Brevet FR2879604A1 — publié le 20060623

La présente Invention est relative à de nouveaux peptides citrullinés spécifiquement reconnus par des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde. La polyarthrite rhumatoïde (ci après abrégée en " PR ") est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. Il s'agit d'une maladie auto-immune, et le sérum des patients atteints contient des autoanticorps dont certains sont spécifiques, et peuvent constituer un marqueur de cette maladie, permettant son diagnostic même à des stades précoces. Des recherches ont donc été effectuées en vue d'identifier des antigènes reconnus par ces anticorps, afin d'en obtenir des préparations purifiées utilisables dans des techniques classiques de diagnostic immunologique. Il a été montré que des auto-anticorps spécifiques de la PR reconnaissaient différents variants isoélectriques de la (pro)filaggrine (pour revue, cf. par exemple SERRE et VINCENT, In: Autoantibodies, PETER and SHOENFELD Eds, Elsevier Science Publishers, 271-276, 1996). Ces autoanticorps ont pour cette raison été dénommés: auto-anticorps antifilaggrine (AAF) . La Demande EP 0 511 116 décrit la purification et la caractérisation d'antigènes de la famille des filaggrines reconnus par ces anticorps, et leur utilisation pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde. Ultérieurement, les épitopes de la filaggrine reconnus par les AAF ont été identifiés comme des régions de la molécule de filaggrine porteuses de résidus citrullyl, résultant de la transformation des résidus arginyl par une peptidylarginine désiminase (Girbal- Neuhauser E et al., J Immunol, 162, 585-94, 1999; Schellekens GA et al., J Clin Invest, 101, 273-81, 1998). L'analyse de divers peptides synthétiques dérivés de la séquence de la filaggrine humaine a montré que la désimination (citrullination) était nécessaire à la constitution des épitopes reconnus par les AAF, qui sont aujourd'hui également appelés auto-anticorps antiprotéines citrullinées (AAPC). Il a également été observé que l'environnement des résidus citrullyl jouait aussi un rôle important (Girbal-Neuhauser E, 1999, précité; Schellekens GA, 1998, précité; Union A et al., Arthritis Rheum, 46, 1185-95, 2002) ; certains acides aminés permissifs vis-à-vis de la fixation de l'anticorps et dont la nature module probablement l'affinité de fixation de l'anticorps ont été identifiés. Parmi ces acides aminés, les résidus -gly-, -ser-, - his-, -thr- et -gln-, sont les plus souvent retrouvés au niveau de l'environnement immédiat des résidus citrullyl des peptides "filaggrine" citrullinés qui, à ce jour, ont été identifiés comme porteurs d'épitopes reconnus par les AAPC (Sebbag M et al., Rev Rhum, 68, 106, 2001). De très nombreux peptides citrullinés spécifiquement reconnus par des AAPC, et utilisables pour le diagnostic de la PR ont été obtenus à partir de la filaggrine. Cependant, il a également été observé que bien qu'étroitement spécifique de la PR, la réactivité de ces différents peptides citrullinés vis-à-vis des AAPC était hétérogène, des peptides différents étant reconnus par des sérums issus de sujets différents. Ceci implique que pour obtenir un réactif de diagnostic capable d'identifier la présence d'AAPC dans une large population, il est nécessaire d'associer plusieurs peptides différents. Parallèlement, il a été montré que les AAPC sont sécrétés par les plasmocytes du tissu synovial (Masson-Bessière C et al., Clin Exp Immunol, 119, 544-52, 2000) et sont spécifiquement dirigés contre des formes citrullinées des chaînes a et R de fibrine présentes dans ce tissu (Masson-Bessière C et al. , J Immunol, 166, 4177-84, 2001). Les Inventeurs ont entrepris, dans le but de mieux caractériser les épitopes reconnus par les AAPC, d'identifier ceux présentés par les chaînes a et 0 de la fibrine. Dans ce but, ils ont évalué la réactivité de sérums contenant des AAPC vis-à-vis de peptides synthétiques citrullinés dérivés de la séquence de la chaîne a et de la séquence de la chaîne R de la fibrine. Compte tenu de l'hétérogénéité connue des profils réactionnels des peptides citrullinés issus de la filaggrine avec les AAPC, les Inventeurs ont utilisé des mélanges de sérums choisis de manière à contenir des AAPC représentant les différents profils de réactivité observés dans le cas de ces peptides issus de la filaggrine, afin de détecter tous les peptides de la fibrine pouvant être reconnus par des AAPC. Les peptides testés ont été obtenus à partir de la séquence de la chaîne a et de la séquence de la chaîne (3 de la fibrine. Au total, 71 peptides, dont 40 dérivés de la chaîne a de la fibrine et 31 dérivés de sa chaîne R ont été choisis. Parmi les 71 peptides citrullinés analysés, les Inventeurs ont identifié 12 peptides dérivés de la séquence de la chaîne a et 5 peptides dérivés de celle de la chaîne a de la fibrine comme réagissant significativement avec l'un et/ou l'autre des mélanges de sérums testés, et donc comme étant porteurs d'épitopes reconnus par certains des AAPC présents dans ce(s) mélange(s). Les Inventeurs ont ensuite analysé individuellement chacun des 17 peptides réactifs identifiés avec chacun des sérums constitutifs des mélanges testés. Cette analyse a confirmé, pour la majeure partie des peptides testés, la large variabilité interindividuelle de spécificité des AAPC précédemment observée dans le cas des peptides citrullinés dérivés de la filaggrine. D'autre part, elle a permis aux Inventeurs d'identifier des peptides qui, de manière inattendue, possédent un spectre de réactivité avec les AAPC beaucoup plus large que ceux rapportés jusqu'à présent dans le cas des peptides citrullinés dérivés de la filaggrine. En effet, les Inventeurs ont identifié 4 peptides citrullinés (3 peptides dérivés de la chaîne a et 1 dérivé de la chaîne (3 de la fibrine), qui sont chacun reconnus individuellement par au moins 40% des sérums analysés, et apparaissent donc porteurs d'épitopes majeurs. Parmi ces peptides, deux sont reconnus par la majorité des sérums, et présentent en outre des profils de réactivité complémentaires englobant la totalité des sérums analysés. Chacun de ces sérums reconnaît en effet l'un et/ou l'autre de ces peptides. Ceci suggère que ces deux peptides sont porteurs de motifs structuraux représentatifs d'une très large majorité des différents motifs reconnus par les AAPC. La présente invention a pour objet un peptide isolé reconnu par des auto-anticorps anti-protéines citrullinées (AAPC) présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un résidu citrullyl, et en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par: a) un peptide défini par la séquence X1PAPPPISGGGYX2AX3 (SEQ ID No:1) dans laquelle X1r X2, et X3 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus X2 ou X3 est un résidu citrullyl b) un peptide défini par la séquence GPXIVVEX2HQSACKDS (SEQ ID No:2) dans laquelle X1, et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus X1 ou X2 est un résidu citrullyl c) un peptide défini par la séquence SGIGTLDGFX1HX2HPD (SEQ ID No:3) dans laquelle X1, et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus X1 ou X2 est un résidu citrullyl d) un peptide défini par la séquence VDIDIKIX1SCX2GSCS (SEQ ID No:4) dans laquelle XI et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu 25 30 35 arginyl, et au moins l'un des résidus X1 ou X2 est un résidu citrullyl; e) un peptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 7 acides aminés consécutifs, et avantageusement, de 8 à 14 acides aminés consécutifs, dont au moins un résidu citrullyl, de l'un des peptides a) à d) ci-dessus. Les peptides conformes à l'invention ont une taille d'au moins 5 acides aminés, de préférence une taille de 5 à 25 acides aminés, et, de manière tout à fait préférée, une taille de 10 à 20 acides aminés. Selon un mode de réalisation préféré d'un peptide conforme à l'invention il est choisi parmi: - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 1 dans laquelle au moins X3 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 2 dans laquelle au moins X2 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 3 dans laquelle au moins X2 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 4 dans laquelle au moins X1 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl. De maniere particulièrement préférée, un peptide conforme à l'invention est choisi parmi: - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 1 dans laquelle X1, X2, et X3 sont des résidus citrullyl, ou un peptide d'au moins 16 acides aminés comprenant ladite séquence; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 2 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 3 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 4 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl. Des peptides citrullinés conformes à l'invention peuvent par exemple être obtenus à partir de fragments de fibrine ou de fibrinogène naturels, recombinants, ou de synthèse, par l'action de la peptidyl arginine déiminase (PAD) ; ils peuvent également être obtenus par synthèse peptidique, en incorporant directement un ou plusieurs résidus citrulline, dans le peptide synthétisé. Des peptides citrullinés conformes à l'invention englobent également des dérivés des peptides SEQ ID NO: 1 à 4 ou des fragments de ceux-ci, définis ci- dessus, lesdits dérivés portant des modifications destinées à améliorer leur reconnaissance par les AAPC: à titre d'exemples de tels dérivés, on citera: des peptides cyclisés; des peptides de type rétro, dans lesquels des acides L-aminés sont enchaînés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire; des peptides de type rétro-inverso, constitués par des acides aminés de la série D (au lieu des acides aminés de la série L des peptides naturels) enchaînés selon une séquence inverse de celle du peptide à reproduire. La présente Invention a également pour objet l'utilisation des peptides conformes à l'invention, tels que définis ci-dessus, pour détecter la présence d'AAPC spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, dans le cadre du diagnostic in vitro de la PR. La présente invention a également pour objet des compositions antigéniques, utilisables pour détecter la présence d'AAPC spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lesquelles compositions sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide conforme à l'invention. Des compositions conformes à l'invention peuvent associer entre eux différents peptides choisis parmi les peptides conformes à l'invention, ou bien peuvent associer un ou plusieurs peptides conformes à l'invention avec un ou plusieurs peptides citrullinés dérivés notamment de la filaggrine. Selon un mode de réalisation préféré d'une composition antigénique conforme à l'invention, elle comprend au moins un peptide de séquence SEQ ID NO: 1, et au moins un peptide de séquence SEQ ID NO: 2, tels que définis ci-dessus. Cette composition possède un très large spectre de réactivité, et peut permettre en outre de détecter la PR à un stade précoce. Avantageusement, une composition conforme à l'invention peut comprendre en outre un peptide de séquence SEQ ID NO: 3 et/ou un peptide de séquence SEQ ID NO: 4, tels que définis ci-dessus. Les compositions conformes à l'invention peuvent, le cas échéant, se présenter sous forme de compositions multipeptidiques, dans lesquelles les peptides constitutifs sont associés entre eux ou à une molécule porteuse commune, généralement par liaison covalente. A titre d'exemple, on citera les multi-peptides antigéniques (MAP pour multiple antigen peptides décrits notamment par TAM (froc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5409-13, 1988). La présente Invention a également pour objet un procédé de détection de la présence d'AAPC spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un peptide ou une composition antigénique conforme à l'Invention, tel que définis ci- dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les AAPC spécifiques de la PR éventuellement présents dans ledit échantillon; - la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé. Ce procédé de détection peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire comprenant au moins un peptide ou une composition antigénique selon l'Invention, et, le cas échéant, des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps. Avantageusement, ledit nécessaire comprend un peptide ou une composition antigénique selon l'Invention, immobilisé sur un support solide. A titre d'exemples non-limitatifs de supports solides utilisables, on citera des plaques de microtitration, des cônes de l'appareil VIDAS (commercialisé par BIOMERIEUX), des billes, des microbilles ou microparticules, des bandelettes, etc.... Ledit nécessaire peut également comprendre des échantillons de référence, tels qu'un ou plusieurs sérum(s) négatif(s) et un ou plusieurs sérum(s) positif(s). La présente invention sera mieux comprise à 35 l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'identification des peptides conformes à l'invention et la mise en évidence de leur profil de réactivité vis-à-vis des AAPC. EXEMPLE 1: MISE EN EVIDENCE DE L'HETEROGENEITE DE LA REACTION DES AAPC AVEC DES PEPTIDES CITRULLINES ISSUS DE LA FILAGGRINE, ET OBTENTION DE MELANGES DE SERUMS REPRESENTATIFS DES DIFFERENTS PROFILS DE REACTIVITE. sérums, présentant des AAPC détectables à la fois par ELISA et par immunotransfert sur fibrinogène humain désiminé in vitro (Masson-Bessière C, 2001, précité 10; Nogueira L et al., Arthritis Res, 4, 90, 2002) mais aussi par immunofluorescence indirecte sur cryocoupes d'oesophage de rat (Vincent C et al., Ann Rheum Dis, 48, 712-22, 1989) et par immunotransfert sur filaggrine épidermique humaine (Vincent C et al., J Rheumatol, 25, 838-46, 1998) ont été utilisés. La réactivité de ces 90 sérums multi-positifs a été analysée en ELISA à l'égard de 5 peptides citrullinés différents dont la réactivité vis-à-vis des AAPC avait été précédemment établie. Ces peptides sont les suivants: E12D ESSRDGSXHPRSHD (SEQ ID NO: 5) T12E TGSSTGGXQGSHHE (SEQ ID NO: 6) E12H EQSADSSXHSGSGH (SEQ ID NO: 7) cfc6 SHQESTXGXSRGRSGRSGS (SEQ ID NO: 8) cf48-65-4 TIHAHPGSXXGGRHGYHH (SEQ ID NO: 9) (X désigne un résidu citrullyl) Les peptides E12D, T12E, et E12H ont été décrits par Girbal-Neuhauser, E. et al. (1999) les peptides cfc6 et cf48-65-4 ont été décrits par Schellekens, G. et al. (1998). L'analyse par ELISA a été effectuée selon le protocole décrit par Girbal-Neuhauser, E. et al. (1999) Cette analyse a permis d'identifier 12 profils de réactivité à l'égard des 5 peptides. Ces profils sont résumés dans le Tableau I ci- dessous. Tableau Profil E12D E12H T12E cfc6 cf48-65-4 1 + + + + 2 + + + 3 -- + + + 4 + + + 6 + + 7 + 8 + + + 9 + + + 11 + 12 + De manière à être le plus représentatif possible des différents profils de réactivité des AAPC, des mélanges, dénommés ci-après mélanges: A et B ont chacun été constitués par mélange à parts égales de 10 sérums représentant différents profils de réactivité sur peptides "filaggrine". La composition de ces deux mélanges est indiquée dans le Tableau II ci-dessous. 10 Tableau II Sérum Profil Mélange 97.0459 1 97.0388 3 --- 97.1436 4 97.0169 6 97.0530 7 97.0311 8 A 97.0506 9 97.0468 10 97.0796 97.0907 12 97.1715 - 1 97.0524 1 97.0323 2 97.0794 4 95.0256 5 97.1795 5 B 97.1474 - -- 9 - r 97.0244 10 _ -- 97.1548 11 97.1210 - 12 A eux deux, les mélanges A et B sont donc représentatifs de l'hétérogénéité de spécificité des sérums AAPC+. EXEMPLE 2: IDENTIFICATION DE PEPTIDES CITRULLINES DERIVES DES CHAINES a ET 0 DE LA FIBRINE, REAGISSANT AVEC LES AAPC. Les peptides testés ont été obtenus à partir de la séquence de la chaîne a et de la séquence de la chaîne 0 de la fibrine [correspondant respectivement aux résidus 36-629 et 45-491 des chaînes A(a) (référence Ref Seq NP Accession: NP 068657) et B((3) (référence SWISSPROT FIBB HUMAN Prim. Accession: P02675) du fibrinogène]. Les séquences des résidus 1 à 629 et 1 à 491 des chaînes A(a) et B((3) du fibrinogène sont également respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 11, et sur la Figure 1 A et B. Les séquences indiquées en gras sur la Figure 1 sont celles des fibrinopeptides A et B. Chaque chaîne a ou 0 de fibrine a été segmentée en séquences contiguës de 15 acides aminés, et tous les peptides comprenant au moins un résidu arginyl ont été choisis. Dans le cas des peptides pour lesquels le résidu arginyl se situait à l'extrémité NH2- ou 000H-terminale, une seconde série de peptides de 15 acides aminés, chevauchant les premiers, de façon à recentrer le résidu arginyl terminal dans la séquence, a été choisie. Au total, 71 peptides dont 40 dérivés de la chaîne a de la fibrine et 31 dérivés de sa chaîne 0 ont été choisis. Pour chacun des peptides, la forme avec résidu(s) arginyl (forme native) et la forme où tous les résidus arginyl ont été substitués par des résidus citrullyl (forme citrullinée) ont été synthétisées, selon la méthode en phase solide de Merrifield (pureté ? 60%). La liste des peptides citrullinés choisis est donnée dans le Tableau III ci-après: Tableau ill [A. Première série Chaîne a a36-50Cit38,42 'al71-185Cit178181 a351365Cit353 a456-470Cit458,459 a66-80Cit69 al 86-2000it186,190 a366380Cit367 a501-515Cit510 512 a81-95Cit84 a216-230Cit216.218 a38I395Cit394 a546-560Cit547 (x246-260Cit258 a396-410Cit404 a561-575Cit573 al 11_ 125Cit114,123 -a261-275C1t263,271 a411-425C1t425 x591 605Crts91 a126140C1t129135137 al41-155Cit143 i x276-290Cit287 a426-440Cit426 a621629Cit621,627 _ a441-455Cit443 al56-170Cit160,168x306-320Cit3o8 Chaîne B: (31 95- (3330-344Cit334 (3435-449Cit436,445 209Cit196,199 206 (34559Cit47,53 (360-74Cit6o,72,74 X3210-224Cit224 3375-389Cit376 (3465479Cit478 _ 75-89CitS7 3240-254Cit246 390-404Cit395 13480-49 Cit485 (3120134Cit121,1243255-269Cit267 (3405-419Cit410 (3150-164Cit158 j j3285299Cit285,294 J33420-434Cit421 B. Deuxième série: Chaîne a a300-314Cit308 a438-452Cit443 a615-629Cit621. a138-152Cit143 a347-361Cit353 a455- 469Cit458,459 a183-197Cit186. 190 a213-227Cit216.218 a363-377Cit367 a542-556Cit547 a259-273Cit263,271 a420 434Cit425,426 a588-602Cit591 __ Chaîne B: (350 64Cit53 60 (3202 216Cit206 (3281-295Cit285 294 I [3474-488Cit478,485 __ X3215 229Cit224 (3373-387Cit376 (3116-130Cit121 124 (3188-202Cit196199 X219-233Cit224 (3416-430Cit421 (3236-250Cit246 (3433-447Cit436,445 iI (3193- 207Cit196, 199,206 La nomenclature utilisée est la suivante: nom d'origine de la chaîne polypeptidique (a ou (3) du fibrinogène dont dérive la séquence, puis position dans cette séquence du résidu amino-terminal du peptide position du résidu carboxy-terminal du peptide. Ces positions sont numérotées par rapport à l'extrémité N-terminale du fibrinogène. La mention Cit indique qu'il s'agit d'une forme citrullinée du peptide. La position du résidu arginyl qui est substitué par un résidu citrullyl est indiquée en indice. Seules les formes citrullinées des peptides sont présentées. Chaque paire de peptides (citrulliné et noncitrulliné) a été testée en ELISA avec un mélange à parts égales de 10 sérums ne présentant pas d'AAPC (mélange contrôle) et avec les 2 mélanges A et B décrits dans l'Exemple 1. Les peptides ont été testés après revêtement de plaques en polystyrène irradié (Nunc Maxisorp) dans trois tampons différents (acétate pH 5,0, PBS pH 7,4 et carbonate pH 9,0), de manière à optimiser les chances de fixation passive des peptides (10 g/ml) qui présentaient des points isoélectriques très hétérogènes (s'étalant de 4 à 12 pour les formes non citrullinées). Chaque paire de peptides (forme native et citrullinée) a été testée sur la même plaque et une paire de peptides contrôle peptide "filaggrine" citrulliné cfc6 et son correspondant natif cf0 (Schellekens GA, 1998, précité) a été incluse lors de chaque expérimentation, ce qui a permis de calculer un coefficient de variation inter-essais et d'effectuer des corrections. Après saturation en PBS-BSA 2%, les mélanges de sérums dilués au 1/50 en PBS 2M NaCl - BSA 2% ont été incubés puis leur fixation a été révélée avec des IgG de chèvre anti-IgG humaines marquées à la peroxydase (Southern) diluées au 1/1000 en PBS BSA 2%. Toutes les incubations ont eu lieu pendant 1 h à 4 C et ont été suivies de lavages en PBS-Tween 0,1%. L'activité de la peroxydase a été révélée par une solution d'orthophénylènediamine (2mg/ml Sigma) en peroxyde d'hydrogène (0,03% Sigma). La réaction a été stoppée après 5 minutes par de l'acide sulfurique 4M et la densité optique (DO) à 492 nm a été mesurée grâce à un spectrophotomètre automatique (Multiskan, Thermo Labsystems). La réactivité spécifique des mélanges de sérums à l'égard des peptides citrullinés correspondait à la différence entre la DO obtenue avec le peptide citrulliné et celle obtenue avec le peptide natif correspondant (delta DO). Les résultats correspondent à la moyenne de 2 déterminations. Tout peptide citrulliné permettant d'obtenir une delta DO supérieure à 0,250 pour au moins un des deux mélanges A et B après revêtement dans au moins un des trois tampons, a été considéré comme réactif. Parmi les 71 peptides citrullinés analysés, 12 peptides dérivés de la séquence de la chaîne a de la fibrine et 5 peptides dérivés de celle de la chaîne p se sont révélés porteurs d'épitopes reconnus par les AAPC. Parmi ces peptides, 5 peptides étaient très réactifs (DeltaD0?1,5), 8 peptides l'étaient moyennement (0,5delta DO Les résultats obtenus pour les 17 peptides réactifs sont présentés dans le Tableau IV ci-après: Tableau IV Mélange de Tampon de revêtement Peptide sérums Acétate PBS Carbonate Mélange A 3,998 2,687 3,432 _ a36 50Cit3s,42 Mélange B 4,272 2,652 2,640 Mélange A 0,149 0,287 0, 749 a171-185Cit178 181 Mélange B 0,076 0,213 0,467 a246-260Cit258 Mélange A 0,044 0,000 0,000 Mélange B 0,265 0250 0,333 a366- 380Cit367 Mélange A 0,283 0,372 1 0,259 Mélange B 0,000 0,035 0,084 Mélange A 0,043 0,022 0, 428 a396-410Cit404 Mélange B 0,153 0,167 0,201 Mélange A 0,085 0, 158 0, 563 a411 425Cit425 Mélange B 0,377 0,661 0,429 Mélange A 0,159 0, 919 0, 145 a501-515Cit5lo,512 Mélange B 0,723 2,598 0,792 Mélange A 0,376 0,738 0,334 a546-560Cit547 Mélange B 0,046 0,147 0,155 1 Mélange A a561- 575Cit 0,050 0,298 s73 Mélange B 0,137 0,522 0,165 Mélange A 0,412 1,678 1,360 a183 197Cit186,190 Mélange B 0,013 0,149 0,067 Mélange A 0,137 0, 595 0,122 _ a259-273Cit263,271 Mélange B 0,208 0,690 0,196 _ Mélange A 0,046 0,163 0,363 a588-602Cit591 Melange B 0,055 0,332 0, 672 Mélange A 1,015 2,064 1,270 R60-74Cit60,72,74 Mélange B 2,833 2,687 2, 723 Mélange A 0253 0,294 1,141 (3210-224Cit224 Mélange B 0,001 0,602 1, 561 Mélange A 0,414 0,578 0,672 (3420-434Cit421 Mélange B 1 0,003 0,000 0, 028 Mélange A 0,121 0,603 0,612 (3281-295Citzss,z94 Mélange B 0,109 0, 753 0,708 Mélange A 0,355 0,482 0,436 (3433-447Cit436,445 Mélange B 0,000 0, 000 0,000 EXEMPLE 3: PROFIL DE REACTIVITE DES PEPTIDES CITRULLINES REAGISSANT AVEC LES AAPC. Les 13 peptides porteurs d'épitopes les plus réactifs (DeltaDO>- 0,5) ont été testés indépendamment avec les 20 sérums constitutifs des mélanges A et B, afin d'évaluer le profil de réactivité de chacun de ces peptides. Les tests ont été effectués en ELISA dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 2 ci-dessus, à ceci près que, pour chaque paire de peptides, on a choisi comme tampon de revêtement celui ayant permis d'obtenir la plus forte réactivité vis-à-vis de ce peptide lors du criblage. En outre, les dilutions des sérums ont été ajustées de telle sorte qu'ils aient une avidité équivalente pour le fibrinogène désiminé entier. Ainsi pour chaque sérum, on a choisi la dilution permettant d'obtenir une DO de 1 en ELISA sur le fibrinogène désiminé (Nogueira L, 2002, précité). Les dilutions s'échelonnaient du 1/20 au 1/2700. Les résultats sont illustrés par le Tableau V ci-après. Tableau V Sérums et r N N_ oô d N, ^ v-, V N É-É vi N" ç h i- N N O n L) p. vii a r W O Lv n L) _ Ü o L) N y Ü U v v1 v r p" r-- ^c) d M N te.) ê te-) oo v1 o Ü - te) Éc- N o - p > N N v-) p N co cC t - [-- Oc cd N tr) vi cd N o cC 97.0459 1/60 0,708 3,553 0,286 2,224 3,214 0,375 97.1715 1/300 3,497 1,786 97.0524 1/200 3,390 2,853 0,592 0,250 97.0323 1/120 1, 726 1,865 3,234 1,160 0,359 0,250 97.0388 1/50 3,317 2,882 1,144 97.1436 1/150 3,299 2,799 97.0794 1/50 0,750 3,431 3,300 2,093 0,262 1,954 95. 0256 1/35 3,482 2,354 2,367 2,853 97.1795 1/50 2,286 0,571 0,489 0,791 97. 01691/400 0,314 1,344 97.0530 1/50 2,974 0,688 0,438 97.0311 1/200 1,930 0,710 1,947 0,463 0,871 0,302 0,286 97.0506 1/75 1,925 0,436 1,801 0,851 97.1474 1/20 0,366 1,931 1,075 0,362 0,712 0,389 97.0468 1/700 1,076 0, 416 0,315 97.0244 1/2700 1,234 3,390 97.1548 1/60 1,478 0,710 0,530 97. 0796 1/500 0,360 0,666 1,176 0,709 97.0907 1/300 1,166 0,442 0,331 97. 1210 1/300 3,329 0,723 0,844 Nb sérums 14/20 12/20 9/20 9/20 6/20 6/20 3/10 5/20 5/20 2/10 3/20 2/20 1/20 positifs aPour ces 2 peptides, la réactivité individuelle des sérums du mélange B n'a pas été testée car celui-ci n'était pas réactif REVENDICATIONS 1) Peptide isolé reconnu par des auto-anticorps anti-protéines citrullinées (AAPC) présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR), caractérisé en ce qu'il comprend au moins un résidu citrullyl, et en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par: a) un peptide défini par la séquence X1PAPPPISGGGYX2AX3 (SEQ ID No:1) dans laquelle XI, X2, et X3 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus X2 ou X3 est un résidu citrullyl; b) un peptide défini par la séquence GPXIVVEX2HQSACKDS (SEQ ID No:2) dans laquelle XI et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus XI ou X2 est un résidu citrullyl c) un peptide défini par la séquence SGIGTLDGFXIHX2HPD (SEQ ID No:3) dans laquelle XI et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus XI ou X2 est un résidu citrullyl d) un peptide défini par la séquence VDIDIKIXISCX2GSCS (SEQ ID No:4) dans laquelle XI et X2 représentent chacun un résidu citrullyl ou un résidu arginyl, et au moins l'un des résidus XI ou X2 est un résidu citrullyl e) un peptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, dont au moins un résidu citrullyl, de 30 l'un des peptides a) à d) cidessus. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par. un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 1 dans laquelle au moins X3 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 2 dans laquelle au moins X2 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 3 dans laquelle au moins X2 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 4 dans laquelle au moins X1 est un résidu citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant ledit résidu citrullyl. 3) Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe 20 constitué par: - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 1 dans laquelle X1r X2, et X3 sont des résidus citrullyl, ou un peptide d'au moins 16 acides aminés comprenant ladite séquence; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 2 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 3 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl; - un peptide défini par la séquence SEQ ID NO: 4 dans laquelle X1 et X2 sont des résidus citrullyl, ou un peptide comprenant un fragment d'au moins 30 35 acides aminés consécutifs de ladite séquence contenant lesdits résidus citrullyl. 4) Utilisation d'un peptide selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour détecter la 5 présence d'AAPC spécifiques de la PR dans un échantillon biologique. 5) Composition antigénique, caractérisée en ce qu'elles comprend au moins un peptide selon une quelconque des revendications 1 à 3. 6) Composition antigénique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide de séquence SEQ ID NO: 1, et un peptide de séquence SEQ ID NO: 2 selon une quelconque des revendications 1 à 3. 7) Composition antigénique selon une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide de séquence SEQ ID NO: 3 et/ou un peptide de séquence SEQ ID NO: 4, selon une quelconque des revendications 1 à 3. 8) Procédé de détection de la présence d'AAPC spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un peptide selon une quelconque des revendications 1 à 3 ou une composition antigénique selon une quelconque des revendications 5 à 7, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les AAPC spécifiques de la PR éventuellement présents dans ledit échantillon; - la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.