Brevet FR2885140A1 — publié le 20061103

La présente invention concerne un procédé de détection spécifique sur une membrane d'un ou plusieurs microorganismes présents dans un liquide, un gaz ou sur une surface, comprenant une étape d'amplification isotherme spécifique des acides nucléiques desdits microorganismes, ainsi qu'un kit de détection et des séquences pour la mise en oeuvre de ce procédé. Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau et de l'air ainsi que des outils et matériaux utilisés ou rejetés, dans le cadre d'activités industrielles ou médicales, répond aujourd'hui à des normes de plus en plus strictes. De ce fait, les acteurs industriels et les autorités sanitaires doivent pouvoir disposer d'outils permettant de détecter le plus tôt possible les contaminations microbiologiques, afin de pouvoir y remédier dans les meilleurs délais et à coût réduit. Traditionnellement le suivi microbiologique se pratique sur milieu de culture gélosé. Ce type de cultures, simple à mettre en oeuvre, permet de faire une énumération des germes à l'oeil nu et de conserver vivants les microorganismes, ce qui permet, de pratiquer, le cas échéant, des tests de caractérisation. Ces tests de caractérisation consistent généralement à extraire les acides nucléiques contenus dans les microorganismes et à amplifier lesdits acides nucléiques de manière spécifique, par une des nombreuses techniques de réactions en chaîne (PCR: réaction de polymérisation en chaîne ou LCR: réaction de ligature en chaîne) connues de l'homme du métier. Toutefois, bien que les tests de caractérisation par amplification d'acides nucléiques soient d'une très grande fiabilité, les étapes consistant à cultiver les microorganismes, à en extraire les acides nucléiques, et à mettre en oeuvre la technique de PCR, sont longues à réaliser. Pour être visibles à l'oeil nu, il faut laisser les microorganismes en culture au moins pendant 24 heures, et parfois davantage pour des microorganismes à croissance plus lente comme les mycobactéries ou parce que les germes ont été stressés par les conditions environnementales. En outre, l'extraction des acides nucléiques, qui ne peut se pratiquer directement sur la gélose, nécessite de prélever les microorganismes préalablement à leur caractérisation par PCR. Enfin la PCR, qui consiste en de nombreux cycles d'amplification à différentes températures, présente l'inconvénient de devoir être pratiquée en solution dans des tubes de petite dimension que l'on place dans un thermocycleur, ce qui occasionne des manipulations supplémentaires de transfert des acides nucléiques avant et après amplification. Le développement récent des laboratoires sur puce, qui s'appuient sur des technologies d'hybridation avec des sondes d'acides nucléiques fixées sur support solide, pourrait permettre un gain de temps pour l'étape de caractérisation des microorganismes. Cependant ces techniques ont un coût de revient encore élevé et ne permettent pas de s'affranchir complètement des étapes d'extraction des acides nucléiques et de transfert des acides nucléiques. Dans ces conditions, il faut encore compter plus de 24 heures pour que les microorganismes puissent être dénombrés et caractérisés, ce qui est beaucoup trop long dans un contexte industriel où il faut assurer un suivi permanent de la qualité des produits. Dans le domaine particulier du contrôle de la qualité de l'eau industrielle destinée à entrer, par exemple, dans la composition de solutions pharmaceutiques injectables, on doit pouvoir avoir une indication quasiment en temps réel de la qualité de l'eau introduite dans la chaîne de production. La détection des microorganismes doit avoir lieu sur place et, si possible, avec un minimum de matériel et de personnel. La détection à mettre en place est d'autant plus difficile, dans ce contexte, que le niveau de détection souhaité est souvent de l'ordre de quelques microorganismes seulement par litre d'eau, ce qui nécessite une étape préalable de concentration des microorganismes par filtration. Pour répondre à ces contraintes, une première approche de détermination rapide de la présence ou de l'absence de microorganismes, a été proposée par le demandeur dans la demande de brevet WO 01/59157. Cette approche consiste à réduire la durée minimale de culture en basant la détection sur l'activité métabolique des microorganismes. Un marqueur métabolique universel iqui peut être par exemple, I'ATP contenu dans les microorganismes, ou bien encore l'émission de CO2, est mesuré, ce qui permet de rendre compte de la présence de microorganismes avant que des colonies visibles à l'ceil nu ne se forment sur le milieu gélosé. Dans l'exemple du contrôle microbiologique de l'eau, on filtre sur une membrane un certain volume d'eau (compris entre 100 mL et 1 L) de sorte à capter sur la membrane filtrante les microorganismes contenus dans l'eau. On place ensuite la membrane sur un milieu gélosé de sorte à ce que les microorganismes puissent se multiplier et former des colonies. On récupère alors la membrane afin de détecter l'ATP des microorganismes présents à sa surface, et on fait réagir l'ATP avec une enzyme qui permet de convertir l'ATP en photons (réaction catalysée par la luciférase). La luminescence est alors mesurée grâce à un système d'analyse d'image. Ce système commercialisé sous le nom de Miliflex Rapid par le demandeur, a déjà permis de réduire de plusieurs heures le temps nécessaire pour établir la présence ou l'absence de microorganismes présents dans un liquide. Ce système produit cependant une information de type quantitative et non qualitative. Aussi, si la nature des microorganismes présents doit être établie, ou bien si un microorganisme donné doit être spécifiquement recherché, il convient d'ajouter une étape d'identification des microorganismes, généralement réalisée par PCR, ce qui, comme cela a été évoqué plus haut, allonge significativement la durée du test. Par ailleurs, est apparue une technique d'amplification spécifique des acides nucléiques portant le nom de LAMP (amplification isotherme par l'intermédiaire de boucles), dont le principe est décrit dans les demandes internationales WO 00/28082, WO 01/077317 et WO 02/024902. Cette méthode, distincte de la PCR, présente la particularité d'être conduite à température constante tout en conservant un niveau élevé de spécificité. L'objet de la présente invention est un procédé permettant d'obvier les inconvénients des méthodes de détections antérieures, par la mise en oeuvre d'une détection des microorganismes par amplification de leurs acides nucléiques sur membrane. De manière surprenante, il est apparu que l'utilisation d'une technique d'amplification isotherme, telle que la technique LAMP, qui est d'habitude mise en oeuvre en solution après culture et extractions des acides nucléiques, pouvait être mise en oeuvre directement sur une membrane où étaient captés les microorganismes, sans nécessairement faire appel à une étape de culture de ces microorganismes et de transfert de leur acides nucléiques. Le procédé de l'invention permet, en conséquence, dans une durée de temps réduite, de détecter de manière spécifique des microorganismes présents dans un volume d'eau, de gaz ou bien sur la surface d'un solide, avec un seuil de détection de quelques microorganismes seulement. L'invention permet, par ailleurs, par un choix d'amorces et un marquage appropriés d'énumérer individuellement in-situ, c'est-à-dire en un endroit donné de la membrane, les microorganismes captés sur celle-ci. La présente invention concerne donc un procédé de détection spécifique sur membrane d'un ou plusieurs microorganismes présents dans un liquide, un gaz ou sur une surface, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on met en contact le liquide, le gaz ou la surface avec la membrane de sorte à capter sur la membrane le ou les microorganismes; b) on amplifie spécifiquement les acides nucléiques présents dans le ou 30 les microorganismes de manière isotherme sur la membrane pour obtenir des produits d'amplification; c) on détecte les produits d'amplification obtenus. L'invention concerne également un dispositif, un kit et des amorces spécifiques adaptés à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Les figures suivantes ont pour but d'illustrer certains aspects de l'invention: FIGURE 1: Principe de la technique d'amplification LAMP adaptée à la détection des ARNmessagers contenus dans le ou les microorganismes, utilisée préférentiellement à l'étape b) du procédé de détection selon l'invention. FIGURE 2: Séquence d'ADN provenant du gène oprL (5' -> 3') montrant les amorces utilisée pour la détection spécifique de Pseudomonas aeruginosa par la technique LAMP selon le procédé de l'invention. Les séquences correspondant aux amorces utilisées selon l'invention sont grisées et leur orientation est indiquée par des flèches. FIGURE 3: Etapes du procédé selon l'invention, mises en oeuvre dans l'exemple 1. FIGURE 4: Illustrations des étapes b) et c) du procédé selon l'invention, décrites dans l'exemple 1 FIGURE 5: Etapes du procédé de détection selon l'invention, mises en 25 oeuvre dans l'exemple 2. FIGURE 6: Etapes b) et c) du procédé de détection selon l'invention, décrites dans l'exemple 2. FIGURE 7: Etapes du procédé de détection selon l'invention, mises en oeuvre dans l'exemple 3. FIGURE 8: Vue en perspective d'un dispositif d'amplification d'acides nucléiques destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. FIGURE 9: Vue en coupe transversale du dispositif de la figure 8. FIGURE 10: Vue en coupe transversale du dispositif de la figure 8 dépourvu de sa paroi plane et de son couvercle. FIGURE 11: Vue de dessus de la figure du dispositif de la figure 10. FIGURE 12: Vue en perspective éclatée du dispositif de la figure 8. FIGURE 13: Vue en perspective du dispositif de la figure 8 après que son réservoir ait été retiré. FIGURE 14: Vue en coupe transversale du dispositif de la figure 13. FIGURE 15: Vue en perspective éclatée du dispositif de la figure 13. 20 Description détaillée de l'invention: Le procédé de détection selon l'invention permet de contrôler la qualité microbiologique aussi bien d'un liquide, d'un gaz que d'une surface. Ce procédé s'applique donc à un grand nombre d'applications tant industrielles que sanitaires, comme par exemple le contrôle de l'eau, lors de sa production et son retraitement dans des contextes agro- alimentaire ou pharmaceutique, celui de l'air en sortie des systèmes de climatisation ou à l'intérieur de salle blanche, ou le contrôle du niveau d'aseptie des laboratoires et des blocs chirurgicaux. Ce procédé peut être utile également à des fins diagnostiques par exemple pour l'analyse des urines en cas d'infection urinaire, du liquide cérébrospinal en cas de méningite, du liquide amniotique en cas d'infections ou d'anomalies foetales, du plasma pour la recherche d'infection virales, de l'air expiré en cas d'infection bronchique ou pulmonaire. Plus généralement, Il constitue une alternative aux laboratoires sur puces pour la caractérisation des acides nucléiques, quelque soit l'application envisagée. Les microorganismes visés par le procédé de l'invention sont en général choisis parmi les bactéries pathogènes du genre Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas; les protozoaires du genre Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Uréaplasma, les champignons du genre Aspergillus, Candida ou Penicillium, les virus de l'hépatite A et E, lesquels sont des contaminants à caractère pathogène présents de manière ubiquitaire dans l'environnement. Le procédé de l'invention peut être également utilisé pour la détection d'algues unicellulaires telles que des cyanobactéries, de formes unicellulaires d'organismes parasitaires, telles que des amibes ou des oeufs de nématodes, de trématodes ou d'ascaris, ou encore de gamètes de plantes ou d'animaux tels que des pollens ou des spermatozoïdes. Selon l'invention les microorganismes sont initialement présents dans un liquide, un gaz ou sur une surface. Le liquide est de préférence une solution pouvant comprendre une phase solide en suspension, plus préférentiellement une solution en milieu aqueux. Le gaz est, de préférence, constitué d'un mélange de gaz tel que l'air, mais peut également, par extension, consister en un mélange de particules solides, liquides et de gaz, tel un aérosol. Une surface est de préférence celle d'un solide, comme par exemple, le sol ou les murs d'une salle blanche. Les microorganismes sont alors captés, c'est-à-dire retenus, sur une membrane Par le terme membrane , on désigne dans la présente 30 demande un support synthétique présentant deux faces, dont les pores ont un diamètre moyen connu. La membrane utilisée dans le cadre de la présente invention présente, en général, un rapport surface/volume élevé et une épaisseur constante comprise, de préférence, entre 90 et 200 microns. Les pores de la membrane ont en général un diamètre moyen compris entre 0, 1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,15 et 0,8 microns, plus préférentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. Une telle membrane peut être mono ou multicouche. Elle est en général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytetrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidene), le polycarbonate, le polyamide, le polysulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. Les matériaux sont de préférence choisis pour être compatibles avec les solvants utilisés au cours des étapes b) et c) du procédé, en particulier, les alcools et aldéhydes susceptibles d'être employés pour fixer les microorganismes sur la membrane et libérer les acides nucléiques contenus dans ces microorganismes. Une membrane selon l'invention est de préférence une membrane filtrante en PVDF, comme par exemple la membrane commercialisée par la firme Millipore sous le nom de marque HVWP . Selon le procédé de la présente invention, le ou les microorganismes sont captés sur la membrane par filtration ou par simple mise en contact. La filtration peut être réalisée par passage d'un liquide ou d'un gaz à travers les pores de la membrane par application d'une différence de pression entre les deux faces de la membrane. Le ou les microorganismes sont alors retenus par les pores de la membrane. Selon un aspect préféré de l'invention, l'étape a) du procédé consiste en une filtration visant à concentrer sur la membrane des microorganismes présents dans le liquide ou le gaz. Lorsqu'on cherche à retenir des rnicroorganismes de type levures et moisissures, il convient de choisir un diamètre moyen des pores compris entre 0.5 et 1,5 microns, de préférence entre 0,6 et 1 microns. Pour les microorganismes bactériens, on choisira un diamètre moyen compris entre 0, 2 et 0,8 microns, de préférence entre 0,3 et 0,5 microns. Pour les microorganismes de type mycoplasmes et virus, on choisira un diamètre inférieur à 0,2 microns, de préférence entre 0,1 et 0,2 microns. La taille des pores résulte d'un calcul statistique, car en général les pores résultent de la superposition de différentes couches d'un même matériau ou de différents matériaux présentant chacun une porosité irrégulière. II peut être avantageux lors de la filtration d'utiliser une membrane filtrante comprenant un maillage de nature hydrophobe formant un réseau d'une solution de cires hydrocarbonées non mouillables, de