Brevet FR2864245A1 — publié le 20050624

La présente invention est relative à un procédé pour mesurer quantitativement dans un moût, ou dans un vin, les protéines responsables de la casse protéique dans le vin embouteillé. Le vin embouteillé peut présenter après un temps plus ou moins long de conservation un trouble entraînant sa dépréciation et par là-même de fortes pertes économiques. II existe plusieurs types de troubles: casse blanche, ferrico-calcique, ferrique, bleue, protéique par exemple. Depuis une vingtaine d'années, le phénomène de trouble connu sous l'appellation de casse protéique a été étudié, ce qui a conduit à des méthodes de traitement du vin afin de l'éviter. Parmi les nombreuses méthodes préconisées, beaucoup n'ont pu être mises en oeuvre industriellement. Celle qui est la plus utilisée à ce jour, consiste en l'addition de bentonite sur des moûts avant débourbage ou sur des vins avant leur mise en bouteille. Cette technique est utilisée pour stabiliser des vins blancs, des vins effervescents et des vins rosés. Par contre les vins blancs secs destinés à être élevés sur lies, ne devront être traités à la bentonite qu'au terme de leurs élevages. Mais ce traitement à la bentonite a pour inconvénient de déprécier la qualité des vins. Pour prévoir si un vin risque d'être sujet à la casse protéique, il existe un certain nombre de tests qui permettent seulement d'évaluer le risque mais aussi de le quantifier. II s'agit en fait de tests de sensibilité à la casse protéique ou de présence de protéines dans le vin. Parmi ceux-ci les plus utilisés sont: - La méthode de l'anneau: Dans un tube à essai de 20 ml, on introduit du vin. On ajoute un millilitre d'une solution de tanin à 10 %. On chauffe à un point précis du tube en le faisant tourner sur la veilleuse du bec Bunsen. Au refroidissement, un anneau de protéines coagulées se forme à l'emplacement du chauffage. Ce test est facile, sensible et rapide. le Bentotest: On introduit 1 ml de Bentotest dans 20 ml de vin. On agite. En quelques minutes une coloration bleue se développe et un trouble se forme, plus ou moins intense. Ce test est trop draconien et trop peu spécifique. Il est positif dans des vins peu ou pas sensibles à la casse protéique car ils contiennent des protéines stables, celles de très hauts poids moléculaires. Une chose est certaine avec le Bentotest: quand il est négatif, on est sûr que le vin est stable. - Test à la chaleur: On chauffe un échantillon de vin au bain-marie à 80 C pendant 30 minutes sans addition de tanin; puis, après refroidissement pendant quelques heures, on mesure le trouble au néphélomètre. C'est le test recommandé par l'ONIVIN et par de nombreux auteurs comme le plus représentatif des protéines instables du vin. Il a été constaté à de nombreuses reprises en faisant parallèlement le Bentotest et le test à la chaleur à 80 C pendant 30 minutes que ce dernier est bien le plus fiable. Le résultat du test peut être lu au néphélomètre, mais aussi à l'oeil nu; la lecture est très facilement interprétable et avec un peu d'habitude, on peut cerner les doses nécessaires au traitement. Mais aucun de ces tests n'est considéré par les professionnels du vin comme étant ni totalement juste, ni vraiment spécifique. Par ailleurs, de plus en plus de pays édictent des réglementations imposant de mentionner si notamment un vin est exempt de substances allergènes ou sinon d'indiquer lesquels. En particulier les protéines responsables de la casse protéique pourraient être reconnues comme allergisantes: ceci est décrit en particulier dans l'article intitulé Nuisance proteins of wine are grape pathogenesis-related proteins paru dans Journal of Agricultural Food Chemistry (1966, 44, 3-5) et dans celui ayant pour titre Plant allergens and pathogenesis-related proteins (Int. Arch Allergy Immunol 2000; 122: 155-166). Aussi un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé pour mesurer quantitativement dans un moût ou dans un vin les protéines responsables de la casse protéique. Un but de l'invention est aussi de fournir un procédé de ce type qui permet de limiter la quantité de bentonite à utiliser. Un autre but de la présente invention est de fournir un tel procédé qui peut être mis en oeuvre de façon rapide et aisée. Un but supplémentaire de l'invention est de fournir un procédé qui permet de mettre en évidence que les moûts et vins sont dénués de substances allergènes. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour mesurer quantitativement dans un moût ou dans un vin les protéines responsables de la casse protéique, lequel procédé est caractérisé selon la présente invention, par le fait qu'il comprend les étapes suivantes: - a) on réalise une gamme étalon de protéines responsables de la casse protéique; - b) on prélève un échantillon du moût ou du vin à analyser; - c) on dépose sur des bandelettes en nitrocellulose des gouttes de chaque point de la gamme étalon et de l'échantillon, et on laisse sécher; - d) on sature les sites de fixation en protéines desdites bandelettes et on lave lesdites bandelettes; - e) on met en présence les bandelettes issues de l'étape d) avec des anticorps polyclonaux primaires dirigés contre les protéines de la casse protéique; - f) on lave les bandelettes; - g) on met en présence les bandelettes issues de l'étape f) avec des anticorps secondaires couplés à une peroxydase et dirigés contre les anticorps primaires; - h) on lave les bandelettes; - i) on dispose les bandelettes issues de l'étape h) dans une solution révélatrice: on obtient ainsi un précipité de couleur noire; et, - j) on compare visuellement les taches des sites correspondant à l'échantillon et à ceux de la gamme étalon afin de déterminer la quantité de protéines responsables de la casse protéique. De préférence, à l'étape a) on réalise la gamme étalon de 0 pg/pl à 15 pg/pl par dilution successive dans un tampon d'acétate de sodium 50 mM à pH 5. Avantageusement, à l'étape c) on dépose deux gouttes (50pl) de chaque point de la gamme étalon et de l'échantillon; puis on laisse sécher les bandelettes pendant environ 15 mn à l'air ambiant. De préférence, à l'étape d) on utilise un tampon Tris-Buffer-Saline (TBS) supplémenté avec 4 % en poids de lait en poudre écrémé. Puis, on lave les bandelettes avec le tampon TBS. Avantageusement, l'étape e) est réalisée sous agitation douce pendant environ 1 heure. De préférence, à l'étape f) on lave les bandelettes sous agitation douce par un tampon TBS-Tween à 0,05 % : ce lavage est réalisé trois fois, par exemple. Avantageusement, l'étape g) est réalisée sous agitation douce pendant environ 1 heure. De préférence, à l'étape h) on lave les bandelettes sous agitation douce par un tampon TBS-Tween à 0,05 % : ce lavage est réalisé trois fois, par exemple. Avantageusement, à l'étape i) la solution révélatrice est une solution d'eau oxygénée à 30 % diluée dans le tampon TBS et de 4-chloronaphtol dilué dans du méthanol. La description qui précède et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme du métier, à partir d'un exemple de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, de mieux comprendre la mise en oeuvre de celle-ci ainsi que les avantages que celle-ci procure. En premier lieu, étape a), on réalise une gamme étalon, de 0 pg/pl à 15 pg/pl, de protéines responsables de la casse protéique par dilution successive dans un tampon d'acétate de sodium 50 mM à pH 5. On prélève, étape b), un échantillon du moût ou du vin à analyser, de l'ordre de 0,5 ml: on dépose, étape c), sur des bandelettes en nitrocellulose des gouttes, soit environ 50 l, de chaque point de la gamme étalon et de l'échantillon, et on laisse sécher pendant environ un quart d'heure à température ambiante. Puis on dispose les bandelettes dans un récipient, par exemple dans un tube à hémolyse, contenant 2 ml de tampon Tris-Buffer Saline (TBS) supplémenté avec 4 % en poids de lait en poudre. Pendant environ 30 minutes à température ambiante, on agite le récipient de temps à temps afin de saturer, étape d), les sites de fixation en protéines des bandelettes. Ces bandelettes sont ensuite transférées dans un tube contenant 2 ml de TBS afin de les laver, étape d). Dans un récipient, tel qu'un tube à hémolyse, on met en présence, étape e) , les bandelettes issues de l'étape d) avec des anticorps primaires polyclonaux dirigés contre les protéines de la casse protéique: cette étape dure environ une heure sous agitation douce. Puis, étape f), on lave les bandelettes Ensuite, étape g), on met en présence les bandelettes issues de l'étape f) avec des anticorps secondaires couplés à une peroxydase et dirigés contre les anticorps primaires: ceci est réalisé, dans le présent exemple de réalisation en disposant