Brevet FR2862980A1 — publié le 20050603

Moyens pour le transport et la conservation de cellules ou tissus vivants L'invention a pour objet des moyens, en particulier des kits, des dispositifs et des méthodes, pour le transport et la conservation de cellules ou de tissus vivants. La commercialisation de cellules sous forme de plaques de culture prêtes à l'emploi nécessite une phase de transport entre le producteur ou le distributeur et l'utilisateur final. La solution technique la plus fréquemment utilisée, et la moins onéreuse, consiste à recouvrir les plaques remplies de milieu de culture d'un film plastique adhésif. Les bulles d'air piégées sous le film, doivent être chassées manuellement à l'aide d'une seringue, dans chaque puits: elles peuvent en effet se retrouver au contact des cellules lors du transport et sont susceptibles de provoquer l'endommagement des cellules. Il faut alors recouvrir la plaque d'un second film plastique adhésif pour boucher les trous faits par la seringue. Ce processus de préparation des plaques pour le transport présente l'inconvénient d'être long et donc peu productif en terme industriel. En outre, l'utilisation des films adhésifs pour rendre étanches les plaques de culture se heurte à différents types de problèmes, tels que les fuites de produits potentiellement toxiques, l'étanchéité du système ne pouvant être garantie. Un autre problème concerne la contamination possible entre les différents puits de la plaque lors du retrait du film adhésif. La contamination inter-puits devient quasi inévitable lors de l'utilisation de plaques de 96 puits ou au-delà. De plus, les cellules placées dans ces conditions survivent difficilement plus de trois jours, ce qui limite la possibilité d'exporter ces plaques sur de longues distances et en particulier sur d'autres continents. Ces divers inconvénients se retrouvent avec d'autres systèmes de bouchage pour le transport, comme les bouchons en plastique ou en caoutchouc. De plus leur prix de revient est élevé, ce qui les rend peu utilisables dans ce secteur industriel. Le transport et la conservation d'organes tels que par exemple les cornées, les artères, la peau, les tumeurs, sont effectués en milieu liquide, dans des flacons fermés hermétiquement par des bouchons. Mais les organes ainsi placés en solution subissent des chocs lors du transport. Ces chocs provoquent la dilacération d'organes mous tels que les amygdales ou les tissus gras, ce qui les rend difficilement exploitables par la personne qui les reçoit. Par ailleurs, les fragments d'organes ne pouvant être orientés de façon précise, il est nécessaire d'utiliser autant de flacons que de fragments à analyser. Il est en effet impossible de différencier plusieurs fragments une fois placés dans un même flacon (ce qui peut être 'le cas par exemple lorsque différents fragments d'organes sont prélevés sur un patient en milieu opératoire et doivent être identifiés pour être analysés). En outre, les fragments d'organes non immobilisés ne peuvent être soumis directement à certaines techniques d'analyse telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM) du fait de leur mouvement en milieu liquide. L'objectif de l'invention consiste en particulier à développer des moyens de transport permettant de rendre le milieu de transport solide. Dans le cas du transport de cellules, l'invention permet d'affranchir le producteur de l'utilisation de films plastiques adhésifs ou autres systèmes de fermeture, ce qui évite ainsi le contact de bulles d'air avec les cellules, les fuites de liquide et la contamination inter-puits. Dans le cas du transport de tissus (organes ou fragments d'organes), la solidification du milieu de transport permet d'immobiliser les tissus. L'invention permet ainsi de réduire les chocs subis par les tissus pendant le transport et de maintenir leur intégrité dans l'attente de leur utilisation. L'invention permet en outre, dans ce cas, la mise en oeuvre de techniques d'analyse médicale nécessitant l'immobilisation des tissus (comme par exemple les analyses en IRM). A cet effet les travaux des inventeurs ont porté sur des hydrogels sous forme de poudre calibrée répondant à des caractéristiques déterminées. Les hydrogels sont des systèmes hydrophiles constitués d'une matrice polymère insoluble mise à gonfler dans un milieu aqueux. Ils sont entre autre définis par leur taux de gonflement (TG) qui est établi comme suit: TG = 100x[(poids de gel humide) - (poids de gel sec)]/(poids de gel sec). On