Brevet FR2882357A1 — publié le 20060825

R2 R1 (I) La présente invention concerne l'utilisation de dérivés phénanthrèniques en tant qu'agents anti-inflammatoires. La présente invention concerne également un procédé de synthèse des ces dérivés phénanthrèniques ainsi que les produits intermédiaires synthétisés lors de ce procédé. La réaction inflammatoire est une réaction de défense de l'hôte à une agression extérieure. Cette réaction peut notamment être médiée par des composés appartenant à la classe des prostaglandines et des leucitriènes. Dans ce cas, la molécule centrale de la réaction inflammatoire est l'acide arachidonique, la réaction inflammatoire et l'ensemble de ses métabolismes étant appelés cascade de prostaglandines . L'acide arachidonique n'est quasiment pas présent à l'état libre dans le cytoplasme cellulaire, il est essentiellement présent au niveau cellulaire sous forme d'ester au niveau des phospholipides membranaires. Sous l'action d'une enzyme, la phospholipase A2, l'acide arachidonique est libéré et métabolisé selon deux voies: la voie des lipo-oxygénases qui conduit à la synthèse des leucitriènes et la voie des cyclo- oxygénases qui enclenche la synthèse des prostanoïdes. Le traitement de la composante inflammatoire des pathologies cutanées par voie topique implique généralement l'utilisation de corticoïdes locaux dont les effets secondaires sont bien connus. Les agents antiinflammatoires non stéroïdiens sont peu ou pas actifs lorsqu'ils sont administrés par voie topique. La recherche d'agents anti-inflammatoires non stéroïdiens actifs par voie topique reste donc un axe majeur de recherche en pharmacologie, en dermatologie et en dermo-cosmétique. Au sens de la présente invention, on entend par dérivés phénanthrèniques des composés de formule générale qui peuvent éventuellement être substitués en position 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 9 par des radicaux choisis dans le groupe constitué par OH, OCH3, OC2H5, CH3 et C2H5. Lorsque deux substituants sont portés par des atomes de carbone adjacents, ils peuvent éventuellement former ensemble un hétérocycle -O- CH2-O-. Les principaux dérivés phénanthrèniques connus ont été isolés à partir d'extraits de plantes appartenant à la famille des Orchidaceae. Ainsi divers dérivés phénanthrèniques ont été isolés, principalement à partir de différentes Orchidaceae (P.L. Majumder and R.C. Sen, Pendulin, a polyoxygenated phenanthrene derivative from the Orchidaceae Cymbidum pendulum, Phytochemistry, Vol. 30, pp. 2432-2434, 1991; P. Tuchinda et al, Phenanthrenes of Eulophia nuda, Phytochemistry, Vol. 27, no10, pp. 32673271, 1988; Shimuzu et al, anti-inflammatory constituents of topically applied crude drugs III. Constituents ant anti-inflammatory effect of Paraguayan crude drug Tamanda cuna , Chem. Pharm. Bull., 36(11)447-4452, 1988). Les dérivés phénanthrèniques, isolés à partir d'extraits d'Orchidaceae, sont décrits comme présentant une activité sur le système gastrointestinal, une activité antipyrétique, une activité anti-oxydante ainsi qu'une activité spasmolytique. Le Tamier, plante principale de la famille des Dioscoreaceae, est une plante assez commune des sous-bois européens. Elle porte un certains nombre de noms vernaculaires tels que herbe aux femmes battues , racine de feu , vigne sauvage , ... Le tamier est une plante grimpante, vivace par un rhizome, la tige est volubile, herbacée, grêle, striée, verte ou rougeâtre. Le tamier peut atteindre 3 m de hauteur, le rhizome est volumineux et charnu, gris à section blanchâtre, recouvert d'une sorte de liège. Les feuilles sont entières, pétiolées, cordiformes à la base et terminées en pointe au sommet, à nervation palmée. L'insertion des feuilles sur la tige est alterne. Les fleurs sont regroupées en inflorescences axillaires. Les fleurs mâles et les fleurs femelles ne sont pas portées par le même pied: le Tamier est une espèce dioïque. Le fruit est une petite baie globuleuse, charnue et luisante, d'abord verte puis devenant rouge à maturité. La maturation s'effectue du mois d'août et au mois de novembre. Le Tamier est connu pour posséder de nombreuses propriétés médicinales traditionnelles, notamment des propriétés diurétiques et purgatives, des propriétés anti-inflammatoires, mais aussi analgésiques. Reisch et al. ont été les premiers à mettre en évidence la présence de dérivés phénanthrèniques dans le rhizome de Tamier (Reisch et al., structure and biochemistry of naturel phenanthrene derivatives, Herba Hung, 1970, 9(2), 43-48; Reisch et al., Chemistry of naturel substances. Nitrogen-free phenenthrene derivatives from Tamus communis rhizomes, Tetrahedron Lett., 1969, 2, 67-68). Les dérivés phénanthrèniques ont été décrits comme régulateurs de croissance et inducteurs de dormance. La confusarine, qui a été isolée de l'Orchidaceae Bulbophyllum reptans, de Eia confusa de Bulbophyllum gymnopus, et de Catasetum barbatum, est connue pour présenter une action anti-inflammatoire (Shirmuzu et al, antiinflammatory constituents of topically applied crude drugs III. Constituents ant anti-inflammatory effect of Paraguayan crude drag Tamanda cuna , Chem. Pharm. Bull., 36(11)447-4452, 1988). Elle répond à la formule suivante: En général, les dérivés de phénanthrène, en particulier la confusarine, présentent une activité génotoxique qui limite leur utilisation en tant que médicament. Aussi existe-t'il un besoin de produits, naturels ou obtenus par synthèse organique, qui présentent une activité anti-inflammatoire mais qui soient peu génotoxiques. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que certains dérivés phénanthrèniques présentent une activité anti-inflammatoire, tout en étant peu génotoxiques. Ces dérivés peuvent être isolés à partir d'extraits de Tamier commun ou peuvent être obtenus par synthèse organique. La présente invention concerne l'utilisation de dérivés de phénanthrène de 25 formule générale (I) (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent, indépendamment les uns des autres, un radical hydroxyle ou un radical méthoxy (-OMe), R4 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxyle éventuellement protégé par un groupe protecteur approprié, à l'exception de la confusarine, pour la fabrication d'un médicament destiné à inhiber les réactions inflammatoires. Avantageusement Rl représente le radical méthoxy et R2 ou R3 représente le radical hydroxyle, encore plus avantageusement R1 représente le radical méthoxy, R2 représente le radical hydroxyle et R3 représente le radical méthoxy. Les dérivés de phénanthrène selon l'invention permettent avantageusement l'inhibition des réactions inflammatoires qui comportent une implication de la cascade arachidonique. Les dérivés de phénanthrène selon l'invention sont peu génotoxiques, ils peuvent donc effectivement être utilisés, chez l'homme ou l'animal, en tant qu'agents anti-inflammatoires. Au sens de la présente invention, on entend par groupement protecteur approprié de la fonction hydroxyle tout substituant capable de protéger le radical hydroxyle de toute réaction indésirable qui pourrait avoir lieu. Comme exemple de groupement protecteur approprié de la fonction hydroxyle, on peut notamment citer un éther de méthyle, par exemple le méthoxyméthyle ou le benzyloxyméthyle, un benzyle, un trityle, un éther d'éthyle substitué, par exemple le 2,2,2-tricholoéthyle, un éther silylé (SiMe3, SitBuMe2, SiC6H5Me2), un éther préparé par réaction entre le radical hydroxyle et un acide carboxylique (acétate, benzoate) ou un tétrahydropyrane. Les dérivés de phénanthrène de formule (I) peuvent être isolés à partir d'extraits de Tamier, notamment de Tamus communis. Ils sont avantageusement isolés à partir d'extraits de rhizomes de Tamier, notamment de rhizomes de Tamus communis. Les dérivés de phénanthrène de formule (I) peuvent également être obtenus par synthèse 25 organique. Les inventeurs ont également découvert que la confusarine pouvait être isolée à partir d'extraits de Tamier, notamment de Tamus communis, avantageusement à partir d'extraits de rhizomes, ou être obtenue par synthèse organique. Le médicament selon l'invention est avantageusement destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies inflammatoires, notamment des pathologies 30 articulaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde, des atteintes cutanéo-muqueuse de l'appareil intestinal, tel que la maladie de Crohn, de l'appareil circulatoire, du tissu conjonctif et du système nerveux central. Le médicament selon l'invention est plus particulièrement destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies inflammatoires cutanées telles que l'eczéma atopique, l'eczéma de contact, les dermatoses inflammatoires, les dermites irritatives, l'acné, le psoriasis, la sclérodermie, le pityriasis versicolor, le vieillissement cutané, la photo-immuno suppression, le vitiligo. Le médicament selon l'invention comprend entre 0,001 et 50% en poids, avantageusement 0,001 et 30% en poids, de dérivés de phénanthrène de formule (I) et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Le médicament peut également contenir les adjuvants habituels dans le domaine 10 pharmaceutique. Selon la présente invention, le médicament est formulé pour être administré par voie topique, orale, sous-cutanée, injectable, rectale et génitale. Le médicament est avantageusement formulé pour être administré par voie topique Lorsque le médicament est formulé pour être administré par voie topique, il peut se présenter sous la forme d'une solution ou d'une lotion à usage externe, d'une crème, de pommade, de lait, de lotion, de gel, d'onguent, de sérum, de pâte, de mousse, d'aérosol, d'un patch ou de stick. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales des composés et compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. La présente invention a également pour objet une méthode de traitement dermocosmétique des peaux, notamment des peaux grasses ou sèches, exposées ou non aux rayonnements ultraviolets, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur la peau une composition comprenant au moins un dérivé de phénanthrène de formule (I). La méthode de traitement dermo-cosmétique permet avantageusement le traitement des peaux sélectionnées parmi les peaux sensibles, irritées, intolérantes, à tendance allergique, âgées, présentant un trouble de la barrière cutanée, présentant des rougeurs cutanées, ou présentant un désordre ou un déséquilibre immunologique non pathologique lié au vieillissement intrinsèque, extrinsèque ou hormonal. La composition, utilisée dans la méthode de traitement dermo-cosmétique selon l'invention, comprend avantageusement entre 0,001 et 50% en poids de dérivés de phénanthrène de formule (I) et un excipient cosmétiquement acceptable. La composition peut également contenir les adjuvants habituels dans le domaine cosmétique. Selon la présente invention, la composition dermo-cosmétique est formulée pour être administrée par voie topique, orale, sous-cutanée, injectable, rectale et génitale. La composition dermo-cosmétique est avantageusement formulée pour être administrée par voie topique. Lorsque la composition dermo-cosmétique est formulée pour être administrée par voie topique, elle peut se présenter sous la forme d'une solution ou d'une lotion à usage externe, d'une crème, de pommade, de lait, de lotion, de gel, d'onguent, de sérum, de pâte, de mousse, d'aérosol, d'un patch ou de stick. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique, de préférence dermatologique, adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. La présente invention concerne aussi les dérivés particuliers de phénanthrènes de formules (VI) et (VII) : HO Ces dérivés (VI) et (VII) ont été isolés à partir d'extraits de rhizomes de Tamier, notamment de Tamus communis. Ils peuvent également être obtenus par synthèse organique. La présente invention concerne également un procédé de synthèse organique d'un composé de formule (I), y compris la confusarine, par déprotection d'un composé de formule (II) R'l MeO (II) dans laquelle R'1, R'2 et R'3 représentent, indépendamment les uns des autres, une 10 fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié ou un radical méthoxy, et R'4 représente un atome d'hydrogène ou une fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié. Le groupement protecteur approprié de la fonction hydroxyle est tel que défini précédemment. Selon une variante avantageuse de l'invention, la fonction hydroxyle est 15 protégée par un groupement benzyle. Selon une variante avantageuse de l'invention, le radical R' l représente le radical méthoxy et un radical R'2 ou R'3 représente une fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié. D'une manière encore plus avantageuse, R' I représente le radical méthoxy, R'2 représente une fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié et R'3 représente le radical méthoxy. Les conditions de l'étape de déprotection vont dépendre du groupement protecteur de la fonction hydroxyle employé. Ces conditions sont parfaitement connues de l'homme du métier. Par exemple, si la ou les fonction(s) hydroxyle est ou sont protégée(s) par un groupement benzyle, l'étape de déprotection pourra être une étape d'hydogénolyse en présence de palladium. Selon une variante avantageuse de l'invention, le composé de formule (I) obtenu suite à l'étape de déprotection est en outre purifié par toute méthode connue de l'homme du métier. Le composé de formule (II) est avantageusement obtenu par cyclisation radicalaire d'un stilbène de formule (III) R'3 MeO (III) dans laquelle R'1, R'2 R'3 et R'4 ont la même signification que pour la formule (II). Selon une variante avantageuse de l'invention, l'étape de cyclisation du stilbène de formule (III) est une cyclisation radicalaire. Cette cyclisation radicalaire est avantageusement réalisée en présence d'hydrure de tributylétain et d'AIBN (azobisisobutyronitrile). Le rendement molaire de cette étape de cyclisation est avantageusement supérieur à 40%. Le composé de formule (III) est obtenu par réaction de Wittig entre un composé de formule (IV) et un composé de formule (V) (V) Le bromure de phosphonium est engendré in situ à partir du bromure (IV) et de triphénylphosphine à une température d'environ 110 C pendant environ une heure dans le DMF. Après addition d'une solution d'aldéhyde (V) dans le DMF puis de MeOLi (préalablement préparé à partir de MeLi dans MeOH) et agitation du mélange réactionnel pendant environ 16 heures à environ 90 C, le dérivé stilbénique (III) est obtenu avec un rendement molaire supérieur à 50%, éventuellement sous la forme d'un mélange d'isomères. CHO Br La présente invention concerne enfin, en tant que produits intermédiaires, les dérivés de formule (III) MeO (III) dans laquelle R'1, R'2, R'3 et R'4 ont la même signification que pour la formule (II). Selon une variante avantageuse de l'invention, le radical R'1 représente le radical méthoxy et un radical R'2 ou R'3 représente une fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié. D'une manière encore plus avantageuse, le radical R'1 représente le radical méthoxy, R'2 représente une fonction hydroxyle protégée par un groupement protecteur approprié et R'3 représente le radical méthoxy. Dans les exemples suivants, qui sont donnés à titre illustratifs et qui, en conséquence, ne délimitent pas la portée de la présente invention, on utilise les abréviations suivantes pour désigner les dérivés phénanthrèniques testés: SR3 4: 3,7-dihydroxy-2,4,8triméthoxyphénanthrène SR4 6: 3,7-dibenzyloxy-2,4,8triméthoxyphénanthrène SR69: 4, 7-dihydroxy-2,3,8triméthoxydihydrophénanthrène SR82: 4, 7-dibenzyloxy-2, 3, 8triméthoxyphénanthrène SR216: 2, 7-dihydroxy-3,4,8triméthox:yphénanthrène (confusarine) SR23 7: 3 -hydroxy-2,4, 8triméthoxyph énanthrène SR223: 3-hydroxy-7-benzyloxy-2,4,8triméthoxyphénanthrène A34: 4,7-dihydroxy-2,4-diméthoxyphénanthrène Dans ces exemples, on utilise la nomenclature suivante: 1 I) Les lettres A, B et C correspondent au nom de chacun des cycles: on parlera par 25 exemple du cycle C. Les numéros correspondent à la numérotation généralement admise des atomes de carbone des dérivés phénanthrèniques (il existe d'autres nomenclatures dans lesquelles les atomes de carbone sont numérotés d'une autre manière). Ainsi le dérivé SR34 correspond au dérivé phénanthrènique de formule (I) 5 substitué par un radical hydroxyle sur les atomes de carbone numérotés 3 et 7 et par un radical méthoxy sur les atomes de carbone numérotés 2, 4 et 8. Les fractions issues de l'extrait de rhizome de Tamier sont obtenues de la manière suivante. L'extrait végétal est réalisé sur 250 g de rhizome de Tamier, Tamus communis, préalablement broyé, additionné d'acétate d'éthyle. Le tout est chauffé à reflux sous agitation. Le mélange est ensuite filtré sur Büchner. Le filtrat récupéré est évaporé à sec à l'évaporateur rotatif pour récupérer 2,5 g d'extrait sec. Dans les exemples qui suivent, l'extrait ainsi récupéré est appelé extrait total de Tamier ou extrait total de Tamus communis . Cet extrait contient de la 15 confusarine. A partir de l'extrait sont obtenues des fractions sur colonne de silice ouverte suivie d'une élution par des solvants de polarité croissante: CHC13/hexane 30/70: 16 fractions que l'on ne récupère pas; -CHC13/hexane 70/30: 9 fractions, les 2 premières sont rassemblées (fraction 20 A) et les 7 autres sont rassemblées (fraction B) ; - CHC13 pur: 12 fractions, les 2 premières sont rassemblées (fraction C), les 4èmes et Sèmes fractions sont rassemblées (fraction D). La fraction D est refractionnée sur colonne de silice et éluée au CHC13 pur, on obtient ainsi des cristaux de A34. Ces fractions comprennent les dérivés phénanthréniques suivants: -3,7dihydroxy-2,4,8-triméthoxyphénanthrène; - 7-hydrox y-2,3,4-trimétho x yphénanthrène; - 2, 7-dihydroxy-3,4, 8-triméthoxyphénanthrène; 8-hydroxy2, 3,4, 7-tétraméthoxyphénanthrène. Les exemples qui suivent illustrent l'invention et ne sont pas limitatifs. Exemple 1: activité anti-inflammatoire des dérivés phénanthrèniques (Traceur PG6KF1 a) Dans cet exemple, nous avons évalué l'activité de deux phénanthrènes SR 34 et 5 SR 46 comparativement à celle de l'extrait total de Tamus communis et une de ces fractions sur la production de PG6KF l a induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, le ionophore calcique A23187. Principe: mesure de la production de prostaglandine PG6KF1a produite par le kératinocyte humain après stimulation par i['ionophore calcique A23187 (voie de la 10 cylcooxygènase) au moyen d'un test Elisa. Le kératinocyte est la cellule la plus représentée au niveau de l'épiderme. En réponse à de nombreux facteurs extra-cellulaires présents dans son environnement, il libère divers médiateurs biologiquement actifs, notamment les prostaglandines et les leucotriènes qui jouent un rôle important dans l'initiation et la modulation des réactions inflammatoires cutanées et qui interviennent également dans la régulation de la réponse immune. Le kératinocyte est un bon modèle d'étude en pharmacologie cutanée, qui permet de déterminer, in vitro, les capacités de diverses molécules à moduler la production de ces médiateurs issus du métabolisme de l'acide arachidonique. Dans cet exemple, nous nous sommes intéressés en particulier à une prostaglandine, la PG6KF 1 a qui est un des métabolites majeurs produits par le kératinocyte stimulé, et représentatif de la modulation de la production des métabolites de l'acide arachidonique issus