Brevet FR2865034A1 — publié le 20050715

Le domaine technique de l'invention est celui des marqueurs biologiques de la dégradation des tissus cartilagineux. La présente invention concerne plus particulièrement des procédés d'évaluation de la dégradation des tissus cartilagineux et leur mise en oeuvre, notamment, dans des méthodes de diagnostic, de suivi et de détermination d'un pronostic de pathologies des tissus cartilagineux. Les pathologies des tissus cartilagineux se traduisent notamment par une dégradation des tissus cartilagineux. Le collagène de type II est le constituant protéique principal des tissus cartilagineux et est spécifique de ces tissus. Le collagène de type II est synthétisé par les chondrocytes sous forme de procollagène comprenant des propeptides N et C terminaux de part et d'autre du corps du collagène. Lors du clivage des propeptides qui se réalise naturellement in vivo lors de la maturation du collagène, le collagène mature sécrété par les chondrocytes a pour structure un domaine en triple hélice contenant trois chaînes al qui sont bordées du côté N et C terminal par trois chaînes telopeptidiques qui ne sont pas en triple hélice. Ces télopeptides ont pour fonction de pontage intramoléculaire entre les fibrilles de collagène. La dégradation du collagène de type II est réalisée par des collagénases (MMP1, MMP8 et MMP13) (Billinghurst et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. J. Clin. Invest.1997, 99: (1534-45). Un site caractéristique de coupure par les collagénases est situé dans le domaine en triple hélice du collagène de type II entre les résidus 775 et 776, qui génère 2 fragments de 3/4 et de la longueur du collagène intact. Ces deux fragments ont un poids moléculaire de 75 et 25 kDa (pour une chaîne). Des anticorps reconnaissant la partie C-terminale du fragment Co12-3/4 et la partie N-terminale du fragment Co12-1/4 ont été développées (Hollander et al. Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay. J. Clin. Invest. 1994, 93: 1722-32). Il a été démontré que l'épitope du Co12-3/4 et non pas l'épitope du Co12-1/4 se retrouvait dans la circulation (Croucher and Hollander. Differential detection of type II collagen N- terminal and C-terminal denaturation epitopes in degrading cartilage.1999. Mol. Pathol. 52, 323-31). Des immuno-dosages pour la détection de l'épitope du Co12-3/4 ont été mis au point (US patent 6132976). Des fragments plus petits du collagène de type II générés par des protéolyses successives peuvent être filtrés plus facilement dans les liquides biologiques, plus particulièrement lors de la filtration rénale. L'un des objectifs de la présente invention est de fournir des procédés d'évaluation de la dégradation du collagène de type II utilisant de nouveaux marqueurs de sa dégradation et leur mise en oeuvre pour le diagnostic d'une pathologie des tissus cartilagineux, le suivi d'évolution d'une telle pathologie, le pronostic pré-symptomatique d'une telle pathologie, l'évaluation de l'efficacité d'un traitement thérapeutique administré pour lutter contre une pathologie des tissus cartilagineux, l'évaluation de la toxicité vis à vis des tissus cartilagineux d'un traitement thérapeutique et la prédétermination de l'évolution d'une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu atteint d'une telle maladie. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence de nouveaux marqueurs biologiques spécifiques de la dégradation du collagène de type II. Ces marqueurs sont issus de la dégradation de la partie 3/4 située dans la région en triple hélice de la chaîne al du collagène de type II. Les inventeurs ont montré l'intérêt du dosage de tels marqueurs dans les liquides physiologiques, et en particulier dans les urines, pour le diagnostic et le suivi, notamment, de pathologies des tissus cartilagineux. La présente invention a notamment pour objet un procédé d'évaluation de la dégradation des tissus cartilagineux d'un individu à partir de la détection in vitro dans un échantillon biologique provenant de l'individu, du niveau d'au moins un marqueur spécifique de la dégradation des tissus cartilagineux, le(s) marqueur(s) spécifique(s) détecté(s) étant un fragment de dégradation du collagène de type II, issus de la dégradation de la séquence en acides aminés SEQ ID N 2 de la chaîne al du collagène de type II située dans la région en triple hélice, ces dits fragments de dégradation comprenant au moins quatre acides aminés consécutifs présents dans le peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3, éventuellement modifié posttraductionnellement. Les différentes définitions données ci-après aident à comprendre la description 30 de l'invention. Par marqueur spécifique de la dégradation du collagène de type II, on entend un fragment protéique issu de la dégradation du collagène de type II et dont la détection permet d'être directement corrélée au niveau de dégradation du collagène de type II. Par pathologie des tissus cartilagineux, on entend les désordres associés aux processus cataboliques des tissus cartilagineux, du cartilage de croissance et des disques intervertébraux. Les désordres associés au processus cataboliques des tissus cartilagineux sont par exemple des différents types d'arthrites comme la polyarthrite rhumatoïde, l'arthrose, l'arthrite psoriasique, la goutte, l'arthrite induite par Yersinia, l'arthrite pyrophosphate, l'arthrite septique ou les désordres liés aux disques intervertébraux comme les maladies dégénératives des disques ou les spondyarthropathies. Les désordres du cartilage de croissance incluent notamment la maladie de Kashin-Beck, l'acromégalie et le nanisme. Par individu, on entend un animal ou, de préférence, un être humain, susceptible d'être atteint