Brevet FR2880896A1 — publié le 20060721

La présente invention concerne, d'une part, un procédé pour transformer une souche de levure non productrice d'endopolygalacturonase, faisant partie des enzymes regroupées sous le nom générique de pectinases, en une souche la produisant et, d'autre part, un plasmide portant le matériel génétique nécessaire à l'expression et à l'amplification de cette enzyme. Plus particulièrement, elle est relative à un procédé pour obtenir des microorganismes exprimant à un haut niveau l'endopolygalacturonase des souches de levures notamment et en particulier de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Ce procédé permet également, au moyen des techniques de biologie moléculaire, de construire des plasmides contenant l'ORF (phase ouverte de lecture) et une partie du promoteur du gène codant pour cette enzyme. Ces vecteurs s'avèrent des outils de choix pour amplifier la synthèse de l'endopolygalacturonase. Les polygalacturonases sont des enzymes pectolytiques, faisant partie des enzymes regroupées sous le nom générique de pectinases, qui ont pour substrat privilégié les pectines, polysaccharides naturels comportant des motifs d'acide D-galacturonique estérifié ou non par du méthanol et reliés entre eux par des liaisons a (1-4). L'endopolygalacturonase (E. C. 3.2.1.15) attaque au hasard les liaisons a (1-4) des pectines, ce qui provoque une dépolymérisation du substrat ayant pour conséquence une chute rapide de la viscosité. Ces pectines font partie des polysaccharides présents naturellement dans le règne végétal: ce sont des composants importants de la lamelle moyenne et de la paroi primaire des cellules végétales. Ces pectines sont à l'origine de multiples problèmes lors de la mise en oeuvre de procédés industriels, aussi bien dans le domaine agroalimentaire que dans d'autres industries citées plus loin. Leur dégradation s'avère très souvent utile voire indispensable. En effet, lors de la production de jus de fruits ou de boissons fermentées, par exemple à base de raisin ou de pomme, la présence de pectines rend les jus et les moûts troubles: l'action de l'endopolygalacturonase dépolymérise les pectines en suspension, ce qui clarifie les jus. Mais ces pectines posent un certain nombre de problèmes au niveau de la clarification et de la filtration. Par exemple, les polysaccharides du raisin retrouvés dans les moûts sont représentés essentiellement par les pectines et il est parfois nécessaire de procéder à leur élimination. Pour garantir une meilleure stabilité physicochimique du produit, le plus souvent, on remédie à ces problèmes en effectuant une centrifugation et/ou une micro-filtration. Lors de ces dernières opérations, il s'en suit généralement un colmatage des surfaces filtrantes et une montée en pression, ce qui augmente le coût de l'opération. De plus l'appauvrissement en certains éléments peut être tel que les qualités organoleptiques de la boisson se retrouvent considérablement affectées. Il est donc primordial de n'éliminer que les macromolécules gênantes qui contribuent à maintenir la qualité du produit. Ces problèmes sont résolus par l'adjonction de pectinases. Les pectinases sont également utilisées dans d'autres domaines tels que: l'isolement des protoplastes (cellules limitées par la membrane cytoplasmique). - la fabrication du papier: elles interviennent dans le procédé de rouissage qui consiste en un trempage de végétaux (lin, chanvre...). Le défibrinissage de ceux-ci consiste en leur hydrolyse assurée par des microorganismes exprimant cette activité. - le traitement des eaux usées générées par les industries de fabrication de jus d'agrumes. - l'extraction d'huiles comme l'huile d'olives ou de palme: l'utilisation de ces enzymes permet d'augmenter les rendements, d'assurer une meilleure stabilité et d'écarter l'utilisation des solvants organiques souvent d'utilisation dangereuse. - le dépulpage du café: les grains de café sont insérés dans une gangue à l'intérieur du fruit du caféier appelé cerise. Afin de séparer le grain de la gangue, une fermentation traditionnelle est souvent réalisée par trempage pendant plusieurs jours. Cette fermentation est considérablement accélérée par l'adjonction de pectinases. - le bois fraîchement coupé : celui-ci n'absorbant pas spontanément les traitements de protection ou de coloration, l'ajout d'enzymes pectolytiques associées à des cellulases, lors du trempage du bois permet de l'attendrir et de le rendre perméable à ces traitements. Les différents problèmes, énumérés ci-dessus, peuvent être résolus ou facilités par l'adjonction d'enzymes pectolytiques ou par l'ensemencement de microorganismes les sécrétant. Actuellement, les enzymes pectolytiques utilisées dans l'industrie dérivent de champignons et notamment de l'espèce Aspergillus piger. Le fait que ces enzymes soient utilisées sous forme non purifiée, facilite le processus de leur obtention mais, n'élimine pas les inconvénients dus à d'autres activités enzymatiques non désirées. De nos jours, la majorité des levures dites oenologiques sont criblées sur la base de leurs caractéristiques à donner des produits de qualité, par exemple les vins. Malheureusement, la plupart d'entre elles ne possèdent pas d'activités pectolytiques. Les levures sont parmi les microorganismes les plus utilisées dans l'industrie agro-alimentaire. Ainsi, la levure Saccharomyces cerevisiae, une des plus étudiées et donc connues, est connue pour secréter très peu de protéines et a fortiori pas celles produisant des activités indésirables. Il a été tout particulièrement étudié une souche clarifiante, commercialisée par la société PASCAL BIOTECH sous la référence Fermol Clarifiant, qui a une très faible activité protéolytique. Aussi, un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé pour transformer une souche de levure non productrice d'endopolygalacturonase, appelée communément pectinase, en une souche la produisant. Un autre but de l'invention est de fournir un plasmide portant le matériel génétique nécessaire à l'expression et à l'amplification de cette enzyme. Un but supplémentaire de l'invention est de fournir un tel procédé et un tel plasmide avec des coûts de production faible n'obérant pas le prix de revient final du produit agro-alimentaire. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour transformer une souche de levure non productrice d'endopolygalacturonase, faisant partie des enzymes regroupées sous le nom générique de pectinases, en une souche la produisant, qui est caractérisé, selon la présente invention, par le fait que l'on introduit dans cette souche un plasmide porteur d'une séquence représentant l'ORF codant pour l'endopolygalacturonase ainsi que le promoteur débarrassé des séquences jouant un rôle dans le silencing. Avantageusement, la souche de levure est du genre Saccharomyces cerevisiae. De préférence, on utilise le plasmide pRPGL1-2. La présente invention concerne aussi un procédé pour obtenir un plasmide portant le matériel génétique nécessaire à la l'expression et à l'amplification de l'endopolygalacturonase, qui est caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: - a) l'on amplifie par PCR avec les amorces U1 et Al un fragment d'ADN génomique d'environ 1500pb issu de la souche X2180; - b) l'on soumet à une phosphorylation des extrémités des amplifiats obtenus à l'étape a) ; - c) on ouvre le plasmide pFL45 par des enzymes de restriction BamHl et Xbal; et, - d) on effectue une ligation des fragments amplifiés au plasmide pFL45S linéarisé. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme de métier de mieux comprendre la mise en oeuvre de la présente invention ainsi que ces nombreux avantages. Comme la quasi majorité des levures n'expriment pas d'activité pectolytique et que celles qui l'exhibent le font le plus souvent au travers du phénomène de transposition, il a été soupçonné que la non expression des gènes codant pour l'endopolygalacturonase est due au phénomène du silencing: il est rappelé que le phénomène de silencing est l'extinction de l'expression d'un gène considéré. Comme certaines séquences sont connues pour jouer un rôle dans ce phénomène, dans un premier temps elles ont été recherchées au niveau des séquences intergéniques DAL5-PGL1 contenant la région promotrice du gène PGLI. La soumission de la partie intergénique DAL5-PGL1 (séquence englobant le promoteur du gène PGLI codant pour l'endopolygalacturonase) aux moteurs de recherches (http://cgsigma.cshl.org/cgi-bin/jz/) a permis de localiser des séquences impliquées dans le silencing. Sur la figure 11, on observe la présence