Brevet FR2876246A1 — publié le 20060414

Procédé et Modèle d'obtention d'épithélium bronchiolaire humain régénéré L'invention concerne un modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe comprenant des cellules bronchiolaires épithéliales d'origine humaine, aptes à régénérer un épithélium bronchiolaire humain, et un implant comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain ensemencé sur une trachée ou autre support d'un mammifère non- humain. L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'un modèle de mammifère non-humain comprenant un épithélium bronchiolaire humain régénéré, un procédé d'obtention d'épithélium bronchiolaire humain régénéré, un procédé de criblage de composés pharmacologiques d'intérêt dans le domaine des pathologies respiratoires, un procédé d'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire, l'utilisation du modèle de mammifère non-humain l'invention ou de l'implant selon l'invention pour l'étude de cellules pluripotentes, et un procédé d'évaluation de la transfection de polynucléotides au sein de l'épithélium bronchiolaire du modèle de mammifère non-humain selon l'invention. L'épithélium humain bronchiolaire normal est monostratifié, constitué de cellules basales, de cellules ciliées, de cellules sécrétoires de type cellules de Clara et de quelques cellules sécrétoires de type muqueuses (Ebert and Terracio: The bronchiolar epithelium in cigarette smokers. Observations with the scanning electron microscope. Am. Rev. Respir. Fis., 1975, 111(1) : 4-11). Dans de nombreuses pathologies respiratoires humaines, d'origine génétique comme la mucoviscidose ou, acquises comme les bronchopneumopathies chroniques obstructives, les bronchites chroniques ou les bronchiolites, qui touchent les voies aériennes les plus distales, appelées bronchioles, on assiste à des lésions et à des remaniements de l'épithélium respiratoire qui borde ces voies aériennes. Ces remaniements et lésions peuvent se traduire par une modification de la structure épithéliale, une perte de l'intégrité de la barrière épithéliale associée à une desquamation partielle ou totale de l'épithélium, ce qui est particulièrement vrai pour les voies aériennes distales de type bronchiolaire. Dans ce type de tissus respiratoires pathologiques, l'épithélium humain bronchiolaire devient pseudostratifié et présente une hyperplasie des cellules sécrétoires de type muqueuse (Hubea et al: Quantitative analysis of inflammatory cells infiltrating the cystic fibrosis airway mucosa. Clin. Exp. Immunol., 2001, 124(1) : 69- 76). Ces remaniements et lésions entraînent une perte des fonctions (antioxydante, transport d'ions et d'eau, anti-bactérienne...) de l'épithélium respiratoire qui doit se régénérer pour restaurer ses fonctions. Dupuit et al ont mis au point un modèle de xénogreffe bronchique humanisée, l'épithélium bronchique étant très accessible et riche en cellules (Dupuit et al: Differentiated and functional human airway epithelium regeneration in tracheal xenografts, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278: LI 65-L176, 2000). L'épithélium respiratoire de type bronchiolaire, par opposition à l'épithélium bronchique est très peu accessible de par sa localisation, et très peu riche en cellules de par le diamètre des bronchioles (1 mm de diamètre). Des cellules bronchiolaires ont déjà été isolées à partir de bronchioles et mises en culture pour examiner les flux ioniques les traversant (Blouquit et al, Characterization of ion and fluid transport in human bronchioles, Am. J. Respir. Cell mol. Biol., vol. 27, pp. 503-510, 2002). Les conditions de la culture réalisée (maintien des cellules dans leur état de différenciation initiale) ne permettaient pas d'envisager l'étude des modifications de l'état de ces cellules, notamment des modifications intéressantes dans le cadre de la définition de la régénération d'un épithélium bronchiolaire. II n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèle cellulaire permettant de préparer un épithélium bronchiolaire humain et, par la suite, d'étudier les conditions (par exemple la cinétique) de sa régénération. Les inventeurs ont réalisé de nombreuses études afin d'obtenir un modèle chimérique in vivo apte à régénérer un épithélium bronchiolaire humain, permettant d'une part, les études, y compris les études pré-cliniques, de molécules pharmacologiques utilisables dans les pathologies respiratoires touchant les voies aériennes distales de type bronchiolaire et d'autre part, l'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire humain à partir de cellules pathologiques ou à partir de cellules normales (c'est à dire caractéristiques d'un tissu sain). L'invention concerne un modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe comprenant des cellules bronchiolaires épithéliales d'origine humaine, aptes à régénérer un épithélium bronchiolaire humain. La greffe réalisée pour obtenir le modèle animal selon l'invention est une xénogreffe dans la mesure où les cellules greffées sont d'origine humaine alors que le modèle est un animal (excluant l'homme) mammifère non-humain xénotolérant. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules sont greffées en utilisant l'intermédiaire d'un support, qui peut être d'origine animale. Ce modèle de mammifère non-humain permet, à partir de cellules bronchiolaires greffées d'origine humaine, non seulement la régénération complète de l'épithélium bronchiolaire humain normal, mais aussi la reproduction de la cinétique des évènements conduisant à cette régénération, en particulier une étape intermédiaire du processus de régénération présentant un épithélium humain bronchiolaire similaire à un épithélium bronchiolaire humain pathologique. Dans un mode de réalisation spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales pathologiques. Le modèle est alors préparé à partir de bronchioles issues de tissus de patients atteints de maladies telles que la mucoviscidose, les bronchopneumopathies chroniques obstructives, les bronchites chroniques ou les bronchiolites. Dans un autre mode de réalisation spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales non pathologiques, dites normales ou saines. Les cellules sont obtenues par une étape de dissociation à partir de bronchioles prélevées sur des tissus de pièces pulmonaires humaines dans des zones éloignées du tissu pathologique, le plus souvent tumoral. Par le terme cellules pathologiques on entend désigner des cellules qui sont différenciées et qui proviennent de tissus pathologiques, notamment d'un épithélium respiratoire d'un patient affecté par une maladie respiratoire quelconque. Les cellules non pathologiques ou normales sont différenciées et proviennent de tissus sains. Par le terme épithélium , on désigne un tissu vascularisé ou non vascularisé constitué d'une ou plusieurs couches de cellules collées les unes aux autres. L'invention permet la réalisation des différentes étapes de la régénération de l'épithélium bronchiolaire et en conséquence, un modèle de mammifère non-humain selon l'invention est caractérisé aussi par le stade de régénération de l'épithélium, notamment en fonction du temps écoulé depuis la mise en place de la greffe et/ou le cas échéant du traitement de ladite greffe avec des substances dont on teste l'effet sur l'épithélium bronchiolaire. Dans un exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain régénéré du modèle est monostratifié. Le terme épithélium monostratifié désigne un épithélium normal ou sain présentant des cellules différenciées, notamment quelques cellules basales, de nombreuses cellules ciliées, quelques cellules sécrétoires de type muqueuses et de type cellules de Clara. Dans un exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain régénéré du modèle est pseudostratifié. Le terme épithélium pseudostratifié désigne un épithélium histologiquement similaire à l'épithélium humain bronchiolaire remanié observé lors de diverses pathologies respiratoires touchant les voies aériennes de type bronchioles. Cet épithélium présente des cellules différenciées, comprenant d'assez nombreuses cellules basales et sécrétoires de type muqueuses, quelques cellules de Clara et de nombreuses cellules ciliées. Dans un exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain régénéré du modèle est pluristratifié. Le terme épithélium pluristratifié désigne un épithélium composé de cellules indifférenciées, notamment composé de quelques couches de cellules cubiques recouvertes d'une couche de cellules aplaties. Les types cellulaires présents dans l'épithélium aux différents stades de sa régénération sont caractérisés par des marqueurs cellulaires connus (voir exemples ci-après). Le modèle de xénogreffe selon l'invention peut être obtenu par le greffage de la trachée ou autre support d'un premier mammifère non-humain dans un deuxième mammifère non-humain, ladite trachée ou autre support servant de support aux cellules bronchiolaires d'origines humaines et apportant à ces cellules des facteurs matriciels appropriés pour contribuer à la prolifération et à la différenciation des cellules, comme par exemple les protéines de la lame basale comme les collagènes ou les laminines. Alternativement la trachée peut être remplacée par d'autres supports, des segments d'oesophage ou d'intestin désépithélialisés. Préalablement à leur ensemencement sur la trachée (ou sur un autre support adapté), les cellules sont mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. Ainsi, lors de leur ensemencement sur la trachée (ou autre support), les cellules bronchiolaires sont sous formes essentiellement dédifférenciées. Le premier mammifère utilisé pour réaliser ce modèle peut être un rongeur, par exemple un rat Wistar ou un rat Fisher. Le deuxième mammifère peut être un rongeur xénotolérant, par exemple une souris xénotolérante, telle qu'une souris NUDE ou une souris