Brevet FR2872045A1 — publié le 20051230

H2N\/c02H R2 z A-t 3 AZ R3 R4- "Médicaments pour le traitement spécifique de symptômes de la maladie de Parkinson" L'invention vise l'utilisation d'analogues cycliques de l'acide glutamique pour fabriquer des médicaments pour le traitement spécifique de symptômes de la maladie de Parkinson (MP en abrégé). La MP est une affection dégénérative, rare avant 45 ans, touchant 1,5% de la population de plus de 65 ans, qui atteint autant les hommes que les femmes. Au cours de la maladie, la dégénérescence des neurones dopaminergiques de la Substance Noire Pars compacta (SNc) est accompagnée d'un dysfonctionnement des Ganglions de la Base (GB), structures souscorticales impliquées dans le contrôle de la motricité. Ces modifications d'activité se manifestent, par une hyperactivité réactionnelle des neurones glutamatergiques. Ces modifications d'activité au sein des GB sont responsables de l'expression des principaux troubles moteurs observés dans le cadre de la MP, à savoir: l'akinésie (retard dans l'initiation du mouvement) et la bradykinésie (ralentissement de l'exécution motrice), la rigidité musculaire et le tremblement au repos. A ces différents troubles moteurs s'ajoutent des atteintes cognitives diverses, relatives aux capacités attentionnelles, mnésiques, ainsi que des troubles motivationnels. Si l'étiologie de cette pathologie est encore mal connue, des traitements palliatifs existent en clinique humaine et visent principalement à augmenter les taux de dopamine dans les structures cibles de la SNc, au moyen d'administrations régulières de son précurseur, la L-DOPA. Ce type de traitement reste le plus utilisé actuellement, mais il présente plusieurs inconvénients majeurs: son efficacité diminue progressivement avec l'évolution de la maladie, et la répétition des prises ainsi que l'augmentation des doses de L-DOPA conduit, après plusieurs années de traitement, à l'apparition de fluctuations motrices et de mouvements involontaires sévères et invalidants (dyskinésies). Afin de proposer des stratégies de traitements alternatifs à la DOPA thérapie, et de mieux appréhender le fonctionnement et les relations, normales et pathologiques, des différentes structures qui constituent les GB, de nouvelles voies de recherche tentent de caractériser les effets du blocage ou de l'activation de différents systèmes neuronaux dont l'activité est modifiée par la neurodégénérescence dopaminergique. Dans ce contexte, des études, réalisées dans différents modèles animaux de la MP, ont pu montrer une implication, des récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR). Parmi les différents groupes de mGluR, le rôle fonctionnel des mGluR du groupe III est encore mal connu. Or, les soustypes mGluR4 et R7 de ces récepteurs présentent la particularité d'être exprimés au niveau présynaptique sur certaines catégories de neurones, supposés hyperactifs au cours de la MP, et en particulier sur les neurones gabaergiques du striatum, qui projettent au niveau du Globus Pallidus (GP). Les inventeurs ont étudié l'implication des mGluR du groupe III dans la régulation de l'activité des GB. Ils ont alors constaté que, de manière surprenante, des agonistes sélectifs de récepteurs du groupe III, et des mGluR4 en particulier, étaient capables d'activer des récepteurs dans le GP de modèles expérimentaux, et de réduire l'akinésie dans ces modèles, montrant leur effet régulateur de l'hyperactivité gabaergique au niveau du GP et le rôle essentiel de cette structure dans l'expression de troubles moteurs associés à la MP. L'invention a donc pour but l'utilisation d'agonistes de récepteurs glutamatergiques pour fabriquer des médicaments permettant de traiter de manière spécifique certains symptômes de la MP particulièrement invalidants chez les patients. Elle vise également une méthode de traitement de ces symptômes mettant à profit les propriétés de ces agonistes. L'invention vise ainsi plus particulièrement l'utilisation, pour fabriquer des médicaments permettant de traiter les symptômes d'akinésie dans la MP, de composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) H2N\/C 02H RI\/1 R2 2 Al 4 3 A2 R3 R4 dans laquelle -R1 à R4, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle ou un radical aryle, ces radicaux étant le cas échéant eux-mêmes substitués, R1 et R2 ensemble pouvant en outre représenter un pont -(CH2)m-, où m est un entier de 1 à 5, ou un pont X représentant une combinaison linéaire de m groupes hydrocarbonés, m étant tel que défini ci-dessus, et comportant, le cas échéant, au moins un hétéro-atome tel que 0, N ou S, ou un pont X représentant une combinaison linéaire de p hétéroatomes 0, N et/ou S, où p est un entier de 1 à 3, -A1 et A2 représentent des radicaux -COOH, -SO3H ou -P03H2, ou leurs dérivés tels qu'esters ou amides, - Y représente une chaîne hydrocarbonée - (CH2)n-, n étant nul ou un entier de 1 à 5, ou représente une combinaison linéaire de n groupes hydrocarbonées et au moins un hétéroatome 0, N ou S, ou une combinaison linéaire de q hétéroatomes 0, N et/ou S, où q est un entier de 1 à 3. Ces composés sont décrits dans le brevet EP 0 970 043 au nom du CNRS et les brevets correspondants. L'invention vise de manière préférée l'utilisation d'une famille formée de composés monocycliques. Il s'agit de composés de formule I dans laquelle Y n'existe pas et les carbones portant R1 et R2 ne sont pas reliés entre eux en formant l'un des ponts précités. L'invention vise encore l'utilisation d'une autre famille dans laquelle les composés sont également monocycliques et répondent à la formule I ci-dessus, dans laquelle les carbones portant R1 et R2 ne sont pas reliés entre eux en formant l'un des ponts précités, et Y représente un groupe ou une combinaison comme défini ci-dessus. L'invention vise également l'utilisation d'une autre famille dans laquelle les composés sont bicycliques et répondent à la formule I ci- dessus dans