Brevet FR2873585A1 — publié le 20060203

L'invention a pour objet de nouvelles formulations galéniques permettant d'améliorer l'absorption intestinale de principes actifs administrés par voie orale, leur procédé de préparation ainsi que l'application d'excipients lipidiques associés à un ou des tensioactifs et un ou des cotensioactifs pour inhiber les pompes à efflux. De nombreux principes actifs sont faiblement absorbés après 10 administration orale. Un certain nombre de facteurs peuvent être responsables de cette mauvaise absorption: É Une faible solubilité dans le milieu gastro-intestinal 15 dans des zones où le pH peut varier entre 5 et 8; É Une dégradation chimique ou enzymatique du principe actif dans le tube digestif; É Un efflux du principe actif au niveau de l'épithélium intestinal par une pompe telle que la P-glycoprotéine. 20 Afin de surmonter les problèmes d'absorption, de nombreuses approches de formulations ont été proposées, basées soit sur la modification de la physiologie de la voie gastro-intestinale, soit sur celle de l'état du médicament lui-même à l'intérieur du tube digestif. En général, l'augmentation de l'absorption par une modification temporaire des caractéristiques du tractus gastro-intestinal implique: É soit l'utilisation de promoteurs d'absorption qui agissent via une voie paracellulaire en ouvrant une jonction étroite (Liu, D.Z. et al., J. Pharm. Sci. 1999, 88 (11) . 1161-1168; 1169-1174; Thanou, M. et al., J. Pharm. Sci. 2000, 90 (1) : 38-46), É soit des additifs qui inhibent les estérases dans le tractus gastro- intestinal, et ainsi augmentent la stabilité de la prodrogue (Van Gelder, J et al., Pharm. Res. 1999, 16 (7): 1035-1040; Van Gelder, et a1., Drug Metab Dispo. 2000, 28 (12): 13941396) , É soit des additifs qui modulent le transport des composés actifs médié par la P-glycoprotéine (Chang, T. et al., Clin Pharmacol Ther. 1996, 59 (3): 297-303; Zhang, Y. et al., Drug Metab Dispo. 1998, 26 (4): 360-366; Soldner, A. et al., Pharm. Res. 1999, 16 (4) : 478-485). Une stratégie alternative est de modifier la disposition du 10 principe actif à l'intérieur du tractus gastro-intestinal. Il suffit. É d'augmenter la stabilité des composés peu solubles dans l'eau par des méthodes variées qui peuvent être: - l'utilisation d'excipients solubilisants (Saha, P. 15 et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50: 403-411), - l'obtention de formulations: ^ de dispersion solide (Perng, C-Y et al., Int. J. Pharm. 1998, 176: 31- 38; Chowdary, K.P.R et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 2000, 26 (11): 1207- 1211), ^ de microémulsion (Kommuru, T.R et al., Int. J. Pharm. 2001, 212(2): 233- 246; Pouton, C.V et al., Eur. J. Pharm. Sci. 2000, 11: S93-S98; Gershanik, T. et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50(1): 179-188), ^ de complexation dans la cyclodextrine (Lin, HS et al., J. Clin. Pharm. Ther. 2000, 25(4): 265-269; Uekama, K et al., J. Pharm. Sci. 1983, 72(11) : 1338-1341) É de réduire la taille des particules (Farinha, A. et al., 30 Drug Dev. Ind. Pharm. 2000, 26(5): 567-570) , É de rediriger les médicaments vers des sites spécifiques du tractus gastro-intestinal afin d'échapper à la protéolyse de ces médicaments par les estérases intestinales (Bai, JP et 35 al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1995, 12 (4): 339-371). Il existe encore un besoin de trouver de nouvelles méthodes permettant d'améliorer l'absorption intestinale de médicaments ayant reçu l'autorisation de mise sur le marché ou en cours de développement. En particulier, de nombreux médicaments présentent une faible biodisponibilité orale parce qu'ils sont substrats de pompes telles la Pglycoprotéine. Pour cette classe de composés, l'efflux par ces pompes constitue l'étape limitante du processus d'absorption. Selon la présente invention, l'absorption de tels principes actifs est significativement améliorée par l'application de certains mélanges autoémulsionnants d'excipients permettant d'inhiber les pompes à efflux. De nouvelles compositions pharmaceutiques comprenant ces mélanges ont été mises en uvre selon l'invention. Les systèmes auto-émulsionnants sont des solutions d'huiles et de tensioactifs qui forment des émulsions ou des micro- émulsions huile dans eau, quand elles sont mises en présence d'un milieu aqueux. Lorsqu'on incorpore des mélanges d'excipients lipidiques et de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs dans des compositions pharmaceutiques renfermant des principes actifs substrats de pompes à efflux, on obtient une formation d'émulsions ou de micro-émulsions lorsque ces mélanges sont en contact avec un milieu aqueux tel que le fluide gastro-intestinal, et une inhibition des pompes à efflux qui permet d'augmenter l'absorption intestinale du principe actif. L'invention s'applique donc tout particulièrement aux principes actifs connus pour être faiblement absorbés après administration orale et pour être substrats de pompes à efflux. Cette inhibition entraîne en plus, le cas échéant, une 35 augmentation de la solubilité et/ou la protection du principe actif contre la dégradation chimique dans le tube digestif. Le résultat de la mise en uvre selon l'invention est une augmentation notable de l'absorption intestinale. Le type de formulation selon l'invention permet aussi de diminuer les doses par rapport à une formulation classique pour une même efficacité thérapeutique, voire une même exposition plasmatique, ce qui réduit le coût. Les formulations selon l'invention peuvent également être appliquées à des principes actifs connus et commercialisés, permettant ainsi de créer de nouvelles formes pharmaceutiques qui présentent une absorption intestinale accrue ou d'étendre un produit classiquement administré par voie parentérale (telle que, par exemple, intraveineuse ou sous cutanée) à une application du même principe actif par voie orale. Le mécanisme de promotion du passage intestinal est dû à une interaction de l'excipient selon l'invention avec le système biologique plutôt qu'à une augmentation de la solubilité. En effet, comme le montre la partie expérimentale telle que décrite plus bas, l'absorption est de moins de 1% quand le principe actif est préparé dans le DMSO par exemple, alors même que c'est le solvant dans lequel la solubilité est la plus élevée. Ce mécanisme n'a jamais été mis en évidence au regard de l'art antérieur. Il permet d'envisager de nombreuses possibilités d'amélioration de la biodisponibilité orale de principes actifs dont l'absorption est limitée par l'action d'une pompe à efflux comme la P-glycoprotéine. Le mécanisme de promotion d'absorption intestinale des systèmes selon l'invention implique donc l'inhibition d'une pompe à efflux comme la Pglycoprotéine. Le cas échéant, il implique aussi l'augmentation de la solubilité aux pH physiologiques de l'intestin et/ou la protection contre la dégradation par les enzymes digestives. L'invention a donc pour objet l'application de mélanges autoémulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs, tels que définis plus bas, afin d'inhiber les pompes à efflux. Comme le montrent les tests expérimentaux décrits plus bas, les excipients lipidiques associés à un ou des tensioactifs et, le cas échéant, un ou des-co-tensioactifs dans un mélange auto-émulsionnant agissent sur un ou plusieurs facteurs responsables de la mauvaise absorption. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention permettent ainsi d'améliorer l'absorption intestinale de principes actifs présentant un ou plusieurs des paramètres suivant s'opposant à une absorption optimale: É faible passage trans-épithélial dans le sens de l'absorption sous l'action de pompes à efflux, É faible solubilité aux pH physiologiques au niveau intestinal, É dégradation chimique ou enzymatique dans le tube digestif. L'invention a pour objet l'application de mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de cotensioactifs, pour la préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale renfermant un ou des principes actifs, avec pour effet d'augmenter l'absorption intestinale des dits principes actifs par un mécanisme impliquant l'inhibition de pompes à efflux. L'invention a aussi pour objet l'application de mélanges autoémulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs, pour la préparation de compositions pharmaceutiques renfermant un ou des principes actifs, avec pour effet d'augmenter l'absorption intestinale des dits principes actifs par un mécanisme impliquant l'inhibition de pompes à efflux et l'augmentation de la solubilité du principe actif. L'invention a aussi pour objet l'application de mélanges autoémulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs, pour la préparation de compositions pharmaceutiques renfermant un ou des principes actifs, avec pour effet d'augmenter l'absorption intestinale des dits principes actifs par un mécanisme impliquant l'inhibition de pompes à efflux et l'augmentation de la stabilité du principe actif dans le tractus gastro-intestinal. L'invention a encore pour objet l'application de mélanges autoémulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs, pour la préparation de compositions pharmaceutiques renfermant un ou des principes actifs, avec pour effet d'augmenter l'absorption intestinale des dits principes actifs par un mécanisme impliquant l'inhibition de pompes à efflux, l'augmentation de la solubilité du principe actif et l'augmentation de la stabilité du principe actif dans le tractus gastro- intestinal. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co- tensioactifs, afin d'inhiber l'activité de la Pglycoprotéine. Selon l'invention, le principe actif est notamment pris en charge par la P-glycoprotéine et peut être soluble ou pas soluble dans le tractus gastro-intestinal, ou stable ou non stable dans le tractus gastrointestinal Le choix des excipients et le choix des rapports entre ces différents excipients s'effectue de la manière suivante: un de ces excipients est un excipient de nature lipidique, et un autre excipient est un tensioactif, et/ou un autre excipient est un co-tensioactif, et ces excipients sont ajoutés dans un rapport tel que, pour un principe actif donné, le mélange forme un système auto-émulsionnant. Les mélanges selon l'invention peuvent comprendre en outre 5 un dissolvant tel que le glycofurol ou le DMSO. Par système auto-émulsionnant, on entend une solution liquide ou solide formée d'un excipient lipidique, et éventuellement un tensioactif qui peut être lipophile (c'est-à-dire dont la balance hydrophile-lipophile [HLB] est supérieure à 10) ou hydrophile (HLB L'invention a de préférence pour objet des mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de cotensioactifs qui forment des micro-émulsions huile dans eau lorsqu'ils sont ajoutés dans un milieu aqueux, directement ou en dehors du milieu physiologique. Selon l'invention, les particules formées après interaction avec un milieu aqueux, et en particulier le liquide duodénal., ont une taille inférieure à 100 nm. Par excipient lipidique, on entend notamment les glycérides (mono-, di- et tri-glycérides), les acides gras et leurs dérivés, les phospholipides, les glycolipides et les stérols. 30 Selon l'invention, les excipients lipidiques sont choisis parmi les glycérides, les acides gras et leurs dérivés, les phospholipides, les glycolipides et les stérols. Par excipient lipidique on entend selon l'invention de préférence. É linoléate de glycérol tel que Maisine 35-1 (Gattefossé), É monooléate de glycérol tel que Peceol (Gattefossé), É glycéryl laurate tel que Gélucire 44/14 (macrogol-32) (Gattefossé), É oléate/linoléate de glycérol tel que Olicine , É polyglycéryl-3 oléate tel que plurol oléique (Gattefossé), É huile de soja, É triglycérides d'acide caprique/caprylique/laurique tel que Captex 350 (Abitec corporation), et É l'acide oléique. 10 Par tensioactif, on entend une substance amphiphile comprenant deux parties, l'une à caractère hydrophobe, l'autre à caractère hydrophile, et qui agit à une interface eau/lipide ou eau/air en abaissant la tension interfaciale, même à faible concentration. Le tensioactif est lipophile si HLB est supérieure à 10, hydrophile si elle est inférieure à 10. Selon l'invention, le tensioactif peut en particulier être 20 hydrophile. Selon l'invention, le tensioactif peut être lipophile le cas échéant. Selon l'invention, par tensioactif on entend de préférence É glycéryl caprylate/caprate tel que Labrasol (macrogol-8) (Gattefossé), É triricinoléate de polyoxyéthylène glycérol tel que Cremophor EL (BASF), et É oléate de sorbitane polyoxyéthylène tel que Tween 80. Par co-tensioactif, on entend une substance qui a les propriétés d'un tensioactif, et qui agit en présence d'un premier tensioactif en stabilisant le mélange formé par ce tensioactif et un excipient lipidique. 