Brevet FR2861732A1 — publié le 20050506

La présente invention concerne un anticorps de type Fragment variable simple chaîne (scFv) anti-CD63 élaboré à partir des gènes codant pour les parties variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps monoclonal MOF11et ses utilisations. L'anticorps monoclonal MOF11 reconnaît une glycoprotéine transmembranaire de la famille des tétraspanines, le CD 63, présente à la surface de nombreux types cellulaires tels que les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les plaquettes activées, les cellules endothéliales, les hépatocytes, mais aussi les cellules de mélanomes et de lymphome. Il a été mis au point dans le laboratoire d'Immunologie de l'Université de Bordeaux 2 (1). Les protéines à quatre domaines transmembranaire appartenant à la famille des tétraspanines ( transmembrane four superfamily : TM4SF) possèdent une structure type supposée comprenant quatre régions hydrophobes hautement conservées, transmembranaires, flanquées de courtes séquences N et C terminales (figure 1). Entre les domaines hydrophobes 1 et 2 s'étend une petite boucle extracellulaire et entre les domaines 3 et 4 une large boucle. Excepté quatre cystéines hautement conservées il n'existe pas de séquence en amino-acides conservée dans la large boucle. La famille des tétraspanines inclut au moins seize membres partageant 20 à 30 % de séquences similaires. Six membres de cette famille (CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82) sont fortement représentés sur les leucocytes, les CD9, CD63 et CD81 sont présents à la surface de nombreux autres types cellulaires chez l'homme et de très nombreux animaux. L'existence de nombreuses molécules différentes de cette famille, aussi bien que leur expression dans des organismes aussi divers allant de l'homme au shistosome, suggère un rôle clé pour ces molécules. Malgré cela, les fonctions biologiques précises des protéines de la famille des tétraspanines ne sont pas encore parfaitement connues. Elles ont été décrites comme antigènes spécifiques de tumeurs, antigènes anti-prolifératifs, antigènes d'activation des cellules T, marqueurs spécifiques de sous-populations cellulaires, jouant un rôle dans l'adhésion cellulaire ou encore dans la migration et l'invasion de la matrice extra-cellulaire. Plusieurs de ces fonctions s'intègrent dans des phénomènes biologiques complexes de co-activation, de transduction de signal auxquels participent également les intégrines et les molécules du CMH II. Les protéines de la famille des tétraspanines seraient des adaptateurs transmembranaires qui organiseraient la distribution et les fonctions des autres molécules de surface ainsi que celles de leurs protéines de co-signal associées. De plus, il a été montré chez l'homme, que les tétraspanines jouent un rôle dans la pénétration au niveau du foie de Plasmodium falciparum dans le cas de paludisme (2) (1 à 2 millions de morts par an pour 500 millions de cas dans le monde) et du virus de l'hépatite C (3) (150 millions de porteurs dans le monde, 1 à 1,2% de la population française). La multiplication de ces pathogènes dans les cellules hépatiques joue un rôle important dans le développement de ces maladies infectieuses. Le CD63, membre de la famille des tétraspanines a été caractérisé pour la première fois en 1989, et a été cloné en 1990 par Metzelaar et al. (4). Le CD63 est une protéine de 238 acides aminés comportant trois sites supposés de Nglycolysation qui a été décrite comme antigène d'activation plaquettaire puis comme antigène membranaire spécifique de stades du mélanome (5). Son expression est forte dans les lignées myélomonocytaires (U937 et THP1), les granulocytes, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques folliculaires, mais pauvre dans les cellules de Langherans. Son expression est aussi importante dans les plaquettes activées. Des études récentes ont montré que le CD63, à la surface des cellules, est impliqué dans un réseau comportant d'autres molécules CD63, d'autres membres de la famille des tétraspanines, des molécules du CMH II (HLA-DR) et les intégrines VLA-3, VLA-4 et VLA-6 (6). Cette molécule protéique CD63 a été identifiée par ailleurs dans la membrane de différents types de granules intracellulaires comme dans les granules lysosomiaux, les corps de Weibel-Palade et les granules denses des plaquettes (7), ainsi que dans le compartiment du CMH II (8). Le CD63 peut être rapidement délivré à la membrane après l'activation par différents stimuli. Les fonctions du CD63 et celles du complexe multiprotéique auquel il participe demeurent inconnues. Il semble toutefois que cette glycoprotéine CD63 ait un rôle important dans la mobilité et la croissance des cellules. En effet l'inhibition par un anticorps monoclonal de la surexpression du CD63 a la capacité de réduire la prolifération et la formation de métastases des cellules de mélanomes humains (9). De plus, des activités tyrosine kinases et phosphatidylinositol-4 kinases ont été retrouvées associées au CD63 (10). Ces travaux suggèrent un rôle transducteur de signaux. Un anticorps monoclonal capable de reconnaître et de se lier à l'antigène CD63, tel que l'anticorps monoclonal MOF 11 pourrait donc permettre de diagnostiquer, prévenir et/ou traiter les pathologies liées au CD63. Cependant, l'utilisation d'anticorps monoclonaux hétérologues en thérapie présente un inconvénient majeur du fait de leur immunogénicité. En effet, celle-ci peut causer des chocs anaphylactiques, une clearance de l'anticorps dans le sang et une réduction de l'efficacité de sa fonction effectrice. Les inventeurs ont montré qu'un anticorps de type Fragments variables simple chaîne (scFv) élaboré à partir des gènes codant pour les parties variables des chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l'anticorps monoclonal MOF 11 possède la spécificité de l'anticorps monoclonal MOF11vis-à-vis de l'antigène CD63 et permet de réduire efficacement son immunogénicité puisqu'ils ne sont composés que des parties variables de l'anticorps d'origine, et permet de plus de diminuer les fixations non spécifiques qui se produisent en utilisant des anticorps entiers. Le MOF11est d'isotype IgG2b et marque les cellules de Langerhans et les leucocytes du derme ainsi que les cellules dendritiques isolées des amygdales, les monocytes, les polynucléaires et les macrophages. Il marque également les éosiniphiles, au repos, d'individus non allergiques et marque très fortement les cellules du cordon CD34 positives (11). Le MOF11 est également l'un des rares anticorps à inhiber considérablement la migration de neutrophiles (12), à activer la NADPH oxydase (13), et à supprimer l'activité de phagocytose des macrophages et cela à un degré supérieur à celui du contrôle positif (14). De plus, le MOF11détecte fortement l'antigène CD63 après stimulation (15). Un objet de la présente invention est donc un anticorps comprenant la partie variable de la chaîne lourde et la partie variable de la chaîne légère de l'anticorps monoclonal MOF11et ses variants fonctionnels. La présente invention a également pour objet un anticorps comprenant le Fragment variable simple chaîne (scFv) de l'anticorps monoclonal MOF11codé par SEQ ID N 11 et ses variants fonctionnels. Préférentiellement, l'anticorps de l' invention est codé par SEQ ID n l 1. Par variants fonctionnels , on entend désigner selon la présente invention des fragments scFv comprenant SEQ ID N 11 et/ou dérivant de SEQ ID N 11, c'est-à-dire différant de la séquence de référence par une ou plusieurs mutations et/ou délétion et/ou substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides nucléiques, n'altérant pas l'activité biologique de l'anticorps selon la présente invention. Ces variants fonctionnels peuvent être obtenus par toute technique bien connue de l'homme du métier telle que la mutagenèse dirigée ou aléatoire. Dans le texte ci-après, par anticorps , on entend selon la présente invention les anticorps de l'invention en tant que tels ainsi que les variants fonctionnels définis ci-dessus, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier, y compris par voie recombinante. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que principe actif au moins un anticorps selon la présente invention et un support pharmaceutiquement acceptable, notamment pour la thérapie humaine. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon la présente invention pour l'obtention de médicaments. En effet, quand une pathologie peut être traitée en ciblant une ou plusieurs catégorie (s) de cellules particulières et que celle(s)-ci exprime (nt), voire surexprime (nt) l'antigène CD63, ladite pathologie peut donc être traitée à titre préventif ou curatif par l'anticorps de l'invention. Dans un mode particulier de l'utilisation dudit médicament, ladite pathologie est un cancer tel que le lymphome B. Dans un autre mode préféré de ladite utilisation, ledit médicament est destiné à prévenir ou traiter les pathologies liées à la pénétration d'un agent pathogène dans les cellules hépatiques. Dans un mode particulier de ladite utilisation dudit médicament, lesdites pathologies liées à la pénétration d'un agent pathogène dans les cellules hépatiques sont le paludisme et l'hépatite C. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et éventuellement de numération de cellules présentant l'antigène CD63 à leur surface présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste : # à mettre en présence ledit échantillon à analyser avec au moins un anticorps selon la présente invention # à détecter, et éventuellement à compter, les complexes anticorps-antigène formés par toute technique appropriée telle que la cytométrie en flux, l'immuno-fluorescence ou les techniques immuno-enzymatiques. La numération des cellules présentant l'antigène CD63 à leur surface grâce à l'anticorps selon la présente invention permettrait entre autre d'affiner la numération différentielle des monocytes et macrophages, et d'identifier les plaquettes activées et les polynucléaires neutrophiles dégranulés. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic pour la détection spécifique et éventuellement la numérotation de l'antigène CD63, caractérisé en ce qu'elle comprend : # un anticorps, selon la présente invention, éventuellement modifié par marquage par tout marqueur approprié, notamment enzyme, fluorochrome et/ou fixé sur un support solide, # des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation si nécessaire. Bien entendu, cette trousse comprend également les réactifs couramment utilisés dans les détections de ce type à savoir : a) pour les tests par immunofluorescence, des anticorps couplés à un fluorochrome ainsi que des tampons et des supports appropriés ; b) pour les tests par voie enzymatique, des anticorps couplés à l'enzyme, les agents révélateurs de l'activité enzymatique, les tampons et les supports appropriés ; c) pour les tests radioimmunologiques, des anticorps modifiés par un marqueur radioactif, ainsi que les tampons et supports appropriés. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation des anticorps, selon la présente invention. Il va de soi, toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne sauraient constituer en aucune manière une limitation. Figure 1 : schématique des tétraspanines (d'après Maecker H.T., Todd S. C. and Levy S. (1997), The tetrasparin superfamily : facilitator. FASEB J. 11 : 428-442) Figure 2 : schématique du procédé d'ingénierie du scFv anti-CD63 et de son clonage dans le plasmide dérivé du pHOG 21 Figure 3 : SEQ ID n 4 Figure 4 : SEQ ID n 9 Figure 5: SEQ ID n 10 Figure 6: SEQ ID n 11 Figure 7 : Test ELISA permettant de mettre en évidence la fixation du scFv anti- CD63 produit dans E-coli sur la grande boucle de l'antigène CD63. EXEMPLES 1. Obtention de l'hybridome MoFll Le MOF 11anticorps monoclonal contre un antigène membranaire alors non identifié des leucocytes a été obtenu par la technique classique d'hybridation de cellules somatiques. Des souris BALB/c ont été immunisées avec des monocytes humains de donneurs sains obtenus après culture longue. Les cellules spléniques de la souris ont été fusionnées avec les cellules de myélome murin X63 Ag8. 653. Les anticorps du clone hybridome MOF11ont été purifiés à partir de surnageant de culture par chromatographie d'affinité sur protéine-A-Sépharose. Le tri des surnageants des puits d'hybridomes réagissant avec les monocytes a été effectué par immuno-fluorescence indirecte. L'hybridome MOF11a été sous-cloné deux fois par la méthode de dilution limite. Un sous-clone, C8 a été choisi sur des critères de bonne croissance et de production d'anticorps testée en cytométrie en flux. 2. Ingénierie du scFv anti-CD63 L'étape suivante a consisté à réaliser l'ingénierie du scFv anti-CD63 à partir des ARN totaux de l'hybridome MOF11, c'est-à-dire après transcription inverse, à amplifier par PCR les séquences codant pour les parties variables de la chaîne lourde (VH) et de la chaîne légère (VL) de l'anticorps et à les cloner dans un vecteur de clonage et d'expression dans la bactérie E. coli, le pHOG21d. Ce vecteur contient une origine de réplication multicopie, le gène de résistance à l'ampicilline permettant la sélection des bactéries renfermant le vecteur, un promoteur inductible par l'IPTG et des sites de restriction permettant le clonage des VH et VL en phase avec les séquences codant pour le peptide signal pelB, le peptide de liaison YOL, le peptide c-myc et un peptide de six acides aminés histidine. Le c-myc est une étiquette qui permet de détecter à l'aide d'un anticorps la protéine clonée ; peptide polyhistidine a la même fonction, et peut également être utilisé pour purifier la protéine sur colonne de nickel. Le clonage a été réalisé selon le schéma représenté figure 2. a) Clonage de la VH # Obtention de la VH Les ADNc du clone C8 ont été synthétisés par transcription inverse (kit Superscript II, GibcoBRL) avec soit une amorce oligo(dT) soit l'amorce Bi4 5'CAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT3' (SEQ ID N 1) spécifique des parties conservées en 3'des VH à l'intérieur d'une même famille d'Ig de souris. Un premier tour de PCR (figure 2) a ensuite été réalisé à partir des ADNc, à l'aide des amorces VHmouse 5'AGGT (GC)(AC)A(AG)CTGCAG(GC)AGTC(AT)GG3' (SEQ ID N 2) spécifique des parties conservées en 5'des VH et Bi4. Les produits de l'amplification ont été visualisés après électrophorèse en gel d'agarose. Un fragment d'ADN de 400 pb correspondant à la VH a été obtenu à partir des matrices ADNc oligo(dT) et ADNc Bi4. Aucun fragment de 400 pb n'a été observé pour les contrôles négatifs, réalisés en absence de transcriptase inverse ou en absence de matrice ADNc. Celle-ci est réalisée à l'aide des amorces VHmouse(NcoI) 5'CAGCCGGCCATGGC GCAGGT (GC)CAGCTGCAG(GC)AG3' ID N 3) et Bi4 5'CAGGGGCCAGTGGATAGACAAG CTTGGGTGTCGTTTT3' (SEQ ID N 1) qui permettent l'ajout des sites NcoI et Hindlll afin de cloner les produits amplifiés. # Digestions 400 ng des fragments ainsi obtenus ont été digérés à l'aide des enzymes Ncol et HindIII, purifiés et analysés sur gel d'agarose afin de les quantifier. Une concentration d'environ 8 ng/ l a été obtenue. En parallèle les mêmes étapes de digestion ont été réalisées à partir de g de vecteur pHOG21d purifié. Une concentration finale de 27 ng/ l a été obtenue. # Ligation et transformation Lors de la ligation, deux conditions ont été utilisées : - condition 1 : en extrémités (100 ng de vecteur pHOG21d et 12,5 ng d'insert) - condition 2 :trois fois plus d'insert (100 ng de vecteur pHOG21d et 37,5 ng d'insert) Les produits de ligation ont été introduits par électroporation dans les bactéries XLIBlue. Dans chaque condition, des bactéries transformées ont été obtenues. # Vérification du clonage de la VHdans le pHOG21d Cette vérification a été réalisée par PCR directe sur 12 colonies avec les amorces VHmouse (SEQ ID n 2) et Bi4 (SEQ ID n 1). Pour 7 colonies, (8. 1, 8.2, 8. 3, 8. 4, 8. 5, 8. 6 et 8.11) un fragment de 400 pb correspondant à la VH du MOF11a été amplifié. # Vérification de l'intégration de la VH dans le bon cadre de lecture L'intégration de la VH au sein du pHOG21d dans le bon cadre de lecture entraîne la production par les bactéries d'un scFv détectable en western blot à l'aide de l'anticorps anti-c-myc. Le western blot a été réalisé à partir des clones précédemment testés par PCR. Pour toutes les colonies positives en PCR, une protéine de 30kda correspondant au scFv a été détectée par western-blot. Les colonies testées négatives en PCR (8. 7, 8. 8, 8.9, 8.10) ne présentent aucun signal correspondant au scFv. # Détermination de la séquence codantpour la VH (SEQ ID n 1) La séquence de la VH des clones testés positifs en PCR et en western-blot a été effectuée et correspond à SEQ ID N 4 et à la figure 3. L'alignement de la séquence en acides nucléiques avec celles présentes dans les banques de données (V-base, Blast) révèle un pourcentage d'homologie avec des séquences de VH de souris de 95%. b) Clonage de la VL # Obtention des VL Un premier tour de PCR a été réalisé à partir des ADNc synthétisés par transcription inverse avec l'amorce oligo (dT). permet d'amplifier les VL à l'aide des amorces spécifiques des parties conservées en 5' et 3' des VL : VkD : 5'GACATCCAGATGAC (N)CAGTCTCCA3' (SEQ ID N 5) et Vk4: 5'CCGTTTCAG CTCCAGCTTGGTCCC3' (SEQ ID N 6) (16). A l'issue de la PCR, un fragment de 350 pb correspondant à la séquence codant pour la VL a été visualisé après électrophorèse en gel d'agarose. Aucun fragment de 350 pb n'a été observé pour les contrôles négatifs, réalisés en absence de transcriptase inverse ou en absence de matrice ADNc. Une deuxième PCR à l'aide des amorces VkDMIuI: 5'CATGATCCACGCGTAGAC ATCCAGATGACN3' (SEQ ID N 7) et Vk4NotI : 5'ACATGCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAG 3' (SEQ ID N 8) permet l'ajout des sites Mlu I et Not 1 afin de cloner les produits amplifiés. # Digestions. 400 ng des fragments ainsi obtenus ont été digérés à l'aide des enzymes MluI et Notl, purifiés et analysés sur gel d'agarose afin de les quantifier. Après purification une concentration de 4ng/ul est obtenue. En parallèle, 5 g de vecteur provenant du clone bactérien 8. 2 contenant la VH du clone C8 ont été digérés avec les mêmes enzymes. Après purification une concentration de 15 g/ l a été obtenue. # Ligation et transformation Les conditions de ligation et de transformation ont été identiques aux deux utilisées pour la VH. Des transformants ont été obtenus dans les deux conditions. # Vérification du clonage de la VL dans le pHOG21d 19 colonies issues du clone 8. 2 ont été testées par PCR directe à l'aide des amorces VkD (SEQ ID N 5) et Vk4 (SEQ ID N 6). Parmi ces 19 colonies, 10 colonies (8. 2.2 à 8. 2.6, 8. 2.8, 8. 2.13, 8. 2.15, 8. 2.18 et 8. 2.19) présentaient un fragment de 350 pb correspondant à la taille de la VL. # Vérification de l'intégration de la VL dans le bon cadre de lecture Parmi les 10 colonies testées par western-blot pour la présence du scFv, 9 colonies (8. 2.3, 8. 2.4, 8. 2.5, 8. 2.6, 8. 2.8, 8. 2.13, 8. 2.15, 8. 2.18 et 8. 2.19) se sont révélées positives. Les dix colonies testées positives en PCR ont ensuite été testées par western-blot à l'aide de l'anticorps anti-cmyc. Pour neuf colonies (8. 2.3, 8.2.4, 8. 2.5, 8. 2.6, 8. 2.8, 8. 2.13, 8. 2.15, 8. 2.18, 8. 2.19) une protéine de 30 kDa correspondant au scFv a été détectée. Détermination de la séquence du gène codantpour la VL La VL des clones testés positifs en PCR et en western-blot a été séquencée et correspond à SEQ ID N 9 et à la figure 4. L'alignement de la séquence en acides nucléiques consensus de la VL avec des séquences présentes dans des banques révèle une homologie d'environ 95% avec des séquences de VL de souris. 3. Production des scFv solubles A partir du clone 8. 