laquelle X ou à la fois X et Y sont présents et sont définis comme indiqué ci-dessus. Dans un groupe préféré de composés de ces différentes familles utilisés selon l'invention, Al et A2 sont identiques. Dans des composés préférés de ce groupe Al et A2 représentent tous deux un groupe carboxyle, ou les esters ou amides correspondants. Dans un autre groupe de composés de ces différentes 30 familles utilisés selon l'invention, Al et A2 sont tels que définis plus haut, mais diffèrent l'un de l'autre. Des composés avantageux de ces familles et groupes comprennent des substituants R1, R2, et/ou R3 et R4 représentant un radical alkyle ou aryle, ces radicaux étant le cas échéant substitués. Par radical "alkyle", on entend conformément à l'invention un radical de 1 à 10 atomes de carbone, notamment de 1 à 5 atomes de carbone. Par radical "aryle", on entend un radical aromatique mono- ou polycyclique. Un radical aryle préféré est constitué par le radical phényle. Les radicaux alkyle ou aryle peuvent être substitués, par exemple, par un atome d'halogène ou un groupe hydroxyle. Dans d'autres composés avantageux, R1 et R2 et/ou R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène. Les composés définis ci-dessus utilisés conformément à l'invention peuvent exister comme molécules achirales ou chirales, sous forme de différents diastéréoisomères, éventuellement comme racémique, le cas échéant sous forme de l'un des énantiomères. L'invention vise particulièrement l'utilisation de l'acide 1-aminocyclopentane-1,3,4 tricarboxylique de formule H2N,, 1CO2H HO2C CO2H ACPT I = meso-cis ACPT = (1S, 3R, 4S) pour fabriquer des médicaments permettant de traiter les symptômes d'akinésie dans la MP qui correspond, comme indiqué ci-dessus, à l'un des symptômes les plus invalidants chez les patients. Ce composé est désigné par "ACPT-1" dans le brevet 25 EP 0 970 043 indiqué plus haut. Les inventeurs ont testé les effets d'injections intrapallidales de l'ACPT-I dans différents modèles expérimentaux analogues de la MP chez les rats. Les modèles utilisés au cours de ces expériences correspondent à des modèles d'akinésie (perte de l'"initiation motrice"), induit soit par lésion bilatérale partielle des neurones dopaminergiques de la SNc, soit par blocage pharmacologique des récepteurs dopaminergiques par l'halopéridol. Afin de mettre en évidence les effets du traitement à l'ACPT-1, des tests comportementaux adaptés (test de temps de réaction simple (TR) et test de catalepsie) ont été utilisés. Le test de TR est couramment utilisé en clinique afin d'évaluer les déficits akinétiques chez les malades Parkinsoniens (Gauntlett-Gilbert et Brown, 1998). Il permet l'étude des processus impliqués dans la préparation du mouvement comme la détection et le traitement de l'information sensorielle, la planification, la programmation et le déclenchement du mouvement. L'exécution correcte du mouvement (i.e avec une contrainte temporelle) nécessite un haut niveau d'attention et de motivation. Le test de catalepsie permet de mettre en évidence des déficits moteurs qui s'apparentent à une akinésie. Cette étude repose donc sur l'utilisation de modèles expérimentaux de la MP chez le rat, dans le but de caractériser les effets de l'administration intra-pallidale d'ACPT-1, agoniste mGluR4, dans différents tests comportementaux permettant d'évaluer des capacités motrices et cognitives. Des données considérables de la littérature portant sur l'étude fonctionnelle des systèmes dopaminergiques ont été suscitées par la découverte d'une toxine spécifique des neurones catécholaminergiques centraux, la 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Chez les rongeurs, l'effet principal de ce type d'exclusion neurochimique visant à détruire les neurones dopaminergiques mésencéphaliques par voie unilatérale se traduit par une asymétrie posturale accompagnée d'un comportement de rotation. L'utilisation de cette approche, qui est largement utilisée comme "modèle de la maladie de Parkinson" et a conduit à la mise en évidence de phénomènes importants, pose cependant quelques questions. La pathologie Parkinsonienne, dont l'origine est une atteinte unilatérale des neurones du système nigrostrié, qui évolue très rapidement vers une pathologie bilatérale. De plus, les perturbations comportementales observées ne peuvent être décelables pour des taux de déplétion en dopamine inférieurs à 90 Enfin, les déficits moteurs mis en évidence dans le comportement de rotation ne reflètent pas l'importance et la variété des désordres observés chez les malades parkinsoniens qui englobent la sphère motrice et cognitive. Il est donc apparu évident de mettre au point un test comportemental qui puisse mettre en évidence des perturbations d'ordre moteur mais également d'ordre cognitif après suppression de la transmission dopaminergique chez le rat. Ce test devait également être suffisamment sensible pour détecter des déficits produits par de faibles déplétions en dopamine, plus à même de refléter les étapes précoces de la maladie. Les inventeurs ont donc développé une tâche comportementale, dérivée du protocole de mesure de temps de réaction simple permettant d'évaluer des déficits akinétiques chez les malades Parkinsoniens. La mesure des performances d'animaux entraînés à effectuer un mouvement de la patte en réponse à un stimulus lumineux avec une contrainte en rapidité, permet ainsi d'appréhender les processus intégratifs nécessaires à l'association entre un stimulus conditionné et une réponse motrice appropriée. Les animaux sont entraînés à maintenir un appui sur une pédale avec une patte antérieure jusqu'à l'apparition d'une lumière (stimulus conditionné ou impératif) pendant une durée variable et aléatoire. Ils doivent alors relâcher la pédale le plus rapidement possible pour obtenir une récompense alimentaire (voir protocole expérimental). Les performances motrices sont exprimées en nombre d'essais réussis, pour lesquels le