de la voie de la cyclo-oxygénase. Matériels et méthodes - Lignée cellulaire: kératinocytes humains HaCaT Plaques de culture 6 puits: 35 mm de diamètre xc Réactifs: -Milieu de culture RPMI (Roswell Park Memorial Institute, milieu de Moore; fournisseur GIBCO) - Tampon phosphate PBS pH 7,4 (Phosphate buffer saline: solution saline à pH 30 physiologique; fournisseur GIBCO) - Trypsine EDTA (fournisseur GIBCO) - Sérum de veau foetal (SVF; fournisseur GIBCO) Système EIA (Enzyme Immuno Assay; fournisseur EUROMEDEX) -Ionophore calcique A23187 (fournisseur SIGMA) xc Produits testés: - Phénanthrènes SR 34 et SR 46 (15 mg solubilisés respectivement dans 300 l d'éthanol et 300 pl d'acétate d'éthyle). - Extrait total de Taurus communis et la fraction B (10 mg solubilisés dans 200 gl de DMSO) xc Protocole: La suspension de kératinocytes dans:le RPMI 10% SVF est distribuée dans des plaques 6 puits (1xl06 cellules/puits), et incubée pendant 16 heures à 37 C dans une atmosphère à 5% de CO2. Les kératinocytes sont alors rincés avec du PBS pour éliminer les cellules non-adhérentes puis exposés aux:produits à tester inclus dans du RPMI sans SVF (qui pourrait interférer dans le dosage). Le SR 34 et le SR 46 sont solubilisés respectivement à une concentration de 50mg/ml d'éthanol et d'acétate d'éthyle puis sont repris dans du RPMI sans SVF. Les concentrations testées en culture sont de lgg/ml, 3gg/ml et 10gg/ml pour le SR 34 et de 1 lug/ml, 3 gg/ml, l 0gg/ml, 20gg/ml et 40gg/ml pour le SR 46. A ces concentrations non cytotoxiques, la concentration finale en éthanol est inférieure à 0,025% et celle en acétate d'éthyle inférieure à 0,1 %. L'extrait total de Tamus communis et une fraction (fraction B) sont solubilisés à une concentration de 50mg/ml de DMSO puis sont repris dans du RPMI sans SVF. La concentration testée en culture est de 30gg/ml. Les différentes concentrations ont été choisies après un test d'évaluation de cytotoxicité et ne sont pas cytotoxiques. Pour chaque lot, 3 puits sont réalisés. Les cellules sont pré-incubées pendant 60 mn avec les produits à tester puis un agent stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, le ionophore calcique, est ajouté pendant 5 heures: le ionophore calcique A23187 est utilisé à la concentration 2,5 M. Après ces 5 heures de culture, les milieux de culture de chacun des puits sont récupérés, centrifugés à 3000 tr/mn et conservés à - 80 C. La production de prostaglandine 6KF 1 a pour chacun des essais est mesurée par Kit Elisa (fournisseur EUROMEDEX). Principe du test Elisa: les dosages immunoenzymatiques permettent de doser les antigènes et les anticorps grâce à l'utilisation d'un marqueur, qui est une molécule dont la détection permet d'identifier ces éléments. Dans la méthode Elisa, ces marqueurs sont des enzymes. Le principe repose sur une compétition entre l'antigène qui est la PG6FK1a contenue dans les échantillons (analyte), et l'antigène conjugué à une enzyme (PG6FKla conjuguée à l'enzyme). Cette compétition s'effectue pour un nombre limité d'anticorps préalablement fixés à une microplaque sur laquelle sont réalisés les tests. L'anticorps se trouve en défaut par rapport à la quantité totale d'antigène (analyte et antigène conjugué). Lorsque la réaction a atteint son équilibre, les anticorps ont fixé analyte et antigène conjugué dans la proportion même où ils se trouvent dans le mélange réactionnel initial. Les substances non fixées sont éliminées par lavage. L'analyte est par définition en quantité variable: plus il est abondant, moins les anticorps fixent d'antigène conjugué et réciproquement. L'ajout d'un substrat chromogène va permettre le dosage des antigènes: en effet, au contact du conjugué, une réaction colorée s'effectue et la densité optique de chaque échantillon peut alors être mesurée au spectrophotomètre. Plus la réaction est colorée, plus il y a d'antigènes conjugués liés aux anticorps et moins l'échantillon analysé contient de PG6FK1a: dans ce cas là, le produit testé limite la synthèse de PG6FKIa et possède donc un pouvoir anti-inflammatoire. Réciproquement, moins la réaction est colorée, plus la quantité d'antigènes conjugués liés aux anticorps est faible et plus l'échantillon analysé contient de PG6FK1a: le produit testé n'inhibe pas la synthèse de PG6FK1 a et ne possède pas un bon pouvoir anti-inflammatoire. Résultats A titre comparatif, l'ensemble des résultats est donné dans le tableau 1. Ils sont exprimés en picogrammes de prostaglandine 6KF 1 a. pour 1 x 106 kératinocytes. L'analyse statistique des résultats est réalisée par une analyse de variance et par le test de Dunnett (*** significatif au seuil P Traitements pg/1 x 106 kératinocytes %activité/A23 187 Lots A23187 témoin - 334,17 +/- 38 - Témoin stimulé 2,5 M 1270,04 +/- 20,48 - SR34 1 gghnl 2, 5 M 955,57 +/- 77,20 -25% SR 34 3gg/ml 2,51M 518,72 +/- 55,53 -59% SR 34 10gg/m1 2,5 M 128,36 +/- 22,57 -90% SR 46 1 g/ml 2,5 M 1287,76 +/- 36,45 +1% SR 46 3 g/ml 2,5 M 1335,57 +/- 51,79 +5% SR 46 10 g/ml 2, 5 M 1309,86 +/- 77,16 +3% SR 46 20gg/ml 2,5 M 1298,89 +/-,64.63 +2% SR 46 40 g/ml 2, 5 M 1357,61 +/- 133,46 +7% Extrait total de 30 g/ml 2,5 M 300, 70 +/- 5, 96 -76% Tamier Fraction B 30 g/ml 2,5 M 103,75 +/- 45.75 -92% Tableau 1 Conclusion Les Phénanthrènes SR 34 et SR 46, l'extrait total de Tamus communis et sa fraction B ont été évalués, en terme d'activité antiinflammatoire, sur la libération de la 5 prostaglandine 6KFla par les kératinocytes. Chacun des produits a été testé à différentes concentrations. La production significative de PG6KFla induite par l'A23187 (1270pg/l x 106 cellules) se détache largement (+380%) de la production basale du témoin (334pg/1 x 106 cellules). => Le phénanthrène SR 34 montre une activité anti-inflammatoire significative pour les trois concentrations évaluées avec un pourcentage d'inhibition de la libération de PG6KFla a allant de 25% à 90%, cet effet est dose-dépendant. => Le phénanthrène SR 46 ne présente pas d'activité anti-inflammatoire en terme d'inhibition de libération de PG6KFla et cela quelles que soient les concentrations utilisées. Ce résultat permet de suggérer qu'au moins un groupement hydroxyle porté par une des deux cycles aromatiques axillaires (A et C) est nécessaire à l'activité anti-inflammatoire. => L'extrait total de Tamus communis présente une activité antiinflammatoire significative à la concentration de 30gg/ml avec un pourcentage d'inhibition de libération de PG6KF l a de 76%. => La fraction B de Tamus communis présente une activité antiinflammatoire 5 significative à la concentration de 30 g/ml avec un pourcentage d'inhibition de libération de PG6KF 1 a de 92%. Exemple 2: activité anti-inflammatoire des dérivés phénanthrèniques (Traceur PG6KF1 a) Dans cet exemple, nous avons évalué :l'activité de trois phénanthrènes SR 34, SR 69 et SR 82 sur la production de PG6KF la. induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, le ionophore calcique A23187. On procède de la même manièreque dans l'exemple 1, seuls changent les produits testés: Phénanthrènes SR 34, SR 69 et SR 82 (10rng solubilisés respectivement dans 50 l d'éthanol pour SR 34 et 50 l d'acétate d'éthyle pour les deux autres). Le SR34, le SR69 et le SR82 sont solubilisés à une concentration de 200mg/ml d'éthanol pour le SR34 et d'acétate d'éthyle pour les deux autres puis sont repris dans du RPMI sans SVF. Les concentrations testées sont de l g/ml, 3 g/ml et 10gg/ml. A ces concentrations non cytotoxiques, la concentration finale en éthanol est inférieure à 0,025% et celle en acétate d'éthyle inférieure à 0,1 %. Résultats A titre comparatif, l'ensemble des résultats est donné dans le tableau 2. Ils sont exprimés en picogrammes de prostaglandine 6KFla pour 1x106 kératinocytes. L'analyse statistique des résultats est réalisée par une analyse de variance et par le test de Dunnett (*** significatif au seuil P Traitements pg/1 x 106 kératinocytes %activité/A23187 Lots A23187 témoin 193,85 +/- 24,02 - Témoin stimulé 2,5 M 1020,08 +/- 14,32 - SR34 1 1g/ml 2,5 M 729,47 +/- 42,02 -20% SR 34 3 g/ml 2,5 M 403,88 +/- 32,69 -60% SR 34 10 g/ml 2,5 M 177,96 +/- 17,34 -82% SR 69 1 g/ml 2,5 M 724,49 + /- 56, 69 -29% SR 69 3 g/ml 2,5 M 697,51 +/- 29,36 -31% SR 69 10.xg/ml 2, 5 M 241,32 +/- 3,67 -76% SR 82 1 g/ml 2,5 M 1025,20 +/- 44,46 0% SR 82 3 g/ml 2,5 M 1010,10 +/- 20,96 -1% SR 82 10 g/m1 2,5 M 990,52 +/- 35,20 - 3% Tableau 2 Conclusion La production significative de PG6KFla induite par l'A23187 (1020pg/1 x 106 cellules) se détache largement (+525%) de la production basale du témoin 5 (194pg/1 x 106 cellules). => Les phénanthrènes SR 34 et SR 69 montrent une activité antiinflammatoire significative, pour les trois concentrations évaluées, sur la libération de PG6KF1a. tableau 3 Concentration 1 gghnl 3 g/m1 10 g/ml SR 34 (% activité) -28% -60% -82% SR69 (% activité) -29% -31% -76% Tableau 3 L'activité de SR 34 est parfaitement reproductible d'une expérimentation à l'autre. => Le phénanthrène SR 82 ne présente pas d'activité anti-inflammatoire en terme d'inhibition de libération de PG6KF1a. et cela quelles que soient les concentrations utilisées. Ce résultat permet de suggérer qu'au moins un groupement hydroxyle porté par une des deux cycles aromatiques axillaires (A et C) est nécessaire à l'activité anti-inflammatoire Exemple 3: activité anti-inflammatoire des dérivés phénanthrèniques (Traceur PG6KF 1 a) Dans cet exemple, nous avons évalué l'activité de sept phénanthrènes SR34, SR46, SR69, SR82, SR216, SR223 et SR237 sur la production de PG6KF1a induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, le ionophore calcique A23187. On procède de la même manière que dans les exemples 1 et 2. Les résultats obtenus pour les phénanthrènes testés sont donnés dans le tableau 4: Produit testé SR34 SR46 SR69 SR82 SR216 SR223 SR237 Quantité de - 60% -* - 31% - -39% -24% -72% PG6KFla produite Tableau 4 * - signifie que la molécule testée n'a pas d'action sur la production de PG6KF1 a Quantité de produit testé : 3 g/mL Les produits dont les fonctions hydroxyles sont protégées par des groupements benzyles (codés SR42 et SR82) ne montrent pas d'activité anti-inflammatoire, suggérant qu'au moins un groupement hydroxyle porté par un des deux cycles aromatiques axillaires (A et C) est nécessaire à l'activité antiinflammatoire. Le produit SR216, qui est la confusarine, présente également une activité anti-inflammatoire. Toutefois, cette activité est moins importante que celle du SR34 ou du SR237. Exemple 4: activité anti-inflammatoire des dérivés phénanthrèniques (Traceur PG6KF 1 a) Dans cet exemple, nous avons évalué l'activité d'extraits obtenus à partir du rhizome de Taurus communis sur la production de PG6KF1a induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, le ionophore calcique A23187 (2,5 M). On procède de la même manière que dans les exemples 1 à 3. Les résultats obtenus pour les fractions testées sont donnés dans le tableau 5 suivant: Fraction A Concentration 0,3 gg/ml 1 gg/ml 3 gg/ml 10 g/ml %activité -39% -53% -70% -74% Fraction B Concentration 0,3gg/ml 1 g/ml 3gg/ml 10 g/ml %activité -38% -40% -65% -81% Concentration 0,3 gg/ml 1 g/ml 3 gg/ml 10 g/m1 Fraction C %activité -51% -53% -62% -79% A34 Concentration 0,3 gg/ml 1 gg/ml 3 gg/ml 10 g/ml %activité +12% -10% -53% -61% Tableau 5 Les trois fractions et A34 présentent une activité anti-inflammatoire significative à la concentration de 10gg/ml. Exemple 5: Etude de l'activité génotoxique par le test de Micronucleus sur cellules de lymphome de souris L5178Y sur le produit SR237 et sur l'extrait total de Tamier 15 Le test du Micronucleus in vitro est un test qui permet de détecter simultanément le retard mitotique, l'apoptose, les cassures chromosomiques, la perte d'un ou plusieurs chromosomes et la nondisjonction. Les micronoyaux sont constitués de fragments de chromosomne(s) ou d'un 20 (ou plusieurs) chromosome(s) entier(s) n'ayant pas migré vers l'un des pôles à l'anaphase. Ils résultent soit de cassures chromosomiques, soit d'une altération de la structure et/ou du fonctionnement d'une partie de l'appareil mitotique, des chromosomes entiers étant susceptibles de ne pas migrer vers les pôles. Principe: Des cellules L5178Y en phase exponentielle de croissance sont traitées en microplaques de 96 puits avec différentes doses du produit à étudier sans activation métabolique. Après les périodes de traitement et de recouvrement, les cellules sont recueillies, fixées. étalées sur lames et colorées. Le nombre de micronoyaux pour 1000 cellules mononuc:léées est déterminé par lecture au microscope (x 500 à immersion). Un produit entraînant une augmentation statistiquement significative du nombre de micronoyaux par rapport au témoin négatif avec une relation dose/effet est conclu génotoxique dans ce test. Les cellules L5178Y sont des cellules d'un lymphome de souris. Il s'agit d'une lignée transformée continue. Méthode: Mise en culture des cellules: une ampoule conservée à -180 C contenant environ 3 à 4.106 cellules est décongelée. Les cellules L5178Y sont remises en suspension dans 40 ml de milieu de Fischer contenant 10% de sérum décomplementé de cheval (FM10) afin d'éliminer le liquide de congélation contenant 10% de DMSO. Après une centrifugation de 5 minutes à 900 tr/mn le surnageant est retiré et remplacé par 40 ml de FM10. Les cellules sont remises en suspension par aspiration-refoulement à l'aide d'une pipette de 10 ml à usage unique puis transvasées dans un flacon de culture de 80 cm'. Le flacon est vissé légèrement et incubé en étuve à 5% CC-Z à 37 C pendant 72 heures. On obtient alors une densité cellulaire de l'ordre de 7 à 9.105 cellules/ml. Les essais de genotoxicité sont réalisés en duplicate: traitement de 24 heures sans activation métabolique, suivi d'un temps de recouvrement de 20 heures. Préparation des produits La dose maximale est fixée à 2000 mg/ml en concentration finale. Produit soluble dans un solvant aqueux: une solution mère (SM) à 40 mg/ml est préparée puis la solution fille (SF) : 0,1 ml de SM + 0,9 ml de FM 10 = 4 mg/ml Produit soluble dans le DMSO: une solution mère (SM) à 200 mg/ml est préparée puis la solution fille (SF) : 0,025 ml de SM + 1, 225 ml de FM 10 =4 mg/ml. Les dilutions successives sont effectuées en microplaques (3 plaques sont utilisées) : 1. Distribution 200 gl de la solution-fille dans le premier puits de 2 rangées successives, 2. Distribution de 100 pl de FM10 dans tous les autres puits, 3. Prélèvement de 100 l du premier puits à l'aide d'une pipette multicanaux et dilutions de puits en puits par aspirationrefoulement, 4. Rejet de 1.00 l du dernier puits. Adjonction des cellules: des cellules L51 "78Y sont dénombrées à l'hématimètre de Mallassez. La suspension cellulaire est préparée dans du FM 10: 4. 106 cellules/ml. On distribue à la pipette multicanaux 100 gl de la suspension adéquate dans les plaques correspondantes. A la fin de la période de traitement, les plaques sont centrifugées 5 minutes à 900 tr/mn. Le milieu de traitement est retiré par retournement. Deux lavages consécutifs sont effectués par remise en suspension des cellules par ajout de 200 pi de FM10 dans tous les puits. Après le dernier lavage, 200 pi de FM10 sont à nouveau ajoutés, les cellules remises en suspension puis les plaques sont réincubées pour 20 heures. Récolte Après centrifugation, le mileu est éliminé et remplacé par le milieu de lavage (milieu FM10 + 0,1% d'acide pluronique), lui-même, après centrifugation, éliminé et remplacé par le milieu hypotonique (milieu FMO/2 + 0,1% d'acide pluronique). Après centrifugation, le surnageant est éliminé puis on ajoute un fixateur (mélange 3 volumes d'ethanol absolu + 1 volume d'acide acétique). Ensuite, après un temps d'attente, les cellules sont étalées sur lames numérotées. Coloration Après au moins 24 heures de séchage à l'air ambiant, les lames sont colorées 25 pendant 10 minutes dans une solution 2 % de Giemsa dans l'eau. Elles sont ensuite rincées à l'eau. Lecture Les doses retenues pour la détermination de la fréquence des cellules micronucléées, dans le cas d'un produit toxique, doivent induire une toxicité relative par rapport au témoin solvant autour de 50 % pour la concentration maximale, entre 50 et 25 % pour la dose intermédiaire et inférieur à 25 % pour la dose faible. La toxicité relative est calculée pour chaque dose par le rapport [Absorbance moyenne de la dose] / [Absorbance moyenne du témoin]. Les critères de détermination d'un micronoyau sont les suivants: É Intensité de coloration du micronoyau La lecture s'effectue sur 1000 cellules mononucléées ayant un cytoplasme bien préservé. Pour exclure les phénomènes d'apoptose ou de fragmentation d'ADN, les cellules mononucléées contenant plus de 5 micronoyaux ne sont pas comptabilisées. Interprétation des résultats Pour chacune des doses testées, une comparaison statistique des résultats est réalisée en utilisant le test du CHI 2. Un produit est classé comme étant génotoxique vis-à-vis des cellules de lymphome de souris L5178Y en culture s'il induit une augmentation statistiquement significative du nombre de micronuclei par rapport au témoin, si cette augmentation comporte au moins un doublement par rapport au témoin et s'il existe une relation dose-effet. Résultats Culture et traitement Cellules: L5178Y de lymphome de souris en culture à TO Durée du traitement: 24 h suivies de 20 h de recouvrement * extrait de Tamier Communis caractéristiques: extrait visqueux brun foncé Essai du micronucleus: doses étudiées: 60-30-15 g/ml solvant: DMSO témoin positif: Mitomycine C: 0,025 gg/ml Les résultats de l'étude de l'activité génotoxique par le test du micronucleus en 30 microméthode sur cellules de lymphome de souris L5178Y, lors de l'essai sans activation métabolique pour un traitement de 24 heures suivi de 20 heures de recouvrement, sont donnés dans le tableau 6 suivant. Produit Dose Pourcentage Nombre de Nombre total X2 * P * tg/m1 de survie micronoyaux pour de relative/ 1000 cellules micronoyaux témoin mononucléées par pour 2000 (MTT) lame cellules mononucléées Lecteur 1 Lecteur 2 Témoin solvant 0 100 3 2 5 Mitomycine C 0,025 95,29 46 35 81 68, 639 97,57 7 4 11 2,259 N.S. * test du chi-deux tableau 6 Conclusion L'extrait de Tamier Communis a provoqué une augmentation statistiquement significative du nombre de micronoyaux sur cellules L5178Y de lymphome de souris après te traitement de 24 heures en absence d'activation métabolique suivi d'une période de recouvrement à la concentration maximale analysable de 60 gg/ml avec 21 cellules micronucléées pour 2000 cellules mononucléées vs 5 pour le témoin solvant. Dans ces conditions, l'extrait de Tamier Communis présente donc une activité génotoxique significative vis-à-vis des cellules L5178Y de lymphome de souris après un traitement en absence d'activation métabolique suivi d'une période de 20 heures de recouvrement, au cours d'un essai de screening du test du micronucleus in vitro réalisé en microméthode et sans répétition. * SR237 caractéristiques: Poudre blanche peu dense Essai du micronucleus: doses étudiées: 31,25-15,63-7,81 g/ml solvant: DMSO témoin positif: Mitomycine C: 0,025 tg/ml Les résultats de l'étude de l'activité génotoxique par le test du micronucleus en microméthode sur cellules de lymphome de souris L5178Y, lors de l'essai sans activation métabolique pour un traitement de 24 heures suivi de 20 heures de recouvrement, sont donnés dans le tableau 7 suivant. Pourcentage Nombre de Nombre total micronoyaux pour de Dose de survie 1000 cellules