Brevet FR2872171A1 — publié le 20051230

METHODE UNIVERSELLE D'EXTINCTION D'UN TRANSGENE PAR ARN INTERFERENT La présente invention concerne des procédés pour inactiver l'expression de molécules d'intérêt dans une cellule, ainsi que différents vecteurs permettant de mettre en oeuvre ces procédés. Pour l'étude du rôle des facteurs biologiques, et notamment des ARN et des protéines, dans la cellule, il est important d'être en mesure d'induire leur expression, mais également de stopper cette expression pour déterminer les changements provoqués dans un cas comme dans l'autre. Les systèmes d'expression inductibles ont contribué significativement à l'étude des modèles biologiques. Certains systèmes permettent notamment d'induire l'expression d'une protéine ou la traduction d'un ARN, lorsque la cellule est mise en présence d'une molécule inductrice (par exemple en présence de tétracycline). Cependant, nombre de systèmes inductibles présentent l'inconvénient d'être ensuite difficiles à inactiver de manière fiable et rapide. En effet, tant que le milieu ou la cellule contient encore une certaine quantité de la molécule inductrice, l'effet inducteur ne peut être complètement stoppé. Dans ces conditions, l'expression de la protéine ou l'ARN d'intérêt va en décroissant pendant une durée qu'il est difficile d'estimer. De plus, les systèmes inductibles traditionnels comme le système tétracycline ou le système CRE/loxP, sont souvent peu souples en ce sens qu'ils ne sont pas aisément applicables à une large gamme de modèles cellulaires, certains sont notamment difficilement applicables aux cellules primaires ou quiescentes. Les inventeurs ont maintenant mis au point une méthode d'extinction de transgènes, simple et puissante basée sur la technologie de l'interférence de l'ARN, cette méthode est applicable à une large gamme de modèles cellulaires et plus particulièrement aux cellules primaires ou quiescentes. De surcroît, son utilisation peut être envisagée pour la genèse d'animaux transgéniques. Son utilisation est également particulièrement avantageuse lorsque des membres d'une banque de transgènes sont exprimés dans différentes cellules et qu'il s'agit d'éteindre de manière identique l'expression de ces transgènes, et ce quel que soit le type cellulaire. La présente invention repose sur la mise en évidence, par les inventeurs, de la dégradation d'un ARNm donné suite à l'action d'un ARNi (ARN interférent) ciblant une séquence précise de cet ARNm, hors de la séquence codante. Les inventeurs ont également mis en évidence la relation entre le taux de dégradation d'un ARNm donné suite à l'action d'un ARNi (ARN interférent) ciblant cet ARNm et le nombre de répétitions de la séquence cible de l'ARNi dans l'ARNm visé. Les inventeurs ont montré que ce résultat peut être appliqué à l'extinction de transgènes. La présente invention concerne donc un procédé pour éteindre l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, qui est ou qui pourrait être exprimé dans une cellule. La présente invention concerne également une combinaison de vecteurs, de préférence viraux, permettant d'exprimer puis d'éteindre l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, des cellules modifiées comprenant ces vecteurs et un kit permettant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention. Dans le cadre de la présente demande, les termes suivants revêtent la signification précisée: ARNi (RNAi en anglais) : ARN interférent, il s'agit d'une molécule d'ARN capable de cibler une séquence particulière dans une molécule d'ARN et de guider le clivage de cet ARN à un site déterminé au sein de la séquence cible. Quand cette réaction a lieu à l'intérieur d'une cellule et que l'ARN clivé est de l'ARN messager (ARNm), le clivage de la molécule d'ARNm conduit ensuite à la dégradation de la molécule, empêchant ainsi toute étape ultérieure, telle que la traduction de l'ARNm en protéine. Selon le type d'ARNi, la séquence cible est soit la séquence complémentaire de l'ARNi (notamment siRNA) soit une séquence quasi-complémentaire de l'ARNi, avec toutefois quelques positions non concordantes (notamment miRNA). siRNA: short interfering RNA, anglicisme signifiant ARN interférent de petite taille. II s'agit d'une séquence d'ARN double brin, comprenant environ de 21 à 23 nucléotides (Dykxhoorn et aI, Nature Reviews 2003, vol 4, p.457). Les siRNA peuvent provenir du clivage d'ARN double brin de taille plus importante par une protéine dénommée dicer. Les siRNA ainsi produits sont ensuite intégrés dans un complexe multiprotéique d'inhibition induite par l'ARN (RISC RNA- inducing silencing complex). L'ARNm cible est clivé en un site unique au milieu de la région duplex formée entre le siRNA (qui sert de guide) et l'ARNm cible, à 10 nucléotides de l'extrémité 5' du siRNA. Afin d'obtenir des siRNA, dans une cellule, plusieurs méthodes sont envisageables. 1. il est possible d'introduire directement dans la cellule des siRNA obtenus par synthèse chimique; dans ce cas, l'action du dicer est contournée. 2. il est également envisageable d'introduire dans la cellule des fragments d'ARN double-brin de grande taille, qui sont ensuite clivés en siRNA par la protéine dicer. 3. il est possible d'introduire ou d'exprimer dans la cellule un duplex d'ARN en épingle à cheveux, par exemple un shRNA (pour small haipin RNA), qui est ensuite clivé par la protéine Dicer en siRNA. shRNA: short hairpin RNA, anglicisme signifiant ARN en petite épingle à cheveux. Cet ARN peut être clivé par la machinerie cellulaire (notamment par la protéine dicer) afin de devenir un ARN interférent. La présente invention concerne d'abord un procédé pour inactiver l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, dans une cellule, comprenant: - l'introduction dans la cellule d'un premier vecteur comprenant: i. une séquence d'acides nucléiques A codant pour la protéine ou l'ARN d'intérêt, ii. une séquence B, d'au moins 10 nucléotides, l'introduction dans la cellule d'un second vecteur conduisant à la synthèse d'un ARNi ciblant la séquence B. Selon l'invention, le premier vecteur est construit de façon telle que la séquence A est sous le contrôle d'un promoteur permettant sa transcription en ARNm et que la séquence B fasse partie du transcrit comprenant la séquence A, sans faire partie de la séquence codante comprenant la séquence A. La séquence B, qui est la cible de l'ARNi est donc présente au sein du transcrit comprenant la séquence A, mais pas au sein de la séquence codante. La séquence B peut notamment être présente dans un intron, ou dans les régions 3'UTR ou 5'UTR. L'inactivation de l'expression signifie que l'expression est réduite de manière détectable quand le second vecteur est introduit, c'est-à-dire réduite d'au moins 5%, de préférence au moins 10% voire au moins 20%. L'inactivation de l'expression englobe donc une extinction partielle et l'extinction totale. L'extinction totale signifie que la protéine ou l'ARN d'intérêt n'est plus détectable dans la cellule après l'introduction du second vecteur. De plus, les inventeurs ont mis en évidence que la multimérisation de la séquence cible d'un ARNi au sein du ARNm conduit à une probabilité de clivage de cet ARNm très largement augmentée et donc un taux de dégradation de l'ARNm ciblé plus important, voisinant les 100% lorsque 3 répétitions de la séquence cible sont présentes dans l'ARNm. Par conséquent, selon une variante préférée de la présente invention, le premier vecteur comprend au moins deux répétitions de la séquence B, de telle façon que ces répétitions fassent partie du transcrit comprenant la séquence A, mais en dehors de la séquence codante de A. Par répétition d'une séquence, il faut comprendre que la séquence est présente au moins 2 fois, à des emplacements entièrement distincts non chevauchants, et sur un même brin lorsque la séquence nucléotidique est double brin. Pour une protéine, on appelle 'séquence codante' les parties du transcrit qui codent pour les acides aminés de la protéine. Pour un ribozyme, on appelle séquence codante' les parties du transcrit nécessaires à l'activité du ribozyme, c'est-à-dire la partie catalytique et les bras hybridant la cible. De même, pour un ARN antisens, on appelle 'séquence codante' du transcrit la partie de ce transcrit qui est capable de s'hybrider à la séquence cible de l'ARN antisens. De manière générale, on appelle 'séquence codante' d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine ou un ARN d'intérêt, les parties de cette séquence portant l'information nécessaire à l'obtention de cette protéine ou ARN d'intérêt. Selon une situation préférée dans le