temps de réaction est mesuré entre l'apparition du signal lumineux et le relâchement de la pédale ainsi qu'en nombre d'échecs, relâchements trop précoces de la pédale (mouvements anticipés) ou trop tardifs (supérieurs à une limite de temps imposée). a) Composantes motrices de la tâche de TR Dans le modèle expérimental analogue de la maladie de Parkinson des injections locales bilatérales de 6-OHDA ont été effectuées au niveau du striatum dorsal ou ventral (noyau accumbens) dans les aires de projection des neurones dopaminergiques. Les inventeurs ont montré qu'une destruction partielle des terminaisons dopaminergiques nigrostriées (environ 60 % de baisse des taux de dopamine dans la partie postérieure et dorsale du striatum), induite par une injection de 6-OHDA au niveau du striatum, se traduisait par une hypokinésie qui correspondait à des allongements des temps de réaction et une augmentation des "essais tardifs" alors que la destruction des neurones dopaminergiques de la voie mésolimbique ne provoquait aucun déficit (Amalric and Koob 1987). Ces résultats ont donc permis de conclure que de faibles taux de déplétion en dopamine au niveau du striatum pouvaient produire des déficits comportementaux quantifiables sur des paramètres moteurs précis, chez le rat. b) Composantes attentionnelles dans la tâche de TR Des troubles de l'attention sélective, fonction correspondant à la sélection des informations perceptives, permettant un meilleur traitement des informations sélectionnées, peuvent s'exprimer dans la sélection de réponses lors de tests simples. La mesure du temps de réponse dans la tâche en TR permet ainsi la mise en évidence de certains traitements de l'information. Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, sont utilisés en quantités thérapeutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont préparés sous forme de tablettes, gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, liposomes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité, de préférence de 2,5 à 50 mg. Compte tenu, de l'activité de l'ACPT-1 sur la voie gabaergique, l'invention vise également l'élaboration de médicaments administrables de manière systémique par voie injectable. Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sou-cutanée, intramusculaire). Les médicaments se présentent alors sous forme de solutions stériles ou stérilisables. Les doses par unité de prise peuvent varier de 0,5 à 50 mg de principe actif, de préférence de 1 à 30 mg. Les médicaments de l'invention sont utilisables au stade 20 pré-clinique ou clinique de la maladie. L'invention vise aussi une méthode de traitement de l'akinésie dans la MP, caractérisée par l'administration de d'au moins un composé tel que défini ci-dessus, en quantités thérapeutiquement acceptables. Elle vis tout particulièrement une méthode de traitement de l'akinésie dans la MP comprenant l'administration de l'ACPT-l. Cette méthode est mise en oeuvre notamment en administrant les médicaments par voie orale ou par voie injectable, selon les formes et quantités indiquées ci-dessus. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les résultats rapportés ci-après afin d'illustrer l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 5 qui représentent, respectivement: Figure 1: Effet de l'injection intrapallidale d'ACPT-I dans un test de catalepsie. A. Médiane des latences de descente. Les résultats présentés corrspondent aux médianes des latences de descentes pour chaque 5 temps (TO à T60) après injection d'ACPT-I. B. Somme des latences sur 60 minutes. Les résultats présentés correspondent au temps total passé sur la barre. * p Figure 2: Effets à long terme de la lésion dopaminergique dans un test de temps de réaction simple. A. Effets sur les réponses correctes. B. Effets sur les réponses tardives. C. Effets sur les réponses anticipées. Les résultats présentés correspondent aux moyennes SEM des performances: de la condition préopératoire (7 sessions: J-7 à J-1). - de la condition postopératoire à court terme (Postl: J10 à J16). - de la condition Post2 (J17, 20, 21, 24, 25, 28, 29) - de la condition Post2 (J32, 34,36, 37, 38, 39,40) Lésés: n=24 / Témoins: n=11. * p Figure 3: Effets de la lésion dopaminergique et de PACPT-I en injection intra-pallidale dans un test de temps de réaction simple. A. Distribution des TR moyens en période Pré et Postopératoire. Les résulatats présentés correspondent aux moyennes SEM des performances: - de la condition préopératoire (7 sessions: J-7 à J-1). - de la condition postopératoire à court terme (Posta: J10 à J16). Lésés: n=24 / Témoins: n=11. B. Effet des injections intra-pallidales d'ACPT-I sur les TR moyens. Les résultats présentés correspondent aux moyennes SEM des performances: - de la condition préopératoire (7 sessions: J-7 à J-1). de la condition postopératoire (4 sessions qui précèdent les injections: 40 J21,25,29,33). des jours d'injections (J22; J26; J30; J34 respectivement). Lésés: n= 17 / Témoins: n=7. * p # p Figure 4: Effets de PACPT-I en injection intra-pallidale dans un test de temps de réaction simple. A. Effets sur les réponses correctes. B. Effets sur les réponses tardives Les résultats présentés correspondent aux moyennes SEM des performances: - de la condition préopératoire (7 sessions: J-7 à J-1) - de la condition postopératoire (4 sessions qui précèdent les injections: J21,25,29,33). - des jours d'injections (J22; J26; J30; J34 respectivement). Lésés: n= 17 / Témoins: n=7 * p # p p Figure 5: Effets de l'ACPT-I en injection intra-pallidale sur les réponses anticipées dans un test de temps de réaction simple. Les résultats présentés correspondent aux moyennes SEM des performances: - de la condition préopératoire (7 sessions: J-7 à J-1) - de la condition postopératoire (4 sessions qui précèdent les injections: J21,25,29,33). - des jours d'injections (J22; J26; J30; J34 respectivement). Lésés: n= 17 / Témoins: n=7 * p # p MATERIEL ET METHODES - 