Brevet FR2871058A1 — publié le 20051209

La présente invention concerne une association à base d'extraits végétaux de Groseille à Maquereau, d'Orchidée Noire et de Tulipe Noire, ainsi qu'une composition topique la contenant, et plus particulièrement une composition contenant une telle association, utile pour le traitement et la prévention des dommages liés au vieillissement de la peau, ainsi que les procédés cosmétiques associés. La peau comprend plusieurs couches intégrées, allant de la couche superficielle, l'épiderme, jusqu'au couches plus profondes, le derme et l'hypoderme, et chacune possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et de s'adapter aux conditions de son environnement. L'épiderme est principalement composé de trois types de cellules qui sont les kératinocytes (90% des cellules épider- miques), les mélanocytes (2 à 3% des cellules épidermiques) et les cellules de Langerhans. Son épaisseur varie selon les différentes parties du corps. L'épiderme, qui constitue la couche externe, joue un rôle fondamental pour assurer la protection et le maintien d'une bonne trophicité. C'est pourquoi de nombreuses compositions ont été mises au point afin de le protéger et d'améliorer ses fonctions, et notamment de renforcer son élasticité et sa fermeté. Le derme est épais, solide, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins et en glandes sudoripares. Il protège et répare les tissus abîmés. Cette couche se compose principalement de collagène, d'élastine et de protéoglycanes. Ces trois types de molécules sont synthétisés par les fibroblastes dermiques. Les fibres de collagène, qui représentent 70% du poids sec du derme, forment un réseau de support responsable des caractéristiques mécaniques de la peau telles que la résistance mécanique et la texture. L'élastine est responsable de l'élasticité et les protéoglycanes jouent un rôle majeur de structure et d'hydratation de la peau. D'autres cellules comme les macrophages et les leucocytes sont également présentes dans la couche du derme. B1996fr L'hypoderme, fixé au bas du derme, est la couche la plus profonde de la peau. Il contient les adipocytes qui produisent des lipides pour que le tissu sous-cutané fabrique une couche grasse qui protège les muscles, les os et les organes internes contre les chocs, et agit en tant qu'isolant et source d'énergie pendant les périodes de jeûne. L'un des premiers signes de vieillissement de la peau est une perte d'élasticité et la formation de rides et ridules, qui sont le résultat direct de la détérioration de la couche du derme de soutien. En fait, la capacité de la peau à remplacer le collagène endommagé diminue et il se développe plus d'espaces et d'irrégularités dans le réseau du collagène. L'apparition de marques pigmentaires, la finesse de la peau et l'affaissement de la peau sont également des changements observés au cours du vieillissement ultérieur de la peau. De nombreux facteurs contribuent à accélérer la dégradation du collagène, et en particulier l'exposition au soleil, les radicaux libres, certains changements hormonaux associés à la vieillesse et le tabac. Le vieillissement de la peau est souvent décrit comme apparaissant de deux façons. La première est le vieillissement chronologique ou intrinsèque, tandis que la deuxième est le vieillissement extrinsèque, à savoir le vieillissement provoqué par l'environnement; ceci est plus particulièrement le cas du photovieillissement, qui est cet endommagement fait à la peau du fait des effets directs ou indirects de la lumière ultra-violette. La présente invention a trait non seulement au vieillissement intrinsèque, mais également au vieillissement extrinsèque. A l'échelle de la peau, le vieillissement provoque notamment une diminution des synthèses protéiques (collagène, élastine) une diminution de la synthèse des protéoglycanes entre autres, ainsi qu'une élévation des métalloprotéinases de type MMP3. Par ailleurs, les phénomènes d'oxydation (teneur en radicaux libres) entraînent des processus inflammatoires qui augmentent la sensibilité cutanée. Pour lutter contre le vieillissement de la peau, on a proposé certains traitements à base de crèmes contenant des alpha-hydroxyacides ou des rétinoïdes, appliquées régulière-ment pour réduire à long terme le nombre des fines ridules. On a aussi proposé des implants de collagène pour dissimuler les lignes d'expression autour des yeux ou de la bouche, la Io dermabrasion et les peelings chimiques pour éliminer la couche supérieure de la peau endommagée, la chirurgie esthétique, telle que la blépharoplastie (chirurgie des paupières) ou un lifting pour rajeunir une peau s'affaissant, ou encore une restructuration à l'aide d'un laser au dioxyde de carbone pour éliminer les ridules et améliorer les cicatrices. Cependant, il existe toujours un besoin accru de trouver des compositions topiques alternatives permettant de lutter efficacement contre le vieillissement cutané, et notamment de trouver des compositions topiques à base d'extraits végétaux appropriés, particulièrement provenant de plantes connues pour leurs facultés de résistance ou de vie en milieu pauvre ou pour leur teneur élevée en nucléotides. Suivant la présente invention, on a maintenant trouvé de manière étonnante que l'on peut utiliser une association d'extraits végétaux à base de Groseille à Maquereau, d'Orchi- dée Noire et de Tulipe Noire pour la préparation d'une application topique destinée au traitement ou à la prévention des dommages liés au vieillissement de la peau. En fait, on a observé que ledit extrait végétal augmente le taux de protéo- glycanes péri-membranaires, transmembranaires et matriciels et augmente en outre le taux de collagène des fibroblastes dermiques humains. On peut donc l'utiliser à titre de compo- sition cosmétique anti-âge. Ainsi, on peut procéder à l'appli- cation topique de la composition selon l'invention sur une zone de la peau pour contrebalancer la perte de renouvellement des cellules et la perte des fonctions du derme. La présente invention a donc pour objet une association d'extraits végétaux à base de Groseille à Maquereau, d'Orchi-5 dée Noire et de Tulipe Noire. La présente invention a aussi pour objet une composition topique pour le traitement ou la prévention des dommages liés au vieillissement de la peau, comprenant une association selon le premier objet de l'invention indiqué ci-dessus. L'invention a encore pour objet de proposer l'utilisation d'une association comme ci-dessus, pour la préparation d'une composition topique destinée à lutter contre les dommages liés au vieillissement de la peau. Enfin, la présente invention a également pour objet un procédé cosmétique pour combattre les dommages liés au vieillissement de la peau, qui comprend une étape consistant à appliquer à des zones de la peau affectées une composition contenant une quantité efficace de la composition topique selon le deuxième objet de la présente invention. Le procédé cosmétique pour l'amélioration de l'aspect externe comprenant une étape consistant à appliquer cette composition topique aux zones de la peau affectées, constitue également un autre objet de la présente invention. On peut utiliser ces compositions topiques de façon avantageuse en dermatologie ou cosmétologie pour le traitement ou la prévention des dommages liés au vieillissement de la peau, plus particulièrement comprenant la perte de la fermeté et de la tonicité de la peau, et l'apparition de rides et ridules. Dans ce qui suit, à des fins de simplification, la composition topique est utile dans un but dermatologique ou cosmétique, sauf indication contraire. Davantage de détails sont donnés ci-après sur les plantes dont sont issus les extraits végétaux à la base de l'asso-35 ciation selon la présente invention. La Groseille à Maquereau est notamment connue pour sa forte teneur en polyphénols (RIBES UVA CRISPA). Le groseillier à Maquereau est originaire d'Asie et est devenu sub-spontané en Europe du Nord et de l'Est. On le trouve en plaine ou en basse montagne colonisant les milieux pauvres ou encore les terrains spécifiquement acides. Par exemple on le trouve dans les Vosges jusqu'à 1000 m d'altitude ainsi que sur les berges de la Loire en zone inondable. C'est le fruit qui est utilisé. L'Orchidée Noire (Cycnoches Cooperi), comme toutes les orchidées, vit en milieu pauvre et des écorces de pin ou des débris de lichen peuvent suffire à son développement. Il ne lui faut comme élément essentiel que la lumière, l'humidité et la chaleur. Elle est capable de stocker les matières nutritives et l'humidité. L'Orchidée Noire est particulièrement riche en flavonoïdes qui ont un