cadre de la présente invention, la séquence B ou les répétitions de la séquence B sont positionnées de telle manière qu'après transcription, elles soient dans la partie non traduite 3' du transcrit (3'UTR). Pour obtenir une telle configuration, il faut bien sûr placer les séquences B en aval du codon stop, quand la séquence A code pour une protéine. L'invention n'est cependant pas limitée au positionnement dans la région non traduite 3', la région 5' non traduite est également envisageable. Il est également envisageable que les séquences B soient positionnées au sein d'une séquence qui correspond à un intron de la séquence A. Par protéine ou ARN d'intérêt, il faut entendre tout polypeptide ou ARN dont l'expression est souhaitée, ou dans un but de recherche, ou à des fins thérapeutiques, diagnostiques, ou dans un procédé de criblage. La protéine ou l'ARN d'intérêt peut notamment être une molécule thérapeutique. Selon une situation préférée, il s'agit d'un transgène, de préférence d'un transgène n'ayant aucune contrepartie endogène dans la cellule. La séquence A est donc de préférence sans contrepartie endogène. Le procédé de l'invention permet d'éteindre l'expression de cette molécule d'intérêt. Cependant, il faut noter que l'extinction de cette molécule peut également impliquer l'induction d'une troisième molécule. En effet, dans le cas où la molécule d'intérêt, codée par la séquence A, est un inhibiteur de l'expression d'un gène, l'expression de ce gène est restaurée lorsqu'on éteint l'expression de l'inhibiteur grâce à l'ARNi. Le procédé de l'invention est donc un procédé permettant d'éteindre l'expression d'une molécule d'intérêt et qui peut donc également être utilisé de façon à induire l'expression d'une autre molécule. Dans toute la demande, le premier vecteur et le second vecteur sont des vecteurs distincts. De préférence, le premier vecteur est un vecteur viral. Indépendamment du fait que le premier vecteur soit ou non un vecteur viral, le second vecteur est également préférentiellement un vecteur viral. Une situation donc particulièrement préférée est le cas dans lequel les deux vecteurs sont des vecteurs viraux. Par vecteur viral, on entend un vecteur qui est dérivé du génome d'un virus. Parmi les vecteurs préférés, on peut nommer les vecteurs lentiviraux, autant pour le premier vecteur que pour le second. Ainsi, il sera préférentiellement fait usage d'un vecteur lentiviral, pour au moins l'un des vecteurs de l'invention, et de préférence pour les deux. Des vecteurs lentiviraux envisagés dans le cadre de la présente invention sont par exemple des vecteurs dérivés du virus de l'immuno-déficience humaine HIV, du SIV (Simian Immunodeficience virus) du FIV ou de l'EIAV. Il est de préférence fait usage de vecteurs défectifs. Selon une mise en oeuvre préférée, le premier vecteur est un dérivé d'un vecteur lentiviral SIV. De manière préférée, le second vecteur est également un dérivé d'un vecteur lentiviral SIV. D'autres vecteurs peuvent parfaitement être envisagés dans le cadre de la présente invention par l'homme du métier, notamment des vecteurs nonviraux tels que des vecteurs plasmidiques. Une application particulièrement avantageuse de l'invention concerne l'utilisation de vecteurs dits ciblants, c'est-à-dire aptes à s'introduire dans certains types de cellules uniquement. Par exemple, si le second vecteur, qui vectorise l'ARNi, cible préférentiellement les cellules neuronales, il est ainsi possible d'éteindre spécifiquement l'expression de la protéine ou de l'ARN d'intérêt dans les cellules neuronales, alors que l'expression sera poursuivie dans d'autres types cellulaires. Pour obtenir de tels vecteurs, on peut utiliser des enveloppes virales ciblantes pseudotypant les vecteurs. Ainsi, par l'utilisation d'enveloppes virales ciblantes pseudotypant le vecteur codant l'ARNi, il est possible de restreindre l'activité d'extinction de ce vecteur à certaines cellules choisies. Il est également possible d'utiliser comme second vecteur un vecteur MLV de façon à restreindre l'extinction induite par l'ARNi à des cellules en division, seules cellules susceptibles d'être infectées par le MLV. Selon une application préférée du procédé, le second vecteur est introduit postérieurement au premier. Dans cette situation, il y a d'abord expression de la protéine ou l'ARN d'intérêt codée par la séquence A. Après introduction du second vecteur, cette expression est inactivée. Selon une autre application du procédé, le second vecteur est introduit simultanément ou antérieurement au premier. Dans une telle situation, la protéine ou l'ARN d'intérêt n'est pas exprimé. II peut s'avérer avantageux d'utiliser des vecteurs portant des marqueurs ou des gènes rapporteurs, par exemple des gènes de résistance à des antibiotiques ou bien des gènes codant pour des protéines fluorescentes, afin de vérifier l'introduction des vecteurs dans la cellule. Comme mentionné plus haut, la séquence A doit pouvoir être transcrite, elle est donc liée de manière opérationnelle à un promoteur, qui peut par exemple être le promoteur CMV. D'autres promoteurs sont également envisageables, et notamment des promoteurs permettant un contrôle spatial ou temporel de la transcription de la séquence A. Le promoteur peut également être complété par la présence au sein du vecteur de différents éléments de régulation de la transcription tels que des enhancers . Des exemples de promoteurs et enhancers de transcription par l'ARN polymérase II, qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention sont le CMV (promoteur précoce du cytomégalovirus), SV40 (promoteur de l'antigène T du virus simien de type 40), TK (promoteur de la Thymidine Kinase de l'herpès de type I), EF-1 alpha (promoteur du facteur d'élongation de la traduction 1 alpha), PGK (promoteur de la phosphoglycerol kinase), UbC (promoteur de l'ubiquitine C), RSV (promoteur du virus du sarcome de Rous). Dans le cadre de l'invention, il peut avantageusement être fait usage de promoteurs dont l'activité soit tissu-spécifique. Des exemples de tels promoteurs (ARN polymérase II) tissus spécifiques sont: promoteur du virus de l'hépatite B, promoteur du gène de l'albumine, promoteur du gène de la PSA (Prostate Specific Antigen). Selon une construction préférée, la séquence engendrant la synthèse de l'ARNi est de préférence clonée en aval d'un promoteur pour l'ARN polymérase III, de préférence le promoteur H1, afin d'être sous le contrôle de ce promoteur. II est également possible d'utiliser un promoteur conditionnel pour la synthèse de l'ARNi, ou tout autre système permettant de rendre l'expression réversible et/ou inductible, par exemple un système de type TeT On/ Tet Off ou Cre/LoxP. Selon une construction particulièrement préférée, la séquence B est répétée trois fois. Les inventeurs ont effectivement démontré qu'un ARNm possédant un trimère d'une séquence cible pour un ARNi peut être clivé avec une efficacité supérieure à 90%, pour une séquence B et un ARNi appropriés. Une séquence B selon l'invention contient au moins 10 nucléotides, de préférence entre 10 et 50, par exemple entre 15 et 40, de préférence entre 18 et 25 nucléotides. Des exemples de longueur pour la séquence B sont 20, 21, 22 et 23 nucléotides. Différentes constructions sont envisageables permettant d'introduire au moins 2, de préférence trois répétitions d'une séquence cible d'un ARNi dans un transcrit ARNm. Les répétitions de la séquence B peuvent notamment être directement liées les unes aux autres, sans aucun nucléotide entre les répétitions, les séquences peuvent être également répétées mais avec une séquence intermédiaire ente les répétitions. Cette séquence intermédiaire a une longueur tout-à-fait variable, la séquence intermédiaire peut par exemple être constituée par la séquence A elle-même. Ou bien la séquence intermédiaire, jouant le rôle d'espaceur, peut être constituée d'une dizaine de nucléotides, voire moins. En effet, bien que la distance entre les répétitions ne soit pas critique, cette distance est préférentiellement inférieure à 1kb afin que le transcrit ne soit pas trop long, et même inférieure à 100 bases, voire inférieure à 50, 25 ou même 10 bases. Par exemple la séquence intermédiaire comprend entre 0 et 25 nucléotides, de préférence entre 0 et 10 nucléotides. Les répétitions peuvent également être tête-bêche, c'est-à-dire que la partie 3' d'une répétition de la séquence B est liée, directement ou par le biais d'une séquence intermédiaire, à la partie 3' d'une autre répétition de la séquence B. La cellule dans laquelle sont introduits le premier et le second vecteur est n'importe quel type de cellule, il peut s'agir notamment d'une cellule épithéliale, ou d'une cellule neuronale, dendritique ou bien encore d'une cellule primaire ou d'une cellule souche. Il peut s'agir par exemple d'une cellule hématopoïétique, ou d'une cellule embryonnaire. Il peut s'agir également d'une cellule complètement différenciée, ou plus généralement d'une cellule qui n'a pas la capacité de se diviser ou qui ne l'a plus. II peut s'agir également d'une cellule qui se divise peu. Inversement, il peut également s'agir d'une cellule souche embryonnaire. La cellule est de préférence une cellule eucaryote, par exemple une cellule végétale, animale, mammifère, humaine ou non-humaine. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre sur une cellule in vitro, par exemple une cellule isolée cultivée, ou bien une cellule au sein d'un tissu mais ex vivo. Le procédé peut également être mis en oeuvre in vivo. Concernant l'ARNi, la présente invention n'est limitée à aucun type d'ARNi, à condition que le précurseur de cet ARNi provienne de la transcription du second vecteur de l'invention. Certains types sont toutefois préférés. Il est particulièrement avantageux de réaliser le procédé de l'invention avec de l'ARNi obtenu à partir de shRNA. Un avantage important de la présente invention est que l'ARNi introduit, qui permet d'éteindre l'expression de la protéine ou ARN d'intérêt, n'est pas fonction de la séquence A codant pour cette protéine ou ARN, mais uniquement de la séquence B. On est ainsi assuré d'obtenir une extinction similaire de tout transcrit qui contient le même nombre de répétitions de la séquence B, quelque soit la séquence A. Un autre avantage de l'invention est que l'extinction obtenue est stable et restreinte aux séquences exogènes introduites selon le procédé de l'invention. En effet, seules ces séquences contiennent la séquence B ou les répétitions de la séquence B; elles sont donc les seules sensibles à l'ARNi introduit dans la cellule. Cette caractéristique est particulièrement avantageuse quand la séquence introduite (séquence A) est un transgène qui correspond à un gène déjà présent dans la cellule. Il est ainsi possible d'étudier spécifiquement l'influence de l'expression de ce transgène, et l'influence de son extinction. Un autre avantage de l'invention est qu'il est possible d'utiliser plusieurs vecteurs correspondant à la description du premier vecteur selon l'invention avec des séquence A distinctes, qui permettent d'exprimer différentes protéines ou ARN d'intérêt. Si ces différents vecteurs comportent la même séquence B, alors l'introduction d'un unique second vecteur peut permettre d'éteindre simultanément l'expression de toutes les protéines ou ARN d'intérêt. En effet, dans cette situation, tous les transcrits possèdent la séquence B qui est la séquence cible de l'ARNi synthétisé par le second vecteur. Alternativement, il est également possible d'utiliser deux couples distincts de séquence B cible-ARNi, un premier couple (séquence B1 et ARNi1 ciblant la séquence B1) et un second couple (séquence B2 et ARNi2 ciblant la séquence B2), tels que l'ARNi1 soit sans effet sur un ARN comprenant la séquence B2 et que l'ARNi2 soit également sans effet sur un ARN comprenant la séquence B1. La séquence B1 est comprise dans un transcrit qui code pour une protéine ou ARN d'intérêt 1, tandis que la séquence B2 est comprise dans un transcrit qui code pour une protéine ou ARN d'intérêt 2. Dans ces conditions, il est possible, au sein d'une même cellule, d'éteindre de manière distincte et différentielle, l'expression de la protéine ou l'ARN d'intérêt 1, grâce à l'ARNil sans affecter l'expression de la protéine ou l'ARN d'intérêt 2, et inversement. Selon l'invention, l'extinction réalisée peut être stable ou bien transitoire. Dans le cas où le second vecteur, codant pour l'ARNi, demeure dans la cellule, par exemple suite à l'intégration stable dans le génome, l'extinction obtenue est définitive. Inversement, on peut envisager un vecteur moins stable ou sciemment dégradable, afin que l'expression de l'ARNi soit transitoire. II est également possible de rendre l'extinction réversible, en éteignant par exemple l'expression de l'ARNi précisément par le procédé de l'invention, c'est-à-dire en réalisant un nouvel ARNi qui cible spécifiquement le transcrit issu du second vecteur ou par un procédé analogue permettant de cibler l'espaceur dans le cas d'un shRNA. L'extinction peut également être rendue réversible par tout moyen connu de l'homme du métier. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont également mis en évidence un couple constitué d'une séquence cible et d'un shRNA particulièrement avantageux dans le cadre de la présente invention. On sait en effet que toute séquence d'ARN n'est pas nécessairement une séquence cible appropriée pour un ARNi. L'identité de séquences entre l'ARNi et sa cible n'est pas le seul facteur permettant de déterminer la capacité d'un ARNi à cliver une séquence d'ARNm. En effet, la structure secondaire de l'ARN est un facteur important; certaines portions d'une molécule d'ARN, du fait des contraintes spatiales imposées par la molécule, ne sont pas accessibles à un ARNi ciblant une séquence contenue dans une telle portion. Les inventeurs ont mis évidence les avantages liés à l'utilisation de la séquence GCAAGCTGACCCTGAAGTTC (SEQ ID 1) comme séquence B préférée. Lorsque cette séquence est utilisée comme séquence cible, l'ARNi doit être construit pour spécifiquement induire le clivage de cette séquence. Un ARNi particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention est synthétisé à partir d'un shRNA issu de la séquence: 5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTC-espaceur- GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3' (SEQ ID N 2). Après transcription de cette séquence en ARN simple brin, l'espaceur ( spacer en anglais) est la région qui va constituer la boucle de l'épingle à cheveux alors que le bras 3' et le bras 5' vont s'hybrider pour former la tige de l'épingle à cheveux. L'espaceur a de préférence la séquence suivante: TTCAAGAGA. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le shRNA utilisé est obtenu grâce à la transcription de la séquence suivante, ou d'une séquence plus longue comprenant cette séquence: GCAAGCTGACCCTGAAGTTCttcaagagaGAACTTCAGGGTCAGCTTGCtttt (SEQ ID N 3). Les inventeurs ont en effet montré que l'ARNi issu de ce shRNA, associé à la 30 séquence cible SEQ ID N 1 permet d'obtenir un clivage particulièrement efficace d'un ARN comprenant la séquence cible (exemple 1). Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont également montré que la présence d'au moins deux séquences cibles au sein d'un ARN polycistronique permet la dégradation de la molécule d'ARN dans son intégralité, par action d'un ARNi clivant ladite séquence cible. La position des séquences cibles au sein de l'ARN polycistronique n'est pas déterminante. Les inventeurs ont ainsi montré la possibilité d'éteindre simultanément l'expression de deux transgènes portés par un même ARN bicistronique en ciblant spécifiquement avec un ARNi une séquence cible comprise dans le second cistron. Inversement, la séquence cible peut être comprise dans le premier cistron. Pour la mise en oeuvre de l'invention, des séquences cibles préférées et des ARNi préférés sont ceux cités précédemment. D'autres couples de séquences ont également été validés par les inventeurs et sont des séquences préférées dans le cadre de la présente invention. Une telle séquence B alternative est la séquence CGGCAAACTCACACTCAAGTTT (SEQ ID N 4). Lorsqu'une telle séquence B est utilisée, il est de préférence fait usage, pour le second vecteur, de la séquence: GGCAAACTCACACTCAAGT- espaceurACTTGAGTGTGAGTTTGCCGttt qui conduit à la synthèse d'un shRNA puis d'un ARNi par action de la machinerie cellulaire, ciblant spécifiquement la séquence B précédemment mentionnée. La séquence de l'espaceur est de préférence ttcaagaga. Tant la séquence B que l'ARNi ont de préférence les séquences qui ont été mentionnées précédemment. Il est cependant entendu que tout autre couple de séquence cible B et ARNi ciblant cette séquence cible convient également dans le cadre de cette invention. En effet, dans le cadre de l'invention, il est également possible de tester d'autres couples de séquence B cible/ARNi, afin d'obtenir un couple optimal selon l'utilisation qui est envisagée. Il est par exemple possible de trouver un couple ayant une efficacité particulièrement élevée, même lorsque la séquence B n'est présente qu'en un seul exemplaire. Il est également envisageable de rechercher un