Brevet FR2883573A1 — publié le 20060929

La présente invention est relative à une nouvelle souche de levure du genre Issatchenkia, ainsi qu'à un procédé pour produire du xylitol, de l'éthanol et de la biomasse par la mise en oeuvre de cette souche. Le xylitol, résultat de la réduction du xylose (05H1005), est produit normalement par le corps humain au cours du métabolisme; il se trouve en faible quantité dans de nombreux fruits et légumes, mais son extraction en est généralement difficile et peu rentable. II présente cependant de nombreux intérêts tant métabolique, dentaire que technique qui font du xylitol un sucre de substitution très attractif. Ainsi le xylitol étant métabolisé indépendamment de l'insuline, il peut être ainsi consommé sans souci par les sujets diabétiques non-insulinodépendants. De plus, il peut trouver un rôle non négligeable dans les régimes amaigrissants compte tenu de son assimilation lente au niveau gastrique et de sa capacité à réduire la sensation de faim. Le xylitol est par ailleurs non cariogénique. Dans la bouche, le saccharose et autres composés sucrés sont fermentés par des streptocoques et autres bactéries générant des acides responsables de l'abaissement du pH buccal et conduisant à la déminéralisation de l'émail des dents et donc à l'apparition de caries. Ces bactéries sont pour la plupart incapables de fermenter le xylitol et par conséquent de contribuer à la dégradation des dents. Des études semblent également indiquer que le xylitol pourrait agir de façon positive en empêchant l'apparition de nouvelles caries et même de réduire les lésions dentaires existantes en induisant la reminéralisation. D'autre part, du point de vue gustatif, le xylitol ne présente pas le goût 25 typiquement désagréable des autres ersatz de sucres: on constate au contraire une certaine fraîcheur au niveau de la bouche. En dépit de ces nombreux avantages, l'utilisation du xylitol sur une large échelle reste limitée en raison d'un prix de revient relativement élevé dû en grande partie à la difficulté de production tant chimique que biologique. En effet, sa synthèse chimique nécessitant un procédé complexe et fastidieux reste chère et peu efficace. En ce qui concerne, sa synthèse biologique et plus particulièrement microbiologique, la difficulté du procédé réside entre autre dans le choix de l'organisme producteur: les chercheurs font alors souvent appel à des microorganismes génétiquement modifiés. 2 2883573 Ainsi des équipes de chercheurs ont modifié génétiquement des bactéries, comme Zymomonas mobilis, en ajoutant à certaines souches des gènes tels que ceux codant pour la xylose-isomérase, la xylulokinase, la transaldolase et la transacétolase afin de produire certains alcools à partir de sucres en C5. Des levures telles que celles appartenant à l'espèce Saccharomyces cerevisiae incapables de métaboliser certains pentoses, ont également été modifiées génétiquement, en ajoutant à leur génome des gènes exogènes (issus de bactéries ou d'autres levures) tels que ceux codant pour la xylose-réductase et/ou la xylitol-déshydrogénase leur permettant ainsi d'utiliser le xylose pour produire du xylitol ou de l'éthanol. D'autres équipes ont quant' à elles eu recours à des cocultures associant des bactéries à des mutants de levures pour la production d'éthanol ou de xylitol (Delgenes et al.,1998 Ind Crops Prod). Par ailleurs, on connaît les documents FR-2641545-A et WO-8805457-A qui sont tous les deux relatifs à un procédé de production de xylitol en utilisant un microorganisme du genre Candida. Le document FR-245838-A concerne la production d'éthanol à partir de substrats contenant du xylose en mettant en oeuvre une levure du genre Pichia: on peut donc transformer du xylose en éthanol. De même, le document FR-2692908-A est relatif à un procédé de production d'éthanol à partir d'un substrat renfermant du xylose et du glucose au moyen de deux souches de levures: la première transformant le xylose en xylitol et la seconde notamment du genre Pichia transformant le xylitol en éthanol. Enfin, il est connu le document WO-9008193-A qui concerne un procédé pour produire du xylitol en particulier à partir d'hydrolysats d'hémicelluloses, en utilisant des levures du genre Candida, Pichia, Pachysolen et Debaryomyces. Ces levures sont donc connues comme ayant la capacité de transformer le xylose en xylitol et les hexoses en éthanol. Mais ces procédés de l'art antérieur n'ont pu être mis en pratique sur un plan industriel du fait de leur coût et/ou de leur rendement peu économique. La production biologique, c'est à dire, l'utilisation de microorganismes vivants pour produire simultanément selon la présente invention, du xylitol, de l'éthanol et de la biomasse, suscite un grand intérêt compte tenu des problèmes posés pour la valorisation des produits végétaux (lignocellulosiques). En effet, ceux-ci sont encombrants quant à leur stockage et leur élimination, et leurs produits de 3 2883573 dégradation, notamment les pentoses (sucres en C5), n'ont qu'une faible valeur marchande. Notre invention vise donc à transformer ces pentoses et principalement le xylose, en des produits à haute valeur ajoutée (xylitol, éthanol, biomasse). Ce procédé en plus d'être une source alternative d'éthanol à partir de la transformation d'une matière première peu coûteuse et de produire de la biomasse utilisable dans l'industrie alimentaire et dans l'industrie des produits microbiologiques, conduit avantageusement à la biosynthèse de xylitol. Aussi un des buts de la présente invention est-il de fournir un nouveau microorganisme du genre Issatchenkia présent dans là nature. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé permettant de produire du xylitol, de l'éthanol et de la biomasse par la mise en oeuvre de cette souche. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par une nouvelle souche de levure du genre Issatchenkia déposée sous le N CNCM I- 3402 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) auprès de l'Institut Pasteur (Paris). La présente invention est aussi relative à un procédé mettant en oeuvre cette nouvelle souche pour produire simultanément du xylitol, de l'éthanol et de la biomasse, lequel procédé est caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: a) on prépare un inoculum en multipliant la souche d'Issatchenkia occidentalis (souche Ioxxb5) sur un milieu riche tel que le milieu YPG; et, b) on cultive cet inoculum comprenant de 5.103 à 5.106 cellules/ml d'lssatchenkia occidentalis (souche Ioxxb5), dans un fermenteur contenant un milieu dont la formule de base comprend de 10 à 100 g/I de D-xylose ou d'un hydrolysat de matières végétales contenant des pentoses additionnés de 1 à 7 g/1 d'extrait de levure, en aérobie ou anaérobie, à une température comprise entre 15 et 37 C, pendant une durée comprise entre 48h et 150h et à un pH compris entre 3 et 6, dans des conditions d'aération et d'agitation allant de 0 à 300 rpm de telle sorte que la bioconversion des sucres en xylitol, éthanol et biomasse soit assurée. Ainsi qu'il a été dit, la présente invention a donc pour but de fournir une nouvelle souche de microorganisme non modifiée génétiquement qui permet la production de xylitol, d'éthanol et de biomasse simultanément à partir de pentoses obtenus par dégradation de matières végétales lignocellulosiques. 4 2883573 Le microorganisme utilisé est une levure judicieusement sélectionnée à partir de microorganismes de fruits de consommation courante, donc non toxiques et ne perturbant pas l'équilibre biologique de la nature puisqu'il en est issu. Le principal critère de sélection de ce microorganisme repose sur sa propriété exceptionnelle à assimiler le xylose comme seule source de carbone. Après sélection de cette levure parmi les 6000 microorganismes isolés à partir de jus de fruits, il en a été effectué une caractérisation minutieuse. Ainsi, la souche retenue, souche dénommée loxxb5 et déposée sous le N CNCM 1-3402 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) auprès de l'Institut Pasteur (Paris), est une levUre appartenant à l'espèce Issatchenkia occidentalis qui se trouve naturellement sur des produits de consommation courante (fromages, fruits,...). Cette souche a été isolée à partir de jus de groseilles de fabrication artisanale et de consommation courante et caractérisée comme suit: 1 ) Caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques de la souche Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) Les descriptions macroscopiques et microscopiques générales sont données dans le tableau I ci-après: Tableau I Aspect macroscopique sur Aspect microscopique après 48h de culture gélose de SABOURAUD sur gélose de SABOURAUD à 30 C après 48h de culture à 30 C Colonie circulaire et plissée, Levure de taille moyenne, de forme ovoïde régulière, élévation en dôme, plus ou moins allongée, forme sous de consistance molle et certaines conditions du pseudo-mycélium, blanche bourgeonnement bi ou multipolaire 2883573 Quelques résultats de son analyse métabolique (test d'assimilation de substrats carbonés), réalisée sur galerie API20C AUX, sont présentés ci-dessous dans le tableau II: Tableau Il glucose + glycérol + Calcium-2-cétogluconate - L-arabinose -adonitol - Dgalactose - inositol - D-sorbitol - Méthyl-D-glucopyranoside - N-Acétylglucosamine + D-cellobiose - D-lactose - D-maltose - D-saccharose - Draffinose - (+) : assimilation (-) : pas d'assimilation 2 ) Test de sporulation La. souche de levure Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) a été testée quant à sa capacité à sporuler sur de nombreux milieux de sporulation. C'est seulement sur un milieu de sporulation au concombre (Barnett, Payne et Yarrow, 2000) et au bout de 14 jours qu'elle forme une ascospore sphérique. É 2883573 3 ) Caractéristiques moléculaires de la souche Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) Son caryotype a été établi par électrophorèse en champs pulsés (Schwartz et Cantor, 1984). Ainsi, par cette technique, on peut observer un profil propre à la souche loxxb5 et distinguer 