Brevet FR2883885A1 — publié le 20061006

La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et plus particulièrement celui de l'évolution in vitro. L'évolution des protéines in vitro est une activité en pleine expansion, dont l'objectif est de générer des mutants présentant des caractéristiques modifiées, ou ayant acquis des activités nouvelles par rapport à la protéine naturelle. L'évolution in vitro s'inspire de l'évolution naturelle pour améliorer in vitro des molécules d'intérêt industriel, médical ou biotechnologique. On identifie deux étapes essentielles: la création d'une diversité génétique (par mutagenèse et/ou recombinaison) d'une part, et d'autre part la sélection en masse ou le criblage individuel de cette diversité, à la recherche de mutants ayant acquis les caractéristiques d'intérêt. L'évolution in vitro permet l'amélioration des protéines, et principalement des enzymes, des anticorps et des protéines thérapeutiques. L'amélioration des enzymes est d'un intérêt économique majeur: en effet, de très nombreuses enzymes industrielles sont utilisées dans différents procédés - comme la synthèse d'antibiotiques ou de vitamines, la brasserie, le traitement des textiles - ou sont incorporées dans des produits aussi divers que les lessives ou les aliments pour animaux. Les enzymes naturelles sont le plus souvent imparfaites pour cet usage, et il est nécessaire d'obtenir des enzymes améliorées, notamment sur les critères de leur activité ou de leur stabilité à haute température, pour pouvoir les utiliser dans ces industries. L'amélioration des enzymes permet de réduire les coûts des procédés correspondants, ou permet d'en mettre en oeuvre de nouveaux. L'utilisation d'enzymes en substitution de méthodes chimiques classiques souvent polluantes est porteuse de bénéfices pour l'environnement (on parle de chimie verte ). On estime le marché actuel des enzymes à plusieurs milliards d'euros par an. L'évolution in vitro peut aussi permettre d'améliorer la stabilité ou l'activité des protéines thérapeutiques (peptides, hormones, cytokines, interférons, vaccins, anticorps,...), ou servir à contrôler la spécificité d'anticorps utilisés en diagnostic ou en chimie analytique. L'évolution in vitro permet enfin d'améliorer directement des acides nucléiques fonctionnels, par exemple des ribozymes, des désoxyribozymes, ou encore des acides nucléiques utiles dans le cadre des ordinateurs à ADN (Breaker RR. Nature. 2004; 432:838-45; Schubert S et al. Curr Drug Targets. 2004; 5:667-81; Parker J. EMBO Rep. 2003; 4:7-10). L'évolution in vitro trouve donc un grand nombre d'applications dans des domaines clé tels que la santé ou l'industrie chimique. On comprend alors pourquoi les techniques destinées à faciliter cette activité d'amélioration des gènes et des protéines ont été l'objet d'efforts de recherche importants. Pour créer la diversité génétique sur laquelle porte la sélection, l'évolution naturelle fait intervenir deux processus de base: la mutation, et la recombinaison. Les mutations sont introduites à un taux de l'ordre de grandeur de une mutation par mégabase et par génération. Elles peuvent être dues à des erreurs spontanées de la polymérase à l'origine de la réplication de l'ADN, ou à des modifications des nucléotides suite à leur atteinte par un rayonnement ultraviolet. La recombinaison est un phénomène actif, médié par des protéines se liant sur l'ADN. De même, dans le domaine de l'évolution in vitro, la mutagenèse et la recombinaison existent toutes deux. La mutagenèse peut se faire de façon aléatoire, rationnelle, ou sur un mode intermédiaire. La mutagenèse rationnelle est basée sur les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de la protéine, lorsque disponibles. Des prédictions sont faites à partir de ces informations, et les mutants correspondants sont générés individuellement par mutagenèse dirigée. Dans le mode intermédiaire entre l'aléatoire et le rationnel, de nombreux mutants ayant une probabilité accrue par rapport au hasard de véhiculer une amélioration sont générés, sans que la probabilité associée à chacun ne soit suffisamment importante pour que l'on puisse réellement parler de prédiction. Dans tous les cas, ces mutants sont destinés à être sélectionnés en masse ou individuellement criblés, afin d'identifier des clones améliorés. La recombinaison in vitro de gènes permet en premier lieu de recombiner les mutants améliorés lors d'une approche basée sur la mutagenèse. Les mutants combinant plusieurs des mutations améliorantes sont susceptibles d'avoir un niveau encore supérieur de la caractéristique recherchée. La recombinaison in vitro permet également de mélanger entre eux différents gènes naturels de séquences totalement ou seulement partiellement connues, afin d'associer plusieurs caractéristiques d'intérêt de ces gènes et/ou de générer des caractéristiques nouvelles. Dans ce cas, une étape préparatoire consiste à isoler des gènes homologues (le niveau d'homologie requis est variable d'une technique à l'autre), soit par clonage à partir des souches cultivées in vitro, soit en utilisant une approche permettant de s'affranchir de cette culture in vitro. Cette dernière approche, dite par metagénome (Streit WR et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2004; 15:285-90), semble être la plus efficace parce qu'elle permet d'accéder à un grand nombre de gènes en produisant un effort limité. Dans tous les cas, on notera que les expériences d'évolution in vitro font intervenir plusieurs tours (typiquement 3 à 30 générations de molécules améliorées). Aussi, apparaît-il souhaitable que chaque étape élémentaire de mutation, sélection ou, en l'occurrence ici, recombinaison, soit d'un coût, d'une complexité et d'une durée minimaux. L'objet de l'invention concerne une technique de recombinaison in vitro: l'arrière plan technologique de cette activité est plus précisément exposée dans les paragraphes suivants. La première technique de recombinaison in vitro a été décrite en 1993 et est maintenant connue sous le nom commercial de DNA-shuffling (Stemmer WPC. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 91:10747 51; Stemmer WPC. Nature. 1994; 370: 389-91). Depuis, la recombinaison d'ADN a été appliquée avec succès dans des contextes aussi divers que la génération: d'une enzyme thermostable et tolérant des solvants organiques (Hao J et al. Protein Eng Des Sel. 2004; 17:689-97); d'un variant de la pénicilline G acylase possédant une spécificité de substrat élargie (Hsu JS. Appl Environ Microbiol. 2004; 70:6257-63); d'une enzyme augmentant la résistance de plantes à l'herbicide glyphosate; d'une ADN polymérase capable d'incorporer des nucléotides non standards (Ghadessy FJ et al. Nat Biotechnol. 2004; 22:755-9); de vaccins améliorés (Locher CP et al. Expert Opin Biol Ther. 2004; 4:589-97); d'enzymes à l'énantiosélectivité contrôlée (Reetz MT. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:5716-22); de virus au tropisme modifié (Soong NW et al. Nat Genet. 2000; 25:436-9). Cette liste est loin d'être exhaustive et l'avènement de la recombinaison in vitro a permis un saut qualitatif dans ce qu'il était possible de faire dans le domaine de l'évolution in vitro, avec les enjeux industriels importants décrits plus hauts. On peut distinguer deux grandes classes de procédés de recombinaison in vitro. La première classe, qui regroupe la plupart des méthodes décrites à ce jour, fait intervenir un processus de fragmentation / assemblage. A partir des séquences à recombiner, on crée dans une première étape des fragments, que l'on assemble dans une seconde étape en de nouvelles séquences complètes. Ainsi, dans le cas du DNA- shuffling évoqué précédemment, l'ADN parental est clivé de manière non contrôlée par une DNAse puis les fragments servent d'amorce à une réaction de PCR effectuée sans autres amorces (US 5,605,793, US 5,830,721, US 6,506,603). Les techniques de recombinaison de type fragmentation / assemblage sont décrites ci-dessous, sans que cette description puisse être considérée comme exhaustive. Une première variante consiste à traiter des matrices incorporant des dUTP par l'exonucléase V (Miazaki K. Nucleic Acids Res. 2002; 30:e139). La quantité de produit obtenue est très faible et le produit est réamplifié par une seconde PCR qui contient des amorces appropriées. L'ADN peut également être fragmenté de manière aléatoire par sonication ou par simple rupture mécanique. Le RACHITT ( random chimeragenesis of transient templates ) est une autre technique de fragmentation / assemblage qui permet de recombiner in vitro des molécules d'ADN (Coco WM et al. Nat. Biotechnol. 2001; 19:354-359 et Coco WM. Methods Mol. Biol. 2003; 231:111-127). Un brin d'un ADN parental particulier contenant des dUTP sert de matrice sur laquelle viennent s'apparier les autres ADN parentaux. Ces derniers sont ensuite digérés par une exonucléase et les trous qui en résultent sont comblés par une ADN polymérase. Par rapport au DNAShuffling , RACHITT permet d'augmenter le nombre de recombinaisons par molécule. Dans tous les cas, la fragmentation ne se fait pas complètement au hasard: les DNAses, par exemple, coupent préférentiellement certaines positions, ce qui conduit à créer des biais. Trois autres techniques de recombinaison in vitro par fragmentation / assemblage sont conceptuellement très proches du DNA-shuffling : le L- shuffling (WO0009679), particulièrement adapté au cas de gènes longs, le FIND (W003097834), qui isole des ADN simple brins pour augmenter le taux de recombinaison et le synthetic reassembly (US 6,537,776). ITCHY ( incremental truncation for the creation of hybrid enzymes ) est une autre technique de recombinaison par fragmentation / assemblage qui consiste à liguer des banques de fragments générés après la troncation de deux séquences matrices, où chaque matrice est digérée depuis des brins opposés (Ostermeier M et al. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 1205-9 et Lutz S. Nucleic Acids Res. 2001; 29:e19). Des fragments d'une matrice digérés par l'exonucléase III et la nucléase S depuis la portion 5' du gène sont ainsi assemblés avec les fragments d'une autre matrice digérée depuis la portion 3' du gène. Pour générer rapidement une variété de tailles de fragment, ITCHY fait varier le temps de la digestion ou introduit des liaisons phosphothioate résistants à la nucléase dans les matrices. Il est possible d'ajouter une étape de DNA-Shuffling après une étape d'ITCHY afin d'obtenir des molécules ayant plusieurs recombinaisons. La technique ITCHY a l'intérêt de ne pas nécessiter d'homologie entre les séquences à recombiner. Cependant, cette technique nécessite d'utiliser un plasmide adapté, est limitée à la recombinaison de deux gènes et est d'une mise en oeuvre relativement complexe, avec notamment divers traitements enzymatiques et plusieurs purifications d'ADN. Deux autres méthodes de fragmentation / assemblage ont été récemment décrites, qui permettent de faire de la recombinaison site-spécifique entre gènes de séquences pouvant être très peu similaires. La première utilise des amorces spécifiques pour générer précisément des fragments de gènes qui sont ensuite assemblés par extension chevauchante (O'Maille PE et al. J. Mol. Biol. 2002; 321:677-91) . La seconde introduit par mutagenèse des sites d'enzyme de restriction dans les matrices à recombiner puis fragmente ces matrices avec les endonucléases correspondantes (Higara K et al. J. Mol. Biol. 2003; 330:287-96). Dans tous les cas de recombinaison site-spécifique, la génération des fragments à recombiner fait intervenir un nombre élevé de réactions de PCR et des étapes de purification. Leur mise en oeuvre reste complexe et elles sont réservées aux cas où la structure de la protéine cible est bien connue. A l'opposé, lorsqu'on recombine au hasard (c'est-à-dire sans spécificité de site) des séquences très différentes, on obtient le plus souvent une majorité de protéines non fonctionnelles car se repliant mal. Les méthodes de fragmentation / assemblage sont donc relativement complexes à mettre en oeuvre, en raison de la multiplicité des étapes d'assemblage, et ne constituent pas un outil que pourrait utiliser facilement n'importe quel laboratoire de biologie moléculaire pour des expériences d'évolution in vitro de routine. Ces méthodes ne sont, en outre, pas applicables à des gènes très courts ( 3 kpb). La deuxième classe de procédés de recombinaison in vitro repose sur l'amplification interrompue de gènes homologue. Le Staggered Extension Process (StEP) est une méthode qui n'implique pas de fragmentation / assemblage de séquences, mais consiste à amplifier par PCR un ensemble de matrices en utilisant au moins deux amorces flanquant le gène d'intérêt, avec des cycles contenant une phase d'élongation très courte (de l'ordre de la seconde). Ainsi, à chaque cycle, le produit détaché d'une matrice peut se réapparier à une matrice différente, donnant ainsi lieu à un évènement de recombinaison (US 6,153,410, US 6, 177,263, Zhao et al. Nat. Biotechnol. 1998; 16:258-61 et Aguinaldo AM et al. Methods Mol. Biol. 2003; 231:105-110). Le StEP a sur toutes les techniques de fragmentation / assemblage décrites précédemment l'avantage majeur de sa relative simplicité de réalisation. Bien qu'en théorie cette étape ne soit pas indispensable, les travaux publiés utilisant le StEP font intervenir une étape supplémentaire d'amplification des produits obtenus à la suite de l'amplification à cycles courts. L'ADN obtenu est finalement purifié puis cloné par ligation double brin dans un vecteur plasmidique linéarisé. Le StEP est de mise en oeuvre sensiblement simplifiée par rapport aux techniques de fragmentation / réassemblage, bien qu'en pratique il ne soit pas toujours aisé de régler les conditions d'amplification de manière à favoriser l'obtention de molécules recombinées. Cependant, les produits obtenus après recombinaison par StEP sont peu abondants et doivent généralement être amplifiés par PCR. Dans les deux classes de procédés (fragmentation / assemblage, ou STEP), une amplification exponentielle de l'ADN existe: elle peut avoir lieu lors de la PCR d'assemblage, lors de la réaction de StEP, ou lors de la PCR qui suit le StEP. Le caractère exponentiel de cette amplification peut conduire à introduire dans la banque un biais d'amplification. L'existence de biais en faveur de certaines molécules recombinantes sera amplifié suivant une progression approximativement géométrique, et ces molécules seront finalement fortement surreprésentées dans la banque finale. Cet effet est d'autant plus gênant que le gène d'intérêt est long et que le nombre de cycles est grand. Egalement, dans tous les cas, une étape finale de ligation double brin dans un plasmide linéarisé (de préférence adapté à l'expression), est nécessaire. Cette étape de ligation double brin, outre le fait qu'elle augmente le coût, la difficulté et la durée de la manipulation, conduit à limiter la diversité de la banque générée. L'ADN à liguer doit de surcroît être préalablement purifié, généralement sur gel d'agarose, ce qui augmente encore le coût et le niveau d'intervention humaine. Dans le domaine de la mutagenèse dirigée, les premières techniques décrites reposaient sur une étape de PCR chevauchante pour introduire les mutations ponctuelles désirées, suivie d'une purification de l'amplicon et d'une ligation double brin de l'insert dans un vecteur plasmidique (Kadowaki H et al. Gene. 1989; 76:161-6). Ces techniques ont depuis été largement remplacées par des techniques basées sur la réplication circulaire (Hemsley et al. Nucleic Acids Res.1989; 17:6545:51), permettant d'introduire les mutations directement sur le plasmide initial et donc sans ligation. Aujourd'hui, les techniques QuickChange (US2004253729) et Massive Mutagenesis (W00216606), notamment, permettent de générer des mutations de façon rapide et simple dans n'importe quel plasmide, sans qu'il soit nécessaire d'effectuer de ligation double brin. En outre, on peut citer le développement de techniques permettant le sous- clonage d'ADN rapide sans utiliser de ligase comme le TOPO -cloning (W002061034 et WO0216594), ou le système Gateway (US5,888,732). En résumé, l'analyse de l'état de l'art en matière de recombinaison d'ADN montre qu'il existe une variété de techniques efficaces. Ces techniques font toutes intervenir plusieurs étapes, souvent relativement complexes. Cette complexité fait que leur utilisation reste relativement limitée en comparaison de celle d'autres approches de création de diversité génétique, comme la mutagenèse aléatoire par exemple. En particulier, les étapes de PCR, de purification d'ADN et de ligation double brin inhérentes aux techniques existantes de recombinaison in vitro contribuent notablement au coût, à la durée et à la complexité des protocoles de recombinaison. Ces étapes nuisent en outre à la qualité de la diversité générée, notamment en terme de taille de la diversité et à cause du biais d'amplification pendant la PCR. Il existe donc un intérêt fort pour une technique de recombinaison in vitro simple et rapide, qui ait lieu en un nombre minimum d'étapes, et ne fasse intervenir ni amplification exponentielle, ni ligation double brin. Enfin, la présente invention concerne en outre une banque de polynucléotides d'intérêt recombinées produites par le procédé selon la présente invention ainsi qu'une banque protéique issue de l'expression de cette banque. Elle concerne également l'ADN issus de l'amplification ou du clivage de cette banque, l'ARN issus de la transcription in vivo ou in vitro de cette banque. Description résumée La présente invention a pour objet un procédé de recombinaison génétique in vitro, c'est-à-dire la production, à partir d'un mélange de plusieurs polynucléotides matrices parents , d'une descendance de nombreux nouveaux polynucléotides dont les séquences combinent chacune deux séquences parentales ou plus. Partant d'un ensemble de polynucléotides partageant un certain degré d'homologie, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'obtention en seulement une étape simple et rapide d'un mélange contenant une proportion importante de molécules recombinées en un ou plusieurs sites. La technique de l'invention est en particulier caractérisée par le fait qu'aucune étape de ligation double brin, qui constitue un facteur limitant les techniques selon l'art antérieur, n'est nécessaire. La technique selon l'invention est également caractérisée par l'absence d'amplification exponentielle de matériel génétique, généralement nécessaire dans les techniques de l'art antérieur, et source de l'introduction de biais dans la diversité générée. L'invention concerne également les polynucléotides obtenus et les peptides, polypeptides ou protéines qu'ils permettent d'obtenir. La technique selon l'invention est une technique de recombinaison de gènes de séquences homologues caractérisée par le fait que la recombinaison s'opère directement entre deux molécules d'ADN circulaires. En effet, dans la technique selon l'invention, les gènes à recombiner sont présents sous forme de molécules d'ADN circulaires fermées, de préférence double-brin, et à aucun moment ces molécules circulaires ne sont linéarisées préalablement ou lors de l'étape de recombinaison, comme dans les techniques de l'art antérieur. Cet élément technique constitue une différence majeure par rapport aux techniques selon l'art antérieur, où une étape de ligation double-brin (précédée d'une purification de l'insert), qui est toujours source de nombreuses difficultés, est nécessaire pour recréer des molécules circulaires double brin. De plus, la technique selon l'invention est caractérisée par le fait qu'un seul oligonucléotide est nécessaire pour introduire la recombinaison. Dans les techniques selon l'art antérieur basées sur la polymérisation à cycles courts (StEP), la recombinaison est générée en utilisant deux oligonucléotides homologues de brins opposés, de façon à déclencher une réaction de PCR permettant l'amplification exponentielle des brins d'ADN ciblés. Les techniques de fragmentation / assemblage font également intervenir une amplification exponentielle. Cette réaction d'amplification exponentielle est associée à des biais dans la représentativité des mutations. Au contraire, dans le procédé selon l'invention, un seul oligonucléotide amorce, de préférence complémentaire d'une partie des molécules d'ADN circulaires n'étant pas sujette à variabilité, est nécessaire. L'amplification d'ADN pouvant résulter de la polymérisation à partir de cet oligonucléotide n'est pas de nature exponentielle, mais est au contraire linéaire. Le biais d'amplification disparaît donc puisque ce sont toujours les molécules de plasmide parentales qui servent de matrice. Cependant, il est à noter que le procédé selon la présente invention n'exclue pas l'utilisation de plusieurs oligonucléotides amorces. Dans un mode de réalisation particulier, les oligonucléotides amorces s'hybrident tous sur le même brin des molécules d'ADN circulaires. Ceci permet d'augmenter la fréquence des recombinaisons. Dans un mode de réalisation alternatif, les oligonucléotides amorces s'hybrident sur les deux brins des molécules d'ADN circulaires. Ceci permet d'augmenter le pourcentage de molécules recombinantes par rapport aux plasmides parents, avec pour contrepartie d'introduire un possible biais d'amplification. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production in vitro de polynucléotides d'intérêt recombinés à partir d'au moins 2 polynucléotides d'intérêt différents, caractérisé en ce qu'il comprend: a) préparer un mélange comprenant des molécules polynucléotidiques circulaires comprenant chacunes un desdits polynucléotides d'intérêt différents, et au moins un oligonucléotide amorce s'hybridant à une région conservée dans lesdites molécules polynucléotidiques circulaires; b) soumettre le mélange à plusieurs cycles d'élongation comprenant chacun une phase d'élongation, et la durée d'élongation pour au moins un des cycles est adaptée pour que l'élongation soit interrompue au niveau desdits polynucléotides d'intérêt; ledit procédé résultant en la production de molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées comprenant des polynucléotides d'intérêt recombinés. De préférence, le procédé comprend en outre une étape c) de sélection des molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées. Dans un mode de réalisation particulier, la sélection c) est effectuée par digestion des molécules polynucléotidiques circulaires résultant de l'étape b) par une ou plusieurs enzymes spécifiques de l'ADN méthylé, de préférence sélectionnées parmi le groupe suivant: Dpnl, NanII, NmuDI et NmuEI. Dans un mode alternatif de réalisation, les molécules polynucléotidiques circulaires initiales de l'étape a) ont été amplifiés dans des souches ung- et la sélection c) est effectuée en transformant des souches ung+ par des molécules polynucléotidiques circulaires résultant de l'étape b). Dans un mode de réalisation additionnel, l'oligonucléotide amorce présente une ou plusieurs bases mésappariées qui supprime(nt), dans les molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées, un site de restriction d'une endonucléase présent dans les molécules polynucléotidiques circulaires initiales de l'étape a), et la sélection c) est effectuée par la digestion des molécules polynucléotidiques circulaires initiales par ladite enzyme de restriction. Dans un mode de réalisation préféré, le nombre de polynucléotides d'intérêt différents est compris entre 2 et 1011, de préférence entre 2 et 106. De préférence, les étapes d'élongation ont des durées comprises entre 0 s et 100 s, et de préférence comprises entre 0 s et 5 s. Dans un mode de réalisation préféré, l'élongation est réalisée par une polymérase thermostable, de préférence sélectionnée parmi le groupe des DNA polymérases Taq, Pfu, Vent, Pfx, KD ou un mélange de celles-ci. Dans un mode de réalisation particulier, une DNA ligase thermostable (de préférence: la Taq Ligase, la Tth Ligase ou l'Amp Ligase) est ajoutée dans ledit mélange. De préférence, les polynucléotidiques d'intérêt présentent une identité de séquence supérieure à 50%, et de préférence supérieure à 85%. Dans un mode de réalisation particulier, les polynucléotides d'intérêt sont issues du clonage homologue d'un gène dans plusieurs organismes différents. Dans un mode de réalisation alternatif, les polynucléotides d'intérêt sont produits par clonage direct - par les techniques dites du metagénome d'ADN issu d'une source environnementale. Dans un autre mode de réalisation, les polynucléotides d'intérêt sont produits par une technique de mutagenèse. La technique de mutagenèse utilisée peut être la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, ou la Massive Mutagenesis . De préférence, les molécules polynucléotidiques circulaires sont doublebrin, de préférence elles sont un plasmide. Dans un mode de réalisation préféré, les molécules polynucléotidiques circulaires ne diffèrent essentiellement que par les polynucléotides d'intérêt. Plus particulièrement, l'oligonucléotide amorce a une taille comprise entre 6 et 100 bases, et de préférence entre 15 et 25 bases. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé met en oeuvre un seul oligonucléotide amorce. Dans un mode de réalisation alternatif, le procédé met en oeuvre deux oligonucléotides amorces ou plus, de préférence entre deux et 5 oligonucléotides amorces. De préférence, l'oligonucléotide amorce s'hybride sur les molécules polynucléotidiques circulaires en dehors des polynucléotides d'intérêt. De préférence, l'oligonucléotide amorce est phosphorylé. Dans un mode de réalisation particulier, les molécules polynucléotidiques circulaires 25 résultant de l'étape c) sont soumises à nouveau à l'étape b). Dans un mode de réalisation préféré, les polynucléotides d'intérêt recombinés résultants sont ensuite soumis à une étape de criblage à basdébit, haut-débit ou ultra-haut-débit. De préférence, l'étape de criblage est une étape de sélection fonctionnelle. La méthode de sélection fonctionnelle peut être sélectionnée parmi les techniques suivantes: sélection à la surface d'un ribosome ribosome display , sélection à la surface d'un phage phage display , sélection à la surface d'une cellule cell-surface display , sélection à la surface d'un plasmide plasmid display , fusion ARNm-peptide, compartimentation in vitro, autoréplication compartimentée, et sélection in vivo. Description détaillée Le procédé selon l'invention est un procédé de recombinaison in vitro de gènes de séquences homologues caractérisé par sa facilité de manipulation. En particulier, la présente invention concerne un procédé de recombinaison in vitro de plasmides parents caractérisée en ce que la recombinaison s'opère directement entre les molécules circulaires des plasmides parents et donc sans aucun clonage moléculaire et en ce qu'au moins un oligonucléotide amorce complémentaire ou partiellement complémentaire d'une région d'un des brin des plasmides parents est utilisé pour amorcer une réaction d'amplification linéaire cyclique par une polymérase, de préférence thermostable, avec des étapes d'élongation très courtes produisant des molécules de plasmides fils qui combinent une ou plusieurs séquences d'un ou plusieurs plasmides parents. Le procédé comprend de préférence les étapes suivantes: a) Dans un tube, on réalise un mélange contenant: - Des molécules d'ADN circulaires, de préférence double brin, de natures différentes, de préférence présentes en concentrations équimolaires; - Au moins un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et homologue d'une région commune aux molécules d'ADN, ou d'une région étant suffisamment homologue sur les matrices pour permettre l'hybridation de l'oligonucléotide; et - Une polymérase, de préférence thermostable, et l'ensemble des réactifs (notamment substrats, tampons et cofacteurs) permettant la polymérisation d'ADN. b) On soumet le mélange préparé en a) à plusieurs cycles d'élongation comprenant de préférence: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre eux; - une phase à plus basse température de façon à ce que le ou les oligonucléotide(s) amorce(s) s'hybride(nt) sur son site de liaison au niveau des différents plasmides; et - une phase d'élongation, la durée d'élongation pour au moins un des cycles est adaptée pour que l'élongation soit interrompue au niveau de la partie à recombiner. Cette durée d'élongation peut être calculée d'après la vitesse de procession de la polymérase. c) De préférence, on soumet la réaction obtenue en b) à une étape de sélection des brins nouvellement synthétisés. Cette sélection se fait essentiellement par élimination des brins parents. Les molécules d'ADN circulaires décrites à l'étape a) sont de préférence constituées d'une part d'un vecteur (de préférence identique pour toutes les molécules, et contenant un gène de résistance à un antibiotique et les éléments suffisant à sa réplication) et d'autre part d'un insert constitué essentiellement du polynucléotide d'intérêt. Le vecteur est de préférence un plasmide. Le polynucléotide d'intérêt est de préférence constitué d'une phase codante. Il peut également être un polynucléotide présentant une activité biologique tel qu'un promoteur, un antisens, un ribozyme, etc... Ce polynucléotide d'intérêt est différent d'une molécule d'ADN à l'autre. Le vecteur pourra en outre contenir un promoteur permettant l'expression de l'insert dans des organismes procaryotes ou eucaryotes ou encore l'expression in vitro. Si le polynucléotide d'intérêt est un promoteur, il sera de préférence associé de manière opérationnelle à une séquence codante, par exemple une séquence codant un gène rapporteur. De préférence, l'insertion des inserts (différents) aura été faite au niveau du même site dans le vecteur (sites uniques présents au niveau du multisite de clonage), ou au niveau de sites voisins. A l'étape a), les polynucléotides d'intérêt présentent des séquences proches, de préférence avec un degré de similarité ou d'identité supérieur à 50%, 60% ou 70%, et plus préférentiellement encore supérieur à 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. Dans un premier mode de réalisation, les polynucléotides d'intérêt présents à l'étape a) sont des gènes de la même famille, isolés par clonage par homologie à partir d'organismes différents soit par isolation des gènes à partir de cultures d'organismes in vitro, soit par une technique d'isolement direct de gènes homologues à partir de l'ADN isolé d'échantillons environnementaux (approche encore dénommé metagénome ). Dans ce mode de réalisation, l'objectif est de recombiner ces gènes pour obtenir des variants ayant des propriétés améliorées ou cumulées, ou encore des caractéristiques nouvelles. Dans un second mode de réalisation, les polynucléotides d'intérêt sont des mutants d'un même gène parental, ne différant de celui-ci, et entre eux, que par un nombre restreint de modifications. Dans ce second mode de réalisation, l'objectif est de recombiner ces variants ayant préalablement été sélectionnés, afin d'obtenir un ou plusieurs variants secondaires issus de la recombinaison de ces variants primaires, ces variants secondaires présentant un niveau encore supérieur d'amélioration. Ces polynucléotides d'intérêt sont présents à une concentration totale dans le mélange de l'étape a) préférentiellement comprise entre 1 et 100 ng/ l. Dans un mode de réalisation préféré, les molécules d'ADN circulaires utilisés à l'étape a) sont double brin. Dans un mode de réalisation alternatif, les molécules d'ADN circulaires utilisés à l'étape a) sont simple brin. Dans un autre mode de réalisation particulier, les molécules d'ADN circulaires utilisés à l'étape a) sont composés pour partie de bases non classiques, comme par exemple des désoxy-uridine, permettant de mettre en oeuvre à l'étape c) certains modes de sélection efficaces des molécules nouvellement synthétisées. A l'étape a), le ou les oligonucléotides amorces utilisés sont préférentiellement complémentaires d'une région des molécules d'ADN circulaires de départ qui est située sur le vecteur, à une distance variable du polynucléotide d'intérêt. Ces oligonucléotides amorces sont présents à une concentration dans le mélange de l'étape a) préférentiellement comprise entre 0,01 M et 10 M. A l'étape b), la polymérase thermostable utilisée est par exemple une polymérase ou un mélange de polymérases sélectionnée(s) parmi: Taq, Pfu, Vent, Pfx, et KOD. De préférence, on utilise une polymérase ayant une bonne fidélité de lecture, la génération de mutations au hasard n'étant pas recherchée ici. Dans un mode de réalisation préféré, une ligase thermostable (par exemple la Taq Ligase, la Tth Ligase ou l'Amp Ligase), son tampon et ses éventuels co-facteurs sont ajoutés au mélange décrit à l'étape a). Dans ce dernier cas, le ou les oligonucléotide(s) utilisé(s) pour l'amorçage de la polymérisation aura ou auront préférentiellement été préalablement phosphorylé(s) en utilisant une polynucléotide kinase dans des conditions adaptées. Alternativement à cette voie enzymatique, la phosphorylation de l'oligonucléotide ou des oligonucléotides peut être faite par couplage chimique. A l'étape b), la température de fusion des deux brins d'ADN pourra classiquement être de 94 C, cette température étant connue pour déshybrider la totalité des brins d'ADN double-brin. La durée de fusion n'est pas discriminante, et est de préférence comprise entre une seconde et deux minutes. Dans cette même étape b), la température d'hybridation du ou des oligonucléotide(s) sur les brins plasmidiques pourra classiquement être choisie aux alentours de 50 C. En effet, la plupart des oligonucléotides de taille classique (20mers) s'hybrident efficacement sur leur matrice à une telle température. Lors du premier cycle, la seule hybridation recherchée est celle du ou des oligonucléotide(s) servant d'amorce sur sa ou leur séquence homologue des brins plasmidiques parentaux. Lors de ce premier cycle, la durée d'hybridation n'est pas discriminante, et est de préférence comprise entre une seconde et une minute. Dans les cycles ultérieurs, l'hybridation des brins obtenus lors des cycles précédents, d'une longueur de plusieurs dizaines à plusieurs milliers de bases, est recherchée en priorité, et il peut être intéressant d'utiliser une température et un temps d'hybridation qui favorise l'hybridation de ces brins par rapport à l'hybridation du ou des oligonucléotide(s) de départ. En effet, lorsque ces produits d'extension simple brin, obtenus lors des cycles précédents par extension sur une matrice parentale x, s'hybrident sur une matrice parentale y, une nouvelle extension commence sur cette matrice y; cette hybridation est plus ou moins homologue, du côté 3' du brin néosynthétisé, et peut donc nécessiter des conditions d'hybridation particulières, et notamment une température d'hybridation adaptée, et une durée d'hybridation plus longue, de plusieurs minutes voire de plusieurs dizaines de minutes. Eventuellement, plusieurs températures d'hybridation, pourront être utilisées, de façon à permettre à des brins ayant des degrés d'homologie différents de s'hybrider, chacun à leur température optimale. La température d'élongation utilisée lors de cette étape b) est classiquement comprise entre 68 et 72 C, plage de températures d'efficacité maximale des polymérases thermostables. D'une façon générale, la température à utiliser ici est la température d'activité optimale de la polymérase thermostable utilisée. La durée de cette étape d'élongation est très discriminante. En effet, il est souhaité que l'élongation du brin d'ADN soit telle qu'elle soit interrompue à son arrivée au niveau de la zone non homologue, où l'on souhaite voir recombiner des brins parentaux. L'élongation n'étant pas totalement synchrone, l'interruption n'aura pas lieu exactement au même niveau d'une molécule à l'autre, et une réelle diversité sera donc générée dans les brins recombinés. Pour ce faire, il est possible de mesurer la distance entre la zone d'hybridation de l'oligonucléotide amorce et la région où l'on souhaiterait voir s'interrompre la synthèse, et de calculer le temps nécessaire pour franchir la distance entre l'oligonucléotide et la zone ciblée, la vitesse de progression de la polymérase étant connue (cette vitesse dépend de la nature exacte de l'enzyme utilisée, et est généralement indiquée par le fournisseur). Par exemple, si 1500 bases séparent l'oligonucléotide (à l'extrémité 3' duquel sera initié la polymérisation du brin néoformé), et la région où l'on souhaiterait que la polymérase s'interrompe, et si la polymérase utilisée a une vitesse de progression de 750 bases par minute, deux minutes d'élongation seront nécessaires. D'une façon générale, la polymérisation ne commence pas vraiment lorsque la température atteint le plateau (à 68 ou 72 C par exemple), mais progressivement lors de la phase de montée en température. Il est donc nécessaire de prendre en compte cet élément pour calculer la durée nécessaire à cette phase d'élongation. Le plus souvent, il est préférable d'identifier empiriquement la durée optimale: on effectue alors, dans une phase préliminaire, plusieurs tests afin d'identifier la durée optimale permettant d'obtenir un taux important de molécules recombinées, et/ou un nombre d'évènements de recombinaison par molécules maximal. Le nombre de cycles d'élongation est généralement compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 5 et 50. Ces cycles peuvent être tous identiques ou les durées et les températures des phases d'hybridation et d'élongation peuvent être différentes suivant les cycles. Dans un mode de réalisation particulier, les cycles d'élongation réalisés à l'étape b) peuvent être suivis d'une série de cycles supplémentaires, associés à une durée d'élongation plus longue, dont la fonction est de compléter la réplication circulaire autour du plasmide servant de matrice, et éventuellement de permettre la ligation de l'extrémité 3' du brin néoformé sur l'extrémité 5', phosphorylée, du ou des oligonucléotide(s) ayant servi d'amorce. Le ou les oligonucléotides servant à l'amorçage peut ou peuvent être homologue(s) à une région située à une distance variable de la zone n'étant pas homologue entre les brins parentaux, plus particulièrement la région comprenant le polynucléotide d'intérêt. Dans un premier mode de réalisation, le ou les oligonucléotide(s) servant à l'amorçage est ou sont localisé(s) le plus loin possible de la zone où l'on souhaiterait voir s'interrompre la synthèse. Ainsi, la distance à parcourir étant la plus longue possible, on s'attend à ce que les variations au niveau de la zone précise de décrochage, d'une molécule à l'autre, soient également maximales, la variabilité étant conservée en pourcentage de la distance parcourue, mais augmentée si l'on mesure en nombre de bases. Dans un second mode de réalisation, au contraire, le ou les oligonucléotide(s) servant d'amorçage est ou sont localisé(s) le plus proche possible de la partie non homologue des brins parentaux, c'est-àdire de la région comprenant le polynucléotide d'intérêt. Le temps d'élongation est minimal, par exemple de une seconde, voire zéro. Ainsi, il n'y a plus de phase d'élongation à proprement parler, mais seulement une montée en température entre la température d'hybridation et la température de dénaturation. La polymérisation a lieu pendant la montée en température, et la pente (en C/s) de cette montée est alors déterminante. Le choix des volumes soumis au thermocyclage, du tube ou de la plaque utilisé, du thermocycleur et du programme sont donc critiques et peuvent gagner à être ajustés empiriquement. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé met en oeuvre un seul oligonucléotide amorce. Dans un mode de réalisation alternatif, le procédé met en oeuvre plusieurs oligonucléotides amorces. Dans un mode de réalisation particulier, les oligonucléotides amorces s'hybrident tous sur le même brin. De préférence, ils s'hybrideront au niveau de différents sites répartis sur le vecteur à des distances variables du polynucléotide d'intérêt. Ainsi, on peut augmenter la diversité des sites de recombinaison. Dans un autre mode de réalisation particulier, les oligonucléotides amorces s'hybrident sur les deux brins du vecteur. Dans un mode de réalisation préféré, on réalise à l'issue de l'étape de recombinaison une série de cycles d'élongation, comportant une phase à la température permettant l'activité de la polymérase et éventuellement de la ligase, d'une durée suffisante pour permettre de réaliser le tour du plasmide et éventuellement la liaison subséquente à l'extrémité 5', préférentiellement phosphorylée, de 1'oligonucléotide utilisé pour l'amorçage. A l'étape c), on utilise tout moyen connu de l'homme du métier pour sélectionner les brins néo-synthétisés. En effet, les brins parentaux utilisés dans le mélange constituent encore, à la fin de la réaction réalisée en b), une fraction importante et le plus souvent très majoritaire des brins d'ADN présents dans le mélange. Dans un premier mode de réalisation, on utilise une approche basée sur les différences de méthylation entre l'ADN synthétisé dans des bactéries (méthylé) et l'ADN synthétisé in vitro (non méthylé). Il s'agit d'utiliser l'enzyme Dpnl, spécifique de sites présents sur l'ADN méthylé, mais pas sur l'ADN non méthylé (Lacks et al.Methods in Enzymology. 1980; 65:138). Les enzymes NanII, NmuDI et NmuEI peuvent également être utilisées pour remplir le même objectif. Dans une réaction par extension circulaire d'un oligonucléotide hybridé sur un plasmide, ces enzymes digèrent les brins parentaux (produits in vivo par des bactéries), mais pas les brins synthétisés lors de la réaction, non méthylés. Dans un second mode de réalisation, un des oligonucléotides utilisés pour l'amorçage est homologue d'une région contenant un site unique de restriction, et en diffère au niveau d'un ou de plusieurs nucléotides, de préférence situés au niveau de sa partie centrale. Le brin néosynthétisé ne sera donc pas porteur de ce site de restriction. Une étape de digestion en utilisant une enzyme de restriction adaptée, c'est-à-dire spécifique dudit site de restriction, aura pour effet de rendre linéaires les matrices parentales, mais pas les brin néosynthétisés, qui pourront, seuls, être transformés efficacement dans des bactéries compétentes. Dans un troisième mode de réalisation, les matrices parentales ont été générées à partir de cultures obtenues dans des bactéries dutung- (déficientes en dUTPase), introduisant dans l'ADN en synthèse un certain nombre de désoxy-uridine au lieu des désoxy-thymidines. Lors de la réaction de l'étape b), les brins d'ADN néosynthétisés seront, au contraire, composés uniquement des quatre bases classiques, dont la désoxy-thymidine. La transfomation du mélange réactionnel dans une souche bactérienne ung+ aura pour effet d'éliminer les brins parentaux (la plupart des souches classiquement utilisées en laboratoire sont ung+ ; ces bactéries possèdent une enzyme qui détruit sélectivement les brins d'ADN portant des désoxy- uridines). Cette approche expérimentale est analogue à celle décrite par Kunkel dans le cadre de la mutagenèse dirigée (Kunkel, TA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 488-92). Ces trois systèmes de sélection, qui ne constituent en aucun cas une liste exhaustive, peuvent être utilisés en combinaison de façon à obtenir un niveau de sélection optimale. Dans un mode de réalisation préféré, le mélange réactionnel obtenu en c) est destiné à être transformé dans des bactéries compétentes, en utilisant n'importe quel procédé permettant de transformer efficacement de l'ADN dans des bactéries, et de préférence un procédé de transformation par choc thermique ou un procédé de transformation par choc électrique (électroporation). Dans le cas d'une électroporation, il est nécessaire de se débarrasser de la majorité des sels présents dans le mélange, par exemple par dialyse sur membrane ou en utilisant des colonnes adaptées (par exemple le MinElute PCR Purification Kit de Qiagen) . Les bactéries transformées peuvent ensuite être étalées sur un milieu de culture solide, contenant un agent de sélection, de façon à obtenir des colonies bactériennes individualisées. Chacune de ces colonies contient le plus souvent un unique plasmide, correspondant pour certains à l'un des plasmides parentaux (produits non recherchés ici), et pour d'autres à des plasmides contenant des fragments appartenant à plusieurs plasmides parentaux différents, un ou plusieurs événements de recombinaison ayant alors eu lieu. *** Mode de réalisation 1: Recombinaison in vitro circulaire de variants d'un gène obtenus par mutagenèse; sélection par Dpnl. Dans un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la recombinaison in vitro de variants d'un gène obtenus par mutagenèse et par la succession des étapes suivantes: a) On dispose d'un gène d'intérêt G1 cloné dans un vecteur adapté : un plasmide contenant en particulier, outre G1, les régions nécessaires à sa réplication, éventuellement à l'expression de G1, et un ou plusieurs marqueurs de sélection, par exemple un gène de résistance à un antibiotique. b) On synthétise par tout procédé connu de mutagenèse aléatoire (de préférence: la PCR mutagène) une banque B1 de variants du gène G1 clonés dans le plasmide initial. Alternativement, on synthétise, par mutagenèse site-spécifique (de préférence en utilisant un kit commercial de mutagenèse dirigée, par exemple le kit QuickChange TM de Stratagene ou le kit GeneEditorTM de Promega) un ensemble de mutants dirigés du gène G1. Eventuellement, on réalise plusieurs ensembles de mutants dirigés en parallèle qu'on mélange ensuite pour créer la banque B1. Alternativement, et de préférence, on synthétise par le procédé Massive Mutagenesis une banque combinatoire B1 de nombreux mutants dirigés du gène G1 (typiquement 105 à 1010 mutants différents). c) Dans un unique tube, on réalise un mélange contenant: - la banque B1 obtenue à l'étape b) ; - un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et homologue d'une région commune à l'ensemble des gènes de la banque B1, de préférence une région du vecteur, lequel est unique, et non de l'insert, qui présente différents variants; - une polymérase thermostable, ou un mélange de polymérases thermostables, et l'ensemble des substrats, tampons et cofacteurs permettant la polymérisation d'ADN; -éventuellement une ligase thermostable. d) On soumet la réaction préparée en c) à un certain nombre de cycles de température (de préférence: 5 à 100 cycles) comprenant: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre eux (typiquement entre 80 C et 110 C; de préférence à 95 C) ; - une phase à plus basse température de façon à ce que l'oligonucléotide s'hybride sur son site de liaison au niveau des plasmides de la banque B1 (typiquement entre 20 C et 60 C; de préférence à 50 C) ; - une phase d'élongation, typiquement à une température comprise entre 60 C et 80 C (de préférence entre 65 C et 75 C), d'une durée comprise de préférence entre 0 seconde (auquel cas la polymérisation a lieu uniquement pendant la montée et la descente en température) et 100 secondes (lorsqu'on souhaite obtenir des régions recombinées relativement longues). e) On soumet la réaction obtenue en d) à une étape de sélection des brins nouvellement synthétisés. Pour ce faire, on digère (de préférence pendant une durée comprise entre 10 minutes et 10 heures et à une température comprise entre 25 et 45 C) les plasmides produits à l'étape d) par une enzyme de restriction spécifique des ADN méthylés, de préférence une ou plusieurs enzymes appartenant au groupe des enzymes Dpnl, Nanl, NmuDI et NmuEI. Plus préférentiellement encore, on digère la réaction une demiheure à 37 C par l'enzyme Dpnl. On obtient une banque B2 enrichie en plasmides recombinants. f) Etape optionnelle. On élimine par dialyse sur membrane ou toute autre technique adaptée (par exemple une extraction au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol ou encore l'utilisation d'un kit commercial de purification), l'essentiel des sels présents dans la banque B2. g) On transforme par une technique adaptée la banque B2 obtenue à l'étape e) (ou f)) dans des cellules (par exemple, des cellules de bactéries, de levures, de plantes, d'insectes, de mammifères ou humaines). De préférence, on transforme l'ADN plasmidique obtenu à l'étape f) par électroporation de cellules d'E. coli. h) On fait pousser les cellules transformées sur un milieu de sélection correspondant au marqueur de sélection présent sur le plasmide initial. i) On prépare l'ADN plasmidique des cellules qui ont poussées. On obtient ainsi une 30 banque B2'. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire (de préférence: 1 à 5 tours) : on itère les étapes c) à i) mais à l'étape c) on utilise non pas la banque B1 mais la banque B2' obtenue à l'issue de l'étape i) du tour précédent. *** Mode de réalisation 2: Recombinaison in vitro circulaire de variants d'un gène obtenus par mutagenèse; sélection par suppression d'un site de restriction dans les plasmides amplifiés. *** Dans un second mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la 10 recombinaison in vitro de variants d'un gène obtenus par mutagenèse et par la succession des étapes suivantes: a) On dispose d'un gène d'intérêt cloné dans un vecteur adapté : un plasmide contenant en particulier, outre le gène d'intérêt G1, les régions nécessaires à sa réplication, éventuellement à l'expression du gène G1, et un ou plusieurs marqueurs de sélection, par exemple un gène de résistance à un antibiotique. b) On synthétise par tout procédé connu de mutagenèse aléatoire (de préférence: la PCR mutagène) une banque B1 de variants du gène G1. Alternativement, on synthétise, par mutagenèse site-spécifique (de préférence en utilisant un kit commercial de mutagenèse dirigée, par exemple le kit QuickChange MultiSiteTM de Stratagene ou le kit GeneEditorTM de Promega) un ensemble de mutants dirigés du gène G1. Eventuellement, on réalise plusieurs ensembles de mutants dirigés en parallèle qu'on mélange ensuite pour créer la banque B1. Alternativement, et de préférence, on synthétise par le procédé Massive Mutagenesis une banque combinatoire B1 de nombreux mutants dirigés du gène G1 (typiquement 105 à 1010 mutants différents). c) Dans un unique tube, on réalise un mélange contenant: - la banque B1 obtenue à l'étape b) ; - un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et partiellement homologue d'une région commune à l'ensemble des gènes de la banque B1. Cet oligonucléotide, de préférence homologue d'une région du vecteur, lequel est unique, et non de l'insert, qui présente différents variants, n'est pas totalement homologue et présente un petit nombre de mésappariements (1 à 10; préférentiellement 1 à 4) conçus de façon à supprimer dans le plasmide un site de restriction unique R1 (un site qui avait une seule occurrence précédemment dans toute la séquence du plasmide initial) ; - une polymérase thermostable, ou un mélange de polymérases thermostables, et l'ensemble des substrats, tampons et cofacteurs permettant la polymérisation d'ADN; - éventuellement une ligase thermostable. d) On soumet la réaction préparée en c) à un certain nombre de cycles de température (de préférence: 5 à 100 cycles) comprenant: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre eux (typiquement entre 80 C et 110 C; de préférence à 95 C) ; - une phase à plus basse température de façon à ce que l'oligonucléotide s'hybride sur son site de liaison au niveau des plasmides de la banque B1 (typiquement entre 20 C et 60 C; de préférence à 50 C) ; - une phase d'élongation, typiquement à une température comprise entre 60 C et 80 C (de préférence entre 65 C et 75 C), d'une durée comprise de préférence entre 0 seconde (auquel cas la polymérisation a lieu uniquement pendant la montée et la descente en température) et 100 secondes (lorsqu'on souhaite obtenir des régions recombinées relativement longues). e) On soumet la réaction obtenue en d) à une étape de sélection des brins nouvellement synthétisés. Pour ce faire, on digère (de préférence pendant une durée comprise entre 10 minutes et 10 heures et à une température comprise entre 25 et 45 C) les plasmides produits à l'étape d) par une enzyme de restriction spécifique du site R1. On obtient une banque B2. Les plasmides qui viennent d'être synthétisés à l'étape d) ne portent pas le site R1, ne sont pas digérés et restent circulaires. Au contraire, les plasmides initiaux portent le site R1, sont clivés par l'enzyme et deviennent linéaire. Ces plasmides linéarisés ont une efficacité de transformation très faibles et seront ainsi nettement appauvris dans la banque B2' qui sera obtenue à l'étape i). f) Etape optionnelle. On élimine par dialyse sur membrane ou toute autre technique adaptée (par exemple une extraction au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol ou encore l'utilisation d'un kit commercial de purification), l'essentiel des sels présents dans la banque B2. g) On transforme par une technique adaptée la banque B2 obtenue à l'étape e) (ou f)) dans des cellules (par exemple, des cellules de bactéries, de levures, de plantes, d'insectes, de mammifères ou humaines). De préférence, on transforme l'ADN plasmidique obtenu à l'étape f) par électroporation de cellules d'E. coli. h) On fait pousser les cellules transformées sur un milieu de sélection correspondant au 10 marqueur de sélection présent sur le plasmide initial. i) On prépare l'ADN plasmidique des cellules qui ont poussées. On obtient ainsi une banque B2'. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire (de préférence: 1 à 5 tours) : on itère les étapes c) à i) mais à l'étape c) on utilise non pas la banque B1 maisla banque B2' obtenue à l'issue de l'étape i) du tour précédent. *** Mode de réalisation 3: Recombinaison in vitro circulaire de variants d'un gène obtenus par mutagenèse; sélection par utilisation de souches ung-. *** Dans un troisième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la recombinaison in vitro de variants d'un gène obtenus par mutagenèse et par la succession des étapes suivantes: a) On dispose d'un gène d'intérêt cloné dans un vecteur adapté : un plasmide contenant en particulier, outre le gène d'intérêt G1, les régions nécessaires à sa réplication, éventuellement à l'expression du gène G1, et un ou plusieurs marqueurs de sélection, par exemple un gène de résistance à un antibiotique. b) On synthétise par tout procédé connu de mutagenèse aléatoire (de préférence: la PCR mutagène) une banque B1 de variants du gène G1. Alternativement, on synthétise, par mutagenèse site-spécifique (de préférence en utilisant un kit commercial de mutagenèse dirigée, par exemple le kit QuickChange TM de Stratagene ou le kit GeneEditorTM de Promega) un ensemble de mutants dirigés du gène G1. Eventuellement on réalise plusieurs ensembles de mutants dirigés en parallèle qu'on mélange ensuite pour créer la banque B1. Alternativement, et de préférence, on synthétise par le procédé Massive Mutagenesis une banque combinatoire B1 de nombreux mutants dirigés du gène G1 (typiquement 105 à 1010 mutants différents). On transforme cette banque dans des bactéries dut- ung(déficientes en dUTPase), introduisant dans l'ADN en synthèse un certain nombre de désoxy-uridine au lieu des désoxy-thymidines. Cette approche expérimentale utilisant des bactéries particulières est analogue à celle décrite par Kunkel dans le cadre de la mutagenèse dirigée (Kunkel, TA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 488-92). On prépare l'ADN plasmidique amplifié par la machinerie des bactéries ung-, et on récupère une banque B' 1. c) Dans un unique tube, on réalise un mélange contenant: - la banque B' l obtenue à l'étape b) ; - un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et homologue d'une région commune à l'ensemble des gènes de la banque B'1, de préférence une région du vecteur, lequel est unique, et non de l'insert, qui présente différents variants; - une polymérase thermostable, ou un mélange de polymérases thermostables, et 20 l'ensemble des substrats, tampons et cofacteurs permettant la polymérisation d'ADN; - éventuellement une ligase thermostable. d) On soumet la réaction préparée en c) à un certain nombre de cycles de température (de préférence: 5 à 100 cycles) comprenant: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre eux 25 (typiquement entre 80 C et 110 C; de préférence à 95 C) ; - une phase à plus basse température de façon à ce que l'oligonucléotide s'hybride sur son site de liaison au niveau des plasmides de la banque B' l (typiquement entre 20 C et 60 C; de préférence à 50 C) ; - une phase d'élongation, typiquement à une température comprise entre 60 C et 80 C 30 (de préférence entre 65 C et 75 C), d'une durée comprise de préférence entre 0 seconde (auquel cas la polymérisation a lieu uniquement pendant la montée et la descente en température) et 100 secondes (lorsqu'on souhaite obtenir des régions recombinées relativement longues). A l'issue de la réaction d'amplification, on obtient une banque B2 contenant des plasmides recombinants. e) Etape optionnelle. On élimine par dialyse sur membrane ou toute autre technique adaptée (par exemple une extraction au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol ou encore l'utilisation d'un kit commercial de purification), l'essentiel des sels présents dans la banque B2. f) On transforme par une technique adaptée la banque B2 dans des cellules d'E. colt standard ung+ ; ces bactéries possèdent une enzyme qui détruit sélectivement les brins d'ADN portant des desoxy-uridines et ceci permet de contre-sélectionner les plasmides initiaux et d'enrichir en plasmides synthétisés à l'étape c). g) On fait pousser les cellules transformées sur un milieu de sélection correspondant au marqueur de sélection présent sur le plasmide initial. h) On prépare l'ADN plasmidique des cellules qui ont poussées. On obtient ainsi une banque B2'. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire (de préférence: 1-5) : on itère les étapes c) à h) mais à l'étape c) on utilise non pas la banque B1 mais une banque B3 qui correspond à la banque B'2 de l'étape h) qu'on aura réamplifiée par des bactéries ung-. *** Mode de réalisation 4: Recombinaison in vitro circulaire de gènes obtenus par les techniques du metagénome * * * Dans un quatrième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par 25 la recombinaison in vitro de variants d'un gène obtenus par une technique dite du metagénome et par la succession des étapes suivantes: a) On constitue par une des techniques dites du metagénome disponible, une banque B1 de gènes environnementaux. Dans un premier mode de réalisation, on amplifie par PCR les gènes homologues à un gène d'intérêt connu puis on les clone dans un plasmide pour obtenir une banque B1. Dans un second mode de réalisation, on clone directement par shotgun cloning dans un plasmide adapté un ensemble de gènes environnementaux, qu'on sélectionne ensuite par un test fonctionnel pour obtenir après sélection une banque B1. b) Dans un unique tube, on réalise un mélange contenant: - la banque B1 obtenue à l'étape a) ; - un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et homologue d'une région commune à l'ensemble des gènes de la banque B1, de préférence une région du vecteur, lequel est unique et non de l'insert, qui présente différents variants; - une polymérase thermostable, ou un mélange de polymérases thermostables, et l'ensemble des substrats, tampons et cofacteurs permettant la polymérisation d'ADN; -éventuellement une ligase thermostable. c) On soumet la réaction préparée en b) à un certain nombre de cycles de température (de préférence: 5 à 100 cycles) comprenant: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre eux (typiquement entre 80 C et 110 C; de préférence à 95 C) ; - une phase à plus basse température de façon à ce que l'oligonucléotide s'hybride sur son site de liaison au niveau des plasmides de la banque B1 (typiquement entre 20 C et 20 60 C; de préférence à 50 C) ; - une phase d'élongation, typiquement à une température comprise entre 60 C et 80 C (de préférence entre 65 C et 75 C), d'une durée comprise de préférence entre 0 seconde (auquel cas la polymérisation a lieu uniquement pendant la montée et la descente en température) et 100 secondes (lorsqu'on souhaite obtenir des régions recombinées relativement longues). d) On soumet la réaction obtenue en c) à une étape de sélection des brins nouvellement synthétisés. Pour ce faire, on digère (de préférence pendant une durée comprise entre 10 minutes et 10 heures et à une température comprise entre 25 et 45 C) les plasmides produits à l'étape d) par une enzyme de restriction spécifique des ADN méthylés, de préférence une ou plusieurs enzymes appartenant au groupe des enzymes Dpnl, Nanl, NmuDI et NmuEI. Plus préférentiellement encore, on digère une demi-heure à 37 C par l'enzyme DpnI. On obtient une banque B2 enrichie en plasmides recombinants. e) Etape optionnelle. On élimine par dialyse sur membrane ou toute autre technique adaptée (par exemple une extraction au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol ou à 1'isopropanol ou encore l'utilisation d'un kit commercial de purification), l'essentiel des sels présents dans la banque B2. f) On transforme par une technique adaptée la banque B2 obtenue à l'étape d) (ou e)) dans des cellules (par exemple, des cellules de bactéries, de levures, de plantes, d'insectes, de mammifères ou humaines). De préférence, on transforme l'ADN obtenu à l'étape e) par électroporation de cellules d'E. coli. g) On fait pousser les cellules transformées sur un milieu de sélection correspondant au marqueur de sélection présent sur le plasmide initial. h) On prépare l'ADN plasmidique des cellules qui ont poussées. On obtient ainsi une 15 banque B2'. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire (de préférence: 1-5) : on itère les étapes b) à h) mais à l'étape b) on utilise non pas la banque B1 issue du metagénome mais la banque B2' obtenue à l'issue de l'étape h) du tour précédent. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de sélection utilisée ne fait pas appel à la méthylation, mais à la disparition d'un site de restriction (voir mode de réalisation 2) ou à l'utilisation de souches bactériennes particulière (voir mode de réalisation 3). *** Mode de réalisation 5: Recombinaison in vitro circulaire de gènes homologues extraits de différents organismes *** Dans un cinquième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la recombinaison in vitro de variants de gènes homologues extraits de différents organismes et par la succession des étapes suivantes: a) On choisit un petit nombre N1 (compris entre 2 àl000, et de préférence compris entre 3 à 50) d'organismes que l'on sait cultiver en laboratoire et dont le génome renferme pour chacun une version différente d'un même gène G1. On cultive indépendamment ces organismes, on amplifie par PCR en utilisant des amorces adaptées le gène G1 et on clone indépendamment dans N1 plasmides identiques les N1 versions du gène G1 présentes dans les N1 organismes. Par exemple, G1 peut coder une protéine thermostable et on clone G1 à partir de plusieurs organismes (tels que Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus, Pyrococcus species GB-D, Thermococcus, ...) vivant dans des environnements marins très chauds. En mélangeant les N1 plasmides contenant les différentes versions de G1, on obtient une banque B1. De préférence on réalise un mélange équimolaire des plasmides. b) Dans un unique tube, on réalise un mélange contenant: - la banque B1 obtenue à l'étape a) ; - un oligonucléotide d'une taille suffisante pour l'hybridation, et donc de préférence comprise entre 6 et 100 bases, et plus préférentiellement encore comprise entre 15 et 30 bases, et homologue d'une région commune à l'ensemble des gènes de la banque B1, de préférence une région du vecteur, lequel est unique et non de l'insert, qui présente différents variants; - une polymérase thermostable, ou un mélange de polymérases thermostables, et 20 l'ensemble des substrats, tampons et cofacteurs permettant la polymérisation d'ADN; - éventuellement une ligase thermostable. c) On soumet la réaction préparée en c) à un certain nombre de cycles de température (de préférence: 5 à 100 cycles) comprenant: - une phase à haute température de façon à dissocier les brins d'ADN entre 25 eux (typiquement entre 80 C et 110 C; de préférence à 95 C) ; - une phase à plus basse température de façon à ce que l'oligonucléotide s'hybride sur son site de liaison au niveau des plasmides de la banque B1 (typiquement entre 20 C et 60 C; de préférence à 50 C) ; - une phase d'élongation, typiquement à une température comprise entre 60 C et 80 C 30 (de préférence entre 65 C et 75 C), d'une durée comprise de préférence entre 0 seconde (auquel cas la polymérisation a lieu uniquement pendant la montée et la descente en température) et 100 secondes (lorsqu'on souhaite obtenir des régions recombinées relativement longues). d) On soumet la réaction obtenue en c) à une étape de sélection des brins nouvellement synthétisés. Pour ce faire, on digère (de préférence pendant une durée comprise entre 10 minutes et 10 heures et à une température comprise entre 25 et 45 C) les plasmides produits à l'étape d) par une enzyme de restriction spécifique des ADN méthylés, de préférence une ou plusieurs enzymes appartenant au groupe des enzymes Dpnl, Nanl, NmuDI et NmuEI. Plus préférentiellement encore, on digère une demi-heure à 37 C par l'enzyme Dpnl. On obtient une banque B2 contenant des plasmides recombinants. e) Etape optionnelle. On élimine par dialyse sur membrane ou toute autre technique adaptée (par exemple une extraction au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol ou encore l'utilisation d'un kit commercial de purification), l'essentiel des sels présents dans la banque B2. f) On transforme par une technique adaptée la banque B2 obtenue à l'étape d) (ou e)) dans des cellules (par exemple, des cellules de bactéries, de levures, de plantes, d'insectes, de mammifères ou humaines). De préférence, on transforme l'ADN obtenu à l'étape e) par électroporation de cellules d'E. coli. g) On fait pousser les cellules transformées sur un milieu de sélection correspondant au 20 marqueur de sélection présent sur le plasmide initial. h) On prépare l'ADN plasmidique des cellules qui ont poussées. On obtient ainsi une banque B2'. Dans un mode de réalisation particulier, on réalise plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire (de préférence: 1-5) : on itère les étapes b) à h) mais à l'étape b) on utilise non pas la banque B I issue du clonage de gènes homologues de différents organismes mais la banque B2' obtenue à l'issue du tour précédent. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de sélection utilisée ne fait pas appel à la méthylation, mais à la disparition d'un site de restriction (voir mode de réalisation 2) ou à l'utilisation de souches bactériennes particulière (voir mode de réalisation 3). *** Mode de réalisation 6: Recombinaison in vitro circulaire et sélection fonctionnelle ** Dans un sixième mode de réalisation particulier, on part comme précédemment de gènes obtenus soit par mutagenèse soit par les techniques du metagénome soit encore par clonage de gènes homologues dans différents organismes puis le procédé est adapté de manière évidente pour les gens de l'art afin qu'à l'issue de la dernière étape des modes de réalisation décrits précédemment, la banque de plasmides recombinants puisse être soumise à une méthode de sélection fonctionnelle in vivo ou in vitro. De préférence, la méthode de sélection utilisée est l'une des méthodes suivantes: sélection in vivo, phage display, cell-surface display, compartmentalized self-replication, in vitro compartmentation, ribosome display, mRNA-peptide fusion, mRNA display, plasmid display. Les plasmides obtenus après l'application de cette méthode de sélection fonctionnelle (et éventuel clonage) peuvent être utilisés pour une expression individuelle afin d'isoler un petit nombre de variants significativement améliorés ou employés directement pour un nouveau tour de recombinaison in vitro circulaire. De préférence, on utilise alors une méthode de sélection fonctionnelle qui a lieu directement sur les plasmides circulaires de sorte qu'on peut enchaîner de manière rapide et économique plusieurs tours de recombinaison in vitro circulaire / sélection fonctionnelle. *** Mode de réalisation 7: Recombinaison in vitro circulaire en utilisant plusieurs oligonucléotides * * Dans un septième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation, au sein du mélange qui subit la réaction d'amplification circulaire recombinante, de plusieurs oligonucléotides s'appariant à des endroits différents le long de la séquence des plasmides à recombiner. Ceci permet d'augmenter la fréquence des évènements de recombinaisons (ie. diminuer la distance moyenne entre deux points de recombinaisons). Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation, au sein du mélange qui subit la réaction d'amplification circulaire recombinante, d'un ou plusieurs oligonucléotides s'appariant à l'un des brins des plasmides à recombiner tandis qu'un ou plusieurs autres oligonucléotides s'apparient à l'autre brin. Ceci permet d'augmenter la proportion de plasmides recombinants par rapport aux plasmides parentaux dans le produit obtenu à l'issue de l'amplification. Exemples Exemple 1: Recombinaison de deux matrices mutées. Un premier modèle d'étude, destiné à mesurer l'efficacité de recombinaison entre deux matrices de séquence totalement identiques exceptées deux positions, a été mis en place. Les deux matrices parentales étaient composées du gène de l'ILl5 humain inséré dans le plasmide pORF (Invivogen). La matrice parentale A contenait une mutation au niveau de la position 457, annulant un site de restriction BsrGI, unique sur l'ensemble du plasmide et de l'insert. La matrice parentale B contenait une mutation au niveau de la position 208, annulant un site de restriction MslI, unique sur l'ensemble du plasmide et de l'insert. L'oligonucléotide utilisé pour l'amorçage de la polymérisation, IL15(A), était homologue d'une région située 25 bases après l'ATG d'initiation de l'IL15. Sa séquence, de 5' vers 3', était GTATTTCCATCCAGTGCTAC (SEQ ID No 1). Dans une étape préliminaire, 1,5 nmole de l'oligonucléotide IL15(A) a été phosphorylé de façon enzymatique dans un volume réactionnel de 20 l, en utilisant une quantité suffisante de phosphonucléotide kinase et de son tampon, et une concentration finale dans la réaction de 1 mM d'ATP. Le mélange réactionnel a été incubé une heure à 37 C. L'enzyme a ensuite été inactivée en incubant le mélange à une température de 65 C pendant 20 minutes. matrice parentale A (75 ng/ l) 1 l matrice parentale B (75 ng/ l) 1 l Oligonucléotide IL15(A) phosphorylé (dilué à 0,75 M) 1 l dNTP (25 mM) 1 l ATP (10 mM) 1 pl MgSO4 (100 mM) 1 pl Tampon 10x pfu pol 2,5 l Tth ligase 0,8 l NAD (100 mM) 0,2 pl On a ensuite réalisé le mélange réactionnel suivant: 25 dTT(1 M) 0,2 gl Pfu polymérase 0,8 gl Taq polymérase 0,5 l Eau distillée 14 l Total 25 l Un second mélange réactionnel, similaire mais ne comprenant pas d'oligonucléotide (contrôle négatif), a été réalisé en parallèle. Les deux mélanges réactionnels ont ensuite été soumis à une série de cinq cycles de 10 température tels que [94 C, 1 sec; 50 C, 1 sec; 68 C, 1 sec], suivis de douze cycles de température tels que [94 C, 1 sec; 50 C, 1 sec; 68 C, 20 min]. l de chaque mélange réactionnel ont ensuite été prélevés et disposés dans un nouveau tube. Leur ont été ajoutés 4 l de tampon 4 (NEB), 0,5 gl d'enzyme Dpn I à 20 000u/mL (NEB), et 10,5 l d'eau distillée. Après trente minutes d'incubation puis vingt minutes d'inactivation à la température (65 C), 4 l de chaque mélange réactionnel ont été prélevés et disposés sur une membrane de dialyse (Millipore). Après quinze minutes, 4 l de chaque réaction dialysée sont utilisées pour transformer des bactéries DH10B électrocompétentes en utilisant des conditions classiques. Après une période d'incubation d'une heure dans un milieu SOC ne contenant pas d'agent sélectif, les bactéries transformées ont été étalées sur une boite de pétri contenant de l'ampicilline. Le lendemain, 1380 colonies ont été dénombrées sur la boite de pétri correspondant au mélange réactionnel complet, alors que 6 colonies seulement ont été dénombrées sur la boite correspondant au témoin négatif. Quatre-vingt-seize colonies ont été individuellement repiquées et mises à incuber sous agitation dans 100 l de milieu liquide contenant de l'ampicilline. Des réactions de PCR ont ensuite été réalisées sur ces cultures, en utilisant deux oligonucléotides de sens opposé, flanquant la région codante, et respectivement nommés IL15+ (CTTGGAGCCTACCTAGACTCA (SEQ ID No 2); homologue d'une région située environ 270 pb avant le codon ATG) ; et IL15-" (TGTCTCGGTGTTGACCAAAGG (SEQ ID No 3); homologue d'une région située environ 100 pb après le codon STOP). Le fragment amplifié en utilisant ces oligonucléotides avait une taille de 1079 pb. Les fragments d'ADN amplifiés ont été individuellement soumis à la digestion par l'enzyme BsrGI d'une part et par l'enzyme Ms1I d'autre part. Les produits de digestions ont été migrés sur un gel d'agarose. De cette façon, la présence de chacun des deux sites de restriction a pu être mesurée pour chacun des 96 clones, et on a pu classer chaque clone dans l'une des quatre catégories possibles: BsrG IR Msl Is; BsrG Is Msl IR; BsrG IR Msl IR; BsrG Is Msl Is (l'exposant R signifie ici que le fragment amplifié était résistant à la digestion par l'enzyme de restriction, l'exposant S signifie que ledit fragment y était sensible). Les deux premières de ces catégories correspondaient aux matrices parentales. Les deux dernières catégories correspondaient aux clones ayant eu au moins un événement de recombinaison. Les deux populations parentales BsrG IR Msl Is et BsrG Is Msl IR représentaient 44% et 32% de la population (soit respectivement 41 et 30 colonies sur 96). Les populations recombinées BsrG IR Msl IR et BsrG Is Msl Is représentent respectivement 20% et 3% de la population totale (soit respectivement 19 et 3 clones sur les 96). Leur nature précise a été vérifié par séquençage d'un échantillon statistique de ces clones recombinants. Une fréquence significative de clones recombinés (23%) a donc été observée dans cet exemple expérimental, qui démontre donc la faisabilité de la technologie selon l'invention. Exemple 2: Evolution d'une enzyme par évolution in vitro et recombinaison. On part d'un plasmide contenant un gène codant pour une protéine dont on souhaite augmenter l'activité. On construit rapidement, par la technique Massive Mutagenesis (WO0216606) une banque de plasmides contenant des variants de ce gène d'intérêt, porteurs chacun de diverses mutations ponctuelles. On exprime ces gènes et on les crible de façon à isoler une fraction de plasmides positifs contenant des gènes codant des protéines ayant une activité améliorée. La séquence précise de ces gènes n'est pas connue, mais on sait que leurs séquences sont assez similaires, et identiques au gène de départ mises à part diverses mutations ponctuelles. On dilue ce mélange P1 de plasmides positifs jusqu'à une concentration voisine de 100 ng/gl. On choisit un oligonucléotide amorce Al complémentaire de la région située ailleurs que sur le gène d'intérêt, de préférence au niveau du vecteur plasmidique. On synthétise cet oligonucléotide puis on phosphoryle 1,5 nmole de l'oligonucléotide Al dans un volume réactionnel de 20 l, en utilisant une quantité suffisante de phosphonucléotide kinase et de son tampon, et une concentration finale dans la réaction de 1 mM d'ATP. Le mélange réactionnel est ensuite incubé une heure à 37 C. L'enzyme kinase est ensuite inactivée en incubant le mélange à une température de 65 C pendant 20 minutes. Mélange de matrices parentales P1 (100 ng/ l) 2 l Oligonucléotide Al phosphorylé (dilué à 0,75 M) 1 l dNTP (25mM) 1 l ATP (10 mM) 1 l MgSO4 (100 mM) 1 gl Tampon 10x pfu pol 2,5 l Tth ligase 0,8 l NAD (100 mM) 0, 2 l dTT (1 M) 0,2 l Pfu polymérase 0,8 l Taq polymérase 0,5 gl Eau distillée 14 l Total 25 l Le mélange réactionnel est ensuite soumis à une série de cinq cycles de température tels que [94 C, 1 sec; 50 C, 1 sec; 68 C, 1 sec], suivie de douze cycles de température tels que [94 C, 1 sec; 50 C, 1 sec; 68 C, 20 min]. Après ces cycles de température, 25 ul du mélange réactionnel sont prélevés et disposés dans un nouveau tube. Leur sont ajoutés 4 l de tampon 4 (NEB), 0,5 l d'enzyme Dpn I à 20 000 u/mL (NEB), et 10,5 gl d'eau distillée. Après trente minutes d'incubation et vingt minutes d'inactivation thermique (65 C), 4 l du mélange réactionnel sont prélevés et disposés sur une membrane de dialyse (Millipore). Après quinze minutes, 4 On réalise ensuite le mélange réactionnel suivant: 15 l de chaque réaction dialysée sont utilisés pour transformer des bactéries DH10B électrocompétentes en utilisant des conditions classiques. Après une période d'incubation d'une heure dans un milieu SOC ne contenant pas d'agent sélectif, les bactéries transformées sont étalées sur une boîte de pétri contenant de l'ampicilline et mises à incuber à 37 C. Le lendemain, on récupère la boîte de pétri et on y prélève 940 colonies qu'on met individuellement à incuber dans 10 plaques à 96 puits pendant trois heures sous agitation dans 100 gl de milieu liquide contenant de l'ampicilline de façon à permettre l'expression protéique. On prend soin de placer deux témoins dans des puits de localisation connue: un milieu de culture seul et un milieu de culture contenant un clone porteur du plasmide d'intérêt initial, qui produira donc une enzyme présentant l'activité de base. Après expression, on teste individuellement l'activité enzymatique de la protéine d'intérêt présente dans chaque puit et on la compare à celle de chacun des deux contrôles. On récupère les clones dont l'activité enzymatique est mesurée comme significativement supérieure à celle du clone initial. Exemple 3: Recombinaison de gènes naturels partageant un certain degré d'homologie. On clone dans un même plasmide contenant un gène marqueur de résistance à l'ampicilline un ensemble de gènes homologues issus d'organismes différents. On dilue ce mélange P 1 jusqu'à une concentration de 100 ng/ l. La concentration des matrices parentales P 1 s'entend en quantité d'ADN total par gl (par exemple, dans le cas d'un mélange équimolaire de 4 gènes, on introduit 100/4 = 25 ng/ l de chacun des gènes). On choisit un oligonucléotide amorce Al complémentaire de la région située ailleurs que sur les gènes d'intérêt, de préférence au niveau du vecteur plasmidique. On synthétise cet oligonucléotide puis on phosphoryle 1,5 nmole de l'oligonucléotide Al dans un volume réactionnel de 20 l, en utilisant une quantité suffisante de phosphonucléotide kinase et de son tampon, et une concentration finale dans la réaction de 1 mM d'ATP. Le mélange réactionnel est ensuite incubé une heure à 37 C. L'enzyme kinase est ensuite inactivée en incubant le mélange à une température de 65 C pendant 20 minutes. On réalise ensuite le mélange réactionnel suivant: Mélange de matrices parentales P1 (100 ng/gl) 2 l Oligonucléotide Al phosphorylé (dilué à 0, 75 M) 1 gl dNTP (25mM) ATP (10 