Brevet FR2876704A1 — publié le 20060421

Procédé de Préparation d'un Identifiant Biologique La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'un moyen d'identification biologique ou identifiant biologique et son utilisation pour la traçabilité de la matière biologique, préférentiellement des animaux, en particulier du bétail comme les bovins. Les impératifs de tracabilité et de contrôle dans le cadre des différentes filières agro-alimentaire ont conduit les industriels à développer des méthodes de suivi standards susceptibles d'être communes et partagées par tous. Ces problématiques sont d'autant plus sensibles que les durées de suivi sont long, comme c'est le cas par exemple dans le domaine de l'élevage, ou la tracabilité doit pouvoir être assurée fidèlement de la naissance de l'animal jusque dans l'assiette du consommateur, soit plusieurs années. Ces méthodes portent tout autant sur le support de codification et de suivi (norme EAN pour les codes à barre, normes RFID...) que sur l'information susceptible d'être codifiée au titre de la tracabilité (p.e. norme de codification de produit, n lots, n d'identification bovins...). Aucune de ces méthodes, quelque soit leur robustesse, ne permettent cependant d'assurer une tracabilité parfaite et exempte de tout risque d'erreur. En effet, quelque soit le support de tracabilité (code barre, étiquette électronique...) ou l'information codifiée (n de lot, date, provenance...) cette information est décorrélée du produit auquel elle s'applique. L'arrachage de l'étiquette ou la perte des données... induisent dès lors une rupture de la chaîne de la tracabilité et font échec à son fonctionnement. Le seul moyen de garantir une tracabilité "indestructible" est d'utiliser comme source ET comme support de donnée le produit lui-même. C'est ainsi que les produits sont parfois "marqués" de manière inaltérable (encre indélébile et/ou marquée, poinçon...). Mais de tels procédés induisent très souvent une altération du produit qui peut être parfois dommageable, ou ne garantisse pas que le marquage ne soit désolidarisé du produit. Dans le domaine des matières vivantes, il existe cependant un support d'information intrinsèque, fiable et extrêmement redondant: l'ADN L'ADN de chaque être vivant contient dans chacune des cellules qui les constituent un message unique et non équivoque qui le défini biologiquement. L'ADN contient donc certaines informations qui sont propre à l'individu et qui lui sont intrinsèquement attachées. Répondant aux exigences de la discrimination et de la quasi inaltérabilité, ces informations constituent donc un parfait support de tracabilité individuelle. L'ADN constitue également un reflet du relationnel entre un individu et ses parents biologiques, en effet son contenu est une combinaison de l'ADN de la mère et du père. A cet égard, l'ADN constitue donc également un support de tracabilité parentale. Les techniques existantes aujourd'hui ne permettent cependant pas de faire une lecture directe, rapide et in situ des informations contenues dans l'ADN. Le décryptage de ces informations nécessite la mise en oeuvre de techniques d'analyse de biologie moléculaire réservées à une utilisation en laboratoire spécifique et selon des délais qui ne vont actuellement pas en deçà de 24 heures. Il convient donc de transformer cette information biologique en une information directement accessible, mais dont la pertinence et la validité peut être vérifiée à tout instant par une analyse génétique du produit auquel elles s'appliquent. Le coeur de la technique présentement exposée est donc de transformer certaines informations individuelles contenues dans l'ADN en un identifiant numérique spécifique à chaque individu et représentatif de son individualité biologique. L'approche suivie est la même que dans la constitution du numéro de sécurité sociale, qui est représentatif des caractéristiques sociales de l'individu et qui le rendent socialement unique. Dans notre hypothèse notre "numéro d'identification biologique" est représentatif des caractéristiques biologiques/génétiques de l'individu et qui le rendent biologiquement/génétiquement unique. Afin de garantir sa pertinence industrielle, cet identifiant doit, en plus de sa capacité à discriminer les individus, pouvoir s'intégrer dans les processus de tracabilité classiquement utilisés par les industriels des différentes filières. C'est pourquoi le choix s'est porté, dans sa réalisation préférée, sur un format de données susceptible d'être