les bandelettes dans un tube contenant 2 ml de tampon TBS supplémenté avec ces anticorps secondaires. On agite pendant une heure environ. Puis, étape h), on lave les bandelettes par agitation douce dans 3 fois 2 ml de tampon TBS-Tween à 0,05 % pendant 3 fois 5 minutes à température ambiante. Ensuite, étape i), on dispose les bandelettes issues de l'étape h) dans une solution révélatrice, qui est une solution d'eau oxygénée à 30 % diluée dans le tampon TBS et de 4-chloro-naphtol dilué dans du méthanol. Cette solution révélatrice est réalisée extemporanément. On obtient ainsi un précipité de couleur noire, qui est fixé sur la bandelette en nitrocellulose. Enfin, étape j), on compare visuellement les taches des sites présents sur les bandelettes de l'échantillon et à ceux des bandelettes de la gamme étalon afin de déterminer la quantité de protéines responsables de la casse protéique. Cette comparaison visuelle permet de quantifier les protéines responsables de la casse protéique, présentes dans l'échantillon de moût ou de vin, et par conséquent de déterminer l'éventuelle quantité de bentonite à utiliser. Ceci a notamment pour conséquence d'améliorer la qualité organoleptique des vins lo blancs, rosés et effervescents. Comme dit précédemment, ce procédé permet, ainsi que l'homme du métier a pu le comprendre, de certifier que ces vins ne comprennent pas de protéines allergisantes. REVENDICATIONS 1. - Procédé pour mesurer quantitativement dans un moût ou dans un vin les protéines responsables de la casse protéique, caractérisé par le fait qu'il comporte les étapes suivantes: - a) on réalise une gamme étalon de protéines responsables de la casse 5 protéique; - b) on prélève un échantillon du moût ou du vin à analyser; - c) on dépose sur des bandelettes en nitrocellulose des gouttes de chaque point de la gamme étalon et de l'échantillon, et on laisse sécher; - d) on sature les sites de fixation en protéines desdites bandelettes et on lave 10 lesdites bandelettes; - e) on met en présence les bandelettes issues de l'étape d) avec des anticorps polyclonaux primaires dirigés contre les protéines de la casse protéique; - f) on lave les bandelettes; - g) on met en présence les bandelettes issues de l'étape f) avec des anticorps 15 secondaires couplés à une peroxydase et dirigés contre les anticorps primaires; - h) on lave les bandelettes; - i) on dispose les bandelettes issues de l'étape h) dans une solution révélatrice: on obtient ainsi un précipité noir de protéines; et, - j) on compare visuellement les taches des sites correspondant à l'échantillon et à ceux de la gamme étalon afin de déterminer la quantité de protéines responsables de la casse protéique. 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape a) on réalise la gamme étalon de 0 pg/pl à 15 pg/pl par dilution successive dans un 25 tampon d'acétate de sodium 50 mM à pH 5. 3. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape c) on dépose deux gouttes (50p1) de chaque point de la gamme étalon et de l'échantillon. 4. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape c) on laisse sécher les bandelettes pendant environ 15 mn à l'air ambiant. 5. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape d) on utilise un tampon Tris-Buffer-Saline (TBS) supplémenté avec 4 % en poids de lait en poudre écrémé. 6. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape d) on lave les bandelettes avec le tampon TBS. 7. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'étape e) est réalisée sous agitation douce pendant environ 1 heure. 8. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape f) on lave les bandelettes sous agitation douce par un tampon TBSTween à 0,05 %. 9. -Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le lavage de l'étape f) est réalisé trois fois. 10. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'étape g) est réalisée sous agitation douce pendant environ 1 heure. 11. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape h) on lave les bandelettes sous agitation douce par un tampon TBSTween à 0,05 %. 12. -Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le lavage de l'étape h) est réalisé trois fois. 13. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape i) la solution révélatrice est une solution d'eau oxygénée à 30 % diluée dans le tampon 15 TBS et de 4-chloro-naphtol dilué dans du méthanol.