Brevet FR2873037A1 — publié le 20060120

METHODES ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE CANCERS La présente invention concerne des utilisations ou des méthodes pour le traitement de pathologies prolifératives, en particulier des cancers, mettant en oeuvre des s composés du ruthénium et des compositions les contenant. Elle a trait également à de nouveaux composés du ruthénium, ainsi qu'à leur procédé de préparation. Il est connu que les composés métalliques de la mine du platine présentent des activités antitumorales importantes. Le plus connu d'entre eux est le cisplatine qui io est couramment utilisé pour le traitement clinique de nombreux cancers. La résistance de certaines cellules cancéreuses et la toxicité intrinsèque du platine font partie des problèmes rencontrés lors de l'utilisation de ce composé. Depuis les années 70, les recherches s'intensifient pour trouver des molécules susceptibles de se substituer au cisplatine et depuis quelques années des composés contenant du ruthénium sont apparus comme pouvant être une alternative intéressante à ceux qui contiennent du platine. Certains complexes du ruthénium ont ainsi déjà été décrits comme pouvant être une alternative lors de traitements anticancéreux. II existe donc un besoin pour de nouveaux agents anti-cancéreux qui pourraient 20 être une alternative à ceux actuellement utilisés et/ou qui présenteraient des effets secondaires indésirables moindres. La présente invention propose ainsi des composés du ruthénium qui présentent des propriétés anti-tumorales particulièrement intéressantes. Ces composés sont des composés organométalliques, c'est-à-dire qu'ils contiennent au moins une liaison covalente Carbone-Ruthénium (C-Ru). De plus, cette liaison C-Ru est stabilisée par une liaison intramoléculaire azote-ruthénium (N-Ru), l'azote étant un élément de la partie organique liée au métal par l'atome de carbone, conformément au schéma ci-dessous: Dans ce type d'arrangement d'atomes, le ruthénium fait donc partie d'une entité cyclique et cette classe de composés est communément appelée par les chimistes s de la discipline, la classe des composés cyclométallés. L'entité cyclique contenant le ruthénium est appelée un métallocycle. Dans un métallocycle, le métal est donc lié à la fois à un ligand organique par une liaison covalente carbone-métal et une liaison de type donneur-accepteur (acide-base de Lewis, ou liaison de coordination) azotemétal. L'existence d'un métallocycle dans une molécule organométallique io confère à celle-ci des propriétés particulières en terme de réactivité et de stabilité thermodynamique. Divers types de carbones (aromatique, benzylique ou aliphatique) peuvent être métallés et la nature du lien entre l'atome donneur (l'azote) et le carbone peut être modifiée de multiples façons. is Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé complexe du ruthénium (II) de formule générale (I) ou (Il) suivante: m+ [Y-lm m+ m (I) 2873037 3 formule (I) ou (II) dans laquelle: LI, L2, L3 et L4, identiques ou différents, représentent soit un ligand donneur de 2 électrons par un atome d'azote, d'oxygène, de phosphore ou de soufre, soit un atome d'halogène, RI représente un atome d'hydrogène ou une ou plusieurs substitutions sur le groupe phényle, choisie parmi un radical (CI-6) alkyle et (C6-18)aryle, Y est un contre-ion (lorsque m = 1), m est 0 ou 1, entre C et N, représentée par une ligne courbe, il existe une succession d'atomes io formant, avec les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés sur les formules (I) et (Il), le métallocycle, qui est constitué de 5 à 8 atomes (incluant les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés dans les formules (I) et (Il)). Les composés de l'invention peuvent être sous forme de sels, solvates et/ou de prodrogues pharmaceutiquement acceptables. Les pro-drogues sont des variants des composés de l'invention qui peuvent être transformés in vivo en composés de formule (I) ou (II) selon l'invention. Selon l'invention, le terme "alkyle" désigne un radical hydrocarboné linéaire ou ramifié ayant avantageusement de 1 à 6 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, néopentyle, nhexyle, etc. Les groupes en C1-C4 sont préférés. Les groupes alkyles peuvent être substitués par un groupe aryle tel que défini ci-après, auquel cas on parle de groupe arylalkyle. Des exemples de groupes arylalkyle sont notamment benzyle et phénéthyle. Les groupes aryle sont des systèmes hydrocarbonés aromatiques mono-, bi- ou tri-cycliques, éventuellement interrompus par au moins un hétéroatome (en 30 particulier O, S ou N). Préférentiellement, les groupes aryle incluent les systèmes 2873037 4 hydrocarbonés aromatiques monocycliques ou bi-cycliques ayant de 6 à 18 atomes de carbone, encore plus préférentiellement 6 atomes de carbone. On peut citer par exemple les groupes phényle, naphtyle et bi-phényle. Lorsqu'ils sont interrompus par des hétératomes, les groupes aryle incluent les cycles pyridyle, imidazoyle, s pyrrolyle et furanyle. Les groupes aryle peuvent éventuellement présenter un ou plusieurs substituants, choisis notamment parmi un atome d'halogène, un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, un radical alkoxy (-0-alkyl), thiol, thioether (-S-alkyl), hydroxyl, nitro, cyano et ester (-CO2-alkyl). io Par halogène , on entend un atome de fluor, de chlore, de brome ou d'iode. Avantageusement, l'atome d'halogène est le chlore. Les ligands donneurs de deux électrons par un atome d'azote, d'oxygène, de phosphore ou de soufre incluent, par exemple, H2O, di((C1_6)alkyl)O, di((C,_ 6)alkyl)S, di((C1_6)alkyl)S(0), (C1.6)alkyl)SO3, di((C1.6)alkyl)C=O, (C1. 6)alkylCO2. D'autres ligands incluent notamment des ligands nitriles, comme par exemple des ligands de formule (C1.6)alkylCN (en particulier CH3CN) et des ligands pyridine, éventuellement substitués, sur un ou plusieurs atomes de carbone des cycles pyridine, par un radical (C1.6) alkyle ou un atome d'halogène, tel que défini ci- dessus. Parmi d'autres ligands, on peut notamment citer les amines primaires (C1_6)alkyle, tel que méthylamine ou éthylamine. Les ligands donneurs de deux électrons par un atome de phosphore incluent les ligands de type phosphine. Avantageusement, ils sont de formule P(Ph) 3_X(alkyle)X, avec x représentant 0, 1 ou 2 (de préférence x représente 2) (Ph représentant le groupe phényl). Parmi ces ligands, on peut notamment citer P(Ph)(CH3)2. Selon un mode particulier, dans le cas de la formule (Il), au moins deux des groupements L1, L2, L3 et L4, pris deux à deux, peuvent être reliés par au moins une liaison covalente. Dans ce cadre, on peut notamment citer les motifs bipyridine ou phénanthroline, éventuellement substitués, notamment par au moins un radical alkyle tel que défini ci-dessus. Ainsi, de manière préférentielle, les composés de l'invention présentent au moins un groupement LI, L2, L3 et L4, représentant un ligand donneur de deux électrons par un atome d'azote ou de phosphore, en particulier un groupement pyridine, phophine (e.g, de formule P(Ph)3_X(alkyle)X, telle définie ci-dessus), bipyridine ou phénanthroline, lesdits groupements étant éventuellement substitués. io Y- dans les composés selon l'invention est un contre-ion et est seulement présent dans le composé lorsque le complexe du ruthénium porte une charge positive. Y" est de préférence un anion peu nucléophile, tel que par exemple BF4, PF6, CF3SO3, CF3CO2, CH3CO2 et NO3-, en particulier PF6. Selon un mode particulier de l'invention, m est égal à 1. La ligne courbe représente avec les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés sur les formules (I) et (Il), le métallocycle. Ce métallocycle est généralement constitué de 5 à 8 atomes (incluant les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés dans les formules (I) et (Il)). Typiquement, les atomes du métallocycle (autres que ceux représentés dans les formules (I) et (Il)) sont choisis parmi les atomes de carbone, d'azote, d'oxygène ou de soufre. Chacun de ces atomes peut indépendamment du métallocycle former des structures linéaires ou cycliques, saturées ou non, pour lesquelles il n'existe pas de limitations particulières. Ainsi, parmi les unités structurales incluant un métallocycle à 5 ou 6 atomes (incluant les atomes Ru, C et N représentés dans les formules (I) et (II)), on peut notamment citer: R = H, Me (1) (2) (3) (4) Parmi d'autres structures incluant un métallocycle à 6 ou 7 atomes, on peut notamment citer: io avec R, identique ou différent, représentant H ou un radical alkyle, de préférence méthyle, et R2 et R3, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, un radical alkoxy (-0-alkyl), thiol, thioether (-S-alkyl), hydroxyl, nitro, cyano et ester (-CO2-alkyl). Dans le métallocycle (5), de préférence R2 et R3 représentent tous deux CO2Me et/ou les deux R représentent un radical méthyle. Dans le métallocycle (6), de préférence R2 représente H et R3 un radical méthyle (Me) et/ou les deux R représentent un radical méthyle. Avantageusement, l'atome d'azote du métallocycle et représenté dans les formules (I) et (II) n'est pas un atome d'azote inclus dans une structure de type benzodiazépine, en particulier les composés décrits dans Organometallics, vol. 21, 2002, pp 5437-5438. Selon un mode particulier de l'invention, les composés selon l'invention ne sont pas les composés suivants (décrits dans Organometallics, vol. 21, 2002, pp 1184-1189). R R = NMe2, Me, I, NO2 lo R = NMe2, Me 2873037 8 Parmi les composés de formule (I) ou (Il), on peut citer notamment les composés représentés à la figure 8 (composés numérotés de 3-6 et 8-25). En particulier, les composés numérotés 6, 9, 11, 12, 14-25 et, plus particulièrement, les composés 6, 9,11 et 12. Ainsi, l'invention a également pour objet les composés 6, 9, 11, 12 et 1425. De préférence, les composés 6, 9 et 11. i0 II existe différentes voies de synthèse d'obtention des composés selon l'invention. Le procédé de préparation le plus avantageux est celui qui fait appel à la réaction dite de cyclométallation. Cette réaction met en jeu des propriétés chimiques particulières de la part des métaux à partir desquels cette réaction est observée. Certains métaux de transition sont en effet capables d'activer dans des conditions douces une liaison C-H grâce à laquelle ils substituent directement l'atome d'hydrogène pour former le composé cyclométallé. Le palladium est certainement le métal le plus couramment utilisé pour ce type de réaction. Plusieurs articles de revues (A. D. Ryabov, Chem. Rev. 1990, 90, 403-424) ont été consacrés à cette réaction et aux propriétés particulières des composés qui en résultent. Pour ce qui concerne les composés du ruthénium, une méthode de préparation de ces composés a été publiée dans Organometallics 1999, 18, 2390-2394. D'autres voies de synthèse sont également possibles notamment lorsque la réaction d'activation C-H directe par le métal de transition ne peut pas être mise en oeuvre. Dans ces cas-là, le coordinat organique azoté est métallé au niveau du carbone par le mercure(ll) et le composé organomercuré ainsi obtenu peut être transmétallé sur le composé du ruthénium (voir J. Organometal. Chem. 1995, 494, 187-193, pour les composés du mercure, et Inorg. Chim. Acta 1996, 249, 63-67, pour la réaction de transmétallation). Ainsi, les composés de la présente invention peuvent être obtenus à partir des familles de composés A et B décrites ci-dessous + + PF6 PFg A B Dans ces familles de composés, l'unité "métallocyclique" représente en particulier s et schématiquement les unités (1) à (6) décrites précédemment. Les voies de synthèse pour obtenir ces deux familles de composés (A) ou (B) (incluses respectivement aux formules (I) et (Il), avec S représentant un groupement acétonitrile NCCH3) sont, soit la voie directe dite de cyclométallation par activation de la liaison C-H en ortho de l'aryle, soit la voie de transmétallation io par un composé organomercuré. Le schéma général de synthèse des composés A et B est résumé sur le diagramme suivant: 2873037 + PF6 - r/ c CH3CN, NaOH, KPF6, 45iC (-CH N + A CH3CN, KPF6 r CH3CN hv Y + PF6 - CH3CN, KPF6, hv B Les composés issus des familles A et B avec les différents coordinats organiques cyclométallés peuvent être modifiés en substituant un ou deux ligands acétonitriles par respectivement un ligand monodenté comme une phosphine P(Ph)3_X(alkyle)X, s telle que définie ci-dessus, ce qui a conduit aux composés de type C et D, ou par un ligand bidenté comme une bipyridine ou la phénanthroline, ce qui a conduit aux composés de type E. i0 + PF6 " CH2Cl2, L PF6 A C _ _ + + PF6' > CH2Cl2, L PF6 - L=PR3 NCCH3 H3CCN. CCH3 B D + PF6 - + PF6 LlL CH2Cl2, L B E = bipyridine, ph?nanthroline s Il existe de nombreux autres composés qui contiennent la même unité structurale métallocyclique. Par exemple, il est en effet possible de transformer les composés de type A par réaction avec un acétylénique (R2CCR3) ou un alcène (R2CH=CH2, avec R2 et R3, tels que définis précédemment. Les composés ainsi formés ont une structure qui rappelle celle de A mais qui présente un groupe métallocyclique Io contenant un plus grand nombre d'atomes, 7 et 6 respectivement. Les composés modifiés sont notamment les suivants: + PF6 + CM e PF6 - La synthèse de ces deux composés est décrite dans Bull. Soc. Chim. Fr. 1997, 134, 947-954 et dans Organometallics 2003, 22, 347-354. Les mêmes réactions que celles conduisant aux composés C, D et E peuvent être appliquées à ces espèces et ainsi élargir le nombre de composés présentant des propriétés antitumorales. io Comme spécifié ci-dessus, les compositions selon l'invention sont particulièrement avantageuses pour traiter des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, en particulier des cancers. Les cancers incluent ceux à tumeurs solides ou liquides. Les cancers correspondent notamment à des glioblastomes, des leucémies promyélocytaires, les cancers de la prostate, des ovaires, des poumons, des seins, des voies digestives, en particulier du foie, du pancréas, de la tête et du cou, du colon, les lymphomes non-Hodgkiniens et les mélanomes. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé de formule (I) ou (Il), tel que défini ci-dessus, dans le cadre de la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à traiter des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, en particulier des cancers. Les composés selon l'invention présentent un effet antiprolifératif vis-àvis de cellules tumorales. Ils sont particulièrement utiles pour traiter des cancers par 2873037 13 accumulation des cellules tumorales en phase GOIG1 et éventuellement par induction d'apoptose dans des cellules tumorales. En effet, sans vouloir se lier à une quelconque théorie de l'invention, les composés selon l'invention semblent notamment capables d'accumuler les cellules tumorales en phase GO/G1, et donc en bloquant leur cycle cellulaire, mais également semblent capables de générer leur apoptose rapidement, en particulier lorsque leur concentration est augmentée, signe d'une toxicité dose-dépendante. io En outre, les composés selon l'invention sont particulièrement avantageux pour traiter des tumeurs résistantes au cisplatine ou à d'autres drogues anticancéreuses. Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être administrés de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc., les voies intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, orale et par inhalation étant préférées. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. 2873037 14 Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, aérosols, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie concernée, du mode io d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0.1 pg et 100 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 10 mg/kg, typiquement entre 0,1 et 10 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes retard ou prolongés peuvent être avantageux. L'invention concerne également une méthode de traitement d'une pathologie liée à une hyperprolifération cellulaire, en particulier un cancer, par l'administration à un sujet atteint d'une telle pathologie d'une quantité efficace de l'un des composés selon l'invention. Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, etc.). Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements chimiques ou physiques (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains. Ainsi, les composés selon l'invention peuvent être utilisés de manière avantageuse en combinaison avec un traitement anti-cancéreux mettant en oeuvre des 30 rayonnements, tel que la radiothérapie. 2873037 15 Selon un autre aspect de l'invention, les composés selon l'invention peuvent être utilisés avec d'autres agents chimiques ou traitements thérapeutiques anticancéreux, tel que les agents chimiques thérapeutiques suivants: le cisplatine, le carboplatine, le NCS (Néocarzinostatin), le taxotère ou le taxol, avantageusement s le NCS ou le taxol. Les composés selon l'invention sont de préférence conditionnés et administrés de façon combinée, séparée ou séquentielle par rapport à d'autres agents ou traitements thérapeutiques. Elle concerne aussi une méthode pour inhiber in vivo, in vitro ou ex vivo la io prolifération de cellules tumorales comprenant la mise en contact desdites cellules tumorales avec l'un des produits selon l'invention. Les cellules tumorales peuvent être notamment celles des pathologies spécifiées ci-dessus. LEGENDE DES FIGURES Dans les figures et les exemples qui suivent, le terme CDR signifie composé dérivé du ruthénium . FIGURE 1: Les cellules A172 ont été cultivées en plaques de 96 puits en milieu DMEM avec 10% de sérum ce veau. À 30% de confluence, les cellules ont été traitées pendant 48 h avec le cisplatine ou les divers composés dérivés du ruthénium aux concentrations indiquées (1, 5, 15, 50 NM). La quantité de cellules présentent dans les puits a été évaluée par un test MU (MU, Sigma) dont les produits de la réaction sont quantifiés avec un lecteur de plaque Elisa (Metertech, USA) (490-650 nm). Les résultats obtenus ont été rapportés aux valeurs de la condition contrôle (100 % de viabilité). Les graphiques sont une moyenne de 8 points avec les écarts types sur une expérience représentative sur 4 effectuées. La ligne noire épaisse indique l'IC50 pour chaque graphique. TABLEAU 2: résumé des résultats obtenus sur diverses lignées cellulaires et des cultures primaires de glies. Les expériences ont été menées dans les mêmes conditions que celles décrites pour les cellules A172. Chaque IC50 est une valeur indicative obtenue sur 4 expériences indépendantes. 2873037 16 FIGURE 2: A- Les cellules A172 ont été cultivées sur lamelles de verre. À 50 % de confluence, les cellules ont été traitées pendant 24 h avec par le cisplatine, le CDR2 (25 pM) ou le CDR6 (15 pM). Les cellules ont ensuite été fixées au s paraformaldéhyde 4%, perméabilité au NP40 0,1% et marquées avec le colorant Hoeschst (en bleu) et l'anticorps anti-p20 (fragment actif de la caspase 3, en rouge). Les cellules ont ensuite été observées au microscope à fluorescence. B-Représentation graphique du nombre de cellules avec un noyau apoptotique, fragmenté ou condensé. Les barres sont une moyenne de deux lamelles d'une io expérience représentative sur 3 réalisées. C- En parallèle, des extraits protéiques ont été préparés à partir de cellules traitées aux diverses drogues (cisplatine 15 pM; CDR2 25 pM; CDR6 15 pM; CDR9 15 pM) et après dénaturation les extraits ont été déposés sur un gel SDS-Page 10 %. Après migration, les protéines ont été transférées sur nitrocellulose (Biorad, 0,2pm) et le fragment p20 de la caspase 3 a été détecté par Western blot avec un anticorps anti-p20 (1/1000, R&D System). FIGURE 3: Détection de p53 et p73 dans les cellules A172 traitées aux CDR. Les cellules A172 ont été traitées aux concentrations indiquées (2, 5 ou 10 pM) avec les divers composés et pour les durées indiquées (24 h ou 6 h) . Les protéines ont été extraites avec un tampon de lyse et ont été séparées sur gel SDS-Page 10%. Après transfert sur nitrocellulose, les protéines p53 et p73 ont été détectées par Western blot à l'aide d'anticorps anti-p53 (pAb1801) et anti-p73 (1/200, Ab2, Oncogene). FIGURE 4: Détection de p21 et Bax dans les cellules A172 traitées aux CDR. Les cellules A172 ont été traitées avec les divers composés (10 pM) pendant 24 h. Les protéines ont été extraites avec un tampon de lyse et ont été séparées sur gel SDS-Page 10%. Après transfert sur nitrocellulose, les protéines p21 et Bax ont été détectées par Western blot à l'aide d'anticorps anti-p21 (1/200, Oncogene) et anti- Bax (1/2000, Santacruz). 2873037 17 FIGURE 5: Détection de p53, p21 et de la phosphorylation de l'histone H3 dans les cellules HCT116 traitées aux CDR. Les cellules HCT116 ont été traitées avec les divers composés (10 pM) et pour les durées indiquées (24 h ou 6 h). Les protéines s ont été extraites avec un tampon de lyse et ont été séparées sur gel SDS-Page 10%. Après transfert sur nitrocellulose, les protéines p53, p21 et histone H3 ont été détectées par Western blot à l'aide d'anticorps anti-p53 (pAb1801), anti- p21 (1/200, Oncogene) et anti-phospho sérine 10 de l'histone H3 (1/2000, Santacruz). ro FIGURE 6: Les cellules 2008/CMV et 2008/ATP7B (un don du Dr. Howell) ont été cultivées en plaques de 96 puits en milieu DMEM avec 10% de sérum de veau. À 30% de confluence, les cellules ont été traitées pendant 48 h avec le cispiatine ou les divers composés dérivés du ruthénium aux concentrations indiquées (1, 5, 15, 50 pM). La quantité de cellules présentent dans les puits a été évaluée par un test MTT (MU, Sigma). Les résultats obtenus ont été rapportés aux valeurs de la condition contrôle (100 % de viabilité). Les graphiques sont une moyenne de 8 points avec les écarts types sur une expérience représentative sur 3 effectuées. La ligne noire épaisse indique l'IC50 pour chaque graphique. FIGURE 7: Les cellules A172 ont été cultivées en plaques de 96 puits en milieu DMEM avec 10% de sérum ce veau. À 30% de confluence, les cellules ont été traitées pendant 48 h avec le cispiatine, le CDR6, le NCS (Néocarzinostatin), le Taxol ou une combinaison de ces drogues aux concentrations indiquées. La quantité de cellules présentent dans les puits a été évaluée par un test MTT (MTT, Sigma) dont les produits de la réaction sont quantifiés avec un lecteur de plaque Elisa (Metertech, USA) (490-650 nm). Les résultats obtenus ont été rapportés aux valeurs de la condition contrôle (100 % de viabilité). Les graphiques sont une moyenne de 8 points avec les écarts types sur une expérience représentative sur 4 effectuées. La ligne noire épaisse indique l'IC50 pour chaque graphique. 2873037 18 FIGURE 8: Exemples de composés de formule (I) ou (II), à l'exception des composés numérotés 1 et 2 qui sont présentés à titre de références. D'autres aspects et avantages de la présente demande apparaîtront à la lecture 5 des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES 1- PROCEDES DE SYNTHESE DE COMPOSES SELON L'INVENTION: Les composés cyclométallés du ruthénium(ll) sont sensibles à l'oxygène de l'air et aux acides. Tous les solvants doivent par conséquent être parfaitement séchés et désoxygénés avant leur utilisation. Les manipulations se font dans une atmosphère controlée (azote ou argon) en utilisant la technique des tubes de schlenks. Synthèse du composé 5 (d'après Organometallics, 1999, 18, 2390): On ajoute la N,N dimethylaminomethylbenzene (0.120 mL, O. 8 mmol), NaOH (0. 031 g, 0.8 mmol) et KPF6 (0.292 g, 1.6 mmol) à une suspension de [(16C6H6)RuCl2]2 (0.2 g, 0.4 mmol) dans l'acétonitrile (5mL) à 20 C pendant 3 jours. La solution jaune ainsi obtenue est alors filtrée (chromatographiée) sur de l'alumine standardisée (12x3cm) avec l'acétonitrile comme éluant. On recueille la fraction jaune qui est sèchée sous vide. Le résidu obtenu est redissout dans un minimum d'acétonitrile (2mL). L'ajout d'éther éthylique à cette solution provoque la cristallisation d'un produit jaune vif qui est le composé attendu (rendement 0.32 g, 80%). Synthèse du composé 6 [Ru (r16-C6H6)-2-(CH2NMe2)-C6H4-(PMe2Ph)]PF6: on ajoute PMe2Ph (0,019mL, 0,162 mmol) à une solution jaune du complexe 5 (0,08g, 0,156 mmol) dans CH2Cl2 (10mL) et la solution résultante est agitée à température ambiante pendant 3 2873037 19 heures. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu résultant est dissout dans un minimum de CH2Cl2 (1 mL). L'addition de n-hexane provoque la précipitation du complexe 6 (rendement: 0,09g, 95%). Analyse élémentaire. Calculé pour C23H23NF6P2Ru+1/2 CH2Cl2: C, 44. 13; H, 4.69; N, 2.19. Trouvé: C, 44.30, H, 4.59; s N, 2.16. RMN1H (CD3CN): 7.75 (dt, 1H, H6, 3J=7.5), 7.39 (tdd, 1H, p, 3J=7.5, 4J=1. 7), 7.22 (td, 2H, m, 3J=8.0, 4J=2.0), 7.08 (tdd, 1H, H4 ou H5, 3J=7.1), 7. 00-6.88 (m, 3H, o et H4 or H5), 6.72 (d, 1H, H3, 3J=7.5), 5.74 (d, 6H, C6H6, 3JHp=1.1), 2.85 and 2.43 ((AB, 2H, 2J=14.5), 2.77 (d, 3H, NMe, 4JHp=1.1), 2.66 (s, 3H, NMe), 1.99 (d, 3H, PMe, 2J=9.3), 1.50 (d, 3H, PMe, 2J=9.7). RMN 31P (CD3CN): 6.37 (s, 1P, PMe2), -142.97 (sept, 1P, PF6, 1J=711). Synthèse du composé 8 (d'après Organometallics, 1999, 18, 2390): On ajoute la 2-phenylpyridine (6,02 mmol), NaOH (0,48 g, 6,02 mmol) et KPF6 (2,22 g, 12,04 mmol) à une suspension de [(etas-C6H6)RuCl2]2 (1,5 g, 3,01 mmol) dans l'acétonitrile (50mL) à 45 C pendant 20h. Le solvant est alors évaporé sous vide et le résidu obtenu est chromatographié sur colonne d'alumine standardisé avec l'acétonitrile comme éluant. La bande jaune est recueillie et séchée sous vide. Ce résidu est dissout dans un mélange d'acétonitrile et de dichlorométhane (1:1); la diffusion lente d'ether ethylique dans cette solution permet d'obtenir le composé 8 sous la forme de cristaux jaunes vifs (rendement 68%). Synthèse du composé 9 [Ru (C6H4-2-05H4N) (PMe2Ph) (NCMe)3]PF6 9: on ajoute PMe2Ph (0,031 mL, 0, 22 mmol) à une solution jaune du complexe 8 (0.124g, 0.22 mmol) dans CH3CN (5mL) et la solution résultante est agitée à température ambiante pendant 18 heures. La solution jaune-verte est filtrée sur alumine avec de l'acétonitrile comme éluant. La fraction jaune est récoltée et concentrée sous vide. La poudre obtenue est dissoute dans un minimum d'acétonitrile et d'éther éthylique. (1:1). L'addition de n-hexane provoque la précipitation du composé 9 sous la forme d'une poudre jaune. 2873037 20 (rendement: 0.122g, 84%). Analyse élémentaire: Calculé pour C25H28N4F6P2Ru: C, 45.39, H, 4.27, N, 8.47. trouvé: C, 45.35, H, 4.49, N, 8.33. RMN1H (CD3CN): 8.39 (ddd, 1H, H12, 3J=5.8, 4J=1.6, 5J=0.8), 8.08 (dddd, 1H, H6, 3J=7.1, 4JHp=4.7, 4J=1.3, 5J=0.5), 7.89 (d, 1H, H9, 3J=8.1), 7.80 (d, 1H, H3, 3J=7.8), 7.71-7.63 (m, 3H, H10 et o), 7.53-7.49 (m, 2H, m), 7.44 (t, 1H, p, 3J=7.4) , 7.20 (td, 1H, H5, 3J=7.3, 4J=1.4), 7.06 (td, 1H, H4, 3J=7.5, 4J=1.4), 6. 92 (ddd, 1H, H11, 3J=7.3, 3J=5.8, 4J=1.5), 2.33 (d, 3H, NCMe, 5JHp=1.7), 1.97 (d, 3H, NCMe, 5JHp=1.8), 1.86 (d, 6H, PMe2, 2JHp=5.8). RMN 13C{1H} (CD3CN): 185.5 (Cl), 170.2 (C8), 156.6 (C12), 147.1 (C2), 138. 0 (C6), 137.5 (C10), 131.0 (Co), 129.7 (Cm), 129.3 et 129.2 (C5 and Cp), 124.4 (C4 et Cipso), 123.6 (NCMe), 122.9 (C4), 122.3 (Cl1), 119.4 (C9), 13.55 and 13.41 (PMe2), 4.31 et 3.99 (NCMe). RMN 31P (CD3CN): -7.08 (s, 1P, PMe2), -144.40 (sept, 1P, PF6, 1J=704.6). Synthèse du composé 11 [Ru(C6H4-2-05H4N)(phen)(NCMe)2]PF6 11: on ajoute la phénanthroline (0, 032g, 0,178 mmol) au composé 8 (0,1g, 0,178 mmol) dissout dans CH2Cl2 (13 mL). La solution est agitée à temp. ambiante pendant 2 jours, l'évolution de la réaction étant suivie par RMN du proton. Le solvant est ensuite évaporé sous vide et le résidu est dissout dans le minimum d'acétonitrile/CH2Cl2 (1:1) et de n-hexane (20 mL) et cette solution est laissée au repos pendant 3 jours. Le produit Il est obtenu sous forme de cristaux bruns foncés (rendement: 0,099g, 84%). Analyse élémentaire: Calculé. pour C27H22N5F6PRu: C, 48.95, H, 3.35, N, 10.57. trouvé: C, 48. 00, H, 3.58, N, 10.60. RMN 1H (CD3CN): 9.72 (dd, 1H, H14, 3J=5.0, 4J=1.5), 8.72 (dd, 1H, H16, 3J=8.2, 4J=1.4), 8.30 (dd, 1H, H23, 3J=7.4, 4J=1.3), 8.22 (m, 1H, H18), 8.20-8.17 (m, 2H, H15 et H11), 8.15 (dd, 1H, H12, 3J=5.3, 4J=1.4), 8.03 (d, 1H, H19, 3J=8.9), 7.88 (dd, 1H, H9, 3J=7.8, 4J=1.2), 7.84 (d, 1H, H6, 3J=8.1), 7.48 (ddd, 1H, H5, 3J=8.1, 3J=7.4, 4J=1.6), 7.37 (dd, 1H, H10, 3J=8.1, 3J=5.4), 7.34 (ddd, 1H, H3, 3J=5.7, 30 4J=1.6, 5J=0.8), 7.30 (dd, 1H, H21, 3J=7.3, 4J=1.3), 7.11 (dd, 1H, H22, 3J=7.7, 2873037 21 3J=7.2), 6.58 (ddd, 1H, H4, 3J=7.3, 3J=5.8, 4J=1.5), 2.29 (s, 3H, NCMe), 2.07 (s, 3H, NCMe). RMN 13C{1H} (CD3CN): 192.6 (Cl), 169.5 (C8), 156.1 (C15), 152.0 (C3), 151. 5 (C14), 150.7 (C2), 147.4 et 146.8 ( C26 et C25), 139.0 (C23), 136.5 (C16), 136.4 (C5), 135 (C18), 131.3 et 131.1 (C20 et C17), 129.2 (C21), 128.4 (C12), 128.3 (C19), 126.8 (Cl1), 125.1 (C10), 124.7 (C9), 125.5 et 122.7 (NCMe), 121.9 (C4), 121.5 (C22), 118.8 (C6), 4.40 et 4.01 (NCMe). Synthèse du composé 12: io [Ru(C6H4-2-05H4N)(4,4'-dimethyl-2,2'bipyridine)(NCMe)2]PF6 12: on ajoute la 4,4'-diMe-2,2'-bipyridine (0,032g, 0.181 mmol) au composé 8 (0,102g, 0.181 mmol) dissout dans CH2Cl2 (13 mL) . La solution est agitée à température ambiante pendant 2 jours, l'évolution de la réaction étant suivie par RMN du proton. Le solvant est ensuite évaporé sous vide et le résidu est dissout dans le minimum d'acétonitrile/Et2O (1:1) et de n-hexane (30 mL) et cette solution est laissée au repos pendant 3 jours. Le produit 11 est obtenu sous forme de cristaux bruns foncés Anal. Calcd. pour C27H26N5F6PRu C, 48.65, H, 3.93, N, 10.51. trouvé: C, 48.83, H, 4.32, N, 10.30. RMN 1H (CD3CN): 9.18 (d, 1H, H14, 3J=5.5), 8.30 (s, 1H, H16), 8.21 (ddd, 1H, H6, 3J=7.4, 4J=1.3, 5J=0.5), 8.09 (s, 1H, H17), 7.85-7.81 (m, 2H, H9 et H12), 7.68-7.66 (m, 2H, H15 et H19), 7.52 (ddd, 1H, H10, 3J=8.2, 3J=7.4, 4J=1.6) , 7.44 (ddd, 1H, H3, 3J=5.7, 4J=1.6, 5J=0.8), 7.24 (td, 1H, Hl 1, 3J=7.3, 4J=1.3), 7.05 (ddd, 1H, H5, 3J=7.7, 3J=7.2, 4J=1.3), 6.85 (dd, 1H, H18, 3J=5.9, 4J=1.8), 6.73 (ddd, 1H, H4, 3J=7.3, 3J=5.7, 4J=1.5), 2.64 et 2.34 (2s, 6H, CH3), 2.21 et 2.19 (2s, 6H, NCMe). Synthèse du composé 13 [Ru-2-(CH2NMe2)-C6H4-(bipy) (NCMe)2]PF6 On ajoute un équivalent de 2,2'- bipyridine à une solution de 5 (0,1 g) dans 15mL d'acétonitrile. Le mélange est agité pendant 24h. La solution pourpre obtenue est évaporée sous vide et le résidu est chromatographié sur une colonne d'alumine 2873037 22 avec I'acétonitrile comme éluant. La bande pourpre foncée est recueillie et évaporée sous vide. Le composé 13 est obtenu sous la forme de cristaux pourpres foncés en faisant diffuser de l'éther éthylique dans une solution de 13 dissout dans le minimum de dichlorométhane/acétonitrile (1:1) (rendement: 53%). Analyse élémentaire: Calculé. pour C29H38N5F6PRu: C, 49.57, H, 5.45, N, 9.97. trouvé: C, 49.21, H, 5.60, N, 9.62. RMN IH (CD3CN): 9.52 (dd, 1H, 3J 6.0, 4J 1.6, H2"), 8.69 (dd, 1H, 3J 5.5, 4J 1.1, H2'), 8.65 (d, 1H, 3J 8.2, H"), 8.53 (d, 1H, 3J 7.7, H5'), 8.17 (td, 1H, 3J 7.7, 4J 1.1, H4"), 7.92 (td, 1H, 3J 8.2, 4J 1.6, H4'), 7.86 7.80 (m, 2H, H3" + H5), 7.36 (ddd, 1H, io 3J 7.1, 3J 6.0, 4J 1.6, H3'), 7. 08 (td, 1H, 3J 7.1, 4J 1.1, H4), 7.00 (d, 1H, 3J 7.2, H2), 6.85 (td, 1H, 3J 7.1, 4J 1.1, H3), 3.88 (d, 1H, 2J 13.8, CH2), 3.30 (d, 1H, 2J 13.8, CH2), 2.45 (s, 3H, NCMe), 2.18 (s, 3H, NMe2), 2.07 (s, 3H, NCMe), 1.36 (s, 3H, NMe2). RMN 13C (CD3CN): 168.46, 159.49, 155.80, 153.17 (C2'), 150.65 (C2"), 148. 03, 137.61 (C5), 135.96 (C4"), 134.96 (C4'), 126.52 (C3"), 125.43 (C3'), 125. 28 (C4), 122.82 (C5'), 122.60 (C5"), 120.76 (C2), 120.27 (C3), 118.03, 73. 02 (CH2), 52.00 (NMe2), 50.46 (NMe2), 4.00 (NCMe), 3.16 (NCMe). Synthèse des composés 14 à 25: Les composés 14 à 25 ont été obtenus par une méthode analogue à celle utilisée pour la synthèse de 13. Dans un premier temps les composés analogues au composé 5 ont été obtenus en utilisant à la place de la N,N dimethylaminomethylbenzene le ligand substitué correspondant. Dans un deuxième temps, ces composés ont été traités par la 2,2'-bipyridine comme dans l'exemple ci-dessus, les rendements sont analogues à ceux obtenus pour 13. 2. TEST DE PROLIFERATION DES COMPOSES SELON L'INVENTION SUR DES LIGNEES CELLULAIRES TUMORALES Cellules 2873037 23 Les produits sont testés sur différentes lignées cellulaires. Les cellules utilisées sont des RDM4 issues d'un lymphome T murin ainsi qu'une lignée MOLT-4, provenant d'une leucémie lymphoblastique aiguë. Ces lignées cancéreuses expriment toutes les deux la protéine p53, contrairement aux cellules HL-60 issues s d'une leucémie promyélocytaire humaine où, à la suite d'une délétion de son gène, p53 est absente. L'influence de la protéine p53 dans les effets induits par les produits a été déterminée en utilisant la lignée lymphoblastoïde humaine TK6 (p53 sauvage) et son variant NH32 dont le gène p53 a été totalement inactivé par double io recombinaison homologue (Chuang et al, 1999). Les cellules TK6 proviennent de l'American Tissue Culture Collection (ATGC, Manassas, VA, USA). Les cellules NH32 ont été fournies par H. L. Liber (Chuang et al, 1999). Toutes ces cellules sont cultivées dans du RPMI 1640-Glutamax, supplémenté par 10% de sérum foetal de veau inactivé à la chaleur à 56 C pendant 30 minutes, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 mM d'acides aminés non essentiels et 50pg/mL de gentamycine (Life Technologies, Cergy Pontoise, France). Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37 C avec une atmosphère saturée d'humidité, à 5% de CO2. La concentration et la viabilité des cellules sont déterminées par test d'exclusion au 20 Bleu de Trypan (Sigma-Aldrich, France) et la densité cellulaire est maintenue à une concentration inférieure à 106 cellules/mL. Test de prolifération Ce test utilise le réactif UptiBlue (Interchim, Montluçon, France), métabolisé par les cellules vivantes. Les cellules sont incubées en plaques de 96 puits à 104 celluleslpuit (200pL) avec le produit et cultivées pendant 72 heures. Puis 20pL d'UptiBlue sont ajoutés dans chaque puits. Après 3 heures d'incubation, la fluorescence des échantillons contenus dans les plaques est mesurée à 590nm (excitation à 560nm), à l'aide d'un lecteur de micro-plaques Fluorolite 1000 (Dynex technologies, Issy-Les-Moulineaux, France). RÉSULTATS Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 suivant. 5 Tableau 1 IC50 ( M) Composés du Lignée ruthénium RDM4 1 40 2 - 3 - 4 50 40 6 - 8 >50 9 12 >50 11 11 12 9 13 11 14 15 Cisplatine 0,3 9 (NH32) : 3; 9 (Molt-4) : 3,8; 9 (WTK1) : 3; 9 (U-937) : 3. RDM4: lymphome, souris AKR TK6: lignée lymphobiastoide humaine NH32: variant de TK6, n'exprimant pas p53 ("p53 knock-out") io WTK1: autre variant de TK6, exprimant un gène p53 muté MOLT-4: leucémie lymphoblastique T humaine U- 937: leucémie promonocytaire humaine 2873037 25 - Test de prolifération de la lignée RDM4 avec chaque composé La sélection des anti-cancéreux potentiels est faite, dans un premier temps, sur la lignée RDM4. L'effet des différents composés organo-ruthénés sur la viabilité cellulaire est d'abord déterminé par un test de prolifération en fonction de la concentration en produit. L'activité des composés dérivés du Ru est comparée à celle du cisplatine. L'exposition des cellules RDM4 à ces dérivés se traduit par une diminution dose- dépendante de leur prolifération. L'effet dépend donc du complexe organique qui entoure le noyau de Ru. La concentration d'inhibition de la io croissance de 50% des cellules (IC50) est déterminée pour chacun des produits. De tous les composés testés, les composés 9 et 11 apparaissent comme étant les plus actifs avec une IC50 comprise entre 10 et 15pM. Les dérivés du ruthénium montrant une IC50 trop importante (>50pM) ont été éliminés de l'étude biologique - Mesure de l'apoptose par marquage à l'annexine-V sur des RDM4 traitées avec les complexes 9 et 11 La mesure de la mort cellulaire est faite par un premier marquage spécifique de l'apoptose. L'externalisation des phospholipides anioniques, normalement situés sur le feuillet interne de la membrane plasmique, est un des marqueurs précoces de l'apoptose (Martin et al, 1996). L'annexine-V est une protéine qui se fixe spécifiquement sur les phosphatidyl-sérines en présence de calcium. Lorsque l'annexine-V est couplée à un fluorochrome, il permet de quantifier les cellules apoptotiques par cytométrie en flux. Les cellules sont marquées après 24h, 48h et 72h de traitement avec les produits 9 et 11 à deux concentrations différentes: l'IC50 (15pM) et une concentration supérieure qui garantit une inhibition importante de la prolifération (45pM). Les cellules contrôles sont traitées avec l'équivalent en volume de solvant (éthanol). Le traitement avec 15pM de produit ne montre pas d'effet. Après 72h, le taux d'apoptose est toujours aussi faible que celui des cellules contrôles. En revanche, 2873037 26 avec le traitement à 45pM, ce taux atteint déjà 70% à 24h et dépasse 99% après 48h, signe d'une induction d'apoptose importante. - Mesure de la fragmentation de l'ADN par marquage à l'iodure de propidium sur 5 des RDM4 traitées avec les complexes 9 et 11 Un second marquage spécifique de l'apoptose est la fragmentation de l'ADN entre les nucléosomes. L'ADN fragmenté se retrouve dans les corps apoptotiques en phase terminale de l'apoptose. Cet ADN est hypodiploïde et donc de quantité inférieure à celle présente dans les cellules normales. II peut être quantifié par cytométrie en flux après une perméabilisation de la membrane des cellules et un marquage à l'IP. La quantité d'ADN dans une cellule normale est de 2n en phase GO/G1 et de 4n en phase G2. L'ADN subGO de quantité inférieure à 2n présente donc une intensité de fluorescence plus faible. Les cellules traitées avec 15pM de produit présentent une accumulation en phase GO/G1 pendant les deux premiers jours de l'expérience. Ce phénomène tend à s'estomper après 48h de traitement. En revanche lorsque les cellules sont traitées à 45pM, la formation des particules hypodiploïdes, visualisées par le contenu en ADN sub-GO, est inférieure à 10% à 24h et dépasse les 50% à 48h pour atteindre les 60% à 72h. La fragmentation de l'ADN montre que l'apoptose induite par les produits survient rapidement. La quantité de particules hypodiploïdes chez les cellules contrôles reste inférieure à 4% pendant cette même période. Les deux complexes organo-ruthénés présentant un effet antiprolifératif sont capables d'accumuler les cellules RDM4 en phase GO/G1, mais également de générer leur apoptose rapidement à plus forte concentration signe d'une toxicité dose-dépendante. 3. APOPTOSE ET PROTÉINE P53 Le rôle de la protéine p53 est central dans la gestion de l'apoptose et l'induction du 30 blocage cellulaire. En cas d'altération de l'ADN cellulaire, cette protéine est un 2873037 27 facteur transcriptionnel qui régule l'expression d'autres protéines intervenant dans le blocage du cycle, la réparation de l'ADN et dans l'induction de l'apoptose (Alarcon-Vargas & Ronai, 2002). - Effets comparés du complexe 11 et du cisplatine sur la prolifération des lignées MOLT-4 et HL-60 Les cellules MOLT-4 possèdent le gène p53 qui est supprimé par délétion chez les HL-60. Les résultats des tests de prolifération comparés montrent que le produit 11 et le cisplatine ont des incidences différentes sur l'activité proliférative de ces io lignées. Le cisplatine diminue la prolifération des cellules MOLT-4 de façon plus importante, (IC50 - Effets comparés du complexe 11 et du cisplatine sur la prolifération des lignées TK6 et NH32 Le râle de la protéine p53 sur la prolifération cellulaire en présence du complexe 11 et du cisplatine est également étudié sur d'autres lignées cellulaires: les cellules lymphoblastoïdes humaines TK6 (p53 sauvage) et leurs variants NH32 (p53 -/-). Les courbes de prolifération des deux types cellulaires peuvent être superposées. La variation du statut de la protéine p53 ne semble pas avoir d'effet sur l'action anti-proliférative du complexe de Ru. Par contre le cisplatine provoque un effet plus important sur les cellules p53 +/+ que sur les cellules p53 déficientes. p53 joue 2873037 28 donc un rôle dans le pouvoir inhibiteur du cisplatine. Cependant l'action antiproliférative du cisplatine est moins importante que celle du complexe 11. - Mesure de l'apoptose par marquage à l'annexine-V sur des cellules TK6 et NH32 5 traitées avec le complexe 11 La toxicité du complexe organoruthéné sur les cellules lymphoblastoïdes TK6 et NH32 est mesurée avec l'annexine-V, marqueur spécifique de l'apoptose précoce. Ce marquage est effectué sur des cellules traitées avec le dérivé 11 à 1,5pM après Oh, 24h, 48h, 72h et 96h. Les résultats montrent que l'externalisation des phosphatidyl-sérines dépasse 50% à 48h et atteint 90% après 72h de traitement continu. Au-de là de 72h, l'apoptose atteint la limite maximum de 90% et forme un plateau. Chez les cellules contrôles, le taux d'apoptose reste inférieur à 10% tout au long de l'expérience. L'augmentation avec le temps de l'externalisation des phospholipides anioniques est similaire chez les deux lignées cellulaires, mais les cellules TK6 entrent en apoptose avec un retard d'une douzaine d'heures sur leurs variants p53 déficients. La lignée NH32 atteint la limite formée par le plateau de 90% plus tôt que les cellules TK6. La protéine p53 semble retarder l'activation des signes précoces de l'apoptose induite par les complexes du Ru. 4.AssoClATION CHIMIO-RADIOTHERAPEUTIQUE Les IC50 du cisplatine et du complexe organo-ruthéné 11 mesurées sur les RDM4 sont respectivement d'environ 0,7pM et 15pM. Des cellules de cette même lignée sont traitées avec des concentrations de 0,7pM de cisplatine et 15pM de complexe 11. 24 heures après le début du traitement, les cellules sont irradiées à 4Gy avec des neutrons rapides. Les effets de l'association chimioradiothérapeutique sont alors déterminés par simple comptage cellulaire en mesurant la concentration de cellules dans le milieu au cours du traitement à 24h, 72h et 168h après l'irradiation. Les échantillons non-irradiés, traités et non-traités, ont tous une prolifération exponentielle. Cette croissance est ralentie par l'ajout des complexes chimiques organo-métalliques. Le cisplatine à 0,7pM inhibe la prolifération plus efficacement que le dérivé ruthéné à 10NM. L'association chimio-radiothérapeutique augmente s l'efficacité des composés chimiques et montre un effet supérieur à une simple addition des effets des radiations ionisantes et des complexes pris séparément. La courbe du dérivé ruthéné 11 seul se superpose à celle des cellules contrôles. L'effet antiprolifératif de ce complexe à cette concentration est négligeable. Mais l'addition de radiations ionisantes à ce produit entraîne un effet radical rendant la io prolifération cellulaire quasiment nulle pendant la durée de l'expérience. Cette observation ne se retrouve pas de façon aussi importante avec le cisplatine qui, lorsqu'il est utilisé seul, a un effet cytostatique plus marqué que celui du complexe 11. 5. ANALYSE DES EFFETS CYTOSTATIQUES ET CYTOTOXIQUES DES COMPOSES DERIVES DU RUTHENIUM SUR DES CULTURES DE GLIOBLASTOMES ET NEUROBLASTOMES La première étape dans la caractérisation des effets anticancéreux des composés dérivés du ruthénium consiste à tester leur activité sur des lignées tumorales maintenues en culture et de comparer ces effets sur des lignées qui présentent des caractéristiques différentes de résistance aux traitements anticancéreux. Deux lignées de glioblastomes humaines (A172, HS683) et deux lignées de neuroblastomes (N2A et SH5Y) ont été utilisées afin de tester les effets cytostatiques des composés selon l'invention. Le cisplatine a été choisi comme agent cytotoxique de comparaison. En première approche, un test MTT a été utilisé pour mesurer l'activité d'une enzyme mitochondriale, ce qui donne une estimation du nombre de cellules. Par la suite, les effets cytotoxiques des composés selon l'invention ont été caractérisés plus finement par une analyse de la morphologie du noyau et de l'activation de la caspase 3, deux marqueurs de l'apoptose cellulaire. RÉSULTATS Plusieurs composés dérivés du ruthénium diminuent le nombre de cellules tumorales et sur l'ensemble des lignées testées, A172, HS683, N2A, et SH5Y s (Figure 1, tableau 2). Pour les composés les plus actifs (composés 6, 9 et 12), cet effet est observé à une concentration similaire ou inférieure à celle du cisplatine. En se basant sur ces expériences, il a été estimé des valeurs d'IC50 correspondant à la concentration nécessaire pour diminuer de moitié la quantité de cellules tumorales présentes par rapport à la condition contrôle. Ces résultats résumés io dans le tableau 1 ont également été reproduits dans d'autres lignées cellulaires, les HCT116 et les 293, et sur des cultures primaires de glies. Les analyses immunocytochimiques sur les cellules de glioblastome A172 ont montré qu'après 48 h de traitement les composés 6, 9 et 12 induisent une condensation et une fragmentation nucléaire caractéristique de l'apoptose (figure 2A, B). Par ailleurs, les cellules traitées avec les composés les plus actifs (composé 6) présentent un marquage important du fragment actif de la caspase 3 (figure 2A, B). Ce résultat est renforcé par l'augmentation des niveaux protéiques du fragment actif de la caspase 3 détectées par Western blot dans les cellules A172 traitées au cisplatine ou à un composé (composé 6 ou 9, figure 2C). Des résultats équivalents ont également été observés dans les cellules N2A et HCT116 (résultats non montrés). Dans leur ensemble, les résultats montrent que les composés du ruthénium (6, 9 et 12) exercent des effets cytostatiques et cytotoxiques sur les lignées de neuroblastome, de glioblastome et d'autres types cellulaires. La caractérisation des effets cytotoxiques montre que ces CDR induisent l'apoptose dans ces divers types cellulaires, à l'instar de ce qui est observé avec le cisplatine. 6. ANALYSE DES MECANISMES MOLECULAIRES MIS EN JEU PAR LES DERIVES DU RUTHENIUM L'arrêt de la prolifération cellulaire ou l'induction de l'apoptose sont des processus s cellulaires induits par diverses drogues anticancéreuses. Deux des protéines importantes dans le déclenchement de ces processus sont les protéines codées par les gènes homologues p53 et p73 (Marin and Kaelin 2000). Les protéines p53 et p73 codées par ces deux gènes sont des facteurs de transcription dont les niveaux protéiques sont induits en réponse à des dommages à l'ADN ou d'autres io stress cellulaires. L'induction des niveaux protéiques de p53 passe par une augmentation de la stabilité de la protéine qui n'est plus dégradée par la voie du protéasome (Vargas, Takahashi et al. 2003; Yang, Li et al. 2004). Le cisplatine est un inducteur de p53 et de p73 (Siddik 2003). Par ailleurs, ces protéines, en tant que facteurs de transcription, induisent l'expression de gènes particuliers directement impliqués dans l'arrêt de la croissance cellulaire, comme p21 un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines, ou dans l'apoptose, comme bax qui est localisé dans la mitochondrie et participe au relargage du cytochrome C (Prives and Hall 1999). Dans le but de déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par les dérivés du ruthénium et de les comparer à ceux induits par le cisplatine, il a été analysé l'expression de p53, p73 p21 et bax dans les lignées A172 et HCT116. RESULTATS Des analyses par Western blot ont été réalisées afin de déterminer si les CDR induisent les niveaux protéiques de p53 dans les cellules A172. Les résultats montrent des différences entre les CDR et le cisplatine. Après 24h de traitement, le cisplatine induit les niveaux protéiques de p53 mais aucun effet n'est observé pour le CDR 6 (figure 3). Par contre à 6 h de traitement, le CDR6 et le cisplatine 2873037 32 induisent p53. Un résultat équivalent est observé sur les niveaux protéiques de p73. Afin de déterminer si l'induction des protéines p53 et p73 conduit à l'activation des gènes cibles de ces protéines, l'expression de p21 et de Bax a été analysée par Western blot. Après 24 heures de traitement, le CDR 6 comme le cisplatine induisent l'expression de p21 et de Bax (figure 4). Ces expériences ont été répétées dans les cellules HCT116 qui sont largement utilisées comme modèles d'étude de l'activation de p53 par des agents anticancéreux. Dans ces cellules, il a été également observé une induction de p53 par les CDR (CDR6), mais avec certaines différences (figure 5). D'une part, la cinétique d'activation est similaire à celle du cisplatine commençant à 6h et se maintenant jusqu'à 24h. D'autre part, les CDR induisent p53 plus faiblement que le cisplatine. Cependant, l'augmentation de l'expression de p21 et l'inhibition de la phosphorylation de l'histone H3, un marqueur de prolifération cellulaire, sont identiques entre le CDR 6 et le cisplatine. Les données recueillies montrent que les CDR induisent des mécanismes moléculaires en partie identiques à ceux mis en jeu par le cisplatine (p53, p73, Bax, p21). Cependant, il existe aussi des différences qui indiquent que les CDR déclencheraient des mécanismes différents de ceux du cisplatine ou d'autres composés anticancéreux. 7. ANALYSES DE LA SENSIBILITE DES DERIVES DU RUTHENIUM AUX MECANISMES CELLULAIRES DE RESISTANCE Les effets anticancéreux de drogues telles que le cisplatine sont malheureusement largement diminuées par le déclenchement par la cellule de processus de résistance qui bloquent des mécanismes apoptotiques (mutation de p53...) ou 2873037 33 augmente l'expression de protéines qui détoxiquent la cellule. Pour le cisplatine, plusieurs mécanismes ont été décrits et ils sont également efficaces contre le carboplatine, un dérivé du cisplatine (Safaei, Katano et al. 2004). Il est donc particulièrement important de tester la sensibilité des CDR vis-à-vis de ces mécanismes de résistance afin de déterminer l'apport exact que peut avoir ces composés pour le traitement de tumeurs résistantes aux traitements chimiothérapeutiques déjà existants. L'un de ces mécanismes est la surexpression du la pompe d'export du cuivre (ATP7B) qui expulse le cisplatine hors de la cellule. Il a été montré que cette io molécule est surexprimée dans des tumeurs humaines et que des lignées cellulaires qui surexpriment cette molécule sont plus résistantes au cisplatine et au carboplatine que des lignées contrôles. RESULTATS Deux lignées cellulaires dérivées de cellules 2008 (Katano, Safaei et al. 2003) ont été étudiées. L'une surexprime la pompe ATP7B et l'autre ne contient que le vecteur contrôle. Il a été testé l'activité cytostatique du cisplatine et des CDR dans ces deux lignées en utilisant le test MTT. De manière très intéressante, il a été observé que la lignée exprimant ATP7B est significativement moins sensible au cisplatine. alors que sa sensibilité vis-à-vis du CDR6 est équivalente à celle de la lignée contrôle (figure 5). Ces résultats suggèrent que les mécanismes de résistance développés par une cellule contre le cisplatine ou envers une autre drogue sont, en partie, moins efficace contre les CDR. Il est donc envisageable d'utiliser les CDR dans le traitement de tumeurs résistantes au cisplatine ou à d'autres drogues anticancéreuses. 8. UTILISATION DES COMPOSES DERIVES DU RUTHENIUM EN COMBINAISON AVEC D'AUTRES 30 AGENTS ANTICANCEREUX 2873037 34 Les mécanismes induits par diverses drogues anticancéreuses sont différents suivant le mode d'action de ces drogues. Depuis de nombreuses années des traitements anticancéreux combinant plusieurs drogues sont utilisées de manière à augmenter leur efficacité. En se basant sur cette approche, des traitements combinant des dérivés du ruthénium à d'autres drogues comme le NCS (Néocarzinostatin) etle taxol ont été entrepris et leur efficacité comparée à celle des traitements individuels. Le NCS induit des cassures double brin de l'ADN, similaires à celles des rayons gamma (Smith and Nicolaou 1996). Le taxol perturbe io les fuseaux mitotiques (Oberlies and Kroll 2004). RESULTATS: Le NCS ou le Taxol sont des drogues avec un IC50 de l'ordre du nM. Une comparaison a été effectuée en utilisant deux doses de NCS et deux doses de Taxol. L'une qui permet d'attendre l'IC50, l'autre qui conduit à une diminution de 10% de la viabilité cellulaire après 48 h de traitement. Ces deux concentrations ont été combinées avec une concentration de dérivé du ruthénium ou de cisplatine provoquant 10 % de l'effet maximal. Le co-traitement par les dérivés du ruthénium (CDR 6) est significativement plus efficace par rapport à un co-traitement avec le cisplatine (figure 6). Des résultats équivalents sont obtenus avec le taxol et le NCS. Ces résultats montrent que les composés dérivés du ruthénium ont un effet potentialisateur significativement plus fort que le cisplatine sur l'activité d'autres drogues comme le NCS ou le taxol. RÉFÉRENCES Alarcon-Vargas D. & Ronai Z. (2002). p53-Mdm2--the affair that never ends. Carcinogenesis. 23(4), 541-7 Coelho D, Fischer B, Holl V, Jung GM, Dufour P, Bergerat JP, Denis JM, Gueulette J, Bischoff P. (2002). involvement of tp53 in apoptosis induced in human lymphoblastoid cells by fast neutrons. Radiat. Res. 157(4), 446-52 Katano, K., R. Safaei, et al. (2003). "The copper export pump ATP7B modulates the cellular pharmacology of carboplatin in ovarian carcinoma cells." Mol Pharmacol 64(2): 466-73. Marin, M. C. and W. G. Kaelin, Jr. (2000). "p63 and p73: old members of a new family." Biochim Biophys Acta 1470(3): M93-M100. Oberlies, N. H. and D. J. Kroll (2004). "Camptothecin and taxol: historie achievements in natural products research." J Nat Prod 67(2): 129-35. Prives, C. and P. A. Hall (1999). "The p53 pathway." J Pathol 187(1): 11226. Safaei, R., K. Katano, et al. (2004). "Cross-resistance to cisplatin in cells with acquired resistance to copper." Cancer Chemother Pharmacol 53(3): 239-46. Siddik, Z. H. (2003). "Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance." Oncogene 22(47): 7265-79. Smith, A. L. and K. C. Nicolaou (1996). "The enediyne antibiotics." J Med Chem 39(11): 2103-17. Vargas, D. A., S. Takahashi, et al. (2003). "Mdm2: A regulator of cell growth and death." Adv Cancer Res 89: 1-34. Yang, Y., C. C. Li, et al. (2004). "Regulating the p53 system through ubiquitination." Oncogene 23(11): 2096-106. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé complexe du ruthénium (II) de formule 5 générale (I) ou (II) suivante: U 1 N (I) \ r3L m+ Ct/R1L1 Ulm [Y-lm formule (I) ou (Il) dans laquelle: L1, L2, L3 et L4, identiques ou différents, représentent soit un ligand donneur de 2 io électrons par un atome d'azote, d'oxygène, de phosphore ou de soufre, soit un atome d'halogène, R1 représente un atome d'hydrogène ou une ou plusieurs substitutions sur le groupe phényle choisie parmi un radical (C1-6)alkyle et (C6-18)aryle, Y est un contre-ion (lorsque m = 1), mest0ou1, entre C et N, représentée par une ligne courbe, il existe une succession d'atomes formant, avec les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés sur les formules (I) et (II), le métallocycle, qui est constitué de 5 à 8 atomes (incluant les atomes de carbone, d'azote et de ruthénium représentés dans les formules (I) et (Il)). 2. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les ligands donneurs de deux électrons par un atome d'azote, d'oxygène, de phosphore ou de soufre sont choisis parmi H2O, di((C1.6)alkyl)O, di((C1.6)alkyl)S, di((C1_6)alkyl)S(0), (Ci_6)alkyl)SO3, di((C1.6)alkyl) C=0 et (CI_6)alkylCO2. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les ligands donneurs de deux électrons par un atome d'azote sont choisis parmi les ligands de formule (C1.6)alkylCN (en particulier CH3CN) et des ligands pyridine, éventuellement substitués, sur un ou plusieurs atomes de carbone des cycles pyridine, par un radical (C1_6)alkyle ou un atome d'halogène. 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les ligands donneurs de deux électrons par un atome d'azote sont choisis parmi les amines primaires (C1.6)alkyle, tel que méthylamine ou éthylamine. 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les ligands 15 donneurs de deux électrons par un atome de phosphore sont les ligands de type phosphine. 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les ligands donneurs de deux électrons par un atome de phosphore sont de formule P(Ph)3_X(alkyle)X, avec x représentant 0, 1 ou 2. 7. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que dans le cas de la formule (II), au moins deux des groupements L1, L2, L3 et L4, pris deux à deux, sont reliés par au moins une liaison covalente. 8. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que dans le cas de la formule (Il), au moins deux des groupements L1, L2, L3 et L4, pris deux à deux, représentent les motifs bipyridine ou phénanthroline, éventuellement substitués, en particulier par au moins un radical alkyle. 9. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce s que, dans le cas de la formule (Il), au moins un groupement LI, L2, L3 et L4, représentant un ligand donneur de deux électrons par un atome d'azote ou de phosphore, est un groupement pyridine, phosphine, bipyridine ou phénanthroline. 10. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce io que Y- est PF6, BF4-, CF3CO2, CH3CO2, CF3SO3, ou NO3-. 11. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que m est égal à 1. 12. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la ligne courbe est un métallocycle à 5 atomes choisi parmi un métallocycle défini selon l'une des formules suivantes: R = H, Me (1) (2) (3) (4) 2873037 39 13. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la ligne courbe est un métallocycle à 6 ou 7 atomes choisi parmi un métallocycle défini selon l'une des formules suivantes: avec R, identique ou différent, représentant H ou un radical alkyle, de préférence méthyle, et R2 et R3, identiques ou différents, représentant un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alkyle, un radical alkoxy, thiol, thioether, hydroxyl, io nitro, cyano ou ester. 14. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé est choisi parmi les composés 3 à 6 et 8 à 25. (5) (6) 15. Composés du ruthénium, choisis parmi les composés suivants: NCCH3, NCCH3 PF6 PMe2Ph NCCH3 + PFs + PFs 11 12 + PFs + PFs 14 15 16 + PFs + PFs + PFs + PFs + PF6 - 21 22 PFs + + PFs - NCCH3 - 23 24 25 16. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire. 17. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des 5 cancers. 18. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des glioblastomes, des leucémies promyélocytaires, des cancers de la prostate, des ovaires, des poumons, des seins, des voies digestives, en particulier du foie, du io pancréas, de la tête et du cou, du colon, des lymphomes non-Hodgkiniens ou des mélanomes. 19. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des cancers par accumulation des cellules tumorales en phase GO/G1, et 15 éventuellement par induction d'apoptose. 20. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des tumeurs résistantes au cisplatine ou à d'autres drogues anticancéreuses. 21. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des cancers en combinaison avec un traitement anti-cancéreux mettant en oeuvre des rayonnements, tel que la radiothérapie. 22. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, destinée à traiter des 25 cancers en combinaison avec au moins un autre agent chimique anticancéreux, conditionné et administré de façon combinée, séparée ou séquentielle.