intégré dans un code à barre standard. La présente technique porte donc à la fois sur des techniques de mise en évidence des caractéristiques génétiques d'un individu, notamment chez les bovins mais pas uniquement, et sur les techniques de codification de ces informations permettant leur transmission, et leur portabilité optimale. La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'un moyen d'identification spécifique ou identifiant d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de: prélèvement de l'échantillon biologique à identifier, - isolation de l'ADN dudit échantillon, - amplification et analyse des fragments microsatellites de l'ADN isolé et/ou des polymorphismes ponctuels, codification des longueurs de fragments microsatellites obtenues et/ou des séquences des combinaisons de polymorphismes ponctuels selon un algorithme approprié pour l'obtention du moyen d'identification spécifique à la composition génétique dudit échantillon. Le moyen d'identification est spécifique en ce sens qu'il est directement lié à l'ADN de l'échantillon, lequel contient des informations qui sont propre à l'individu et qui lui sont intrinsèquement attachées, répondant aux exigences de discrimination et de quasi inaltérabilité. L'amplification de l'ADN isolé est de préférence effectuée par PCR, selon les méthodes usuelles de la technique. L'analyse des fragments microsatellites et/ou des séquences de combinaisons de polymorphismes ponctuelles sont réalisées selon les techniques usuelles, notamment au moyen de kits disponibles dans le commerce. L'algorithme de codification est choisi parmi un algorithme de contrôle d'intégrité des données de type checksum , comme l'algorithme modulo 90, un algorithme de compression de données comme un algorithme de codage algoritmétique ou par exemple l'algorithme LZW. Des techniques pour représenter de manière condensée une liste de nombres entiers sont utilisées notamment dans les télécommunications de longue date, comme p.e. le calcul des checksums et CRCs (cyclic redundancy checks). Une liste d'entiers, dont les valeurs sont codées sur un nombre fixe M d'octets est ainsi représenté par un seul nombre, calculé sur la totalité de la liste et codé sur M octets. Pour assurer le contrôle du respect de l'intégrité d'un message durant sa transmission, l'émetteur calcule ce checksum et transmets la liste de valeurs plus son checksum à un récepteur. Le récepteur de son coté, dispose du même procédé de calcul du checksum et l'applique sur la liste de valeurs reçues. Si jamais durant la transmission, ne serait-ce qu'une seule des valeurs de la liste a été altéré, les checksums récepteur et émetteur seront différents, ce qui atteste de la modification du message durant sa transmission permet au récepteur d'en re-solliciter la retransmission. Il est à noter que la réduction d'une liste de valeurs à une seule valeur checksum constitue une compression de données avec forte perte d'information et une intolérance aux erreurs. Ainsi, deux émetteurs générant le même message utilisant un procédé pas complètement hermétique aux erreurs, génèreraient deux messages totalement différents si seul le checksum est comparé. Dans l'invention, la perte et l'intolérance du système de codage sont diminuées en scindant la liste en plusieurs sous listes ou composants et en représentant chaque composant par une valeur checksum, au prix d'une compression de données moins importante. Toujours dans l'invention, l'application du procédé checksum tel qu'utilisé dans les télécommunications consiste à comparer deux messages générés pour savoir s'ils peuvent avoir une même signification. On ne dispose pas des deux messages d'origine, seulement de deux suites de codes checksum, véhiculés p.e. par les digits d'un code barre. Une modification importante du procédé checksum tel qu'utilisé dans les télécommunications, réside dans la non émission d'un composant, ce qui est effectué par l'émission d'un checksum avec un code réservé. Ce procédé est applicable si le processus générant les composants individuels du message est capable de mesurer le taux de confiance qu'on peut attribuer à chaque composant. Dans certains cas, ce taux peut être jugé insuffisant, ce qui équivaut à constater un échec partiel du processus de génération du message. Ainsi, plutôt que d'émettre une fausse information on émet une non information, dans le souci de pouvoir comparer le message avec un autre message généré ultérieurement, à travers des checksums. Une autre modification consiste à exploiter le fait que seul un nombre limité mais pas a priori connu de valeurs peuvent exister pour chaque composant du message. Un checksum est à la base un calcul reproductible et en général non-reversible. Un retour en arrière est rendu possible par le choix d'un mode de calcul simple et réversible du calcul checksum. Un calcul satisfaisant ces critères est par exemple un calcul modulo 99 qui retient le restant en tant que checksum. On ne sait pas ce qui a rendu le checksum 90, mais si on sait que 140 fait partie du composant et que la plage des valeurs possible va de 120 à 160, alors par extrapolation on sait que le composant était à deux valeurs et que 148 était la deuxième valeur du composant (140 + 148 % 99 = 90). D'autres calculs satisfaisant ces critères relèves du domaine de la compression de données plus que du contrôle d'intégrité de données. Les méthodes basés sur les dictionnaires comme le LZW [Unisys U.S. LZW Patent No. 4,558,302] et les méthodes statistiques basés sur les connaissances a priori comme le codage arithmétique [Witten, I.H., Neal, R.M., and Cleary, J.G. 1987, Communications of the ACM, vol. 30, pp. 520 40.] peuvent réaliser une compression suffisante des résultats d'analyse microsatellites pour qu'une représentation sous forme de code barre devienne possible. Un algorithme de compression sans perte représente un calcul de checksum 100% réversible. Le moyen d'identification spécifique ou identifiant - est avantageusement une chaîne alphanumérique de moins de 100 éléments (chiffres ou lettres), préférentiellement de moins de 30 éléments. Le moyen d'identification spécifique est une chaîne numérique de moins de 30 20 chiffres, représentée sous forme de code barre. L'usage du code barre comme moyen d'identification spécifique permet un usage de ces données à un niveau industriel. L'échantillon biologique est prélevé sur un organisme vivant, de préférence un animal, plus préférentiellement un animal d'élevage, en particulier bovin. Enfin, le procédé selon l'invention comprend également une étape selon laquelle le moyen d'identification spécifique est comparé dans une banque de données comprenant des moyens d'identifications spécifiques préalablement rassemblés ou encore comparé à celui d'un autre échantillon biologique correspondant à un autre individu ou au même individu généré préalablement ou simultanément. Le résultat d'une analyse portant sur l'amplification par PCR d'un microsatellite se présente comme une liste à une ou deux entrées de nombres entiers, représentant les tailles des fragments amplifiés. Les résultats d'un panel de N microsatellites se présente par conséquent comme une liste à N entrées de liste de tailles à une ou deux entrées. Le processus d'amplification et d'analyse des microsatellite selon kit Applied Biosystem "StockMarks Animal Genotyping System" est représenté sur la figure 1. Le résultat d'analyse des microsatellites selon kit Applied Biosystem "StockMarks Animal Genotyping System" et logiciel Genscan & Genmapper est représenté sur la figure 2. La liste de microsatellites bovins selon kit Applied Biosystem "StockMarks Animal Genotyping System" est donnée sur la figure 3. En pratique, les entrées des listes de taille sont souvent des nombres à valeurs type', mais ceux-ci ne sont pas connus d'une manière exhaustive, ce qui limite les possibilités de représentation de l'information par les systèmes informatiques. Deux individus appartenant à une même espèce possèdent pour un microsatellite donné souvent les mêmes tailles, en revanche, si on utilise un panel de microsatellites multiples, p.e. N = 10, la probabilité que deux individus, même appartenants à une même espèce voire race, possèdent les mêmes tailles pour tous les microsatellites, tend vers zéro. Ce principe est utilisé dans le cadre de la police scientifique pour comparer l'ADN de deux individus humains. Lorsque le champs d'application de l'analyse microsatellite a été élargie à l'analyse des espèces, on s'est rendu compte que des espèces parfois éloignés pouvaient dans certain cas marginaux produire des résultats proche. Un complément à l'analyse microsatellite peut être constitué par une analyse des polymorphismes ponctuels codants (coding SNPs ou cSNPs). Contrairement aux microsatellites, ceux-ci sont liés aux fonctions biologiques et par conséquent reflètent certaines caractéristiques d'une espèce et d'un individu. Comme pour le microsatellite, le résultat d'une analyse SNP n'est pas une valeur simple mais une liste, dont le nombre d'entrées dépend de la région génomique amplifié et l'espèce. Les entrées dans la liste SNP sont des couples (position, base) et comme pour les microsatellites, chaque SNP peut avoir une ou deux valeurs simultanées, quand il s'agit d'une analyse d'un organisme diploïde, ayant deux copies de chaque chromosome dans chaque cellule. Une telle méthode combinée microsatellite / SNP peut donc être performante sur le plan de l'identification individuelle mais l'identifiant généré est complexe et difficile à représenter et par conséquent difficile à traiter par un système informatique. Une façon simple de représenter ou coder de tels résultats est de les transformer en un identifiant représentable sous forme d'un code barre ou code matrice 2D. Dans sa réalisation préférée appliquée à la tracabilité individuelle bovine, l'invention représente chaque fragment microsatellite par une seule valeur checksum entre 0 et 99. Ainsi, l'application d'un panel de 11 microsatellites connus et disponibles commercialement en kit pour les bovins TGLA227 FAM Blue 64 115 BM2113 FAM Blue 116 146 TGLA53 FAM Blue 147 197 ETH10 FAM Blue 198 234 SPS 115 FAM Blue 235 265 TGLAl26 JOE Green 104 131 TGLAl22 JOE Green 134 193 INRA23 JOE Green 193 235 ETH3 NED Yellow 90 135 ETH225 NED Yellow 135 165 BM1824 NED Yellow 170 218 génère 11 valeurs numériques, correspondant avec la codification CRC modulo 99' des longueurs mesurées des fragments microsatellites. En cas de pics trop faibles obtenus pour une microsatellite, le CRC affiche le code réservé 99 signifiant le blanc. Cette partie de l'identifiant est évolutive et rétro compatible; au fur et à mesure que le panel est élargie (N+l, N+2, . ) l'identifiant devient plus long mais il reste possible de comparer des valeurs générées dans le passé avec des panels plus restreints...DTD: Pour l'espèce bovines ou pour d'autres espèces (ovin, porcin, cétacé, humain...), d'autres combinaisons de microsatellites pourront être sélectionnés, dès lors qu'elles répondent aux exigences de discrimination inter-individu posées par le procédé. Toujours à titre de réalisation préférée appliquée à la tracabilité individuelle bovine, l'invention consacre ensuite un certain nombre de valeurs à l'analyse SNP du deuxième exon du gène bovin BoLA-DRB3. Cet exon est amplifié par des amorces internes comme un fragment de 237 paires de bases, possédant 66 positions variables connues à ce jour, produisant 106 variations génétiques (allèles) connues à ce jour. Les bovins étant diploïdes, une analyse SNP par PCR et séquençage direct produira pour chaque position variable connue soit une des quatre bases A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanosine), T (Thymidine), soit une des six combinaison de deux bases différentes, notés communément par les codes issues du standard IUPAC comme R (A+G, puRine), Y(C+T, pYrimidine), K (G+ T, Keto), M (A+C, aMino), S (G+C, Strong bond) et W(A+T, Weak bond). Une analyse SNP ainsi effectué produira une par mis dix valeurs possibles pour chaque position variable, soit à ce jour théoriquement 1 *E20 combinaisons, portant sur 66 positions. Dans la pratique, le nombre de combinaisons est limité par le nombre d'allèles connus. Sachant qu'un individu peut avoir jusqu'à deux allèles, le nombre de combinaisons est en pratique bien en dessous de 1 *E4 combinaisons. L'analyse SNP est représentée par deux valeurs numériques entre 0 et 99 représentant directement l'index de l'entrée dans le dictionnaire des combinaisons connues. Cette représentation possède comme la partie microsatellite une certaine tolérance à l'erreur, dans la mesure où nous sommes capable de calculer une distance pour chaque paire d'entrées dans le dictionnaire. Comme la partie microsatellite, la partie SNP de l'identifiant est rétro-compatible, le dictionnaire sera enrichi au fur et à mesure de l'avancée des connaissances dans le domaine. Des développements en cours permettront sans doute, à terme, par une combinatoire de marqueurs (SNPs, microsatellites...) dispersés dans le génome de l'individu de déterminer l'appartenance à une race, notamment dans le cas des bovins. Selon la méthode décrite ci-dessus, la création d'un dictionnaire de SNPs discriminants des races entre elles, pourra être utilisé pour générer un nouveau constituant de l'identifiant représentatif de cette caractéristique et également rétro-compatible. A titre de réalisation préférée, l'identifiant de 13 valeurs numériques (digits) entre 0 et 99 est représenté par une code barre Code 128 C' selon la norme EAN 128, permettant un codage de jusqu'à 30 digits entre 0 et 99, dans sa variante '90 usage interne ou accord bilatéral'. En complément, un test du sexe de l'animal est effectué et son résultat est représenté comme le 14'é11e digit du code barre. Un test d'identification par PCR d'un fragment spécifique à l'espèce analyse, peut permettre d'ajouter une information relative à l'espèce. A nouveau la codification sera préférentiellement faite par le recours à un dictionnaire des différentes espèces référencés. Un exemple de code barre obtenu par le procédé selon l'invention est représenté sur la figure 4. Dans le cadre de la traçabilité individuelle, deux codes barres sont comparés, reflétant les identifiants générés pour deux prélèvements génétiques, typiquement des cellules de tissues (oreille, viande). Comme la plupart des tests basés sur la statistique, cette comparaison établit une identité avec un certain taux de confiance entre deux prélèvements, ici en fonction de l'équivalence entre digits à positions identiques entre les deux codes. Un digit est dit équivalent si sa valeur est identique au digit à la même position dans l'autre code barre ou si un des deux digits affiche la valeur réservée de 99. Le taux de confiance dépend du nombre de digits équivalent et/ou identiques. Le principe de cette traçabilité individuelle est représenté sur la figure 5. Disposant d'un code barre identifiant la mère et/ou le père d'un bovin, ainsi que le code barre d'un descendent direct prétendant', cette descendance directe supposée peut être vérifiée moyennant comparaison des codes barres. Il est alors possible de dire si le code barre du prétendant peut être un code barre d'un descendant directe, avec une bonne confiance si l'on dispose simplement du code barre du père ou de la mère, avec une très bonne confiance si l'on dispose des deux. La réversibilité partielle du calcul de checksum et le calcul de distance entre entrées du dictionnaire SNP permettent ainsi d'explorer la transmission génétique entre parent et enfant. Il est même théoriquement possible d'effectuer un calcul exhaustif de tous les codes barres que peut avoir la descendance directe d'un père et d'une mère donnée. Revendications 1. Procédé de préparation d'un moyen d'identification spécifique d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de: - prélèvement de l'échantillon biologique à identifier, isolation de l'ADN dudit échantillon, - amplification et analyse des fragments microsatellites de l'ADN isolé et/ou des polymorphismes ponctuels, - codification des longueurs de fragments microsatellites obtenues et/ou des séquences des combinaisons de polymorphismes ponctuels selon un algorithme approprié pour l'obtention du moyen d'identification spécifique à la composition génétique dudit échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'amplification de l'ADN isolé est effectuée par PCR. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'algorithme _de codification est choisi parmi un algorithme de contrôle d'intégrité des données de type checksum , ou un algorithme de compression de données. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'algorithme contrôle d'intégrité des données est l'algorithme modulo 90. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'algorithme de compression de données est un algorithme de codage algorithmique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le moyen d'identification spécifique est une chaîne alphanumérique de moins de 100 éléments (chiffres ou lettres), préférentiellement de moins de 30 éléments. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen d'identification spécifique est une chaîne numérique de moins de 30 chiffres, représentée sous forme de code-barre. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est prélevé sur un organisme vivant, de préférence un animal, plus 30 préférentiellement un animal d'élevage, en particulier bovin. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le moyen d'identification spécifique est comparé dans une banque de données comprenant des moyens d'identifications spécifiques préalablement rassemblés. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le moyen d'identification spécifique d'un échantillon correspondant à un individu est comparé à celui d'un autre échantillon correspondant à un autre individu ou à un même individu, lequel est généré préalablement ou simultanément.