Brevet FR2877224A1 — publié le 20060505

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une composition pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancers et plus particulièrement pour inhiber la croissance tumorale ou la prolifération des métastases. Les cellules sont constamment renouvelées, une partie d'entre elles meurent et sont remplacées par de nouvelles. Le cancer se caractérise par une croissance incontrôlée de cellules anormales. Elles prolifèrent de manière anarchique pour former une tumeur qui envahit et détruit, par la suite, les tissus environnants. La tumeur peut être bénigne (c'est-à-dire ne présente aucun danger) ou maligne (c'est-à-dire dangereuse, provoquant des métastases). Le processus métastatique implique une série d'étapes: après l'invasion du tissu environnant, les cellules cancéreuses peuvent pénétrer dans les vaisseaux sanguins ou lymphatiques et se déplacer avec la circulation. Elles peuvent s'arrêter dans un nouveau lit vasculaire, migrer dans l'environnement du nouvel organe puis proliférer pour former une micro métastase. Cette dernière développera un nouveau réseau vasculaire pour croître. Les causes des cancers peuvent être d'origine virale, génétique (dysfonctionnement de certains gènes), immunitaire ou hormonale. D'autres facteurs comme le tabac ou une exposition à certaines radiations favorisent également leur apparition. Les traitements classiques du cancer sont: la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et/ou l'hormonothérapie. D'autres traitements moins éprouvants pour le patient peuvent être envisagés pour inhiber la croissance tumorale ou la prolifération des métastases. L'angiogénèse est un processus biologique de néovascularisation se développant autour de la tumeur, permettant à celle-ci de s'approvisionner et de croître. De plus en plus de médicaments comprennent des inhibiteurs de l'angiogenèse formant un nouveau type de traitement pour le cancer qui interrompt spécifiquement la formation et la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins et par le fait même coupe l'approvisionnement sanguin pour asphyxier la tumeur. La thérapie génique est également utilisée pour remplacer un gène défectueux, responsable de la formation des cellules cancéreuses, par un gène intact. Une autre thérapie consiste à développer le système immunologique de l'organisme pour le défendre contre l'intrusion des cellules cancéreuses. La présente invention vise donc à proposer un autre moyen pour inhiber la croissance tumorale ou la prolifération des métastases et en particulier une composition ne contenant que des composés naturels ou de très faible coût. La demanderesse a mis en évidence qu'une composition comprenant de l'éthanol, de l'acétate d'éthyle, de l'eucalyptol, du dipropylène glycole, du linalol, de l'acétate de linalol, de l'anydride itaconique ou méthyle succinique, du terpinène-4-ol, du a-terpinéol, du camphre, de l'acétate de bornyle, du formiate de géranyle, du géraniol ou de l'acétate de géranyle, de la coumarine, du diethyle phtalate, possède de façon surprenante une activité antiproliférative des cellules cancéreuses. Le profil toxicologique de ces différents composés n'est pas de nature à induire un risque sur la santé humaine et la formulation ne présente pas d'innovation de nature à provoquer des réactions nocives pour l'être humain. De plus, il n'est pas connu à ce jour d'interaction néfaste entre ces composés. Selon l'invention, cette composition est utilisée pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers et plus particulièrement pour inhiber la croissance tumorale ou la prolifération de métastases chez des patients atteints de cancers. Cette composition est particulièrement adaptée pour être appliquée sur un patient humain, mais elle peut également être utilisée pour d'autres mammifères. Préférentiellement, les composés sont dosés dans des proportions voisines des valeurs suivantes: éthanol 20% ; acétate d'éthyle 1% eucalyptol 1% ; dipropylène glycole 20% ; linalol 13% ; acétate de linalol 2% ; anydride itaconique ou méthyle succinique 1% ; terpinène-4-ol 5% a-terpinéol 5 % ; camphre 1% ; acétate de bornyle 4 % ; formiate de géranyle 2% ; géraniol ou acétate de géranyle 5% ; coumarine 1% diethyle phtalate 20%. La quantité utilisable dépend de l'effet recherché et la composition peut être utilisée pure ou diluée avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, avantageusement entre 0.01 et 0.3%, préférentiellement à 0.7%. La plupart des composés à la base de la composition