2.8, des productions en bactéries XLIBlue (Stratagene) de plusieurs litres ont été réalisées, et les produits ont été analysés en western blot à l'aide de l'anti-c-myc. Les résultats nous indiquent que le scFv est produit dans le périplasme de la bactérie, mais n'est pas excrété dans le surnageant de culture. Le scFv a été obtenu après éclatement des bactéries et centrifugation. Le fragment scFv est alors retrouvé dans le surnageant. La séquence de ce scFv a été ensuite réalisée, elle correspond à SEQ ID N 10 et à la figure 5. Nous avons constaté la présence d'un codon STOP (TAG, apparaissant en gras souligné sur la figure 5) dans la VH. Pour éviter tout problème d'expression ultérieur nous avons procédé à une mutagenèse dirigée avec le Quickchange TM Sitedirected mutagenesis kit (Stratagene). Cette mutation a consisté à transformer le codon TAG en codon TGG (tryptophane, apparaissant en gras souligné sur la figure 6). Après transformation et production en bactéries BL21(Stratagene), la séquence définitive du scFv a été vérifiée et correspond à SEQ ID n 11et à la figure 6. La production du scFv dans les bactéries BL21 a de nouveau été vérifiée par western-blot et la fonctionnalité du scFv, c'est-à-dire sa capacité à se fixer sur l'antigène CD63 a été montrée en ELISA. Pour ce test, la grande boucle du CD63 a été purifiée puis fixée sur la plaque ELISA, les plaques ont ensuite été incubées avec différentes dilutions des fractions des bactéries BL21 transformées avec le gène codant pour le scFv ou de bactéries témoins transformées mais non induites. La présence du scFv a été révélée à l'aide de l'anticorps anti-c-myc marqué à la péroxydase et d'un substrat colorimétrique de la péroxydase. La densité optique de la réaction péroxydasique a été relevée pour chaque dilution. Les résultats sont présentés figure 7. Applications diagnostiques et thérapeutiques de l'invention Les tétraspanines sont associées avec la prolifération, la mobilité cellulaire et les métastases du cancer. Elles représentent une cible antigénique potentielle pour toutes les cellules exprimant le CD63, de plus Audran (17) a précisé que le complexe antigène CD63 et anticorps était le plus efficacement internalisé, en faisant le meilleur candidat pour transporter des drogues aux cellules cancéreuses. L'application au traitement des lymphomes B post-transplantation a été argumentée par JL Garnier au Third Symposium ou immunodeficiencies and malignancies de Berlin en 2001 en prenant comme exemple le MOF 11 anti-CD63 (18). Le scFv anti-CD63 pourrait donc être envisagé comme traitement des lymphomes B après couplage à des isotopes des toxines ou des Rnases. REFERENCES 1 Bézian J. H. and Vincendeau Ph. (1995). Leucocyte Typing V, volume 2, Oxford University Press, ppl 198. 2. Silvie O., Rubinstein E., Franetich J. F., Prenant M., Belnoue E., Renia L., Hannoun L., Eling W., Levy S., Boucheix C., and Mazier D. (2003). 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Anticorps selon la revendication 1 comprenant le Fragment variable simple chaîne (scFv) de l'anticorps monoclonal MOF11 codé par SEQ ID N 11 et ses variants fonctionnels. 3. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que principe actif au moins un anticorps selon la revendication 1 ou 2 et un support pharmaceutiquement acceptable. 4. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 1 ou 2 pour l'obtention de médicaments. 5. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce le médicament est destiné à prévenir ou traiter des cancers. 6. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce que le médicament est destiné à prévenir ou traiter les pathologies liées à la pénétration d'un agent pathogène dans les cellules hépatiques. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les pathologies liées à la pénétration d'un agent pathogène dans les cellules hépatiques sont le paludisme et l'hépatite C. 8. Procédé de détection et éventuellement de numération de cellules présentant l'antigène CD63 à leur surface présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste : - à mettre en présence ledit échantillon à analyser avec au moins un anticorps selon la revendication 1 ou 2 et - à détecter et éventuellement compter les complexes anticorps-antigène formés. 9. Trousse de diagnostic pour la détection spécifique et éventuellement la numération de l'antigène CD63, caractérisée en ce qu'elle comprend: des anticorps selon la revendication 1 ou 2, éventuellement modifiés par marquage par tout marqueur approprié, notamment enzyme, fluorochrome et/ou fixés sur un support solide, des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation si nécessaire.