Brevet FR2864549A1 — publié le 20050701

TITRE: Méthode d'ingénierie moléculaire pour l'optimisation de l'expression de protéines recombinantes à haut et bas débit Introduction La production d'une protéine recombinante d'intérêt biomédical ou industriel nécessite toujours le clonage du gène permettant l'expression de la protéine. Cette étape consiste en l'insertion du fragment d'ADN ou d'ADNc contenant le gène d'intérêt dans un vecteur de clonage approprié qui permettra l'expression de la protéine après l'introduction du vecteur résultant dans des cellules hôtes compétentes. Généralement, le clonage de ce fragment d'ADN ou d'ADNc s'accompagne de l'inactivation d'un marqueur (par exemple, lacZ, le fragment alpha-lacZ, galK ou gfp (Messing et al., 1977; Cubitt et al., 1995) pour rapidement identifier les transformants contenant le vecteur recherché. Par ailleurs, l'optimisation du couple cellule hôte/vecteur d'expression est fondamentale pour permettre l'expression d'une protéine recombinante, notamment parce que ce couple est en général spécifique de la protéine (Ikonomou L et al. 2003; Yokoyama S. 2003). La maîtrise de la production d'une protéine recombinante implique donc de pouvoir cloner le gène d'intérêt en parallèle dans différents vecteurs pour cribler l'intérêt de plusieurs couples hôte/vecteur. D'une part, la cellule hôte, procaryote comme Escherichia coli ou eucaryote comme Pichia pastoris ou CHO, est le paramètre clef influençant la production de protéines recombinantes, notamment leur niveaux d'expression, leur fonctionnalité et les modifications post-traductionnelles (Andersen DC, Krummen L. 2002). Le vecteur d'expression doit aussi être adapté à cet hôte pour permettre l'expression des protéines et contenir des éléments (l'origine de réplication, le promoteur, les signaux de terminaison) propres à chacunes des cellules hôtes choisies (in Higgins SJ, Hames,D., 1999). Enfin, pour un hôte donné, la nature du vecteur d'expression influence la production de protéines recombinantes. Dans le cadre de l'expression de protéines dans E. coli, la nature de l'origine de réplication peut ainsi avoir une influence importante sur les niveaux d'expression et de solubilité de la protéine exprimée (Baneyx F, 1999). Un tel constat s'applique aussi aux promoteurs, à la présence d'autres gènes et de séquences polypeptidiques fusionnées à la protéine d'intérêt conférant des propriétés intéressantes (Hammarstrom M et al., 2002). La maîtrise des procédés de production en parallèle ou à haut débit des protéines recombinantes, initiée à la fin des années 90 dans le contexte de la Génomique structurale (Edwards AM et al., 2000) devient actuellement le challenge technologique majeur pour permettre la découverte de nouveaux gènes d'intérêt biomédical ou industriel. En effet, les programmes de séquençage complet des génomes associés aux développement de la Bioinformatique, l'étude du transcriptome et du protéome et plus récemment l'apparition des techniques de si-ARN permettent l'indentification sans cesse croissante de nouveaux gènes d'intérêt. Cependant, la compréhension de leur mode d'action nécessite l'expression de ces gènes en protéines recombinantes en quantité et qualité compatibles avec les analyses biochimiques, biophysiques et enzymatiques ainsi que pour la conception de puces à protéines. La mise au point de procédés d'ingénierie génétique permettant d'assurer le clonage des gènes a été fondamentale pour assurer l'expression des protéines à haut débit. Les techniques de clonage conventionnelles reposant sur l'emploi des endonucléases ne peuvent être appliquées pour le clonage en parallèle de gènes, la séquence d'ADN reconnue par ces endonucléases pouvant être présente dans les gènes ciblés. Pour pallier à ce problème, différentes méthodes existent. II s'agit notamment de méthodes de clonage basées sur des réactions de recombinaison site-spéficique catalysées par des intégrases d'origine phagique (Hartley JL et al.,2000) ou des recombinases telles Rec E/recT (Zhang Y,et al., 2000) ou Cre-loxP (Buchholz F, Bishop M, 2001) ainsi que sur des réactions d'hybridation telles le clonage 'T/A' (Zhou MY, Gomez- Sanchez CE, 2000) ou impliquant l'appariement d'extrémités cohésives générées par l'emploi d'enzymes telles les exonucléases ou l'ADN T4 polymérase (Galvao-Botton LM et al., 2003). Cependant, le développement de nouveaux procédés est central pour tester l'expression dans différents systèmes cellulaires et optimiser la production à haut débit. Description de l'invention L'invention concerne une méthode innovante de production de protéines recombinantes à bas et haut débit dans différents hôtes cellulaires reposant sur l'intégration opérationnelle de cassettes ADN dans des vecteurs d'expression De manière préférée mais non limitative, les expériences de Biologie Moléculaire attenant à l'intégration des cassettes dans un ou plusieurs vecteurs, leur modification et le sous clonage des gènes sont réalisés dans E. coll. Le vecteur est qualifié de vecteur d'expression si tous les éléments nécessaires à l'expression des protéines dans un hôte donné y sont présents. L'intégration de la cassette est dite opérationnelle si le gène cloné dans cette dite cassette peut être traduit en protéine. La cellule recombinante peut être procaryote ou eucaryote, ce qui inclut de façon non limitative les bactéries telles qu' E. coli, les cellules fongiques telles que la levure, les cellules mammifères telles que les lignées de cellules d'origine humaine, bovine, porcine, de singe et de rongeur et les cellules d'insecte. L'extrait in vitro contient tous les facteurs cellulaires nécessaires à la transcription/traduction et peut être de manière non limitative dérivé de lysats cellulaires de E. coli, germe de blé ou réticulocyte de lapins. L'introduction des vecteurs construits en relation avec l'invention permettant de tester l'expression des protéines recombinantes à bas et haut débit dans différents hôtes cellulaires se fera au moyen de techniques telles que la transformation, la transfection, la fusion de protoplasmes ou l'électroporation. La conception des cassettes représente un procédé d'ingénierie génétique innovant pour réaliser la production des protéines recombinantes dans tous systèmes d'expression à haut et bas débit car elle permet de: 1) contrôler directement l'intégration des cassettes dans les vecteurs choisis; 2) sous cloner les gènes d'intérêt quelle que soit leur séquence au moyen d'une méthode unique et efficace, la méthode de clonage ligation independant cloning, LIC (Aslanidis C, de Jong PJ., 1990). 