Brevet FR2878622A1 — publié le 20060602

Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à un biocapteur de détection en temps réel de microorganismes pathogènes en milieu liquide et elle concerne plus particulièrement un système de surveillance autonome, en continu et in situ de la qualité d'une eau. Arrière-plan de l'invention La surveillance de la qualité des eaux, en particulier les eaux potables ou de baignades demeure une préoccupation constante. Les rejets de micro-organismes d'origine entérique en mer, et en particulier, d'espèces pathogènes pour l'homme (E. coli, Streptocoques fécaux...) posent des problèmes sanitaires et économiques importants. La surveillance de cette qualité et la communication rapide des résultats représentent un facteur de santé et ont également des conséquences économiques. Actuellement, la méthode utilisée pour la détection des bactéries présentes dans un liquide consiste à mettre un échantillon du liquide en culture après concentration sur des filtres. Après incubation, de l'ordre de 18 à 48 heures, les bad:éries s'étant développées sur des milieux spécifiques sont énumérées. Il existe d'autres méthodes plus rapides comme la chromatographie en phase liquide, le spectromètre de masse et les kits immunologiques. Les kits immunologiques font appel à une technique de type sandwich dans laquelle les échantillons sont d'abord incubés dans une première étape avec des anticorps spécifiques adsorbés sur les parois d'un 2878622 2 tube ou d'un puits de microplaque. Dans une dernière étape, les microorganismes immobilisés sur les parois sont incubés en présence d'un deuxième anticorps spécifique du micro-organisme marqué par une enzyme. Une réaction de colorimétrie proportionnelle à la concentration du contaminant permet de révéler la présence du contaminant dans l'échantillon. Ces dernières méthodes demandent néanmoins plusieurs heures et nécessitent des équipements lourds, coûteux et posent de problèmes d'approvisionnement et de stabilité. Objet et résumé de l'invention La présente invention propose de pallier les inconvénients précités en proposant un système de surveillance fiable, autonome, en continu, in situ et en temps réel de la qualité d'un liquide ou d'une eau. La présente invention se propose donc un système de surveillance autonome, en continu et in situ de la qualité d'une eau comportant: -un élément inférieur avec un logement destiné à accueillir un dispositif de détection en temps réel de microorganismes pathogènes ledit dispositif de détection comprenant au moins un biocapteur comportant au moins une couche réceptrice de matériau biologique permettant la reconnaissance des microorganismes pathogènes par des réactions du type anticorps-antigènes; -un élément intermédiaire connecté électriquement avec le dispositif de détection de microorganismes pathogènes par des liaisons électriques et comportant des connexions électriques extérieures pour connecter le dispositif de détection de microorganismes pathogènes à un module électronique;et -un élément supérieur fermé permettant une circulation continue de l'eau 30 à surveiller et comportant une chambre étanche permettant d'amener 2878622 3 l'eau en contact avec ladite couche réceptrice du dispositif de détection de microorganismes pathogènes. Ainsi, le système de surveillance selon l'invention, est basé sur la réaction immunologique anticorps-bactéries en lecture directe sans passer par une phase de prolifération. Ce système permet notamment de s'affranchir des délais des méthodes immunologiques classiques actuelles. Les temps de détection passent alors de l'ordre de 2h-48h à quelques minutes. De plus, ce système est modulaire, portable, et autonome 10 permettant ainsi une surveillance en continu et in situ de la qualité de l'eau directement sur les sites de prélèvement. Avantageusement, le dispositif de détection de microorganismes pathogènes comporte une pluralité de biocapteurs, chaque biocapteur comportant une couche réceptrice spécifique comprenant un anticorps de spécificité appropriée pour la détection d'un antigène particulier permettant ainsi au dispositif de détection d'analyser simultanément un ou plusieurs types de microorganismes pathogènes. Chaque biocapteur comporte en outre un capteur à ondes acoustiques comprenant un substrat piézoélectrique, au moins une ligne à retard ayant une électrode d'entrée et une électrode de sortie déposées sur la surface du substrat piézoélectrique et permettant la génération et la réception d'une onde acoustique, et une couche guidante de matériau diélectrique recouvrant la surface du substrat et les électrodes d'entrée et de sortie, la couche guidante étant recouverte de la couche réceptrice. Les électrodes d'entrée et de sortie de la au moins une ligne à retard sont des électrodes interdigitées déposées de manière photolithographique sur la surface du substrat piézoélectrique. Avantageusement, la au moins une ligne à retard comporte une couche d'un matériau métallique déposée entre les électrodes d'entrée et 2878622 4 de sortie sous la couche guidante afin d'éliminer l'influence de la conductivité du milieu liquide. Selon une particularité de la présente invention, le capteur à ondes acoustiques comporte une première ligne à retard de détection et une seconde ligne à retard de référence permettant de s'affranchir de perturbations extérieures s'appliquant de manière identique sur les première et seconde lignes à retard. Le capteur à ondes acoustiques peut être un capteur à ondes de Love. Selon une autre particularité de la présente invention, le module électronique comporte au moins un oscillateur, chaque oscillateur étant associé à une ligne à retard dudit chaque biocapteur, de sorte que les réactions du type anticorps-antigènes qui perturbent l'onde acoustique se traduisent par un changement de la fréquence de sortie de l'oscillateur. Avantageusement chaque oscillateur comporte: -un amplificateur à fort gain et faible bruit; - un atténuateur variable permettant d'ajuster le gain; un coupleur permettant de mesurer la fréquence d'oscillation; -un filtre passe bande permettant d'atténuer les harmoniques de la fréquence; et -des transformateurs de gain unitaire permettant une attaque de la ligne à retard en différentiel assurant un fonctionnement correct en présence de liquides conducteurs. Le module électronique est connecté à un module d'acquisition comportant un circuit électronique d'acquisition permettant le pilotage et 25 la mesure de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs. Le module d'acquisition peut comporter un réseau de neurones artificiels associé à une technique de fenêtres glissantes pour traiter les données de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs. Le module d'acquisition peut comporter un ensemble de circuits 30 programmables et un microcontrôleur implantés sur une carte 2878622 5 électronique permettant de traiter les données de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs. Le module d'acquisition comporte en outre une interface d'entrée permettant de sélectionner un mode de fonctionnement du système de détection de contaminants, et une interface de sortie permettant d'afficher les résultats de la détection. Le module d'acquisition comporte un compteur de fréquence mesurant les fréquences de sortie des oscillateurs, le compteur de fréquence étant piloté par un ordinateur comportant un logiciel de pilotage et d'acquisition. Avantageusement, l'élément supérieur est associé à une pompe péristaltique pour la circulation de l'eau et des vannes afin de contrôler des séquences de nettoyage et de détection de microorganismes pathogènes. L'eau à surveiller peut être une eau de baignade, une eau potable, ou une eau de surface. L'invention vise aussi un dispositif de détection en temps réel de microorganismes pathogènes en milieu liquide comportant au moins un biocapteur, ledit au moins un biocapteur comportant: -un capteur à ondes acoustiques comprenant un substrat piézoélectrique, au moins une ligne à retard ayant une électrode d'entrée et une électrode de sortie déposées sur la surface du substrat piézoélectrique et permettant la génération et la réception d'une onde acoustique, et une couche guidante de matériau diélectrique recouvrant la surface du substrat et les électrodes d'entrée et de sortie; et -une couche réceptrice de matériau biologique recouvrant la couche guidante et permettant la reconnaissance des microorganismes pathogènes par des réactions du type anticorps-antigènes. Avantageusement, le dispositif de détection comporte une 30 pluralité de biocapteurs, chaque biocapteur comportant une couche 2878622 6 réceptrice spécifique comprenant un anticorps de spécificité appropriée pour la détection d'un antigène particuliier permettant ainsi au dispositif de détection d'analyser simultanément un ou plusieurs types de microorganismes pathogènes. Brève description des dessins D'autres particularités et avantages du procédé et du dispositif selon l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après, à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels: -la figure 1 est une vue très schématique montrant le principe de fonctionnement d'un biocapteur selon l'invention pour la détection de contaminants; - la figure 2 est une vue très schématique montrant le 15 biocapteur de la figure 1 avec une couche guidante; - la figure 3 est une vue schématique montrant la structure de deux lignes à retard d'un biocapteur selon la figure 2; -la figure 4 est un exemple montrant la réponse d'un biocapteur selon la figure 2, à la détection d'une solution de phages de 20 bactériophages M13; -la figure 5 illustre très schématiquement un système de détection comportant quatre biocapteurs selon la figure 2; - la figure 6 montre un schéma en bloc d'un système de biodétection à ondes acoustiques comprenant un système de détection 25 multibiocapteurs, un module électronique et un module d'acquisition selon l'invention; - la figure 7 illustre très schématiquement le module électronique de la figure 6; - la figure 8 illustre très schématiquement le module 30 d'acquisition de la figure 6; 2878622 7 - la figure 9 illustre très schématiquement une vue éclatée d'un dispositif de surveillance en continu et in situ de la qualité d'un liquide selon l'invention; et - la figure 10 illustre très; schématiquement un système de 5 circulation continue du liquide comportant le dispositif de surveillance de la figure 9. Description détaillée de modes de réalisation La figure 1 est une vue très schématique montrant le principe de fonctionnement d'un biocapteur selon l'invention pour la détection de contaminants, en particulier pour la détection de microorganismes pathogènes. Ce biocapteur 1 comporte un capteur à ondes acoustiques 3 et une couche réceptrice 5 de matériau biologique. Le capteur à ondes acoustiques 3 est basé sur la génération d'ondes acoustiques dans un cristal ou substrat 7 piézoélectrique. Cette génération se fait au moyen de deux électrodes, une électrode d'entrée 11 et une électrode de sortie 13, parallèles et coplanaires déposées à la surface du substrat 7 piézoélectrique. En appliquant une tension alternative 13 au niveau de l'électrode d'entrée 