Brevet FR2884829A1 — publié le 20061027

La présente invention concerne un nouveau procédé d'obtention d'un extrait bactérien biologiquement actif de sangsues médicinales, l'extrait obtenu, ainsi que son utilisation pour la préparation d'une composition pharmaceutique. L'utilisation de sangsues pour la préparation d'extraits biologiquement actifs est connue. On peut citer par exemple le document RU-2,129,428 qui décrit des extraits de sangsues ayant des propriétés psychosomatiques, et le document RU-1,552,420 décrivant les propriétés antithrombotiques, thrombolytiques, ou antiathérosclérotique de ces mêmes extraits. Des extraits d'homogénat de sangsues médicinales, obtenus notamment à partir de sécrétion de glandes salivaires, du sang ou du tube digestif de sangsues ont été préparés, et leur activité anti-stress et antioxydante décrite dans le document RU-2,153,325. Le brevet US-5,977, 056 décrit une méthode de traitement de la thrombose utilisant un extrait de glandes salivaires de sangsues, évelituellement en association avec des anticoagulants tels que l'hirudine. Enfin le document FR-2,603,188 décrit l'utilisation d'extraits de sangsues lyophilisés possédant une activité enzymatique à effet cosmétique. Plus récemment, la Demanderesse a mis en évidence que les propriétés pharmaceutiques et/ou cosmétiques des extraits de sangsues étaient dues en grande partie à une bactérie symbiote des sangsues: Aeromonas hydrophila (FR-2,834,292). Cette bactérie produit la plus grande partie, voire la totalité des substances actives obtenue de la salive des sangsues. Il était alors possible d'envisager l'administration de ces bactéries, et non plus des extraits de sangsues eux-mêmes, afin de diminuer voire de supprimer les phénomènes d'irritation et de réactions allergiques associés aux sangsues. Toutefois l'administration directe de telles bactéries à des individus hôtes peut présenter des effets toxiques. Ainsi, cette demande de brevet FR-2,834,292, divulgue une méthode d'obtention d'un extrait bactérien à partir de sangsues, ledit extrait possédant les propriétés recherchées et ne provoquant pas les effets indésirables connus. En outre, devant l'intérêt commercial de ces extraits bactériens et dans l'optique d'une production à l'échelle industrielle, l'amélioration de leur procédé d'obtention, plus particulièrement du rendement, ainsi que de leur efficacité, est d'une importance grandissante. La Demanderesse a ainsi mis au point un procédé nouveau qui permet, comme dans le cas de celui évoqué ci-dessus, de s'affranchir des sangsues, mais qui fourni un extrait bactérien beaucoup plus actif, car possédant une plus grande quantité d'enzyme, et ayant une efficacité accrue. De plus, il possède également l'avantage d'éviter le sacrifice de trop nombreux animaux pour obtenir ces extraits et au contraire, grâce à des cultures en fermenteurs de plusieurs centaines de litres, d'avoir des quantités très importantes d'extraits bactériens contenant les actifs et les enzymes nécessaires aux besoins de la pharmacie, de la cosmétologie ou de l'agro-alimentaire. La présente invention concerne ainsi un procédé d'obtention d'un extrait bactérien actif de sangsues comprenant les étapes suivantes: (a) culture de sangsues pendant une période d'au moins 2 mois sans nourriture, (b) prélèvement dans le tube digestif des sangsues de bactéries Aeromonas. (c) culture des bactéries Aeromonas hydrophila dans un milieu approprié, (d) séparation des bactéries et du milieu de culture, (e) lyse des cellules par sonication, (f) centrifugation, (g) récupération du surnageant, caractérisé en ce que les bactéries subissent au moins un choc thermique avant l'étape de sonication. Les sangsues utilisées sont typiquement des sangsues Hirudo medicinalis. La période de jeûne sera avantageusement de deux mois. Par choc thermique au sens de la présente invention, on entend une brusque variation de température. En particulier le ou les chocs thermiques selon l'invention sont réalisés par des abaissements de température importants réalisés pendant une durée comprise entre 12 et 24 heures. Les chocs thermiques selon