Brevet FR2881828A1 — publié le 20060811

Méthode de mesure quantitative par immunochromatographie, d'analytes dans un échantillon liquide La présente invention concerne une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ainsi que le dispositif mis en oeuvre à cet effet. Apparue vers la fin des années 1980, la technologie de l'immunochromatographie a connu un développement important. Elle offre aujourd'hui un large éventail d'applications, depuis les champs traditionnels du diagnostic médical ou vétérinaire, jusqu'à l'environnement ou l'agroalimentaire. L'immunochromatographie entre dans un groupe de méthodes de diagnostic basées sur des réactions de liaisons par affinité entre membres de paires de liaisons spécifiques, regroupées sous le terme générique d'immunoessais. Globalement, selon l'approche utilisée, les immuno-essais sont divisés en deux grandes catégories: celles faisant intervenir la compétition pour un ligand spécifique entre l'analyte recherché et un analyte marqué et celles qui sont dites de type "Sandwich", dans lesquelles la liaison de l'analyte à un premier ligand spécifique est révélée par un second ligand spécifique marqué, fixé sur ledit analyte. Les immuno-essais ont progressivement évolué vers des dispositifs de plus en plus simples d'utilisation, permettant le développement de méthodes de diagnostic de routine, rapides et d'un coût modéré. Cette évolution a été particulièrement sensible dans le domaine médical, avec la forte émergence du diagnostic par "point of care" ou "home testing", dans lequel un diagnostic est directement réalisé près du lit du patient ou à son domicile, sans qu'il soit nécessaire de faire appel aux techniques de laboratoire d'analyse automatisées. L'immunochromatographie fait partie des technologies utilisées pour ce type de diagnostic rapide. Il s'agit d'une méthode de diagnostic en phase solide, utilisant la chimie sèche et la migration latérale sur une membrane inerte. Cette approche met en oeuvre un support poreux sous forme de bandelette, dans lequel sont intégrés sous forme sèche les réactifs nécessaires à la réalisation du test. La membrane est traitée de façon à ce qu'une réaction de reconnaissance entre partenaires de liaison spécifiques (généralement antigène / anticorps) se produise au niveau d'une zone déterminée et puisse être révélée à ce niveau. Schématiquement, lorsque l'échantillon à analyser est déposé sur le support, celui-ci migre le long de la membrane par un phénomène de capillarité. L'analyte recherché est capturé par un ligand spécifique immobilisé sur une zone déterminée de la membrane, et la réaction est révélée par un second ligand spécifique marqué, selon le principe de la méthode sandwich. II est également possible d'utiliser en immunochromatographie une réaction de type compétition. On utilise dans ce cas un analyte marqué compétiteur de l'analyte recherché pour la liaison avec le ligand immobilisé. Pour ce même type de test, on peut aussi utiliser le ligand marqué: dans ce cas, l'analyte recherché est en compétition avec l'analyte immobilisé. Enfin, il est également possible d'utiliser en immunochromatographie une réaction de type sérologique concernant la recherche d'anticorps. Dans ce cas une possibilité de dosage est décrite. L'antigène spécifique de la pathologie est immobilisé sur le support. Il permet de capturer les anticorps humains spécifiques de l'antigène et de la pathologie, présents dans l'échantillon. La présence des anticorps humains est révélée après addition d'un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines humaines. Pour ces tests de sérologie, il est même possible de faire une typologie des anticorps pour déterminer la classe d'anticorps humains détectés (IgM, IgG ou IGA) (Le principe d'une bandelette d'immunochromatographie est schématisé sur la figure 1). De nombreux documents de l'état de l'art décrivent des tests et dispositifs d'immunochromatographie et des adaptations particulières de cette technique à certaines applications. On peut par exemple citer, à titre non exhaustif, US5,591,645, US5,120,643, EP299428 ou EP250137 qui visent des tests d'immunochromatographie dans leur principe général, comprenant une bandelette de test permettant une migration de liquide par capillarité et la capture de l'analyte recherché par un réactif spécifique immobilisé au niveau d'une zone déterminée de la bandelette, EP291184 qui décrit un appareil d'analyse spécifique composé d'un boîtier creux contenant un support de réaction, EP383619 qui concerne un support membranaire spécifique, ou EP267006, qui décrit un procédé d'immunochromatographie qualitative pour la détection simultanée de la présence de plusieurs analytes dans un échantillon. Toutefois, la plupart des tests rapides unitaires par immunochromatographie décrits dans l'état de l'art sont des tests qualitatifs de type "yes/no" basés sur une lecture à l'oeil nu. Or, la subjectivité de ce type de lecture est une source de variabilité et de confusion. De plus, ces tests ne peuvent pas être utilisés dans certaines applications pour lesquelles existe un seuil de décision, comme c'est par exemple le cas de certains marqueurs d'exclusion de thrombose, tels les DDimères, dans le domaine de l'hémostase. Il est donc rapidement apparu le besoin de disposer d'approches permettant de quantifier les résultats obtenus d'une manière la plus simple 5 possible. L'une des approches les plus anciennes couramment utilisée par l'homme du métier est celle utilisant un contrôle interne spécifique appelé "Témoin de Bon Fonctionnement" (TBF) (voir par exemple EP 0 542 627, WO 96/10179, WO 94/07163 ou AN, C.D., YOSHIKI T., LEE G. and OKADA Y. , Cancer Letters, 2001, 162: 135-139 CHAN, C.P.Y., SUM K.W., CHEUNG K.Y., GLATZ J.F.C., SANDERSON J.E., HEMPEL A., LEHMANN M., RENNEBERG I. and RENNEBERG R., J. Immunol. Methods, 2003, 279:91-100). Schématiquement dans ce système, l'échantillon à analyser est mis en présence d'un conjugué spécifique de l'analyte recherché lors du dépôt sur la bandelette d'immunochromatographie. Le conjugué se lie à l'analyte recherché et le complexe formé migre le long de la membrane jusqu'à la zone de capture test spécifique de l'analyte. La coloration qui se développe au niveau de cette zone est proportionnelle à la concentration d'analyte recherché. L'excès de conjugué qui n'est pas lié à l'analyte est capturé au niveau d'une zone TBF, en aval de la zone de capture test sur la bandelette. Cette zone de TBF comprend un réactif immobilisé spécifique du conjugué utilisé. En pratique, dans cette approche, le conjugué est en général un anticorps monoclonal d'origine animale et le réactif immobilisé dans cette zone de TBF est un anticorps anti-espèce, dirigé contre l'espèce animale du conjugué. Bien que relativement simple dans son principe, ce système présente toutefois certains inconvénients. Ainsi, le même réactif conjugué sert à révéler le test et le contrôle. De ce fait le signal du TBF est fortement dépendant de la concentration de l'analyte. Pour une concentration élevée, le signal peut-être fortement diminué, voire absent pour les cas extrêmes. En outre, dans un tel système de contrôle, il n'y a aucune pondération des variations liées à l'échantillon et à la membrane. Dans d'autres approches, EP088636 décrit un procédé d'analyse quantitative basé sur l'utilisation de plusieurs zones de réaction successives spécifiques d'un même analyte, espacées sur le support de migration. WO 91 /12528 décrit une méthode d'immunochromatographie quantitative, utilisant également une bandelette à zones multiples, dans laquelle, schématiquement, l'analyte recherché est pris en "sandwich" entre deux réactifs spécifiques dont l'un est couplé à un marqueur et l'autre à de la biotine. Le produit résultant de ces interactions migre le long de la bandelette et est capturé au niveau de la zone de détection par un agent de capture constitué par de l'avidine fixée sur des particules de latex, l'ensemble étant immobilisé sur la bandelette. WO 97/09620 concerne une méthode pour la détection quantitative ou semiquantitative d'un analyte dans un échantillon, consistant à utiliser un agent de calibration et basée sur la présence de plusieurs zones dont au moins une pour la calibration, une pour la mesure et une dernière pour le contrôle de bon fonctionnement du test. WO 00/43786 décrit une approche pour quantifier les résultats obtenus par immunochromatographie avec une visualisation des résultats associée à une coloration, dans laquelle on affecte des valeurs ou domaines de valeurs à des colorations ou des intensités de coloration de signal, et où l'on compare la coloration du résultat avec celle d'un témoin interne de calibrage. La démarche utilisée dans cette référence est en réalité celle d'un test semi- quantitatif, avec définition d'une intensité de coloration de référence correspondant à une concentration de référence de l'analyte recherché. Elle ne fait pas recours à un instrument de mesure et de pré calibration, seuls moyens pour garantir des résultats fiables lorsqu'il s'agit de tests quantitatifs. WO 97/37222 et WO 02/077646, concernent des méthodes d'immunochromatographie quantitative mises en oeuvre avec un dispositif RAMPTM (Rapid Antigen Measurement Platform). Ces méthodes sont relativement complexes dans leur application. Elles font notamment intervenir une différentiation entre la zone d'application de l'échantillon et la zone mise en contact de celui-ci avec le réactif spécifique de l'analyte recherché. Par ailleurs, elles utilisent comme réactif de détection des populations de particules capables de se lier spécifiquement à l'analyte recherché, qui migrent avec celui-ci jusqu'à une zone de détection. La présente invention vise à fournir une méthode générale d'immunochromatographie quantitative simple, assurant une fiabilité des résultats malgré certaines fluctuations dues à des facteurs tels que l'échantillon (viscosité, composition, etc.) ou la membrane (micro hétérogénéité de structure), grâce à un système de pondération spécifique. Selon un premier aspect, la présente invention a ainsi pour objet une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), la ou lesdites zones de capture spécifiques comprenant chacune un réactif de capture immobilisé sur le support, ledit réactif de capture formant une paire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec un réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) mettre en contact l'échantillon avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable et avec un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, c) déposer l'échantillon mis en présence du réactif de contrôle et du conjugué ou du mélange de conjugués sur la zone d'application du support, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, e) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, f) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR, dans laquelle la quantité (ou taux) de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR. La présente invention a également pour objet un dispositif d'immunochromatographie pour l'analyse quantitative d'un ou plusieurs analytes dans un échantillon selon la méthode définie ci-dessus, comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), dans lequel la zone de CMR comprend un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif étant capable de former une paire par liaison spécifique avec un réactif de contrôle portant un marqueur détectable. Selon la présente invention, le réactif de contrôle qui migre le long de la membrane d'immunochromatographie et qui est ensuite capturé par le réactif de capture de contrôle immobilisé dans la zone CMR ne possède pas de réactivité croisée avec les analytes recherchés. II fournit ainsi un signal dont l'intensité est indépendante de la concentration de l'analyte recherché dans l'échantillon. Le signal qui se développe à ce niveau permet donc de sécuriser les résultats observés grâce à une pondération des influences de certaines conditions expérimentales, telles que la viscosité et la composition de l'échantillon, les variations des propriétés physico-chimiques de la membrane, etc. Les signaux obtenus selon la méthode de l'invention sont avantageusement mesurés par un appareil de lecture de signal, ce qui permet de fournir des résultats chiffrés et d'éliminer toute subjectivité. Dans le cadre de la méthode de l'invention, le conjugué ou mélange de conjugués spécifiques du ou des analytes recherchés, ainsi que le réactif de contrôle CMR peuvent être ajoutés à l'échantillon préalablement au dépôt sur la zone d'application du support. Dans ce mode de réalisation, le mélange échantillon / conjugué(s) / réactif CMR est ensuite déposé sur la zone d'application conformément aux étapes b) et c) de la méthode annoncée ci-dessus. Selon un second aspect préféré de l'invention, le conjugué ou mélange de conjugués, ainsi que le réactif de contrôle CMR sont utilisés sous forme sèche. Ils sont alors contenus dans un réservoir au niveau de la zone d'application de l'échantillon et la mise en contact de l'échantillon liquide avec le conjugué ou mélange de conjugués et avec le réactif de contrôle CMR se produit au moment du dépôt de l'échantillon sur la zone d'application du support. Le dépôt de l'échantillon va entraîner la solubilisation des conjugués et du réactif de contrôle CMR, la liaison du ou des conjugués sur leur(s) analyte(s) spécifique(s) et la migration par capillarité le long du support, des complexes formés entre chaque analyte et son conjugué spécifique, du réactif CMR et, éventuellement, des excès de conjugués qui n'auront pas réagi avec les analytes. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le dépôt de l'échantillon a lieu sur un réservoir préalablement saturé (par exemple dans une solution de saturation PBS - Régilait 1% - Surcrose 5% (à raison de 0,5m1 à 1ml/test) dans le bac de saturation). Ainsi, selon cette variante particulière, l'invention a pour objet: une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), ladite zone d'application comprenant un réservoir contenant un réactif de contrôle portant un marqueur détectable et un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif capable de former un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) déposer l'échantillon sur la zone d'application du support, c) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, e) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR, dans laquelle la quantité de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR. L'invention a également pour objet, un dispositif d'immunochromatographie pour la mise en oeuvre de la méthode définie ci-dessus, ledit dispositif comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), dans lequel la zone d'application comprend un réservoir contenant un réactif de contrôle portant un marqueur détectable et un conjugué ou mélange de conjugués sous forme sèche, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle et la zone de CMR comprend un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable. Un tel dispositif est représenté schématiquement sur la figure 2. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le conjugué capable de réagir spécifiquement pour former une liaison avec un analyte est un anticorps, par exemple un anticorps monoclonal dirigé contre un premier site antigénique de l'analyte. Le réactif de capture de l'analyte lié au conjugué peut aussi être un anticorps, par exemple un anticorps monoclonal dirigé contre un deuxième site de l'analyte. 2881828 12 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le réactif (ou composé) de capture du contrôle CMR est aussi un anticorps, par exemple un anticorps polyclonal. Dans le cadre de la méthode de l'invention exposée ci-dessus, l'utilisation d'un TBF devient accessoire. La fonction de ce type de témoin dans ce cas se limite à vérifier si tout le conjugué spécifique de l'analyte recherché a été complexé ou s'il reste après la réaction un excès de conjugué non utilisé. La fourniture de conjugués dans un réservoir permet d'assurer un transfert uniforme des conjugués et de l'échantillon sur la membrane de migration. En effet, après addition de l'échantillon sur le dispositif de test comportant le réservoir de conjugués, il y a solubilisation du traceur. Ainsi, le traceur est "libéré" ou "relargué" du réservoir sur la membrane de migration. Ensuite, le reste des réactions aboutissant à la détection et/ou au dosage se déroule normalement dans les conditions optimales. Les types de matériaux utilisés pour servir de réservoir de conjugué sont surtout des matériaux non-tissés. On peut citer: les fibres de verre ou Glass Fiber (GF) qui sont les plus couramment utilisées, puis les filtres de cellulose et les polyesters hydrophiles. Les réservoirs de conjugués sont généralement prétraités; le traitement étant une saturation préalable par des agents saturants dont les protéines et/ou les surfactants. Après cette saturation suivie d'un séchage rapide à température de 37 C (en général), le conjugué est déposé par immersion ou par "printing". L'emplacement de la zone CMR sur le support n'a pas d'importance pour réaliser la méthode de l'invention, dès lors que celui-ci est distinct de celui de chacune des zones de capture. L'éloignement des zones CMR d'une part et de capture d'autre part, peut être dans un intervalle de 3 à 10 mm, avantageusement autour de 5 0,5 mm. Pour des raisons de simplification d'utilisation, la zone de CMR est de préférence située en aval des autres zones de capture test. La méthode de l'invention peut avantageusement être mise en oeuvre pour la quantification simultanée de plusieurs analytes, chaque analyte étant alors arrêté dans sa migration sur le support au niveau d'une zone de capture spécifique, et révélé par un conjugué spécifique. La quantification des concentrations de chaque analyte est avantageusement réalisée avec un seul CMR. II suffit dans ce cas de calculer le rapport de chacun des signaux test sur le signal CMR. Comme cela l'a déjà été indiqué, le réactif de contrôle capturé au niveau de la zone de CMR et les analytes recherchés ne possèdent pas de réactivité croisée, ce qui garantit une intensité de signal CMR indépendante de la concentration et de la nature des analytes recherchés. Par exemple, dans le cas d'un dosage réalisé sur un échantillon d'origine humaine, le CMR est choisi parmi les molécules d'origine animales, sans réactivité croisée avec le type d'analytes recherchés. Ainsi, le réactif de contrôle peut être choisi parmi certaines immunoglobulines d'origines animales telles que les immunoglobulines de poule. Le réactif de capture est dans ce cas un anticorps dirigé contre l'espèce 30 animale dudit réactif de contrôle, à savoir un anticorps antiimmunoglobuline de poule. La paire de liaison formée par le réactif de contrôle CMR et son réactif de capture spécifique est préférentiellement de type antigène / anticorps. Toutefois, elle peut être constituée par d'autres partenaires d'affinité par exemple de type latex ou liposomes ou des paires telles que: Avidine (streptavidine)/biotine, Protéine A/Immunoglobuline (Ig), Protéine G/Ig, Lectines/Concanavaline A (Con A), anti-Haptoglobine/Hémoglobine. Le marqueur utilisé sur les conjugués et sur le réactif CMR est généralement de deux types: - direct, comme les marqueurs particulaires (particules d'or, de latex, de carbone, de polycarbonate) et les colorants, le dextran coloré, les traceurs fluorescents, etc.... Ces marqueurs sont détectables en soi, sans autre réaction supplémentaire, indirect, comme les marqueurs enzymatiques qui nécessitent une réaction de révélation dont le produit est détecté et/ou mesuré. Préférentiellement, le marqueur sur le conjugué ou mélange de conjugués est identique à celui utilisé sur le réactif de contrôle CMR. Néanmoins, il est possible d'utiliser des marqueurs différents, à la condition que ceux-ci absorbent dans la même longueur d'onde, de façon à pouvoir toujours établir une corrélation lors de la mesure. De préférence, le marqueur utilisé est de type particulaire, en l'occurrence des particules d'or, l'or colloïdal. Comme cela l'a déjà été souligné, la mesure quantitative de la concentration de l'analyte recherché est avantageusement effectuée à l'aide d'un lecteur de bandelette qui peut mesurer, par exemple par réflectance ou transmittance, les signaux test et CMR en unités arbitraires. La mesure finale à laquelle on se réfère est le rapport signal test/CMR (également dénommé "ratio" dans les exemples ci-après). Ainsi pour chaque test réalisé correspond un ratio mesuré. Dans un premier temps, une courbe standard est établie à partir du dosage de l'analyte de référence à plusieurs concentrations. Cette courbe standard sert, pour un analyte donné, de référence pour déterminer la quantité d'un analyte de l'échantillon, correspondant au ratio signal test / signal CMR mesuré. Les valeurs de la courbe standard correspondent de même aux ratios