3) vérifier l'efficacité de la réaction de clonage et; 4) apprécier directement l'absence de mutations engendrant l'apparition d'un codon stop la traduction ou le changement du cadre de lecture 5) assurer des avantages pour l'expression des protéines recombinantes. En relation avec l'invention, deux cassettes intégrables, CPX_1 et CPX_2 ont été construites (Figure 1-2). La cassette CPX 1 est composée des éléments suivants (Figure 2): a) deux sites de clonage multiple MCS_1 et MCS_2 permettant l'intégration de la cassette aux extrémités 3' et 5' ; b) un codon ATG de démarrage de la traduction intégré dans MCS_1; c) un gène codant pour un marqueur de sélection, correspondant à MARQ_I compris entre deux sites de restriction ER_3 et ER_4 permettant son excision et/ou son remplacement et le traitement à l'ADN polymérase du phage T4, première étape de la méthode de clonage LIC ; d) deux séquences SEQ ID NO:6 et SEQ ID NO:7 permettant le clonage de l'insert par la méthode LIC; e) Un signal TAAN de fin de traduction en 3' de SEQ ID NO: 7 permettant de décaler le cadre de lecture de MARQ_II par rapport à celui de MARQ_I d'une base. La cassette CPX_2 est composée des éléments suivants (Figure 2): a) deux sites de clonage multiple MCS_1 et MCS_2 permettant l'intégration de la cassette aux extrémités 3' et 5' ; b) un codon ATG de démarrage de la traduction intégré dans MCS_1; c) un gène codant pour un marqueur de sélection: MARQ_I suivi d'un signal TAAN de fin de traduction en 3' et compris entre deux sites de restriction ER_3 et ER_4 permettant son excision et/ou son remplacement et le traitement à l'ADN polymérase du phage T4, première étape de la méthode de clonage LIC ; d) deux séquences SEQ ID NO:6 et SEQ ID NO:7 permettant le clonage de l'insert par la méthode LIC; e) un gène codant pour un marqueur de sélection: MARQ_II compris encadré par deux sites de clonage multiple MCS_6 permettant son excision et l'expression du gène d'interet non fusionné à MARQ_II; f) un site de clonage multiple MCS_5 compris entre SEQ ID NO:7 et MCS_6 permettant le remplacement de MARQ_II; g) un signal TAAN de fin de traduction en 3' de MCS_6 permettant de décaler le cadre de lecture de MARQ_II par rapport à celui de MARQ_l d'une base et dont la perte lors du clonage de l'insert engendre l'apparition d'une fusion traductionnelle entre ledit insert et MARQ_II. De manière préférée de l'invention, les cassettes CPX_1 et CPX_2 présentent respectivement les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3telles que décrites dans les figures 3 et 4. Dans la cassette SEQ ID NO:1, les sites de restriction reconnus par les endonucléases Ncol (CCATGG) et HindIll (AAGCTT) correspondent respectivement à MCS_1 et MCS_2, le codon ATG de démarrage de la traduction étant inclu dans le site de restriction reconnu par Ncol. Le site de restriction reconnu par l'endonucléase Mfel (CAATTG) correspond à ER 3 et ER_4. La séquence SEQ ID NO:6 comprend 12 nucléotides dont les 9 derniers ne peuvent être qu'A, T ou G et le premier ne pouvant être que G, de préférence 5'-GGGCATCACCAT. La séquence SEQ ID NO:7 comprend 9 nucléotides dont les 8 derniers ne peuvent être qu'A, T ou G et le dernier ne pouvant qu'être C, de préférence 5'-GATGGTGAC. Le gène codant pour la green fluorescent protein (gfp) correspond à SEQ ID NO: 2. La séquence TAAG correspond à TAAN (Figure 1). Dans la cassette CPX 2, les éléments différents ou ajoutés par rapport à la cassette SEQ ID NO:1 sont les suivants (Figure 2). Le site de restriction reconnu par l'endonucléase Xhol (CTCGAG) correspond à MCS_5. Les gènes codant pour le fragment alpha de la betagalactosidase (lacZ) et la gfp correspondent respectivement à SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5 (Figure 2).. Le site de restriction reconnu par l'endonucléase Notl (GCGGCCGC) correspond à MCS_6. Dans un premier temps, les cassettes sont intégrées dans le ou les vecteurs choisis au moyen des technologies de Biologie Moléculaires classiques décrites dans Sambrook et al. (1989) et connues de l'homme de l'art. Le vecteur choisi est linéarisé par une ou deux enzymes de restriction appropriée. Les sites de restriction sont localisés de telle manière que l'ATG des cassettes correspond au site d'initiation de la traduction pour réaliser leur intégration de manière opérationnelle. Par exemple, dans le cas d'un vecteur d'expression dans E. coli, la séquence ATG devra être localisée à une distance appropriée d'un site de fixation aux ribosomes en aval d'un promoteur (in Higgins SJ, Hames,D., 1999). Par ailleurs, les endonucléases utilisées pour le clonage reconnaissent les séquences contenues dans MCS_1 et MCS_2. Ces séquences sont présentes aux extrémités 5' du gène ou introduites par amplification par PCR. Dans ce cas, les oligonucléotides utilisés présentent à leur extrémité 5' la séquence des sites de restriction contenus dans MCS_1 et MCS_2. Une fois le vecteur et les cassettes digérés par les enzymes appropriées, ils sont mis en présence de la T4 DNA ligase pour catalyser la réaction de ligation. Le mélange de ligation sert à transformer une souche d' E. coli compétente. Après étalement sur milieu gélosé et en présence éventuelle d'inducteur, la présence de Marq_I permet de repérer l'intégration opérationnelle de la cassette au sein du vecteur d'expression par simple visualisation du changement de phénotype des colonies. Ainsi, il n'est pas nécessaire de recourir à