d'une pathologie des tissus cartilagineux, atteint d'une pathologie des tissus cartilagineux, qui est ou a été sous médication pour traiter une pathologie et notamment une pathologie des tissus cartilagineux. Par échantillon biologique, on entend un liquide corporel ou fragment de tissu extrait d'un individu. Cet échantillon biologique peut être choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, la sueur, la lymphe, les larmes, le liquide synovial, les tissus, les cellules, les surnageants de cultures tissulaires ou cellulaires, et de préférence l'urine et le sérum. Par stade destructeur d'une pathologie des tissus cartilagineux, on entend un stade de la pathologie dans lequel la dégradation des tissus cartilagineux peut être constatée par radiographie, résonance magnétique, résonance magnétique nucléaire, ultrasons, scanner. L'invention met en évidence que la détection dans un échantillon biologique d'un individu de certains fragments de dégradation du collagène de type II donne des informations spécifiques sur l'état de dégradation des tissus cartilagineux. Les inventeurs se sont particulièrement intéressés aux fragments de dégradation de la partie du collagène de type II de séquence SEQ ID N 2. Plus spécifiquement, les inventeurs se sont intéressés aux fragments de dégradation comprenant au moins quatre acides aminés consécutifs présents dans le peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3. En particulier, l'invention utilise la détection des fragments de dégradation comprenant la séquence SEQ ID N 3 en totalité et encore plus particulièrement le fragment de dégradation de séquence SEQ ID N 3, nommé Helix-II. Les fragments de dégradation comprenant la séquence SEQ ID N 3 peuvent être définis par la formule générale suivante: (Xaa)m-ERGETGP-Hyp-GTS-(Xaa)n dans laquelle Hyp est la 4-hydroxyproline, m et n représentent indépendamment des entiers compris entre 1 et 10 et Xaa est un acide aminé ou dérivé d'acide aminé issu de la dégradation de la séquence SEQ ID N 2. Après traduction, le collagène de type II peut subir des modifications, lors de sa maturation. Par exemple, les acides aminés de la SEQ ID N 3 peuvent subir des modifications post-traductionnelles, telles que, entre autres, la citrullination (arginine devient citrulline), 1'hydroxylation (proline devient l'hydroxyproline), la chloration (arginine ou lysine ou tyrosine deviennent chloro-argininine, chlorolysine et chlorotyrosine), la nitration (tyrosine devient la nitrotyrosine), la glycation (oxydation des lysines par des oses)... Dans ce cas, l'invention visera à détecter les fragments de dégradation 15 comprenant au moins quatre acides aminés consécutifs du peptide Helix- II mais dont un ou plusieurs acides aminés a été modifié posttraductionnellement. Les méthodes de détection de la présence d'un marqueur utilisées selon l'invention peuvent être quantitatives ou qualitatives. Notamment, la détection peut être effectuée par une technique de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), par fluorescence, par spectroscopie aux ultraviolets, par détection électrochimique ou par les techniques d'analyse protéomique ou microarray . De façon avantageuse, la détection consiste à mettre en contact l'échantillon biologique avec des anticorps, fragments d'anticorps ou analytes dirigés contre le marqueur à détecter, puis à détecter leur liaison avec le marqueur par une technique immunologique, de préférence choisie parmi la technique ELISA, les techniques immun- enzymatiques, les techniques d'immunofluorescence, les techniques radio- immunologiques, les techniques chemo-immunologiques et les techniques d'analyse protéomique. Ces différentes techniques de détection sont bien connues de l'homme de l'art. Pour les techniques immunologiques, on pourra se référer à Diamandis et Cristopoulos, Immunoassay, Academic Press, San Diego 1996, notamment les pages 579 et suivantes. Pour les techniques d'analyse protéomique, on pourra notamment se référer à Urbanowska et al. Development of protein microarray technology to monitor biomarkers of rheumatoid arthritis disease. Cell Biol. Toxicol., 2003 19(3):189-202 et à Glokler and Angenendt. Protein and antibody microarray technology. Journal of chromatography B, 2003 797(1-2): 229-240. Des anticorps monoclonaux, polyclonaux ou anticorps humanisés incluant les fragments Fc, Fab, les anticorps chimériques ou tout autre fragment d'anticorps antigène-spécifique pourront être utilisés. Selon un aspect de l'invention, on utilisera, pour la détection des fragments de dégradation, des anticorps se liant à un épitope dont au moins un acide aminé appartient au fragment de dégradation correspondant au peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3, ou au peptide Helix-II dont un ou plusieurs acides aminés a été modifié post-traductionnellement et préférentiellement à un épitope contenu dans la séquence SEQ ID N 3, éventuellement modifiée posttraductionnellement. Par épitope, on entend le site situé sur la séquence peptidique avec lequel l'anticorps vient se lier. Un épitope est généralement constitué d'un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Dans ce contexte la présente invention a également pour objet les anticorps se liant à un épitope contenu dans les séquences SEQ ID N 3, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6 ou SEQ ID N 7 notamment. Les anticorps se liant à un épitope contenu dans la séquence SEQ ID N 3 sont néanmoins préférés. Les anticorps selon l'invention peuvent être monoclonaux ou, de préférence, polyclonaux. La production de ces anticorps se fait selon les méthodes standard, bien connues de l'homme du métier et décrites notamment par Harlow et Lane en 1988 et Kôhler et Milstein en 1975 dans Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975, 256(5517):495-7. En particulier, on préparera par exemple selon les synthèses peptidiques classiques, les marqueurs à détecter que l'on couplera à une protéine dite carrier qui est préférentiellement la KLH (Keyhole limpet hemocyanine) ou l'albumine bovine ou humaine sérique, l'ovalbumine, la thyroglobuline ou toute autre protéine carrier comme l'edestine, la toxoïde tétanique ou cholérique, les polyaminoacides comme la poly-D-Lysine-D-acide glutamique. Ce couplage sera réalisé via une cystéine, une glutaraldéhyde, ou un carbodiimide par exemple. Cette séquence couplée permet alors l'immunisation de souris, rat, lapin, poulet, ou tout autre individu permettant la production d'anticorps. Les anticorps au sens de l'invention seront qualifiés de spécifiques car ils reconnaissent les fragments de dégradation du collagène de type II contenant au moins 4 acides aminés consécutifs présents dans le peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3, mais pas le collagène de type II intact. La présente invention a également pour objet les trousses de dosage d'un fragment de dégradation du collagène de type II comportant un anticorps tel que défini ci-dessus. Ces trousses de dosage combinent des réactifs et instructions pour pouvoir mener le dosage du fragment de dégradation. De plus, dans le cadre de l'invention, il a été montré l'intérêt de doser les marqueurs selon l'invention dans les urines pour le suivi, le diagnostic, le pronostic de pathologies des tissus cartilagineux et en particulier de l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde et la spondylarthrite. En effet, plus la pathologie est avancée, plus le niveau de marqueurs détectés est élevé, traduisant une augmentation de la dégradation du collagène de type II et donc des tissus cartilagineux. De plus, plus le risque de destruction du cartilage est élevé, plus le niveau de marqueurs détectés est élevé. Plus précisément, la présente invention a également pour objet un procédé pour diagnostiquer une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu mettant en oeuvre un procédé d'évaluation tel que défini cidessus. De façon avantageuse, le niveau de marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence caractéristique de l'absence de pathologie. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé pour suivre l'évolution d'une pathologie des tissus cartilagineux d'un individu atteint d'une pathologie des tissus cartilagineux mettant en oeuvre un procédé d'évaluation tel que défini précédemment. De façon avantageuse, le niveau de marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence, correspondant par exemple au niveau obtenu pour un stade prédéterminé de la pathologie. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé pour pronostiquer de façon pré-symptomatique une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu mettant en oeuvre un procédé d'évaluation tel que défini précédemment. De façon avantageuse, le niveau de marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence établi chez des individus de même âge et de même sexe, sans pathologie ou à un stade prédéterminé de la pathologie. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé pour prédéterminer l'évolution d'une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu atteint d'une telle maladie mettant en oeuvre un procédé d'évaluation tel que défini précédemment. De façon avantageuse, le niveau des marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence correspondant à un niveau seuil représentant l'absence de la pathologie ou représentant un stade prédéterminé de la pathologie. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer l'efficacité d'un médicament administré à un individu pour traiter une pathologie des tissus cartilagineux mettant en oeuvre un procédé d'évaluation tel que défini précédemment. De façon avantageuse, le niveau des marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence obtenu avant le début du traitement. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer la toxicité vis à vis des tissus cartilagineux d'un traitement administré à un individu mettant en oeuvre un procédé tel que défini précédemment. De façon avantageuse, le niveau des marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence obtenu avant le début du traitement. Les résultats obtenus par les inventeurs ont également montré que les marqueurs selon l'invention étaient spécifiques de la dégradation du collagène de type II et qu'ils étaient en corrélation avec ceux obtenus avec un autre marqueur connu de séquence SEQ ID N 4, développé par Nordic Bioscience A/S, nommé CTX-II ou Cartilaps. De plus, la détection des marqueurs selon l'invention permet d'obtenir des informations complémentaires de celles obtenues avec d'autres marqueurs du cartilage, notamment le CTX-II. Par conséquent, au sens de l'invention, il est avantageux de détecter, dans l'échantillon biologique de l'individu, au moins deux marqueurs spécifiques de la dégradation du collagène de type II. En plus d'un marqueur selon l'invention, on détectera le marqueur de SEQ ID N 4 ou tout autre marqueur de dégradation ou de la synthèse des tissus cartilagineux notamment ceux de la synthèse du collagène de type II c'est-à-dire des propeptides C-terminaux (appelé PIICP) ou N-terminaux (des formes IIA ou IIB du procollagène de type II appelé PIIANP et PIIBNP, Garnero et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum., 2002 46(10) : 2613-24). En particulier, on détectera, dans l'échantillon biologique de l'individu, à la fois le niveau de HelixII et le niveau de CTX-II de séquence SEQ ID N 4. Les parties intitulées METHODES et RESULTATS donnés