peuvent être extraits par distillation de produits naturels, par exemple: éthanol (raisin fermenté), eucalyptol (eucalyptus radiata), /ina/ol (occimum basilicum), acétate de linalol (citrus aurantium), terpinène-4-ol (malaleuca alternifolia), a-terpinéol (citrus aurantifolia), camphre (rosmarinus officinalis), acétate de bornyle (cistus ladaniferus), formiate de géranyle (pelargonium graveolens), géraniol (citrus lemonum), acétate de géranyle (cymbopogon nardus), coumarine (fève Tonka). Les autres composés peuvent être obtenus par des procédés de fabrication simples et peu onéreux, par exemple, acétate d'éthyle (WO 01/46117A1), dipropylène glycole (US 3574772), anhydride itaconique (GB 854999), anhydride méthyle succinique (FR 2735775), diethyle phtalate (US 2618651). Selon une caractéristique de l'invention, ces composés sont avantageusement extraits par distillation d'un mélange de sel iodé, de jus de citron, d'oignon frais, d'acide citrique et d'alcool, dosés dans les proportions voisines de: 10 % de sel iodé, 15 % de jus de citron, 50 % d'oignon frais, 5 % d'acide citrique, 20 % d'alcool. Ces différentes caractéristiques permettent d'obtenir une composition ne contenant que des composés naturels de très faible coût et facile à préparer. Les voies d'administration de la composition selon la présente invention, sous forme de solution buvable ou sous une forme médicamenteuse appropriée, seront établies en fonction de la pathologie à traiter, par exemple par voie buccale, par voie locale en application topique sur la peau et les muqueuses ou par injection par voie intraveineuse, intramusculaire, intrapérithonéale ou sous-cutanée. Ces compositions peuvent se présenter sous toutes les formes pharmaceutiques habituellement utilisées en médecine humaine: comprimés, gélules, gouttes, granulés, préparations injectables, pommades, crèmes ou gels. Préférentiellement, la composition se présente sous la forme d'une solution injectable par voie parentérale. Les composés de l'invention peuvent être associés de manière classique à des véhicules, supports ou excipients traditionnellement utilisés dans le milieu médical et pharmaceutiquement acceptables: conservateurs, antioxydants, solvants, stabilisants... En outre, la composition pourra être utilisée en combinaison avec d'autres agents anti-cancéreux comme les agents antimicrotubules (vinblastine, vincristine, vindésine, ...), les agents alkylants (ifosfamide, lomustine, cyclophosphamide, chlorambucil, busulfan, ...), les anthracyclines (doxorubicine, épirubicine, losoxantrone, ...), les agents antibiotiques (bléomycine, mitomycine, ...), les dérivés de platine (cisplatine ou carboplatine, ...) ou les agents anti- angiogéniques (facteur plaquettaire 4 + héparine, medroxyprogestérone, SCM-chitine, ...). Pour ce qui concerne les concentrations d'administration, il faudra donc adapter la concentration à la pathologie visée et éventuellement au patient. Les concentrations optimales se situent entre 0.01 et 0.3 % et seront de préférence situées à environ 0.7 %. La posologie sera adaptée en fonction de la concentration du mélange de base, de la pathologie à traiter et du profil du patient. De préférence, la solution est préparée de telle façon à en injecter de 0.01 à 1000 mL, ladite solution contenant 0.7% de la composition selon l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture des exemples suivants, faits à titre indicatif et non limitatif et en regard des dessins annexés sur lesquels: - La figure 1 montre les effets d'un traitement à l'aide de 5 concentrations croissantes de la composition de la demanderesse (0.01 à 5 % final) sur la survie de la lignée cellulaire KB. Les effets sont déterminés après 96h de traitement et révélés par un essai MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie. Chaque valeur est la moyenne de quatre déterminations. (Expérience de prédétermination). - La figure 2 montre les effets d'un traitement à l'aide de 10 concentrations croissantes de la composition de la demanderesse (0.01 à 5 0/0 final) sur la survie de la lignée cellulaire KB. Les effets sont déterminés après 96h de traitement et révélés par un essai MU. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie. Chaque valeur est la moyenne de quatre déterminations. (Expériences de détermination n 1 à 3). - La figure 3 résume des effets d'un traitement à l'aide de 10 concentrations croissantes de la composition de la demanderesse (0.01 à 5 % final) sur la survie de la lignée cellulaire KB. Les effets sont déterminés après 96h de traitement et révélés par un essai MU. Trois expériences indépendantes ont été réalisées. EXEMPLE 1: Détermination des concentrations de la composition selon l'invention permettant d'obtenir 50% d'inhibition de la prolifération (IC50) de la lignée cellulaire humaine KB. 1. Matériels et méthodes. La composition de la demanderesse a été fournie sous forme de solution (30% v/v dans l'eau). les composés de la composition de base sont dosés dans des proportions voisines des valeurs suivantes: éthanol 20% ; acétate d'éthyle 1% ; eucalyptol 1% ; dipropylène glycole 20% ; linalol 13% ; acétate de linalol 2% ; anydride itaconique ou méthyle succinique 1% ; terpinène-4- ol 5% ; a-terpinéol 5 % ; camphre 1% ; acétate de bornyle 4 % ; formiate de géranyle 2% ; géraniol ou acétate de géranyle 5% ; coumarine 1% ; diethyle phtalate 20%. Le milieu de culture a été utilisé comme véhicule. La lignée cellulaire KB ainsi que le milieu de culture approprié ont été fourni par Oncodesign . Les cellules ont été cultivées en monocouche dans une étuve à 37 C et sous atmosphère humide (5% CO2, 95% air). Le milieu de culture a été du RPMI 1640 (Ref BE12-702F, Cambrex ) contenant 2 mM de L-glutamine et supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (Ref DE14-801E, Cambrex ). Pour les expérimentations, les cellules ont été détachées du support par une incubation de 10 minutes avec une solution de trypsineversene (Ref 02-007E, Cambrex ), diluée 10 fois dans du tampon Hank's ne contenant ni calcium ni magnésium (Ref BE10-543F, Cambrex ). Les cellules ont été dénombrées à l'aide d'un hématimètre et leur viabilité a été évaluée par un test d'exclusion au bleu trypan 0,25%. La détection des mycoplasmes a été réalisée par le test Mycotect (Ref 15672-017, Invitrogen ). La détection des mycoplasmes a été réalisée en duplicate à partir des surnageants de culture et comparée à des contrôles positifs et négatifs. Aucune contamination par des mycoplasmes n'a été mise en évidence dans la lignée KB. 2. Schéma expérimental: étude de la cytotoxicité in vitro. Les cellules KB (10,000 cellules par puits) ont été distribuées 24h dans des microplaques 96 puits à fond plat (Ref 055260, Nunc ). Les cellules ont été incubées 24 h avant traitement à 37 C dans 100 pl de milieu de culture ne contenant pas de substance à tester. a. ETAPE 1: prédétermination de l'ICso Les cellules KB ont été incubées durant 96 heures avec 5 concentrations différentes de la composition de la demanderesse (entre 0,01% et 5% en concentration finale). Les cellules (100 pl) ont été incubées dans un volume final de 200 pI de milieu de culture contenant la composition de la demanderesse. L'expérience a été effectuée une seule fois, chaque concentration étant testée en quadruplicate, les cellules contrôles étant incubées avec du milieu de culture sans la composition de la demanderesse. A la fin de l'incubation, l'activité cytotoxique a été évaluée par un test MU. b. ETAPE 2: détermination de l'ICso Les cellules KB ont été incubées durant 96 heures avec 10 concentrations différentes de la composition de la demanderesse (entre 0,01% et 5% en concentration finale). Les cellules (100 pI) ont été incubées dans un volume final de 200 pl de milieu de culture contenant la composition de la demanderesse. L'expérience a été effectuée trois fois, chaque concentration étant testée en quadruplicata, les cellules contrôles étant incubées avec du milieu de culture sans la composition de la demanderesse. A la fin de l'incubation, l'activité cytotoxique est évaluée par un test MU. c. Test MU L'activité cytotoxique in vitro de la composition de la demanderesse a été révélée par le test MTT (CARMICHAEL et ai., Cancer Res. 1987, 47: 936-942). Dans l'hypothèse où des tests ELISA devaient être effectués, 50 pl de surnageants de culture ont été prélevés dans chaque puit avant la révélation par le test MU et conservés à -80 C. A la fin de l'incubation, 20 pl d'une solution de sels de tetrazolium à 5 mg/ml (Ref M2003, Sigma ) diluée dans du tampon phosphate (Ref BE17-517Q, Cambrex ) et filtrée à 0, 22 pm, ont été ajoutés dans chaque puits. Les microplaques ont été incubées pendant 4 h à 37 C. Les surnageants ont ensuite été retirés et les cristaux de formazan ont été solubilisés par 200 pl de DMSO (Sigma ). L'absorbance (OD) à 570 nm a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre de type Multiskan (Labsystem ). Les résultats ont été enregistrés à l'aide du logiciel Genesis (Labsystem). Les résultats sont exprimés comme la concentration de la composition de la demanderesse nécessaire à l'inhibition de 50% de la croissance cellulaire (IC50). 