l'invention seront en particulier des congélations à -80 C suivies ou séparées, dans le cas de plusieurs chocs thermiques successifs, par une ou des étapes de décongélation. Dans un autre aspect de l'invention, l'abaissement de température est obtenu par action d'azote liquide. Dans un autre aspect avantageux de l'invention, les bactéries subissent au moins deux chocs thermiques avant l'étape de sonication, chaque choc thermique étant suivi d'une étape de centrifugation, et d'une étape de récupération du surnageant. L'addition d'au moins une étape de choc thermique (congélation/décongélation) permet d'obtenir une meilleure libération des composants internes de Aeromonas hydrophila. La quantité des actifs enzymatiques est ainsi supérieure, et plus facile à extraire et à purifier. Le milieu de culture des bactéries peut être solide ou liquide. Dans un aspect de l'invention, le milieu de culture est donc solide, en particulier il peut être constitué d'un agar-extrait de boeuf. Dans ce cas, la séparation des bactéries du milieu, à l'issue de la première étape du procédé se fait par raclage doux du milieu solide, et lavage, par exemple à l'aide d'eau distillée. Dans un autre aspect de l'invention, le milieu de culture est liquide, en particulier il peut être constitué de bouillon de boeuf ou de tout autre milieu liquide classiquement utilisé pour les bactéries gram-, en particulier les milieux liquides commerciaux. Dans ce cas, la séparation des bactéries du milieu se fait par centrifugation, à une vitesse pouvant varier préférentiellement entre 5000 et 6000 tours par minutes. Dans une variante du procédé selon l'invention, on ajoute au stade de l'enrichissement, c'est-à-dire à l'étape (c), une faible quantité de sécrétions intestinales prélevées directement à partir de sangsues ou un extrait total de sangsues à jeun depuis au moins 2 mois. Les éventuels gènes ou plasmides de la bactérie sont alors stimulés. Dans le cadre d'une autre variante, lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sur des grands volumes (allant de 10 à 50 litres), on peut recueillir les colonies par grattage de milieu solide, en particulier des boîtes de Pétri, après 12 à 18 heures de pousse, et les mettre en suspension épaisse dans du bouillon de boeuf. Le bouillon est ensuite mis à l'étuve entre 28 et 30 C pendant 6 à 8 heures avant de subir une étape de centrifugation. Le culot de centrifugation est ensuite soumis à une lyse des cellules par sonication, puis la suite du procédé est identique à ce qui figure ci-dessus. La présente invention concerne également l'extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Dans un aspect particulier, cet extrait bactérien comprend au moins une substance choisie parmi la dopamine, la 5-hydroxytryptamine, l'acétylcholine, le GABA, la sérotonine, la substance P, les peptides vasoactifs, l'encéphaline, la somatostatine, la déstabilase, les inhibiteurs de kallikréine, les protéases neutres de granulocytes, la kininase, la cholestérolestérase, la bdeline, l'égline, les antioxydants, et la 6-cétoprostaglandine. L'extrait bactérien selon l'invention peut être incorporé avantageusement dans une composition pharmaceutique qui peut être administrée à un patient de manière orale ou parentérale. Par parentérale on entend notamment une administration sous cutanée, intraveineuse, intra- articulaire, une injection intra-trachéique, des techniques d'infusion. D'autres moyens d'administration tels qu'une administration topique peuvent être utilisés, l'extrait bactérien peut être utilisé comme ingrédient d'onguents ou de suppositoires. L'invention concerne donc aussi une composition pharmaceutique contenant une 30 extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila tel que défini ci-dessus, en combinaison avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon une réalisation, une composition pharmaceutique, incorporant l'extrait selon l'invention, comprend un véhicule qui est préférablement choisi de manière à ce que la formulation puisse être administrée en intraveineuse, telle qu'une solution saline stérile. Par exemple pour l'hirudine, la formulation intraveineuse comprend typiquement une quantité d'hirudine suffisante pour qu'après l'administration aux patients, la concentration dans le sang d'hirudine soit de l'ordre de 10 à 100 unités d'hirudine/ml. Le terme véhicule pharmaceutiquement acceptable est utilisé pour désigner un matériau non toxique, solide ou liquide diluant ou encapsulant, qui ne réagit pas sur le composé actif de manière négative pour son efficacité. On utilise par exemple des véhicules liquides appropriés tels qu'une solution aqueuse stérile, une solution saline, une solution aqueuse de dextrose, une solution de sucre, de l'éthanol, du glycol et des huiles. Des comprimés et capsules destinés à une administration orale peuvent contenir des excipients habituels tels que des agents liants, des agents lubrifiants, etc. Des préparations liquides orales peuvent être sous forme de suspension aqueuse ou huileuse, de solution, d'émulsion, de sirop, d'élixir ou analogue, ou peuvent être présentées sous forme d'un produit en poudre reconstituable en présence d'eau ou d'un autre transporteur approprié. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs habituels tels que des agents de suspension, des agents émulsifiants, des transporteurs non aqueux. L'application topique peut être sous forme d'une suspension aqueuse ou huileuse, d'une solution, d'une émulsion, d'un gel notamment. La dose unitaire d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut contenir une quantité appropriée d'extrait bactérien. Le dosage optimal pharmaceutiquement acceptable et la dose pour un patient donné (notamment l'homme) dépend de plusieurs facteurs notamment l'activité de l'individu, son âge, son poids corporel, son état de santé général, son état d'anxiété, l'objet du traitement, la maladie traitée. Par exemple, une dose systémique d'extrait bactérien de l'ordre de 0,01 à 100 mg/kg de poids corporel, de préférence 0,05 à 10 mg/kg, peut être utilisée. L'invention concerne aussi l'extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila tel que défini ci-dessus en tant que médicament. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila tel que défini précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique anti-coagulante, antiinflammatoire, antithrombolytique, immunostimulante, hypotensive, lipolytique, antihypoxie, et/ou contre l'oedème. Il a été largement démontré dans l'art antérieur, l'intérêt de pouvoir disposer de composés ayant les propriétés évoquées précédemment et pouvant être administrés par l'intermédiaire de support physiquement acceptable tel qu'une prothèse implantable, et en particulier un support stent. Les stents sont des endoprothèses, couramment utilisés en chirurgie cardiovasculaire pour être implantés dans un conduit vasculaire, notamment artère coronaire ou artère périphérique. Il est connu de traiter les maladies athéromateuses vasculaires, qui correspondent à des rétrécissements des artères, par des techniques de dilatation par ballonnet, techniques dénommées angioplasties. Le ballonnet est introduit dans l'artère, gonflé à une pression telle qu'il écrase le dépôt d'athéromes. Ces techniques n'étant toutefois pas toujours suffisantes, il est connu d'implanter dans le conduit vasculaire au niveau de la zone traitée par angioplastie, une endoprothèse plus communément appelée stent, typiquement support métallique agissant comme tuteur une fois qu'il est introduit à l'intérieur de l'artère au niveau de la zone traitée. De tels stents sont par exemple sertis sur le ballonnet, dans une position dite de repos, préalablement à l'introduction du ballonnet dans le conduit vasculaire. Une fois le stent acheminé jusqu'à la zone d'implantation à l'intérieur du conduit vasculaire, il est déployé par expansion du ballonnet de manière à être amené au contact de la paroi du conduit vasculaire à élargir. Il est d'autre part connu de couvrir des stents à l'aide de substances thérapeutiquement actives destinées à agir notamment dans la zone d'implantation La demanderesse a ainsi, par le passé, mis en évidence qu'il était possible d'isoler à partir de sangsues un complexe de destabilase comprenant de la destabilase associée à au moins un composé choisi parmi l'hirudine, la prostaglandine, et les inhibiteurs de kallikréine (FR-2,843,304). Dans le cadre de la présente invention, il est apparu que l'extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila obtenu selon le procédé exposé précédemment contient ce même complexe de destabilase. L'efficacité et l'activité améliorées de l'extrait bactérien permettent d'envisager sont utilisation pour recouvrir au moins une partie, ou encore la totalité, d'une prothèse médicale implantable. La présente invention concerne donc également une prothèse médicale implantable dans laquelle au moins une partie de la prothèse est couverte avec un habillage comprenant un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila tel que défini précédemment. La prothèse médicale peut plus particulièrement être un support stent, préférentiellement entièrement recouvert d'un habillage comprenant un extrait bactérien d'Aéromonas hydrophila selon l'invention L'extrait d'Aéromonas hydrophila selon la présente invention contient notamment les enzymes intervenant dans la prévention des maladies cardio-vasculaires ou des accidents vasculaires cérébraux. Cet extrait peut alors être utilisé sous forme de probiotique, en capsules, gélules, ampoules, ou ajouté à des produits alimentaires. Le mélange d'enzymes présent dans l'extrait bactérien intervient aussi efficacement contre la coagulation sanguine exagérée et son action sur les vaisseaux. Il trouvera donc également une utilisation chez les personnes hypertendues. Enfin, pour certaines des pathologies citées précédemment, l'extrait bactérien selon l'invention pourra être utilisé dans le domaine vétérinaire. Ainsi, dans un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un extrait bactérien d'Aéromonas hydrophila tel que défini précédemment en tant que supplément alimentaire, en particulier pour prévenir et/ou améliorer les conditions liées aux maladies cardiovasculaires. D'autres aspects et avantages de l'invention seront présentés dans la description détaillée des exemples qui suit, ainsi que dans la figure 1 qui illustre un exemple de procédé d'obtention d'un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon l'invention. Exemple 1: Obtention d'un extrait bactérien d'Aéromonas hydrophila. 5 Les sangsues sont lavées à l'aide d'eau stérile. A l'aide d'une seringue stérile on prélève des sangsues le sang intestinal dans le tube digestif, puis, toujours en condition stérile pour éviter des bactéries autres qu'Aéromonas, le prélèvement est distribué uniformément dans plusieurs boites de Pétri sur milieu agar-extrait de boeuf. Après incubation une journée à 28 C, les colonies développées dans les boites sont réensemencées sur support solide (variante n 1, agar-extrait de boeuf) ou sur support liquide (variante n 2, milieu de culture liquide). La culture en milieu liquide, avec croissance exponentielle des bactéries incubées pendant 24 heures à 28 C, s'accompagne d'une décroissance du pH du milieu jusqu'à 5-6. L'analyse microscopique montre des bactéries se développant, formant une structure en bâtonnets. On sépare ensuite les bactéries du milieu de culture par centrifugation à 5000-6000 tours/minute environ pendant 15 minutes à température ambiante. Pour la variante de culture sur milieu solide, les cellules se développent sur le milieu avec incubation à 28 C. Quelques millilitres de sécrétions intestinales de sangsues à jeun depuis 2 mois sont ajoutées. Les colonies de bactéries sont de petite taille (diamètre d'environ 2 m) d'un aspect brillant translucide de couleur jaune. Les couleurs et les tailles des colonies sont liées au fait que Aéromonas hydrophila peut se présenter sous des formes différentes: groupe 1 ou groupe 2. Les groupes se caractérisent par leur aspect (en particulier leur couleur) et leurs propriétés métaboliques. Les bactéries sont alors congelées à -80 C pendant 12 à 24 heures et ramenées à température ambiante. Ces deux étapes sont répétées une seconde fois. Les cellules sont lavées avec de l'eau distillée, puis lysées aux ultrasons de 22 à 30 kHz