signal obtenu avec l'analyte de référence à une concentration donnée / signal CMR unique. Le signal CMR est choisi par l'homme du métier pour établir la courbe standard et correspond à une valeur du complexe formé entre le réactif de capture de CMR-CMR qui donne un signal (dit signal CMR) se situant dans la partie ascendante de la courbe signal/complexe, par opposition à une valeur qui se situerait dans la partie plateau de la courbe. Dans un second temps, le ratio mesuré pour un dosage réalisé est reporté sur cette courbe standard. Ainsi, il est possible de traduire le ratio mesuré 20 en concentration d'analyte recherché. Tout dosage d'un échantillon est ainsi réalisé par rapport à une courbe standard qui est tracée ou mémorisée par le lecteur sous une forme de présentation adéquate (courbe, code barres...). Le principe de fonctionnement de ce type d'instrument de mesure est résumé sur la figure 3. Selon le schéma, le lecteur mesure la lumière réfléchie (5) et transmise (6) 30 par une bandelette d'immunochromatographie (1). Deux sources de lumière distinctes (4 et 4') sont utilisées pour éclairer la bandelette (1). L'agent de détection généralement utilisé dans les tests d'immunochromatographie est l'or colloïdal qui a son pic d'absorption autour de 535 nm. Dans ce cas, pour la détection, le lecteur peut être équipé de deux sources de lumière LED (Light Emitting Diode) émettant à 530 nm. Pour cette utilisation, les deux types de lumière (transmise et réfléchie) ont des caractéristiques différentes: la réflectance est plus ou moins indépendante de l'environnement et il n'y a pas d'influence du matériel utilisé à part la bandelette elle-même, la transmittance dépend très fortement du matériel et plus particulièrement du matériau dans lequel la bandelette réactive est insérée. Ce qui implique que selon la nature et l'épaisseur du matériau utilisé, il est plus ou moins possible de mesurer la transmittance. Les mesures des lumières réfléchies et transmises sont proportionnelles à la concentration d'analyte capturé par un réactif spécifique couplé auxparticules d'or colloïdal (conjugué). Pour les illustrations de l'invention, c'est la réflectance qui a été préférentiellement retenue. Comme cela le sera plus précisément exposé au niveau des exemples, la méthode de l'invention fournit une aide au diagnostic médical réalisé dans des conditions d'urgence pour l'exclusion de certaines pathologies, en permettant de limiter le recours à certaines explorations invasives ou à des analyses onéreuses. C'est par exemple le cas, dans le domaine de l'hémostase, du diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse qui regroupe les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires. On estime qu'en France, la seule embolie pulmonaire pourrait concerner près de 100 000 patients par an, et être responsable de 10 000 à 20 000 décès. Il s'agit donc d'une pathologie grave qui peut concerner toutes les catégories de patients qu'ils soient hospitalisés ou ambulatoires. Ne pouvant être porté uniquement sur l'examen clinique, son diagnostic implique le recours à des examens complémentaires d'imagerie lourds (et parfois invasifs) tels que l'angioscanner, l'angiographie ou la scintigraphie, le plus souvent associés à un Doppler des membres inférieurs. Ce diagnostic requiert donc un matériel coûteux et un personnel spécialisé, pas toujours disponible dans les établissements de soins. De plus, la réalisation de plusieurs examens peut être nécessaire pour exclure avec certitude le diagnostic d'embolie pulmonaire où à l'inverse pour le confirmer, justifiant alors l'instauration d'un traitement anti-coagulant efficace. II faut cependant noter que le diagnostic d'embolie pulmonaire n'est confirmé aux termes de l'exploration que chez moins d'un tiers des patients ambulatoires admis dans un service d'urgence. D'où l'intérêt pour le développement de tests biologiques non invasifs permettant de confirmer ou au contraire d'infirmer le diagnostic d'embolie pulmonaire et plus généralement de maladie thromboembolique veineuse. La plupart des tests ont concerné des marqueurs d'activation de la coagulation et surtout de la fibrinolyse, en particulier les D-Dimères, des produits de dégradation spécifiques de la fibrine. L'intérêt du dosage des D-Dimères pour exclure un diagnostic d'embolie pulmonaire a été clairement identifié. Les D-Dimères apparaissent comme produits de dégradation du caillot de fibrine sous l'action de la plasmine. En effet, la thrombine générée lors de l'activation de la coagulation clive la molécule de fibrinogène entraînant, après libération de deux petits peptides (FPA et FPB), la génération de monomères de fibrine qui se polymérisent ensuite (caillot soluble). La stabilisation du caillot (caillot insoluble) est sous la dépendance du facteur XII, dont la forme activée est une transglutaminase qui permet la liaison (cross-link) des molécules de fibrine impliquées par l'intermédiaire de leurs domaines D. L'activation du système fibrinolytique va ensuite entraîner, via la génération de plasmine, une lyse du thrombus constitué. L'action protéasique de la plasmine sur la fibrine aboutit à la libération de nombreux fragments de clivage de taille variable dont les D-Dimères qui apparaissent relativement tardivement par rapport au processus initial thrombotique. II s'agit néanmoins d'un ensemble de produits de dégradation hétérogène sur le plan biochimique. Il est à noter que la plasmine est également capable de cliver le fibrinogène, ainsi que d'autres facteurs de coagulation lors d'une activation pathologique du système fibrinolytique. Les produits issus de la de gradation du fibrinogène ou de la fibrine sont regroupés sous le terme générique de PDF (Produits de Dégradation de la Fibrine/Fibrinogène). Les D-Dimères sont donc le reflet d'une lyse par la plasmine de molécules de fibrine polymérisées ayant subi l'action du facteur XIII. Le taux de DDimère plasmatique est considéré comme un bon reflet de la formation d'un caillot de fibrine et de sa lyse. II augmente dans plusieurs cas cliniques: thromboses veineuses profondes, embolie pulmonaire, coagulation intra vasculaire disséminée (C.I.V.D.), chirurgie, cancers et cirrhoses, etc Le dosage des D-Dimères est donc devenu un outil très précieux utilisé comme aide au diagnostic d'exclusion de la maladie thromboembolique veineuse (MTEV) que ce soit la thrombose veineuse profonde (TVP) ou l'embolie pulmonaire (EP). De ce fait, la mise au point d'un test rapide de dosage quantitatif suffisamment fiable et indépendant de l'expérience de l'utilisateur ainsi que des conditions environnementales s'avère particulièrement utile pour limiter le recours à des examens tels que l'angiographie pulmonaire, la phlébographie ou les scintigraphies pulmonaires. Le dosage du D-Dimère dans un échantillon sanguin selon la méthode de l'invention est illustré dans les exemples ci-après. L'échantillon sanguin dosé quantitativement selon l'invention, est par exemple, un échantillon de plasma. Une quantité d'environ 30 ml de plasma peut être déposée sur la bandelette pour réaliser le test. La lecture du test conduit à un taux de D-Dimère, résultant du ratio obtenu entre la mesure du signal de l'anlyte test et celle du signal du contrôle CMR. 15 L'invention a aussi pour objet un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de mesure quantitative par immunochromatographie d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide, comprenant: un support inerte sur lequel ont été immobilisés en des zones distinctes, différents types de composés dits de capture permettant (i) d'une part, s'agissant de chaque composé de capture de l'analyte, la capture d'un analyte déterminé de l'échantillon testé par une réaction de liaison spécifique entre ledit composé de capture et un analyte contenu dans l'échantillon, lorsque ledit analyte forme un partenaire de liaison spécifique avec un conjugué constitué par un réactif portant un marqueur détectable, et (ii) d'autre part, s'agissant du composé de capture du réactif de contrôle, la capture d'un réactif de contrôle portant un marqueur détectable; un conjugué ou un mélange de différents conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif capable de former une 25 30 liaison spécifique avec un analyte déterminé, recherché dans un échantillon biologique, ledit conjugué portant en outre un marqueur détectable, ledit (lesdits) conjugué(s) étant contenu(s) dans un réservoir de conjugués saturé ; un réactif de contrôle (dit CMR: contrôle de mesure ratiométrique) portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du (des) conjugué(s) ; pour chaque analyte une courbe standard, spécifique dudit analyte, établie à partir du dosage à plusieurs concentrations de l'analyte de référence associé à un conjugué et du dosage du réactif de contrôle (CMR) à une concentration donnée, dans les mêmes conditions, chaque point de la courbe correspondant au rapport du signal produit par le conjugué associé à l'analyte et capturé par le composé de capture de l'analyte, et du signal produit par le réactif de contrôle capturé par le composé de capture du réactif de contrôle; un ou plusieurs supports (backing) destinés à contenir les supports inertes pour la réalisation du test; le cas échéant un boîtier pouvant contenir les supports inertes et leurs accessoires pour constituer une cartouche à placer dans le lecteur de signal, - le cas échéant, des directives pour l'utilisation du kit aux fins de réalisation de la mesure de la quantité d'analyte ou des analytes. En particulier, les composés de capture sont immobilisés (coatés) sur une membrane inerte ayant la forme d'une bandelette, par exemple, une membrane de nitrocellulose. Les différentes parties du dispositif comportant les bandelettes sont illustrées dans les exemples et à la figure 4. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode ou du kit de l'invention, les composés de capture sont des anticorps de capture, en particulier des anticorps monoclonaux pour la capture de l'analyte et des anticorps polyclonaux pour la capture du CMR. L'anticorps de capture d'analyte est par exemple immobilisé sur le support 10 inerte à une concentration de 1,5 à 4mg/mI, par exemple autour de 2 0,1 mg/ml. L'anticorps de capture de réactif de contrôle est apr exemple immobilisé sur le support inerte à une concentration de 0,5 à 2 mg/ml, par exemple autour 15 de 1+ 0,05 mg/ml. Legendes des figures: Les exemples et les figures ci-dessous, illustrent la présente invention. La figure 1 est un rappel du principe d'une bandelette d'immunochromatographie. La membrane comprend respectivement: une zone de dépôt (1) sur laquelle est déposée l'échantillon; la zone de dépôt est représentée avec un réservoir contenant le conjugué sous forme sèche; une zone de capture (2) comprenant un anticorps de capture immobilisé, spécifique de l'analyte recherché ; une zone de TBF (3) comprenant un anticorps de capture immobilisé, spécifique du conjugué. L'excès de conjugué qui n'a pas réagi avec l'analyte de l'échantillon migre le long de la membrane jusqu'à la zone de TBF, où il est arrêté par l'anticorps de capture; un absorbant (4) qui sert à la fois de "pompe" et de "poubelle" des réactions immunologiques déclenchées par le passage de l'analyte de l'échantillon sur la bandelette réactive. Il a en effet pour fonction d'augmenter la capacité d'absorption de tout le dispositif pour finalement bien "nettoyer" la membrane de migration sur laquelle ont eu lieu les réactions immunologiques aboutissant au dosage. La figure 2 schématise le principe général du dispositif selon l'invention. Dans ce schéma, on considère que l'on ne recherche qu'un seul analyte. La membrane (5) comprend respectivement: une zone de dépôt (1) sur laquelle est déposée l'échantillon. Sur cet exemple, le conjugué et le réactif de contrôle CMR sont présents sous forme sèche dans un réservoir (2) au niveau de la zone de dépôt. une zone de capture (3) comprenant un réactif de capture immobilisé spécifique de l'analyte recherché, une zone de CMR (4), comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé, spécifique du réactif de contrôle marqué. Ce réactif de contrôle rendu soluble par le dépôt de l'échantillon sur la zone de dépôt migre par capillarité le long de la membrane jusqu'à la zone de CMR où il est spécifiquement capturé par le réactif de capture de contrôle. Au niveau de cette zone CMR se développe ainsi un signal totalement indépendant de la concentration de l'analyte à doser. 10 un absorbant (6) qui sert à la fois de "pompe" et de "poubelle" des réactions immunologiques déclenchées par le passage de l'analyte de l'échantillon sur la bandelette réactive. Il a en effet pour fonction d'augmenter la capacité d'absorption de tout le dispositif pour finalement bien "nettoyer" la membrane de migration sur laquelle ont eu lieu les réactions immunologiques aboutissant au dosage. L'excès de conjugué qui n'a pas réagi avec l'analyte de l'échantillon ou avec le réactif de capture pour le CMR, migre le long de la membrane puis est aspiré par absorbant. La figure 3 est une représentation schématique du principe de fonctionnement de l'appareil de lecture utilisé pour la méthode de l'invention. La figure 4 est un schéma d'assemblage de la bandelette d'immunochromatographie, en coupe transversale. Dimensions réelles des supports entrant dans la composition de la 20 bandelette (dimension 7cm 5mm) : 1= Backing (support adhésif) (70mm) 2= Membrane de nitrocellulose coatée (40mm) 3= Réservoir des conjugués (7mm) 4= Filtre (16mm) 5= Absorbant (18mm) Positionnement des recouvrements: Absorbant/membrane de nitrocellulose= AB = 4mm Réservoir des conjugués / membrane de nitrocellulose= CD = l mm 10 Filtre / réservoir des conjugués = DE = 6mm La figure 5 illustre un exemple de courbe standard pour la calibration. Les exemples ci-après illustrent la présente invention. Exemple 1 Procédé de coating ou d'immobilisation sur la membrane de nitrocellulose. Matériel Anticorps de capture anti-D-Dimères à immobiliser: monoclonal 2. 