3. Résultats. a. Détermination de l'IC50 La courbe dose-réponse de l'inhibition de la prolifération (IC) est exprimée comme suit: OD puits exposés à la drogue IC = X 100 OD puits sans drogue IC50: concentration de la composition de la demanderesse inhibant 50% de la prolifération cellulaire. La courbe dose-réponse a été calculée à l'aide du logiciel XLFit 3 (IDBS ). Les valeurs d'IC50 correspondant aux étapes de pré-détermination et de détermination ont été calculées à l'aide du logiciel XLFit 3 à partir de courbes semi-log. b. Etude de la cytotoxicité In vitro Le résultat de l'étude de prédétermination est présenté figure 1, les résultats de l'étude de détermination sont présentés figure 2. Le tableau résumant les IC50 déterminées lors de l'étude de détermination est présentée figure 3. La lignée cellulaire KB est sensible in vitro à la composition de la demanderesse. L'IC50 de la composition de la demanderesse sur cette lignée est 0.74 0.14 %. Cette valeur n'est pas significativement modifiée si la solution est filtrée. 4. Conclusion. Une activité antiproliférative de la composition de la demanderesse a été observée sur la lignée cellulaire KB. Une utilisation pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber la croissance tumorale ou la prolifération de métastases chez des patients atteints de cancers peut donc être envisagée. EXEMPLE 2: Evaluation de la tolérance de la composition de la 10 demanderesse chez la souris Nude. 1. Protocole. Trois souris Nude saines ont reçu une injection de 100 pl de la composition de la demanderesse à 5% durant cinq jours consécutifs. La survie et le poids des animaux ont été enregistrés deux fois par semaine. Les animaux ont été sacrifiés 14 jours après le dernier traitement et autopsiés. 2. Résultats. Aucune modification du poids des animaux n'a été observée suite à l'injection sous-cutanée de la composition de la demanderesse à 5 % durant cinq jours consécutifs. Rien de particulier n'a été observé au site d'injection. Les animaux ont été sacrifiés 14 jours après le dernier traitement. Rien de notable n'a été observé lors de l'autopsie des animaux. 3. Conclusion. La composition de la demanderesse est parfaitement tolérée chez la souris Nude. - 10 - REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une composition comprenant de l'éthanol, de l'acétate d'éthyle, de l'eucalyptol, du dipropylène glycole, du linalol, de l'acétate de linalol, de l'anydride itaconique ou méthyle succinique, du terpinène-4-ol, du a-terpinéol, du camphre, de l'acétate de bornyle, du formiate de géranyle, du géraniol ou de l'acétate de géranyle, de la coumarine, du diethyle phtalate, pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers. 2. Utilisation selon la revendication 1 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber la croissance tumorale chez des patients atteints de cancers. 3. Utilisation selon la revendication 1 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber la prolifération de métastases chez des patients atteints de cancers. 4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les composés sont dosés dans les proportions voisines de: éthanol 20% ; acétate d'éthyle 1% ; eucalyptol 1% ; dipropylène glycole 20% ; linalol 13% ; acétate de linalol 2% ; anydride itaconique ou méthyle succinique 1% ; terpinène-4-ol 5% ; a-terpinéol 5% ; camphre 1% ; acétate de bornyle 4% ; formiate de géranyle 2% ; géraniol ou acétate de géranyle 5% ; coumarine 1% ; diethyle phtalate 20%. 5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition est diluée avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable entre 0.01 et 0.3 %. - 11 - 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la composition est diluée à environ 0.7 %. 7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition est utilisée en combinaison avec d'autres agents anti-cancéreux comme les agents antimicrotubules, les agents alkylants, les anthracyclines, les agents antibiotiques, les dérivés de platine, les agents anti-angiogéniques. 8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les différents composants sont extraits d'une composition comprenant du sel iodé, du jus de citron, de l'oignon frais, de l'acide citrique et de l'alcool. 9. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée par le fait que les composants sont dosés dans les proportions voisines de: 10 % de sel iodé, 15 % de jus de citron, 50 % d'oignon frais, 5 % d'acide citrique, 20 fo d'alcool.