l'extraction de l'ADN et son analyse par profil de restriction ou séquençage. Cet avantage lié à l'invention provient du fait que le cadre ouvert de lecture de MARQ_I est en phase avec la séquence ATG de la cassette. La méthode de clonage du gène d'intérêt retenue pour l'invention est la méthode LIC ligation independant cloning qui est fondée sur l'appariement d'extrémités cohésives générées par l'emploi de l'ADN T4 polymérase (Aslanidis C, de Jong PJ., 1990). Dans cette méthode de clonage, le vecteur linéarisé et les gènes d'intérêt comprennent les séquences complémentaires de 10-20pb à leur extrémité. Ces dernières sont traitées avec une ADN polymérase, présentant une activité 3' -5' exonucléase, de manière préférée, l'ADN T4 polymérase, en présence d'un dNTP spécifique (par exemple dCTP pour le vecteur linéarisé et dGTP pour le gène). Ce traitement a pour conséquence un arrêt de l'activité 3' -5' exonucléase au site d'incorporation de ce dNTP situé à l'extrémité 3' des séquences complémentaires. Il en résulte ainsi la formation de séquences simples brins 5' sortantes cohésives pour le vecteur et l'insert dont le simple appariement permet de réaliser la réaction d'appariement de manière directionnelle. En relation avec l'invention, l'insertion des gènes en suivant la méthode LIC est réalisée en respectant les étapes suivantes. En relation avec l'invention, les cassettes présentent des sites de restriction ER_3 et ER_4 encadrant MARQ_I. La digestion par les enzymes de restriction choisies permet d'une part de linéariser le vecteur et de rendre accessible à l'action de la T4 ADN polymérase les séquences SEQ ID NO:6 et SEQ ID NO:7. De manière préférée, les sites de restriction sont reconnus par des endonucléases libérant l'extrémité 5' telle que Mfel pour favoriser la fixation de la T4 ADN polymérase (Aslanidis C, de Jong PJ., 1990). Dans le cadre de l'invention, la linéarisation des vecteurs s'accompagne de la perte du marqueur de sélection Marq_l de telle sorte que les vecteurs circulaires non accessibles à la T4 ADN polymérase sont facilement repérés. L'action de l'ADN polymérase T4 est réalisée en présence de dGTP de telle manière que l'activité 3' -5' exonucléase stoppe au premier C rencontré. D'une manière préférée, il en résulte deux brins 5' sortant; 5' AATTGATGGTGATGAT correspondant à la séquence inversée complémentaire des 9 derniers nucléotides de SEQ ID NO:6 additionné au site ER_3 clivé et 5' AATTGGATGGTGA correspondant au site ER_4 clivé et aux 8 premiers nucléotides de SEQ ID NO:7. Dans la présente invention, le gène codant pour la protéine d'intérêt doit comprendre des séquences particulières pour permettre son clonage par la méthode LIC. La séquence du gène doit comprendre à son extrémité 5', une séquence codante, SEQ ID NO: 8, identique aux 9 dernières bases de SEQ ID NO:6 et au site de restriction ER_3 ainsi qu'à son extrémité 3', une séquence codante, Correspondant à SEQ ID NO: 9 identique au site de restriction ER_4 et aux 8 dernières bases de SEQ ID NO:7. De manière préférée, la séquence SEQ ID NO: 8 est 5'-CATCACCATCAATTG et la séquence SEQ ID NO: 9 5'- CAATTGGATGGTGA. En relation avec l'invention, le gène que l'on cherche à cloner doit comprendre directement ou après amplification par PCR ces séquences. Dans ce dernier cas, les oligonucléotides utilisés pour la réaction PCR contiennent la séquence homologue à SEQ ID NO: 8 (oligonucléotide direct) ou la séquence inversée complémentaire à Correspondant à SEQ ID NO: 9 (oligonucléotide inverse) à leur extrémité 5'. L'action de l'ADN polymérase T4 est réalisée en présence de dCTP de telle manière que l'activité 3' -5' exonucléase stoppe au premier G rencontré. D'une manière préférée, il en résulte deux brins 5' sortant; 5'CATCACCATCAATT correspondant aux 14 premiers nucléotides de SEQ ID NO: 8 et 5'-TCACCATCCAATT correspondant à la séquence inversée complémentaire des 13 derniers nucléotides de SEQ ID NO: 9. En relation avec la méthode LIC les vecteurs et les gènes d'intérêt ainsi traités sont purifiés par des techniques de Biologie Moléculaire classiques décrites dans Sambrook et al. (1989) et connues de l'homme de l'art telles que le gel d'agarose ou la précipitation au PEG 1500 puis mis en présence de telle façon à favoriser l'hybridation entre les séquences cohésives générées dans le cadre de l'invention. Ce mélange d'hybridation sert à transformer une souche d'E. coli compétente. Après étalement sur milieu gélosé et en présence éventuelle d'inducteur, la conception des cassettes permet de visualiser les colonies positives de manière avantageuse en relation avec l'invention. D'une part, lors du clonage des gènes d'intérêt dans les vecteurs traités contenant les cassettes CPX 1 ou CPX_2, la possibilité de visualiser MARQ_l, présent dans les cassettes CPX 1 et CPX_2 permet de repérer directement les colonies contenant les vecteurs circulaires dont la présence interfère avec l'efficacité de la méthode de clonage LIC. D'autre part, les méthodes de criblage en relation avec l'invention permettent soit de garantir l'intégration dans le vecteur (criblage négatif), soit de garantir l'intégration opérationnelle (criblage opérationnel), c'est-à-dire que le gène cloné peut être traduit en protéine (figure 1). La méthode de criblage négatif repose sur le changement de phénotype des colonies lié à la disparition de Marq_I présent dans les cassettes CPX 1 et CPX 2. Dans un mode préféré de l'invention, les colonies sont soit fluorescentes sous excitation sous lumière bleue (cassette SEQ ID NO:1), soit blanches en présence de X-gal (cassette SEQ ID NO:3). Le fait que cette méthode ne repose pas sur l'inactivation de Marq_I mais sur sa disparition exclut toute possibilité de présence de faux-négatifs. La méthode de criblage opérationnel repose sur le fait que l'organisation de la cassette CPX 2 garantit que le gène cloné dispose bien de la phase ouverte de lecture prédite. Ce criblage est possible du fait de la présence du marqueur présent à leur extrémité 3', MARQ_II. Avant préparation du vecteur contenant CPX_2 et l'intégration du gène d'intérêt, le gène marqueur MARQ_II ne peut être traduit. En effet, une séquence stop (TAAN) a été introduite en amont de MARQ_II pour interrompre la traduction débutant à la séquence ATG d'initiation de traduction présente dans cette cassette. Par ailleurs, le cadre de lecture de MARQ_II est différent de celui donné par la séquence ATG d'initiation de la traduction présent dans cette cassette. Une fois le gène intégré selon la méthode de clonage LIC en relation avec l'invention, ce dernier se retrouve en fusion traductionnelle avec MARQ_II. Ainsi, si il n'y a pas de changement de cadre de lecture 2864549 7 ou d'apparition de codon stop, les cellules transformées par de tels vecteurs disposeront d'un phénotype lié à l'expression de MARQ_II. Dans un mode préféré de l'invention, les colonies sont fluorescentes sous excitation sous lumière bleue lorsque le gène intégré dans la cassette CPX_2 dispose bien de la phase ouverte de lecture prédite. L'invention fournit donc ici une méthode qui permet de cribler les gènes pour lesquels leur traduction en protéine est a priori possible, ce qui est innovant notamment dans le contexte de l'expression des protéines à haut débit. Cette dernière méthode est aussi avantageuse car elle permet de réduire le nombre d'étapes et de contrôles qualité connus de l'homme de l'art telles que le séquençage de l'insert ou la méthode de criblage colony blot (Bussow K et al. 1998) nécessaires pour aboutir à ce résultat. La conception des cassettes permet d'intégrer des éléments apportant des propriétés supplémentaires intéressantes dans le cadre de la production et de la purification des protéines recombinantes. En particulier, il est possible d'introduire au sein des cassettes des éléments pouvant être spécifiques à une protéine donnée pour en optimiser sa production et sa purification. D'une part, la présence de MCS_1 permet d'intégrer différents gènes en fusion avec le gène d'intérêt pour en optimiser son expression ou la purification. Dans un mode préféré de l'invention, les cassettes SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 disposent en aval du site reconnu par l'endonucléase Ncol une séquence codant pour une étiquette hexa histidine qui permet la purification des protéines produites selon la méthode (IMAC). De manière non limitative, ces gènes peuvent être des gènes codant pour des épitopes reconnus par des anticorps (étiquette T7, c-myc), des protéines d'affinité telles la protéine de liaison à la chitine (protéine chitin-binding domain), la cellulose (protéine dellulose-binding domain) ou l'amylose (protéine maltose-binding protein ou à la biotine, la protéine FLAG, l'étiquette Strep-tag, le peptide de liaison à la calmodulin, des protéines solubilisantes telles que la thioredoxine, NusA ou des protéines et polypeptides permettant leur translocation telles ompA ou pelB. Les présences de MCS_5 et de MCS_6 permettent d'intégrer le marqueur MARQ_II le plus approprié dans le contexte de l'expression du gène d'intérêt. Ainsi, selon la nature du marqueur, en plus du cadre de lecture, le niveau de production, la solubilité et le niveau de dégradation peuvent être contrôlés. De manière non limitative, MARQ_II peut coder pour des gènes dont l'expression est visualisable directement par tests colorimétriques, enzymatiques ou par émission de fluorescence. II peut s'agir du S-tag, la GFP (green fluorescent protein) ou DsRed (red fluorescent protein), la CAT acetyltransferase, la beta-galactosidase entière ou le fragment alpha, la secretin alkaline phophatase ainsi que la luciferase. MARQ_II peut aussi correspondre à des protéines agissant sur la viabilité des cellules. Il s'agit des gènes connus de l'homme de l'art codant pour la résistance aux antibiotiques ou des protéines toxiques telles que par exemple les endonucléases (e.g. Dpnl), les gènes induisant l'apoptose (e.g. ASK1 ou les membres de la famille of the bcl- 2/ced-9), les défensines telles que NP-1, ou les protéines toxiques en absence d'antidote tels que kicB or ccdB. Enfin, MARQ_II peut correspondre à des protéines apportant des propriétés supplémentaires intéressantes dans le cadre de la production et de la purification, tel que intégrés par le biais de MCS_1. Enfin, du fait de la présence de MCS_6, MARQ_II peut aussi être excisé à l'aide d'endonucléases par simple digestion suivie d'une réaction de ligation intramoléculaire. Cette possibilité offerte par l'invention est avantageuse car elle permet de produire la protéine d'intérêt en l'absence de la protéine rapporteuse sans avoir recours à des protéases pour en assurer le clivage. Les cassettes CPX_1 et CPX_2 permettent ainsi la production de protéines d'interet par leur intégration dans tout vecteur eucaryote ou procaryote se propageant dans des cellules hôtes respectivement eucaryotes ou procaryotes. De façon préférée les cellules hôtes eucaryotes sont sélectionnées dans le groupe constitué par: pFastBac, pFastBac HT, pFastBac DUAL, pSFV, pTet-Splice, pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pB1101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA, YACneo, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, p3'SS, pXTI, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1 neo, and pOG44, pYES2, pAC360, pBlueBacHis, pVL1392, pBlueBaclll, pCDM8, pcDNA1, pleoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4, and pEBVHis et les cellules hôtes procaryotes sont sélectionnées dans le groupe constitué par: pcDNA II, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHis, pRSET, pGEMEX-1, pGEMEX-2, pET, pTrc99A, pKK223-3, pGEX, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pKK233-2, pKK388-1, pProEx-HT, pIVEX. Les protéines ainsi produites peuvent être des anticorps thérapeutiques (i.e. protéine se liant à des cibles d'intérêt pharmacologique), des protéines cibles d'intérêt pharmacologique, des protéines utilisés comme additifs dans l'industrie alimentaire, des enzymes utilisées dans des procédés industriels ou des protéines utilisés pour le diagnostic. Légendes des fiqures Figure 1: Description schématique du procédé Figure 2: Description de l'organisation des cassettes CPX_1 et CPX_2 Figure 3: Séquence SEQ ID NO: 1 Figure 4: Séquence SEQ ID NO: 3 Figure 5: Résultat du double criblage Figure 6: Analyse des tests d'expression. Gels Nu-PAGE 4-12%. Coloration au bleu de Coomassie. M: Marqueur de poids moléculaire, NI: Culture non induite, I: Culture induite Figure 7. Analyse des tests d'expression de PBP et GT réalisés à 15C et 37C sur Gels Nu-PAGE 4-12%. Après coloration au bleu de Coomassie. 5A) : Fraction protéines totales; 5B) Fraction protéines solubles. M: marqueur de poids moléculaire; 1: GT1_Sp; 2: GT_Sa; 3: GT_Ef; 4: PBP_Rd; 5: GT_Rd; 6: STG_Sa; 7: GT1_Sp; Les flèches indiquent la position des protéines Exemples: Exemple 1: Construction, vectorisation et propagation des cassettes SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 dans différents vecteurs d'expression Cet exemple illustre la construction des cassettes SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 ainsi que la facilité de leur intégration dans un ou plusieurs vecteurs grâce à la présence d'un marqueur de sélection en utilisant les méthodes classiques de Biologie Moléculaire décrites par Sambrook et al. (1989). La cassette SEQ ID NO:1 (Figure 1) a été crée en amplifiant par PCR le gène codant pour la GFP (Green fluorescent protein) portée par le vecteur pEGFP (Clontech) à l'aide de l'ADN polymérase Taq-HIFI (Invitrogen) et du couple d'oligonucléotides suivant: 5'- ATACATCCATGGCTCATCACCATCACCATCACGGGCATCACCATCAATTGGTGAGCAAGGGC GAGGAGCTGTTC (primer direct) et 5'ATATGGATCCTTAGTCACCATCCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (primer reverse). Le produit PCR obtenu est alors digéré par Ncol+clonage puis inséré dans le pET15b (Novagen) clivé par les mêmes enzymes. Après transformation de E. colt Novablue (DE3) (Novagen) avec le mélange de ligation, étalement sur LB+ampicilline (100 glmL)+IPTG, le vecteur, pLX01, contenant la cassette SEQ ID NO:1 est isolé par simple visualisation des colonies fluorescentes sous lumière bleue. La propagation de la cassette SEQ ID NO:1 ainsi vectorisé est alors réalisée soit: 1) par ligation directe du produit PCR digéré Ncol+clonage dans tout vecteur au préalable clivé par les mêmes enzymes. Cette méthode a été utilisée pour générer à partir des vecteurs pQE60 (Qiagen), et pET_DUET (Novagen), les vecteurs pLX02 et pSF05a 30 (Tableau 1) ; 2) par amplification PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides suivants 5'-gggCATCACCATCAATTg (primer direct) et 5'- gTCACCATCCAATTg (primer reverse) présentant en amont des sites de restriction spécifiques au vecteur de destination choisi. Une telle approche a été choisie pour cloner la cassette SEQ ID NO:1 dans pMAL C2x digéré Ndel+clonage et obtenir le vecteur pLX06 (Tableau 1). 3) Par sous-clonage de la cassette SEQ ID NO:1 déjà vectorisée. Cette méthode a été utilisée pour transférer du pLX02, la cassette SEQ ID NO:1 dans le vecteur pQE80 (Qiagen) en employant les enzymes EcoRl+clonage et obtenir ainsi pLX03 (Tableau 1). Dans ces différents exemples, l'intégration de la cassette est contrôlée après transformation de E. 40 colt par le mélange de ligation par visualisation des colonies fluorescentes. 2864549 10 La cassette SEQ ID NO:3 a été crée en deux étapes (Figure 2). Dans une première étape, le gène codant pour la GFP (Green fluorescent protein) portée par le vecteur pEGFP (Clontech) a été amplifié par PCR à l'aide de l'ADN polymérase Taq-HIFI (Invitrogen) et du coupled'oligonucléotides suivant: 5'GATCATCCATGGAATTCCCTCGAGGCGGCCGCAGGTAGCGCTGGCTCC GCTGCTGGTTCTGGTGAGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC (primer direct) et 5'AGACGGGATCCATT ATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (primer reverse). Le produit PCR a alors été digéré par Ncol+clonage puis inséré dans le vecteur pLX03 digéré par ces mêmes enzymes pour obtenir le vecteur pSF03. Dans une seconde étape, le gène codant pour le fragment a-lacZ porté par le vecteur pMaLc2x (New England Biolabs) a été amplifié par PCR à l'aide de l'ADN polymérase Taq-HIFI (Invitrogen) et du couple d'oligonucléotides suivant: 5' - ATACATCCATGGCTCATCACCATCACCATCACGGGCATCACCATCAATTG TCACTGGCCGTCGTTTTACAACG (primer direct) et 5'- TAGCCGCTCGAGGTCACCATCCAATTGATTACAGGCGCCATT CGCCATTCAGGCTG (primer reverse). Le produit PCR a alors été digéré par Ncol+Xhol puis inséré dans le vecteur pSF03 digéré par ces mêmes enzymes afin obtenir le vecteur pSF04 contenant la cassette SEQ ID NO:3 (Fig 2). Tableau 1: famille des vecteurs générés par intégration des cassettes SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 Nom du vecteur Cassette intégrée Vecteur porteur PLXOI SEQ ID NO:1 pET15b PLX02 SEQ ID NO:1 pQE60 PLX03 SEQ ID NO:1 pQE80 PLX06 SEQ ID NO:1 pMAL C2X PSFO4 SEQ ID NO:3 pQE80 PSF05a SEQ ID NO:1 pETDUET Exemple Il: Clonage en parallèle de gènes par le biais des cassettes SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 Cet exemple illustre la possibilité liée à l'invention des cassettes et SEQ ID NO:3 de pouvoir cloner en parallèle un ou plusieurs gènes dans différents vecteurs. Un même gène codant pour la protéine TIMP a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN polymérase Taq-HIFI (Invitrogen) à l'aide des oligonucléotides suivants: 5'- CATCACCATCAATTGATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG et 5'- TCACCATCCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTC CATGCCGAG. Les caractères en gras représentent respectivement les séquences SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9 nécessaires au clonage par la méthode LIC. Les produits PCR sont purifiés sur gel d'agarose à l'aide du système NucleoSpin Extract (Macherey Nagel). Afin de pouvoir cloner ce produit PCR par la méthode LIC, 0,2 pmol du produit de PCR purifié est traité par l'ADN polymérase en présence de 2,5 mM de dCTP 30min à 22 C avant d'inactiver l'enzyme en chauffant 20 min à 75 C. En parallèle, deux vecteurs d'expression, pLX01 et pLX02, sont digérés à l'aide de l'enzyme de restriction Mfel pour exciser l'insert portant SEQ ID NO:6. Les vecteurs pLX01 et pLX02 sont alors purifiés sur gel d'agarose à l'aide du système NucleoSpin Extract (Macherey Nagel) puis traités par l'ADN polymérase en présence de 2,5 mM de dGTP 30min à 22 C avant d'inactiver l'enzyme en chauffant 20 min à 75 C. La réaction d'hybridation se déroule en mélangeant à 0,01 pmol de chaque vecteur, 0,02 pmol d'insert dans un volume réactionnel de 3 NI, puis après 5 min d'incubation à 22 C, en ajoutant 1 pl d'EDTA 25 mM. Après une seconde incubation de 5 min à 22 C, la totalité de la réaction d'hybridation sert à transformer E. coli DH5-alpha. Les résultats du comptage du nombre de colonies ainsi que de l'analyse du profil de restriction réalisé sur 5 clones différents sont résumés dans le tableau 2. Tableau 2: Résultat de clonage de TIMP dans PLX01 et PLX02 Taux d'insertion clone Nombre de colonies (testés dur 5 clones) PLXOI+ TIMP 224 100% PLX02+TIMP 373 80% PLXOI 0 ND PLX02 10 ND Le nombre élevé de clones ainsi que le taux d'insertion >80% montrent qu'une fois vectorisée, la cassette SEQ ID NO:1 permet une insertion en parallèle dans différents vecteurs d'expression. En suivant le protocole décrit précédemment, les gènes codant pour la maltose-binding protéine, la dihydrofolate réductase, le fragment alphalacZ de la béta-galactosidase ainsi que pour la Gluthatione S-transférase (GST) ont été clonés dans le vecteur d'expression pLX02. Au préalable, ces gènes ont été amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques auxquelles ont été ajouté aux extrémités 5' les séquences 5'CATCACCATCAATTG (oligonucléotide direct) et 5'-TCACCATCCAATTG (oligonucléotide reverse). Après clonage des différents produits PCR dans pLX02 en suivant la méthode LIC, le mélange réactionnel est transformé dans E. coli DH5- alpha. Les colonies obtenues sont alors comptées sous lumière fluorescente pour visualiser les clones possédant pLX02 sans insert (colonies fluorescentes). Parmi les clones non fluorescents, 20 furent choisis pour extraire l'ADN plasmidique. L'analyse du profil de digestion montre que plus de 80% des vecteurs contiennent l'insert sélectionné (Tableau 3). Tableau 3: Résultat de clonage des différents gènes dans PLX02 Taux d'insertion construit Nombre de colonies (Testé sur 20 clones) PLX02+ DHFR 400 90% PLX02+GST 2000 100% PLX02+alpha-LacZ 2000 100% PLX02+ MBP 500 85% PLX02 190 ND Ces résultats montrent que l'utilisation des cassettes décrites dans l'invention permet un clonage en parallèle de gènes dans tous vecteurs choisis au préalable. Par ailleurs, l'intégration des cassettes de l'invention ne nécessite pas de méthodes spécifiques autres que celles décrites par Sambrook et aI. (1989). La facilité d'intégration de ces cassettes est enfin améliorée par la présence d'un marqueur qui permet d'en visualiser le succès directement sur boîte. Exemple III: Double criblage des résultats de clonage Cet exemple illustre l'un des avantages liée à l'invention de la cassette SEQ ID NO:3, à savoir de pouvoir isoler dès la phase de clonage, l'insertion d'un gène codant pour une phase ouverte de taille équivalente à la taille théorique: Le gène codant pour la gluthatione S-transférase (GST) a été amplifié par PCR à partir du pGEX-2T (Amersham Bioscience) à l'aide des oligonucléotides 5'-CATCACCATCAATTG TCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGG et 5'TCACCATCCAATTGATCCGATTTT GGAGGATGGTCGCC. Les caractères en gras représentent respectivement les séquences SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9 nécessaires au clonage par la méthode LIC. Le produit PCR obtenu est alors traité par l'ADN polymérase T4 en présence de dCTP. En parallèle, le vecteur d'expression pSF04 comportant la cassette SEQ ID NO:3 est linéarisé par Mfel, purifié sur gel d'agarose puis traité par l'ADN polymérase T4 en présence de dGTP. Après insertion du produit PCR dans psF04 en suivant la méthode de clonage LIC, E. colt DH5-alpha est transformé avec le mélange réactionnel puis étalé sur LB+ ampicilline (100 tg/mL) en présence de 1 mM IPTG et 4mM Xgal. Après incubation à 37C, la double visualisation de colonies bleues et de colonies fluorescentes sous excitation à la lumière bleue est possible (Figure 3). Ce double criblage permet en une seule étape de: 1) différentier les clones contenant le vecteur pSF04 sans insert (colonies bleues) des clones contenant le vecteur psF04 ayant intégré le gène codant pour GST (colonies blanches) 2) isoler les clones contenant le vecteur pSF04 pour lesquels le gène amplifié par PCR a été intégré et code pour une phase ouverte de lecture de taille correspondant à celle du gène (colonies fluorescentes). Les digestions de I 'ADN plasmidique extrait à partir de trois colonies différentes, confirment les résultats de cette double méthode de criblage, à savoir l'absence d'insert pour les colonies bleues et leur présence pour les colonies fluorescentes. Le séquençage de l'ADN plasmidique de l'un des clones fluorescents confirme bien que le gène cloné correspond à la phase ouverte complète de la GST. Par ailleurs, des tests d'expression ont été effectués à partir des trois clones précédents. Pour chaque clone, une colonie isolée a été mise en culture à 37 C dans 10 mL de LB. L'induction de l'expression de la protéine a été effectuée avec 1mM IPTG pendant 2h. Les extraits protéiques totaux ont été séparés sur gel d'acrylamide Nu-PAGE 4-12% dont l'analyse a été effectuée par coloration au bleu de Coomassie (Figure 4). Cette dernière montre que l'induction par l'IPTG s'accompagne de l'expression d'une protéine de masse molaire apparente 59 kDA qui est proche de la masse molaire théorique de la fusion GST-GFP (56.0 kDA). Cette méthode de criblage des résultats au niveau traductionnel par l'emploi d'un gène rapporteur tel que défini dans l'invention permet donc de s'assurer que le gène code pour une protéine de taille entière. Exemple IV: Expression des protéines Cet exemple illustre la possibilité liée à l'invention des cassettes de pouvoir cloner en parallèle plusieurs gènes afin de réaliser l'expression des protéines à haut débit. L'étude s'est intéressée à différents gènes codant pour des penicillin binding proteines entières (PBP) ou pour les domaines catalytiques correspondant (GT) ainsi que pour deux transglycosidases (STG ou MTGA) provenant de différents microorganismes (Tableau 3). Les 21 gènes correspondant ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de ces différents microorganisme à l'aide d'oligonucléotides spécifiques à chaque séquence ciblées dont les extrémités 5' comportaient les séquences 5'-CATCACCATCAATTG (oligonucléotide direct) et 5'TCACCATCCAATTG (oligonucléotide reverse). Les produits PCR obtenus ont alors été traités par l'ADN polymérase T4 en présence de dCTP et clonés dans le vecteur PLX02 préalablement traité par la méthode LIC. E. soli DH5-alpha est transformé avec le mélange réactionnel puis étalé sur LB+ ampicilline (100 gg/mL) en présence de 1 mM IPTG. Le résultat de la transformation est indiqué dans le tableau 3. L'extraction de l'ADN plasmidique, réalisé sur 4 colonies non fluorescentes, montre que l'emploi de la cassette SEQ ID NO:1 permet d'assurer en une seule étape, une insertion de tous les gènes ciblés avec un taux de succès d'au moins 50%. Des tests d'expression à 37 C et 15 C ont été réalisés avec chacun des vecteurs selon une méthodologie haut débit. Après transformation des différents vecteurs Tableau 4: Résultats de clonage des différents gènes codant pour les PBP et des tests d'expression associés. Nom du Nombre Nombre de %Taux de Protéines Protéines de d'intégration Microorganisme clones (testés sur 4 gène clones totales solubles totaux fluorescents colonies non fluorescentes) GT1_Sp 9825 224 75 X X PBP1_Sp Streptococcus 4125 112 100 X GT2_Sp pyogenes SF370 9450 120 100 X PBP2_Sp 3975 212 75 X GT_Sa Staphylococcus 2700 72 75 X PBP_Sa aureus MU50 4575 140 75 X X GT_Ef Enterococcus 2775 76 75 X X PBP_Ef faecalis V583 2700 360 50 GT_Lm Listeria 5325 160 50 X PBP_Lm monocytogenes 4b 1350 68 50 X GT Hp 10000 200 75 X Helicobacter pilori 11925 240 50 X PBP_Hp GT Tm 7800 176 50 Thermotoga maritima PBP_Tm 7800 280 75 X GT1 Te 4425 320 75 PBPI_Te Thermotophilus 1425 224 100 GT2_Te elongatus 3225 184 100 PBP2_Te 4650 280 75 G1Rd Deinococcus 13425 120 50 X X PBP_Rd radiodurans 6225 84 100 X X STG_Sa Staphylococcus 3825 80 75 X X aureus MTGA_Nm Neisseria menigitis 9300 300 100 X Bibliographie Andersen DC, Krummen L. (2002). 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Méthode de production de protéines recombinantes selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend: - l'amplification optionnelle de la cassette CPX_1 ou CPX 2 par PCR à l'aide d'oligonucléotides présentant des sites de restriction présent dans le vecteur. - l'intégration opérationnelle de la cassette CPX_1 ou CPX_2 dans les vecteurs choisis - la ligation du gène d'intérêt à l'aide de la T4 DNA ligase - la sélection des cellules d'E. cou transformées par les vecteurs ayant intégré le gène d'intérêt - transformation dans les souches d'expression à l'aide du vecteur ayant intégré le gène d'intérêt 3. Méthode de production de protéines recombinantes selon la revendication n 1 ou 2 caractérisée en ce que ledit vecteur est i. un vecteur eucaryote se propageant dans des cellules hôtes eucaryotes de préférence sélectionné dans le groupe constitué par: pFastBac, pFastBac HT, pFastBac DUAL, pSFV, pTet-Splice, pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pB1121, pDR2, pCMVEBNA, YACneo, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232- 8, p3'SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1 neo, and pOG44, pYES2, pAC360, pBlueBacHis, pVL1392, pBlueBaclll, pCDM8, pcDNA1, pleoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4, and pEBVHis; ou bien ii. un vecteur procaryote se propageant dans des cellules hôtes procaryotes (vecteur procaryote) de préférence sélectionné dans le groupe constitué par: pcDNA ll, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHis, pRSET, pGEMEX-1, pGEMEX-2, pET, pTrc99A, pKK223- 3, pGEX, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pKK233-2, pKK388-1, pProEx-HT, pIVEX. 4. Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que les cassettes intégrables CPX_1 utiles à la mise en oeuvre du procédé sont composées de: a) deux sites de clonage multiple MCS_1 et MCS_2 permettant l'intégration de la cassette; b) un codon ATG de démarrage de la traduction indus dans MCS_I; c) un gène codant pour un marqueur de sélection: Marq_I compris entre deux sites de restriction ER 3 et ER_4 permettant son excision et/ou son remplacement et le traitement à l'ADN polymérase du phage T4; d) deux séquences en 5' et 3' de l'insert permettant son clonage par la méthode ligation independant cloning (LIC), e) un signal TAAN de fin de traduction en 5' de Marq_II permettant de décaler le cadre de lecture de MARQ_II par rapport à celui de MARQ_I d'une base. 5-- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 et 2 caractérisées en ce que les cassettes CPX_2 utiles à la mise en oeuvre du procédé sont composées de: a) deux sites de clonage multiple MCS_1 et MCS_2 permettant l'intégration de la cassette; b) un codon ATG de démarrage de la traduction inclus dans MCS_1; c) un gène codant pour un marqueur de sélection MARQ_I suivi d' un signal TAAN de fin de traduction en 3' et compris entre deux sites de restriction ER_3 et ER 4 permettant son excision et/ou son remplacement et le traitement à l'ADN polymérase du phage T4; d) deux séquences en 5' et 3' de l'insert permettant son clonage par la méthode ligation independant cloning (LIC), e) un gène codant pour un marqueur de sélection: MARQ_II encadré par deux sites de clonage MCS_6 permettant son excision et l'expression du gène d'intérêt non fusionné à MARQ_II. f) un site de clonage multiple MCS_5 