Brevet FR2884831A1 — publié le 20061027

L'invention concerne une méthode de criblage permettant la sélection d'inhibiteurs spécifiques de la protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP), efficaces et à courte durée d'action. 2] La MTP ("Microsomal Triglyceride Transfer Protein") est une protéine de transfert localisée dans le réticulum des hépatocytes et des entérocytes qui catalyse l'assemblage de biomolécules transporteurs de triglycérides, les lipoprotéines à apoB. 3] Par apoB, on désigne plus particulièrement l'apoprotéine B48 de l'intestin et l'apoprotéine B100 du foie, sans être toutefois limité à celles-ci. 4] Des mutations de la MTP ou des apoprotéines B se traduisent chez l'homme par des taux très faibles, voir une absence, de lipoprotéines à apoB. Les lipoprotéines contenant l'apoB (chylomicrons, "Very Low Density Lipoproteins" = VLDL) et leurs résidus métaboliques (chylomicrons remnants, "Low Density Lipoproteins" = LDL) sont reconnus comme un facteur de risque majeur dans le développement de l'athérosclérose, principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. 5] On observe que, chez des individus hétérozygotes pour ces mutations, des taux diminués en moyenne de moitié sont associés à un risque cardiovasculaire faible (C.J. Glueck, P.S. Gartside, M.J. Mellies, P.M. Steiner, Trans. Assoc. Am. Physicians, 90, 184, (1977)). 6] Ceci suggère que la modulation des sécrétions de lipoprotéines riches en triglycérides par l'intermédiaire d'antagonistes de MTP et/ou de sécrétion de l'apoB pourrait être utile dans le traitement de l'athérosclérose et plus largement des pathologies caractérisées par une élévation des lipoprotéines à apoB. 7] Des molécules inhibant la MTP et/ou la sécrétion d'apoB pourraient ainsi être utiles pour le traitement des hypertriglycéridémies, des 2884831 -2 hypercholestérolémies et des dyslipidémies associées au diabète, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 8] La littérature fournit déjà quelques exemples de composés susceptibles d'inhiber la MTP, mais l'on constate que depuis que des recherches sont effectuées sur ces inhibiteurs, aucun d'eux ne se trouve disponible sur le marché. En fait, de nombreux projets de développement ont été arrêtés dès les premiers essais cliniques. 9] En effet, des résultats préliminaires d'études cliniques supportent l'inhibition de la MTP comme moyen de diminuer le taux de triglycérides et de io cholestérol chez l'homme. Une telle thérapie nécessite cependant un traitement long, s'étendant sur plusieurs années. L'administration in vivo chez l'homme de composés inhibiteurs de la MTP sur de telles longues périodes pourrait engendrer des effets toxiques, comme par exemple, une accumulation de lipides dans l'intestin et dans le foie, entraînant par exemple des stéatoses hépatiques. 0] En d'autres termes, bien qu'un test de criblage primaire in vitro permette aujourd'hui d'identifier des candidats potentiels inhibiteurs de MTP, les tests de confirmation in vivo montrent que nombre de ces candidats sont responsables d'effets toxiques pour le foie. 1] Pour pallier ce problème, il est, par exemple, aujourd'hui proposé d'associer des inhibiteurs de MTP avec des fibrates. Ce type de thérapie présente cependant les inconvénients liées à l'administration de deux matières actives (problèmes de dosage, de compatibilité, etc.). 2] Il subsiste par conséquent un besoin de disposer de substances actives inhibitrices de la MTP n'induisant pas ou peu d'effets secondaires toxiques, en particulier de stéatose hépatique. 3] Ainsi, un premier objectif de l'invention consiste à réduire les taux de triglycérides et de cholestérol sanguins, sans induire d'accumulation de lipides dans le foie et dans l'intestin. 4] Un autre objectif de l'invention consiste à fournir un test de criblage 30 permettant de sélectionner des composés susceptibles de diminuer 2884831 -3 l'hypertriglycéridémie et la cholestérolémie avec un risque plus faible d'accumulation lipidique dans le foie. 5] D'autres objectifs encore apparaîtront dans la description de l'invention explicitée plus en détail ci-après. s [0016] La présente invention repose sur l'hypothèse que le foie secrète à nouveau l'excès de lipides accumulés, excès inhérent à l'activité inhibitrice du composé, dès lors que celui-ci n'est plus actif. 7] Les inventeurs ont maintenant découvert de manière surprenante que, étant donné qu'une certaine puissance est nécessaire pour obtenir un effet pharmacologique suffisant, seuls les principes actifs possédant une courte durée d'action et susceptibles de fournir un effet pharmacologique suffisant (effet "flash") génèrent moins d'effets toxiques, ou ne génèrent pas les effets toxiques observés avec les inhibiteurs à longue durée d'action. 8] En outre, l'utilisation chez l'homme impliquant un traitement chronique, il est nécessaire que cette phase de récupération par le foie ait lieu entre deux administrations afin d'éviter l'accumulation de lipides pouvant conduire au développement d'une stéatose. 9] Par conséquent, les inventeurs ont, pour la première fois, utilisé un test connu qualitatif de sélection de candidats inhibiteurs de la MTP, pour déterminer la cinétique d'action dudit candidat. 0] Ainsi, la présente invention propose tout d'abord une méthode de criblage pour la sélection de matières actives inhibitrices de la protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP), comprenant les étapes de: a) engagement d'un composé candidat dans un test de suivi cinétique d'inhibition d'un paramètre lié à l'inhibition de la MTP (inhibition de la sécrétion d'apoB, inhibition de la sécrétion des VLDL et autres) ; b) suivi de la cinétique d'inhibition dudit paramètre par ledit candidat depuis le départ du test et pendant une durée comprise entre 3 heures et 24 heures, de préférence entre 5 heures et 12 heures, de préférence encore entre 6 heures et 10 heures; et - 4 - c) sélection du candidat dans la cas où il présente une cinétique d'inhibition dudit paramètre caractérisée par: i) un pourcentage d'inhibition pour ledit paramètre supérieur ou égal à 50% pendant une durée maximale inférieure à 4 heures, de préférence inférieure à 3 heures; et ii) une activité inhibitrice rémanente pour ledit paramètre inférieure à 20%, de préférence inférieure à 10%, au-delà de 10 heures, de préférence au-delà de 8 heures, de préférence encore au-delà de 6 heures, après le début du test. io [0021] Dans la méthode de criblage de la présente invention, le test de suivi cinétique d'inhibition est identifié "Test A" dans la suite de la présente description. 2] Ainsi le Test A défini ci-dessus permet de sélectionner les composés possédant à la fois une activité inhibitrice de la MTP suffisante, et une absence d'activité inhibitrice rémanente qui pourrait entraîner des effets indésirables, tels que ceux mentionnés ci-dessus, et en particulier la stéatose hépatique. 3] Par "activité inhibitrice de la MTP suffisante", on entend que le pourcentage d'inhibition observé pour le paramètre lié à l'inhibition de la MTP (par exemple apoB ou VLDL) est au moins égal à 50%. 4] Par "activité inhibitrice rémanente", il doit être compris une activité inhibitrice observée pour le paramètre lié à l'inhibition de la MTP (par exemple apoB ou VLDL) inférieure à 20%, de préférence inférieure à 10%, de préférence encore, une activité inhibitrice non significative versus placebo. 5] Dans la suite du présent exposé, on qualifie de "réversibles" les composés à courte durée d'action, c'est-à-dire, ceux présentant l'effet "flash" recherché, et de "non réversibles", les composés à longue durée d'action. 6] Le Test A de la méthode de criblage selon la présente invention permet la sélection de candidats réversibles. 7] Ce Test A est un suivi cinétique d'inhibition d'un paramètre lié à l'inhibition de la MTP, par exemple un test d'inhibition de la sécrétion d'apoprotéine B (apoB), avantageusement lorsqu'il s'agit d'un test in vitro, à partir de tout type de cellules hépatiques ou entériques, de préférence hépatiques, telles 2884831 -5 que des cellules HepG2, ou encore d'un test d'analyse cinétique d'inhibition de la MTP sur la sécrétion de lipoprotéines de très basses densité ("Very Low Density Liporoteins" = VLDL), avantageusement lorsqu'il s'agit d'un test in vivo. Les exemples qui suivent présentent, à titre illustratif, des modes de réalisation s particuliers du Test A. [0028] Le Test A peut être conduit in vitro ou encore in vivo. Selon une variante préférée de l'invention, le Test A conduit in vitro (noté Av;tro dans la suite de la description) mesure la cinétique de la sécrétion d'apoB, et le Test A conduit in vivo (noté Av;vo dans la suite de la description) mesure la cinétique de la lo sécrétion des VLDL. 9] Dans le Test Av;tro, les composés candidats sont considérés de courte durée d'action lorsqu'ils présentent une réversibilité satisfaisante, c'est-à-dire lorsque la sécrétion d'apoB, 24 heures après le retrait du composé à tester, est revenue à un niveau dont la valeur est égale ou supérieure à 50%, avantageusement égale ou supérieure à 70%, par rapport à un témoin n'ayant, par définition, pas été traité par un composé inhibiteur. 0] Selon une variante préférée de la présente invention, le Test A est conduit in vitro, puis les candidats retenus sont engagés dans un ou plusieurs Tests A in vivo, afin de confirmer l'activité du candidat retenu à l'issue du Test A in vitro. 1] Le Test A est conduit in vitro sur des cellules en culture qui sont de préférence des cellules hépatiques, avantageusement des cellules HepG2. Le Test A est conduit in vivo sur un modèle animal approprié, par exemple rat. 2] En outre, le Test A défini plus haut peut être combiné à un ou plusieurs autres tests de pré- ou post-sélection, permettant un criblage plus rapide et/ou plus spécifique de sélection de candidats inhibiteurs de la MTP à courte durée d'action. 3] Ainsi, en plus du test de réversibilité d'action sur la MTP (Test A de cinétique défini supra), la méthode de criblage selon l'invention peut être suivie ou précédée d'un ou plusieurs tests qualitatifs d'inhibition de l'activité de la MTP, tel 2884831 -6 que, par exemple, celui décrit par Wetterau et Zilversmit (Biochem. Biophys. Acta, (1986), 875-610). 4] Ce test (dénommé Test B dans la suite) permet de réaliser une sélection qualitative des candidats au regard de leur capacité à inhiber ou non la s MTP in vitro. De par sa nature, ce test est avantageusement réalisé avant le Test A précédemment défini. 5] En outre, il peut s'avérer avantageux d'engager les produits candidats dans un test (dit Test C dans la suite de l'exposé) d'inhibition de la sécrétion d'apoB, par exemple dans la lignée humaine de cellules HepG2, permettant io d'analyser la capacité inhibitrice des candidats de la sécrétion d'apoB. 6] Le test C présente un intérêt, comme le test B, en particulier lorsqu'il est mis en oeuvre avant le test A, pour permettre un premier criblage de type "actif-inactif" des composés à tester. 7] Le test C est également connu et couramment utilisé dans le domaine. On pourra par exemple se référer à Dixon J. et Ginsberg H. (J. Lipid. Res. , (1993), 34, 167-179) pour la mise en oeuvre de ce test. 8] La méthode de criblage selon la présente invention permettant de sélectionner les composés possédant une réversibilité satisfaisante peut, selon un autre mode de réalisation, comprendre en outre un ou plusieurs tests visant à déterminer si les métabolites plasmatiques des composés testés sont actifs ou inactifs. 9] En effet, le problème que se propose de résoudre la présente invention consiste à sélectionner des inhibiteurs de la MTP possédant une activité inhibitrice satisfaisante mais de courte durée (effet "flash", inhibiteurs réversibles). Dès lors, il est avantageux de s'assurer que les métabolites plasmatiques des composés à sélectionner ou sélectionnés ne possèdent pas eux-mêmes une activité inhibitrice sur la même cible, à savoir une CI50 sur l'activité de la MTP supérieure à 1 NM, de préférence supérieure à 10 pM. 0] Ainsi le Test A peut également être précédé ou suivi, de préférence suivi, de un ou plusieurs tests d'inhibition de la MTP et/ou d'inhibition de la sécrétion des VLDL et/ou d'inhibition de la sécrétion d'apoB, similaires, voire 2884831 -7- identiques aux Tests B et/ou C, respectivement, définis plus haut, mais conduits cette fois-ci sur les métabolites plasmatiques des composés candidats. Ces tests sur les métabolites seront dénommés Test D (test métabolites/Inhibition MTP) et Test E (test métabolites/Inhibition apoB) dans la suite. 1] Par métabolites plasmatiques, on entend les produits de dégradation par l'organisme vivant des composés candidats. Ces métabolites sont obtenus selon toute méthode classique et connue de l'homme du métier, et par exemple par détermination structurale des produits de dégradation des composés candidats après incubation dans des cellules vivantes, de préférence dans des microsomes, puis re-synthèse des métabolites potentiels. 2] La méthode de criblage selon la présente invention peut être suivie d'un ou plusieurs tests de confirmation (post-sélection) d'activité in vivo. Avantageusement, la méthode de criblage selon l'invention comprendra en outre au moins un test de confirmation in vivo choisi parmi un test qualitatif d'inhibition de la sécrétion des VLDL, similaire aux tests B et C in vitro définis supra, et un test d'évaluation de la cinétique d'inhibition de la sécrétion des VLDL, similaire au test A in vitro défini supra. Ces deux tests de confirmation seront notés test F et test Avwo respectivement. 3] Enfin, les candidats ayant répondu positivement aux tests retenus parmi ceux définis précédemment, peuvent être soumis à un dernier test (Test H), in vivo, de détermination de l'effet pharmacologique recherché (diminution des triglycérides dans le sang). Ce Test H peut être de tout type connu et par exemple tel que présenté dans les exemples qui suivent. 4] L'ensemble des tests décrits ci-dessus et qui viennent compléter / confirmer le test A dans la méthode de criblage selon l'invention sont rassemblés dans le tableau suivant par ordre chronologique, ce qui constitue une variante préférée de la méthode de criblage selon l'invention, avec mention de la cible du test, à savoir modèle animal (en particulier le rat) pour les tests in vivo, cellules HepG2, protéines MTP ou tout autre type de cellules hépatiques pour les tests in vitro: Test ln vitro / in vivo Substrat Cible Description Pré-sélection B in vitro Candidat Protéines MTP Inhibition MTP/qualitatif C in vitro Candidat Cellules HepG2 Inhibition apoB/ qualitatif Sélection Avitro in vitro Candidat Cellules HepG2 Inhibition apoB/cinétique Tests sur les métabolites D in vitro Métabolites Protéines MTP Inhibition MTP/qualitatif E in vitro Métabolites Cellules HepG2 Inhibition apoB/ qualitatif Post-sélection -- Confirmation F in vivo Candidat - animal Inhibition VLDL/qualitatif Avivo in vivo Candidat -animal - Inhibition VLDL/cinétique H in vivo Candidat - animal - Effet pharmacologique recherché (diminution des triglycérides du sang) [0045] II est bien entendu que le Test A de cinétique peut être utilisé comme unique test, in vivo ou in vitro, pour la détermination de composés inhibiteurs de la MTP à courte durée d'action. On notera toutefois que si le Test Avitro est seul employé dans ladite méthode, il sera avantageusement suivi d'un Test Avivo d'analyse cinétique du pouvoir inhibiteur du composé candidat. 6] Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une méthode de criblage de composés inhibiteurs de la MTP comprenant la sélection de candidats au moyen d'un Test Avitro tel que défini précédemment, puis la Io sélection des candidats ayant répondu positivement au Test Avitro au moyen d'un Test Avivo. 7] Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de criblage de composés inhibiteurs de la MTP comprenant une présélection de candidats choisis parmi ceux ayant répondu positivement au Test B et/ou au Test C définis précédemment, sélection parmi les candidats issus de la présélection au moyen d'un Test Avitro tel que défini précédemment, puis sélection des candidats ayant répondu positivement au Test Avitro au moyen d'un Test Avivo. 2884831 -9 [0048] Selon encore un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode de criblage, comprenant les étapes de: a) engagement de composés candidats dans un Test B et/ou un Test C, puis présélection des candidats répondant positivement audit Test B et/ou s audit Test C; b) engagement des composés candidats issus de l'étape a) dans un Test A, avantageusement un Test Avitro et sélection des candidats répondant positivement audit Test A; c) sélection complémentaire éventuelle des composés candidats lo sélectionnés de l'étape b), par analyse des métabolites desdits candidats au moyen d'un Test D et/ou d'un Test E; d) engagement des composés candidats sélectionnés au cours des étapes a), b) et c) dans au moins un test de confirmation in vivo F et/ou A,,;,,o, puis sélection des candidats répondant positivement au Test F et/ou au Test A,,;,,o; et e) confirmation des candidats sélectionnés au cours de l'étape précédente, par sélection au moyen d'un Test H in vivo de contrôle de la diminution des triglycérides du sang. 9] La mise en oeuvre des différents tests décrits ci-dessus est de préférence exécutée dans l'ordre B et/ou C - Avitro D et/ou E F et/ou Avivo H, sans que cet ordre constitue une limitation quelconque de la présente invention. 0] La présente invention concerne aussi l'utilisation de la méthode de criblage selon l'invention comprenant au moins un Test Av;rro, un Test A,;,,, ou une combinaison de ceux-ci, tels que définis précédemment, pour déterminer la cinétique d'un paramètre lié à l'inhibition de la MTP par un composé candidat. Les conditions de réalisation de ces tests sont celles décrites au sein de la méthode de criblage. 1] De préférence, on utilise ce test pour déterminer si le composé candidat a une courte durée d'action (effet flash ) au sens de la présente invention, ou au contraire une longue durée d'action. 2] La présente invention concerne également un kit de criblage pour la sélection de matières actives inhibitrices de la protéine microsomale de transfert 2884831 - 10- des triglycérides (MTP) mettant en oeuvre la méthode de criblage telle que définie précédemment. 3] Le kit de criblage est par conséquent défini comme comprenant l'ensemble des moyens permettant la mise en oeuvre d'au moins un Test A, Test Ave) et/ou Test A,,;,,o, défini précédemment, et éventuellement un, plusieurs ou tous les tests B à H définis précédemment, dans un ordre quelconque. [0054] Les composés sélectionnés par la méthode de criblage selon l'invention, ou sélectionnés par utilisation du kit défini précédemment, présentent une application possible tout à fait intéressante dans le traitement des hypertriglycéridémies, des hypercholestérolémies et des dyslipidémies associées au syndrome métabolique et au diabète, des pancréatites, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 5] Ainsi, les inhibiteurs de MTP à courte durée d'action sélectionnés par la méthode de criblage selon la présente invention induisent une diminution significative de l'hypertriglycéridémie chez le rat Zucker obèse (fatty fa/fa), un modèle animal d'hypertriglycéridémie, sans aggravation du contenu en lipides du foie (stéatose) comme cela est observé a contrario avec un inhibiteur de MTP à longue durée d'action. 6] Selon un autre aspect, la présente invention concerne par conséquent également les composés sélectionnés par la méthode de criblage selon l'invention ou encore au moyen du kit selon la présente invention. Ils peuvent être utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les hypertriglycéridémies, les hypercholestérolémies et les dyslipidémies associées au syndrome métabolique et au diabète, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 7] À titre purement illustratif, les composés 1 et 2 décrits dans la demande de brevet FR 2 816 940 (& WO 02/42291) sont des composés inhibiteurs de la MTP à courte durée d'action. H H 1 2 8] La présente invention concerne également un procédé de préparation ou de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant une méthode de criblage selon l'invention, qui conduit à la sélection d'un composé d'intérêt pharmaceutique, et le mélange de ce composé avec un véhicule ou excipient acceptable du point de vue pharmaceutique. 9] L'invention est notamment relative à un tel procédé destiné à la so préparation ou fabrication d'un médicament destiné à traiter les dérèglements lipidiques, tels que les hypertriglycéridémies, les hypercholestérolémies et les dyslipidémies associées au syndrome métabolique et au diabète, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 0] Le procédé de préparation ou fabrication comprend de préférence la mise en oeuvre de la méthode de criblage selon l'invention, comprenant au moins un Test Avitro et/ou au moins un Test A,,;,,o définis précédemment, au(x)quel(s) il est possible d'adjoindre un ou plusieurs des tests complémentaires définis supra, à savoir un, plusieurs ou tous les Tests B à H définis précédemment, dans un ordre quelconque. 1] La présente invention concerne en outre les compositions pharmaceutiques ou médicaments susceptibles d'être obtenus par la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être décrit. 2] La présente invention concerne de manière plus générale les compositions pharmaceutiques comprenant une quantité pharmaceutique efficace 25 d'un composé sélectionné par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de 2884831 -12- criblage selon l'invention, en association avec un ou plusieurs véhicules ou excipients acceptables du point de vue pharmaceutique. 3] Ces compositions peuvent être administrées par voie orale, sous forme de comprimés, de gélules ou de granules à libération immédiate ou contrôlée, ou sous forme liquide, e. g. sirop, par voie intraveineuse sous forme de solution injectable, par voie transdermique, sous forme de dispositif transdermique adhésif, par voie locale, sous forme de solution, crème ou gel. 4] Une composition solide pour une administration orale, est préparée par addition au composé sélectionné par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de criblage selon l'invention, d'une charge et, le cas échant, d'un liant, d'un agent délitant, d'un lubrifiant, d'un colorant, ou d'un correcteur de goût, et par mise en forme du mélange en un comprimé, un comprimé enrobé, un granulé, une poudre ou une capsule. 5] Des exemples de charges englobent le lactose, l'amidon de maïs, le saccharose, le glucose, le sorbitol, la cellulose cristalline et le dioxyde de silicium, et des exemples de liants englobent le poly(alcool vinylique), le poly(éther vinylique), l'éthylcellulose, la méthylcellulose, l'acacia, la gomme adragante, la gélatine, le Shellac, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose, le citrate de calcium, la dextrine et la pectine. 6] Des exemples de lubrifiants englobent le stéarate de magnésium, le talc, le polyéthylène glycol, la silice, et les huiles végétales durcies. Le colorant peut être n'importe lequel de ceux autorisés pour une utilisation dans les médicaments. 7] Des exemples de correcteurs de goût comprennent le cacao en poudre, la menthe sous forme d'herbe, la poudre aromatique, la menthe sous forme d'huile, le bornéol et la cannelle en poudre. Il doit être compris que le comprimé ou le granulé peut être convenablement enrobé de sucre, de gélatine ou analogue. [0068] Une forme injectable contenant le composé sélectionné par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de criblage selon l'invention, en tant que principe actif est préparée, le cas échéant, par mélange du dit composé avec un régulateur de pH, un agent tampon, un agent de mise en suspension, un agent de 2884831 13 solubilisation, un stabilisant, un agent de tonicité et/ou un conservateur, et par transformation du mélange en une forme injectable par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, selon un procédé classique. Le cas échéant, la forme injectable obtenue peut être lyophilisée par un procédé classique. s [0069] Des exemples d'agents de mise en suspension comprennent la méthylcellulose, le polysorbate 80, l'hydroxyéthylcellulose, l'acacia, la gomme adragante en poudre, la carboxyméthylcellulose sodique et le monolaurate de sorbitane polyéthoxylé. 0] Des exemples d'agents de solubilisation englobent huile de ricin io solidifiée par du polyoxyéthylène, le polysorbate 80, la nicotinamide, le monolaurate de sorbitane polyéthoxylé et l'ester éthylique d'acide gras d'huile de ricin. 1] En outre, le stabilisant comprend le sulfite de sodium, le métasulfite de sodium et l'éther, tandis que le conservateur comprend le para-hydroxybenzoate de méthyle, le para-hydroxybenzoate d'éthyle, l'acide sorbique, le phénol, le crésol et le chlorocrésol. 2] Les doses et posologies efficaces d'administration des composés sélectionnés par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de criblage selon l'invention, destinés à la prévention ou au traitement d'une maladie, trouble ou état causé par ou associé à la modulation de l'activité de la MTP, dépend d'un grand nombre de facteurs, et par exemple de la nature de l'inhibiteur, de la taille du patient, du but du traitement recherché, de la nature de la pathologie à traiter, de la composition pharmaceutique spécifique utilisée et des observations et des conclusions du médecin traitant. 3] Par exemple, dans le cas d'une administration par voie orale, par exemple un comprimé ou une gélule, une posologie possible convenable des composés sélectionnés par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de criblage selon l'invention, se situe entre environ 0,1 mg/kg et environ 100 mg/kg de poids corporel par jour, de préférence entre environ 0,5 mg/kg et environ 50 mg/kg de poids corporel par jour, plus préférentiellement entre environ 1 mg/kg 2884831 -14- et environ 10 mg/kg de poids corporel par jour et de préférence encore entre environ 2 mg/kg et environ 5 mg/kg de poids corporel par jour de matière active. ] Si l'on considère des poids corporels représentatifs de 10 kg et 100 kg afin d'illustrer la gamme de posologie journalière par voie orale qui peut être utilisée et comme décrit ci-dessus, des posologies convenables des composés sélectionnés par la méthode de criblage de l'invention ou par le kit de criblage selon l'invention, seront comprises entre environ 1-10 mg et 1000-10 000 mg par jour, de préférence entre environ 5-50 mg et 500-5000 mg par jour, de préférence encore entre environ 10,0-100,0 mg et 100,0-1000,0 mg par jour, et plus préférentiellement entre environ 20, 0-200,0 mg et environ 50,0-500,0 mg par jour, de matière active comprenantun composé préféré. 5] Ces gammes de posologie représentent des quantités totales de matière active par jour pour un patient donné. Le nombre d'administration par jour auquel une dose est administrée dépendra peut varier dans de grandes proportions en fonction des facteurs pharmacocinétique et pharmacologique, tels que la demi-vie de la matière active, qui reflète son taux de catabolisme et de clairance, ainsi que les niveaux minima et optima dans le plasma sanguin et/ou dans d'autres fluides corporels de ladite matière active atteints chez le patient et qui sont requis pour une efficacité thérapeutique. 6] De nombreux autres facteurs doivent également être considérés pour décider du nombre d'administrations journalières et de la quantité de matière active qui doit être administré en une fois. Parmi ces autres facteurs, et non des moindres, on trouve la réponse individuelle du patient à traiter. 7] Les compositions pharmaceutiques telles qu'elles viennent d'être définies sont de préférence destinées à traiter les dérèglements lipidiques, tels que les hypertriglycéridémies, les hypercholestérolémies et les dyslipidémies associées au syndrome métabolique et au diabète, des pancréatites, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 8] La présente invention concerne aussi une méthode de traitement des dérèglements lipidiques, tels que les hypertriglycéridémies, les hypercholestérolémies et les dyslipidémies associées au syndrome métabolique et 2884831 15 au diabète, des pancréatites, mais aussi à la prévention et au traitement de l'obésité. 9] Cette méthode prévoit de traiter un patient par phases successives, chaque phase étant séparée de la précédente par une durée dite de récupération s suffisante pour permettre au foie d'éliminer les lipides accumulés lors du traitement pendant la phase précédente. Cette méthode utilise avantageusement une composition pharmaceutique ou médicament selon l'invention, caractérisé par une courte durée d'action au sens de l'invention. On voit tout l'avantage de disposer de composés à effet flash , permettant ainsi des périodes de io traitement répétées entrecoupées de périodes de récupération ou clairance, et d'adapter à volonté la densité du traitement en fonction de l'état du patient, de l'effet thérapeutique observé et de la tolérance. 0] Dans ces conditions, on peut traiter à l'aide d'une composition pharmaceutique contenant le composé 1 et/ou 2 précité. 1] L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel: - la Figure 1 est un graphe avec, en abscisse, le temps (min) après traitement de rats par le composé 1 précité et, en ordonnée, le % d'inhibition, illustrant la durée 20 d'action du composé 1 sur la sécrétion de VLDL-triglycérides; - la Figure 2 est un graphe avec, en abscisse, le temps (min) après traitement de rats par le composé 2 précité et, en ordonnée, le % d'inhibition, illustrant la durée d'action du composé 2 sur la sécrétion de VLDL- triglycérides. EXEMPLES TEST B Analyse qualitative de l'inhibition de l'activité de la MTP in vitro [0082] L'inhibition de l'activité de la protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP) a été testée en utilisant le protocole opératoire suivant. 2884831 16 [0083] L'inhibition de l'activité de la MTP par un composé peut être quantifiée par l'observation de l'inhibition du transfert d'un triglycéride marqué, d'une particule donneuse vers une particule acceptrice, en présence de MTP. La procédure de préparation de la MTP est basée sur la méthode de Wetterau et Zilversmit (Biochem. Biophys. Acta, (1986), 875-610). Quelques grammes de foie de hamster doré sont prélevés, puis rincés plusieurs fois dans une solution de saccharose à 250 mM à 0 C. Toutes les étapes suivantes se déroulent à +4 C. Un homogénat à 50% dans du saccharose 250 mM est préparé avec un broyeur en téflon, puis centrifugé 10 minutes à 10000 g à +4 C. Le surnageant est alors lo centrifugé à 105000 g pendant 75 minutes à +4 C. Le surnageant est éliminé et le culot microsomial est repris dans 3 mL (par g de foie de départ) de tris/HCI 150 mM pH 8,0. Des fractions aliquotes de 1 mL sont conservées à -80 C jusqu'à utilisation. 4] Après décongélation d'une fraction de microsomes (1 mL), 12 mL de tampons réfrigérés Tris/HCI 50 mM, KCI 50 mM, MgCl2 5 mM pH 7,4 et 1,2 mL de desoxycholate (0,54 % dans l'eau) sont ajoutés. Après 30 minutes d'incubation à +4 C sous légère agitation, la suspension est centrifugée à 105000 g pendant 75 minutes. Le surnageant contenant la MTP soluble est dialysé contre du tampon Tris/HCI 150 mM, NaCl 40 mM, EDTA 1 mM, azoture de sodium 0,02% pH 7,4 (5 fois un litre en 2-3 jours). La MTP est conservée à +4 C, stable au moins 30 jours et est utilisée telle quelle dans le test. 5] Les particules donneuses (liposomes) sont préparées à partir de 208 pL de L-phosphatidylcholine à 10 mg/mL dans le chloroforme et de 480 pL de [3H]-trioléine à 0,5 mCi/mL dans le toluène. Après agitation, la solution est évaporée sous azote, reprise par 6 mL de tampon Tris/HCI 50 mM, KCI 50 mM, MgCl2 5 mM pH 7,4 et mise à incuber au bain à ultrasons 30 minutes à température ambiante. Les liposomes sont conservés à +4 C et soniqués à nouveau 10 minutes avant chaque utilisation. 6] Les particules acceptrices sont des lipoprotéines de faible densité biotynylées (LDL-biot). Ces particules sont fournies par la société Amersham. 2884831 17 [0087] Le mélange réactionnel est réalisé en plaques blanches '/2 puits non traitées (Corning Costar) par l'addition, dans l'ordre, de: 5 pL de tampon HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1% (poids/volume), azoture de sodium 0,05% (poids/volume), pH 7,4; 5 pL de liposomes; 5 pL de LDL-biot; 5 pL dans le s DMSO de produits à tester; 5 pL de MTP. Après 18-24 heures d'incubation à 37 C, la réaction est arrêtée par l'ajout de 100 pL de billes Amersham SPA (Scintillation Proximity Assay) couplées à de la steptavidine et la radioactivité est comptée à l'aide d'un Top Count (Packard) au moins 1 heure après. L'inhibition du transfert des triglycérides par un composé se traduit par une diminution de la io radioactivité transférée. Le pourcentage d'inhibition pour un composé donné est déterminé par rapport à des contrôles qui ne contiennent pas de composés dans le mélange réactionnel. 8] Les résultats sont exprimés en termes de C150, à savoir la concentration permettant une inhibition à 50% de la MTP. Ces résultats sont résumés dans le 15 tableau I suivant, pour les composés 1 et 2 décrits supra. -- TABLEAU I -- Composé CI50 (nM) 1 320 2 65 TEST C Analyse qualitative de la sécrétion d'apo B dans la lignée humaine de cellules HepG2: [0089] L'activité d'un composé peut être évaluée en mesurant l'inhibition de la sécrétion d'apo B dans les cellules HepG2. 0] Les cellules HepG2 (ECACC numéro 85011430) sont utilisées comme modèle dans l'étude de la sécrétion hépatique in vitro de lipoprotéines, comme décrit par Dixon J. et Ginsberg H. (J. Lipid. Res., (1993), 34, 167179). 1] Les cellules HepG2 sont mises en culture dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant du sérum foetal de veau à 10% (DMEM et FBS 2884831 -18- Gibco) dans des plaques 96 puits en atmosphère de dioxyde de carbone 5% pendant 24 heures (confluence environ 70%). 2] Les composés à tester sont dissous à 2 ou 10 mM dans le diméthyl sulfoxyde (DMSO). Des dilutions en série (1:3,16) sont faites dans le DMSO et s sont ajoutées (1:200 Robot Multimek Beckman) dans le milieu de croissance (200 pL), puis finalement incubées pendant 24 heures dans les différents puits contenant les cellules HepG2. 3] Le surnageant de culture de 24 heures dilué au 1:5 (phosphate buffer saline: PBS contenant 1% de sérum albumine bovine) est testé selon une 10 méthode sandwich-ELISA spécifique de l'apo B humaine. 4] Les résultats, présentés dans le Tableau II suivant pour les composés 1 et 2, sont exprimés en termes de C150, à savoir la concentration assurant 50% d'inhibition de la sécrétion d'apoB dans les cellules HepG2. -- TABLEAU II -- Composé CI50 (nM) 1 18,0 2 3,1 TEST Avitro Analyse de la cinétique (réversibilité) de l'inhibition de la sécrétion d'apoB par les cellules HepG2: [0095] Les cellules HepG2 sont mises en contact avec les produits comme décrit dans le paragraphe précédent et la sécrétion d'ApoB est mesurée après 6 et 24 heures. La comparaison est effectuée à dose équipotente pour l'inhibition de la sécrétion d'apoB après 24 heures. 6] Ensuite, les produits sont retirés du milieu de culture (lors de changements de milieu à 0, 6, 24 et 48 heures) et la sécrétion d'Apo B est à nouveau mesurée pour déterminer la cinétique de retour à une sécrétion normale. La réversibilité est jugée satisfaisante lorsque la sécrétion, 24 heures après le 2884831 19 retrait des produits, présente une valeur supérieure ou égale à 70% de celle des contrôles (cellules témoin sans composé). 7] Ces résultats sont réunis dans le Tableau III ci-dessous pour les composés 1 et 2. -- TABLEAU III -- Composé Sécrétion d'apoB 24h après retrait des produits (% des contrôles) 1 >85% 2 85% TEST D Métabolisationlinactivation du produit io [0098] Les produits sont évalués pour leur capacité à être inactivés rapidement in vitro. Pour cela, les composés ayant montré une activité satisfaisante in vitro sont testés pour leur vitesse de métabolisation dans des microsomes de foie de rongeurs. Le milieu d'incubation est préparé en mélangeant les constituants suivants: NAD (1 mM), Glucose 6 phosphate (5 mM), NADP (1 mM) , Glucose 6 phosphate déshydrogénase (1 UI/mL), Albumine sérique de boeuf (1 mg/mL), TRIS (10 mM pH = 7,6), MgCl2 (5 mM). 9] Une concentration de 0,5 mg/mL de microsomes (Bioprédic) est mise en présence de 10 pM de produit à tester. Le mélange est incubé pour 1 heure à 37 C. Une fraction de la préparation est prélevée au temps initial à laquelle est ajouté un volume équivalent d'éthanol (arrêt de la réaction par précipitation des protéines). La même opération est renouvelée après 1 heure d'incubation. 0] Les échantillons obtenus sont centrifugés à 4000 rpm pendant 10 minutes et le surnageant est analysé par LC/MS/MS. Le pourcentage de disparition du produit parent entre TO et T60 minutes est déterminé par le calcul des surfaces des pics chromatographiques. 1] Les métabolites M1 et M2 (des composés 1, respectivement 2) potentiels sont identifiés, re-synthétisés et évalués pour leur activité d'inhibiteurs de MTP. Les composés 1 et 2 montrent (Tableau IV) une 2884831 -20- métabolisation/inactivation supérieure à 50% par heure en métabolites peu ou pas actifs (C150 > 1 pM). -- TABLEAU IV -- Com osé Métabolisation Activité des métabolites P (%/heure) 1 88 M1, M2 inactifs 2 95 M1, M2 inactifs TEST F Inhibition de la sécrétion de VLDL chez le rat: [0102] L'inhibition de la MTP hépatique par les composés 1 et 2 a été évaluée d'après l'impact de ceux-ci sur la sécrétion de lipoprotéines de très basse densité io ("Very Low Density Lipoproteins" = VLDL). Des rats Wistar mâles (220-280 g) reçoivent un régime standard et de l'eau ad libitum. Le jour de l'expérience, les animaux (n = 7) sont mis à jeun et, une heure plus tard, sont traités avec les composés (100 mg/kg per os; excipient methylcellulose 0,5%). La sécrétion de VLDL est mesurée une heure après traitement et ceci pendant 5 heures, par la technique du triton (WR 1339). Lorsqu'il est injecté dans le compartiment sanguin, le triton (400 mg/kg) permet d'empêcher le catabolisme des VLDL en inhibant leur lipolyse par la lipoprotéine lipase et en inhibant leur captation par les tissus. La mesure de l'accumulation de triglycérides (TG) et de cholestérol, composant des VLDL, permet alors de révéler la sécrétion de VLDL par le foie. 3] L'effet du produit sur la sécrétion de VLDL est donc évalué entre 1 heure et 6 heures après traitement à la dose de 100 mg/kg, soit entre 0 et 5 heures après l'injection intraveineuse du triton. Des prélèvements sanguins sont effectués sous anesthésie gazeuse à intervalles réguliers pour le dosage des triglycérides et du cholestérol. La sécrétion de VLDLtriglycérides et de VLDL- cholestérol est exprimée en mmol/L/h (valeurs moyennes). On a déterminé les niveaux d'inhibition par rapport à des contrôles non traités par les composés, et les résultats sont rassemblés dans le Tableau V. 2884831 -21- -- TABLEAU V -- Composé Inhibition de la sécrétion Inhibition de la sécrétion de VLDL-TG de VLDL-cholestérol 1 -56% -45% 2 -49% -46% TEST At/h/0 Détermination de la durée d'action d'inhibiteurs de MTP sur la 5 sécrétion de VLDL [0104] Ce test permet d'évaluer la cinétique d'inhibition de composés inhibiteurs de MTP sur la sécrétion de VLDL chez le rat Zucker fatty fa/fa (10-12 semaines), un modèle animal caractérisé par une hypersécrétion de VLDL. L'intensité et la durée d'inhibition sont mesurées par la technique du triton décrite io plus haut sur une période allant jusqu'à 8 heures après administration des produits. La durée d'action d'un produit dépendant à la fois de la dose administrée et de ses caractéristiques intrinsèques, celle-ci est déterminée à une dose permettant d'atteindre une inhibition maximale (Imax) d'au moins 50% sur un intervalle de temps significatif. La comparaison du profil de durée d'action de deux composés pouvant avoir des puissances différentes, est donc réalisée à des doses respectives permettant d'avoir des Imax similaires. Les composés 1 et 2 montrent une durée d'action inférieure à 8 heures avec une absence d'inhibition rémanente significative entre 6 et 8 heures après traitement. 5] Les courbes d'inhibition en fonction du temps des composés 1 et 2 sont représentés par les Figures 1 et 2 respectivement: TEST H Évaluation in vivo de l'effet antilipémique versus l'effet stéatogène d'inhibiteurs de MTP [0106] Pour caractériser la capacité stéatogène des inhibiteurs de MTP, un ratio entre l'effet pharmacologique recherché (diminution de la triglycéridémie, diminution de la fraction VLDL) et l'effet mécanistique potentiellement délétère 2884831 -22 (accumulation de triglycérides dans le foie) est déterminé après un traitement répété chez l'animal. Des rat Zucker fatty (fa/fa) de 10 semaines sont nourris avec un régime standard ad libitum et traités per os pendant 7 jours (n = 7-8) avec le composé 2 s (excipient méthylcellulose 0,5%). La comparaison entre des composés de différentes durée d'action s'effectue à doses équipotentes pour l'effet pharmacologique recherché, à savoir la diminution des triglycérides circulants, et porte sur le degré d'accumulation de triglycérides dans le foie par rapport aux animaux contrôles. Les résultats sont présentés dans le Tableau VI: -- TABLEAU VI -- Composés Triglycérides Variation/placebo Triglycérides Variation /placebo plasmatiques (% statistiques) hépatiques (% statistiques) (mM) (mg/g tissu) Placebo 4,29 0,13 - 54 10 - 2 1,40 0,06 -67%, p -23 REVENDICATIONS 1. Méthode de criblage pour la sélection de matières actives inhibitrices de la protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP), comprenant les étapes de: a) engagement d'un composé candidat dans un test de suivi cinétique d'un paramètre lié à l'inhibition de la MTP; b) suivi de la cinétique d'inhibition dudit paramètre par ledit candidat depuis le départ du test et pendant une durée comprise entre 3 heures et 24 heures, de préférence entre 5 heures et 12 heures, de préférence encore entre 6 heures et 10 heures; et c) sélection du candidat dans la cas où il présente une cinétique d'inhibition 15 dudit paramètre caractérisée par: i) un pourcentage d'inhibition pour ledit paramètre supérieur ou égal à 50% pendant une durée maximale inférieure à 4 heures, de préférence inférieure à 3 heures; et ii) une activité inhibitrice rémanente pour ledit paramètre inférieure à 20%, de préférence inférieure à 10%, au-delà de 10 heures, de préférence au-delà de 8 heures, de préférence encore au-delà de 6 heures, après le début du test. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est réalisée in vitro, ou in vivo, de préférence in vitro, de préférence encore in vitro, puis in vivo. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le paramètre lié à l'inhibition de la MTP est l'inhibition de la sécrétion d'apoprotéine B 30 (apoB), à partir de tout type de cellules hépatiques ou entériques, telles que des cellules HepG2, lorsqu'il s'agit d'un test in vitro, et l'inhibition de la MTP sur la 2884831 -24 sécrétion de lipoprotéines de très basses densité ("Very Low Density Liporoteins" = VLDL), lorsqu'il s'agit d'un test in vivo. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, s caractérisée en ce que le test de suivi cinétique est précédé ou suivi d'un test d'inhibition de l'activité de la MTP. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le test de suivi cinétique est précédé ou suivi d'un test lo d'inhibition de la sécrétion d'apoB. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs tests d'inhibition de la MTP et/ou d'inhibition de la sécrétion d'apoB, réalisés sur les métabolites des is composés candidats. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est réalisée in vitro et est suivie d'un ou plusieurs tests de confirmation d'activité in vivo. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un test de confirmation in vivo choisi parmi un test qualitatif d'inhibition de la sécrétion des VLDL, et un test d'évaluation de la cinétique d'inhibition de la sécrétion des VLDL. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes de: a) engagement de composés candidats dans un Test B et/ou un Test C, puis pré-sélection des candidats répondant positivement audit Test B et/ou audit Test C; p 2884831 b) engagement des composés candidats issus de l'étape a) dans un Test A, avantageusement un Test Avitro et sélection des candidats répondant positivement audit Test A; c) sélection complémentaire éventuelle des composés candidats 5 sélectionnés de l'étape b), par analyse des métabolites desdits candidats au moyen d'un Test D et/ou d'un Test E; d) engagement des composés candidats sélectionnés au cours des étapes a), b) et c) dans au moins un test de confirmation in vivo F et/ou Avivo, puis sélection des candidats répondant positivement au Test F et/ou au Test A,,;,,o; et Io e) confirmation des candidats sélectionnés au cours de l'étape précédente, par sélection au moyen d'un Test H in vivo de contrôle de la diminution des triglycérides du sang. 10. Utilisation de la méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins un Test Avitro, un Test Ai, ;,,o ou une combinaison de ceux-ci, pour déterminer la cinétique d'un paramètre lié à l'inhibition de la MTP par un composé candidat. 11. Kit de criblage pour la sélection de matières actives inhibitrices de la 20 protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP) mettant en oeuvre la méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.