Brevet FR2885369A1 — publié le 20061110

L'invention concerne un matériel infectieux synthétique et standardisé de type prion et ses utilisations en tant qu'inoculum infectant. DOMAINE DE L'INVENTION Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central (SNC), connues chez l'être humain comme étant, entre autres, la maladie de Creutzfeld-Jacob (MCJ) et affectant également de nombreux mammifères, particulièrement les ovins et les bovins (tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine). Les propriétés de l'agent étiologique de ces maladies le classent dans ce que l'on appelle les "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). L'agent causal n'est pas connu. Mais la signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante au moins partiellement aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans les cellules, provoquant la mort de celles-ci. Cette forme anormale pathogène de la PrP, appelée PrPsc, résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (P. Brown, Transfusion, 41, 4333-436, 2001 et D. Vdlkel et al, Transfusion, 41., 441-448, 2001). La transgenèse in vitro ou in vivo contribue largement à la connaissance des EST. Ainsi, les souris dont le gène codant pour la PrPsc a été inactivé sont très fortement résistantes à l'infection expérimentale. Inversement, des souris et des cultures cellulaires exprimant (ou surexprimant) des transgènes pathologiques, clonés à partir du gène de la PrP de sujets souffrant d'EST familiale, ou des xeno-gènes, - 2 -miment les maladies héréditaires correspondantes ou sont sensibles à un inoculum provenant de sujets infectés appartenant à la même espèce que les transgènes. Les lignées cellulaires transgéniques sont également utilisées comme modèle in vitro pour la recherche de molécules interagissant avec la transconformation de la PrP en PrPsc. Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans le sang et les dérivés sanguins (voir référence précédente à P. Brown). Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation de la maladie, lorsqu'elle est installée. Etant donné l'origine de certains médicaments, à savoir une provenance de matières premières biologiques d'origine humaine ou animale susceptibles d'être contaminées par un ATNC (sang, organes, os, peau, plasma, placenta ou cultures cellulaires), ou une provenance d'un procédé susceptible de contaminer la matière première (milieu de culture, facteur de croissance), l'industrie pharmaceutique cherche aujourd'hui à évaluer d'une part l'efficacité des procédés d'obtention ou de traitement des médicaments biologiques, d'autre part, celle des procédures de décontamination de matériel vis-à-vis de l'élimination des ATNC et enfin, celle des procédures de confinement. Le seul agent infectieux (c'est-à-dire capable de transmettre la maladie) connu, commun à tous les ATNC, étant la protéine prion sous forme pathogène, PrPsc, l'efficacité de ces méthodes est évaluée quant à l'élimination ou le confinement de la PrPsc. En effet, la surprenante résistance de la PrPsc empêche le recours à des procédés d'inactivation - 3 - classiquement mis en oeuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween-TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von Willebrand etc.). ART ANTERIEUR De telles méthodes d'évaluation et/ou de contrôle de l'efficacité des procédés d'obtention ou de traitement des médicaments biologiques, des procédures de décontamination de matériel vis-à-vis de l'élimination des PrPsc et des procédés de confinement nécessitent: - d'une part une méthode de titrage de la PrPsc dans le produit biologique en amont, en aval et au cours du procédé d'obtention ou de traitement ou de la procédure de décontamination - d'autre part un inoculum infectant c'est-à- dire un matériel infectieux permettant d'infecter le produit biologique ou le matériel à décontaminer, de titre infectieux connu en PrPsc, dont on pourra suivre l'évolution. On connaît en tant que méthode de titrage des PrPsc, 25 les méthodes suivantes. Généralement, les titrages d'infectiosité liés aux prions s'effectuent par inoculation intracérébrale à des animaux de laboratoire de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en PrPsc, tels que des rongeurs qui ont préalablement permis l'adaptation de souches d'EST infectant d'autres espèces animales, en particulier le hamster doré, ou des souris transgéniques exprimant une PrP de la même espèce que la PrPsc, source d'infectiosité. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux. Cependant, cette méthode présente les inconvénients d'être longue, coûteuse et 2885369 - 4 peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle. Chez le hamster doré, la période d'incubation de la Tremblante du mouton par injection intracérébrale est de 75 jours. Par ailleurs, des méthodes de titrage connues sont disponibles pour le titrage in vitro des agents infectieux des EST. Elles consistent en la détection de la PrPsc par la technique de Western-Blot (Ironside J. W. et al, J. of Thrombosis and Haemostasis, 1, 1479- 1486, 2003) ou d'ELISA. Ces techniques nécessitent une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP). En effet, les anticorps détectent le fragment de protéine prion résistant à la protéinase K appelé PrPres. Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP. Pareillement, la Demanderesse a exposé dans la demande WO 04/02179 une méthode de titrage in vitro d'un ATNC utilisant des lignées de cellules transgéniques stables supportant la réplication de la PrPsc correspondant audit ATNC et permettant d'amplifier la quantité de PrPsc présente dans le produit biologique à tester ainsi que l'utilisation d'une telle méthode de titrage dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC ou dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Cette méthode de titrage permet de calculer le titre infectieux en PrPsc d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. Les Exemples A et B de la présente demande sont des Exemples de référence permettant de rappeler la - 5 - faisabilité de la méthode de titrage de la demande WO 04/02179 et de son utilisation pour évaluer l'efficacité d'une étape de nanofiltration vis-à-vis de l'élimination de la PrPsc. Pour ce qui est du choix de l'inoculum infectant utilisable pour de telles méthodes, le choix est extrêmement limité. Jusqu'à présent une seule source d'infectiosité est 10 utilisée: un inoculum infectant est représenté par un homogénat de cerveau infecté. Le plus souvent, on utilise un homogénat de cerveaux d'animaux de laboratoire, en particulier de rongeurs, qui ont été infectés par inoculation intracérébrale de matériel infectieux. Miekka et al. divulguent l'utilisation d'un homogénat de cerveaux de hamsters infectés par la protéine scrapie 263K de hamster en tant qu'inoculum infectant d'une solution d'albumine à 25% pour évaluer l'efficacité de l'irradiation gamma quant à l'inactivation de la PrPsc de hamster tout en maintenant l'intégrité de l'albumine humaine. On peut également utiliser des préparations standards de cerveau et de rate provenant de sujets atteints du variant de la maladie de CreutzfeldJacob (vCJD) qui sont disponibles auprès du National Institute for Biological Standard and Controls (NIBSC). Elles consistent en des homogénats de tissu à 10%, aliquotés et stockés. Elles ont l'avantage d'être une source humaine de matériel infectieux. Stenland et al. ( Partitioning of human and sheep forms of the pathogenic prion protein during the purification of therapeutic proteins from human plasma , TRANSFUSION, Vol 42, Novembre 2002) ont comparé différents homogénats de cerveaux, de différentes espèces, infectés par différentes maladies, quant à leur élimination par différentes étapes de purification de protéines plasmatiques - 6 - humaines. Ils ont utilisé, en tant qu'inoculums infectants, des homogénats de cerveau: - humain infecté par le variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob (National CJD Surveillance Unit, 5 Edinburgh, Scotland) - humain infecté par la maladie de Creutzfeld-Jacob sporadique (NIH Laboratory of CNS Studies, Bethesda, MD) - humain infecté par le syndrome de Gertsmann- Stràussler-Scheinker (New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities, Staten Island, NY) - de mouton infecté par la tremblante du mouton (scrapie) (Caine Veterinary Teaching Center, 15 University of Idaho, Moscow, ID) - de hamster infecté par la souche 263K de scrapie adaptée au hamster. Les homogénats sont préparés par dispersion de 1 g de tissu dans 9 volumes de TBS (Tris Buffered Saline) 20 froid puis par homogénéisation. Ils en ont conclu que l'homogénat de cerveau de hamster infecté par la souche de prion scrapie adaptée au hamster 263K est un modèle satisfaisant pour remplacer un homogénat de cerveau humain infecté par les différents ATNC précités. Vey et al. ("Purity of Spiking Agent Affects Partitioning of Prions in Plasma Protein Purification", Biologicals, 2002, 30, 187-196) ont comparé différentes formes d'inoculums infectants de puretés différentes: homogénat de cerveau, fraction membranaire microsomale, domaine "caveolaelike" (compartiment membranaire spécialisé), PrPsc purifiée (Bolton et al. , Isolation and structural studies of the intact scrapie agent protein, Arch Biochem Biophys. 1987 Nov 1;258(2):579-90), quant à leur élimination, en titre de PrPsc, par différents procédés de purification de protéines plasmatiques. - 7 Les homogénats de cerveau sont préparés par dispersion à 10% dans du TBS froid puis homogénéisation avec un Ultra Turrax. Ils en ont conclu qu'il serait préférable d'utiliser différents inoculums infectants présentant des propriétés différentes afin de mimer au mieux l'élimination du contaminant prion théorique du sang. Le brevet US 6,020,537 divulgue l'utilisation de souris transgéniques exprimant une PrP de la même espèce que la source d'infectiosité pour fabriquer des échantillons de référence pour la détection des prions. La société Haemosan LSS GmbH (Pr Herwig Reichl) utilise la lignée cellulaire lymphocytaire SMB infectée par la souche de scrapie 139A comme surcharge expérimentale pour des expériences d'évaluation de procédés d'obtention d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC vis-à-vis de leur capacité à éliminer cet ATNC.. Cette lignée n'est pas transgénique et génère des quantités extrêmement faibles d'infectiosité, ce qui est un obstacle majeur à l'évaluation d'une étape de fabrication d'un produit d'origine biologique. PROBLEME TECHNIQUE La mise en uvre d'un homogénat de cerveau en tant qu'inoculum infectant pose des problèmes techniques de compatibilité avec les produits à tester ou avec les méthodes d'élimination/inactivation. En effet, la richesse en lipides d'un extrait cérébral peut provoquer un phénomène d'absorption du produit biologique que l'on cherche à obtenir sur des agrégats de cerveau; ou bien l'insolubilité qui en résulte peut augmenter artificiellement le facteur de réduction en PrPsc puisque le matériel infecté a alors un comportement différent d'un matériel soluble, par - 8 - exemple il peut colmater un filtre ou il peut sécher à la surface du matériel à décontaminer. Il est évidemment possible d'utiliser une dilution de l'homogénat de cerveau. Cependant, ceci est incompatible avec un titre infectieux élevé, surtout que l'homogénat est déjà préparé par dilution à 10% poids de cerveau/volume de diluant. La mise en uvre d'un homogénat de cerveau en tant qu'inoculum infectant pose également des problèmes de - temps d'incubation pour la réplication de la PrPsc - de coût en animaux - de main d'oeuvre qualifiée pour la manipulation des animaux de laboratoire - d'utilisation industrielle - de reproductibilité entre les échantillons - en parallèle de problèmes éthiques évidents dus à l'utilisation d'animaux et à leur infection volontaire. En outre, le matériel cérébral infectieux est difficile à standardiser. En effet, la dose infectieuse dans un cerveau d'animal infecté résultant de l'inoculation par voie intracérébrale d'un matériel infectieux est difficilement reproductible. C'est en particulier le cas lorsque ce matériel infectieux est lui-même un homogénat de cerveau dont on ne connaît pas la charge infectieuse. Enfin, un homogénat de cerveau semble être, à lui seul, un modèle peu adapté à une forme infectieuse potentielle dans le sang présente dans un tout autre environnement. Il semble par conséquent indispensable d'identifier une nouvelle source d'infectiosité, de titre infectieux comparable, voire supérieur, en PrPsc à celui d'un homogénat de cerveaux infectés et qui - 9 -présente des avantages résolvant d'une part les problèmes précités dus à l'utilisation d'un homogénat de cerveaux (solubilité, standardisation, conservation, reproductibilité, conditions de culture simplifiées) et permettant d'autre part son utilisation en tant qu'inoculum infectant dans des méthodes d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'une procédure de décontamination. RESUME DE L'INVENTION La Demanderesse a identifié, de manière surprenante, une telle nouvelle source d'infectiosité, synthétique, standardisée, soluble, reproductible et facile à manipuler, qui consiste en un lysat cellulaire ou surnageant de culture provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène, PrPsc, de ladite PrP, dont le titre infectieux en PrPsc est supérieur à 50%, en particulier 75%, de préférence 100%, du titre infectieux d'un homogénat de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. Le lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention peut être standardisé et stabilisé par des 25 méthodes connues de l'homme du métier. Ce lysat cellulaire ou surnageant de culture peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant: - pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC, en particulier un procédé de purification de dérivés du plasma sanguin, en particulier encore les chromatographies ou la nanofiltration. - pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC. - pour une méthode d'évaluation d'un composé inhibant l'infectiosité d'un ATNC. - 10 - Il est envisageable d'obtenir un tel inoculum infectant, de titre infectieux élevé, en quantité infinie, quelle que soit l'espèce infectée par l'ATNC, en particulier l'homme, puisque les lignées cellulaires utilisées permettent d'amplifier in vitro le matériel infectieux. La Demanderesse a identifié le seul moyen d'obtenir un matériel infectieux humain sans recourir à l'utilisation de cerveaux de patients. De la même manière, le matériel infectieux selon l'invention permet de s'affranchir de l'utilisation de collections de cerveaux ovins ou bovins infectés par la Tremblante du Mouton ou l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention concerne donc un lysat cellulaire ou surnageant de culture provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène, PrPsc, de ladite PrP, dont le titre infectieux en PrPsc est supérieur à 50%, en particulier 75%, de préférence 100%, du titre infectieux d'un homogénat à 10% de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. L'utilisation de telles cellules transgéniques stables selon l'invention présente de nombreux avantages, notamment celui d'une production indéfinie et d'un matériel immédiatement disponible puisqu'il est excrété dans le surnageant de culture. Vilette et al. (PNAS, Mars 2001, 98(7), 4055-4059) ont montré que des cellules épithéliales de lapin, transgéniques et stables, exprimant la PrP ovine (transgène), sont capables de répliquer la PrPsc ovine après infection par des extraits contenant de la PrPsc ovine. Le modèle cellulaire qu'ils ont construit, la lignée Rov9, exprime de façon inductible la PrP exogène, ce qui garantit son maintien lors de la période d'incubation nécessaire à l'accumulation de la - 11 - PrPsc dans ces cellules mises en contact avec un matériel infectieux. De telles cellules transgéniques stables supportant la réplication d'une PrPsc sont susceptibles d'être utilisées pour produire le matériel infectieux selon l'invention. Archer et al. (Journal of Virology, Jan. 2004, p. 482-490) ont construit un autre type de lignée cellulaire stable supportant la réplication d'une PrPsc. Leur modèle consiste en des cellules gliales murines exprimant la PrP ovine et supportant la réplication de la PrPsc ovine, les cellules MovS. Ces cellules se sont révélées être particulièrement satisfaisantes pour produire le matériel infectieux selon l'invention. L'homogénat à 10% de cerveaux d'animaux infectés par une PrPsc, dont le titre infectieux sert de référence au titre infectieux en la même PrPsc du lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention, est dilué à 10%, par exemple dans un tampon isotonique, par exemple du TBS ou du PBS. Il est ensuite homogénéisé dans ce diluant, par exemple par un Ultraturrax. Les cerveaux d'animaux sont dits infectés par une PrPsc lorsque cette infection a été confirmée par examen histopathologique et/ou détection de la PrPres par immunohistochimie et que lesdits animaux ont développé les symptômes de l'ATNC correspondant à ladite PrPsc. En particulier, les cerveaux d'animaux infectés par une PrPsc peuvent provenir d'animaux morts d'une pathologie liée à un ATNC ou proches de la mort et sacrifiés, l'infection du cerveau par la PrPsc ayant été confirmée par histopathologie et/ou immunohistochimie. Le titre infectieux peut être déterminé par la méthode 35 de titrage décrite dans la demande internationale WO 04/02179 déposée par la Demanderesse. - 12 - Le titre infectieux peut également être déterminé par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Par exemple, des dilutions sériées du matériel à titrer sont injectées par voie intracérébrale à des animaux infectables par la PrPsc à titrer, ceci à raison d'une dilution du matériel par groupe d'animaux. Suivant le temps d'incubation de la maladie dans chaque groupe d'animaux et le nombre d'animaux atteints, on peut en déduire un titre infectieux par des méthodes statistiques connues de l'homme du métier comme la méthode Spearman-Kârber. De manière avantageuse, le lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention peut être standardisé en unités infectieuses par dose. En outre, il peut être stabilisé par congélation, séchage, lyophilisation, atomisation, en présence éventuellement de substances connues de l'homme du métier et destinées à éviter une perte du titre infectieux selon le mode de stabilisation mis en oeuvre. Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout ATNC, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ mis en évidence chez des sujets jeunes, ou bien encore ceux responsables chez les animaux de la tremblante ovine ou de l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline. Le terme protéine prion représente la protéine signature d'un ATNC, exprimée sous forme normale, PrP, chez les individus d'une espèce donnée susceptibles d'être contaminés par cet ATNC, et sous forme pathogène, PrPsc, chez les individus de la même espèce infectés par cet ATNC. Cette protéine est l'élément porteur d'infectiosité retrouvé dans tous les cas d'infections par un ATNC, en particulier dans le cerveau, c'est-à-dire qu'elle est capable de provoquer les symptômes de l'ATNC par inoculation intracérébrale chez un individu sain. - 13 - Le lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention présente en particulier un titre infectieux >_ 4, de préférence 5, de manière plus préférée >_ 6, de manière particulièrement préférée >_ 7 log TCID50/ml. En particulier, la PrPsc infectieuse présente dans le lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention est d'origine ovine, bovine ou humaine. De préférence, elle représente la protéine prion ovine de la tremblante du mouton ou la protéine prion humaine du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob. Un mode particulier de réalisation de l'invention consiste à comparer le titre infectieux du lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention à un homogénat de cerveaux d'animaux d'une espèce donnée infectés par une PrPsc de la même espèce, par exemple un homogénat de cerveaux de moutons infectés par la PrPsc ovine de la tremblante du mouton, un homogénat de cerveaux de hamsters infectés par la PrPsc de la souche 263K adaptée aux hamsters, un homogénat de cerveaux de bovins infectés par la PrPsc bovine de l'encéphalopathie spongiforme bovine (BSE) , un homogénat de cerveaux de patients humains infectés par la PrPsc humaine du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob (vCJB). Selon un autre mode particulier de l'invention, le titre infectieux du lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention est comparé à un homogénat de cerveaux d'animaux transgéniques exprimant en tant que transgène une PrP d'une espèce donnée et infectés par une PrPsc de la même espèce, par exemple un homogénat de cerveaux de souris transgéniques exprimant la PrP ovine et infectés par la PrPsc ovine. Ces animaux transgéniques peuvent être des knock- out (délétés sur les deux allèles) pour le gène de la PrP de leur propre espèce. De manière avantageuse, le lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'invention provient de cellules épithéliales de lapin, en particulier des cellules épithéliales de lapin de la lignée Rov9 - 14 - (Vilette et al.) ou de cellules gliales murines, en particulier des cellules gliales murines de la lignée MovS6 (Archer et al.) . L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux selon l'invention en tant qu'inoculum infectant dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un agent transmissible non conventionnel (ATNC). Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée: en ce qu'on inocule le matériel infectieux selon l'invention au produit biologique pour mimer une infection - et en ce qu'on applique au produit biologique infecté artificiellement par le matériel infectieux selon l'invention, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre 20 infectieux en PrPsc obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction en PrPsc. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique. En particulier, un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique est un procédé d'obtention ou de purification de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguin, utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration, en particulier les chromatographies décrites dans le brevet EP 0 359 593 et dans la demande de brevet WO 02092632. L'invention concerne également l'utilisation du - 15 - matériel infectieux selon l'invention en tant qu'inoculum infectant dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Dans ce cas, on infecte artificiellement le matériel à décontaminer par la méthode de décontamination à tester. Pour cela, on met en contact le matériel infectieux selon l'invention, de titre infectieux connu, avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine le titre d'un échantillon prélevé sur le matériel décontaminé ayant subi la procédure de décontamination. Celui-ci est comparé au titre infectieux initial du matériel infectieux selon l'invention pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie. La procédure de décontamination peut, par exemple, être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude. L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux selon l'invention en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation d'un composé inhibant l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, la capacité infectieuse en un ATNC du matériel infectieux selon l'invention est testée en présence ou non du composé susceptible d'inhiber l'infectiosité dudit ATNC. L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux selon l'invention en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de confinement de matériel infectieux, en particulier une procédure et un équipement de type P3. - 16 - Exemple A de référence: Titrage d'infectiosité de la PrPsc PG127 par titrage in vitro sur cellules Mov S6 Pour étudier la faisabilité d'un système de titrage in vitro de l'infectiosité liée aux ATNC, les cellules MovS6 (Archer F. et al. 2004) ont été sélectionnées comme cellules supportant la réplication des ATNC, et la souche de Scrapie PG127 adaptée aux souris transgéniques Tg301 a été utilisée comme source d'infectiosité (Vilotte JL et al., Journal of Virology, Vol. 75, n 13, p.5977-5984, 2001) . L'inoculum consistait en un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127 c'est-à-dire par un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveau de mouton PG127/98 (Veterinary Laboratory Agency, Addelstone, UK) (cf. Vilotte JL et al., Journal of Virology, Vol. 75, n 13, p.5977-5984, 2001, Matériel et Méthodes). Les cellules Mov S6 étaient cultivées en milieu DMEM + HamF-12 complémenté en glutamine et sérum de veau foetal. Les plaques de titragesétaient préparées 24 heures avant l'inoculation. Les cellules étaient ensemencées à raison de 40.000 cellules par puits pour un format 96 puits (expérience n 1), et 100.000 cellules pour des plaques de 24 puits (expérience n 2 et 3). Des dilutions sériées de l'homogénat de cerveaux de souris étaient préparées avec du milieu de culture, les pas de dilutions étaient de 10 en 10 (expériences n 1 et n 2), ou de 5 en 5 (expérience n 3). Pour chaque dilution de l'inoculum 5 puits de plaque de culture étaient infectés. Les cellules étaient mises en contact avec un certain volume d'inoculum (50 à 150 l) pour une période allant de 12 heures à 4 jours. Le Tableau 1 récapitule les conditions expérimentales d'inoculation et d'expansion des cellules spécifiques à chaque expérience. L'inoculum était jeté et remplacé par du milieu de culture neuf puis les cellules étaient maintenues en culture 72h jusqu'au premier passage au cours duquel - 17 - un changement de format de plaque de culture était réalisé afin de garder la moitié (expérience n 1), ou la totalité des cellules infectées (expériences n 2 et 3). Lors de la poursuite de la culture cellulaire, le milieu de culture était changé une fois par semaine et les cellules repiquées avec un rapport de 1 sur 10, permettant d'effectuer des analyses sur 90 % des cellules à chaque passage. Les cellules récupérées à chaque passage étaient congelées sous forme de culots cellulaires, et conservées à --80 C jusqu'à leur analyse par la méthode de Western Blot pour détecter la PrPsc. Chaque culot cellulaire était traité 2 heures à 37 C par la Benzonase (250 unités) dans un volume de 50 l. Les lysats cellulaires étaient ensuite traités par la Protéinase K, dénaturés puis analysés par électrophorèse en gel de poly- acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les protéines ayant migré dans le gel étaient transférées sur une membrane de nitrocellulose par électro-transfert. La PrPsc présente sur les membranes était détectée par incubation avec l'anticorps 6H4 (Prionics) puis un anticorps secondaire marqué (anticorps de chèvre dirigés contre des anticorps de souris). Les membranes marquées étaient révélées par chemi- luminescence. Un échantillon était considéré comme positif si le profil électrophorétique des trois formes de PrPsc glycosylée était visible sur les autoradiogramme. Pour chaque analyse par Western Blot, des témoins négatifs (cellules MovS6 non infectées) :30 étaient traités en parallèle des échantillons. A chacun des passages cellulaires, l'ensemble des puits de plaques de culture était testé. Lorsque l'ensemble des réplicats de cultures cellulaires inoculées avec une dilution donnée de l'inoculum était retrouvé positif pour la PrPsc lors de deux passages successifs, ces cultures n'étaient plus testées lors des passages suivants. Le titre d'un échantillon était calculé à la fin de la culture cellulaire par la - 18 méthode de Spearman Kârber (Schmidt NJ and Emmons RW, Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection 1989, 6th Edition). Tableau 1. Conditions expérimentales des expériences de titrage in vitro de l'infectiosité liée aux ATNC. Paramètres Expérience Expérience Expérience. n 1 n 2 n 3 Format de Microplaque Plaque 24 Plaque 24 culture pour 96 puits puits puits l'inoculation Densité 40 000 100 000 100 000 cellulaire d'ensemencement (cellules/puits) Volume de 50 1 100 150 l'inoculum ( l) (100 l dilué dans 1 ml de milieu frais) Durée mise en 12 96 24 contact primaire (heures) Ajout de milieu 0,2 1 1 frais (ml) (inoculum jeté) Incubation,puis 24 72 secondaire 48 en (heures) Id'inoculum présence dilué, 48 avec du milieu frais. - 19 - Pourcentage de 50 % 100 % 100 % cellules repiquées au ler passage (changement de format 6 puits) Résultats Expérience n 1 Les dilutions de l'homogénat de cerveaux de souris infectées par la souche de Scrapie PG127 testés étaient de 10-1 à 10-6. Au passage n 3, aucun puits de culture cellulaire ne présentait de PrPsc. Au passage n 4, 100 % des puits ayant été inoculés avec les dilutions 10-1 à 10-3 de l'inoculum étaient positifs pour la PrPsc, et 75 % des cultures infectées par la dilution 10-4 étaient positives. Au passage n 5, 25% des puits inoculés à la dilution 10-5 étaient positifs, aboutissant à l'établissement d'un titre de 6,05 log de dose infectieuse 50% (TCID50) par ml selon la méthode de Spearman Karber. Le titre du stock n'augmentait pas lors des passages cellulaires suivants. Expérience n 2 Le Tableau 2 résume les résultats obtenus lors de l'expérience n 2, et permet de constater à nouveau l'évolution du pourcentage de positivité de chacun des réplicats de culture infecté par chacune des dilutions de l'inoculum (de 10-3 à 10-7). On peut constater que le délai d'apparition de la PrPsc dans les cultures est inversement proportionnel à la dose d'infectiosité avec laquelle les cultures ont été inoculées. Ainsi les cultures ayant reçu la dilution 10-3 de l'inoculum présentaient de la PrPsc dès le passage n 2, alors qu'il fallait attendre un passage supplémentaire pour que 100 % des cultures ayant reçu la dilution 10-4 - 20 - soient positifs. Le titre de l'inoculum calculé pour cette expérience était de 5,5 TCID50/ml. Tableau 2. Résultats de l'expérience de titrage n 2. Nombre de cultures infectées selon Passage la dilution inoculée Titre n (log TCID50/ml) (puits infectés/puits inoculés) 10-3 104 105 10-6 10-7 Témoin nég. 1 NT NT NT NT NT NT 2 5/5 1/5 10/5 0/5 0/5 0/5 4,7 3 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,5 4 NTa 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,5 NTa NTa 1 0/5 0/5 0/5 0/5 5; 5 6 NTa NTa 0/5 0/5 0/5 0/5 5,5 NT: Non testé, car 100 % des cellules sont ensemencées NTa. Non testé, car 100% positif pour les deux passages précédents. Expérience n 3 Le Tableau 3 résume les résultats obtenus lors de l'expérience n 3. Pour cette expérience, le pas de dilution dé l'inoculum était réduit à 1/5, et les dilutions testées étaient de 10-4 à 10-6,8. Le titre maximum étaient obtenu au passage n 6, et le titre calculé était de 6,43 TCIDS0 /ml. - 21 - Tableau 3. Résultats de l'expérience n 3. Nombre de cultures infectées selon la Passage dilution inoculée Titre n (log TCID50/ml) (puits infectés / puits inoculés) 10-4 10-4'7 10-5'4 106'1 10-6'8 Témoin nég. 1 NT NT NT NT NT NT 2 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 4,6 3 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,6 4 5/5 5/5 3/5 0/5 ' 0/5 0/5 6,3 NTa 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5 6, 3 6 NTa NTa 4/5 0/5 0/5 0/5 6,4 7 NTa NTa 4/5 0/5 0/5 0/5 1 6,4 NT: Non testé, car 100% des cellules sont ensemencées NTa: Non testé, car 100% positif pour les deux 5 passages précédents. Les résultats de ces trois expériences réalisées démontrent la faisabilité d'un titrage in vitro en TCID50 de l'infectiosité liée aux ATNC. Exemple B de référence Calcul d'un facteur de réduction associé à une étape de purification d'un médicament biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC Pour cette expérience, une étape de nanofiltration était choisie comme exemple d'une étape de procédé de fabrication d'un produit biologique. Le filtre choisi était un filtre PLANOVA 15 N (ASAHI KASEI) d'une porosité de 15 nm et d'une surface de 0,01 m2. Le produit à filtrer choisi était de l'albumine humaine à 0,2 g/l, dans du tampon citrate trisodique dihydrate 0,01 M, glycine 0,12 M, L-lysine (monochlorure) 0,016 M, chlorure de calcium dihydrate 0,OO1M, chlorure de sodium 0,17 M, osmolarit,é 490-510 mosmol/kg, pH 6,90-7,10. La nanofiltration était - 22 - effectuée sous une pression de 500 100 mbar, à 25 C. Le filtre était équilibré avant la nanofiltration du produit avec 40 ml de tampon de dilution de l'albumine humaine. Un volume de 30 ml de produit à filtrer, expérimentalement surchargé à 4 % avec de l'homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées par la souche de Scrapie PG127 était filtré, puis un volume de 10 ml de tampon d'équilibrage était filtré pour faire sortir le produit du filtre. Deux expériences de nanofiltration étaient réalisées afin de conforter la reproductibilité de l'étape. Le produit à filtrer surchargé expérimentalement était préparé en quantité suffisante pour prélever une fraction aliquote destinée à quantifier l'infectiosité présente dans le produit avant la nanofiltration. Un volume total d'environ 40 ml de filtrat était récupéré en aval de la nanofiltration, et titré afin de déterminer la quantité d'infectiosité dans le produit après la nanofiltration. Le matériel de départ surchargé expérimentalement, ainsi que le produit filtré étaient dilués au 1/3 dans du milieu de culture avant d'être conservés à -80 C en l'attente de leur titrage. Les échantillons