9, on génère une alternance de compressions et d'expansions qui peuvent se propager le long du substrat 7 sous forme d'onde acoustique 15. Le système étant réversible, l'électrode de sortie 11 sert de récepteur et permet de recueillir le signal sous forme électrique. Le signal reçu 17 est retardé et atténué par rapport au signal émis 11. Ainsi, les électrodes d'entrée 9 et de sortie 11 forment une ligne à retard 19. Le type d'onde acoustique 15 se propageant dans le substrat 7 dépend de paramètres tels que la coupe cristallographique du cristal piézoélectrique, les caractéristiques du milieu et le mode considéré. Une variation de ces paramètres perturbe l'onde acoustique 15 et en change 2878622 8 les caractéristiques, vitesse de propagation et amplitude notamment. Parmi ceux-ci, on peut citer les propriétés des matériaux telles que la masse volumique, l'élasticité, la viscosité ou l'épaisseur de la couche réceptrice 5 de matériau biologique ajoutée sur le chemin de propagation de l'onde acoustique 15, ainsi que des paramètres extérieurs tels que la température ou la pression. Dans le cadre de l'application des dispositifs à ondes acoustiques à la détection d'espèces biologiques contaminantes, la principale source de perturbation de l'onde acoustique 15 est un changement de la masse de la structure appelé effet de masse. Ainsi, l'ajout d'une couche réceptrice 5 mince sensible à ces espèces biologiques sur le chemin de propagation modifie la vitesse de phase de l'onde 15 par effet de masse dû au dépôt de ces espèces sur cette couche sensible 5. Par exemple, si la couche réceptrice 5 est choisie pour ses affinités avec une espèce biologique particulière, lorsque l'espèce est présente dans l'environnement du capteur 3, elle interagit avec la couche réceptrice 5 principalement par sorption, induisant une variation de la masse de cette couche réceptrice 5, et par conséquent, perturbe l'onde acoustique 15. La mesure précise de ces perturbations permet de détecter ces espèces spécifiques et de remonter à leur concentration. Afin d'utiliser le capteur à ondes acoustiques 3 en milieu liquide, il faut que les ondes acoustiques 15 soient des ondes transverses horizontales du type Guided SH-SAW ou Love qui permettent d'éviter un rayonnement de l'énergie acoustique dans le liquide environnant. En effet, la figure 2 est une vue très schématique montrant un biocapteur 1 de détection en temps réel de contaminants biologiques (microorganismes pathogènes) en milieu liquide. Ce biocapteur 1 comporte un capteur à ondes acoustiques 3 30 comprenant un substrat 7 piézoélectrique constitué d'un monocristal (par 2878622 9 exemple du quartz ou du tantalate de lithium) pouvant ainsi supporter des ondes 15 transverses horizontales. En outre le biocapteur 1 comporte au moins une ligne à retard 19 (par souci de simplification, une seule ligne à retard 19 est représentée sur le dessin) ayant une électrode d'entrée 9 et une électrode de sortie 11 déposées sur la surface du substrat 7 piézoélectrique et permettant la génération et la réception d'une onde acoustique 15 transversale. Les électrodes 9 et 11 ont des formes interdigitées disposées transversalement à la direction de propagation de l'onde acoustique 15 et sont réalisées sur le substrat 7 piézoélectrique par photolithographie. La figure 3 est une vue schématique montrant la structure de deux lignes à retard 19a et 19b comportant chacune une électrode d'entrée 9a et 9b et une électrode de sortie lia et lib respectivement. A titre d'exemple, la périodicité À des électrodes peut être de l'ordre de 40 dam. L'ouverture W des électrodes peut être d'environ 1,6 mm, et la distance centre à centre I{c peut être d'environ 8,4 mm. Avantageusement, une couche 21 d'un matériau métallique (représentée en traits discontinus) peut être déposée sur le substrat 7 piézoélectrique entre les électrodes d'entrée 9a, 9b et de sortie 11a, llb. Cette couche 21 métallique déposée sur le chemin acoustique, entre les électrodes 9 et 11, permet d'éliminer l'influence de la conductivité du milieu liquide sur la propagation de l'onde pour limiter les perturbations pendant les détections. Les électrodes 9, 11 ainsi que la couche 21 métallique peuvent être réalisées en or, d'une épaisseur d'environ 70 nm, avec une couche intermédiaire d'accrochage sur le substrat 7 piézoélectrique en titane ou en chrome. Par ailleurs, le capteur à ondes acoustiques 3 peut comporter une première ligne à retard de détection 19a et une seconde ligne à retard 30 de référence 19b. 2878622 10 En effet, la figure 3 montre un capteur à ondes acoustiques 3 ayant deux lignes à retards 19a, 19b, une première 19a sensible à la présence des contaminants et une seconde 19b pouvant servir de référence. Cela permet, en faisant la différence entre la fréquence de la première ligne 19a sensible à l'espèce à détecter et la fréquence de la seconde ligne de référence 19b, de s'affranchir d'un certain nombre de perturbations extérieures (par exemple la température) s'appliquant de manière identique sur les deux lignes à retard 19a et 19b. Avantageusement, le capteur à ondes acoustiques 3 est un capteur à ondes de Love. En effet, les ondes de Love répondent au critère de polarisation transverse horizontale et sont bien adaptées à l'application proposée. Par ailleurs, le biocapteur 1 comporte une couche de matériau diélectrique 23 (par exemple du SiO2 ou un polymère) dite couche guidante recouvrant la surface du substrat 7 piézoélectrique et les électrodes d'entrée 9 et de sortie 11 et éventuellement la couche 21 de matériau métallique (voir figure 3) excepté les accès aux contacts électriques 10, 12, 22 des électrodes d'entrée 9, de sortie 11 et de la couche 21 métallique. Cette couche guidante 23 est une couche mince et peut avoir une épaisseur de l'ordre de 4 à 6 pm. En effet, l'onde 15 transverse horizontale se trouve confinée dans cette couche guidante 23. Ainsi, l'énergie de l'onde acoustique 15 en restant confinée au niveau de l'interface solide-liquide confère une grande sensibilité au biocapteur 1. Conformément à l'invention et afin de détecter des microorganismes pathogènes en milieu liquide (par exemple eau de baignade, eau potable, eau de surface), le biocapteur 1 comporte une couche réceptrice 5 de matériau biologique recouvrant la couche guidante 23 (au moins au niveau du chemiin acoustique entre les électrodes d'entrée 9 et de sortie 11) et permettant la reconnaissance des microorganismes pathogènes par des réactions du type anticorps-antigènes. En effet, l'anticorps est bien adapté pour la réalisation d'un biocapteur 1 sensible à la masse. Bien évidemment, la couche réceptrice 5 recouvre la couche guidante 23 au niveau de la ligne à retard de détection 19a de contaminants et non au niveau de la ligne à retard de référence 19b. Le procédé de mise en place de cette couche réceptrice 5 sur la surface du capteur à ondes acoustiques 3 comporte les étapes suivantes: -Le capteur 3 est tout d'abord lavé avec de l'acide, suivi par des rinçages avec de l'eau distillée, par des lavages avec de l'alcool et enfin par des rinçages avec de l'acétone. Ces étapes sont effectuées à température ambiante. Après un rinçage final avec une solution saline préchauffée, la surface propre du capteur 3 est incubée avec un agent couplant en solution dans un solvant. La procédure d'activation de la surface est terminée par un rinçage avec une solution saline. - La surface est ensuite incubée d'une solution d'anticorps monoclonal à une concentration finale donnée. Après cette incubation le capteur 3 est rincé avec une solution saline. - Les sites de liaisons non spécifiques sont bloqués par 20 incubation d'une solution de protéine en solution saline. - Le procédé est terminé par un rinçage du capteur 3 formant ainsi le biocapteur 1. Ainsi, en mesurant les perturbations de la propagation de l'onde acoustique 15, notamment sa vitesse de phase, on peut remonter à la présence de contaminants (microorganismes pathogènes) dans le milieu environnant. La principale source cle perturbation de l'onde est un changement de masse en surface du biocapteur 1 dû à l'accrochage des contaminants sur la couche réceptrice 5 d'anticorps. Cependant d'autres effets peuvent également perturber l'onde et intervenir dans la réponse du biocapteur 1, notamment des changements de la viscoélasticité de la 2878622 12 couche réceptrice 5 d'anticorps, ces effets peuvent permettre d'amplifier la réponse du biocapteur 1. Ce mode de détection permet de suivre en temps réel l'accrochage des contaminants et les modifications de la couche réceptrice 5 qui en résultent. En effet, tout changement de masse ou de propriétés physiques de cette couche réceptrice 5 produit immédiatement une perturbation de l'onde acoustique 15 mesurée par la partie électronique décrite ci-après. Après une immunoréaction entre la couche réceptrice 5 et le contaminant, la surface du biocapteur 1 peut être réutilisée. Les forces mises en jeu lors des interactions antigènes-anticorps sont des liaisons chimiques faibles qui assurent néanmoins, par leur grand nombre, une énergie de liaison assez élevée. Cependant, il est possible de déstabiliser les liaisons antigènesanticorps, ce qui permet de décrocher les microorganismes pathogènes de la surface du biocapteur 1 et ainsi de constituer une couche réceptrice 5 réutilisable. Par exemple, après des rinçages salins, les phages accrochés à la couche réceptrice 5 peuvent être élués avec une solution acide. Le biocapteur 1 peut être étalonné selon l'espèce contaminante recherchée. A titre d'exemple, on peut utiliser comme modèle un complexe anticorps/antigène du type IgG anti M13 (anticorps) pour détecter un virus bactériophage M13 (antigène). Le bactériophage M13 est un organisme parfaitement bien caractérisé de taille comparable à celle de nombreux virus pathogènes (900nm de long et 9nm de diamètre). Il est constitué de nombreuses copies (270) de la protéine majeure de l'enveloppe (pVIII) en association avec d'autres protéines mineures (PIII, PVI et PVII), et d'un ADN circulaire simple brin. Par ailleurs, de nombreux anticorps anti-M13 bien caractérisés 30 dirigés contre les protéines PVIII ou PIII sont disponibles. La numération des phages est facilitée par leur propriété d'infection des bactéries E. Coli "mâles" et la formation des plages de lyses sur un tapis bactérien. Cette numération se fait de manière classique. En effet, des dilutions de phages sont incubées avec une solution de cellules indicatrices des bactéries E. Coli et étalées sur une boîte de Petri. Après incubation les plages de lyses sont comptées et le nombre de phages exprimé en PFU/ml est déterminé. La figure 4 est un exemple montrant la réponse du biocapteur à la détection d'une solution de phages de bactériophages M13 à 1012 pfu.mL"1. La courbe 25 montre que la variation de fréquence est quasi simultanée à l'introduction de la solution de bactériophages sur le biocapteur 1. Ainsi, il est possible de déterminer la présence du polluant au bout de quelques minutes. La figure 5 illustre très schématiquement un dispositif de détection 31 en temps réel des microorganismes pathogènes, comportant au moins un biocapteur (quatre biocapteurs