Brevet FR2876706A1 — publié le 20060421

ATP-métrie pour détecter et dénombrer les virus, utilisation et procédé de mise en oeuvre à partir des nucléotides adényliques des cellules hôtes ou du patrimoine génétique des virus. Domaine de l'invention La présente invention a trait à une nouvelle technique d'ATP-métrie pour détecter et dénombrer les virus à partir des nucléotides adényliques (AN) des cellules hôtes ou du patrimoine génétique (DNA ou ARN) des virus. Elle concerne également l'utilisation de cette nouvelle technique et un procédé de mise en oeuvre à partir de cellules hôtes selon que les virus à déterminer sont lytiques (à l'issue de leur développement, ils clivent la paroi des cellules hôtes) ou non lytiques (à l'issue de leur développement, ils traversent la paroi des cellules hôtes sans la détruire), d'une part, ou à partir du DNA ou du RNA des virus selon qu'il s'agit de virus à DNA ou à RNA, d'autre part. Art antérieur On sait l'ATP-métrie, qui est fondée sur la réaction: (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons, permet de mesurer efficacement la teneur en ATP d'un milieu. Cette réaction est spécifique de l'ATP, quel que soit le système utilisé luciférine (substrat)/luciférase (enzyme). Elle permet de distinguer les cellules mortes (dépourvues d'ATP) des cellules vivantes quand celles-ci contiennent de l'ATP. Cependant l'ATP-métrie n'est pas applicable aux virus en tant que cellules, dès lors les virus sont dépourvus d'ATP, d'ADP et d'AMP intracellulaires libres. Pour leur développement, les virus utilisent l'ATP de leurs cellules hôtes. Quand ils arrivent à maturité, ils quittent leurs cellules hôtes pour aller infecter d'autres cellules. Or on sait que, à l'intérieur d'une même espèce ou variété de cellules non virales, la teneur en AN intracellulaires libres totaux est constante, eu égard à la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, voir à cet effet l'article de Champiat D. et al., Luminescence, 2001;16.193-198, où il est proposé, d'une part, de transformer l'AMP et, respectivement, l'ADP en ATP au moyen de pyruvate kinase et, respectivement, de myokinase, et d'autre part, de mesurer la lumière émise (en RLU, i.e. en unité relative de lumière) sans ajout puis après ajout de 10 L d'ATP supplémentaire. But de l'invention Il existe un besoin, qui se manifeste avec acuité, en ce qui concerne la détection et la numération des virus. On se propose donc de fournir une nouvelle solution technique mettant en oeuvre une ATP-métrie portant soit sur l'ensemble des AN libres des cellules hôtes, exprimés sous forme d'ATP, pour satisfaire ce besoin, lesdits AN étant libres extracellulairement quand le virus à tester est lytique et intracellulairement quand le virus à tester est non lytique, soit sur les AN liés au niveau du DNA ou du RNA du virus. Objet de l'invention Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) : (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase --> oxyluciférine + photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce 2 0 qu' elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, 3 0 après avoir transformé les ADP et AMP de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA- ase, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant dudit clivage, exprimée sous forme d'ATP, après 3 5 transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et 2876706 3 ADP, puis transformation des AMP et ADP totaux en ATP, ladite mesure des AN libres étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP. Selon un second aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques à partir des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. Selon un troisième aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus non lytiques à partir des 1 o AN intracellulaires libres des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP, la teneur en AN intracellulaires libres totaux des cellules infectées de la cible étant différente de celles des mêmes cellules non infectées de ladite cible. Selon un quatrième aspect de l'invention on fournit un procédé pour détecter et dénombrer les AN totaux liés qui se trouvent associés au patrimoine génétique des virus constitué par leur DNA pour les virus à DNA, ou leur RNA pour les virus à RNA, les AN liés étant libérés par action d'une DNA-ase ou RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP. Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un nécessaire de dosage pour mettre en oeuvre ledit procédé. Ledit nécessaire de dosage est caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole, de l'ATP pour l'ajout dosé, de la myokinase, de la pyruvate kinase, et le cas échéant une DNA-ase, une RNA-ase et/ou de la pyruvate orthophosphate dikinase. Ledit nécessaire pouvant en outre comporter, le cas échéant, des cellules vivantes et saines de la cible. Abréviations Par commodité, la liste des abréviations et acronymes utilisés dans la 30 présente invention a été fournie ci-après. ADP adénosine diphosphate, AMP adénosine monophosphate, AN nucléotide adénylique (autre nomenclature utilisable: adénosine nucléotide), l'ensemble des AN comprend ici les ATP, ADP et AMP, ATP adénosine triphosphate, cAMP adénosine monophosphate cyclique, dADP adénosine diphosphate dimère, dAMP adénosine monophosphate dimère, GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate, RLU unité relative de lumière. Description détaillée de l'invention Procédé mettant en oeuvre des cellules cibles On vise un procédé de détection et de numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1) : (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase -a oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (1 ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres; (2 ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible; (3 ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible; (4 ) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP; (5 ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4 ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP; (6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP; et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, par utilisation d'un système d'abaques 2876706 5 préétabli, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. En variante, la teneur en AN totaux extracellulaires est déterminée par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1 ) à (7 ) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. On vise également un procédé de détection et de numération des souches d'un virus non lytique par bioluminescence selon la réaction (1) : (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase - oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (la ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est 2 0 susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres; (2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible; (3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le 25 virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible; (4a ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP; (5a ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP; (6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction 35 (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue 2876706 6 d'ATP; et (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, et la comparer à celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (la ) à (7a ) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. En variante, la détermination de la teneur en AN totaux intracellulaires peut être réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli. On en déduit ensuite le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E). En bref les étapes (1 -(2 et (5 ) sont identiques aux étapes (la -(2a et (5a ) ; les étapes (3 ) et (6 )-(7 ) sont sensiblement analogues aux étapes (3a ) et (6a )-(7a ) ; et l'étape (4 ) est différente de l'étape (4a ). Les modalités de la mise en oeuvre des étapes identiques ou similaires seront traitées en commun. En revanche, celles des étapes respectives (4 ) et (4a ) seront traitées séparément. L'échantillon (E) est une composition liquide aqueuse, le cas échéant il peut être une composition liquide organique. Cet échantillon (E) provient d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide qui est avantageusement aqueux. La réaction (1) précitée fournit de l'oxyluciférine, des photons, de l'AMP et un ou plusieurs phosphates, principalement le pyrophosphate. Elle est spécifique de l'ATP, la luciférine et la luciférase étant à une concentration optimale, le nombre de photons émis dès que ces trois substances sont en présence, est directement proportionnel à la quantité d'ATP. Dans l'organisme et tout milieu réactionnel, l'ATP extracellulaire disparaît relativement rapidement, soit par réutilisation, soit 3 0 principalement par dégradation. L'ATP intervient dans la cellule en tant que source d'énergie (énergie mécanique, énergie osmotique, énergie chimique, énergie calorique, énergie lumineuse) donneur de phosphate, donneur de pyrophosphate, donneur d'AMP et donneur d'adénosine. La teneur en ATP dans les cellules d'une même espèce varie fortement selon l'état physiologique. Le seuil de détection est de l'ordre de 103 bactéries. Selon l'invention, on va atteindre une meilleure sensibilité qui va de 1 attomole d'ATP (sans stabilisation du signal lumineux émis) jusqu'à 0,5 attomole d'ATP (avec stabilisation dudit signal), ce qui correspond approximativement au contenu moyen en AN intracellulaires totaux d'une bactérie. Quand on considère la relation (2), on néglige ici la teneur intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (cAMP), qui est le précurseur intervenant dans la synthèse de l'AMP. Cette teneur est pratiquement négligeable dans les milieux réactionnels de l'invention. On utilise selon l'invention le principe bien connu de la luciole (Photinus pyralis), qui fonctionne avec un enzyme (luciférase), un substrat luminophore (luciférine) et un coenzyme (en l'occurrence 1' ATP) . Le résultat est souvent affiché au photomètre (ou luminomètre) en RLU, qui bien que proportionnel à la quantité d'ATP, ne permet pas de déterminer d'un échantillon à l'autre la concentration réelle en ATP. Pour remédier à cette difficulté, on préconise l'apport d'une quantité connue (par exemple 102 à 10 pmol d'ATP), après la première lecture (entreprise sans apport d'ATP). Cependant, la technique de l'apport dit dosé ne permet pas une détermination quantitative de la numération car la teneur en ATP dans lesdites cellules ne reste pas constante: il y a un "turnover" rapide en fonction de l'état physiologique. En revanche, les cellules d'une cible donnée présentent toutes la même teneur en AN. Selon l'invention, en déterminant la teneur en AN, exprimée sous forme d'ATP, on va pouvoir réaliser des déterminations quantitatives pour la numération des cellules de la cible et des souches de virus. De façon avantageuse, l'étape (1 ) ou (la ) du procédé de l'invention, qui est relative à l'isolation et concentration, est effectuée par 30 É filtration sur membrane, É évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou É immunocapture. La technique d'immunocapture est préférée. Elle permet la concentration et la purification des souches du virus par fixation de celles- 2876706 8 ci par des anticorps. De façon pratique, ces anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes de surface