admet que le TG correspond au volume maximum d'une solution aqueuse donnée que l'hydrogel peut absorber. Ce volume est dit volume de gonflement. Dans la présente invention, les hydrogels sont préparés sous forme d'une poudre calibrée déshydratée ou sous forme de pastilles (poudre compressée) . L'adjonction d'une solution physiologique (un milieu de culture cellulaire ou un milieu de transport d'organe par exemple) provoque leur gonflement. En dessous de 90% du TG, les grains de gel sont agglomérés sous une forme compacte. Au delà les grains gonflés commencent à se détacher les uns des autres. Il apparaît une phase liquide excédentaire dans laquelle les grains dissociés sont immergés. Les gels sont utilisés préférentiellement entre 80 et 90% de leur TG. En dessous de 80% les grains de gel sont susceptibles de continuer leur gonflement en prenant l'eau des cellules ou des tissus avec lesquels ils sont en contact, d'où une moindre biocompatibilité. De manière inattendue, de tels hydrogels permettent une survie prolongée de cellules et de tissus, ce qui permet d'assurer un allongement du temps pour leur transport. Dans le cas des tissus, ils permettent de les immobiliser en les encastrant dans la masse des grains entre les grains d'hydrogel gonflés. L'invention vise donc l'utilisation, pour le transport et la conservation de cellules ou de tissus vivants, de polymères susceptibles de former des hydrogels compatibles avec la survie cellulaire. Elle vise également des kits comportant ces hydrogels sous forme d'une poudre calibrée ou de pastille (poudre compactée) 10 prête à être réhydratée avec le milieu. Un autre objet de l'invention porte sur des dispositifs de transport et de conservation de cellules ou de tissus vivants élaborés en utilisant de tels hydrogels. L'invention porte également sur une méthode pour réaliser 15 de tels dispositifs. Conformément à l'invention, le transport et la conservation de cellules en culture et de tissus vivants sont réalisés à l'aide d'hydrogels polymères sous forme de grains, caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués par des polysaccharides hydrophiles, insolubilisés par réticulation, compatibles avec la survie cellulaire, dont le gonflement avec un milieu aqueux est réalisé in situ, sans chauffage préalable. De manière avantageuse, la dissociation de ces grains 25 d'hydrogels peut se faire à température ambiante par simple ajout de milieu liquide. De préférence, lesdits hydrogels sont utilisés entre 80 et 90% de leur taux de gonflement. Les hydrogels de polysaccharides utilisés selon l'invention sont plus spécialement choisis parmi ceux manipulables sous différentes formes compactées, telles des pastilles ou sous forme de poudre, qui permettent une distribution rapide de quantités précises de polymères dans des plaques de culture cellulaire de différents formats (de 6 puits à 96 puits et au-delà) ou dans des récipients pour le transport de tissus vivants, notamment d'organes de différentes tailles. L'invention vise spécialement l'utilisation d'hydrogels de 5 pullulanes pour le transport et la conservation de cellules en culture ou de tissus vivants. D'autres hydrogels de polysaccharides appropriés comprennent les hydrogels de dextrane, ou encore de scléroglucane, de curdlane, et leurs mélanges. L'invention vise en particulier l'utilisation de pullulanes en mélange avec au moins l'un desdits polysaccharides. Les polysaccharides utilisés conformément à l'invention sont éventuellement chimiquement modifiés par des groupes fonctionnels cationiques, neutres, hydrophobes ou anioniques (en particulier par des groupements carboxylates, sulfates ou phosphates). De préférence, lesdits hydrogels de polysaccharides sont réticulés par pontage des liaisons hydroxyle du ou des 20 polysaccharides. L'agent de réticulation et le taux de réticulation sont choisis de manière à disposer d'un matériau répondant aux caractéristiques ci-dessus, notamment en ce qui concerne la compatibilité avec la survie cellulaire. Un agent de réticulation approprié est constitué par exemple par le TMPS (trimétaphosphate de sodium). Les taux de réticulation sont en particulier de l'ordre de 3 à 20 notamment de 5 à 10 Dans une variante, les hydrogels de polysaccharides sont co-réticulés avec des polysaccharides naturels tels que des glycosaminoglycannes (en particulier l'héparine). De manière avantageuse, lesdits hydrogels de polysaccharides sont stérilisables selon les techniques classiques en matière de culture cellulaire et de transport de tissus, et aisément dissociables pour permettre la récupération de cellules ou de tissus vivants et fonctionnels à l'issue du transport. L'invention vise également des kits pour le transport et la conservation de cellules ou de tissus vivants, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un hydrogel de polysaccharide, tel que défini ci-dessus. Avantageusement, de tels kits comportent: É un récipient ou une pluralité de récipients pour les cellules ou les tissus, É au moins un hydrogel de polysaccharide sous forme compactée ou de poudre, É un milieu pour le transport des cellules ou des tissus. Dans le cas de transport de cellules, les kits comportent en outre avantageusement un agent pour la solubilisation des grains d'hydrogel à l'issue du transport et/ou une solution permettant la dissociation des grains. Comme agent de dissociation, on utilise préférentiellement le milieu de transport ajouté au bouchon en excès. Une enzyme spécifique de l'hydrogel à solubiliser, en particulier sous forme d'une solution enzymatique, peut également être utilisée. L'invention vise également des dispositifs pour le transport et la conservation de cellules ou de tissus vivants 25 obtenus en utilisant lesdits hydrogels. Ces dispositifs sont caractérisés en ce qu'ils comportent un récipient ou une pluralité de récipients renfermant les cellules ou les tissus, et un ou plusieurs hydrogels tels que définis ci-dessus, dont le gonflement in situ par un milieu, tel que le milieu de transport, assure le recouvrement des cellules ou des tissus. Pour le transport de tissus vivants, on notera que le tissu, notamment l'organe ou le fragment d'organe, peut être plus ou moins encastré dans les grains d'hydrogel. Une simple addition d'une solution, notamment du milieu de transport, sur l'hydrogel assure la séparation des grains agglomérés et permet de récupérer l'organe ou le tissu. Dans le cas du transport de cellules, on utilise un récipient classique constitué par une plaque multipuits, le bouchon constitué de grains d'hydrogel recouvrant les cellules et évitant ainsi toute fuite. Conformément à l'invention, le recouvrement de cellules ou de tissus par les hydrogels de polysaccharides est réalisé en ajoutant les hydrogels de polysaccharide sous forme compactée (pastille) ou de poudre, dans le récipient contenant les cellules ou les tissus et un milieu de transport en quantité appropriée pour obtenir le gonflement désiré des grains d'hydrogel in situ, sans chauffage. Un mode préféré de réalisation de l'invention pour le recouvrement des cellules, comprend: - l'ensemencement de cellules dans un récipient jusqu'à une confluence de 90 à 100, - l'ajout de milieu de transport en une quantité suffisante pour que le gonflement du polysaccharide assure le recouvrement des cellules par un bouchon constitué de grains d'hydrogel agglomérés, - le dépôt du polysaccharide sous forme compactée ou de poudre, soumis à un traitement préalable de stérilisation, en une quantité appropriée pour obtenir le recouvrement recherché. Le transport peut être effectué avantageusement à température ambiante généralement d'environ 15 à 30 C ou à une température inférieure qui peut être de l'ordre de 4 C. Au moment de l'utilisation, on a recours à une étape supplémentaire consistant à ajouter une solution constituée par exemple par le milieu du transport pour dissocier le bouchon. En variante, on peut ajouter un agent pour la dissolution du gel. La digestion est généralement réalisée en une dizaine de minutes à 37 C. Le délitement des bouchons par excès de milieu ou la solubilisation des grains d'hydrogel par digestion enzymatique, à l'aide d'enzymes spécifiques du polysaccharide, constituent des moyens standards applicables quel que soit le type cellulaire transporté. L'invention est applicable au transport de tissus vivants, en particulier d'organes ou de fragments d'organes tels que cornées, artères, peau, tumeurs, cordons ombilicaux, amygdales, bulbes pilaires, tissus gras. Elle s'applique également au transport de cellules humaines, animales ou végétales. On citera par exemple son utilisation pour le transport de cellules SIRC, des fibroblastes du derme, des kératinocytes de l'épiderme, des cellules endothéliales et des hépatocytes. Les dispositifs réalisés sont notamment utilisables pour des expérimentations chez le client (par exemple les tests de toxicité sur des cornées de porc, les tests cosmétologiques sur des fragments de peau, ou les tests d'irritation oculaire sur des cellules comme le tests PredisafeTM), des greffes sur un patient (par exemple greffes de cornées, d'artères, de peau...), des analyses de tissus prélevés en milieu opératoire (par exemple l'analyse histologique de tumeurs dans un laboratoire distant de l'hôpital). L'invention procure ainsi des moyens appropriés pour la fourniture ou la réalisation de dispositifs de transport de cellules ou de tissus prêts à l'emploi. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent à titre illustratif et en se rapportant aux figures 1 à 5, qui représentent: - La figure 1: une photo de cellules SIRC après un transport selon l'invention. - La figure 2: le % de mortalité cellulaire après test d'un produit cytotoxique sur les cellules transportées selon l'invention ou avec un film. - La figure 3: une photo de cornée de porc transportée selon l'invention. - La figure 4: une photo d'aortes de lapin incluses dans un hydrogel selon l'invention, et - Les figures 5A et 5B: les analyses IRM correspondant à la figure 4. A/ TRANSPORT ET CONSERVATION DES CELLULES 1. Préparation des gels de polysaccharides Pullulane [Polysciences (Polysciences, Warrington, PA, USA; Lot #21115) ou Hayashibara (Hayashibara, Japan; Lot # PI20)]. Dans la suite des descriptions, la mention "pullulane" seule se réfère au pullulane Polysciences, le pullulane Hayashibara étant mentionné explicitement. Dextrane [Sigma D-5251; Lot # 81K1082] Scléroglucane [Carbomer Inc; Cat # 4,00043; Lot # 5- 8787] Carboxyméthyl dextrane CMD (Laboratoire ERIT-M 0204) Carboxyméthyl pullulane CMP (Laboratoire ERIT-M 0204) Héparine [Sanofi; Lot # H-702; activité anticoagulante:159 UI/mg; non fractionnée (15000- 18000 g/mol)] -*Méthode On dépose 2 g de polysaccharide dans le tube, puis on ajoute 4, 3 mL de NaOH à 1M. L'ensemble est placé dans un bain-marie à 25 50 C et sous agitation (10 min). On ajoute ensuite le TMPS (Sigma) selon le taux de réticulation voulu dans le mélange réactionnel. On maintient le milieu sous agitation. Le gel prend en quelques minutes. É Exemple 1: Synthèse de GP4 (5% de TMPS) 10 g de pullulane + 21,5 mL de soude 1M homogénéisation pendant 10 minutes ajout de 5% ( en poids) de TMPS: 0,5 g prise du gel: 2 minutes 30 aspect du gel: rigide et très élastique. É Exemple 2: Synthèse de GPH2 (5% d'héparine, 10% de TMPS) 9,5 g de pullulane + 0,5 g d'héparine + 21,5 mL de soude 1M - homogénéisation pendant 10 minutes ajout de 10% ( en poids) de TMPS: 1 g prise du gel: 1 minute 50 aspect du gel: très rigide -*Récupération du gel Le gel se présente sous forme d'un bloc plus ou moins rigide; on le passe en force à travers un tamis en ajoutant de l'eau bidistillée pour faciliter son passage. Cette étape permet d'optimiser les lavages du gel qui vont suivre. On récupère le gel broyé avant lavages. - Lavages des gels Les lavages sont réalisés dans un tampon neutre PBS (Phosphate buffer saline) à pH 7,4. Le gel récupéré est d'abord broyé, puis on effectue:3 lavages au PBS 1,5 M; 2 lavages au PBS 0,15 M; 2 à 3 lavages au PBS 0,015 M. Au final, on doit atteindre un pH proche de 7,4, chaque lavage est effectué pendant 20 minutes. -> Séchage des gels Les billes de gel obtenues sont séchées dans des mélanges 25 éthanol/PBS 0,015M aux concentrations suivantes: 2 bains éthanol/PBS 0,015 M à 70% d'éthanol 2 bains éthanol/PBS 0,015 M à 50% d'éthanol 1 bain à 100% d'éthanol. Les billes sont ensuite séchées dans une étuve sous vide à 40 C pour évaporer l'alcool, puis tamisées. II. Mise en forme, caractérisation et digestion des gels Les gels sont utilisés sous forme de poudres ou mis en forme de pastilles (grains comprimés). É Taux de gonflement des gels synthétisés Gels simples de pullulane ou de dextrane Le tableau suivant regroupe les taux de gonflement des gels simples mesurés dans le PBS (0,15 M) Gels Composition Taux de Taux de Réticulation gonflement (TR) (TG) 5% GP1 Pullulane 10% 1800% (Polysciences) GP2 Pullulane 3% 3600% (Polysciences) GP3 Pullulane 1% 4000% (Polysciences) GP4 Pullulane 5% 2000% (Polysciences) GPyl Pullulane 10% 3600% (Hayashibara) GPy4 Pullulane 5% 2400% (Hayashibara) GD1 Dextrane 10% 2800% 000g/mol GD2 Dextrane 5% 3600% 000g/mol GD3 Dextrane 10% 3400% 500 000g/mol GD4 Dextrane 3% 4400% 500 000g/mol GD5 Dextrane 5% 4000% 500 000g/mol Gels mixtes Le tableau suivant regroupe les taux de gonflement des gels mixtes mesurés dans le PBS 0,15 M Gels Composition Taux de Taux de Réticulation gonflement (TR) (TG) 5% GPS1 Pullulane: 85% 10% 2000% Scléroglucane: 15% GPS2 Pullulane: 85% 3% 3000% Scléroglucane: 15% GPS3 Pullulane:85% 1% 2200% Scléroglucane: 15% GPS4 Pullulane:95% 10% 3000% Scléroglucane: 5% GPS5 Pullulane: 99% 10% 3300% Scléroglucane: 1% GPS6 Pullulane:70% 10% 2000% Scléroglucane: 30% GPS7 Pullulane: 99% 5% 2000% Scléroglucane: 1% GPCMP1 Pullulane: 90% 1 % 2000% CMP: 10% GPCMP3 Pullulane: 90% 10 % 1600% CMP: 10% GPCMP4 Pullulane: 90% 25 % 1300% CMP: 10% GPCMP5 Pullulane: 90% 50 % 1000% CMP: 10% GPH1 Pullulane: 90% 10% 2800% Héparine: 10% GPH2 Pullulane: 95% 10% 2200% Héparine: 5% GPH3 Pullulane: 99% 10% 4000% Héparine: 1% GPH4 Pullulane: 95% 5% 3000% Héparine: 5% GpyH4 Pullulane 5% 2800% (Hayashibara) : 95% Héparine 5% GPSH1 Pullulane 85% 10% 4000% Scléroglucane: 10% Héparine: 5% GPD1 Pullulane 75% 1% 3000% Dextrane (500 000g/mol) : 25% GPD2 Pullulane: 75% 10% 3000% Dextrane (500 000g/mol): 25% GPD3 Pullulane: 50% 1% 2000% Dextrane (500 000g/mol) : 50% GDH1 Dextrane 10% 2800% (500 000g/mol) : 95% Héparine: 5% Les gels sont gonflés ensuite entre 80% et 90% de leur taux de gonflement pour une bonne tenue mécanique en plaques de 24 et de 96 puits. III. Protocole de formation du bouchon de polysaccharide É MATERIELS ET REACTIFS Plaques 24 ou 96 puits, fibroblastes Plaques Predisafe (Bioprédic) 24 ou 96 puits Plaques 24 ou 96 puits, hépatocytes de rat Plaques 24 ou 96 puits, kératinocytes Solution enzymatique de pullulanase de Bacillus acidopullulyticus (SIGMA):Numéro de produit: P2986; Activité : 441 unités par mL É SYSTEMES D'ESSAI : Les gels sont mis sous forme de pastilles Granulométrie: 100 à 500}gym. Plaques 24 puits: pastille de 13 mm de diamètre, 60 mg (spécifications: ci-dessous). Plaques 96 puits: pastille de 5 mm de diamètre, 8 mg (spécifications cidessous). Poids de Diamètre des Pression Durée de la poudre (mg) pastilles(mm) exercée(tonnes pression(min.) 8 5 3 5 5 3 4 5 2 3 13 2 4 13 3 4 = Les différents types de cellules utilisés sont: Hépatocytes de rats, SIRC (fibroblastes de cornée de lapin), Kératinocytes d'épiderme humain, cellules endothéliales humaines, hépatocytes humains. = Les bouchons de polysaccharides sont dégradés par voie enzymatique: - solution de Pullulanase: Concentration finale: 88 unités/mL. É METHODE = Ensemencement des cellules Décongélation des cellules et ensemencement à JO Observation des cellules et détermination de leur confluence = Mise en place des bouchons sur les cellules confluentes Stérilisation des pastilles: sous UV pour une durée 5 minimale de 15 minutes par face aspiration du milieu de culture introduction d'un volume du milieu de transport correspondant à 80% du TG de l'hydrogel, dépôt des pastilles dans les puits Le tableau suivant regroupe les volumes de milieu de transport à ajouter dans les puits pour obtenir le gonflement de pastilles de différents poids à 80% du TG des hydrogels GPH2 et GP4. Poids de la Volume de Volume de pastille (mg) milieu de milieu de transport (mL) transport (mL) GPH2 GP4 8 0,150 0,200 0,370 0,500 0,750 0,800 0,800 1,000 = Conservation Transport à température ambiante ou à 4 C sur 1 à 4 jours: cellules et bouchons de polysaccharides Présence d'un témoin: Film adhésif (technique actuelle) = Digestion enzymatique des bouchons Utilisation d'une solution de pullulanase à 88 unités/mL diluée dans le milieu de transport. digestion pendant 10 minutes à 37 C. On obtient alors un milieu liquide dont 1 à 2 rinçages au PBS permettent d'éliminer toutes traces de débris de gel. 20 - Distribution des volumes enzymatiques: 1/3 du volume du gel gonflé Le tableau suivant regroupe les volumes de solution enzymatique dans les puits pour obtenir le délitement des 5 pastilles préparées à partir des hydrogels GPH2 et GP4. Poids de la Volume de Volume de pastille (mg) solution solution enzymatique enzymatique (mL) (mL) GPH2 GP4 8 0,059 0,053 0,146 0,133 0,294 0,267 0,440 0,400 Selon l'utilisation souhaitée à ce stade, les cellules sont placées dans un milieu adéquat. On procède par exemple à : - une remise du milieu de culture pour faire des photos de l'état morphologique des cellules, - une coloration HES, MGG pour avoir une analyse histologique, - des test au rouge neutre pour déterminer la viabilité des cellules, des tests fonctionnels pour mesurer la cytotoxicité et le pouvoir irritant oculaire d'un produit cosmétique. IV. Résultats obtenus suivant le type cellulaire É Hépatocytes de rat Les hépatocytes sont ensemencés sur des plaques de 24 puits. Les cellules sont mises en