intérêt particulier comme piégeurs de radicaux libres et protecteurs membranaires. C'est la plante entière qui est utilisée. La Tulipe Noire (Tulipa Nigra) est la plante qui contient le plus d'ADN végétal. C'est une tulipe cultivée. Son origine des régions montagneuses du Nord de l'Europe et de l'Asie explique ses grandes qualités de résistance et de reproduction, ainsi qu'une grande résistance aux UV. C'est un extrait des pétales qui est utilisé. Ces extraits végétaux peuvent être caractérisés par leur teneur en extrait sec et/ou par leur teneur en actif. Les extraits sont avantageusement des extraits hydroglycoliques ou hydroalcooliques, par exemple obtenus par macération à froid dans un mélange eau/propylène glycol ou eau/éthanol. Typiquement, les extraits détaillés ci-après peuvent être utilisés pour la préparation de l'association selon la présente invention. Extrait de Groseille à Maquereau - Eau / Ethanol 50/50 - Matière sèche 1,8% - Polyphénols (sur matière sèche) 0,13% - Flavonoïdes (sur matière sèche) 0,05% Extrait d'Orchidée Noire - Eau / propylène glycol 50/50 5 Matière sèche 0,20% - Flavonoïdes (sur matière sèche) 0,05% Extrait de pétales de Tulipe Noire - Eau / propylène glycol 50/50 - Matière sèche 0,6% - ADN (présence) L'association peut également prendre la forme d'extraits huileux qui peuvent être obtenus par macération des plantes dans des triglycérides capriques/capryliques, du tournesol oléique ou tout mélange polaire/apolaire du type huile de noyau d'abricot / huile de vaseline. On peut ainsi extraire les matières liposolubles telles que des flavones et certains polyphénols. Les compositions topiques selon l'invention peuvent se présenter sous toute formulation cosmétique. Les compositions topiques selon l'invention peuvent par exemple comprendre des excipients appropriés pour une administration topique externe, en particulier des excipients acceptables sur le plan dermatologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent en particulier les épaississants tels que les gommes naturelles et les polymères de synthèse; les émollients et les tensio-actifs tels que l'octanoate de cétéaryle, le myristate d'isopropyle, l'isononanoate de cétéaryle, la diméthicone, la cyclométhicone, le 3-diiso- stéarate de polyglycéryle, le polyisobutène hydrogéné, l'alcool cétylique, le palmitate cétylique, le phosphate cétylique; les émulsifiants; les conservateurs tels que le phénoxyéthanol, le parahydroxybenzoate de méthyle (méthylparaben), le parahydroxybenzoate de propyle (propylparaben) et le Phenonip associant du phénoxyéthanol et des parahydroxy- benzoates de méthyle, éthyle, butyle et isobutyle; les colorants; les parfums; etc. D'autres ingrédients peuvent être utilisés dans les compositions: les agents hydratants tels que le propylène glycol, la glycérine, le butylène glycol et également les vitamines antioxydantes telles que la vitamine E, par exemple l'acétate de tocophérol ou le tocotriénol, la vitamine C, les polyphénols naturels. On peut également ajouter à la composition des agents conditionneurs de la peau tels que le nylon. Les compositions topiques selon l'invention peuvent être sous la forme d'une solution, d'une lotion hydrophile, d'une pommade, d'une crème, d'un sérum ou d'un gel. Les compositions peuvent également être, par exemple, sous forme d'émulsions huile dans eau, eau dans huile ou multiples, de produits moussants ou sous une forme de liposomes. On peut aussi appliquer sur la peau toutes les compositions telles que décrites ci-dessus au moyen de lingettes. Les compositions topiques selon l'invention peuvent de plus inclure un ou plusieurs d'une diversité d'ingrédients facultatifs, tels que des agents colorants, des agents opacifiants et analogues. Dans l'association selon le premier but de l'invention chacun des extraits végétaux de Groseille à Maquereau, d'Orchidée Noire et de Tulipe Noire, est avantageusement présent dans une teneur comprise entre 5 et 90%, ces teneurs étant exprimées par rapport au poids total de l'association. De préférence, ces teneurs sont d'environ 25 à 50%, et plus préférentiellement on utilise une association comprenant les trois extraits en quantités sensiblement égales. Les compositions topiques selon l'invention incluent typiquement entre 0, 1% et 20% (p/p) en poids de l'association selon la présente invention par rapport au poids total de la composition topique, et de préférence de 2% à 8%. Suivant une forme avantageuse de réalisation, les extraits constituant l'association de l'invention sont complétés par des principes actifs ou ingrédients auxiliaires choisis pour leurs propriétés complémentaires, afin de renfor- cer les effets anti-âge de la composition. Ainsi il est particulièrement avantageux de les combiner avec des quantités appropriées d'une antihyaluronidase telle que Echinacine B afin de générer un maximum d'eau liée, d'Imperata cylindrica, par exemple MOIST 24 de la société Sederma, afin de favoriser lo l'hydratation de la peau par modification de la pression osmotique, des protéines de graines d'amarante (Amarantus caudatus) ou des globulines de pois afin d'obtenir un effet tenseur de la peau, de l'huile de Calophylum afin de renforcer l'effet anti-rides, de l'huile d'Echium pour son effet anti- inflammatoire, ou encore un palmitoyl pentapeptide-3 tel que le Matrixyl ou des dérivés tels que le palmitoyl GHK (possédant la chaîne Glycyl- Histidyl-Lysine) et le palmitoyl GQPR (Glycyl-Glutamyl-Prolyl-Arginine) ou le palmitoyl VGVAPG (Valyl-Glycyl-Valyl-Alanyl-Prolyl-Glycine) associé à un céra- mide-2, ainsi que d'une manière générale toute association avec un céramide. Les compositions topiques selon l'invention ont un effet d'amélioration des dommages cutanés dus au vieillissement. On peut obtenir les premiers résultats après 2 à 3 semaines de traitement quotidien en appliquant une à deux fois par jour les compositions sur les zones de la peau à traiter. Lesdites compositions de l'invention peuvent être choisies pour une utilisation de jour et/ou de nuit sur le visage, le corps et les mains. Les compositions selon l'invention sont particulièrement appropriées pour le traitement des zones de contour des yeux et des lèvres, qui sont très fragiles et hautement susceptibles de voir apparaître des rides et une perte de la fermeté de la peau. Les compositions selon l'invention sont très bien tolérées sur cette zone sensible, et rendent possible une réduction visible du nombre de rides et de marques aux yeux, ainsi qu'un raffermissement de la peau particulièrement sensible du contour des yeux et de la bouche. Les exemples qui suivent illustrent la présente inven-5 tion, sans en limiter la portée. Des exemples de formulations sont rapportés aux exemples 1 à 4. L'exemple 5 est relatif à une étude toxicologique et à des tests d'activité sur les fibroblastes humains, qui ont permis d'évaluer l'effet anti-inflammatoire (interleukines) et l'effet anti-vieillissement (dosage de MPP3, protéoglycanes et collagènes). Dans les exemples 1 à 4 qui suivent, le "complexe de plante" correspond à une association à base d'extraits végétaux de Groseille à Maquereau, d'Orchidée Noire et de Tulipe Noire selon la présente invention dans laquelle les trois extraits sont ceux détaillés ci-dessus (extrait par macération à froid d'un mélange eau/propylène glycol ou eau/éthanol) et ils sont compris en parties égales. Sauf indication contraire, les compositions sont données en parties en poids. Exemple 1 Lotion tonique calmante et hydratante Eau de Roses 5,0 Eau de Bleuet 10,0 Eau d'Hamamelis 10,0 Butylène glycol 1-3 5,0 Glycérine 5,0 Lactate de sodium 2,0 Complexe de plantes suivant l'invention 3,0 Phenonip 0,5 Eau de laitue 5,0 Eau déminéralisée QSP 100,0 Exemple 2 Crème de jour éclat hydratante Eau déminéralisée QSP 100,0 Glycérine 5,0 Butylène glycol 1-3 4,0 Complexe de plantes suivant l'invention 5,0 Extrait de levure 2,0 Extrait d'Imperata cylindrica 3,0 Protéines d'Amarante 1,0 Huile de noisettes 5,0 Huile de pépins de framboises 0,5 Huile de noyau de cerise aminés 1,0 Perhydrosqualène 5,0 Polysorbate 60 3, 5 Stéarate de sorbitan 2,5 Alcool cétostéarylique 4,0 Diméthicone 1,0 Tocophérols 0,5 Exemple 3 Crème antirides régénérante Eau déminéralisée QSP 100,0 Phenonip 0,7 Glycérine 4,0 Butylène Glycol 1,3 3,0 Sorbitol 70% 2,0 Complexe de plantes suivant l'invention 10,0 Matrixyl (palmitoyl pentapeptide-3)* 3,0 Protéines d'Amarante 2,0 Beurre de Karité 3,0 Huile d'Echium 2,0 Huile de Rosier Muscat 3,0 Huile de Calophylum 2,0 PEG 20 Methyl glucose stearate 3,5 Methyl glucose stéarate 3,0 Lécithine 1,0 Microcapsules de vitamine A et E 1,0 Ascorbyl sulfate de magnésium