du virus sans le détruire. De façon également pratique, ces anticorps sont immobilisés sur des billes de latex magnétique en vue de la concentration et de la purification des produits de conjugaison du type virus-anticorps-bille dans un champ magnétique et du recueil desdits produits de conjugaison. En variante, des billes non magnétiques ou non magnétisables, liées aux anticorps qui fixent les souches du virus, permettent également, par décantation, la concentration et la purification desdites souches. Lesdits produits de conjugaison sont ensuite séparés, si nécessaire, notamment par élution, pour disposer d'une composition liquide concentrée de souches virales qui ne sont plus liées aux anticorps. Le cas échéant, pour limiter les dilutions qui diminuent la sensibilité, il peut être judicieux de concentrer ladite composition liquide au moyen d'un dispositif d'évaporation-centrifugation (opérant de 2000-10000 tours/ 15 minutes à 2000-10000 tours/1 minute), qui permet de sécher un grand nombre d'échantillons ou de milieux réactionnels en quelques minutes, sans perte de produits. L'évaporation-centrifugation à température ambiante offre l'avantage de pouvoir éliminer la majeur partie de l'eau du 2 0 milieu contenant les souches. De façon également avantageuse, les étapes (2 )-(3 ) ou (2a )-(3a ) relatives à la mise en contact des souches virales avec les souches de la cible puis à leur développement sont réalisées selon un mode connu de la personne du métier. 2 5 A l'étape (4a ) la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a ) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, 3 0 puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. La lyse est requise afin de pouvoir accéder aux AN intracellulaires. La transformation à l'étape (4 ) ou (4a ) des ADP et AMP en ATP 2876706 9 est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. Les mécanismes réactionnels sont les suivants: myokinase (3) AMP + ATP 2ADP myokinase (3a) AMP + GTP > ADP + GDP pyruvate kinase COO O I II (4) C O i 0 CI-12 OÎoo =0 CH3 ADP ATP phosphoénolpyruvate pyruvate Pour gagner du temps, l'étape (5 ) du procédé de l'invention relative à la transformation des ADP et AMP en ATP peut être mise en oeuvre en même temps que l'étape (4 . De façon avantageuse, l'étape (5 ) ou (5a ) du procédé de l'invention est mise en oeuvre avec la luciférine et la luciférase de luciole 15 (Photinus pyralis). Le substrat et l'enzyme sont susceptibles d'être extraits simultanément de la luciole. De façon pratique, il est recommandé de réaliser l'étape (6 ) ou (6a ) relative à la mesure de la lumière émise par la réaction (1) en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner: É la pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) qui transforme l' AMP et le pyrophosphate, produits au cours de la réaction (1) précitée, en ATP, et É l'adénosine phosphate déaminase, qui dégrade l' ADP et/ou l' AMP résiduels pouvant être présents dans le milieu réactionnel Le premier enzyme fournit un signal stable en régénérant l'ATP de façon sensiblement continue. Le second enzyme permet de diminuer le bruit de fond dû à la présence résiduelle dans le milieu d'essai d'ADP et/ou d'AMP, sans que le processus d'utilisation de l'ATP comme source 2876706 10 d'énergie lumineuse soit perturbé. Ledit second enzyme, l'adénosine phosphate déaminase, est plus avantageusement utilisé pour éliminer les résidus de nucléotides dans le milieu réactionnel et plus particulièrement pour écarter en les détruisant les résidus de nucléotides extracellulaires présents le cas échéant dans l'échantillon lors de l'étape (1 ) précitée. En pratique, pour stabiliser l'émission de photons conformément à la réaction (1), on recommande plus particulièrement l'utilisation de PPDK à l'étape (5 ). Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la numération des virus, tels que HIV, les bactériophages, le virus de l'hépatite C. - Procédé mettant en oeuvre le patrimoine génétique des virus Ce procédé va être maintenant décrit de façon succincte par 15 référence aux étapes précédentes. On fait appel à un échantillon liquide aqueux (E) comme à l'étape (1 ) cidessus. L'isolation/concentration est effectuée par É filtration sur membrane, É évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou É immunocapture. comme indiqué plus haut. On lyse la paroi virale par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. On clive le DNA ou le RNA viral au moyen de DNA-ase ou RNA-ase, et transforme les dimères présents dAMP et dADP en monomères AMP et ADP. On transforme les AN, initialement liés et ainsi obtenus, en ATP au moyen de myokinase et de pyruvate kinase comme à l'étape (4 ). L'émission de photons est mise en oeuvre au moyen de luciférine de 2876706 11 luciole et luciférase de luciole comme indiqué plus haut pour la réalisation de l'étape (5 ) ou (5a ) sans ajout d'ATP puis après ajout dosé d'ATP. De façon avantageuse on opère comme indiqué ci-dessus en stabilisant ladite émission de photons au moyen de PPDK. La mesure du signal amplifié et la détermination sont réalisées comme indiqué plus haut aux étapes (6 ) et (7 ). Selon l'invention, on préconise un procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de RNAase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP, la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP, - la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et 2 0 la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'un exemple de réalisation. Bien entendu, cet exemple n'est pas limitatif, mais est fourni à titre d'illustration. Exemple Dosage de bactériophages On a utilisé des bactéries lactiques en tant que cellules cibles des 30 bactériophages qui sont des virus