micronoyaux Produit relative/ mononucléées par * P * g/ml témoin pour 2000 (MTT) lame cellules Lecteur Lecteur mononucléées 1 2 Témoin solvant 0 100 4 4 8 Mitomycine C 0,025 93,41 54 70 124 105,418 SR237 15,6 80,27 3 4 7 0,067 N.S. 3 93,41 1 4 3 2,279 N.S. * test du chi-deux tableau 7 Dans le tableau 8 suivant, les résultats correspondent aux données obtenues à partir de 13 essais indépendants lors de l'étude de l'activité génotoxique par le test du micronucleus in vitro sur cellules de lymphome de souris L5178Y (microméthode), sans activation métabolique pour un traitement de 24 heures suivi de 20 heures de recouvrement. Nombre total de micronoyaux pour 2000 cellules mononucléées Témoin solvant Mitomycine C 0,025 g/ml Moyenne 4,35 73,62 Ecart-type 1, 60 39, 65 Maximum 8 194 Minimum 3 37 Tableau 8 Conclusion Le SR237 n'a provoqué aucune augmentation statistiquement significative du nombre de micronoyaux sur cellules L5178Y de lymphome de souris après un traitement de 24 heures en absence d'activation métabolique suivi d'un temps de recouvrement de 20 heures. Dans ces conditions, le SR237 ne présente donc pas d'activité génotoxique vis-à-vis des cellules L5178Y de lymphome de souris en absence d'activation métabolique, au cours d'un essai de screening du test du micronucleus in vitro réalisé en microméthode et sans répétition. Dans les exemples qui suivent, les pourcentages sont exprimés en moles, sauf indications contraires. Exemple 6: synthèse de SR34 ou 3,7-dihydroxy-2,4,8-triméthoxyphénanthrène 10 (RN=118169-17-8) de formule Le 3,7-dihydroxy-2, 4,8triméthoxyphénanthrène est un produit qui, jusqu'alors, a été isolé de l'Orchidaceae Bulbophyllum reptans, de Cymbidium pendulum, de Glottis livida (Lindley) Schltr. (Orchidaceae), de Thumia alba et d'Eulophia muda. Ce phénanthrène a été synthétisé par cyclisation radicalaire d'un dérivé stilbénique bromé, suivie d'une hydrogénolyse des groupements benzyles. Le dérivé stilbénique a, quant à lui, été préparé par réaction de Wittig entre un benzaldéhyde et un bromure benzylique. 1) Synthèse du benzaldéhyde de formule: 1OMe Ce dérivé a été facilement préparé en deux étapes à partir du syringaldéhyde, commercial, par bromation (86%) suivie d'une benzylation (89%), soit un rendement global de 77%. 2) Synthèse du bromure benzylique de formule r OBn Le bromure est synthétisé en 4 étapes à partir du 2,3-dihydroxybenzaldéhyde, commercial, avec un bon rendement global de 65% : i) 0-méthylation régiosélective du 2,3-dihydroxybenzaldéhyde; ii) benzylation du groupement hydroxy restant; iii) réduction de l'aldéhyde par NaBH4; et iv) bromation de l'alcool primaire 3) Synthèse du dérivé stilbénique de formule: MeO OBn BnO OMe MeO Le dérivé stilbénique (Z) est préparé par réaction de Wittig entre le 10 phosphonium issu du bromure benzylique et du benzaldéhyde. Le bromure de phosphonium est engendré in situ à partir du bromure benzylique et de triphénylphosphine à 110 C pendant une heure dans le DMF. Après addition d'une solution de benzaldéhyde dans le DMF puis de MeOLi (préalablement préparé à partir de MeLi dans MeOH) et agitation du mélange réactionnel pendant 16 heures à 90 C, le dérivé stilbénique est obtenu avec un rendement variant de 67 à 76%, sous la forme d'un mélange d'isomères (de = 60-80%). Dans ces conditions, la réaction de Wittig est connue pour donner sélectivement le stilbène Z. 4) Synthèse du dérivé dibenzylé SR46 de formule: Me0 OBn Le dérivé dibenzylé SR46 est obtenu par cyclisation radicalaire intramoléculaire du dérivé stilbénique (Z) L'isomère rnajoritaire (Z) a été mis en réaction dans des conditions radicalaires en présence d'hydrure de tributylétain et d'AIBN dans du toluène dégazé et maintenu à reflux pendant environ 6 heures. Cette réaction de cyclisation nous a conduit au dibenzyloxyphénanthrène avec un rendement correct et reproductible (59-61%) dans des milieux relativement concentrés (0,08M). Cependant, le dérivé SR46 n'a jamais pu être obtenu pur mais toujours en mélange avec des traces de dérivé de AIBN (probablement [Me2(CN)C]2, S(Me) 1.5ppm), ceci malgré des purifications successives. L'hydrogénolyse des groupements benzyles a donc été menée sur le mélange dérivé SR46 / dimère pour conduire après 24 heures sous 20 bars de H2 au phénanthrènediol SR34 avec de bons rendements (68-74%). Le dérivé SR34 peut être obtenu pharmacologiquement pur après purification sur colonne de silice et trituration dans l'éther de pétrole. Une pression d'hydrogène importante doit être maintenue sur une longue période du fait de l'hydrogénolyse difficile du second groupement benzyle; le suivi CCM montre clairement la formation très rapide d'un dérivé mono-benzylé puis la disparition de ce dernier avec une cinétique beaucoup plus lente. Une double réaction de benzylation permet alors d'obtenir le benzyloxyphénanthrène SR46 avec 80% de rendement et un degré de pureté satisfaisant pour des tests pharmacologiques. Exemple 7: synthèse du 2,7-dihydroxy-3,4,8-triméthoxyphénanthrène (SR216) ou confusarine (RN108909-02-0) de formule MeO La Confusarine ou 2, 7dihydroxy-3,4,8-triméthoxyphénanthrène est un produit qui, jusqu'alors, a été isolé de l'Orchiacae Bulbophyllum reptans, de Eia confusa de 20 Bulbophyllum gymnopus, et de Catasetum barbatum. Ce phénanthrène a été synthétisé, selon une stratégie identique à celle utilisée pour SR34, c'est-à-dire par cyclisation radicalaire d'un dérivé stilbénique bromé suivie d'une hydrogénolyse des groupements benzyles. Le dérivé stilbénique a, quant à lui, été préparé par réaction de Wittig entre un benzaldéhyde et un bromure benzylique dont la synthèse a été décrite dans l'exemple précédent. La principale difficulté de cette nouvelle synthèse résidait dans la préparation de l'a-bromo benzaldéhyde. En effet, la dissymétrie de ce composé rendait nécessaire la mise en uvre et le développement de réactions de 0-méthylation et de bromation aromatique régiosélectives. 