SCID. Par mammifère xénotolérant ou rongeur xénotolérant , on entend désigner un mammifère ou un rongeur apte à recevoir des cellules ou tissus étrangers ou hétérologues, sans qu'il y ait rejet de cette greffe. L'invention concerne également un implant comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain ensemencé sur une trachée ou autre support d'un mammifère non-humain, susceptible d'être obtenu à partir d'un modèle animal non-humain selon l'invention. La trachée (ou autre support) peut être montée sur un dispositif et maintenues par des ligatures. L'ensemble dispositif trachée de rat peut faire l'objet de cycles de congélation décongélation. Le dispositif est par exemple un cathéter. Les cellules humaines bronchiolaires sont inoculées dans le montage constitué par la trachée (ou autre support approprié) en injectant les cellules dans le dispositif situé à proximité immédiate de la trachée (ou autre support). L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'un modèle de mammifère non-humain apte à régénérer un épithélium bronchiolaire humain comprenant les étapes suivantes: a) isolement de bronchioles à partir de pièces pulmonaires humaines, b) dissociation de cellules épithéliales bronchiolaires qui bordent lesdites bronchioles, c) ensemencement desdites cellules bronchiolaires et culture dans un milieu de culture approprié permettant leur prolifération jusqu'à l'obtention d'une culture confluente, d) en parallèle de l'étape c), dissection d'une trachée ou autre support d'un animal, par exemple un rongeur, traitement pour éliminer les cellules vivantes et montage sur un dispositif, e) après détachement, ensemencement desdites cellules bronchiolaires dans la trachée ou dans un autre support de l'animal, f) greffage de l'ensemble formé du dispositif et de la trachée ou autre support sous la peau d'un animal xénotolérant, par exemple un rongeur, g) élevage de l'animal pendant un délai permettant la régénération totale ou partielle de l'épithélium bronchiolaire. Dans un exemple spécifique de l'invention, le milieu de culture utilisé dans l'étape c) permet d'obtenir une prolifération des cellules épithéliales bronchiolaires. Le milieu de culture utilisé dans l'étape c) peut comprendre des facteurs de prolifération, notamment de l'Epidermal Growth Factor (EGF), de l'Extrait pituitaire bovin, de l'épinéphrine et de la 3, 3', 5-triido-Lthyronine. En particulier, le milieu de culture permettant la prolifération des cellules épithéliales entraîne une dédifférentiation de ces cellules. Dans un exemple spécifique de l'invention, les cellules de l'étape c) sont ensemencées à très faible densité. Par exemple, les cellules sont ensemencées à une densité comprise entre 13 000 et 70 000 cellules par cm2, de préférence entre 20 000 et 40 000 cellules par cm2. Le dispositif a les caractéristiques suivantes: tubulure creuse, stérile, partiellement souple, c'est-à-dire excepté au niveau de la zone de jonction de la trachée (ou autre support) qui doit être plus rigide. Le dispositif est par exemple sur un cathéter. Les exemples ci-après décrivant l'utilisation d'une trachée et d'un cathéter peuvent être déclinés respectivement pour tout type de support remplaçant la trachée, et pour tout type de dispositif remplaçant le cathéter adapté au fonctionnement des étapes d) à g) du procédé selon l'invention. L'animal utilisé dans les étapes f) et g) peut être un rongeur, notamment une souris, par exemple une souris NUDE ou SCID. L'animal utilisé dans les étapes d), e) et f) peut être un rongeur, notamment un rat, par exemple un rat Wistar ou un rat Fisher. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape d'isolement de bronchioles est effectuée par microdissection. L'étape consiste à micro-disséquer les bronchioles humaines, par exemple issues de résections pulmonaires chirurgicales, sous loupes binoculaires. L'étape de dissociation des cellules épithéliales peut être effectuée par processus enzymatique. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape d) comprend des étapes de congélation, décongélation, après dissection de la trachée de rat ou autre support, laquelle est ensuite montée sur le dispositif puis recongelée. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape e) comprend une étape de décongélation de la trachée de rat ou autre support avant l'ensemencement des cellules bronchiolaires dans celle-ci. Dans un mode de réalisation spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales pathologiques. Le modèle est alors préparé à partir de bronchioles issues de tissus de patients atteints de maladies telles que la mucoviscidose, les bronchopneumopathies chroniques obstructives, les bronchites chroniques ou les bronchiolites. Dans un autre mode de réalisation spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales non pathologiques, dites normales ou saines. L'invention concerne également un procédé d'obtention d'épithélium bronchiolaire humain régénéré comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un modèle de mammifère non-humain apte à régénérer un épithélium bronchiolaire humain selon l'invention, b) récupération de l'ensemble formé du dispositif et de la trachée ou autre support portant l'épithélium régénéré sous la peau de l'animal c) éventuellement récupération de l'épithélium bronchiolaire humain régénéré. Ce procédé d'obtention d'épithélium bronchiolaire humain régénéré comprend les mêmes étapes a) à g) que le procédé d'obtention d'un modèle de mammifère non-humain comprenant un épithélium bronchiolaire humain régénéré cité ci-dessus. Toutes les remarques faites au sujet du procédé d'obtention du modèle sont applicables au procédé d'obtention de l'épithélium concernant les étapes a) à g). L'invention concerne également un procédé de criblage de composés pharmacologiques d'intérêt dans le domaine des pathologies respiratoires comprenant les étapes suivantes: - mise en contact du modèle de mammifère non-humain selon l'invention ou de l'implant selon l'invention comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain régénéré avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. Les molécules pharmacologiques d'intérêt sont par exemple des molécules anti-inflammatoires, cytoprotectrices et pro-régénératrices de l'épithélium. L'invention concerne également un procédé de criblage de composés pharmacologiques d'intérêt dans le domaine des pathologies respiratoires comprenant les étapes suivantes: - mise en contact de l'épithélium bronchiolaire pathologique provenant du modèle de mammifère non-humain avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. L'objet de l'invention porte également sur un procédé d'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire comprenant les étapes suivantes: - mise en contact du modèle de mammifère non-humain selon l'invention ou de l'implant selon l'invention comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain régénéré avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. L'objet de l'invention porte également sur un procédé d'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire comprenant les étapes suivantes: le composé pharmacologique déterminé est mis en contact avec l'épithélium bronchiolaire provenant du modèle de mammifère non-humain. La deuxième étape concernant la détection de la modification de l'état dudit épithélium est identique. Dans un exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire est monostratifié. Dans un autre exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire est pseudostratifié. Dans un autre exemple spécifique de l'invention, l'épithélium bronchiolaire est pluristratifié. L'objet de l'invention porte également sur l'utilisation du modèle de mammifère non-humain l'invention ou de l'implant selon l'invention pour l'étude de cellules pluripotentes. L'invention concerne également un procédé d'évaluation de la transfection de polynucléotides au sein de l'épithélium bronchiolaire du modèle de mammifère non-humain selon l'invention, comprenant: -la transfection des cellules de l'épithélium bronchiolaire avec un polynucléotide déterminé, -l'observation des effets de la transfection réalisée sur les cellules de l'épithélium. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: cathéter composé d'une tubulure élastique (diamètre interne 0, 76 mm, diamètre externe 1,65 mm) et d'une tubulure en polyéthylène (diamètre internel,14 mm, diamètre externe 1,57 mm), imbriquées l'une dans l'autre. Figure 2: trachée de rat décongelée et montée sur le cathéter et maintenue grâce à des ligatures et de la colle tissulaire. Figure 3: cellules humaines bronchiolaires inoculées dans le montage en injectant les cellules dans le cathéter situé à proximité immédiate de la trachée. Figure 4: montages greffés sur une souris NUDE. une incision est réalisée derrière chacune des oreilles de la souris. A l'aide d'une canule insérée dans l'incision, nous décollons la peau du dos de la souris. Un montage est inséré dans chacune des incisions. Les incisions sont ensuite suturées grâce à du fil de suture chirurgical non. Chaque souris porte deux greffes. Figure 5a: Epithelium bronchiolaire dans la xénogreffe après 4 jours. Figure 5b: Epithelium bronchiolaire dans la xénogreffe après 13 jours (épithélium pluristratifié). Figure 5c: Epithelium bronchiolaire dans la xénogreffe après 25 à 35 jours (épithélium pseudostratifié). Figure 5d: Epithelium bronchiolaire dans la xénogreffe après 35 à 45 jours (épithélium monostratifié). Figure 6a: CK13 marqueur de cellules basales. Figure 6b: CK18 marqueur de cellules cylindriques (cellules ciliées, muqueuses et de Clara. Figure 6c: CCI O marqueur de cellules de Clara. Figure 6d: MUC 5AC marqueur de cellules muqueuses. EXEMPLES Exemple 1: microdissection des bronchioles humaines. La méthode a consisté à microdisséquer les bronchioles humaines issues de résections pulmonaires chirurgicales