Brevet FR2884144A1 — publié le 20061013

L'invention concerne la combinaison, dans une solution ou dans un kit, d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. L'invention concerne également une méthode de marquage de cellules ou tissus par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, dans laquelle les cellules ou tissus mis en contact avec un fixateur histologique ou cytologique sont marqués, simultanément ou après, par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones. Des composés photoactivables de la famille des quinones incluent en 10 particulier des quinones polycycliques telles que l'hypericine, l'hypocrelline A ou l'hypocrelline B, ou des dérivés de celles-ci. "Dérivé" signifie un composé modifié chimiquement dans lequel la modification est considérée comme une routine par le chimiste à compétences ordinaires, tel qu'un ester ou un amide d'un acide, des groupes de protection, tels qu'un groupe benzyle pour un alcool ou un thiol, et un groupe tert-butoxycarbonyle pour une amine. L'hypocrelline A (1H-Cyclohepta[ghi]perylene-5,11-dione, 1-acétyl-2,3dihydro-2,6,12-tihydroxy- 4,8,9,13-tétraméthoxy-2-méthyl-, cis-) et l'hypocrelline B (1 H-Cyclohepta[ghi]perylene-5,12-dione, 3-acétyl-6,11dihydroxy-4,8,9,13- tétramethoxy-2-méthyl) sont des quinones isolées à partir des champignons Hypocrella bambusae et Shiraia bambusicola. CH30 CH3O CH3O CH3O OH 0 OH ü hypocrelline A hypocrelline B Ces pigments ont été utilisés en combinaison avec une photothérapie pour le traitement de différentes maladies de la peau. Récemment des propriétés antivirales ont été identifiées et il a été montré que ces quinones constituent de puissants photosensibilisants dans le traitement photodynamique du cancer (Hirayama et al., 1997; Zhang et al., 1998). Les maxima d'absorption et d'émission de fluorescence, mesurés dans le méthanol, sont respectivement 463 nm et 600 nm pour I'hypocrelline A, et 459 nm et 5 616 nm pour l'hyprocrelline B. L'hypericine a pour formule chimique 1,3,4,6,8,13-Hexahydroxy-10,11-diméthylphénanthro(1,10,9,8,opgra) perylène-7,14-dione: C H C OH O L'hypericine est un pigment naturel isolé de plantes du genre Hypericum, 10 qui constitue un puissant inhibiteur sélectif de la protéine kinase C. L'hypericine présente une diversité de propriétés pharmacologiques qui vont d'une activité antibactérienne ou antivirale, à une activité antinéoplasique et à l'induction de l'apoptose. L'hypericine est connue de longue date pour ses effets photosensibilisants et comme entrant dans la composition d'un antidépresseur (le millepertuis). C'est une molécule fluorescente qui présente un maximum d'absorption à 591 nm et un maximum d'émission de fluorescence à 594 nm, mesuré dans l'éthanol. Il a été montré que l'hypericine perfusée dans la vessie s'accumule sélectivement dans les cellules carcinomateuses urothéliales. Cette caractéristique, associée à ses propriétés photosensibilisantes et fluorescentes, a conduit plusieurs équipes à proposer un diagnostic du cancer de la vessie par cytologie de fluorescence ex vivo (Olivo et al., 2003a; Olivo et al., 2003b; Pytel et Schmeller, 2002). L'utilisation d'hypericine en tant que traitement photodynamique des lésions carcinomateuses de la vessie a été également proposée (Kamuhabwa et al., 2004). Ces méthodes impliquent l'infusion in vivo d'hypericine dans la vessie du patient. II est connu que l'hypericine est une molécule lipophile qui peut être incorporée dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires. Les mécanismes exacts d'intégration ne sont pas connus mais il est supposé que cette intégration est médiée par un transport actif. Aussi, à ce jour l'hypericine n'a été utilisée que sur des cellules vivantes. Jusqu'à présent, il était en effet considéré comme nécessaire de pratiquer un marquage à l'hypericine sur des cellules vivantes, par exemple en cultivant in vitro des cellules dans une solution contenant de l'hypericine, ou encore en mettant l'hypericine extemporanément en contact des cellules ou des tissus fraîchement prélevés, de manière à ce que l'hypericine puisse être incorporée par les cellules vivantes. Contre toute attente, l'inventeur a maintenant démontré que l'hypericine, mélangée à un fixateur, est incorporée très rapidement par des cellules tumorales mises en suspension dans le mélange fixateur/hypericine, alors même que les cellules ont été tuées par le contact avec le fixateur. La mise en évidence de ce que l'hypericine est fixée aussi efficacement par les cellules, qu'elles soient vivantes ou mortes, ouvre de nouvelles possibilités pour le marquage cytologique ou histologique à l'hypericine, et plus généralement à l'aide de composés photoactivables de la famille des quinones. La fixation est une opération destinée à tuer les cellules pour les conserver, autant que possible, en l'état où elles se trouvaient pendant la vie. Faute de fixation, il y a risque d'autolyse. Les meilleurs fixateurs sont ceux qui, tout en agissant rapidement, produisent le moins possible de modifications secondaires ou d'artifices susceptibles de donner une idée très fausse de la morphologie interne des cellules. Désormais, il est possible d'étudier les cellules ou les tissus à tout moment, sans être obligé de les maintenir en vie, en réalisant un marquage avec un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, notamment à l'hypericine, simultanément ou consécutivement à la fixation des cellules ou tissus par un fixateur cytologique ou histologique. En outre, il a été mis en évidence que lorsque des cellules tumorales sont mises en suspension dans une solution de fixateur contenant des doses micromolaires d'hypericine, l'affinité de l'hypericine pour les cellules est telle que la quasi-totalité de l'hypericine est incorporée par les cellules. La phase liquide de la suspension cellulaire ne contenant pratiquement plus d'hypericine, il est alors possible de réaliser une analyse directe des cellules (analyse morphologique et/ou de l'émission de fluorescence) sans rinçage de la suspension cellulaire. Cette propriété permet donc d'envisager une automatisation de la préparation cellulaire/tissulaire et de l'analyse des cellules. L'invention concerne donc une solution comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De manière préférentielle encore, ladite composition comprend, ou est constituée de, un fixateur histologique ou cytologique et d'hypericine. Par fixateur histologique ou cytologique ou solution de fixation histologique ou cytologique , on entend une solution couramment utilisée en analyse histologique ou cytologique pour réaliser la fixation de cellules ou tissus. Des exemples de fixateurs cytologiques incluent des fixateurs à base d'alcool éthylique, d'alcool méthylique, ou de polyéthylène glycol (PEG). Des exemples de fixateurs histologiques incluent des fixateurs à base de formaldéhyde, comme une solution de formol pur à 10% (le formol pur correspondant à la solution aqueuse de formaldéhyde à 40%, généralement vendue dans le commerce sous la dénomination de formol ), une solution de formol - NaCl (constituée par exemple par mélange de 10 ml de formol pur, 0,9 g de NaCl et 90 ml d'eau), une solution de formol - acide acétique (par exemple 100 ml de formol pur, 50 ml d'acide acétique glacial et 850 ml d'eau), le liquide de Bouin alcoolique (ou Duboscq Brasil; par exemple 250 ml de formol pur, 70 ml d'acide acétique glacial, 5 g d'acide picrique et 680 ml d'éthanol à 70 ). D'autres exemples de fixateurs incluent le fixateur alcool - formol acétique (20 ml de formol pur, 50 ml d'acide acétique glacial, 750 ml d'alcool éthylique absolu, et 180 ml d'eau), ou encore des fixateurs à base de chlorure de zinc (formol 10%, 10-50 g/l de chlorure de zinc, et acide acétique 5% ou NaCI 9 g/I, éventuellement alcool absolu 75 %). La solution selon l'invention comprend avantageusement 1 à 20 micromoles/mI, de préférence 1 à 15 micromoles/mI, de préférence 1 à 10 micromoles/mI, et de préférence encore 1 à 2 micromoles/mI de composés photoactivables de la famille des quinones. L'invention concerne également un kit comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De préférence encore, le kit selon l'invention comprend un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine. Le kit peut optionnellement comprendre en outre un tampon de lavage approprié, une notice d'utilisation ou toute autre solution ou dispositif approprié. L'invention concerne aussi une méthode de marquage ex vivo de cellules 10 ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. Ladite méthode comprend les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la familles des quinones, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu les incorporent; et c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu. De manière préférentielle, la solution comprenant le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est la solution de fixation histologique ou cytologique. Les étapes a) et b) sont alors mises en oeuvre simultanément. Le délai de fixation d'une suspension cellulaire est très court (de l'ordre de quelques minutes) et celui d'échantillon tissulaire de l'ordre d'une heure. Or l'incorporation de composés photoactivables de la familles des quinones, notamment de l'hypericine, par des cellules en suspension prend généralement de 1 à 2 heures. La différence dans le délai d'incorporation des composés photoactivables de la familles des quinones et dans le délai de fixation des cellules ou tissus garantit que, selon la méthode de l'invention, les composés photoactivables de la familles des quinones sont incorporés alors que les cellules ont déjà été fixées, autrement dit sont mortes. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De préférence encore la méthode est une méthode de marquage ex vivo de cellules ou d'un tissu par l'hypericine. Les cellules ou le tissu sont préférentiellement des cellules tumorales ou suspectées d'être tumorales. L'échantillon de cellules ou de tissu peut ainsi être obtenu par prélèvement ou biopsie chez un patient suspecté d'être atteint d'un cancer et chez qui on cherche à mettre en évidence la présence de cellules tumorales. L'échantillon peut également avoir été obtenu d'un patient chez qui on a diagnostiqué un cancer et pour lequel on évalue l'efficacité d'un traitement thérapeutique en mesurant l'évolution au cours du temps de l'incorporation d'hypericine par les cellules cancéreuses. Les cellules ou tissu peuvent provenir de n'importe que l'organe, par exemple l'utérus, le foie, l'estomac, le poumon, l'oesophage, la vessie, la prostate, sein, etc. Un échantillon de cellules peut par exemple être un prélèvement de liquide tel que les urines, l'ascite, le liquide pleural ou péricardique; d'un frottis tel qu'un frottis cervical, vaginal, vulvaire, ou oesophagien; d'un écoulement mamellaire ou encore d'une ponction d'organe, par exemple une glande superficielle telle que le sein, la thyroïde et la parotide ou d'organe profond, tel que le rein, le foie, les ovaires, etc. Un échantillon de tissu peut être une biopsie ou une exérèse totale ou en partie de n'importe quel organe. Le patient peut être un animal, de préférence un mammifère tel qu'un humain, un rongeur, un chien, un chat. De préférence le patient est un humain. L'invention concerne également l'utilisation d'une solution comprenant un fixateur histologique et cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, pour le diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie, ou le suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement ou d'un cancer. L'invention propose plus spécifiquement une méthode de diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie, dans laquelle on réalise un marquage de cellules ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones selon la méthode décrite plus haut, et où la présence de cellules ou d'un tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est révélatrice de la présence de cellules tumorales ou dysplasiques. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant de l'hypericine, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent l'hypericine; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie. La détection d'un marquage des cellules ou tissu par des composés photoactivables de la famille des quinones peut être aisément effectuée en mesurant la fluorescence émise par les cellules ou le tissu, notamment aux alentours de 600 nm pour l'hypericine, l'hypocrelline A ou l'hypocrelline B. L'exemple suivant illustre l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE Des cellules d'un glioblastome de souche humaine sont cultivées sur boîte de Pétri. De l'hypericine est mise en suspension dans une solution de fixateur cytologique Sakomano, avec une concentration de 2 micromoles par ml, quatre heures avant les expérimentations. La solution de fixateur comprenant l'hypericine est conservée à l'abri de la lumière. Les cellules de glioblastome sont fixées directement en les mettant dans la solution de fixateur préparée à base d'hypericine pendant une heure. Des tests comparatifs sont menés avec un microspectrofluorimètre pour comparer le niveau d'intensité de fluorescence et la qualité du spectre de fluorescence mesurés dans des cultures de cellules de glioblastome vivantes identiques, incubées à la même concentration pendant une heure dans la solution de fixateur cytologique Sakomano contenant de l'hypericine, et les cellules fixées. Les résultats montrent que les spectres sont totalement superposables et que les intensités de fluorescence sont identiques entre les cellules encore vivantes et les cellules fixées. REFERENCES Hirayama J., et al. (1997) Photoinactivation of virus infectivity by hypocrellin A; Photochem. Photobiol. 66, 697 Kamuhabwa A, Agostinis P, Ahmed B, Landuyt W, van Cleynenbreugel B, van Poppel H, de Witte P. (2004) Hypericin as a potential phototherapeutic agent in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. Photochem Photobiol Sci. ; 3(8):772-80. Epub 2004 Apr 2. Olivo M, Lau W, Manivasager V, Bhuvaneswari R, Wei Z, Soo KC, Cheng 10 C, Tan PH. (2003b) Novel photodynamic diagnosis of bladder cancer: ex vivo fluorescence cytology using hypericin. Int J Oncol. ; 23(6):1501-4. Olivo M, Lau W, Manivasager V, Tan PH, Soo KC, Cheng C. (2003a) Macromicroscopic fluorescence of human bladder cancer using hypericin fluorescence cystoscopy and laser confocal microscopy. Int J Oncol. ; 23(4):983-90. Pytel A, Schmeller N. (2002) New aspect of photodynamic diagnosis of bladder tumors: fluorescence cytology. Urology. ; 59(2):216-9. Zhang J., et al.; (1998) Photodynamic effects of hypocrellin A on three human malignant cell Unes by inducing apoptotic cell death J. Photochem. Photobiol. B. 43, 106 9 2884144 REVENDICATIONS 1. Solution comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. 2. Solution selon la revendication 1, comprenant 1 à 20 micromoles /ml de composés photoactivables de la famille des quinones. 3. Solution selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine. 4. Kit comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. 5. Kit selon la revendication 4, comprenant un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine. 6. Méthode de marquage ex vivo de cellules ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent le ou les composés photoactivables de la famille des quinones; et c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu. 7. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle ladite solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones est la solution de fixation histologique ou cytologique et les étapes a) et b) sont mises en oeuvre simultanément. 8. Méthode selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle on marque des cellules ou un tissu par l'hypericine. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 86 à 8, dans laquelle l'échantillon de cellules ou de tissu provient d'un patient suspecté d'être atteint d'un cancer. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l'échantillon des cellules est un prélèvement de liquide, un frottis, un écoulement mamellaire, ou une ponction d'organe. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle l'échantillon de tissu est une biopsie ou une exérèse totale ou partielle d'un organe. 12. Utilisation d'une solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie, ou pour le suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement du cancer. 13. Méthode de diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent le ou les composés photoactivables de la famille des quinones; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie. 14. Méthode de diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie selon la revendication 13, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant de l'hypericine, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent l'hypericine; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie.