Brevet FR2873038A1 — publié le 20060120

COMPOSITION COMPRENANT UN MILIEU DE CULTURE DE MICROORGANISME MARIN ET/OU D'EAU DOUCE PHOTOSYNTHÉTIQUE. La présente invention concerne une composition comprenant, à titre de principe actif, un milieu de culture clarifié de microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique. L'utilisation de microorganismes dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie est connue de l'art antérieur. Le document EP 0 876 813 décrit une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, une quantité efficace de milieu de culture d'au moins une bactérie filamenteuse non photosynthétique, ledit milieu étant clarifié et stabilisé. Il a notamment été découvert dans le document EP 0 876 813 que le milieu de culture clarifié et stabilisé présentait des propriétés similaires de celles de la biomasse. La recherche d'ingrédients biologiquement actifs est un domaine en plein développement car c'est un moyen pour augmenter la performance de produits devant présenter une activité biologique qui est nécessaire au développement de produits cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires. L'activité biologique est mesurée grâce à des modèles biologiques qui vont permettre de comparer entre eux plusieurs ingrédients afin de ne retenir que le ou les meilleurs sur le modèle considéré. Par exemple, les biologistes ont développé de nombreux modèles qui permettent de sélectionner des extraits et molécules actives sur des mécanismes biologiques importants pour réguler le métabolisme cutané. Les actifs, sélectionnés grâce à ces modèles, peuvent ainsi être incorporés dans des produits cosmétiques et/ou dermatologiques qui seront bénéfiques sur des paramètres cutanés qui auront été préalablement ciblés. La même approche est valable pour le développement de produits pharmaceutiques, diététiques et alimentaires qui s'appuient également sur l'activité biologique démontrée sur des modèles. La recherche d'ingrédients biologiquement actifs s'appuie sur des criblages de nombreux ingrédients sur des modèles biologiques judicieusement choisis par l'homme de l'art. Généralement, les ingrédients proviennent de plantes qui ont été préalablement sélectionnées par diverses méthodes. L'ethnobotanique est l'approche la plus utilisée. Elle consiste à étudier préférentiellement des plantes dont l'utilisation est déjà existante dans des usages traditionnels ou par les médecines anciennes. La plante sélectionnée est testée sur des modèles biologiques appropriés. Pour chaque plante de nombreux tests sont à réaliser sur différents organes de la plante et sur différents modes d'extractions. Dans le cas de plantes sélectionnées par l'approche ethnobotanique, l'usage traditionnel oriente le chercheur vers le ou les modèles biologiques à mettre en uvre. L'approche ethnobotanique est très efficace pour la sélection de végétaux terrestres, ce qui n'est cependant pas le cas des végétaux marins qui sont peu, voir pas du tout connus pour des usages traditionnels. La présente invention concerne la découverte, la mise au point et l'utilisation d'une nouvelle famille d'actifs particulièrement intéressante. Cette nouvelle famille est issue du monde marin et/ou d'eau douce et plus précisément de milieux marins et/ou d'eau douce contenant des microorganismes. Ces microorganismes appartiennent aux différentes familles des microalgues et bactéries marines (=les cyanobactéries), largement répandues dans les mers, océans, lacs, rivières et étangs, communément appelées phytoplanctons. La présente invention a plus particulièrement pour objet une composition cosmétique, dermatologique, pharmaceutique ou alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu de culture d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, ledit milieu étant clarifié. Généralement, les microorganismes sont cultivés dans des conditions standardisées afin de fournir une biomasse qui est habituellement obtenue par centrifugation. Cette biomasse peut alors subir les mêmes techniques d'extraction que celles utilisées pour les végétaux terrestres, et peut donc en conséquence aboutir à des molécules et extraits biologiquement actifs. Cependant, dans le cas de la présente invention, ce n'est pas la biomasse qui est utilisée comme source de nouvelles substances actives mais c'est le milieu débarrassé de la biomasse. Ce milieu de culture est dénommé clarifié car il représente le résultat d'une culture clarifiée par élimination de la biomasse, c'est-à-dire par élimination de l'ensemble des microorganismes et débris cellulaires présents dans le milieu de culture. De façon surprenante, la Demanderesse a découvert que les propriétés du milieu de culture clarifié étaient différentes de celles de la biomasse. Ainsi lorsque le milieu de culture clarifié de la présente invention présente des propriétés cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires particulièrement intéressantes ceci n'est pas forcément le cas de la biomasse. Le milieu de culture clarifié entrant dans la composition de l'invention désigne le milieu de culture obtenu après amplification du ou des microorganismes mis en culture, et après séparation de l'ensemble des microorganismes et débris cellulaire du milieu de culture. Le milieu de culture clarifié ne contient alors plus que les substances résultantes de la culture du ou des microorganisme(s), encore dénommées substances actives. Les substances actives désignent notamment les métabolites primaires et secondaires synthétisés et relargués par les cellules dudit ou desdits microorganisme(s) marin(s) et/ou d'eau douce, lesdits métabolites pouvant être excrétés durant l'activité cellulaire ou bien libérés après lyse des cellules. Ces substances actives peuvent désigner des molécules de nature diverses: enzymes, peptides, acides aminés, vitamines, polysaccharides etc..., et possèdent différentes propriétés biologiques à même de jouer un rôle dans le secteur de la cosmétique, de la pharmacie ou de la nutrition. La Demanderesse a montré que, suivant la nature du milieu de culture, le choix du ou des microorganismes cultivés et du protocole de culture développé, de nouvelles substances actives très intéressantes pouvaient être produites pour des applications cosmétiques, dermatologiques, pharmaceutiques et alimentaires. La composition de l'invention est remarquable en ce qu'elle présente des propriétés cosmétiques particulièrement avantageuses, notamment 2873038 5 dépigmentantes et anti-oxydantes, grâce aux substances actives présentes dans le milieu clarifié. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue issue(s) de milieux marins tels que mer, océan, eau saumâtre, eau saline ou eau douce. L'eau saline désigne une eau présentant divers degrés de salinité allant de 35 g/L à 90 g/L. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue appartenant à la division des chlorophytes choisie(s) dans le groupe constitué par les cyanophytes, les chlorophytes, les chrysophytes, les chlorarachniophytes, les dinophytes, les cryptophytes, les euglenophytes ou les rhodophytes. Plus particulièrement, la cyanobactérie et/ou microalgue appartient à la classe des Prasinophycées choisie(s) dans le groupe constitué par les cyanophycées, les chlorophycées, les prasinophycées, les pedinophycées, les prymnesiophycées, les eustigmatophycées, les raphidophycées, les chrysophycées, les diatomophycées, les tribophycées, les chlorarachniophycées, les dinophycées, les cryptophycées, les euglenophycées et les rhodophycées. Parmi les microalgues utilisables, on peut citer par exemple. - Nostoc commune, Synechococcus sp. et Synechocystis sp, de la classe des cyanophycées; - Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus acutus, Dunaliella primolecta, Dunaliella tertiolecta, Dunaliella bardawil, Neochloris oleobundans, Clamydomonas reinhardtii, Botryococcus braunii, Chlorococcum oleofaciens, Dysmorphococcus globosus, Hormotilopsis gelatinosa, Ulothrix acuminata et Ourococcus sp, de la classe des chlorophycées; - Tetraselmis suecica, de la classe des prasinophycées; - Pavlova lutheri et Isochrysis galbana, de la classe des prymnésiophycées; - Nannochloropsis oculata, de la classe des eustigmatophycées; - Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans, Cyclotella sp, Thalassiosira pseudonana et Navicula pelliculosa, de la classe des diatomophycées; - Porphyridium cruentum et Rhodosorus marinas, de la classe des rhodophycées. La composition de l'invention est également caractérisée en ce que la quantité du milieu de culture clarifié représente de 0,01% à 100% en poids par rapport au poids total de la composition. La composition de l'invention est encore caractérisée en ce que ledit milieu de culture clarifié est obtenu par un procédé comportant les étapes suivantes: a) la sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini ci-dessus, b) l'introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente, c) l'amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture, d) l'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques. L'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification constitue la biomasse. Le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue de l'étape d) d'élimination, peut subir certaines modifications avant son utilisation. Ainsi, il peut par exemple être dessalé par électrodialyse ou nanofiltration afin de diminuer sa concentration en chlorure de sodium et faciliter son utilisation dans certaines formulations. Il peut être concentré par élimination d'une partie de l'eau le constituant, ou au contraire il peut être dilué. 1l peut également être séché par atomisation ou lyophilisation afin de se présenter sous une forme concentrée plus utilisable dans certaines applications. Lorsqu'on sélectionne, dans l'étape a) ci-dessus décrite, au moins deux microorganismes, ces deux microorganismes peuvent être identiques ou différents. Deux microorganismes différents désignent deux microorganismes, et notamment deux microalgues, appartenant à une espèce différente l'une de l'autre. En outre, ils peuvent appartenir à une classe différente et/ou à un genre ou à un ordre différent. Le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel est introduit au moins un microorganisme) est choisi dans le groupe constitué par l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande, l'eau de mer, l'eau d'océan, l'eau saumâtre, l'eau saline, l'eau douce, un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme ou leurs mélanges. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel est introduit au moins un microorganisme) est un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini cidessus ou tel qu'obtenu à l'issue du procédé tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture de l'étape b) peut être enrichi en éléments nutritifs choisis dans le groupe constitué par les minéraux, les oligo-éléments et les vitamines. La culture (étape c) d'amplification) peut être effectuée à la température appropriée convenant à l'espèce du ou des microorganisme(s) cultivé(s), et notamment de la ou des microalgue(s) cultivée(s). Généralement, cette température est comprise entre 15 et 25 C suivant la nature de l'espèce cultivée. Le pH du milieu de culture est compris entre 2 et 12, et de préférence entre 7 et 8 suivant la nature de l'espèce cultivée. Chaque jour différents paramètres sont mesurés (densité optique, concentration cellulaire, température, oxymétrie etc...) afin de suivre l'évolution de la croissance cellulaire dans le milieu de culture. L'étape d) d'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification peut être obtenue par toute technique classique, comme par exemple la centrifugation ou la filtration, et de préférence la centrifugation. Cette étape d) permet de séparer la biomasse du milieu de culture et d'obtenir le milieu de culture clarifié. Le milieu de culture clarifié peut être obtenu à différents stades physiologiques de la culture, en fonction des substances actives que l'on recherche (début ou fin de phase exponentielle de croissance, phase stationnaire). Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue du procédé tel que décrit ci-dessus, comprend par exemple: - de l'Eau de Source marine de l'Ile Grande (éventuellement enrichie en éléments nutritifs), - des métabolites primaires et secondaires synthétisés et relargués par les cellules microalguales elles-mêmes (substances actives). Cependant, selon les microalgues cultivées, l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande peut être remplacée par de l'eau de mer, de l'eau douce ou de l'eau saumâtre (mélange d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande et d'eau douce). L'Eau de Source Marine de l'Ile Grande peut aussi être remplacée par le milieu de culture clarifié d'une autre microalgue, voir par son propre milieu de culture clarifié. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, une microalgue peut donc être cultivée dans son propre milieu de culture clarifié ou alors dans le milieu de culture clarifié d'une autre microalgue, avec ou sans ajout de milieu nutritif (concept de la "Clarificulture", terme inventé par la Demanderesse). De même, ainsi que cela a déjà été mentionné, deux microalgues ou plus, identiques ou différentes, peuvent être cultivées dans le même milieu de culture (concept de la co-culture). De même, chaque milieu nutritif (comprenant des minéraux, des oligoéléments, des vitamines...) est spécifique de chaque microalgue et de sa croissance, et peut varier d'une microalgue à l'autre. Le type et la concentration en substances actives synthétisées par les cellules microalguales sont fonctions de l'espèce de microalgue cultivée, de la phase physiologique de croissance et des conditions environnementales. Chaque culture de microalgues, nécessaire à l'obtention de milieux de culture clarifiés, est réalisée dans des photobioréacteurs ou des bassins. Un petit volume d'une solution concentrée en microalgues et stérile sert d'inoculum pour démarrer la culture. La composition selon l'invention est encore caractérisée en ce qu'elle contient au moins un autre ingrédient actif. Cet ingrédient peut être tout actif utile aux propriétés de la composition. L'ingrédient actif pouvant supplémenter les compositions de l'invention peut également provenir de la biomasse telle qu'obtenue à l'issue de l'étape d) d'élimination telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture clarifié, utilisé comme agent actif dans les compositions de l'invention, est vectorisé dans des liposomes ou autres vecteurs afin de favoriser leur activité pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou alimentaire. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) la sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini ci-dessus, b) l'introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente, c) l'amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture, d) l'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques. Le procédé de préparation selon l'invention est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il comprend les étapes telles que décrites ci-dessus. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de préparation de l'invention est caractérisé en ce que l'on procède en outre à une étape de criblage du milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus, ou tel qu'obtenu selon le procédé tel que défini ci-dessus, afin d'évaluer les propriétés pharmaceutiques, cosmétiques, dermatologiques ou alimentaires dudit milieu de culture clarifié. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique à activité éclaircissante et/ou dépigmentante. L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique protectrice contre les radicaux libres, permettant de lutter contre le vieillissement. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique permettant de lutter contre la sensibilité cutanée et les réactions inflammatoires. L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique à activité pigmentante sur la peau et le cheveu. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique à activité amincissante. L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique à activité bronzante. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci- dessus pour la préparation d'une composition cosmétique favorisant la pousse et la repousse du cheveu. L'invention concerne encore l'utilisation d'un milieu de culture clarifié tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition cosmétique à activité raffermissante, tonifiante, stimulante, équilibrante. La figure 1 illustre la réaction à la Dopa-Oxydase sur épiderme séparé. Le carré en haut à gauche représente le témoin DOPA, le carré en haut à droite représente l'acide kojique, le carré en bas à gauche représente le milieu de culture clarifié de Phaeodactylum tricornutum et le carré en bas à droite représente le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ces exemples illustrent l'invention sans la limiter aucunement. Exemple 1. préparation d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Tetraselmis suecica, et son utilisation cosmétique en tant que dépigmentant. Un bassin situé sous une serre, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 20 m3 d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. La composition du milieu nutritif est la Na2 EDTA: 0,045 g/L Na2 NO3: 0,1 g/L H3BO3: 0,0336 g/L NaH2PO4, 2H2O: 0,026 g/L MnC12, 4H2O: 3,6.10-4 g/L FeCl3: 6H2O: 1,3.10-3 g/L ZnC12: 2,1.10-5 g/L CoC12, 6H2O: 2.10-5 g/L (NH4) 6Mo7O24, 4H2O: 9.106 g/L CuSO4, 5H2O: 2.10-5 g/L Vitamine B1: 2.104 g/L Vitamine B12: 1.10-5 g/L On inocule le bassin avec 2500L d'une culture concentrée de la microalgue Tetraselmis suecica. Le bullage, assuré par 2 rampes de bulleurs situés de chaque côté du bassin, apporte à la culture de l'air et du CO2, et permet ainsi un brassage permanent des cellules. Tetraselmis suecica est cultivée à un pH de 7 grâce à une régulation automatique en CO2 et à une température de 20 C. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et à une température comprise entre 20 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,300 à la longueur d'onde de 435 nm. Après une dizaine de jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration (seuil de coupure de la membrane = 1000 daltons) afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques à activité dépigmentante. Exemple 2 Obtention d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Scenedesmus acutus, et son utilisation cosmétique en tant qu'antioxydant. Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce. Un milieu nutritif stérile (milieu MLA) est ajouté à l'eau douce. La composition du milieu nutritif est la suivante: Na2 EDTA: 4, 36.10-3 g/L FeC13: 6H2O: 1,58.10-3 g/L NaHCO3: 0,6.10-3 g/L MnC12, 4H2O: 0,36.103 g/L CuSO4, 5H20: 1.10-5 g/L ZnSO4, 7H2O: 2,2.10-5 g/L CoC12, 6H2O: 1.105 g/L MgSO4: 4,95. 10-2 g/L NaNO3: 0,17 g/L H3BO3: 2,47. 10-3 g/L NaHCO3: 4, 23. 10-3 g/L K2HPO4: 3,475. 10-2 g/L CaC12: 2, 94. 10-2 g/L Vitamine B1: 1. 10-4 g/L Vitamine B12: 5. 10-8 g/L Vitamine H: 5. 10-8 g/L Le photobioréacteur est inoculé avec 10 25 Litres d'une culture stérile et concentrée de Scenedesmus acutus. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Scenedesmus est réalisée à une température 30 de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. 10 15 20 Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 17 et 21 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 1,4 à la longueur d'onde de 679 nm. Après 15 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique afin d'être incorporé dans des compositions cosmétiques à activité anti-oxydante. Exemple 3 Culture de Phaeodactylum tricornutum dans le milieu de culture clarifié de Porphyridium cruentum. Au préalable une culture de Porphyridium cruentum est réalisée de la façon suivante: Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de mer. La composition du milieu nutritif est la suivante: Na2 EDTA: 0,045 g/L Na2 NO3: 0,1 g/L H3BO3: 0,0336 g/L NaH2PO4, 2H2O: 0,026 g/L MnCl2, 4H2O: 3,6.10-4 g/L FeC13: 6H2O: 1,3.10-3 g/L ZnC12: 2,1.10-5 g/L CoC12, 6H2O: 2. 10-5 g/L (NH4) 6Mo,O24, 4H2O: 9.10-6 g/L CuSO4, 5H2O: 2.10-5 g/L Vitamine B1: 2.10- 4 g/L Vitamine B12: 1.10-5 g/L Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Porphyridium cruentum. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Porphyridium cruentum est réalisée à une température de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 7,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,112 à la longueur d'onde de 440 nm. Après 15 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est filtré sur lpm afin d'éliminer les cellules résiduelles. Un nouveau photobioréacteur désinfecté au Deptil PA 5, est rempli avec les 300 Litres du clarifié filtré de Porphyridium cruenté obtenu précédemment. Litres d'une culture stérile et concentrée de Phaeodactylum tricornutum servent d'inoculât pour la culture. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Phaeodactylum tricornutum est réalisée à une température de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , O2, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention de la phase stationnaire. Après 10 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Exemple 4: Co-culture de Phaeodactylum tricornutum et de Skeletonema costatum dans un même milieu. Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de mer. La composition du milieu nutritif est la suivante: Na2 EDTA: 0,045 g/L Na2 NO3: 0,1 g/L H3BO3: 0, 0336 g/L NaH2PO4, 2H2O: 0,026 g/L MnC12, 4H2O: 3,6.10-4 g/L FeC13: 6H2O: 1,3.10-3 g/L ZnC12: 2,1.10-5 g/L CoC12, 6H2O: 2. 10-5 g/L (NH4) 6Mo,O24, 4H2O: 9.10-6 g/L CuSO4, 5H2O: 2.10-5 g/L Vitamine B1: 2.10- 4 g/L Vitamine B12: 1.10-5 g/L Silice: 0,04 g/L Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Phaeodactylum tricornutum puis avec 10 litres d'une culture stérile et concentrée de Skeletonema costatum. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La co-culture de Phaeodactylum tricornutum et Skeletonema costatum est réalisée à une température de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la co-culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la co-culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et à une température comprise entre 21 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,250 à la longueur d'onde de 440 nm. 10 Après 10 jours, la co-culture est centrifugée (16500 tours/min) et leclarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Exemple 5. préparation d'un milieu de culture clarifié issu d'une culture de Skeletonema costatum. 1) Culture de Skeletonema costatum dans de l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un bassin situé sous une serre, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 20 m3 d'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande. La composition du milieu nutritif est la suivante: Na2 EDTA: 0,045 g/L Na2 NO3: 0,1 g/L H3303: 0,0336 g/L NaH2PO4, 2H2O: 0,026 g/L MnC12, 4H2O: 3,6.10-4 g/L FeC13: 6H2O: 1,3.10-3 g/L ZnC12: 2,1.10-5 g/L CoCl2, 6H2O: 2. 10-5 g/L (NH4) 6Mo,O24, 4H2O: 9.10-6 g/L CuSO4, 5H2O: 2.10-5 g/L Vitamine B1: 2.10- 4 g/L Vitamine B12: 1.10-5 g/L Silice: 0,04 g/L On inocule le bassin avec 2500L d'une culture concentrée de la microalgue Skeletonema costatum. 25 30 Le bullage, assuré par 2 rampes de bulleurs situés de chaque côté du bassin, apporte à la culture de l'air et du CO2, et permet ainsi un brassage permanent des cellules. Skeletonema costatum est cultivée à un pH de 7 grâce à une régulation automatique en CO2 et à une température de 20 C. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , O2, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 7 et 8, et à une température comprise entre 20 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique d'environ 0,760 à la longueur d'onde de 440 nm. Après une dizaine de jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration (seuil de coupure de la membrane = 1000 daltons) afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques. 2) Culture de Skeletonema costatum dans de l'eau provenant d'une nappe souterraine. Un bassin extérieur est rempli avec de l'eau provenant d'une nappe souterraine. On inocule le bassin avec une culture concentrée de la microalgue Skeletonema costatum. L'agitation de la culture, permettant un brassage permanent des cellules, est assurée par des rampes de bulleurs situés au fond du bassin. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique d'au moins 0,600 à la longueur d'onde de 440 nm. Lorsque la concentration cellulaire désirée est atteinte, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le milieu de culture clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré et dessalé par nanofiltration + diafiltration afin d'atteindre l'isotonie et pouvoir être incorporé dans des compositions cosmétiques. Exemple 6: Méthode de criblage de milieux de culture clarifiés dépigmentants par la réaction à la Dopa-Oxydase sur épiderme séparé (Laboratoire BIO-EC) La méthode consiste à visualiser sur des mélanocytes humains le potentiel dépigmentant d'une composition testée par inhibition de la L-DOPA oxydase (une des enzymes responsables de la synthèse des mélanines). La réaction se fait par mélange de la composition dépigmentante et de la L-DOPA. La réaction est visualisée par l'intensité de la coloration des mélanocytes sur épiderme séparé. Le témoin 100% d'activité (maximum de coloration) est effectué en présence de L-DOPA (substrat de la L-DOPA oxydase). Le témoin positif (minimum de coloration) est effectué en présence de LDOPA additionné d'acide kojique à 0.015%. L'acide kojique est connu pour son activité dépigmentante. Les milieux de culture clarifiés testés sont respectivement: - le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica tel qu'obtenu dans l'exemple 1, - le milieu de culture clarifié de Phaeodactylum tricornutum tel qu'obtenu dans l'exemple 3. Les épidermes utilisés sont ceux provenant d'une plastie mammaire congelée. Les épidermes sont séparés par incubation dans du NaBr 2N (1h45) à 37 C. Les épidermes sont fixés dans un fixateur formolé tamponné, sont rincés et mis en contact avec le mélange volume/volume: solutions de L-DOPA (substrat)/milieu de culture clarifié (50 1_1g d'extrait lyophilisé/ml de milieu de dosage). Après incubation, les épidermes sont rincés, montés entre lame et lamelle avec du liquide de montage Mounting Medium (mélange aqueux contenant du glycérol et permettant une conservation parfaite de l'échantillon). L'observation est réalisée en microscopie optique (objectif x 10). Les résultats de la réaction à la Dopa- Oxydase sur épiderme séparé sont illustrés à la figure 1. Conclusion: le milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica présente une activité dépigmentante semblable à celle obtenue avec de l'acide kojique sur le modèle d'épiderme séparé, tandis que le milieu de culture clarifié de Phaedactylum tricornatum ne présente pas d'activité dépigmentante. Exemple 7: Effets de milieux de culture clarifiés sur la production d'IL8 par des KHN stimulés avec de l'IL-15 (Laboratoire SEPhRA) Principe du test: Des kératinocytes humains normaux sont mis en culture dans une microplaque jusqu'à obtention d'une confluence à 80%. Les primocultures de KHN sont obtenues à partir de cellules isolées de prélèvements cutanés issus de chirurgie plastique. Les KHN sont ensemencés à la densité de 20000 cellules par puits (milieu de culture spécifique KSFM, Life Technologies) dans une microplaque 96 puits. Les cellules sont mises à incuber dans une étuve humide à 37 C sous 5% de CO2 pendant 24H. Les cellules sont ensuite traitées pendant les 24H suivantes avec les différents milieux de culture clarifiés à tester en même temps qu'elles sont stimulées par de l'IL-1 à 1 ng/ml. 4 puits sont traités par dilutions (n = 4), les dilutions étant réalisées dans le milieu de culture. Des cellules sont laissées sans traitement et d'autres ne sont traitées que par l'IL-15. Des surnageants de culture contenant l'IL-8 sont conservés à -20 C jusqu'au dosage. L'IL-8 humaine est quantifiée au moyen du test en microplaque ELISA Quantikine (Kit Quantikine human IL-8 D8050, R&D systems). Le test utilise la méthode immunoenzymatique du sandwich. Un anticorps monoclonal spécifique de l'IL-8 a été pré-coaté sur une microplaque. Sont déposés dans les puits de la microplaque de titration: - les standards (IL-8 humaine recombinante) (n = 2) à des concentrations allant de 0 à 1000 pg/ml, - les surnageants de culture à doser contenant l'IL 8 libérée par les cellules traitées par le milieu de culture clarifié ( = 4), - l'anticorps polyclonal anti-IL-8 conjugué à l'enzyme Horse Radisch Peroxydase. Si de l'IL-8 est présente, elle est piégée entre l'anticorps immobilisé et l'anticorps polyclonal conjugué. Après lavage éliminant toutes substances non adhérées, une solution substrat (peroxyde d'hydrogène et tetraméthylbenzidine) est ajoutée aux puits. La coloration se développe proportionnellement à la quantité d'IL-8 piégée. La réaction colorée est stoppée et l'intensité de coloration (DO) mesurée à 450 nm. Le résumé rapide du protocole est le suivant. 1. Ajouter 100 pl/puits de tampon de dosage (fourni par le kit), 2. Ajouter 50 pl/puits de standard (concentrations connues d'IL8) ou d'échantillons à doser (surnageants de culture contenant l'IL8 libérée par les cellules traitées par le milieu de culture clarifié). Agiter la plaque pour mélanger les réactifs dans chaque puits. 3. Ajouter 100 pl/puits d'IL-8 conjugué. 4. Laisser incuber l'ensemble 2h30 à température ambiante. 5. Vider les puits puis rincer par 5 ou 6 lavages. 6. Ajouter 200pl/puits de solution substrat (peroxyde d'hydrogène et tetraméthylbenzidine) et incuber 30 minutes à l'abri de la lumière. 7. Ajouter 50 pl de solution stop (solution d'acide). 8. Lire l'absorbance à 450 nm dans les 30 minutes et calculer les résultats de la concentration en pg/ml d'IL-8. En parallèle, un dosage protéique pour chaque puits de la microplaque est effectué. La méthode utilisée est celle de l'acide bicinchoninique (ou BCA). Après 24H de traitement, les surnageants sont congelés et les puits rincés avec du PBS sans Ca" ni Mg' (Gibco). Le tapis cellulaire est dissous à l'aide d'une solution de NaOH 0,1 M. Un mélange d'acide bicinchoninique et de sulfate de cuivre (50V/1V) est ajouté. La plaque est placée à 37 C sous 5% de Cq dans l'obscurité. Après 30 minutes, l'absorbance à 570 nm est mesurée. En parallèle, une gamme étalon est réalisée à partir d'une solution mère de BSA (Bovin serum albumin) 1 mg/ml (P0914, SIGMA) permettant de convertir les DO en quantités (pg de protéines). Le résultat final est exprimé en pg/ml d'IL-8/ig de protéines (obtenues par le dosage au BCA). On observe 20 % d'inhibition de la libération d'IL8 par les kératinocytes après traitement par le milieu de culture clarifié à 25 pg/ml pour le milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta. Conclusion: une libération d'interleukine 8 traduit un terrain inflammatoire; par conséquent en inhibant la libération d'IL-8, on lutte contre un état inflammatoire de la peau. Dunalliela primolecta présente donc in vitro des propriétés antiinflammatoires. Exemple 8: Protocole anti-radicalaire - Test3D (DNA Damaged Detection) : Analyse quantitative 2873038 27 des effets protecteurs d'un milieu de culture clarifié de l'invention. Les milieux de culture clarifiés testés sont Scenedesmus dimorphus et Nostoc commune. La mesure du pouvoir anti-radicalaire est effectuée à l'aide d'un kit de dosage (réf. IDN 003) commercialisé par la société SFRI Laboratoire (FSaint Jean d'Illac) ayant pour but la mise en évidence de la protection de l'ADN par des extraits potentiellement anti-radicalaires contre des lésions causées par les radicaux hydroxyles (représentés par OH ), radicaux générés par la réaction de Fenton ci-dessous: Fe2+ + H2O2 OH + OH- + Fei+ Le protocole détaillé est le suivant: Les puits sont prélavés: on ajoute 300 pl de solution de lavage (tampon phosphate, pH 7), diluée au 1/10ème avec de l'eau ultra pure ne contenant pas de traces de métaux, puis on élimine l'eau par aspiration. On répète l'opération une fois. On distribue 50 pl d'ADN préalablement lésé ou non lésé dans le puits. On recouvre la microplaque de titration d'un film adhésif et on incube 30 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 2 fois. On distribue les milieux de culture clarifiés à tester: 50 pl de chaque échantillon dilué est distribué par puits (les milieux de culture clarifiés étant testés dans une zone de concentration allant de pure à une dilution au 1/100ème) On incube 30 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 3 fois. On répare les lésions de l'ADN par un système enzymatique de réparation (mélange fourni dans le kit de dosage et breveté par le fournisseur) à raison de 50 pl par puits de réparation dans chaque puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 3 heures à 30 C sans agiter. On lave les puits 3 fois. On distribue 50 iii de la solution de révélation I (nucléotide marqué par l'avidine peroxydase) dans tous les puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 15 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 5 fois. On distribue 50 de la solution de révélation II (substrat chimiluminescent de 10 l'avidine peroxydase) dans chaque puits. On incube 5 minutes à 30 C sous agitation douce à l'obscurité. On lit la plaque à l'aide d'un luminomètre. Les résultats sont exprimés en unité arbitraire de chimiluminescence (RLU) . É pourcentage d'inhibition non spécifique: (RLU ADN lésé) - (RLU ADN lésé + échantillon) / (RLU ADN lésé) x 100; É pourcentage d'inhibition en présence de radicaux libres: (RLU H2O2) - (RLU H2O2 + échantillon) / (RLU H202) x 10 0; É pourcentage de protection spécifique = (% d'inhibition en présence ROS) - (% d'inhibition non spécifique) ; (ROS= reactives oxygen species) Le tableau 1 ci-dessous représente les valeurs obtenues pour le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus. Tableau 1: Concentration testée en mghnL 1 0.1 0.01 0.001 % inhbition non spécifique 14.55 18.19 18.19 % inhbition en présence ROS 81.89 79.89 69.35 35 % de protection 67.34 61.7 51.15 35 20 Conclusion: le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus présente une IC50 (concentration permettant d'obtenir 50% d'inhibition de l'effet des radicaux libres) voisine de 0.01 mg/ml. Lors d'un stress externe comme une exposition prolongée aux radiations ultra-violettes ou à la pollution etc..., les cellules expriment un taux élevé de radicaux libres, ayant pour conséquence des effets délétères sur la cellule (dégradation de protéines, lipides, endommagement de l'ADN, mort cellulaire). Un extrait présentant une propriété antiradicalaire comme l'extrait de Scenedesmus dimorphus permettra donc à la cellule de mieux se défendre. Le tableau 2 ci-dessous représente les valeurs obtenues pour le milieu de culture clarifié de Nostoc commune. Tableau 2. Concentration testée en mgfmL 1 0.1 0.01 0.001 % inhibition non spécifique 18.3 Io iihibition en présence ROS 66.74 55.12 26.28 16.393 % de protection 48.43 36.82 7.973 -1.9102 Conclusion: le milieu de culture clarifié de Nostoc commune présente une IC50 (concentration permettant d'obtenir 50% d'inhibition de l'effet des radicaux libres) voisine de 1 mg/ml. Un extrait présentant une propriété antiradicalaire comme l'extrait de Nostoc commun permettra à la cellule de mieux se défendre. Exemple 9. Test3D (DNA Damaged Detection) : Mise en évidence des effets réparateurs d'un milieu de culture clarifié de l'invention sur l'ADN. Le milieu de culture clarifié testé est Skeletonema costatum. La mesure du pouvoir réparateur de l'ADN est effectuée à l'aide d'un kit de dosage (réf. IDN 003) commercialisé par la société SFRI Laboratoire (F-Saint Jean d'Illac) ayant pour but la mise en évidence de l'activation de la réparation de l'ADN par des extraits afin de réparer des lésions causées par les radicaux hydroxyles (représentés par OH ), radicaux générés par la réaction de Fenton ci-dessous: Fe2+ + H2O2 p OH' + OH- + Fei-' Le protocole détaillé est le suivant: Les puits sont prélavés: on ajoute 300 pl de solution de lavage (tampon phosphate, pH 7), diluée au 1/10ème avec de l'eau ultra pure ne contenant pas de traces de métaux, puis on élimine l'eau par aspiration. On répète l'opération une fois. On distribue 50 pl d'ADN préalablement lésé ou non lésé dans le puits. On recouvre la microplaque de titration d'un film adhésif et on incube 30 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 2 fois. On distribue les milieux de culture clarifiés à tester: 50 pl de chaque échantillon dilué est distribué par puits (les milieux de culture clarifiés étant testés dans une zone de concentration allant de pure à une dilution au 1/100') On incube 30 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 3 fois. On répare les lésions de l'ADN par un système enzymatique de réparation (mélange fourni dans le kit de dosage et breveté par le fournisseur) à raison de 50 pl par puits de réparation dans chaque puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 3 heures à 30 C sans agiter. On lave les puits 3 fois. On distribue 50 pl de la solution de révélation I (nucléotide marqué par l'avidine peroxydase) dans tous les puits. On recouvre la plaque d'un film adhésif et on incube 15 minutes à 30 C sous agitation douce. On lave les puits 5 fois. On distribue 50 pl de la solution de révélation II (substrat chimiluminescent de l'avidine peroxydase) dans chaque puits. On incube 5 minutes à 30 C sous agitation douce à l'obscurité. On lit la plaque à l'aide d'un luminomètre. Les résultats sont exprimés en unité arbitraire de chimiluminescence (RLU) . É pourcentage d'augmentation du taux de réparation: (RLU ADN lésé + échantillon)* 100 / (RLU ADN lésé); Conclusion: le milieu de culture clarifié de Skeletonema costatum induit une augmentation du taux de réparation de l'ADN de 40% à 1 pg/ml. Lors d'un stress externe les cellules expriment un taux élevé de radicaux libres, ayant pour conséquence des effets délétères sur la cellule dont des lésions sur l'ADN. Un extrait présentant la capacité d'augmenter la vitesse de réparation de l'ADN lésé, comme l'extrait de Skeletonema costatum, permettra à la cellule de plus vite récupérer son capital ADN intact. Exemple 10: Émulsion cosmétique dépiqmentante d'un milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica. La composition d'une émulsion cosmétique dépigmentante de l'invention est par exemple: - milieu de culture clarifié de Tetraselmis suecica obtenu selon l'exemple 1: 20 g - émulsion cosmétique classique (alcools gras, alcools gras polyoxyéthylénés, huile végétale, palmitate d'isopropyle, glydérine, gélifiant type carbopol, conservateurs, parfums, eau) . qsp 100 g Exemple 11: Poudre protectrice anti-peau sèche pour le bain d'un milieu de culture clarifié de Scenedesmus acutus. Le milieu de culture clarifié de Scenedesmus acutus est obtenu selon l'exemple 2, puis est concentré par évaporation thermique et lyophylisé jusqu'à obtention d'une poudre à homogénéiser avant conditionnement dans des poches de 20 g à utiliser dans le bain. Exemple 12: Lotion hydratante pour peaux sensibles d'un milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta Le milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta est obtenu selon le protocole décrit ci- dessous. Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce. Un milieu nutritif stérile (milieu CONWAY) est ajouté à l'eau douce. La composition du milieu nutritif est la suivante: Na, EDTA: 0,045 g/L Na, NO3: 0,1 g/L H3BO3: 0,0336 g/L NaH2PO4, 2H2O: 0,026 g/L MnCl2, 4H2O: 3,6. 10-4 g/L FeCl3: 6H2O: 1,3.10-3 g/L ZnC12: 2,1.10-6 g/L CoC12, 6H2O: 2.106 g/L (NH4) 6Mo,O24, 4H2O: 9.10-6 g/L CuSO4, 5H2O: 2.10-6 g/L Vitamine B1: 2.10- 4 g/L Vitamine B12: 1.10-5 g/L Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Dunaliella primolecta. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Dunaliella est réalisée à une température aux environs de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 19 et 27 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une 10 15 concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 0,6 à la longueur d'onde de 438 nm. Après 16 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique et dessalé par membrane de dialyse (seuil de coupure = 500 Da) La composition d'une lotion hydratante de l'invention est par exemple: milieu de culture clarifié de Dunalliela primolecta obtenu tel que décrit ci-dessus: 50 g - milieu de culture clarifié de Porphyridium cruentum obtenu selon la première phase du protocole décrit dans l'exemple 3, mais jusqu'à obtention d'un clarifié visqueux (commercialisé par la Demanderesse sous la dénomination hydrocomplexe 2 ) 50 g Exemple 13: Fond de teint bioprotecteur. Le milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus est préparé selon le protocole ci-après: Un photobioréacteur, après désinfection au Deptil PA 5, est rempli avec 300 Litres d'eau douce. Un milieu nutritif stérile (milieu MLA) est ajouté à l'eau douce. La composition du milieu nutritif est la suivante. Na2 EDTA: 4,36.10-3 g/L FeC13: 6H2O: 1,58.10-3 g/L NaHCO3: 0,6.10-3 g/L MnCl2, 4H2O: 0,36.10-3 g/L CuSO4, 5H2O 1.10-5 g/L ZnSO4, 7H2O 2,2.10-5 g/L CoC12, 6H2O: 1.10-5 g/L MgSO4: 4, 95. 10-2 g/L NaNO3: 0,17 g/L H3BO3: 2,47. 10-3 g/L NaHCO3: 4, 23. 10-3 g/L K2HPO4: 3,475. 10-2 g/L CaC12: 2, 94. 10-2 g/L Vitamine B1: 1. 10-4 g/L Vitamine B12: 5. 10-8 g/L Vitamine H: 5. 10-8 g/L Le photobioréacteur est inoculé avec 10 Litres d'une culture stérile et concentrée de Scenedesmus dimorphus. Un bullage en air et en CO2 assure à la culture un brassage permanent des cellules et un maintien du pH aux alentours de la neutralité. La culture de Scenedesmus est réalisée à une température de 20 C. 24 heures après l'inoculation, des rampes de néons sont allumées autour de la culture afin d'apporter la lumière essentielle à la photosynthèse. Un suivi hebdomadaire de la culture est effectué afin d'évaluer la croissance cellulaire. Les paramètres mesurés sont les suivants: pH, T , 02, DO. La culture est effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8, et à une température comprise entre 17 et 23 C. La culture est menée jusqu'à l'obtention d'une concentration cellulaire correspondant à une densité optique de 1,8 à la longueur d'onde de 677 nm. 10 2873038 36 Après 22 jours, la culture est centrifugée (16500 tours/min) et le clarifié obtenu est conditionné et stocké en chambre froide. Le milieu de culture clarifié est ensuite concentré par évaporation thermique La composition d'un fond de teint bioprotecteur de l'invention est par exemple: - milieu de culture clarifié de Scenedesmus dimorphus obtenu tel que décrit ci-dessus 25 g - formulation classique du fond de teint (alcools et esters gras, silicones, phospholipides de soja, butylène glycol, gomme xanthane, oxydes de fer, filtres solaires, conservateurs, parfums, eau) qsp 100g Exemple 14. Comprimé pour absorption orale. La composition d'un comprimé pour absorption orale est par exemple: milieu de culture clarifié obtenu à partir d'une co-culture de Phaeodactylum tricornutum et de Skeletonema costatum comme décrit dans l'exemple 4 puis lyophilisé 100 mg - amidon 25 mg - lactose 80 mg - arôme 5 mg - excipients pour comprimés (talc, stéarate de magnésium) qsp 250 mg REVENDICATIONS 1. Composition cosmétique, dermatologique, pharmaceutique ou alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu de culture d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, ledit milieu étant clarifié. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue issue(s) de milieux marins tels que mer, océan, eau saumâtre, eau saline ou eau douce. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique est une cyanobactérie et/ou une microalgue appartenant à la division des chlorophytes choisie(s) dans le groupe constitué par cyanophytes, les chlorophytes, les chrysophytes, les chlorarachniophytes, les dinophytes, les cryptophytes, les euglenophytes ou les rhodophytes 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que la cyanobactérie et/ou la microalgue appartient à la classe des Prasinophycées choisie(s) dans le groupe constitué par les cyanophycées, les chlorophycées, les prasinophycées, les pedinophycées, les prymnesiophycées, les eustigmatophycées, les raphidophycées, les chrysophycées, les diatomophycées, les tribophycées, les chlorarachniophycées, les dinophycées, les cryptophycées, les euglenophycées et les rhodophycées. 2873038 38 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la quantité du milieu de culture clarifié représente de 0,01% à 100% en poids par rapport au poids total de la composition. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit milieu de culture clarifié est obtenu par un procédé comportant les étapes suivantes: a) la sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini à l'une des revendications 2 à 4, b) l'introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente, c) l'amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture, d) l'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à sélectionner au moins deux microorganismes, lesdits microorganismes pouvant être identiques ou différents. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que le milieu de culture clarifié, obtenu à l'issue de l'étape d) d'élimination, est soumis à une étape supplémentaire de 30 2873038 39 déssalage, de concentration, de dilution et/ou de séchage. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel est introduit au moins un microorganisme) est choisi dans le groupe constitué par l'Eau de Source Marine de l'Ile Grande, l'eau de mer, l'eau d'océan, l'eau saumâtre, l'eau saline, l'eau douce, un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme ou leurs mélanges. 10. Composition selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que le milieu de culture de l'étape b) (dans lequel est introduit au moins un microorganisme) est un milieu de culture clarifié tel que défini à l'une des revendications 1 à 8. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que le milieu de culture de l'étape b) est enrichi en éléments nutritifs choisis dans le groupe constitué par les minéraux, les oligo-éléments et les vitamines. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un autre ingrédient actif provenant de la biomasse telle qu'obtenue à l'issue de l'étape d) d'élimination décrite dans la revendication 6. 13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le milieu de culture clarifié est vectorisé dans des liposomes ou 2873038 autres vecteurs afin de favoriser leur activité pharmaceutique, cosmétique, dermatologique ou alimentaire. 14. Procédé de préparation d'un milieu de culture clarifié d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) la sélection d'au moins un microorganisme marin et/ou d'eau douce photosynthétique tel que défini à l'une des revendications 2 à 4, b) l'introduction, dans un milieu de culture, du ou des microorganisme(s) sélectionné(s) lors de l'étape a) précédente, c) l'amplification dudit ou desdits microorganismes dans ledit milieu de culture, d) l'élimination de l'ensemble des microorganismes obtenus à l'issue de l'étape c) d'amplification, afin d'obtenir un milieu de culture clarifié dudit ou desdits microorganismes marins et/ou d'eau douce photosynthétiques. 15. Procédé de préparation selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes telles que décrites dans l'une quelconque des revendications 7 à 11. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que l'on procède en outre à une étape de criblage du milieu de culture clarifié tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 13, ou tel qu'obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 14 ou 15, afin d'évaluer les propriétés pharmaceutiques, cosmétiques, dermatologiques ou alimentaires dudit milieu de culture clarifié.