Brevet FR2875239A1 — publié le 20060317

PROCÉDÉ POUR L'ACCÉLÉRATION DES MUTATIONS SOMATIQUES ET SON APPLICATION EN PROTÉOMIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biologie, et plus spécialement le domaine de l'adaptation par mutation dirigée, spécifique au monde vivant. Elle concerne plus particulièrement l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro, ainsi que les applications que les perfectionnements d'une telle technique rendent désormais possibles. Dans une forme de réalisation particulière, l'invention concerne l'induction des mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Pour simplifier, il est fait référence dans la suite au lymphome de Burkitt BL2. Il faut cependant souligner que cela vise seulement à faciliter l'exposé de la technique concernée et du concept inventif revendiqué, sans pour autant limiter l'invention à cet égard. La lignée cellulaire du lymphome de Burkitt de type I BL2, présente les caractéristiques des cellules B centroblastiques. Cette lignée cellulaire est la plus proche contrepartie immortalisée des centroblastes des centres germinatifs. Son origine de centre germinatif a été confirmée par la présence de mutations somatiques dans les gènes VH d'immunoglobuline des lymphomes de Burkitt. L'homogénéité et la stabilité des cellules BL2 dans des cultures appropriées a été soulignée (Denépoux S. et al., Immunity, vol. 6, 35-46, 1997). Il a été proposé, en conformité avec le phénotype de centroblaste, de considérer que la BL2 résulte de la transformation d'un centroblaste de centre germinatif qui a subi plusieurs phases de mutations somatiques. On estime par ailleurs que les cellules B subissent une hypermutation au stade du centroblaste (Pascual V. et al., J. Exp. Merl. 180, 329-339 (1994). Le phénomène d'hypermutation des immunoglobulines a lieu dans les centres germinatifs, après stimulation d'une cellule B par un antigène Tdépendant. 2875239 2 En particulier, Denépoux S. et al., (op. cité) ont établi que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation après agrégation de leur récepteur de surface et co-culture avec une cellule T-auxiliaire ou amplificatrice, après une semaine de culture. Il a été conclu dans cet article que c'est par des activations répétées des cellules BL2 que l'on peut augmenter la fréquence de mutation. Egalement ces auteurs ont souligné que les mutations induites in vitro sur la BL2 n'affectent pas la région constante de l'IgM et ne font pas apparaître une sélection dirigée par un antigène. Egalement, Yélamos J. et al., Nature, vol. 376, pp. 225-229 (1995) ont relaté des expériences tendant à montrer que le fragment de gène V de l'immunoglobuline n'est pas indispensable pour une hypermutation et que la construction de substrats de mutation artificiels pourrait s'en trouver simplifiée. La lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, peut ainsi être utilisée comme outil de mutagenèse ciblée pour altérer un gène d'intérêt. Malgré ces développements de la technique antérieure, on ne disposait pas de moyens efficaces pour étudier ces phénomènes et pour en retirer des résultats pratiques, en particulier à des fins de diagnostic et/ ou de suivi, ainsi que de traitement des processus tumoraux, dans des conditions de praticité et de rapidité satisfaisantes. Il y avait donc un besoin pour des moyens permettant de réaliser des tests d'hypermutation somatique rapides et fiables. Il existait plus particulièrement un besoin pour des moyens permettant de disposer d'un modèle d'induction de mutations somatiques, applicable aux gènes V, mais également aux autres gènes susceptibles d'être impliqués dans un processus tumoral, notamment chez les humains, comme par exemple les gènes Bd-6 et Fas Ligand (FasL). La présente demanderesse a précédemment montré que la mutation des gènes d'immunoglobulines peut être induite par des signaux qui imitent le déclenchement des processus d'hypermutation des gènes d'immunoglobulines: stimulation par un anticorps anti-IgM, plus co-culture avec des cellules T auxiliaires, ou stimulation avec des anticorps anti-CD19 et anti-CD21 plus les anticorps anti-IgM biotinylés, qui peuvent ensuite être agrégés à l'aide de billes magnétiques couplées à la streptavidine. 