf telles que définies précédemment. facultativement, sélection du ou des oiseaux reconstitués dont au moins une des cellules comprend un noyau de cellule aviaire donneuse. Par transfert nucléaire ou transfert de noyau, on entend désigner le transfert de noyau d'une cellule donneuse provenant d'un premier oiseau dans le cytoplasme d'une cellule receveuse énucléée d'un second oiseau de la même espèce ou d'une espèce différente ou d'une race différente. a) b) c) d) e) La cellule aviaire donneuse de noyau et le dit ovocyte d'oiseau non fécondé sont choisis parmi des cellules de la même espèce aviaire et les cellules de deux espèces ou de deux races aviaires différentes. Les cellules donneuses de noyau sont indifféremment à l'état prolifératif ou à l'état de quiescence. L'état de quiescence qui correspond au stade Go/G1 du cycle cellulaire est obtenue par exemple chez les cellules en culture par inhibition de contact ou par privation en sérum. L'état prolifératif peut être considéré comme correspondant à tous les autres stades du cycle cellulaire. La cellule donneuse est sélectionnée parmi les cellules souches embryonnaires aviaires totipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules primordiales germinales (PGC) et les cellules somatiques. En outre, la cellule donneuse de noyau peut être génétiquement modifiées ou bien non modifiées génétiquement. La cellule receveuse est l'ovocyte obtenu par le procédé selon l'invention. Cet ovocyte peut être non-fécondé (génome haploïde) ou bien fécondé (génome diploïde). De préférence, l'ovocyte n'est pas fécondé. L'invention fournit également un procédé in vitro de développement d'un embryon chimérique d'oiseau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) obtention d'un ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation, de préférence entre les temps 3h00 et 14h00 post- ovulation et caractérisé en ce qui le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; b) facultativement mise en contact du dit ovocyte non-fécondé entouré de son propre albumen de l'étape a) avec une quantité appropriée de spermatozoïdes dans des conditions appropriées permettant d'obtenir un ovocyte fécondé ; c) injection d'au moins une cellule aviaire exogène, de préférence de plusieurs cellules aviaires exogènes, dans des conditions appropriées de sorte que les dites cellules exogènes participent au développement de l'embryon, de sorte à former un embryon chimérique. d) incubation du dit embryon chimérique entouré de son propre albumen à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. De préférence, l'étape d) comprend les sous-étapes suivantes: e) incubation du dit embryon chimérique à une température de 41 C pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. Par cellule exogène au sens de la présente invention, on entend o désigner une cellule qui n'appartient pas à l'embryon. La cellule exogène et le dit ovocyte d'oiseau sont choisis parmi des cellules de la même espèce aviaire et les cellules de deux espèces ou de deux races aviaires différentes. Ainsi, la cellule exogène peut provenir d'une souche aviaire d'intérêt économique. La cellule exogène peut être génétiquement modifiée ou bien non modifiée génétiquement. Dans le cadre du développement d'espèces aviaires d'élevage aux performances agronomiques particulières, les dites cellules aviaires exogènes, mais également les cellules donneuses de noyaux, ne sont pas génétiquement modifiées. De préférence, il s'agit de cellules appartenant à une sous-espèces ou à une race présentant des caractéristiques particulièrement intéressantes, et qui proviennent de sous-espèce ou de race différente de celle de l'ovocyte selon l'invention. Dans le cadre du développement d'espèces aviaires transgéniques destinées à la production de protéines recombinantes dans les oeufs, les dites cellules aviaires exogènes, mais également les cellules donneuses de noyaux sont génétiquement modifiées, de sorte que le ou les transgènes qu'elles contiennent dirigent l'expression du ou des gènes codant pour la protéine recombinante d'intérêt dans l'oeuf. Il peut s'agir indifféremment de cellules appartenant ou non à la même sous- espèces ou race. La cellule exogène est sélectionnée parmi les cellules souches embryonnaires aviaires totipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules primordiales germinales (PGC) et les cellules somatiques. De préférence, il s'agit de cellules ES telles que décrit par Pain et al. (1996, Development 122:2339-2348), WO9612793, US5,340,740 et US5,656,479. De préférence, le dit ovocyte d'oiseau non fécondé est au stade de 35 développement compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation, et le dit procédé comprend une étape additionnelle de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation, telle que précédemment décrite, comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 gIL. L'invention fournit également un procédé in vitro d'obtention d'oiseaux chimériques comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'embryons chimériques par le procédé selon l'invention précédent; b) transfert de l'embryon chimérique obtenu à l'étape a) dans une 10 coquille d'oeufs hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées telles que précédemment décrite pour permettre l'éclosion de l'ceuf. e) facultativement sélection du ou des oiseaux chimériques dont au moins une des cellules est exogène. C'est également un des objets de la présente invention de fournir un procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau transgénique obtenu par transgénèse de gènes médiée par les spermatozoïdes (SMGT). Pour ce faire, dans le procédé in vitro selon l'invention de développement d'un embryon d'un oiseau dans son propre albumen, les dits spermatozoïdes à l'étape b) sont génétiquement modifiés, et/ou associés à du matériel génétique exogène, selon des techniques connues de l'homme du métier (voir par exemple W003/024199). De préférence, l'étape c) comprend les sous-étapes suivantes: e) incubation du dit embryon transgénique à une température de 41 C pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. Egalement, lorsque le dit ovocyte non fécondé est au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 14h00, de préférence 3h00 et 12h00 post-ovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle f) de réhydratation de l'albumen par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L telle que précédemment décrite. L'invention fournit également un procédé in vitro d'obtention d'oiseaux transgéniques par SMGT comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon transgénique par le procédé selon l'invention précédent; b) transfert de l'embryon transgénique obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis c) incubation de l'embryon transgénique dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. Io d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'oeuf. e) facultativement, sélection du ou des oiseaux transgéniques ayant intégré tout ou partie du matériel génétique exogène dans au moins une des cellules. L'invention fournit également un procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau transgénique par injection de matériel génétique exogène, selon le procédé in vitro selon l'invention de développement d'un embryon d'un oiseau dans son propre albumen caractérisé en ce que le dit procédé comprend l'étape supplémentaire e) de transférer ou d'injecter du matériel génétique exogène dans le dit ovocyte fécondé obtenu à l'étape a) ou c), de sorte à former un embryon d'oiseau transgénique. De préférence, l'étape c) comprend les sous-étapes suivantes: e) incubation du dit embryon d'oiseau transgénique à une température de 41 C pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. Lorsque le dit ovocyte obtenu est au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation, le dit procédé comprend en outre une étape additionnelle de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte, telle que décrite précédemment, par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L. L'invention fournit également un procédé in vitro d'obtention d'oiseaux transgéniques par injection de matériel génétique exogène comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'embryons d'oiseaux transgéniques par le procédé selon l'invention précédent; b) transfert de l'embryon transgénique obtenu à l'étape a) dans une coquille d'ceuf hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à température de environ 37, 7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'ceuf. to e) facultativement, sélection du ou des oiseaux transgéniques ayant intégré tout ou partie du matériel génétique exogène dans au moins une des cellules. Au sens de la présente invention, on entend désigner par matériel génétique exogène du matériel génétique qui n'appartient pas au matériel 1s génétique de la cellule receveuse. Le matériel génétique exogène, également nommé transgène , est sous la forme d'ADN ou d'ARN, simple ou double brin. De préférence il s'agit d'ADN double brin. Le transgène comprend de préférence l'ensemble des informations nécessaires à l'expression d'un gène d'intérêt dans la cellule receveuse. Le transgène peut:(i) être insérer de manière ciblée dans le génome cellulaire [i.e technologie d'inactivation ciblée d'un ou plusieurs gènes par recombinaison homologue ( Knock-Out ) ; technologie d'insertion ciblée d'un ou plusieurs gènes par recombinaison homologue ( Knock-In )], (ii) être insérer de manière aléatoire dans le génome cellulaire, ou (iii) se maintenir sous forme épisomale dans la cellule (vecteur plasmidique, minichromosome, etc..). Les méthodes pour transfecter le matériel génétique dans la cellule receveuse sont bien connues de l'homme de l'art. Enfin, la présente invention concerne également les oiseaux, transgéniques ou non, chimériques ou non, ainsi que leur descendance obtenus par les procédés selon l'invention. Le terme aviaire ou oiseau selon l'invention se réfère à n'importe quelles espèces, sous- espèces ou races d'oiseaux d'élevage de la classe taxonomique ava. Par oiseau d'élevage , on entend désigner les oiseaux élevés ou susceptibles d'être élevés par l'homme. Le terme oiseau d'élevage s'oppose à celui d ( oiseau sauvage qui ne peuvent être élevés en captivité. Les oiseaux d'élevage comprennent les oiseaux élevés par l'homme à des fins agro- alimentaires, agronomiques, ornementales et/ou d'agrément. Les oiseaux d'élevage à fins agro-alimentaires et/ou agronomiques sont constitués pour l'essentiel par les oiseaux de chair et les oiseaux de ponte, destinés à la consommationalimentaire, et par les oiseaux reproducteurs. A titre d'exemples non limitatifs, il convient de citer le poulet, la poule, la dinde, le canard, l'oie, le faisan, la perdrix, la caille, le pigeon et l'autruche. De préférence, l'oiseau selon l'invention est une poule appartenant de préférence à une des nombreuses souches connues de Gallus gallus, telles que White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New to Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partidge-colored. Parmi les oiseaux d'élevage à des fins ornementales ou d'agrément, il convient de citer de manière non- limitative la colombe, la tourterelle, le pigeon, le paon mais également certains oiseaux exotiques telles la perruche et le perroquet. Enfin, c'est également un objet de l'invention de fournir un procédé d'obtention de cellules souches embryonnaires d'oiseaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de développer in vitro un embryon aviaire selon l'un des procédés selon l'invention, puis récupération des cellules souches embryonnaires constitutives de l'embryon obtenu. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront mieux mis en évidence à la lecture des exemples suivants. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes. FIGURES, Figure N 1: Volume d'albumen et concentration en glucose dans l'albumen en fonction du stade de développement de l'embryon dans l'utérus de la poule. Le temps est exprimé en heure post-ovulation. Figure N 2: Schéma du verre tronconique. Le récipient de culture (1) possède une géométrie générale tronconique dont le diamètre (2) de la partie inférieure de la paroi interne est inférieur au diamètre du follicule pré-ovulatoire. Grâce aux caractéristiques de géométrie du récipient de culture, les ovocytes, lesquels, après décantation par gravité, atteignent le fond dudit récipient, entrent en contact avec la paroi interne du fond dudit récipient sans choc ou contrainte mécanique importante de nature à affecter leur viabilité. En effet, la forme en cône de la paroi interne (3) du fond du récipient de culture se termine vers le fond par une calotte sphérique, ce qui s permet de répartir sur une surface maximale de l'ovocyte mature les contraintes mécaniques dues à l'arrêt de sa course par la surface de la paroi interne du récipient de culture. Selon un mode préférentiel, la paroi interne (3) du récipient possède la géométrie d'une calotte sphérique de 8 à 12 mm de rayon (R) et de préférence de 10 mm de rayon (R). EXEMPLES EXEMPLE 1: ANALYSE DU VOLUME D'ALBUMEN ET DE LA CONCENTRATION EN GLUCOSE DANS L'ALBUMEN A DIFFERENTS STADES DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE CHEZ LA POULE 1.1- Matériels et méthodes: 1.1.1 Obtention des oeufs: Les oeufs à coquille dure, fertilisés ou non, sont pondus naturellement par la poule. Les oeufs mous à des stades plus précoces, 3 à 14 h, sont obtenus soit par chirurgie après sacrifice de la poule pour les oeufs compris entre 0,5 et 6h30 après l'ovulation, soit par expulsion prématurée induite par injection de prostaglandines (DinolyticTM). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. La fertilisation facultative des oeufs est réalisée par insémination artificielle de la poule. 1.1.2- Mesure du volume d'albumen de l'oeuf: L'albumen présent dans l'oeuf, fertilisé ou non, est séparé du vitellus. L'albumen 3o est récupéré dans une éprouvette graduée de 50 ou 100 ml. Le volume d'albumen est mesuré à l'aide de l'éprouvette. 1.1.3- Dosage de la concentration du glucose dans l'albumen: Le volume d'albumen présent dans un oeuf est complété avec du PBS 35 (phosphate buffered saline) afin d'obtenir un volume final de 50 ml puis homogénéisé par agitation. 