Brevet FR2876106A1 — publié le 20060407

PROCEDE D'EXTRACTION DE PROTEINES POUR LEUR SEPARATION PAR ELECTROPHORESE La présente invention concerne un procédé d'extraction de protéines, basé sur l'utilisation de cyclodextrines, en vue d'obtenir une préparation apte à subir une discrimination par électrophorèse. L'invention couvre aussi le tampon d'extraction utilisé. L'électrophorèse est une des techniques les plus utilisées en biologie moléculaire. Elle permet de séparer des molécules chargées de nature et de taille très différentes telles que des protéines, des peptides, des acides aminés, des acides nucléiques ou encore des nucléotides. L'électrophorèse est basée sur le principe de la mise en mouvement différentiel. Les molécules à séparer sont placées dans un champ électrique et se déplacent vers un pôle de signe opposé à leur charge et à une vitesse proportionnelle à cette charge. Elles sont généralement déposées sur un support convenable poreux et imprégné de tampon. A cet effet, on peut utiliser par exemple du papier, de l'acétate de cellulose, du gel de polyacrylamide, du gel d'agarose, du gel d'amidon ou du gel de silice. La plupart des techniques d'électrophorèse actuelles utilisent un gel ou un équivalent. Le gel se comporte comme un tamis moléculaire, les molécules migrant d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses. Plusieurs facteurs influencent donc la vitesse de migration et de ce fait la 20 séparation des molécules durant l'électrophorèse. Ces facteurs sont la charge et la taille des molécules ainsi que leur affinité pour la matrice et le pH du milieu. Les protéines sont des molécules couramment séparées par électrophorèse. La séparation des protéines par électrophorèse se fait essentiellement en gel, et plus particulièrement en gel de polyacrylamide. Les protéines à séparer peuvent être natives ou dénaturées par des agents tel que le sodium dodécylsulfate (SDS). Il existe plusieurs techniques d'électrophorèse en gel. On appelle pour la suite de la description: gel natif, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer des protéines non dénaturées, gel SDS, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer des 10 protéines dénaturées par du SDS, gel IEF, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer les protéines selon la technique d'isoélectrofocalisation. L'électrophorèse en gel natif permet de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire et de leur charge, tout en permettant le maintien des 15 interactions protéine-protéine et de l'activité biologique. Il existe également l'électrophorèse en gel de polyacrylamide SbS dont le principe consiste à utiliser du SDS, qui impose une charge fixe à toutes les protéines. Ainsi, les protéines sont séparées uniquement en fonction de leur poids moléculaire. On connaît encore l'électrophorèse en gel IEF qui consiste à séparer les protéines en fonction de leur point isoélectrique, c'est-à-dire le pH pour lequel la somme de leurs charges positives et négatives périphériques s'annulent. Finalement il est possible de combiner deux électrophorèses l'une par rapport à l'autre et réaliser ce qu'on appelle une électrophorèse bidimensionnelle. Cette technique consiste à effectuer un second transport électrolytique perpendiculaire au premier sur les composants séparés obtenus lors de la première électrophorèse. Actuellement ces différents procédés de séparation sont couramment utilisés pour des études protéomiques applicables dans de nombreux domaines. Toutefois ces techniques connaissent une limite: elles ne permettent pas d'étudier toutes les protéines. En effet, certaines classes de protéines ou des protéines présentes en très faible quantité ne peuvent pas être séparées par électrophorèse en gel. Parmi les protéines difficilement détectables par électrophorèse, on peut citer en particulier les protéines hydrophobes. Ce phénomène s'explique par la présence d'interactions entre les résidus hydrophobes d'une même protéine, ou de plusieurs protéines, entraînant des modifications de la configuration de la protéine qui se replie, s'agrège et ne peut plus migrer dans le gel. C'est le cas notamment des protéines membranaires. Or ces protéines membranaires ont une importance cruciale car elles sont impliquées dans de nombreuses interactions et constituent une "porte d'entrée" pour la cellule. Il existe également d'autres protéines difficilement détectables par électrophorèse qui jouent un rôle déterminant dans la bonne compréhension du fonctionnement cellulaire, notamment des protéines de très haut poids moléculaire, comme certains facteurs impliqués dans la biosynthèse des protéines. Il subsiste donc un besoin pour un outil qui permettrait d'améliorer le pouvoir de détection des protéines par électrophorèse. Pour y répondre, la présente invention se propose d'augmenter la qualité d'extraction des protéines et d'améliorer leur solubilisation dans le gel d' électrophorèse, en introduisant, préalablement à l'étape de séparation par électrophorèse, des cyclodextrines dans le tampon d'extraction. La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction qui consiste à placer un extrait cellulaire dans un tampon d'extraction contenant des cyclodextrines, de manière à obtenir une préparation apte à subir une discrimination par électrophorèse. Par cyclodextrines on entend toutes cyclodextrines naturelles ou modifiées. Il s'agit de façon avantageuse de cyclodextrines modifiées. bans le cas de cyclodextrines mono-modifiées, on choisit préférentiellement les cyclodextrines modifiées sur l'hydroxyle primaire et en particulier la 6A-(3-Aminopropylamino)-6A-desoxy-cyclomatoheptaose (propane diamine-(3-CD) et la 6A-(3-Aminoethylamino)-6A-desoxycyclomatoheptaose (éthane diamine-(3-CD) décrites dans le brevet FR2714067. bans le cas de cyclodextrines poly-modifiées, on peut citer comme particulièrement efficace pour la présente invention, la 6I-(3a, 7a, 12atrihydroxy-5l3-cholan-24-amido)-6I-desoxy-2I-O-méthyl-hexakis (2II-VII, 6II-VII-di-O-methyl) cyclomaltoheptaose (DIMEB-acide cholique) décrite dans le brevet FR2792942. On suppose que l'amélioration du pouvoir d'extraction des protéines extraites selon la présente invention est due à l'interaction des cyclodextrines présentes dans la solution d'extraction avec les résidus hydrophobes des protéines. Ainsi les cyclodextrines entrent en compétition avec les interactions qui peuvent exister entre ces résidus, empêchent l'agrégation des protéines et permettent ainsi leur visualisation dans le gel. Les protéines extraites selon la présente invention peuvent ensuite être séparées par tout type d' électrophorèse. Avantageusement, pour augmenter l'effet obtenu par la présente invention, l'électrophorèse peut être réalisée dans un gel contenant lui-même des cyclodextrines. Les cyclodextrines peuvent être introduites soit directement dans le gel au moment de sa fabrication, soit dans la solution de réhydratation dans le cas d'un gel prêt à l'emploi. 2876106 5 D'autres caractéristiques et avantages ressortiront des exemples qui vont suivre, exemples donnés en regard des figures annexées sur lesquelles: - la figure lA représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS standard, de protéines totales de bactérie, les protéines ayant été extraites de façon standard. - la figure 1B représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/5D5 standard, de protéines totales de bactérie, les protéines ayant été extraites selon l'invention dans un tampon contenant de la propane diamine-13-CD. - la figure 2A représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS standard, de protéines d'une fraction membranaire d'Escherichia coli, les protéines ayant été extraites de façon standard. - la figure 2B représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS standard, de protéines d'une fraction membranaire d'E. coli, les protéines ayant été extraites selon l'invention dans un tampon contenant de la propane diamine-13-CD. - la figure 2C représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS - le gel IEF utilisé pour la première dimension contenant des cyclodextrines -, de protéines d'une fraction membranaire d'E. coli, les protéines ayant été extraites selon l'invention dans un tampon contenant de la propane diamine-(3-CD. - la figure 3A représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/5D5 standard, de protéines d'une fraction membranaire de bactérie, les protéines ayant été extraites de façon standard. - la figure 3B représente les résultats d'une séparation par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SD5 standard, de protéines d'une fraction membranaire de bactérie, les protéines ayant été extraites selon l'invention dans un tampon contenant de la DIMEB-acide cholique. Exemple 1: Extraction de protéines totales de bactérie en présence de propane 5 diamine-p-CD On utilise des cellules d' E. coll. Les cellules sont lysées et traitées avec de la DNase I et de la RNase I. La solution obtenue est ensuite traitée avec un tampon d'extraction contenant: - 8 M d'urée, - 50 mM de dithiothréitol (DTT), - 10 à 120 mM de propane diamine-p-CD, plus particulièrement 20 à 70 mM, - 2% de CHAPS, et - 0,2% d'ampholyte (pH 3-10). La solution obtenue est finalement clarifiée par centrifugation et stockée à - 80 C. Cette solution contient des protéines qui peuvent être séparées par électrophorèse. On sépare les protéines obtenues par une électrophorèse bidimensionnelle 20 IEF/SD5 standard. Les figures lA et 1B nous permettent de comparer la séparation de protéines totales de d'E. coli, extraites de façon standard ou en présence de propane diamine-p-CD. On constate que l'intensité et le nombre de taches sont plus importants sur la figure 1B que sur la figure 1A. Ainsi la présence de propane diamine-p-CD favorise l'extraction des protéines et par conséquent augmente la limite de détection et le pouvoir de séparation de l'électrophorèse. 2876106 7 Exemple 2: Extraction de protéines membranaires de bactérie en présence de propane diamine-5-CD Les protéines à séparer sont extraites dans une solution constituée de: - 8 M d'urée, 50 mM de DTT, 2% de CHAPS, - 10 à 100 mM de propane diamine-13-CD, plus particulièrement 20 à 70 mM, et - 0,2% d'ampholyte (pH 3-10). Cette solution est incubée pendant deux heures à 25 C. On supprime ensuite la matière insoluble par centrifugation à 25 C pendant une heure. Les protéines ainsi extraites peuvent ensuite être séparées par électrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS standard. Si on compare les résultats obtenus sur les figures 2A et 2B, on constate que la présence de cyclodextrines dans la solution d'extraction des protéines permet d'obtenir de nouvelles taches ainsi qu'une meilleure résolution. La limite de détection et le pouvoir de séparation des protéines membranaires par électrophorèse en gel est donc augmentée en présence de propane diamine-I3-CD. Sur la figure 2C, on observe que l'ajout de propane diamine-13-CD à la fois dans la solution d'extraction des protéines et dans le gel d'électrophorèse permet d'augmenter significativement la limite de détection et le pouvoir de séparation des protéines membranaires par électrophorèse. Exemple 3: Extraction de protéines membranaires de bactérie en présence de DIMEB-acide cholique Les protéines à séparer sont extraites dans une solution constituée de: - 8 M d'urée, - 50 mM de bTT, 2% de CHAPS, - 1 à 80mM de DIMEB-acide cholique, plus particulièrement 5 à 30 mM, et - 0,2% d'ampholyte (pH 3-10). Cette solution est incubée pendant deux heures à 25 C. On supprime ensuite la matière insoluble par centrifugation à 25 C pendant une heure. Les protéines ainsi extraites peuvent ensuite être séparées par électrophorèse 10 bidimensionnelle IEF/SDS standard. 5i on compare les résultats obtenus sur les figures 3A et 3B, on constate que les résultats de la figure 3B présentent de nouvelles taches ainsi qu'une meilleure résolution. La présence de DIMEB-acide cholique dans la solution d'extraction permet donc de détecter les protéines membranaires par électrophorèse en gel. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction de protéines d'un extrait cellulaire en vue de leur séparation par électrophorèse, caractérisé en ce que l'on additionne à une solution tampon des cyclodextrines et ce que l'on place ledit extrait cellulaire dans cette solution tampon additionnée de cyclodextrines. 2. Procédé d'extraction de protéines d'un extrait cellulaire en vue de leur séparation par électrophorèse selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisies parmi les cyclodextrines naturelles ou modifiées. 3. Procédé d'extraction de protéines d'un extrait cellulaire en vue de leur séparation par électrophorèse selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisies parmi les cyclodextrines mono-modifiées au niveau de l'hydroxyle primaire. 4. Procédé d'extraction de protéines d'un extrait cellulaire en vue de leur séparation par électrophorèse selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont de la forme 6A-(3Aminopropylamino)-6A-desoxy- cyclomatoheptaose ou 6A-(3-Aminoethylamino)-6A-desoxy-cyclomatoheptaose. 5. Procédé d'extraction de protéines d'un extrait cellulaire en vue de leur séparation par électrophorèse selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisies parmi les cyclodextrines poly-modifiées de la forme la 6I-(3a, 7a, 12a-trihydroxy5(3-cholan-24-amido)-6I-desoxy-2I-O- méthyl-hexakis (2II-VII, 6II-VII-di-O-methyl) cyclomaltoheptaose. 6. Tampon d'extraction obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il contient 1 à 100 mM de cyclodextrines.