Brevet FR2884258A1 — publié le 20061013

La présente invention concerne l'application de la mesure de l'activité spécifique de la glyoxalase I au diagnostic de la prédisposition, la survenue et/ou le suivi des complications associées au diabète. Le diabète est une maladie chronique, induisant des complications graves aux niveaux cardiovasculaire, neurologique, oculaire, rénal etc. On distingue principalement deux types de diabète: le diabète insulinodépendant ou diabète de type 1 caractérisé par la disparition de la sécrétion d'insuline par les cellules (3 des îlots de Langerhans du pancréas et le diabète non insulino-dépendant ou diabète de type 2 caractérisé par une diminution de l'action de l'insuline sur les tissus cibles. Le diabète de type 2 est une maladie qui affecte actuellement 7 % de la population mondiale et dont la prévalence pourrait atteindre 10 % au cours des 10 prochaines années. Ainsi, le diabète est devenu un problème majeur de santé publique, aux conséquences humaines et financières considérables. Le diabète est aujourd'hui la première cause de cécité et d'insuffisance rénale nécessitant des dialyses ou la greffe rénale, mais aussi un facteur prépondérant de la mortalité cardiovasculaire. L'hyperglycémie, la principale caractéristique du diabète, est à l'origine de toutes les complications vasculaires associées à cette maladie. Celles-ci se traduisent non seulement par une augmentation des accidents cardiovasculaires classiques (macroangiopathies: maladie coronarienne, accidents cérébraux, artérite des membres inférieurs), mais surtout par une pathologie spécifique qui touche les petits vaisseaux sanguins (microangiopathie) comme la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie. En effet, le risque de survenue de toutes ces complications chez les sujets diabétiques est 2 à 3 fois supérieur par rapport aux individus non diabétiques. Devant la gravité de ces pathologies, une des questions qui se pose est: peut-on prévenir toutes ces complications, sachant que, pour une même glycémie, les sujets diabétiques développent des complications secondaires à des degrés variables ? A ce jour, il n'existe aucune méthode de diagnostic de la prédisposition de la survenue et/ou du suivi des complications associées au diabète. On sait que l'hyperglycémie favorise les réactions de glycation qui sont considérées comme des réactions non enzymatiques du glucose et de ses métabolites (a-oxoaldéhydes tels que le glyoxal ou le méthylglyoxal) avec des protéines aboutissant à des composés complexes dénommés produits de glycation avancée (Advanced Glycation End products: AGEs). Le glucose lui-même est un faible agent de glycation; par contre la réactivité des composés dicarbonylés avec les amines libres des protéines est 10 000 fois supérieure à celle du glucose. La surproduction irréversible d'AGEs chez les sujets diabétiques, induite en particulier par le glyoxal et le methylglyoxal présents en concentration élevée chez ces malades, joue un rôle majeur dans la pathogenèse des complications diabétiques. Les effets toxiques des AGEs résultent à la fois d'altérations structurales et fonctionnelles des protéines et d'une interaction des AGEs avec leurs récepteurs cellulaires conduisant à une production accrue de radicaux libres. Plus précisément, les AGEs sont à l'origine des endommagements tissulaires par plusieurs mécanismes incluant principalement la réticulation des protéines, la mutation d'ADN, l'activation ou l'inactivation des enzymes et des facteurs de croissances et la formation des radicaux libres d'oxygène. La participation des AGEs dans la survenue des micro- et macroangiopathies diabétiques ainsi que dans l'apparition de cataracte chez ces malades est clairement démontrée. Il faut souligner que les AGEs sont également impliqués dans le phénomène de vieillissement cellulaire (ainsi que dans le développement de la maladie d'Alzheimer) via le même mécanisme que l'apparition des pathologies liées au diabète. Ils semblent également impliqués dans l'amyloïdose associée aux dialyses ou à la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose et la maladie de Parkinson (Suji et al., Biogerontology, 5, pages 365-373, 2004) et dans l'insuffisance rénale chronique et la porphyrie. Compte tenu de la toxicité particulière du glyoxal et du méthylglyoxal, tous les organismes vivants possèdent un système de détoxication enzymatique: le système des glyoxalases qui est composé de deux enzymes, la glyoxalase I (EC 4.4.1.5, une isomérase) et la glyoxalase II (EC 3.1.2. 