5 mL d'acide trichoroacétique à 10% sont ajoutés à 5 ml du mélange albumen-PBS puis centrifugés 10 minutes à 3500 G afin de culoter les protéines de l'albumen. La mesure de la concentration en glucose est effectuée sur un aliquot de 1 ml du surnageant à l'aide d'un glucosimètre (Glucose Analyser 2 / Beckman). La mesure de la concentration du glucose est basée sur la réaction enzymatique de la glucose oxydase. Elle est réalisée à l'aide d'une électrode spécifique qui mesure la consommation d'oxygène. La valeur mesurée est ramenée au volume d'albumen initial présent dans l'ceuf afin d'obtenir la concentration en glucose de l'albumen. Io 1.2- Résultats: Au cours de la descente dans le tractus de la poule des oeufs mous aux stades compris entre 3 et 14h00 heures post-ovulation, on assiste à une augmentation du volume de l'albumen qui s'hydrate, ainsi qu'à une augmentation de la concentration en glucose de l'albumen. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 suivant et dans la figure N 1. Tableau 1: Volume moyen d'albumen et concentration moyenne en glucose de l'albumen dans l'oeuf normal de la poule, depuis 3h00 jusqu'à 24H00 après l'ovulation. Les mesures ont été réalisées sur 5 oeufs différents. Le temps est exprimé en heure post-ovulation. Temps en heures Volume d'albumen Concentration en après l'ovulation (ml) glucose dans (heure) l'albumen (gll) 3H00 15 0,35 6H00 25 0,86 6H30 25 1, 4 8H00 30 1,45 10H00 35 2 12H00 36,6 2,4 14H00 40 3,4 16H00 40 3,5 24H00 40 3,6 Ces résultats obtenus par les inventeurs suggèrent le rôle prépondérant de l'albumen hydraté ainsi que de la concentration en glucose dans l'albumen au cours de l'embryogenèse normale, plus particulièrement pour les embryons au stade les plus précoces du développement embryonnaire (c'est-à-dire de 3h00 jusqu'à 14h00 post- ovulation). Il ressort également de cette analyse que l'étape d'hydratation in vitro de l'albumen est nécessaire pour le développement embryonnaire in vitro d'oeufs mous au stade compris entre 3H00 et 12H00 post-ovulation, mais n'est pas absolument nécessaire pour le développement embryonnaire in vitro d'oeufs mous au stade 14h00 post- ovulation puisque o l'hydratation de l'albumen est quasiment achevée. EXEMPLE 2: REHYDRATATION ARTIFICIELLE IN VITRO DES OEUFS AU STADE 6H30 à 10H00 POST-OVULATION ET DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE IN VITRO 2.1.- Obtention d'oeufs mous non fécondés à un stade précoce du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 14 heures postovulation. L'expulsion d'ovocytes non fécondés au stade précoce du développement compris entre 6h30 et 14h00, est induite par injection de prostaglandines (DinolyticR). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. 2.2.- Obtention d'oeufs mous fécondés à un stade précoce du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 14 heures postovulation. Les oeufs de poule sont fertilisés par insémination artificielle de sperme de coq. Les poules sont inséminées tous les 7 jours. L'expulsion des oeufs fécondés au stade précoce du développement compris entre 6h30 et 14h00, est induite par injection de prostaglandines (DinolyticR). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. 2.3- Désinfection des oeufs présentant une coquille molle Les oeufs mous entourés d'une coquille molle (6H30 à 14H00 post-ovulation) peuvent être désinfectés par passages succéssifs dans un premier bain d'eau distillée-eau de javel (0,15% chlore actif) à 41 C puis dans un second bain d'eau distillée à 41 C. Ils sont ensuite essuyés à l'aide de papier absorbant. Ils sont ensuite conservés à une température de 41 C. Les oeufs mous dépourvus de coquille molle, mais possédant une membrane coquillère (3H00 à 6H30 post-ovulation) ne sont pas désinféctés. 2.4- Hydratation des oeufs mous fécondés, au stade du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 12 heures post-ovulation 2.4.1- Des oeufs mous fécondés au stade de développement compris entre les stades 3h00 et 12h00 post-ovulation nécessitent de subir une étape d'hydratation de leur albumen. Pour ce faire, les inventeurs ont testé différents milieux d'hydratation parmi lesquels l'albumen d'oeufs extrait d'oeufs pondus, le tampon PBS ( phosphate buffered saline), le tampon bicarbonate et un milieu de culture cellulaire de base de type DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium). Ces milieux sont complémentés en antibiotiques (penicillinestreptomycine), facultativement en glucose. L'étape d'hydratation consiste à incuber les oeufs mous pendant 3 heures dans le milieu d'incubation à une température de 41 C, complémentés ou non en glucose, et contenant des antibiotiques (pénicilline-streptomycine). Les inventeurs n'ont obtenus aucun développement embryonnaire en culture in vitro en utilisant comme milieu d'hydratation, l'albumen d'oeufs extrait d'oeufs pondus, le tampon PBS ( phosphate buffered saline) ou le tampon bicarbonate. En revanche, les inventeurs ont obtenu des développements embryonnaires en utilisant un milieu de culture de base de type DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium). Par ailleurs, différents essais ont montré la teneur en CO2 dans l'atmosphère de l'incubateur n'avait pas ou peu d'influence sur le développement embryonnaire. A l'issue des 3 heures d'hydratation dans un milieu de culture de base de type DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium), les oeufs mous , fécondés, au stade du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 10 heures post-ovulation, sont essuyés à l'aide de papier absorbant, puis disposés dans un verre tronconique (cf figure 2) dans un incubateur, de type Coudelou par exemple, à une température de 41 C. Le verre tronconique est recouvert de papier plastique étirable de type SARAN WRAPTM pour subir l'étape d'incubation. 2.4.2- Des oeufs fécondés "mous" au stade de développement compris entre les stades 12h00 et 14h00 post-ovulation (qui possèdent une coquille molle) ne nécessitent pas de subir une étape d'hydratation de leur albumen. 2.5- Incubation in vitro des oeufs mous au stade du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 14 heures post-ovulation L'incubation des oeufs mous fécondés au stade du développement embryonnaire compris entre 3 heures et 14 heures post-ovulation est réalisée à 41 C pendant 20h, puis poursuivie à 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 heures (c'est-à-dire 3 jours d'incubation) et 76 heures (c'est-à-dire 4 jours d'incubation) dans un verre tronconique (cf figure 2) dans un incubateur de type Coudelou par exemple. Le verre tronconique est recouvert de papier plastique étirable de type SARAN WRAPTM. Les embryons sont sacrifiés puis disséqués pour déterminer le stade de développement. 