1) synthèse de l'a-bromo benzaldéhyde de formule: OBn MeO - ; . MeO CHO Br à partir de l'acide gallique. Une première étape d'acétylation du gallate de méthyle en présence de NEt3 conduit au 3,4,5-triacétoxybenzoate de méthyle avec 94% de rendement. L'utilisation de NEt3 à la place de la pyridine permet une augmentation de rendement significative et simplifie le traitement. Lorsque le dérivé triacétoxylé est chauffé à 50 C dans le DMF en présence de K2CO3 et de MeI, une réaction d'alkylation régiosélective a lieu pour aboutir au 3,5diacétoxy-4-méthoxybenzoate de méthyle avec 75% de rendement. L'hydrolyse basique du diacétate (K2CO3, MeOH-H20, T.A., 19h) conduit au dihydroxy ester de formule OH avec un excellent rendement. Ce benzoate de méthyle doit ensuite être réduit pour obtenir le benzaldéhyde correspondant. A ce stade de la synthèse, le dihydroxy benzaldéhyde doit être monobromé puis 15 les groupes OH doivent être différenciés par deux alkylations différentes (méthylation et benzylation) pour finalement obtenir le composé désiré. En raison de l'activation du cycle aromatique par les deux fonctions hydroxy, réussir à obtenir un dérivé monobromé a constitué la principale difficulté de la réaction de bromation. En effet, malgré la mise en oeuvre d'un seul équivalent de NBS et le suivi minutieux de la réaction, le dérivé monobromé a toujours été obtenu (de 42 à 53%) en mélange avec le dérivé dibromé (de 36 à 20%). Ces deux produits ont pu néanmoins être facilement séparés sur colonne chromatographique. 2) Synthèse du dérivé stilbénique de formule: MeO OMe MeO 2882357 28 Le dérivé stilbénique est obtenu par réaction de Wittig selon un mode opératoire identique à celui utilisé pour SR 34 (exemple 2) à partir de l'a-bromo benzaldéhyde et du bromure benzylique. Dans ce cas, la réaction est stéréospécifique puisque seul l'isomère Z a été isolé 5 et qu'aucune trace de l'isomère E n'a pu être détectée. 3) Synthèse du dérivé dibenzylé SR82 de formule: MeO OMe La cyclisation radicalaire a ensuite été menée pour conduire au phénanthrène SR82 dans des rendements reproductibles et équivalents à ceux obtenus pour la synthèse du SR 34. Cependant, dans ce cas, le problème de mélange avec des dérivés de AIBN n'a pas été rencontré et le dérivé SR82 a pu être obtenu pharmacologiquement pur par simple purification sur colonne chromatographique. Après hydrogénolyse des groupements benzyliques, on obtient la Confusarine avec 85% de rendement. Exemple 8: synthèse de 3-hydroxy-7-benzyloxy-2,4,8-triméthoxyphénanthrène (SR223) de formule Le phénanthrène SR223 est l'analogue mono benzylé en position 7 du SR 34. A l'instar de ce dernier, la méthodologie de synthèse via un stilbène a été retenue. Il nous a alors suffit de différencier les groupements protecteurs des deux fonctions hydroxy portées respectivement par les précurseurs du cycle A (benzaldéhyde) et du cycle C (bromure benzylique) du phénanthrène final. En raison de la rapidité de préparation de ce composé, notre choix s'est porté sur une protection du OH de l'a-bromo benzaldéhyde sous la forme d'un éther de para-méthoxybenzyle (OPMB). Le bromure benzylique reste, quant à lui, inchangé. En effet, contrairement au groupement benzyle, le groupe PMB peut être éliminé par hydrolyse acide. Après bromation du syringaldéhyde (86%), le phénol est mis en réaction en présence de chlorure de p-méthoxybenzyle, NaI et K2CO3 au reflux de l'acétone pour atteindre l'a-bromo benzaldéhyde avec un excellent rendement global (84%). Le stilbène est obtenu par réaction de Wittig entre le bromure de benzylique et l'a-bromo benzaldéhyde avec 70% de rendement sous la forme d'un mélange d'isomères Z/E = 85/15. L'isomère (Z) est ensuite placé dans les conditions de cyclisation radicalaire pour atteindre le phénanthrène di-protégé qui subit finalement une hydrolyse acide au reflux de l'acide acétique pour conduire au dérivé monohydroxylé SR223. Le rendement global s'élève à 13%. Exemple 9: synthèse de 3-hydroxy-2,4,8-trirnéthoxyphénanthrène (SR237) de formule MeO OH Le phénanthrène SR 237 ne possède pas de fonction hydroxy sur le cycle C. Par conséquent, sa synthèse implique la préparation d'un nouveau bromure benzylique 15 ortho-méthoxylé de formule: Br OMe Ce bromure benzylique ortho-méthoxylé a été préparé en 3 étapes à partir du salicylaldéhyde avec 86% de rendement global. Néanmoins, l'alcool benzylique précurseur du bromure ainsi que l'o-méthoxybenzaldéhyde sont commerciaux Le phénanthrène SR237 est finalement obtenu selon la séquence réactionnelle des exemples précédents (Wittig / cyclisation radicalaire / hydrogénolyse) avec un rendement global de 22% à partir de ce bromure benzylique ortho-méthoxylé. La réaction de Wittig conduit majoritairement à l'isomère cis mais avec un excès diastéréoisomérique moindre (50% au lieu de 70%). OMe MeO Revendications 1. Utilisation de dérivés de phénanthrène de formule (I) R3 R2 MeO (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un radical hydroxyle ou un radical méthoxy, R4 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxyle éventuellement protégé par un groupe protecteur approprié, à l'exception de la confusarine, pour la fabrication d'un médicament destiné à inhiber les réactions inflammatoires. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente le radical méthoxy et R2 ou R3 représente le radical hydroxyle. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R1 représente le radical méthoxy, R2 représente le radical hydroxyle et R3 représente le radical méthoxy. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le médicament est destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies inflammatoires, notamment des pathologies articulaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde, des atteintes cutanéo-muqueuse de l'appareil intestinal, tel que la maladie de Crohn, de l'appareil circulatoire, du tissu conjonctif et du système nerveux central. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le médicament est destiné au traitement et/ou à la prévention des pathologies inflammatoires cutanées telles que l'eczéma atopique, l'eczéma de contact, les dermatoses inflammatoires, les dermites irritatives, l'acné, le psoriasis, la sclérodermie, le pityriasis versicolor, le vieillissement cutané, la photo-immuno suppression, le vitiligo. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le médicament comprend entre 0,001 et 50% en poids de dérivés de phénanthrène de formule (I). 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le médicament est à application topique. 8. Méthode de traitement cosmétique des peaux, notamment des peaux grasses ou sèches, exposées ou non aux rayonnements ultraviolets, caractérisé en ce qu'elle consiste à appliquer sur la peau une composition comprenant au moins un dérivé de phénanthrène de formule (I). 9. Méthode de traitement cosmétique selon la revendication 8, caractérisé en ce que la composition comprend entre 0,001 et 50 % en poids de dérivés de phénanthrène de formule (I). 10. Dérivés de phénanthrènes de formules (VI) et (VII) : MeO OMe