contact des bouchons de pullulane- dextrane (gel mixte), de pullulane et de pullulane hépariné et laissées sur la paillasse à température ambiante pendant 24 heures. Après dégradation enzymatique des gels, les cellules sont observées sous microscope. Les observations de densité cellulaire et de qualité des monocouches sont résumées sur le tableau ci-dessous: 2 h après remise en 20 h après remise en incubateur incubateur Gels Perte de Qualité des Perte de Qualité des cellules cellules cellules cellules Témoin film Non +++ Non +++ GPD2 Oui ++ Oui +++ GPH2 Non + Non +++ GP1 Peu ++ Non + É Cellules SIRC (fibroblastes de cornée de lapin) Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 1. Juste après la digestion, on observe des cellules étalées de J1 à J2, quelques pertes cellulaires à J3 et J4 La coloration May Grunwald Giemsa montre un aspect normal des noyaux. Test au rouge neutre: Pourcentage de viabilité cellulaire Référence: 100% = film à J1; moyenne de 3 expériences J1 J2 J3 GP4 105 10 100 7 91 7 GPH2 95 3 91 4 83 6 Film 100 11 98 8 88 5 Test fonctionnel: test d'une lotion colorante modérément 15 toxique: On rapporte sur la figure 2 le de mortalité des cellules après addition du colorant. Cellules après 1 jour de transport avec les bouchons GPH2, GP4 et le film. L'examen de cette figure montre que les cellules sont fonctionnelles; les bouchons de polysaccharide GP4 et GPH2 sont biocompatibles avec les cellules SIRC et la réponse des cellules dans ce test de cytotoxicité est normale. É Kératinocytes d'épiderme humain -+ Transport en plaque 24 puits Le bouchonnage se fait avec les gels de polysaccharides GP4 et GPH2 sous forme de pastilles de 13 mm (poids: 60 mg, granulométrie: 100 à 500 pm). Les cellules sont conservées 3 jours à température ambiante et à 4 C. La digestion se fait selon le mode opératoire présenté dans la méthode. Observation après digestion: cellules avec une morphologie intacte pour les deux températures de conservation. É Cellules endothéliales humaines -> Transport en plaques 24 puits Le bouchonnage est effectué avec les gels GD4, GD5 et GDH1. Les cellules sont conservées 3 jours à température ambiante. Observation après digestion: cellules avec morphologie intacte. É Hépatocytes humains Les hépatocytes humains ensemencés à confluence sont mis en contact des hydrogels puis conservés pendant 3 jours à température ambiante sur la paillasse (conditions du transport habituel). Après dégradation des gels par une solution de pullulanase à 88 u/ml, la qualité des cellules est observée sous microscope, après digestion et 24 heures après la remise en culture dans un incubateur avec un milieu approprié. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-après: J3 Observation après Observation 24 h digestion après la remise en culture Témoin Film + ++ GPy4 ++ ++ GPH4 ++ ++ GpyH4 ++ + B/ TRANSPORT ET CONSERVATION D'ORGANES 1. Protocole général 5 Matériels et réactifs Plaques 12 puits Cornées de porc Aortes de rat Peau humaine PF4% (paraformaldéhyde à 4%) D-saccharose 4% GP4 (gel de pullulane réticulé à 5% de TMPS) GPH2 (gel de pullulane réticulé à 10% de TMPS et Co-réticulé avec 5% 15 d'héparine) GPyl (gel de pullulane Hayashibara réticulé à 10% de TMPS) GPy4 (gel de pullulane Hayashibara réticulé à 5% de TMPS) GpyH4 (gel de pullulane Hayashibara réticulé à 5% de TMPS et coréticulé avec 5% d'héparine) Milieu de transport de cornées Milieu de transport des aortes Système d'essai = Les gels sont mis sous forme de pastilles de granulosité 100 à 500}gym dans des plaques 12 puits (pastille de 13 mm de diamètre et poids 60 mg) ou sous forme de poudre pour les autres récipients. = Les hydrogels de polysaccharides sont éliminés par un excès de milieu METHODE = Prélèvement des tissus à transporter Prélèvement et dissection des tissus selon les 5 protocoles adaptés Décontamination dans un bain de NaCl à 0,9% et d'antibiotiques Conservation dans le milieu de transport = Mise en place des hydrogels à JO Stérilisation des Pastilles: sous UV pour une durée minimale de 15 minutes par face. Volumes optimaux de gonflement des hydrogels (à 85% du taux de gonflement) Le temps de gonflement des hydrogels varie entre 10 et 20 15 minutes. exemples: gels GPH2 et GP4 Poids des Volume de milieu Volume de milieu pastilles (mg) de transport de transport (mL) (mL) GPH2 GP4 1,8 1,6 2,7 2,6 3,6 3,3 = Conservation Transport à température ambiante: organe et hydrogels de 20 polysaccharides. Présence d'un témoin: Film adhésif (test en parallèle) = Récupération de l'organe Par excès de milieu de transport Distribution du double du milieu introduit pour le gonflement. II. RESULTATS OBTENUS SUIVANT LE TYPE D'ORGANE É CORNEES DE PORC Préparation des pastilles Le gonflement est effectué en deux étapes de manière à encastrer l'organe à transporter à l'intérieur de l'hydrogel: Poids de pastille 100 mg (1 pastille de 60 mg + 1 pastille de 40 mg)Granulosité : 100 à 500}.gym - Forme des pastilles: 13 mm de diamètre. Mise en contact cornées/ gels de polysaccharides On fait gonfler la première pastille de 60 mg dans 1.1 ml de milieu de transport, dès la prise en poids de l'hydrogel, on place la cornée sur l'hydrogel, puis on ajoute 0.7 ml de milieu de transport et on fait gonfler la seconde pastille de 40 mg par dessus. Transport en plaques 12 puits La mise en place de l'hydrogel se fait en 20 minutes. Les cellules sont conservées 3 jours à température ambiante et à 20 4 C. Mise en contact cornées et hydrogels Les résultats obtenus sont illustrés par la photo de la figure 3. Analyses histologiques Bonne conservation en général des cornées jusqu'à J3. Résultats des tests fonctionnels au MTT Expériences réalisées à la périphérie gauche, au centre et à la périphérie droite de la cornée. La référence 100% est le MTT sur la cornée à JO % de viabilité Points de mesures film GPy4 GPyH4 cellulaire Conditionnement Périphérie gauche 38 6 96 12 112 20 J3 Centre 57 13 112 13 82 12 périphérie droite 73 11 128 21 108 14 J6 Périphérie gauche 47 15 115 26 47 9 Centre 41 13 82 12 52 8 Périphérie droite 32 9 106 9 108 9 GPy4: gel de pullulane Hayashibara réticulé à 5% de TMPS GPyH4: gel de pullulane Hayashibara co-réticulé à 5% d'héparine et réticulé à 5% de TMPS É AORTES DE RAT Transport en plaque 24 puits L' hydrogel utilisé est un gel de pullulane Hayashibara à 10% de TMPS (GPyl) et gonflé à 50, 80 ou 90% de son taux de gonflement. Le gel est mis en contact avec l'artère sous forme de 10 poudre de granulosité 38 à 100 pm. Introduction des artères dans le gel Le gonflement se fait en deux temps, dans une plaque de 24 puits, on introduit 2 ml de milieu (sérum physiologique). La moitié de la quantité de poudre nécessaire est introduite dans le puits et gonfle pendant 10 minutes, ensuite on y dépose l'artère. La moitié de poudre restante est versée par dessus. La conservation se fait à 4 C durant 5 jours. Récupération de l'artère L'artère couverte de gel est récupérée à l'aide d'une spatule. Analyses histologiques Le témoin: aorte conservée dans le milieu de conservation présente un endothélium intact L'aorte conservée dans le gel à un taux de gonflement inférieur à 8o% présente un endothélium endommagé (cellules rondes) L'aorte conservée dans le gel à 90% de son taux de 5 gonflement présente un endothélium intact (cellules bien conservées). É AORTES DE LAPIN (POUR ANALYSES IRM) L'hydrogel utilisé est un gel de pullulane à 10% de TMPS (GPyl) et gonflé à 90% de son taux de gonflement. Le protocole est identique au protocole précédent pour l'addition du gel sur les fragments d'organes. Ces fragments proviennent de lapins ayant reçu un marquage avec de nanoparticules métalliques d'oxyde de fer qui marquent les zones inflammatoires (plaques athéromateuses). La détection par Imagerie à Résonance magnétique (1.5 Tesla) est réalisée sur un appareil clinique. Il s'agit d'aortes thoraciques (AT non inflammatoire), Aortes abdominales (AA) après 3 heures (H3), 12 heures (H12) et 5 jours (J5). Tém:témoin non incubé. La figure 4 donne une photo des aortes incluses dans l'hydrogel. Les analyses IRM sont données sur les figures 5A et 5B. Transport à température ambiante sur 5 jours. É EXPLANTS DE PEAU HUMAINE Transport à température ambiante sur 2 jours et 7 jours - Technique de transport et récupération de l'organe Gonflement du gel de polysaccharide au 3/4 de son gonflement maximum. Dépôt de l'expiant: face épiderme contre le gel et face 30 derme dirigée vers l'extérieur Le gel fini de gonfler (jusqu'à 90% de son taux de gonflement) et emprisonne l'épiderme de l'expiant L'expiant est prêt à l'emploi après un rinçage de la face épiderme au PBS - Résultats des tests au MTT Les mesures sont effectuées à J0, J2 et J7. Référence: JO = 100% % de viabilité GPy4 GPH4 GPyH4 Conditionnement J2 93 6 38 6 96 12 J7 104 6 113 5 92 7 GPy4: gel de pullulane Hayashibara réticulé à 5% de TMPS GPyH4: gel de pullulane Hayashibara coréticulé à 5% d'héparine et réticulé à 5% de TMPS GPH4: gel de pullulane Polysciences réticulé à 5% de STMP. REVENDICATION S 1/ Utilisation pour le transport et la conservation de cellules en culture ou de tissus vivants de grains d'hydrogels polymères essentiellement constitués par des polysaccharides hydrophiles, insolubilisés par réticulation, compatibles avec la survie cellulaire, dont le gonflement avec un milieu aqueux est réalisé in situ, sans chauffage préalable. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gonflement des hydrogels est de 80 à 90 % de leur taux de gonflement. 3/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le polysaccharide utilisé pour préparer lesdits hydrogels est le pullulane. 4/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2,caractérisée en ce que les polysaccharides utilisés pour préparer lesdits hydrogels sont choisis parmi les dextranes, le scléroglucane, le curdlane, et leurs mélanges et sont le cas échéant en mélange avec le pullulane. 5/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides sont modifiés par des groupes fonctionnels, cationiques, neutres, hydrophobes ou anioniques, en particulier des groupements carboxylates, sulfates ou phosphates. 6/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits hydrogels de polysaccharides sont réticulés par pontage des groupes hydroxyle du ou des polysaccharides, ou sont co-réticulés avec des polysaccharides naturels tels que des glycosaminoglycannes, en particulier l'héparine. 7/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits hydrogels de polysaccharides se présentent avant gonflement sous forme de pastilles ou de poudre. 8/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les tissus transportés sont des organes ou des fragments d'organes d'origine humaine, animale ou végétale. 9/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les cellules transportées sont des cellules humaines, animales ou végétales. 10/ Kits pour le transport et la conservation de cellules isolées ou de tissus vivants, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un hydrogel de polysaccharides, tel qu'utilisé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11/ Kits selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils comportent: É un récipient ou une pluralité de récipients pour les 15 cellules ou les tissus, É au moins un hydrogel de polysaccharide sous forme compactée ou de poudre et, de préférence, É un milieu pour le transport des cellules ou des tissus. 12/ Kits selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils comportent en outre un agent pour la dissociation de l'hydrogel à l'issue du transport et/ou une solution. 13/ Kits selon la revendication 12, caractérisés en ce que l'agent de dissociation est une enzyme spécifique de l'hydrogel à dissocier. 14/ Dispositifs pour le transport et la conservation de cellules ou de tissus vivants, caractérisés en ce qu'ils comportent un récipient ou une pluralité de récipients renfermant les cellules ou les tissus, recouverts par un hydrogel tel qu'utilisé selon l'une des revendications 1 à 9, obtenu par gonflement in situ dans un milieu tel que le milieu de transport. 15/ Dispositifs selon la revendication 14, caractérisés en ce que les tissus transportés sont des organes ou des fragments d'organes d'origine humaine, animale ou végétale et les cellules transportées sont des cellules humaines, animales ou végétales. 16/ Méthode pour l'élaboration de dispositifs selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend l'addition des hydrogels de polysaccharides tels qu'utilisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, sous forme compactée ou en poudre dans le récipient contenant les cellules ou les tissus et un milieu de transport en quantité appropriée pour obtenir le gonflement désiré de l'hydrogel. 17/ Méthode selon la revendication 16 pour le transport et la conservation de cellules en culture, caractérisée en ce qu'elle comprend: l'ensemencement de cellules, - l'ajout de milieu de transport en une quantité suffisante pour que le gonflement du polysaccharide assure la fermeture étanche du récipient ou le recouvrement des cellules, - le dépôt du polysaccharide sous forme compactée ou de 20 poudre, soumis à un traitement préalable de stérilisation, en une quantité appropriée pour obtenir le recouvrement recherché. 18/ Méthode selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'au moment de l'utilisation, on ajoute un agent pour la dissolution du gel, en particulier une enzyme spécifique de l'hydrogel, ou une solution.