Brevet FR2883978A1 — publié le 20061006

La présente invention concerne l'utilisation de polypeptides et de polynucléotides dans le domaine du diagnostic d'infection à la bactérie Mycoplasma pneumoniae. M. pneumoniae provoque des infections respiratoires aiguës, plus fréquentes chez l'enfant à partir de 5 ans et chez l'adulte jeune. Il peut s'agir de pneumonies atypiques, d'évolution favorable, parfois associées à d'autres manifestations évocatrices (ORL, cutanées, hématologiques, neurologiques), ou plus souvent de simples trachéobronchites. Son rôle éventuel dans l'asthme est encore une hypothèse. M. pneumoniae serait responsable d'environ 15 à 20% des pneumopathies communautaires se manifestant à l'état endémique avec de petites poussées épidémiques tous les quatre à sept ans. La persistance des mycoplasmes dans les voies respiratoires (entre quelques semaines et quelques mois après le début de l'infection), contribue à la nature endémique de la maladie (Bébéar C, Bébéar C.M et de Barbeyrac B. dans Freney J, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000). M. pneumoniae pénètre dans l'organisme par voie aérienne (inhalation de gouttelettes, contact direct avec des sujets infectés) et adhère aux cellules épithéliales respiratoires. La bactérie produit à leur contact des peroxydes qui altèrent le mouvement ciliaire et produisent des lésions cellulaires ainsi qu'une réaction inflammatoire locale. Des réactions immuno-pathologiques entraînent l'apparition d'infiltrats et parfois d'auto-anticorps, dûs à la présence d'antigènes membranaires portés par M. pneumoniae identiques à certains antigènes retrouvés dans le cerveau et le pancréas (Waites Ken B, Talkington Deborah F, Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin. Microbiol. Rev., 2004). La symptomatologie respiratoire ne permet pas de différencier les infections à M. pneumoniae de celles provoquées par d'autres agents de pneumonies atypiques. Le début de la maladie est progressif après une incubation assez longue de 15 à 20 jours. La maladie se manifeste par de la fièvre, un malaise, des céphalées, des myalgies et rachialgies et, surtout, une toux sèche et opiniâtre. L'état général est peu altéré. L'examen physique est pauvre en symptômes et contraste avec l'importance des images radiologiques. L'évolution est en règle générale lentement régressive mais la convalescence est longue et la toux persistante. Des complications et localisations extra-pulmonaires sont possibles: pleurésie, éruptions cutanées, sinusites, myocardites, péricardites, atteintes articulaires, anémie hémolytique, manifestations nerveuses, infections génitales (Waites Ken B, Talkington Deborah F, Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin. Microbiol. Rev., 2004; Bébéar C., Bébéar C.M. et de Barbeyrac B. dans Freney J., Renaud F., Hansen W., Bollet C., Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000). L'absence de paroi cellulaire chez M. pneumoniae rend la bactérie insensible à la pénicilline et aux autres bêta- lactamines données habituellement en cas de pneumonie d'origine bactérienne. Cette résistance naturelle rend le diagnostic d'infection à M. pneumoniae essentiel pour que l'antibiothérapie administrée au patient soit appropriée. Les antibiotiques potentiellement actifs sont les tétracyclines, les fluoroquinolones, les macrolides et apparentés, le traitement reposant le plus souvent sur l'administration de macrolides. Il n'existe pas de test de diagnostic de référence pour la détection de M. pneumoniae. Les tests utilisés actuellement sont la culture et la Polymérase-Réaction en Chaîne (PCR) pour le diagnostic direct et les tests sérologiques (agglutinines froides, Réaction de Fixation du Complément, immunofluorescence indirecte, agglutination passive, ELISA), pour le diagnostic indirect. La culture de M. pneumoniae peut être réalisée à partir de prélèvements de gorge, d'aspirations nasopharyngées chez l'enfant et de lavages bronchoalvéolaires, mais elle est longue (2 à 3 semaines) et fastidieuse. Rarement pratiquée en routine, elle est plutôt réservée aux laboratoires de référence. Cependant, lorsqu'elle est positive, elle est spécifique à 100%. La persistance de la bactérie pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines après l'infection, des tests complémentaires, comme le dosage d'anticorps spécifiques, sont nécessaires pour confirmer le diagnostic d'une infection active. L'amplification génique par PCR, à partir de prélèvements du tractus respiratoire, est une méthode plus rapide et plus sensible que la culture (sur 100 prélèvements positifs en PCR, seulement 60 sont positifs en culture). Différents systèmes ont été proposés, amplification de séquences au hasard, amplification du gène de l'adhésine ou encore du gène codant pour l'ARN 16S. Cette approche est sensible (78-92%), permettant la détection de 10 à 100 unités formant colonies (cfu) avec une bonne spécificité (92-100%)(Loens K, Goossens H and Ieven M., Molecular Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections, J. Clin. Microbiol., 2003). Cependant, la technique n'est pas standardisée et reste très coûteuse et trop complexe à utiliser en routine dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique, aucun kit de détection n'étant commercialisé. Les sérologies sont les méthodes les plus utilisées dans le diagnostic d'infection à M. pneumoniae, notamment en cas d'absence de prélèvements. A la suite d'une infection à M. pneumoniae, le système immunitaire d'un individu non immunodéprimé répond rapidement par la production d'anticorps atteignant un pic au bout de 3 à 6 semaines pour ensuite décliner graduellement sur une période allant de quelques mois à quelques années. La production d'immunoglobulines M (IgM), spécifiques de M. pneumoniae, apparaît 7 à 10 jours après le début de l'infection. Leur mise en évidence est souvent la preuve d'une infection récente, surtout chez les jeunes enfants qui n'ont pas eu d'expositions répétées à la bactérie. Cependant, chez l'adulte ayant eu une exposition répétée, l'infection à M. pneumoniae ne provoque pas de montée rapide d'IgM et, dans ce cas, les tests sérologiques commercialisés mettant en évidence une réponse IgM peuvent être pris en défaut. De même, la réponse IgM pouvant