1.16 (Stago, France). Anticorps de capture CMR à immobiliser: Anticorps de chèvre anti-Ig de poule (Goat anti-Chicken antibody (Sigma, France)). Membrane de coating: Nitrocellulose SHF0900405 (Millipore, USA) 15 Tampon de coating: Tampon Phosphate 0.15 M pH 7,4. Matériel de distribution des solutions d'anticorps: Linomat IV (Camag, Suisse) ou Bio Jet Quanti 3000 (Bio dot, USA). Méthode Le coating (ou immobilisation) des anticorps et protéines de capture sur un support inerte est réalisé selon la méthode qui est brièvement rappelée. Sur la membrane de nitrocellulose prédécoupée en format utile pour le test (par exemple 40mm x 200mm), distribué à l'aide d'un appareil de dépôt de type Linomat ou Bio Jet Quanti les anticorps de capture à raison de 1 pg par test pour l'anticorps de capture Test 2.1.16 et 0,25 pg par test pour l'anticorps de capture CMR anti-Ig de poule produite par la chèvre. Après le dépôt des anticorps sur la membrane, sécher immédiatement dans une étuve ventilée pendant 30 minutes à 37 C. La membrane ainsi coatée avec les anticorps est gardée dans un sachet en aluminium fermé, à température ambiante (22-25 C). Exemple 2 Procédé de couplage anticorps particules d'or colloïdal. Matériel Anticorps monoclonal anti-D-Dimères: Fragments F(ab)'2 9C3 (Stago, France) . Anticorps de révélation CMR: Ig G poule (Sigma, France) 15 Acide Tétrachloroaurique (Sigma, France) Tri sodium citrate (Prolabo, France) PEG 20 000 (Prolabo, France) Tampon Borate 2 mM. Solution de K2CO3 0,2 M. Réservoir de conjugué: PT-R5 (MDI, Inde). Méthode 26 Préparation des Particules d'or colloïdal Les particules d'or colloïdal de taille 50 nm sont préparées selon lune légère modification de la méthode de Frens - Tinglu. Cette méthode est brièvement rappelée. Ajouter 2 ml de solution d'acide tétrachloroaurique 1 % à 198 ml d'eau ultra pure dans le ballon propre. Mettre un agitateur magnétique dans le ballon et chauffer à ébullition. Ajouter 275 pl de la solution de Tri sodium citrate 10 %, toujours sous agitation magnétique. Continuer à chauffer. Après l'apparition de la couleur violette, chauffer encore 10 minutes. Laisser refroidir à température ambiante (22-25 C). Garder les particules d'or colloïdal à 4 C et à l'abri de la lumière dans une bouteille en verre ambré. Les particules ainsi préparées sont caractérisées: mesure de la 15 longueur d'onde maximale et de la DO à cette longueur d'onde, mesure du pH. Préparation du conjugué Test anti-D-Dimères - Particules d'or colloïdal Cette préparation comprend plusieurs étapes. 20 a) Préparation de l'anticorps au couplage L'anticorps anti-D-Dimères 9C3 (Fragment F(ab) '2, Stago) est couplé aux particules d'or selon le protocole suivant. Diluer l'anticorps dans du Borate 2 mM pH 6,5 afin d'avoir une concentration finale de 1 mg/ml puis le dialyser contre ce tampon pendant 3 heures à température ambiante (22-25 C). Centrifuger la solution d'anticorps 15 minutes à 5 000 rpm à 4 C. Après avoir récupéré le surnageant contenant l'anticorps, vérifier sa concentration par mesure spectrophotométrique à 280 nm, avant le couplage. b) Préparation des particules d'or colloïdal pour le couplage Ajuster à 1 la DO 530 nm des particules d'or colloïdal par addition d'eau Milli-Q. Ajuster le pH de la solution de particules d'or colloïdal à 6,5 +1-0,1 en ajoutant du K2CO3 0,2 M. c) Couplage Mélanger la solution d'anticorps à 0, 2 mg/ml à la solution de particules d'or colloïdal, à raison d'un rapport de 1/10 (volume Anticorps/volume particules d'or), soit par exemple, 1,85 ml d'anticorps pour 18,5 ml de particules d'or colloïdal. Agiter pendant deux minutes à température ambiante (22-25 C). d) Stabilisation après couplage et récupération du conjugué Ajouter 1.2 ml de PEG 20 000 1 % et vortexer pendant 2 minutes température ambiante (22 C). Ajouter 2.4 ml de BSA 1 % et vortexer pendant 2 minutes à température ambiante (22-25 C). Centrifuger pendant 1 heure à 9 000 rpm, à 4 C. Eliminer le surnageant et récupérer le culot dans du tampon Tris 20 mM 5 pH 8,2, PEG 20 000, BSA 1 %, Azide de sodium 0,09 %. Filtrer ensuite le conjugué récupéré sur 0,2 pm. Le conjugué est caractérisé sur le plan spectral. Mesurer la max. et la DO max. Préparation du conjugué CMR IgG Poule Particules d'or colloïdal. La même démarche est suivie pour la préparation de ce conjugué CMR. La différence porte essentiellement sur la concentration de couplage et le pH de couplage: 0,1 mg /ml et pH 9,5. Exemple 3 Saturation du réservoir coniuqué et dépôt du coniuqué Immerger la feuille de PTR5 (MDI, Inde) dans la solution de saturation (PBS, Lait 1 % Sucrose 5 %), à raison de 1 ml de solution par test. Laisser 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après élimination de la solution de saturation, faire sécher la feuille de 20 réservoir pendant 3 h à 37 C dans une étuve ventilée. Le mélange des deux conjugués (Test et CMR) est déposé sur le réservoir conjugué saturé à raison de 8 pl par cm, soit 4 pl par test, la largeur du réservoir de conjugué étant de 0, 5 cm. Le dépôt est fait par le système Air Jet (Bio dot). Après le dépôt, le réservoir du conjugué est séché 1 heure à 37 C dans une étuve ventilée. Exemple 4 Cartouche de test de dosage du D-Dimère. Bandelette d'immunochromatographie. Les différents éléments constitutifs de la bandelette utilisés sont les suivants: - absorbant (17CHR, Whatman, USA) - filtre échantillon (GF 3596, Schleicher & Schüell, Allemagne), - membrane de nitrocellulose (SHF0900405, Millipore, USA) coatée, - réservoir (PT-R5, MDI, Inde) de conjugué déposé. Ils sont assemblés sur un support inerte rigide appelé "backing" (010 15 "white polyester" GL-187, G&L, USA). Le schéma d'assemblage est représenté sur la figure 4. Après assemblage, des bandelettes de 5 mm de large et 70 mm de long sont découpées avec un cutter (Bio dot, USA). Chaque bandelette est insérée dans un boîtier plastique dont le schéma est donné à type d'illustration sur la figure 6. Après insertion de la bandelette, le boîtier plastique est fermé et emballé dans un sachet en aluminium (Soplaril, France) avec un dessicant (BO54/Indice 1, Airsec, France) puis gardé à 2-8 C. Exemple 5 Dosaqe du D-Dimère selon la méthode de l'invention. Matériel Tampon de migration: PBS Caséine 0,5% Triton X100 0,1% Calibrant D-Dimères: DDimères préparés à partir de plasmas humains 5 (Stago, France). Lecteur de bandelettes: Lecteurs: Rapi-kit (77 Elektronika, Hongrie). Méthode Protocole opératoire Le protocole suivant est utilisé: É Laisser stabiliser les bandelettes, les tampons, les échantillons à 15 température ambiante (22-25 C). É Déposer 15 pl de calibrant D-Dimères ou d'échantillon de plasma sur le puits échantillon du boîtier plastique. É Ajouter 150 pl de tampon de migration. É Laisser 10 minutes à température ambiante É Lire le résultat avec un lecteur de bandelette d'immunochromatographie (77 Elektronika). Tous les essais sont faits en duplicate. Obtention et interprétation des résultats Dans un premier temps, la courbe standard est établie à partir du dosage du calibrant D-Dimères stabilisé après reconstitution à différentes concentrations de 0 à 4 000 ng/ml. Pour chaque dosage, les deux signaux Test et CMR sont mesurés par le lecteur et le ratio Test/CMR est calculé. En reportant ce ratio en fonction de la concentration en calibrant DDimères, la courbe standard est construite. Elle est valable pour un lot donné de cartouche de test. Le signal CMR est choisi par l'homme du métier dans la partie ascendante de la courbe signal/ complexe formé entre le réactif de capture de CMR et le CMR située autour de 4000 500. Dans un second temps, le ratio mesuré pour chaque dosage de plasma de concentration en D-Dimères inconnue est reporté sur cette courbe standard. Ainsi, il est possible de traduire le ratio mesuré en concentration d'analyte recherché. Les étapes de réalisation de la courbe de calibration sont les suivantes: a) reconstituer le calibrant approximativement (4500 mg/ml) avec de l'H2OMilli-Q, b) laisser le calibrant se stabiliser 30 minutes. Le calibrant est stable 4 heures à TA une fois qu'il est reconstitué, c) diluer le calibrant dans du tampon de migration de façon à obtenir les taux en DDimères suivants: - 150, 250, 500, 1000, 1500 et 2000 mg/ml, d) les tests sont réalisés en duplicate, e) déposer 30 ml d'échantillon dans le puits échantillon (pour le point 0 de la calibration, on dépose 30m1 de tampon de migration), f) ajouter 130m1 de tampon de migration (PBS 10mM Caséine 0,5% - Triton x100 0,1% - Azide de sodium 0,095%), g) attendre 10 minutes à température ambiante, h) lire les résultats sur lecteur, i) reporter les résultats sur les fiches de résultats, j) tracer la courbe de calibration [taux en D-Dimère = f (Radio Test / CMR)], k) doser les plasmas et le contrôle en suivant le protocole de a à i. Exemple de résultats pour la courbe standard D- Aire Ratio Moyenne Calibrant Dimères N Essai CMR Aire Test Test/CMR Ratio (ng/ml) Test/CMR 1 4665 116 0,025 1 0 2 4503 132 0,029 0,027 250 1 4392 431 0,098 0,098 2 2 4953 483 0,098 500 1 4529 1127 0,249 0,267 3 2 3744 1068 0,285 1000 1 4234 2368 0,559 0,573 4 2 4554 2669 0,586 2000 1 4992 5335 1,069 1,056 2 4551 4752 1,044 4000 1 5256 6866 1,306 1,376 6 2 4835 6994 1,447 Exemple de dosaqe de plasmas Nom N Essai Ratio Dosage Dosage Méthode Méthode de Plasma Aire CMR Aire Test TestICMR CMR comparaison (hg/mi) (hg/mi) 0105290294 1 3492 369 0,106 280 310 2 4963 606 0,122 0107020181 1 4821 5493 _ 1,139 2750 2600 2 4622 5844 1,264 0105100264 1 5009 5694 1,137 2325 2250 2 3223 3638 1,129 0105290418 1 5227 4610 0,882 1420 3370 2 4059 3147 0,775 0105050112 1 3930 5326 1,355 3400 > 4000 2 4299 5402 1,257 0106160147 1 4778 3848 0,805 1450 1490 2 5583 4844 0,868 0106190137 1 4646 3314 0,713 1300 1830 2 5010 3988 0,796 0107060177 1 4293 5252 1,223 3450 3850 2 3587 4963 1,384 0105240148 1 4299 2637 0,613 1125 1080 2 3805 2567 0,675 0105220259 1 5251 853 0,162 375 260 2 4166 796 0,191 0105250240 1 4462 2848 0,638 1100 780 2 5803 3633 0,626 0105250267 1 3921 1398 0,357 660 580 2 4754 1794 0,377 0105300196 1 3718 5575 1,499 3625 > 4000 2 4142 4839 1,168 0106070275 1 4575 3392 0,741 1250 1560 2 3551 2856 0,804 0106010160 1 5015 2687 0,536 1050 1130 2 4604 3039 0,660 9740 1 4296 4631 1,078 2400 2078 2 3930 4693 1,194 9432 1 4378 4963 1,134 2100 2405 2 4873 4982 1,022 _ 7355 1 3261 4574 1,403 >4000 3391 2 3216 4848 1,507 8199 1 4439 5950 1,340 _ 5534 >4000 2 3980 6230 1,565 9666 1 3370 5212 1,547 >4000 31093 2 4614 6539 1,417 8967 1 3845 565 0,147 380 412 2 4261 792 0,186 6616 1 3571 6111 1,711 >4000 9041 2 4996 7021 1,405 Les résultats de dosage obtenus avec la méthode de l'invention sont comparés par rapport à ceux obtenus avec une méthode de référence qui est basée sur l'ELISA, Asserachrom DDimère (Stago, France). Nous pouvons voir que les résultats obtenus avec la méthode de l'invention sont tout à fait très proches de ceux de la méthode de référence. II s'agit donc d'une méthode qui permet une détermination quantitative pouvant fournir des résultats équivalents à ceux de la méthode de référence. C'est l'objet de l'invention, le CMR, qui permet de pondérer les variations inhérentes à la technique de l'immunochromatographie (variations dues aux supports et à l'échantillon, etc.). II est possible d'avoir une estimation de cette pondération à partir des résultats obtenus. Effet de pondération du CMR Chaque dosage est fait en duplicate. L'effet de la pondération due au CMR est estimé à partir de l'écart absolu entre les deux valeurs obtenues pour chaque dosage. Pour un système de pondération théorique parfait, l'écart entre les deux valeurs d'un même dosage doit être égal à O. Calibrant Ecart Ecart ou Plasma Absolu Absolu Signal Ratio Test 0 16 0,004 250 52 0,001 500 59 0,036 1000 301 0,027 2000 583 0,025 4000 128 0,140 0105290294 237 _ 0107020181 351 0, 125 0105100264 2056 0,008 0105290418 1463 0,107 0105050112 76 0,099 0106160147 996_1 0,062 0106190137 674 0,083 0107060177 289 0,160 0105240148 70 0,061 0105220259 57 0,029 0105250240 785_ 0,012 0105250267 396 0,021 0105300196 736 0,331 0106070275 536 0,063 0106010160 352 0,124 9740 62_ 0,116 9432 19 0,111 7355 274 0,105 8199 280 0,225 9666 1327 0, 129 8967 227 0,039 6616 910 0,306 Moyenne 475,4 0,092 Avec ces résultats, on démontre que les écarts les plus faibles sont obtenus uniquement avec le système de l'invention. En revanche, en l'absence du CMR, donc en n'utilisant que le seul signal Test, le dosage est possible mais avec une plus grande incertitude sur sa mesure. L'effet de pondération est encore démontré avec les essais de répetabilité. Dans ce cas, c'est le même échantillon qui est dosé 21 fois selon la méthode de l'invention. ESSAI DE REPETABILITE Plasma 1 Plasma 1 Dosage ratio Test CMR DDimère Test/CMR (ng/ml) 2063 5699 0,36 650 2518 6103 0,41 725 2395 5822 0,41 725 1997 4451 0,45 775 2236 4637 0,48 770 1559 4314 0,36 650 2186 4955 0,44 760 2368 5799 0,41 725 1911 5310 0,36 650 1939 5508 0,35 630 1608 4523 0, 36 650 2067 5247 0,39 680 1989 5276 0,38 675 1442 4383 0,33 600 2312 5801 0,40 700 2411 5482 0,44 760 2228 5471 0,41 725 2392 5560 0, 43 750 1872 5652 0,33 600 2008 5351 0,38 675 2043 4718 0,43 750 :.. Moyenne 2073,52381 5241,04762 0,396 _ 696,429 Ecart type 292,10 540,45 0, 04 55,46 C.V. (%) 14,09 10,31 10,45 7,96 Essais Avec ces dosages faits en répetabilité, la méthode de l'invention permet de pondérer les variations. En effet, un gain de 4 à 6% de variation est observé, par comparaison avec le signal Test uniquement. 10 15 20 25 30 35 40 REVENDICATIONS, 1) Méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), la ou lesdites zones de capture spécifiques comprenant chacune un réactif de capture immobilisé sur le support, ledit réactif de capture formant une paire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec un réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) mettre en contact l'échantillon avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable et avec un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, c) déposer l'échantillon mis en présence du réactif de contrôle et du conjugué ou du mélange de conjugués sur la zone d'application du support, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, e) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, f) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR, dans laquelle la quantité de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR. 2) Méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode 15 comprenant les étapes consistant à : a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), ladite zone d'application comprenant un réservoir contenant un réactif de contrôle portant un marqueur détectable et un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) déposer l'échantillon sur la zone d'application du support, c) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, e) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR, dans laquelle la quantité de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR. 3) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le conjugué ou 20 mélange de conjugués, ainsi que le réactif de contrôle sont utilisés sous forme sèche. 4)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le réactif de contrôle capturé au niveau de la zone de CMR et les analytes 25 recherchés ne possèdent pas de réactivité croisée. 5)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que dans le cas d'un dosage réalisé sur un échantillon d'origine humaine, le CMR est choisi parmi des molécules d'origine animale. 6)Méthode selon la revendication 5 caractérisée en ce que le réactif de contrôle est choisi parmi des immunoglobulines d'origine animale et son réactif de capture est un anticorps dirigé contre l'espèce animale dudit réactif de contrôle. 7)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la paire de liaison formée par le réactif de contrôle CMR et son réactif de capture spécifique est de type antigène / anticorps. 8)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le marqueur utilisé sur le conjugué ou mélange de conjugué et celui utilisé sur le réactif de contrôle CMR absorbent dans la même longueur d'onde. 9)Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que le marqueur 15 utilisé sur le réactif de contrôle CMR sont identiques. 10)Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que le marqueur utilisé est de type particulaire. 11)Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le marqueur utilisé est de l'or colloïdal. 12)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la lecture des signaux tests et CMR est réalisée à l'aide d'un lecteur de 25 bandelettes. 13)Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que la mesure est réalisée par réflectance ou transmittance. 14)Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le rapport signal test/CMR (ratio) est comparé à une courbe standard de calibration établie à partir du dosage de l'analyte de référence à plusieurs concentrations et du dosage du CMR, chaque point de la courbe de calibration correspondant à un taux d'analyte directement proportionnel au ratio signal analyte / signal CMR. 15)Utilisation de la méthode selon la revendication 1 ou 2 pour le dosage du D-Dimère dans un échantillon sanguin. 16)Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le dosage est réalisé sur un échantillon de plasma. 17)Utilisation de la méthode selon la revendication 15 ou 16 dans le 15 diagnostic d'exclusion de la maladie thromboembolique veineuse. 18)Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de mesure quantitative par immunochromatographie d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide, comprenant: a. un support inerte sur lequel ont été immobilisés en des zones distinctes, différents types de composés dits de capture permettant (i) d'une part, s'agissant de chaque composé de capture de l'analyte, la capture d'un analyte déterminé de l'échantillon testé par une réaction de liaison spécifique entre ledit composé de capture et un analyte contenu dans l'échantillon, lorsque ledit analyte forme un partenaire de liaison spécifique avec un conjugué constitué par un réactif portant un marqueur détectable, et (ii) d'autre part, s'agissant du composé de capture du réactif de contrôle, la capture d'un réactif de contrôle portant un marqueur détectable; b. un conjugué ou un mélange de différents conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif capable de former une liaison spécifique avec un analyte déterminé, recherché dans un échantillon biologique, ledit conjugué portant en outre un marqueur détectable, ledit (lesdits) conjugué(s) étant contenu(s) dans un réservoir de conjugués saturé ; c. un réactif de contrôle (dit CMR: contrôle de mesure ratiométrique) portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du (des) conjugué(s) ; d. pour chaque analyte une courbe standard, spécifique dudit analyte, établie à partir du dosage à plusieurs concentrations de l'analyte de référence associé à un conjugué et du dosage du réactif de contrôle (CMR) à une concentration donnée dans les mêmes conditions, chaque point de la courbe correspondant au rapport du signal produit par l'analyte et capturé par le composé de capture de l'analyte, et du signal produit par le réactif de contrôle capturé par le composé de capture du réactif de contrôle; e. un ou plusieurs supports (backing) destinés à contenir les supports inertes pour la réalisation du test; f. le cas échéant, un boîtier pouvant contenir les supports inertes et leurs accessoires pour constituer une cartouche à placer dans le lecteur de signal, g. le cas échéant, des directives pour l'utilisation du kit aux fins de réalisation de la mesure de la quantité d'analyte ou des analytes. 19)Kit selon la revendication 18, dans lequel le support inerte est une 30 membrane de nitrocellulose. 20)Kit selon la revendication 18 ou 19, dans lequel les composés de capture sont des anticorps de capture, en particulier des anticorps monoclonaux, pour la capture de l'analyte et des anticorps polyclonaux pour la capture du CMR. 21)Kit selon la revendication 20, dans lequel l'anticorps de capture est immobilisé sur le support inerte à une concentration de 2 0, 1 mg/ml. 22)Kit selon l'une des revendications 18 à 21, dans lequel l'anticorps de 10 capture du CMR est une IgG liée à la biotine, à une concentration de 1 0,05 mg/ml. 23)Kit selon l'une quelconque des reventions 18 à 22, dans lequel les zones de dépôt des différents composés de capture sont séparées l'une de 15 l'autre d' environ 5 0,5 mm. 24)Kit selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, dans lequel l'analyte recherché est le D-Dimère, le composé de capture de l'analyte est un anticorps monoclonal anti-D-Dimère, et la courbe de calibration standard est établie pour des taux de D-Dimères variants de 0 à 4000 mg/ml et une concentration en contrôle CMR déterminée dans l'intervalle 1200-1600 mg/mi.