6, une hydrolase) et du glutathion comme cofacteur. Ces deux enzymes catalysent la conversion du glyoxal et du méthylglyoxal respectivement en glycolate et en D-lactate. Le système des glyoxalases, est localisé dans le cytosol de toutes les cellules et dans certains organites comme les mitochondries. L'augmentation de l'activité de la glyoxalase I a été observée chez les patients diabétiques (quel que soit le type de diabète) par rapport aux non diabétiques et en particulier chez ceux présentant des complications du type microangiopathie par rapport aux patients diabétiques ne présentant pas ce type de complications (McLellan et al., Clinical Science, 1994, 87, pages 21-29; Ratcliff et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1996, vol. 81, N 2, pages 488-492) . Or de façon surprenante les présents inventeurs ont mis en évidence une excellente corrélation entre la présence des pathologies microvasculaires chez les sujets diabétiques et la diminution de l'activité spécifique de la glyoxalase I érythrocytaire. Cette enzyme est donc un marqueur fiable pour le diagnostic des complications liées au diabète. En effet, les observations des inventeurs apportent des preuves de la fréquence accrue des complications vasculaires chez des sujets caractérisés par une faible activité spécifique de la glyoxalase I en indiquant l'intérêt diagnostic/pronostic du dosage de cette enzyme principalement chez les sujets diabétiques mais également chez des individus considérés comme des sujets à risque tout en n'étant pas diabétiques. En effet certains sujets ont une glycémie normale tout en présentant des problèmes macro- ou microvasculaires du même type que les complications liées au diabète. Jusqu'à ce jour il était impossible de prédire quel sujet allait présenter ce type de problèmes et/ou de complications. La présente invention concerne donc une méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux complications micro- et macrovasculaires du diabète et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution des complications micro- et macrovasculaires du diabète, ladite méthode comprenant la détermination dans un échantillon biologique provenant d'un sujet du rapport entre l'activité enzymatique de la glyoxalase I et le résultat de l'analyse quantitative de la glyoxalase I. Au sens de la présente invention, on entend par activité spécifique de la glyoxalase 1 le résultat obtenu en faisant le rapport entre l'activité de la glyoxalase I et la quantité de glyoxalase I mesurées dans un même échantillon biologique. Au sens de la présente invention, un sujet est prédisposé Si son activité spécifique de la glyoxalase I est de préférence inférieure d'au moins 1,5 U/ g, avantageusement au moins 2 U/ g, à celle d'un sujet contrôle sain n'étant pas un sujet à risque. Avantageusement, le sujet est un sujet à risque. De façon avantageuse il est diabétique, de façon encore plus avantageuse de type 2. Avantageusement les complications microvasculaires du diabète sont choisies parmi les microangiopathies, de façon avantageuse choisies parmi les rétinopathies, néphropathies et neuropathies et leur combinaison. Avantageusement les neuropathies peuvent être périphériques ou végétatives. Avantageusement la rétinopathie peut être choisi parmi les affections suivantes ou une combinaison de celles-ci: micro-anévrysme rétinien, exsudat mou, petites hémorragies intra-rétinienne, hémorragie sous forme de tache, saignement veineux, néovascularisation, décollement rétinien et traction rétinienne. Avantageusement les complications macrovasculaires du diabète sont choisies 30 parmi les macroangiopathies, de façon avantageuse choisies parmi les artérites des membres inférieurs, l'insuffisance coronaire, l'insuffisance cardiaque et leur combinaison. La présente invention concerne en outre une méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux maladies choisies parmi les micro- et macroangiopathies, la cataracte, la maladie d'Alzheimer, l'amyloïdose associée à la dialyse ou à la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose, la maladie de Parkinson, l'insuffisance rénale chronique, la porphyrie et le vieillissement physiologique et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution de ces maladies, ladite méthode comprenant la détermination dans un échantillon biologique provenant d'un sujet du rapport entre l'activité enzymatique de la glyoxalase I et le résultat de l'analyse quantitative de la glyoxalase I. Avantageusement le sujet n'est pas diabétique. De façon avantageuse, le sujet est un sujet à risque. Avantageusement l'échantillon biologique est choisi parmi le sang, les cellules sanguines telles que les plaquettes, les globules rouges, les globules blancs tels que les cellules mononucléaires et/ou polynucléaires ou un tissu ou un mélange de ceux-ci. Avantageusement il s'agit du sang. De façon avantageuse, il s'agit du lysat de sang complet. De façon encore plus avantageuse il s'agit du lysat d'érythrocytes. Avantageusement le sujet est un Mammifère, de façon avantageuse un être 25 humain. Dans un mode de réalisation particulier la méthode de diagnostic selon la présente invention est telle que la détection comporte les étapes suivantes: 1) évaluation de l'activité enzymatique de la glyoxalase I dans l'échantillon biologique par mesure de la formation de S-D-lactoylglutathion par spectrophotométrie en utilisant l'hémithioacétal ou l'ensemble méthylglyoxal et glutathion