sous loupes binoculaires. Exemple 2: Dissociation des cellules épithéliales bronchiolaires. Les bronchioles ont ensuite été maintenues dans du milieu de culture DMEM/Ham F12 (Gibco BRL) supplémenté avec de la pénicilline (100 U/mL), de la streptomycine (100 pg/mL), de la gentamycine (50 pg/ml) et de l'amphotéricine B (2,5 pg/ml) (Gibco BRL), jusqu'à la dissociation des cellules épithéliales. Pour la dissociation des cellules épithéliales, les bronchioles ont été incubées pendant 16 heures à 4 C dans du milieu RPMI/HEPES (Gibco, BRL) additionné de 0,1% de pronase E (Sigma Aldrich). A l'issue, les bronchioles ont été agitées manuellement dans le milieu de dissociation. L'action de la pronase E a été stoppée par addition de 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL). Les restes de bronchioles ont été enlevés à l'aide d'une pince stérile et le surnageant est centrifugé pendant 5 minutes à 250 g. Le culot cellulaire a alors été resuspendu et incubé pendant 5 minutes à 37 C dans une solution de PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 et dépourvu de Cal+ et de Mg2+; Gibco BRL) contenant 25% de trypsine à 2,5% (Sigma Aldrich) et 25% de versène (solution constituée de PBS contenant 8.5 g/L de NaCI(Chlorure de sodium, Sigma Aldrich) et 2 g/L d'EDTA (éthylène-diamino-tétraacétique, Sigma). L'action de la solution a été stoppée par addition de 10% de sérum de veau foetal. Le surnageant a été centrifugé pendant 5 minutes à 250 g. Exemple 3: Ensemencement des cellules bronchiolaires dans un milieu de culture approprié permettant leur prolifération jusqu'à l'obtention d'une culture confluente. Le culot cellulaire a alors été resuspendu et ensemencé dans du milieu de culture constitué de 75% de milieu DMEM (Gibco BRL) et 25% de milieu F12 (Gibco BRL) supplémenté avec 0.87 pM d'insuline bovine (Sigma Aldrich), 65 nM de transferrine humaine (Sigma Aldrich), 1.6 nM d'EGF (Epidermal growth factor) recombinante humaine (Sigma Aldrich), 1.38 pM d'hydrocortisone (Sigma Aldrich), 30 nM de retinyl acetate (Sigma Aldrich) , 9.7 nM de 3,3',5-triiodo-L-thyronine (Sigma Aldrich), 2.7 pM d'épinéphrine (Sigma Aldrich), 35 pg/ml d'extrait pituitaire bovin (Sigma Aldrich), 5 pM d'éthanolamine (Sigma Aldrich), 5 pM d'o- phosphoryléthanolamine (Sigma Aldrich), 30 nM de sélénite de sodium (Sigma Aldrich), 1 nM de manganese chloride tetrahydrate (Sigma Aldrich), 0.5 pM de sodium metasilicate nonahydrate (Sigma Aldrich), 1 nM d'ammonium molybdate tetrahydrate (Sigma Aldrich), 5 nM d'ammonium vanadate (Sigma Aldrich), 1 nM nickel sulfate hexahydrate (Sigma Aldrich), 0.5 nM de stannous chloride dihydrate (Sigma Aldrich), 100 U/ml de penicilline et 100 pg/ml de streptomycine (Gibco BRL) ainsi que 10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont alors cultivées dans un incubateur à 37 C en présence de 5% de CO2. Après 24 heures, le milieu a été changé et remplacé par le même milieu mais dépourvu de sérum de veau foetal. La culture a été poursuivie dans ce milieu, avec un renouvellement du milieu tous les trois jours, jusqu'à obtention d'une culture confluente. Exemple 4: Dissection d'une trachée de rat et montage sur un cathéter. En parallèle, la trachée de rats mâles Wistar (220-250 g, Charles River) a été prélevée après sacrifice des animaux, et congelée à -80 c Un cathéter a été fabriqué : il se compose de tubulure élastique (diamètre interne 0,76 mm, diamètre externe 1,65 mm, Silastic) et de tubulure en polyéthylène (diamètre interne 1,14 mm, diamètre externe 1,57 mm, Etablissement Aubry), imbriquées l'une dans l'autre selon la figure 1. La trachée de rat a alors été décongelée et montée sur le cathéter où elle a été maintenue grâce à des ligatures (fil de soie tressée non résorbable, Look Suture) et de la colle tissulaire (Histoacryl , B Braun Medical) selon la figure 2. L'ensemble a alors été recongelé à -80 c jusqu'à utilisation. Exemple 5: Détachement des cellules puis ensemencement dans la trachée de rat. Lorsque la culture de cellules humaines bronchiolaires était confluente, les cellules ont été rincées deux fois à l'aide de PBS dépourvu de Cal+ et de Mg2+, puis détachées à l'aide d'une solution de trypsine/EDTA (0,5 g de trypsine et 0,2 g d'EDTA par litre de PBS, Gibco BRL). Les cellules détachées ont été reprises dans du milieu DMEM/Ham F12 contenant 10% de SVF, puis comptées, centrifugées à 250g pendant 5 minutes puis resuspendues à raison de 12,5 millions de cellules /mL de milieu DMEM/Ham F12 contenant 10% de sérum de veau foetal. L'ensemble cathéters + trachée de rat appelé montage a été décongelé dans du milieu DMEM/Ham F12. Le milieu DMEM/Ham F12 a été passé trois fois dans le montage à l'aide d'une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de 21 Gx11'2 (0,8x40 mm, Terumo) afin d'éliminer les débris de l'épithélium de la trachée de rat qui a desquamé à la suite des deux cycles de congélation/décongélation. Le montage a été ensuite vidé de son contenu liquide par injection d'air. Les cellules humaines bronchiolaires ont été alors inoculées dans le montage à raison de 80pL de suspension cellulaire par montage, en injectant les cellules dans le cathéter situé à proximité immédiate de la trachée, selon la figure 3. Les extrémités des cathéters ont ensuite été closes. L'ensemble a été maintenu dans du milieu DMEM/Ham F12 pendant 2 heures dans un incubateur à 37 c en présence de 5%de CO2, en retournant le montage toutes les 15 minutes. Exemple 6: Greffage de l'ensemble formé du cathéter et de la trachée sous la peau d'une souris. Des souris femelles NUDE (nu/nu, 8 semaines, Charles River), ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (60 mg/kg, Centravet). Les montages ont été alors greffés: une incision a été réalisée derrière chacune des oreilles de la souris. A l'aide d'une canule insérée dans l'incision, la peau du dos de la souris a été décollée. Un montage a été inséré dans chacune des incisions. Les incisions ont ensuite été suturées grâce à du fil de suture chirurgical non résorbable (polyamide monofil noir monté sur aiguille triangulaire vectral 3/8 de cercle et 16 mm, Ethicon). Chaque souris portait deux greffes (figure 4). Exemple 7: Sacrifice des souris et analyse de l'épithélium humain bronchiolaire. Les souris ont été élevées en atmosphère stérile jusqu'à leur sacrifice, à l'excision de la greffe et à l'analyse de l'épithélium humain bronchiolaire qui borde alors la trachée de rat. Après 4, 13, 25 et 35 jours de greffe, des souris sont sacrifiées parsurdose de pentobarbital sodique et les greffons excisés. Exemple 8: Histologie des greffes. Après 4 jours de greffe, une monocouche de cellules aplaties indifférenciées a été observée. Après 13 jours de greffe, un épithélium pluristratifié constitué de quelques couches de cellules cubiques recouvertes d'une couche de cellules aplaties était observé. Après 25 à 35 jours de greffe, un épithélium pseudostratifié présentant des cellules différenciées a été observé: d'assez nombreuses cellules basales et sécrétoires de types muqueuses, quelques cellules de Clara et de nombreuses cellules ciliées étaient présentes. Après 35 à 45 jours de greffe, un épithélium présentant un phénotype comparable à celui d'un épithélium natif normal a été observé. Cet épithélium différencié présentait quelques cellules basales, de nombreuses cellules ciliées, quelques cellules sécrétoires de type muqueuses et de type cellules de Clara. II est important de noter qu'entre 25 et 35 jours suivant la greffe, l'épithélium présent dans les greffes est histologiquement similaire à l'épithélium humain bronchiolaire remanié observé lors de diverses pathologies respiratoires touchant les voies aériennes de type bronchiole. II est important de noter qu'entre 35 et 45 jours suivant la greffe, l'épithélium présent dans les greffes est histologiquement similaire à l'épithélium humain bronchiolaire normal (figures 5a, 5b, 5c et 5d). Exemple 9: Caractérisation immunohistochimique des greffes. La présence des différents types cellulaires constituant l'épithélium humain bronchiolaire a été évaluée par marquage immunofluorescent avec des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre les cytokératine 13 (Sigma Aldrich) mettant en évidence les filaments intermédiaires du cytosquelette des cellules basales, des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la cytokératine 18 (Sigma Aldrich) mettant en évidence les filaments intermédiaires du cytosquelette des cellules cylindriques (cellules sécrétoires de type muqueuses ou Clara, et cellules ciliées), des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine MUC-5AC (Santa Cruz) mettant en évidence les cellules sécrétoires de type muqueuses et des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la protéine CC10 (Singh et al. A Quantitative assay for a Clara cell- specific protein and its application in the study of development of pulmonary airways in the rat. Pediatr. Res., 1986, 20:802-805) mettant en évidence les cellules sécrétoires de type cellules de Clara (figures 6a, 6b, 6c et 6d). Pour cela, une partie des greffes a été incluse dans une résine (OCT, Optimal Cutting Temperature; Tissue Tek) puis congelée dans les vapeurs d'azote liquide. Des coupes de 5pm d'épaisseurs ont été réalisées à partir de ces bloc à l'aide d'un cryostat (Cryocut, Reichert Jung) puis recueillies sur des lames préalablement recouvertes d'une solution de gélatine et d'alun de chrome (gélatine 0,5% (Prolabo) et alun de chrome (KCr(SO4)2; Fluka), dans de l'eau désionisée, puis séchées à l'air). Après fixation dans du méthanol froid 10 minutes à -20 C, les lames ont été rincées au PBS, puis incubées 10 minutes dans une solution de PBS contenant 3% d'albumine bovine sérique (Sigma Aldrich) avant d'être incubées pour une heure avec les différents anticorps préalablement cités dilués dans la même solution de PBS et d'albumine bovine sérique. Après un nouveau lavage en PBS, les lames ont été incubées pour une heure avec un anticorps secondaire pertinent (dirigé contre les anticorps de souris ou de lapin) couplé à des molécules de biotine (Amesham) dilué dans la même solution de PBS et d'albumine bovine sérique. Après lavage au PBS, les lames ont ensuite été incubées pour 30 minutes à l'obscurité avec un conjugué constitué de streptavidine, ayant une forte affinité pour la biotine, couplé à un fluorochrome (Alexa Fluor 488, Molecular Probe) dilué dans du PBS. Après lavage avec du PBS, les lames ont été incubées avec un colorant nucléaire, l'hématoxylline de Harris (Shandon), rincées au PBS puis à l'eau désionisée puis montées sous lamelles grâce à une solution de montage (Aqueous Mounting Medium, Biomeda). Les lames ont été observées sous un microscope Axiophot (Zeiss). Exemple 10: Caractérisation fonctionnelle des épithéliums régénérés. La présence de la protéine CC10 secrétée spécifiquement par les cellules de Clara a été détectée par la méthode ELISA. Pour cela, aux différents temps de régénération (4, 13, 25 et 35 jours de greffe), les greffes ont été lavées en faisant passer du milieu DMEM/Ham F12 dans les montages sur le dos des souris vivantes. Les montages ont alors été vidés de leur contenu liquide en faisant passer de l'air, puis de nouveau remplis avec du milieu DMEM/Ham F12. Après 4 heures de contact avec l'épithélium humain bronchiolaire tapissant les greffes en cours de régénération, la souris a été sacrifiée et le liquide a été collecté. La concentration en protéine CCIO a alors été déterminée grâce à un kit ELISA spécifique (Biovendor). Les résultats montraient la présence, avec une concentration croissante, de la protéine CC10 dans les liquides collectés, attestant de la sécrétion fonctionnelle de cette protéine par les cellules de Clara présentes dans les épithéliums régénérés. Les propriétés bioélectriques des épithéliums régénérés ont été étudiées. Pour cela, des greffes de 35 jours ont été prélevées, ouvertes dans le sens de la longueur puis montées dans les chambres dites de Ussing permettant d'étudier le courant généré par les mouvements d'ions à travers l'épithélium (Isc), ainsi que la différence de potentiel transépithéliale (ddp). Les résultats obtenus ont montré une ddp conforme à la ddp générée par un épithélium bronchiolaire humain natif et des variations d'Isc, suite à une stimulation par des drogues, similaires à celles obtenues avec un épithélium bronchiolaire natif, c'est-à-dire une diminution suite à l'incubation avec de l'amiloride (10-5 M; Sigma Aldrich), et une augmentation suite à l'incubation avec de la forskoline (10"5 M; Sigma Aldrich) et de l'ATP (10-4 M; Sigma Aldrich). REVENDICATIONS 1- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe comprenant des cellules bronchiolaires épithéliales d'origine humaine greffées sous la peau dudit mammifère non-humain dans des conditions permettant de régénérer un épithélium bronchiolaire humain. 2- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales pathologiques. 3- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire humain est obtenu à partir de cellules bronchiolaires épithéliales non pathologiques. 4- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon les revendications 1 ou 2, caractérisé .en ce que l'épithélium bronchiolaire humain régénéré est monostratifié. 5- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire humain régénéré est pseudostratifié. 6- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire humain régénéré est pluristratifié. 7- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon 30 l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est obtenu par le greffage de la trachée ou autre support d'un premier mammifère non-humain dans un deuxième mammifère non-humain. 8- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier mammifère est un rongeur, par exemple un rat. 9- Modèle de mammifère non-humain comportant une xénogreffe selon les revendications 7 ou 8, caractérisé en- ce que le deuxième mammifère est 10 un rongeur xénotolérant, par exemple une souris xénotolérante. 10- Implant comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain ensemencé sur une trachée ou autre support d'un mammifère nonhumain, susceptible d'être obtenu à partir d'un modèle animal non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11- Procédé d'obtention d'un modèle de mammifère non-humain destiné à être sacrifié, apte à régénérer un épithélium bronchiolaire humain, comprenant les étapes suivantes: a) isolement de bronchioles à partir de pièces pulmonaires humaines, b) dissociation de cellules épithéliales bronchiolaires qui bordent lesdites bronchioles, c) ensemencement desdites cellules bronchiolaires et culture dans un milieu de culture approprié permettant leur prolifération jusqu'à l'obtention d'une culture confluente. d) en parallèle de l'étape c), dissection d'une trachée ou autre support d'un animal, par exemple un rongeur, traitement pour éliminer les cellules vivantes et montage sur un dispositif, e) après détachement, ensemencement desdites cellules bronchiolaires dans la trachée ou autre support de l'animal, f) greffage de l'ensemble formé du dispositif et de la trachée ou autre support sous la peau d'un animal xénotolérant, par exemple un rongeur, g) élevage de l'animal pendant un délai permettant la régénération totale ou partielle de l'épithélium bronchiolaire. 12- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé dans l'étape c) comprend des facteurs de prolifération pour obtenir une prolifération des cellules épithéliales bronchiolaires. 13- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les facteurs 20 de prolifération sont notamment de l'Epidermal Growth Factor (EGF), de l'extrait pituitaire bovin, de l'épinéphrine et de la 3, 3', 5-triiodo-LThyronine. 14- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce lesdites cellules de l'étape c) sont ensemencées à très faible densité, par exemple à une densité comprise entre 13 000 et 70 000 cellules par cm2, de préférence entre 20 000 et 40 000 cellules par cm2. 15- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le rongeur utilise dans les étapes f) et g) est une 30 souris NUDE. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le rongeur utilisé dans les étapes d), e) et f) est un rat Wistar. 17- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 16 caractérisé en ce que l'étape d'isolement de bronchioles est effectuée par microdissection. 18- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, caractérisé en ce que l'étape d) comprend des étapes de congélation, décongélation, après dissection de la trachée de rat ou autre support, laquelle est ensuite montée sur le dispositif puis recongelée, 19- Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, caractérisé en ce que l'étape e) comprend une étape de décongélation de la trachée de rat ou autre support avant l'ensemencement des cellules bronchiolaires dans celle-ci. 20- Procédé d'obtention d'épithélium bronchiolaire humain régénéré 20 comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un modèle de mammifère non-humain apte à régénérer un épithélium bronchiolaire humain, selon l'une quelconque des revendications 11 à 19, b) récupération de l'ensemble formé du dispositif et de la trachée ou autre support portant l'épithélium régénéré sous la peau de l'animal, après le sacrifice dudit animal, c) éventuellement récupération de l'épithélium bronchiolaire humain régénéré. 21- Procédé de criblage de composés pharmacologiques d'intérêt dans le domaine des pathologies respiratoires comprenant les étapes suivantes: mise en contact du modèle de mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou de l'implant selon la revendication 10, comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain régénéré, avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. 22- Procédé de criblage de composés pharmacologiques d'intérêt dans le domaine des pathologies respiratoires comprenant les étapes suivantes: mise en contact de l'épithélium bronchiolaire pathologique provenant du modèle de mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. 23- Procédé d'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire comprenant les étapes suivantes: - mise en contact du modèle de. mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou de l'implant selon la revendication 10, comprenant ou étant constitué d'un épithélium bronchiolaire humain régénéré, avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. 24- Procédé d'étude de la régénération de l'épithélium bronchiolaire comprenant les étapes suivantes: - mise en contact de l'épithélium bronchiolaire provenant du modèle de 5 mammifère non-humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, avec un composé pharmacologique déterminé, - détection de la modification de l'état dudit épithélium. 25- Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 24 caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire est monostratifié. 26- Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 24 caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire est pseudostratifié. 27- Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 ou 24 caractérisé en ce que l'épithélium bronchiolaire est pluristratifié. 28- Utilisation du modèle de mammifère non-humain selon l'une 20 quelconque des revendications 1 à 9 ou de l'implant selon la revendication 10 pour l'étude de cellules pluripotentes. 29- Procédé d'évaluation de la transfection de polynucléotides au sein de l'épithélium bronchiolaire du modèle de mammifère non-humain selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 9, comprenant: -la transfection des cellules de l'épithélium bronchiolaire avec un polynucléotide déterminé, -l'observation des effets de la transfection réalisée sur les cellules de l'épithélium.