2.5.1- ufs fécondés au stade 6H30 post-ovulation A ce stade l'albumen n'est pas hydraté. Dans le cadre d'un développement in vitro, il est indispensable de réaliser une étape d'hydratation in vitro de l'albumen avant de réaliser l'étape d'incubation in vitro. Expérience n 1 Conditions: - aucune désinfection de l'oeuf n'a été réalisée. Quatre concentrations de glucose dans le DMEM ont été testées: 3,5 g/l; 5 g/I; 7,5 g/l et 10 g/I. - Les observations sont réalisées après 4 jours d'incubation, ce qui correspond à un stade normal de 21 dans la classification de HH (96 heures d'incubation, moins 17.5 heures qui auraient dues être dans le tractus femelle, soit 78 heures d'incubation classique, c'est à dire le stade 21). Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (7/10) mais un seul embryon vivant a atteint un stade 18 de la classification de Hamburger et Hamilton HH (1951) dans le milieu DMEM complémenté en glucose à 7,5g/I. Io Expérience n 2 Conditions: Une désinfection de l'oeuf à l'eau de Javela été réalisée. Quatre concentrations de glucose dans le DMEM ont été testées: 3,5 15 g/1; 5 g/I; 7,5 g/1 et 10 g/l. - Les observations sont réalisées après 4 jours d'incubation, Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (6/11) mais un seul embryon vivant a atteint un stade 13 de la classification de HH dans le milieu DMEM complémenté en glucose à 7,5g/l. Expérience n 3 Conditions: - aucune désinfection n'a été réalisée. une seule concentration de glucose dans le Dulbecco a été testée 25 (7, 5g/I). - Les observations sont réalisées après 4 jours d'incubation Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (6/11) dont 2 embryons vivants ont atteint un stade 14 et 15 de la classification de HH. Un autre embryon a atteint le stadel5. En conclusion, en utilisant un milieu avec 7,5g/l de glucose, un total de 5/17 embryons bien développés (supérieurs à stade 13 HH) a donc été obtenu après réhydratation ( plumping ) in vitro. 4 embryons au moins présentaient des battements cardiaques (cf tableau N 2). Un embryon vivant a atteint un stade 18HH. Ces résultats montrent qu'il est possible de réaliser artificiellement la phase d'hydratation de l'albumen in vitro et ainsi d'assurer le développement embryonnaire dans des oeufs à des stades précédent la phase d'hydratation ou plumping . Tableau N 2: tableau récapitulatif des résultats de développement in vitro obtenus à partir d'oeufs mous au stade 6H30 post-ovulation Stade atteint du Nombre d'embryons Pourcentage développement ayant atteint le stade (%) embryonnaire de développement/ nombre total d'embryons obtenus > Stade 13 de 5 / 17 29 Hamburger et Hamilton (HH) Stade coeur de 4 / 17 23 embryon bat Stade 18 de Hamburger 1 / 17 6 et Hamilton (HH) 2.5. 2. CEufs au stade 10 et 12 heures après l'ovulation. Les oeufs sont désinfectés par passage successif dans un bain eau de javel (0,15% chlore actif) + eau distillée à 41 C puis eau distillée à 41 C seule. Ils sont ensuite essuyés et mis dans le verre propre recouvert de ParafilmTM et placés dans un incubateur classique de type Coudelou à 41 C pendant 20 heures. A l'issue des 20 heures d'incubation dans le milieu DMEM complémenté en glucose à 7,5g/L, la température est passée à 38.2 C et l'incubation est poursuivie pour atteindre un total de 3 à 4 jours. Expérience n 4 Conditions: - aucune désinfection n'a été réalisée. Les observations ont été réalisées après 3 jours d'incubation, ce qui correspond à un stade normal de 17 dans la classification de HH (72 heures d'incubation, moins 12 heures qui auraient dues être dans le tractus femelle, égal 60 heures d'incubation classique, soit stade 17). Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (11/24) dont 3 embryons vivants ont atteint un stade 13 de la classification de HH. Expérience n 5 Conditions: - une désinfection à l'eau de Javel a été réalisée. - Les observations ont été réalisées après 3 jours d'incubation, dans les mêmes conditions que ci dessus. Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (7/10) dont 1 embryon vivant qui a atteint un stade 13 de la classification de HH. Il faut noter que lors de cet essai 2 embryons ont été perdus dont 1 présentait des traces de réseau sanguin. Tableau N 3: développement embryonnaire d'oeufs collectés 10-12h postovulation et incubés pendant 3 jours Stade de Nombre Nombre d'embryons / Nbre total développement d'embryons (%) Embryon perdu 10 41, 7 54,2 Ovocyte non 1 4,2 fertilisé Stade VI EG 2 8,3 Stade I HH 1 4,2 45, 8 Stade IV HH 2 8,3 Stade VI/VIII HH 5 20,8 Stade XIII HH 3 12,5 Au total, 24 embryons sont mis en incubation. Le pourcentage est calculé par rapport à ce nombre total de 24 embryons. Des embryons non manipulés incubés pendant 60 heures atteignent le stade 17 de la classification de HH. Les observations montrent que 50 % des embryons manipulés dépassent le stade de développement atteint par un oeuf a l'oviposition. Ainsi le développement embryonnaire qui se déroule normalement in utero peut être réalisé in vitro. Le groupe d'embryons le plus nombreux présente un retard au développement de 36 heures par rapport à des embryons non manipulés. Un retard au développement est classiquement observé lors de la manipulation des embryons. 2.5.3. CEufs au stade 14 heures après l'ovulation. Lors des essais préliminaires de prélèvement des oeufs à différents moments to avant la ponte naturelle, les inventeurs ont observé que le volume maximal d'albumen dans l'oeuf est atteint après 14 heures. A 14 heures, les oeufs obtenus ont terminé la phase d'hydratation. L'ceuf est essuyé et remis dans le verre propre recouvert de ParafilmTM et placé dans un incubateur classique de type Coudelou à 41 C pendant 20 heures. A l'issue des 20 heures d'incubation, la température est passée à 38.2 C et l'incubation est poursuivie pour atteindre un total de 3 jours d'incubation. Les résultats sont les suivants: Expériences N 6 et N 7 Conditions: une désinfection a été réalisée à l'eau de Javel. Les observations ont été réalisées après 3 jours d'incubation, ce qui correspond à un stade normal de 17 dans la classification de HH (72 heures d'incubation, moins 10 heures qui auraient dues être dans le tractus femelle, égal 62 heures d'incubation classique, soit stade 17). Plusieurs développements embryonnaires ont été observés (9/16) dont 3 embryons vivants ont atteint un stade 13, 15 et 17 de la classification de HH. Tableau N 4: développement embryonnaire d'oeufs collectés 14h postovulation et incubés pendant 3 jours Stade de Nombre Nombre développement d'embryons/ Nbre total d'embryons (%) Embryon perdu 2 20 Stade X EG 3 30 Stade IV HH 1 10 Stade Xlll HH 1 10 Stade XVII HH 1 10 Des embryons non manipulés incubés pendant 60 heures atteignent le stade 17 de la classification de HH. Les observations montrent que 50 % des embryons manipulés ne dépassent le stade de développement atteint par un oeuf a l'oviposition. Cependant 10 % des embryons atteignent le stade correct de développement malgré la manipulation des embryons. EXEMPLE 3: FECONDATION IN VITRO (FIV) D'OVOCYTES PRELEVES CHEZ LA POULE DE 0,5 à 14 HEURES POST-OVULATION 3.1- Matériels et méthodes: 3.1.1Préparation des ovocytes Les oeufs mous de poule à des stades précoces (0,5 à 14 heures) sont obtenus soit par chirurgie après sacrifice de la poule pour les oeufs compris entre 0,5 heures et 6h30 après l'ovulation, soit