réduit comme substrat, 2) analyse quantitative de la glyoxalase I dans l'échantillon biologique par une technique de type ELISA, 3) détermination du rapport entre l'activité enzymatique et le résultat de l'analyse quantitative. Avantageusement la technique de type ELISA est basée sur la détection de la glyoxalase I par un anticorps polyclonal spécifique obtenu chez un lapin. De façon encore plus avantageuse, l'anticorps polyclonal spécifique est obtenu en utilisant comme antigène la glyoxalase I recombinante exprimée chez Escherichia Coli BL21 (DE3). Le gène de la glyoxalase I a été séquencé et est décrit par Sulabha et al. (The Journal of Biological Chemistry, vol. 268, N 8, 1993, pages 5661-5667). La présente invention concerne en outre un kit de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux complications micro- ou macrovasculaires du diabète ou aux maladies choisies parmi les micro- et macroangiopathies, le diabète, la cataracte, la maladie d'Alzheimer, l'amyloïdose associée à la dialyse ou à la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose, la maladie de Parkinson, l'insuffisance rénale chronique, la porphyrie et le vieillissement physiologique, et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution de ces complications ou de ces maladies, comprenant: (a)- un réactif permettant de mesurer l'activité enzymatique de la glyoxalase I dans un prélèvement biologique et (b)- un réactif permettant de réaliser l'analyse quantitative de la glyoxalase I dans un prélèvement biologique. Avantageusement le sujet et l'échantillon biologique sont tels qu'indiqués ci-dessus. De façon avantageuse, le réactif (a) est l'hémithioacétal et/ou l'ensemble méthylglyoxal et glutathion réduit. Avantageusement le réactif (b) est l'anticorps polyclonal anti-glyoxalase I. L'évaluation clinique de l'activité spécifique de la glyoxalase I permettra donc le dépistage précoce du risque d'apparition des complications micro- et macrovasculaires du diabète et l'amélioration du pronostic de cette maladie en prévenant la survenue de ces complications. Les exemples suivants sont donnés à titre indicatif non limitatif. Les figures 1 à 4 représentent la répartition de l'activité spécifique de la glyoxalase I en fonction des différents types des microangiopathies chez des patients diabétiques présentant (0) ou ne présentant pas (N) de complications diabétiques (Figure 1: au moins une mi croangiopathie, Figure 2: Rétinopathie, Figure 3: Néphropathie, Figure 4: Neuropathie). Il s'agit de diagrammes en boîtes (box-plot) où la boîte donne les premiers, deuxième (médiane) et troisième quartiles de la distribution empirique et les limites extérieures (les minima et les maxima). Exemple 1: Evaluation de l'activité spécifique de la glyoxalase I érythrocytaire et de la fréquence de microangiopathies chez les sujets diabétiques Cette étude a été réalisée sur 175 patients diabétiques de type 2. Les échantillons du sang de patients ont été congelés immédiatement après le prélèvement et conservés à -20 C jusqu'à l'exécution des dosages. L'évaluation de l'activité enzymatique ainsi que de la quantité de la glyoxalase I a été réalisée sur le lysat du sang complet (sang/H20, vol/vol). L'activité enzymatique de la glyoxalase I a été déterminée par une technique spectrophotométrique en utilisant comme substrat, l'hémithioacétal et en mesurant la formation de S-D-lactoyl-glutathion. L'hémithioacétal est préparé par incubation de méthylglyoxal (2 mM) avec le glutathion réduit (2 mM) dans un tampon phosphate (50 mM, pH 6,6) pendant 10 minutes à 37 C. Une partie aliquote de lysat sanguin est additionnée à l'hémithioacétal ainsi formé (soit 629 mM avec une constante d'équilibre de 333 Mi). L'activité de l'enzyme est évaluée à 37 C en mesurant la croissance de l'absorption à x = 240 nm correspondant à la formation du L-D-lactoyl-glutathion. La quantité de produit formé est déterminée en appliquant la loi de Beer-Lambert en utilisant la valeur 2,87 mM-1 cm-' comme coefficient d'absorption molaire spécifique de L-D-lactoyl-glutathion. Une unité d'activité enzymatique de la glyoxalase I correspond à la formation d'une mole de S-D- lactoylglutathion par minute dans les conditions expérimentales définies ci-dessus. L'analyse quantitative de la glyoxalase I présente dans le lysat sanguin a été réalisée à l'aide d'une technique d'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) basée sur la détection d'un antigène (glyoxalase I) par son anticorps spécifique. Le prêt-à-monter ELISA a été fabriqué avec les anticorps polyclonaux produits chez le lapin immunisé avec la glyoxalase I recombinante exprimée chez Escherichia coli BL21 (DE3). Dans une première étape le lysat sanguin est incubé en présence des anticorps anti glyoxalase I préalablement fixés sur un support solide. Ensuite sont rajoutés successivement: les anticorps anti glyoxalase I conjugué à la biotine et l'extravidine peroxydase. Enfin l'activité peroxydase est révélée après addition de son substrat dichlorhydrate de 0phénylène diamine et de l'eau oxygénée. La valeur de l'absorption correspondante à la quantité du produit formé est déterminée à x = 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaque ELISA. Les concentrations de la protéine dans différents échantillons dosés, sont déterminés en se rapportant à une gamme standard établie grâce à la protéine pure dans les mêmes conditions que le lysat sanguin. La gamme présente une zone de linéarité entre 1 à 30 g/ml avec une sensibilité de 1 à 2 g/ml. L'activité spécifique de la glyoxalase I correspond à un rapport: activité enzymatique/quantité (U/ g de glyoxalase I pure). Résultats L'analyse des dossiers médicaux de 175 patients diabétiques indique que la majorité de sujets (n=109) manifeste des complications microvasculaires, telles que rétinopathies (n=48), néphropathies (n=43) et neuropathies (n=84). L'association entre l'activité spécifique de la glyoxalase I érythrocytaire déterminée chez les patients diabétiques et chaque type de microangiopathie a été étudiée à l'aide d'un modèle d'analyse de variance. Tous les tests étaient de formulation bilatérale, au seuil de 0,05. Les résultats obtenus (Tableau 1 et Figure 1) montrent que l'activité spécifique de la glyoxalase I est significativement plus faible (3,3 U/ g = 23,4 %) chez l'ensemble des patients souffrant d'au moins une microangiopathie (P Tableau 1. Association de l'activité spécifique de la glyoxalase I avec la fréquence des microangiopathies chez des patients diabétiques Activité spécifique Microangiopathie Différence P (U/ g) Oui Non Au moins une 10,9 (3,3) 14,1 (3,0) -3,3 REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux complications micro et macrovasculaires du diabète et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution des complications micro- et macrovasculaires du diabète, ladite méthode comprenant la détermination dans un échantillon biologique provenant d'un sujet du rapport entre l'activité enzymatique de la glyoxalase I et le résultat de l'analyse quantitative de la glyoxalase I. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que le sujet est diabétique, avantageusement de type 2. 3. Méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux maladies choisies parmi les micro- et macroangiopathies, la cataracte, la maladie d'Alzheimer, l'amyloïdose associée à la dialyse ou à la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose, la maladie de Parkinson, l'insuffisance rénale chronique, la porphyrie et le vieillissement physiologique et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution de ces maladies, ladite méthode comprenant la détermination dans un échantillon biologique provenant d'un sujet du rapport entre l'activité enzymatique de la glyoxalase I et le résultat de l'analyse quantitative de la glyoxalase I. 4. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce que le sujet n'est pas diabétique. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sang, les cellules sanguines telles que les plaquettes, les globules rouges, les globules blancs tels que les cellules mononucléaires et/ou polynucléaires ou un tissu ou un mélange de ceux-ci, avantageusement le sang. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le sujet est un Mammifère, avantageusement un être humain. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la détection comporte les étapes suivantes: 1) évaluation de l'activité enzymatique de la glyoxalase I dans l'échantillon biologique en mesurant la formation de S-D-lactoyl- glutathion par spectrophotométrie en utilisant l'hémithioacétal ou l'ensemble méthylglyoxal et glutathion réduit comme substrat, 2) analyse quantitative de la glyoxalase I dans l'échantillon biologique par une technique de type ELISA. 3) détermination du rapport entre l'activité enzymatique et le résultat de l'analyse quantitative. 8. Kit de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet aux complications micro- ou macrovasculaires du diabète ou aux maladies choisies parmi les micro et macroangiopathies, le diabète, la cataracte, la maladie d'Alzheimer, l'amyloïdose associée à la dialyse ou à la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose, la maladie de Parkinson, l'insuffisance rénale chronique, la porphyrie et le vieillissement physiologique, et/ou de l'apparition et/ou du suivi de l'évolution de ces complications ou de ces maladies, comprenant: (a)- un réactif permettant de mesurer l'activité enzymatique de la glyoxalase I dans un prélèvement biologique et (b)- un réactif permettant de réaliser l'analyse quantitative de la glyoxalase I dans un prélèvement biologique. 9. Kit de diagnostic selon la revendication 8 caractérisé en ce que le sujet est un Mammifère, avantageusement un être humain. 10. Kit de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 caractérisé en ce que le réactif (a) est l'hémithioacétal et/ou l'ensemble méthylglyoxal et glutathion réduit et le réactif (b) est l'anticorps polyclonal antiglyoxalase I.