lytiques. Dans les laiteries et les fromageries, la qualité des produits laitiers est fonction de la quantité d'acide lactique produit par les bactéries lactiques, et il convient de surveiller la teneur en bactériophages pour empêcher la destruction desdites bactéries lactiques. A une population connue de bactéries lactiques [déterminée selon le 2876706 12 procédé décrit dans la demande de brevet intitulée: "ATPmétrie à partir de nucléotides adényliques intracellulaires pour détecter et dénombrer des cellules, utilisation et procédé de mise en oeuvre pour la détermination de bactéries notamment dépourvues d'ATP" déposée le même jour que la présente demande] on a ajouté des quantités croissantes de bactériophages (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L, 20 virus/L). Par la mise en oeuvre des étapes (1 ) - (7 ) précitées, on retrouve les populations correctes de départ (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L et 20 virus/L). REVENDICATIONS 1. Utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) : (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase - oxyluciférine + photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d' ADP et d' AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, après avoir transformé les ADP et AMP de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA- ase, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant dudit clivage, exprimée sous forme d'ATP, après transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP, puis transformation des AMP et ADP totaux en ATP, ladite mesure des AN libres étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP. 2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'ATP- 3 0 métrie des virus lytiques est entreprise à partir des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. 3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l' ATPmétrie des virus non lytiques est entreprise à partir des AN intracellulaires libérés par la lyse provoquée de la paroi des cellules de la cible, lesdits 2876706 14 AN étant exprimés sous forme d'ATP. 4. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. 5. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus non lytiques caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN intracellulaires libres des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP, la teneur en AN intracellulaires libres totaux des 1 o cellules infectées de la cible étant différente de celles des mêmes cellules non infectées de ladite cible. 6. Procédé suivant la revendication 4, pour la détection et la numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1) : (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase --> oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (1 ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres; (2 ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible; (3 ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible; (4 ) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP; (5 ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4 ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP; (6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP; et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, par utilisation d'un système d'abaques préétabli, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que, à l'étape (7 ), la teneur en AN totaux extracellulaires est déterminée par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1 ) à (7 ) en l'absence dudit virus, puis en en déduit le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. 8. Procédé suivant la revendication 5, pour la détection et la numération 15 des souches d'un virus non lytique par bioluminescence selon la réaction (1) qui suit: (1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase -+ oxyluciférine + photons, ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) : (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, 25 étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (la faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN; 3 0 (2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible; (3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible; (4a ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de 2876706 16 façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP; (5a ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP; (6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP; et l0 (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, et la comparer à celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (la ) à (7a ) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (7a ), la teneur en AN totaux intracellulaires est réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli avant d'en déduire le nombre de virus (V) de 1 "échantillon (E) initial. 10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (4a ), la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a ) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. 11. Procédé suivant la revendication 6 ou 8, caractérisé en ce que l'étape (4 ) ou (4a ) de la transformation des ADP et AMP en ATP est réalisée 30 au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. 12. Nécessaire de dosage mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole, de l'ATP pour l'ajout dosé, de la myokinase, de la pyruvate kinase, et le cas échéant de la pyruvate orthophosphate dikinase. 13. Procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: - le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP, la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, la mise en contact de dATP avec une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP, la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus.