Brevet FR2884717A1 — publié le 20061027

La présente invention est relative à la déplétion de l'arginine plasmatique, à des compositions permettant d'assurer cette déplétion et au traitement des pathologies susceptibles de bénéficier de cette déplétion et de ses conséquences, par exemple sur la synthèse d'oxyde nitrique. Ainsi l'invention est relative au traitement de certaines tumeurs, telles que le mélanome malin et l'hépatocarcinome, et à la prévention et au traitement du choc septique. L'arginine est un acide aminé non essentiel. Il est synthétisé dans le cours du cycle lo de l'urée, à partir de la citrulline en deux étapes et grâce à l'argininosuccinate synthétase et l'argininosuccinate lyase. La première enzyme catalyse la conversion de la citrulline en argininosuccinate et la deuxième réalise la conversion en arginine. L'arginine est métabolisée en ornithine sous l'action de l'arginase et l'ornithine peut être à son tour transformée en citrulline par une réaction catalysée par l'ornithine transcarbamoylase. Il a été montré en revanche que certains types de cellules tumorales ont besoin d'un apport d'arginine ce qui a conduit à considérer la dépression de l'arginine comme un traitement possible de ces formes de cancers dites auxotrophes à l'arginine. L'activité anti-tumorale de l'arginine déiminase a fait l'objet de nombreuses publications. Une activité in vivo a ainsi été démontrée vis-àvis du mélanome malin et de l'hépatocarcinome. Cependant, cette enzyme présente des inconvénients majeurs. L'arginine déiminase n'est pas produite chez les mammifères mais est obtenue à partir de micro-organismes, ce qui en fait un composé fortement antigénique pour un mammifère. En outre, cette enzyme a une demi-vie très courte chez les mammifères, de l'ordre de 5 heures environ et doit être administrée à forte dose journellement pour développer son efficacité. Pour résoudre ces inconvénients, des auteurs ont proposé des formes péguilées de cette enzyme, c'est-à-dire de l'arginine déiminase conjuguée à du polyéthylène glycol (PEG), ce qui a conduit à des formulations moins antigéniques et ayant une demi-vie plus longue (de 7 à 9 jours). Parmi les publications traitant de ce sujet, on peut citer les travaux suivants sur le traitement du mélanome et de I'hépatocarcinome: F. Izzo et al., J. Clin. Oncol. 2004, 22: 1815-1822; C.M. Ensor et al., Cancer Research 2002, 62: 5443-5450; F.W. Holtsberg et al. J. Control. Release 2002, 80: 259271; J.S. Bomalaski et al., Preclinica, Research Article Nov/Dec 2003, 1, 5: 284-293; Curley S A et al., Hepatogastroenteroplogy, 50, 1214-6, 2003. to Le brevet US 4,965,857 propose une toute autre méthode consistant à réaliser un traitement extra-corporel du sang en utilisant un réacteur dans lequel l'arginine déiminase agit sur la circulation extracorporelle. Les traitements actuels à base d'arginine déiminase péguilée sont intéressants, mais souffrent de certaines limitations liées à la nécessité d'administrer des doses relativement importantes et répétées à des moments rapprochés, du fait d'une demi-vie qui reste encore courte, et à la toxicité liée à l'administration répétée et à forte dose, avec à la longue le risque d'induire des taux d'anticorps contre le principe actif susceptibles de conduire à des phénomènes allergiques et à l'inhibition du principe actif. II serait donc d'un grand intérêt de disposer d'un produit actif ayant une meilleure biodisponibilité (meilleure activité biologique, durée de demi-vie prolongée), permettant d'optimiser la quantité d'enzyme administrée et de diminuer la toxicité, même en cas de traitements répétés, et limitant les risques de réaction immunitaire et d'allergie clinique. L'intérêt de l'utilisation des globules rouges comme vecteurs de médicaments a été proposée depuis longtemps. Ils ont une biocompatibilité naturelle et après transfusion, ils sont totalement biodégradables selon un processus connu et ont une demi-vie in vivo relativement longue (demivie de l'ordre de 30 jours environ chez l'homme). L'encapsulation de l'arginase, enzyme naturelle du cycle de l'urée, a été proposée et testée dans le cadre du traitement de patients hyperargininémiques présentant un déficit de leurs hématies en cette enzyme. (C.G. Millan, J. Controlled release 2004, 95:27-49; K. Adriaenssens et al., Int. J. Biochem. 1984, 16, 7: 779-786). L'objectif était de compenser les déficiences métaboliques et enzymatiques liées à un déficit en arginase endogène. L'arginase possède un pH optimal alcalin situé aux environs de 9,5, et son activité à pH physiologique est faible. Au contraire, l'arginine déiminase a un pH optimal de to 6,5 environ, conserve plus de 70% de son activité à pH physiologique et présente une affinité pour l'arginine 1000 fois supérieure à celle de l'arginase: B.J. Dillon et al., Med. Sci. Monit. 2002, 8, 7: 248-253. Dans cette étude relative à l'inhibition de la synthèse de l'oxyde nitrique NO, les auteurs rapportent une forte activité de l'arginine déiminase sur l'arginine extracellulaire, mais une absence d'activité sur l'arginine intracellulaire (macrophages). Le NO est un biomédiateur dont on pense qu'il est synthétisé essentiellement à partir de l'arginine extracellulaire. Le choc septique est médié par NO et par le facteur de nécrose tumorale TNFa. L'inhibition de la synthèse de NO a été envisagée comme traitement contre le choc septique, d'où les travaux de Dillon et al. supra et de J.B. Thomas Biochem. J. 2002, 363, 581-587. Le NO semble aussi impliqué dans le processus de cancérisation comme rapporté dans Lind DS. Arginine and cancer. J. Nutr. 2004: 2837S-41. II apparaît que l'arginine déiminase possède un potentiel de dégradation de l'arginine et d'inhibition de la synthèse de NO très supérieur à l'arginase. Cependant, cette enzyme n'aurait pas d'activité enzymatique intracellulaire, son pH optimal n'est pas le pH physiologique, elle a une demi-vie courte et est susceptible d'induire une réaction immunitaire. Partant de cette situation complexe, les inventeurs se sont donnés pour objectif de proposer une solution technique permettant de dégrader efficacement l'arginine plasmatique et/ou d'inhiber la synthèse d'oxyde nitrique NO. Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'érythrocytes renfermant de l'arginine déiminase pour la préparation d'un médicament permettant de faire diminuer la concentration d'arginine plasmatique in vivo. L'arginine déiminase est identifiée sous la référence EC 3.5.3.6 dans IUBMB Enzyme Nomenclature. L'enzyme employée peut être d'origine naturelle, synthétique, artificielle ou obtenue par génie génétique (par exemple production de l'enzyme dans une cellule hôte, par exemple E. coli, ayant intégré un vecteur d'expression du gène codant pour l'enzyme). Des arginines déiminases utilisables sont décrites par exemple dans EP-A-1 011 717, EP-A-O 414 007, US-A-5 372 942, JP-A-6062867, JP-A-2053490, JP-A2035081. De manière équivalente, l'invention inclut l'emploi d'analogues de cette enzyme qui peuvent être notamment des enzymes qui ont été modifiées afin d'accroître leur activité enzymatique (EP-A-0 981 607). La présente invention vise à dépléter l'arginine plasmatique, ce qui signifie la diminution de la concentration en arginine dans le plasma. Sans vouloir être lié à la théorie, on pense que l'arginine plasmatique pénètre par diffusion passive dans les érythrocytes traités. Les érythrocytes de l'invention se comportent comme des bioréacteurs dans lesquels l'arginine entrante est dégradée par l'arginine déiminase. L'invention présente d'autres avantages. En fin de vie, les érythrocytes sont détruits par les macrophages, essentiellement dans le foie, la rate et la moelle osseuse, ainsi que dans les poumons. Il s'ensuit une libération ciblée de l'arginine déiminase, entraînant une déplétion locale de l'arginine plasmatique. Ce phénomène est mis à profit lors du traitement de pathologies, en particulier de tumeurs, affectant ces organes, tels que l'hépatocarcinome. La solution retenue par l'invention permet de combiner de manière remarquable plusieurs avantages déterminants, à savoir la durée de vie des érythrocytes 3o permettant une longue durée d'action, le stockage de l'enzyme dans un environnement, d'une part, favorable, avec un pH généralement inférieur à 7,4 pour lequel l'enzyme présente une activité enzymatique supérieure à 80% et, d'autre part, préservé, l'enzyme étant isolée du système immunitaire ce qui diminue le risque de développer une réaction immunitaire contre l'enzyme, ce qui est un atout dans le cas de traitements répétés. L'enzyme est protégée vis-à-vis d'éventuels anticorps antiarginine déiminase, par la membrane des érythrocytes et son activité enzymatique est donc préservée même lorsque des anticorps sont présents dans le sang du patient traité. En outre, les cellules saines seront préservées, dans la mesure où s l'enzyme n'agit pas sur l'arginine intracellulaire. L'invention trouve donc une application particulièrement intéressante dans les tumeurs arginine-dépendantes pour lesquelles l'effet favorable de la déplétion de l'arginine plasmatique est démontré (voir par exemple F. Izzo et al., 2004, C.M. o Ensor et al., 2002, F.W. Holtsberg et al. 2002, J.S. Bomalaski et al., 2003, et Curley S A et al., 2003, précités). Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, le médicament est destiné au traitement des tumeurs arginine-dépendantes. Par argininedépendantes on entend is des tumeurs impliquant des cellules tumorales qui ont besoin d'arginine pour se répliquer, sont incapables de synthétiser tout ou partie de l'arginine dont elles ont besoin et requièrent donc un apport en arginine. La déplétion en arginine plasmatique va priver ces cellules de l'arginine dont elles ont un besoin essentiel pour se développer, conduisant à la mort ciblée de ces cellules, à l'inhibition de la croissance tumorale ou encore une régression de la masse tumorale. Selon une caractéristique, l'invention a pour objet l'utilisation de ces érythrocytes, pour la préparation d'un médicament pour traiter l'hépatocarcinome ou cancer primitif du foie. Selon une deuxième caractéristique, l'invention a pour objet l'utilisation de ces érythrocytes, pour la préparation d'un médicament pour traiter le mélanome malin, sous ses différentes formes, telles que le mélanome superficiel extensif et le mélanome nodulaire. Suivant un deuxième mode de réalisation de l'invention, l'invention a pour objet l'utilisation de ces érythrocytes, pour la préparation d'un médicament pour inhiber la synthèse d'oxyde nitrique. Il convient de préciser que le médicament agit au moins en partie via la dégradation de l'arginine plasmatique, comme décrit dans Dillon et al. 2002, précité. Suivant une caractéristique de ce mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation de ces érythrocytes, pour la préparation d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement du choc septique. L'invention vise encore l'utilisation de ces érythrocytes, pour la préparation d'un médicament pour le traitement de l'une des pathologies cancéreuses suivantes: lo - cancer du sein (Shen Wei-Chiang. et al., California Breast cancer research: http://www.cbcrp. org/research/PageGrant.asp?grant_id=1954) - neuroblastome (Gong H. et al., Int. J. Cancer 2003, 106: 723-8) - leucémie (Gong H. et al., Leukemia 2000, vol.14, 826-9; Noh EJ. et al., Int. J. Cancer 2004, 112: 502-8) ; ou encore pour l'inhibition de l'angiogénèse et le traitement de maladies associées telles que: angiome, angiofibrome, arthrite, rétinopathie diabétique, rétinopathie du prématuré, glaucome neovasculaire, maladie de la cornée, macule involutive, dégénérescence maculaire, pterygium, dégénérescence rétinienne, fibroplasie rétrocristallinienne, psoriasis, telangiectasis, granulome pyogène, dermatite séborrhéique, acné, cancer et métastases liées à l'angiogénèse (WO0209741; Park IS. et al., Br. J. Cancer 2003, 89: 907-14). L'invention a également pour objet des érythrocytes renfermant l'arginine déiminase. L'invention a encore pour objet une suspension de ces érythrocytes dans une solution saline pharmaceutiquement acceptable (en général milieu standard pour hématies, solution contenant du NaCI et un ou plusieurs ingrédients choisis parmi glucose, dextrose, adénine et mannitol; e.g. SAG-mannitol ou ADsol). Cette solution est apte à assurer la conservation des érythrocytes, et peut inclure un additif de conservation tel que la Lcarnitine. Cette suspension peut être conditionnée prête à l'emploi ou à diluer avant utilisation. Le taux d'hématocrite final du produit prêtàl'emploi (après éventuelle dilution extemporanée) est de préférence compris entre 40 et 70%. Elle est susceptible d'être administrée par voie intraveineuse, de préférence par perfusion. Une telle suspension ou toute formulation administrable contenant des érythrocytes selon l'invention constitue en soi un médicament ou une composition pharmaceutique objet de l'invention. Ce médicament ou composition peut notamment être destiné aux diverses applications précitées. II peut être conditionné par exemple sous forme de poche souple pour perfusion, ou sous une autre forme pour administration par injection. Suivant une caractéristique de l'invention, le médicament comprend une suspension io d'érythrocytes à un taux d'hématocrite compris entre 40 et 70%, de préférence entre 45 et 55%, mieux de 50%. Il est de préférence conditionné sous un volume de 10 à 250 ml. La quantité d'enzyme encapsulée correspondant à la prescription médicale est de préférence contenue intégralement dans la poche de sang. Une prescription médicale peut varier de 1 à 200 UI par kg de poids corporel. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement des formes de cancer arginine-dépendantes, telles que l'hépatocarcinome et le mélanome malin, ou l'une des autres pathologies cancéreuses ou non précitées, comprenant l'administration à un patient qui en a besoin d'une quantité efficace d'un tel médicament, notamment par voie intraveineuse, par injection ou perfusion, de préférence par perfusion. Suivant une modalité intéressante, le patient est traité après exérèse chirurgicale de la tumeur. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement destiné à inhiber la synthèse d'oxyde nitrique et/ou à prévenir et/ou traiter le choc septique, comprenant l'administration à un patient d'une quantité efficace d'un tel médicament, notamment par voie intraveineuse, par injection ou perfusion, de préférence par perfusion. Suivant une modalité particulièrement avantageuse pour ces diverses méthodes de traitement, le patient est traité avec ses propres érythrocytes, après que ceux-ci ont été traités pour encapsuler l'enzyme. En variante, les érythrocytes proviennent d'un ou plusieurs donneurs. La méthode peut ainsi comprendre le prélèvement d'un ou plusieurs échantillons de sang, par exemple poche(s) de sang, d'un patient ou d'un ou plusieurs donneurs, la préparation d'un culot d'érythrocytes, l'incorporation d'enzyme conformément à l'invention et la production d'un lot d'érythrocytes incorporant de l'enzyme, puis l'administration de la suspension (médicament) au patient, par voie intraveineuse. Typiquement, on administre un volume de suspension d'érythrocytes traités correspondant à de 1 à 200 UI d'enzyme par kg de poids corporel. Suivant une caractéristique de l'invention, on administre de 10 à 250 ml d'une suspension io d'érythrocytes à un taux d'hématocrite compris entre 40 et 70%, de préférence entre 45 et 55%, mieux de 50%. Suivant une modalité particulière, on administre une telle suspension à une fréquence comprise entre 15 jours et trois mois, de préférence mensuellement, sur une durée suffisante. Les techniques permettant d'encapsuler des principes actifs dans des érythrocytes sont connues et la technique de base par lyse-rescellement, qui est préférée ici, est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EP-A679 101, auxquels l'homme du métier pourra se référer. Selon cette technique, on alimente en continu le compartiment primaire d'un élément de dialyse avec une suspension d'érythrocytes, tandis que le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes; ensuite dans une unité de rescellement, on induit le rescellement des érythrocytes en présence de l'enzyme par augmentation de la pression osmotique et/ou oncotique, puis l'on recueille une suspension d'érythrocytes contenant l'enzyme. Parmi les variantes décrites jusqu'à présent, on préférera la méthode décrite dans la demande de brevet français n 0408667 qui permet d'encapsuler l'enzyme de 3o manière performante, reproductible, sûre et stable. Cette méthode comprend les étapes suivantes: 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque (y compris en parallèle), 3 - procédure de lyse et d'internalisation de l'enzyme, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8 C, dans une cartouche de dialyse; les paramètres de lyse étant ajustés en io fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment; et 4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40 C, et en présence d'une solution hypertonique. Par internalisation , on entend pénétration de l'enzyme à l'intérieur des érythrocytes. Suivant une première caractéristique de l'invention, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8 C, de préférence entre + 2 et + 6 C, typiquement aux alentours de + 4 C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %. Conformément à une caractéristique importante de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée sur les érythrocytes juste avant l'étape de lyse. Les érythrocytes ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est 3o rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes. Les deux paramètres permettant de maîtriser la dialyse sont le temps de présence des cellules dans le dialyseur (en fonction des caractéristiques de ce dernier) et l'osmolarité du dialysat. Les deux paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques de résistance, ou à l'inverse de fragilité, osmotique des globules rouges conditionnés pour subir les étapes de lyse/rescellement. Cette résistance osmotique peut être caractérisée par au moins un des paramètres suivants: a. l'osmolarité du milieu pour laquelle l'hémolyse apparaît, c'est-à-dire le début de la formation des pores. b. La vélocité V de l'hémolyse, déterminée par la pente de la partie linéaire de la lo courbe % hémolyse = f (osmolarité du milieu). c. Le pourcentage d'hémolyse pour une osmolarité donnée. d. L'osmolarité qui permet d'obtenir 50 % d'hémolyse (HSO). e. Le temps pour obtenir un certain pourcentage d'hémolyse (par exemple 50 %). Suivant des modes de réalisation préférés, on caractérise la résistance osmotique à l'aide des paramètres b, d ou b et d. La fragilité osmotique doit donc être mesurée dans un temps court, compatible avec le laps de temps court entre prise d'échantillon et début de lyse. Suivant une caractéristique de l'invention, on mesure un ou plusieurs de ces paramètres d'hémolyse, contre une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. eau (eau distillée ou autre), au travers d'une membrane semi-perméable. Une méthode manuelle peut être envisagée. Cependant, suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure automatique conformé pour mesurer la fragilité osmotique d'un échantillon d'érythrocytes en moins de 15 minutes, plus particulièrement en moins de 12 minutes et de préférence en moins de 10 minutes, et le résultat obtenu est exploité dans un bref laps de temps pour ajuster les paramètres de lyse, et débuter cette dernière. La mesure de la fragilité osmotique peut être réalisée à l'aide d'un appareil automatisant au moins en partie la technique manuelle décrite par J.V. Dacie dans Practical Haematology, 2nd edn, Churchill, London 1956. Un exemple d'un tel Il appareil est décrit dans l'article de J. Didelon et al., Clinical Hemorheology and Microcirculation 23 (2000) 31- 42. Le principe est basé sur l'utilisation d'un dispositif mettant en présence, de part et d'autre d'une membrane semi-perméable, l'échantillon de la suspension d'érythrocytes à évaluer, et une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. de l'eau distillée, en volumes adaptés, de façon à générer une hémolyse lente des érythrocytes à mesure que les ions NaCl diffusent vers la solution, e.g. l'eau distillé. L'évolution de l'hémolyse au cours du temps est suivie par mesure de la transmittance (voir aussi J. Didelon et al., Biorheology 37, 2000: 409-416) au moyen d'un rayonnement laser ayant une longueur d'onde de 808 nm. io Une cellule photoélectrique mesure les variations de la lumière transmise au travers de la suspension. Par exemple, les mesures sont effectuées sur 10 minutes. L'appareil permet d'obtenir un ou plusieurs des paramètres a e mentionnés supra. Suivant une première modalité, on effectue la mesure de la fragilité osmotique sur un échantillon dont la température initiale est comprise entre + 1 et + 8 C, de préférence avec de l'eau distillée également à cette température, dans des conditions où l'évolution de la température n'est pas préjudiciable à la mesure. Suivant une deuxième modalité, la mesure de la fragilité osmotique est réalisée sur un échantillon maintenu à la température comprise entre + 1 et + 8 C. Ainsi, l'appareil de mesure décrit dans J. Didelon et al. supra peut être modifié pour permettre la régulation de la température. De préférence cette température est proche de ou identique à la température de lyse. Une fois un ou plusieurs de ces paramètres déterminé(s), une relation peut être appliquée prenant en compte ce ou ces paramètres afin de déterminer soit le débit des cellules dans le dialyseur, soit l'osmolarité du dialysat, adéquate pour obtenir des globules rouges encapsulant l'enzyme et/ou la quantité désirée de celle-ci: Débit hématies = [A x (HSO)] + [B x (V)] + K - A et B = variables adaptables en fonction du dialyseur et 3o osmolarité de la solution de lyse K = constante d'ajustement. Osmolarité dialysat = [C x (HSO)] + [D x (V)] + K C et D = variables adaptables en fonction du dialyseur et du débit des hématies dans le dialyseur K = constante d'ajustement. Suivant un aspect de l'invention, on débute la procédure de lyse lorsque la température de la suspension d'érythrocytes est comprise entre + 1 et + 8 C, et que 5 la fragilité osmotique a été mesurée et les paramètres de lyse enregistrés. Suivant une caractéristique avantageuse, la suspension initiale à traiter est placée dans l'enceinte de lyse-internalisation mentionnée supra. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le procédé utilise un module réfrigéré muni d'une régulation de température, on place dans ce module une poche de la suspension d'érythrocytes réfrigérée entre + 1 et + 8 C, raccordée, ou que l'on raccorde, à un ensemble amovible stérile à usage unique, comportant une cartouche de dialyse, des tubulures de raccordement de la cartouche d'une part à la poche et d'autre part à la solution de lyse, le module comportant en outre des moyens susceptibles d'assurer la circulation de la suspension d'érythrocytes et de la solution de lyse, module à l'intérieur duquel on stabilise la température entre + 1 et + 8 C. Le module réfrigéré est dimensionné pour loger la poche et l'ensemble amovible à usage unique. Le fait de disposer la poche, la cartouche de dialyse, la solution de lyse, reliés par les diverses tubulures, dans un tel module réfrigéré unique est une caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention. Le terme poche renvoie aux poches souples communément utilisées dans le domaine de la transfusion sanguine et des dérivés sanguins. Suivant un aspect important de l'invention, on fait en sorte de maintenir les érythrocytes en suspension homogène dans la poche, de manière à maintenir stable le taux d'hématocrite de la suspension traversant le dialyseur. Suivant une caractéristique de l'invention, la poche est ainsi munie d'une circulation extérieure en boucle, susceptible d'assurer une circulation de la suspension à partir de, et vers, la poche. Par cartouche de dialyse, on entend un élément comportant deux compartiments séparés par une paroi de dialyse à travers laquelle peut se faire un échange ionique qui permet de modifier de façon contrôlée la pression osmotique d'une solution aqueuse située dans l'un des compartiments en introduisant dans l'autre compartiment une solution aqueuse comportant un sel. Ce type de cartouche est largement utilisé dans le domaine médical. Suivant une modalité préférée, on utilise une cartouche de dialyse à fibres creuses, par exemple une telle cartouche ayant les s spécificités suivantes: diamètre intérieur des fibres compris entre 100 et 400 qm, surface extérieure totale des fibres comprise entre 0,3 et 2 m2, longueur des fibres comprise entre 10 et 40 cm, coefficient d'ultrafiltration compris entre 1,5 et 8 ml/h.mmHg. lo Comme il a été précisé plus haut, on peut débuter la procédure de lyse lorsque la température de la suspension dans la poche est comprise entre + 1 et + 8 C. Suivant une modalité intéressante, on contrôle la température de la suspension à l'aide d'un capteur placé sur la circulation extérieure en boucle. Suivant la fragilité osmotique relevée, on peut jouer sur deux paramètres principaux, le débit de la suspension d'érythrocytes dans la cartouche de dialyse et l'osmolarité de la solution de lyse, étant entendu qu'il est préférable de fixer, dans les deux cas, un débit constant pour la solution de lyse. La valeur du débit n'est pas critique. Typiquement, pour une cartouche de dialyse à fibres creuses, telle que décrite supra, le débit de la solution de lyse est fixé entre 50 et 300 ml/min, de préférence entre 150 et 250 ml/min. La solution de lyse est une solution saline hypotonique par rapport à la suspension de globules rouges. Lorsqu'elle est fixée à une valeurconstante, son osmolarité peut typiquement être située entre 20 et 120 mOsm, de préférence entre 70 et 110 mOsm, par exemple de l'ordre de 90 mOsm. A titre d'exemple, la solution de lyse peut comprendre Na2HPO4 et/ou NaH2PO4 et un sucre tel que le glucose. Suivant une première modalité, on adapte le débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, tandis que débit et osmolarité du tampon de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus le débit de la suspension est augmenté. Typiquement, pour une cartouche dont les spécifications on été indiquées supra, le débit sera amené à varier dans l'intervalle de 5 à 200 ml/min, de préférence de 10 à 40 ml/min. Suivant une deuxième modalité, on adapte l'osmolarité de la solution de lyse, tandis que les débits de suspension et de la solution de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus l'osmolarité de la solution de lyse est augmentée. Typiquement, l'osmolarité sera amenée à varier dans l'intervalle de 10 à 200 mOsm/l, de préférence de 20 à 150 mOsm/l. Suivant une troisième modalité, on adapte à la fois le débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, et l'osmolarité de la solution de lyse. L'enzyme à encapsuler peut être présente dans la poche de suspension et/ou être introduite, de préférence progressivement, dans la circulation de suspension en amont ou en aval de la cartouche de dialyse. Les volumes introduits étant faibles, une réfrigération de l'enzyme est optionnelle. De préférence, la suspension de globules rouges est produite à partir d'un culot globulaire de groupe sanguin compatible avec le receveur, déleucocyté, sans pathogène recensé, notamment présenté en poche, par exemple de 500 ml. Les globules rouges peuvent avoir été irradiés lorsqu'ils sont destinés à des patients fortement immunodéprimés susceptibles d'exprimer une réaction immunologique greffon/hôte (R.J. Davey Immunol. Invest. 1995, 24 (1-2) : 143-149). Suivant une particularité de l'invention, le culot globulaire initial, servant à préparer la suspension, a subi au préalable un traitement visant à éliminer les éléments du sang autres que les érythrocytes. Ce type de traitement, par exemple lavage avec une solution saline pour éliminer le plasma ou une solution de conservation, est connu de l'homme du métier. Suivant une modalité particulière, le lavage est réalisé en présence de l'enzyme à encapsuler. Le lavage peut être réalisé par toute technique usuelle, telle que la technique poche quadruple ou 4 poches pour le lavage de globules rouges (méthode et poche de transfert MacoPharma). On peut aussi utiliser un laveur de globules rouges automatique du type COBE 2991 Cell Processor. Suivant une autre caractéristique de l'invention, les érythrocytes peuvent être préalablement traités avec une solution susceptible d'augmenter et/ou d'homogénéiser leur résistance osmotique. De telles solutions sont connues de l'homme du métier. Par exemple, une solution contenant de la L-carnitine peut permettre d'obtenir une amélioration de la résistance osmotique des globules rouges. Comme autres exemples, on peut citer les solutions d'héparine, de citratephosphate-dextrose (CPD) et de mannitol. De préférence, la température lors de l'étape de lyse, est maintenue entre + 2 et 15 + 6 C, et de manière encore plus préférée aux environs de + 4 C. La procédure de rescellement est de préférence effectuée par réchauffage de la suspension lysée et ajout d'une solution de rescellement hypertonique. La température de rescellement peut être comprise entre + 30 et + 40 C. Elle est de préférence comprise entre + 35 et + 38 C, par exemple 37 C environ. L'incubation peut typiquement durer de 15 à 45 minutes. De préférence, la suspension sortant de la cartouche de dialyse ainsi qu'une solution hypertonique de rescellement sont introduites, de préférence en continu, dans une poche intermédiaire. La suspension y est réchauffée, et incubée à la température souhaitée pendant un délai suffisant pour assurer le rescellement. Suivant un aspect particulier, la poche intermédiaire est placée dans un module ou enceinte chauffée, dont la température intérieure est régulée à la température choisie. En variante, la suspension est amenée dans une poche intermédiaire, ainsi que la solution de rescellement. Lorsque la totalité de la suspension a été recueillie dans cette poche, elle est scellée et transférée dans un module permettant le chauffage et l'incubation à la température souhaitée. La suspension de globules rouges rescellés peut ensuite subir une ou plusieurs étapes de lavage à l'aide d'une solution saline, en vue d'éliminer les cellules non ou mal rescellées, les résidus et l'hémoglobine extracellulaire. Suivant une autre caractéristique, on conditionne les érythrocytes dans une solution de conservation des hématies, par exemple contenant de la Lcarnitine. Les érythrocytes produits sont de préférence conservés à une température comprise entre + 1 et + 8 C, de préférence entre + 2 et + 6 C, typiquement à environ + 4 C. Le taux d'hématocrite final du produit est de préférence compris entre 40 et 80 %. La présente invention peut-être mise en oeuvre en employant un dispositif de lyserescellement comprenant: - un module susceptible d'être réfrigéré à une température comprise entre + 1 et + 8 C, comprenant des moyens de refroidissement et de régulation de température, - un ensemble amovible stérile à usage unique, conçu pour pouvoir être placé dans le module et comprenant une cartouche de dialyse susceptible d'être raccordée d'une part à une arrivée de solution de lyse et d'autre part à une arrivée de suspension d'érythrocytes, - des moyens de réglage du débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de lyse et/ou d'ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter. Suivant un mode de réalisation, l'ensemble amovible est un kit à usage unique et comporte une poche susceptible de contenir la suspension d'érythrocytes et une tubulure raccordant cette poche à la cartouche de dialyse, et le module comporte une pompe susceptible de coopérer avec cette tubulure et de faire circuler la suspension d'érythrocytes à partir de la poche vers et au travers de la cartouche, 3o cette pompe étant éventuellement couplée aux moyens de réglage de débit. L'ensemble permet d'assurer le maintien de la stérilité. Suivant une caractéristique avantageuse, la poche est en outre munie d'une tubulure en boucle raccordée à la poche à ses deux extrémités, et le module comporte une i0 pompe susceptible de coopérer avec cette tubulure et d'assurer une circulation du contenu de la poche depuis et vers cette poche. Suivant une autre caractéristique avantageuse, une sonde de température est disposée sur cette tubulure en boucle. Suivant une autre caractéristique, une tubulure d'injection de l'enzyme est raccordée à la tubulure reliant la poche à l'entrée sang de la cartouche de dialyse. Suivant une autre caractéristique, la cartouche de dialyse est raccordée par une tubulure à un flacon susceptible de contenir la solution de lyse et le module réfrigéré comporte des moyens de réception de ce flacon et d'une pompe susceptible de coopérer avec ladite tubulure pour faire circuler la solution de lyse vers et au travers de la cartouche de dialyse. Suivant une caractéristique, les moyens de refroidissement et de régulation de température sont susceptibles de maintenir une température comprise entre + 2 et + 6 C, de préférence de l'ordre de + 4 C dans le module. Suivant une autre caractéristique, la sortie sang de la cartouche de dialyse est raccordée à une tubulure de sortie débouchant ou susceptible de déboucher à l'extérieur du module. Suivant une autre caractéristique, une tubulure d'injection de principe actif est raccordée à cette tubulure de sortie. La tubulure de sortie peut être raccordée à une deuxième poche (poche intermédiaire) susceptible de recueillir la suspension d'érythrocytes issue de la lyse ainsi qu'une solution de rescellement (introduite de préférence par une tubulure secondaire débouchant dans la tubulure de sortie un peu en amont de son débouché dans la poche intermédiaire). Cette poche est avantageusement disposée dans un second module muni de moyens susceptible de réguler la température dans ce module entre + 30 et + 40 C, de préférence entre + 35 C et + 38 C. Suivant un mode de réalisation avantageux, l'ensemble amovible à usage unique comporte d'un seul tenant les poches, tubulures de circulation, tubulures d'injection (munies d'un dispositif d'injection ou d'un réceptable destiné à coopérer avec un tel dispositif), cartouche de dialyse, et de préférence flacon de solution de lyse. De préférence, l'ensemble amovible lui-même ne comporte pas de moyens spécifiques destinés au refroidissement ou au réchauffage. Ces fonctions sont uniquement apportées par les modules ou enceintes dans lesquels les deux parties de l'ensemble seront placées. Les pompes utilisées dans le procédé et le dispositif de l'invention sont de io préférence des pompes péristaltique (pompes occlusives) ; suivant un mode de réalisation, la pompe assurant la recirculation de la suspension de et vers la poche initiale et la pompe de circulation du tampon de lyse ont une vitesse de rotation constante prédéterminée, tandis que la pompe envoyant la suspension vers la cartouche de dialyse a une vitesse de rotation réglable en fonction de la fragilité is osmotique des érythrocytes à traiter. L'introduction d'enzyme peut se faire par tout moyen adapté, par exemple un pousse-seringue à débit fixe, éventuellement piloté, raccordé à la tubulure d'injection correspondante. En variante, on peut remplacer les pousse-seringues par des pompes péristaltiques. Le dispositif comporte des moyens de réglage du débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de lyse et/ou d'ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter. Suivant une caractéristique, les moyens de réglage de débit sont conçus pour piloter la pompe envoyant la suspension vers la cartouche de dialyse. Suivant une autre caractéristique alternative, les moyens de réglage sont conçus pour réguler l'osmolarité d'une solution de lyse, soit pour diluer et faire baisser l'osmolarité, soit pour augmenter cette osmolarité en introduisant un soluté adapté. En variante, on choisit d'introduire dans le module, une solution de lyse d'osmolarité adaptée à la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter. Suivant une modalité préférée, le dispositif comporte des moyens électroniques aptes à commander le processus de lyse et éventuellement le processus de rescellement, suivant des instructions entrées par l'opérateur (e.g. l'opérateur entre directement les données concernant le débit de la suspension d'érythrocytes), ou suivant des données entrées par l'opérateur, se rapportant à la fragilité osmotique (les moyens électroniques étant conçus alors pour déterminer et régler les paramètres de lyse, e.g. le débit de la suspension d'érythrocytes). Ces moyens électroniques sont de préférence reliés aux capteurs de température (permettant de contrôler la température dans les modules et/ou au capteur de température pour la lo suspension d'érythrocytes). Ces moyens sont susceptibles de commander et piloter les pompes, par exemple la pression et le débit de suspension au travers de la cartouche de dialyse. De préférence, les modules sont munis sur une face au moins, d'une surface vitrée, 1s permettant de contrôler visuellement l'installation et la circulation des solutions et suspensions. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel: la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de lyse- rescellement conforme à l'invention; la figure 2 est une synoptique de base du procédé. Exemple 1: installation On se réfère tout d'abord à la figure 1. Un premier cadre en traits interrompus figure un premier module 1, ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des pompes péristaltiques P1, P2 et P3, et des moyens de réception, non représentés, d'un ensemble amovible qui va maintenant être décrit. Les pompes P1 et P3 sont à débit constant prédéterminé. La pompe P2 est pilotée pour en faire varier le débit. L'ensemble amovible comporte une poche 2 souple de volume, contenant une suspension d'érythrocytes à lyser. Cette poche 2 est équipée d'une tubulure 3 souple, en boucle, coopérant avec la pompe P1, afin d'assurer une circulation depuis et vers la poche pour maintenir les érythrocytes en suspension. Cette poche est en outre raccordée à sa base à une tubulure 4 souple raccordée à l'entrée du compartiment sang d'une cartouche de dialyse 5. Cette tubulure 4 coopère avec la pompe P2, qui assure la circulation de la suspension depuis la poche vers la cartouche. Un pousse-seringue PSI piloté est raccordé à la tubulure 4 en amont de la cartouche 5, ce pousse-seringue permettant l'introduction de l'enzyme dans la io circulation d'érythrocytes. La sortie du compartiment sang de la cartouche 5 est raccordée à une tubulure 6 souple de sortie, débouchant à l'extérieur du module 1. Un deuxième pousse-seringue PS2 piloté est raccordé à la tubulure 6, ce pousse-seringue permettant l'introduction de l'enzyme dans la circulation d'érythrocytes lysés. Un flacon 7 contenant une solution de lyse est disposé dans le module 1, et raccordé à l'entrée dialysat de la cartouche 5 par une tubulure 8 souple, coopérant avec la pompe P3 assurant la circulation de la solution de lyse au travers de la cartouche 5. Enfin, la solution de lyse sortant de la cartouche est évacuée du module 1 par une tubulure 9 souple d'évacuation, débouchant dans un flacon 10 situé en dehors du module 1. La tubulure 6 de sortie pénètre dans un second module 11 ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des moyens de réception, non représentés, d'éléments faisant partie de l'ensemble amovible qui vient d'être en partie décrit. II s'agit d'une poche 12 souple, raccordée à la tubulure 6, et dans laquelle vient se stocker la suspension lysée. Un pousse-seringue PS3 piloté est raccordé à la tubulure 6, et permet d'injecter le produit de rescellement. 3o L'ensemble amovible est entièrement réalisé en matière plastique souple et transparente, permettant une visibilité complète du processus. Le dispositif est pourvu en outre de divers moyens non représentés: moyens permettant de refroidir l'intérieur du module 1 et d'y réguler la température entre + 2 et + 4 C, comprenant entre autres une sonde de température placée sur la tubulure 3 pour mesurer la température de la suspension y circulant, une sonde de température pour la mesure de la température Ti à l'intérieur du module 1, le module 11 est pourvu en outre de moyens permettant de chauffer l'intérieur du module 11 et d'y réguler la température T2 entre + 37 et + 38 C; une sonde de température est placée à l'intérieur du module. moyens de détection (par exemple ultrasons ou colorimétriques) de la 10 présence d'érythrocytes dans les tubulures, en Dl et D2, - moyens PR1 de mesure de pression à l'entrée de la cartouche de dialyse. - dispositif électronique recevant d'une part les informations provenant des sondes de température, de pression et des moyens de détection, et d'autre part les informations relatives aux réglages des paramètres de lyse; à partir de ces données, le dispositif pilote les pompes P1, P2 et P3. Un synoptique de procédé est représenté à la figure 2. Le dispositif électronique est constitué d'un ordinateur conçu pour faire fonctionner le synoptique ci-dessus. La mise en oeuvre de ce dispositif conduit à récupérer en 12 une poche contenant une suspension d'érythrocytes renfermant l'enzyme. Exemple 2: production d'érythrocytes encapsulant de l'arginine déiminase On prélève 400 ml de sang sur le patient. Le sang, maintenu à 4 C, est déleucocyté et lavé avec une solution saline pour éliminer le plasma, et placé dans une poche souple de 250 ml de volume, à une hématocrite ajustée à 80%. On ajoute une solution aqueuse d'arginine déiminase dans la suspension d'érythrocytes de manière à obtenir une concentration de 400 UI d'enzyme par ml et une hématocrite de 70%. On prélève 1 ml de la suspension à 4 C que l'on place dans l'appareil de mesure de la fragilité osmotique décrit dans J. Didelon et al. 2000 précité, dont le principe de fonctionnement a été décrit supra. Les mesures sont effectuées sur 10 minutes. L'appareil permet de déterminer la salinité permettant d'avoir 50% d'hémolyse. Cette s salinité est généralement comprise entre 3 et 5,5 g de NaCI par litre. La poche 2 souple de volume 250 ml, contenant la suspension d'érythrocytes et l'enzyme, est placée dans l'installation de l'exemple 1, et l'on admet progressivement la suspension et la solution de lyse hypotonique dans les compartiments respectifs io de la cartouche de dialyse. En fonction du paramètre de salinité déterminé à l'étape précédente (fragilité ou résistance osmotique), on règle le débit de la suspension d'érythrocytes dans le dialyseur entre 15 et 30 ml/min. La solution de rescellement est ajoutée en ligne à 10% vol/vol à la suspension d'érythrocytes lysés juste en amont de la poche 12. La suspension est incubée 30 min à 37 C dans la poche. Elle est ensuite lavée avec une solution saline, une solution de conservation y est ajoutée (SAG-mannitol), puis la poche est conservée à + 4 C jusqu'à son emploi. Le procédé permet d'obtenir des érythrocytes présentant une activité enzymatique comprise entre 80 et 180 UI par ml d'érythrocytes purs. L'administration du volume total de la suspension au patient est réalisée par perfusion intra-veineuse selon les pratiques usuelles de transfusion sanguine. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'érythrocytes renfermant de l'arginine déiminase pour la préparation d'un médicament permettant de faire diminuer la concentration d'arginine plasmatique in vivo. io 2. Utilisation selon la revendication 1, pour le traitement des tumeurs argininedépendantes. 3. Utilisation selon la revendication 2, pour le traitement de l'hépatocarcinome. 15 4. Utilisation selon la revendication 2, pour le traitement du mélanome malin. 5. Utilisation selon la revendication 1, pour inhiber la synthèse d'oxyde nitrique. 6. Utilisation selon la revendication 1, pour la prévention et/ou le traitement du 20 choc septique. 7. Utilisation selon la revendication 2, pour le traitement du cancer du sein, du neuroblastome ou de la leucémie lymphoblastique T ou l'inhibition de I'angiogénèse ou le traitement d'une maladie associée. 8. Erythrocyte contenant de l'arginine déiminase. 9. Suspension d'érythrocytes dans un liquide pharmaceutiquement acceptable. 10. Médicament comprenant des érythrocytes ou une suspension d'érythrocytes selon la revendication 8 ou 9. 11. Médicament selon la revendication 9, pour faire baisser la concentration plasmatique en arginine. 12. Médicament selon la revendication 9, pour le traitement d'une tumeur arginine-dépendante. 13. Médicament selon la revendication 10, pour le traitement d'une tumeur choisie parmi: mélanome malin, hépatocarcinome, cancer du sein, neuroblastome et leucémie lymphoblastique T, ou pour l'inhibition de l'angiogénèse ou le traitement d'une maladie associée. w 14. Médicament selon la revendication 9, pour inhiber la synthèse de NO, de préférence pour prévenir et/ou traiter le choc septique.