sont représentés sur le dessin). Ainsi, chaque biocapteur 1 peut comporter une couche réceptrice spécifique 5a, 5b, 5c, 5d comprenant un anticorps de spécificité appropriée pour la détection d'un antigène particulier permettant ainsi au dispositif de détection 31 d'analyser simultanément un ou plusieurs types de microorganismes pathogènes. Le choix du complexe anticorps-antigènes comme système de couche réceptrice-polluant est notamment motivé par la grande sélectivité de ce type de réaction immunologique (un anticorps ne s'accroche que sur son antigène spécifique). Ceci permet de réaliser un dispositif de détection 31 multibiocapteurs dans lequel chaque biocapteur 1 est dédié à la détection d'une espèce biologique particulière. Ainsi, un tel dispositif de détection 31 comportant une pluralité 30 de biocapteurs 1 permet d'avoir une détection rapide et efficace des 2878622 14 contaminants. Ceci occulte les problèmes liés à l'utilisation des kits immunologiques et de plus, permet une détection en temps réel et sur site. La figure 6 montre un schéma en bloc d'un système 33 de biodétection à ondes acoustiques comprenant un dispositif de détection 31 multibiocapteurs, un module électronique 35 et un module d'acquisition 37. Le module électronique:35 est connecté électriquement (connexion 39) au dispositif de détection 31 multibiocapteurs afin de mesurer la ou les fréquences de sortie du ou des biocapteurs 1 qui indiquent les concentrations des contaminants (microorganismes pathogènes). En outre, le module électronique 35 est relié (connexion 41) au module d'acquisition 37 qui permet le pilotage du système 33 de biodétection et l'interprétation de la fréquence mesurée. La figure 7 illustre très schématiquement un module électronique 35 comportant une chaîne d'oscillation formant un oscillateur 43 associé à une ligne à retard 19 d'un biocapteur 1. On notera que le module électronique 35 peut comporter au moins un oscillateur 43, un pour chaque ligne à retard 19, ou bien un seul oscillateur 43 prélevant les signaux des différentes lignes à retard 19 d'une manière séquentielle ou selon la commande de l'utilisateur. L'oscillateur 43 étant associé à la ligne à retard 19 d'un biocapteur 1, les réactions du type anticorps-antigènes qui perturbent l'onde acoustique 15 se traduisent par un changement de la fréquence de sortie 47 de cet oscillateur 43. En effet, de manière à satisfaire les critères de stabilité et de sensibilité, chaque ligne à retard 19 est insérée dans une boucle de rétroaction d'un amplificateur 45 pour constituer un oscillateur de précision. Lors des détections de contaminants, les perturbations de l'onde acoustique 15 se traduisent alors par un changement de la fréquence de 2878622 15 sortie 47 de l'oscillateur 43 qui représente une grandeur aisément mesurable. Ainsi, l'oscillateur 43 est une configuration d'une chaîne d'oscillation comportant un amplificateur 45 à fort gain et faible bruit, un atténuateur variable 49 permettant d'ajuster le gain, un coupleur 51 permettant de mesurer la fréquence d'oscillation, un filtre passe bande 53 permettant d'atténuer les harmoniques de la fréquence, et des transformateurs 55 de gain unitaire permettant une attaque de la ligne à retard 19 en différentiel assurant un fonctionnement correct du biocapteur 1 en présence de liquides conducteurs. Le gain de l'ensemble amplificateur 45 et atténuateur variable 49 est calculé de manière à pouvoir compenser les pertes de la ligne à retard 19. Etant donné les disparités entre les différents biocapteurs 1 et les variations de pertes susceptibles d'apparaître lors des détections en milieu liquide, il est nécessaire de disposer d'un gain variable pouvant s'adapter aux différentes situations rencontrées. Une fréquence de l'ordre d'une centaine de megahertz rend complexe la réalisation d'amplificateur à gain variable. Le choix se porte donc sur l'association d'un amplificateur 45 de gain fixe (de l'ordre de 45 dB) et suffisamment élevé pour répondre aux applications en milieu liquide et d'un atténuateur variable 49 permettant de régler le gain de l'ensemble. Un exemple de spécifications pour ces deux éléments est donné ci-après: le gain de l'amplificateur 45 est de l'ordre de 45 dB, -le facteur de bruit est inférieur à environ 2 dB, -la fréquence de fonctionnement est d'environ 20 MHz à 250 MHz, -la puissance de sortie est de l'ordre de 20 dBm, et -l'atténuation peut aller de 5 à 30 dB. Le coupleur 51 permet de prélever une partie du signal de sortie 30 pour en mesurer la fréquence sans perturber le montage. 2878622 16 Le filtre passe-bande 53 permet d'atténuer les harmoniques de la fréquence d'oscillation pour améliorer la stabilité de l'oscillateur43, il permet également de filtrer une remontée du bruit observée sur les biocapteurs 1 à haute fréquence. Le filtre 53 peut être un filtre de Tchébitchev du 3ème ordre comportant une très faible atténuation clans une bande passante d'environ 0,01dB. La bande passante du filtre 53 peut être une fréquence comprise entre 75 MHz et 125 MHz (par exemple 50 MHz). Dans le cadre d'un fonctionnement en double ligne à retard 19a, 19b (voir figure 3), deux oscillateurs 43 doivent fonctionner simultanément, des précautions de réalisation sont alors nécessaires pour éviter les problèmes de couplage électromagnétique entre ces éléments. Par exemple, une isolation électrique des éléments et la réalisation d'une masse en étoile pour éliminer les boucles pouvant rayonner peuvent être suffisantes pour éviter ces problèmes de couplage électromagnétique. L'oscillateur 43 ainsi réalisé permet d'obtenir une très haute stabilité à court terme, de l'ordre de 1 Hz/s. Cela permet des détections avec un seuil de sensibilité très bas, puisqu'il est possible de discriminer des variations de seulement quelques dizaines de Hertz sur la fréquence de sortie 47 de l'oscillateur 43. Ainsi, le module électronique 35 permet une détection précise des microorganismes pathogènes à des seuils de concentration très faibles. La figure 8 illustre très schématiquement un module d'acquisition 37 connecté au module électronique 35, ce dernier étant connecté au dispositif de détection 31 multibiocapteurs. Le module d'acquisition 37 comporte un circuit électronique 61 d'acquisition permettant le pilotage et la mesure de la ou des fréquences de sortie du module électronique 35. L'objectif du module d'acquisition 37 est de mesurer la fréquence de sortie de l'oscillateur 43 décrit ci-dessus et de fournir à l'utilisateur une interface permettant de piloter et d'acquérir les valeurs des fréquences mesurées sur chaque biocapteur 1, pour les afficher en temps réel sur un écran 63 et les stocker dans des fichiers 65 de mesure qui pourront être exploités a posteriori. Le module d'acquisition 37 se décline en deux configurations, l'une pour des mesures en laboratoire, l'autre entièrement portable pour des rnesures directement sur le site de prélèvement. La première configuration (non représentée sur le dessin) utilise des appareils de laboratoire et un ordinateur pour le pilotage et l'acquisition de la fréquence ainsi que pour l'exploitation des mesures. Dans ce cas, la fréquence de sortie de l'oscillateur 43 est directement mesurée par un compteur de fréquence piloté depuis l'ordinateur. Un logiciel de pilotage et d'acquisition est développé par exemple avec l'environnement Labwindows CVI et/ou Labview (marques déposées). La deuxième configuration (représentée sur le dessin) est entièrement intégrée sur des cartes de mesure ce qui la rend portable et permet de faire des mesures sur les sites même de prélèvements. Le système met en oeuvre un ensemble de circuits programmables 69 et un microcontrôleur 71 implantés sur une carte électronique 73 permettant de traiter les données de la ou des fréquences de sortie du module électronique 35. En outre, le module d'acquisition 37 comporte une interface d'entrée 75 (par exemple une pluralité de touches 77) permettant de sélectionner un mode de fonctionnement du système de détection 31 de contaminants, et une interface de sortie 63 (par exemple un afficheur LCD 79) permettant d'afficher les résultats de la détection. Cette carte 73 permet de mesurer simultanément les 30 fréquences de la pluralité de biocapteurs 1. D'une manière générale, les capteurs à ondes acoustiques 3 fonctionnent à des fréquences de l'ordre d'une centaine de mégahertz et ayant un temps de réponse de l'ordre de quelques secondes. Etant donné la stabilité à 1 Hz/s de l'oscillateur 43, il est nécessaire de pouvoir mesurer la fréquence avec une précision de l'ordre du Hertz. Alors, pour obtenir une détection rapide le signal est intégré sur une seconde. Afin d'obtenir la précision recherchée, la fréquence de sortie de l'oscillateur 43 est divisée avant d'être appliquée au microcontrôleur 71. La division est réalisée à l'aide d'un circuit programmable 69 fonctionnant jusqu'à des fréquences supérieures à 100 MHz. La sortie du diviseur est reliée au bus de donnée du microcontrôleur 71 et la sortie de report est reliée à l'entrée de capture du microcontrôleur 71, ce qui permet d'assurer un comptage complet des impulsions d'entrée jusqu'à des fréquences élevées. Cette structure est répétée sur chaque voie d'acquisition (une voie étant associée à chaque biocapteur 1) et permet d'effectuer une acquisition quasi simultanée sur la pluralité des voies en un temps de l'ordre de la seconde. Le résultat de la mesure peut être affiché sur l'écran LCD 79 et/ou stocké dans l'un des fichiers 65 de données. Eventuellement, une liaison RS232 permet de relier la carte 73 d'acquisition à un ordinateur 81 pour une récupération et un traitement des fichiers 65 de données si nécessaire, ou pour réinitialiser certains paramètres du circuit programmable 69. De même que précédernment, une interface utilisateur développée par exemple avec l'environnement Labwindows CVI et/ou Labview (marques déposées) permet de gérer les différents éléments de l'acquisition et l'initialisation de la carte 73. Par ailleurs, la fréquence de sortie 47 de l'oscillateur 43 peut être traitée par une technique de fenêtres glissantes associée à un réseau de neurones artificiels (non représenté). Conformément à l'invention, la figure 9 illustre très schématiquement une vue éclatée d'un système de surveillance 83 autonome, en continu et in situ de la qualité d'un liquide, en particulier d'une eau (par exemple eau potable, eau de baignade, eau de surface). Ce système de surveillance 83 comporte un élément inférieur 85, un élément intermédiaire 87, et un élément supérieur 89. L'élément inférieur 85 comporte un logement 91 destiné à accueillir le dispositif de détection 31 'en temps réel de microorganismes pathogènes. L'élément intermédiaire 87 est connecté électriquement avec les contacts électriques 10, 12 du dispositif de détection 31 de microorganismes pathogènes par des liaisons électriques 93 qui peuvent être assurées par des pointes de touches à ressort (pogo pins). L'élément intermédiaire 87 comporte aussi des connexions électriques 95 extérieures pour connecter le dispositif de détection 31 de microorganismes pathogènes au module électronique 35. L'élément supérieur 89 est fermé et permet une circulation continue du liquide (eau à surveiller) à travers une canalisation 97 comportant un canal d'entrée 97a et un canal de sortie 97b. Il comporte aussi une chambre étanche 99 grâce à un joint d'étanchéité 101, permettant d'amener le liquide en contact avec la ou les couches réceptrices 5 du dispositif de détection 31 de microorganismes pathogènes. Les trois éléments 85, 87, et 89 s'encastrent les uns dans les autres pour former une cellule fermée comprenant les connexions électriques 95 du dispositif de détection 31 de microorganismes pathogènes vers les modules électroniques 35 et d'acquisition 37 associés et vers un système de circulation du liquide. 