Brevet FR2876378A1 — publié le 20060414

La présente invention concerne des oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces végétales notamment dans des substrats complexes ou dégradés. On connaît différentes méthodes permettant l'identification de végétaux 5 basées sur l'analyse du génome, mais aucune ne permet pour l'instant de travailler sur des substrats dégradés et/ou complexes. Les méthodes d'empreintes génétiques sont ainsi basées sur l'analyse du génome complet. L'objectif de ces méthodes est de fournir une empreinte génétique propre à chaque individu (identification de l'individu et non de l'espèce). Cependant, bien que ce ne soit pas l'objectif initial, elles peuvent aussi permettre dans une certaine mesure l'identification de l'espèce. Toutes ces méthodes nécessitent l'obtention d'ADN de bonne qualité (non dégradé), et sans mélange avec des ADN exogènes (provenant d'autres organismes). De ce fait, il est impossible d'utiliser ces approches pour l'identification de végétaux dans des substrats dégradés ou complexes. A titre d'exemple de méthode d'empreinte génétique, on peut citer les méthodes AFLP et DArT. La méthode AFLP "Amplified Fragment Length Polymorphism" est actuellement très utilisée à la fois en génétique des populations et en cartographie génétique (Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414; US Patent 6,045,994). Elle est basée sur une digestion/ligation de l'ADN génomique, suivie de deux amplifications successives utilisant des amorces PCR particulières de manière à simplifier le génome pour le rendre analysable par électrophorèse. Elle nécessite de l'ADN de très bonne qualité, et en quantité suffisante (plusieurs centaines de nanogrammes d'ADN en général). II est absolument impossible d'utiliser cette approche de manière pertinente pour l'analyse de substrats dégradés et complexes. La méthode DArT "Diversity Array Technology" est basée sur une approche très similaire (digestion/ligation puis amplification), mais en diffère par la méthode d'analyse (hybridation) (Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (2001) Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research, 29, e25; US patent n 6,713,258). Il est également impossible d'utiliser cette approche sur des substrats dégradés et complexes. D'autres méthodes sont basées sur l'amplification et le séquençage. D'un point de vue théorique, le séquençage d'une région homologue suffisamment longue (plusieurs centaines de paires de bases) possède le potentiel pour permettre l'identification de l'espèce chez les végétaux. Une telle région doit être encadrée par des zones très conservées autorisant la conception d'amorces universelles pour l'amplification. L'ADN nucléaire n'est pas très approprié, car son accès est très difficile voire impossible dans le cas de substrats dégradés Cependant, en ce qui concerne l'ADN nucléaire, les ITS (Internai Transcripted Spacer de l'ADN ribosomique) ont été utilisés pour la détection et l'identification de végétaux. Des amorces universelles ont été décrites chez les champignons et se sont avérées fonctionner également chez les végétaux (White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics ln: PCR protocols, a guide to methods and applications (eds. Innis MA, Gelfand DH, Sninski JJ, White TJ), pp. 315-322. Academic Press, San Diego, California). De ce fait, cette région de quelques centaines de paires de bases a été utilisée pour effectuer des phylogénies entre espèces proches chez les végétaux (Baldwin BG (1992) Phylogenetic utility of the internai transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1, 3-16; Gielly L, Yuan Y-M, Küpfer P, Taberlet P (1996) Phylogenetic use of noncoding regions in the genus Gentiana L.: chloroplast trnL (UAA) intron versus nuclear ribosomal internai transcribed spacer sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, 460-466) et pour identifier les espèces (voir par exemple Linder C, Moore L, Jackson R (2000) A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology, 9, 1549-1559 ou le site web de la société "Bioprofiles": http://www.bioprofiles.co.uk/). Cependant, cette région possède des inconvénients. Premièrement, elle est trop longue pour être utilisée dans le cas de substrats très dégradés, de plus il s'agit de séquences nucléaires certes répétées, mais de manière moindre que celles présentes dans l'ADN chloroplastique. Deuxièmement, les amorces peuvent amplifier plusieurs types de séquence au sein d'une même espèce. Enfin, les amorces ne sont pas réellement universelles et il peut être difficile d'obtenir une amplification chez certaines espèces. En revanche, les ADN mitochondrial et chloroplastique sont présents de manière hautement répétées dans chaque cellule (plusieurs centaines de copies). Il en résulte qu'ils représentent une cible pour l'amplification beaucoup plus accessible dans le cas de substrats dégradés. L'ADN mitochondrial est cependant trop peu variable chez les végétaux. Ainsi, plusieurs articles décrivent des amorces universelles ciblant différentes régions de l'ADN chloroplastique (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105- 1109; Demesure B, Sodzi N, Petit RJ (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non- coding regions of mitochodrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4, 129-131; Dumolin-Lapègue S, Pemonge M-H, Petit RJ (1996) An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular Ecology, 5, 393-397; et Hamilton MB (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation. MolecularEcology, 8, 521-523). Certaines d'entre elles ont été largement utilisées pour amplifier et séquencer des régions variables de l'ADN chloroplastique. II s'agit principalement des amorces c et d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109) qui amplifient l'intron du gène de l'ARN de transfert pour la Leucine, codon UAA (trnL UAA). Actuellement, plusieurs milliers de séquences de cet intron sont disponibles dans les bases de données publiques (GenBank). L'intron du gène trnL (UAA) est très variable, mais possède aussi des parties conservées lié au fait qu'il peut constituer des structures secondaires (Simon D, Fewer D, Friedl T, Bhattacharya D (2003) Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-Leu group I intron. Journal of Molecular Evolution, 57, 710-720). Cependant, ces amorces c et d amplifient des régions trop longues pour être utilisées sur des substrats dégradés. Une autre solution pour l'identification spécifique a été proposée par Bobowski et al. (Bobowski B, Hole D, Wolf P, Bryant L (1999) Identification of roots of woody species using polymerase chain reaction (PCR) and restricted fragment Iength polymorphism (RFLP) analysis. Molecular Ecology, 8, 485-491) : amplification du gène rbcL à l'aide d'amorces universelles, et caractérisation du produit d'amplification par digestion enzymatique suivi d'une migration sur gel (le produit pourrait être également caractérisé par séquençage direct). Cependant, toutes ces amorces amplifient des régions trop longues pour être utilisées sur des substrats dégradés. C'est la raison pour laquelle d'autres amorces ont été définies par Poinar et al. (Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Paâbo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281, 402-406) afin d'amplifier des fragments plus courts, compatibles avec l'analyse de restes "fossiles" (coprolithes d'un paresseux disparu dans ce cas). Ces auteurs ont conçu des amorces dans le gène chloroplastique rbcL. Les fragments amplifiés permettent tout juste d'identifier la famille, et ces amorces ne sont pas vraiment universelles. Malgré cela, en l'absence d'alternative, Willerslev et al. (Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Brand TB, Gilbert MTP, Shapiro B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A (2003) Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science, 300, 791-795) ont utilisé les amorces de Poinar et al. (Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Paabo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281, 402-406) dans leur analyse de l'ADN extrait du permafrost (sol gelé). Leur objectif était de caractériser les ADN végétaux encore présents dans des sols. Là aussi, seules les familles ont pu être identifiées. Pour résumer, soit les systèmes proposés pour l'instant se basent sur des séquences trop longues pour être efficaces dans l'analyse de substrats dégradés, soit le niveau de variabilité des fragments courts n'est pas assez élevé pour être vraiment utile dans l'identification des végétaux. Les régions à la fois suffisamment courtes et suffisamment variables sont rares et aucune n'a été caractérisée. Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouveaux oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces végétales. Les oligonucléotides de la présente invention permettent d'amplifier une région très courte mais également très variable de l'intron du gène trnL (UAA) de l'ADN chloroplastique. Un premier avantage de la présente invention est que les oligonucléotides et les méthodes de la présente invention permettent la détection et l'identification des végétaux dans des substrats complexes ou dégradés tels que des substrats transformés (par la chaleur, la lyophilisation, etc.) car la région amplifiée est à la fois courte et très variable. Un autre avantage de la présente invention est que la région amplifiée est non seulement très variable entre espèces végétales mais possède également des régions flanquantes très conservées permettant l'amplification de la région d'intérêt dans différentes espèces végétales à l'aide d'amorces universelles. Un autre avantage de la présente invention est que l'intron du gène trnL (UAA) est l'une des rares séquences chloroplastiques pour laquelle plusieurs milliers de séquences sont disponibles dans les bases de données telles que GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). L'analyse de la région variable amplifiée à l'aide des amorces universelles permet donc d'identifier l'espèce végétale correspondante en se référant aux séquences disponibles dans les bases de données. Des méthodes permettant l'identification de végétaux dans des substrats complexes ou dégradés présentent un grand intérêt. On citera par exemple les applications dans l'industrie agroalimentaire où, par exemple, le respect des critères de traçabilité impose le développement de nouvelles méthodes d'analyses permettant d'identifier la composition détaillée en espèces végétales de préparations alimentaires. DESCRIPTION DE L'INVENTION Un premier objet de la présente invention est une paire d'oligonucléotides dans laquelle le premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 67 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3. Un autre objet de la présente invention est une paire d'oligonucléotides dans laquelle premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 67 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux dont la séquence est représentée aux SEQ ID Nos. 23-66. Typiquement, l'hybridation s'effectue à 55 C dans un tampon d'amplification comprenant du MgCl2 2mM. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le premier oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 1, 415 et le deuxième oligonucléotide est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 2, 16-22. L'invention concerne aussi des oligonucléotides dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 2, les SEQ ID 25 Nos. 4-15 et les SEQ ID Nos. 16-22. L'invention concerne aussi des polynucléotides dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les paires d'oligonucléotides, les oligonucléotides et les polynucléotides selon l'invention sont 30 immobilisés sur un support solide. Un autre objet de la présente invention est un procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux comprenant les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon comprenant de l'ADN génomique végétal; b) on amplifie une région variable de l'ADN chloroplastique avec une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, la région variable de l'ADN chloroplastique amplifiée à l'étape b) est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux selon l'invention comprend une étape d'extraction de l'ADN chloroplastique avant l'étape d'amplification b). De préférence, on amplifie la région variable de l'ADN chloroplastique par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). L'invention concerne aussi un procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon comprenant les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire 15 d'oligonucléotides selon l'invention, ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention; c) on détecte l'obtention d'un produit d'amplification attestant de la présence d'une espèce végétale dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier, le produit d'amplification est un 20 polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon selon l'invention comprend une étape d'extraction de l'ADN avant l'étape d'amplification b). De préférence, on effectue une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). L'invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon comprenant les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce 30 végétale; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'invention, ou avec au moins un oligonucléotide selon l'invention; c) on analyse le produit d'amplification obtenu pour identifier l'espèce 35 végétale contenue dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier, le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. Dans un mode de réalisation, à l'étape c), on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. Dans un autre mode de réalisation, à l'étape c), on hybride le produit d'amplification avec au moins une séquence végétale de référence pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. De préférence, la séquence de référence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 3 et 23-66. Dans un autre mode de réalisation, à l'étape c), on analyse le produit d'amplification par électrophorèse pour identifier l'espèce végétale contenue dans 10 l'échantillon. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de l'ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales. Dans un mode de réalisation particulier, la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 2366. La présente invention concerne des polynucléotides dérivés de deux régions très conservées de l'ADN chloroplastique des végétaux. Ces polynucléotides dérivés de régions dont la séquence est très conservée dans tout le règne végétal, en particulier chez les angiospermes et les gymnospermes, peuvent être utilisés comme amorces universelles pour l'amplification ou le séquençage de l'ADN de chloroplaste des végétaux. En outre, on a trouvé que, de façon particulièrement avantageuse, les régions conservées dont sont dérivés les polynucléotides de la présente invention flanquent une région à la fois courte et très variable de l'ADN chloroplastique. La variablité de cette région entre espèces végétales peut donc être utilisée pour distinguer et identifier les espèces végétales. Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés. Typiquement, les polynucléotides modifiés peuvent contenir des nucléotides modifiés. Alternativement, ces polynucléotides modifiés sont des polynucléotides conjugués à des réactifs de liaison (biotine par exemple) ou à des réactifs marqués (marqueurs fluorescents par exemple). Classiquement, les réactifs de liaison ou les réactifs marqués conjugués aux polynucléotides facilitent la purification ou la détection de ces polynucléotides. Selon l'invention, on entend par oligonucléotide un polynucléotide constitué d'une courte séquence de nucléotides, dont le nombre varie d'une à quelques dizaines, mais généralement inférieur à 100 bases. Le terme polynucléotide désigne donc aussi les oligonucléotides. On entend par amorce une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase d'entamer la synthèse d'un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice. Avantageusement, les polynucléotides de la présente invention peuvent être immobilisés sur un support solide. On connaît les support solides adaptés à l'immobilisation de polynucléotides ou d'oligonucléotides notamment pour la fabrication des puces à ADN. Il existe de nombreuses variétés de puces à ADN, qui se distinguent par le type de support utilisé, la nature, la densité et le mode de fixation ou de synthèse des séquences nucléotidiques sur le support, et les conditions de lecture. Ces techniques sont connues de l'homme du métier. On entend également par support solide des supports de type microsphères tels que les produits FLEXMAPTM de la société LUMINEX et les produits LiquidChipTM de la société QIAGEN . De manière générale, les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. ( Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. On entend par espèce végétale tout organisme vivant faisant partie du règne végétal. L'invention concerne également une paire d'oligonucléotides dans laquelle le premier oligonucléotide s'hybride à une première région très conservée de l'ADN chloroplastique et le deuxième oligonucléotide s'hybride à une deuxième région très conservée de l'ADN chloroplastique dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux. La séquence de la première région conservée correspond à la séquence de l'amorce g (SEQ ID No.1) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID No. 67). La séquence de la deuxième région conservée correspond à la séquence de l'amorce h (SEQ ID No.2) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID No. 68). Chez le tabac qui peut être utilisé comme espèce végétale de référence les paires d'oligonucléotides de la présente invention permettent l'amplification sélective de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3. Les séquences des paires d'oligonucléotides de la présente invention sont choisies de telle façon que le premier oligonucléotide s'hybride à la SEQ ID No. 67 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la SEQ ID No. 68 dans des conditions de stringence suffisantes pour permettre l'amplification sélective de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux. L'homme du métier connaît les réactions d'amplification d'ADN et les conditions de stringence permettant une amplification sélective et notamment les conditions température d'hybridation et de composition du tampon d'hybridation. L'homme du métier pourra donc facilement définir différentes variantes des amorces g (SEQ ID No. 1) et h (SEQ ID No. 2) en utilisant des techniques de routine. Ces variantes s'hybrident aux séquences de référence et permettent l'amplification sélective de la région variable d'intérêt de l'ADN chloroplastique. Certaines variantes possibles de l'amorce g sont représentées aux SEQ ID Nos. 4-15 et certaines variantes possibles de l'amorce h sont représentées aux SEQ ID Nos. 16-22. Habituellement, les variations de séquence sont plutôt introduites à l'extrémité 5' des oligonucléotides pour ne pas compromettre la réaction d'amplification. Classiquement on peut par exemple introduire des nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' des oligonucléotides. Par "s'hybrider", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5 C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30 C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60 C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 pg/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1%SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989). De préférence, les polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence. 5 Dans la présente invention, la fonction des polynucléotides est l'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique. Par stringence on entend la rigueur des conditions opératoires (notamment la température et la force ionique) dans lesquelles se déroule une hybridation moléculaire. Par amplification on entend toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN. Habituellement, l'amplification comporte des cycles successifs (généralement de 20 à 40) d'amplification, eux-mêmes composés de trois phases: après une étape de dénaturation (séparation des deux brins de la double hélice) de l'ADN, le positionnement des amorces (courtes séquences d'oligonucléotides spécifiquement choisies) en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'ADN, et leur fixation sur ces cibles constitue la deuxième phase du procédé (hybridation). La phase d'extension fait intervenir une enzyme, l'ADN polymérase, qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice. La répétition de ce cycle conduit à l'amplification exponentielle du fragment d'ADN. L'invention concerne aussi un procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux à l'aide des polynucléotides, des oligonucléotides et/ou des paires d'oligonucléotides selon l'invention. Les procédés d'amplification de séquence d'ADN sont bien connues de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera la réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) mais tout type de réaction d'amplification peut être utilisée dans les procédés selon l'invention. Etant donné que les séquences des polynucléotides selon la présente invention sont fortement conservées dans.tout le règne végétal, ces polynucléotides peuvent être utilisés pour la détection d'espèces végétales. On entend par détection la détermination de la présence d'une espèce végétale dans un échantillon mais aussi la mesure et la quantification d'une espèce végétale dans un échantillon. A l'aide des polynucléotides de la présente invention il est maintenant possible d'amplifier une région très variable de l'ADN de chloroplaste. La séquence de cette région diffère d'une espèce végétale à l'autre de telle sorte que chaque séquence est spécifique d'une espèce ou d'un petit nombre d'espèces très proches. Une fois que la région variable a été amplifiée, sa séquence est analysée pour identifier l'espèce végétale. L'analyse peut être effectuée par différentes méthodes bien connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un séquencage complet ou partiel suivi d'une comparaison avec des séquences connues. Alternativement, il peut s'agir de la détermination du degré d'homologie avec des séquences connues (séquences de référence) en faisant appel à des techniques d'hybridationpar exemple. Une autre possibilité est l'analyse par électrophorèse puis la comparaison avec des séquences de référence. Les procédés selon la présente invention permettent donc de déterminer l'identité d'une espèce végétale présente dans un échantillon. On entend par échantillon dans une procédure d'analyse, la substance à mesurer. Dans la présente invention, l'échantillon comprend habituellement une substance organique suspectée de contenir une espèce végétale. De façon avantageuse, les procédés de la présente invention permettent l'analyse d'échantillons constitués de matière en décomposition ou dégradée par chauffage, lyophilisation, congélation ou par tout autre traitement entraînant une dégradation de l'ADN. Les procédés de la présente invention permettent ainsi la détection d'espèces végétales dans des aliments transformés par exemple. Une autre application des procédés de la présente invention est la détection d'espèces végétales dans des substrats issus de sols gelés (permafrost) ou dans des restes fossilisés. L'échantillon peut subir un traitement avant d'effectuer la réaction d'amplification à l'aide des polynucléotides de l'invention. Typiquement, il peut s'agir d'une étape d'extraction de l'ADN selon des techniques de routine bien connues de l'homme du métier. On entend par extraction l'opération consistant à extraire une substance d'un milieu à l'aide d'un solvant par exemple ou par toute autre méthode physico-chimique. L'invention concerne aussi l'utilisation de la région variable du gène de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de l'ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales. A partir de la séquence de référence du tabac (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147) et des positions de la région variable sur cette séquence de référence, l'homme du métier peut identifier les séquences correspondantes chez d'autres espèces végétales à l'aide de techniques de routine. DESCRIPTION DU LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID No. 1: Amorce g. SEQ ID No. 2: Amorce h. SEQ ID No. 3: Séquence variable amplifiée de Nicotiana tabacum. SEQ ID No. 4-15: Variantes de l'amorce g. SEQ ID No. 16-22: Variantes de l'amorce h. SEQ ID No. 23-66: Séquence variable amplifiée de différentes espèces végétales. SEQ ID No. 67: Séquence de la région complémentaire à l'amorce g. SEQID No. 68: Séquence de la région complémentaire à l'amorce h. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Localisation de la zone étudiée et des amorces universelles sur la séquence de l'ADN chloroplastique de tabac (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147) ; c et d représentent les amorces définies par Taberlet et al. (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109), g et h représentent les amorces universelles définies dans le cadre de cette demande de brevet. Figure 2: Exemples d'amplifications obtenues avec les amorces g et h, à partir d'extraits d'ADN provenant de substrats dégradés. 1, pomme de terre cuite; 2, pâte cuite; 3 et 4, potage en sachet lyophilisé; 5, contrôle négatif de l'extraction (réaction d'amplification à partir d'une extraction sans subtrat); 6, contrôle négatif d'amplification (réaction d'amplification sans extrait d'ADN); 7, contrôle positif (ADN de Cyclamen) ; M, marqueur de poids moléculaire. II est intéressant de noter que le fragment correspondant à la pomme de terre cuite (79 pb) est plus court que celui correspondant à la pâte cuite et donc au blé (92 pb). Figure 3: Expérimentation comparant l'efficacité des amorces c-d (pistes 1-4) et g-h (pistes 5-8) pour l'amplification d'ADN extrait de substrat dégradé (mie de pain). M, marqueur de poids moléculaire. 1 et 5, ADN extrait de mie de pain. 2 et 6, contrôle d'extraction. 3 et 7, contrôle d'amplification. 4 et 8, contrôle positif. Figure 4: La Figure 4 présente, sous forme schématique, la démarche générale qui pourrait être appliquée pour identifier des végétaux en utilisant certains modes de réalisation de l'invention. La première étape consiste à extraire l'ADN à partir du substrat. La seconde étape est l'amplification de l'extrait à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction). L'analyse du produit d'amplication constitue la troisième étape. Quatre solutions alternatives se présentent. La première possibilité d'analyse ne concerne que les substrats simples (une seule espèce végétale présente) et consiste à séquencer directement le produit d'amplification avec les méthodes classiques. Les deuxièmes et troisièmes possibilités sont réservées pour les substrats complexes contenant un mélange de végétaux. L'analyse est soit effectuée après clonage du produit d'amplification puis séquençage de plusieurs clones (voir Tableau 4 pour un exemple de résultat), soit après hybridation sur un support avec les séquences cibles potentielles (méthode non illustrée, qui implique la connaissance préalable des espèces susceptibles d'être présentes). Une dernière possibilité d'analyse consiste à caractériser les produits d'amplification par électrophorèse (soit dénaturante, soit non dénaturante de type SSCP). Cette dernière possibilité peut aussi bien être utilisée pour des substrats simples (une seule espèce végétale présente) ou pour des substrats contenant un mélange. EXEMPLES 1) Amorces universelles Le tableau 1 représente les séquences des amorces universelles utilisées pour amplifier la région variable de l'ADN chloroplastique permettant d'identifier les végétaux après extraction et amplification à partir de substrats dégradés. Les positions de la base 3' sur la séquence de référence du tabac sont indiquées dans le tableau (Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110147). Tableau 1 Amorce Séquence Position de la base 3' sur la séquence du tabac g 5'GGGCAATCCTGAGCC 49425 AA 3' h 5'CCATTGAGTCTCTGC 49466 ACCTATC 3' L'alignement de ces deux régions flanquantes montre (Tableaux 1 et 2) qu'il est possible de définir des amorces qui sont universelles chez les végétaux supérieurs (Angiospermes et Gymnospermes). Après avoir aligné plusieurs centaines de séquences d'introns du trnL (UAA), les quelques variations de séquences observées au niveau de la zone où nous avons défini les amorces démontrent que les amorces sont réellement universelles (voir Tableau 2). En effet, la différence observée avec la séquence de l'amorce implique au plus un seul mésappariement n'affectant en aucun cas les trois dernières bases du côté 3' de l'amorce. De ce fait, on peut prédire avec certitude que les amorces g et h sont universelles. 2) Variabilité de la région amplifiée Le Tableau 2 montre les variations de la zone amplifiée par les amorces g et h pour différentes espèces végétales entrant dans la composition des aliments (voir aussi le Tableau 3). Ces séquences ont soit été importées de GenBank (base de données publique de séquence d'ADN) soit été effectuées dans notre laboratoire. Deux régions très conservées encadrent une partie très variable d'une longueur d'environ 20 à 100 paires de bases (Figure 1). Une telle région représente donc la cible idéale pour une identification des végétaux à partir de substrats dégradés (dans ces conditions, il est souvent difficile d'obtenir des produits d'amplification pour des fragments d'une longueur supérieure à 120 paires de bases). Nous n'avons pas trouvé d'autres régions répondant à ces critères. Il semble donc que le système que nous proposons soit unique. Le tableau 2 représente l'alignement de séquences montrant d'une part la zone sur laquelle ont été définies les amorces universelles, et d'autre part la variabilité de la région amplifée. Les nucléotides soulignées dans les régions correspondant aux amorces indiquent les mésappariements avec les amorces universelles g et h. Concernant la région amplifiée, les soulignements indiquent des séquences identiques. Tableau 2 Nom sel uence de la séquence de la région amplifiée séquence de la scientif ue région correspondant à région correspondant à l'amorce.2 l'amorce h Theobroa GGGCAATCCTG ATCCTATTATTTTATTATTTTACGAAAC GATAGGTGCA cacao AGCCAA TAAACAAAGGTTCAGCAAGCGAGAAT GAGACTCAAT AATAAAAAAAG GG Beta vulgans GGGCAATCCTG CTCCTTTTTTCAAAAGAAAAAAAATAA GATAGGTGCA AGCCAA GGATTCCGAAAACAAGAATAAAAAAA GAGACTCAAA AAG GG Castanea GGGCAATCCTG ATCCTATTTTACGAAAACAAATAAGGG GATAGGTGCA sativa AGCCAA TTCAGAAGAAAGCGAGAATAAAAAAA GAGACTCAAT AG GG Cannabis GGGCAATCCTG ATCCGGTTTTCTGAAAACAAACAAGGA GATAGGTGCA sativa AGCCAA TTCAGAAAGCAATAATAAAAAAGAAT GAGACTCAAT AG GG Cicer arietinum GGGCAATCCTG ATCCTGCTTTCGGAAAACAAACAAAAA GATAGGTGCA AGCCAA AAGTTCAGAAAGTTAAAATCAAAAAA GAGACTCAAT G GG Saccharum GGGCAATCCTG ATCCCCTTTTTTGAAAAAACAAGTGGT GATAGGTGCA officinarum AGCCAA TCTCAAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GAGACTCAAT Asparagus GGGCAATCCTG ATCTTTATGTTTAGAAAAACAAGGGTT GATAGGTGCA officinales AGCCAA TTAATTTAAAAACTAGAAGAAAAAGG GAGACTCAAT Triticum GGGCAATCCTG ATCCGTGTTTTGAGAAAACAAGGGGTT GATAGGTGCA aestivum AGCCAA GAGACTCAAT GG CTCGAACTAGAATACAAAGGAAAAG Secale cereale GGGCAATCCTG ATCCGTGTTTTGAGAAAACAAGGGGTT GATAGGTGCA AGCCAA GAGACTCAAT GG CTCGAACTAGAATACAAAGGAAAAG Oryza sativa GGGCAATCCTG ATCCATGTTTTGAGAAAACAAGCGGTT GATAGGTGCA AGCCAA CTCGAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Panicum GGGCAATCCTG ATCCCTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT GATAGGTGCA miliaceum AGCCAA CTCAAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Ribes aureum GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTACAAACAAAACACAAGA GATAGGTGCA AGCCAA GTTCACAAAGAGAGAATAAAAAAAG GAGACTCAAT GG Fragaria vesca GGGCAATCCTG ATCCCGTTTTATGAAAACAAACAAGGG GATAGGTGCA AGCCAA TTTCAGAAAGCGAGAATAAATAAAG GAGACTCAAT GG Citrusx GGGTAATCCTG ATCCTCTTCTCTTTTCCAAGAACAAAC GATAGGTGCA paradisi AGCCAA AGGGGTTCAGAAAGCGAAAAAGGGG GAGACTCAAT GG Triphasia GGGTAATCCTG ATCCTCTTCTCTTTTCCAAGAACAAAC GATAGGTGCA trifolia AGCCAA AGGGGTTCAGAAAGCGAAAAAGGGG GAGACTCAAT GG Vitis vinifera GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCCGAAAACAACCAAGGG GATAGGTGCA AGCCAA TTCAGAAAACGATAATAAAAAAAG GAGACTCAAT GG Prunus persica GGGCGATCCTGATCCTGTTTTATTAAAACAAACAAGGG GATAGGTGCA GAGACTCAAT GG AGCCAA TTTCATAAACCGAGAATAAAAAAG Prunus GGGCGATCCTG ATCCTGTTTTATTAAAACAAACAAGGG GATAGGTGCA armeriana AGCCAA GAGACTCAAT GG TTTCATAAACCGAGAATAAAAAAG Prunus cerasus GGGCGATCCTG ATCCTGTTTTATTAAAACAAACAAGGG GATAGGTGCA AGCCAA GAGACTCAAT GG TTTCATAAACCGAGAATAAAAAAG Actinidia GGGCAATCCTG ATCCTTTTTTTCGAAAACAAACAAAGA GATAGGTGCA chinensis AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATAAAACAAG GAGACTCAAT GG Zea mais GGGCAATCCTG ATCCCTTTTTTGAAAAACAAGTGGTTC GATAGGTGCA AGCCAA TCAAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Pisum sativum GGGCAATCCTG ATCCTTCTTTCTGAAAACAAATAAAAG GATAGGTGCA AGCCAA TTCAGAAAGTGAAAATCAAAAAAG GAGACTCAAT GG Phaseolus GGGCAATCCTG ATCCCGTTTTCTGAAAAAAAGAAAAAT GATAGGTGCA vulgaris AGCCAA TCAGAAAGTGATAATAAAAAAGG GAGACTCTAT GG Sorghum GGGCAATCCTG ATCCACTTTTTTCAAAAAAGTGGTTCT GATAGGTGCA halepense AGCCAA CAAACTAGAACCCAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Cynara GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAACTAAACAAAGG GATAGGTGCA cardunculus AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATCAAAAAG GAGACTCGAT GG Arctium lappa GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATAAAAAAG GAGACTCGAT GG Lactuca sativa GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAACGG GATAGGTGCA AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATCAAAAAG GAGACTCGAT GG Helianthus GGGCAATCCTG ATCACGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA annuus AGCCAA TTCAGAAAGCGAAAATAAAAAAG GAGACTCGAT GG Ficus carica GGGCAATCCTG ATCCGGTTTTCTGAAAACAAACAAGGG GATAGGTGCA AGCCAA TTCAGAAGGCGATAATAAAAAAG GAGACTCAAT GG Humulus GGGCAATCCTG ATCCGGTTTTCTGAAAACAAACAAGGA GATAGGTGCA lupulus AGCCAA TTCAGAAAGCAATAATAAAGGG GAGACTCAAT GG Avena sativa GGGCAATCCTG ATCCGTGTTTTGAGAGGGGGGTTCTCG GATAGGTGCA AGCCAA AACTAGAATACAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Nasturtium GGGCAATCCTG ATCCTTGTTTACGCAAACAAACCGGAG GATAGGTGCA officinale AGCCAA TTTAGAAAGCGAGAAAAAAGG GAGACTCAAT GG Armoracia GGGCAATCCTG ATCCTTGTTTACGCGAACAAACCTGAG GATAGGTGCA rusticana AGCCAA TTTAGAAAGCGAGATAAAAGG GAGACTCAAT GG Hordeum GGGCAATCCTG ATCCGTGTTTTGAGAAGGGATTCTCGA GATAGGTGCA vulgare AGCCAA ACTAGAATACAAAGGAAAAG GAGACTCAAT GG Anthriscus GGGCAATCCTG ATCCTATTTTTTCCAAAAACAAACAAA GATAGGTGCA cerefolium AGCCAA GGCCCAGAAGGTGAAAAAAG GAGACTCAAT GG Allium cepa GGGCAATCCTG ATCTTTCTTTTTTGAAAAACAAGGGTTTGATAGGTGCA AGCCAA AAAAAAGAGAATAAAAAAG GAGACTCAAT GG Allium porum GGGCAATCCTG ATCTTTATTTTTTGAAAAACAAGGGTT GATAGGTGCA AGCCAA TAAAAAAGAGAATAAAAAAG GAGACTCAAT GG Carum GGGCAATCCTG ATCCTATTTTCCAAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA petroselinum AGCCAA CCCAGAAGGTGAAAAAAG GAGACTCAAT GG Solanum GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTGAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA tuberosum AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GAGACTCAAT GG Solanum GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTGAAAACAAACCAAGG GATAGGTGCA lycopersicum AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GAGACTCAAT GG Solanum GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCTCAAAACAAACAAAGG GATAGGTGCA melongena AGCCAA TTCAGAAAAAAAG GAGACTCAAT GG Raphanus GGGCAATCCTG ATCCTGAGTTACGCGAACAAACCAGA GATAGGTGCA sativus AGCCAA GTTTAGAAAGCGG GAGACTCAAT GG Brassica GGGCAATCCTG ATÇÇM.QTTAÇÇ ÇÇt MÇAAAAÇAQA GGATAGGTGCA oleracea AGCCAA ç.1T.LS.Q. AA C Q. AGACTCAAT ça itata GG P Brassica rapa GGGCAATCCTG ATÇÇ EÇ.ç r ' AÇ(,ÇGAAÇAAAÇÇA,C,A GATAGGTGCA rapa AGCCAA,Ç;TTTAÇ.,AAAQ.CÇ.G GA GACTCAAT GG Brassica nigra GGGCAATCCTG ATCCTGGGTTACGCGAACAAACCAGA GATAGGTGCA AGCCAA GTTTAGAAAGCGG GAGACTCAAT GG Olea europaea GGGCAATCCTG ATCCTGTTTTCCCAAAACAAAGGTTCA GATAGGTGCA AGCCAA GAAAGAAAAAAG GAGACTCAAT GG Urtica dioica GGGCAATCCTG ATCTGGTGTTATAAAACAAAGCGATAA GATAGGTGCA AACCAA AAAAAAG GAGACTCAAC GG Rumex acetosa GGGCAATCCTG CTCCTCCTTTCCAAAAGGAAGAATAAA GATAGGTGCA AGCCAA AAAG GAGACTCAAT GG La région amplifiée montre non seulement une variation de taille entre les différentes espèces, mais aussi une variation de séquences. Il est intéressant de remarquer que le niveau de variabilité permet d'identifier la grande majorité des espèces consommées. Cependant, les espèces proches peuvent dans certains cas ne pas être discernables. C'est le cas dans notre exemple entre le blé et le seigle, et entre le chou et le navet. Le tableau 3 représente les noms communs et origines des séquences 5 des aliments du tableau 2. LECA = séquences réalisées par les inventeurs. Tableau 3 Nom scientifique Nom de Origine l'aliment Theobroa cacao Cacao LECA Beta vulgaris Bettrave sucrière LECA Castanea sativa Châtaigne GenBank: AF133653 Cannabis sativa Cannabis GenBank: AF501598 Cicer arietinum Pois chiche GenBank: AB 117648 Saccharum officinarum Canne à sucre GenBank: AY116253 Asparagus officinalis Asperge GenBank: AJ441164 Triticum aestivum Blé GenBank: AB042240 Secale cereale Seigle GenBank: AF519162 Oryza sativa Riz GenBank: X15901 Panicum miliaceum Millet GenBank: AY142738 Ribes aureum Groseiller à fleur GenBank: jaune AF374816 Fragaria vesca Fraise LECA Citrus x paradisi Citron/Orange GenBank: AY295277 Triphasia trifolia Poncirus GenBank: AY295297 Vitis vinifera Raisin LECA Prunus persica Pêche GenBank: AF348560 Prunus armeriana Abricot LECA Prunus cerasus Cerise LECA Actinidia chinensis Kiwi GenBank: AF534655 Zea mais Maïs GenBank: NC_001666 Pisum sativum Petit pois LECA Phaseolus vulgaris Haricot GenBank: AY077945 Sorghum halepense Sorgho GenBank: AY 116244 Cynara cardunculus Artichaud GenBank: AF129828 Arctium Zappa Grande bardane GenBank: AF129824 Lactuca sativa Laitue GenBank: U82042 Helianthus annuus Tournesol GenBank: U82038 Ficus carica Figue LECA Humulus lupulus Houblon GenBank: AF501599 Avena sativa Avoine GenBank: X75695 Nasturtium officinale Cresson GenBank: AY122457 Armoracia rusticana Raifort GenBank: AF079350 Hordeum vulgare Orge GenBank: X74574 Anthriscus cerefolium Cerfeuil GenBank: AF432022 Allium cepa Oignon LECA Allium porum Poireau LECA Carum petroselinum Persil LECA Solanum tuberosum Pomme de terre LECA GenBank: Solanum lycopersicum Tomate AY098703 Solanum melongena Aubergine GenBank: AY266240 Raphanus sativus Radis GenBank: AF451576 Brassica oleracea capitata Choux GenBank: AF451574 Brassica rapa rapa Navet GenBank: AF451573 Brassica nigra Moutarde noire GenBank: AF451579 Olea europaea Olive LECA Urtica dioica Ortie GenBank: AY208725 Rumex acetosa Oseille GenBank: AY177334 3) Exemples d'applications à des substrats dégradés Nous avons réalisé plusieurs expérimentations qui démontrent clairement la validité de l'approche proposée dans la présente demande. L'ADN de plusieurs substrats complexes et/ou transformés a été extrait en utilisant un kit d'extraction classique et en suivant les instructions du fabriquant (Dneasy Plant Mini kit, Qiagen) . Les substrats testés sont les suivants: (i) Sucre de canne (ii) Pomme de terre cuite (iii) Pâte cuite (iv) Potage en sachet lyophilisé Pour les aliments solides, l'ADN a été extrait à partir de 50 mg de poids sec. Le volume final de l'extrait d'ADN a été récupéré dans 200 NI. L'amplification a été réalisée en utilisant les amorces g et h (Tableau 1) , 15 et les conditions d'amplification suivantes: (i) volume final: 25pl (ii) MgCl2: 2 mM (iii) dNTP: 0,2 mM chacun (iv) Amorces: 1 pM chacune (v) Taq polymérase (Amplitaq Gold, Perkin Elmer) : 1 unité (vi) BSA: 0,2 pl par tube (vii) Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 pl (1/80 de l'extrait) (viii) Dénaturation initiale de 10 mn à 95 C (ix) Nombre de cycles: 35 (sauf pour le sucre de canne: 50) (x) Dénaturation: 30 s à 95 C, Hybridation: 30 s à 55 C, Elongation: 60 s à 72 C La Figure 2 illustre un résultat d'amplification. Les produits d'amplification ont ensuite été séquencés par séquençage direct sur séquenceur automatique capillaire ABI 3100. Les séquences obtenues pour le sucre de canne, la pomme de terre cuite, et la pâte cuite sont identiques respectivement aux séquences de la canne à sucre (Saccharum officinarum), de la pomme de terre (Solanum tuberosum), et du blé (Triticum aestivum). En revanche, la séquence obtenue par séquençage direct pour le potage en sachet lyophilisé n'est pas lisible, ce qui indique qu'il s'agit d'un mélange. Nous avons donc cloné le produit PCR du potage en sachet lyophilisé afin de séparer les différentes molécules. Sur 23 clones séquencés, nous avons obtenu 19 clones contenant la séquence du poireau, trois clones contenant la séquence de la pomme de terre, et un seul clone contenant la séquence de l'oignon. Le tableau 4 montre les résultats du clonage du produit d'amplification obtenu à partir du potage en sachet lyophilisé (23 clones séquencés). Les résultats obtenus correspondent à la composition indiquée sur le sachet. Tableau 4 Séquence obtenue Identification nombre ATCTTTATTTTTTGAAAAACAAGGGTTTAAAA Poireau 9 AAGAGAATAAAAAAG ATCCTGTTTTCTGAAAACAAACAAAGGTTCA Pomme de terre 3 GAAAAAAAG ATCTTTCTTTTTTGAAAAACAAGGGTTTAAAA Oignon 1 AAGAGAATAAAAAAG 4) Exemple comparatif sur substrat dégradé avec les amorces g, h et c, d L'objectif de cette expérimentation était de comparer la présente invention avec l'approche publiée en 1991 (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109). L'ADN génomique a été extrait à partir de 100 mg de mie de pain en utilisant un kit d'extraction (Dneasy Plant Mini kit, Qiagen) et en suivant les instructions du fournisseur. Le volume final de l'extrait d'ADN a été récupéré dans 100 pI. L'amplification a été réalisée en utilisant d'une part les amorces g et h, et d'autre pari: les amorces cet d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109). Les conditions d'amplifications suivantes ont été appliquées: volume final: 25p1 MgC12: 2 mM dNTP: 0,2 mM chacun Amorces: 1 pM chacune Taq polymérase (Amplitaq Gold, Perkin Elmer) : 1 unité BSA: 0,2 pI par tube Volume d'extrait d'ADN utilisé : 2,5 pI (1/80 de l'extrait) Dénaturation initiale de 10 mn à 95 C Nombre de cycles: 25 Dénaturation: 30 s à 95 C, Hybridation: 30 s à 55 C, Elongation: 60 s 20 à 72 C La Figure 3 présente les résultats obtenus. Aucun produit d'amplification n'apparaît avec les amorces c et d, alors qu'un produit d'amplification est obtenu avec les amorces g et h. REVENDICATIONS 1) Paire d'oligonucléotides caractérisée en ce que le premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 67 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac dont la séquence est représentée à la SEQ ID No. 3. 2) Paire d'oligonucléotides caractérisée en ce que le premier oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 67 et le deuxième oligonucléotide s'hybride à la séquence de la SEQ ID No. 68 dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification sélective d'une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux dont la séquence est représentée aux SEQ ID Nos. 23-66. 3) Paire d'oligonucléotides selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'hybridation s'effectue à 55 C dans un tampon d'amplification comprenant du MgCl2 2mM. 4) Paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le premier oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 1, 4-15 et le deuxième oligonucléotide est choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 2, 16-22. 5) Oligonucléotide caractérisé en ce que sa séquence est choisie dans le groupe comprenant la SEQ ID No. 1, la SEQ ID No. 2, les SEQ ID Nos. 4-15 et les SEQ ID Nos. 16-22. 6) Polynucléotide caractérisé en ce que sa séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. 7) Paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4, oligonucléotide selon la revendication 5 ou polynucléotide selon la revendication 6 35 caractérisés en ce qu'ils sont immobilisés sur un support solide. 8) Procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon comprenant de l'ADN génomique végétal; b) on amplifie une région variable de l'ADN chloroplastique avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5. 9) Procédé d'amplification d'une région variable de l'ADN chloroplastique des végétaux selon la revendication 8 caractérisé en ce que à l'étape b) la région variable de l'ADN chloroplastique amplifiée est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. 10)Procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale; b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5; c) on détecte l'obtention d'un produit d'amplification attestant de la présence d'une espèce végétale dans l'échantillon. 11)Procédé de détection d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 10 caractérisé en ce que à l'étape c) le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. 12)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on dispose d'un échantillon suspecté de contenir une espèce végétale, b) on effectue une réaction d'amplification avec une paire d'oligonucléotides selon l'une des revendications 1-4 et 7, ou avec au moins un oligonucléotide selon la revendication 5; c) on analyse le produit d'amplification obtenu pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. 13)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 dans lequel à l'étape c) le produit d'amplification est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66. 14)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. 15)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on hybride le produit d'amplification avec au moins une séquence végétale de référence pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. 16) Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 15 dans lequel la séquence de référence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 3 et 23-66. 17)Procédé d'identification d'une espèce végétale dans un échantillon selon la revendication 12 ou 13 dans lequel à l'étape c) on analyse le produit d'amplification par électrophorèse pour identifier l'espèce végétale contenue dans l'échantillon. 18)Utilisation de la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux correspondant aux positions 49425 à 49466 de l'ADN chloroplastique du tabac pour la détection et l'identification d'espèces végétales. 19) Utilisation selon la revendication 18 dans laquelle la région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL des végétaux est un polynucléotide dont la séquence est choisie dans le groupe comprenant les SEQ ID Nos. 23-66.