Brevet FR2877014A1 — publié le 20060428

Systèmes d'expression de protéines recombinantes et leurs applications L'invention a pour objet la production de protéines recombinantes d'intérêt. Elle concerne plus particulièrement de nouveaux systèmes d'expression de telles protéines ainsi que leurs applications industrielles, notamment pharmaceutiques. Des systèmes de production traditionnelle utilisent la culture de cellules de mammifères, d'insectes, de micro-organismes et d'animaux transgéniques. Les coûts de production par ces systèmes sont élevés et ne permettent pas d'effectuer une production de protéine à l'échelle industrielle. La stratégie mise en place par les inventeurs s'appuie sur l'utilisation de vecteurs viraux d'expression via une bactérie pathogène pour la plante. L'invention a alors pour but de fournir un nouveau système d'expression transitoire pour la production de protéines d'intérêt, permettant notamment la réduction des coûts de production et une fabrication à grande échelle des protéines. Elle vise également un nouveau procédé de production de protéine à l'aide d'un tel système d'expression transitoire. L'invention vise en outre l'application du nouveau système d'expression à la production 25 notamment de protéines possédant des propriétés vaccinales, en particulier anti-Leishmania. Le système, selon l'invention, d'expression transitoire de protéines dans un végétal est caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur viral d'expression, comportant un promoteur constitutif et ubiquitaire en amont d'un gène d'intérêt, un gène rapporteur placé en aval du promoteur et un gène adapté pour l'expression des gènes eucaryotes. De manière préférée, ledit vecteur comprend en outre un gène suppresseur de silencing placé en aval dudit promoteur. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise la partie réplicative du virus de la panachure jaune du riz (RYMV, Rice Yellow Mottle Virus) en amont du gène d'intérêt, de préférence, combiné à un suppresseur de silencing. Le gène rapporteur est choisi parmi les gènes facilement détectable visuellement ou par fluorimétrie, tel que le gène GUS qui code pour la (3glucuronidase. Ce gène GUS est placé, dans une construction préférée, en aval du promoteur 35S du CaMV. Comme gènes suppresseurs de silencing appropriés pour la mise en oeuvre de l'invention, on citera P1, le suppresseur de silencing du virus de la panachure jaune du riz (RYMV, Rice Yellow Mottle Virus) qui a une action cellule non autonome(il va agir sur les cellules adjacentes à la cellule qui le synthétise) et p19 qui est le suppresseur de silencing du TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus) qui agit sur la cellule qui le synthétise et exerce donc une action cellule autonome. Le vecteur utilisé est notamment un plasmide commercial comme le pCambia 1305.1. Ces systèmes d'expression présentent de nombreux avantages. Notamment, ils permettent (i) de produire des protéines complexes dans un système eucaryote; (ii) d'identifier le niveau de production possible, l'activité biologique de la protéine et le coût de production; (iii) d'identifier le meilleur système de production (type de plantes, de tissus, systèmes transitoire ou constitutifs, promoteur constitutif ou inductible, et la combinaison de protéine/suppresseur la plus adapté) ; (iv) de travailler sur l'activité biologique de la protéine (mutagénése, délétion, modification post-traductionnelle, séquence d'adressage pour la localisation subcellulaire). Conformément à l'invention, le procédé de production de protéines recombinantes est caractérisé en ce qu'il comprend le transfert d'un vecteur tel que défini ci-dessus dans un système végétal via une bactérie pathogène et la détection de l'expression transitoire du vecteur. Avantageusement, les systèmes végétaux mis en oeuvre sont des plantes entières. En variante, il s'agit de suspensions cellulaires. Dans le cas de plantes entières, on utilise plus particulièrement des plantules. Des végétaux permettant d'obtenir des résultats satisfaisants comprennent Nicotonia 5 benthamiana, notamment Nicotonia benthamiana var.BY2, et Oryza sativa, notamment Oryza sativa var. 02428. Le transfert dans les systèmes végétaux est effectué par infiltration d'agrobactéries, comme Agrobacterium tumefaciens, ou par co-culture. Pour le transfert des vecteurs dans les suspensions cellulaires, on a recours à la co-culture de bactéries avec les suspensions cellulaires. La mise en évidence de l'expression transitoire est effectuée visuellement, notamment par un 15 test histochimique, ou quantitativement, en particulier par un test fluorimétrique. L'invention fournit ainsi les moyens de produire en grandes quantités des protéines d'intérêt industriel, notamment pharmaceutique. En particulier, les moyens de l'invention sont tout particulièrement appropriés pour produire des protéines à propriétés vaccinales, par exemple antileishmania. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 et 2, qui représentent respectivement: - les figures 1A et 1B, les résultats obtenus par test histochimique avec des suspensions cellulaires Oryza sativa var. 02428 (figure 1A) et dans les suspensions cellulaires de BY2 (figure 1B), et - la figure 2, l'activité enzymatique GUS en nm de substrat par minute par g de protéine en fonction du temps et des vecteurs d'expression, Exemple 1: Transfert transitoire des vecteurs d'expression dans la plante par la méthode d' agroinfiltration Des agrobactéries sont mises en culture à 28 C en présence des antibiotiques indispensables pour la sélection du vecteur et des bactéries. Après deux jours de culture, la densité optique des bactéries à 600nm est estimée à l'aide d'un spectrophotomètre. Les bactéries sont précipitées et remises en suspension dans une solution de MgCl2 afin d'obtenir une DO de 0,5. Cette solution est additionnée d'acétosyringone afin d'augmenter la virulence des agrobactéries. La solution est incubée à température ambiante de 3 à 24 h. Les agrobactéries sont inflitrées avec une seringue sans aiguille. Une simple pression exercée sur la feuille de la plante permet l'infiltration de la solution dans la feuille entière. Les plantes sont replacées en chambre de culture et des prélèvements sont effectués à différents temps après infiltration. Exemple 2: Transfert de vecteurs dans des suspensions cellulaires par la méthode de la co- culture Une culture liquide d 'Agrohacterium tumefaciens est incubée une nuit à 28 C. La culture de bactéries est étalée sur un milieu solide et incubée à 28 C. Après 2 jours, le tapis bactérien est remis en suspension dans un milieu liquide (milieu pour la culture des suspensions cellulaires de BY2 ou milieu de co-culture des Oryza sativa var. 02428). Ce milieu est additionné d'acétosyringone. La solution d'agrobactérie est incubée pendant plusieurs heures avec les suspensions cellulaires. Après lavage les suspensions cellulaires sont replacées en chambre de culture. Exemple 3: Mise en évidence de l'expression transitoire par test histochimique On place les morceaux de feuilles ou les suspensions cellulaires prélevées dans le substrat. Après un vide de 10min. pour faciliter la pénétration du substrat, le test est placé une nuit à 37 C. Une coloration bleue des feuilles ou des cellules apparaît lorsque le gène GUS est exprimé. On rapporte sur la figure 1 les résultats du test permettant la visualisation dans les suspensions cellulaires de Oryza saliva var. 02428 (figure 1A) et dans les suspensions cellulaires de BY2 (figure 1B). Les tests sur les plantes entières montrent qu'en infiltrant des agrobactéries contenant le gène rapporteur GUS, on observe une coloration bleue des feuilles révélatrice de l'expression du gène rapporteur. Une cinétique de l'expression enzymatique a été réalisée pour déterminer le temps d'apparition de l'expression protéique. Les résultats obtenus ont montrés qu'une coloration bleue des feuilles apparaît dès 24 h après l'infiltration. Exemple 4: Mise en évidence de l'expression transitoire par test fluorimétrique 10 Les feuilles ou cellules sont broyées. Les protéines sont extraites ensuite à l'aide d'un tampon d'extraction pour protéine (Na2 EDTA 0,5 m pH8, N-laurylsarcosine, Triton pur, NaHPO4, 50 mM, pH7) et centrifugé à 2 reprises. Le test fluorimétrique est appliqué au surnageant. Pour déterminer l'activité enzymatique du surnageant en fonction de la quantité de protéines, on procède à une quantification des protéines selon le test de Bradford.. A cet effet, le bleu de Coomassie est ajouté aux protéines. Après agitation et incubation 15 min à température ambiante, on mesure la densité optique à 595 nm. Une gamme étalon est établie avec différentes concentration en BSA (albumine de sérum bovin) pour faire correspondre la densité optique à 595 nm et la quantité de protéine. On obtient alors une concentration en.ig de protéines par l d'échantillons. Le test fluorimétrique est basé sur l'hydrolyse du substrat en un composé fluorescent à une longueur d'onde de 460 nm. Les échantillons sont additionnés aux substrats. Trois mesures de la DO sont effectuées à 460 nm toutes les 30 min. La différence de DO est calculée et rapportée par minute pour faire correspondre la densité optique à 460 nm et l'activité enzymatique, on réalise une gamme étalon avec différentes concentrations du produit issu de l'hydrolyse du substrat. On obtient une quantité de produit en moles par minute rapportée par g de protéine grâce à la quantification du test de Bradford. On obtient alors une activité enzymatique en pmoles de substrat par minute et par g de protéine. Une quantification de l'expression protéique par test fluorimétrique est réalisée. On observe un activité enzymatique qui augmente jusqu'à 3 jours après infiltration et qui diminue après 6 jours. Exemple 5: Utilisation d'un vecteur contenant en combinaison un gène rapporteur et des gènes suppresseurs de silencing Afin d'augmenter l'expression protéique, le vecteur contenant le gène rapporteur GUS a été combiné à des gènes suppresseurs de silencing, Pl, p19 ou Pl et p19. En réalisant une cinétique de l'activité enzymatique, on observe une expression 17 fois plus importantes en utilisant le suppresseur de silencing p19 comme le montre la figure 2. REVENDICATIONS 1/ Système d'expression transitoire de protéines recombinantes dans un végétal, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur viral d'expression, comportant un promoteur constitutif et ubiquitaire en amont d'un gène d'intérêt, un gène rapporteur placé en aval du promoteur et un gène adapté pour l'expression des gènes eucaryotes. 2/ Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit vecteur comprend en outre un gène suppresseur de silencing placé en aval dudit promoteur constitutif et ubiquitaire. 3/ Système selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la partie réplicative du virus de la panachure jaune du riz (RYMV, Rice Yellow Mottle Virus) en amont du gène d'intérêt. 4/ Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gène rapporteur est choisi parmi les gènes facilement détectable visuellement ou par fluorimétrie, tel que le gène GUS qui code pour la (3-glucuronidase. 5/ Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que le gène GUS est placé en aval du promoteur 35S du CaMV. 6/ Système selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le gène suppresseur de silencing est choisi parmi P1, gène suppresseur de silencing de RYMV, et p19, 25 suppresseur de silencing du TBSV. 7/ Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le vecteur utilisé est un plasmide comme pCambia 1035.1. 8/ Procédé de production de protéines recombinantes, caractérisé en ce qu'il comprend. le transfert d'un vecteur tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans un système végétal via une bactérie pathogène, et la détection de l'expression transitoire du vecteur. 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les systèmes végétaux mis en oeuvre sont des plantes entières. 10/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les systèmes végétaux mis en oeuvre sont des suspensions cellulaires. 11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le transfert dans les systèmes végétaux est effectué par infiltration d'agrobactéries ou par coculture. 12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que le transfert des vecteurs dans les suspensions cellulaires est effectué par co-culture de bactéries avec les suspensions cellulaires. 13/ Application d'un système d'expression transitoire de protéines recombinantes selon l'une quelconque de revendications 1 à 7, ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, pour la production de protéines d'intérêt industriel notamment pharmaceutique.