ci-après, en référence aux figures annexées, illustrent l'invention. La Fig. 1 est la courbe standard type de l'ELISA dosant le peptide HelixII. La Fig. 2 illustre la spécificité des anticorps polyclonaux préparés visà-vis de l'Helix-II, par rapport à d'autres peptides synthétiques et visà-vis du collagène de type II humain intact. La Fig. 3 montre la corrélation entre 2 marqueurs de la dégradation des tissus cartilagineux chez 82 sujets contrôlés et 89 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde: - le marqueur de la chaîne al du collagène de type II: Helix-II - le marqueur du C- telopeptide du collagène de type II: CTX-II. La Fig. 4 montre la concentration en Helix-II (ng/mmol de créatinine urinaire) chez des adultes contrôles sains (n=85) chez des patients atteints d'arthroses du genou (n=90) et chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (n=89). La Fig. 5 montre le niveau de progression de la destruction des tissus cartilagineux en fonction de la combinaison de la mesure de l'excrétion urinaire de l'Helix-II et du CTX-II (n est le nombre de patients). A. METHODES 1. Préparation du peptide synthétique La préparation des peptides synthétiques peut être réalisée selon les techniques largement décrites dans la littérature scientifique. Le peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3, dérivé de la séquence a-helix de la chaîne alpha I du collagène de type II (numéro d'accession dans GenBank: P02468) a été produit par la technique de synthèse peptidique sur phase solide en utilisant un blocage réversible de l'amine de l'acide aminé par le Fmoc (9- fluorénylméthyloxycarbonyl). La pureté du peptide a été vérifiée par HPLC et par spectrométrie de masse. Le peptide servant d'immunogène, synthétisé avec une cystéine supplémentaire du côté N-terminal, a été couplé du côté N-terminal à une protéine porteuse qui est la KLH (keyhole limpet hemocyanine) ce qui va permettre une meilleure réponse immunologique vis-à-vis de ce peptide. Le peptide synthétique destiné à être adsorbé sur les microplaques a été couplé à la biotine (Harlow, E., Lane, D. Antibodies: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988: 72-87) . 2. Préparation des anticorps polyclonaux Les lapins ont subi une injection par voie intra-péritonéale du peptide conjugué à la KLH émulsifié avec de l'adjuvant complet de Freud. Cette opération a été répétée 3 fois pendant trois mois en utilisant le même peptide avec de l'adjuvant incomplet de Freud. Après chaque injection, un échantillon de sang de lapin a été prélevé. On a laissé coaguler ce sang pendant 30 min et le tout a été centrifugé pendant 10 min à 2500 rpm pendant 10 min afin de récupérer le sérum. Dix jours après la dernière injection, les lapins ont été sacrifiés et tout le sang a été récupéré. Chaque prélèvement sérique a été titré par technique ELISA en présence du peptide de séquence SEQ ID N 3 couplé à la biotine. L'antisérum avec le meilleur titre a été sélectionné pour la mise au point de l'ELISA de compétition (Harlow, E., Lane, D. Antibodies: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988a: 92-120). 3. Titration des antisérums Les titres des antisérums ont été réalisés en adsorbant le peptide conjugué à la biotine dilué avec du tampon de coating sur des plaques avidinées 2h à température ambiante. Après lavage, 100 l d'antisérums dilué du 1/100 au 1/1000000 sont ajoutés à 100 l de tampon de dilution dans les puits et sont mis à incuber pendant une nuit à 4 C. Après lavage, 100 gl de tampon d'anticorps secondaire couplé à la peroxydase et dirigé contre les immunoglobulines de lapins sont ajoutés pendant une heure à température ambiante. Les puits sont lavés et 100 gl de substrat (TMB) sont ajoutés. La réaction est stoppée avec 100 l d'H2SO4. 4. ELISA de com. étition. our le. e. tide a-helix de la chaîne alpha 1 du collagène de type II Le peptide conjugué à la biotine dilué avec du tampon de coating est adsorbé sur des plaques avidinées 2h à température ambiante. Après lavage, 100 id d'antisérums dilués au titre optimal sont ajoutés à 100 gl de standard (peptide de séquence SEQ ID N 3 dilué dans du tampon) ou à 100 gl d'échantillons à doser et sont laissés à incuber pendant une nuit à 4 C. Après lavage, 100 l de tampon d'anticorps secondaire couplé à la peroxydase et dirigé contre les immunoglobulines de lapins sont ajoutés pendant une heure à température ambiante. Les puits sont lavés et 100 l de substrat (TMB) sont ajoutés. La réaction est stoppée avec 100 pl d'H2SO4. 5. Patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, d'arthrose et sujets contrôles Nous avons sélectionné 89 patients qui présentaient les critères de polyarthrite rhumatoïde (PR) définis par l'American College of Rheumatology (Arnett FC et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for classification of rheumatoid arthritis 1988; 31:315-324). Ces patients font partie d'une étude plus large multicentrique en double aveugle comparant l'efficacité de l'etanercept et du methotrexate chez 632 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde débutante (Bathon JM et al. A comparison of etanercept and methotrexate in patients with early rheumatoid arthritis. N Engl J Med 2000; 343: 15861593 Garnero P et al. Association of Baseline Levels of Urinary GlucosylGalactosyl-Pyridinoline and Type II Collagen C-Telopeptide are associated with Progression of Joint Destruction in Patients with Early Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum, 2002. 46(1):21-30). Les 89 patients avaient un âge supérieur à 18 ans, ne présentaient pas d'autres maladies, étaient atteints de PR depuis moins de trois ans et n'ont pas été traités avec le methotrexate. Afin de recruter les candidats à haut risque de progression, les patients devaient être en phase active de maladie c'est-à-dire lors de leur recrutement ces patients avaient plus de 12 articulations sensibles et plus de 10 articulations gonflées. Ces patients présentaient également un taux de facteur rhumatoïde positif et aussi 3 érosions osseuses visibles radiologiquement au niveau des mains, des poignets ou des pieds. Les traitements anti-rhumatismaux pris par les patients tels que l'hydroxychloroquinone et le sulfasalazine ont été interrompus 4 semaines avant le début de l'étude. Les traitements avec des doses fixes de corticostéroïdes et les anti-inflammatoires non stéroïdiens ont été permis. Les doses de corticosteroïdes ne pouvaient pas excéder 10 mg de prednisone par jour. Parmi les 89 patients de cette étude, 33 recevaient une dose de methotrexate qui s'échelonnait de 7,5 à 20 mg par semaine pendant les 8 premières semaines de l'étude, 28 recevaient 10 mg d'etanercept en sous-cutané 2 fois par semaine et 28 patients 25 mg, pendant 1 an. Les caractéristiques des patients atteints de PR au départ de l'étude sont présentées dans le Tableau 1. Pour tous les patients, la seconde miction urinaire a été collectée lors de la visite de base. 90 patients atteints d'arthrose selon les critères de l'ACR et appartenant à une étude randomisée ont été étudiés. Les critères d'inclusion sont les suivants: ^ Hommes ou femmes adultes âgés de plus de 50 ans. ^ Confirmation clinique de l'arthrose du genou depuis au moins 3 mois avant l'étude et diagnostiqué selon les critères de l'American College of Rheumatology (ACR). Les sujets sélectionnés avaient pour critères principaux d'inclusion: Douleur dans ou autour du genou la plupart du temps. raideur matinale > 30 minutes. des crépitations lors de mouvements actifs. Des ostéophytes du genou confirmés radiologiquement de grade 2 ou 3 (c'est-à-dire >1 et 50 mm sur une échelle analogue visuelle de 100 mm. En ce qui concerne les contrôles, les valeurs de référence des marqueurs biologiques ont été obtenues chez 82 sujets sains âgés de 26 à 80 ans (82% de femmes, moyenne d'âge 52 15 ans). Tous ces individus étaient sains et n'étaient atteints d'aucune maladie et ne prenaient aucun traitement qui pouvait interférer le métabolisme de l'os ou de l'articulation incluant le traitement hormonal substitutif pour les femmes ménopausées. Tableau 1: Caractéristiques des patients avec polyarthrite rhumatoïde débutante Femme (%) 78 Age (ans) 49 12 Durée de la maladie (mois) (médiane, 25; 75%) 9 (3,3-19,8) Facteur rhumatoïde (%) 88 Utilisateurs d'anti-inflammatoires non-stéroidiens (%) 83 Utilisateurs de corticoides (%) 35 Nombre d'articulations sensibles 28 14 Nombre d'articulations gonflées 22 10 Score d'évaluation du médecin 5,8 1,9 Score d'évaluation du patient 6,4 1,8 Index d'handicap ("Health Assessment Questionnaire") 1, 41 0,63 Douleur (Echelle visuelle) 5,8 2,2 Protéine C-réactive (mg/dl) (médiane, 25; 75%) 2,0 (05-4,8) Score de Sharp * (médiane; 25; 75%) 7,0 (2,0-15,0) Total Erosion osseuse 3,0 (0,0-7,8) Pincement de l'interligne 2,0 (0,0-7,8) * Le score radiologique total de Sharp varie de 0 à 398; un score élevé représente une destruction des tissus cartilagineux plus importante. 6. Evaluation de l'activité de la maladie lors de la visite de référence L'évaluation du stade de la maladie chez les patients atteints de PR incluait un comptage complet des articulations sensibles et gonflées (71 articulations ont été vérifiées; la hanche et les cervicales ont été vérifiées seulement pour leur sensibilité). Les articulations sont classées comme sensibles si une douleur apparaît lors de pression ou de mouvement de l'articulation. Les articulations sont classées comme gonflées si on remarque la présence de tissu mou enflé. Toutes les évaluations des articulations ont été réalisées par deux investigateursindépendants et spécialement formés pour l'étude. Le questionnaire d'autoévaluation clinique (Health Assessment Questionnaire, HAQ, Fries JF et al. The dimensions of health assessment questionnaire, disability and pain scores. J. Rheumatol 1982; 9: 789-793 a été collecté pour tous les patients. Les autres indices de l'activité de la maladie incluaient l'évaluation par le patient et par le médecin (échelle allant de 0 pour le meilleur à 10 pour le pire), l'évaluation de la douleur par le patient (échelle allant de 0 pour le meilleur à 10 pour le pire) et le niveau sérique de la protéine C-réactive (CRP). 7. Mesure du niveau urinaire de CTXII Le CTXII (décrit par Christgau et al. Bone 2001) urinaire a été mesuré par un ELISA de compétition (Cartilaps, Nordic Bioscience, Herlev, Danmark). Un anticorps monoclonal a été produit chez la souris et est dirigé contre la séquence EKGPDP du Ctelopeptide du collagène de type II humain (Garnero et al., 2002 supra; Garnero et al. Association of Baseline Levels of Markers of Bone and Cartilage Degradation are associated with Longterm Progression of Joint Damage in Patients with Early Rheumatoid Arthritis: the Cobra Study. Arthritis Rheum., 2002a 46(11):2847-56; Garnero et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2002b 46(10) : 2613-24; Christgau et al. Collagen type II C- telopeptide fragments as an index of cartilage degradation. Bone 2001; 29:209-215). Cette séquence est spécifique du collagène II et n'est pas présente chez d'autres collagènes tels que le collagène de type I et chez des protéines structurales. Les coefficients de variation (CVs) inter et intra essai sont inférieurs à 8 et 10 % respectivement. 8. Evaluation radiologique des patients Des radiographies antéropostérieures des mains, poignets et pieds ont été faites lors de la visite de référence, à 6 mois et 12 mois chez tous les patients atteints de PR. Les radiographies de ces 89 patients ont été analysées par deux radiologues indépendants (Bathon et al., 2000 supra). Ce sont deux médecins spécialisés qui ont été formés à la méthode de comptage et procèdent au comptage en aveugle sans connaître le traitement pris par les patients ni la visite à laquelle a été prise la radiographie. La moyenne des comptages des deux radiologistes est utilisée pour estimer le pincement de l'interligne de l'articulation, l'érosion osseuse et le score total de Sharp qui est la somme du pincement de l'interligne et l'érosion osseuse. La moyenne du taux de progression par patient (unité de Sharp/an) est obtenue par régression linéaire des trois observations au même instant. 9. Analyses statistiques Toutes les données sont exprimées en moyenne la déviation standard (DS). Du fait que les indices cliniques et radiologiques et les niveaux de marqueurs spécifiques de la dégradation du collagène de type II selon l'invention ou selon l'art antérieur ne sont pas normalement distribués, les corrélations ont été estimées par le coefficient de corrélation non paramétrique de rang de Spearman. La progression de la destruction de l'articulation a été définie par une augmentation du score radiographique de Sharp de 1 unité/an ou plus comme cela a été décrit précédemment (Garnero et al.,2002 supra; Garnero et al., 2002a supra). Les risques relatifs de la progression de la destruction de l'articulation en fonction des niveaux des marqueurs selon l'invention ou selon l'art antérieur ont été estimés par des analyses de régression logistique après ajustement de la prise du traitement. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le SAS (SAS institute Inc, Cary, NC) (SAS Institute Inc. SAS STAT Users's Guide, Version 6, 4tn Ed, Vol 1 and 2, Cary, NC SAS Institute, Inc). B. RESULTATS Exemple 1: ELISA de compétition pour le peptide Helix-II de la chaîne alpha 1 du collagène de type II. Les méthodes de production des peptides, des antisérums ainsi que la méthode ELISA de compétition sont décrites précédemment. Une courbe standard ou de calibration a été obtenue sur un graphe semi log en dosant les 8 standards (de 0.25 à 40 g/1) avec l'antisérum H12 sélectionné pour son titre (Fig. 1). Les valeurs sont exprimées en pourcentage de BO qui est la valeur du standard 0 (sans peptide). La concentration en peptide Helix-II dans les échantillons est obtenue par extrapolation de la courbe de calibration. La détection limite de cet essai a été déterminée par le calcul de la moyenne de 32 déterminations du standard 0 auquel on retranche trois fois la déviation standard. La détection limite est de 0,02 g/1. Exemple 2: Caractérisation de la spécificité de l'antisérum anti-Helix-II L'antisérum sélectionné a été testé vis-à-vis de différents peptides selon la méthode ELISA décrite précédemment afin de vérifier sa spécificité. Les peptides testés sont: le peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3 (le peptide immunogène), le peptide de séquence SEQ ID N 5 correspondant au peptide immunogène avec un acide aminé en plus du côté N- terminal, le peptide de séquence SEQ ID N 8 correspondant à la séquence homologue dans le collagène de type I et le collagène de type II humain intact. Comme le montre la Fig.2, tous ces peptides ainsi que le collagène de type II intact ne sont pas capables de rentrer en compétition avec le peptide Helix-II adsorbé sur la plaque. Donc l'antisérum H12 montre une très forte affinité pour le peptide al du collagène de type II. Exemple 3: caractéristiques analytiques de l'ELISA Les performances analytiques de l'ELISA ont été vérifiées en effectuant: - des tests de dilution: un échantillon urinaire est dosé pur et dilué (Tableau 15 2). - des tests de recouvrement: on ajoute une quantité connue de peptide Helix-II à des échantillons urinaires (Tableau 3). - des tests de précisions infra et inter essai: on mesure 32 fois le même échantillon (intra-essai) ou l'on mesure le même échantillon dans 10 manipulations 20 différentes (inter-essai) afin de vérifier la variabilité des valeurs obtenues (Tableau 4). Tableau 2: Tests de dilution de deux urines dans le dosage ELISA Helix-II Echantillon dilution Helix-II Recouvrement (gg/L) (%) attendu mesuré pur 2,784 2,784 100 1/2 1,392 1,137 82 I 1/3 0,928 0,763 82 1/4 0,696 0,592 85 1/5 0,557 0,537 96 pur 4,126 4,126 100 1/2 2,06 2,14 104 II 1/3 1,37 1,30 95 1/4 1,03 1,065 103 1/5 0,825 0,822 99,6 Tableau 3:Recouvrement de peptide standard dans le dosage ELISA du peptide Helix-II échantillon peptide hélicoïdal ( g/L) Recouvrement(%) Endogène Ajouté Mesuré 1,337 1 1,069 91,52 1,337 2 1,672 100,2 I 1,337 5 4,015 126,7 1,337 10 5,606 98,89 3,105 1 1,623 79,1 3,105 2 2,854 112 II 3,105 5 5,350 132,1 3,105 10 10,06 153,6 Tableau 4: Précision de la mesure du peptide Helix- II intra et inter-essai dans trois échantillons urinaires. Intra-essai Inter-essai Echantillons Concentration CV, % Concentration CV, % de Helix-II de Helix-II A 0,570 0,07 13,3 0,552 0,08 14,9 B 1,350 0,12 9,9 1,378 0,152 11 C 1,949 0,15 7,7 1,917 0,14 7,6 Exemple 4: Corrélation linéaire entre deux marqueurs spécifiques de la dégradation des tissus cartilagineux: Helix-II et CTX-II L'excrétion urinaire du marqueur Helix-II a été mesurée par ELISA (protocole 10 précisé ci-dessus) et a été comparée avec l'excrétion urinaire de CTX-II mesurée également par ELISA (Cartilaps ELISA, Nordic Bioscience AIS). Chacun de ces marqueurs a été mesuré chez: - 82 sujets contrôles - 89 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Les résultats (Fig. 3) montrent que le marqueur Helix-II corrèle significativement avec un marqueur connu spécifique de la pathologie ou de la dégradation des tissus cartilagineux le CTX-II ou Cartilaps (r=0,66, p Exemple 5: Evaluation du niveau d'Helix-II chez des patients atteints d'arthrose 20 du genou, de polyarthrite rhumatoïde et des contrôles. Des urines de personnes contrôles ainsi que de patients atteints d'arthrose du genou et de polyarthrite rhumatoïde ont été collectées et dosées en Helix-II comme décrit dans le protocole (paragraphe A.4). La concentration en Helix-II (ng/mmol de créatinine urinaire) pour les différentes populations est présentée dans la Fig. 4: chez des adultes contrôles sains (n=85) chez des patients atteints d'arthroses du genou (n=90) et chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (n=89). Toutes les valeurs sont corrigées par la créatinine urinaire. Les lignes horizontales représentent la médiane de Helix-II/créatinine dans chaque groupe. Les valeurs de significativité de différence entre les groupes (p) sont représentées sur le graphe. Exemple 6: Comparaison des deux marqueurs de la dégradation articulaire Helix-II et CTX-II Tableau 5: Corrélation entre les niveaux de base de CTX-II et Helix II et 10 la progression de la destruction articulaire chez 89 patients avec polyarthrite récente Marqueur au temps de base Changement des scores Helix-II CTX-II radiographiques sur 1 an Erosion osseuse 0,35* 0,16 Score de Sharp total 0,30** 0,22*** * p=0,002, ** p=0,007, *** p=0,05 Lorsque les valeurs des marqueurs biologiques de la dégradation du collagène de type II (Helix-II et CTX-II (Cartilaps) urinaires) ainsi que la progression de la destruction articulaire évaluée par les changements des différents scores de Sharp sur un an, une corrélation (r de Spearman) significative a été observée entre des taux élevés de Helix II et une progression plus rapide de l'érosion osseuse et de la destruction totale. Pour le CTX-II, l'association est plus faible et n'est observé que pour le score total de Sharp. La destruction articulaire significative (> 0,5 unité/ an) des patients présentant des niveaux de marqueur dans le tertile supérieure par rapport aux autres patients est représenté dans le Tableau 6. Tableau 6: Association entre les niveaux de base des marqueurs du cartilage (CTX-II et Helix-II) et le risque de progression de la destruction articulaire estimé par les changements radiologiques du score total de Sharp sur 1 an. Risque relatif de progression (intervalle de confiance à 95%) Helix-II CTX-II Non ajusté 6,9 (2,5- 19,6) 3,1 (1,2-7,8) -Ajusté pour le score de 3,1 (1,2-7,9) Sharp 6,6 (2,3-18,8) -Ajusté pour la CRP 6,1 (2,1-17,8) 2,2 (0,8-6,0) -Ajusté pour Sharp et CRP 5,9 (2,0- 17,2) 2,2 (0,8-86,3) Tous les risques relatifs ont été ajustés pour chaque groupe de traitement. L'intérêt clinique des marqueurs biologiques comme facteurs prédictifs de la progression, est combiné avec l'identification de valeur seuil permettant au clinicien d'identifier les patients à risque important de progression. Dans l'étude ci-dessus, il a été montré que les patients qui, au temps de base, avaient un taux de Helix-II dans le tertile supérieur de la population (33% de la population avec les niveaux les plus élevés) avaient en moyenne un risque relatif de progression de destruction articulaire 6,9 fois plus élevé que les patients qui avaient des taux dans les deux tertiles inférieurs. De façon importante, ce risque augmenté de progression pour des taux élevés d'Helix-II est en partie indépendant du niveau d'autres facteurs de risque et notamment le niveau de destruction articulaire initial (évalué par le score de Sharp) et le niveau d'inflammation systémique évalué par la concentration sérique de la protéine C-réactive (CRP). Pour le CTX-II, l'association est aussi significative, avec toutefois un risque relatif plus faible et non-significatif après ajustement avec la CRP. Tous les risques relatifs ont été calculés par régression logistique Comme le montre la Fig.5, la combinaison de la mesure de l'excrétion urinaire de l'Helix-II et du CTXII, permet une meilleure identification des patients avec polyarthrites récente à progression rapide. Dans cette étude, les 87 patients PR ont été séparés en quatre groupe sur la base de leur taux initiaux d'Helix-II et de CTX-II en utilisant comme valeur seuil pour chaque marqueur le tertile supérieur ( haut Helix-II et CTX-II). Les patients qui ont des taux d'Helix-II et de CTX-II dans le tertile supérieur, ont une progression de la destruction articulaire évaluée par le changement du score total de Sharp beaucoup plus importante que les patients présentant soit des taux élevés d'Helix-II soit des taux élevés de CTX-II. Ces résultats confirment donc que le dosage urinaire de Helix-II reflète des mécanismes de destruction articulaire indépendants du CTX-II dans la PR. La combinaison de ces deux marqueurs améliore la prédiction de la destruction articulaire. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'évaluation de la dégradation des tissus cartilagineux d'un individu à partir de la détection in vitro dans un échantillon biologique provenant de l'individu, du niveau d'au moins un marqueur spécifique de la dégradation des tissus cartilagineux caractérisé en ce que les marqueurs spécifiques détectés sont des fragments de dégradation du collagène de type II, issus de la dégradation de la séquence en acides aminés SEQ ID N 2 de la chaîne al du collagène de type II située dans la région en triple hélice, ces dits fragments de dégradation comprenant au moins quatre acides aminés consécutifs présents dans le peptide Helix-Il de séquence SEQ ID N 3, éventuellement modifié post-traductionnellement. 2 - Procédé d'évaluation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on détecte le niveau d'au moins un fragment de dégradation du collagène de type II, dont la séquence comprend la séquence SEQ ID N 3. 3 - Procédé d'évaluation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on détecte le niveau de Helix-Il. 4 - Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection est effectuée par une technique de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), par fluorescence, par spectroscopie aux ultraviolets, par détection électrochimique ou par des techniques d'analyse protéomique. 5 - Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection consiste à mettre en contact l'échantillon biologique avec des anticorps, fragments d'anticorps ou analytes dirigés contre le marqueur à détecter, puis à détecter leur liaison avec le marqueur par une technique immunologique, de préférence choisie parmi la technique ELISA, les techniques immuno-enzymatiques, les techniques d'immunofluorescence, les techniques radio-immunologiques, les techniques chemo-immunologiques ou les techniques d'analyse protéomique. 6 - Procédé d'évaluation selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est mis en contact avec des anticorps polyclonaux. 7 - Procédé d'évaluation selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est mis en contact avec des anticorps monoclonaux. 8 - Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, la sueur, la lymphe, les larmes, le liquide snovial, les tissus, les cellules, ou les surnageants de cultures tissulaires ou cellulaires de l'individu. 9 - Procédé d'évaluation de la dégradation du tissu cartilagineux d'un individu à partir de la détection, in vitro, dans un échantillon biologique de l'individu, de la présence de fragments de dégradation du collagène de type II, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec des anticorps se liant à un épitope dont au moins un acide aminé appartient au fragment de dégradation correspondant au peptide Helix-II de séquence SEQ ID N 3, ou au peptide Helix-II dont un ou plusieurs acides aminés a été modifié post-traductionnellement. 10 - Procédé d'évaluation selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec des anticorps se liant à un épitope contenu dans la séquence SEQ ID N 3. 11 - Procédé d'évaluation selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les anticorps mis en oeuvre sont polyclonaux. 12 - Procédé d'évaluation selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les anticorps mis en oeuvre sont monoclonaux. 13 - Procédé d'évaluation selon l'une des revendication 9 à 12, caractérisé en ce que la liaison anticorps/épitope est détectée par une technique immunologique choisie parmi la technique ELISA, les techniques immuno-enzymatiques, les techniques d'immunofluorescence, les techniques radio-immunologiques, les techniques chemo-immunologiques et les techniques d'analyse protéomique. 14 - Procédé d'évaluation selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, la sueur, la lymphe, les larmes, le liquide synovial, les tissus, les cellules, ou les surnageants de cultures tissulaires ou cellulaires de l'individu. - Procédé pour diagnostiquer une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu mettant en oeuvre un procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 14. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le niveau de 30 marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence caractéristique de l'absence de pathologie. 2UU - 17 - Procédé pour suivre l'évolution d'une pathologie des tissus cartilagineux d'un individu atteint d'une pathologie des tissus cartilagineux mettant en oeuvre un procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 14. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le niveau de marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence, correspondant par exemple au niveau obtenu pour un stade prédéterminé de la pathologie. 19 - Procédé pour pronostiquer de façon pré-symptomatique une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu mettant en oeuvre un procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 14. - Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le niveau de marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence établi chez des individus de même âge et de même sexe, sans pathologie ou à un stade prédéterminé de la pathologie. 21 - Procédé pour prédéterminer l'évolution d'une pathologie des tissus cartilagineux chez un individu atteint d'une telle maladie mettant en oeuvre un procédé d'évaluation selon l'une des revendications 1 à 14. 22 - Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le niveau des marqueurs spécifiques détectés est quantifié et comparé avec un niveau de référence correspondant à un niveau représentant l'absence de la pathologie ou représentant un stade prédéterminé de la pathologie. 23 - Procédé selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que l'on détecte, dans l'échantillon biologique de l'individu, au moins deux marqueurs spécifiques de la dégradation du collagène de type II. 24 - Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que l'on détecte, dans l'échantillon biologique de l'individu, à la fois le niveau de Helix-II et le niveau de CTX-II de séquence SEQ ID N 4. - Procédé selon l'une des revendications 14 à 24, caractérisé en ce que la pathologie des tissus cartilagineux est un rhumatisme inflammatoire, une arthropathie métabolique, un rhumatisme dégénératif, la polyarthrite rhumatoïde, une spondyarthropathie ou l'arthrose. 26 - Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la pathologie des tissus cartilagineux est la polyarthrite rhumatoïde. 27 - Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la pathologie des tissus cartilagineux est l'arthrose. 28 - Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la pathologie des tissus cartilagineux est la spondylarthrite.