étaient titrés selon les conditions expérimentales de l'expérience n 3 décrite dans le premier exemple. Pour les échantillons de filtrats dont on attendait qu'ils ne présentent pas ou très peu d'infectiosité résiduelle, la plus petite dilution de l'échantillon non cytotoxique a été incoculée sur dix réplicats, et les dilutions suivantes sur 5 réplicats comme précédemment décrit. Le Tableau 4 résume les résultats des titrages des quatre échantillons générés durant cette expérience de nanofiltration. Les échantillons de matériel de départ surchargé 35 présentaient des titres de 4,67 log TCID50 /ml pour les essais 1 et 2. Aucune infectiosité résiduelle n'était détectée dans les échantillons de filtrats. La charge de ces échantillons était calculée selon la loi - 23 -de Poisson à 0,28 log TCIDS0 /ml à partir du volume de la plus petite dilution de l'échantillon inoculée. La charge totale présente dans les échantillons était calculée en multipliant leur charge par leur volume respectif, et le facteur de réduction était calculé en divisant la charge présente dans le matériel de départ, ou échantillon initial, avant la nanofiltration par celle présente dans les filtrats. Les facteurs de clairance étaient calculés à partir de la quantité calculée d'infectiosité ajoutée dans la surcharge expérimentale. La différence entre le facteur de clairance et le facteur de réduction permet de mettre en évidence, quand elle est supérieure à un log, l'interférence du produit de départ sur la capacité du système de titrage à détecter de l'infectiosité dans ce produit. Le Tableau 5 résume ces calculs. Les facteurs de réduction associés à l'élimination de l'infectiosité présente dans le broyat de cerveau ayant servi à surcharger le matériel de départ étaient de >_ 4,24 et > 4, 22 log pour les essais 1 et 2 respectivement. Aucune interférence du matériel de départ n'était mise en évidence par le calcul des facteurs de clairance. - 24 - Tableau 4. Résultats des titrages des échantillons générés lors de l'évaluation d'une étape de nanofiltration. Echantillon Dernières nombre de Titre dilutions cultures (log positives infectées/nombre TCID50/ml) de cultures inoculées Echantillon 1/9375 5/5 5,15 initial 1/46875 0/5 essai 1 Filtrat Pur 0/15 Echantillon Titre Volume Charge Facteur Facteur (log (ml) totale de de TCID50/ml) (log Clairance Réduction TCID50) (log)1 (log)2 Stock de 6,43 1, 213 6,51 départ essai 1 !Echantillon 4,67 30 6,63 !initial essai 1 - 25 Filtrat 2: calculé à partir de la charge initiale mesurée dans le matériel de départ. 3: volume prenant en compte le prélèvement de la fraction aliquote destinée au titrage de l'échantillon initial. 4: pas d'infectiosité détectée: limite de détection calculée par la loi de Poisson Exemple 1: Titrage d'un lysat de cellules MovS6 infectées par la souche PG127 en utilisant la méthode de titrage selon l'Exemple 1 On utilise la méthode de titrage de l'Exemple 1 avec 15 les conditions expérimentales de l'expérience 3. Seul diffère l'inoculum infectant. On utilise en tant qu'inoculum infectant un lysat cellulaire de cellules Mov S6 infectées selon l'Exemple 1 par un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127. Des dilutions sériées de 10 en 10, de 10-4 à 10-8, sont utilisées pour infecter 5 puits de plaque de culture par dilution. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6. - 26 - Tableau 6: Titrage d'un lysat de cellules MovS6 infectées par la souche PG127 Passage Nombre de cultures infectées selon Titre n la dilution inoculée (log (puits infectés/puits inoculés) TCID50/ml) 10-4 105 10-6 10-7 10-8 Témoin nég. 1 NT NT NT NT NT NT 2 ND ND 0/5 0/5 0/5 0/5 ND 3 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,92 4 5/5 5/5 2/5 1/5 0/5 0/5 6,92 NTa NTa 4/5 3/5 i 0/5 0/5 7, 72 6 NTa NTa 5/5 3/5 0/5 0/5 7,92 7 NTa NTa 5/5 3/5 0/5 1 0/5 7,92 J ND: non déterminé pour cause de problème technique NTa: Non testés, car 100 % positif pour les deux passages précédents NT: Nontestés, car 100% des cellules ont été reensemencées Exemple 2: Titrage d'un surnageant de culture de cellules MovS6 infectées par la souche PG127 en utilisant la méthode de titrage selon l'Exemple 1 On utilise la méthode de titrage de l'Exemple 1 avec les conditions expérimentales de l'expérience 3. Seul diffère l'inoculum infectant. On utilise en tant qu'inoculum infectant un surnageant de culture cellulaire de cellules Mov S6 infectées selon l'Exemple 1 par un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127. Des dilutions sériées de 3 en 3, de 1/3 à 1/2187, sont utilisées pour infecter 5 puits de plaque de culture par dilution. Les résultats sont présentés dans le Tableau 7. - 27 - Tableau 7: Titrage d'un surnageant de culture cellulaire de cellules MovS6 infectées par la souche PG127 Nombre de cultures infectées selon la Passage dilution inoculée Titre n (log TCID5 0/ml) (puits infectés/puits inoculés) 1/27 1/81 1/243 1/729 1/2187 Témoin nég. 31 5/5 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2,68 4 5/5 4/5 2/5 2/5 0/5 0/5 3,35 NT 5/5 4/5 2/5 0/5 0/5 3,54 6 NT 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 3,64 7 NT NT 5/5 3/5 0/5 0/5 3, 73 1: au 3ème passage, tous les réplicats des dilutions 1/3, 1/9 et 1/27 étaient positifs. Les passages précédents n'ont pas été testés NT: Non testés, car 100 % positif pour les deux passages précédents. Exemple 3: Comparaison des titres en PrPsc et en infectiosité Les titres infectieux sont résumés dans le Tableau 8 à partir des Tableaux 3, 6 et 7. Par ailleurs, la technique du Western-Blot selon l'Exemple 1 a été utilisée afin de quantifier la PrPsc dans