Brevet FR2883296A1 — publié le 20060922

PROCEDE ET DISPOSITIF PERMETTANT D'ISOLER DES MICROORGANISMES La présente invention se rapporte à l'isolement des 5 microorganismes. Nombre de microorganismes se développent en synthétisant un biofilm. Outre les bactéries les champignons, les algues, les protozoaires s'organisent également en biofilms. Les biofilms sont donc omniprésents dans de nombreux domaines, présentant des risques sanitaires et causant des dommages relativement importants,. Lorsqu'un biofilm se développe, il y a d'abord adhésion des bactéries sur un support puis colonisation de ce support. Les bactéries en se multipliant forment rapidement un film constitué par des strates de corps cellulaires sécrétant une gangue d'exopolysaccharide qui les protège des agressions du milieu environnant (Costerton et al. Bacterial Biofilms. Sciences1999; 284-6). La cinétique de formation d'un biofilm peut être subdivisée en 5 étapes (figure 1): - Conditionnement de la surface: Les molécules organiques ou minérales présentes dans la phase liquide vont s'adsorber sur la surface, pour y former un film conditionnant . - L'adhérence ou adhésion réversible: Les microorganismes présents se rapprochent des surfaces par gravimétrie, mouvements browniens ou par chimiotactisme s'ils possèdent des flagelles. Au cours de cette première étape de fixation, faisant intervenir uniquement des phénomènes purement physiques et des interactions physico-chimiques faibles, les microorganismes peuvent encore être facilement décrochés. - L'adhésion: Cette étape plus lente fait intervenir des interactions de plus forte énergie ainsi que le métabolisme microbien et les appendices cellulaires du microorganisme (flagelles, pilis,....). L'adhésion est un phénomène actif et spécifique. Les premiers colonisateurs vont s'attacher de manière irréversible à la surface grâce notamment à la synthèse d'exopolysaccharides (EPS). Ce processus est relativement lent et dépend des facteurs environnementaux et des microorganismes en présence. La maturation du biofilm (développement et colonisation de la surface) : Après avoir adhéré à une surface, les bactéries se multiplient et se regroupent pour former des microcolonies entourées de polymères. Cette matrice de polymères (ou glycocalyx) va agir comme un ciment et renforcer l'association des bactéries entre-elles et avec la surface pour finalement former un biofilm et atteindre un état d'équilibre. Le biofilm se développe généralement en une structure tridimensionnelle qui constitue un lieu de confinement. Ce micro-environnement va être le siège de nombreuses modifications physiologiques et moléculaires par rapport au mode de croissance planctonique. Le biofilm ainsi formé va occuper toute la surface qui lui est offerte si les conditions le lui permettent. Généralement la maturation du biofilm est corrélée à la production d'EPS même si certaines espèces de microorganismes ne synthétisant pas ou peu de polymères peuvent également adhérer et former des biofilms sur des surfaces. Décrochement: Les biofilms sont des structures en perpétuel équilibre dynamique et évoluent en fonction du support, des microorganismes, et de l'environnement. Cette évolution peut se traduire par des décrochements de cellules ou d'agrégats. Selon la présente invention, la propriété d'adhésion, de fixation des microorganismes est utilisée pour permettre l'isolement de ceux-ci. Le principe de l'invention consiste à ajouter dans un prélèvement brut, plus ou moins liquide d'un milieu dont on veut étudier la contamination par un microorganisme des particules, particulièrement des billes, magnétiques ou magnétisables, à laisser les billes en contact avec le milieu pendant un temps suffisant à l'adhésion des microorganismes à la surface des particules, à isoler lesdites particules du milieu par tout moyen approprié, particulièrement à 'aide d'un aimant et à étaler lesdites particule sur un milieu de culture solide adéquat afin de réaliser une culture desdits microorganismes piégés avec les particules. Ainsi l'invention à pour objet un procédé d'isolement d'au moins un microorganisme à partir d'un milieu les contenant, comprenant les étapes suivantes: a) introduction dans un prélèvement dudit milieu 20 d'une quantité donnée de particules magnétiques ou magnétisables b) incubation des particules et du milieu pendant un temps suffisant à l'adhésion des microorganismes à la surface desdites particules; c) séparation desdites particules du milieu d) étalement desdites particules sur un support compatible avec le développement des microorganismes; e) incubation desdites particules sur un support pendant un temps suffisant au développement de colonies correspondant au microorganisme isolé. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut comprendre une étape préalable de pré-culture du prélèvement dudit milieu contenant le microorganisme que l'on veut isoler. Pour cela on porte ledit prélèvement à une température compatible avec la viabilité des microorganismes. On sait parfaitement qu'outre les organismes vivants à des températures classiques (20 à 50 degrés Celsius), il existe des microorganismes vivants dans des conditions extrêmes en températures, en pression partielle de gaz (Oxygène, Azote, gaz carbonique, ...), en salinité, en pH (acide, basique), en conditions d'oxydoréductions, en conditions aérobies ou anaérobies. Dès Lors, l'Homme du Métier adaptera la température de culture aux exigences de l'organisme qu'il cultive. De la manière la plus courante, les températures de culture peuvent être comprises entre 20 et 50 degrés Celsius, de préférence entre 30 et 40 degrés Celsius. Cette étape de préculture qui a pour objectif d'enrichir le milieu de culture en microorganismes peut s'effectuer pendant un temps très variable en fonction des microorganismes, qui peut-être compris entre 20 minutes et 7 à 10 jours, de préférence entre 1 et 48 heures, éventuellement sous agitation. Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut comprendre une étape supplémentaire intercalée entre les étapes c) et d) du procédé selon l'invention, consistant en l'immersion facultative des billes obtenues à l'étape c) dans une solution de rinçage avantageusement aqueuse permettant d'éliminer le précédent milieu et permettant d'éliminer les microorganismes non adhérents (présents dans le liquide d'imbibition des billes). Cette étape permet de sélectionner les microorganismes les plus adhérents, dont l'adhésion est la plus irréversible. Cette étape peut aussi être l'occasion de traitements rapides ou prolongés pour tester les propriétés d'adhésion des microorganismes (traitements préventifs ou curatifs dans la solution de rinçage). L'Homme du Métier sait déterminer sans difficulté la quantité de billes qu'il introduit dans le milieu. Selon l'invention, l'incubation de l'étape b se poursuit pendant un temps qui peut être compris entre quelques secondes et quelques heures, de préférence entre 15 secondes et 45 minutes en fonction des microorganismes. Après ce temps d'incubation, les microorganismes ont pu adhérer sur les particules (billes). Selon l'invention, la séparation des particules et du milieu à l'étape c peut être réalisée selon toute méthode connue de l'Homme du Métier. Par exemple on pourrait prélever ces particules par centrifugation et élimination du milieu de culture, ou encore et préférentiellement selon l'invention, en utilisant un système générant un champ magnétique ou électrique capable d'attirer les particules, particulièrement un aimant. Selon cette forme de réalisation particulièrement préférée, les particules sont prélevées à l'aide d'un aimant qui est plongé dans le prélèvement. Selon un mode de réalisation avantageux, le système générant un champ magnétique ou électrique capable d'attirer les particules, particulièrement un aimant, peut être protégé par tout système, particulièrement un revêtement amovible ou un capot, réalisé en tout matériau, par exemple du plastique, qui n'interfère pas avec les ondes magnétiques ou électriques. Encore plus avantageusement ledit capot est jetable après utilisation. On pourrait alors réutiliser cet aimant. Selon encore un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé peut comporter une étape supplémentaire de lavage du système générant un champ magnétique ou électrique afin d'éliminer les microorganismes non adhérents présents dans le liquide de mouillage, ou les microorganismes faiblement adhérents. Au cours de cette étape supplémentaire, on plonge ledit système dans une solution de lavage qui peut par exemple être du milieu de culture stérile. L'Homme du Métier comprend que cette étape en principe ne dure pas plus de quelques secondes, tout au plus quelques minutes, le temps nécessaires à l'élimination des microorganismes nos adhérent à la surface du système. Selon l'invention, l'étalement desdites particules sur un support compatible avec le développement des microorganismes peut être réalisé par dépôt desdites particules à la surface d'un dispositif de culture de microorganisme, par exemple une boîte de Pétri contenant un milieu de culture adéquat au développement des microorganismes. Selon un mode de réalisation particulier, le dépôt peut-être réalisé en retirant l'aimant du capot plastique tout en rapprochant le capot plastique de la surface du dispositif de culture de microorganismes. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les billes peuvent être déposées en utilisant un autre aimant placé sous la surface du dispositif de culture. Pour étaler et disperser les billes, on peut utiliser tout système connu de l'Homme du Métier, comme par exemple un étaleur manuel. Selon un mode de réalisation particulier, on utilise un aimant rotatif placé sous la surface du dispositif de culture de microorganismes. La dispersion des billes peut être obtenue aussi par un vortex liquide généré par la rotation dispositif de culture 25 de microorganisme. Une fois les particules (billes) dispersées, le dispositif de culture est placé dans un incubateur pendant un temps suffisant au développement des microorganismes à la surface du dispositif. Ici l'Homme du métier adaptera le temps d'incubation et la température au microorganisme qu'il désire isoler. Ce temps peut être compris entre quelques heures et plusieurs jours, de préférence entre 4 heures et 48 heures. La température d'incubation peut être comprise entre 30 et 40 degrés Celsius. D'autres avantages de l'invention apparaîtront dans les figures annexées dans lesquelles la figure 1 représente une comparaison des méthodes 5 traditionnelles de prélèvement des microorganismes (A) et la méthode selon l'invention (B). la figure 2 représente les étapes de prélèvement et de rinçage des particules; la figure 3 représente le dépôt des particules à la 10 surface d'une boîte de Pétri; la figure 4 représente la dispersion des particules à la surface de la boîte de Pétri à l'aide d'un aimant rotatif. 8 REVENDICATIONS 1. Procédé d'isolement d'au moins un microorganisme à partir d'un milieu les contenant, comprenant les étapes suivantes: a) introduction dans un prélèvement dudit milieu d'une quantité donnée de particules magnétiques ou magnétisables; b) incubation des particules et du milieu pendant un temps suffisant au développement et à l'adhésion des microorganismes à la surface desdites particules; c) séparation desdites particules du milieu; d) étalement desdites particules sur un support compatible avec le développement des microorganismes; e) incubation desdites particules sur un support pendant un temps suffisant au développement de colonies correspondant au microorganisme isolé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape préalable de pré-culture du prélèvement dudit milieu contenant le microorganisme que l'on veut isoler, éventuellement sous agitation. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on porte ledit prélèvement à une température compatible avec la viabilité des microorganismes, particulièrement à une température comprise entre 20 et 50 degrés Celsius, de préférence entre 30 et 40 degrés Celsius. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de préculture à une durée comprise entre 20 minutes et 10 jours, de préférence entre 1 heure et 48 heures. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape supplémentaire entre les étapes c) et d), consistant en l'immersion facultative des billes obtenues à l'étape c) dans une solution de rinçage avantageusement aqueuse. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'incubation de l'étape b se poursuit pendant un temps qui peut être compris entre quelques secondes et quelques heures, de préférence entre 15 secondes et 45 minutes en fonction des microorganismes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séparation des particules et du milieu à l'étape c est réalisée par centrifugation et élimination du milieu de culture, ou encore en utilisant un système générant un champ magnétique ou électrique capable d'attirer les particules. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séparation des particules et du milieu à l'étape c est réalisée à l'aide d'un aimant. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'aimant est plongé dans le prélèvement. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le système générant un champ magnétique ou électrique capable d'attirer les particules, est protégé, particulièrement par un revêtement amovible, ou un capot. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit revêtement amovible ou capot est jetable. 12. Procédé selon la revendication 7 ou 10, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire de lavage du système générant un champ magnétique ou électrique.