situé en 3' de MCS_6, g) un signal TAAN de fin de traduction en 5' de MCS_6 permettant de décaler le cadre de lecture de MARQ_II par rapport à celui de MARQ_I d'une base et dont la perte lors du clonage de l'insert engendre l'apparition d'une fusion traductionnelle entre ledit insert et MARQ_II. 6- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications n 4 et 5 caractérisée en ce que les sites de clonage multiple, MCS_1, MCS_2, MCS_5 et MCS_6 sont représentés par un ensemble de séquences spécifiques d'enzymes de restriction de préférence contenant le site de restriction reconnu par l'enzyme Ncol qui inclue la séquence ATG d'initiation de la traduction, pour MCS_1 - le site de restriction reconnu par l'enzyme BamHl pour MCS_2 - le site de restriction reconnu par l'enzyme Xhol pour MCS_5, et - le site de restriction reconnu par l'enzyme Notl pour MCS_6, 7-, Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications n 4 et 5 caractérisée en ce que les séquences ER_3 et ER_4 sont reconnues par des enzymes de restriction générant des extrémités 5' sortante de préférence ces séquences sont reconnues par l'enzyme Mfel. 8- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 4 à 7 caractérisée en ce que Marq_I est un marqueur de sélection permettant de repérer l'intégration opérationnelle de la cassette CPX_1 ou CPX_2. 9- Méthode de production de protéines recombinantes selon tes revendications 5 à 7 caractérisée en ce que MARQ_II est un marqueur de sélection permettant de garantir l'intégration opérationnelle du gène d'interet ainsi que l'absence de codon stop ou un décalage du cadre de lecture, de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les protéines S-tag, la GFP (green fluorescent protein) correspondant à ta séquence SEQ tD NO: 5 ou DsRed (red fluorescent protein), CAT acetyltransferase, la beta- galactosidase entière ou le fragment alpha, la secretin aikaline phophatase ainsi que la luciferase, protéines de résistance aux antibiotiques, protéines induisant I'apoptose (e.g. ASK1 ou members de la famille of the bcl-2/ced-9), protéines toxiques en absence d'antidote (kicB or ccdB), les defensins (NP-1) 10- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 4 à 5 caractérisée en ce que la séquence 5' permettant le clonage de l'insert par la méthode LIC dans les cassettes intégrables est une séquence codante comprenant 12 nucléotides dont les 9 derniers ne peuvent être qu'A, T ou C et le premier ne pouvant qu'être G, de préférence SEQ id NO: 6 correspondant à 5'-GGGCATCACCAT. 11- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 4 à 5 caractérisée en ce que la séquence 3' permettant le clonage de l'insert par la méthode LIC dans les cassettes intégrables est une séquence codante comprenant 9 nucléotides dont les 8 derniers ne peuvent être qu'A, T ou G et le dernier ne pouvant qu'être C, de manière préférée SEQ ID NO:7 correspondant à 5'-GATGGTGAC. 12- Méthode de production de protéines recombinantes selon tes revendications 1 à 11 caractérisée en ce que les cassettes CPX_1 et CPX_2 correspondent aux séquences SEQ ID 30 NO: 1 et SEQ ID NO: 3. 13- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 12 caractérisée en ce que le gène cloné dans le vecteur comprend - directement ou après amplification par PCR, une séquence codante composée à son extrémité 5' des 9 dernières bases de SEQ ID NO:6 et du site de restriction ER_3, de préférence la séquence SEQ ID NO: 8 correspondant à 5'-CATCACCATCAATTG, les séquences soulignées correspondant au site de restriction reconnue par Mfel et, - directement ou après amplification par PCR, une séquence codante composée à son extrémité 3' du site de restriction ER_4 et des 8 premières bases de SEQ ID NO:7, de préférence la séquence SEQ ID NO: 9 correspondant à 5'- CAATTGGATGGTGA, les séquences soulignées correspondant au site de restriction reconnue par Mfel. 14- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 13 caractérisée en ce que les oligonucléotides utilisés pour la réaction PCR contiennent la séquence homologue à SEQ ID NO: 8 (oligonucléotide direct) ou la séquence inversée complémentaire à SEQ ID NO: 9 (oligonucléotide reverse) à leur extrémité 5'. 15- Méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 14 caractérisée en ce que l'expression de la protéine est réalisée dans différents systèmes caractérisés en ce que lesdits systèmes sont - des cellules recombinantes, procaryote ou eucaryote, ce qui inclut de façon non limitative les bactéries telles qu' E. coli, les cellules fongiques telles que la levure, les cellules mammifères telles que les lignées de cellules d'origine humaine, bovine, porcine, de singe et de rongeur et les cellules d'insecte, et - des extraits in vitro contenant tous les facteurs cellulaires nécessaires à la transcription/traduction et peut être de manière non limitative dérivés de lysats cellulaires de E. coli, germe de blé ou réticulocyte de lapins. 16- Méthode de production de protéines recombinantes selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'introduction des vecteurs construits dans les cellules se fait au moyen de techniques telles que la transformation, la transfection, la fusion de protoplasmes ou l'électroporation. 17- Cassettes intégrables CPX 1 telles que décrites dans les revendications 1 à 16 utiles à la mise en oeuvre de la méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 16. 18- Cassettes intégrables CPX_2 telles que décrites dans les revendications 1 à 16 utiles à la mise en oeuvre de la méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 16. 19- Les protéines produites par la mise en oeuvre de la méthode de production de protéines recombinantes selon les revendications 1 à 16, de préférence des anticorps thérapeutiques (i.e. protéine se liant à des cibles d'intérêt pharmacologique), des protéines cibles d'intérêt pharmacologique, des protéines utilisés comme additifs dans l'industrie alimentaire, des enzymes utilisées dans des procédés industriels ou des protéines utilisés pour le diagnostic.