Propyl Paraben * : commercialisé par Sederma Exemple 4 Sérum antirides régénérant Mélange de plantes lyophilisées: - Polyphénols de Groseille Maquereau 0,05 - Extrait d'Orchidée 0,10 - ADN de Tulipe Noire 0,20 - Glycocolle 0,65 TOTAL 1,00 En flacon lyophilisé Solvant Glycérine 0,5 15 - Butylène glycol 0,5 - Biosaccharide grum-1 1,0 Phenonip 0,07 - Globulines de pois 2,0 - Extrait d'Imperata cylindrica 0,3 - Protéines d'Amarante 1,0 - Eau déminéralisée QSP 10,0 La partie lyophilisée est dissoute par le solvant et procure un traitement pour 7 jours. Exemple 5 Outre la toxicologie du produit, des études sur les fibroblastes humains en culture ont été menées. 5-1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL 1.1. Fibroblastes humains en culture Les cultures de fibroblastes sont établies à partir de peau de prépuces humains récoltés lors de circoncisions et sont amplifiées en milieu de culture RPMI 1640 supplémenté par du sérum de veau foetal, de la L-glutamine et de la 0,3 0, 1 gentamycine. Les fibroblastes ont été ensemencés dans des boites de 25 cm2 à raison de 106 cellules par ml. Ils ont ensuite été incubés pendant 24 heures. 1.2. Aspect toxicologique Le but de cette première étape était de chercher la cytotoxicité du produit vis-à-vis des fibroblastes humains en culture. La croissance cellulaire est réalisée sur 3 concentrations non cytotoxiques. La cytotoxicité a été réalisée par la détermination de la 10 néosynthèse des protéines. Les fibroblastes humains obtenus par primoculture ont été récupérés après trypsinisation et centrifugation. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 10 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté avec le sérum de veau foetal (10%), de la L-glutamine (8 mM) et de la gentamicine (80 pg/ml). Après homogénéisation, les cellules ont été réparties dans des plaques multipuits (6 puits) à raison de 1.105 cellules/ml. Les plaques ont été mises à incuber pendant 24 heures. Le milieu a été ensuite éliminé et du milieu frais a été ajouté soit seul, soit additionné de différentes concentrations du produit "complexe de plantes" 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1% et 5%). Les temps de contact du produit avec les cellules étaient de 24 heures. Pour étudier la capacité des cellules préalablement traitées par le produit à incorporer les précurseurs radioactifs dans les protéines, la technique de pulse a été adoptée. Les précurseurs radioactifs ont été ajoutés aux cultures après les durées d'incubation avec le produit à différentes concentrations. Les cellules ont été alors incubées pendant deux heures supplémentaires à 37 C en présence de 3H-leucine (1 pCi/ml de milieu de culture, activité spécifique: 5 Ci/mmol). Après avoir éliminé le milieu par aspiration, les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu sans sérum pour éliminer la radioactivité non incorporée puis détachées du support par grattage de la surface de culture. Les cellules ont été lavées une nouvelle fois puis centrifugées à 600 g pendant 5 minutes. Le culot cellulaire a été repris dans 500 pl de milieu. Pour la détermination de la radioactivité incorporée dans les macromolécules, on a ajouté 500 pl de NaOH 20% (poids/volume) puis l'ensemble a été soumis à l'hydrolyse pendant 30 minutes à 37 C. Les hydrolysats ont ensuite été précipités avec 1 ml d'une solution acide trichloracétique (TCA) à 40%. Les préparations sont laissées une heure à 4 C. Les échantillons ont été filtrés sur filtre en fibre de verre (Whatman GF/A) monté en appareil Millipore. Les filtres ont été lavés trois fois avec 10 ml de TCA 5% et deux fois avec de l'éthanol 95% puis introduits dans des flacons de comptage et séchés pendant 30 minutes à 80 C. La radioactivité a été mesurée dans un compteur à scintillation liquide en présence de 5 ml de scintillateur liquide (Ready organique, Beckman) contenant 0,9% d'acide acétique. 1.3. Dosage des médiateurs de l'inflammation (IL1-a, IL-6, TNF-a) A la fin du temps d'incubation (24 heures), les milieux de culture ont été prélevés, et le dosage de l'IL1-a et de l'IL-6 a été réalisé conformément aux protocoles décrits dans les kits de dosages: - Kit de détection interleukine 1-A (Ill-a)/R&D Systèmes - Kit de détection interleukine 6 (Ill-6)/R&D Systèmes 1.4. Evaluation de l'effet de produit sur les consti- tuants de la matrice extracellulaire des fibroblastes humains 1.4.1. Etude de l'effet du produit sur les protéoglycanes synthétisés par les fibroblastes humains. Pour cette étude, les fibroblastes ont été utilisés en grand nombre pour avoir une quantité suffisante de protéo- glycanes et de glycosaminoglycanes. Les fibroblastes ont été répartis dans des boîtes multipuits (6 puits) à raison de 2.105/ml dans 3 ml de milieu de culture. Elles ont ensuite été maintenues 24 heures en étuves à CO2. Afin d'étudier la capacité des cellules, préalablement traitées par la substance, à incorporer le précurseur radioactif, la technique de pulse a été adoptée. Le précurseur radioactif ([3H]- Glucosamine) a été rajouté aux cultures 18 2871058 14 heures avant la récupération des cellules. Le temps de contact des cellules avec le produit a été de 24 heures à 37 C. Après avoir éliminé le milieu par aspiration, les cellules ont été lavées 2 fois avec du milieu sans sérum pour éliminer la radioactivité non incorporée, puis détachées du support par grattage de la surface de la culture. Les cellules ont été lavées une nouvelle fois avec du milieu puis recentrifugées à 600 g pendant 5 minutes. A partir de ce culot final ont été réalisés: - le dosage des protéoglycanes par FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) - la néosynthèse des glycosaminoglycanes totaux (GAGs) le dosage des protéines totales Extraction Protéoglycanes périmembranaires Une première fraction du culot a été resuspendu dans NaCl 1M contenant la désoxyribonucléase (50 U/ml) et des inhibiteurs de protéases. L'homogénat a ensuite été incubé à 4 C pendant 2 heures. Une centrifugation pendant 30 minutes à 12 000 g a permis d'obtenir le premier homogénat contenant les protéoglycanes péri-membranaires. Le culot a servi à extraire les protéoglycanes des 2 autres compartiments (Cl). Protéoglycanes trans-membranaires Le culot Cl obtenu à partir de la première étape d'extraction a été resuspendu dans l'azide sodium 0,1% contenant du désoxycholate de sodium (DOC: 4%), soniqué à 75 mv pendant 20 secondes puis incubé 2 heures à 4 C. Une centrifugation pendant 30 minutes à 12 000 g a permis d'obtenir le deuxième surnageant contenant les protéoglycanes trans-membranaires. Le culot a servi à extraire les protéoglycanes du compartiment matriciel (C2). Protéoglycanes matriciels Le culot C2 a été lavé trois fois avec l'azide de sodium 0,1% puis a été remis en suspension sous agitation dans un tampon acétate de sodium 50 mM contenant la guanidine HC1 4 M et du triton X-100 0,1% ainsi que des inhibiteurs de protéases. Une centrifugation pendant 30 minutes à 12 000 g a permis d'obtenir le troisième surnageant contenant les protéoglycanes 5 matriciels. Purification par FPLC Préalablement à la purification par FPLC, chacun des 3 surnageants a été précipité une nuit à 4 C dans un volume d'éthanol absolu, puis centrifugés à 12 000 g pendant 30 minutes. Les culots obtenus ont été resuspendus dans un tampon tris-HCL 50mM pH 7,4. Le même protocole d'analyse a été réalisé pour 3 solutés. La chromatographie échangeuse d'anions a été utilisée. Chaque culot a été resuspendu dans 250 ml du tampon Tris-HCL 50 mM pH 7,4. Le gel sepharose CL-6B (DEAE) (Pharmacia) a été coulé dans une colonne K 10/40 (Pharamcia). Le gel échangeur d'anions a une grande résolution et un bon rendement. 100 pl de chaque échantillon ont été injectés; L'élution est suivie par détection au spectrofluomètre à longueur d'onde 280 nm. Le pic contenant les protéoglycanes est élué à 1 M de NaCl. Dosage Le dosage de la radioactivité est réalisé à la sortie d'HPLC grâce à un compteur Packard (Flow-one). 1.4.2. Etude de l'effet du produit sur les glycosaminoglycanes 25 synthétisés par les fibroblastes humains Une deuxième fraction du culot a été traitée par la pronase 1 mg/ml pendant 24 heures à 60 C. La réaction a été stoppée par refroidissement des tubes. Les protéines ont été précipitées par du TCA 12% à 4 C pendant une nuit. Les précipités ont ensuite été centrifugés à 12 000 g pendant 30 minutes. Les surnageant contenant les glycosaminoglycanes ont été récupérés, dialysés contre de l'eau ultra pure (MilliQ plus), puis lyophilisés. Les lyophilisats ont ensuite été resuspendus dans un tampon Tris-HC1 pH 7,4 contenant des inhibiteurs de protéases. Un aliquote de 50 pl a été prélevé pour le comptage de la radioactivité incorporée dans les glycosaminoglycanes totaux. 1.4.3. Etude de l'effet du produit sur la néo synthèse du collagène synthétisés par les fibroblastes humains Pour cette étude les fibroblastes ont été cultivés de la même façon que dans le paragraphe 1.4. 1. Après le temps d'incubation, les fibroblastes sont récupérés par centrifugation. Les culots sont digérés par les collagènes (1 mg/culot cellulaire) dans l'acide acétique 0,5 ml/l pendant 24 heures à 4 C. Après centrifugation à 10 000 g, les collagènes sont précipités par le chlorure de sodium (NaCl) à 1 M, le précipité est resuspendu puis dialysé. Les acides aminés primaires sont dérivés par l'acide ophtaldéhyde (OPA) éliminant ainsi leur interférence. L'hydroxyproline et la proline sont alors dérivées par le NBD-Cl par couplage des groupement aminés au NBD-Cl. Le NBD-Hyp est séparé et identifié par le HPLC en phase inverse. Pour la mise au point de la séparation des dérivés d'acides aminés, un couplage au NBD-CL d'un standard contenant l'hydroxyproline est d'abord réalisé. - L'hydroxyproline est dosée par mesure de la fluorescence après séparation HPLC en phase inverse: o Injecteur automatique o Colonne Ultrasep C18 {30cm*0,18cm) o 6 pm de porosité o Détecteur de fluorescenceLa phase mobile est constituée d'un mélange d'acétonitrile/tampon phosphate de sodium 0,1 mol/l, pH 7,2 (9:91 v/v), le débit est réglé a 1 ml/min, l'élution est réalisé en mode statique et le cycle est de 10 minutes. La phases mobile est préalablement filtrée, puis dégazée avant utilisation. - Les solutions sont préparées de la façon suivante: 35 NBD-Cl: 25 mmol dissous dans le méthanol, OPA = 150 mrnol/1 dissous dans du méthanol, Tampon phosphate = 0,4 mmol/l, pH ajusté à 7,2. La gamme étalon est préparée à partir d'une solution d'hydroxyproline à 50 mg/l. Les dilutions successives permettent d'obtenir des solutions allant de 0,5 à 40 mg/l. La dérivatisation et l'établissement de la courbe d'étalonnage sont effectués à partir de 10 pl d'une solution étalon à différentes concentrations mélangés avec 10 pl du tampon. Après addition de 5 pl d'OPA et agitation, les tubes sont gardés 5 min à température ambiante puis 10 pl de la solution NBD-Cl sont ajoutés. Le dérivât se fait à 60 C, au bain marie, pendant 3 minutes, à l'abri de la lumière. Les tubes sont ensuite retirés et la coloration orange permet de vérifier la dérivatisation. Ils sont, par la suite, mis dans la glace afin d'assurer le refroidissement. 50 pl de ce mélange sont ensuite injectés dans la colonne afin d'obtenir la courbe d'étalonnage qui doit être linéaire. Les échantillons sont traités de la même façon. 1.4.4 Etude de l'effet du produit sur la suppression de la MMP-3 (Metalloprotéinase 3) A la fin du temps d'incubation (24 heures), les milieux de culture ont été prélevés, et le dosage de la MMP-3 a été réalisé conformément aux protocoles décrits dans les kits de dosage. Kit de détection de la Métalloprotéinase 3 (MMP-3) . Interchim 2-RESULTATS 2.1. EVALUATION DE LA CYTOTOXICITE La cytotoxicité a été étudiée par incorporation de la 3H-leucine dans les protéines cellulaires après 24 heures de contact. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous: Incorporation de % d'incorporation PH]-leucine (cpm) Témoin 5410 450 - Complexe de plantes 5400 570 - (0,1) Complexe de plantes 5430 120 - (0, 2%) Complexe de plantes 5425 230 (0, 5%) Complexe de plantes 5390 120 - (1%) Complexe de plantes 4890 220 -9(ns) (5%) 2.2 EVALUATION DE LA CROISSANCE CELLULAIRE Croissance cellulaire après 48 heures de contact Les résultats sont regroupés dans le tableau ci- dessous: Incorporation de % d'incorporation [3H]-leucine (cpm) Témoin 13985 950 - Complexe de plantes 13432 120 ns (0,2%) Complexe de plantes 13241 230 ns (0,5%) Complexe de plantes 13370 120 ns (1%) ns: non significatif Croissance cellulaire après 72 heures de contact Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous: Lots Incorporation de % d'incorporation [3H]-leucine (cpm) Témoin 17855 1644 - Complexe de plantes 17855 1343 ns (0, 2%) Complexe de plantes 17230 1972 ns (0,5%) Complexe de plantes 17534 1612 ns (1%) ns: non significatif Commentaires Les résultats obtenus montrent que le produit " Complexe de plantes " aux concentrations 0,2%, 0,5%, 1% n'ont aucun effet sur l'incorporation de 3H-leucine dans les protéines de fibroblastes humains en culture après 48 et 72 heures de contact avec les cellules. Les résultats révèlent que le produit est dénué de toute activité cytotoxique aux concentrations utilisées. 2.3 EVALUTION DE L'ACTIVITE ANTI-INFLAMMATOIRE Dosage de l'Interleukine 1a Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous Lots IL1- a (pg/ml) % Témoin négatif 59,8 4,5 - Témoin UVB 118,2 16,8 +98 (10 0 mJ/cm2) Complexe de plantes 85,4 11,8* -27 (0,2%)+UVB (100 mj/cm2) Complexe de plantes 76,5 15,5* -35 (0,5%)+UVB (100 mJ/cm2) Complexe de plantes 72,8 9,9* -38 (1%)+UVB (100 mJ/cm2) *significativement différent par rapport au témoin positif irradié aux UVB (100 mJ/cm2) (p 2.4. EVALUATION DU TAUX DES PROTEOGLYCANES Dosage des protéoglycanes par incorporation du précurseur radioactif 35SO4 suivi par estimation en FPLC. Protéoglycanes péri-membrannaires Les résultats sont reportés dans le tableau ci-dessous: Lots Incorporation du % d'incorporation [35504] (cpm) Témoin 132 33 - Complexe de plantes 221 35* +68 (0,2a) Complexe de plantes 258 24* +96 (0, 5) Complexe de plantes 261 54* +98 (1) *significativement différent par rapport au témoin p 2.5 EVALUATION DU TAUX DES COLLAGENES La séparation et l'identification de l'hydroxyproline ont été réalisées par HPLC en phase inverse. Les pics de fluorescence, après intégration, ont permis de calculer la concentration de l'hydroxypoline dans le milieu de culture. Protéoglycanes péri-membranaires Les résultats sont reportés dans le tableau ci-dessous: Lots Incorporation du % d'incorporation 35SO4 (cpm) Témoin 1,85 0,4 Témoin + Vit C 2,98 0,48* +61 Complexe de plantes 2,24 0,49* +21 (0, 2%) Complexe de plantes 2,54 0,26* +38 (0,5%) Complexe de plantes 2,63 0,15* + 43 (1%) *significativement différent par rapport au témoin p 2.6 EVALUATION DU TAUX DES MMP3 Le dosage des MMP3 a été réalisé par des kits ELISA au niveau du milieu de culture. Les résultats sont reportés dans le tableau ci-dessous: MMP3 Concentration % (MMP3) (pg/ml) Témoin 105,8 10,6 - Complexe de plantes 84,4 9,9* -20 (0,2%) Complexe de plantes 75,5 6,7* - 328 (0, 5%) Complexe de plantes 62,2 8,4* -41 (1%) *significativement différent par rapport au témoin p REVENDICATIONS 1. Association d'extraits végétaux à base de groseille à Maquereau, d'Orchidée Noire et de Tulipe Noire. 2. Association selon la revendication 1, caractérisée en ce que chacun des extraits végétaux de Groseille à Maquereau, d'Orchidée Noire et de Tulipe Noire, est présent dans une teneur comprise entre 5 et 90%, ces teneurs étant exprimées par rapport au poids total de l'association. 3. Association selon la revendication 2, caractérisée en ce que les teneurs en chacun des extraits végétaux sont d'environ 25 à 50% ne poids par rapport au poids total de l'association. 4. Association selon la revendication 3, caractérisée en ce que les trois extraits végétaux sont présents en quantités sensiblement égales. 5. Composition topique pour le traitement ou la prévention des dommages de la peau associés au vieillissement de la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend une association selon la revendication 1 à 4. 6. Composition topique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une antihyaluronidase telle que Echinacine B, Imperata cylindrica, des protéines de graines d'amarante (Amarantus caudatus) ou des globulines de pois, de l'huile de Calophylum, de l'huile d'Echium, un palmitoyl pentapeptide-3 ou des dérivés tels que le palmitoyl GHK et le palmitoyl GQPR ou le palmitoyl VGVAPG associé à un céramide-2, ainsi qu'un céramide. 7. Utilisation d'une association selon la revendication 1 à 4, pour la préparation d'une composition topique destinée à lutter contre les dommages de la peau associés au vieillissement de la peau. 8. Procédé cosmétique pour combattre les dommages de la peau associés au vieillissement de la peau, qui comprend une étape consistant à appliquer à des zones de la peau affectées une composition contenant une quantité efficace de la composition topique selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6. 9. Procédé cosmétique pour l'amélioration de l'aspect externe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à appliquer une composition topique selon l'une des revendications 5 ou 6.