par expulsion prématurée induite par injection de prostaglandines (DinolyticTM) pour les oeufs ayant été ovulé depuis plus de 6h30. l'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. Les ovocytes ainsi obtenus sont conservés dans du milieu de culture de type DMEM, complémenté avec de l'albumine sérique bovine (BSA) et des antibiotiques (pénicilline-streptomycine) à 41 C. Les ovocytes ne doivent subir aucune variation de température. De manière préférée, les ovocytes sont conservés entourés de leurs enveloppes, de l'albumen et de la coquille. Pour les besoins de la présente démonstration, les ovocytes sont au préalable débarrassés à la fois de leur albumen et de leurs enveloppes pour ne conserver s que le vitellus qui est placé dans un verre à pied contenant du milieu DMEM complémenté par des antibiotiques et de l'albumine sérique bovine (BSA). Lorsque les oeufs sont entourés d'une coquille molle, celle-ci est découpée à l'aide de ciseaux. L'albumen est entaillé avec des ciseaux et le vitellus est expulsé grâce à une pression exercé sur l'albumen. to 3.1.2- Préparation du sperme Un pool de spermes frais issus de 5 coqs est collecté 1 à 2 fois par semaine. La concentration en spermatozoïdes est évaluée à température ambiante après dilution au 1/2 dans du PBS dépourvu de Ca" et de Mg". La mobilité des spermatozoïdes est alors évaluée au microscope. Dans l'attente de l'insémination, le sperme est conservé à 20 C. 3.1.3- Fécondation in vitro (FIV) d'oeufs dépourvus d'albumen et de membranes Les ovocytes, débarrassés à la fois de l'albumen et de leurs enveloppes sont placés dans un verre à pied, puis sont inséminés sur le disque germinal avec 20 pl de sperme frais dilué au 1/200 ou non dilué. Le sperme et l'ovocyte sont laissés en contact pendant 10 minutes puis 3 rinçages sont effectués avec du milieu DMEM. Les expériences de FIV inclues toujours un contrôle réalisé en absence de dépôt de spermatozoïdes, afin de déterminer l'influence éventuelle de la parthénogenèse. L'efficacité de la FIV est évaluée en analysant la perforation de la membrane vitelline par les spermatozoïdes. Brièvement, l'embryon fécondé est placé dans un cristallisoir rempli de PBS. L'embryon fécondé doit être recouvert d'au moins deux fois sa hauteur par le PBS. La membrane vitelline de l'embryon obtenu par FIV est alors retirée avec une pince. La membrane vitelline est ensuite rincée dans du PBS puis étalée sur lame. Son observation à la loupe binoculaire permet de vérifier l'intégrité de l'embryon, ou son altération du fait d'un trop grand nombre de perforations provoquées par les spermatozoïdes. Les ovocytes inséminés sont conservés dans un milieu de culture de type DMEM complémenté avec des antibiotiques et de la BSA. Pour éviter la dessiccation, 2 disques de parafilm sont posés à la surface du milieu de culture et un couvercle ferme le verre à pied. Les embryons fécondés sont ensuite conservés pendant 24 heures à l'étuve à 41 C au cours desquelles les embryons poursuivent leur développement. 3.1.4- Analyse des embryons obtenus par FIV ro L'analyse consiste à déterminer la présence de plusieurs noyaux, synonyme de développement embryonnaire ou l'absence de multiples noyaux, synonyme d'absence de développement embryonnaire, à l'aide d'un microscope à fluorescence. L'embryon est déposé sur une lame, puis est incubé pendant 10 minutes dans une goutte de 10 pl de colorant Hoeschst 342 avant d'être analysé en microscopie. Afin d'étudier le développement embryonnaire des embryons d'oiseaux obtenus par FIV à partir d'ovocytes dépourvus d'albumen et d'enveloppes, les inventeurs ont analysés les embryons à six stades distincts du développement embryonnaire (Tableau N 5): Tableau N 5: Stades distincts du développement embryonnaire analysés N du stade de Temps Caractéristiques de l'embryon de développement post- ovulation poulet (heure) 1 0,5 ^ uf sans albumen entouré de deux membranes péri-vitellines (infundibulum et début du magnum) 2 3,5 ^ uf avec de l'albumen et une membrane coquillière 3 6,5 ^ uf avec une coquille en cours de formation 4 10-12 ^ uf avec une coquille subissant l'hydratation de l'albumen 12-14 ^ uf avec début de calcification de la coquille 6 24 ^ uf pondu (oviposition naturelle) Le bilan des résultats de l'observation des embryons et des noyaux est présenté dans le tableau N 6 ci après: Tableau 6: Résultats de la FIV Délai entre Traitement Observation des Observation des noyaux après cellules à la loupe l'ovulation coloration au binoculaire et la Hoechst 342 (nombre d'embryons pluricellulaires/ nombre d'embryons totaux) collecte de (nombre d'embryons multi-nucléés / nombre d'embryons totaux) l'ovocyte min PBS 3/10 2/10 min FIV 9/9 8/9 3,5 heures PBS 6/10 3/10 3,5 heures FIV 9/10 7/10 6,5 heures PBS 3/10 3/10 6, 5 heures FIV 7/11 7/11 10-12 PBS 2/9 heures 10-12 FIV 9/10 heures 14 heures PBS 9/12 6/12 14 heures FIV 10/13 9/13 24 heures PBS 4/10 0/10 24 heures FIV 4/10 0/10 FIV: fécondation in vitro réalisée avec du sperme de coq PBS: contrôle négatif de la FIV, consistant à réaliser l'insémination de l'Ovocyte avec du tampon phosphate buffered saline (PBS) Les résultats expérimentaux obtenus par les inventeurs montrent de manière inattendue la possibilité pour les spermatozoïdes de féconder un ovocyte au Io moins âgé jusqu'à 14 heures après l'ovulation. En effet, dans le tableau ci- dessus N 6 neuf embryons sur treize présentent des noyaux, traduisant ainsi un développement embryonnaire. Pour la première fois les inventeurs ont démontré la possibilité pour les spermatozoïdes de franchir la seconde membrane péri-vitelline qui se dépose dans l'infundibulum 30 minutes environ après l'ovulation. Jusqu'alors, cette membrane était considérée comme infranchissable par les spermatozoïdes et était même réputée bloquer la capacitation des spermatozoïdes. Les résultats originaux de la présente invention remettent complètement en cause l'affirmation selon laquelle la fécondation d'un oeuf d'oiseau n'est plus possible après le dépôt de la seconde membrane péri-vitelline dans l'infundibulum. Dans nos conditions de travail, les deux membranes périto vitellines sont présentes et ont été digérées par le matériel enzymatique contenu dans l'acrosome des spermatozoïdes comme en témoigne la présence des trous de digestion visibles au microscope à la surface des membranes péri-vitellines. De manière générale, ces résultats indiquent aussi que la fenêtre de fécondation des ovocytes de poule se révèle beaucoup plus longue que ce qui était jusqu'alors admis. Cependant, comme chez les mammifères, l'efficacité de la fécondation diminue dans le temps qui s'écoule après l'ovulation. L'intérêt du succès de la FIV d'ovocytes au stade 6h30 à 14 heures après l'ovulation est renforcé par le fait qu'à ce stade de développement les oeufs sont pourvus d'albumen dont l'hydratation n'est pas complète et d'une coquille non minéralisée. La présence de ces deux composés rend l'oeuf moins fragile et renforce les chances de succès d'un développement embryonnaire. En effet, il est établit que l'albumen a un rôle décisif dans la capacité de l'embryon à établir des axes de symétrie de développement. EXEMPLE 4: DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE COMPLET IN VITRO Les résultats précédemment décrits permettent d'envisager le développement complet in vitro d'embryon de poule depuis l'ovulation jusqu'à l'éclosion. 4.1- Développement embryonnaire in vitro jusqu'au stade X de développement 4.1.1- A partir d'ovocytes de poule fécondés in vitro L'expulsion d'ovocytes non-fécondés au stade précoce du développement compris entre 6h30 et 14h00, est induite par injection de prostaglandines (DinolyticR). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de o prostaglandines. Les ovocytes non fécondés compris entre 3h30 et 6h30 sont prélevés réalisée chirurgicalement après sacrifice de la poule. Facultativement et en fonction de rage des ovocytes, ceux-ci subissent une étape d'hydratation d'une durée d'environ 3 heures à une température de 41 C dans un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par du glucose à une concentration d'environ 7,5 g/l. Les ovocytes agés de 3H00 à 10H00 post-ovulation nécessitent de subir cette étape d'hydratation, alors que pour les ovocytes agés de 10H00 à 14H00 post-ovulation cette étape est facultative et peut être aisément omise. L'étape de fécondation in vitro des ovocytes non fécondés est de préférence réalisée après l'étape de réhydratation de l'albumen. Cependant, on peut imaginer que cette étape ait lieu avant ou pendant l'étape d'hydratation. Cette étape d'hydratation est réalisée en mettant en contact l'ovocyte et de préférence le disque germinal de l'ovocyte, avec une solution de spermatozoïdes de coq. Les ovocytes fécondés agés de 3H00 à 14H00 post-ovulation sont alors incubés dans un milieu d'incubation, composé d'un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par du glucose à une concentration 3o d'environ 7,5 g/l, pendant une durée d'environ 20 heures à une température de 41 C, puis poursuivie à 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 heures (c'est-à-dire 3 jours d'incubation) et 76 heures (c'est-à-dire 4 jours d'incubation) dans un verre tronconique (cf figure 2) dans un incubateur de type Coudelou par exemple. 4.1.2- A partir d'ovocytes de poule fécondés 4.1.2.1- fécondation naturelle La poule est accouplée avec un coq. L'oeuf fécondé ainsi produit est récolté par intervention chirurgicale après sacrifice de la poule ou par expulsion prématurée induite par injection de prostaglandines (DinolyticR). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. L'oeuf fécondé récolté est au stade précoce du développement compris entre 3H00 et 14h00 post- ovulation. lo Facultativement et en fonction de rage des oeufs, ceux-ci subissent une étape d'hydratation d'une durée d'environ 3 heures à une température de 41 C dans un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par du glucose à une concentration d'environ 7,5 g/l. Les oeufs agés de 3H00 à 10H00 post-ovulation nécessitent de subir cette étape d'hydratation, alors que pour les oeufs agés de 10H00 à 14H00 postovulation, cette étape est facultative et peut être aisément omise. Les oeufs fécondés agés de 3H00 à 14H00 post-ovulation sont alors incubés dans un milieu d'incubation, composé d'un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par du glucose à une concentration d'environ 7,5 g/I, pendant une durée d'environ 20 heures à une température de 41 C, puis poursuivie à 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 heures (c'est-à-dire 3 jours d'incubation) et 76 heures (c'est-à- dire 4 jours d'incubation) dans un verre tronconique (cf figure 2) dans un incubateur de type Coudelou par exemple. 4.1.2.2- fécondation par insémination artificielle La poule est inséminée artificiellement avec du sperme (dilué ou non) d'au moins un coq. L'insémination est réalisée une fois par semaine. Les oeufs compris entre 3h30 et 6h30 sont prélevés par intervention chirurgicale après sacrifice de la poule. L'expulsion des ovocytes fécondés par insémination artificielle au stade précoce du développement compris entre 6h30 et 14h00, est induite par injection de prostaglandines (DinolyticR). L'expulsion intervient dans les 5 à 20 minutes suivant l'injection de prostaglandines. Facultativement et en fonction de rage des ovocytes, ceux-ci subissent une étape d'hydratation d'une durée d'environ 3 heures à une température de 41 C dans un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par s du glucose à une concentration d'environ 7,5 g/l. Les ovocytes agés de 3H00 à 10H00 post-ovulation nécessitent de subir cette étape d'hydratation, alors que pour les ovocytes agés de 10H00 à 14H00 post-ovulation cette étape est facultative et peut être aisément omise. o Les oeufs fécondés agés de 3H00 à 14H00 post-ovulation sont alors incubés dans un milieu d'incubation, composé d'un milieu de culture cellulaire de base, tel que le DMEM, complémenté par du glucose à une concentration d'environ 7,5 g/I, pendant une durée d'environ 20 heures à une température de 41 C, puis poursuivie à 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 heures (c'est-à- dire 3 jours d'incubation) et 76 heures (c'est-à-dire 4 jours d'incubation) dans un verre tronconique (cf figure 2) dans un incubateur de type Coudelou par exemple. 4.2- Développement embryonnaire in vitro après le stade X de développement 4.2.1- Nettoyage et classement des oeufs: Les oeufs sont désinfectés puis pesés. Leur poids est répertorié puis ils sont stockés en chambre froide pendant 6 mois maximum. 4.2.2- Préparation des coquilles receveuses: Des oeufs plus gros, de préférence dont le poids est supérieur de 25g à celui des oeufs incubés, sont choisis afin d'éviter que l'albumen de l'oeuf que l'on transfert ne déborde. Les oeufs sont conservés à température ambiante. Le 1/3 supérieur de l'oeuf est découpé au niveau de la grosse extrémité de l'oeuf à l'aide d'une meuleuse et d'une lame de scalpel. Les oeufs sont vidés et le blanc et le jaune sont récupérés pour réaliser une analyse de contamination bactérienne. Les coquilles receveuses (appelées coquilles doubles ) sont retournées dans une boîte 150 mm pour éliminer le maximum de blanc résiduel. 4.2.3- Transfert de coquilles: Les embryons incubés facultativement manipulés sont placés dans un récipient arrondi type mortier prérecouvert de film étirable. Les quatre extrémités du film étirable sont jointes de façon à constituer une poche contenant l'embryon avec le blanc et le jaune; ces derniers sont alors délicatement transférés dans la coquille double. De préférence, le blanc est d'abord transféré afin qu'il entraîne l'embryon. Le surplus de film étirable est éliminé avec précaution de façon à éviter de percer le jaune. Le bord de la coquille double est enduite de blanc d'oeuf de façon à colmater le trou réalisé dans la coquille; un morceau de film o étirable est ensuite appliqué pour boucher l'ouverture. On découpe le surplus de film étirable pour favoriser les échanges gazeux à travers la coquille de l'oeuf. Enfin, les oeufs sont numérotés, puis incubés. 4.2.4- Incubation: L'incubation est poursuivie jusqu'au stade 44 HH dans une atmosphère humide, à 37,7 C, avec un retournement de maximum 30 par heure; le retournement est indispensable, car il évite notamment aux embryons de se coller à la coquille. Après 18 jours de développement, l'embryon est transféré dans un éclosoir jusqu'à l'éclosion du poussin. REVENDICATIONS 1. Procédé in vitro de développement d'un embryon d'un oiseau dans son propre albumen caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a. obtention d'un ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation et caractérisé en ce qui le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; b. facultativement mise en contact du dit ovocyte non-fécondé o entouré de son propre albumen de l'étape a) avec une quantité appropriée de spermatozoïdes dans des conditions appropriées permettant d'obtenir un ovocyte fécondé ; c. incubation du dit ovocyte d'oiseau fécondé, de l'étape a) ou b), entouré de son propre albumen à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le dit ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, est au stade de développement compris entre environ 3h00 et environ 12h00 post-ovulation, de préférence environ 6h30 et environ 12h00 post-ovulation. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le dit ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, est au stade de développement compris 25 entre environ 12h00 et environ 14h00 post-ovulation. 4. Procédé selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 est obtenu par la mise en oeuvre d'un technologie choisie parmi l'injection de prostaglandine et l'intervention chirurgicale. 5. Procédé selon les revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la dite incubation de l'étape c) est réalisé dans un milieu de culture cellulaire pour l'ovocyte, fécondé ou non-fécondé, âgée de 3h00 à 6h00, et dans un récipient à sec pour l'ovocyte fécondé ou non-fécondé âgé de 6h30 à 24h00, de préférence 6h30 à14h00. 6. Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'à l'étape b), s le dit ovocyte est mis en contact avec un nombre de spermatozoïdes compris entre 1 et 10 milliard, de préférence 1 000 et 10 000 000. 7. Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, lorsque le dit ovocyte obtenu est au stade de développement compris entre les temps 3 io heures et 14 heures post-ovulation, de préférence entre les temps 3 heures et 12 heures post-ovulation, le dit procédé comprend une étape supplémentaire d) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'étape d) de réhydratation de l'albumen est réalisée par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose allant de 4 g/L à 10 g/L, avantageusement de 5 g/L à 9 g/L et préférentiellement de 7 g/L à 8 g/L. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la dite concentration en glucose est d'environ 7,5 g/L. 10. Procédé selon les revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l'étape d) est réalisée à une température comprise entre 38 C et 42 C, de préférence 25 environ 41 C. 11. Procédé selon les revendications 7 à 10 caractérisé en ce que l'étape d) est arrêtée lorsque le volume d'albumen réhydraté et la dite concentration en glucose dans l'ovocyte, fécondé ou non-fécondé, correspondent aux valeurs physiologiques normales après la réhydratation naturelle de l'albumen dans l'espèce aviaire considérée. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que chez la poule les dites valeurs physiologiques normales sont environ 40m1 d'albumen et 35 environ 3,4g/L de glucose dans le dit albumen. 13. Procédé selon les revendications 7 à 12 caractérisé en ce que la dite étape d) a une durée comprise entre 1 et 5 heures, de préférence 2 et 4 heures, de manière préférée entre 2,5 et 3,5 heures, de manière encore plus préférée pour une durée d'environ 3 heures. 14. Procédé selon les revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'étape c) comprend les sous-étapes suivantes: cl) incubation du dit ovocyte fécondé à une température de 41 C pendant io environ 20 heures; puis c2) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. 15. Procédé in vitro d'obtention d'oiseau comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon d'oiseau par le procédé selon les revendications 1 à 14; b) transfert de l'embryon entouré de son propre albumen, obtenu à l'étape a) dans une coquille d'ceuf hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'oeuf. 16. Procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau obtenu par transfert nucléaire caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) obtention in vitro d'un ovocyte d'oiseau non fécondé au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation, de préférence compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation et caractérisé en ce que le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; b) facultativement, énucléation ou destruction du noyau du dit ovocyte obtenu à l'étape a) ; c) fusion d'une cellule aviaire donneuse de noyau avec le dit ovocyte de l'étape a) ou b) ou insertion d'un noyau de cellule aviaire donneuse de noyau dans le dit ovocyte de l'étape a) ou b) dans des conditions permettant d'obtenir un embryon. d) facultativement, activation de l'embryon obtenu à l'étape c) ; e) incubation du dit embryon, entouré de son propre albumen, à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'étape e) comprend les sous-étapes suivantes: o h) incubation du dit embryon à une température de 41 C pendant environ 20 heures; puis i) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. 18. Procédé in vitro d'obtention d'oiseaux chimères comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon d'oiseau obtenu par le procédé selon les revendications 16 à 17; b) transfert de l'embryon reconstitué entouré de son propre albumen obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'ceuf. e) facultativement, sélection du ou des oiseaux chimères dont au moins une des cellules comprend un noyau de cellule aviaire donneuse. 19. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que, lorsque le dit ovocyte d'oiseau non fécondé est au stade développement compris entre les temps 3 heures et 14 heures post-ovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle f) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. w 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape f) de réhydratation de l'albumen est réalisée par un incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L. 21. Procédé selon les revendications 16 à 20, caractérisé en ce que la dite cellule aviaire donneuse de noyau et le dit ovocyte d'oiseau non fécondé sont choisis parmi des cellules de la même espèce aviaire et les cellules de deux espèces ou de deux races aviaires différentes. 22. Procédé selon les revendications 16 à 21 caractérisé en ce que la dite cellule donneuse est choisie parmi les cellules génétiquement modifiées et les cellules non modifiées génétiquement. ls 23. Procédé selon les revendications 16 à 22 caractérisé en ce que la dite cellule donneuse est sélectionnée parmi les cellules souches embryonnaires aviaires totipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules primordiales germinales (PGC) et les cellules somatiques. 24. Procédé in vitro de développement d'un embryon chimérique d'oiseau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) obtention d'un ovocyte d'oiseau, fécondé ou non-fécondé, au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 24h00 post-ovulation, de préférence entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation et caractérisé en ce qui le dit ovocyte est entouré de son propre albumen; b) facultativement mise en contact du dit ovocyte non-fécondé entouré de son propre albumen de l'étape a) avec une quantité appropriée de spermatozoïdes dans des conditions appropriées permettant d'obtenir un ovocyte fécondé ; c) injection d'au moins une cellule aviaire exogène, de préférence de plusieurs cellules aviaires exogènes, dans des conditions appropriées de sorte que les dites cellules exogènes participent au développement de l'embryon; de sorte à former un embryon chimérique. d) incubation du dit embryon chimérique entouré de son propre albumen à une température comprise entre 38 C et 42 C, dans des conditions permettant le développement embryonnaire in vitro. 25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'étape d) comprend les sous-étapes suivantes: e) incubation du dit embryon chimérique à une température de 41 C ro pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. 26. Procédé in vitro d'obtention d'oiseaux chimériques comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'embryons chimériques par le procédé selon les revendications 24 à 25; b) transfert de l'embryon chimérique obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeufs hôte; puis c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à une température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'oeuf. e) facultativement sélection du ou des oiseaux chimériques dont au moins une des cellules est exogène. 27. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisé en ce que, lorsque le dit ovocyte d'oiseau non fécondé est au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle f) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'étape f) de réhydratation de l'albumen est réalisé par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L. FR 05 50 298 Le 19.05.05 29. Procédé selon les revendications 24 à 28, caractérisé en ce que les dites cellules aviaires exogènes sont sélectionnées parmi les cellules génétiquement modifiées et les cellules non génétiquement modifiées. 30. Procédé selon les revendications 24 à 29, caractérisé en ce que les dites cellules aviaires exogènes et le dit ovocyte d'oiseau fécondé sont choisies parmi des cellules de la même espèce aviaire, des cellules de deux espèces ou de deux races aviaires différentes. 31. Procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau transgénique obtenu par transgénèse de gènes médiée par les spermatozoïdes (SMGT) selon le procédé selon les revendications 1 à 14 caractérisé en ce que les dits spermatozoïdes à l'étape b) sont génétiquement modifiés, et/ou associés à du matériel génétique exogène; 32. Procédé selon la revendication 31 caractérisé en ce que l'étape c) comprend les sous- étapes suivantes: e) incubation du dit embryon transgénique à une température de 41 C 20 pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. 33. Procédé in-vitro d'obtention d'oiseaux transgéniques par SMGT comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon transgénique par le procédé selon les revendications 31 à 32; b) transfert de l'embryon transgénique obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis 3o c) incubation de l'embryon transgénique dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion 35 de l'oeuf. 51 FR 05 50 298 Le 19.05.05 e) facultativement, sélection du ou des oiseaux transgéniques ayant intégré tout ou partie du matériel génétique exogène dans au moins une des cellules. 34. Procédé selon les revendications 31 à 33, caractérisé en ce que, lorsque le dit ovocyte non fécondé est au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle f) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. 35. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que l'étape f) de réhydratation de l'albumen est réalisée par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 g/L. 36. Procédé in vitro de développement d'un embryon d'oiseau transgénique par injection de matériel génétique exogène, selon le procédé selon l'une des revendication 1 à 14 caractérisé en ce que le dit procédé comprend l'étape supplémentaire d) de transférer du matériel génétique exogène dans le dit ovocyte fécondé obtenu à l'étape a) ou c), de sorte à former un embryon d'oiseau transgénique. 37. Procédé selon la revendication 36 caractérisé en ce que l'étape d) comprend les sous-étapes suivantes: e) incubation du dit embryon d'oiseau transgénique à une température 25 de 41 C pendant environ 20 heures; puis f) incubation à une température de 38,2 C pendant une durée comprise entre 52 et 76 heures. 38. Procédé in vitro d'obtention d'oiseaux transgéniques par injection de matériel génétique exogène comprenant les étapes suivantes: a) développement in vitro d'embryons d'oiseaux transgéniques par le procédé selon les revendications 36 à 37; b) transfert de l'embryon transgénique obtenu à l'étape a) dans une coquille d'oeuf hôte; puis 52 FR 05 50 298 Le 19.05.05 c) incubation de l'embryon dans sa coquille pendant une période d'environ 14 à 16 jours en condition humide à température de environ 37,7 C, en retournant régulièrement le dit embryon. d) Incubation dans des conditions appropriées pour permettre l'éclosion de l'oeuf. e) facultativement, sélection du ou des oiseaux transgéniques ayant intégré tout ou partie du matériel génétique exogène dans au moins une des cellules. 39. Procédé selon les revendications 36 à 38 caractérisé en ce que, lorsque le dit ovocyte obtenu est au stade de développement compris entre les temps 3h00 et 14h00 post-ovulation, le dit procédé comprend une étape additionnelle f) de réhydratation de l'albumen dudit ovocyte. 40. Procédé selon la revendication 39 caractérisé en ce que l'étape f) de réhydratation de l'albumen est réalisée par incubation dans une solution aqueuse de réhydratation comprenant une concentration en glucose d'environ 7,5 gIL. 41. Procédé selon les revendications 1 à 40 caractérisé en ce que le dit oiseau est sélectionné parmi le poulet, la dinde, le canard, l'oie, le faisan, la perdrix, la caille, le perroquet, les aigles, l'autruche, l'émeu, l'outarde. 42. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que le dit oiseau est la poule. 43. Oiseaux et leur descendance obtenus par les procédés selon l'une quelconque des revendications 15, 18 à 23, 26 à 30, 33 à 35, 38 à 40; 44. Procédé d'obtention de cellules souches embryonnaires d'oiseaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) développement in vitro d'un embryon d'oiseau selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 14, 16, 17, 24, 25, 31, 32, 36 et 37; b) récupération des cellules souches embryonnaires constitutives de l'embryon obtenu à l'étape a).