vaseline, de cires ou d'huiles de silicone, de résines époxy, de polyfluoroéthylène ou de polystyrène, de sorte à mieux répartir les microorganismes sur l'ensemble de la membrane et pouvoir mieux les énumérer à l'étape c). En absence de filtration, les microorganismes sont captés par une simple mise en contact du microorganisme avec la surface de la membrane. Ce contact peut se produire par projection active d'un liquide ou d'un gaz en direction de la membrane (flux d'air, courant d'eau) ou de manière passive lorsque le microorganisme se dépose par gravité sur la membrane. Inversement la membrane peut être appliquée sur une surface solide où se trouve le microorganisme. Pour ce mode de capture, il peut être avantageux que la surface de la membrane soit recouverte d'un revêtement facilitant l'adhésion des microorganismes. Ce revêtement peut par exemple être du glycérol. De manière facultative, une étape de mise en culture du ou des microorganismes immobilisés sur la membrane peut être réalisée avant l'étape b) d'amplification. Une telle culture peut avoir lieu directement sur la membrane par mise en contact de la membrane avec un milieu nutritif, en particulier un milieu gélosé, ce qui permet, d'augmenter, le cas échéant, le nombre des microorganismes présents, tout en respectant la localisation initiale du ou des microorganismes sur la membrane. Les colonies obtenues peuvent servir de matériel biologique pour l'étape c), soit être prélevés en vue d'autres analyses, comme par exemple, une quantification par ATP-bioluminescence. Les acides nucléiques contenus dans le ou les microorganismes captés sur la membrane consistent essentiellement en des ADN et ARN doubles ou simples brins. Ceux-ci peuvent consister notamment en de l'ADN chromosomique, de l'ADNchloroplastique, de l'ADN mitochondrial, des ARNribosomiques, des ARN de transfert ou en des ARNmessagers. Selon un mode préféré de l'invention, on lyse la paroi externe des microorganismes avant l'étape c) d'amplification afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les microorganismes. L'étape de lyse peut être réalisée directement sur la membrane, par exemple, en imprégnant celle-ci d'un tampon de lyse. Elle peut être complétée, le cas échéant, par une étape de purification consistant, par exemple, à précipiter les acides nucléiques avec de l'alcool à la surface ou à l'intérieur de la membrane. Selon un mode préféré de l'invention, les microorganismes captés sur la membrane et/ou les acides nucléiques provenant desdits microorganismes peuvent être fixés sur la membrane par un traitement approprié. Cette étape de fixation permet d'éviter la migration et le mélange sur la membrane des acides nucléiques provenant des différents microorganismes. Ce traitement peut consister en l'imprégnation de la membrane par une solution de fixation comprenant, par exemple, un agent de réticulation tel que le glutaraldéhyde, le formaldéhyde ou le paraformaldéhyde. Le glutaraldéhyde est particulièrement avantageux lorsqu'une membrane à base de polyamide est utilisée. Une autre mode de fixation selon l'invention consiste à irradier la membrane avec des rayonnements ultraviolets (UV) afin d'obtenir une réaction de réticulation entre les matériaux dont est constituée la membrane et certaines molécules organiques dont est constitué le matériel biologique. Selon l'étape b) du procédé de l'invention, on amplifie spécifiquement sur la membrane les acides nucléiques présents dans le ou les microorganismes de manière isotherme pour obtenir des produits d'amplification. Par amplification spécifique, on désigne ici une réaction de polymérisation d'acides nucléiques initiée par l'hybridation d'une amorce spécifique complémentaire d'un acide nucléique servant de matrice, en vue de reproduire tout ou partie des séquences que comprend cet acide nucléique servant de matrice. Contrairement aux techniques de PCR, l'étape b) d'amplification selon l'invention ne nécessite pas de changements cycliques de température, et donc ne requiert pas l'emploi d'un thermocycleur, ni des consommables de petite dimension qui lui sont associés, lesquels sont conçus pour assurer un transfert efficace de chaleur au milieu de réaction. Selon un aspect préféré de l'invention, l'étape d'amplification est effectuée sur la membrane, c'est-à-dire à la surface ou à l'intérieur de celle-ci, et plus préférentiellement dans une enceinte à température contrôlée. En général la température est maintenue entre 35 et 90 C, préférentiellement entre 50 et 70 C, et plus préférentiellement entre 60 et 65 C. Différentes méthodes d'amplification isotherme des acides nucléiques peuvent être appliquées au procédé de l'invention, comme, par exemple, la technique NASBA (nucleic acid sequence based amplification) qui est appelée également TMA (transcription mediated amplification), laquelle permet d'obtenir des amplicons d'ARN simple brin [Nature, 1991, 350: 9192]. Une technique d'amplification préférée selon l'invention est la technique LAMP par laquelle une matrice d'ADN est reproduite par l'intermédiaire d'amplicons formant des tiges-boucles. Le principe de la technique LAMP est décrit dans la demande internationale WO 00/28082. Une adaptation préférée de cette technique au procédé selon 25 l'invention est illustrée dans la figure 1. Par technique d'amplification de type LAMP, on désigne toute technique d'amplification isotherme dérivant de la technique LAMP, comprenant au moins l'étape par laquelle une ADN polymerase possédant une activité de déplacement de brin, synthétise à partir d'une matrice d'acides nucléiques, un brin d'ADN complémentaire de celle-ci, par l'intermédiaire d'une amorce spécifique FIP (Forward Inner Primer: amorce interne sens). L'amorce FIP est caractérisée en ce qu'elle s'hybride à la matrice dans sa partie 5', mais pas dans sa partie 3'. Sa partie 3' dispose, en effet, d'une séquence différente lui permettant de s'hybrider par la suite avec une des séquences du brin complémentaire formé. Il en résulte, qu'une fois le brin complémentaire synthétisé, la partie 3' de FIP va favoriser l'hybridation sur lui- même du brin synthétisé créant une structure en tige-boucle. Cette structure en tige boucle est ensuite reproduite dans les étapes ultérieures de l'amplification. L'amplification de type LAMP requiert, préférentiellement une seconde amorce BIP (Backward Inner Primer: amorce interne antisens), qui a la même fonction que FIP, mais sur le brin opposé. Plus préférentiellement des amorces complémentaires désignées FI, F2, F3 (F: Forward) et B1, B2, B3 (B: Backward) sont mises en oeuvre. Les amorces F1, F2, F3 correspondent à des séquences situées sur le brin codant et les amorces B1, B2, B3 à des séquences sur le brin complémentaire. F3 et B3 correspondent aux extrémités 5' des fragments amplifiés, F2 et B2 correspondent aux séquences situées à l'extrémité 5' de FIP et BIP, F1 et B1 correspondent aux séquences complémentaires des séquences situées à l'extrémité 3' de FIP et BIP (notées F1c et Bic). Selon la nature des acides nucléiques à amplifier, une phase de dénaturation de l'ADN par chauffage entre 60 et 80 C visant à séparer les brins d'ADN des molécules d'ADN double-brin, peut s'avérer nécessaire au début du processus d'amplification. En général une technique d'amplification de type LAMP utilise comme matrice de départ un ADN simple ou double brin. Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, la matrice de départ est un ADNc. Selon un aspect plus préféré de l'invention, les ARN des microorganismes sont préalablement restro-transcrits à l'aide d'une transcriptase reverse en utilisant une amorce BIP, comme indiqué sur la figure 1, ce qui permet d'obtenir un ADNc comportant une structure en tige-boucle, permettant de débuter directement l'amplification de type LAMP. Selon un aspect encore plus préféré de l'invention, les ARN provenant des microorganismes utilisés pour l'étape préalable de rétro-transcription sont des ARN messagers. Les ARN messagers présentent, en effet, l'avantage d'être présents en un plus grand nombre d'exemplaire que les molécules d'ADN ayant servi à leur transcription. De cette façon il est possible d'abaisser le seuil de détection du procédé selon l'invention. La technique d'amplification de type LAMP comprend avantageusement une phase durant laquelle des amorces supplémentaires loop F et loop B s'hybrident aux produits d'amplification au niveau des séquences constituant les boucles. Ces amorces favorisent la synthèse de nouveaux brins complémentaires à partir des boucles que comportent les produits d'amplification, ce qui permet d'augmenter la vitesse de formation des produits d'amplification. Les produits d'amplification obtenus selon une technique de type LAMP sont généralement des molécules d'ADN double brin comprenant plusieurs tiges-boucles. La taille des produits d'amplification varie en fonction du nombre de boucles synthétisées. En général, plusieurs tailles de fragments co-existent à l'issue du processus d'amplification, ce qui se traduit par un profil éléctrophorétique particulier du type de celui représenté sur la Figure 4. Selon un aspect préféré de l'invention, l'étape c) de détection des produits d'amplification est réalisée par des méthodes utilisant directement ou indirectement des molécules marquées permettant une détection par fluorescence, colorimétrie ou chimioluminescence des produits d'amplification. Un analyseur d'image peut alors être utilisé pour enregistrer le spectre d'émission des molécules marquées et la position de celles-ci sur la membrane. Par un traitement approprié du signal, visant notamment à éliminer les signaux parasites liés aux amplifications non spécifiques, il est possible de visualiser les produits d'amplifications in-situ sur la membrane avec une plus grande précision quantitative et qualitative. Les moyens de détection des produits d'amplification par colorimétrie ou fluorescence sont connus de l'homme du métier. De préférence, les moyens de détection utilisés selon le procédé de l'invention sont spécifiques et permettent l'identification individuelle du ou des microorganismes dont les acides nucléiques ont été amplifiés. Un moyen de détection peut consister, par exemple, en l'incorporation de bases puriques ou pyrimidiques modifiées dans les produits d'amplification au cours de l'étape b) du procédé, en tant que substrat de la réaction d'amplification. De préférence, les bases puriques ou pyrimidiques marquées sont des dNTP, plus préférentiellement des dUTP. Un autre moyen de détection peut consister à hybrider à la fin de l'étape b) les produits d'amplification obtenus avec une ou plusieurs sondes spécifiques marquées. Différents types de sondes peuvent être utilisés, comme, par exemple, des sondes de type PNA (Peptide Nucleic Acid: Peptide d'acides nucléiques), c'est-à-dire des sondes constituées d'une chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle d'un ADN [Nielsen, P. E. et al. (1991) Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, Science 254:1497-1500]. Les sondes utilisées sont avantageusement de type molecular beacons (balises moléculaires), c'est-à-dire qu'elles possèdent un fluorophore, un groupe quencher (désactivateur) et une structure en tige-boucle permettant une fluorescence de la sonde uniquement dans le cas où celleci est hybridée aux produits d'amplification. Lorsque les produits d'amplification sont détectés à l'aide de sondes d'hybridation, il peut s'avérer nécessaire de procéder à une étapepréalable de dénaturation des produits d'amplification, visant notamment à séparer les brins d'ADN. Un autre moyen de détection selon le procédé de l'invention consiste en l'utilisation de ligands spécifiques, de préférence des antigènes et anticorps marqués. Dans ce cas, les bases puriques ou pyrimidiques modifiées, ou bien les sondes spécifiques, sont marquées à l'aide d'une ou plusieurs molécules servant d'antigènes, telle que la dioxygenine, pouvant être reconnues spécifiquement par un anticorps, comme par exemple un anticorps anti-dioxygénine. Alternativement, les sondes de détection peuvent être couplées à un anticorps, qui est ensuite mis en contact avec un antigène marqué. Les anticorps ou les antigènes peuvent être conjugués à un fluorophore, tel que, le FITC (une forme particulière de l'isothyocyanate). Le marquage des bases puriques ou pyrimidiques modifiées, ou bien des sondes spécifiques peut être réalisé par des isotopes radioactifs (H3, P32, P33, S35) ou bien par des produits non radioactifs, tel que, par exemple, la biotine, qui est détectée par l'ajout d'une solution contenant de l'avidine ou de la streptavidine conjuguée à une enzyme telle que la peroxydase de Raifort ou de la graine de soja ou bien la phosphatase alcaline. Lorsqu'un substrat de ces enzymes est répandu à la surface de la membrane, ces enzymes libèrent des photons, ce qui provoque une réaction luminescente. Un mode de marquage préféré selon l'invention, consiste à coupler les sondes d'hybridation ou les ligands évoqués ci-dessus avec des molécules fluorescentes ou fluorophores. Avantageusement, des fluorophores ayant des spectres d'émission différents peuvent être utilisés lors de l'étape de détection c), couplés à des ligands ou des sondes définis pour reconnaître des produits d'amplification issus de microorganismes différents. Dans cette optique les fluorophores comme ceux commercialisés sous le nom d'ALEXA FLUOR par Molecular probes ou DY- par Dyomics sont avantageusement utilisés, car ils présentent des spectres d'émission différents. Une détection en parallèle portant sur différentes espèces de microorganismes est dès lors possible. Après un traitement de l'image approprié, un code de couleur peut être attribué à chacun d'entre aux ce qui permet de déterminer sur la membrane, le nombre de microorganismes ou de colonies de chaque espèce recherchée. Il est également possible de marquer les sondes ou les ligands mis en oeuvre à l'étape c) avec de très fines particules connues sous le nom de quantum dots et commercialisés sous la désignation Qdots . Il s'agit de fluorophores inorganiques composés de nanocristaux dont la fluorescence est beaucoup plus stable dans le temps. Leur utilisation est particulièrement adaptée à la détection de cibles peu abondantes nécessitant un temps de collecte des données par l'analyseur d'image plus long. Les quantum dots sont compatibles également avec un marquage multi-couleurs; Ils permettent donc la détection simultanée de différentes espèces de microorganismes. Dans le cadre de la présente invention, il est fréquent que la membrane sur laquelle se trouvent les produits d'amplification à détecter, présente elle-même une certaine fluorescence due au matériaux synthétiques qui la compose. Ce phénomène d'auto-fluorescence présente l'inconvénient de créer un bruit de fond empêchant une interprétation satisfaisante des résultats. Il est alors recommandé d'utiliser des marqueurs qui présentent une fluorescence dans l'infra rouge proche, tels que les IRdyes commercialisé par la société LiCor sous les désignations IRdye 700 et IRDye 800 ou commercialisé par la société Dyomics par exemple sous les désignations DY-700, DY-730, DY-750 et DY-780. Il a été observé en effet que la membrane émettait généralement moins de fluorescence dans l'infra rouge proche. Le procédé selon l'invention permet, en général, de détecter dans un gaz, un liquide ou sur une surface moins de 1000 microorganismes d'une même espèce, préférentiellement moins de 50 microorganismes d'une même espèce, plus préférentiellement jusqu'à moins de 5 microorganismes d'une même espèce et jusqu'à un seul microorganisme. Afin d'éviter le déplacement des microorganismes ou celui de leurs acides nucléiques à la surface de la membrane au cours de l'une des étapes du procédé décrit ci-dessus, il est avantageux d'utiliser des moyens permettant physiquement de limiter les échanges pouvant s'opérer par l'intermédiaire des solutions de réactions entre les différentes zones présentes à la surface de la membrane. Un moyen de limiter ces échanges consiste par exemple à mettre la solution de réaction au contact des microorganismes ou des acides nucléiques via l'intermédiaire d'un tampon imprégné de la solution de réaction. Le tampon imprégné, lorsqu'il est plaqué sur la surface de la membrane délivre localement un volume de solution de réaction suffisant pour que la réaction puisse se produire, sans débordement vers les zones adjacentes. Un autre moyen de limiter les échanges peut consister à formuler la solution de réaction sous forme d'un gel, de préférence un gel d'acrylamide. Un autre moyen pour limiter les échanges selon l'invention consiste en un cloisonnement vertical apposé sur la membrane délimitant différentes zones de celle-ci. Avantageusement, ce cloisonnement est conçu pour aménager un certain volume à la surface de la membrane de sorte à accueillir la solution de réaction. De préférence, le cloisonnement se présente sous la forme d'une grille formant une pluralité d'alvéoles qui est maintenue au contact de la membrane. Selon un aspect préféré de l'invention, le présent procédé s'applique à la détection spécifique sur membrane filtrante d'une ou plusieurs bactéries de l'espèce Pseudomonas aeruginosa contenues dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on filtre le liquide au travers d'une membrane filtrante, b) on capte les bactéries contenues dans le liquide sur la membrane filtrante; c) on amplifie spécifiquement les acides nucléiques de Pseudomonas aeruginosa contenus dans ces bactéries de manière isotherme à la surface ou à l'intérieur de la membrane filtrante à l'aide d'une amplification de type LAMP en utilisant, notamment, au moins une amorce comprenant une séquence prise parmi SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, et SEQ ID N 7; d) on détecte les produits d'amplification obtenus sur la membrane filtrante. Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention, les amorces utilisées pour l'amplification des acides nucléiques de Pseudomonas aeruginosa par la technique de type LAMP sont les suivantes: -F3: CCTCCAAGGGCGGCGATGC (SEQ ID NO.2) - B3: TGCCTTTCAGGTCTTTCGCGTGT (SEQ ID NO.3) - FIP: CTGCCGTCAACGGCACCGCTTTTCCGGTGAAGGTGCCAATGGC (SEQ ID NO.4) BIP: GCGTGCGATCACCACCTTCTACTTTTCAGAGCGCGCATGGCTTCC (SEQ ID NO.5) LOOPF:CCTGCGTTCGGGTCGACGC (SEQ ID NO.6) - LOOP B: CGAGTACGACAGCTCCGACC (SEQ ID NO.7) Ces amorces permettent l'amplification de la région de Pseudomonas aeruginosa représentée par SEQ ID NO.1 (région du gène oprL). De préférence, les ARN messagers contenus dans Pseudomonas aeruginosa sont retro-transcrits à l'étape b) afin d'obtenir un ADNc comprenant la séquence SEQ ID N 1, lequel est alors amplifié selon la technique d'amplification de type LAMP. Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif d'amplification des acides nucléiques, adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention décrit précédemment. Ce dispositif qui comporte une membrane (1) pour la réception des acides nucléiques à amplifier est caractérisé en ce qu'il comporte un corps (2) délimitant un volume interne et muni de moyens pour le maintien en contact, dans ce volume interne, de la membrane (1) avec une paroi imperméable plane (3) et avec une grille (4) formant une pluralité d'alvéoles à la surface de la membrane (1). De préférence, les alvéoles, qui peuvent être de taille et de géométrie variables sont conçues de telle sorte qu'elles permettent de contenir un volume compris généralement entre 1 et 100 l, préférentiellement entre 1 et 50 l et plus préférentiellement entre 3 et 10 l d'une solution de réaction. Le corps (2) du dispositif peut comporter un épaulement (5) adapté à coopérer avec la périphérie de la membrane (1), de sorte à ce que celleci par sa périphérie puisse être fixée contre ledit épaulement (5). La paroi plane (3) peut également servir à serrer la périphérie de la membrane poreuse (1) contre ledit épaulement (5). Elle peut être amovible vis-à-vis du corps et comporter, en outre, une jupe (6) s'étendant transversalement. Dans ce cas, le corps (2) comporte avantageusement un manchon (7) destiné à coopérer avec la jupe (6), laquelle peut présenter une forme évasée en s'éloignant de la paroi plane (3). La grille (4) peut être indépendante du corps ou bien d'une seule pièce avec le corps (2). Lorsqu'elle est indépendante du corps, elle peut s'encastrer dans le corps, de sorte à ce que les cloisons des alvéoles soient uniformément au contact de la surface de la membrane. Les alvéoles sont de préférence de taille égales et de forme régulière cubiques ou parallélépipédiques afin de pouvoir être remplies d'un volume égal d'une solution de réaction. Lorsque la grille et le corps ne forment qu'une seule pièce, la membrane peut alors être avantageusement scellée sur la grille afin d'éviter les contaminations croisées entre alvéoles. Selon un autre aspect de l'invention, le dispositif comporte un réservoir (9) rattaché au corps (2). Ce réservoir est destiné à être rempli d'un liquide que l'on filtre par passage à travers la membrane (1) (laquelle se trouve être alors une membrane filtrante), par exemple à l'aide d'une pompe à vide que l'on emboîte sur le manchon (7), à la place de la paroi plane (3). Les microorganismes contenus dans le liquide sont alors captés sur la membrane coté admission. Une fois cette opération terminée, la paroi plane (3) est replacée de manière hermétique contre la face inférieure de la membrane. Pour éviter la contamination du liquide avant filtration, il est prévu que le réservoir puisse être muni d'un couvercle amovible (8). Le réservoir (9) peut être avantageusement rattaché au corps (2) par une zone frangible (10), de telle sorte qu'une fois l'opération de filtration 25 terminée, le réservoir peut être détaché en exerçant de haut en bas une pression brutale sur le rebord supérieur horizontal du réservoir. Selon un aspect préféré de l'invention., le couvercle amovible (8) est adapté à fermer alternativement le réservoir (9) et ledit volume interne au niveau de la zone frangible (10). Une fois le couvercle refermé sur la zone frangible, le couvercle (8) amovible se trouve alors disposé en vis-à-vis de la grille (4) pour fermer ledit volume interne, comme cela est représenté aux Figures 13 et 14. Le dispositif sous cette forme permet un confinement de la membrane dans un volume délimité par la paroi plane (3), le corps (2) et le couvercle, et cloisonné verticalement par la grille (8). Ce volume est destiné à recevoir les solutions de réaction pour l'amplification et éventuellement d'autres étapes du procédé, comme les étapes de purification, de fixation, et de lavage évoqué précédemment. De préférence, ce volume est étanche pour ne pas perdre de solution. Le confinement de la membrane dans un volume de réaction réduit est important pour pouvoir réaliser les réactions d'amplification dans des conditions satisfaisantes. En effet, il faut éviter, d'une part les contaminations provenant du milieu extérieur, et d'autre part que les réactions enzymatiques ne se produisent dans des volumes trop importants. Cela est nécessaire car les réactifs enzymatiques sont coûteux et que la température doit être régulée de manière uniforme. Enfin, il faut éviter une évaporation trop importante des solutions de réaction. Le dépôt desdites solutions s'opère de préférence en retirant temporairement le couvercle, par-dessus la grille, à l'aide d'une micropipette ou d'un vaporisateur. Le volume de la solution peut dépasser ou non la hauteur de la grille. Selon un aspect préféré du dispositif selon l'invention, la paroi plane (3) comporte un orifice de drainage (11), et le cas échéant, un bouchon (12) adapté à fermer l'orifice de drainage (11). H est alors possible après l'étape d'amplification ou de marquage selon le procédé de l'invention, par exemple, d'évacuer doucement la solution sans risquer de mettre excessivement en suspension les acides nucléiques se trouvant sur la membrane. Une fois les étapes d'amplification et de marquages réalisées, il est possible de ne conserver que le corps du dispositif muni de la membrane, ou, le cas échéant, la membrane seule, afin d'analyser cette dernière suivant la technologie choisie, comme par exemple une analyse par bioluminescence à l'aide d'un analyseur d'image. Un autre aspect de l'invention concerne un kit pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention. Ce kit comprend au moins - une membrane, de préférence filtrante; -un ou plusieurs amorces spécifiques permettant d'amplifier des acides nucléiques de manière isotherme, Par amorces spécifiques permettant d'amplifier des acides nucléiques de manière isotherme , on désigne ici des molécules capables de s'hybrider et d'initier une réaction de polymérisation en présence d'une ADN polymérase, comme par exemple les oligonucléotides FIP et BIP dans le cas d'une amplification de type LAMP, ou en présence d'une ARN polymérase comme dans le cas d'une amplification de type NASBA. Un kit selon l'invention destiné plus particulièrement à la détection de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, comprend au moins un oligonucléotide comprenant une séquence d'ADN choisie parmi SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7. Un autre aspect de l'invention concerne un oligonucléotide permettant la détection spécifique de Pseudomonas aeruginosa par amplification des acides nucléiques contenus dans cette bactérie, caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7. Les exemples qui suivent visent à illustrer l'invention de manière plus détaillée. Exemple 1 Un essai illustré Figure 4 de la présente demande a consisté à amplifier selon la technique LAMP illustré à la figure 1, les ARN messagers de seulement 50 cellules de Pseudomonas aeruginosa. Les amorces utilisées à cet effet sont celles décrites à la figure 2 de la présente demande. Afin de pouvoir être précis sur le nombre des cellules traitées, les acides nucléiques ont été extraits des bactéries et l'amplification a été réalisée dans 25pL de la solution (2 pmol/pL d'oligonucléotides FIP & BIP; 1 pmol/pL d'oligonucléotides loop F & loop B; 0.2 pmol/pL d'oligonucléotides F3 & B3 dans 40 mM Tris HCI pH 8.8, 20 mM KCI, 0.6 M Betaine, 1.5 mM de chaque dNTP + 0.2 mM UTP biotine, 20 mM (NH4) 2SO4, 8 mM MgSO4, 0.1% Triton X100, 0.005 U/pL AMV RTase, 0.32 U/pL B. st DNA polymerase) dans un tube laissé au bain marie à 63 C pendant 3 heures. L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes: -tube N 1: traitement de 50 cellules de P.aeruginosa; - tube N 2: témoin sans cellules; - tube N 3: témoin sans cellules + dUTP-biotine; - tube N 4: traitement de 50 cellules + dUTP-biotine Les produits d'amplification ont été visualisés sur gel d'agarose pour s'assurer de la présence de produits d'amplification dans les mélanges des réactions 1 et 4 et de l'absence d'amplification dans les mélanges 2 et 3. Les produits des 4 réactions ont été déposés sur une membrane en nylon. La membrane a été ensuite incubée avec une solution de blocage (Pierce blocking buffer + 1% SDS) pendant 45 minutes, puis mise en contact avec une solution de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (1 mg/ml), laquelle a été diluée à hauteur de 1/750 dans la solution de blocage; Après 45 minutes d'incubation, la membrane a été rincée à l'aide d'une solution lavage (PBS tween 0,2 %) pendant 30 minutes. Un substrat à base de luminol, commercialisé par la société Pierce de la peroxydase du radis noir a été pulvérisé à la surface de la membrane afin de permettre la réaction lumineuse de se produire. Le point C/ de la figure 4 montre l'image obtenu après traitement de l'image par un analyseur (camera CCD). On peut facilement visualiser pour le mélange de réaction N 4, la réaction obtenue entre les produits d'amplification marqués par la biotine et la peroxydase. Cette expérience montre que l'on peut détecter facilement sur 30 membrane des produits d'amplification obtenus à partir d'une quantité d'acides nucléiques équivalente à 50 cellules d'un microorganisme tel que Pseudomonas aeruginosa. Exemple 2 Un autre essai illustré à la figure 4 a consisté à déposer sur une membrane - 130 cellules de Pseudomonas aeruginosa. Suite à ce dépôt la membrane a été placée sur un pad en cellulose imprégné avec 1.5 mL de la solution de fixation (0.25% Glutaraldehyde dans 95% d'alcool dénaturé) pendant 5 min à température ambiante puis séchée 5 min à température ambiante. La membrane a été placée dans une boite de Pétri hermétique puis 0. 5 mL de la solution d'amplification (2 pmol/pL d'oligonucléotides FIP & BIP; 1 pmol/pL d'oligonucléotides loop F & loop B; 0.2 pmol/pL d'oligonucléotides F3 & B3 dans 40 mM Tris HCI pH 8.8, 20 mM KCI, 0.6 M Betaine, 1.5 mM de chaque dNTP + 0.2 mM UTP biotine, 20 mM (NH4) 2SO4, 8 mM MgSO4, 0.1% Triton X100, 0.005 U/pL AMV RTase, 0.32 U/pL DNA polymerase) a été ajouté avant l'incubation à 63 C pendant 150 min. La membrane a été ensuite incubée avec une solution de blocage (Pierce blocking buffer + 1% SDS) pendant 45 minutes, puis mise en contact avec une solution de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (1 mg/ml), laquelle a été diluée à hauteur de 1/750 dans la solution de blocage; Après 45 minutes d'incubation, la membrane a été rincée à l'aide d'une solution de lavage (PBS tween 0,2 %) pendant 30 minutes. Un substrat à base de luminol, commercialisé par la société Pierce de la peroxydase du radis noir a été pulvérisé à la surface de la membrane afin de permettre à la réaction lumineuse de se produire. Les signaux sont enregistrés à l'aide du Milliflex Rapid . Les résultats sont présentés aux parties B & C de la figure 6. Sur la partie C de la figure 6, on peut facilement visualiser deux pics d'amplification correspondant aux dépôts initiaux des cellules sur la membrane. En parallèle la solution ayant servi à l'amplification a été recueillie et analysée par électrophorèse en gel d'agarose. Le résultat de celle-ci est présenté à la partie B de la figure 6. On peut facilement visualiser qu'il est retrouvé dans la solution d'amplification une partie des produits d'amplification Cette expérience montre que l'on peut détecter facilement sur membrane des produits d'amplification obtenus à partir d'une quantité d'acides nucléiques équivalente à 130 cellules d'un microorganisme tel que Pseudomonas aeruginosa. Néanmoins une partie de ces produits d'amplification est éluée de la membrane et peuvent être détectés par électrophorèse. Exemple 3 Un autre essai illustré à la figure 6 peut consister à filtrer 100 mL d'une solution en utilisant le dispositif présenté à la figure 5. Suite à la filtration le dispositif est placé sur un pad en cellulose imprégné avec 1.5 mL de la solution de fixation (0.25% Glutaraldehyde dans 15 95% d'alcool dénaturé) pendant 5 min à température ambiante. La membrane est séchée 5 min à température ambiante, puis la partie inférieure du dispositif est fermée en utilisant la cassette de fermeture afin d'éviter les fuites durant l'incubation. 