pendant 2-3 minutes. Les parois cellulaires insolubles dans l'eau sont séparées par centrifugation pendant 30 minutes à 17000-20000 rotations/minute à 4 C. Le précipité est lavé plusieurs fois avec de l'eau distillée. La culture sur milieu solide peut être effectuée jusqu'au moins 7 fois dans cette réalisation. Le surnageant final est récupéré puis lyophilisé. La figure 1 illustre les deux variantes du procédé selon l'invention: une variante sur support solide, et une variante en milieu liquide. Exemple 2: Détermination de l'activité antithrombique de l'extrait final. L'activité antithrombique de l'extrait selon l'invention est démontrée à l'aide de tests appropriés. Les inventeurs ont montré que l'activité antithrombique de l'extrait était due à la présence d'hirudine, révélée par la prolongation du temps de coagulation du fibrinogène par la thrombine. On peut par exemple utiliser le test-thrombine 30 IU/ml de Behringwerke décrit notamment dans le brevet US 5 563 041. En particulier le mélange comprend 0,1 ml d'une solution de fibrinogène à 0,3%, 0,1% d'une préparation d'extrait bactérien Aeromonas (ou une solution de NaCl à 0,9% pour le contrôle) incubée 1,5 minutes à 30 C, et 0,1 ml d'une solution de thrombine. On obtient par exemple des valeurs 5 - 78 ATU mg 1. L'activité anti-thrombine est démontrée pour les bactéries en culture sur support solide après les 7-8 premiers ré-ensemencements sur phase solide, et pour les cultures sur support liquide pour les premiers réensemencements. Exemple 3: Activité d'inhibiteur de la kallikréine du plasma sanguin Toutes les préparations obtenues issues du ré-ensemencement sur phase solide (plus de 8 fois) et sur phase liquide (3 fois), présentent une activité d'inhibiteur de kallikréine indépendamment de l'activité antithrombine de 1'hirudine. Cette détermination utilise un test du temps de recalcification du plasma sanguin. L'activité d'inhibiteur de kallikréine est déterminée en mesurant le temps de prolongation de recalcification du plasma sanguin: la prolongation de la durée d'une période par deux correspond à deux unités APC (unités antiprocoagulantes) de l'inhibiteur. Le mélange utilisé comprend 0,2 ml de plasma sanguin, 0,1 ml de la préparation d'extrait bactérien des sangsues (ou 0,9% NaCl pour le contrôle) incubée 1,5 minute à 37 C et 0,1 ml une solution 0,25 M Ca C12. On obtient par exemple des valeurs 50 - 250 APC mg-I Exemple 4: Toutes les préparations d'extrait bactérien inhibent l'activation de la phase de contact de la coagulation sanguine. Les résultats ont été effectués en utilisant du plasma sanguin activé par du sulfate dextrane en présence d'un substrat chromogénique S-2302 utilisé selon la méthode du "point final" : la réaction est stoppée 10 minutes après l'addition de substrat. A405: 0.2 - 0.95 Exemple 5: L'activité caséinase et BAME-estérase de l'extrait sanguin est pratiquement nulle. Par contre, l'activité destabilase est démontrée dans toutes les préparations d'extrait bactérien obtenu après re-ensemencement sur phase solide. Cette activité est démontrée à la fois pour les eaux flushing et pour les précipités de pulpe après la centrifugation des cellules bactériennes de sangsues. Résultat après 16 heures d'incubation à 37 C: 49 - 825 mm2/mg. Les cellules obtenues cultivées en phase liquide ne présentent pas d'activité destabilase. L'activité destabilase a été analysée sur des portions de fibrine stabilisée. Exemple 6: Une activité lipolytique non spécifique a été démontrée à la fois pour des cellules issues d'une culture sur support solide et une culture en milieu liquide. Les substrats utilisés sont notamment le paranitrophénylacétate, le glycerol-3-(I-C14)-trioléate et le cholestérol-(IC14)-oléate. Résultats avec les substrats utilisés suivants: le paranitrophénylacétate: 5 10-8 - 26 10-8 M mg-1 après 10 minutes d'incubation la glycérine-3-(I-C14)-thrioléate: 2 10-8 8.6 10-8 M mg -I après 60 minutes d'incubation la cholestérine-(I-C14)-oléate 18 10-8 42 10"8 M mg -1 après 60 minutes d'incubation. Exemple 7: L'extrait bactérien comprend en outre des substances analogues à la prostacycline, repérés