Brevet FR2881651A1 — publié le 20060811

La présente invention se rapporte au domaine des nécessités de la vie et plus particulièrement au domaine des produits pharmaceutiques. La présente invention a pour objet un nouveau produit pharmaceutique et un procédé de fabrication de ce produit pharmaceutique. Elle concerne également de nouvelles solutions de gélatine ayant subi une irradiation, cette irradiation conduisant à une réticulation de ces produits et leur conférant en outre la propriété d'être facilement pulvérisables. Ces nouveaux produits possèdent également des propriétés d'étalement remarquables ainsi que des propriétés hémostatiques. La gélatine est une substance obtenue par hydrolyse du collagène. Elle est constituée de fragments de fibrilles de collagène, qui est un des constituants protéiques majeurs des os, des tendons, des cartilages, de la peau, et des tissus conjonctifs animaux. La gélatine constitue un composé de choix pour une application hémostatique, c'est-à-dire qu'elle favorise l'hémostase, cette dernière se définissant par l'ensemble des mécanismes qui concourent à freiner ou à arrêter les hémorragies et empêcher les thromboses, c'est à dire la formation de caillots de sang. Le mode d'action de la gélatine est principalement mécanique par la formation d'un obstacle à l'écoulement sanguin, favorisant ainsi la coagulation du sang. Les molécules dénaturées qui constituent la gélatine ne présentent pas de spécificité d'espèce. Lorsqu'elles sont mélangées à de l'eau ou à une solution saline, elles forment rapidement un gel plus ou moins visqueux, et présentent ainsi un pouvoir hémostatique plus ou moins marqué. Lorsqu'un gel de gélatine est implanté dans un tissu (à 37 C), il devient liquide en un temps variable suivant son volume et son inertie thermique, les protéines contenues dans le gel étant ensuite internalisées par différentes cellules dont des macrophages qui les stockent dans des vésicules intracellulaire appelées phagosomes et lysosomes. A l'intérieur de ces cellules, les protéines sont dégradées à bas pH par des enzymes, en l'occurrence des protéinases. Cette biodégradation de la gélatine, dans la plupart des cas, ne déclenche pas de réaction inflammatoire cliniquement visible. La gélatine est déjà utilisée dans de nombreux biomatériaux et systèmes implantables comme des obturateurs fémoraux, des éponges, des films 2881651 2 hémostatiques, des revêtements de prothèses vasculaires et même en solution saline comme agent de substitution du plasma sanguin. Par ailleurs, certains produits hémostatiques à base de gélatine sont utilisés comme vecteurs de protéines ostéogéniques en injection percutanée pour combler des cavités osseuses ("défects") ou traiter des fractures. Du phosphate tricalcique (TCP) ou d'autres sels de calcium, ou bien de l'acide phosphorique, peuvent être ajoutés dans ces cas (cf. WO 01/28603 Al, aux noms de Li et al.). Il est également envisageable d'utiliser des gels de gélatine pour assurer une transfection transitoire par des plasmides. La possibilité de transfection par des éponges de collagène ou de gélatine a déjà été soulignée dans quelques publications (Truong-Le,V.I., Leong K.W.: Controlled gene delivery by DNA-gelatin nanospheres. Hum Gene Ther,9, 1709-1717 (1998), Lauffenburger D.A., Schaffer D.V., The matrix delivers, Nature Medicine, 5, 7: 733-734 -1999)) . La transfection transitoire de plasmides portant différents gènes à action locale (facteurs de croissance ou morphogéniques) permet d'avoir une synthèse régulée de ces facteurs d'information durant quelques semaines. En ce qui concerne l'hémostase, la nécessité de freiner ou d'interrompre un saignement apparaît de façon cruciale particulièrement lors d'opérations chirurgicales. En particulier, les interventions chirurgicales en chirurgie abdominale, thoracique ou même orthopédique s'accompagnent toujours de saignements pouvant être très importants qui peuvent amener à une chute du volume sanguin. Ces pertes sanguines peuvent conduire à une anémie post-opératoire nécessitant des transfusions sanguines. Or il existe un risque médical important lors d'une transfusion sanguine pratiquée dans le cadre de la compensation des pertes sanguines lors d'interventions chirurgicales banales, du fait de l'éventuelle transmission de maladies virales ou à agents infectieux non conventionnels du type prion présents dans le sang transfusé. Lors d'interventions chirurgicales, les pertes sanguines les plus fréquentes ne se font pas du fait de saignements de gros vaisseaux ou d'artérioles, qui nécessitent une ligature ou bien une cautérisation, mais plutôt par suintement ou bien par hémorragie en nappe, ou même par évaporation lorsque la surface du champ opératoire est importante. 