1. Animaux. Les animaux utilisés (n=64) sont des rats mâles Wistar (Charles River) pesant entre 350 et 370g au moment de la phase de chirurgie. Les animaux ont été placés par cage de deux, avec un accès libre à la nourriture et à l'eau. Par la suite, l'apport de nourriture a été rationné pour les rats utilisés dans le test de temps de réaction simple (TR - 2. Substances pharmacologiques - La 6-hydroxydopamine (6-OHDA) est une toxine spécifique des neurones catécholaminergiques. Elle est utilisée dans le but d'induire des lésions des neurones dopaminergiques (DA). La 6-OHDA est dissoute à une concentration de 4 log/dal dans un solvant comprenant du sérum physiologique (NaCl 9%) et de l'acide ascorbique (0.1%). - L'Halopéridol (Haldol, Janssen-Cilag, solution injectable à 5mg/ml), antagoniste des récepteurs dopaminergiques D2, est injecté par voie intrapéritonéale (i.p.) pour un volume de lml/kg. Cette substance est diluée dans du sérum physiologique pour une concentration finale de 1 mg/kg. - L'acide (1S, 3R, 4S) -1-aminocyclopentane-1, 3, 4-tricarboxilique (ACPTI) est un agoniste sélectif des récepteurs mGluR4. L'ACPT-I a été dissous dans de l'eau stérile, puis dans une solution de HC1 à 0,1N, puis le pH est réajusté à 7 au moyen de quelques gouttes de NaOH à 0,1N. Les concentrations d'ACPT-I utilisées sont de 1, 2.5 et 5nmol/ l. L'ACPT-1 a été injectée dans le GP. - 3. Chirugie 3.1. Lésion dopaminergique. La 6-OHDA est injectée au niveau du striatum dorsal, et va donc être captée par les terminaisons synaptiques des neurones DA grâce au système de recapture de la dopamine (DAT: DA Transporter), puis transportée de façon rétrograde jusqu'aux corps cellulaires de ces neurones. Une fois incorporée dans les neurones DA, cette molécule entraîne une augmentation des taux de radicaux libres, ce qui provoque un stress oxydatif et induit une dégénérescence des neurones DA. Les animaux ont été répartis en deux groupes expérimentaux, lésés 6-OHDA (i.e. "lésés" n=28) et "témoin" (n=12). Les rats ont été lésés selon le protocole décrit par Baunez et al (1995). 3.2. Implantation bilatérale de canules dans le globus pallidus. L'ensemble des animaux testés dans cette étude ont été canulés bilatéralement au niveau du globus pallidus, afin d'évaluer ultérieurement les effets de l'ACPT-I, lors des différents tests comportementaux (test de TR et de catalepsie). Cette opération intervient après l'injection de 6-OHDA (ou son solvant) et a été décrite dans Almaric et Koob (1989). 3.3. Procédure d'injection intracérébrale Après récupération postopératoire et reprise de la performance du test de TR, les injections ont été réalisées dans le GP chez les rats non anesthésiés quelques min avant le test. Pour cela, des injecteurs en acier inoxydable de 13 mm de longueur et de 0.3mm de diamètre externe sont insérées dans les canules implantées. Ils sont connectées à deux seringues Hamilton de 10 gL par deux tubulures souples. Les seringues sont actionnées par une micropompe et le volume d'injection est fixé à 0.5 gL pour un débit de 0.166 gL/min. Les animaux reçoivent donc l'ACPT-1 aux concentrations de 0,5, 1,25 et 2, 5 nmol/0.5 gL dans chaque GP. A la fin de l'injection, le système est laissé en place pendant trois minutes supplémentaires afin d'éviter toute remontée du produit et d'assurer ainsi sa diffusion complète. - 4. Dispositifs expérimentaux. 4.1. Test de Catalepsie. Le dispositif utilisé lors du test de catalepsie induite par l'halopéridol est constitué d'un support sur lequel une barre métallique horizontale est fixée à une hauteur neuf centimètres 4.2. Test de Temps de Réaction Simple. Le dispositif expérimental utilisé lors du test de TR est constitué de huit cages de conditionnement identiques contenant un levier rétractable, au dessus duquel se trouve une lampe qui sert de stimulus lumineux. A la droite du levier, se trouve une mangeoire reliée à un distributeur de nourriture automatisé. Lors du démarrage des cages de conditionnement, le levier, jusqu'alors rétracté et inaccessible, se met en place. Chaque cage est placée dans une boîte munie d'un système de ventilation qui permet de maintenir un fond sonore homogène et d'atténuer les bruits extérieurs (Figure 1A). Ces différentes cages sont reliées à une interface MED PC (Med Associates inc, Georgia, Vermont), elle-même reliée à un ordinateur qui enregistre les données via le logiciel MED PC II. - 5. Procédures comportementales 5.1. Test de Catalepsie. 5.1.1. Principe du test de catalepsie induite par l'halopéridol. Le test de catalepsie est basé sur le fait que des animaux placés dans une position inconfortable modifient immédiatement leur posture à l'état normal. L'effet cataleptogénique de certains composés pharmacologiques, se manifeste par le fait que les animaux ne réagissent qu'après une certaine latence. L'administration d'antagonistes des récepteurs dopaminergiques à dose élevée, tel que l'halopéridol, est connue pour induire des effets cataleptiques chez les rongeurs. Afin de quantifier l'intensité de cet état cataleptique (qui s'apparente à une akinésie parkinsonienne), les pattes antérieures des rats sont positionnées sur une barre horizontale, et les latences de descente de la barre sont mesurées, jusqu'à un temps limite de 120s. 5.1.2. Protocole expérimental. Les animaux sont d'abord canulés afin de pouvoir injecter l'ACPT-I ou son solvant dans le GP. Après sept jours de récupération post-opératoire, les effets de l'ACPT-I à 1 et 5 nmol/ L sont évalués séparément au cours de deux expériences espacées d'une semaine. Une phase de test se déroule de la façon suivante: à un temps donné, les rats reçoivent une injection i.p. d'halopéridol ou de son solvant. Les animaux reçoivent, 85 min plus tard, une injection intra-pallidale d'ACPTI. Immédiatement après l'injection, qui correspond approximativement à 90 min post injection d'halopéridol (ou de son solvant), les rats sont placés délicatement sur la barre horizontale et les temps de descente sont mesurés pour la première fois (Test 0, noté TO). Afin d'évaluer la durée d'action de la drogue, les rats sont ensuite testés toutes les dix minutes pendant une heure (de T10 à T60). 5.2. Test de Temps de Réaction Simple. 5.2.1. Principe du test de Temps de Réaction Simple. Le test utilisé repose sur un conditionnement opérant à renforcement alimentaire. Les animaux doivent apprendre à associer le renforcement avec une séquence motrice précise. Les rats sont entraînés à appuyer sur un levier, à attendre l'apparition d'un signal lumineux et à relâcher le levier avec un TR court n'excédant pas 600 ms pour être récompensés par une boulette de nourriture de 45 mg. Le signal lumineux, qui constitue le stimulus impératif de déclenchement de la réponse, peut apparaître suivant quatre délais aléatoires et équiprobables de 500, 750, 1000 et 1250 ms. Les animaux peuvent produire trois types de réponses: des réponses correctes pour lesquelles le levier est relâché avec un TR inférieur à 600 ms, et des réponses incorrectes, non récompensées, qui peuvent être soit des réponses anticipées, pour lesquelles le rat relâche le levier avant l'apparition du stimulus, et des réponses tardives, pour lesquelles l'animal relâche le levier avec un TR supérieur à 600 ms (FigurelB). Les sessions quotidiennes de conditionnement comprennent un total de 100 essais qui peuvent être soit des réponses correctes, soit des réponses retardées. Les réponses anticipées sont comptabilisées séparément. Lorsque l'animal relâche le levier trop tôt pour un délai donné d'apparition de la lumière, le même délai est présenté à l'essai suivant, et ceci jusqu'à ce que l'animal réalise une réponse correcte ou longue. Le nombre maximal des réponses anticipées par session n'est donc pas limité. Cette méthode de quantification permet d'obtenir un nombre équivalent de mesures des temps de réaction pour chaque valeur de délaid'apparition du stimulus (25 mesures de TR par délai, par session et par rat). Une session s'achève après 100 essais, ou lorsque 30 min se sont écoulées. 5.2.2. Variables expérimentales. Durant chaque session, les variables suivantes sont enregistrées: - Le nombre de réponses correctes, retardées et anticipées décrites précédemment. - Le temps de réaction (TR) correspond au temps mis par l'animal pour relâcher le levier après apparition du signal lumineux. Les TR maximum autorisé, pour qu'une réponse soit considérée comme correcte, est limité à 600 ms. 5.2.3. Protocole expérimental. Après la fin du conditionnement, les performances des rats sont enregistrées pendant les sept jours qui précèdent la chirurgie (J-7 à J-1) . Les mesures effectuées durant cette phase constituent les performances pré-opératoires des animaux. Après une période de récupération de 10 jours (JO à J9), les rats sont à nouveau testés dans la tâche de TR pour une période de sept jours (J10 à J16), et les mesures effectuées pendant cette période constituent les performances post-opératoires à court terme (Postl). A J18, les rats reçoivent une première injection intra-pallidale d'eau stérile (solvant de l'ACPT-I). Cette première injection a pour but d'habituer les rats aux injections intracérébrales et les performances réalisées à J18 ne sont donc pas prises en compte lors de l'analyse des résultats. Afin d'évaluer l'effet du traitement à l'ACPT-I en injection intra-pallidale, chez les animaux du groupe Témoin et du groupe Lésé , les rats reçoivent ensuite trois injections de la drogue à différentes concentrations (1, 2.5 et 5 nmol/ L) et une injection de solvant suivant un protocole de "pseudo carré latin". Au cours de cette phase de traitement, chaque animal reçoit donc le solvant et les différentes doses d'ACPT-I, et ceci dans un ordre différent, aux jours J22, J26, J30 et J34 post- opératoires. Toutes les combinaisons n'étant pas réalisables, seuls quatre ordres d'injection ont été testés (d'où le terme de pseudo carré latin). Immédiatement après les injections, les performances des animaux sont mesurées dans le test de TR, et comparée aux performances réalisées la veille des injections (J21, J25, J29 et J33), qui constituent un niveau de référence. Les effets à long terme de la lésion sont évalués lors des sessions quotidiennes sans injection et ceci jusqu'à J40 postopératoire. Les sessions sont séparées en bloc de sept jours et sont notés Post 2 et Posta. Les analyses des TR en fonction du délai ont été réalisées lors de 4 sessions consécutives en Pré, Postl et pour chaque jour d'injection. - 6. Histologie. A la fin des expériences, les animaux ont été décapités à l'aide d'une guillotine. Les cerveaux ont été prélevés rapidement, puis congelés dans de la carboglace et conservés à -80 C dans un congélateur. Des coupes de 10 dam d'épaisseur sont ensuite réalisées à l'aide d'un cryostat au niveau du striatum (pour les rats du test de TR) et du GP (pour tous les rats), puis montées sur des lames de verre gélatinées et replacés à -80 C. Les lames correspondant au GP seront ensuite colorées au crésyl violet afin de vérifier la position exacte des sites d'injection. Dans le but de vérifier l'étendue des lésions dopaminergiques, les coupes de striatum seront marquées au 3H-mazindol (ligand radioactif des transporteurs de la dopamine) puis révélées grâce à un film d'autoradiographie. - 7. Analyses statistiques. La significativité des effets observés a été testée à l'aide du programme "Statview". Pour le test de catalepsie, les tests statistiques utilisés sont des tests non paramétriques (les temps de latences ne suivent pas une distribution normale, car leurs valeurs maximales sont limitées à 120 secondes). Afin d'analyser les différences générales entre tous les groupes, un test de Kruskal Wallis est utilisé, suivi d'un test de Mann Whitney pour comparer les résultats entre deux groupes expérimentaux. Pour étudier les différences entre deux groupes pour un temps donné (TO à T60 post injection d'ACPT-1 ou de son solvant), des tests de Mann-Whitney ont été réalisés. Dans tous les cas, le seuil de significativité retenu est de 95% (p RESULTATS - 1. Test de Catalepsie. 