Brevet FR2881655A3 — publié le 20060811

FR 2881655 A3 20060811 FR 0501211 A 20050207 Toutes les informations en ligne et les documents cités ci-après sont incorporés à la présente à titre de référence dans leur intégralité. La présente invention appartient au domaine de la préparation et de la formulation de l'interleukine-2 pour une utilisation pharmaceutique. L'interleukine-2 (IL-2) est une cytokine qui favorise la croissance et la différentiation des cellules T in vivo et améliore aussi la cytotoxicité des cellules T CD8+ et des cellules natural killers . Son administration à des patients se traduit par de multiples effets immunologiques de manière dose-dépendante, comprenant l'activation de l'immunité cellulaire avec des lymphocytose, éosinophilie, thrombocytopénie profondes, et la production de cytokines comprenant le facteur TNF, l'IL-1 et l'interféron-y. Des détails supplémentaires relatifs à l'IL-2 peuvent être obtenus dans sa GeneCard sous le numéro d'accès GC04M123831. L'IL-2 a été approuvée pour une utilisation pharmaceutique chez l'homme dans plusieurs pays. Le nom non-propriétaire international recommandé est ALDESLEUKINE, et une formulation est commercialisée par la Société Chiron Corporation sous le nom de marque commerciale PROLEUKINTM. Aux États-unis, la FDA a approuvé l'IL-2 PROLEUKINTM pour une utilisation dans le traitement des adultes présentant un carcinome de cellules rénales métastatique (RCC métastatique) ou un mélanome métastatique. Comme il est stipulé dans sa fiche d'informations de prescription US, la PROLEUKINTM existe sous forme de microagrégats biologiquement actifs, liés de manière non covalente, avec une taille moyenne de 27 molécules d'IL-2 recombinante. Elle est fournie sous la forme d'un gâteau lyophilisé blanc à blanc cassé, stérile, dans des flacons à usage unique prévus pour une administration par voie intraveineuse (IV). Lorsqu'il est reconstitué avec 1,2 ml d'eau stérile pour injection, chaque ml contient 18 millions d'UI (1,1 mg) d'IL-2 PROLEUKINTM, 50 mg de mannitol et 0,18 mg de dodécylsulfate de sodium (SDS), tamponné avec approximativement 0, 17 mg de phosphate de sodium monobasique et 0,89 mg de phosphate de sodium dibasique à un pH de 7,5. Le simple mélange de ces ingrédients ne donne pas, toutefois, la même forme microagrégée d'IL-2 que celle rencontrée dans le produit PROLEUKINTM La microagrégation de l'IL-2 dans le produit PROLEUKINTM est importante pour l'efficacité in vivo. Les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de l'IL-2 non agrégée (monomère libre) sont très différentes de celles de l'IL-2 microagrégée et les deux formes ont des index thérapeutiques différents: les agrégats qui sont trop petits sont éliminés par le corps humain trop rapidement; les agrégats qui sont trop grands peuvent être insolubles et moins actifs. La microagrégation est donc un élément clé du produit PROLEUKINTM Le procédé par lequel les microagrégats de PROLEUKINTM biologiquement actifs sont formés, n'a jamais été mis à la disposition du public auparavant même si un certain nombre de procédés pour la préparation des formulations d'IL-2 pharmaceutiques ont été décrits dans l'art antérieur [par exemple, voir les références 1 à 30]. La référence 9, en particulier, se propose de décrire le procédé de fabrication de la PROLEUKINTM, comprenant des détails relatifs à l'expression, la récupération, la purification, la formulation et la finition, mais cette description s'avère incomplète à bien des égards. Pour quiconque souhaite fabriquer un produit IL-2 similaire à la PROLEUKINTM, il serait utile de savoir comment réaliser la même forme active microagrégée d'IL-2 que celle rencontrée dans le produit PROLEUKINTM. C'est pourquoi, un objet de la présente invention consiste à fournir un procédé pour la préparation d'IL-2 sous une forme microagrégée telle que celle rencontrée dans le produit PROLEUKINTM, et également à fournir une telle IL-2 microagrégée. Un autre objet de la présente invention consiste à fournir un procédé pour la préparation de l'IL-2 afin de compléter la description de la référence 9. Le procédé par lequel le produit PROLEUKINTM est préparé comprend les étapes clés suivantes: (i) purification de l'IL-2 exprimée à partir d'une culture de cellules; (ii) solubilisation de l'IL-2 en utilisant un détergent SDS; (iii) réduction de l'IL-2 à une forme monomérique; (iv) purification, oxydation et précipitation de l'IL-2; (v) re-solubilisation de l'IL-2 en utilisant un niveau élevé de détergent SDS; (vi) purification pour éliminer l'IL-2 oligomérique; (vii) diafiltration pour réduire le niveau de détergent SDS, sans élimination complète, jusqu'à une plage optimale afin d'obtenir une préparation d'IL-2 microagrégée de manière appropriée; (viii) formulation avec du mannitol et un tampon; et (ix) lyophilisation et conditionnement. Les étapes (i), (iv), (vi), (viii) et (ix) de cette procédure sont décrites dans la référence 9, mais les étapes (ii), (iii), (v) et (vii) ne le sont pas, bien que l'utilisation d'un détergent non spécifié pour re-solubiliser l'IL-2 avant l'étape (vi) soit décrite. En outre, la référence 9 suggère que l'on ajoute du SDS à l'IL-2 après la purification de l'étape (vi), alors qu'en réalité on l'élimine. Sur ces neuf étapes, les étapes les plus critiques par lesquelles les microagrégats sont formés sont les étapes (v) et (vii). Aucune des étapes (viii) ou (ix) en aval n'a un quelconque effet significatif sur la microagrégation, et les procédures de purification des étapes (i), (ii), (iii), (iv) et (vi) ont également un effet insignifiant. Toutefois, après avoir ajouté le SDS à l'étape (v), l'IL-2 est solubilisée et c'est ensuite la réduction des niveaux de SDS à l'étape (vii) qui va entraîner la formation des microagrégats présents dans le produit PROLEUKINTM final. Il faut ajouter suffisamment de SDS pour re-solubiliser l'EL-2 précipitée dans une forme soluble essentiellement monomérique puis il faut ensuite l'éliminer (mais pas complètement) pour obtenir les microagrégats souhaités. C'est pourquoi l'invention fournit un procédé de préparation de l'interleukine-2 à usage pharmaceutique, comprenant les étapes consistant à : (a) ajouter du dodécylsulfate de sodium (SDS) à une composition comprenant l'interleukine-2, pour donner une concentration finale de SDS d'au moins 500 g de SDS par mg d'IL-2; (b) éliminer une partie mais non la totalité du SDS de la composition, pour donner une composition contenant entre 95 et 250 gg de SDS par mg d'interleukine-2. Cette procédure d'addition puis d'élimination partielle du SDS donne des conditions optimales pour une interaction étroite entre les molécules d'IL-2 et de SDS afin de former des microagrégats d'IL-2 et de SDS tels que ceux rencontrés dans le produit PROLEUKINTM et, pour un rapport IL2/SDS donné, elle conduit à l'obtention d'un produit différent de celui obtenu par simple mélange de SDS et d'IL-2. La composition aqueuse résultant du procédé peut être lyophilisée à des fins de répartition, et le matériau lyophilisé peut finalement être reconstitué avec un porteur aqueux en vue d'une administration à des patients. Après reconstitution, la composition a, de préférence, une turbidité (r) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g et/ou contient des agrégats de SDS/IL-2 avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm. Ainsi, le procédé peut comprendre, en outre, les étapes consistant à lyophiliser la composition puis, éventuellement, à reconstituer la composition avec un milieu aqueux. La composition peut aussi avoir ces caractéristiques de turbidité ('c) et/ou hydrodynamique avant l'étape de lyophilisation. L'invention fournit une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et dans laquelle les agrégats peuvent être obtenus par les procédés de l'invention. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation pharmaceutique, telle que démontrée par le produit PROLEUKIN. L'invention fournit aussi une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et dans laquelle la composition a une turbidité ('r) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation pharmaceutique, telle que démontrée par le produit PROLEUKINTm. L'invention fournit aussi une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et dans laquelle les agrégats ont un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation pharmaceutique, telle que démontrée par le produit PROLEUKIN'. L'invention fournit aussi une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et dans laquelle le nombre moyen de molécules d'interleukine-2 par agrégat est compris entre 10 et 50. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation pharmaceutique, telle que démontrée par le produit PROLEUKINTM L'invention fournit une composition lyophilisée comprenant l'interleukine2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle la composition peut être reconstituée pour donner une solution aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et qui a une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g. Au lieu de considérer la valeur i, ou tout en la considérant, les agrégats peuvent avoir un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et nm. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation pharmaceutique, telle que démontrée par le produit PROLEUKINTm. L'invention fournit un procédé pour préparer une composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle: (i) la composition lyophilisée peut être reconstituée pour donner une composition aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et qui a une turbidité (t) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) ajouter le dodécylsulfate de sodium à une composition comprenant l'interleukine-2, dans laquelle on ajoute suffisamment de dodécylsulfate de sodium pour donner une interleukine-2 solubilisée monomérique; (b) réduire la concentration de dodécylsulfate de sodium à un niveau où l'interleukine-2 forme des agrégats avec le dodécylsulfate de sodium; et (c) lyophiliser la composition. L'invention fournit un procédé pour préparer une composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle: (i) la composition lyophilisée peut être reconstituée pour donner une composition aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) ajouter le dodécylsulfate de sodium à une composition comprenant l'interleukine-2, dans laquelle on ajoute suffisamment de dodécylsulfate de sodium pour donner une interleukine-2 solubilisée monomérique; (b) réduire la concentration de dodécylsulfate de sodium à un niveau où l'interleukine-2 forme des agrégats avec le dodécylsulfate de sodium; et (c) lyophiliser la composition. L'invention fournit aussi un procédé pour préparer une composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle: (i) la composition lyophilisée peut être reconstituée pour donner une composition aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats, et qui a une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) mélanger le dodécylsulfate de sodium et l'interleukine-2 pour donner un mélange dans lequel le dodécylsulfate de sodium est présent à une première concentration; (b) éliminer le dodécylsulfate de sodium du mélange pour réduire sa concentration à une deuxième concentration, et (c) lyophiliser la composition, ce qui permet, de ce fait, de fournir ladite composition. La deuxième concentration est inférieure à la première concentration. La première concentration est généralement d'au moins 500 g de SDS par mg d'IL-2 contenu dans le mélange, et la deuxième concentration est généralement comprise entre 95 et 250 g de SDS par mg d'IL-2. L'invention fournit aussi un procédé pour préparer une composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle: (i) la composition lyophilisée peut être reconstituée pour donner une composition aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous la forme d'agrégats avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) mélanger le dodécylsulfate de sodium et l'interleukine-2 pour donner un mélange dans lequel le dodécylsulfate de sodium est présent à une première concentration, (b) éliminer le dodécylsulfate de sodium du mélange pour réduire sa concentration à une deuxième concentration, et (c) lyophiliser la composition, ce qui permet, de ce fait, de fournir ladite composition. La deuxième concentration est inférieure à la première concentration. La première concentration est généralement d'au moins 500 g de SDS par mg d'IL-2 contenu dans le mélange, et la deuxième concentration est généralement comprise entre 95 et 250 g de SDS par mg d'IL-2. L'invention fournit aussi un procédé pour préparer une composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium (SDS), dans laquelle: (i) la composition lyophilisée peut être reconstituée pour donner une composition aqueuse dans laquelle l'interleukine-2 et le SDS sont présents sous la forme d'agrégats et qui a une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g, et où la concentration de SDS est x g de SDS par mg d'IL-2, où x est compris entre 95 et 250; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) mélanger le SDS et l'interleukine-2 pour donner un mélange dans lequel la concentration de SDS est au moins quatre fois supérieure à x , (b) éliminer une partie mais non la totalité du SDS du mélange, pour donner une composition dans laquelle la concentration de SDS est x , et (c) lyophiliser la composition. La concentration est, de préférence, au moins 5 fois supérieure à x , de manière davantage préférée au moins 8 fois supérieure, 10 fois supérieure, 15 fois supérieure ou même 20 fois supérieure à x . L'invention fournit aussi un procédé pour préparer une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium (SDS), dans laquelle: (i) l'interleukine-2 et le SDS dans la composition sont présents sous la forme d'agrégats, où les agrégats ont un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm, et où la concentration de SDS est x ug de SDS par mg d'IL-2, où x est compris entre 95 et 250; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) mélanger le SDS et l'interleukine-2 pour donner un mélange dans lequel la concentration de SDS est au moins 4 fois supérieure à x ; (b) éliminer une partie mais non la totalité du SDS du mélange, pour donner une composition dans laquelle la concentration de SDS est de x , et (c) lyophiliser la composition. La concentration est, de préférence, au moins 5 fois supérieure à x , de manière davantage préférée au moins 8 fois supérieure, 10 fois supérieure, 15 fois supérieure ou même 20 fois supérieure à x . Si un procédé de l'invention implique une réduction de la concentration de SDS jusqu'à ce qu'elle se situe à l'intérieur de la plage allant de 95 à 250 ug de SDS par mg d'IL-2, il est possible dans certains modes de réalisation de réduire la concentration à une valeur inférieure à 95 g/mg; (par exemple à une valeur comprise entre 50 et 95 gg/mg) puis d'augmenter de nouveau la concentration jusqu'à ce qu'elle se situe à l'intérieur de la plage allant de 95 à 250 g/mg. Cette augmentation afin que la concentration soit à l'intérieur de la plage allant de 95 à 250 ug/mg peut, de manière pratique, avoir lieu pendant la reconstitution du matériau lyophilisé : par exemple, le procédé peut impliquer l'élimination du SDS jusqu'à une valeur Le détergent Les procédés de l'invention impliquent l'utilisation du dodécylsulfate de sodium (SDS), qui est également connu sous l'appellation de laurylsulfate de sodium. La formule de ce détergent anionique est CH3(CH2)11OSO3Na+ ; son numéro CAS est le 151-21-3 et son numéro EC est le 205-788-1. Le SDS est un réactif standard utilisé pour solubiliser les protéines et dans le cas où l'IL-2 est présente sous forme précipitée avant addition de SDS, alors le SDS est utilisé à cette fin dans l'étape (a) du procédé de l'invention. Si l'on démarre avec une composition comprenant de l'IL-2 précipitée, il faut ajouter suffisamment de SDS pour garantir que pratiquement (ou essentiellement) la totalité de l'IL-2 précipitée est rendue soluble, (sauf pour tous les multimères IL-2 liés de manière covalente dans le précipité, qui restent principalement précipités même en présence de SDS). La microagrégation de l'IL-2 à une concentration de 1 mg/ml est pratiquement (ou essentiellement) inexistante lorsque le SDS est présent à une valeur supérieure à environ 500 g/mg et par conséquent il est classique d'ajouter du SDS de manière à obtenir une concentration finale de SDS d'au moins 500 g de SDS par mg d'IL-2 (par exemple, d'au moins 550, d'au moins 600, d'au moins 700, d'au moins 800, d'au moins 900, d'au moins 1 000, d'au moins 1 200, d'au moins 1 400, d'au moins 1 600, d'au moins 1 800 ou d'au moins 2 000 g de SDS par mg d'IL-2). L'utilisation d'environ 910 pg de SDS par mg d'IL-2 est préférée. On connaît généralement la concentration initiale de SDS dans un échantillon, parce que le SDS n'existe pas à l'état naturel dans les cellules et que la quantité de SDS ayant été ajoutée pendant le traitement du matériau dérivé de cellules a été surveillée. Toutefois, dans le cas où la concentration de SDS est inconnue, il est possible de l'évaluer en utilisant des techniques de dosage classique, réalisées sur le matériau dans sa totalité ou sur un échantillon du matériau. Par exemple: la référence 31 décrit un procédé d'électrophorèse capillaire utilisé pour la séparation et la détermination des agents tensioactifs parmi lesquels on trouve le SDS; la référence 32 décrit une méthode de la goutte unique utilisée pour la détermination de l'ion dodécylsulfate sur une plage allant de 0,2 à 10011M au moyen d'un cristal de quartz piézo- électrique sans électrode; la référence 33 compare trois méthodes de détermination pratique du SDS dans des solutions aqueuses, à savoir le titrage au bromure de cétyltriméthylammonium en utilisant une électrode sélective d'ions ou la turbidité afin de mesurer le point limite, ou une mesure de la turbidité en présence de bromure de myristyltriméthylammonium; la référence 34 décrit une méthode de détermination du SDS, basée sur son interaction avec des teintures fluorescentes telles que le bromure d'éthidium; etc. La méthode de dosage préférée pour mesurer les niveaux de SDS est un dosage spectrophotométrique basé sur une réaction avec l'acridine orange, comme décrit de manière plus détaillée dans les exemples et dans la référence 35. Une variante de la mesure de la teneur en SDS comparativement à la masse de l'IL-2, consiste à mesurer la teneur en SDS comparativement à l'activité de l'IL-2. Sur la base d'une activité d'IL-2 de 18 x 106 UI dans 1,1 mg d'IL-2 (telle que rencontrée dans la PROLEUKINTM), 100 g de SDS par mg d'IL-2 équivalent à 6,111 g de SDS par MUI d'IL-2. Au lieu d'utiliser du SDS dans les procédés et les produits de l'invention, il est également possible d'utiliser du laureth sulfate de sodium (SLS) ou du lauryl sulfate d'ammonium (ALS). Il est également possible d'utiliser des mélanges de SLS, d'ALS et/ou de SDS. Dans les modes de réalisation préférés de l'invention, toutefois, on utilise du SDS. Élimination du détergent Après addition du SDS à la composition d'IL-2, le procédé de l'invention implique l'élimination d'une partie (mais non de la totalité) du SDS, ce qui permet d'obtenir, de ce fait, une forme microagrégée d'IL-2 et de SDS. Différentes techniques permettent d'éliminer le SDS. La chromatographie par échanges d'ions permet d'éliminer le SDS chargé négativement et il est également possible d'utiliser une chromatographie d'exclusion diffusion. De manière préférée entre toutes, toutefois, le SDS est éliminé par diafiltration. Dans une diafiltration, le solvant et/ou les micro-solutés (par exemple des sels) sont remplacés par un solvant et/ou des micro-solutés différents. En règle générale, l'élimination et le remplacement se produisent à un débit identique et il est ainsi possible de conserver un volume de solution essentiellement constant, et de ce fait l'effet global est le remplacement des solvants/micro-solutés d'origine par de nouveaux solvants/microsolutés. La diafiltration contre un tampon dépourvu de SDS est la méthode préférée 30 d'élimination du SDS, par exemple contre un tampon de phosphate de sodium l O mM, à un pH de 7,5. L'élimination du SDS se poursuit jusqu'à ce que la composition contienne entre 95 g et 250 g de SDS pour chaque mg d'interleukine-2, par exemple entre 118 et 210 g/mg, entre 135 et 180 g/mg, ou environ 160 g/mg. Les propriétés pharmacocinétiques de l'IL-2 sont essentiellement cohérentes dans cette plage et le niveau de SDS n'est pas élevé au point de donner naissance à des préoccupations en matière de toxicité. Toutefois, comme la concentration du SDS chute en dessous d'environ 95 g/mg, la taille des microagrégats augmente brusquement (Figure 1), et s'élève en passant d'une moyenne de 60 molécules d'IL-2 par agrégat à 95 g/mg jusqu'à une moyenne de -180 à 75 g/mg. L'addition puis l'élimination incomplète du SDS a pour résultat les microagrégats d'IL-2 biologiquement actifs que l'on trouve dans le produit PROLEUKINTM. Le simple mélange de SDS et d'IL-2 aux concentrations rencontrées dans le produit PROLEUKINTM ne donne pas de microagrégats. La référence 36 décrit une étude dans laquelle on a ajouté du SDS à des préparations d'IL-2 contenant, tout comme le produit PROLEUKINTM, 1,1 mg d'IL-2. On a découvert que le SDS précipitait l'IL-2 à des concentrations de détergent comprises entre 0,02 % et 0,05 %. Par opposition, l'IL-2 ne précipite pas à ces concentrations de SDS pendant l'élimination du SDS selon l'invention même alors que le SDS diminue et passe de 1 200 g/mg (environ 0,1 % de SDS basé sur 1,1 mg d'IL-2) jusqu'à 70 gg ( Pendant l'élimination du SDS, il est possible de déterminer la concentration de SDS, comme décrit précédemment. Si la méthode d'élimination est standardisée et reproductible, alors la surveillance des niveaux de SDS pendant l'élimination du SDS peut ne pas s'avérer nécessaire, dans la mesure où l'on peut, en règle générale, s'attendre à obtenir le même résultat chaque fois que la procédure est exécutée (bien que des mesures finales de confirmation puissent être réalisées). Néanmoins, alors que la méthode d'élimination est variable, ou alors qu'une surveillance régulière est requise pour d'autres raisons, on peut réaliser une mesure régulière ou continue des niveaux de SDS jusqu'à obtention de la concentration finale souhaitée. Autres étapes du procédé Comme mentionné ci-dessus, les étapes clés du procédé pour la formation de microagrégats d'IL-2/SDS sont (a) l'addition et ensuite (b) l'élimination consécutive du SDS. Alors que ces deux étapes donnent de 1'IL-2 dans une forme appropriée à une utilisation comme principe actif dans un produit pharmaceutique, à eux seuls, ils ne sont pas appropriés pour préparer une composition pharmaceutique finale, et d'autres étapes sont nécessaires. Ces étapes peuvent se dérouler avant les étapes (a) et (b), après les étapes (a) et (b), et/ou entre les étapes (a) et (b). La première étape d'un procédé pour préparer l'IL-2 en vue d'une utilisation pharmaceutique, sera généralement l'expression de la protéine. Ceci implique, en règle générale, l'utilisation d'une cellule hôte contenant un gène codant pour l'IL-2 d'intérêt, telle qu'une cellule hôte bactérienne, une cellule hôte de levure ou une cellule hôte de mammifère. En variante à la voie recombinante, toutefois, il est aussi possible d'activer ou de réguler à la hausse l'expression d'un gène IL-2 endogène dans le génome d'une cellule hôte, (par exemple par activation d'un promoteur), ou de purifier l'hormone à partir d'une source naturelle (par exemple à partir du sang). L'expression de l'IL-2 dans un E. coli recombinant est une voie préférée pour obtenir l'IL-2, avec des inclusions de corps formant l'IL-2. Des E. coli appropriés ont été déposés conformément aux dispositions du Traité de Budapest à l'ATCC en 1984 avec les numéros d'accès 39452 et 39626. Les procédés permettant de cultiver, de recueillir, de lyser ou d'extraire l'IL-2 à partir de divers types de cellules sont connus dans le métier: voir par exemple dans les références 19 à 30 et 37 à 41. Après l'expression, ou si l'on démarre avec un matériau exprimé, on utilise une étape initiale de purification de l'IL-2. Si l'IL-2 est présente à l'intérieur des cellules, alors l'étape de purification impliquera une rupture des cellules (par exemple par choc osmotique, homogénéisation, sonification, etc.) afin de libérer la protéine; si 1'IL- 2 est déjà présente dans la solution, (par exemple si elle a été sécrétée après l'expression), alors la rupture n'est pas nécessaire. L'inactivation des cellules vivantes peut également être réalisée, de même qu'une centrifugation. À la fin de l'étape initiale de purification, l'IL-2 se présentera généralement sous une forme précipitée, en particulier si elle a été purifiée à partir de corps d'inclusion, mais elle aura été séparée des débris cellulaires pour donner une pâte riche en IL-2 destinée à un traitement ultérieur. Après la préparation de l'IL-2 purifiée précipitée, ou si l'on démarre avec un matériau précipité, il est possible de solubiliser l'IL-2 afin de la séparer des autres protéines de la cellule hôte, etc. La solubilisation peut être réalisée en ajoutant un détergent tel que le SDS, de préférence pour donner une concentration finale comprise entre 4 et 4, 5 %. Ceci peut être obtenu de manière pratique en ajoutant une solution de SDSà5%. Après la solubilisation, ou si l'on démarre avec un matériau solubilisé, l'IL-2 peut être réduite, afin de rompre tous les ponts disulfures de la protéine, et en particulier afin de rompre tous les ponts disulfures intermoléculaires. C'est pourquoi, tous les agrégats d'IL-2 covalentsformés par pontage disulfure intermoléculaire sont convertis dans une forme monomérique. Les agents réducteurs utilisés couramment afin de réduire les ponts disulfures comprennent le (3-mercaptoéthanol et le dithiothreitol (DTT). La présence d'un détergent est, en règle générale, maintenue afin de garantir la solubilité de l'IL-2. Après réduction, ou si l'on démarre avec un matériau réduit, l'IL-2 peut ensuite être ré-oxydée pour donner l'IL-2 monomérique avec des ponts disulfures intramoléculaires. Après re-oxydation, ou si l'on démarre avec un matériau re-oxydé, l'IL-2 peut ensuite être purifiée encore pour éliminer les réactifs tels que l'agent oxydant, pour éliminer l'endotoxine, pour éliminer l'ADN et/ou les protéines de la cellules hôte, pour éliminer les isoformes ou les conformères de l'IL-2 (par exemple les formes oxydées de l'IL-2), etc. Cette purification peut être réalisée de manière pratique en utilisant une chromatographie liquide à haute performance à polarité de phases inversée. Après une purification par chromatographie liquide à haute performance à polarité de phases inversée (RP-HPLC), ou si l'on démarre avec un matériau soluble purifié par RP-HPLC, l'IL-2 peut être précipitée, par exemple, en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 0,8 N. Ceci permet non seulement de précipiter l'IL-2 mais aussi de séparer la protéine de tous les solvants organiques utilisés pendant la chromatographie RP-HPLC. Le matériau précipité peut être recueilli de manière pratique par centrifugation. Le matériau obtenu après expression, purification, solubilisation, réduction, oxydation, chromatographie RP-HPLC et précipitation (comme décrit ci-dessus) est idéal pour une resolubilisation et une diafiltration selon le procédé de l'invention, bien qu'il soit également possible d'utiliser l'IL-2 préparée par d'autres voies de purification. En règle générale, toutefois, l'IL-2 est sous une forme précipitée avant l'addition du SDS à l'étape (a) du procédé de l'invention. Comme mentionné ci-dessus, les multimères d'IL-2 liés de manière covalente restent précipités même en présence de SDS. Comme ces multimères sont beaucoup plus grands que les protéines d'IL-2 solubilisées par le SDS (parce qu'ils ne sont pas dissociables), ils peuvent, de manière pratique, être éliminés entre les étapes (a) et (b) (c'est-à-dire après addition de SDS mais avant la diafiltration) par une chromatographie d'exclusion diffusion. La présence de SDS doit être maintenue pendant la chromatographie d'exclusion diffusion afin d'éviter la précipitation de l'IL-2. Après diafiltration pour éliminer le SDS et former des microagrégats, une solution d'IL-2 peut être soumise à une ou plusieurs des étapes suivantes: dilution pour donner une dose finale souhaitée; stérilisation, en général par filtration stérile, par exemple, sur un filtre de 0,22 m; formulation pharmaceutique (voir ci-dessous) ; lyophilisation; conditionnement; etc. Microagrégats Le résultat de la solubilisation et de la diafiltration du SDS par le procédé de l'invention est la formation de microagrégats de SDS et d'IL-2 biologiquement actifs, comme ceux observés dans le produit PROLEUKINTm. La structure moléculaire précise des microagrégats de SDS/IL-2 n'a pas été déterminée mais on pense qu'il s'agit de structures micellaires ou de structures semblables aux micelles. À une concentration de SDS de -160 g/mg, une micelle type contient 30 molécules d'IL-2 et -450 molécules de SDS. Le SDS et l'IL-2 contenus dans les microagrégats interagissent de manière non covalente et la queue hydrophobe de l'IL-2 (résidus 121 à 133) peut interagir avec le squelette alkyle du SDS pour former les micelles. Une partie du SDS peut demeurer libre dans la solution. Les microagrégats peuvent être détectés par diffusion de la lumière, et cette technique permet d'en mesurer la taille (voir ci-dessous). La relation entre la concentration du SDS et la taille moyenne des microagrégats, telle que mesurée par une diffusion de la lumière classique, a été évaluée de manière empirique comme représentée sur la Figure 1. Au fur et à mesure que se poursuit l'élimination du SDS, une concentration est obtenue au-dessous de laquelle la taille des agrégats commence à augmenter de manière exponentielle (voir Figure 1). Selon l'invention, le SDS est éliminé jusqu'à ce que sa concentration soit comprise entre 95 g et 250 g par mg d'IL-2. Sur cette plage, la turbidité (i) spécifique est comprise entre -0,05 et -1,00 c m 2/ g, ce qui implique une moyenne de moins de 50 molécules d'IL-2 par agrégat. À une valeur de 160 g de SDS par mg d'IL-2, la turbidité et) spécifique est d'environ 0,48 (environ 27 molécules d'IL-2). L'homme du métier saura comprendre qu'une composition donnée de SDS/IL-2 selon l'invention contient rarement, si ce n'est jamais, une seule espèce de microagrégats. Au contraire, les mesures réalisées par la technique de diffusion de la lumière révèlent que les microagrégats présentent une variété de tailles entrant dans le cadre d'une distribution et les mesures peuvent révéler une taille moyenne. Alors qu'une composition comprend des microagrégats avec une taille moyenne indiquée, il y a néanmoins, en règle générale, un certain nombre de microagrégats plus petits et un certain nombre de microagrégats plus grands. Les compositions préférées de l'invention comprennent des microagrégats de SDS/IL-2 tels que la composition a une turbidité (i) spécifique comprise entre 0,3 et 0,6, par exemple entre 0,4 et 0,5, ou d'environ 0, 45. Ces compositions concernent, en particulier, les compositions qui ont été reconstituées après lyophilisation, et la valeur dei peut être inférieure avant la lyophilisation et la reconstitution (Figure 14). Les compositions préférées de l'invention comprennent des microagrégats de SDS/IL-2 avec un diamètre hydrodynamique compris entre 11 nm et 13 mn. Les microagrégats préférés de l'invention contiennent entre 10 et 50 molécules d'IL-2, par exemple entre 20 et 35, et de préférence environ 27. Dans les compositions préférées, essentiellement la totalité de l'IL-2 est présente sous forme de microagrégats. Les compositions peuvent être essentiellement exemptes d'IL-2 monomérique. Turbidité (T) spécifique Étant donné que les microagrégats de SDS/IL-2 de l'invention sont affectés par les conditions régnantes, les techniques telles que la chromatographie par exclusion de taille et la centrifugation analytique ne peuvent pas être utilisées pour évaluer leur taille. En revanche, il est possible d'utiliser la technique de diffusion de la lumière classique (CLS) (ou statique) pour détecter et analyser les microagrégats en mesurant leur turbidité. Il est également possible d'utiliser la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les mesures peuvent être réalisées sur une instrumentation spécifique, ou peuvent être réalisées sur un fluorimètre avec des monochromateurs d'excitation et d'émission réglés à une même longueur d'onde (par exemple 467 nm à partir d'une lampe au xénon ou 488 nm à partir d'une lampe à l'argon, toutes les deux étant éloignées des longueurs d'onde qui sont absorbées par l'analyte) et/ou en utilisant des filtres appropriés (par exemple des filtres jaunes), de sorte que le fluorimètre agit en qualité de photomètre CLS 90 . Lors de la mesure de la diffusion de la lumière, un paramètre spectroscopique standard est le taux de diffusion de Rayleigh (Re). Lorsque la diffusion de la lumière est mesurée à 90 par rapport à la lumière incidente (c'est-à-dire lorsque e = 90 ), le taux de diffusion de Rayleigh est connu comme étant R90 [voir par exemple la référence 42], et la diffusion à 90 est utilisée pour réaliser des mesures de turbidité. Des mesures de turbidité (intensité de diffusion à 90 ) peuvent être normalisées par rapport à du toluène de grade optique, en d'autres termes la mesure de la turbidité pour un échantillon de toluène standard est divisée par le R90 du toluène. Grâce à une normalisation réalisée de cette manière, il est ainsi possible de déterminer la valeur absolue de l'intensité de la lumière diffusée. Pour les microagrégats d'IL-2 de l'invention, il est possible de mesurer la turbidité à 467 nm ou 488 nm, à 25 C. Avant d'évaluer la turbidité, les compositions peuvent être centrifugées ou filtrées afin d'éliminer les grosses particules (par exemple les protéines précipitées) qui sinon, faussent les données. Lorsqu'elles sont centrifugées, les compositions d'IL-2 de l'invention conservent, de préférence, au moins 97 % (par exemple 98 % ; >_ 99 % ou plus) de l'IL-2 totale dans le surnageant. Les mesures de la turbidité pour les mélanges de SDS/IL-2 peuvent être converties en valeurs de turbidité (t) spécifique absolue comme suit: Tt098T. 32x10-2 z= x où : T C T1 est l'intensité de la turbidité de la composition d'IL-2, Ti est l'intensité de la turbidité d'un témoin de toluène, C est la concentration d'IL-2 dans la composition d'IL-2. Lorsque T1 et TI sont mesurées en cm-1 et que C est mesurée en g/ml (c'est-à-10 dire en g/cm3), alors les unités de i sont les cm2/g. Il s'agit de la mesure préférée pour évaluer la turbidité des compositions d'IL-2 de l'invention. Les compositions de l'invention peuvent avoir une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g, mais de préférence supérieure à 0,1 cm2/g. Les compositions préférées ont une valeur 'r inférieure à 0,7 cm2/g. Les compositions de l'invention ont, de préférence, une valeur 'r située dans la plage allant de 0,3 à 0,6 cm2/g. Diffusion dynamique de la lumière Comme décrit dans la référence 43, en particulier dans le chapitre 10, il est possible d'utiliser la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour déterminer le diamètre hydrodynamique (ou rayon) des particules à l'intérieur d'une solution. Les agrégats de SDS/IL-2 de l'invention peuvent être détectés au moyen de la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS). En utilisant la DLS, les agrégats préférés ont un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm, de préférence entre 10 nm et 15 nm, de manière davantage préférée entre 11 mn et 13 nm, et de manière préférée entre toutes d'environ 12 nm. Comme représenté sur la Figure 17, les agrégats ont des diamètres répartis autour de cette moyenne. En pratique, la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet de détecter certaines particules plus grandes (par exemple le pic 54 nm sur la 30 Figure 17), mais le diamètre hydrodynamique auquel il est fait référence ci-dessus est celui du pic principal de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), qui représente généralement au moins 90 % en nombre (par exemple au moins 95 %, au moins 97 %, au moins 99 %, au moins 99,5 % ou plus) sur le spectre de diffusion dynamique de la lumière (DLS). Ainsi, au moins 90 % en nombre de particules détectées au moyen de la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont la moyenne numérique spécifiée. La présence de composants à variation lente tels que des particules de poussière ou des phénomènes mixtes est susceptible de complexifier l'interprétation des données issues de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Afin d'éviter de telles complications, les compositions d'IL-2 de l'invention destinées à être mesurées par la diffusion dynamique de la lumière (DLS) sont, de préférence, exemptes de particules ayant un diamètre supérieur à environ 1 m, (par exemple, exemptes de poussière), et ceci peut être obtenu par l'utilisation de filtres appropriés, par exemple, par des filtres de 0,22 m. Les compositions doivent aussi être bien mélangées avant toute mesure par DLS. Si la mesure par DLS révèle la présence d'un composant à variation lente dans la composition, les résultats doivent être rejetés et la mesure doit être répétée sur un nouvel échantillon. L' interleukine-2 L'IL-2 est une protéine bien connue et les procédés et les produits de l'invention peuvent utiliser une quelconque forme appropriée d'IL-2. L'IL-2 est habituellement de l'IL-2 humaine ou un dérivé d'IL-2 qui conserve une activité biologique chez l'homme. L'IL-2 est traduite naturellement chez l'homme en tant que protéine précurseur (par exemple le 153-mer dans la GenBank sous le numéro d'accès NP_000577.2). Le précurseur est clivé (par exemple après Ser-20 dans NP_000577.2) afin de donner un produit mature avec une alanine Nterminale (SEQ ID NO: 4). Lorsqu'elle est exprimée dans E. coli, il est habituel de remplacer le peptide signal naturel par un seul résidu méthionine N-terminal (par exemple SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4). Lorsqu'elle est exprimée, cette méthionine est clivée sans intervention, en laissant le résidu humain naturel N-terminal de l'alanine (par exemple, la SEQ ID NO: 3 est convertie en SEQ ID NO: 1). L'IL-2 de la PROLEUKINTM est dépourvue de résidu Ala-1 naturel. L'absence d'alanine N-terminale habituelle signifie que l'IL-2 de la PROLEUKINTM est référencée de manière formelle en tant que forme des-alanyl-1 de l'IL-2. Les formes des-alanyl-1 de l'IL-2 sont les formes préférées pour une utilisation dans le cadre de l'invention. L'IL-2 de la PROLEUKINTM est également conçue pour avoir deux résidus cystéine internes, au lieu des trois résidus naturels. Cela réduit le nombre d'appariements de résidus cystéine possibles (et donc de ponts disulfures intramoléculaires) de trois à un [46], et améliore le résultat du repliement de la protéine et la stabilité de stockage. La substitution d'un résidu sérine par le résidu naturel Cys-125 [44] signifie que l'IL-2 de la PROLEUKINTM est référencée de manière formelle en tant que forme sérine-125 de l'IL-2. Les formes sérine-125 de l'IL-2 sont les formes préférées pour une utilisation dans le cadre de l'invention. La structure cristalline à trois dimensions d'une forme Ser-125 de l'IL-2 humaine exprimée dans E. coli est disponible dans les bases de données des structures sous le numéro d'accès 3INK . Il est possible de réaliser d'autres substitutions à l'intérieur d'une séquence d'acides aminés d'IL-2, en particulier, celles dans lesquelles la substitution est conservatrice, c'est-à-dire celles qui ont lieu à l'intérieur d'une famille d'acides aminés qui sont en relation au niveau de leurs chaînes latérales. Il est possible de diviser les acides aminés en quatre familles: (1) acides aminés acides - aspartate, glutamate; (2) acides aminés basiques - lysine, arginine, histidine; (3) acides aminés apolaires - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane; (4) acides aminés polaires non chargés - glycine, asparagine, glutamine, cystéine, sérine thréonine, tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane et la tyrosine sont quelquefois classés en tant que famille d'acides aminés aromatiques. Par exemple, il est raisonnablement prévisible qu'un remplacement isolé de la leucine par l'isoleucine ou la valine, de l'aspartate par le glutamate, de la thréonine par la sérine ou qu'un remplacement conservatif similaire d'un acide aminé par un acide aminé structurellement apparenté n'aura aucun effet majeur sur l'activité biologique. La personne du métier saura facilement déterminer des régions de l'IL-2 susceptibles de tolérer un changement, basé sur une variation naturelle, des alignements des formes actives des protéines, etc., et les protéines substituées peuvent faire l'objet d'essais afin de déterminer leur activité biologique par exemple selon la norme 86/504. Il est également possible de trouver dans le métier des directives portant sur les régions de la protéine d'IL-2 susceptibles d'être modifiées par l'intermédiaire de substitutions, de suppressions ou d'insertions de résidus (par exemple, des études sur les relations entre la structure et la fonction et/ou des études sur les liaisons), comme celles des références 45 à 52, etc. La référence 53 décrit une variété de mutants de l'IL-2, comprenant: Asn-26-Gln; Trp-121-Phe; la suppression de tous les résidus suivants Arg-120; et leurs formes Met-1. La référence 44 décrit l'IL-2 avec une suppression ou une substitution de Cys-125, avec ou sans Ala N-terminal. La référence 54 décrit une substitution ou une suppression de résidus comprenant les numéros 2, 3, 4, 5, 6, 104 et 125. La Met-104 est sensible à l'oxydation, aussi la mutation de ce résidu (par exemple, la substitution avec Glu, Val, Ala, etc.) peut améliorer la stabilité [55]. La référence 56 décrit des substitutions d'IL-2 au niveau d'Asp-20 (avec His ou I1e), au niveau d'Asn-88 (avec Arg, Gly ou Ile), et/ou au niveau de Gln-126 (avec Leu ou Glu) qui ont été rapportée comme ayant réduit la toxicité et la sélectivité pour les récepteurs d'IL-2 à haute affinité. La référence 57 décrit des substitutions d'Arg-38-Ala et de Phe-42-Lys afin de réduire la toxicité en vue d'une utilisation dans le cadre d'une immunothérapie. La référence 58 décrit une mutation d'une séquence tripeptidique native Xaa'-Asp-Xaa2, où Xaal est Leu, Ile, Gly ou Val, et Xaa2 est Val, Leu ou Ser, afin de réduire une fuite vasculaire. La référence 59 décrit des peptides avec une méthionine N-terminale fusionnée aux 30 premiers résidus d'IL- 2 éventuellement avec une substitution Asp-20-Lys, qui sont dits conserver une activité analogue à l'IL-2. D'autres substitutions connues comprennent: T7A, T7D, T7R, KSL, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, TlON, Q11A, Q11R, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, 124L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K35I, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L36L, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M46L, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P65I, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W, L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, P95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N1 19Q, T123S, T123C, Q126I, et Q126V. Les variants biologiquement actifs de l'IL-2 ont généralement une identité de séquence d'acides aminés d'au moins environ 70 %, (par exemple > 80 % ; > 90 % ; > 95 % ; > 98 % ; > 99 %) avec la séquence d'acides aminés de la molécule polypeptidique d'IL-2 de référence, telle que l'IL-2 humaine native décrite ci-dessus. Un variant peut, par exemple, différer de seulement 1 à 15 résidus d'acides aminés, de seulement 1 à 10 résidus, tels que 6 à 10, de seulement 5, de seulement 4, 3, 2, ou même de seulement 1 résidu d'acide aminé. La présence d'une extension en C-terminal de l'IL-2 a été rapportée [60]. L'IL-2 utilisée avec l'invention, de préférence, ne comporte pas une telle extension en 20 C-terminal. D'autres formes de l'IL-2 susceptibles d'être utilisées comprennent des séquences non humaines. Par exemple, l'IL-2 peut provenir de: singe rhésus (Mucucu mulatto; N d'accès GenBank P51498) ; babouin olive (Papio unubis; GenBank Q865Y1) ; mangabey enfumé (Cercocebus torquatus atys; P46649) ; macaque mangeur de crabe (Macaca fascicularis; Q29615) ; gibbon commun (Hylobates lar; ICGI2) ; singe écureuil commun (Saimiri sciureus; Q8MKH2) ; vache (Bos taures; P05016 ou NP-851340; séquence mature représentée par les résidus 24 à 158 du N d'accès GenBank NP-851340) ; buffle des Indes (Pubalus bubalis; Q95KP3) ; cheval (Equus caballus; P37997) ; chèvre (Capra hircus; P36835) ; mouton (Ovis aries; P19114) ; cochon (Sus scrofu; P26891) ; cerf rouge (Cervus elaphus; P51747) ; chien (Canis familiaris; Q29416) ; chat (Felis catus; 407885) ; lapin (Oryctolagus cuniculus; 077620) ; épaulard (Orcinus orca; 097513) ; éléphant de mer du Nord (Miroungu angustirostris; 062641) ; souris domestique (Mus musculus; NP-032392) ; souris sauvage occidentale (Mus spretus; 408867) ; rat surmulot (rat de Norvège) (Rattus norvegicus; P17108) ; gerbille de Mongolie (Meriones unguiculatus; Q08081). Il est également possible d'utiliser l'une quelconque des formes de variants décrits dans ces entrées de la GenBank. Ces entrées de la GenBank décrivent généralement des séquences précurseurs qui, comme décrit ci- dessus pour la séquence humaine, sont traitées afin de donner une forme finale biologiquement active, par exemple, par clivage des 20 premiers acides aminés. Les formes des-alanyl-1, sérine-125 de l'IL-2 humaine sont particulièrement préférées pour une utilisation dans le cadre de l'invention. La forme de l'IL-2 préférée entre toutes comporte la séquence d'acides aminés 132-mer représentée sur la Figure 2 (SEQ ID NO: 1), telle que rencontrée dans le produit PROLEUKINTM. Les compositions sont, de préférence, dépourvues d'IL-2 qui ne comporte pas d'Ala N- terminale. La protéine de la Figure 2 peut être exprimée en utilisant la séquence d'acide nucléique représentée sur la Figure 4 (SEQ ID NO: 2), après clivage de la méthionine N-terminale traduite. L'IL-2 dans le produit PROLEUKINTM est non glycosylée, en conséquence de l'hôte d'expression E. coll. L'IL-2 non glycosylée est préférée pour une utilisation dans le cadre de l'invention. Les procédés permettant de détecter la présence d'IL-2 dans une composition et de la quantifier sont connus dans le métier. La détection immunologique faisant appel à des anticorps anti-IL-2 (par exemple le dosage par la méthode ELISA) est le procédé de détection le plus courant, et ces procédés peuvent être utilisés de manière quantitative. Parmi les autres procédés quantitatifs, il faut citer l'analyse d'acides aminés, le dosage des protéines par la méthode de Lowry avec une protéine étalon approuvée par la réglementation, les dosages par chromatographie I-IPLC et les mesures d'absorption intrinsèque dans l'ultraviolet. L'unité de mesure quantitative standard pour l'IL-2 est l'Unité Internationale (UI) qui repose, non pas sur la masse des protéines, mais sur une activité dans un dosage biologique. Selon la norme 86/504, 1 UI correspond à la quantité d'IL-2 qui produit 50 % de la prolifération maximale d'une lignée cellulaire CTLL-2 dépendante de 1'IL-2 établie [61]. La quantification de l'activité de 1'IL-2 dans d'autres préparations est réalisée en comparant les courbes dose-réponse de la préparation avec des étalons disponibles (par exemple l'ampoule standard d'IL-2 de l'Organisation Mondiale de la Santé (WHO), qui contient 100 UI/ml après reconstitution) en faisant appel à une analyse des lignes parallèles, ou à un logiciel informatique tel que le programme ALLFIT [62, 63]. En pratique, lorsque la fabrication est standardisée, il est alors possible d'effectuer une conversion entre le poids du médicament et les unités internationales (UI). Pour le produit PROLEUKIN', par exemple, la conversion est la suivante: 1,1 mg d'IL-2 équivalent à 18 x 106 UI. L'activité peut être convertie en une activité spécifique (c'est-à-dire une activité par unité de masse d'IL-2 par exemple UI/mg) en la divisant par la masse d'IL-2 présente. Une composition préférée de l'invention possède une activité spécifique comprise entre 16 et 17 MUUmg. Compositions pharmaceutiques Les procédés de l'invention produisent des microagrégats d'IL-2/SDS qui sont appropriés pour une utilisation pharmaceutique chez l'homme, et, ainsi l'invention fournit une composition pharmaceutique comprenant les microagrégats d'IL-2/SDS de l'invention. Toutefois, au lieu d'être simplement utilisés immédiatement après la diafiltration, les microagrégats vont, généralement, être formulés avant leur administration à des patients. Par exemple, les microagrégats d'IL-2 peuvent être dilués afin de donner une concentration standard, tout en maintenant le rapport IL-2/SDS. La dilution pour donner une concentration d'IL-2 d'environ 1,1 mg/ml est habituelle. Les microagrégats (par exemple, après dilution) peuvent être mélangés à des stabilisateurs, en particulier, s'ils doivent être lyophilisés. L'addition de sucres (par exemple saccharose, tréhalose) est habituelle pour apporter de la stabilité pendant la lyophilisation, et le mannitol est un stabilisateur préféré. Cet alcool de sucre peut être ajouté pour donner une concentration finale comprise entre 40 et 50 (par exemple d'environ 45,5 mg) de mannitol par mg d'IL-2 (50 mg pour 1,1 mg d'IL-2). Il est également possible d'ajouter de la sérum albumine humaine (de préférence recombinante) en tant que stabilisateur. On peut aussi utiliser des mélanges de sucres, par exemple de saccharose et de mannitol, ou de tréhalose et de mannitol, etc. Il est possible de rajouter un tampon à la composition de microagrégats, par exemple, un tampon Tris, un tampon d'histidine, un tampon de glycine ou de préférence, un tampon de phosphate (par exemple, contenant du phosphate monosodique et du phosphate disodique). L'addition d'un tampon permettant d'obtenir un pH compris entre 7,2 et 7,8 est préférée, et en particulier un pH d'environ 7,5. Les compositions comprenant les microagrégats peuvent être stérilisées, généralement par une stérilisation sur filtre, par exemple, par l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m. Celle-ci peut être précédée d'une filtration réalisée au moyen d'un filtre ayant des pores plus importants. Les compositions aqueuses comprenant les microagrégats peuvent être conditionnées directement dans des seringues prêtes pour une injection. Elles peuvent aussi être conditionnées dans des nébuliseurs, prêts pour une inhalation. Les compositions aqueuses comprenant les microagrégats peuvent être lyophilisées avant distribution. Le matériau aqueux ou lyophilisé peut être conditionné dans des récipients (par exemple, dans des flacons), qui peuvent ensuite être fermés hermétiquement. La lyophilisation s'effectue généralement à l'intérieur des flacons, et elle est suivie d'un bouchage hermétique après lyophilisation. Le matériau lyophilisé équivalent à 22 x 106 UI d'IL-2 peut être conditionné dans un seul flacon en tant que dose unitaire, en vue de sa reconstitution dans un volume aqueux final d'environ 1,1 ml, pour donner environ 18 x 106 UUml. Les quantités fractionnées (par exemple 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/8) de celle-ci peuvent également être conditionnées sous forme de doses unitaires. En particulier, il est possible d'utiliser des doses unitaires d'environ 9 x 106 UI, d'environ 4,5 x 106 UI et d'environ 14 x 106 UI. Pour la reconstitution après lyophilisation, il est possible d'utiliser de l'eau stérile pour injection. Il est également possible de reconstituer un gâteau lyophilisé avec