2881651 3 Les saignements survenant dans le cadre d'interventions chirurgicales nécessitent l'utilisation de compresses en tissu ou bien en collagène, en gélatine, ou en cellulose oxydée, afin d'assurer une coagulation de contact d'une part, et aussi dans le but de libérer le champ opératoire du sang qui obstrue la vue du chirurgien d'autre part. Il s'avère cependant que l'utilisation de compresses à ces fins présente des inconvénients importants, car la compresse n'assure d'une part qu'un contact ponctuel avec la zone qui saigne et d'autre part n'assure aucune étanchéité lors de son contact avec la zone de saignement. De plus sa surface est limitée à quelques cm2, ce qui est très souvent inférieur à la surface des zones de saignement à traiter. Par ailleurs, une des complications classiques liées à l'utilisation des compresses en tissu, c'est à dire non biodégradables, est le risque d'oubli dans la zone opératoire par le chirurgien lors de la fermeture de cette dernière. La réduction de ce risque passe obligatoirement par une procédure de comptage long et fastidieux des compresses en fin d'opération, ce qui réduit certes le risque, mais sans pour autant le supprimer, puisque les exemples de ré-intervention afin de récupérer dans l'abdomen une compresse oubliée ne manquent pas. Les compresses en cellulose oxydée, quant à elles, bien qu'elles soient biodégradables, peuvent présenter des problèmes de migration aboutissant dans certains cas à de graves lésions nerveuses. Cela conduit certains utilisateurs à opérer leur retrait malgré leur biodégradabilité, avant fermeture du site opératoire. Il existe donc un besoin de disposer d'un produit présentant les propriétés fonctionnelles de la gélatine, les avantages d'une compresse et s'affranchissant de ses inconvénients, et dont les propriétés essentielles soient donc les suivantes: É biocompatible, É biodégradable, É stérile, É permettant de couvrir une grande surface, ^ pouvant recouvrir de manière étanche la zone de saignement, É assurant une hémostase locale par contact, É n'obstruant pas la vue du chirurgien, 2881651 4 É simple d'utilisation. Pour répondre à ce besoin, la demanderesse a développé un nouveau produit pharmaceutique, qui est caractérisé en ce qu'il comprend un récipient sous pression, équipé de moyens de pulvérisation sous pression, et une solution de gélatine réticulée obtenue par irradiation, contenue dans le récipient. Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: -réalisation d'un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 %, et de préférence 15 % à 20% ; - irradiation de ce gel de gélatine au moyen d'un rayonnement ionisant 10 mettant en oeuvre notamment des rayonnements de type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 kGray; - introduction de ce gel de gélatine dans le récipient. La demanderesse a constaté que l'irradiation d'un gel de gélatine à une intensité nécessaire pour le stériliser entraîne une réticulation des protéines par création de liaisons hydrogène et lui donne des propriétés physiques différentes et des propriétés hémostatiques plus importantes. L'irradiation est de nature ionisante et met en oeuvre plus particulièrement des rayonnements gamma ou béta. En outre les propriétés rhéologiques du produit obtenu sont modifiées, ce qui permet sa pulvérisation. Ainsi le produit objet de l'invention peut, par pulvérisation, couvrir une zone opératoire allant jusqu'à quelques dizaines de cm2 et de préférence 1 à 10 cmz. Cette formulation pharmaceutique lui permet en outre d'être appliquée sans recours à quelque instrument médical comme cela est nécessaire pour des compresses. La forme pulvérisable de ce produit lui confère donc une grande simplicité d'utilisation et aussi, ce qui constitue un avantage supplémentaire, une aptitude à atteindre des zones difficilement accessibles aux compresses, comme par exemple, des plis cutanés ou des conduits. Le récipient est un récipient aérosol pour pulvérisation, et peut être à usage unique par souci d'utiliser une préparation stérile. La valve utilisée dans le système pulvérisateur évite tout contact entre le produit et le gaz propulseur, et permet aussi d'administrer un volume déterminé du produit. On peut également utiliser des flacons à pompes opérant sous pression d'air, mais les volumes pulvérisés sont alors plus faibles. 