d'une séquence ACS (ARS Consensus Sequence), des sites de reconnaissances des protéines Abf1, et Rapt. Ces séquences sont connues comme des éléments pouvant jouer un rôle dans l'établissement du silencing. La séquence correspondant à l'ACS (boîte A) diffère de la séquence consensus par 1 nucléotide: 5'-(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)-3' : séquence consensus 5'- T TTTAT A TAT T -3' : séquence selon l'invention Le consensus de la séquence pour la fixation de la protéine Rapt n'est pas total mais on retrouve le motif essentiel à savoir 5'-CCCA-3'. Le moteur de recherche a donné comme séquence de fixation de la protéine Rapt: 5'CACCCAT-3'. Cette séquence dans la littérature est la suivante: 5'ACACCCAYACAYYY-3' (où Y= TIC). Pour ce qui est de la séquence consensus de la protéine Abf1, elle est 100% identique à celle décrite dans la littérature: 5'-TCAGTGACTACG-3'. Cornme il a été rapporté que tous les nucléotides du consensus de l'ACS joue un rôle déterminant dans l'efficacité de l'activité de l'ARS, il a semblé important de cloner cette séquence en présence de celle où se fixe Abfl p pour tester sa fonctionnalité. De plus, d'autres séquences riches en A/T favorisant la réplication, il est donc indiqué dans la séquence intergénique du gène PGL1 les régions riches en AIT. Il a donc été amplifié la totalité de la partie intergénique des gènes PGL1 de la souche X2180 avec les oligonucléotides pgpromXba (5'-AAT CTA GAA GAA ATC ATT GCG TTT GTC AAT CAA-3' (-161+8 par rapport à l'ATG)) et pgpromBam (5'- GGG GAT CCT GAA GAA ACA GAG AAT TTA GAG-3' (-1612/-1582 par rapport à l'ATG de la X2180)). Ces fragments ont été ensuite insérés dans le plasmide pFL45S débarrassé au préalable de l'origine de réplication 2p. Ce plasmide a servi à transformer la souche MA Ta ura3D, trp1-4. Après étalement sur un milieu sélectif (SD supplémenté de tryptophane), des colonies sont apparues au bout de 7 jours. Les plasmides pARSx sont donc capables de diriger la réplication, il s'agit donc d'une véritable ARS. La région intergénique de la souche X2180 contient donc une ARS puisqu'est obtenue une autonomie de réplication. Comme l'ACS est une séquence primordiale pour l'établissement du silencing avec l'aide du site de fixation aux protéines Rapt et Abfl, l'extinction du gène PGL1 est donc due au silencing. Ces séquences inhibitrices (en l'occurrence le consensus ARS) de l'expression du gène codant pour cette enzyme, l'endopolygalacturonase, ont été les cibles au niveau desquelles les mutations ont été effectuées au niveau du génome des levures non productrices d'endopolygalacturonase. En utilisant la méthode de détection de l'activité endopolygalacturonase, toutes les souches modifiées au niveau de la séquence ARS et qui étaient non productrices de cette enzyme ont été transformées en levures positives pour l'endopolygalacturonase. Pour la construction des plasmides, le fragment débarrassé de cette séquence a été inséré dans un plasmide. Après transformation d'une réceptrice Saccharomyces, une forte expression de cette activité est obtenue. De plus, dans cette construction contenant ce promoteur raccourci, la production est modulable par certaines sources de carbone et notamment, la production se trouve fortement induite par le substrat de l'enzyme ou par les produits de dégradation de ce substrat. La séquence ID NO 1, objet de la figure 1, représente la séquence intergénique du gène DAL5 et PGL1. Au-delà du nucléotide 1599, on trouve la séquence correspondant à l'ORF (cadre ouvert de lecture) codant pour une protéine de 161 acides aminés correspondant à l'endopolygalacturonase. Cette séquence commence par le codon d'initiation ATG. Cette figure 1 représente les séquences responsables de l'inhibition (silencing) du gène PGL1 selon l'invention. Au niveau de ces séquences toute mutation, même ponctuelle, lève l'inhibition et transforme une souche non productrice en une souche exhibant une activité endopolygalacturonase comme, il a été démontré ci-dessus. La figure 2 illustre les différentes étapes de la construction des plasmides permettant l'expression de la polygalacturonase. Ce plasmide a servi pour transformer la souche ura3-trp 1-4 déposée sous le numéro MUCL 40781 auprès de Belgium coordinated collections of microorganisms (BCCM) à Louvain en Belgique. Cette souche a été déposée selon la Convention de Budapest. Cette construction du plasmide comprend les étapes suivantes: ampliation d'un fragment contenant la partie régulatrice débarrassée de la séquence inhibitrice suivie par l'ORF (cadre ouvert de lecture) PGL1. Cette étape peut être réalisée grâce à la méthode PCR décrite par Saiki et al. dans Primer-directed enzymatic amplification of DNA polymerase Science 239 (1988) 481-487; - modification par une T4 kinase des fragments amplifiés afin de phosphoryler les extrémités des amplifiats obtenus; on ouvre le plasmide pFL45S par une enzyme de restriction (en l'occurrence SMA1); - on effectue une ligation des fragments amplifiés au plasmide pFL45S linéarisé. L'exemple qui suit, permettra à l'Homme du métier de mieux comprendre la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention. EXEMPLE 1 Obtention des fragments L'ADN génomique de la souche X2180-1B (MAT a; YEAST GENETIC STOCK CENTER), qui est connue pour son absence d'activité pectolytique (Gainvors et al. Yeast vol. 10 (1994), 1311-1319), est la cible amplifiable. On utilise deux amorces d'ADN contenant 18 bases chacune qui ont été synthétisées par la société EUROGENTEC (parc scientifique du start Tilman 4102 - SERAING - Belgique) et dont les séquences sont respectivement. Les amorces utilisées sont U1: 5'- TGT AAC GGA AAC AGA GAG - 3' (-315/297) situé en amont de l'ORF PGL1 et Al: 5'- TCC TGC ATC TTT GTT CTG -3' (+68/+86) par rapport au codon stop du gène PGL1. Le choix des oligos a été fait de sorte à amplifier la région intergénique (environ 300 pb) comprise entre le gène PGL1 et le gène DAL5 (situé en aval) suivi de l'ORF PGL1. Des fragments d'une taille de 1467 pb et de 1804 pb ont été amplifiés respectivement à partir de la souche X2180-1B. Ces séquences ont été choisies sur la base de la séquence nucléotidique du chromosome X de la souche S288C. L'amplification a été réalisée en suivant la procédure décrite par Saiki et al. 1988. Les cycles d'amplification consistent en une dénaturation à 95 C pendant 30 secondes suivie d'une hybridation des amorces à 50 C pendant 30 secondes et d'une polymérisation à 70 C pendant 2 minutes. Ces cycles ont été réalisés dans le Thermal Cycler fabriqué par la société PERKIN ELMER et ont été répétés 30 fois. Le fragment obtenu après amplification a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose comprenant entre 1 et 2 % en poids d'agarose. Les fragments d'ADN sont ensuite extraits du gel d'agarose par électroélution. Le fragment obtenu commence par la séquence de l'amorce U1 en position 315 par rapport au codant d'initiation ATG marquant le début de la séquence codante PGL1. L'amorce Al vient terminer le fragment en position +68 / + 86 par rapport au codon stop TAA marquant la fin de la séquence codante PGL1-2. 2 - Construction d'un plasmide recombinant comprenant le fragment Les différents fragments amplifiés provenant de la souche X2180 sont modifiés par une T4 kinase (phosphorylation des extrémités) suivie de leur insertion à l'aide d'une ligase dans le plasmide pFL45S linéarisé (plasmide décrit par Chevalier et al., Gene (1980) vol. 11, 11-19 et par Bonneaud et al., Yeast vol. 7, 609-615). On a obtenu ainsi plusieurs plasmides dont celui de l'invention. Après vérification de sa structure, par détermination de sa séquence de nucléotides. Ce nouveau plasmide recombinant est destiné à être introduit dans une levure dépourvue d'activité pectolytiques dont on espère qu'elle exprimera le gène de l'endopolygalacturonase, et ce en en fournissant de grandes quantités. L'homme du métier serait bien entendu à même de procéder à la construction d'un plasmide recombinant à partir du fragment obtenu par PCR et d'un vecteur convenable. TRANSFORMATION DE LA LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Le microorganisme hôte est une souche dérivée de Saccharomyces cerevisiae FL 100 (ATCC 28583) appelée ura3-trp 1-4 dans laquelle on introduit les différents plasmides par électroporation (25 pF, 12,5 kV/cm, 2000) selon la méthode de Becker et Garente Met. Enzym (1992) vol. 194, 182. Cette souche transformée est cultivée à 30 C dans un milieu SD se composant de 6,7 g/l de Yeast Nitrogen Base (YNB) (DIFCO) sans acides aminés, de 10 g/l de glucose et de 50 pg/ml de tryptophane. Ce milieu ne permet que la croissance des souches qui ont été transformées. Afin de savoir si la souche transformée produit ou non une endopolygalacturonase extracellulaire, on utilise la méthode au rouge de ruthénium décrite par Mc Kay. 3 - Expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Essai avec la souche transformée MAT alpha ura3-trpl-4 Le plus souvent la détection de l'activité endo-PG se faisait par la méthode de Nelson (Nelson and Avigad, 1944). Cette méthode colorimétrique ne discerne pas les activités exoPG et endoPG et de ce fait, chez Aspergillus Niger les résultats sont approximatifs (Aguilar and Huitron, 1987; Nair et al., 1995). De plus comme Saccharomyces cerevisiae est capable de consommer l'acide galacturonique et digalacturonique (Petruscu and Frederici 1992; Gainvors and Belarbi 1995), les résultats seront obligatoirement faussés. Certes, l'activité endo-PG pourrait être suivie par la chute de la viscosité ; mais vu le nombre élevé d'échantillons cela n'était pas raisonnable. Pour contourner ces problèmes, il était nécessaire de trouver une autre voie pour étudier la régulation de l'expression de l'endo-PG. Saccharomyces cerevisiae ne possède pas le gène LacZ, mais son habilité à synthétiser une 11--galactosidase active à partir d'un plasmide contenant le gène LacZ a été beaucoup exploitée pour identifier les séquences régulatrices dans les régions 5' non codantes des gènes de la levure. Ainsi, pour analyser l'expression de PGL1, les régions situées en amont du gène PGL1 ont été fusionnées avec la région codante du gène LacZ d'E. coll. Le plasmide Yepp3X obtenu précédemment a été utilisé pour transformer la réceptrice Saccharomyces cerevisiae MATa, ura3-trpl-4. Les transformants ont ensuite été cultivés dans différents milieux et sous différentes conditions et leurs activités 11-galactosidases ont été déterminées. La figure 3 représente les rendements comparatifs obtenus suite à la délétion de la séquence inhibitrice. Afin de savoir si les souches modifiées produisent ou non une endopolygalacturonase extracellulaire, on introduit dans son milieu de culture (milieu solide constitué de 6,7 g/1 de Yeast Nitrogen Base (DIFCO) , de 0,5 % d'agarose, de 1 % de glucose dans un tampon phosphate 50 mM (pH) 5,5 et de l'acide polygalacturonique jouant le rôle de pectine, à raison de 1 %. Après croissance, on inonde la boite avec du rouge de ruthénium (0,1 %) qui est un colorant spécifique des pectines. L'apparition d'un halo décoloré autour de la levure sera le signe d'une production d'endopolygalacturonase qui a dégradé l'acide polygalacturonique. On n'observe aucun halo autour des levures ne présentant pas ces activités. Technique décrite par McKay en 1988 dans FEMS Microbiol Letters, vol.56, 355-358. 2880896 REVENDICATIONS 1. - Procédé pour transformer une souche de levure non productrice d'endopolygalacturonase, faisant partie des enzymes regroupées sous le nom générique de pectinases, en une souche la produisant, caractérisé par le fait que l'on introduit dans ladite souche un plasmide porteur d'une séquence représentant l'ORF codant pour l'endopolygalacturonase ainsi que le promoteur débarrassé des séquences jouant un rôle de silencing. 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la souche de levure est du genre Saccharomyces cerevisiae. 3. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on utilise le plasmide pRPGL1-2. 4. - Souche de levure du genre Saccharomyces cerevisiae obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. - Procédé pour obtenir un plasmide portant le matériel génétique nécessaire à l'expression et à l'amplification de l'endopolygalacturonase, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: - a) l'on amplifie par PCR avec les amorces U1 (SEQ IND N 2: 5'- TGT AAC GGA MC AGA GAG - 3') et Al (SEQ IND N 3: 5'- TCC TGC ATC TTT GTT CTG -3') un fragment d'ADN génomique (SED IND N 1) d'environ 1500pb issu de la souche X2180 (saccharomyces cerevisiae); - b) l'on soumet à une phosphorylation des extrémités des amplifiats obtenus à l'étape a) ; - c) on ouvre le plasmide pFL45S par des enzymes de restriction BamHl et Xbal; et, - d) on effectue une ligation des fragments amplifiés (région intergénique comprise entre les gènes PGL1 et DAL 5) au plasmide pFL45S linéarisé.