Brevet FR2877012A1 — publié le 20060428

SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS AMI DEFICIENTES A POST-ACIDIFICATION REDUITE La présente invention se rapporte au domaine des bactéries 5 lactiques utiles dans l'industrie agro-alimentaire. Plus précisément, l'invention concerne des souches de Streptococcus thermophilus AMI déficientes à post-acidification réduite. L'invention vise également l'utilisation de ces souches pour préparer des produits alimentaires fermentés, ainsi que les produits 10 alimentaires fermentés eux-mêmes. Le choix des bactéries lactiques pour la production de produits alimentaires, notamment laitiers, fermentés fait intervenir différents critères, parmi lesquels l'activité acidifiante et la formation de composants aromatiques qui sont responsables des propriétés organoleptiques du produit, ainsi que la production d'agents épaississants qui jouent un rôle sur la texture et l'onctuosité. L'activité acidifiante se caractérise essentiellement par trois paramètres: (i) la cinétique d'acidification; (ii) l'acidité titrable ou le pH final de fermentation qui conditionne les propriétés organoleptiques du produit et son aptitude à la conservation; et (iii) la post-acidification qui se développe au cours de la conservation du produit. Une vitesse d'acidification élevée permet de réduire la période durant laquelle la préparation est sensible aux contaminants, et de 25 diminuer ainsi le risque de contamination bactérienne. L'augmentation de la vitesse d'acidification améliore également l'économie du procédé en augmentant la productivité et la flexibilité du matériel industriel. Les propriétés de post-acidification des souches sont 30 particulièrement importantes pour la conservation des produits. En effet, les produits frais fermentés sont généralement conservés à des températures comprises entre environ 4 C et 8 C pendant une durée n'excédant pas habituellement 4 semaines. Or, si l'activité métabolique des bactéries est réduite par la conservation au froid, elle n'en est pas pour autant bloquée. Cette activité rémanente entraîne la production d'acide lactique à partir du lactose, ce qui a pour conséquence une diminution du pH et une augmentation de la saveur acide qui dégradent les propriétés organoleptiques du produit. De plus, outre les critères retenus pour leur contribution à la qualité du produit, d'autres éléments plus spécifiquement liés au procédé interviennent dans le choix des souches, par exemple la température de fermentation, la vitesse d'acidification et la résistance aux phages. La résistance aux phages est un critère très important dans le choix des souches afin de diminuer le risque d'incidents phagiques en production, lesquels sont susceptibles de bloquer pour décontamination l'ensemble de la production, sur des périodes plus ou moins longues. Le brevet français FR 2 725 212 décrit une souche de S. thermophilus, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, Paris, France) sous le n 1-1477, qui présente une cinétique d'acidification rapide permettant d'atteindre un degré d'acidité élevé, et qui ne post-acidifie pas au cours de la conservation des produits laitiers frais fermentés. Une autre souche de S. thermophilus (déposée le 30 décembre 25 1994 auprès de la CNCM sous le numéro I-1520) est décrite dans le brevet français FR 2 771 600 comme ayant une capacité de post- acidification réduite. Il n'est toutefois pas avantageux d'utiliser de telles souches pour fabriquer des aliments fonctionnels (i.e., des aliments qui ont un effet bénéfique sur une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme) comprenant notamment des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt à base de protéines et/ou peptides. Ces souches restent en effet capables de métaboliser, c'est-à-dire de dégrader afin d'utiliser comme sources d'azote, les protéines et/ou peptides, y compris les protéines et/ou peptides fonctionnels d'intérêt, que l'on entend bien évidemment préserver. C'est pourquoi, il est important pour l'industrie agro-alimentaire de disposer de bactéries fermentaires présentant à la fois: (i) une excellente viabilité ; (ii) une activité post-acidifiante très faible ou quasiment nulle; et (iii) une capacité à métaboliser les protéines et/ou peptides, également très faible ou quasiment nulle. C'est précisément le besoin auquel répond la présente invention, en proposant des souches de S. thermophilus AMI déficientes à postacidification réduite. La croissance de S. thermophilus dans le lait se décompose en 15 trois phases de croissance: - une première phase de croissance exponentielle, qui ne dépend pas des caséines du lait; - une deuxième phase de croissance dite "de transition" ; et - une troisième phase de croissance exponentielle, sans doute limitée par 20 le transport des peptides (Letort et al., 2002). Le système de transport des oligopeptides chez S. thermophilus est un transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) constitué d'un translocon de quatre protéines (AmiC, AmiD, AmiE et AmiF) et de trois protéines de liaison très homologues entre elles (AmiAl, AmiA2 et AmiA3). La croissance dans le lait de variants chez lesquels le système de transport des oligopeptides est altéré n'est plus optimale, ce qui montre l'importance de ce système de transport (Garault et al., 2002). Etant donné la dépendance en acides aminés libres et di-/tripeptides d'un variant dont le système de transport des oligopeptides est 30 partiellement altéré, il est logique que sa croissance soit perturbée en lait. Dans le cadre de la présente invention, il a été montré que de tels variants ont des propriétés d'acidification du lait particulièrement intéressantes. D'une part, le pH se stabilise en fin de fermentation pour les variants AMI déficients. En effet, la première phase de croissance en lait n'est pas affectée, et ces variants peuvent conserver une première phase d'acidification relativement rapide tout en ayant une deuxième phase d'acidification beaucoup plus lente. Ils peuvent présenter une courbe d'acidification ayant un fort ralentissement à un pH supérieur à celui pour lequel l'acidification par une souche sauvage AMI fonctionnelle est ralentie. Ce plateau d'acidification , à température de fermentation, est intéressant dans la mesure où il permet de stocker plus longtemps à température de fermentation la masse fermentée, et ce, sans acidification trop importante. Ceci confère une souplesse appréciable à la mise en oeuvre des procédés industriels. En effet, les temps de décaillage des cuves de fermentation sont longs compte-tenu de leur volume. L'utilisation de variants AMI déficients permet donc de limiter l'évolution du pH du lait fermenté au cours de l'étape du soutirage (décaillage avec refroidissement ou conditionnement direct). D'autre part, le seuil de pH pour lequel l'acidification ralentit fortement dépend de la quantité d'acides aminés libres et de di/tripeptides pouvant être transportés par le système AMI et présents dans le lait. Il est donc possible de piloter le pH d'arrêt de la fermentation en modifiant la teneur (quantitative et/ou qualitative) en peptides du lait. La présente invention a donc pour objets une souche de S. thermophilus AMI déficiente à post-acidification réduite, et ses variants et/ou mutants AMI déficients ayant des caractéristiques d'acidification du lait similaires, ainsi que leurs cultures et fractions de cultures biologiquement pures. Au sens de la présente invention, on entend par souche AMI déficiente ou variant AMI déficient ou encore mutant AMI 2877012 5 déficient , une souche, un variant ou un mutant dont la croissance est stimulée par un mélange d'acides aminés libres, et non par un mélange constitué uniquement d'oligopeptides. Par variants ou mutants ayant des caractéristiques d'acidification du lait similaires , on entend désigner des souches obtenues à partir d'une souche de référence. Dans le présent contexte, on utilisera plus particulièrement les termes variant ou variant naturel pour désigner une souche obtenue principalement par mutation et sélection à partir de la souche de référence; tandis que le terme mutant sera plus spécifiquement réservé à une souche obtenue par des techniques de mutagénèse dirigée, notamment par transformation génétique à l'aide de vecteurs, appliquées à la souche de référence. Selon un mode de réalisation, la souche et/ou le variant et/ou le 15 mutant sont résistants à un analogue toxique d'oligopeptides transporté par le système de transport des oligopeptides AMI. En particulier, ledit analogue toxique pourra être choisi parmi l'aminoptérine, la triornithine et la trilysine. Cet analogue sera de préférence l'aminoptérine. On qualifiera ici de résistance à l'aminoptérine , le fait que l'on observe, en présence d'un disque de papier imbibé de 200 pg d'aminoptérine, un diamètre d'inhibition inférieur ou égal à environ 2 cm, de préférence inférieur ou égal à environ 1,8 cm, sur une boite encemencée par 100 l de suspension bactérienne saturée. Une telle définition sera étendue mutatis mutandis par l'homme du métier à d'autres analogues toxiques d'oligopeptides transportés par le système AMI à la lumière de ses connaissances générales. Ainsi, l'homme du métier sera à même de faire varier les valeurs maximales des diamètres d'inhibition de manière appropriée en fonction des analogues toxiques considérés. De préférence, une souche conforme à la présente invention est choisie parmi: - la souche déposée à la CNCM le 10 mai 2004 sous le numéro 1-3211; - la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1- 3301; - la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302; - la souche déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro 1-2774. A titre d'exemple de caractéristiques acidifiantes intéressantes au sens de la présente invention, et comme le montrent les exemples suivants, on précisera que la souche AMI déficiente I-3302 (variant de la souche-mère AMI fonctionnelle 1-3299 déposée à la CNCM le 16/09/04) permet d'obtenir une variation de pH de 0,29 entre le pH de fin d'incubation et le pH du produit en fin de vie, tandis que la souche-mère AMI fonctionnelle 1-3299 donne lieu à une variation de pH de 0,56 entre ces deux temps. En ce cas, l'avantage d'utiliser une souche AMI déficiente par rapport à une souche AMI fonctionnelle réside donc dans une réduction de 0,27 de la variation de pH entre la fin d'incubation et la fin de vie du produit. Comme indiqué supra, les variants et mutants AMI déficients sont obtenus à partir d'une souche-mère de référence. Toutefois, dans le cadre de la présente invention, il s'agira de préférence de variants naturels obtenus par exemple par mutation et sélection selon leurs propriétés acidifiantes. Les techniques pour ce faire sont connues, de même que les tests permettant de contrôler les propriétés acidifiantes (notamment Spinnier H. E., Corrieu G., 1989). A la différence des souches I-3211, I-3301, et I-3302, qui sont des variants AMI déficients de souches-mères AMI fonctionnelles (voir la partie expérimentale ci-après), la souche I-2774 a été isolée et identifiée par la Demanderesse comme étant naturellement AMI déficiente. Les souches selon l'invention sont particulièrement intéressantes pour la préparation de produits alimentaires fermentés. De manière préférée, de tels produits alimentaires fermentés sont des produits laitiers ou végétaux. Par produit laitier , on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine; ainsi que n'importe quel aliment préparé contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait (par exemple des laits infantiles). Par produit végétal , on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz. En outre, les définitions ci-dessus de produit laitier et produit végétal couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple. Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de préparation d'un produit alimentaire fermenté dans lequel un substrat est mis en fermentation avec au moins une souche vivante telle que décrite supra. Il est avantageux de prévoir, dans ce procédé, l'utilisation d'une association d'une ou plusieurs souches bactériennes telles que décrites précédemment, avec notamment au moins une autre souche de bactérie vivante. Avantageusement, ladite autre souche de bactérie est une souche de bactérie lactique, telle que Streptococcus spp. ; Lactobacillus spp., notamment L. bulgaricus, L. acidophilus et L. casei; Lactococcus spp. et Bifidobacterium spp. De préférence, on choisira le substrat à mettre en oeuvre dans le 30 cadre du procédé susmentionné parmi: les substrats lactés, notamment le lait; les substrats à base de matières premières végétales, telles les fruits, les céréales et le soja. On pourra ainsi notamment envisager: si le substrat est lacté, le lait naturel ou reconstitué, écrémé ou non, ou bien des milieux à base de lait ou de produit(s) d'origine laitière. ; et si le substrat est à base de matières premières végétales, des jus de fruits et/ou des jus végétaux. Le substrat peut en outre avantageusement comporter des éléments couramment utilisés dans l'industrie agro-alimentaire pour la préparation de produits fermentés, notamment de desserts lactés, en particulier des éléments solides tels que des fruits, pépites de chocolat ou céréales par exemple, mais également des produits additionnels sucrés ou chocolatés liquides. La présente invention concerne en outre des produits alimentaires 15 fermentés, dont les propriétés organoleptiques sont conservées au cours du stockage. Selon un mode de réalisation, de tels produits comprennent au moins une souche vivante conforme à l'invention. Selon un autre mode de réalisation, les produits alimentaires 20 fermentés selon l'invention sont susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus. De manière préférée, les produits alimentaires fermentés selon l'invention contiennent au moins un ingrédient alimentaire bioactif (ou ingrédient alimentaire fonctionnel), notamment choisi parmi des protéines, des peptides, des analogues ou des dérivés de ceux-ci. L'expression ingrédient alimentaire bioactif ou fonctionnel désigne un ingrédient qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Ainsi, l'effet d'un tel ingrédient peut être une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit ingrédient. Cette définition peut être étendue à l'aliment ou au produit contenant un tel ingrédient, ledit aliment ou produit pouvant dès lors être lui-même qualifié de bioactif ou fonctionnel. On entend par analogue , n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire. Un dérivé au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques. Sont ainsi couverts par la définition de dérivés ci-dessus au moins les hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats. Parmi les ingrédients alimentaires bioactifs susceptibles d'être utilisés dans les produits alimentaires fermentés selon la présente invention, on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, le peptide 91-100 de la caséine as (voir le brevet européen EP 0 714 910), le peptide C6- asi 194-199 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide 07-(3177- 183 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C12-as123-34 (voir le brevet US américain 6 514 941), les caséinophosphopeptides, l'acasomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la J3casomorphine, les caséinomacropeptides (CMP) et les glycomacropeptides (GMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les 3lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gin (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), lle-Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N 17 de septembre 1998). Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache. Tableau 1 Protéines Peptides Origine du Activités décrites originelles fonctionnels* lait** caséine a a casomorphine V activité opiacée caséine a exorphine V activité opiacée casokinine V activité antihypertensive caséine f3 R casomorphine H V activité opiacée casokinine H V activité immunomodulatrice + CPP H V activité antihypertensive action sur les minéraux caséine K CMP=GMP H V modulation de la motricité casoxine V gastrointestinale et de la libération casoplatellines d'hormones digestives antagoniste opiacé activité antithrombotique a lactalbumine fragments 50-53 H V activité opiacée R lactoglobuline R lactorphines V activité opiacée + activité antihypertensive lactoferrine lactoferroxine H V antagoniste opiacé lactoransferrine (*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes (**) H: lait humain / V: lait de vache Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour. T Activités PeÉtildes In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. Effet sur la Caséinomacropeptide production de CCK par Veau: après ingestion de CMP (210 _ Beucher digestion (CMP) cellule intestinale de rat mg/kg), inhibition de la sécrétion Homme: après ingestion de 1994 gastrique et diminution de la CMP (4g), diminution de la Yvon 1994 concentration plasmatique en CKK sécrétion acide casomorphines Lapin après introduction dans lumen: Ben effet antisecrétoire sur l'iléon Mansour Chien: après administration 1988 intragastrique, modulation de Schusdziarra l'insulinémie post-prandiale; 1983 annulation de cet effet par la naloxone (3 casomorphines Plusieurs effets au niveau Tomé 1987, naturelles et certains de de l'iléon de lapin 1988 - Mahé leurs analogues 1989 Analogues de (3 Stimulation de Ben casomorphines non l'absorption intestinale Mansour métabolisés d'électrolytes 1988 Chien: administration 10g Caséine caséine/300mL eau par sonde Defilippi intragastrique: inhibition de la 1995 motilité du grêle, annulée par la naloxone.vs. 10g de protéine de soja: pas d'effet Tableau 2 (suite Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. Effet Lactoferricine Inhibition de la croissance Tomita 1994 antimicrobien Casocidine I (caséine a des souches pathogènes - Zucht 1995 S,) -165-203 Fragment caséine a Inhibition de la croissance Souris, Mouton: efficace en injection Lahov 1996 S1B des souches pathogènes IM contre Staphylococcus aureus (1-23 N terminal) = isracidine Fragment caséine r3 Souris: effet protecteur en injection Migliore- humaine IV contre K. pneumoniae Samour Fragments de a Prolifération des Kayser 1996 lactalbumine bovine et lymphocytes humains de caséine x bovine (PBL) activités par Con A R casokinine 10 et 3 Prolifération ou Kayser 1996 casomorphine 7 de suppression des PBL synthèse suivant concentration Caséine R humaine 54Stimulation de la Parker 1984 59 a phagocytose des globules rouges de mouton par les Effet immuno- lactalbumine 51-53 macrophages péritonéaux modulateur de souris Stimulation des Migliore- macrophages périonéaux Caséine f3 bovine de la souris Pas de protection in vivo Samour Caséine 191-193 1988 Caséine 63-68 Caséine x bovine Inhibition de la Otani 1992, prolifération des 1995 lymphocytes B des Caseino-macropeptides plaques de Peyer chez (106-169) souris et lapin Tableau 2 (suite Activités Peptides ln vitro In vivo animal In vivo homme Réf. Effet Caséinoglycopeptide CGP isolé dans le plasma de Chabance antithrombotique bovin (bCGP) nouveaux-nés après ingestion 1995 Caséinoglycopeptide de lait infantile ou lait de mère humain (hCGP) Peptide 106-116 de Inhibition de l'agrégation Jollès 1986 caséine K bovine plaquettaire Tétrapeptide de, Rat et cobaye avec thrombose Raha 1988 lactotransferrine Inhibition de l agrégation artérielle expérimentale: après Drouet 1990 humaine (39-42) plaquettaire injection IV, activité antithrombotique Effet Hydrolysats Inhibition de l'ACE Mullaly 1997 antihypertenseur enzymatiques de p lactoglobuline et d'a lactalbumine Fragments Inhibition de l'ACE Rats recevant de l'angiotensine I: Kohmura synthétiques de après injection IV, retour au niveau 1989 caséine f3 humaine initial de pression artérielle Peptides de lait Rats hypertendus: ingestion de 10 Masuda fermenté par L. mL lait fermenté / kg poids corporel, 1996 helveticus et S. on retrouve les peptides dans l'aorte cerevisiae avec inhibition de l'ACE _ Peptides issus de _ Rats hypertendus: après ingestion, _ _ lair fermenté par L. diminution de la pression artérielle Yamamoto helveticus 1994 Peptides issus de la Rats hypertendus: après ingestion, Homme hypertendu (36 sujets): Nakamura fermentation de lait diminution de la pression artérielle après 8 semaines d'ingestion 1995 par L. helveticus + Rats normaux: pas d'effet de 95 mL/j, diminution de la Hata 1996 S. cerevisiae Val- pression artérielle Pro-Pro (VPP) / II- Pro-Pro (IPP) Tableau 2 (suite) Activités Peptides n vitro n vivo animal n vivo homme Réf. Effets opiacés Rats: après injection intra-carotides, Homme: après ingestion de Ermisch 1983 accumulation de f3 casomorphines lait de vache, présence de (3 Umbach 1985 dans la zone sans barrière casomorphines dans le Meisel 1986 Veaux nouveaux-nés: après leur contenu intestinal grêle Singh 1989 premier repas de lait de vache, (3 mais pas dans le sang Svedberg casomorphines dans le sang d'adulte 1985 Mini-porcs: après ingestion de Teschemacher caséine bovine, (3 casomorphine 1986 isolée du chyme duodénal Chiots: après ingestion de lait de mère, existence de 13 casomorphines dans le san Peptides de caséine Effet opioïde sur iléon Yoshikawa [3 humaine de isolé de cobaye annulé 1986 synthèse par la naloxone Casoxines (caséine Effets opioïdes Chiba 1989 K) bovine et antagonistes sur muscle humaine de l'iléon isolé de cobaye Avantageusement, les produits alimentaires selon l'invention sont des aliments fonctionnels. Comme indiqué brièvement supra, par aliment fonctionnel , on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un aliment fonctionnel , on citera notamment des activités anti-cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore antimicrobiennes. De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux. Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires objets de l'invention sont des produits frais. Selon un autre mode de réalisation, les produits alimentaires visés 20 par la présente invention sont notamment choisis parmi: une boisson; un yoghourt ou une crème dessert; un lait ou un jus fermenté. La culture des souches selon l'invention, pures ou en association avec d'autres souches, peut également être utilisée comme probiotique dans l'alimentation humaine ou animale, ou encore comme ferment lactique, par exemple dans le cadre du procédé décrit plus haut. La présente invention est illustrée par les figures suivantes: - Figure 1: courbes de cinétiques d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle 1-3299 et de la souche AMI déficiente 1-3301. Lait: lait sans hydrolysat de caséine; lait + N3 0,2 g/L: lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 (ref 211693, Difco, USA) par litre de lait. - Figure 2: courbes de cinétiques d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 et de la souche AMI déficiente I-3302. Lait: lait sans hydrolysat de caséine; lait + N3 0,2 g/L: lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait. - Figure 3: courbes de cinétiques d'acidification de la souche AMI déficiente I-3301 en présence de quantités variables d'ingrédient N3. Lait: lait sans hydrolysat de caséine; lait + 0,05 N3: lait additionné de 0,05 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,1 N3: lait