2873585 9 Par co-tensioactif on entend de préférence, selon l'invention: É éther monoéthylique du diéthylène glycol tel que Transcutol (Gattefossé), É monocaprylate de propylène glycol tel que Capryol 90' (Gattefossé), É éthanol absolu, et É macrogol 800 à 300. Selon l'invention, les mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs sont les suivants: É Système 1: Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol / DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 50 et 60, 15 et 20, 15 et 20, et 5 et 15, ou É Système 2: Gélucire 44/14 / Plurol oléique / 20 Transcutol / Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 50 et 65, 15 et 25, 15 et 25, et 5 et 15, É Système 3: Gélucire 44/14 / Labrasol /DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 65 et 25 85, 15 et 25, et 5 et 15, É Système 4: Gélucire 44/14 / Labrasol /Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 65 et 85, 15 et 25, et 5 et 15, É Système 5: Maisine 35-1 / Cremophor EL /DMSO, dans 30 des proportions pouvant respectivement varier entre 40 et 50, 40 et 50, et 5 et 15, É Système 6: Maisine 35-1 / Cremophor EL /Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 40 et 50, 40 et 50, et 5 et 15, É Système 7: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL /Ethanol/DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15, É Système 8: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL /Ethanol/Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15, É Système 9: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol /DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15, É Système 10: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol / Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15. Selon l'invention, les mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs sont en particulier les suivants: É Système 1: Gélucire 44/14 / Labrasol /DMSO dans des proportions 72/18/10; É Système 2: Gélucire 44/14 / Labrasol /Glycofurol dans des proportions 72/18/10; É Système 3: Gélucire 44/14 / Labrasol /DMSO dans 30 des proportions 80/20/10; É Système 4: Gélucire 44/14 / Labrasol /Glycofurol dans des proportions 80/20/10; Système 5: Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol / DMSO dans des proportions 54/18/18/10; É Système 6: Gélucire 44/14 / Plurol oléique'/ Transcutol /Glycofurol dans des proportions 54/18/18/10; É Système 7: Maisine 35-1 / Cremophor EL / DMSO dans des proportions 45/45/10; É Système 8: Maisine 35-1 / Cremophor EL / Glycofurol 10 dans des proportions 45/45/10; É Système 9: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL /Ethanol/ DMSO dans des proportions 27/27/28,8/7,2/10; É Système 10: Huile de soja / Maisine 35-1 / 15 Cremophor EL /Ethanol/ Glycofurol dans des proportions 27/27/28,8/7,2/10; É Système 11: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol /DMSO dans des proportions 27/27/28,8/7,2/10; É Système 12: Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol / Glycofurol: 27/27/28,8/7,2/10; É Système 13: Huile de soja/ Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol /DMSO dans des proportions 25 27,2/27,2/29,2/7,4/9; É Système 14: Huile de soja/ Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol /Glycofurol dans des proportions 27,2/27,2/29,2/7,4/9; É Système 15: Gélucire 44/14 / Plurol oléique / 30 Transcutol /Glycofurol dans des proportions 55/18/18/9; É Système 16: Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol / DMSO dans des proportions 55/18/18/9. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques renfermant un principe actif et un mélange auto-émulsionnant d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs tels que définis plus haut. A titre d'exemple expérimentaux, ces systèmes ont été appliqués à des principes actifs tels que la molécule A (ester éthylique d'acide (2S)-2-(Naphtalene-1-sulfonylamino)-3-(4-(2-(1,4,5,6tetrahydropyrimidin-2-ylcarbamoyl)-ethyl)-benzoylamino)-propionique) ou la molécule B (acide (2S)-2-Benzyloxycarbonylamino-3-(4-(3-(1,4,5,6tetrahydropyrimidin- 2-ylcarbamoyl)propyloxy)phenyl)propionique), qui sont des composés de la famille des "Osteoclast Adhesion Receptor Antagonists" (O.A.R.A.) développés dans le cadre de la prévention et du traitement de l'ostéoporose tels que définis dans les demandes de brevets internationales W099/32457 et W099/37621. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont préparées de la manière suivante: 1. Ajout de l'excipient lipidique, du tensioactif et, le cas échéant, du co-tensioactif. Les excipients semi-solides nécessitent un préchauffage, 2. Mélange par agitation jusqu'à obtention d'une solution homogène, 3. Dissolution du principe actif dans un dissolvant tel que le DMSO, le glycofurol ou l'un des excipients entrant dans la composition des émulsions et des microémulsions, 4. Ajout du principe actif dissout au mélange d'excipient lipidique, de tensioactif et, le cas échéant, de co-tensioactif, 5. Le cas échéant chauffage ou sonication jusqu'à obtention d'une solution homogène. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent 5 se présenter sous différentes formes selon le cas: É En gélule dure remplie du mélange d'excipients semipâteux, pâteux ou liquide É En capsule molle remplie du mélange d'excipients semi-10 pâteux, pâteux ou liquide É En ampoule scellée remplie du mélange d'excipients liquide É En récipient type bouteille de sirop remplie du mélange d'excipients liquide 15 Outre leur activité permettant d'augmenter l'absorption intestinale, d'autres avantages peuvent être soulignés. Les formulations selon l'invention permettent d'augmenter la perméabilité apparente d'un principe actif dans le sens AB (du côté apical vers le côté basolatéral) et de diminuer celle dans le sens BA (du côté basolatéral vers le côté apical) par rapport à une formulation contrôle (Figure 1, annexe 1). Les formulations selon l'invention permettent également d'augmenter l'accumulation intracellulaire d'un principe actif par rapport à une formulation contrôle (Figure 4, annexe 1). Enfin elles permettent de stabiliser un principe actif dans le liquide intestinal (par exemple duodénal) en protégeant le principe actif contre l'hydrolyse enzymatique (Figure 5, annexe 1). Par ailleurs, certains excipients selon l'invention peuvent être utilisés en injection pour inhiber la P-glycoprotéine de cellules cancéreuses pour augmenter la pénétration cellulaire du principe actif dans les cellules tumorale. L'invention a donc pour objet l'application de mélanges autoémulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs pour la préparation d'une solution injectable permettant d'inhiber la P-glycoprotéine de cellules cancéreuses et d'augmenter la pénétration cellulaire du principe actif dans les cellules tumorales. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemples d'application 1) Mode opératoire 1.1) Molécules et formulations étudiées a) Molécule A: Formulations pour l'étude in vitro Les formulations de molécule A pour l'étude in vitro chez le rat sont indiquées dans le Tableau 1. Tableau 1: Formulations de molécule A utilisées dans 25 l'étude in vitro. Ingrédients utilisés à 1% Formulation Composition dans les solutions donneuses (HBSS/HEPES tampon) DMSO DMSO Glycofurol Glycofurol macrogol 300 macrogol Gelucire 44/14/ A 72/18/10 Labrasol /DMSO Gélucire 44/14 / Plurol B 54/18/18/10 2873585 15 oléique / Transcutol /DMSO Gélucire 44/14 / Plurol C 54/18/18/10 oléique / Transcutol /Glycofurol Maisine 35-1 / Cremophor D 45/45/10 EL /DMSO Huile de soja / Maisine E 27/27/28,8/ 35-1 / Cremophor 7,2/10 EL /Ethanol/DMSO Huile de Soja / Maisine F 27/27/28,8/ 35-1 / Cremophor EL / 7,2/10 Transcutol /DMSO Huile de soja/ Maisine 35- G 27/27/28,8/ 1 / Cremophor EL / 7,2/10 Transcutol / Glycofurol b) Molécule A: Formulation pour l'étude in vivo Les formulations de molécule A pour l'étude in vivo chez le 5 rat sont indiquées dans le Tableau 2. Tableau 2: Formulations de molécule A pour l'étude in vivo chez le rat. Formulations Ingrédients Composition Glyc/W Glycofurol/Eau 50/50 PEG macrogol 300/Eau 30/70 Soy/Glyc Huile de soja/ Maisine 35- 27.2/27.2/2 1 / Cremophor EL / 9.2/7.4/9 Transcutol /Glycofurol Gélu/Glyc Gélucire 44/14 / Plurol 55/18/18/9 oléique / Transcutol /Glycofurol Gélu/DMSO Gélucire 44/14 / Plurol 55/18/18/9 oléique / Transcutol/DMSO c) Souches Caco-2 Les souches Caco-2 utilisées dans les tests sont des cellules Caco-2 clone TC7. Cette lignée est utilisée pour optimiser les formulations. et pour investiguer le ou les mécanismes d'absorption afin d'identifier le paramètre limitant le passage intestinal de principes actifs. Ces cellules ont été cultivées et entretenues suivant les 10 méthodes connues de l'homme du métier. 1.2) Détermination de la solubilité de la molécule A dans différents solvants La solubilité de la molécule A est déterminée dans l'eau purifiée et dans différents tampons présentant des valeurs de pH s'échelonnant entre 1,2 et 8 (1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 et 8,0) Pour 1 ml de solution aqueuse, on ajoute 10 mg de molécule 20 A. Les suspensions sont agitées pendant 24 heures à 25 C, puis centrifugées. La quantité de molécule A dans le surnageant est déterminée par HPLC, et le pH du surnageant est vérifié. La solubilité apparente de la molécule A dans différentes huiles, tensioactifs, co-tensioactifs, DMSO et glycofurol a également été déterminée. A 1 g de chaque véhicule on ajoute de petites quantités de molécule A. La solubilisation est effectuée par sonication à 25 C. On vérifie la dissolution visuellement et par microscopie optique. La solubilité est estimée au mg près. 1.3) Préparation des formulations testées dans les modèles Caco-2 et chez le rat: a) Formulations utilisées pour étudier le mécanisme de 5 perméabilité de la molécule A sur les modèles cellulaires Caco-2/TC7 Afin d'évaluer l'échelle de perméabilité de la molécule A dissout dans le DMSO en fonction de la concentration, deux solutions sont préparées. La première, dans laquelle la molécule A marquée au 14C sera ajoutée, est à 4,3 x 10-2 M; la seconde, dans laquelle on ajoutera le 14C-mannitol, à 5 x 10-2 M. Ces solutions de DMSO sont ensuite diluées dans un tampon 25mM HBSS/HEPES (pH 7,4), dans lequel 0,4 Ci/ml de 14C-mannitol ou 0,4 Ci/ml de molécule A marquée au 14C a été ajouté (correspondant à 7 M), de façon à obtenir des concentrations finales de molécule A de 7, 10, 50 ou 100 M. La concentration finale de DMSO dans chaque solution donneuse est ajustée à 0,5%. Des solutions donneuses contenant 0,5% DMSO, mais ne contenant pas de composé, sont utilisées comme contrôles. Pour analyser le rôle de la P-glycoprotéine dans le mécanisme du transport de la molécule A, des solutions donneuses contenant 10 M de molécule A et 100 M de verapamil, nicardipine, ou progestérone sont préparées et la perméabilité de la molécule A est évaluée et comparée à celle obtenue sans le modulateur de la P-glycoprotéine. b) Effets des solvants utilisés sur la perméabilité dans un modèle de cellule Caco-2/TC7 Pour étudier l'effet du glycofurol et du macrogol 300 sur la perméabilité de la molécule A: É La molécule A est dissoute dans le glycofurol afin d'obtenir des solutions de 4,3 x 10-3 M ou 5 x 10-3 M. Celles-ci sont ensuite diluées dans le tampon 2873585 18 HBSS/HEPES, dans lequel 0,4 Ci/ml de 14C- mannitol ou 0,4 Ci/ml de molécule A marquée au 14C a été ajouté (voir plus haut), pour obtenir des solutions donneuses dont la concentration finale en molécule A est de 50 M et le contenu final de glycofurol de 1%. É La molécule A est dissoute dans le macrogol 300 afin d'obtenir des solutions de 0,3 x 10-3 M ou 10-3 M. Elles sont ensuite diluées dans un tampon HBSS/HEPES, dans lequel 0,4 Ci/ml de 14C-mannitol ou 0,4 Ci/ml de molécule A marquée au 14C a été ajouté (voir plus haut), pour obtenir des solutions donneuses dont la concentration finale en molécule A est de 50 /1M et le contenu final de macrogol 300 dans la solution donneuse de 5%. É La solution donneuse témoin contenant 0,5% DMSO et 5 x 10-5 M de molécule A est préparée comme indiqué plus haut. c) Effet des formulations sur la perméabilité de la 20 molécule A dans un modèle de cellule Caco-2/TC7 Les différentes formulations sont préparées par mélange, dans les conditions appropriées, des excipients lipidiques, des tensioactifs et des co-tensioactifs, suivi d'une agitation violente pendant 30 secondes (Tableau 1). Quand des excipients semi-solides sont utilisés, ils sont au préalable dissous au bain-marie à 50 C. Avant toute formulation, la molécule A est dissoute dans le DMSO ou le glycofurol, pour obtenir dans chaque solvant des solutions de concentrations de 4,3 x 10-3 M ou 5 x 10-3 M. On ajoute 40 Ci/ml de molécule A marquée au 14C dans les solutions à 4,3 x 10-3 M, de façon à ce que la concentration théorique en molécule A soit de 5 x 10-3 M. Les solutions à 5 x 10-3 M sont additionnées de 40 Ci/ml de 14C-mannitol. 2873585 19 Chacune des solutions ainsi obtenues est ensuite diluée dans les mélanges considérés d'excipients lipidiques et de tensioactifs et, le cas échéant, de co-tensioactifs, donnant des formulations contenant le solvant (DMSO ou glycofurol) à 10% et la molécule A à 5 x 10-4 M. Ces formulations sont diluées dans du tampon 25 mM HBSS/HEPES pour obtenir les solutions donneuses, dont la concentration finale en molécule A est 5 x 10-5 M, qui contiennent 0,4 Ci/ml de molécule A marquée au ' C ou bien 0,4 Ci/ml de 14C-mannitol, et dont la proportion d'excipient lipidique est inférieure à 1%. Afin d'évaluer les effets des formulations, côté apical, sur les transports du mannitol et de la molécule A dans le sens BA, des solutions placebo contenant les formulations mais pas la molécule A ont aussi été préparées. d) Formulations étudiées in-vivo chez le rat 1) Administration intraveineuse La molécule A marquée au 14C est injectée dans un mélange 50/50 (v/v) de glycofurol/eau à une concentration de 1,5 25 mg/ml (145,9 Ci/ml), ce qui correspond à la dose pharmacologique. Le glycofurol a été choisi comme le solvant permettant l'administration de la quantité désirée de principe actif, dans la limite du volume maximal administrable par intraveineuse chez le rat (1 ml/kg). 