1.5 mL de la solution d'amplification (2 pmol/pL d'oligonucléotides FIP & BIP; 1 pmol/pL d'oligonucléotides loop F & loop B; 0.2 pmol/pL d'oligonucléotides F3 & B3 dans 40 mM Tris HCI pH 8.8, 20 mM KCI, 0.6 M Betaine, 1.5 mM de chaque dNTP + 0.2 mM UTP biotine, 20 mM (NH4) 2SO4, 8 mM MgSO4, 0.1% Triton X100, 0.005 U/pL AMV RTase, 0.32 U/pL DNA polymerase) est réparti au dessus de la membrane du dispositif puis sa partie haute est refermée avec le couvercle afin d'éviter l'évaporation durant l'incubation à 63 C pendant 150 min. La membrane est ensuite incubée avec une solution de blocage pendant 45 minutes, puis mise en contact avec une solution de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (1 mg/ml), laquelle est diluée à hauteur de 1/750 dans la solution de blocage; Après 45 minutes d'incubation, la membrane a été rincée à l'aide d'une solution de PBS tween 0,2 % pendant 30 minutes. Un substrat de la peroxydase du radis noir à base de luminol, commercialisé par la société Pierce est pulvérise à la surface de la membrane afin de permettre la réaction lumineuse de se produire. Les signaux sont enregistrés à l'aide du Milliflex Rapid .. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection spécifique sur une membrane d'un 5 ou plusieurs microorganismes présents dans un liquide, un gaz ou sur une surface, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on met en contact le liquide, le gaz ou la surface avec la membrane de sorte à capter sur la membrane le ou les microorganismes; b) on amplifie spécifiquement les acides nucléiques présents dans le ou 10 les microorganismes de manière isotherme sur la membrane pour obtenir des produits d'amplification; c) on détecte les produits d'amplification obtenus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape a) on capte le ou les microorganismes par passage du liquide ou du 15 gaz à travers la membrane. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape a) on capte le ou les microorganismes présent dans le gaz ou la surface par impaction des microorganismes sur la rembrane. 4. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce 20 que le ou les microorganismes à détecter sont contenus dans un liquide, en particulier un milieu aqueux. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ou les microorganismes à détecter sont contenus dans un gaz, en particulier l'air. 6. Procédé selon les revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que le ou les microorganismes à détecter sont présents sur la surface d'un solide. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les acides nucléiques amplifiés à l'étape b) consistent 30 en des ADN. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les acides nucléiques amplifiés à l'étape b) consiste en des ADNc obtenus par une étape supplémentaire de transcription inverse spécifique réalisée à partir des ARN contenus dans le ou les microorganismes. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisée en ce que les ARN à partir desquels est réalisée l'étape de transcription inverse sont des ARN messagers contenus dans le ou les microorganismes. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que les ADN contenus dans le ou les microorganismes ou bien les ADNc obtenus par transcription inverse à partir des ARN contenus dans le ou les microorganismes, sont amplifiés à l'étape b) par une technique d'amplification de type LAMP. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la technique d'amplification de type LAMP comprend une phase dans laquelle des amorces loop F et loop B sont hybridés au niveau des boucles présentes au niveau des produits d'amplification, afin d'augmenter la vitesse de formation desdits produits d'amplification. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les produits d'amplification qui sont détectés à l'étape c) consistent en des ADN. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'on incorpore un marqueur dans les produits d'amplification obtenus à l'étape b) permettant leur détection à l'étape c). 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le marqueur incorporé dans les produits d'amplification est une base purique ou pyrimidique marquée. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le marqueur incorporé dans les produits d'amplification consistent en des amorces, lesquelles sont marquées. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le amorces marquées, incorporées dans les produits d'amplification, consistent en des amorces LoopF et/ou LoopB telles que définies à la revendication 11. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le marqueur incorporé dans les produits d'amplification est couplé avec un ligand que l'on fait réagir ensuite avec une molécule marquée capable d'interagir avec ce ligand. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le ligand est une biotine. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on met en contact à l'étape c) les produits d'amplification comportant de la biotine avec de la streptavidine couplée à une molécule permettant sa détection. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le ligand consiste en un antigène ou un anticorps que l'on fait réagir ensuite avec des anticorps ou des antigènes marqués. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le marqueur incorporé dans les produits d'amplification à l'étape b) est couplé 15 avec une digoxygenine. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on met en contact à l'étape c) les produits d'amplification comportant de la digoxygenine avec un anticorps anti-digoxygenine couplé à une molécule permettant sa détection. 23. Procédé selon l'une des revendications 19 et 22, caractérisé en ce que la molécule marquée capable d'interagir avec le ligand est conjuguée avec la peroxydase du radis noir ou la peroxydase de la graine de soja. 24. Procédé selon l'une des revendications 19 et 22, caractérisé 25 en ce que la molécule marquée capable d'interagir avec ce ligand est conjuguée avec la phosphatase alcaline. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 24, caractérisé en ce que le marqueur incorporé dans les produits d'amplification permet une détection par fluorescence. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que les molécules permettant la détection par fluorescence des produits d'amplification ont un spectre d'émission dans l'infra rouge proche. 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on hybride à l'étape c) les produits d'amplification obtenus à l'étape b) avec des sondes d'hybridation spécifiques marquées. 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel les sondes d'hybridation sont marquées à l'aide d'une molécule fluorescente, d'un ligand, un anticorps ou un antigène tels que définis dans l'une quelconque des revendications 17 à 26. 29. Procédé l'une des revendications 27 et 28, caractérisé en ce que la sonde d'hybridation spécifique marquée est de type PNA. 30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 29, caractérisé en ce que l'étape c) de détection de ou des microorganismes est réalisée directement sur la membrane. 31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 30, caractérisé en ce que la membrane utilisée présente des pores d'un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,15 et 0,8 microns, plus préférentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. 