couple ayant une innocuité particulièrement intéressante, car il est connu que certains ARNi déclenchent une réponse interféron non spécifique qui est délétère pour la cellule. Il est également envisageable de faire usage d'ARNi dont la séquence n'est pas parfaitement homologue à la séquence cible, mais diffère par un ou 2 nucléotides. II est ainsi possible d'obtenir des ARNi qui clive la séquence B avec une efficacité réduite. Cette mise en oeuvre de l'invention permet d'obtenir une extinction partielle de la protéine ou l'ARN d'intérêt. En faisant croître le nombre de répétitions de la séquence B au sein du premier vecteur, il est alors possible d'étudier l'incidence de l'extinction progressive de la protéine ou de l'ARN d'intérêt. La présente invention concerne également la combinaison d'au moins deux vecteurs, le premier vecteur comprenant un site de clonage, de préférence multiple, et une séquence B; et le second vecteur comprenant une séquence permettant de synthétiser un ARNi ciblant ladite séquence B. Selon cet aspect de l'invention, la séquence B est constituée d'au moins 10 nucléotides. Le premier vecteur est construit de telle sorte qu'une séquence nucléique A peut être intégrée au sein de ce vecteur grâce au site de clonage, et lorsque la séquence A est transcrite, le transcrit contient également la séquence B, mais la séquence B ne fait pas partie dela séquence codante du transcrit. Une telle situation est obtenue dans le cas où la séquence B fait partie de la région 3'UTR ou 5'UTR du transcrit comprenant la séquence A. Le site de restriction permettant le clonage est de préférence unique dans le vecteur. Selon la variante préférée de la présente invention, le premier vecteur comprend au moins deux répétitions de la séquence B, de telle façon que ces répétitions fassent partie du transcrit comprenant la séquence A, mais en dehors de la séquence codante de A. La combinaison de vecteurs ainsi mentionnée permet de mettre en oeuvre le procédé de l'invention tel que décrit précédemment lorsqu'on insère dans le site de clonage du premier vecteur une séquence A codant pour une protéine ou un ARN d'intérêt. Le premier vecteur est par exemple un dérivé d'un lentivecteur SIV minimal. Il est de préférence équipé d'un polylinker en aval d'un promoteur qui peut être le promoteur CMV. Ce site polylinker permet le clonage simple d'un transgène d'intérêt dans le vecteur. Le vecteur est ensuite transférable dans une large variété de types cellulaires, incluant les lignées, les cellules dendritiques, les neurones, les cellules primaires et les cellules souches. Les répétitions de la séquence B se situent préférentiellement dans ce qui constitue la partie 3' non transcrite du transgène, une fois celui-ci intégré. Tout transgène intégré dans ce vecteur peut ensuite être spécifiquement et efficacement éteint par un unique vecteur correspondant au second vecteur, qui code pour un ARNi dirigé contre la séquence cible. Le second vecteur est de préférence un vecteur SIV. Selon une situation préférée, 30 l'ARNi est codé par une séquence sous le contrôle du promoteur H1. Dans le procédé de l'invention, le niveau d'extinction du transgène porté par le vecteur 1 peut être finement modulé par des doses croissantes de vecteur 2. Selon un autre aspect de l'invention, la combinaison comprend un premier vecteur possédant une séquence d'acides nucléiques A codant pour une protéine ou un ARN d'intérêt et une séquence B; et un second vecteur comprenant une séquence permettant de synthétiser un ARNi ciblant ladite séquence B. Selon l'invention, le premier vecteur comprend au moins deux répétitions de la séquence B. Le premier vecteur est construit de telle sorte que les séquences B fassent partie du transcrit comprenant la séquence A, mais hors de la séquence codante dudit transcrit. Une telle combinaison de vecteurs permet également de mettre en oeuvre le procédé de l'invention tel que décrit précédemment. Les modes de réalisation préférés du premier vecteur sont tels que décrits pour la combinaison précédente. Pour les deux combinaisons mentionnées, les différentes préférences mentionnées plus haut sont également applicables. Notamment, il est de préférence fait usage d'au moins un vecteur viral, dans ce cas, il s'agira préférablement du premier vecteur de l'une des deux combinaisons mentionnées. Selon un autre aspect de l'invention, il sera fait usage de deux vecteurs viraux. Les combinaisons de l'invention telles que décrites peuvent être utilisées pour des 15 procédés de criblage. Elles peuvent également être utilisées pour des applications thérapeutiques. Une situation préférée est celle dans laquelle la séquence B est répétée 3 fois ou au moins 3 fois. Les inventeurs ont en effet montré que cette situation permet d'obtenir un taux de dégradation du transcrit issu de la séquence supérieur à 90%, lorsque la séquence B et l'ARNi sont choisis de manière appropriée. Selon un mode de réalisation de l'invention, les répétitions de la séquence B sont séparées par une séquence d'au moins 3 nucléotides. Bien que la distance entre les répétitions ne soit pas critique, cette distance est préférentiellement inférieure à 1 kb afin que le transcrit ne soit pas trop long, et même inférieure à 100 bases, voire inférieure à 50, 25 ou même 10 bases. Tant la séquence B que I'ARNi ont de préférence les séquences qui ont été mentionnées précédemment. Il est cependant entendu que tout autre couple de séquence cible B et ARNi ciblant cette séquence cible convient également dans le cadre de cette invention. Les combinaisons selon l'invention peuvent être utilisées in vivo, in vitro ou bien ex vivo. Elles sont particulièrement avantageuses pour une utilisation en thérapie. En effet, elles peuvent permettre d'exprimer ainsi une protéine ou un ARN ayant un intérêt thérapeutique, puis de faire cesser cette expression grâce à l'introduction du second vecteur. De telles combinaisons sont également très utiles dans le domaine de la recherche car elles permettent d'identifier la fonction et l'influence de l'expression de protéine ou d'ARN, notamment grâce à l'observation des effets induits par l'extinction de cette expression. Des applications dans le domaine du criblage sont également envisageables dans le cadre de cette invention. La présente invention concerne également un vecteur qui comprend un site de clonage multiple, qui permet d'intégrer une séquence d'acides nucléiques A, et une séquence B d'au moins 10 nucléotides en aval dudit site de clonage. Le vecteur est construit de telle manière que, lorsque la séquence A est introduite au site de clonage et lors de la transcription, la séquence B fasse partie de la région 3'UTR du transcrit comprenant la séquence A. Alternativement, l'invention concerne également un tel vecteur dans lequel la séquence A est déjà présente, codant pour une protéine ou un ARN d'intérêt. De manière identique, lors de la transcription, le vecteur est ainsi construit que la séquence B fait partie du transcrit comprenant la séquence A. Comme précédemment mentionné, la séquence B est avantageusement répétée au moins deux fois, de préférence trois fois, au sein de la région 3'UTR. Les avantages tirés de cette répétition ont été explicités précédemment. Il a également déjà été précisé la disposition des répétitions, notamment la distance préférée entre les répétitions de la séquence B selon l'invention. Selon une variante préférée de l'invention, les vecteurs sont des vecteurs viraux, de 20 préférence des vecteurs lentiviraux dérivés de SIV. Tous les modes de réalisation préférés décrits précédemment sont applicables aux vecteurs mentionnés. La présente invention concerne également des particules virales comprenant un vecteur viral tel que décrit précédemment. De préférence, de telles particules virales sont à large tropisme, par exemple grâce à une enveloppe pantropique. Inversement, il peut être fait usage de particules ayant une enveloppe ciblante, ce qui permet de délivrer le vecteur de l'invention uniquement à certains types de cellules, selon l'enveloppe ciblante choisie. La présente invention a aussi pour objet un kit pour l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, puis son inactivation. Un tel kit comprend une combinaison de vecteurs telle que mentionnée précédemment, c'est-à-dire un premier vecteur (vecteur 1) possédant une séquence d'acides nucléiques A codant pour la protéine ou l'ARN d'intérêt et une séquence B; et un second vecteur (vecteur 2) comprenant une séquence permettant de synthétiser un ARNi ciblant ladite séquence B. - 14 - Le premier vecteur est construit de telle sorte