20 2) Administration orale Les formulations sont préparées comme indiqué dans le Tableau 2. La molécule A marquée au 14C (220 Ci) est d'abord dissoute dans le DMSO ou le glycofurol pour obtenir des solutions à une concentration finale de 5 mg/ml (488,9 Ci/ml). Celles-ci sont ensuite ajoutées dans des mélanges lipidiques pour obtenir les formulations décrites dans le Tableau 2, la concentration finale en molécule A marquée au 14C étant 0,45 mg/ml. Une solution témoin est préparée par dissolution de la molécule A marquée au 14C (220 Ci) dans le macrogol 300 à une concentration finale de 0,5 mg/ml (44 Ci/ml). Avant toute administration orale chez le rat, les formulations sont diluées dans deux volumes d'eau. La solution témoin de macrogol 300 est diluée dans l'eau de façon à obtenir une concentration finale de 0,15 mg/ml (13,2 Ci/ml). Les formulations et le contrôle ainsi préparés permettent d'administrer au rat 1,5 mg/kg dans un volume inférieur à 10 ml/kg. 1.4) Etude du transport a) Les cellules et l'appareillage utilisé Dans les études de transport, des cellules au passage 12 à 32 sont déposées à une densité de 5 x 105 cellules/filtre sur des filtres de polycarbonate de 12 mm de diamètre, dans des boites multi-puits (Transwell , Costar). Les cellules sont incubées à 37 C pendant 21 à 28 jours, en milieu complet supplémenté avec de la pénicilline (100 IU/ml) et de la streptomycine (100 g/ml)(Invitrogen). Un ensemble de 6 puits est utilisé pour déterminer les valeurs de perméabilité de la molécule A (dans la direction 30 AB ou BA) pour chaque solution donnée. b) Les formulations et les solutions utilisées Quand le transport AB est étudié, le milieu basolatéral est 35 remplacé par du tampon frais HBSS/HEPES (1,5 ml) et le milieu apical (0,5 ml) par la solution donneuse. Quand le transport BA est étudié, et à l'exception des formulations lipidiques décrites dans le Tableau 1, le milieu apical est remplacé par du tampon frais HBSS/HEPES, le milieu basolatéral par la solution donneuse. Pour étudier l'effet des formulations lipidiques sur la perméabilité de la molécule A dans la direction BA, une formulation témoin de molécule A à 50 pM dans un tampon HBSS/HEPES contenant 0,5% de DMSO est ajoutée du côté basolatéral, et une solution contrôle est ajoutée du côté apical. c) Prélèvement et traitement des échantillons A T = 0, 100 gl de la solution radioactive sont prélevés pour quantifier la radioactivité initiale. Toutes les 30 min pendant 120 min, un échantillon de 500 pl du côté basolatéral ou de 250 gl du côté apical est prélevé pour l'étude du transport AB et BA respectivement. Les échantillons sont immédiatement remplacés par du tampon frais HBSS/HEPES ou par la formulation placebo (dans le cas d'expériences avec des formulations lipidiques dans la direction BA). Les échantillons sont mesurés par comptage de la scintillation 5, après addition d'un liquide de scintillation, Aqueous Counting Scintillant (ACS, Amersham Buckinghamshire, UK), avec correction de quenching en mode de simple marquage (LKB Wallac 1214, Broma, Sweden). Pour les études du transport dans la direction AB avec 7 pM et 100 pM de molécule A, la quantification est vérifiée par LC/MS/MS. d) Vérification de l'intégrité membranaire Avant chaque expérience de transport, la confluence des Caco-2 est vérifiée en mesurant la valeur de la résistance électrique trans-épithéliale à l'aide d'un endhom (WPI) muni d'électrodes planaires. Cette valeur est de l'ordre de 360 S2.cm2 pour des monocouches de cellules Caco-2 confluentes. On n'utilise pour les expériences de transport que des Caco-2 confluentes et différenciées. A la fin de chaque étude de transport, l'intégrité de la monocouche est vérifiée de nouveau en mesurant la valeur de la résistance électrique trans-épithéliale. On considère que l'intégrité membranaire de la monocouche de Caca-2 est compromise quand la valeur de la résistance électrique transépithéliale décroît de plus de 25 % et que la perméabilité apparente au mannitol est supérieure à 10-6 cm/s. e) Calcul du flux. Dans des conditions d'équilibre, la valeur des flux 15 unidirectionnels dans la direction AB et la direction BA est calculée à l'aide de l'équation suivante: J = dQ/dt x 1/A dQ représente la quantité de principe actif (coups/min) accumulée dans le compartiment receveur durant l'intervalle de temps dt, et.A est la surface exposée de la monocouche (1,13 cm2) . f) Calcul de la perméabilité apparente. La perméabilité apparente (PaPi) du manitol ou de la molécule A est obtenue à partir du flux unidirectionnel en appliquant l'équation suivante: Papp = J/Ci Ci est le nombre de coups/ml initial dans le milieu donneur. 35 g) Calcul de la fraction extrapolée absorbée. La fraction absorbée extrapolée est calculée suivant l'équation (Pontier et al., J. Pharm. Sci. 2001 90: 1608-1619) : Fa = 0 100 +100 -24,064 La fraction absorbée extrapolée est calculée pour les études de transport dans la direction AB, en faisant l'hypothèse que ni la solubilité, ni le taux de dissolution, ni le mécanisme d'efflux, ni la stabilité dans le tractus gastro-intestinal ne forment de barrière pour l'absorption orale. 1.5) Etude de la concentration intracellulaire: a) Détermination du flux et de l'accumulation intracellulaire L'accumulation intracellulaire de la molécule A est évaluée en parallèle avec des études de transport dans les directions AB et BA, en utilisant soit une formulation donneuse témoin, soit une solution donneuse contenant la formulation B, chacune de ces formulations contenant la molécule A marquée au '4C à 5 x 10-5 M. Quand la formulation B est testée dans la direction BA, le côté basolatéral contient une solution donneuse témoin, et le côté apical est rempli par le placebo de la formulation B. Comme pour les études de transport, la totalité des ingrédients ne dépasse pas 1% du milieu. Un total de 24 puits est utilisé pour chaque formulation, dans chaque direction. [1] Détermination des flux A T = 0, 30, 60, 120 et 180 minutes, des échantillons du milieu sont prélevés, soit du côté apical, soit du côté 1 + log Papp -5,595, basolatéral, afin de déterminer les valeurs des flux (en DPM/cm2.h) dans les directions AB et BA, ainsi que décrit plus haut. [2] Détermination de l'accumulation intracellulaire En parallèle, à chacun de ces temps, 6 puits sont complètement vidés de tout milieu, et les filtres correspondants sont récupérés et lavés en PBS (Phosphate 10 buffered saline) à 4 C. Ces filtres, qui portent les cellules Caco-2, sont introduits dans un tube contenant 1 ml d'un mélange 50/50 (vol/vol) de tampon HBSS/HEPES et d'éthanol (95% vol). Après remise en suspension des cellules par sonication 15 pendant 1 min, le liquide est centrifugé à 1000 g pendant 5 min. Un échantillon de 200 gl de surnageant est prélevé, et la radioactivité est comptée au compteur à scintillations. Les résultats sont exprimés en désintégrations par minute (DPM) accumulées dans un volume cellulaire apparent de 1 cm3. Pour le calcul du volume des monocouches, les hypothèses suivantes sont faites: chaque cellule forme un cylindre dont la hauteur est 17,9 tm et le