2875239 3 Les présents inventeurs ont également montré antérieurement qu'il était possible d'effectuer la recombinaison homologue dans cette lignée, alors que la mise en oeuvre de cette technique est habituellement restreinte aux lignées de type ES ("embryonic stem cells") ou à la lignée issue d'un lymphome aviaire, la DT40. RÉSUMÉ DE L'INVENTION On a maintenant trouvé un procédé pour l'induction de mutations somatiques dans lequel on accélère les dites mutations, notamment dans la lignée BL2, dérivée d'un lymphome de Burkitt, en exprimant des ADNc exprimant eux-mêmes des versions modifiées du gène AID (l'abréviation AID désigne la "activation-induced cytidine déaminase" ou cytidine déaminase induite par activation). On a pour ce faire mis au point des gènes AID modifiés, spécialement adaptés, qui font également partie de la présente invention. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Fig. 1 représente la séquence codante nucléotidique naturelle de l'AID humaine et le peptide codé par ladite séquence. Fig. 2 est une représentation des proportions respectives de séquences VH de la lignée BL2 présentant un nombre donné de mutations, respectivement dans des cellules transfectées avec l'AID sauvage et dans des cellules transfectées avec l'AID mutant (SEQ ID NO.1 selon la présente invention). DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Le gène AID (voir Fig. 1) est responsable de l'initiation du processus d'hypermutation par déamination des cytidines du gène V des immunoglobulines en uraciles, ce qui conduit à une réparation ou une réplication erronée de ces bases anormales dans l'ADN. L'AID est une protéine essentiellement cytoplasmique, qui doit être ciblée dans le noyau d'une cellule pour y exercer son activité de déamination. Or, l'AID circule en permanence entre noyau et cytoplasme (voir, par exemple, S. Ito et al., PNAS, 17 février, 2004, vol. 101, No. 7, pp. 1975-1980), et sa localisation cytoplasmique résulte d'un export actif du 2875239 4 noyau, effectué par la protéine CRM1 (voir, par exemple, K.M. McBride et al., J. Exp. Med., vol. 199, No. 9, 3 mai 2004, pp. 1235-1244). Celle-ci reconnaît un site consensus, présent dans la protéine AID. On a alors maintenant trouvé que l'on peut interrompre cet export et obtenir une localisation essentiellement nucléaire de la protéine AID en effectuant une mutagenèse de trois acides aminés hydrophobes de ce site consensus de la protéine AID, à savoir 1eu189, phe193 et leu196, en alanine. On a ainsi trouvé expérimentalement que la mutagenèse observée au locus des immunoglobulines est augmentée de 5 à 10 fois, de façon constitutive, par rapport au taux de mutation que l'on obtiendrait toutes choses égales par ailleurs avec les techniques connues rappelées plus haut. On a également trouvé qu'une autre mutagenèse de l'AID est susceptible d'augmenter également son activité. Les présents inventeurs ont en effet observé que l'AID est une protéine instable, et qu'il est possible de réduire cette instabilité par mutation de la lysine160 en arginine, ce qui constitue une mutation conservative, supprimant un site de dégradation médiée par le protéasome. Cette mutation augmente également la mutagenèse au locus des immunoglobulines, probablement en augmentant la probabilité de rencontre avec l'ADN. La séquence codante nucléotidique de l'AID humaine portant l'une quelconque des mutations indiquées ci-dessus sur les positions appropriées est représentée, avec le peptide codé par ladite séquence, par une séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID NOs.1-3, à savoir: SEQ ID NO.1 pour les mutations des trois acides aminés 1eu189, phe193 et leu196 en alanine sur la séquence de l'AID, É SEQ ID NO.3 pour la mutation de la lysine160 en arginine sur la séquence de l'AID, et É SEQ ID NO.5 pour la mutation combinée des trois acides aminés 1eu189, phe193 et leu196 en alanine et de la lysine160 en arginine sur la séquence de l'AID. 2875239 5 Ces mutagenèses, qui peuvent être réalisées séparément ou simultanément sur le gène AID, s'effectuent selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où on a réalisé ces mutations selon l'invention cumulativement sur un même gène AID, on a constaté une augmentation proportionnellement encore plus élevée du taux des mutations induites dans la lignée BL2 par transfection de cellules avec un gène AID ainsi modifié, par comparaison avec la fréquence de mutation de cellules similaires transfectées avec l'AID sauvage. L'effet procuré par le procédé selon l'invention est attesté par les résultats d'expériences (effectuées de manière traditionnelle, conforme à la pratique connue de l'homme du métier) résumés dans les schémas des Figs 2A-B annexées. On a ainsi trouvé que les cellules de lymphome, notamment les cellules BL2, peuvent enclencher un processus d'hypermutation nettement accéléré sur leurs gènes d'immunoglobulines, contrairement aux données de la technique antérieure, selon lesquelles un processus comparable était long et fastidieux à mettre en oeuvre, ou nécessitant d'autres techniques pour atteindre une mutation quelque peu accélérée. Au surplus, le procédé selon l'invention procure une remarquable distribution du nombre des mutations obtenues (voir Fig. 2B). La fréquence de mutation (pour 100 paires de bases) s'est avérée être de 0,22 % pour des cellules transfectées avec le gène d'AID mutant selon l'invention avec seulement les 3 acides aminés 189, 193 et 196 remplacés par l'alanine (soit SEQ ID NO.1), contre seulement 0,05 % pour des cellules transfectées avec l'AID humaine sauvage selon la séquence représentée sur la Fig. 1. Plus précisément, on a maintenant trouvé de manière inattendue que, avec pour modèle la cellule BL2, on peut réaliser in vitro dans des conditions de rapidité et d'efficacité très exceptionnelles, l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées en transfectant les cellules à faire muter avec au moins un gène AID mutant tel que décrit plus haut et représenté par SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3 ou de préférence SEQ ID NO.5. L'invention a ainsi pour premier objet un procédé pour l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro ou ex vivo, comportant (1) 2875239 6 l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'au moins un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, tandis que ladite version modifiée du dit gène est choisie parmi un gène AID dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine dans chaque cas, et un gène AID dans lequel on a muté la lysine160 en arginine, et une combinaison des ces mutations. Selon une caractéristique, l'induction de mutations somatiques selon l'invention est mise en oeuvre sur une courte durée, en pratique sur une 10 durée de l'ordre de 1h30 (une heure et demie). Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention ne comporte pas la mise en oeuvre de co-cultures avec des cellules d'un autre type cellulaire, notamment avec une cellule T. Selon une caractéristique particulière, le procédé selon l'invention est 15 mis en oeuvre pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. L'invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé d'induction de mutations somatiques pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. Les modalités pratiques les plus appropriées pour l'utilisation du procédé d'accélération des mutations somatiques conformément à l'invention sont parfaitement connues de l'homme du métier, qui dispose à cet égard de moyens de routine et/ou d'essais pour l'ajustement des paramètres, en cas de besoin. Selon une forme de réalisation, cette utilisation est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée, le système selon l'invention est utilisé pour l'induction de mutations sur le lymphome 30 de Burkitt BL2 dans la phase GO/G1. Pour l'induction de mutations somatiques in vitro notamment sur la cellule BL2 conformément à l'invention, on procède en pratique par transfection de cellules, selon de techniques bien connues de l'homme du métier. 2875239 7 L'invention a également pour objet un kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques accélérées tel que défini plus haut. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ce kit pour 5 l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, notamment par l'analyse des protéines. Dans une forme de réalisation, l'utilisation du kit selon l'invention comporte l'identification des modifications post-traductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. Selon une caractéristique de mise en oeuvre préférée, cette utilisation comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur (enhancer) des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. Selon une forme de réalisation avantageuse, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation. L'homme du métier est ainsi apte à concevoir, sur la base des indications ci-dessus et de ses connaissances propres, sans sortir du cadre de la présente invention, des systèmes de test analogues ou équivalents et des utilisations concrètes différentes, apparentées ou non à celles qui sont décrites ici. B-580-FR REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'accélération de l'induction de mutations somatiques in vitro, caractérisé en ce qu'il comporte l'expression dans les cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'au moins un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, tandis que ladite version modifiée du dit gène est choisie parmi un gène AID dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes 1eu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine dans chaque cas, et un gène AID dans lequel on a muté la lysine160 en arginine, et une combinaison des ces mutations. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient une localisation essentiellement nucléaire de la protéine AID en effectuant une mutagenèse de trois acides aminés hydrophobes du site consensus de la protéine AID, à savoir 1eu189, phe193 et leu196, en alanine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une mutation de la lysine160 en arginine, ce qui constitue une mutation conservative supprimant un site de dégradation médiée par le protéasome. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites mutagenèses sont réalisées séparément ou de préférence simultanément sur le gène AID. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites mutagenèses sont réalisées simultanément sur le gène AID. 30 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour la réalisation in vitro de l'induction de mutations somatiques dans des cellules appropriées, on transfecte les cellules à faire muter avec au moins un gène AID mutant représenté par SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3 ou SEQ ID NO.5. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte (1) l'adjonction aux cellules à faire muter, dans des conditions de culture et dans un milieu appropriés aux dites cellules, d'au moins un ADNc exprimant une version modifiée du gène AID, tandis que ladite version modifiée du dit gène est choisie parmi un gène AID dans lequel on a remplacé les trois acides aminés hydrophobes leu189, phe193 et 1eu196 par mutation en alanine dans chaque cas, et un gène AID dans lequel on a muté la lysine160 en arginine, et une combinaison des ces mutations. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur une courte durée, en pratique sur une durée de l'ordre de 1h30. 9. Séquence codante nucléotidique de l'AID humaine mutée, caractérisée en ce qu'elle est représentée, avec le peptide codé par ladite séquence, par une séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID NOs.1, 3 et 5. 10. Utilisation des séquences SEQ ID NO. 1, 3 et 5 selon la revendication 9 pour l'induction in vitro de mutations somatiques dans des cellules appropriées, par transfection des cellules à faire muter avec au moins un gène AID mutant représenté par SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3 ou SEQ ID NO.5. 11. Utilisation du procédé d'induction selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la réalisation de tests in vitro d'hypermutagénicité au niveau protéique et/ou génique. 12. Utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'elle est appliquée aux lymphomes B, en particulier aux lymphomes B humains, plus particulièrement pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2. 2875239 10 13. Utilisation selon la revendication 12 pour l'induction de mutations sur le lymphome de Burkitt BL2 dans la phase G0/G1. 14. Kit pour l'induction de mutations somatiques, caractérisé en ce qu'il comporte un système inducteur de mutations somatiques accélérées comprenant au moins une séquence selon la revendication 9. 15. Kit selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est utile pour l'identification qualitative et/ou quantitative de composants du mutasome, notamment par l'analyse des protéines. 16. Utilisation du kit selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification des modifications posttraductionnelles induites, en particulier par identification, isolement et analyse d'un composant du mutasome, notamment d'un composant protéinique, qui apparaît pendant ladite induction. 17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comporte la fourniture d'au moins un gène, notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, sur lequel on souhaite induire des mutations, tandis que ledit gène est inclus dans une cassette contenant le promoteur et l'activateur des gènes codant pour la chaîne lourde ou légère des IgG, et que ledit gène est transfecté dans des cellules de lymphome, notamment de lymphome de Burkitt BL2. 18. Utilisation selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce que, pour faire muter une séquence quelconque, on encadre la séquence à faire muter par le promoteur et l'activateur des Ig, de préférence dans une cassette de mutation.