une composition aqueuse comprenant de la sérum albumine humaine (de préférence recombinante). La reconstitution dans un volume aqueux compris entre 1,0 ml et 1,2 ml est préférée (en d'autres termes, l'IL-2 peut être diluée pour donner la même concentration qu'avant lyophilisation). Ce matériau reconstitué peut ensuite être dilué de manière aseptique dans un volume de liquide plus important en vue d'une perfusion par voie intraveineuse, par exemple, dans environ 50 ml d'une solution D5W (solution aqueuse de dextrose à 5% pour injection). La turbidité spécifique reste essentiellement constante lors d'une dilution avec une solution D5W, jusqu'à ce que la concentration d'IL-2 diminue aupoint d'être inférieure à environ 0,1 mg/ml. La dilution peut s'effectuer dans divers récipients, par exemple, dans des bouteilles en verre, dans des sachets en plastique (par exemple en poly(chlorure de vinyle), etc. Il faut éviter toute dilution qui conduise à une concentration finale d'IL-2 située en dehors de la plage allant de 30 à 70 g/ml. Les conditions qui provoquent des changements dans la microagrégation doivent être évitées, par exemple, une reconstitution avec de l'eau bactériostatique pour injection ou avec du chlorure de sodium pour injection à 0,9 %. Une première composition pharmaceutique préférée est ainsi une composition aqueuse avec un pH d'environ 7,5, comprenant 1,1 mg/ml d'IL-2, 0,18 mg de SDS, 50 mg/ml de mannitol et un tampon de phosphate, où l'IL- 2 et le SDS forment des microagrégats dans lesquels le nombre moyen de molécules d'IL-2 par agrégat est compris entre 10 et 50. Ces compositions peuvent être reconstituées à partir du matériau lyophilisé. Une deuxième composition pharmaceutique préférée est le produit de la dilution de la première composition pharmaceutique préférée dans une solution D5W. Des compositions préférées sont dépourvues de conservateurs, dépourvues d'antibiotiques et dépourvues de protéines autres que l'IL-2 (et sont également dépourvues de sérum alumine humaine (HSA)) c'est-à-dire que ces matières sont indétectables. Procédés et utilisations pharmaceutiques L'invention fournit un procédé permettant de traiter un patient comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique de l'invention au patient. Le patient est, de préférence, un humain et peut être un enfant (c'est-à-dire un enfant en bas âge ou un nourrisson), un adolescent ou un adulte, mais est généralement un adulte. L'invention fournit aussi les microagrégats de SDS/IL-2 de l'invention en vue de leur utilisation comme médicament. L'invention fournit aussi l'utilisation des microagrégats de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter un patient. Ces utilisations, procédés et médicaments sont, de préférence, destinés au traitement du cancer, en particulier des cancers à tumeurs solides tels que les carcinomes des cellules rénales ou les mélanomes, lesquels cancers peuvent être métastatiques. Les utilisations, procédés et médicaments peuvent aussi être utilisés pour le traitement des patients qui ont reçu une transplantation de tissu ou d'organe ou qui s'apprêtent à en recevoir une. Les utilisations, procédés et médicaments peuvent aussi être utilisés pour le traitement des patients qui sont infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), y compris les patients ayant ou non le SIDA déclaré. C'est pourquoi, pour les patients susceptibles d'être traités avec l'invention, il aura été établi un diagnostic de cancer. Toutefois, les patients qui ne doivent pas être traités selon l'invention peuvent être: (1) les patients ayant une hypersensibilité à l'IL-2 ou à tout autre composant de la composition pharmaceutique; (2) les patients qui sont à un stade ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 2; (3) les patients qui présentent à la fois un stade ECOG > 1 et plusieurs organes comportant des sites métastatiques de la maladie et une période inférieure à 24 mois entre le diagnostic initial de la tumeur primaire et la date à laquelle le patient est évalué en vue d'un traitement par l'IL- 2; (4) les patients avec des antécédents lourds ou pour lesquels il existe une preuve manifeste de maladie cardiaque grave; (5) les patients pour lesquels il existe une preuve d'infection active nécessitant un traitement antibiotique; (6) les patients avec un PaO2 Les procédés permettant de vérifier l'efficacité d'un traitement avec l'IL-2 thérapeutique sont connus dans le métier. Les courbes de demi-vie sérique de l'IL-2 chez l'homme faisant suite à l'administration par voie intraveineuse en bolus ou en perfusion peuvent être décrites comme étant de type bi-exponentiel. Pour un bolus, la demivie T lita est de 8 minutes et la demi-vie T112a est de 88 minutes; pour une perfusion, la demi-vie Tv2a est de 15 minutes et la demi-vie T112a est de 96 minutes. Les niveaux de sérum observés sont proportionnels à la dose d'IL-2. Les caractéristiques des médicaments appropriés sont données ci-dessus dans la section intitulée Compositions pharmaceutiques . Ces compositions sont généralement administrées directement à un patient. L'administration peut être réalisée par injection parentérale (par exemple par voie intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire ou dans l'espace interstitiel d'un tissu) ou par voie rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, orale, pulmonaire ou par une autre administration par voie mucosale. En règle générale, toutefois, l'IL-2 est administrée par injection intraveineuse (par exemple par perfusion continue ou par bolus) ou par injection sous-cutanée (par exemple par perfusion continue ou par bolus). Le dosage de l'IL-2 est habituellement proportionnel à la taille corporelle du patient, qui est évaluée en poids corporel (kg) ou en surface corporelle (BSA; exprimée en m2, exprimée ou estimée par une combinaison de la stature et du poids du patient). Bien qu'il n'existe aucune conversion exacte entre le calcul des doses rapportées au poids et le calcul des doses rapportée à la surface corporelle (BSA), il existe une bonne approximation: pour une personne de poids et de stature moyens (50ème percentile pour chacun), 25 000 UI/kg = 1 MUI/m2. Le traitement peut suivre un planning posologique à dose unique ou à plusieurs doses. Les doses peuvent être administrées par bolus ou par perfusion. Un planning posologique type pour l'IL-2 consiste à administrer 18 x 106 UI par m2 de surface corporelle et par 24 heures sous forme de perfusion continue pendant 5 jours, suivis d'une interruption pendant 2 à 6 jours au terme de laquelle une administration d'IL-2 par voie intraveineuse en perfusion continue est répétée comme auparavant pendant jours supplémentaires, suivis d'une interruption de trois semaines sans administration d'IL-2. Il s'agit là d'un seul cycle d'induction de l'IL-2. Après la période de repos de trois semaines du premier cycle, un deuxième cycle d'induction peut commencer. Il est possible de donner jusqu'à 4 cycles d'entretien avec des intervalles de 4 semaines aux patients qui répondent ou présentent une stabilisation de la maladie. Toutefois, si un patient ne peut tolérer ce planning posologique, il faut réduire la dose ou interrompre le traitement jusqu'à obtention d'une toxicité modérée. Un autre planning posologique pour l'IL-2 consiste à administrer 6 x 105 UI par kg de poids corporel, en bolus intraveineux toutes les 8 heures, soit un total de 14 doses sur 5 jours, puis à administrer un deuxième traitement après une période d'interruption de 9 jours. Les modes d'administration préférés comprennent: la perfusion intraveineuse pour le traitement des carcinomes des cellules rénales métastatiques; perfusion intraveineuse pour le traitement des mélanomes métastatiques; bolus sous-cutané pour le traitement des carcinomes des cellules rénales métastatiques; perfusion sous-cutanée pour le traitement des carcinomes des cellules rénales métastatiques; administration pulmonaire par inhalation pour le traitement des carcinomes des cellules rénales métastatiques avec métastases au poumon. Traitements par association médicamenteuse Il est possible d'utiliser les microagrégats d'IL-2 de l'invention en tant que principe actif de produits pharmaceutiques. De tels produits pharmaceutiques s'utilisent seuls afin de traiter des patients ou peuvent s'utiliser en association avec d'autres principes actifs. En règle générale, l'IL-2 n'est pas mélangée avec l'autre principe actif avant administration, mais l'IL-2 et l'autre principe actif seront plutôt administrés en tant que médicaments indépendants distincts dans un protocole d'association de médicaments. Le traitement par association médicamenteuse se révèle particulièrement adapté au traitement des cancers y compris des cancers malins et métastatiques. Ainsi, l'invention fournit (a) les microagrégats d'IL-2 de l'invention, et (b) un deuxième agent pharmaceutique pour une administration distincte simultanée ou séquentielle. L'invention fournit également une préparation ou un système pharmaceutique comprenant (a) un premier agent pharmaceutique, qui comprend les microagrégats d'IL-2 de l'invention; et (b) un deuxième agent pharmaceutique, où lesdits premier et deuxième agents sont dans un mélange ou sont des compositions distinctes, par exemple pour une administration distincte simultanée ou séquentielle. L'invention fournit également une trousse comprenant (a) un premier agent pharmaceutique, qui comprend les microagrégats d'IL-2 de l'invention; et (b) un deuxième agent pharmaceutique. La présente invention fournit également l'utilisation (a) des microagrégats d'IL-2 de l'invention et (b) d'un deuxième agent pharmaceutique dans la fabrication d'un médicament de combinaison. L'invention fournit également l'utilisation des microagrégats d'IL-2 de l'invention dans la fabrication d'un médicament, dans laquelle le médicament est destiné à être administré à un patient qui a été préalablement traité avec un deuxième agent pharmaceutique. De la même manière, l'invention fournit également l'utilisation d'un deuxième agent pharmaceutique dans la fabrication d'un médicament, dans laquelle le médicament est destiné à être administré à un patient qui a été préalablement traité avec les microagrégats d'IL-2 de l'invention. Ce traitement préalable peut être récent (par exemple, au cours des 24 heures précédant l'administration dudit médicament), intermédiaire (par exemple, antérieur à 24 heures mais ne dépassant pas 4 semaines), plus éloigné (par exemple, antérieur à 4 semaines), ou très éloigné (par exemple antérieur à au moins 6 mois), ces durées faisant référence à la dose la plus récente administrée en pré-traitement. Le patient peut être réfractaire au traitement par l'agent pharmaceutique ayant été administré dans le pré-traitement. L'invention fournit également l'utilisation des microagrégats d'IL-2 de l'invention pour la fabrication d'un médicament, dans laquelle le médicament est co-administré avec un deuxième agent pharmaceutique. De la même manière, l'invention fournit également l'utilisation d'un deuxième agent pharmaceutique dans la fabrication d'un médicament, dans laquelle le médicament est coadministré avec les microagrégats d'IL-2 de l'invention. Les deux agents sont, de préférence, administrés à 4 heures d'intervalle. Les deuxièmes agents pharmaceutiques préférés sont choisis dans le tableau suivant, qui comprend également les informations détaillées des états à traiter pour lesquels il est possible d'utiliser la thérapie par association médicamenteuse (et, lorsque cela est approprié, des informations détaillées de base sur le mode par lequel la thérapie par association médicamenteuse peut être administrée) : Deuxième agent Pour le traitement de Un anticorps anti-CD20, Lymphome non Hodgkinien, leucémie lymphoïde tel que le rituximab, chronique. l'ibritumomab ou le En particulier lorsqu'un patient NHL est réfractaire au tositumomab, par traitement par le rituximab. exemple RituxanTM, MabtheraTM, ZevalinTM, HuMax-CD20TM, BexxarTM Un anticorps anti-CD40 Lymphome non Hodgkinien, multiple myélome, leucémie lymphoïde chronique. Un anticorps anti-Her2, Cancer du sein. tel que le trastuzumab, En particulier lorsque le patient est réfractaire au par exemple HorceptinTM traitement par le trastuzumab. Anticorps anti-EGFR, tel Cancer du poumon à grandes cellules, ou cancer du colon que le cetuximab, par ou du rectum. exemple ErbituxTM En particulier lorsqu'une tumeur sur-exprime le EGFR. En particulier lorsqu'un patient est réfractaire au traitement par le cetuximab. Un anticorps anti-VEGF, Cancer du colon et du rectum. tel que le bevacizumab, par exemple AvastinTM Un anticorps anti-CD52, Leucémie lymphoïde chronique. tel que l'alemtuzumab, par exemple CampathTM Un anticorps anti-CD33, Leucémie myéloblastique aiguë tel que le gemtuzumab, par exemple MylotargTM Un agoniste du récepteur Mélanome malin à stade avancé (par exemple au stade H2, tel que l'histamine IV), leucémie myéloïde aiguë ou carcinome des cellules ou un sel d'histamine rénales. pharmaceutiquement En particulier si le patient présente des métastases dans le acceptable, par exemple foie. le dichlorhydrate Les deux agents peuvent être administrés par injection d'histamine par voie sous-cutanée. Pour le mélanome: IL-2 par voie sous-cutanée deux fois par jour (BID) les jours 1 et 2 des semaines 1 et 3, et les jours 1 à 5 des semaines 2 et 4; dichlorhydrate d'histamine par voie sous-cutanée sur 10 à 30 minutes les jours 1 à 5 de toutes les 4 semaines. Pour la leucémie myéloïde aiguë, commencer après une transplantation de cellules souches autologues ou après une chimiothérapie. BCG (Bacille de Cancer de la vessie. Calmette et Guérin) . L'IL-2 peut être administrée à l'aide d'une sonde de Foley. Thalidomide Lymphome non Hodgkinien. Lenalidomide Multiple myélome. Inhibiteurs de Lymphome non Hodgkinien. protéasome, tels que le bortezomib par exemple VelcadeTM CVP , qui est une Lymphome non Hodgkinien. combinaison de: Administré par injection par voie intraveineuse. cyclophosphamide, vincristine et prednisone. CHOP , qui est une Lymphome non Hodgkinien. combinaison de: Les cyclophosphamide, hydroxydoxorubicine, vincristine cyclophosphamide, sont administrés par injection par voie intraveineuse; la hydroxydoxorubicine, prednisone est dispensée sous forme de comprimés par vincristine et prednisone. voie orale. CHOP-R , qui est une Lymphome non Hodgkinien. combinaison de En particulier pour les patients réfractaires au CHOP CHOP avec du ou au R seul. rituximab. CVP-R , qui est une Lymphome non Hodgkinien. combinaison de CVP En particulier pour les patients réfractaires au CVP ou avec du rituximab. au R seul. Interféron-a ( IFNa ) Cancer du sein, cancer du colon et du rectum ou carcinome des cellules rénales. Interféron-y ( IFNy ) Cancer 5-fluoro-uracile Cancer du sein, cancer du colon et du rectum ou ( 5-FU ) carcinome des cellules rénales. Combinaison de 5-FU & Cancer du sein, cancer du colon et du rectum ou IFNa carcinome des cellules rénales. Composés VIH. anti-rétroviraux Un inhibiteur de tyrosine Cancer des cellules rénales ou mélanome. kinase, tel que Bay43- 9006 ou SU11248 Decitabine Cancer de la thyroïde, syndromes myélodysplastiques, mélanome ou carcinome des cellules rénales. Lorsque le deuxième agent est un anticorps, il est de préférence un anticorps monoclonal, de manière davantage préférée un anticorps humanisé ou humain. Les anticorps seront en règle générale administrés par injection, par exemple par voie sous-cutanée ou intraveineuse. Les anticorps peuvent être conjugués à d'autres agents actifs, par exemple le tiuxetan, l'ozogamicine, des radionucléides, 131I, etc., en particulier pour le traitement du cancer. En règle générale, le deuxième agent peut être un anticorps quelconque qui confère la cytotoxicité cellulaire dépendant des anticorps (ADCC). La thérapie par association médicamenteuse à base d'IL-2 est plus utile avec des anticorps qui servent de médiateurs à la cytotoxicité cellulaire dépendant des anticorps (ADCC) pour traiter le cancer qu'avec des agents qui traitent le cancer par inhibition de la vascularisation ou par altération de la transduction des signaux du cycle cellulaire. Définitions: Le terme comprenant englobe incluant ainsi que consistant en , par 5 exemple une composition comprenant X peut consister exclusivement en X ou peut comprendre un élément supplémentaire, par exemple X + Y. Le terme environ en relation à une valeur numérique x signifie, par exemple, x 10 %. Lorsque cela est nécessaire, le terme environ peut être omis. Le terme pratiquement ou essentiellement n'exclut pas complètement , par exemple une composition qui est pratiquement ou essentiellement exempte de Y peut être complètement exempte de Y. Lorsque cela est nécessaire, le terme pratiquement ou essentiellement peut être omis de la définition de la présente invention. Il est possible de déterminer le pourcentage d'identité de séquence en utilisant un algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman utilisant une recherche affinée des écarts avec une pénalité d'ouverture d'écarts de 12 et une pénalité d'extension d'écarts de 2, matrice BLOSUM de 62. L'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman est présenté dans la référence 64. Description des figures: La figure 1 représente l'augmentation de la turbidité (i) spécifique lorsqu'on élimine le SDS durant la diafiltration. La figure 2 et la figure 3 représentent la séquence d'acides aminés d'IL2 dans le produit PROLEUKINTM (SEQ ID N 1). Cette séquence (i) est dépourvue de la méthionine N-terminal de la SEQ ID N 3, (ii) est dépourvue du résidu alanine trouvé dans le N-terminal de l'IL-2 naturelle mature humaine observée dans la SEQ ID N 4, et (iii) présente une substitution de sérine au niveau du résidu Cys-125 observée dans la SEQ ID N 4. La figure 4 représente une séquence des nucléotides codant pour la séquence de la figure 2 (SEQ ID N 2, qui comprend les codants d'initiation et d'arrêt, et est exprimée par la SEQ ID N 3 avant la coupure de la méthionine N-terminale). Les numéros à gauche indiquent le nombre de la première base dans chaque ligne, tel que compté à partir de l'extrémité 5' du brin d'ADN (+) du gène d'IL-2. Les numéros sous la séquence d'acides aminés indiquent les nombres de résidus, tels que comptés à partir de l'extrémité N-terminale de l'IL-2 humaine native. Les flèches indiquent les différences de nucléotides comparativement à l'IL-2 humaine (c'est-à-dire les différences entre la SEQ ID N 2 et la SEQ ID N 5). La figure 5 représente la turbidité spécifique (i, cm2/g) de sept échantillons utilisés pour les tests pharmacocinétiques, avec différentes concentrations de SDS ( g de SDS par mg d'IL-2), et la figure 6 représente la proportion d'IL-2 totale qui pourrait être granulée par centrifugation dans les sept échantillons. La figure 7 représente la bioactivité plasmatique pour six parmi les sept échantillons. La figure 8 compare les échantillons de 160 g/mg et 25 g/mg, et la figure 9 est une composition des figures 7 et 8. Les axes X indiquent le temps (en heures) après l'injection; les axes Y indiquent la bioactivité plasmatique (ng/ml). La figure 10 représente la turbidité t (cm2/g) par rapport à une concentration de SDS ( g/mg) durant la diafiltration, et la figure 11 convertit la turbidité i en poids moléculaire (kDa). La figure 12 illustre la chute dans la concentration de SDS durant la diafiltration. La figure 13 superpose les résultats de turbidité de la figure 10 sur le profil d'élimination de SDS de la figure 12. La figure 14 illustre l'effet de la lyophilisation sur la turbidité T (cm2/g). Les canées représentent les valeurs pré-lyophilisation, et les cercles représentent les valeurs post-lyophilisation. L'axe X représente la concentration de SDS des échantillons ( g/mg). La figure 15 représente la bioactivité des microagrégats d'IL-2, avant et après dilution avec du sérum, et une comparaison avec l'IL-2 monomérique. Les figures 16 et 17 représentent les spectres de diffusion dynamique de la lumière pour les microagrégats d'IL-2. La figure 16 est répartie en fonction de la masse des composants de la solution, et la figure 17 est répartie en fonction du nombre. Exemples de réalisation: 1/ Préparation des microagrégats d'IL-2 On a mis en culture des E. coli transformés avec un plasmide présentant la séquence des nucléotides de la figure 4 dans des conditions normales, pour que la protéine IL-2 ayant la séquence de la figure 2 soit exprimée. Après la culture, l'IL-2 était principalement sous la forme de corps d'inclusion. La première récupération de l'IL-2 comprenait la concentration, la rupture des cellules, la diafiltration, l'inactivation, une nouvelle rupture et la suspension dans du saccharose. La concentration des cellules recueillies a été réalisée en utilisant des filtres à faisceau horizontal afin de réduire le volume d'utilisation d'approximativement cinq fois. Les cellules étaient décomposées par homogénéisation afin de faciliter l'isolement des corps d'inclusion de l'IL-2. On a éliminé les sels des milieux de fermentation par diafiltration et les bactéries hôtes dans la solution diafiltrée ont été tuées par l'addition d'un alcool. Après traitement à l'alcool, les cellules étaient décomposées par homogénéisation. On a ajouté le saccharose pour obtenir un mélange ayant une densité supérieure, afin de permettre la séparation des corps d'inclusion de l'IL-2 à partir de débris cellulaires pendant la centrifugation. On a récupéré la pâte particulaire d'IL-2 par centrifugation, on l'a transformée en fractions et stockée à -70 C ou à une température plus froide, jusqu'au traitement suivant. On a solubilisé la pâte particulaire d'IL-2 avec du SDS et on l'a réduite avec du dithiotréitol (DTT) afin d'obtenir une forme monomérique de l'IL2 soluble sans aucun pont disulfure. On a exécuté cette étape du procédé afin d'accroître le rendement lorsque l'IL-2 est chromatographiée dans l'étape suivante. On a purifié la forme soluble monomérique de l'IL-2 par un procédé comprenant les étapes de chromatographie d'exclusion de taille (SEC), oxydation, concentration, chromatographie liquide à haute performance à polarité de phases inversée (RP-HPLC), précipitation et centrifugation. On a exécuté la première étape chromatographique de SEC afin de séparer l'IL-2 des protéines hôtes et des acides nucléiques. On a récupéré les fractions contenant l'IL-2 et on les a regroupées. On a oxydé l'IL-2 afin d'obtenir le pont disulfure intramoléculaire. On a effectué la concentration de la solution d'IL-2 en utilisant l'ultrafiltration afin de réduire le volume d'utilisation. On a exécuté la deuxième étape chromatographique, la chromatographie liquide à haute performance à polarité de phases inversée préparative (RP-HPLC), afin de séparer l'IL-2 des endotoxines bactériennes, des acides nucléiques et des protéines hôtes, et afin d'éliminer les isoformes d'IL-2, y compris les formes oxydées. On a recueilli les fractions contenant l'IL-2 et on les a regroupées. On a précipité l'IL-2 par addition d'hydroxyde de sodium (NaOH) et on l'a recueillie par centrifugation. On a exécuté cette étape du procédé afin d'éliminer les solvants utilisés dans la purification par chromatographie RP-HPLC (RP-HPLC). Le matériau à ce stade est désigné par pâte HPLC . On a ensuite re-solubilisé la pâte HPLC par addition d'une solution de Na2HPO4 0,05 M + SDS à 1 %. Lorsqu'on ajoute le SDS à une concentration suffisante, la composition contient alors principalement l'IL-2 monomérique solubilisée, mais une petite quantité d'IL-2 oligomérisée (c'est-à-dire des molécules d'IL-2 liées de manière covalente sous la forme d'oligomères) peut s'être formée durant la purification. On a éliminé ces oligomères par gel filtration, qui élimine également tous les solvants organiques résiduels provenant des étapes précédentes. Etant donné que le SDS peut être toxique pour les cellules, il est éliminé à partir de l'IL-2 solubilisée. On a soumis la solution à une diafiltration contre un tampon de phosphate de sodium 10 mM, pH 7,5, jusqu'à ce que le niveau de SDS atteigne approximativement 160 g/mg d'IL2. Les microagrégats d'IL-2 et de SDS commencent à se former à environ 500 à 600 g/mg, et leur taille s'accroît graduellement à mesure que le niveau de SDS est davantage réduit jusqu'au niveau cible de 160 g/mg (figure 1). L'élimination du SDS, qui est essentielle pour la formation des microagrégats, constitue la dernière étape dans le procédé de purification de l'IL-2, préalablement à la formulation. 2/ Formulation des microagrégats d'IL-2 pour une utilisation pharmaceutique On a testé le mélange de SDS/IL-2 diafiltré contenant les microagrégats, afin de déterminer la concentration de protéine (mg/ml) par division de son absorbance à 280 nm par le coefficient d'atténuation de l'IL-2 (0,79). On a également mesuré le volume de la solution d'IL-2 diafiltrée (ml). On a calculé la quantité totale de la protéine d'IL-2 (mg) par multiplication du volume de la solution d'IL-2 diafiltrée par la concentration de protéine. On a calculé le volume final d'utilisation (ml) pour la formulation par multiplication du mg total de protéine par le facteur 0,909. Ce facteur prend en considération la perte d'IL-2 pendant la filtration. Afin de stabiliser l'IL-2 pendant la lyophilisation, on a ajouté V4 de volume d'une solution de mannitol à 20 %, pour donner une concentration finale en mannitol de 5 % (c'est-à-dire 50 mg/ml). On a également ajouté un tampon de phosphate de sodium 10 mM, pH 7,5, jusqu'au volume final d'utilisation. Après avoir ajouté le mannitol et le tampon, on a déterminé la concentration de l'IL-2 dans la solution formulée par mesure de l'absorbance à 280 nm. Le résultat final après formulation était une solution globale à pH 7,5, contenant: l'IL-2 à une concentration finale de 1,1 0,05 mg/ml; 0,18 mg/ml de SDS; 50 mg/ml de mannitol; 0,17 mg/ml de phosphate monosodique; et 0,89 mg/ml de phosphate disodique. On a stérilisé sur filtre la solution d'IL-2 globale formulée dans une cuve globale stérile. On a transféré le matériau à partir de cette cuve dans des flacons stériles. On a introduit 1,2 ml de solution globale dans chaque flacon. On a ensuite placé les flacons dans un appareil de lyophilisation et on les a lyophilisés. On a ensuite appliqué des bouchons, et on a sur-scellé les bouchons. On a ensuite étiqueté les flacons et on les a conditionnés. 3/ Effet de la concentration de SDS sur la turbidité Avant de parvenir à la plage de concentrations préférée de SDS, on a préparé l'IL-2 par le procédé décrit ci-dessus, à l'exception du fait que l'on a éliminé des gros échantillons ( 300 mg d'IL-2) à divers points pendant la diafiltration pour procéder aux investigations sur la turbidité, afin d'établir l'effet de SDS sur l'agrégation de l'IL-2. La figure 12 illustre la concentration de SDS pendant la diafiltration du matériau de départ. La concentration décroît sous la forme d'une ligne droite sur l'axe du logarithme. On a retiré les échantillons aux concentrations de SDS suivantes (11g/mg d'IL-2) : 1195, 536, 351, 217, 173, 137,123, 104 et 72. La pureté de l'IL-2 était identique dans chaque échantillon (100 % par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS, (SDS-PAGE) 98, 5 % par chromatographie liquide à haute performance). On a mesuré la turbidité à 488 nm et l'on a convertie en une turbidité (i) spécifiqueabsolue comme décrit ci-dessus, en se basant sur la concentration de l'IL2 dans les échantillons. Les résultats sont représentés sur la figure 10, et la figure 13 superpose les résultats de la turbidité sur le profil d'élimination du SDS de la figure 12. En dessous d'environ 300 g/mg, la turbidité augmente graduellement, et l'augmentation se traduit par une très forte pente en dessous d'environ 95 g/mg. Les valeurs de turbidité ti peuvent être converties en les poids moléculaires déduits par la formule suivante: MW= zxl07 8.1+2z Les résultats de cette conversion pour les échantillons de pré-lyophilisation sont représentés sur la figure 11. Ces données et d'autres indiquent qu'un poids moléculaire correspondant à l'IL-2 monomérique est observé au- delà d'environ 600 g/mg, et que le poids moléculaire commence à s'accroître de façon significative lorsque le SDS est en dessous d'environ 300 g/mg, l'augmentation se traduisant par une très forte pente lorsque le SDS chute en dessous d'environ 100 g/mg. En se basant sur le poids moléculaire de l'IL-2 monomérique (15,3 kDa pour 1'IL-2 native), il est possible de convertir le poids moléculaire d'un agrégat en un nombre induit de monomères d'IL-2 par agrégat. 4/ Lyophilisation et turbidité spécifique Pendant la diafiltration pour l'élimination du SDS, on a retiré des échantillons de 15 ml aux concentrations de SDS suivantes: 1155; 840; 585; 400; 190; et 155 g/mg d'IL-2. On a déterminé la turbidité de ces échantillons à la fois avant et après la formulation (c'est-à-dire après addition de mannitol, d'un tampon de phosphate, lyophilisation et reconstitution). Dans les deux cas, les mesures de turbidité étaient précédées par une filtration sur un filtre de 0,2 m afin d'éliminer tous les gros agrégats. La figure 14 représente l'effet de la lyophilisation sur la turbidité T (échelle logarithmique) pour ces échantillons. Le graphique illustre le fait que la lyophilisation ne détruit pas les microagrégats, mais qu'elle peut souvent accroître la turbidité spécifique légèrement (c'est-à-dire que les agrégats augmentent en taille), sans affecter la dépendance sur la concentration du SDS. L'effet est généralement mineur sur la plage de SDS préférée. 5/ Diffusion dynamique de la lumière On a préparé des microagrégats d'IL2 comme décrit ci-dessus, avec une concentration de SDS de 160 g/mg, et on les a analysés par la technique de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les résultats sont représentés sur les figures 16 et 17. La figure 16 représente les résultats de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) répartis en fonction de la masse des composants de la solution, et la figure 17 les représente en fonction du nombre. Sur la figure 16, le principal pic possède un diamètre hydrodynamique moyen de 12,7 nm, représentant 99,02 % de la masse totale. Il existe également un pic en aval avec un diamètre moyen de 55,6 nm, représentant les 0,98 % restants de la masse. Sur la figure 17, le principal pic possède un diamètre hydrodynamique moyen de 11,7 nm, représentant 99,99 % du nombre total. Il existe également un pic en aval avec un diamètre moyen de 53,7 nm, représentant les 0,01 % restants des particules. 6/ Comparaison des microagrégats par rapport à l'IL-2 monomérique On a comparé l'IL-2 microagrégée à l'IL-2 monomérique dans divers tests. On a préparé les microagrégats d'IL-2 comme décrit ci-dessus. Pour les besoins de la comparaison, on a préparé l'IL-2 sous une forme monomérique, dans laquelle on a utilisé du Tween 80 en tant que détergent à la place du SDS. Ce détergent ne forme pas de microagrégats avec l'IL-2, mais le détergent solubilise effectivement l'IL-2 et donne un produit monomérique bioactif. Les deux formes d'IL-2 ont été confirmées comme étant bioactives. L'IL-2 agrégée avait une activité d'environ 20 MUUmg. Lorsqu'elle était diluée avec du sérum ex vivo, l'activité chutait légèrement. Dans les deux cas, l'activité était légèrement supérieure à celle de l'IL-2 monomérique (figure 15). Ainsi, les microagrégats d'IL-2 de la présente invention sont capables de se dissocier pour donner un produit bioactif, et la bioactivité est équivalente à celle de l'IL-2 qui n'avait pas été agrégée. On a comparé la répartition in vivo de l'IL-2 radiomarquée après administration par voie intraveineuse de la protéine soit sous la forme microagrégée avec du SDS soit sous une forme monomérique. La forme microagrégée se répartissait préférentiellement au poumon, au foie, et au rein, tandis que le produit monomérique se répartissait presque à 100 % au niveau du rein. La microagrégation a, par conséquent, un impact sur la répartition in vivo. On a également comparé l'IL-2 microagrégée et l'IL-2 monomérique dans un modèle de tumeurs métastasiques. On a injecté par voie intraveineuse des cellules tumorales B16F10 dans les queues de souris et, 14 jours plus tard, on a inspecté les poumons pour déterminer la présence des tumeurs. Les animaux traités ont reçu de l'IL-2 quotidiennement à partir des jours 3 à 10. Les nombres médians des métastases pulmonaires au jour 14 se présentaient comme suit: Dose (mg/kg) Microagrégats d'IL-2/SDS IL-2/Tween 80 monomérique 1 16 3 26 7,5 4,5 49 24 53,5 1 60 59,5 0, 1 88,5 72 La forme microagrégée d'IL-2 est donc plus efficace dans le modèle tumoral que dans la forme monomérique, en ce que les métastases peuvent être prévenues en utilisant des doses très inférieures d'IL-2. Toutefois, étant donné que 1'IL-2 peut en elle-même être toxique, les données ne sont pas directement comparables, par exemple 10 mg/kg de microagrégats d'IL-2 peuvent tuer environ 'A d'une population d'essai. La comparaison la plus significative est donc à la dose non létale la plus élevée, notamment à la dose de 7,5 mg/kg. À cette dose équitoxique, le nombre médian de métastases observées avec les microagrégats était de 4,5 (plage de 1 à 18), comparé à 16 (plage de 4 à 57) avec l'IL-2 monomérique, la différence étant statistiquement significative. Cette différence représente un index thérapeutique de 3 à 5 fois meilleur pour la forme microagrégée de l'IL-2. D'autres études avec ce modèle de métastase artificielle B16 ont révélé que les niveaux de SDS dans le produit final ne semblent pas avoir d'impact sur l'efficacité. Par exemple, une composition comprenant 160 g/mg de SDS procédait suivant le même mode qu'une comprenant 181 g/mg. Par conséquent, avec du SDS dans la plage de 95 à 250 g/mg, l'activité antitumorale reste optimale tandis que la toxicité associée au SDS est évitée. 7/ Effets pharmacocinétiques sur la concentration finale de SDS Comme illustré ci-dessus, la turbidité des mélanges d'IL-2/SDS s'accroît à mesure que les niveaux de SDS décroissent pendant la diafiltration. Dans un test pharmacocinétique, on a poursuivi la diafiltration bien au-delà de la cible type de 160 g/mg, en diminuant nettement jusqu'à 25 g/mg. On a prélevé les échantillons pendant le procédé de diafiltration à divers stades: 1 090 g/mg; 200 g/mg; 160 g/mg; 125.ig/mg; 95.tg/mg; 65 g/mg; et 25 g/mg. Tous les échantillons à l'exception du plus dilué (25 g/mg) étaient clairement visibles, et la figure 5 illustre la turbidité (i) spécifique des sept échantillons. La chute de la turbidité i à la concentration la plus basse reflète une importante augmentation de la précipitation de la protéine à 25 g/mg, qui était visible à l'oeil nu. La figure 6 représente la proportion de l'IL-2 totale qui pouvait être transformée en granules par centrifugation dans les sept échantillons, et on observe une importante augmentation à la concentration de SDS la plus basse, tandis que les concentrations plus élevées sont essentiellement constantes. Ce matériau précipité se sédimentait et de ce fait ne provoquait pas de turbidité, ce qui explique la valeur ti basse sur la figure 5. Contrairement à la turbidité et à la précipitation variables, la bioactivité (UI) était essentiellement constante pour les sept échantillons (autour de 19 UI/mg). Afin d'étudier la pharmacocinétique, on a injecté tous les échantillons, à l'exception du plus dilué, un bolus dans la veine de la queue des rats (en triple par dose de SDS, 18 rats au total) à raison de 0,2 mg d'IL-2 par kg de poids corporel, en se basant sur une extrapolation allométrique d'une dose humaine. On a prélevé les échantillons sanguins à 1, 3, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 et 60 minutes après l'injection et on les a dosés pour déterminer la bioactivité de l'IL-2. La figure 7 représente la bioactivité plasmatique (ng/ml) de ces échantillons. Entre 0,5 heure et 1 heure, la ligne du haut représente la dose de 160 p.g/mg (a), et la ligne la plus basse représente la dose de 65 g/mg (0), bien que toutes les lignes soient très similaires. Dans une deuxième étude, on a comparé l'échantillon ayant la ligne la plus haute de la première expérience (160 tg/mg) à l'échantillon le plus dilué (25 g/mg). Les paramètres pharmacocinétiques de l'échantillon de 160 gg/mg dans la deuxième étude correspondaient à ceux de la première étude. Tandis que les lignes sur la figure 7 ont toutes des formes similaires les unes aux autres, toutefois, l'échantillon le plus dilué donnait des résultats très différents (figure 8). La vitesse d'élimination calculée à partir des courbes était -30 fois différente: 12,7 ml/min/kg pour la dose de 160 g/mg, et 362 ml/min/kg pour la dose de 25.tg/mg. Lorsqu'on compare les résultats tirés des deux expériences, l'échantillon le plus dilué est clairement distinct des six autres échantillons (figure 9). Ainsi, l'état d'agrégation de l'IL-2 a un effet manifeste sur sa pharmacocinétique in vivo. 8/ SDS libre Les expériences ci-dessus mesurent la concentration de SDS total dans les mélanges de SDS/IL-2. On a réalisé les expériences afin de déterminer la quantité de SDS total qui était associée à l'IL-2 et la quantité qui persistait libre dans la solution. On a reconstitué les flacons du produit PROLEUKINTM suivant les instructions et on les ultrafiltrés sur des membranes Centricon 10 (coupures de kDa) par deux centrifugations à raison de 3 000 tours/minute pendant 30 minutes chacune. On a testé l'échantillon de départ et le filtrat pour déterminer les niveaux de SDS et d'IL-2. On a mesuré le SDS par le dosage à l'acridine orange [35]. En bref, ce dosage implique les étapes suivantes: prendre 0,5 ml de l'échantillon; ajouter 0,1 ml d'une solution de NaHSO4 1,75 M, ajouter 0,1 ml d'une solution d'acridine orange à 1 % (p/v) ; ajouter 1,5 ml de toluène; sceller; soumettre à un vortex pendant trois minutes; séparer les phases organique et aqueuse, par exemple par centrifugation pendant 5 minutes à raison de 3 000 tours/minute et à température ambiante; mesurer l'absorbance de la phase organique supérieure à 499 nm. Les échantillons peuvent être dilués (par exemple avec de l'eau pure) préalablement au dosage afin de les entraîner dans la plage d'une courbe de concordance, par exemple si la courbe de concordance est basée sur des concentrations de SDS connues jusqu'à 25 mg/ml, ensuite il convient de diluer l'échantillon pour entraîner sa concentration de SDS dans cette plage. Le blanc pour l'étape de spectrophotométrie devrait être un étalon contenant zéro SDS qui a été traité suivant le même mode que l'échantillon expérimental. Les résultats indiquaient que l'IL-2 était totalement conservée par les membranes d'ultrafiltration (pas détectable dans le filtrat), tandis qu'environ 35 % de SDS étaient capables de passer au travers de la membrane. Il sera compris que la présente invention a été décrite au moyen d'exemples uniquement et que des modifications des détails peuvent être apportées sans s'écarter de l'esprit et la portée de la présente invention. Références (dont les contenus complets sont incorporés à la présente à titre de référence) [1] Hora et al. (1990) Biotechnology (NY) 8: 755-8. [2] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 569 790. [3] Meyers et al. (1991) Clin Pharmacol Ther, 49: 307-13. [4] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 604 377. [5] Hora et al., (1992) Dev Biol Stand, 74: 295-306. [7) Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 748 234. [8] Ho et al., (1992) Vaccine 10: 209-13. [9] Geigert et al., (1993) Chapter 8 of Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories (eds. Wang & Pearlman). ISBN 0306- 44365-1. [10] Vemuri (1992) Dev 131o1 Stand. 74: 341-51. [11] Anderson et al., (1992) Am. J Hosp. Pharm 49: 608-12. [12] Johnston et al., (1992) Pharm. Res. 9: 425-34. [13] Anderson et al., (1992) J. lmmunother 12: 19-31. [14] Anderson & Sorenson (1994) Clin Pharmacokinet 27: 19-31 [15] Konigsberg et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1370: 243-51. [16] Kanaoka et al., (2001) .J. Pharm. Pharmacol. 53: 295-302. [17] Ozbas-Turan et al., (2002) J. Pharm. Sci. 91: 1245-51. [18] Bergmann et al., (1991) Mol. Immunol. 28 (1-2) : 99-105. [19] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 908 434. [20] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 925 919. [21] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 853 332. [22] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 5 464 939. [23] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 5 824 330. [24] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 778 879. [25] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 992 271. [26] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 5 037 644. [27] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 5 078 997. [28] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 816 440. [29] Brevet européen numéro EP-B-0268110. [30] Brevet européen numéro EP-B-0217645. [31] Heinig & Vogt (1999) Electrophoresis 20: 3311-28. [32] Nomura & Murakami (1999) Bunseki Kagaku 48: 111-6. [33] Fielden & Claesson (1998) J. Colloid. Interface Sci 198: 261-5. [34] Gabor & May (1996) Abstract # C-04, 1996 FDA Science Forum Poster Abstracts. [35] Sokoloff & Frigon (1981) Analytical Biochem. 118: 13 8-41. [36] Arakawa et al., (1994) Int. J. Pept. Protein Res. 43: 583-7. [37] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 738 927. [38] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 656 132. [39] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 530 787. [40] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 572 798. [41] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 931 543. [42] Chapter 8 of Biological Spectroscopy (Campbell & Dwelc). ISBN 08053-1849-6. [43] Piccora (1985) Dynamic Light Scattering. Plenum Press, New York. [44] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 518 584. [45] Bazan (1992) Science 257: 410-2. [46) Wang et al., (1984) Science 224: 1431-3. [47] McKay (1992) Science 257: 412. [48] Theze et al., (1996) Immunol. Today 17: 481-6. 411-5. [49] Buchli & Ciardelli (1993) Arch. Biochem. Biophys. 307: [50] Collins et al., (1988) PNAS USA 85: 7709-13. [51] Kuziel et al., (1993) J. Immunol. 150: 5731. [52] Eckenberg et al., (1997) Cytokine 9: 488-98. [53] Brevet européen numéro EP-A-0136489. [54] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 4 752 585. [55] Brevet européen numéro EP-A-0200280. [57] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 5 229 109. [59] Brevet des États-Unis d'Amérique numéro 6 168 785. [60] Ahmad et al., (1994) J. Protein Chem. 13: 591-8. [61] Gearing & Thorpe (1988) J. Immunol. Methods 114: 3-9. [62] Rossio (1997) Cytokines and immune cell products. Pages 348-356 of Manual of Clinical and Laboratory Immunology, 5th edition (eds. Rose, deMacario, Folds, Lane, Nakamura). [63] Wadhwa et al., (2000) Quantitative biological assays for individual cytokines. Pages 207-239 of Cytokine Cell Biology; A Practical Approach (ed. Balkwill). ISBN 0-19-963860-8. [64] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-9. REVENDICATIONS 1. Procédé pour préparer l'interleukine-2 à usage pharmaceutique, comprenant les étapes consistant à : (a) ajouter du dodécylsulfate de sodium (SDS) à une composition comprenant l'interleukine-2, pour donner une concentration finale de SDS d'au moins 500 g de SDS par mg d'IL-2; (b) réduire la concentration de SDS pour éliminer une partie mais pas la totalité du SDS de la composition, pour donner une composition qui contient entre 95 et 250 g de SDS par mg d'interleukine-2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la concentration finale de SDS à l'étape (a) est d'au moins 900 g/mg. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel le produit de l'étape (b) présente une concentration de SDS comprise entre 135 et 180 gg/mg. 4. Procédé pour préparer une composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans lequel: (i) l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium dans la composition sont présents sous la forme d'agrégats; et (ii) le procédé comprend les étapes consistant à (a) ajouter le dodécylsulfate de sodium à une composition comprenant l'interleukine-2, dans lequel on ajoute suffisamment de dodécylsulfate de sodium pour donner une interleukine-2 solubilisée monomérique; et (b) réduire la concentration de dodécylsulfate de sodium à un niveau où l'interleukine-2 forme des agrégats avec le dodécylsulfate de sodium, tel que la composition, 2 0 après lyophilisation et reconstitution, présente une turbidité (t) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g; 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les agrégats présentent un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la concentration de SDS est réduite par diafiltration. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de 30 gel filtration entre les étapes (a) et (b) afin d'éliminer tous les multimères covalents d'IL-2 précipités. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape d'addition de mannitol. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape de lyophilisation. 10. Composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous forme d'agrégats, et dans laquelle les agrégats peuvent être obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 11. Composition comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous forme d'agrégats, et dans laquelle la composition possède l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: (i) la composition a une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g; (ii) la composition contient des agrégats de SDS/IL-2 avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm; et/ou (iii) la composition contient entre 95 et 250 g de SDS par mg d'interleukine-2. 12. Composition lyophilisée comprenant l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans laquelle la composition peut être reconstituée avec un milieu aqueux pour donner la composition selon la revendication 11. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la turbidité ('c) 2 5 spécifique de la composition est inférieure à 0,7 cm2/g. 14. Composition selon la revendication 13, où la turbidité (i) spécifique de la composition est comprise entre 0,3 cm2/g et 0,6 crn2/g. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition comprend les microagrégats de SDS/IL-2 avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 11 nm et 13 nm. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition comprend du mannitol à une concentration comprise entre 40 et 50 mg de mannitol par mg d'IL-2. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est une IL-5 2 humaine. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est l'IL-2 des-alanyl-1. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est l'IL-2 sérine-125. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est l'IL-2 humaine des-al anyl-1, sérine-125. 21. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 possède la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO: 1. 22. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est 2 0 non-glycosylée. 23. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où l'IL-2 est purifiée après expression dans un hôte procaryote recombinant. 24. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 23, possédant une concentration d'IL-2 d'environ 1,1 mg/ml. 25. Composition pharmaceutique lyophilisée qui, lorsqu'elle est reconstituée avec 1,2 ml d'eau stérile pour injection, contient dans chaque millilitre: 1,1 mg d'IL-2 humaine des- alanyl-1, sérine-125 nonglycosylée; 50 mg de mannitol; 0,18 mg de dodécylsulfate de sodium (SDS) ; 0,17 mg de phosphate monosodique; et 0,89 mg de phosphate disodique à pH 7,5, dans laquelle l'IL-2 et le SDS se présentent sous forme d'agrégats tels que la composition reconstituée a une turbidité (i) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g. 26. Composition pharmaceutique aqueuse, pouvant être obtenue par reconstitution de la composition lyophilisée selon la revendication 25 avec 1,2 ml d'eau stérile pour injection. 27. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 26, et un deuxième agent pharmaceutique, destinée à une administration distincte simultanée ou séquentielle. 28. Trousse comprenant (a) la composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 26; et (b) un deuxième agent pharmaceutique. 29. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 26, à utiliser en médecine. 30. Utilisation de microagrégats de (a) interleukine-2 et (b) dodécylsulfate de sodium, dans la fabrication d'un médicament destiné à être administré à un patient, dans laquelle les microagrégats ont un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm. 31. Utilisation d'une composition comprenant à la fois l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium, dans la fabrication d'un médicament destiné à être administré à un patient, dans laquelle l'interleukine-2 et le dodécylsulfate de sodium sont présents sous forme d'agrégats, et dans laquelle la composition possède une ou plusieurs des caractéristiques suivants: 2 0 (i) la composition a une turbidité ('r) spécifique inférieure à 1,1 cm2/g; (ii) la composition contient des agrégats de SDS/IL-2 avec un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 mn et 20 nm; et/ou (iii) la composition contient entre 95 et 250 g de SDS par mg d'interleukine-2. 32. Utilisation selon la revendication 30 ou la revendication 31, dans laquelle le médicament est destiné à traiter le cancer. 33. Utilisation selon la revendication 32, dans laquelle le cancer est le carcinome des cellules rénales. 34. Utilisation selon la revendication 32, dans laquelle le cancer est le mélanome. 35. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 30 à 34, dans laquelle le patient a été pré-traité avec un deuxième agent pharmaceutique. 36. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 30 à 34, dans laquelle le médicament est co-administré avec un deuxième agent pharmaceutique. 37. Utilisation d'un deuxième agent pharmaceutique, dans la fabrication d'un médicament de combinaison destiné à être administré à un patient, dans laquelle le patient a été pré-traité avec la composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 26. 38. Utilisation d'un deuxième agent pharmaceutique, dans la fabrication d'un médicament de combinaison destiné à être administré à un patient, dans laquelle le médicament est coadministré avec la composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 26. 39. Utilisation de (a) microagrégats d'interleukine-2 et de dodécylsulfate de sodium, et de (b) un deuxième agent pharmaceutique, dans la fabrication d'un médicament de combinaison, dans laquelle les microagrégats ont un diamètre hydrodynamique moyen compris entre 8 nm et 20 nm. 40. Composition selon la revendication 27, où le deuxième agent pharmaceutique est un anticorps monoclonal. 41. Composition selon la revendication 27, où le deuxième agent pharmaceutique est un anticorps qui confère la cytotoxicité cellulaire dépendant des anticorps (ADCC). 42. Composition selon la revendication 27, où le deuxième agent pharmaceutique est choisi dans le groupe consistant en: un anticorps antiCD2O; un anticorps anti-CD4O; un anticorps anti-Her2; un anticorps antiEGFR; et un anticorps anti-VEGF; un anticorps anti-CD52; un anticorps anti-CD33; un agoniste du récepteur H2; le Bacille de Calmette et Guérin (BCG) ; le thalidomide; le Lenalidomide; un inhibiteur de protéasome; une combinaison de cyclophosphamide, vincristine et prednisone; une combinaison de cyclophosphamide, hydroxydoxorubicine, vincristine et prednisone; une cytokine; l'interféron-a; l'interféron-a; le 5-fluorouracile; un composé anti-rétroviral; un inhibiteur de tyrosine kinase; et la Decitabine. 43. Composition, selon la revendication 42, où l'agoniste du récepteur H2 est l'histamine ou un sel d'histamine pharmaceutiquement acceptable, tel que le dichlorhydrate d'histamine.