32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 31, caractérisée en ce que la membrane est constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytetrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidene), le polycarbonate, le polyamide, le polysulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. 33. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 32, caractérisée en ce que la membrane est une membrane filtrante. 34. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 33, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire consistant à mettre en culture le ou les microorganismes captés sur la membrane à l'étape a) par mise en contact de ladite membrane avec un milieu nutritif. 35. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 34, caractérisé en ce qu'on procède, en outre, à une étape de lyse de la paroi du ou des microorganismes captés sur la membrane afin de libérer les acides nucléiques contenus dans le ou les microorganismes. 36. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 35, caractérisé en ce qu'on procède, en outre, à une étape de détection de la présence du ou des microorganismes vivants par ATP-bioluminescence. 37. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'on procède, en outre, à une étape de fixation du ou des microorganismes captés sur la membrane et/ou des acides nucléiques provenant desdits microorganismes. 38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que l'étape de fixation consiste à traiter le ou les microorganismes ou leurs acides nucléiques à la surface de la membrane avec une solution de fixation. 39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que la solution de fixation contient un agent de réticulation choisi parmi le glutaraldéhyde, le formaldéhyde et le paraformaldéhyde. 40. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que l'étape de fixation consiste en une irradiation par les UV de la membrane, du ou des microorganismes, ou leurs acides nucléiques, captés sur ladite membrane. 41. Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que le ou les microorganismes, ou leurs acides nucléiques, sont fixés sur une 20 membrane comprenant un matériau à base de polyamide. 42. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 41, caractérisé en ce que plusieurs types de microorganismes issus du même liquide ou gaz peuvent être détectées en parallèle de manière spécifique sur la même membrane. 43. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 42, caractérisé en ce que le ou les microorganismes à détecter sont choisis parmi les bactéries, virus, protozoaires, mycoplasmes, moisissures et levures. 44. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 43, caractérisé en ce que le ou les microorganismes à détecter sont présents dans un liquide qui est l'eau. 45. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 44, caractérisé en ce que le microorganisme est la bactérie Pseudomonas aeruginosa. 46. Procédé de détection spécifique sur membrane filtrante d'une ou plusieurs bactéries de l'espèce Pseudomonas aeruginosa contenues dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on filtre le liquide au travers d'une membrane filtrante, b) on capte les bactéries contenues dans le liquide sur la membrane filtrante; c) on amplifie spécifiquement les acides nucléiques de Pseudomonas aeruginosa contenus dans ces bactéries de manière isotherme à la surface ou à l'intérieur de la membrane filtrante à l'aide d'une amplification de type LAMP en utilisant au moins une amorce comprenant une séquence prise parmi SEQ IDNO.2,SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQet SEQ ID NO.7; d) on détecte les produits d'amplification obtenus sur la membrane filtrante. 47. Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce qu'on réalise une étape de transcription inverse sur les ARN contenus dans les bactéries afin d'obtenir un ADNc comprenant la séquence SEQ ID NO.1, l'amplification de type LAMP étant réalisée à partir dudit ADNc. 48. Un oligonucléotide permettant la détection spécifique de Pseudomonas aeruginosa par amplification des acides nucléiques contenus dans cette bactérie, caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NO. 2 à 7. 49. Un kit pour la détection spécifique sur membrane d'un ou 25 plusieurs microorganismes comprenant: - une membrane; - un ou plusieurs amorces spécifiques permettant d'amplifier des acides nucléiques de manière isotherme. 50. Un kit selon la revendication 49, caractérisé en ce que la 30 membrane est une membrane filtrante. 2885140 32 51. Un kit selon l'une des revendications 49 et 50, caractérisé en ce que les moyens d'amplification isotherme spécifique des acides nucléiques présents sur la membrane comprennent des oligonucléotides FIP et BIP nécessaires à la mise en oeuvre d'une amplification de type LAMP. 52. Un kit selon l'une des revendications 50 et 51, pour la détection spécifique sur membrane filtrante de la bactérie Pseudomonas aeruginosa comprenant: - une membrane filtrante; - au moins un oligonucléotide comprenant une séquence 10 nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 2 à 7. 53. Dispositif d'amplification d'acides nucléiques adapté à la mise en oeuvre du procédé selon les revendications 1 à 47, comportant une membrane (1) pour la réception des acides nucléiques à amplifier, ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte un corps (2) délimitant un volume interne et muni de moyens pour le maintien en contact, dans ce volume interne, de la membrane (1) avec une paroi imperméable plane (3) et avec une grille (4) formant une pluralité d'alvéoles à la surface de la membrane (1). 54. Dispositif selon la revendication 53, caractérisé en ce que lesdites alvéoles permettent de contenir un volume compris entre 1 et 100 l, de préférence entre 3 et 10 l d'une solution de réaction. 55. Dispositif selon l'une des revendications 53 et 54, caractérisé en ce que le corps (2) comporte un épaulement (5) adapté à coopérer avec la périphérie de la membrane (1). 56. Dispositif selon la revendication 55, caractérisé en ce que la membrane (1) est fixée par sa périphérie contre ledit épaulement (5). 57. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 56, caractérisé en ce que la paroi plane (3) serre la périphérie de la membrane (1) contre ledit épaulement (5). 58. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 57, caractérisé en ce que la grille (4) est faite d'une seule pièce avec le corps (2). 59. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 58, caractérisé en ce que la paroi plane (3) est amovible vis-à-vis du corps (2). 60. Dispositif selon la revendication 59, caractérisé en ce que la paroi plane (3) comporte une jupe (6) s'étendant transversalement et en ce que le corps (2) comporte un manchon (7) destiné à coopérer avec la jupe (6). 61. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 60, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un couvercle (8) amovible adapté à être disposé en vis-à-vis de la grille (4) pour fermer ledit volume interne. 62. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 61, caractérisé en ce qu'il comporte un réservoir (9) rattaché au corps (2). 63. Dispositif selon la revendication 62, caractérisé en ce que le réservoir (9) est rattaché au corps (2) par une zone frangible (10). 64. Dispositif selon la revendication 63, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un couvercle amovible adapté à fermer alternativement le réservoir (9) et ledit volume interne au niveau de la zone frangible (10). 65. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 64, caractérisé en ce que la paroi plane (3) comporte un orifice de drainage (11). 66. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 53 à 20 65, caractérisé en ce que la membrane (1) est une membrane filtrante.