que les répétitions de la séquence B fasse partie du transcrit comprenant la séquence A, mais hors de la séquence codante dudit transcrit. Les modes de réalisation préférés du premier vecteur et du second vecteur ont déjà été décrits. Les particules virales correspondant aux vecteurs 1 et 2 des combinaisons ou du kit peuvent être concentrées et congelées à -80 C pendant plusieurs mois, voire plusieurs années. Un kit selon l'invention est par exemple constitué par une combinaison de deux plasmides correspondant aux deux vecteurs, ou bien par une combinaison d'un plasmide pour le premier vecteur et des particules virales pour le vecteur 2. Un kit selon l'invention peut également comprendre une combinaison sous la forme de particules virales. De tels kits peuvent être aisément stockés et conservés. Les vecteurs compris dans le kit de l'invention peuvent avoir des cellules cibles identiques ou différentes; ils peuvent être à large tropisme ou bien au contraire à enveloppes ciblantes. La présente invention concerne également des cellules génétiquement modifiées par des vecteurs selon l'invention, ou une combinaison ou un kit selon l'invention. Dans une première situation, une cellule selon l'invention comprend dans son génome un transgène exogène intégré dont la partie 3'UTR comprend au moins deux répétitions d'une séquence B, ladite séquence B ayant au moins 10 nucléotides. Comme dans tout ce qui précède, les répétitions de la séquence B peuvent être contiguës ou disjointes, dans le même sens ou bien tête-bêche. Nombre de modes de réalisation préférés ont déjà été précédemment décrits. Par transgène exogène, on entend tout gène (i.e. toutes les séquences nécessaires à la transcription et la traduction d'une séquence codantes) qui est initialement étranger à la cellule; un transgène exogène est de préférence hétérologue à la cellule dans laquelle il est intégré. Dans une seconde situation, une cellule selon l'invention comprend non seulement un transgène exogène intégré dont la partie 3'UTR comprend au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, mais elle comprend en outre une séquence d'acides nucléiques exogène permettant la synthèse dans la cellule d'un ARNi ciblant la séquence B. Cette seconde séquence exogène est maintenue dans la cellule sous forme intégrée ou non. Selon un cas préféré de l'invention, une telle cellule est obtenue par transformation par une combinaison de vecteurs ou un kit selon l'invention. Dans un tel cas, le premier vecteur est un vecteur intégratif. Dans une troisième situation, une cellule génétiquement modifiée selon l'invention comprend un transgène dont la partie 3'UTR comprend une séquence B d'au moins 10 nucléotides, et une telle cellule comprend également une séquence d'acides nucléiques permettant la synthèse dans la cellule d'un ARNi ciblant la séquence B. La séquence B est présente sous forme d'au moins deux répétitions dans la partie 3'UTR dudit transgène. Une telle cellule est de préférence une cellule transformée par une combinaison de vecteurs ou un kit selon l'invention. De ce fait, tous les modes de réalisation préférés concernant les vecteurs de l'invention sont également applicables aux cellules génétiquement modifiées dans le cadre de la présente invention. Enfin, la présente invention concerne un procédé pour inactiver l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt dans une cellule transformée par un vecteur, où ledit vecteur comprend une séquence d'acides nucléiques A, qui code pour la protéine ou l'ARN d'intérêt qu'on souhaite inactiver, et une séquence B d'au moins 10 nucléotides, de telle sorte que lors de la transcription, la séquence B fasse partie de la région 3'UTR du transcrit comprenant la séquence A. La séquence B est présente sous forme d'au moins deux répétitions dans la partie 3'UTR dudit transgène. Un tel procédé comprend l'introduction dans la cellule d'un vecteur conduisant à la synthèse d'un ARNi ciblant la séquence B. Un tel vecteur comprend par exemple une séquence codant pour un shRNA qui, par l'intermédiaire de la machinerie cellulaire, conduit à la synthèse d'un ARNi. De tels vecteurs ont déjà été décrits précédemment ainsi que les modes de réalisation préférés, notamment le vecteur est de préférence un vecteur viral, par exemple un lentivirus, un adénavirus, un herpès-virus ou un AAV. Une application particulièrement avantageuse de la présente invention se situe dans le domaine du criblage d'aptamères protéiques. En effet, pour cribler des aptamères ceux-ci peuvent être produits à partir d'ADN dans des cellules. Cependant, l'état de la technique offre peu de solutions pour stopper l'expression de ces aptamères dans toutes les cellules, de manière analogue. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'ADN codant pour les aptamères est construit de telle façon que le transcrit issu de cet ADN comprend plusieurs répétitions de la séquence B, cette séquence B étant la cible d'un ARNi. En introduisant dans toutes les cellules un même ARNi, qui cible la séquence B, il est alors possible de stopper de manière similaire l'expression de tous les aptamères, et ce quelle que soit la séquence des aptamères. La cible de l'ARNi n'est en effet pas fonction de la séquence codant pour l'aptamère, selon la présente invention, mais de la séquence cible qui est intégrée de façon identique dans tous les transcrits comprenant la séquence codant pour les aptamères. Il s'agit donc d'une méthode universelle pour l'extinction de transgènes. Légende des figures: Figure 1: L'usage d'un SiRNA dirigé contre le second transgène d'un ARN bicistronique inhibe l'expression des deux transgènes. Figure 1A: Représentation schématique des vecteurs SIV intégrés (Provrirus). Figure 1B: Extinction de la GFP. 2x105 cellules Hela ont été transduites avec pSIVTRX-i-GFP (multiplicité d'infection (MOI) de 15 aboutissant à 100% de cellules transduites). 24h plus tard, ces cellules sont transduites à nouveau par deux doses de sirGFP ou d'un construit contrôle sirGFPp.. Les activités transcriptase inverse (RT) des préparations de vecteurs ont été mesurées afin de normaliser les doses de sirGFPs utilisées. 1110 et 1/1 correspondent aux rapports d'activités RT entre les vecteurs sirGFP et pSIV-TRX-i-GFP. 72h après transduction par les sirGFPs, l'intensité moyenne de fluorescence est mesurée par cytométrie en flux. Les résultats sont donnés en pourcentages de l'intensité de fluorescence où 100% correspond à la fluorescence de la condition contrôle. Figure 1C: Extinction de TRX. L'expérience est similaire à celle décrite en B. Une analyse en western Blot est réalisée utilisant les anticorps anti HA et beta-tubuline. Cases noires: SIN LTR délété de la région U3; Cases grisées: les régulateurs d'expression (EF1: forme courte du promoteur du facteur d'élongation de la traduction EF1-a, W: élément de régulation posttranscriptionnelle du virus de l'hépatite de la marmotte (woodchuck), H1: promoteur H1 de type ARN polymérase III). La région TRRE SA cPPT inclut des éléments de SIV cis-actifs essentiels pour l'encapsidation et le fonctionnement du vecteur. Y désigne la séquence d'encapsidation, RRE l'élément de réponse à REV (REV responsive element), SA le site accepteur d'épissage de SIV Env, cPPT la région centrale polypurine de SIV (DNA flap). GFP est la protéine fluorescente verte améliorée (enhanced green fluorescent protein). TRX représente le gène de la thiorédoxine humaine, portant une étiquette HA en 5' afin de faciliter sa détection. sirGFP code pour un petit ARN en épingle à cheveux (small hairpin RNA: shRNA) ciblant la GFP. Figure 2: Extinction de H-2e par un siRNA dirigé contre une séquence cible placée dans la région 3' non codante du transgène. Figure 2A: Schématisation des lentivecteurs codant pour H-2KK Les boîtes grisées représentent les séquences minimales cibles du siRNA GFP. Figure 2B: Extinction de l'expression de H-2KK. 3x105 cellules 293T ont été ensemencées et transduites 24 heures plus tard par des doses de vecteurs H-2KK normalisées pour leur activité RT. Les transductions avec les vecteurs sirGFP ont été réalisées après 24h et la détection de H-2KK 4 jours plus tard. Les courbes grises et noires se rapportent aux cellules contrôles ou transduites par sirGFP, respectivement. Les pourcentages de cellules positives pour H-2Kk sont indiqués pour chacun des cas. Fiqure 3: Extinction de transgènes par un siRNA universel dirigé contre une séquence cible multimérisée. Figure 3A: Extinction de GFPp Des cellules 293T ont été massivement transduites avec GAEts3 GFPp puis 24h plus tard par sirGFP ou SirCtl. (l'expression de GFPg. n'est pas affectée par le siRNA exprimé par sirGFP: résultats non montrés). Les niveaux de fluorescence ont été analysés 72h plus tard par un lecteur de plaques (Envision-Perkin Elmer) Figure 3B: Extinction de TRX dans des cellules Hela. (voir Figure 1C). Figure 3C: Extinction de ZEOR avec le vecteur sirGFP dans des cellules 293T. sirGFP-Flu consiste en un vecteur SIV codant pour GFPp et un shRNA dirigé contre la GFP: la fluorescence codée par ce vecteur peut être utilisée comme un marqueur de l'expression de siRNA dans les cellules transduites. En bref, les cellules 293T sont transduites à une MOI faible avec une préparation de sirGFP-Flu afin d'atteindre 25% de cellules positives pour la GFP 72h après transduction. Les cellules sont alors réensemencées et transduites une seconde fois avec des doses normalisées de vecteurs GAE ZEOR et GAEts3 ZEOR (MOI 10). La Zéocine est ajoutée dans le milieu de culture le jour suivant et maintenue dans le milieu durant 15 jours. L'extinction de la ZEOR conduisant à la mort cellulaire est évaluée par la mesure du pourcentage de cellules GFPp positives avant ou après 20 jours de sélection en présence de Zéocine. Exemple: Le présent exemple correspond à une mise en oeuvre particulière de l'invention. Il s'agit d'une méthode d'extinction de transgènes simple et puissante, basée sur la technologie de l'interférence de l'ARN. Les inventeurs ont démontré dans un premier temps la possibilité d'éteindre simultanément l'expression de deux transgènes portés par un même ARN bicistronique en ciblant spécifiquement le second cistron à l'aide d'un shRNA (short hairpin RNA). La séquence cible de cet shRNA a ensuite été multimérisée puis introduite dans la région 3' non codante de quatre transgènes exprimés à partir de vecteurs lentiviraux. L'expression de tous les transgènes est très fortement réprimée après transduction d'un unique lentivecteur délivrant le shRNA spécifique de la cible greffée. Cette nouvelle méthode d'extinction de transgènes apparaît beaucoup plus souple que les systèmes inductibles traditionnels comme le système tétracycline ou le système CREIIoxP. Elle est applicable à une large gamme de modèles cellulaires et plus particulièrement aux cellules primaires et quiescentes. De surcroît, son utilisation peut être envisagée pour la génèse d'animaux transgéniques. Manipulant en routine des banques d'aptamères peptidiques dans différents systèmes cellulaires, les inventeurs ont cherché à développer une méthode simple et efficace pour éteindre l'expression de chacun des membres de la banque dans tout type cellulaire. Dans ce dessein, les inventeurs ont construit deux vecteurs lentiviraux dérivés de SIV, pSIV-TRX-i-GFP et sirGFP codant respectivement pour la banque d'aptamères (et également pour la GFP, au sein d'un même transcrit, grâce à l'utilisation d'un IRES) et pour un shRNAspécifique de la séquence codante de la GFP (Green Fluorescent Protein) (Fig. 1 a). Le shRNA produit par le vecteur sirGFP reconnaît donc spécifiquement une séquence au sein du transcrit correspondant à la GFP qu'il est alors capable de cliver, entraînant ainsi la dégradation du transcrit. Les inventeurs ont ensuite transduit des cellules humaines HeLa avec le vecteur pSIVTRX-i-GFP, les cellules Hela expriment alors fortement à la fois TRX (Thioredoxine) et GFP. L'expression de ces deux gènes est alors facilement et efficacement réprimée après transduction par des lentivecteurs sirGFP (Fig. 1b,c). En effet, le lentivecteur sirGFP conduit à la synthèse d'un ARNi ciblant spécifiquement une séquence du transcrit issu de la GFP. Les gènes codant pour TRX et GFP faisant partie d'un même transcrit bicistronique, l'ARNi permet d'éteindre simultanément l'expression de ces deux gènes. De même, les inventeurs ont observé une extinction tout aussi efficace d'une banque d'aptamères peptidiques avec ce même shRNA. Six mutations silencieuses ont alors été introduites dans la séquence codante du shRNA de sirGFP afin de générer sirGFPp, un vecteur contrôle dont la transduction n'affecte ni l'expression de TRX ni l'expression de GFP dans le système (Fig. lb,c). La possibilité d'éteindre, à partir d'un même ARN bicistronique, l'expression du premier cistron en ciblant spécifiquement le second, a conduit les inventeurs à émettre l'hypothèse selon laquelle la simple insertion d'une séquence cible dans la région 3' non codante d'un ARN messager pourrait être suffisante pour assurer la dégradation de ce transcrit par un shRNA spécifique. Pour tester cette hypothèse, les vecteurs GAE-H2K et son homologue GAEts1-H2K contrôlant l'expression de la protéine du CMH murin H-2Kk ont été construits. Par opposition à GAE- H2K, GAEts1-H2K est doté d'une séquence cible en aval de I'ORF H-2Kk (Fig. 2A), ladite séquence cible étant celle reconnue par I'ARNi produit par le vecteur sirGFP. La transduction de cellules 293T par ces deux vecteurs se traduit par un niveau d'expression de la protéine H-2Kk comparable révélant l'innocuité de cette séquence cible sur l'expression du transgène. Cependant, si la transduction de ces cellules par sirGFP n'affecte pas l'expression de H2Kk dirigée par GAE-H2K elle induit en revanche une chute d'expression de 34% lorsque ce transgène est cloné dans GAEts-H2K (Fig. 2b). Cette inhibition apparaît plus faible que celle observée figure 1 lorsque la séquence cible du shRNA est positionnée dans le contexte de la GFP. Des différences dans l'accessibilité de la séquence cible, un déterminant majeur de l'efficacité du phénomène d'ARN interférence (Dykxhoorn et al, 2003), pourrait expliquer la faiblesse relative de cette extinction. Afin de potentialiser cet effet inhibiteur, les inventeurs ont alors triplé le nombre de copies de la séquence cible (Doench, et aI, 2003) dans le vecteur lentiviral GAE-H2K. Les inventeurs suspectaient en effet que la multimérisation des cibles augmenterait considérablement la probabilité d'une hybridation fonctionnelle entre le shRNA et l'ARNm cible. D'autre part, il n'est pas exclu qu'elle puisse également perturber localement la structure secondaire de l'ARN et favoriser ainsi l'accessibilité de la séquence cible. En accord avec ces hypothèses, l'expression du transgène H-2Kk exprimé à partir du vecteur GAEts3-H2K s'effondre de plus de 97% suite à la transduction par le vecteur sirGFP (Fig. 2a b). Cette spectaculaire amélioration de l'effet répresseur du shRNA a pu être reproduite par les inventeurs à d'autres transgènes. Dans un premier temps, six mutations silencieuses ont été introduites dans la séquence codant pour la GFP, précisément au niveau de la région cible, afin d'obtenir un transcrit insensible à l'effet du shRNA. Les inventeurs ont ensuite cloné cette séquence, appelée GFPp, dans le vecteur GAEts3. La fluorescence moyenne de cellules 293T transduites par ce vecteur décroît fortement après introduction de sirGFP (Fig. 3a), confirmant ainsi les résultats observés pour H2Kk. De façon similaire, l'expression de TRX dirigée par GAEts3 est réduite à des niveaux indétectables après transduction par le vecteur sirGFP tandis que la transduction par sirGFPp reste sans effet. - 20 - Les inventeurs ont également remarqué que l'ampleur de la répression de TRX est directement corrélée avec la dose de vecteur SirGFP utilisée confirmant l'effet dose réponse de ce mécanisme (Fig. 3b). Enfin, l'étude a également porté sur un gène conférant la résistance à un antibiotique, la zéocine, afin d'évaluer les effets fonctionnels à long terme de l'extinction contrôlée par le système de l'invention. Pour suivre l'effet inhibiteur du shRNA, le vecteur sirGFP a été équipé du gène GFPp créant ainsi sirGFP Flu (Fig. 3c). Des cellules 293T ont été infectées à faible multiplicité par sirGFP-Flu de façon à obtenir 20% de cellules exprimant le sirGFP. Cette population hétérogène a été ensuite tranduite par les vecteurs GAEZEO ou GAEts3-ZEO codant pour le gène de la résistance à la zéocine. Soumises à une sélection en présence de zéocine pendant 20 jours, ces cellules ont ensuite été analysées par FACS afin de mesurer la fluorescence résiduelle dans ces deux sous-populations. Alors que 20% des cellules transduites par GAE-Zeo restent fluorescentes, ce pourcentage chute à moins de 2% lorsque ces cellules sont transduite par GAEts3 (Fig. 3c). Ce résultat confirme donc les résultats obtenus pour un quatrième transgène dont l'extinction produit des effets fonctionnels à long terme. L'invention telle que mise en oeuvre par les inventeurs propose donc une méthode extrêmement simple et flexible d'extinction de transgènes basée sur le mécanisme de l'interférence de l'ARN . Seuls