les inoculums de départ: homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127, lysat cellulaire de cellules Mov S6 infectées selon l'Exemple 1 par un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127 et surnageant de culture cellulaire de cellules Mov S6 infectées selon l'Exemple 1 par un homogénat à 10% (poids/vol) de cerveaux de souris infectées à 100 mg/ml par la souche de scrapie PG127. Pour ce dernier, 28 - une étape de concentration de la PrPsc par ultracentrifugation était nécessaire pour sa détection. Des dilutions sériées de chaque inoculum ont été réalisées en tampon de charge du gel SDS-PAGE. La première dilution de l'inoculum ne présentant plus de signaux spécifiques de la PrPsc était considérée comme contenant une unité Western-Blot. Le titre de l'inoculum en PrPsc est calculé comme l'inverse de la dilution limite, en prenant en compte le volume de chaque échantillon de chaque dilution déposé dans le gel. Tableau 8. Inoculum Titre en Titre infectieux PrPsc par par titrage in Western-Bloc vitro (log unité (TCID50/ml) WB/ml) Homogénat de 5,86 6,43 cerveaux de souris infectées par PG127 Lysat de cellules 5,86 7,92 Mov S6 infectées Surnageant de 2,16 3,73 culture de cellules MovS6 infectées -29 - REVENDICATIONS 1. Lysat cellulaire ou surnageant de culture provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène, PrPsc, de ladite PrP, dont le titre infectieux en PrPsc est supérieur à 50% du titre infectieux d'un homogénat à 10% de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. 2. Lysat cellulaire ou surnageant de culture provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène, PrPsc, de ladite PrP, dont le titre infectieux en PrPsc est supérieur à 75% du titre infectieux d'un homogénat à 10% de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. 3. Lysat cellulaire ou surnageant de culture provenant de cellules transgéniques stables exprimant une protéine prion PrP et supportant la réplication de la forme pathogène, PrPsc, de ladite PrP, dont le titre infectieux en PrPsc est supérieur au titre infectieux d'un homogénat à 10% de cerveaux d'animaux infectés par ladite PrPsc. 4. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par un titre infectieux 4 log TCID50/ml. 5. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par un titre infectieux 5 log TCID50/ml. 6. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par un titre infectieux 6 log TCID50/ml. 7. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par un titre infectieux >_ 7 log TCID50/ml. 8. Lysat cellulaire ou surnageant de - 30 - culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine prion PrP exprimée par les cellules transgéniques stables supportant la réplication de la forme pathogène PrPsc est ovine, bovine ou humaine. 9. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine prion PrP est la protéine prion ovine de la tremblante du mouton. 10. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendications 8, caractérisé en ce que la protéine prion PrP est la protéine prion humaine du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob. 11. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux d'animaux d'une espèce donnée infectés par une PrPsc de la même espèce. 12. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux de moutons infectés par la PrPsc ovine de la tremblante du mouton. 13. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux de hamsters infectés par la PrPsc de la souche 263K adaptée aux hamsters. 14. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux de bovins infectés par la PrPsc bovine de l'encéphalopathie spongiforme bovine (BSE). 15. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux de patients humains infectés par la PrPsc humaine du variant de la maladie de Creutzfeld-Jacob (vCJB). 2885369 - 31 - 16. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux d'animaux transgéniques exprimant en tant que transgène une PrP d'une espèce donnée et infectés par une PrPsc de la même espèce. 17. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'homogénat de cerveaux d'animaux infectés provient de cerveaux de souris transgéniques exprimant la PrP ovine et infectés par la PrPsc ovine. 18. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, provenant de cellules épithéliales de lapin transgéniques stables. 19. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 18, provenant de cellules transgéniques stables épithéliales de lapin de la lignée Rov9. 20. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, provenant de cellules gliales murines transgéniques stables. 21. Lysat cellulaire ou surnageant de culture selon la revendication 20, provenant de cellules gliales murines transgéniques stables de la lignée MovS6. 22. Utilisation d'un lysat ou d'un surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. 23. Utilisation d'un lysat ou d'un surnageant de culture selon la revendication 22, en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé de purification de produits dérivés du plasma sanguin. 24. Utilisation d'un lysat ou d'un 15 - 32 - surnageant de culture selon la revendication 23, caractérisée en ce que le procédé de purification représente les chromatographies ou la nanofiltration. 25. Utilisation d'un lysat ou d'un surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC. 26. Utilisation d'un lysat ou d'un surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation d'un composé inhibant l'infectiosité d'un ATNC. 27. Utilisation d'un lysat ou d'un surnageant de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de confinement de matériel infectieux.