à la fois sur phase liquide et sur phase solide (25 78 gg mg 1). Ce repérage a utilisé un test radioimmunologique à la 6-ceto-prostaglandine F1a. L'extrait bactérien comprend dix fois plus de prostaglandine que les sécrétions des glandes salivaires des sangsues médicinales. Le niveau de thromboformation est de 10 à 15 %, comparé à 80-95 % pour le contrôle. Le contenu de prostaglandine a été calculé à partir de la quantité de 6céto PGF1a en utilisant le jeu de réactifs [125I]-6-céto-prostaglandine Fia du système d'essai 15 Amersham. Revendications 1. Procédé d'obtention d'un extrait bactérien actif de sangsues comprenant les étapes suivantes: (a) culture de sangsues pendant une période d'au moins 2 mois sans nourriture, (b) prélèvement dans le tube digestif des sangsues de bactéries Aeromonas. (c) culture des bactéries Aeromonas hydrophila dans un milieu approprié, (d) séparation des bactéries et du milieu de culture, (e) lyse des cellules par sonication, (f) centrifugation, (g) récupération du surnageant, caractérisé en ce que les bactéries subissent au moins un choc thermique avant l'étape de sonication. 2. Procédé d'obtention selon la revendication 1 caractérisé en ce que les bactéries subissent au moins deux chocs thermiques avant l'étape de sonication, chaque choc thermique étant alors suivi d'une étape de centrifugation et d'une étape de récupération du surnageant. 3. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le ou les choc(s) thermique(s) sont réalisés par des abaissements de température à -80 C suivis ou séparés, dans le cas de plusieurs chocs thermiques, par une ou des étapes de décongélation. 4. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture est solide, et dans ce cas la séparation des bactéries se fait par raclage doux du milieu solide, puis lavage. 5. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le milieu de culture est liquide, et dans ce cas la séparation des bactéries se fait par centrifugation. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que à l'étape (c), on ajoute une faible quantité de sécrétions intestinales ou un extrait total de sangsues prélevé ou obtenu à partir de sangsues à jeun depuis au moins 2 mois. 7. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que les sangsues sont soumises à une période de jeûne de 2 mois. 8. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les sangsues sont des sangsues Hirudo medicinalis. 9. Extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8. 10. Extrait bactérien selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il contient au moins une substance choisie parmi la dopamine, la 5hydroxytryptamine, l'acétylcholine, le GABA, la sérotonine, la substance P, les peptides vasoactifs, l'encéphaline, la somatostatine, la destabilase, les inhibiteurs de kallikréine, les protéases neutres de granulocytes, la hyaluronidase, la kininase, la cholestérolestérase, la bdeline, l'égline, les antioxydants, et la 6-cétoprostaglandine. 11. Composition pharmaceutique contenant un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon la revendication 9 en combinaison avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 12. Extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon l'une des revendications 9 ou 10 en tant que médicament. 13. Utilisation d'un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon l'une des revendications 9 ou 10 pour la préparation d'une composition pharmaceutique anti- coagulante, anti-inflammatoire, anti-thrombolytique, immunostimulante, hypotensive, lipolytique, antihypoxie, et/ou contre l'oedème. 14. Utilisation d'un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon l'une des revendications 9 ou 10 en tant que supplément alimentaire pour prévenir et/ou améliorer les conditions liées aux maladies cardiovasculaires. 15. Prothèse médicale implantable dans laquelle au moins une partie de la prothèse est couverte avec un habillage comprenant un extrait bactérien d'Aeromonas hydrophila selon l'une des revendications 9 ou 10. 16. Prothèse médicale implantable selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un support stent.