Brevet FR2878861A1 — publié le 20060609

La présente invention concerne l'identification de nouveaux polynucléotides et polypeptides, leur production et leur utilisation dans le domaine du diagnostic et/ou la production de vaccins contre Legionella pneumophila. Les légionelloses sont des infections respiratoires sévères résultant de l'inhalation d'aérosols contaminés par des bactéries à croissance intracellulaire du genre Legionella, et qui se manifestent sous forme sporadique ou épidémique. Ces infections surviennent aussi bien en ville (infections communautaires) qu'en milieu hospitalier (infections nosocomiales). Legionella pneumophila est responsable de 95% de l'ensemble des cas de légionellose. Les légionelloses se présentent principalement comme des infections pulmonaires aiguës. Elles se caractérisent par la sévérité du tableau clinique: après une incubation de 2 à 10 jours et un début pseudogrippal, le malade présente une température élevée, un malaise général, des douleurs abdominales, voire des troubles psychiques. L'atteinte radiologique est souvent bilatérale. La mortalité associée, particulièrement élevée chez certaines personnes dites à risque (sujets âgés ou souffrant d'un cancer, d'une hémopathie), varie de 10 à 20% (13% des 835 cas recensés en France en 2002). Il est essentiel de pouvoir poser précocement le diagnostic de légionellose du fait de l'enjeu thérapeutique: en effet, les légionelles sont insensibles aux bêta-lactamines - qui sont les principaux antibiotiques prescrits en cas de pneumopathie - et il faut avoir recours à un traitement spécifique reposant sur les macrolides (érythromycine) ou les fluoroquinolones. A l'heure actuelle, le diagnostic est réalisé par trois méthodes générales: la mise en évidence des bactéries à partir de prélèvements broncho-pulmonaires (soit directement par immunofluorescence soit par culture sur milieux sélectifs) ; la détection d'antigènes urinaires spécifiques; la mise en évidence d'une augmentation 2878861 2 significative du titre des anticorps dans le sérum (sérologie). L'examen direct des prélèvements réalisé par microscopie à fluorescence se pratique, pour la majorité des réactifs commercialisés, à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui reconnaissent l'ensemble des sérogroupes connus de L. pneumophila. Le principal inconvénient de cette technique est sa faible sensibilité. Sa spécificité est également imparfaite (-90%), du fait de réactions immunologiques croisées avec certaines bactéries comme Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertusis ou Bacteroides fragilis. La culture sur milieux spécifiques est la méthode de choix, notamment dans un but épidémiologique (typage des souches), mais donne des résultats tardifs puisque les légionelles cultivent en 3 à 4 jours, voire plus. Les tests urinaires sont rapides et très spécifiques. Néanmoins, leur sensibilité est très variable, de 50-90% ; cette forte variabilité est liée non seulement aux caractéristiques du patient mais aussi au fait que les tests actuels permettent seulement la détection de L. pneumophila sérogroupe 1. Enfin, en présence d'une recherche positive d'antigènes urinaires de légionelles, il est indispensable de réaliser en parallèle une culture de prélèvements respiratoires pour l'isolement de la bactérie. Le sérodiagnostic est tout particulièrement utile chez les patients qui ne produisent pas d'expectoration et en cas d'enquête épidémiologique. Il repose sur la mise en évidence d'une augmentation significative du taux des anticorps entre un sérum précoce et un sérum prélevé 4 à 6 semaines plus tard. Environ 30% des cas de légionellose sont identifiées par cette méthode à l'heure actuelle. Néanmoins, les antigènes utilisés dans les tests actuels sont constitués de simples extraits préparés directement à partir de culture de légionelles inactivées par la chaleur ou après ensemencement des bactéries dans le sac vitellin d'oeufs embryonnés. Les anticorps détectés reconnaissent en 2878861 3 majorité des déterminants du lipopolysaccharide (LPS), qui peuvent être proches de déterminants du LPS d'autres bactéries et provoquer des réactions croisées. De fait, des réactions de ce type ont été décrites avec d'autres bactéries Gram négatives telles que Pseudomonas sp., Bacteroides sp., Bordetella sp. et certaines entérobactéries. Enfin, la plupart des tests actuels permettent seulement la détection des anticorps de type IgG, ce qui nécessite deux prises de sang à 4-6 semaines d'intervalle pour faire un diagnostic d'infection récente. En résumé, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir le diagnostic précoce des légionelloses. En particulier, les tests sérologiques actuels reposent sur des méthodes de détection anciennes, non automatisables, ou utilisent des antigènes non caractérisés ( soupes antigéniques ), dont la spécificité et la sensibilité sont peu satisfaisantes. La technique d'immunofluorescence indirecte (IFI) est la technique la plus employée pour le diagnostic sérologique (McDade JE, Shepard CC, Fraser DW, Tsai TR, Redus MA et Dowdle WR (1977), Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease, N Engl J Med. 297 (22) : 1197-203). Environ 70% des diagnostics au niveau européen sont réalisés par cette méthode. Il existe pourtant de très grandes variations selon les malades: ainsi pour un titre élevé précoce, la sensibilité est basse et la valeur prédictive est très faible (de l'ordre de 10-15% seulement) (Jarraud S, Reyrolle M et Etienne J. dans Freney J, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000). Aucune technique de sérodiagnostic n'utilise donc actuellement d'antigènes purifiés spécifiques de L. pneumophila. Les inventeurs de la présente invention ont identifié, à partir du génome de L. pneumophila, un tel antigène, constitué par une protéine qu'ils ont appelée 2878861 4 2E1, de séquence polypeptidique ID SEQ N 2. Cette protéine s'apparente aux protéines de la famille des OmpH. L'homologue le plus proche de cette protéine est une protéine de Coxiella burneti qui possède seulement 35% d'identité avec 2E1 et qui est elle- même un homologue putatif de la porine OmpH. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi identifié de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides dont les utilisations possibles sont décrites ci-après Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles 2878861 5 que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée. Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines. Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou aminoterminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation 2878861 6 de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. C:reighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48- 62 (1992)). On entend par "isolé", modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été modifié ou isolé de son environnement naturel, ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé", mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé des matériaux coexistants dans son état naturel est "isolé". On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou 2878861 7 par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou la séquence peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements.(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). 2878861 8 Par analogie, un premier polynucléotide ayant une identité d'au moins 95% avec un second polynucléotide est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides dudit second polynucléotide peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou ledit premier polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus par rapport au nombre total de nucléotides du second polynucléotide. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de Legionella pneumophila et celle du polynucléotide conforme à l'invention est de coder ce polypeptide. On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène. 2878861 9 On entend par "analogie structurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) (BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995). On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique. Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant nonnaturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. 2878861 10 Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide. Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. Comme indiqué plus haut, l'invention a pour objet de nouveaux polynucléotides, polypeptides, vecteurs d'expression comprenant ledit polynucléotide et cellules hôtes comprenant ledit vecteur d'expression, leur production, et leur utilisation dans la production d'anticorps, le domaine du diagnostic In vitro et/ou la production de vaccins contre Legionella pneumophila. Les polynucléotides La présente invention a notamment pour objet un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 (appelée 2E1 et extraite à partir du génome de Legionella pneumophila) . L'invention vise également un polynucléotide isolé comprenant: a) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% 35 d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou avec la partie de séquence telle que définie 2878861 11 sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou à la partie de séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b). La présente invention concerne aussi un polynucléotide isolé, comprenant la séquence ID SEQ N 1, codant pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN. Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. Les vecteurs d'expression et les cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention. De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier. 2878861 12 Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre. La présente invention a aussi pour objet une cellule 10 hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales. Les polypeptides La présente invention a aussi pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine 2E1), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention vise également un polypeptide isolé comprenant: a) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence 35 ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux 2878861 13 au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. Les anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'anticorps immunospécifiques, ainsi que les anticorps immunospécifiques pour les polypeptides conformes à l'invention, tels que définis précédemment. Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Sérologie 2878861 14 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'anticorps dirigés contre Legionella pneumophila. L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'antigènes de Legionella pneumophila. L'invention vise, en outre, l'utilisation de polypeptides et d'anticorps selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, respectivement, les anticorps dirigés contre Legionella pneumophila et les antigènes de Legionella pneumophila et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum). Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention ainsi que des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins:L'un des anticorps conformes à l'invention. Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'invention ou un polynucléotide ou un vecteur recombinant ou une cellule hôte selon l'invention. Partie expérimentale A) Protocole d'obtention des antigènes Clonage de la séquence codant pour la protéine 2E1 Le gène codant pour les séquences de la protéine 2E1, qui est un antigène, est obtenu par amplification par PCR à 2878861 15 partir de l'ADN génomique de la bactérie Legionella pneumophila (souche Philadelphia-1, ATCC 33152) en utilisant comme couple d'amorces: l'oligonucléotide sens contenant la séquence: 5'GATTGGGCAAAGATAGGCG -:3' ; et l'oligonucléotide antisens contenant la séquence: 5'- ATTAATTGCTTTAATAAC -3' Le fragment ainsi amplifié correspondant est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production de la protéine clonée sous contrôle d'un promoteur inductible par 1'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). La protéine clonée correspond à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Expression de la protéine 2E1 Une souche d'Escherichia coli est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C sous agitation dans 30ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 gg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50eme dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 g/ml et incubée à 30 C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5. Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris--HC1 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique 2878861 16 (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). La suspension est incubée minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C à 15500xg. Le culot est congelé à -20 C pendant au moins une nuit. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 m. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SPSépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes [acide 2(N-morpholino) éthane sulfonique] 25 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/1. La solution est laissée au moins une nuit à 4 C puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 l de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM pH 8,0 contenant du NaCl 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple SuperdexHR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20 C jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T. , (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par élecrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse. B) Test de diagnostic in vitro Il a été utilisé des sérums provenant de patients ayant eu une infection documentée à Legionella pneumophila 2878861 17 (collection du laboratoire). L'infection a pu être avérée soit par l'isolement/culture des bactéries à partir de prélèvements broncho-pulmonaires, soit par la mise en évidence d'une séroconversion ou encore par un test urinaire positif. Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire). La fixation, sur la protéine 2E1 recombinante purifiée (obtenue comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums peut être évaluée soit par des tests en Western Blot soit par 1a technique ELISA. Protocole du test en Western blot Après transfert, sur une membrane de nitrocellulose, de la protéine purifiée 2E1,, la membrane est saturée 30 minutes à l'aide d'une solution de "tampon salin phosphate" (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (soit 1/300ème) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G, A, M humaines de chèvre (par exemple 170-6462, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés simultanément, pendant une période de 30 minutes après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé. Trois nouveaux lavages sont réalisés puis du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés selon les indications du fournisseur jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat "positif" correspond à une précipitation du substrat sur la membrane à la position de 2E1. Protocole du test en ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4 C en présence de 0,5 g d'antigène purifié (protéine recombinante 2E1) dans du "tampon salin phosphate" (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du 2878861 18 polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure à 37 C par du PBS- Tween contenant 5% de lait demi-écrémé (250 l par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 l de chaque sérum positif, à la dilution 1/200ème dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi- écrémé, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25 C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps antiimmunoglobulines G, A, M humaines de chèvre marqués à la phosphatase alcaline sont ajoutés simultanément pendant 30 minutes à 25 C après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 l de substrat (phosphate de p-nitrophényle), pNPP, par exemple A-3469, Sigma) sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm de chacun des puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37 C. Résultats et interprétation Un résultat type obtenu est présenté dans le tableau ci-après, sachant que les sérums dits "positifs" dans ce tableau sont ceux contenant des anticorps contre Legionella pneumophila identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention par ELISA: 2878861 19 Tableau de résultats du test en ELISA Nombre de sérums de malades 31 infectés par Legionella pneumophila, diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Sérums "positifs" parmi les 12, soit 38,7% 31 testés Sérums de donneurs de sang 88 comme témoins Sérums "positifs" parmi les 8, soit 9 88 testés Des résultats similaires sont obtenus en Western-Blot. D'après le Tableau, on constate que, par le test ELISA ou par le test Western blot, on identifie in vitro au moins 38 des infections à Legionella pneumophila, grâce à l'antigène selon l'invention. Il est donc démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0, 05) vis-à-vis de la protéine 2E1 au cours des infections à Legionella pneumophila et, d'autre part, que la protéine 2E1 est pertinente pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection. De plus l'utilisation de l'antigène 2E1 selon l'invention permet, dans certains cas, l'identification de malades non détectés à ce stade de l'infection (mais confirmés dans des analyses ultérieures) par les techniques de sérologie de l'art antérieur. REVENDICATIONS 1. Polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou b) une partie de la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) une séquence polynucléotidique complémentaire à une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c). 2. Polynucléotide isolé selon le point a) de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. 3. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide 20 selon la revendication 1 ou 2. 4. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 3. 5. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 4 et à isoler ledit polypeptide du milieu de culture. 6. Polypeptide isolé comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une partie de la séquence d'acides aminés 30 ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou c) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. 2878861 21 7. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon la revendication 6. 8. Utilisation des polypeptides selon la revendication 6 pour détecter, in vitro, la présence 5 d'anticorps à Legionella pneumophila dans des échantillons biologiques. 9. Utilisation des anticorps selon la revendication 7 pour détecter, in vitro, la présence d'antigènes Legionella pneumophila dans des échantillons biologiques. 10. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon la revendication 6, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, ou un vecteur recombinant selon la revendication 3 ou une cellule hôte selon la revendication 4. 12. Kit pour l'utilisation selon la revendication 8, 20 caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides. 13. Kit pour l'utilisation selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps.