Brevet FR2882370A1 — publié le 20060825

La présente invention a pour objet un milieu pour la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide comprenant au moins deux chromogènes substrats d'enzymes exprimées par la souche à détecter et/ou par une autre souche susceptible de contaminer ledit échantillon, la coloration finale de l'échantillon, spécifique de la souche à détecter étant détectable dans les longueurs d'ondes du visible lorsque ledit échantillon est soumis au rayonnement de la lumière. La présente invention a également pour objet un procédé de détection, d'identification et de différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide ainsi que la trousse comprenant les moyens nécessaires à la mise en oeuvre de ce procédé. La détection de microorganismes pathogènes et indicateurs divers, en particulier de l'eau, préoccupe les microbiologistes depuis de nombreuses années. Ceux-ci se sont en effet attachés à développer des techniques pour détecter non seulement des indicateurs de contamination fécale tels que E. coli, les coliformes, Enterococcus mais également des pathogènes tels que Aeromonas. Les bactéries E. coli font partie du groupe des coliformes. C'est une espèce très abondante dans la flore intestinale humaine et animale et il est admis que cette espèce est la seule qui soit strictement d'origine fécale. Les bactéries E. coli sont considérées comme le meilleur indicateur de contamination fécale et leur présence dans l'eau signifie que cette dernière est contaminée par une pollution d'origine fécale et qu'elle est donc susceptible de contenir d'autres microorganismes pathogènes. La gastroentérite est la maladie la plus fréquente associée à l'ingestion d'eau contaminée:par les matières fécales. Bien que cette maladie soit souvent bénigne, elle peut parfois avoir des conséquences très graves sur la santé. D'autres maladies plus rares comme les hépatites ou les méningites peuvent aussi être provoquées par l'ingestion d'eau contaminée. Avant l'invention des milieux chromogènes, la détection de E. coli et des autres coliformes se faisait par l'étude complexe d'une multiplicité de caractères tels que la fermentation du lactose, la production d'acide et de gaz.... Les coliformes appartiennent en fait à la famille des Enterobacteriaceae, Gram non sporulantes et il est communément admis qu'ils englobent différents genres, tels que Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter et Escherichia. Il a ensuite été démontré que tous les microorganismes appartenant à ce groupe possédaient une activité (3-galactosidase, les E. coli typiques possédant en plus une activité f3-glucuronidase. La fin des années 70 a connu l'émergence timide de galeries d'identification de microorganismes utilisant des substrats chromogènes, technique basée sur le fait que chaque souche de microorganisme possède une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s) (telles que la 13glucuronidase, la (3-galactosidase, l'a-galactosidase, la I3glucosaminidase, les estérases, les phosphatases, etc...) susceptible(s) d'agir sur un chromogène, lequel libère alors un chromophore donnant lieu à une coloration. Les années 90 ont ensuite connu le développement des milieux d'isolement de microorganismes utilisant des substrats chromogènes précipitant. Compte tenu que les normes de qualité des eaux de baignade sont données pour 100 ml d'eau, on a coutume de tester un échantillon de 100 ml d'eau pour détecter la présence/absence ou effectuer un dénombrement de microorganismes. Cependant, il est à noter que les normes en vigueur relativement à l'eau potable imposent une qualité microbiologique telle, parmi plus de 60 autres critères, que l'eau ne doit contenir ni parasite, ni virus, ni bactérie pathogène et doit être exempte de E. coli dans 100 ml. Par conséquent, des contrôles doivent constamment être effectués sur l'ensemble du réseau de distribution de l'eau, à savoir les points de captage, les stations de traitement, les réservoirs et les réseaux afin de prévenir un quelconque risque de contamination de l'eau d'origine animale ou humaine. Certaines méthodes de détection de microorganismes contaminant l'eau reposent sur la filtration d'un échantillon de 100 ml sur des membranes filtrantes laissant passer l'eau mais retenant les microorganismes. Ces membranes sont ultérieurement transportées sur des milieux de culture solides gélifiés par un gel d'Agar-Agar ou d'autres gélifiants ou dans des tampons solides tels que du papier (technique des filtres absorbants) ou un autre composant spongieux. Dans ces techniques, les différentes souches présentes dans l'échantillon testé sont isolées les unes des autres, se développent sous forme de colonies bactériennes sur la surface dudit filtre et sont ensuite comptées et identifiées. Ces méthodes sont largement utilisées et donnent des résultats satisfaisants quand elles sont combinées à des réactifs spécifiques. Elles présentent cependant l'inconvénient d'être coûteuses et d'être longues à mettre en oeuvre. Une autre méthode utilise des milieux non gélifiés et repose sur le test direct de l'échantillon liquide à tester auquel on ajoute le milieu (c'est le cas par exemple du test Colilert commercialisé par la Société IDEXX ou du test Readycult commercialisé par la Société MERCK). Elle est réalisée dans un récipient unique afin d'obtenir un résultat qualitatif (présence/absence) ou dans des tubes ou compartiments multiples pour obtenir un résultat quantitatif comme c'est le cas pour la méthode MPN (Most: Probable Number) utilisée pour estimer le nombre de coliformes et de E. col/ nécessitant toutefois un matériel spécifique ainsi que du temps de manipulation. De plus, cette méthode présente l'inconvénient, au moins dans le cadre de la détection de E. colt et des coliformes, de nécessiter un substrat fluorogène. En effet, les techniques qui associent un substrat de la (3-galactosidase pour détecter les coliformes et un substrat de la glucuronidase pour détecter E. colt mettent généralement en oeuvre un substrat enzymatique chromogène pour détecter les coliformes et un substrat enzymatique fluorogène pour détecter E. col/. La détection de E. col/ nécessite dans ce cas d'effectuer une lecture de l'échantillon dans des conditions particulières dans la mesure où elle requiert que la fluorescence soit détectée en chambre noire sous une lumière UV. De plus, cette association chromogène + fluorogène ne permet de différencier, au moyen d'une couleur et de la fluorescence, que deux types de microorganismes définis par des capacités enzymatiques respectives qui permettent clairement de les différencier l'un de l'autre. Il doit également être noté que les techniques de l'art antérieur utilisant des produits non gélifiants, dans lesquels les colonies ne sont pas isolées comme elles le sont sur des milieux gélifiés, ne permettent pas de différencier par exemple le pathogène Aeromonas qui est, à l'instar des coliformes, un microorganisme positif pour la (3- galactosidase. Ainsi, il est généralement proposé d'ajouter de la cefsulodine ou un autre agent antimicrobien sélectif dans l'échantillon à analyser, au risque de ne pas détecter du tout Aeromonas et au risque d'inhiber au moins partiellement certains E. colt. De plus, les combinaisons chromogène + fluorogène de l'art antérieur 10 ne permettent pas de repérer les E. colt glc (E. colt atypiques négatives pour la glucuronidase) qui représentent environ 5 % des E. colt. La présente invention propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur par l'utilisation d'une combinaison de chromogènes substrats d'enzymes capables de libérer des chromophores sous l'effet de ces enzymes, ladite combinaison étant choisie pour permettre la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide. Bien évidemment, la combinaison desdits chromogènes est à déterminer en fonction des différentes souches de microorganismes que l'on souhaite détecter et plus particulièrement, des activités enzymatiques respectives de ladite souche. La présente invention a en effet pour objet un milieu pour la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide comprenant: les nutriments nécessaires à l'incubation de la souche à détecter, au moins deux chromogènes, chacun desdits chromogènes étant le substrat d'une enzyme exprimée par la souche à détecter et/ou par une autre souche susceptible de contaminer ledit échantillon et libérant un chromophore sous l'effet de cette enzyme, lesdits chromophores contribuant à la couleur finale du mélange liquide résultant de l'ajout dudit milieu audit échantillon liquide, et ladite couleur étant détectable dans les longueurs d'onde du visible lorsque ledit mélange est soumis au rayonnement de la lumière. Par souche ou souche de microorganismes , on entend -.5indifféremment une espèce particulière ou encore un groupe de microorganismes connus pour avoir des propriétés communes et couramment identifiés par un terme commun. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, l'expression souche ou souche de microorganismes , s'applique notamment aux souches E. coli (regroupant toutes les bactéries E. coli), les souches E. coli glc, les souches E. coli typiques (c'est-à-dire E. coli glc+), les coliformes autres que E. coli ou autres que E. coli typiques et les bactéries du genre Aeromonas. Cette expression concerne également les groupes de souches de microorganismes parmi celles citées précédemment telles que par exemple E. coli typiques + autres coliformes ou E. coli + autres coliformes . Il est à souligner que la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes, dans le cadre de la présente invention, est réalisée dans un mélange non gélifié (constitué de l'échantillon liquide et du milieu de l'invention) dans lequel les microorganismes ne sont pas séparés les uns des autres, comme le sont des colonies:isolées sur un milieu gélifié. De plus, la présente invention ne nécessite pas l'ajout de substrats fluorogènes pour différencier une souche de microorganismes d'une autre et la coloration finale obtenue (après une période d'incubation) est visible dans les longueurs d'ondes du visible. En fait, après incubation, le mélange constitué du milieu de l'invention et de l'échantillon liquide est soumis au rayonnement de la lumière, c'est-à-dire qu'il est placé dans un lieu où il peut être atteint par les longueurs d'ondes du visible et la coloration finale de ce mélange est détectable également dans les longueurs d'ondes du visible, c'est-à-dire à l'oeil nu. On admet que le domaine du spectre visible s'étend environ de 400 à 800 nm. Par conséquent, la lecture du test est immédiate et simplifiée sans la contrainte de deux lectures successives. De plus, elle ne nécessite aucun dispositif particulier, telle qu'une source de lumière UV. Ainsi le milieu et les matériaux du récipient au moyen desquels seront réalisés la détection, et même le contenu de l'échantillon, peuvent indifféremment générer une fluorescence ou interférer avec - 6 - elle par effet de quenching, ceci ne gênera en aucune manière la lecture du test. Dans le cadre de la présente invention, il est à noter que les chromogènes utilisées ne sont pas nécessaires à la croissance des souches à détecter. En effet, pendant la période d'incubation, les souches se développent sur des nutriments traditionnels bien connus de l'homme du métier. De plus, les chromogènes utilisées dans le cadre de la présente invention sont indifféremment non précipitants, précipitants sans ajout ou précipitants après réaction avec un sel du milieu. Le milieu de l'invention peut se présenter sous forme solide ou liquide, déjà introduit dans le récipient où le test sera réalisé ou conditionné dans un récipient indépendant, prêt à être mélangé à l'échantillon liquide à tester. L'invention a également pour objet un procédé de détection, d'identification et de différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide comprenant: la mise en contact de l'échantillon liquide avec le milieu de l'invention, l'incubation du mélange obtenu à l'étape à) pendant environ 18 à 24 heures à une température d'environ 34 C à 40 C et de préférence environ 37 C, la soumission du mélange incubé au rayonnement de la lumière et la lecture de la couleur finale dudit mélange dans les longueurs d'onde du visible, et l'identification de la souche de microorganismes en fonction de ladite couleur finale. Tout d'abord, dans le cadre du susdit procédé, la mise en contact de l'échantillon liquide avec le milieu de l'invention se fait soit par l'ajout du milieu à l'échantillon liquide, soit par l'ajout de l'échantillon liquide au milieu préalablement introduit dans le récipient dans lequel le test sera réalisé. Ensuite, l'étape de détection d'une souche de microorganismes est précédée de l'incubation du mélange constitué par l'échantillon liquide et le milieu de l'invention. Cette étape d'incubation peut être réalisée à une température a) b) c) d) d'environ 34 C à 40 C et de préférence 37 C et pendant une durée d'environ 18 à 24 h. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier adaptera la durée de cette étape d'incubation à la température à laquelle il pourra procéder à cette incubation. Ainsi, si l'homme du métier ne dispose pas d'incubateur et que la température ambiante est inférieure à 37"C, il prolongera de lui-même la durée de cette étape d'incubation afin d'obtenir un résultat similaire. Ainsi, en l'absence d'incubateur, la durée de l'étape d'incubation pourra être prolongée jusqu'à 48 h, voire 72 h à température ambiante. Dans d'autres cas, par exemple en fonction de la richesse du milieu, cette période d'incubation pourra être limitée à une durée d'environ 12 à 18 h. De plus, afin d'augmenter la sélectivité du test, dans le but de distinguer les coliformes (y compris E. coli) thermo-tolérants des autres souches de microorganismes, l'incubation pourra être réalisée pendant environ 24 h à 44- 45 C, température à laquelle les coliforrnes thermotolérants (y compris E. coli) résistent. Pour ce qui concerne l'étape c) du procédé de l'invention, il n'y aura la plupart du temps aucune démarche particulière à entreprendre pour sa mise en oeuvre dès lors que le test est réalisé par exemple en plein jour à l'extérieur ou à l'intérieur dans une pièce comprenant une entrée de lumière. Il est à noter que le procédé de l'invention, tout en pouvant être mis en oeuvre de façon totalement manuelle, peut également être mis en oeuvre de façon semi-automatisée voire totalement automatisée. L'invention a également pour objet une trousse pour la mise en oeuvre du 25 procédé de l'invention comprenant: des nutriments nécessaires à l'incubation de la souche à détecter, au moins deux chromogènes, chacun desdits chromogènes étant le substrat d'une enzyme exprimée par la souche à détecter et/ou une autre souche susceptible de contaminer ledit échantillon, - un récipient pour contenir l'échantillon liquide, lesdits nutriments et lesdits chromogènes, une notice établissant la correspondance entre la coloration finale du mélange constitué de l'échantillon liquide, desdits nutriments et desdits chromogènes d'une part, et la souche détectée d'autre part, ou tout autre système de référence permettant d'identifier la souche détectée. Dans le cadre de la présente invention, l'échantillon liquide ou liquéfié dans lequel sont réalisées la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes, est de préférence l'eau et plus préférentiellement l'eau potable. Cependant, cette détection peut également être réalisée dans lo d'autres liquides et notamment alimentaires tels que le lait, les jus de fruits ou toute autre boisson. La présente invention permet ainsi de détecter et de différencier non seulement les E. coli typiques mais aussi les E. coli glucuronidase négatives (glc) sans avoir à soumettre tous les négatifs pour le caractère glc à un test supplémentaire d'indole qui donne lieu à des erreurs pour certains coliformes tels que Klebsiella oxytoca comme s'ils étaient des E. coli glc. Ce test d'indole est d'ailleurs souvent difficile voire impossible à mettre en oeuvre comme c'est le cas dans le système du Quanti-Tray (commercialisé par la Société IDEXX) où l'échantillon est placé dans des compartiments fermés et soudés. La présente invention permet également de distinguer E. coli des coliformes autres que E. coli sans les confondre avec Aeromonas et sans avoir besoin d'ajouter de la cefsulodine ou un autre agent antiinicrobien inhibant non seulement les Aeromonas mais également: partiellement les E. coli. La présente invention permet en effet de détecter et de différencier simultanément non seulement des indicateurs de contamination fécale tel que E. coli et les coliformes autres que E. coli mais également le pathogène Aeromonas. Le test de détection proposé par la présente invention est essentiellement un test qualitatif, c'est-à-dire un test permettant de révéler la présence ou l'absence d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide. Toutefois, rien ne s'oppose à ce que le test de l'invention soit modifié en un test quantitatif conformément à la méthode MPN par exemple. -9 - Dans le cadre de la présente invention, il convient de déterminer la combinaison de chromogènes appropriée pour la détection de la souche que l'on souhaite détecter. Ainsi, on choisira par exemple un chromogène qui libèrera un chromophore de couleur jaune sous l'effet d'une enzyme exprimée par les coliformes autres que E. coli et un chromogène libérant un chromophore de couleur bleue sous l'effet d'une enzyme exprimée par les E. coli. Si ensuite l'échantillon liquide dans lequel le test est réalisé révèle une coloration finale bleue, on en déduira que l'échantillon est contaminé par des E. coli et si la coloration finale est jaune, on en déduira que l'échantillon est contaminé par des coliformes autres que E. coli. Il est également à souligner que dans le cas où l'échantillon serait contaminé à la fois par des E. coli et des coliformes autres que E. coli, la coloration finale obtenue sera dans la gamme des verts. Il convient donc de choisir les chromophores en fonction de la couleur que l'on souhaite retrouver dans le cas d'une contamination par l'une ou l'autre 15 des souches de microorganismes à détecter. Le choix de la combinaison des chromogènes est primordial mais il n'est nullement nécessaire que les enzymes agissant sur ces chromogènes soient spécifiques d'une souche de microorganismes. Dans certains cas, on utilisera le caractère négatif pour certaines enzymes de la souche à détecter pour que la couleur finale soit représentative de ladite souche, selon le ou les chromophore(s) libéré(s). Au cas où l'échantillon liquide ou liquéfié testé contiendrait une souche de microorganismes n'ayant pas d'enzyme correspondant aux substrats présents dans le milieu de l'invention et par conséquent ne donnant pas lieu à la libération d'un chromophore, la présence de ladite souche pourrait toutefois être détectée par comparaison avec un échantillon liquide témoin non contaminé. En effet, l'échantillon contaminé serait trouble et aurait un aspect laiteux significatif de la croissance de microorganismes dans ledit échantillon. Bien évidemment, conformément à la présente invention, il est possible d'envisager un grand nombre de combinaisons non seulement pour ce qui concerne les enzymes dont l'activité est: utilisée à l'encontre des chromogènes - 10- sélectionnés mais également pour ce qui concerne lesdits chromogènes. Par exemple, parmi les enzymes dont l'activité est utilisable dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment: la (3-Dgalactosaminidase, la (3-D-glucosaminidase, la (3-D-cellobiosidase, la (3D-fucosidase, la a-L- fucosidase, la a-D-galactosidase, la (3-Dgalactosidase, la f3-D-lactosidase, la a-D-maltosidase, la a-Dmannosidase, la a-D-glucosidase, la (3-D-glucosidase, la E3-D-xylosidase, 1'estérase, l'acétate estérase, la butyrate estérase, la carboxylestérase, la caprylate estérase, la choline estérase, la myo-inositol phosphatase, la palmitate estérase, la phosphatase, la diphosphatase, l'aminopeptidase et la sulfatase. Pour ce qui concerne les chromophores dont on souhaite obtenir la libération par la mise en oeuvre d'une activité enzymatique d'une ou plusieurs souche(s) de microorganismes à détecter, on peut citer: 0nitrophényl, P-nitrophényl, ChloroNitrophényl, Hydroxyphényl, Nitroanilide, Phénolphtaléine et thymophtaléine, Hydroxyquinoline, Cyclohexenoesculétine, Dihydroxyflavone, Catéchol, Résazurin, résofurin, VBzTM, VLM, VLPr, VQM, Indoxyl, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-bromo-6chloro-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 6-fluoro-3-indoxyl, 5-lodo-3indoxyl, N-Méthylindoxyl. Comme précédemment indiqué, la présente invention permet de détecter, identifier et différencier la souche E. cou dans un échantillon liquide, y compris quand une autre souche est également présente dans ledit échantillon. L'inventeur a toutefois fait l'observation surprenante que, même mélangée à un million de fois plus de coliformes Enterobacter, la souche E. coli pouvait être détectée après environ 24 heures d'incubation. La combinaison des chromogènes était la suivante: 5-bromo-4-chloro-3indoxyl glucuronide, substrat de la 13-glucuronidase et le nitrophényl (3galactoside substrat de la (3-galactosidase. La couleur bleu-vert a indiqué la présence de la souche E. coli parmi les coliformes Enterobacter (rapport 1: 1 000 000 entre les deux souches). Les exemples qui suivent illustrent la présente invention mais ne peuvent en aucune manière en limiter la portée. EXEMPLES: Les exemples ci-après ne représentent que quelques combinaisons de chromogènes choisis pour être des substrats d'enzymes des souches à détecter mais toutes les autres combinaisons découlant directement ou indirectement de l'enseignement de la présente description font également partie de la présente invention. Pour tous les exemples suivants, le test est réalisé avec 100 ml d'eau et l'étape d'incubation des souches de microorganismes à détecter a été réalisée avec un milieu comprenant au titre des nutriments: (en gramme(s) par litre) : peptone 5, pyruvate 1, NaCl 5, K2HPO4 4, KH2PO4 1, SDS 0,1, KNO3 0,005, Tryptophane 1, Vancomycine 0,002. Dans le cas de l'exemple 15, :le susdit milieu rie contient ni SDS, ni vancomycine. Pour tous les exemples suivants: l'incubation a été réalisée à 35-37 C 15 pendant environ 24 h. Exemple 1: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) a-galactosidase + p-nitrophényl-a-galactoside (pNPaGal) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / aGal Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP aGal E. colt Vert E. coli + autres coliformes Vert Coliformes autres que E. coli Jaune Exemple 2: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) a-galactosidase + (3-glucosidase p-nitrophényl a-galactoside (pNPaGal) + 5-bromo-6-chloro-3 indoxyl (3-glucoside (Mag (3Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / aGal / Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP aGal + Mag (3Glu E. coli glc Jaune E. coli typiques Vert E. coli typiques + autres coliformes Bleu Coliformes autres que E. coli Orange Aeromonas Mauve Exemple 3: Les mêmes enzymes que dans l'exemple 2 ont été utilisées mais deux chromophores ont été inversés. La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide 3-glucuronidase (XGIc) a-galactosidase + 3É-glucosidase 5-bromo-6-chloro-3 indoxyl a- galactoside (Mag aGal) + p-nitrophényl (3-glucoside (pNP(3Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Gic / aGal / (3Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag aGal + pNP PGlu E. coli glc Mauve E. coli typiques Bleu E. coli typiques + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Orange Aeromonas Jaune Exemple 4: La combinaison des chromogènes est la même que celle de l'exemple 2 5 mais il a été ajouté, au milieu de l'invention, un inhibiteur du pathogène Aeromonas pouvant être indifféremment choisi parmi la cefsulodine 0,005 g/1 et l'acide nalidixique 0,001 g/1. ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / aGal / 3 Glu / inhibiteur de Aeromonas Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP aGal + Mag (3 Glu E. coli glc Jaune E. coli typiques Vert E. coli typiques + autres coliformes Bleu Coliformes autres que E. coli Orange - 14- Exemple 5: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) a-galactosidase + -galactosidase p-nitrophényl a-galactoside (pNPaGal) + 5-bromo-6-chloro-3 indoxyl (3-galactoside (Mag (3Gal) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / aGal / Gal Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP aGal + Mag (3Gal E. coli Bleu foncé E. coli + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Orange Aeromonas Mauve Exemple 6: Les mêmes enzymes que celles de l'exemple 5 ont été utilisées mais deux chromophores ont été inversés. La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) a-galactosidase + f3-galactosidase 5bromo-6-chloro-3 indoxyl a-galactoside (Mag aGal) + p-nitrophényl (3galactoside (pNP13Gal) ACTIVITES ENZYMATI[QUES: Glc / aGal / (3Ga1 Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag aGal + pNP (3Gal E. coli Bleu foncé E. coli + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Orange Aeromonas Jaune Exemple 7: La combinaison des chromogènes est la même que celle de l'exemple 5 5 mais il a été ajouté, au milieu de l'invention, un inhibiteur du pathogène Aeromonas pouvant être indifféremment choisi parmi la cefsulodine 0,005 g/1 et l'acide nalidixique 0,001 g/1. ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / aGal / Gal / inhibiteur de Aeromonas Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP aGal + Mag 3Gal E. coli Bleu foncé E. coli + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Orange Exemple 8: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) (3-galactosidase + p-nitrophényl (3-galactoside (pNP13Gal) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3 Gal Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP (3Gal E. coli Bleu vert E. coli + autres coliformes Bleu vert Coliformes autres que E. coli Jaune Exemple 9: Les enzymes sont les mêmes que dans l'exemple 8 mais un chromophore est différent. La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES:SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3glucuronidase (XGIc) (3-galactosidase + 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl (3galactoside (Mag (3Gal) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3Gal Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag E3Gal E. coli Bleu foncé E. coli + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Mauve Exemple 10: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) (3-galactosidase + (3-glucosidase p-nitrophényl J3-galactoside (pNP(3Gal) + 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl f3-glucoside (Mag 13 Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3Gal / (3Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP Gal + Mag (3Glu E. coli glc Jaune E. coli typiques Vert E. coli typiques + autres coliformes Bleu Coliformes autres que E. coli Orange Aeromonas Mauve Exemple 11: Les enzymes sont les mêmes que dans l'exemple 10 mais deux chromophores ont été inversés. La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide J3-glucuronidase (XGIc) (3-galactosidase + (3.-glucosidase 5bromo-6-chloro-3-indoxyl (3-galactoside (Mag (3 Gal) + p-nitrophényl (3glucoside (pNP (3 Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / 3Gal / (3Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag (3Gal + pNP (3Glu E. colt glc Mauve E. colt typiques Bleu E. colt typiques + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. colt Orange Aeromonas Jaune Exemple 12: La combinaison des chromogènes est la même que celle de l'exemple 10 mais il a été ajouté, au milieu de l'invention, un inhibiteur du pathogène Aeromonas pouvant être indifféremment choisi parmi la cefsulodine 0,005 g/l et l'acide nalidixique 0,001 g/1. ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3Gal / Glu / inhibiteur de Aeromonas Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP Gal + Mag Glu E. coli glc Jaune E. coli typiques Vert E. coli typiques + autres coliformes Bleu Coliformes autres que E. coli Orange Exemple 13: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XG1c) (3-Églucosidase + p-nitrophényl (3-glucoside (pNP(3Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + pNP (3Glu E. coli Bleu E. coli + autres coliformes Bleu vert Coliformes autres que E. coli Jaune Exemple 14: Les enzymes sont les mêmes que dans l'exemple 13 mais un chromophore est différent. La combinaison des chromogènes est la suivante: io CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronide (3-glucuronidase (XGIc) (3-glucosidase + 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl (3-glucoside (Mag f3Glu) ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc i (3 Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag (3Glu E. coli Bleu E. coli + autres coliformes Bleu foncé Coliformes autres que E. coli Mauve Exemple 15: La combinaison des chromogènes est la suivante: CHROMOGENES: SUBSTRATS DES ENZYMES: 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl glucuronicle (3-glucuronidase (XGIc) (3-galactosidase + (3-glucosidase 5-bromo-6-chloro-3 indoxyl (3galactoside (Mag (3Gal) p-nitrophényl (3-glucoside (pNP(3Glu) -21 ACTIVITES ENZYMATIQUES: Glc / (3Gal / (3Glu Souche de microorganismes Combinaison de chromogènes: présente dans l'échantillon liquide Xglc + Mag (3Gal + pNP (3Glu E. coli Bleu Coliformes autres que E. coli Orange Enterococcus Jaune - 22 - REVENDICATIONS 1. Milieu pour la détection, l'identification et la différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide comprenant: les nutriments nécessaires à l'incubation de ladite souche à détecter, - au moins deux chromogènes, chacun desdits chromogènes étant le substrat d'une enzyme exprimée par la souche à détecter et/ou par une autre souche susceptible de contaminer ledit échantillon et libérant un chromophore sous l'effet de cette enzyme, lesdits chromophores contribuant à la couleur finale de l'échantillon liquide, et ladite couleur étant détectable dans les longueurs d'onde du visible lorsque ledit échantillon est soumis au rayonnement de la lumière. 2. Milieu selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon liquide est de l'eau, de préférence de l'eau potable. 3. Milieu selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la souche de microorganismes est choisie dans le groupe comprenant: E. coli et/ou 20 coliformes autres que E. coli, E. coli typiques et/ou coliformes autres que E. coli typiques, E. coli glc et Aeromonas. 4. Procédé de détection, d'identification et de différenciation d'une souche de microorganismes dans un échantillon liquide comprenant: a) la mise en contact de l'échantillon liquide avec un milieu selon l'une des revendications 1 à 3, b) l'incubation du mélange obtenu à l'étape a) pendant environ 18 à 24 heures à une température d'environ 34 C à 40 C et de préférence environ 37 C, c) la soumission du mélange incubé au rayonnement de la lumière et la lecture de la couleur finale dudit mélange dans les longueurs d'onde du - 2882370 - 23 - visible, et d) l'identification de la souche de microorganismes en fonction de ladite couleur finale. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'échantillon liquide est de l'eau, de préférence de l'eau potable. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la souche de microorganismes est choisie dans le groupe comprenant: E. colt et/ou 10 coliformes autres que E. colt, E. col;i typiques et/ou coliformes autres que E. coli typiques, E. colt glc et Aeromonas. 7. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 4 à 6 comprenant: des nutriments nécessaires à l'incubation de souche à détecter, au moins deux chromogènes, chacun desdits chromogènes étant le substrat d'une enzyme exprimée par la souche à détecter et/ou une autre souche susceptible de contaminer ledit échantillon, un récipient pour contenir l'échantillon liquide, lesdits nutriments et 20 lesdits chromogènes, - une notice établissant la correspondance entre d'une part la coloration finale du mélange constitué de l'échantillon liquide, desdits nutriments et lesdits chromogènes, et d'autre part la souche détectée, ou tout autre système de référence permettant d'identifier la souche 25 détectée. 8. Trousse selon la revendication 7, dans laquelle l'échantillon liquide est de l'eau, de préférence de l'eau potable. 9. Trousse selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle la souche de microorganismes est choisie dans te groupe comprenant: E. colt et/ou -24 coliformes autres que E. coli, E. colt typiques et/ou coliformes autres que E. colt typiques, E. coli glc et Aeromonas.