diamètre 13,3 m, et chaque monocouche contient 1,1 x 106 cellules par cm2, ainsi qu'il a été rapporté (Pontier et al., J. Pharm. Sci. 2001 90: 1608-1619). Le volume apparent des monocouches croissant sur un filtre de polycarbonate de 1,13 cm2 est alors de 1,24 x 10-2 cm3. A chaque temps, la moyenne des comptages des 6 puits correspondant (en DPM/cm3) est calculée. b) Evaluation de la perméabilité à travers les membranes apicales et basolatérales Pour calculer les valeurs de perméabilité apparente du compartiment intracellulaire vers le côté basolatéral(CB), et du compartiment intracellulaire vers le côté apical (CA), pour la formulation contrôle et pour la formulation B, on fait l'hypothèse que les valeurs de flux obtenues dans les études de transport dans les directions AB et BA reflètent un transfert de masse depuis l'intérieur des cellules vers l'extérieur, soit du côté basolatéral pour la direction AB (JAB étant en DPM/cm2.h), soit du côté apical pour la direction BA (J-BA étant en DPM/cm2.h). Il est aussi postulé que les flux JAB et J-BA sont tous deux dépendants des concentrations intracellulaires COAB et CCBA (exprimées en DPM/cm3) calculées à partir des expériences d'accumulation intracellulaire effectuées en parallèle avec les études de transport correspondantes, dans les directions AB et BA respectivement. Dans ce cas, les flux mesurés dans la direction AB (JAB) et dans la direction BA (JBA) sont égaux aux flux de l'intérieur vers l'extérieur de la cellule à la membrane basolatérale (JCB) et à la membrane apicale (JCA) respectivement. Les perméabilités membranaires sont calculées suivant les équations: PappCB JAB / CcAB = JCB / CcAB Et PappCA = jBA / CcBA = JCA / c-,cAB PappCB et PappCA sont les perméabilités membranaires moyennes dans les directions CB et CA, respectivement. Les valeurs des perméabilités membranaires moyennes sont calculées à l'aide de chacun des 24 puits correspondant à la condition étudiée. Les valeurs des flux moyens et de concentrations intracellulaires moyennes sont aussi calculées à l'aide de chacun des 24 puits correspondant à la condition étudiée. L'écart type de la population des 24 puits est aussi calculé. 1.6) Stabilité de la molécule A dans le fluide duodénal humain: Pour chaque essai de stabilité, on décongèle le volume nécessaire d'un échantillon de fluide duodénal humain congelé immédiatement après prélèvement. Une centrifugation de 15 min à 1000 g élimine les substances ressemblant à du mucus. Le pH du surnageant est ajusté par addition de tampon MES (1250 mM en PBS CMF) à 6,40, une valeur proche de la valeur moyenne du pH du fluide duodénal frais. La molécule A est dissoute dans le DMSO et soit diluée dans le tampon HBSS/HEPES (témoin) directement, soit préparée dans les formulations avant dilution en HBSS/HEPES pour obtenir une microémulsion. La concentration finale dans les deux cas est de 10-4 M. Les formulations préchauffées à 37 C sont ajoutées au fluide duodénal maintenu à 37 C dans un rapport 1/1 (v/v) et immédiatement mélangées, afin que la concentration finale de 20 la molécule A soit 5.10-5 M. A T = 0 (immédiatement après le mélange) et à T = 5, 10, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, des échantillons de 100 l de chaque préparation sont prélevés et mélangés avec le même volume d'acétone à 4 C, pour arrêter la réaction enzymatique. Les échantillons sont ensuite centrifugés (1000 g pendant 5 min) et le_ surnageant testé par une méthode validée LC/MS/MS. 1.7) Etude in vivo On utilise 18 rats Sprague-Dawley (IFFA-Credo, St Germain sur l'Arbresle, France) pesant 300-320 g chacun et nourris avec un mélange de laboratoire standard (UAR 113, Villemoisson sur Orge, France). Après un jeûne de 18 heures, ils sont répartis en 6 groupes égaux, avant de recevoir une dose de molécule A de 1,5 mg/kg, soit par voie orale (10 ml/kg), soit par voie intraveineuse (1 ml/kg). Les formulations utilisées dans l'étude in vivo sont décrites dans le Tableau 2. Pour l'administration orale, un volume de chacune des trois formulations testées est mélangé avec 2 volumes d'eau et agité violemment, afin d'obtenir une émulsion homogène contenant la molécule A à une concentration de 0,15 mg/ml. La concentration finale dans chacune de ces formulations est identique à celle de la formulation contrôle au PEG, c'est-à- dire 0,15 mg/ml (14,67 Ci/ml). Chaque formulation est ensuite administrée à quatre groupes de rats par gavage. Le volume d'administration (10 ml/kg) est ajusté au poids corporel pour avoir une dose de 1,5 mg/kg. Deux autres groupes d'animaux reçoivent la solution témoin Glyc/w à travers la veine caudale à une dose de 1,5 mg/kg dans un volume de lml/kg. Pour chacun des groupes ayant reçu la formulation par voie intraveineuse, le sang est recueilli par incision de la carotide au temps 5 min (0,083 h) . Pour tous les autres groupes, les échantillons sanguins (0,2 ml) sont recueillis à 0,25; 0,5; 1; 2 et 4 heures par prélèvement retro-orbital; à 6 heures, le prélèvement se fait par incision à la carotide. Les échantillons sont recueillis sur tubes traités à l'héparinate de lithium et gardés à 4 C. Le plasma est séparé du sang total par centrifugation à 2000 g pendant 10 min à 4 C. La radioactivité présente dans les fractions plasmatiques est mesurée au compteur à scintillation. La concentration de molécule A marquée au 14C dans le plasma est exprimée en mg.eq/l. Le pourcentage d'absorption (fap' ) de molécule A après administration orale est calculé comme indiqué ci-dessous: 35 faPO = (AUCp.O./ AUC1" mean) x 100 AUCp.O est la surface sous la courbe de concentration dans le plasma de 0 à 6 heures, après l'administration orale. AUC1'vmean est la surface sous la courbe de concentration dans le plasma de 0 à 6 heures, après administration intraveineuse. Pour ces calculs, on fait l'hypothèse que la clairance totale de la radioactivité est la même, quelle que soit la voie d'administration du produit (orale ou intraveineuse). La fraction absorbée est calculée pour chaque animal, et la moyenne et l'écart type sont ensuite calculés pour chaque groupe d'animaux recevant une formulation orale. 2) Résultats Exemple 1: Molécule A. Dans une formulation contrôle, la molécule A est soumise à un transport asymétrique, avec, suivant la concentration, PappBA de 15 à 24 fois plus grande que PappAB (Figure 1, annexe 1). Cet effet est modulé par le verapamil ou le nicardipine (Figure 2, annexe 1) ; il est donc dû à l'action de la P-glycoprotéine qui s'oppose au passage trans-épithélial dans le sens de l'absorption de la molécule A. D'autre part, la solubilité de la molécule A est faible (0, 4 mg/ml) dans un milieu aqueux au pH physiologique de 25 l'intestin. Enfin, la molécule A est instable dans le fluide duodénal humain (Figure 5, annexe 1). La combinaison de ces trois facteurs - faible perméation, 30 faible solubilité, instabilité - résulte dans une très faible absorption du principe actif par voie orale: moins de 1% à partir d'une suspension. 1) Effet des formulations sur l'action de la P-glycoprotéine sur le transport de la molécule A a) Effet sur le transport de la molécule A à travers la 5 monocouche Caco-2 Dans des expériences de transport à travers la monocouche, où les formulations testées sont dans la solution donneuse, Pape est diminuée et PappAB augmentée par rapport au contrôle. Les solvants utilisés pour préparer ces formulations, le glycofurol et le macrogol 3000, n'ont aucun effet sur les Pape (Figure 3, annexe 1). Le rapport PappBA/ PappAB n' est plus que de 1,8 à 4,7 suivant les formulations utilisées, alors qu'il est de 18,3 pour le contrôle, indiquant que l'efflux actif de la molécule A est affecté par les formulations. b) Effet sur l'accumulation intracellulaire de la molécule A dans la monocouche Caco-2 On a mesuré en parallèle l'accumulation intracellulaire de molécule A marquée au 14C et le flux à travers les cellules, dans des expériences de transport à travers la monocouche de Caco-2. Quand le compartiment apical (c'est-à-dire en contact avec la Pglycoprotéine) contient la formulation B, la moyenne de l'accumulation intracellulaire de molécule A marquée au 14C (Ccm et CcBA) augmente par rapport au contrôle, quel que soit le sens du transport: elle est plus grande d'un facteur 8,5 dans le sens AB, et d'un facteur 3,7 dans le sens BA (Tableau 3). Quand le compartiment apical contient une solution contrôle (0,5% DMSO), pappcA est plus grande que Pap,cB d'un facteur 4, 2, à cause du transport actif de la molécule A par la P-glycoprotéine. Par contre, en présence de formulation B dans le compartiment apical, PappcA et pappcB sont égales, indiquant que le transport actif est inhibé. Tableau 3: Accumulation intracellulaire et perméabilité apparente de la molécule A Formulation Témoin B CAB (DPM/cm3) 2,0 x 105 2,6 x 1, 7 x 105 2,6 x jCB (DPM/cm2.h) 1236 98 8856 1401 PappcB (omis) 1, 7 x10-6 1,4 x 1,4 xl0-6 2,3 x 10-7 10-7 CUBA (DPM/cm3) 9,2 x 105 5, 3 x 3,4 x 106 4,5 x 104 105 JCA (DPM/cm2.h) 23625 2630 16000 783 pappCA (cm/ s) 7,1 x10-6 7,9 x 1,3 xl0 6 8,2 x 10-7 10-8 2) Effet des formulations sur la solubilité de la molécule A La solubilité de la molécule A dans des solutions aqueuses est très faible à pH physiologique (0,4 mg/ml). Dans le glycofurol et le macrogol 300, utilisés dans les formulations testées, la solubilité de la molécule A est, respectivement, de 6 mg/ml et 2 mg/ml. 3) Effet des formulations sur la stabilité de la molécule A 15 La stabilité de la molécule A dans le fluide duodénal humain a été mesurée. Dans une formulation contrôle, 30% du principe actif est hydrolisé au bout de 120 minutes. Par contre, au même temps, 100% et 85% de la molécule A sont toujours présents avec les formulations B et F, respectivement. 4) Effet des formulations sur l'absorption de la molécule A La molécule A dans différentes formulations (Tableau 2) a été donnée par voie orale à des rats. Dans un système solvant 5 tel que le PEG, l'absorption n'est que de 25%. L'absorption est de 100% pour chacune des trois formulations utilisées (Tableau 4). Tableau 4: Pourcentage d'absorption (fan ) après 10 administration orale des formulations chez le rat. Formulation AUC(0-6h) (mg. eq/ml) sd (CV%) Eau-glycofurol: 0, 68 0, 13 (32%) - 50/50 (i.v) PEG 0,173 0,046 (46%) 25,4 % 6,8 Soy/Glyc 0,76 0, 16 (37%) 111% + 24 Gélu/Glyc 1,00 0,11 (19%) 147 + 16 Gélu/DMSO 0, 94 0,11 (21%) 138% + 17 5) Molécule A: Résumé des résultats Les résultats montrent que les formulations suivant l'invention permettent: É d'augmenter la perméabilité apparente dans le sens AB et de diminuer celle dans le sens BA par rapport à une 20 formulation contrôle (Figure 3, annexe 1) É d'augmenter l'accumulation intracellulaire de la molécule A par rapport à une formulation contrôle (Figure 4, annexe 1) É de stabiliser la molécule A dans le liquide duodénal en 25 protégeant le principe actif contre l'hydrolyse enzymatique (Figure 5, annexe 1). É d'obtenir une absorption complète chez l'animal alors qu'elle n'est que de 25% dans un système solvant tel que le PEG 300 et que la biodisponibilité absolue est inférieure à 1% à partir d'une suspension (Tableau 4). Exemple 2: Molécule B. Des résultats de transport à travers des monocouches Caco-2 montrent que la molécule B subit un efflux par la Pglycoprotéine. En effet, dans une formulation contenant 0,5% de DMSO, les résultats suivants sont obtenus: Papp dans le sens AB: 4, 4x10.7 cm/s Papp dans le sens BA: 2, 1x10-6 cm/s Une formulation renfermant 1,7% de Gélucire 44/14 / Labrasol dans les proportions 80/20 dans le milieu de transport permet de moduler le passage de la molécule B à travers les monocouches Caco-2 de la manière suivante: É Augmentation du transport dans le sens AB (sens de l'absorption) d'un facteur 5,9 par rapport à un 25 milieu renfermant 0,5% de DMSO: la perméabilité apparente (Papp) passant de 4,4 x 10-' cm/s à 2, 6 x 10-6 cm/s. Figure 1 Perméabilité de molécule A dans les deux directions (AB et BA) dans des monocouches de cellules Caco-2. Figure 2 Modulation de la perméabilité de molécule A à travers des monocouches cellulaires Caco-2 dans les deux directions AB et BA, par le verapamil, le nicardipine et la progestérone à 100 pM dans la solution donneuse. Figure 3: Effet de différentes formulations sur la perméabilité de molécule A à travers des monocouches de cellules Caco-2 dans les deux directions AB et BA directions. Figure 4: Accumulation intracellulaire de C14-molécule A (50 pM) dans les deux directions AB et BA, avec une formulation témoin (0.5% DMSO) et la formulation B. Figure 5 Stabilité dans le fluide duodénal humain de molécule A formulé en DMSO, ou dans les formulations A, B ou F. 34 REVENDICATIONS 1) Application de mélanges auto-émulsionnants d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échant, de cotensioactifs pour la préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale, renfermant un ou des principes actifs et ayant pour effet d'augmenter l'absorption du ou des principes actifs par un mécanisme impliquant l'inhibition des pompes à efflux. 2) Application selon la revendication 1 caractérisée en ce que les mélanges comprennent en outre un dissolvant tel que le DMSO ou le glycofurol. 3) Application de mélanges auto-émulsionnants selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour la préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale ayant pour effet d'augmenter l'absorption du ou des principes actifs par un mécanisme impliquant: - l'inhibition des pompes à efflux et - l'augmentation de la solubilité du principe actif. 25 6) Application de mélanges auto-émulsionnants selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour la préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale ayant pour effet d'augmenter l'absorption du ou des principes actifs par un mécanisme impliquant: - l'inhibition des pompes à efflux et - l'augmentation de la stabilité du principe actif dans le tractus gastro- intestinal 7) Application de mélanges auto-émulsionnants selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour la 6) 7) 8) 9) préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale ayant pour effet d'augmenter l'absorption du ou des principes actifs par un mécanisme impliquant: - l'inhibition des pompes à efflux, - l'augmentation de la solubilité du principe actif et l'augmentation de la stabilité du principe actif dans le tractus gastrointestinal. Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la pompe à efflux est la P-glycoprotéine. Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que les particules formées après interaction avec un milieu aqueux, et en particulier le liquide duodénal, ont une taille inférieure à 100 nm. Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les excipients lipidiques sont choisis parmi les glycérides, les acides gras et leurs dérivés, les phospholipides, les glycolipides et les stérols. Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que les excipients lipidiques sont choisis parmi les composés suivants: - linoléate de glycérol, - monooléate de glycérol, oléate/linoléate de glycérol, - glycéryl laurate, - polyglycéryl-3 oléate, - huile de soja, - triglycérides d'acide caprique/caprylique/laurique, et - l'acide oléique. 10) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les tensioactifs sont hydrophiles. 11) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les tensioactifs sont lipophiles. 12) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les tensioactifs sont choisis parmi les composés suivants: - glycéryl caprylate/caprate, - Cremophor EL, et - oléate de sorbitane polyoxyéthylène 13) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les co-tensioactifs sont choisis parmi les composés suivants: - éther monoéthylique du diéthylène glycol, - monocaprylate de propylène glycol, - éthanol absolu, et macrogol 800 à 300. 14) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol / DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 50 et 60, 15 et 20, 15 et 20, et 5 et 15. 15) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol / Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 50 et 65, 15 et 25, 15 et 25, et 5 et 15. 16) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14 / Labrasol /DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 65 et 85, 15 et 25, et 5 et 15. 17) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Maisine 35-1 / Cremophor ELo/DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 40 et 50, 40 et 50, et 5 et 15. 18) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14 / Labrasol /Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 65 et 85, 15 et 25, et 5 et 15. 19) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Maisine 35-1 / Cremophor EL /Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 40 et 50, 40 et 50, et 5 et 15. 20) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL /Ethanol/DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15. 21) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL /Ethanol/Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15. 22) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol /DMSO, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15. 23) Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le mélange est composé de Huile de soja / Maisine 35-1 / Cremophor EL / Transcutol / Glycofurol, dans des proportions pouvant respectivement varier entre 25 et 35, 25 et 35, 25 et 35, 5 et 15, et 5 et 15. 24) Compositions pharmaceutiques renfermant un principe actif et un mélange auto-émulsionnant d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de co- tensioactifs tels que définis dans les revendications 8 à 13. 25) Compositions pharmaceutiques renfermant un principe actif et un mélange auto-émulsionnant d'excipients lipidiques, de tensioactifs et, le cas échéant, de cotensioactifs, tel que défini dans les revendications 14 à 23. 26) Composition pharmaceutique selon les revendications 24 et 25 caractérisée en ce qu'elle se trouve en gélule dure remplie du mélange d'excipients semi-pâteux, pâteux ou liquide. 27) Composition pharmaceutique selon les revendications 24 et 25 caractérisée en ce qu'elle se trouve en capsule molle remplie du mélange d'excipients semi-pâteux, pâteux ou liquide. 28) Composition pharmaceutique selon les revendications 24 et 25 caractérisée en ce qu'elle se trouve en ampoule scellée remplie du mélange d'excipients liquides. 29) Composition pharmaceutique selon les revendications 24 et 25 caractérisée en ce qu'elle se trouve en récipient type bouteille de sirop remplie du mélange d'excipients liquide. 30) Composition pharmaceutique renfermant les mélanges selon les revendications 24 à 29 caractérisée en ce que le principe actif est l'ester éthylique d'acide (2S)-2-(Naphtalene-l-sulfonylamino) -3- (4- (2(1, 4, 5, 6tetrahydropyrimidin-2-ylcarbamoyl)-ethyl)-benzoylamino)-propionique. 31) Composition pharmaceutique selon la revendication 30 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14 / Plurol oléique / Transcutol /DMSO dans des proportions 54/18/18/10. 32) Composition pharmaceutique renfermant les mélanges selon les revendications 24 à 29 caractérisée en ce que le principe actif est l'acide (2S)-2-Benzyloxycarbonylamino-3-(4-(3-(1,4,5,6-tetra hydropyrimidin-2-ylcarbamoyl)propyloxy)phenyl) propionique. 33) Composition pharmaceutique selon la revendication 32 caractérisée en ce que le mélange est composé de Gélucire 44/14/Labrasol dans des proportions 80/20. 34) Application de mélanges auto-émulsionnant d'excipients, tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, pour la préparation d'une solution injectable permettant d'inhiber la P-glycoprotéine de cellules cancéreuses et d'augmenter la pénétration cellulaire du principe actif dans les cellules tumorales. 35) Procédé de préparation de mélanges auto-émulsionnants d'excipients, tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend des phases de: - ajout de l'excipient lipidique, du tensioactif et, le cas échéant, du co-tensioactif, les excipients semi-solides nécessitant un préchauffage; - mélange par agitation jusqu'à obtention d'une solution homogène; - dissolution du principe actif dans un dissolvant tel que le DMSO, le glycofurol ou l'un des excipients entrant dans la composition des émulsions et des microémulsions; - ajout du principe actif dissout au mélange d'exipient lipidique, de tensioactif et, le cas échéant, de co-tensioactif; - le cas échéant chauffage ou sonication jusqu'à obtention d'une solution homogène.