2881651 5 L'invention concerne également une solution de gélatine, qui est caractérisée en ce qu'elle présente une concentration en gélatine réticulée allant de 5 à 30 %, et de préférence 15 % à 20% dispersée dans un véhicule aqueux stérile. On peut en outre incorporer au produit objet de l'invention, des substances médicamenteuses à activité locale ou générale, comme par exemple des molécules venant renforcer l'hémostase telles que des activateurs de la coagulation comme le collagène ou bien la thrombine ainsi que d'autres molécules impliquées dans la coagulation comme la fibrine, certains facteurs plasmatiques ou encore des protéines du système du complément. D'autres molécules à actions locales ou générales peuvent être associées au produit objet de l'invention, comme par exemple des anti-inflammatoires, des eicosanoides ou des dérivés de l'acide phenylacétique, des facteurs de croissance ou bien des protéines morphogéniques qui ont une action sur la cicatrisation des tissus conjonctifs. On peut également associer des cellules souches au nouveau produit afin que des cellules soient fixées dans le film déposé sur un tissu ou un organe pour localiser les cellules. Les cellules souches cultivées dans des solutions isotoniques de gélatine se développent d'une manière comparable à leur développement dans des milieux de culture classiques. Enfin, des molécules à action systémique peuvent être introduites dans le produit objet de l'invention, soit lors de la pulvérisation, soit au préalable dans le produit selon l'invention, comme des antibiotiques, par exemple la néomycine ou la gentamycine, des antifongiques par exemple l'éconazole ou la ciclopiroxolamine, des hormones sexuelles par exemple des oestrogènes, androgènes ou anti-androgènes,... Les produits selon l'invention trouvent des utilisations multiples en raison de la facilité de pulvérisation. On pourra citer l'emploi comme hémostatique, comme vecteur de médicaments d'action locale ou systémique (antibiotiques par exemple), pour vectoriser des cellules souches, ou encore en chirurgie plastique pour rehausser ou combler des tissus. Les exemples ci-dessous ont pour objet d'illustrer l'invention en ce qui caractérise son mode de fabrication, ses propriétés et son utilisation, sans toutefois limiter la portée de l'invention. 2881651 6 Exemple 1: Procédé de fabrication du nouveau produit Différentes concentration de gélatine: des gels de gélatine à 8, 10, 12, 15 et 30% ont été préparés et coulés dans des tubes à hémolyse, puis irradiés par rayons gamma à une dose de 25 kGy minimum et deux doses de 25 kGy maximum. Leur rhéologie, c'est-à-dire l'étude de leur écoulement, a ensuite été évaluée à 20 C par des évaluateurs indépendants qui les ont classés en deux catégories: pulvérisables et non pulvérisables. II a été déterminé que la viscosité du produit obtenu après irradiation était fonction de la dose d'irradiation et du pourcentage de gélatine que le produit contient. Seuls les gels à 8, 10, 12 et 15% irradiés à 25 kGy minimum permettent une pulvérisation du nouveau produit. Les concentrations supérieures en gélatine ainsi que les irradiations supérieures ne permettent pas de pulvérisation, la solution étant trop visqueuse. Exemple 2: Essais de pulvérisation des nouveaux produits en fonction de différentes concentration de qélatine Des gels de différentes concentrations en gélatine (8, 12, 15 %) ont été conditionnés dans des containers pour aérosol équipés de valves à poche et de différents types de diffuseur spray ou gel. Avant stérilisation, la pulvérisation des produits à 12 et 15 %, sur des plaques de verre à 37 C, est la plus couvrante. Après stérilisation à 25 kGy minimum, les produits obtenus sont pulvérisés et placés à 37 C. Ces produits forment un film beaucoup plus adhérent que les échantillons non irradiés et permettent de recouvrir une unité de surface d'une manière plus homogène que précédemment. Exemple 3: Influence de la stérilisation sur la viscosité des produits La viscosité des produits est mesurée grâce à un viscosimètre Brookfield équipé d'une aiguille Helipath. Le gel de gélatine à 15 % avant stérilisation manifeste une viscosité de 4000 cps à la vitesse de 3 tpm (12% Torque) à 21 C. Le pH de la solution est mesuré à 5,24. Le produit obtenu après stérilisation (vidange d'un spray stérilisé) manifeste 30 une viscosité de 830 000 à 930 000 cps à la vitesse de 3 tpm (60% Torque) à 21 C. Le pH de la solution est mesuré à 5, 58. 2881651 7 Exemple 4: Utilisation du nouveau produit en chirurgie abdominale. Des chiens sous anesthésie générale sont placés en décubitus dorsal, une ouverture abdominale médiane sur la ligne blanche est effectuée pour des interventions chirurgicales variées: occlusions, perforation intestinale. Les artérioles visibles dans l'ouverture abdominale sont suturées et la surface de section est essuyée avec une compresse des deux cotés et la moitié de la section abdominale subit une pulvérisation par le produit selon l'invention. Différentes concentrations du nouveau produit ont été utilisées (une par chien). Le saignement est comparé visuellement dans la partie nue et la partie recouverte. Une diminution significative du temps de