mM) MgSO4 (100 mM) Tampon 10x pfu pol Tth ligase NAD (100 mM) dTT (1 M) Pfu polymérase Taq polymérase Eau distillée 1 l 1 l 1 l 2,5 l 0,8 l 0,2 gl 0,2 pl 0,8 l 0,5 l 14 gl Total 25 l Le mélange réactionnel est ensuite soumis à une série de cinq cycles de témpérature tels que [94 C 1 sec; 50 C 1 sec; 68 C 1 sec], suivis de douze cycles de température tels 15 que [94 C 1 sec; 50 C 1 sec; 68 C 20 min]. Après ces cycles de température, 25 l du mélange réactionnel sont prélevés et disposés dans un nouveau tube. Leur sont ajoutés 4 l de tampon 4 (NEB), 0,5 l d'enzyme DpnI à 20 000 u/mL (NEB), et 10,5 l d'eau distillée. Après trente minutes d'incubation et vingt minutes d'inactivation thermique (65 C), 4 l du mélange réactionnel sont prélevés et disposés sur une membrane de dialyse (Millipore). Après quinze minutes,4 l de chaque réaction dialysée sont utilisés pour transformer des bactéries DH10B électrocompétentes en utilisant des conditions classiques. Après une période d'incubation d'une heure dans un milieu SOC ne contenant pas d'agent sélectif, les bactéries transformées sont étalées sur une boîte de pétri contenant de l'ampicilline et mises à incuber à 37 C. Le lendemain, on récupère la boîte de pétri et on y prélève, au titre de contrôle qualité, 48 colonies qu'on met individuellement à incuber pendant trois heures sous agitation dans 100 l de milieu liquide contenant de l'ampicilline. On prépare l'ADN plasmidique de ces 48 clones et on séquence la région d'intérêt en utilisant des oligonucléotides appropriés. L'analyse des séquences obtenues doit montrer que la banque construite par recombinaison in vitro de variants d'un gène issus d'organismes différents contient des gènes présentant plusieurs recombinaisons entre les variants initiaux. Plusieurs centaines ou plusieurs milliers des gènes recombinés sont ensuite testés en aveugle (c'est-à-dire sans que leur séquence soit préalablement connue) en utilisant un test d'activité. Les gènes présentant une modification de la propriété étudiée sont ensuite séquencés et caractérisés plus complètement. Légendes des figures. Figure 1. Principe de la recombinaison in vitro circulaire. Un ensemble de plasmides parents (pl, p2), sont identiques pour leur partie vecteur (origine de réplication, gène de résistance à un antibiotique,... ; trait plein) et portent comme insert des versions différentes (ayant un certain degré de similarité de séquence) d'un gène d'intérêt (hachures). Pour simplifier le schéma, on a choisit d'illuster un cas où il n'y aurait que 2 plasmides parents; en réalité, il peut y avoir un grand nombre de plasmides parents différents. Cet ensemble de plasmides est amplifié avec des cycles d'élongation très courts en utilisant un seul oligonucléotide amorce. Les produits recombinés obtenus (la descendance: p3, p4, p5, p6) ont tous la portion commune des plasmides de départ (traits pleins) et leurs inserts (hachures) combinent les inserts des plasmides de départ. Ainsi, par exemple, le gène d'intérêt de p3 a une séquence qui est la juxtaposition du début de la séquence de l'insert de pl et de la fin de la séquence issue de p2. Pour le plasmide p4, il y a également une recombinaison unique entre pl et p2 mais l'ordre est inversé. Les plasmides p5 et p6 illustrent les types de produits qui peuvent être obtenus lorsqu'il y a deux événements de recombinaison, avec des séquences de type (début de l'insert de pl partie centrale de l'insert de p2 fin de l'insert de pl) et (début de l'insert de p2 partie centrale de l'insert de pl fin de l'insert de p2) réciproquement. Il est possible suivant ce principe d'obtenir un nombre très élevé de produits différents suivant la position des recombinaisons et leur nombre. Figure 2. Principe de la recombinaison circulaire par élongation à cycles courts. (b) On part dans cet exemple de quatre plasmides parents pl, p2, p3 et p4 différents d'un unique oligonucléotide amorce complémentaire ou partiellement complémentaire d'un brin de ces quatre plasmides. (c) On ajoute une polymérase thermostable, éventuellement une ligase thermostable et des désoxyribonucléotide triphosphate dans un tampon adapté et on soumet le mélange à un thermocyclage. Lors du premier cycle, l'oligonucléotide amorce s'hybride avec pl et une portion de pl est copiée, générant un fragment de plasmide complémentaire d'un brin de pl. Au second cycle, après s'être détachée, cette portion de plasmide s'hybride avec p2 et après polymérisation une molécule recombinée complémentaire d'un fragment d'un brin de pl et d'un fragment d'un brin de p2 est obtenue. Au troisième cycle, après s'être détachée, cette molécule s'hybride avec p3 et on obtient une molécule recombinée complémentaire d'un fragment d'un brin de pl, d'un fragment d'un brin de p2 et d'un fragment d'un brin de p3. A l'issue d'un quatrième cycle de dénaturation, hybridation, élongation, un plasmide complet est obtenu, qui recombine pl, p2, p3 et p4. Figure 3. Recombinaison circulaire de mutants ponctuels. (a) On réalise des mutants dirigés ponctuels d'un plasmide unique à l'aide des oligonucléotides 1, 2, 3 et 4. (b) On obtient une collection de 4 mutants simples. (c) Le procédé selon l'invention permet de recombiner ces mutants simples pour obtenir des mutants doubles, triples et quadruples. Le mélange produit contient également des plasmides sauvages ainsi que des mutants simples. Revendications. 1- Procédé de production in vitro de polynucléotides d'intérêt recombinés à partir d'au moins 2 polynucléotides d'intérêt différents, caractérisé en ce qu'il comprend: a) préparer un mélange comprenant des molécules polynucléotidiques circulaires comprenant chacunes un desdits polynucléotides d'intérêt différents, et au moins un oligonucléotide amorce s'hybridant à une région conservée dans lesdites molécules polynucléotidiques circulaires; b) soumettre le mélange à plusieurs cycles d'élongation comprenant chacun une phase d'élongation, et la durée d'élongation pour au moins un des cycles est adaptée pour que l'élongation soit interrompue au niveau desdits polynucléotides d'intérêt; ledit procédé résultant en la production de molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées comprenant des polynucléotides d'intérêt recombinés. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comprend en outre une étape c) de sélection les molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées. 3- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le nombre de polynucléotides d'intérêt différents est compris entre 2 et 1011, de préférence entre 2 et 106. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les étapes d'élongation ont des durées comprises entre 0 s et 100 s, et de préférence comprises entre 0 s et 5 s. 5- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites lesdits polynucléotidiques d'intérêt présentent une identité de séquence supérieure à 50%, et de préférence supérieure à 85%. 6- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites molécules polynucléotidiques circulaires sont doublebrin, de préférence un plasmide. 7- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites molécules polynucléotidiques circulaires ne diffèrent essentiellement que par les polynucléotides d'intérêt. 8- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide amorce a une taille comprise entre 6 et 100 bases, et de préférence entre 15 et 25 bases. 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé met en oeuvre un seul oligonucléotide amorce. 10- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le 10 procédé met en oeuvre deux oligonucléotides amorces ou plus, de préférence entre deux et 5 oligonucléotides amorces. 11- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide amorce s'hybride sur lesdites molécules polynucléotidiques circulaires en dehors des polynucléotides d'intérêt. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élongation est réalisée par une polymérase thermostable, de préférence sélectionnée parmi le groupe des DNA polymérases Taq, Pfu, Vent, Pfx, KD ou un mélange de celles-ci. 13- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 20 qu'une DNA ligase thermostable (de préférence: la Taq Ligase, la Tth Ligase ou l'Amp Ligase) est ajoutée dans ledit mélange. 14- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'oligonucléotide amorce est phosphorylé. 15- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la sélection c) est effectuée par digestion des molécules polynucléotidiques circulaires résultant de l'étape b) par une ou plusieurs enzymes spécifiques de l'ADN méthylé, de préférence sélectionnées parmi le groupe suivant: Dpnl, NanII, NmuDI, NmuEI. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules polynucléotidiques circulaires initiales de l'étape a) ont été amplifiés dans des souches ung- et que la sélection c) est effectuée en transformant des souches ung+ par des molécules polynucléotidiques circulaires résultant de l'étape b). 17- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit oligonucléotide amorce présente une ou plusieurs bases mésappariées qui supprime(nt), dans les molécules polynucléotidiques circulaires nouvellement synthétisées, un site de restriction d'une endonucléase présent dans les molécules polynucléotidiques circulaires initiales de l'étape a), et en ce que la sélection c) est effectuée par la digestion des molécules polynucléotidiques circulaires initiales par ladite enzyme de restriction. 18- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que lesdits polynucléotides d'intérêt sont issues du clonage homologue d'un gène dans plusieurs organismes différents. 19- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que lesdits polynucléotides d'intérêt sont produits par clonage direct - par les techniques 15 dites du metagénome - d'ADN issu d'une source environnementale. 20- Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que lesdits polynucléotides d'intérêt sont produits par une technique de mutagenèse. 21- Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la technique de mutagenèse utilisée est la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée ou la Massive Mutagenesis 20 . 22- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, caractérisé en ce que les molécules polynucléotidiques circulaires résultant de l'étape c) sont soumises à nouveau à l'étape b) de la revendication 1. 23- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits polynucléotides d'intérêt recombinés résultants sont ensuite soumis à une étape de criblage à bas-débit, hautdébit ou ultra-haut-débit. 24- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits polynucléotides d'intérêt recombinés résultants sont soumis à une étape de sélection fonctionnelle. 25- Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la méthode de sélection fonctionnelle est sélectionnée parmi les techniques suivantes: sélection à la surface d'un ribosome ribosome display , sélection à la surface d'un phage phage display , sélection à la surface d'une cellule cell-surface display , sélection à la surface d'un plasmide plasmid display , fusion ARNm-peptide, compartimentation in vitro, auto-réplication compartimentée, et sélection in vivo. 26- Banque de séquences polynucléotidiques d'intérêt recombinées produites par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 27- Banque protéique issue de l'expression d'une banque selon la revendication 26.