persister pendant des mois, voire des années, le taux d'anticorps IgM ne reflète pas forcément une infection récente. Dans certains cas, la réinfection conduit à une augmentation du taux d'IgG et c'est pourquoi il est préconisé de rechercher, en parallèle, une réponse IgG et IgM. Les IgA sont produits tôt au cours de l'infection mais leur niveau de production décroît plus rapidement que celui des IgG et des IgM. Pourtant absents des test sérologiques existants, ils pourraient être de bons indicateurs d'une infection récente pour toutes les classes d'âges, même après de multiples réinfections (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor F.S. Nolte., 2001, ASM press: 1-30). Il existe différentes techniques sérologiques, souvent complémentaires, pour diagnostiquer une infection à M. pneumoniae. Les principaux tests sont la recherche d'agglutinines froides, la réaction de fixation du complément, l'immunofluorescence indirecte, les tests d'agglutination passive, et les tests ELISA. La présence d'agglutinines froides, évocatrice à un taux >64, est parfois constatée dans les infections à M. pneumoniae mais elle n'est ni constante ni caractéristique. Cette technique autrefois utilisée n'est donc plus recommandée dans la recherche d'infection à M. pneumoniae. La réaction de fixation du complément (RFC), utilisant une préparation antigénique effectuée à partir du 35 micro-organisme entier, a longtemps été utilisée. Le test mesure le taux d'IgM et d'IgG simultanément, sans les différencier. Un titre >64, est évocateur d'une infection. La technique est lourde, peu sensible et peut donner lieu à des réactions croisées ou à des résultats ininterprétables (sérums anticomplémentaires ). La recherche d'anticorps spécifiques peut se faire par immunofluorescence indirecte. Le sérum à tester, mis au contact d'antigènes de M. pneumoniae, est révélé par des anticorps anti-IgM ou anti-IgG humaines, conjugués à un fluorochrome. Cette technique peut être mise en oeuvre au moyen d'un kit commercialisé mais nécessite un microscope à fluorescence. La lecture des lames est longue et fastidieuse et l'interprétation des résultats reste délicate. Des tests d'agglutination passive pour la détection d'IgM et/ou d'IgG sont commercialisés. Ils mettent en évidence une reconnaissance par des anticorps, contenus dans le sérum du patient, d'antigènes (extraits de M. pneumoniae) fixés à des particules de latex, de gélatine ou encore d'érythrocytes dans le cas du test d'hémagglutination indirecte (IHA). La technique nécessite au moins deux sérums pour mettre en évidence une augmentation du titre d'anticorps et ne présente pas d'avantages par rapport à la technique ELISA (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D. F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor: F.S. Nolte, 2001, ASM press: 1-30). Les techniques ELISA permettent de détecter indépendamment des IgG ou des d'IgM. Des préparations d'extraits bactériens, de protéines purifiées comme l'adhésine Pl, de glycolipides ou de peptides synthétiques ont été utilisés, fixés au support solide. Le sérum des patients est incubé avec la phase solide antigénique, et des anticorps anti-IgG ou anti-IgM humaines conjugués à une enzyme réagit avec les anticorps liés à l'antigène. Le complexe est mis en évidence par l'hydrolyse d'un substrat de l'enzyme aboutissant à un produit coloré. Le choix de l'ELISA (IgM et/ou IgG) dépend de l'âge du patient et du nombre de sérums pouvant être testés. La présence d'IgM, très évocatrice chez l'enfant et l'adolescent, est plus rarement observée chez l'adulte. Il est préférable de rechercher des anticorps spécifiques sur deux sérums prélevés à 10-15 jours d'intervalle, pour mettre en évidence une séroconversion (augmentation x4 du titre d'anticorps). En résumé, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir le diagnostic d'infections à M. pneumoniae. Bien que les tests sérologiques semblent les plus adaptés, le diagnostic d'une infection active reste, dans de nombreux cas, difficile à différencier de celui d'une infection passée (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D. F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor: F.S. Nolte., 2001, ASM press: 1-30, Talkington DF, Shott S, Fallon MT, Schwartz SB and Thacker WL. Analysis of eight commercial enzyme immunoassay tests for detection of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in human serum, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2004). Les inventeurs de la présente invention ont identifié, à partir du génome de M. pneumoniae, un gène codant pour une protéine qu'ils ont appelée 2E9, de séquence polypeptidique ID SEQ N 2. La protéine appelée 2E9 est un fragment d'une protéine homologue à une protéase cytoplasmique impliquée dans la réponse au stress et retrouvée chez d'autres micro-organismes. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi 30 identifié des polynucléotides et des polypeptides dont les utilisations possibles sont décrites ci-après. Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans 35 cette description. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent, les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité, ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée. Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les 35 chaînes longues, appelées protéines. Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou aminoterminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs 1- 12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626- 646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)) . On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou la séquence peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxyterminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Par analogie, un premier polynucléotide ayant une identité d'au moins 95% avec un second polynucléotide est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides dudit second polynucléotide peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou ledit premier polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus par rapport au nombre total de nucléotides du second polynucléotide. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de M. pneumoniae et celle du polynucléotide conforme à l'invention est de coder ce polypeptide. On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène. On entend par "analogie structurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) (BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995). On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique. Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant nonnaturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide. Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. L'invention a pour objet l'utilisation, in vitro, de la protéine 2E9, d'une partie ou de variants de cette protéine, de cellules hôtes comprenant des vecteurs incluant un polynucléotide codant pour la protéine 2E9 ou un variant de la protéine 2E9, dans la production d'anticorps et le domaine du diagnostic in vitro de Mycoplasma pneumoniae. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic et une composition pharmaceutique. Utilisation des polypeptides La présente invention a pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le domaine du diagnostic in vitro d'infections à Mycoplasma pneumoniae, d'un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine 2E9), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention vise également l'utilisation d'un polypeptide comprenant: a) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2. Ainsi, des polypeptides conformes à l'invention peuvent comprendre des variants de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Le diagnostic in vitro d'une infection à Mycoplasma pneumoniae est effectué, par exemple, par des tests classiques de réactions immunologiques, tels que ELISA ou Western Blot. Ces tests utilisent l'un des polypeptides selon l'invention qui vient se fixer, de manière spécifique, aux anticorps sériques contre Mycoplasma pneumoniae présents dans les échantillons biologiques. Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polypeptide préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide. De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide selon l'invention et la traduction d'un polypeptide selon l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes, telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis; des cellules de champignons, telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus; des cellules de Streptomyces; des cellules d'insectes, telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9; des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographiesur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. Utilisation des polynucléotides La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le diagnostic d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, d'un polynucléotide comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 (appelée 2E9 et extraite à partir du génome de M. pneumoniae), codant pour la protéine 2E9. L'invention vise également l'utilisation d'un polynucléotide comprenant: a) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou avec la partie de séquence telle que définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou à la partie de séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b). Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN. Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' noncodantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non- traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. Utilisations des anticorps et polypeptides selon l'invention La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'anticorps dirigés contre M. pneumoniae. L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, 10 selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'antigènes de M. pneumoniae. L'invention vise, en outre, l'utilisation de polypeptides et d'anticorps selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, respectivement, les anticorps dirigés contre M. pneumoniae et les antigènes de M. pneumoniae et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum).Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention, ainsi que des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des anticorps conformes à l'invention. Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'invention ou un polynucléotide ou un vecteur recombinant ou une cellule hôte selon l'invention. Partie expérimentale A) Protocole d'obtention des antigènes Clonage de la séquence codant pour la protéine 2E9 Le gène codant pour les séquences de la protéine 2E9, qui est un antigène, est obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie M. pneumoniae (souche M129- B7, ATCC 29342) en utilisant comme couple d'amorces: É l'oligonucléotide sens contenant la séquence: 5'-CCAGCTGTAAAAAAACCAC -3' ; et É l'oligonucléotide antisens contenant la séquence: 5'- GTCCTTGCTTTCCTGCCACC -3' Chez M. pneumoniae le codon TGA code pour un tryptophane alors que ce même codon signale l'arrêt de la traduction chez Escherichia coll. Le codon TGG souligné dans l'oligoantisens code pour un tryptophane chez E. coli; cet oligonucléotide permet donc l'introduction d'une mutation silencieuse qui remplace le codon TGA sauvage présent dans la souche M129 (ATCC 29342). La production de la protéine chez E. coli est ainsi rendue possible sans arrêt de la traduction. Le fragment ainsi amplifié correspondant est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production de la protéine clonée sous contrôle d'un promoteur inductible par 1'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). La protéine clonée correspond à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Expression de la protéine 2E9 Une souche d'Escherichia coli est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C sous agitation dans 30 ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50ème dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml et incubée à 30 C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5. Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). La suspension est incubée minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C à 15500xg. Le culot est congelé à 20 C pendant au moins une nuit. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22}gym. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP- Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes [acide 2(N-morpholino) éthane sulfonique] 25 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/l. La solution est laissée au moins une nuit à 4 C puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 pl de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM pH 8,0 contenant du NaCl 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple SuperdexHR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20 C jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T. , (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par élecrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse. B) Test de diagnostic in vitro Il a été utilisé des sérums provenant de patients ayant eu une infection documentée à M. pneumoniae (collection du laboratoire; c'est-à-dire titre IgM ou titre RFC positifs). Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire). La fixation, sur la protéine 2E9 recombinante purifiée (obtenue comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western Blot soit par la technique ELISA. Protocole du test en Western blot Après transfert, sur une membrane de nitrocellulose, de la protéine purifiée 2E9, la membrane est saturée 30 minutes à l'aide d'une solution de "tampon salin phosphate" (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (soit 1/300ème) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines de chèvre (par exemple 170-6462, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés simultanément ou indépendamment, pendant une période de 30 minutes après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS contenant 3% de lait demiécrémé. Trois nouveaux lavages sont réalisés puis du phosphate de 5-bromo4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés selon les indications du fournisseur jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat "positif" correspond à une précipitation du substrat sur la membrane à la position de 2E9. Protocole du test en ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4 C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéine recombinante 2E9) dans du "tampon salin phosphate" (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure à 37 C par du PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 pl de chaque sérum positif, à la dilution 1/20ème dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25 C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps anti- immunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines de chèvre marqués à la phosphatase alcaline sont ajoutés (simultanément ou indépendamment) pendant 30 minutes à 25 C après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS- Tween contenant 5% de lait demi-écrémé. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat (phosphate de p-nitrophényle), pNPP, par exemple A-3469, Sigma) sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm de chacun des puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37 C. Résultats et interprétation Un résultat type obtenu est présenté dans le tableau ci-après, sachant que les sérums dits "positifs" dans ce tableau sont ceux contenant des anticorps contre M. pneumoniae identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention par ELISA: Tableau de résultats du test en ELISA Nombre de sérums de malades 36 infectés par M. pneumoniae, diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Sérums "positifs" en 16, soit 44 % utilisant des anti-IgM comme anticorps secondaires parmi les 36 testés Sérums de donneurs de sang 48 comme témoins Sérums "positifs" parmi les 1, soit 2 0 % 48 testés Des résultats significatifs peuvent être obtenus en utilisant des anticorps anti-IgA, comme anticorps secondaires. Le test est aussi applicable avec des anti-IgG comme anticorps secondaire. De même des résultats similaires peuvent être obtenus par Western Blot. D'après le Tableau, on constate que, par le test ELISA ou par le test Western blot, on identifie in vitro au moins 44 % des infections à M. pneumoniae, grâce à l'antigène selon l'invention. Il est donc démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0, 05) vis-à-vis de la protéine 2E9 au cours des infections à M. pneumoniae et, d'autre part, que la protéine 2E9 est pertinente pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection. REVENDICATIONS 1. Utilisation pour détecter, in vitro, la présence d'anticorps à Mycoplasma pneumoniae dans des échantillons biologiques: a) du polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) d'une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou c) d'une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide et par isolement dudit polypeptide du milieu de culture. 3. Utilisation selon la revendication 2, quand elle dépend de la revendication 1 point a), caractérisée en ce que le polynucléotide est de séquence ID SEQ N 1. 4. Utilisation pour détecter, in vitro, la présence d'anticorps à Mycoplasma pneumoniae dans des échantillons 25 biologiques: a) du polynucléotide de séquence ID SEQ N 1, ou b) d'une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) d'une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) d'une séquence polynucléotidique complémentaire à 35 une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c). 5. Utilisation d'anticorps pour détecter, in vitro, la présence d'antigènes Mycoplasma pneumoniae dans des échantillons biologiques, caractérisée en ce que les anticorps sont immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2. 6. Kit pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides ou l'un desdits polynucléotides codant pour lesdits polypeptides. 7. Kit pour l'utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps. 8. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant à titre de principe actif au moins: a) un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou c) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 9. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant à titre de principe actif au moins: a) un polynucléotide de séquence ID SEQ N 1, ou b) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même 30 fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) une séquence polynucléotidique complémentaire à une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c) ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.