2878622 20 Bien entendu, il est aussi envisageable d'intégrer les modules électroniques 35 et/ou d'acquisition 37 dans l'un des éléments 85, 87, et 89 du système de surveillance 83. La figure 10 illustre très schématiquement un exemple d'un système de circulation continue 103 du liquide (eau à surveiller) comportant le système de surveillance 83, d'une pompe péristaltique 105, et des vannes 107 et 109 pour la circulation du liquide par l'intermédiaire d'un circuit 111 fluidique. Selon cet exemple, le système de circulation continue 103 du 10 liquide comporte une première électrovanne 107 et une seconde électrovanne 109 à trois voies. Cet exemple est adapté aux tests en laboratoire, notamment lors des essais de mise au point des protocoles de nettoyage et de détection, ainsi que pour les tests de validation du système complet. Ce système de circulation 103 permet de contrôler totalement une alternance de séquences de nettoyage et de détection de contaminants (microorganismes pathogènes). La première électrovanne 107 permet de passer de la circulation d'un milieu de culture de référence 113 (séquence d'initialisation ou de nettoyage) au milieu contenant le contaminant 115 (séquence de détection). La deuxième électrovanne 109 permet de choisir un mode en circuit fermé (par exemple pour la circulation continue de l'échantillon de test dans le dispositif de surveillance 83), ou un mode en circuit ouvert avec évacuation 117 des produits (par exemple pendant les séquences de nettoyage). On notera que pour un prélèvement sur site, le système de circulation 103 peut être simplifié en n'utilisant que la seconde électrovanne 109. Dans ce cas, la pompe péristaltique 105 et l'électrovanne 109 peuvent être commandées par le microcontrôleur 71 du module 30 d'acquisition 37 connecté ou compris dans le système de surveillance 83. 2878622 21 Ainsi, le système de surveillance 83 en liaison avec les électroniques associées 35 et 37, selon l'invention peut être appliqué pour la détection des microorganismes pathogènes (bactériens ou viraux) dans l'eau (eaux de baignades, eaux de surface, eaux thermales, sorties de centres d'épuration, eaux pour la consommation humaine, etc). Cette détection peut être faite par effet de masse ainsi que par d'autres effets comme des variations de viscosité ou de rigidité de surface. En outre, la détection est faite en temps réel et pour une pluralité d'espèces de microorganismes pathogènes grâce à l'utilisation d'un système 31 de multicapteurs dédiés et sélectifs. Cette détection peut être réalisée à des seuils de concentration faible grâce à la mesure précise de la fréquence de l'oscillateur 43 du module électronique 35. De plus, le fonctionnement du dispositif de surveillance 83 en flux continu permet d'obtenir la meilleure résolution de mesure. Les mesures peuvent être réalisées in situ directement sur les sites de prélèvements grâce à un système de surveillance 83 portable et autonome. Un autre avantage est le fait que les couches réceptrices 5 des 20 biocapteurs 1 sont réutilisables. 22 REVENDICATIONS 1. Système de surveillance autonome, en continu et in situ de la qualité 5 d'une eau caractérisé en ce qu'il comporte: - un élément inférieur (85) avec un logement (91) destiné à accueillir un dispositif de détection en temps réel (31) de microorganismes pathogènes ledit dispositif de détection comprenant au moins un biocapteur comportant au moins une couche réceptrice (5) de matériau biologique permettant la reconnaissance des microorganismes pathogènes par des réactions du type anticorps- antigènes; - un élément intermédiaire (87) connecté électriquement avec le dispositif de détection (31) de microorganismes pathogènes par des liaisons électriques (93) et comportant des connexions électriques (95) extérieures pour connecter le dispositif de détection (31) de microorganismes pathogènes à un moclule électronique (35); et -un élément supérieur (89) fermé permettant une circulation continue de l'eau à surveiller et comportant une chambre étanche (99) permettant d'amener l'eau en contact avec ladite couche réceptrice (5) du dispositif de détection (31) de microorganismes pathogènes. 2. Système de surveillance selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif de détection (31) de microorganismes pathogènes comporte une pluralité de biocapteurs (1), chaque biocapteur (1) comportant une couche réceptrice spécifique (5a, 5b, 5c, 5d) comprenant un anticorps de spécificité appropriée pour la détection d'un antigène particulier permettant ainsi au dispositif de détection (31) d'analyser simultanément un ou plusieurs types de microorganisrnes pathogènes. 2878622 23 3. Système de surveillance selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque biocapteur (1) comporte en outre un capteur à ondes acoustiques (3) comprenant un substrat (7) piézoélectrique, au moins une ligne à retard (19) ayant une électrode d'entrée (9) et une électrode de sortie (11) déposées sur la surface du substrat (7) piézoélectrique et permettant la génération et la réception d'une onde acoustique (15), et une couche guidante (23) de matériau diélectrique recouvrant la surface du substrat (7) et les électrodes d'entrée et de sortie (9, 11), la couche guidante (23) étant recouverte de la couche réceptrice (5). 4. Système de surveillance selon la revendication 3, caractérisé en ce que les électrodes d'entrée et de sortie (9, 11) de la au moins une ligne à retard (19) sont des électrodes interdigitées déposées de manière photolithographique sur la surface du substrat (7) piézoélectrique. 5. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la au moins une ligne à retard (19) comporte une couche (21) d'un matériau métallique déposée entre les électrodes d'entrée et de sortie (9, 11) sous la couche guidante (23) afin d'éliminer l'influence de la conductivité du milieu liquide. 6. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le capteur à ondes acoustiques (3) comporte une première ligne à retard de détection (19a) et une seconde ligne à retard de référence (19b) permettant de s'affranchir de perturbations extérieures s'appliquant de manière identique sur les première et seconde lignes à retard (19a, 19b). 2878622 24 7. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que le capteur à ondes acoustiques (3) est un capteur à ondes de Love. 8. Système de surveillance selon la revendication 1, caractérisé en ce que le module électronique (35) comporte au moins un oscillateur (43), chaque oscillateur (43) étant associé à une ligne à retard (19) dudit chaque biocapteur (1), de sorte que les réactions du type anticorps- antigènes qui perturbent l'onde acoustique (15) se traduisent par un changement de la fréquence de sortie (47) de l'oscillateur (43). 9. Système de surveillance selon la revendication 8, caractérisé en ce que chaque oscillateur (45) comporte: -un amplificateur (49) à fort gain et faible bruit; -un atténuateur variable (49) permettant d'ajuster le gain; -un coupleur (51) permettant de mesurer la fréquence d'oscillation; -un filtre passe bande (53) permettant d'atténuer les harmoniques de la fréquence; et -des transformateurs (55) de gain unitaire permettant une attaque de la 20 ligne à retard (19) en différentiel assurant un fonctionnement correct en présence de liquides conducteurs. 10. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que le module électronique (35) est connecté à un module d'acquisition comportant un circuit électronique (61) d'acquisition permettant le pilotage et la mesure de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs (43). 11. Système de surveillance selon la revendication 10, caractérisé en ce 30 que le module d'acquisition comporte un réseau de neurones artificiels 2878622 25 associé à une technique de fenêtres glissantes pour traiter les données de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs (43). 12. Système de surveillance selon la revendication 10, caractérisé en ce que le module d'acquisition comporte un ensemble de circuits programmables (69) et un microcontrôleur (71) implantés sur une carte électronique (73) permettant de traiter les données de la ou des fréquences de sortie des oscillateurs (43). 13. Système de surveillance selon la revendication 12, caractérisé en ce que le module d'acquisition comporte en outre une interface d'entrée (75) permettant de sélectionner un mode de fonctionnement du système de détection (31) de contaminants, et une interface de sortie (63) permettant d'afficher les résultats de la détection. 14. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le module d'acquisition comporte un compteur de fréquence mesurant les fréquences de sortie des oscillateurs, le compteur de fréquence étant piloté par un ordinateur comportant un logiciel de pilotage et d'acquisition. 15. Système de surveillance selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élément supérieur (89) est associé à une pompe péristaltique (105) pour la circulation de l'eau et des vannes (107, 109) afin de contrôler des séquences de nettoyage et de détection de microorganismes pathogènes. 16. Système de surveillance selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que ladite eau à surveiller est une eau de baignade, une eau potable, ou une eau de surface. 2878622 26 17. Dispositif de détection en temps réel de microorganismes pathogènes en milieu liquide, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un biocapteur, ledit au moins un biocapteur comportant: -un capteur à ondes acoustiques (3) comprenant un substrat (7) piézoélectrique, au moins une ligne à retard (19) ayant une électrode d'entrée (9) et une électrode de sortie (11) déposées sur la surface du substrat (7) piézoélectrique et permettant la génération et la réception d'une onde acoustique (15), et une couche guidante (23) de matériau diélectrique recouvrant la surface du substrat (7) et les électrodes d'entrée et de sortie (9, 11); et -une couche réceptrice (5) de matériau biologique recouvrant la couche guidante (23) et permettant la reconnaissance des microorganismes pathogènes par des réactions du type anticorps-antigènes. 18. Dispositif de détection selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte une pluralité de biocapteurs (1), chaque biocapteur (1) comportant une couche réceptrice spécifique (5a, 5b, 5c, 5d) comprenant un anticorps de spécificité appropriée pour la détection d'un antigène particulier permettant ainsi au dispositif de détection (31) d'analyser simultanément un ou plusieurs types de microorganismes pathogènes.