Brevet FR2882436A1 — publié le 20060825

Dispositif et procédé de Préparation extemporanée de suspensions calibrées d'hématies La présente invention concerne un dispositif pour préparer des dilutions de sang de manière facile et précise hors du laboratoire spécialisé, par du personnel non spécialisé en immuno-hématologie, afin d'exécuter en particulier des tests de contrôle de groupe sanguin avant une transfusion de sang, au lit du malade. Les techniques de groupage sanguin ont évolué au cours de ces dernières années en se miniaturisant et conséquemment en exigeant des volumes réduits et des concentrations de réactants (sérum-tests et globules rouges) plus précis que par le passé. Dans ce but, on utilise habituellement en laboratoire spécialisé, des pipettes de précision en remplacement des traditionnelles pipettes Pasteur (techniques en tube) ou même des agitateurs de verre (techniques sur plaque d'opaline). Curieusement, de nos jours, on continue à utiliser la technique rudimentaire d'agglutination sur plaque pour effectuer les contrôles ultimes de groupe sanguin au lit du malade, préalablement à la pose d'une transfusion de sang. Les réactions sur plaque nécessitent peu de matériel et donnent des résultats rapides à partir de sang total non centrifugé. La plaque d'opaline étant ici en l'occurrence le plus souvent une carte de bristol dite P.T.U. (contrôle Pré-Transfusionnel Ultime) sur laquelle sont desséchés des 20 sérum-tests anti-A et anti-B. (Diagast, Biotest, Sifin, etc.). Inversement, les conditions opératoires simplifiées en apparence sont difficilement standardisables et donc conduisent à des résultats peu reproductibles comme expliqué ci-dessous: Le sang du malade est prélevé par piqûre au doigt à l'aide d'un stérilet (ou lancette) suivi du dépôt d'une goutte* de sang sur le carton par compression du doigt. * la goutte étant un volume par définition non standardisé allant de la petite à la grosse goutte... Le sang de la poche du donneur est prélevé à partir d'un segment de tubulure et déposé sur la carte par simple pression sur la tubulure préalablement percée ou 30 coupée. Ces dépôts d'échantillons de sang, on le comprend aisément, sont dénués de toute calibration volumétrique et peuvent également couler, voire contaminer les zones réservées aux tests d'agglutination. Après avoir déposé du sang comme indiqué ci-dessus sur la carte P. T.U., 5 l'opérateur en charge du contrôle ultime doit procéder à : - la réhydratation des sérum-tests pré-desséchés sur la carte par addition de gouttes* de sérum physiologique et par frottement à l'aide d'un agitateur de la zone à réactif pour faciliter la solubilisation des sérum- tests. Un essuyage insuffisant peut conduire à la contamination croisée des réactifs sur la carte si l'on conserve le même agitateur. Le transfert d'échantillons de sang depuis les plages de recueil vers les plages à réaction et ce, à l'aide d'un bâtonnet ou souvent d'un fond de tube à hémolyse trempé dans le sang tel que déposé ci-dessus puis mélangé aux réactifs. On comprendra ici encore que ces opérations sont assez aléatoires et qu'aucune possibilité de maîtriser les quantités transférées ni la concentration des échantillons n'existe. L'ensemble de ces imperfections traduit une fiabilité toute relative, voire médiocre de cette technologie conduisant à des erreurs de transfusion (65 cas rapportés en 3 ans en France; Congrès National de Transfusion de St Etienne, juin 2003). A l'évidence, beaucoup de ces erreurs sont dues aux conditions opératoires mal maîtrisées et difficilement maîtrisables, à des interprétations erronées en raison soit d'un excès de sang déposé soit d'une quantité insuffisante de globules. Le but de la présente invention est de proposer un dispositif et une procédure de préparation de suspension d'hématies, facile à réaliser et qui conduit à des volumes et des concentrations maîtrisées pour pouvoir être utilisées dans des technologies impliquant une telle précision. La préparation des suspensions d'hématies du malade comme celles du donneur met en oeuvre: a- dispositif le dispositif selon l'invention comprend trois éléments: i. un flacon compte-gouttes pré-rempli d'une solution d'eau physiologique additionnée d'un anti-coagulant, (héparine par exemple). Il comporte une ouverture pouvant laisser passer la boucle de l'ôse. Il peut être doté d'un bouchon compte-gouttes intégré ou adaptable permettant la distribution de gouttes calibrées. ii. une ôse (inséminateur habituellement utilisé en bactériologie), encore appelée Micro.-Loop. Les ôses n'ont jamais été proposées à l'emploi pour des tests de groupage sanguin. Ce sont des bâtonnets en plastique (ou en métal) se terminant par une boucle dont le diamètre détermine la quantité de liquide qui est piégée par simple trempage dans le liquide à prélever. (Pour illustrer le mode de fonctionnement de l'ôse, on se remémorera les dispositifs utilisés par les enfants pour faire des bulles de savon). iii. une mini-cupule (ou casserole) jetable permettant de recueillir le sang du malade et / ou du donneur et d'y immerger la boucle de l'ôse. b- procédure i. Malade Il suffit donc de recueillir un échantillon de sang du malade en appliquant directement l'ôse sur le doigt à partir de la goutte qui perle après piqûre au stérilet. Cette quantité est calibrée car elle est fonction du diamètre de la boucle. On ouvre le flacon d'eau physiologique. On y trempe l'ôse et on la fait tourner entre les doigts pour faciliter la diffusion du sang dans le liquide de dilution. On met en place le bouchon compte-gouttes sur le flacon. On peut alors distribuer des gouttes calibrée de cette suspension dans chacune des cupules ou des plages du dispositif utilisé pour le groupage sanguin. ii. Poche de sang On recueille du sang sur la boucle de l'ôse à partir d'un segment de tubulure de la poche à transfuser, préalablement sectionnée ou percée à l'aide d'un dispositif adapté du commerce, ou on dépose du sang dans une cupule (casserole) prévue à cet effet puis on trempe I"ôse dans cette cupule pour en prélever la quantité requise. La suite de la manipulation est identique au point b.i. . En procédant de la sorte, on prépare des suspensions de globules rouges calibrées et on distribue des quantités de sang diluées calibrées dans le dispositif qui va dérouler le test. Toutes les insuffisances et imprécisions rapportées ci-dessus dans le cadre de l'utilisation de la carte PTU sont ainsi éliminées. Après déroulement et interprétation du test, les ôses, les flacons sont envoyés à l'incinérateur. Il n'y a donc plus de risque de contamination de l'opérateur comme celui-ci existe avec les cartes PTU où le sang est étalé sur la carte sans protection. Pour éviter des confusions entre le sang du malade et le sang du donneur, on peut valablement proposer des ôses de couleur et des flacons de couleur identique: blanc pour le malade et rouge pour le donneur (par exemple). Exemple d'utilisation de l'invention: La société SCIBIEX, propriétaire des brevets référencés en France sous le numéro FR 94 05123 a développé une technologie d'adhérence en phase solide humide qui peut être valablement utilisée dans le cadre des contrôles ultimes au lit du malade. Un dispositif BilOba à 6 cupules est proposé avec pour le malade et la poche une cupule anti-A, une anti-E3 et un témoin. Pour dérouler l'analyse, on doit disposer de suspensions d'hématies à 0, 2%. L'opérateur dispose donc de deux flacons compte-gouttes, prêts à l'emploi contenant 3,5 ml d'eau physiologique (ou tout autre liquide isotonique) additionné d'anticoagulant (héparine par exemple), de deux ôses de 10pl, et deux casseroles pour recueillir les sangs du malade et de la poche. On procède comme indiqué plus haut pour le recueil des échantillons de sang. En transportant 10p1 de sang de malade (à +1- 50% de globules rouges) dans 3,5 ml de diluant, on aboutit à une suspension finale de globules rouges à 0,2%, ce qui est exactement la concentration requise par la technologie BilOba. A l'aide du bouchon compte-gouttes positionné sur chaque flacon, on distribue dans chacune des cupules du dispositif BilOba 60pl de suspension globulaire, ce qui est requis par la technologie BilOba. On peut alors lancer la procédure analytique. La cupule témoin va confirmer que l'ensemble des opérations de préparation des sangs s'est déroulée de façon conforme et permettre de lire et d'interpréter les résultats des tests sans artefact. (ce qui n'est pas possible sur les cartes PTU puisqu'il n'y a aucune reproductibilité entre chaque plage de réaction d'agglutination). Si l'on souhaite adapter l'invention à une technique de gel-test en micro- colonnes qui utilise des suspensions d'hématies à 0,8%, il est suffisant d'adapter les volumes du dispositif comme, par exemple, utiliser des oses de 25pl et les diluer dans des flacons contenant 1,5m1 de solution. Applications industrielles: L'invention s'inscrit ici dans la préparation industrielle de trousses prêtes à l'emploi dans lesquelles l'utilisateur trouve l'ensemble des éléments lui permettant de réaliser le contrôle ultime de groupe sanguin au lit du malade, de façon simple et précise, et en plus hygiénique car on a, avec cette trousse, diminué les risques de contamination au contact du sang. La précision et la reproductibilité inhérentes à ce concept permettent de s'affranchir de causes d'erreurs qui sont source d'accidents graves par incompatibilité transfusionnelle. Revendications: 1- Dispositif pour réaliser extemporanément des suspensions d'hématies à concentration maîtrisée caractérisé en ce qu'il comporte un flacon comptegoutte contenant un volume déterminé de liquide de dilution et une Lise permettant le prélèvement d'un micro-volume calibré de sang. 2- Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte un orifice permettant d'y introduire l'extrémité d'une ôse chargée d'un micro-volume de sang piégé . 3- Dispositif selon la revendication 1 comportant un bouchon compte-gouttes permettant, après réalisation de la suspension diluée de sang, de distribuer des volumes précis. 4- Dispositif selon la revendication 1 où les flacons de dilution et les ôses peuvent être colorées de façon distincte afin de bien différentier l'origine des préparations de sang de donneur ou de malade. 5- Dispositif selon la revendication1 où le liquide de dilution peut contenir un anticoagulant pour éviter la formation de caillot. 6- Dispositif selon la revendication 1 qui comporte des cupules jetables (casseroles) indépendantes pour recueillir le sang du donneur et / ou du malade permettant le trempage de la boucle de l'ôse et donc le prélèvement calibré d'échantillon. 7- Procédé pour la préparation extemporanée de suspension calibrée d'hématies caractérisé en ce que l'on trempe la boucle d'une ôse dans du sang recueilli dans une micro-cupule (casserole) et transfère une petite quantité déterminée (10pl par exemple) de sang dans une quantité donnée de liquide de dilution, avec rotation entre les doigts de l'ose pour une bonne diffusion de l'échantillon prélevé dans le liquide de dilution. 8- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'on distribue des quantités calibrées de suspension d'hématies par adjonction d'un bouchon 2882436 7 compte-gouttes sur le flacon de dilution, après avoir effectué le transfert de sang et réalisé une dilution calibrée.