7 chromosomes de taille comprise entre 1500 kpb et 3100 kpb environ. La souche Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) a été sélectionnée pour sa capacité à assimiler le D-xylose. Elle est aussi avantageusement utilisée pour la production de xylitol, d'éthanol et de biomasse en utilisant les pentoses issus d'un hydrolysat de matières végétales lignocellulosiques comme seule source de carbone comme par exemple le xylose. II est à noter que ces sucres peuvent être complémentés sans préjudice par d'autres sucres en C6. A partir de ces substrats et avantageusement à partir du xylose, ce nouveau microorganisme garantit une bonne production de xylitol, d'éthanol et de biomasse; la quantité de xylitol obtenue étant liée entre autre à la concentration en xylose mis à la disposition de la levure criblée parla présente invention. Ainsi l'invention a pour objet un procédé de production de xylitol, d'éthanol et de biomasse à partir de pentoses issus d'un hydrolysat de matières végétales par action de la souche Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) Ce procédé comprend les étapes suivantes: a) préparer un inoculum en multipliant la souche d'Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) sur un milieu riche tel que le milieu YPG; et, b) cultiver cet inoculum comprenant de 5.103 à 5.106 cellules/ml d'Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5), dans un fermenteur contenant un milieu dont la formule de base comprend de10 à 100 g/I de D-xylose ou d'hydrolysat de matières végétales contenant des pentoses additionnés de 1 à 7 g/I d'extrait de levure, en aérobie ou anaérobie, à une température comprise entre 15 et 37 C, pendant le temps nécessaire à l'utilisation du ou des sucres (le plus généralement entre 48 et 150 h) et à un pH compris entre 3 et 6, dans des conditions d'aération et d'agitation allant de 0 à 300 rpm de telle sorte que la bioconversion des sucres en xylitol, éthanol et biomasse soit assurée. Les exemples qui vont suivre et qui ne présentent aucun caractère limitatif, permettront à l'homme du métier de mieux appréhender la mise en oeuvre du procédé ainsi que ces nombreux avantages selon la présente invention. Exemple 1: Dans cet exemple, l'inoculum utilisé selon l'invention est avantageusement de 3.106 cellules/ml d'Issatchenkia occidentalis souche loxxb5. Le milieu de culture utilisé contient 25g/1 de D-xylose et 6,5g/1 d'extrait de levure. La température de culture pouvant être entre 15 et 37 C, est ici de 30 C. Dans un souci de rendement, le pH est fixé à 5 et l'agitation de la culture à 150 rpm. Dans ces conditions, le meilleur rendement de conversion du xylose en xylitol obtenu est de 31% pour une durée de culture de 72 h (figure 1). Exemple 2: Dans cet exemple, on améliore avantageusement le rendement de conversion du xylose en xylitol obtenu dans l'exemple 1 en ajoutant 0,5 g/1 de glucose au milieu. Ainsi au bout de 72 h de culture, on atteint un rendement de 35%. Exemple 3: Dans cet exemple, afin de produire efficacement de l'éthanol, les conditions de culture sont les suivantes: - milieu de culture à pH5,5 comprenant 100g/I de xylose et 6,5 g/1 d'extrait de 20 levure, - inoculum à 5.106 cellules/ml, - culture à 30 C et sous une agitation de 150 rpm Après 147 h de culture, on obtient 0,15g/I d'éthanol (figure2). Exemple 4: Dans cet exemple, les conditions de culture fournies permettent de générer des quantités avantageuses de biomasse. Un inoculum d'Issatchenkia occidentale, souche loxxb5, comprenant de 5. 103 cellules/ml est placé à 30 C dans un milieu à pH 5,5 contenant 50g/l de xylose et 30 2g/l d'extrait de levure sous une agitation de 300 rpm. Au bout de 147h de culture, on atteint à 600nm une DO intéressante de 16 ce qui correspond à une concentration cellulaire de 16.10' cellules/m1 (figure3). 8 REVENDICATIONS 1. Nouvelle souche de levure du genre lssatchenkia occidentalis (souche lo)ob5) déposée le 17 mars 2005 sous le N CNCM I-3402 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) auprès de l'Institut Pasteur (Paris). 2. - Procédé mettant en oeuvre la souche de levure selon la revendication 1 pour produire simultanément du xylitol, de l'éthanol et de la biomasse, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: a) on prépare un inoculum en multipliant la souche d'Issatchenkia occidentalis (souche loxxb5) sur un milieu riche tel que le milieu YPG; et, b) on cultive ledit inoculum comprenant de 5.103 à 5. 106 cellules/ml d'lssatchenkia occidentalis (souche loxxb5), dans un fermenteur contenant un milieu dont la formule de base comprend del 0 à 100 g/l de D-xylose ou d'un hydrolysat de matières végétales contenant des pentoses additionnés de 1 à 7 g/I d'extrait de levure, en aérobie ou anaérobie, à une température comprise entre 15 et 37 C, pendant une durée comprise entre 48h et 150h et à un pH compris entre 3 et 6, dans des conditions d'aération et d'agitation allant de 0 à 300 rpm de telle sorte que la bioconversion des sucres en xylitol, éthanol et biomasse soit assurée.