1.1. Effets de l'halopéridol. En comparaison avec les animaux témoins ("NaCl + solvant ACPT-I") qui ne restent sur la barre que quelques secondes (latence de descente inférieure à l0s), les latences des rats traités à l'halopéridol et au solvant de l'ACPT-I augmentent progressivement au début de l'expérience pour atteindre la valeur maximale de 120s à T20 (Figure 2A et 2B). La valeur des latences pour les animaux du groupe halopéridol + solvant est donc bien supérieure au groupe NaCl + solvant (test de rang de Mann Whitney, p 1.2. Effets de l'ACPT-I. Les latences de descente des animaux du groupe "halopéridol + ACPT-I à lnmol/pL" diminuent fortement par rapport aux rats du groupe halopéridol + solvant (test de Mann Whitney, p Pour le groupe "halopéridol + ACPT-I à 5nmol/pL", aucune différence n'est observée par rapport au groupe halopéridol + solvant. De plus, les latences pour ce groupe sont supérieures à ceux du groupe NaCl + solvant, et ceci pour tous les tests réalisés (Mann Whitney, p - 2. Test de Temps de Réaction Simple. Les résultats concernant les effets de la chirurgie et du traitement à l'ACPT-I, ainsi que les analyses statistiques présentés, portent sur un total de n=35 animaux. Ces rats sont répartis en deux groupes: "lésé", n=25 et "témoins", n=10. 2.1. Performances Pré-opératoires. 2.1.1. Réponses correctes, tardives et anticipées. Avant la phase de chirurgie, les animaux ont été répartis dans les différents groupes de façon à ce que leurs niveaux de performances soient homogènes. Durant les sessions pré-opératoires, les rats des deux groupes présentent donc des performances stables et équivalentes d'environ 80-85 réponses correctes, 15-20 réponses tardives et 50-60 réponses anticipées en moyenne par session (Figure 2A,B,C). 2.1.2. Temps de Réaction moyens et préparation motrice. En période préopératoire, les TR moyens sont équivalents entre groupes (325ms 4,7) (Figure 3A). L'analyse des TR en fonction des différents délais de présentation du stimulus montre que les performances sont semblables entre groupes. De plus, les TR diminuent progressivement avec l'augmentation de la durée du délai (p 2.2. Effets de la lésion dopaminergique dans le test de TR. 2.2.1. Effets sur les réponses correctes, tardives et anticipées. Chez les animaux "témoins", le nombre de réponses correctes et tardives ne varie pas après la chirurgie, par rapport au niveau préopératoire, et reste stable lors des trois semaines postopératoires (tests PLSD de Fisher non significatifs). Chez les animaux "lésés", dès les premières sessions postopératoires, le nombre de réponses correctes diminue significativement par rapport à la condition préopératoire (p En ce qui concerne le nombre de réponses anticipées, aucune différence significative n'est observée entre les deux groupes. Après la chirurgie et pendant les trois semaines "Post", le nombre de réponses anticipées augmente significativement par rapport à la période "Pré" (p 2.2.2. Effets sur les TR moyens et sur la préparation motrice. Pour les animaux du groupe "témoins", les TR moyens ne varient pas après l'opération, par rapport au niveau préopératoire (test PLSD de Fisher non significatif)(Figure 3A). Chez les animaux "lésés", les TR moyens augmentent significativement dans la condition "Post1" par rapport à la condition "Pré" (p L'analyse des TRs en fonction des délais montre que les animaux du groupe "témoins" ne présentent aucune différence significative entre les conditions Pré et Postl. Chez les animaux "lésés", en période Postl, les TR moyens par délai augmentent significativement par rapport à la condition préopératoire (p 2.3. Effets des injections d'ACPT-I dans le GP. L'analyse présentée porte sur un total de n=24 animaux ("lésés", n=17; "témoins", n=7). Les effets lésionnels étant stables dans le temps, seules les performances postopératoires correspondant aux jours précédant les injections (J21, J25, J29 et J33) sont retenues pour la suite de l'étude, et sont notées "Post". Pour la suite de l'analyse, les données relatives aux conditions "Pré" et "Post" ont été moyennées, et comparée aux données obtenues après injection. Pour les animaux des deux groupes, l'effet de l'ordre des injections n'est pas significatif (ANOVA mesures répétées, effet "ordre" non significatif). De ce fait, les données ont été moyennées pour chaque dose entre les différents animaux d'un même groupe. 2.3.1. Effets sur les réponses correctes et tardives. Chez les animaux "témoins", les injections intrapallidales d'ACPT-I aux différentes doses testées, ainsi que l'injection de solvant, ne modifient pas significativement le nombre de réponses correctes et tardives par rapport aux niveaux préopératoire et préinjection (Figures 5A et B). De plus, les performances des animaux après injection d'ACPT-I ou de solvant sont semblables pour ces deux types de réponses. Pour le groupe "lésé", les niveaux de réponses correctes et tardives après injection du solvant sont significativement différents du groupe "témoins" dans la même condition (ANOVA, F(1,22)=4,35; 4,64; p Chez les rats "lésés", l'ACPT-I réduit considérablement les déficits postopératoires observés au cours des sessions précédant les injections, et ceci pour toutes les doses utilisées. En effet, après injection d'ACPTI dans le GP, les niveaux de réponses correctes et tardives sont significativement différents des performances réalisées lors des jours de préinjection et lors des sessions pour lesquelles les rats ont reçu le solvant (tests de t-apparié, p 2.3.2. Effets sur le nombre de réponses anticipées. Pour les réponses anticipées, la variabilité interindividuelle étant très élevée (le nombre d'anticipations n'est pas limité dans cette expérience), aucune différence significative n'a pu être mise en évidence entre les groupes expérimentaux. A la différence des autres paramètres, les rats des groupes "témoins" et "lésés" réagissent donc de la même manière aux différentes doses utilisées, et aux injections de solvant (Figure 5). Pour ces deux groupes, les performances mesurées en condition "Pré", "Post" et après injection de solvant, ne sont pas différentes. En revanche, les trois concentrations d'ACPT-I entraînent une augmentation importante du nombre de réponses anticipées par rapport aux conditions "Pré", "Post" et par rapport au solvant (test de t-apparié, p 2.3.3. Effets sur les TR moyens et sur la préparation motrice. Chez les animaux "lésés", l'ACPT-I entraîne une diminution significative des TR moyens par rapport à l'injection de solvant et aux jours précédant les injections, et ceci pour toutes les doses utilisées (tests de tappariés, p DISCUSSION Dans le test de catalepsie, les résultats obtenus montrent que l'injection d'ACPT-I à la concentration de lnmol/ l réduit partiellement l'akinésie induite par un blocage pharmacologique des récepteurs dopaminergiques au moyen de l'halopéridol. Dans le test de TR, l'injection d'ACPT-I dans le GP, est capable de réduire considérablement l'akinésie induite par la lésion bilatérale partielle des neurones nigro-striés. Cependant, pour les doses les plus fortes (2,5 et 5nmol/pL), les injections intra-pallidales d'ACPT-I entraînent des perturbations de la préparation motrice chez les animaux lésés et chez les témoins. De plus, l'injection intra- pallidale de ce composé induit une augmentation dose dépendante du nombre de réponses anticipées pour ces deux groupes expérimentaux. -1. Effets sur les paramètres moteurs. 1.1. Effet de l'halopéridol et de la lésion dopaminergique: 15 validation des modèles expérimentaux. Les résultats obtenus lors du test de catalepsie montrent que l'injection d'halopéridol entraîne une augmentation des temps de descente de la barre par rapport aux animaux qui ont reçu du NaCl. Comme l'attestent les valeurs élevées des latences de descente, cet état cataleptique se manifeste par un blocage dans une position donnée, qui résulte d'une difficulté à réaliser un mouvement. En ce sens, les animaux ayant reçu l'halopéridol peuvent être considérés comme akinétiques. D'autre part, dans le test de TR, les résultats montrent que l'injection intra-striatale de 6-OHDA a entraîné des déficits sur un plan moteur. En effet, après lésion rétrograde des neurones dopaminergiques, le nombre de réponses tardives ainsi que les valeurs moyennes des TRs augmentent fortement par rapport aux animaux témoins (ayant reçu le solvant de la 6OHDA) et par rapport à la période pré-opératoire. 1.2. Effets des injections intra-pallidales d'ACPT-I. Immédiatement après injection dans le GP, l'ACPT-I à lnmol/pL annule l'akinésie induite par l'halopéridol et la réduit fortement pendant les 30 premières minutes. La diminution de l'effet bénéfique de l'ACPT-I après 30 min montre que l'action de cette substance est transitoire, ce qui peut s'interpréter par une dégradation de cette molécule. Les résultats obtenus suggèrent que ces effets impliqueraient préférentiellement les récepteurs mGlu4 avec une action spécifique au niveau du GP. L'absence d'effet de l'ACPT-I à la dose de 5nmol/pL, ainsi que son effet légèrement sédatif chez les rats témoins, peut s'expliquer par une action non spécifique à forte dose. En effet, outre son action activatrice des mGluR du groupe III, l'étude biochimique des propriétés pharmacologiques de l'ACPT-I révèle que ce composé serait capable d'exercer une action antagoniste des mGluR du groupe I (néanmoins, l'affinité de l'ACPT-I pour ces récepteurs est relativement faible) (Acher et al., 1997). Les récepteurs mGluRs du groupe I étant présents dans le GP, leur blocage pourrait donc, en diminuant l'activité des neurones pallidaux, entraîner des effets opposés à ceux initialement attendus. Une interaction entre la dopamine et les mGluR du groupe III pourrait être à la base des effets différentiels de l'ACPT-I observés dans le test de TR et de catalepsie. En effet, dans le test de TR, les injections intra-pallidales d'ACPT-I réduisent considérablement (voire totalement) l'akinésie induite par la lésion dopaminergique et ceci à les toutes les doses testées. Ainsi, après injection de cette substance chez les "lésés", les niveaux de réponses correctes et tardives ainsi que les TR moyens sont équivalents aux animaux "contrôles" et au niveaux prélésionnels. Ces résultats montrent que l'injection d'un agoniste des mGluR du groupe III dans le GP permet de diminuer de façon efficace les déficits moteurs observés dans ce modèle de la MP chez le rat. -2. Effets sur les processus d'ordre cognitif. 2.1. Effets de la lésion dopaminergique. Dans le test de TR, la lésion ne modifie pas la capacité des animaux à estimer la durée des différents délais d'apparition du stimulus lumineux et entraîne donc un déficit moteur de type akinétique, sans induire de troubles cognitifs relatifs à l'estimation temporelle. Cependant, en période post-opératoire, le nombre de réponses anticipées augmente pour les animaux des deux groupes expérimentaux. Ce résultat montre que les modifications de ce paramètre ne sont pas spécifiques de la lésion dopaminergique, puisqu' aucune différence entre groupes n'a été constatée. Cette augmentation peut refléter une augmentation du niveau d'impulsivité des rats (qui relève à la fois de processus moteurs et cognitifs), probablement consécutive à l'étape chirurgicale. 2.2. Effets des injections intra-pallidales d'ACPT-I. Les expériences réalisées ont montré que les injections intra-pallidales d'ACPT-I entraînent une augmentation dose dépendante du nombre de réponses anticipées, quelque soit le groupe expérimental. En effet, aucune différence n'a pu être mise en évidence entre les animaux "sham" et "lésés", ce qui sous entend que la lésion des neurones nigro-striés ne modifie pas la réactivité des animaux pour ce paramètre. Cet effet n'est donc pas spécifique de la lésion, mais bien d'une modulation de l'activité au niveau du GP. D'autre part, pour les deux groupes expérimentaux, les résultats montrent que l'ACPT-I, aux doses de 2,5 et 5nmol/gL, entraîne une perturbation de la préparation motrice qui se manifeste par une difficulté pour évaluer la durée des différents délais d'apparition du signal lumineux. Si les injections intrapallidales d'ACPT-I entraînent, pour les doses les plus élevées, des déficits relatifs à l'estimation temporelle, il est possible de supposer que ces perturbations soient à l'origine de l'augmentation du nombre d'anticipations. Les résultats obtenus montrent donc que les agonistes des récepteurs mGluR4 sont capables, en injection intra-pallidale, de réduire les déficits moteurs observés dans des modèles animaux de la MP. Ces effets pourraient être dus à une réduction différentielle des transmissions gabaergique et glutamatergique issues du striatum et du NST. De plus, ces résultats soulignent le rôle important joué par le GP dans l'expression des symptômes moteurs et cognitifs de la MP, et tendent à montrer que cette structure serait impliquée dans des mécanismes de régulation beaucoup plus complexes qu'un simple rôle dans le relais des informations au sein des Ganglions de la Base. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ACHER F. C., TELLIER F. J., AZERAD R., BRABET I. N., FAGNI L. & PIN J. P. (1997) Synthesis and pharmacological characterization of aminocyclopentanetricarboxylic acids: new tools to discriminate between metabotropic glutamate receptor subtypes. J Med Chem, 40, 3119-29. AMALRIC M. & KOOB G. F. (1989) Dorsal pallidum as a functional motor output of the corpus striatum. Brain Res, 483, 389-94. BAUNEZ C., NIEOULLON A. & AMALRIC M. (1995) In a rat model of parkinsonism, lesions of the subthalamic nucleus reverse increases of reaction time but induce a dramatic premature responding deficit. J Neurosci, 15, 6531-41. GAUNTLETT-GILBERT J. & BROWN V. J. {1998) Reaction time 15 deficits and Parkinson's disease. Neurosci Biobehav Rev, 22, 865-81. 31 REVENDICATIONS 1. Utilisation pour fabriquer des médicaments permettant de traiter les symptômes d'akinésie dans la MP, de composés répondant à la formule (I) H2N\/c o2 H R\5z. 2 A.1., 4 3 A 2 R4 - dans laquelle -R1 à R4, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle ou un radical aryle, ces radicaux étant le cas échéant eux-mêmes substitués, R1 et R2 ensemble pouvant en outre représenter un pont - (CH2)m-, où m est un entier de 1 à 5, ou un pont X représentant une combinaison linéaire de m groupes hydrocarbonés, m étant tel que défini ci-dessus, et comportant, le cas échéant, au moins un hétéro-atome tel que 0, N ou S, ou un pont X représentant une combinaison linéaire de p hétéroatomes 0, N et/ou S, où p est un entier de 1 à 3, -A1 et A2 représentent des radicaux -COOH, -S03H ou -P03H2r ou leurs dérivés tels qu'esters ou amides, - Y représente une chaîne hydrocarbonée - (CH2) -, n étant nul ou un entier de 1 à 5, ou représente une 30 combinaison linéaire de n groupes hydrocarbonées et au moins un hétéroatome 0, N ou S, ou une combinaison linéaire de q hétéroatomes O, N et/ou S, où q est un entier de 1 à 3. 2/ Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle lesdits dérivés sont des composés monocycliques. 3/ Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle Y n'existe pas et les carbones portant R1 et R2 ne sont pas reliés entre eux en formant l'un des ponts précités. 4/ Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle les carbones portant R1 et R2 ne sont pas reliés entre eux en formant l'un des ponts précités, et Y représente un groupe ou une combinaison comme défini cidessus. 5/ Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les composés sont bicycliques et répondent à la formule I ci-dessus dans laquelle X ou à la fois X et Y sont présents et sont définis comme indiqué ci-dessus. 6/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle Al et A2 sont identiques. 7/ Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle Al et A2 représentent tous deux un groupe carboxyle, ou les esters ou amides correspondants. 8/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle Al et A2 diffèrent l'un de l'autre. 9/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle les substituants R1, R2, et/ou R3 et R4 représentent un radical alkyle ou aryle, ces radicaux étant le cas échéant substitués. 10/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle R1 et R2 et/ou R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène. 2872045 33 11/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle lesdits composés existent comme molécules achirales ou chirales, sous forme de différents diastéréoisomères, éventuellement comme racémique, le cas échéant sous forme de l'un des énantiomères. 12/ Utilisation de l'acide 1-amino-cyclopentane-1,3,4 tricarboxylique de formule HO2C CO2H ACPT I = meso-cis ACPT = (1S, 3R, 4S) pour fabriquer des médicaments permettant de traiter les symptômes d'akinésie dans la MP. 13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle les médicaments se présentent sous une forme pour l'administration par voie orale, notamment sous forme de tablettes, gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, liposomes. 14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que lesdits médicaments renferment de 1 à 100 mg de principe actif par unité, de préférence de 2,5 à 50 mg. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle les médicaments se présentent sous une forme pour l'administration par voie injectable, notamment intraveineuse, soucutanée, intramusculaire. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que les médicaments, se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que lesdits médicaments renferment de 0,5 à 50 mg de principe actif, de préférence de 1 à 30 mg.