saignement est constaté dans la partie qui est couverte par le film formé par le nouveau produit. Exemple 5: Pulvérisation du nouveau produit à la surface d'une culture de cellules souches. Des cellules souche mésenchymateuses humaines ont été cultivées en monocouche à la surface de boîtes de Pétri en polystyrène. Les cellules sont obtenues suivant la méthode suivante: Des fragments de 2-3 mm de côté de tissu osseux spongieux ont été prélevés lors d'interventions chirurgicales pour correction de scoliose. Ils sont lavés dans du sérum physiologique et placés à la surface des boîtes de Pétri dans du milieu de culture composé de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et de glutamine. Les boites sont incubées deux à trois semaines à 37 C dans une atmosphère à 5% de CO2. Lorsque les cellules contenues dans les fragments osseux ont migré à la surface de la boîte et sont quasiment à confluence, celles-ci sont remises en suspension par une solution de trypsine et transférées dans une autre boîte de Pétri. Deux jours après leur transfert, le milieu de culture est enlevé. Le produit préparé avec une concentration de 15% de gélatine réticulée dans du milieu de culture DMEM, est déposé à la surface de la monocouche cellulaire pour 72 heures. Au terme de cette période, le produit à base de gélatine réticulée est enlevé et un test au bleu trypan est effectué afin de détecter les cellules mortes. Leur proportion n'est pas significativement différente de celle d'une culture témoin 2881651 8 dans le milieu de culture seul. Ceci montre que le nouveau produit à base de gélatine réticulée peut servir de vecteur aux cellules mésenchymateuses. 9 REVENDICATIONS 1 - Compositions pharmaceutiques à action hémostatique destinées à être pulvérisées, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif une solution de gélatine réticulée par irradiation présentant des qualités rhéologiques permettant la pulvérisation au moyen d'un récipient sous pression équipé de moyens de pulvérisation sous pression. 2 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que la solution de gélatine réticulée par irradiation est répartie dans des récipients sous pression à usage unique. 3 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que la solution de gélatine est un gel qui présente une concentration en gélatine réticulée allant de 5 à 30 % et de préférence de 15 % à 20 %. 4 - Procédé de préparation des compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 3 qui consiste en ce qu'on réalise un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 % et de préférence de 15 à 20 %, en ce qu'on soumet ce gel de gélatine à une irradiation au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en oeuvre notamment des rayonnements du type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 Kgray, en ce qu'on disperse ce gel de gélatine réticulée dans un véhicule aqueux stérile et en ce qu'on introduit ledit gel dans un récipient sous pression équipé de moyens de pulvérisation sous pression. - Solution de gélatine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente une concentration en gélatine réticulée allant de 5 à 30 %, et 25 de préférence 15 % à 20% dispersée dans un véhicule aqueux stérile. 6 - Solution de gélatine selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient un sel de calcium ou bien un sel de l'acide orthophosphorique. 7 - Solution de gélatine selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs composés d'action 2881651 10 complémentaire ou synergique choisis parmi les antibiotiques, antifongiques, anti-inflammatoires, hormones, eicosanoides, facteurs de croissance, facteurs morphogéniques, collagène, thrombine, fibrine ou facteurs de coagulation. 8 - Solution de gélatine selon la revendication 5, caractérisée en ce 5 qu'elle contient des plasmides destinés à transfecter les cellules au contact du film obtenu par pulvérisation. 9 - Solution de gélatine selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient des cellules vivantes ou inoculées par des cellules vivantes lors de l'émission du produit. 10 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications à 9, comme préparation hémostatique par contact. 11 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 5 à 9 en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert de vecteur pour des médicaments d'action locale ou systémique. 12 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 5 à 9 en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert à vectoriser des cellules souche, en particulier dans les défects cartilagineux. 13 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 5 à 9 en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert, en chirurgie plastique, au rehaussement ou au comblement de tissus.