un vecteur codant pour le transgène et un vecteur apportant le shRNA universel sont requis pour sa mise en oeuvre. Lorsque les vecteurs d'expression sont pseudotypés avec l'enveloppe pantropique VSV-G, la méthode peut s'appliquer à la plupart des modèles cellulaires incluant les cellules primaires et les cellules différenciées. Bien que cette approche soit basée sur la technologie de l'interférence de l'ARN , la plupart des limitations associées à ce procédé sont ici caduques. En effet, puisque le shRNA préalablement validé (ciblant spécifiquement une partie de la séquence codante de la GFP) est universel, l'approche proposée contourne le problème du choix d'un shRNA ad hoc capable d'éteindre efficacement sa cible. Des études récentes ont montré que certains shRNA pouvaient induire une réponse de type interféron (Jackson et al, 2003 et Bridge et al, 2003) , voire étaient capables d'interagir avec des cibles présentant des analogies de séquences limitées (Sledz et al, 2003). Le système présenté ici tire profit d'un siRNA dirigé contre la GFP dont la spécificité et l'efficacité ont déjà été éprouvées in vivo (Tiscornia et al, 2003). Pour explorer cependant les risques d'effets indésirables de ce siRNA universel, il importerait que - 21 - soit testée l'induction de la réponse interféron ou qu'une analyse du transcriptome soit conduite pour contrôler l'innocuité de ce shRNA. Le cas échéant, d'autres paires shRNA/séquence cible pourraient être testées afin d'identifier un couple optimal sans effets secondaires. Cette méthode n'est pas soumise aux limitations des systèmes de régulation transcriptionnel. A l'inverse des systèmes inductibles tels que les systèmes tétracycline ou ecdysone , elle ne requiert pas l'expression d'un facteur de transcription dans la cellule hôte. D'autre part, les inconvénients associés aux systèmes inductibles basés sur la recombinaison homologue comme le système Cre/LoxP, tels que les effets de recombinaison génétique irréversibles ou les problèmes de faible pénétrance de la recombinase, ne s'appliquent pas ici. Cette méthode peut facilement être adaptée pour mener à un système d'extinction réversible en utilisant par exemple un promoteur Pol III inductible pour la synthèse du shRNA (van de Wetering et aI, 2003; Wiznerowicz et al, 2003). Dans cette optique, les inventeurs ont construit un vecteur viral permettant à la fois l'expression du répresseur tétracycline et d'un shRNA lui même contrôlé par la tetracycline. Grâce à ce construit, la répression de la GFP exprimée à partir de GAEts3-GFP est obtenue par addition de tétracycline dans le milieu de culture. Un autre grand intérêt de la méthode présentée est lié au fait qu'elle autorise un contrôle précis de l'extinction du transgène. Tout d'abord l'efficacité de l'extinction dépend de la quantité de lentivecteurs codant les shRNA utilisée (Fig. 1 et 3b). Ensuite, l'efficacité peut être ajustée en variant le nombre de copies de séquences cibles incluses dans la région 3' des transgènes (Fig 2). Enfin, cette méthode est applicable à l'extinction de transgènes chez l'animal en tirant profit des progrès futurs en matière de ciblage rétroviral (Verhoeyen et al, 2004). Matériels et méthodes: Constructions Toutes les constructions dérivent de GAEO, correspondant à PSIV-RMES GAE précédemment décrit {Mangeot, 2000}, {Mangeot, 2002} dans lequel un polylinker synthétique remplace le gène eGFP entre les sites Agel et Xhol. Dans GAE tsl et GAEts3, une ou bien trois séquences cible ont été introduites, respectivement, entre les sites de restriction Hind3 et Xhol dans GAEO. Les oligonucléotides s'hybridant pour générer la séquence cible double brin étaient les suivants pour GAE tsl: (Sens) AGCTTGCTCGAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGATGCATGG, - 22 - (Antisens) TCGACCATGCATCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTCGAGCA; pour GAE ts3: (Sens) AGCTTGCTCGAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCAAGCTGACCCTGA AGTTCATCTGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATGCATGG, (Antisens) TCGACCATGCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCAGATGAACTTCAGGGT CAGCTTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTCGAGCA. Le clonage des oligonucléotides hybridés élimine le site Xhol en aval de la séquence cible et introduit un nouveau site Xhol en amont, qui permet l'introduction des transgènes ZEOR, GFPp, TRX, TRX-i-GFP et H-2Kk entre les sites Agel et Xhol dans toutes les constructions GAE. Le vecteur sirGFP dérive de GAEO délété de la région CMV-polylinker, dans lequel le promoteur minimal humain H1(positions -100 to -1) {Myslinski, 20011 a été inséré dans la LTR 3' ' entre les positions 9778 et 9928 (selon la séquence du SlVmac-51, numéro d'accession GenBank N M19499). Une séquence d'ADN codant pour un shRNA dirigé contre la GFP a été clonée ensuite entre les sites BgI2 et Hindi, en aval du promoteur H1 Les oligonucléotides s'hybridant pour générer ledit shRNA sont les suivants: (Sens) GATCCCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTTCAAGAGAGAACTTCAGGGTCA GCTTGCTTTTTGGAAA; (Antisens) AGCTTTTCCAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTCTCTTGAAGAACTT CAGGGTCAGCTTGCGGG. Les oligonucléotides complémentaires nécessaires pour générer le shRNA dirigé contre la GFP mutée GFPp sont les suivants: (Sens) GATCCCGCGGCAAACTCACACTCAAGTTTCAAGAGAACTTGAGTGTGAGTT 25 TGCCG II I I I GGAAA; (Antisens) AGCTTTTCCAAAAACGGCAAACTCACACTCAAGTTCTCTTGAAACTTGA GTGTGAGTTTGCCGCGG. Pour générer sirCtl, les nucléotides suivants ont été utilisés: (Sens) GATCCCCAGAGTTGCTTTCTCCGTTCTTCAAGAGAGAACGGAGAAAGCAACTCTTT TTTGGAAA. (Antisens) AGCTTTTCCAAAAAAGAGTTGCTTTCTCCGTTCTCTCTfGAAGAACGGAGAAAGCA ACTCTGGG La GFP a été mutée en 6 positions pour générer la GFPp. Les oligonucléotides utilisés pour la mutagénèse assistée par PCR sont les suivants: - 23 - (1) GGGAATTCTGGCTACCGGTCGCCACCAG, (2) GGCAAACTCACACTCAAGTTTATTTGCACCACCGGC, (3) GCCGGTGGTGCAAATAAACTTGAGTGTGAGTTTGCCGTAGG, (4) GCTACTCGAGGATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC. Les bases en gras correspondent aux mutations silencieuses introduites dans la GFP. Les PCR 1-3 et 2-4 sont réalisées avec le vecteur PSIV-RMES GAE comme matrice. Les produits de PCR sont purifiés et puis mélangés pour une amplification finale de haute fidélité de la séquence de GFPp en utilisant les amorces 1 et 4. Manipulation des vecteurs lentiviraux Les vecteurs SIV ont été produits comme décrit précédemment {Mangeot, 2002}, par co-transfection de construits auxiliaires (codant pour gag, pot, tat, rev et VSV-G) et du construit vecteur dans des cellules 293T. Les surnageants filtrés sont concentrés 100 fois par ultracentrifugation. Le titre est calculé après transduction de 5x105 cellules cibles 293T par des dilutions sériées de vecteurs puis analyse par FACS des cellules GFP positives 72 heures plus tard. Pour les mesures d'activité de transcriptase inverse (RT) exogène, des dilutions de vecteur viral sont incubées pendant 1 heure dans 50 mM TrisHCI (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 0.2 M KCI, 0.5 mM [3H]TTP, 0.2 mM PolyA(dT)15, 0.05% NP40 à 37 C. Les échantillons sont déposés sur membrane DE81 avant lavages et quantification de radioactivité associée à l'ADN à l'aide d'un phosphorimager. Culture cellulaire et détection de protéine Toutes les cellules sont cultivées à 37 C dans du milieu Eagle modifié par Dubelcco (DMEM) complémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, de la pénicilline (100 IU/ml), de la streptomycine (100pg/ml). H-2Kk est détecté en utilisant le kit MACS H-2Kk-FITC, selon les instructions du fabricant (Miltenyi Biotech). La Zeocine (Invitrogen) est utilisée à une concentration finale de 200 g/ml. Pour les analyses par western blot, les cellules transduites sont lysées à 4 C dans 20mM Tris-HCI pH 7,4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% NP40 pendant 1 h. TRX fusionnée à une étiquette HA (hémaglutinine) est révélé par l'anticorps anti-HA (Sigma) dilué au 1/1000. Biblioqraphie:. Bridge, A.J., Pebernard, S., Ducraux, A., Nicoulaz, A.L. and Iggo, R. (2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.Nat Genet, 34, 263-264. - 24 - Doench, J.G., Petersen, C.P. and Sharp, P.A. (2003) siRNAs can function as miRNAs.Genes Dev, 17, 438-442. Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D. and Sharp, P.A. (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.Nat Rev Mol Cel! Biot, 4, 457-467. Gossen, M. and Bujard, H. (2002) Studying gene function in eukaryotes by conditional gene inactivation.Annu Rev Genet, 36, 153-173. Jackson, Al., Bartz, S.R., Schelter, J., Kobayashi, S.V., Burchard, J., Mao, M., Li, B., Cavet, G. and Linsley, P.S. (2003) Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol, 21, 635-637. Mangeot, P.E., Negre, D., Dubois, B., Winter, A.J., Leissner, P., Mehtali, M., Kaiserlian, D., Cosset, F.L. and Darlix, J.L. (2000) Development of minimal lentivirus vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) and their use for gene transfer into human dendritic cells [In Process Citation].J Virol, 74, 8307-8315. Mangeot, P.E., Duperrier, K., Negre, D., Boson, B., Rigal, D., Cosset, F. L. and Darlix, J.L. (2002) High levels of transduction of human dendritic celas with optimized SIV vectors.Mo! Ther, 5, 283-290. Myslinski, E., Ame, J.C., Krol, A. and Carbon, P. (2001) An unusually compact external promoter for RNA polymerase III transcription of the human H1RNA gene.Nucleic Acids Res, 29, 2502-2509. Sledz, C.A., Holko, M., de Veer, M.J., Silverman, R.H. and Williams, B.R. (2003) Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biot, 5, 834-839. Tiscornia, G., Singer, O., Ikawa, M. and Verma, I. M. (2003) A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA.Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 1844-1848. van de Wetering, M., Oving, I., Muncan, V., Pon Fong, M.T., Brantjes, H., van Leenen, D., Holstege, F.C., Brummelkamp, T.R., Agami, R. and Clevers, H. (2003) Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible smala-interfering-RNA vector.EMBO Rep, 4, 609-615. Verhoeyen, E. and Cosset, F.L. (2004) Surface-engineering of lentiviral vectors.J 30 Gene Med, 6 Suppl 1, S83-94. Wiznerowicz, M. and Trono, D. (2003) Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.J Virol, 77, 8957-8961. - 25 - REVENDICATIONS, 1. Procédé pour inactiver l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, dans une cellule in vitro ou ex vivo, comprenant: a. l'introduction dans la cellule d'un premier vecteur comprenant i. une séquence d'acides nucléiques A codant pour la protéine ou l'ARN d'intérêt, ii. au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, de telle sorte que lors de la transcription, les séquences B fassent partie du transcrit comprenant la séquence A, sans faire partie de la séquence codante comprenant la séquence A; b. l'introduction dans la cellule d'un second vecteur conduisant à la synthèse d'un ARNi ciblant la séquence B. 2. Procédé selon la revendication 1, où les répétitions de la séquence B font partie de la région 3' UTR du transcrit comprenant la séquence A. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, où l'un des vecteurs est un vecteur viral, ou bien les deux vecteurs sont des vecteurs viraux. 4. Procédé selon la revendication 3, où le vecteur viral est un vecteur lentiviral. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, où le premier vecteur est un dérivé d'un vecteur lentiviral SIV. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, où le second vecteur est un dérivé d'un vecteur lentiviral SIV. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, où la transcription de la séquence d'acides nucléiques A du premier vecteur est dirigée par le promoteur CMV. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, où la synthèse de l'ARNi est dirigée par le promoteur H1. - 26 - 9. Procédé selon la revendication 1, où la séquence B est répétée 3 fois ou plus. 10. Procédé selon la revendication 1, où les répétitions de la séquence B sont séparées par une séquence de 0 à 25 nucléotides. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, où ladite cellule est une cellule neuronale, une cellule dendritique, une cellule primaire ou une cellule souche. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, où ladite cellule ne se divise pas. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, où ladite séquence B est la séquence suivante: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC (SEQ ID 1). 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, où l'ARNi est issu par clivage d'un 15 shRNA et où l'inactivation est obtenue par dégradation de l'ARNm comprenant la séquence A, induite par l'ARNi. 15. Procédé selon la revendication 14, où l'ARNi est issu de la séquence suivante: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC-espaceur- GAACTTCAGGGTCAGCTTGC (SEQ 20 ID N 2). 16. Procédé selon la revendication 15, où l'espaceur a la séquence suivante: ttcaagaga. 17. Procédé selon la revendication 1, où la séquence d'acides nucléiques du second vecteur conduisant à la synthèse de l'ARNi est la suivante: GCAAG CTGACCCTGAAGTTCttcaagagaGAACTTCAGGGTCAGCTTGCtttt (SEQ ID N 3). 18. Combinaison de deux vecteurs, - un premier vecteur comprenant a. un site de clonage multiple permettant d'intégrer une séquence d'acides nucléiques A, b. au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, 35 de telle sorte qu'après introduction de la séquence A au site de clonage et lors de la transcription, les séquences B fassent partie du transcrit - 27 - comprenant la séquence A, sans faire partie de la séquence codante comprenant la séquence A, et - un second vecteur comprenant une séquence permettant de synthétiser un ARNi ciblant ladite séquence B. 19. Combinaison de deux vecteurs, - un premier vecteur comprenant a. une séquence d'acides nucléiques A codant pour une protéine ou un ARN et b. au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, de telle sorte que lors de la transcription, les séquences B fassent partie du transcrit comprenant la séquence A, sans faire partie de la séquence codante comprenant la séquence A, et - un second vecteur comprenant une séquence permettant de synthétiser un 15 ARNi ciblant ladite séquence B. 20. Combinaison selon la revendication 18 ou 19, où les répétitions de la séquence B font partie de la région 3' UTR du transcrit comprenant la séquence A. 21. Combinaison selon la revendication 18 ou 19, où la séquence B est répétée 3 fois ou plus. 22. Combinaison selon la revendication 18 ou 19, où les répétitions des séquences B sont séparées par une séquence de 0 à 25 nucléotides. 23. Combinaison selon l'une des revendications 18 à 22, où l'un des vecteurs est un vecteur viral, ou bien les deux vecteurs sont des vecteurs viraux. 24. Combinaison selon l'une des revendications 18 à 23, pour un usage en thérapie. 30 25. Vecteur comprenant a. un site de clonage multiple permettant d'intégrer une séquence d'acides nucléiques A, b. au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, en 35 aval dudit site de clonage, de telle sorte qu'après introduction de la séquence A dans le site de clonage et lors de la transcription, les séquences B fassent partie de la région 3' UTR du transcrit comprenant la séquence A. 26. Vecteur comprenant: a. une séquence d'acides nucléiques A codant pour une protéine ou un ARN, b. au moins deux répétitions d'une séquence B d'au moins 10 nucléotides, en aval de la séquence A, de telle sorte que lors de la transcription, les séquences B fassent partie de la région 3' UTR du transcrit comprenant la séquence A. 27. Vecteur selon l'une des revendications 25 à 6, où ledit vecteur est un vecteur viral. 28. Vecteur selon l'une des revendications 25 à 27, où les répétitions des séquences B sont séparées par une séquence de 0 à 25 nucléotides. 29. Particules virales comprenant un vecteur viral selon la revendication 27. 30. Kit pour l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt, et son inactivation, comprenant une combinaison de vecteurs selon la revendication 19 où ladite séquence A code pour la protéine d'intérêt ou pour l'ARN. 31. Cellule génétiquement modifiée, comprenant dans son génome un transgène exogène intégré dont la partie 3'UTR comprend au moins deux répétitions d'une séquence B, d'au moins 10 nucléotides. 32. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 31 comprenant en outre une séquence d'acides nucléiques, sous forme intégrée ou non, permettant la synthèse dans la cellule d'un ARNi ciblant la séquence B. 33. Cellule génétiquement modifiée, comprenant un transgène exogène dont la partie 3'UTR comprend au moins deux répétitions d'une séquence B, d'au moins 10 nucléotides et comprenant en outre une séquence d'acides nucléiques permettant la synthèse dans la cellule d'un ARNi ciblant la séquence B. 34. Procédé pour inactiver in vitro ou ex vivo l'expression d'une protéine ou d'un ARN d'intérêt dans une cellule transformée par un vecteur selon la revendication 26, où ladite séquence A code pour ladite protéine ou ARN d'intérêt, conduisant à l'expression de la protéine ou de l'ARN d'intérêt, comprenant -l'introduction dans la cellule d'un vecteur conduisant à la synthèse d'un ARNi ciblant la séquence B.