additionné de 0,1 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,2 N3: lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,4 N3: lait additionné de 0,4 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,8 N3: lait additionné de 0,8 g d'ingrédient N3 par litre de lait. - Figure 4: courbes de cinétiques d'acidification de la souche AMI déficiente I-3302 en présence de quantités variables d'ingrédient N3. Lait: lait sans hydrolysat de caséine; lait + 0,05 N3: lait additionné de 0,05 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,1 N3: lait additionné de 0,1 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,2 N3: lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,4 N3: lait additionné de 0,4 g d'ingrédient N3 par litre de lait; lait + 0,8 N3: lait additionné de 0,8 g d'ingrédient N3 par litre de lait. - Figure 5: courbes de cinétiques d'acidification obtenues à partir de la fermentation du lait après addition d'acides aminés avec la souche-mère AMI fonctionnelle I-1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95) et la souche AMI déficiente I-3211. Nom de la souche sans autres précisions: fermentation en lait; nom de la souche + aa: fermentation réalisée en lait additionné de 20 acides aminés (correspondant au 1 /40ème de la quantité déterminée pour le milieuchimiquement défini adapté à S. thermophilus (Letort et al., 2001). - Figure 6: courbes de cinétiques obtenues en lait additionné d'ingrédient N3. - Figure 7: courbes de cinétiques d'acidification réalisées avec différents mélanges d'ingrédients. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples figurant dans la partie expérimentale ci-après et donnés à titre purement illustratif. PARTIE EXPERIMENTALE 1. Matériels et Méthodes: 1.1. Obtention de variants AMI déficients: a) Evaluation de la biodiversité de la résistance à l'aminoptérine chez S. thermophilus Dans un premier temps, la sensibilité des souches de S. thermophilus à l'aminoptérine a été vérifiée. Pour ce faire, 200 pg d'aminoptérine ont été déposés sur un disque placé sur une boîte de pétri contenant du milieu Elliker sur lequel ont été déposés 100 pL de suspension bactérienne. Si la souche est sensible, un diamètre d'inhibition apparaît autour du disque après une incubation d'une nuit. Les souches-mères 1-1630 (déposée auprès de la CNCM le 24/10/95) et 13299 (déposée auprès de la CNCM le 16/09/04) ont été sélectionnées car elles possèdent des propriétés de texture intéressantes. La souche 1-1630 ne possède pas de protéase de paroi, tandis que la souche 1-3299 en possède une. Ces deux souches ont donc des propriétés de croissance très différentes. Tableau 3 Souche Date de Diamètre dépôt d'inhibition (cm) CNCM I-1477 22/09/94 2 I-1520 30/12/94 2,1 I-1630 24/10/95 2,1 I- 3211 10/05/94 1,5 I-2130 24/02/99 2 I-2774 24/01/02 1,8 I-3299 16/09/04 2, 3 I-3301 16/09/04 1,5 1-3 302 16/09/04 0 Une sensibilité différente a été observée en fonction des souches. Dans le tableau 3, les variants AMI déficients obtenus sont indiqués en gris dans les cadres grisés, le cas échéant, en association avec leur souche-mère respective. La résistance à l'aminoptérine est plus forte pour les variants que pour la souche-mère correspondante. La souche sauvage 1-2774 présente une résistance naturelle à l'aminoptérine, traduisant sa déficience dans le système de transport AMI. b) Obtention des variants AMI déficients Les protocoles de sélection de variants déficients pour le transport des peptides, utilisant un analogue peptidique toxique, ont déjà été décrits 20 (Higgins et Gibson, 1986). Brièvement, une gamme d'aminoptérine allant de 0 à 200 pg/mL a été réalisée en milieu chimiquement défini (MCDaa) adapté à la croissance de S. thermophilus et contenant les 20 acides aminés libres comme source d'azote. A partir d'une préculture réalisée en MCDaa, tous les tubes de la gamme ont été ensemencés à 1%. Après une incubation de trois jours à 37 C, pL de chaque tube de culture ont servi à réaliser un tapis bactérien sur une gélose de milieu Elliker. Un disque sur lequel sont déposés 200 pg d'aminoptérine a été placé au centre de la boîte. Les boîtes ont ensuite été incubées trois jours à 37 C en anaérobiose. La présence de clones dans la zone d'inhibition a ensuite été observée, et une vingtaine de clones ont été prélevés afin d'ensemencer 5 mL de milieu Elliker. Les clones qui sont repartis dans ce milieu et ont donné une suspension bactérienne après 16H00 d'incubation à 37 C ont permis la réalisation d'un tapis à la surface d'une gélose de milieu Elliker sur lequel a été déposé un disque imprégné de 200 pg d'aminoptérine. Tous les clones obtenus ont ensuite été testés en fermentation dans du lait. La cinétique d'acidification a fourni une information quant à la capacité de ces variants à acidifier le lait. 1.2. Préparation du lait: Le lait a été reconstitué avec 120 g de poudre de lait écrémé, dans 930 mL d'eau. Après 30 minutes d'hydratation, le lait a été pasteurisé 30 20 minutes à 95 C. L'ingrédient N3 a été ajouté à partir d'une solution à 10 % réalisée dans de l'eau puis stérilisée par filtration à 0,22 pm. Les autres ingrédients testés ont été ajoutés au lait avant la pasteurisation. La solution d'acides aminés a été réalisée dans l'eau puis stérilisée par filtration à 0,22 pm. 1.3. Préparation des ferments pour la réalisation des suivis d'acidification: Une préculture a été réalisée dans du lait stérilisé avec autolysat de levure ensemencé à 1%, incubée 18h à 42 C. Ensuite, le ferment a été réalisé dans 100 mL de lait stérilisé avec autolysat incubé à 42 C et arrêté en le plaçant dans l'eau glacée quand l'acidité de 80 D était atteinte. Le ferment était conservé à 4 C jusqu'au lancement du suivi d'acidification. Pour le lancement du suivi d'acidification, 250 mL de lait ont été ensemencés à 1 % avec le ferment de S. thermophilus. 1.4. Matériels: N3: protéose peptone N 3, réf R211693, Difco, USA (hydrolysat de 10 caséine contenant des peptides et, principalement, des acides aminés libres) Poudre de lait: Milex 240, Aria Food Ingredients Autolysat de levure: extrait de levure, ref AEB171109, AES Laboratoires CINAC pour le suivi d'acidification: Système automatique de mesure de l'activité acidifiante développé par G. Corrieu LGMPA, marque YSEBAERT Alaco 7014: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. MPH 955: hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 20 D25462, Rellingen, Allemagne. DSE 6441: hydrolysat de protéine de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. MPH 917: hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. WPH 926: hydrolysat de protéine de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. MPH 948: hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. C 12: hydrolysat de protéine de lait, DMV international NCB Laan 80, 30 P. O. BOX 13 5460, Ba Zeghel, Pays-Bas. MPH 910: hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne. II. Résultats: 11.1. Cinétique d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle 1- 3299 5 et de souches AMI déficientes qui en dérivent, en présence ou non d'ingrédient N3 On observe, sur les figures 1 et 2, que la souche-mère AMI fonctionnelle 1-3299 présente la même cinétique en présence ou en absence d'ingrédient 10 N3 dans le lait. En revanche, les souches AMI déficientes présentent des cinétiques différentes. 11.2. Cinétique d'acidification avec des quantités variables d'ingrédient N3, souche AMI déficiente I-3301 La souche I-3301 a une cinétique dont la latence est plus courte en présence d'ingrédient N3. En outre, le pH obtenu en fin de fermentation est d'autant plus élevé qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu. 11.3. Cinétique d'acidification avec des quantités variables d'ingrédient N3, souche AMI déficiente 1-3302 La cinétique d'acidification est d'autant plus rapide qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu. En outre, le pH obtenu en fin de cinétique est d'autant plus bas qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu. 11.4. Résultats de post-acidification en souche pure (par comparaison avec 25 la souche-mère 1-3299) 23 Tableau 4 Temps (J) pH 1-3302 pH I-3299 pH fin d'incubation 4,70 4,70 pH à J28 (10 C) 4,41 4,14 8pH 0,29 0,56 La souche AMI déficiente permet d'avoir une différence (delta) de pH de 0,29 entre le pH de fin d'incubation et le pH du produit en fin de vie, alors 5 que la souche-mère donne lieu à un delta de pH de 0,56. L'avantage d'utiliser la souche AMI déficiente est de 0,27 unité pH si l'on compare les 8pH dans ces conditions. 11.5. Cinétiques d'acidification obtenues à partir de la fermentation du lait après addition d'acides aminés avec la souche-mère AMI fonctionnelle 1-1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95) et la souche AMI déficiente 1-3211 qui en dérive. La stimulation produite par l'addition d'acides aminés libres dans le lait est la même pour la souche-mère et la souche AMI déficiente. Ce résultat semble logique dans la mesure où les acides aminés libres représentent la seule source d'azote disponible dans ces conditions pour les deux souches. 11.6. Cinétiques obtenues en lait additionné d'ingrédient N3 La souchemère AMI fonctionnelle 1-1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95), est clairement stimulée par l'addition d'ingrédient N3 dans le lait, alors que la souche AMI déficiente qui en dérive ne l'est pas. Les peptides de l'hydrolysat N3 sont utilisables par la souche-mère, mais ne le sont pas par la souche AMI déficiente. 11.7. Cinétiques d'acidification réalisées avec différents ingrédients avec la souche AMI déficience 1-3211 Les hydrolysats MPH955 et WPH926 stimulent le mieux la fermentation de la souche AMI déficiente dans le lait. Ce sont également les deux hydrolysats dont les teneurs en petits peptides et acides aminés libres sont les plus élevées. REFERENCES Garault, P., et al., (2002) Journal of Biological Chemistry 277:32-39 Letort et al., (2001) J. Appl. Microbiol. 91:1023-1029 Letort, C., et al., (2002) Applied and Environmental Microbiology 68:3162-3165 Spinnier H.E., et al. Automatic method to quantify starter activity based on pH measurement" J. of Dairy Research, 56 (1989) 755-764); de Roissart H. et Luquet F.M. Edition Lorica ISBN: 2-9507477-0-1 Kayser et al., (1996) FEBS Letters 383, 18-20 Hata Y. et al., (1996) Am. J. Clin. Nutr. 64, 767-71 Nakamura Y. et al., (1995) J. Dairy Sci. 78, 1253-7 Migliore-Samour D. et al., (1988) Experimentia 44, 188-93 Defilippi C. et al., (1995) Nutr. 11, 751-4 Tomé D. et al., (1987) Am. J. Physiol. 253, G737-44 Tomé D. et al., (1988) Reprod. Nutri. Dévelop. 28, 909-18 Ben Mansour A. et al., (1988) Pediatr. Res. 24, 751-5 Mahé S. et al., (1989) Reprod. Nutri. Dévelop. 29, 725-32 Schusdziarra V. et al., (1983) Diabetologia 24, 113-6 Yvon M. et al., (1994) Reprod. Nutri. Dévelop. 34, 527-37 Zucht H.D., et al., (1995) FEBS Letters 372, 185-8 Tomita M. et al., (1994) Acta Paed. 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Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que le diamètre d'inhibition observé en présence d'un disque de papier imbibé de 200 pg d'aminoptérine est inférieur ou égal à environ 2 cm, de préférence inférieur ou égal à environ 1,8 cm, sur une boite encemencée par 100 l de suspension bactérienne saturée. 5. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: - la souche déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211; - la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301; - la souche déposée à la CNCM 1e16/09/04 sous le numéro 1-3302; - la souche déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro 1-2774. 6. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits variants AMI déficients sont obtenus par mutation et sélection de leurs propriétés acidifiantes. 7. Procédé de préparation d'un produit alimentaire fermenté dans lequel un substrat est mis en fermentation avec au moins une souche vivante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée en présence d'au moins une autre souche de bactérie vivante. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite autre souche de bactérie est une bactérie lactique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite bactérie lactique est choisie parmi: Streptococcus spp. ; Lactobacillus spp, notamment L. bulgaricus, L. acidophilus et L. casei; Lactococcus 15 spp. et Bifidobacterium spp. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que ledit substrat est choisi parmi: les substrats lactés, notamment le lait; les substrats à base de matières premières végétales, telles les fruits, les céréales et le soja. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit substrat contient des éléments solides. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que lesdits éléments solides sont choisis parmi: les fruits, les produits chocolatés et les céréales. 14. Produit alimentaire fermenté comprenant au moins une souche 30 vivante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 15. Produit alimentaire fermenté susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13. 16. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il est un produit laitier ou végétal. 17. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'il contient au moins un ingrédient alimentaire bioactif. 18. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ingrédient alimentaire bioactif est choisi parmi des protéines, des peptides, des analogues ou des dérivés de ceux-ci. 19. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il est un aliment fonctionnel. 20. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisé en ce qu'il est un produit frais. 21. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: une boisson; un yoghourt ou une crème dessert; un lait ou un jus fermenté. 22. Utilisation d'au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme ferment lactique. 23. Utilisation d'au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme probiotique dans l'alimentation humaine ou animale.