Brevet FR2864445A1 — publié le 20050701

La présente invention concerne une base nutritive complexe (en abrégé BNC) en milieu aqueux, et ses diverses utilisations en tant que médicament à usage topique, pour le traitement de la peau, aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Par base nutritive complexe, on entend toute composition ou formulation, en milieu aqueux, se distinguant, comme précisé ci-après, d'un milieu de culture cellulaire, même si elle permet, en général, comme ce dernier, une culture in vitro viable pendant au moins 72 heures d'un inoculum de certaines cellules prédéterminées. De telles BNC ont été décrites dans le document WO/96/21421, qui décrit leur utilisation, seule ou en combinaison avec d'autres composants, en tant que produit actif ou comme excipient. Une BNC telle que considérée selon la présente invention, ne comporte, ni dans sa composition originelle ni dans sa mise en oeuvre, de facteur de croissance cellulaire, par exemple d'EGF (Epidermal Growth Factor), d'insuline ou de choiera toxine, non traçable. Une BNC telle que considérée selon la présente invention, ne comporte aucun extrait biologique tel que sérum de veau foetal (SVF) ou tout extrait de tige pituitaire de boeuf, non traçable. Par nature, ces extraits ont une composition variable, voire indéterminée, avec parfois une origine indéterminée. Par "tracer" ou "traçable", on entend la caractéristique selon laquelle l'origine puis le traitement d'une matière biologique peuvent être établis et contrôlés. Une BNC considérée par la présente invention ne comporte, par exemple, aucune substance chimiquement indéfinie, telle que substance biologique, traçable ou non. Une BNC considérée selon la présente invention, ne comporte pas de principe actif médicamenteux, tel qu'un antibiotique ou un corticoïde 30 (hydrocortisone). De telles BNC sont constituées en milieu aqueux par au moins, une multiplicité d'acides aminés, dont certains essentiels, différentes vitamines, des oligo-éléments, et des sels métalliques. Conformément au document WO 96/21421, une telle base nutritive 35 complexe a, par exemple, la composition suivante, selon Tableau 1 ci- après: Tableau 1 COMPOSANTS Concentration en mgll Eau q.s.p. Acides aminés L-Alanine 9 2 421 4 L-Asparagine (anhydre 142 Acide Laspartique 42 0 Acide L-glutamique 14.8 L-Glutamine 76 Glycine 0 LIsoleucine 1312 L-Leucine 54 0 L-Méthionine 13 5 L-Phénylalanine 1O U LProline 126 1 L-Sérine L-Thréonine 24 0 9 3 L-Tryptophane 11 7 L-Tyrosine 2 Na 2H20 L-Valine 70,3 Vitamines --_-----_ d-Biotine O}2 Acide folique 0 80 Nicotinamide 030 Pyridoxine HCI 0 06 Riboflavine 0 04 Thiamine HCI 0 30 I-Inositol 18 0 0 Thymidine 0,73 Adénine (Ha.) 24O Acide DL-lipoïque 0,20 Composants inorqaniques Chlorure de sodium 6800,0_ KCI 112,0 NmuHPO! 284,0 Acetate de sodium 300,0 Sulfate de sodium 3 4 Bicarbonate de sodium 1160,0 La présente invention a pour objet une BNC, telle que précédemment définie, considérée en tant que composition à usage topique, pour le traitement thérapeutique ou non de la peau chez l'homme ou l'animal, car améliorant en particulier la viabilité, la croissance et les processus de synthèse des cellules du derme et/ou de l'épiderme, notamment en cas d'agression ou de stress ou suite à des lésions. La présente invention a plus précisément pour objet d'adapter ou particulariser une BNC telle que précédemment décrite, à une utilisation 10 thérapeutique ou clinique sur la peau. Conformément à la présente invention, de manière à adapter une base nutritive complexe telle que précédemment définie, à une utilisation en tant que médicament à usage topique, pour le traitement de la peau, au moins l'une des caractéristiques de composition pondérale de ladite base, définies ci-après, est mise en oeuvre: (a) sa concentration en glucose est au moins de 0.45%, et par exemple comprise entre 0.1% et 0.6% (b) sa concentration en L-hydroxyproline est au moins de 0.003%, et par exemple comprise entre 0.001% et 0.1% (c) sa concentration en acide ascorbique est au moins de 0.0001%, et par exemple comprise entre 0.00001% et 0.001% (d) sa concentration en chacun des composés suivants, à savoir adénosine, guanine, deoxyribose et ribose, est de 0.00001% au moins, et comprise entre 0.000001% et 0.0001%. Préférentiellement, la BNC mise en oeuvre selon la présente invention à titre de médicament présente la totalité des caractéristiques (a) à (d) ci-dessus, de composition pondérale. COMPOSANTS CaCl2.2H2O ZnSO4.7H2O (NHa.)6_MoO24.4H2O MnCl2.4H2O SnCl2.2H2O NH4 VO3 Concentration en mg/I 1,39 120,0 De 13,0 à 22,05 0,144 0,142 0,00002 0,00011 Préférentiellement, la BNC comprend des peptides, par exemple extraits du lait, à une concentration comprise entre 0.1 % et 1 % en poids, et par exemple de 0.5%. Préférentiellement, la BNC comprend au moins 0.07% en poids de 5 hyaluronate de sodium. Préférentiellement, la BNC comprend au moins 0.20% en poids de Lglutamine. Selon un mode préféré d'exécution de la présente invention, le pH de la BNC est ajusté entre 7.4 et 7.5, par exemple à une valeur de 7.45, et/ou l'osmolarité de ladite BNC est ajustée au plus entre 300 et 350 mOsm. A titre d'exemple d'une BNC utilisée en tant que composition topique selon l'invention, la composition pondérale selon Tableau 2 est mise en oeuvre: Tableau 2 NBRE DENOMINATION CONCENTRATION LIGNE INTERNATIONALE En mgA NOMENCLATURE COSMETIQUE INGREDIENT (NOM INCI) 1 EAU q.s.p. (1000mI) 2 CHLORURE DE 6085 SODIUM 3 GLUTAMINE 2043.2 4 SODIUM BICARBONATE 1160 GLUCOSE 4500 6 ARGININE HCL 421,4 7 SODIUM ACETATE 300 8 DISODIUM PHOSPHATE 284 9 LEUCINE 131,2 SERINE 136,6 11 CHLORURE DE Mg 120,0 12 CHLORURE DE K 112 13 VALINE 70,3 14 SODIUM PYRUVATE 55 LYSINE HCL 54 16 HISTIDINE HCL 50 17 CYSTEINE HCL 42 18 ADENINE 24 19 THREONINE 24 CHLORURE DE Ca 13, 0 à 22,05 21 INOSITOL 18 22 ACIDE GLUTAMIQUE 29,5 23 ASPARAGINE 29,2 24 METHIONINE 13,5 TYROSINE 11,7 26 PHENYLALANINE 10,0 27 TRYPTOPHANE 9,3 28 ALANINE 18,1 29 GLYCINE 15,1 ISOLEUCINE 6,0 31 ACIDE ASPARTIQUE 17,3 32 SODIUM SULFATE 3,4 NBRE DENOMINATION CONCENTRATION LIGNE INTERNATIONALE En mgll NOMENCLATURE COSMETIQUE INGREDIENT (NOM INCI) 33 SULFATE FERREUX 1,4 34 ACIDE FOLIQUE 1,8 THYMIDINE 0,73 36 CYANOCOBALAMINE 0,41 37 CALCIUM 13 PANTOTHENATE 38 THIAMINE HCL 1,3 39 ACIDE THIOCTIQUE 0,3 ZINC SULFATE 0,144 41 SODIUM SILICATE 0,142 42 PYRIDOXINE HCL 1,06 43 NIACINAMIDE 1,04 44 RIBOFLAVIN 0,4 BIOTIN 0,02 46 SULFATE DE CUIVRE 0,003 47 AMMONIUM 0,00120 MOLYBDATE 48 AMMONIUM VANADATE 0,003 49 CHLORURE DE Mn 0,00002 HYALURONATE DE 70 SODIUM 51 HYDROXYPROLINE 30 52 PROLINE 46 53 ACIDE ASCORBIQUE 1 54 ADENOSINE 0.1 GUANINE 0.1 56 DEOXYRIBOSE 0.1 57 RIBOSE 0.1 58 "MILK PEPTIDE 1000 à 10000 COMPLEX" 59 CHOLINE CHLORIDE 1 MYO INOSITOL 2 Une BNC selon la présente invention n'a aucune indication ou application ophtalmique ou ophtalmologique, en particulier par application sur l'extérieur de la cornée, par exemple localement, chez l'homme ou l'animal. Une BNC adaptée selon la présente invention à un usage topique génère au sein de la peau les effets favorables conjoints suivants: - apport d'énergie exogène aux cellules cutanées - stimulation de la fibrillogénèse collagénique et élastique - et la stimulation du renouvellement cellulaire. Ceci est en particulier mis en évidence par le protocole 10 expérimental décrit ci-après. L'efficacité in vitro d'une BNC selon l'invention, ayant la composition selon Tableau 2, est objectivée par rapport à une BNC selon l'art antérieur (WO96/21421), ayant la composition selon Tableau 1, d'une part par des tests sur fibroblastes humains normaux (essai 1), et d'autre part par des tests sur une lignée de kératinocytes humains (essai 2). Essai n 1: test sur fibroblastes humains normaux. La capacité de croissance de fibroblastes humains normaux cultivés pendant 9 jours dans la BNC selon Tableau 2 versus la BNC selon 20 Tableau 1 est évaluée. 1. Objectif de l'étude L'objectif de cette étude est d'évaluer la croissance de fibroblastes humains normaux ensemencés à faible densité dans une BNC selon 25 Tableau 2. L'étude est réalisée en comparaison avec la BNC selon Tableau 1. L'étude est réalisée avec des BNC dépourvues de facteurs de croissance cellulaire (absence de SVF et d'extrait de tige pituitaire de boeuf), et d'autres substances chimiquement non définies ou médicamenteuses. 2. Technique Les fibroblastes sont ensemencés à faible densité en plaque 96 puits dans un milieu standard (DMEM + 10%SVF) et poussent pendant 24h après ensemencement dans ce milieu. Au 2éme jour, les cellules sont placées dans les différentes conditions étudiées. Le milieu BNC selon Tableau 2 est enrichi extemporanément en Complexe MPC - Complexe de peptides de lait (lot n 3035626 CLR) - testé à 2 concentrations: 1 et 5 mg/ml. Différents milieux sont testés: BNC selon Tableau 2 (+MPC 1 et 5 mg/ml) versus BNC selon Tableau 1, en l'absence de SVF et toute autre substance chimiquement non définie ou médicamenteuse. Chaque condition est réalisée en triplicate. Les BNC ne sont pas renouvelées au cours de l'expérimentation. La densité cellulaire est évaluée 24h après l'ensemencement des cellules, avant la mise au contact des différentes conditions d'étude (= TO), puis la croissance des fibroblastes est évaluée aux 2éme, 4ème, 7ème et Sème jours de culture par la méthode de conversion du WST-1 (lecture à 450 nm). 3. Résultats La croissance cellulaire est objectivée par la mesure de la viabilité cellulaire à différents temps de l'expérimentation. Les résultats obtenus présentent le pourcentage de viabilité cellulaire calculé par rapport à la densité cellulaire initiale à TO, pour laquelle on estime avoir une densité cellulaire égale à 100%. Les résultats obtenus se résument comme suit: É En milieu BNC selon Tableau 1, on observe, au 2ème jour de culture, une diminution de la viabilité cellulaire due au passage des cellules dans un milieu dépourvu de sérum. On observe ensuite une légère reprise de la croissance cellulaire jusqu'au 4ème jour (57% de viabilité cellulaire/T0), puis une stabilisation et une lente diminution à partir du 7ème jour. É En milieu BNC selon Tableau 2 contenant 0,1% de Complexe MPC, on observe une stimulation de la croissance cellulaire. La croissance cellulaire augmente régulièrement jusqu'au 7ème jour, puis elle ralentit. É En milieu BNC selon Tableau 2 contenant 0,5% de Complexe MPC, on observe une très forte stimulation de la croissance cellulaire..Jusqu'au 7ème jour, on observe une croissance cellulaire très fortement stimulée par rapport à la culture avec une BNC selon Tableau 1 (+ 360% à T7). On observe par la suite un ralentissement de la croissance cellulaire s'expliquant par le non renouvellement des milieux au cours de l'expérimentation. 4. Conclusion Dans les conditions expérimentales ainsi définies, il apparaît que le milieu BNC selon Tableau 2 permet la croissance de fibroblastes humains normaux. L'ajout extemporané du Complexe MPC stimule très fortement la croissance cellulaire et ce de manière dose-dépendante, avec un effet maximal pour une concentration de 5mglml. La croissance cellulaire est de faible intensité en milieu BNC selon Tableau 1. Essai n 2: test sur une lignée de kératinocytes humains. La capacité de croissance d'une lignée immortalisée de kératinocytes humains normaux, les cellules HaCaT, cultivées pendant six jours dans la BNC selon Tableau 2, versus la BNC selon Tableau 1, est évaluée: 1. Objectif de l'étude L'objectif de cette étude est d'évaluer la croissance d'une lignée 20 immortalisée de kératinocytes humains, les cellules HaCaT, ensemencées à faible densité dans une BNC selon Tableau 2. L'étude est réalisée en comparaison la BNC selon Tableau 1. Chacune des BNC est utilisée sans ajout de facteur de croissance cellulaire (absence de sérum de veau foetal et d'extrait de tige pituitaire de boeuf), et d'autres substances chimiquement non définies ou médicamenteuses. 2. Technique Les cellules HaCaT sont ensemencées à faible densité en plaque 30 96 puits dans un milieu standard (DMEM + 10%SVF) et poussent pendant 24h après ensemencement dans ce milieu. Au 2ème jour, les cellules sont placées dans les différentes conditions étudiées. Le milieu BNC selon Tableau 2 est enrichi extemporanément en Complexe MPC - Complexe de peptides de lait (lot n 3035626 CLR) testé à 2 concentrations: 1 et 5 mg/ml. Différents milieux sont testés: BNC selon Tableau 2 (+MPC 1 et 5 mg/ml) versus BNC selon Tableau 1, en l'absence de SVF et toute autre substance chimiquement non définie ou médicamenteuse. Chaque condition est réalisée en triplicate. Les BNC ne sont pas 5 renouvelées au cours de l'expérimentation. La densité cellulaire est évaluée 24h après l'ensemencement des cellules, avant la mise au contact des différentes conditions d'étude (= TO), puis la croissance des cellules HaCaT est évaluée au 2ème, 4ème et 6ème jours de culture par la méthode de conversion du WST-1 (lecture à 450 nm). 3. Résultats La croissance cellulaire est objectivée par la mesure de la viabilité cellulaire à différents temps de l'expérimentation. Les résultats obtenus présentent le pourcentage de viabilité cellulaire calculé par rapport à la densité cellulaire initiale à TO, pour laquelle on estime avoir une densité cellulaire égale à 100%. Les résultats obtenus peuvent être résumés comme suit: É En milieu BNC selon Tableau 1, on observe, au 2ème jour de culture, une forte diminution de la viabilité cellulaire due au passage des cellules dans un milieu dépourvu de sérum (15% de viabilité cellulaire/T0). On observe ensuite une reprise de la croissance cellulaire jusqu'au 4ème jour (42% de viabilité cellulaire/TO), puis une stabilisation jusqu'au 6ème jour. É En milieu BNC selon Tableau 2 contenant 0,1% de Complexe MPC, on observe au 2ème jour de culture, comme pour le milieu précédent, une forte diminution de la viabilité cellulaire due au passage des cellules dans un milieu dépourvu de sérum (20% de viabilité cellulairelTO). On observe par la suite une forte reprise de la croissance cellulaire, croissance qui se poursuit jusqu'au 6ème jour de culture. É En milieu BNC selon Tableau 2 contenant 0,5% de Complexe MPC, on observe au 2ème jour de culture une diminution de la viabilité cellulaire au passage des cellules dans un milieu dépourvu de sérum mais celle-ci est de moindre intensité par rapport à celle observée pour la BNC selon Tableau 1 (43% de viabilité cellulairelTO). On observe par la suite une très forte reprise de la croissance cellulaire, supérieure à celle obtenue dans le milieu BNC selon Tableau 1 et à celle obtenue avec le milieu BNC selon Tableau 2 contenant 0,1 % de Complexe MPC. La croissance se poursuit jusqu'au 6ème jour où l'on atteint un plateau du à la confluence cellulaire. 4. Conclusion Dans les conditions expérimentales ainsi définies, il apparaît que le milieu BNC selon Tableau 2 permet la croissance d'une lignée immortalisée de kératinocytes humains normaux, les cellules HaCaT. L'ajout extemporané du Complexe MPC stimule très fortement la croissance cellulaire, et ce de manière dose-dépendante avec un effet maximal pour une concentration de 5mg/ml. La croissance cellulaire est de faible intensité en milieu BNC selon 15 Tableau 1. Une BNC selon la présente invention a été expérimentée in vivo et ex-vivo (sur expiants cutanés), comme décrit ci-après. Tous les essais décrits ci-après sont faits avec une BNC selon Tableau 2. Selon l'essai n 3 décrit ci-après, on a évalué l'efficacité d'une BNC selon l'invention chez 12 sujets, par une étude immuno-histochimique de la laminine et une analyse morphométrique du collagène et des fibres élastiques au niveau de biopsies cutanées, et ce en étudiant comparativement la zone traitée avec une BNC selon l'invention et la zone non traitée. Cette étude met en évidence une action de la BNC selon l'invention sur la stimulation du métabolisme des fibroblastes chez les patientes de plus de 60 ans essentiellement, à savoir, augmentation du dépôt de laminine au niveau de la jonction dermo-épidermique, densification des réseaux de fibres élastiques au niveau du derme moyen et du collagène dans le derme superficiel et moyen. Essai n 3: Evaluation de la laminine, du collagène et des fibres élastiques au niveau de biopsies cutanées réalisées chez 12 sujets, avec étude comparative entre la zone traitée par une BNC selon l'invention, et une zone non traitée. Introduction et but Le but de cette étude est de mettre en évidence l'efficacité d'une BNC chez 12 sujets par une étude immunohistochimique de la laminine et une analyse morphométrique du collagène et des fibres élastiques au niveau de biopsies cutanées de la zone traitée en comparaison avec la zone non traitée. Matériel et méthodes L'évaluation immunohistochimique des modifications dermiques a été réalisée à partir des biopsies cutanées après fixation dans le liquide de 10 Bouin et inclusion en paraffine. (a) Analyse de la laminine A partir des fragments inclus en paraffine, l'analyse de la jonction dermo-épidermique a été réalisée avec l'anticorps anti-laminine (Clinisciences). Après démasquage des sites antigéniques par la chaleur (micro-onde) puis action enzymatique par la pepsine, l'immunodétection est réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélée en AEC. Ce démasquage est responsable d'un décollement artéfactiel de la jonction entre derme et épiderme. L'intensité du marquage immunohistochimique a été évaluée à l'aide d'un score histologique semi-quantitatif (0 à 3) au grossissement 40 (5 à 6 champs par coupe). (b) Quantification histologique des fibres élastiques par analyse d'image informatisée. Les fibres élastiques ont été révélées par une coloration à la (+) catéchine. Une quantification morphométrique des fibres élastiques par analyse d'image assistée par ordinateur a été réalisée. Le pourcentage de surface de derme superficiel et moyen occupé par les fibres élastiques a ainsi été calculée. (c) Quantification histologique du collagène par analyse d'image 35 informatisée Le collagène a été mis en évidence par une coloration au rouge sirius et quantifié morphométriquement par analyse d'image assistée par ordinateur. Le pourcentage de surface de derme superficiel et moyen occupé par le collagène a été calculé. (d) Statistiques Une moyenne a été réalisée à partir des résultats obtenus sur les 12 peaux. Une étude comparative a ainsi été réalisée entre le côté traité par la BNC et le côté non traité. Une moyenne a également été calculée par tranche d'âge, 6 sujets entre 60 et 64 ans (sujets 1, 3, 6, 7, 9 et 12) et 6 sujets entre 44 et 49 ans (sujets 2, 4, 5, 8,10 et 11). L'analyse statistique a été effectuée par le test de Student dit de l'écart réduit ou test des échantillons appariés, avec un risque a de 5%. Une iconographie permet d'illustrer les résultats sous forme d'exemples. Résultats a) Analyse de la laminine La qualité de la jonction dermoépidermique tend à être augmentée au niveau des peaux traitées par la BNC. La différence entre côté traité (score moyen de 2,15) et côté non traité (score moyen de 1,75) est nette chez les sujets de la tranche d'âge 40 ans. b) Quantification histologique des fibres élastiques par analyse d'image informatisée L'analyse des fibres élastiques montre une tendance à l'amélioration du réseau de ces fibres, notamment au niveau du derme moyen, 8,35% de fibres côté traité contre 7,7% côté non traité et plus discrète dans le derme superficiel: 4,77% versus 4,5%. Dans le derme superficiel, c'est au niveau de la tranche d'âge des 60 ans que l'amélioration côté traité est la plus nette: 5,2% de fibres élastiques contre 4,6% du côté non traité. Nous n'avons pas observé de modification significative du réseau de fibres élastiques dans la tranche d'âge de 40 ans après traitement par la BNC. Le manque de significativité est vraisemblablement en rapport avec le petit nombre de sujets. c) Quantification histologique du collagène par analyse d'image informatisée L'analyse du collagène montre une tendance à l'amélioration de ce réseau pour la tranche d'âge située autour de 60 ans du côté traité par la BNC, tant au niveau du derme superficiel (réseau de collagène augmenté de 1,9%) que du derme moyen (réseau augmenté de 1,95%). Ce résultat intéressant est à corréler avec ceux de la littérature observant une perte du collagène avec l'âge de l'ordre de 1% tous les 5 ans. Nous n'avons pas observé de modification des faisceaux de collagène dans la tranche d'âge située autour de 40 ans après traitement par la BNC, alors que le réseau de collagène est plus important à 40 ans qu'à 60 ans. L'analyse au cas par cas dans la tranche d'âge située autour de 40 ans a permis de vérifier que la nature du bras traité (droite ou gauche) n'est pas responsable d'une éventuelle modification de la quantité de tissu élastique et n'influence donc pas les résultats. Conclusion Nous avons mis en évidence une action de la BNC selon l'invention sur la stimulation du métabolisme des fibroblastes, essentiellement chez les 20 sujets d'âge situé autour de la soixantaine. L'essai n 3 illustre donc les propriétés bénéfiques d'une BNC selon l'invention en matière de cicatrisation et d'effet anti-âge. Selon l'essai n 4 décrit ci-après, on a évalué au plan immunohistochimique la prolifération, la différenciation et la cohésion cellulaire au niveau de biopsies cutanées réalisées chez 12 patientes, en étudiant comparativement la zone traitée par une BNC selon l'invention et la zone non traitée. Cette étude met en évidence une augmentation de l'index mitotique des kératinocytes, c'est-à-dire du renouvellement cellulaire au sein de l'épiderme, au niveau des zones traitées par une BNC selon l'invention, chez les 12 patientes, par rapport aux zones non traitées, propriété potentiellement bénéfique pour la promotion de la cicatrisation ou le ralentissement du vieillissement cutané. Essai n 4. Evaluation immunohistochimique de la prolifération, de la différentiation et de la cohésion cellulaire au niveau des biopsies cutanées réalisées chez 12 patientes, avec étude comparative entre la zone traitée par une BNC selon l'invention, et une zone non traitée. Introduction et but Le but de cette étude est de mettre en évidence l'efficacité de la BNC selon l'invention chez 12 patientes par une étude immunohistochimique de la différenciation, de la prolifération et de la cohésion cellulaire au niveau de biopsies cutanées de la zone traitée, en comparaison avec la zone non traitée. Matériel et Méthodes L'évaluation immunohistochimique des modifications épidermiques 15 a été réalisée à partir des fragments de peau fixés dans le liquide de Bouin et inclus en paraffine. a) Analyse immunohistochimique de l'activité mitotique des kératinocytes La prolifération épithéliale a été analysée par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps anti-Ki67 (marqueur des cellules en phases M, S, G1 et G2 du cycle cellulaire). L'immunodétection a été réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches, amplifiée (kit DAKO) et révélée en DAB. Le nombre de cellules marquées est évalué par rapport à un total 25 de 200 à 400 cellules. Le pourcentage de cellules en cours de prolifération au niveau de la couche basale a ainsi été calculé. b) Analyse immunohistochimique de la différenciation épithéliale La différenciation épithéliale est mise en évidence avec un 30 anticorps anti-cytokératines totales (Novocastra). L'immunodéteclion est réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélée en DAB (Diaminobenzidine). L'intensité, la topographie ainsi que la répartition du marquage immunohistochimique ont été évaluées à l'aide des scores semiquantitatifs suivants: É Intensité du marquage - négatif: score 0 - léger: score I - modéré : score 2 - important: score 3 É Topographie du marquage (sur toute la hauteur de l'épithélium) - négatif: score 0 - couche cornée et couche granuleuse marquées: score 1 - couche cornée, couche granuleuse et partie haute du corps muqueux: score 2 - ensemble de l'épithélium sauf couche basale: score 3 É Répartition de l'immunomarquage - Inhomogène: score 0 (certains secteurs de l'épiderme seulement sont marqués positivement). - Homogène: score 1 (l'ensemble de l'épithélium est concerné). Un score global de différenciation est calculé en sommant les scores intensité, topographie et répartition de l'immunomarquage et une moyenne est calculée. Un score élevé témoigne d'une bonne différenciation épithéliale. c) Mise en évidence de la cohésion cellulaire La cohésion interkératinocytaire ainsi que la cohésion entre les kératinocytes de la couche basale et le tissu conjonctif sous-jacent peuvent être mis en évidence à l'aide d'un anticorps anti-intégrine VLA (31 (Immunotech, CD 29, 13OkD). L'immunodétection est réalisée à l'aide d'une technique 30 d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélée en DAB (Diaminobenzidine). L'intensité et la répartition du marquage immunohistochimique ont été évaluées à l'aide des scores semi-quantitatifs suivants: É Intensité du marquage - négatif: score 0 - léger: score 1 - léger à modéré: score 2 modéré: score 3 - modéré à important: score 4 É Répartition de l'immunomarquage - très inhomogène (quelques cellules marquées positivement) score 1 - inhomogène (rares secteurs marqués positivement) : score 2 - plusieurs secteurs marqués positivement: score 3 - homogène avec marquage de toute la couche basale: score 4 10 Un score global de cohésion cellulaire est calculé en sommant les scores intensité et répartition de l'immunomarquage et une moyenne est calculée. Un score élevé témoigne d'une bonne cohésion cellulaire. Résultats a) Analyse immunohistochimique de l'activité mitotique des kératinocytes Le traitement par la BNC selon l'invention a permis d'augmenter significativement le renouvellement des cellules épithéliales (p b) Analyse immunohistochimique de la différenciation épithéliale La différenciation épithéliale tend à être de meilleure qualité au niveau des peaux traitées par la BNC selon l'invention en comparaison avec les peaux non traitées. Le score global obtenu est de 6,54 contre 4,96. Nous n'avons pas obtenu de différence statistiquement significative, l'analyse au cas par cas permettant néanmoins d'observer une différenciation nettement meilleure dans 7 cas traités sur 12, en comparaison avec les côtés non traités. c) Mise en évidence de la cohésion cellulaire L'anticorps anti-VLA [31 a permis de mettre en évidence la cohésion inter-kératinocytaire au niveau de la couche basale (score de 1 dans tous les cas analysés, traités ou non traités), ainsi que la cohésion entre la couche basale et la jonction dermo-épidermique. La cohésion cellulaire tend à être de meilleure qualité au niveau des peaux traitées par la BNC selon l'invention, en comparaison avec les peaux non traitées: le score global obtenu est de 5,5 contre 4,6. Nous n'avons pas obtenu de différence statistiquement significative, l'analyse au cas par cas permettant néanmoins d'observer une cohésion cellulaire supérieure dans 8 cas traités sur 12, en comparaison avec les côtés non traités. Conclusion Le traitement par la BNC selon l'invention permet d'obtenir chez 12 sujets une augmentation statistiquement significative de l'index mitotique. La différenciation épithéliale ainsi que la cohésion cellulaire sont améliorées en zone traitée, mais cependant sans caractère significatif. Selon l'essai N 5 décrit ci-après, on évalue les effets d'une BNC selon l'invention sur le maintien en survie et la différenciation de fragments de peau. Cette étude montre les capacités d'une BNC selon l'invention à maintenir en survie des fragments de peau humaine en culture in vitro, ainsi que son action sur la régénération des cellules épidermiques, propriété potentiellement bénéfique pour la promotion de la cicatrisation ou le ralentissement du vieillissement cutané. Essai n 5: Evaluation d'une BNC sur le maintien en survie et la différenciation de fragments de peaux. Introduction et but Le but de cette étude est de mettre en évidence l'efficacité d'une BNC sur la survie ex vivo et la différenciation cutanée de fragments de peau humaine. L'évaluation est histologique (analyse de la viabilité cellulaire) et immunohistochimique (anticorps permettant d'analyser la prolifération, la différenciation et la cohésion cellulaire) avec établissement de scores semi quantitatifs. Matériels et Méthodes a) Maintien en survie de peau humaine Des fragments de peau humaine normale de 4 donneurs différents ont été déposés dans des inserts eux-mêmes positionnés sur des puits de culture. La BNC selon l'invention est déposée au fond des puits, un passage s'effectuant par diffusion lente entre les deux compartiments par l'intermédiaire d'une membrane poreuse (12pm) b) Milieu de culture à tester L'efficacité de la BNC selon l'invention sur la survie et la différenciation des fragments de peau a été comparée avec celle obtenue en présence d'un tampon phosphate type PBS (avec ou sans EGF, "Epithélial Growth Factor"). Ainsi, les comparaisons suivantes ont été effectuées: - tampon PBS - tampon PBS + EGF - BNC Les changements de milieu ont été effectués tous les jours pendant 3 jours, puis les fragments de peau sont recueillis pour une analyse histologique et immunohistochimique. c) Analyses Evaluation histologique et immunohistochimique des modifications épidermiques Les fragments de peau ont été fixés dans le liquide de Bouin et inclus en paraffine. - Evaluation histologique sur la viabilité de l'épiderme L'épiderme est observé à partir de coupes colorées par l'hemalunéosine. La viabilité cellulaire est évaluée au niveau du noyau (affinité tinctoriale à l'hématéine) et du cytoplasme (affinité tinctoriale à l'éosine). En effet, les altérations nucléaires témoignant de la souffrance et de la nécrose cellulaire correspondent à une condensation de la chromatine (pycnose) ou à l'inverse à une clarification du noyau. Les altérations du cytoplasme correspondent également à une clarification ou plus rarement à une condensation avec aspect éosinophile du cytoplasme. Un comptage du nombre de cellules altérées a été effectué au microscope optique au niveau de l'épiderme sur 10 champs (objectif 40). Lorsque le pourcentage de cellules nécrosées dépasse 50%, une acantholyse (clivage des ponts d'union entre les cellules) est habituellement notée avec parfois décollement au niveau de la jonction dermo-épidermique. L'aspect de la chromatine a été examiné après coloration de Feulgen. Cette évaluation a permis de compléter l'analyse histologique et de réaliser une iconographie. Les altérations nucléaires sont évaluées à l'aide de scores semi quantitatifs: - altération très importante (nécrose massive avec altérations concernant 60 à 100% des cellules): score 0 altération importante (altérations nucléaires concernant 25 à 60% des cellules): score 1 - altération légère à modérée (altérations nucléaires concernant 5 à 25% des cellules avec clarification ou pycnose): score 2 pas d'altération nucléaire ou Un comptage du nombre de cellules marquées est effectué et rapporté à la longueur de l'épithélium mesurée sur la coupe (mm). - Analyse immunohistochimique de la différenciation épithéliale 25 La différenciation épithéliale est mise en évidence avec un anticorps anticytokératines totales (Novocastra). L'immunodétection est réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélée en DAB (Diaminobenzidine). L'intensité, la topographie ainsi que la répartition du marquage immunohistochimique ont été évaluées à l'aide des scores semiquantitatifs suivants: É Intensité du marquage 35 - léger: score 1 modéré: score 2 - important: score 3 É Topographie du marquage (sur toute la hauteur de l'épithélium) - négatif: score 0 - couche cornée et couche granuleuse marquées: score 1 - couche cornée, couche granuleuse et partie haute du corps muqueux: score 2 - ensemble de l'épithélium sauf couche basale: score 3 É Répartition de l'immunomarquage - Inhomogène: score 0 (certains secteurs de l'épiderme seulement sont marqués positivement) Homogène: score 1 (tout l'épithélium est concerné) Un score global de différenciation est calculé en sommant les scores intensité, topographie et répartition de l'immunomarquage et une moyenne est calculée. Un score élevé témoigne d'une bonne différenciation épithéliale. - Mise en évidence de la cohésion cellulaire La cohésion interkératinocytaire ainsi que la cohésion entre les kératinocytes de la couche basale et le tissu conjonctif sous-jacent peuvent être mis en évidence à l'aide d'un anticorps anti-intégrine VLA 131 (Novocastra, CD 29, 130 kD). L'immunodétection est réalisée à l'aide d'une technique d'immunoperoxydase indirecte en 3 couches (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) et révélée en DAB (Diaminobenzidine). L'intensité, la topographie ainsi que la répartition du marquage immunohistochimique ont été évaluées à l'aide des scores semiquantitatifs suivants: É Intensité du marquage - négatif: score 0 - léger: score 1 - léger à modéré: score 2 - modéré: score 3 - modéré à important: score 4 É Topographie du marquage - négatif: score 0 - La couche basale: score 1 - La couche basale et suprabasale: score 2 - La couche basale et le corps muqueux: score 3 É Répartition de l'immunomarquage - Très inhomogène (quelques cellules marquées positivement): score 0 Inhomogène: (rares secteurs marqués positivement): score 1 - Homogène: score 2 Un score global de cohésion cellulaire est calculé en sommant les scores intensité, topographie et répartition de l'immunomarquage et une moyenne est calculée. Un score élevé témoigne d'une bonne cohésion cellulaire. Résultats 1) Evaluation histologique de la viabilité de l'épiderme L'examen de l'épiderme à partir de coupes colorées par l'hemalun-éosine a permis de mettre en évidence une bonne viabilité des peaux maintenues en survie en présence d'une BNC selon l'invention. Cette viabilité épidermique est significativement meilleure comparée à celle observée en présence de PBS seul Ainsi, les peaux maintenues en survie pendant 3 jours en présence des différents milieux peuvent être classées en fonction de leur qualité histologique: 1er: BNC selon l'invention 2nd: PBS + EGF 3ème: PBS L'aspect de la chromatine a été examiné après coloration de Feulgen. L'ADN cellulaire bien visible est coloré en rose. Une altération des cellules se traduit par une diminution de la visualisation de l'ADN. L'analyse à l'aide de scores confirme le résultat précédent. Quant aux peaux maintenues en survie en présence de PBS, avec ou sans EGF, des altérations nucléaires modérées à importantes sont observées: score de 1,4. Un classement peut donc être réalisé: 1er: BNC selon l'invention 2nd: PBS + EGF similaire à PBS 2) Evaluation de l'activité mitotique Les cellules en cours de division révélées en immunoperoxydase sont visualisées au niveau de la couche basale et au niveau des 2 à 3 couches supra- basales. Les épithéliums qui prolifèrent sont ceux qui ont été cultivés en présence de la BNC selon l'invention: environ 10 cellules/mm d'épiderme sont dénombrées en phase S de prolifération. II existe une différence statistiquement significative entre les peaux cultivées en présence de la BNC et les peaux cultivées en présence de PBS (avec ou sans EGF) (p 3) Analyse immunohistochimigue de la différenciation épithéliale La différenciation épithéliale est mise en évidence à l'aide de 15 l'anticorps anti-cytokératines totales. En raison du petit nombre d'échantillons et des écarts-types obtenus, nous n'avons pas obtenu de différence significative en ce qui concerne la différenciation épithéliale, quelque soit le milieu de culture appliqué. La différenciation tend malgré tout à être de meilleure qualité au niveau des peaux cultivées en présence de la BNC selon l'invention (score de 5,9) en comparaison avec celles cultivées en présence de PBS, avec ou sans EGF (respectivement score de 4 et 5,1). L'analyse au cas par cas permet d'observer une différenciation nettement meilleure dans 2 cas sur 4 en présence de la BNC, en comparaison avec le PBS, avec ou sans EGF. 4) Mise en évidence de la cohésion cellulaire L'anticorps anti-VLA 131 permet de mettre en évidence la cohésion inter-kératinocytaire au niveau de la couche basale et au niveau de 2 à 3 couches supra-basales, ainsi que la cohésion entre la couche basale et la jonction dermo-épidermique. Une bonne cohésion cellulaire est notée au niveau des peaux cultivées en présence de la BNC selon l'invention, en comparaison avec celles cultivées en présence de PBS, avec ou sans EGF (respectivement scores de 3,5 et 3,9). Le petit nombre de cas analysés et les écarts-types ne permettent pas de mettre en évidence de différence significative. Conclusion Le maintien en survie de peau humaine en présence d'une BNC selon l'invention permet d'obtenir une bonne viabilité épidermique, avec augmentation de l'index mitotique une différenciation épithéliale et une cohésion cellulaire augmentée, en comparaison avec des peaux maintenues en survie en présence de PBS. Essai n 6: Tests d'objectivation in vitro de l'efficacité d'une BNC selon l'invention La cytocompatibilité et les performances de la BNC selon Tableau 2 ont été testées sur des cultures de kératinocytes humains en monocouche et sur des épidermes totaux reconstitués in vitro, en comparaison avec une solution saline tamponnée (PBS). Cette BNC permet une culture de kératinocytes en monocouche dans des conditions optimales de viabilité, durant au moins 36 heures, sans que se manifeste le moindre effet cytotoxique. A l'inverse, une solution de survie classique telle que le PBS s'avère cytotoxique, en particulier après 12 heures d'incubation. De la même façon, cette BNC permet de maintenir en culture des épidermes humains reconstitués in vitro, présentant des couches cellulaires basales, spineuses, granuleuses et cornées intactes, orthokératosiques, de stratification régulière et normale. A contrario, l'utilisation de PBS induit l'apparition de kératinocytes en phase terminale de différenciation au niveau des assises basales et spineuses, avec des signes de nécrose plus ou moins prononcés. Nous avons également étudié les effets de cette BNC sur la croissance d'une lignée de kératinocytes transformés. Aucune différence significative dans la vitesse de prolifération cellulaire n'a été notée jusqu'à confluence des cultures. Nous pouvons donc conclure à l'absence de composants stimulant la prolifération des cellules transformées. Une BNC selon l'invention recrée un environnement extracellulaire caractérisé par: É un apport nutritionnel optimisé, aussi bien en vitamines, oligo- éléments qu'en acides aminés essentiels, É un pH et une osmolarité proches des conditions physiologiques, É sans faire appel aux habituelles substances d'origine animale non tracées jouant le rôle de facteurs de croissance cellulaire. Cette BNC, fabriquée et conditionnée dans des conditions d'asepsie très strictes, est dépourvue de conservateurs. De nombreuses applications pharmaceutiques topiques sont mises en oeuvre comme suit: É solution stérile (uni-doses) destinée à l'entretien et la prise des greffes chez les grands brûlés et surtout procédé de "décontamination" (déplétion) des épidermes de culture vis-à-vis des substances d'origine biologique et médicamenteuse, présents dans les milieux de culture commerciaux, avant qu'ils ne soient greffés chez les grands brûlés. É sérums ou crèmes destinés au traitement des retards et troubles de la cicatrisation (escarres, ulcères variqueux, prévention des chéloïdes et des vergetures...), et au ralentissement du vieillissement cutané. Différentes voies peuvent être mises en oeuvre pour appliquer une BNC selon l'invention de manière topique sur tout ou partie superficielle du corps humain. Une première voie, "traditionnelle", consiste à formuler une BNC sous la forme d'une crème (émulsion eau dans huile ou huile dans eau, émulsions multiples EIHIE OU H/E/H), de pommade, de gel, de crème, ou de spray, avec un ou des excipients appropriés pour un contact avec la peau. Une deuxième voie consiste à associer une BNC selon l'invention, d'une manière ou d'une autre, à un pansement ou tout dispositif médical équivalent ou similaire, destiné à venir au contact de la peau. Un pansement adhésif traditionnel comprend par exemple: - une partie externe, par exemple en non tissé, souvent hydrophobe, et perméable aux gaz - une partie intermédiaire, absorbante, par exemple en cellulose défibrée - et une partie interne, au contact externe et superficiel de la peau, par exemple en voile textile non adhérent. A partir de cette structure traditionnelle, une BNC selon l'invention peut être incorporée à la partie intermédiaire absorbante selon trois modalités: - au moment de l'application du pansement, par exemple sur une plaie, une dose de BNC est appliquée préalablement sur cette partie intermédiaire, pour son imprégnation, - la BNC imprègne en permanence, c'est-à-dire au départ et prête à l'emploi, cette même partie intermédiaire, - la BNC est incorporée, à l'état sec, par exemple sous forme lyophilisée, cette même partie intermédiaire, et l'humidité de la peau, ou l'exsudat de la plaie reconstitue la BNC, pour son action sur la peau. D'autres pansements, moins traditionnels, consistent en une plaque adhésive composée d'un hydrocolloïde, ou gel (par exemple carboxyméthyl cellulose sodique). En pareil cas, comme précédemment, la BNC est incorporée et distribuée, à l'état sec ou en milieu aqueux, dans la matrice de la plaque 15 adhésive. A titre d'exemple, une BNC est incorporée dans un gel filmogène hydroactif, obtenu à partir d'un alginate de sodium ou de calcium, ou de tout autre polymère filmogène. Ce gel forme après séchage un film à la surface de la peau, perméable à l'air, agissant comme une barrière bactériologique, par exemple en favorisant la cicatrisation avec autolyse et élimination des tissus nécrotiques, si le gel filmogène est appliqué sur une plaie. A partir des résultats des essais ci-dessus, une BNC selon l'invention peut-être utilisée en tant que médicament dermatologique, en particulier selon au moins l'une des indications suivantes, à savoir: - régénération de la peau chez les personnes âgées - ralentissement du vieillissement cutané - promotion de la cicatrisation - réparation ou reconstitution de l'épiderme et/ou du derme, traitement de brûlures post-chirurgicales, kératoses actiniques, brûlures "post 30 peeling" ou post-dermabrasion. Une BNC selon l'invention peut être utilisée en tant que pansement, en particulier en tant que pansement compressif, pour la prévention ou le traitement des chéloïdes. En pareil cas, la BNC peut être reconstituée ou libérée à partir du pansement. Une BNC selon l'invention peut être utilisée pour la déplétion en substances d'origine biologique ou médicamenteuse d'épidermes humains de culture, avant la greffe de ces derniers. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une base nutritive complexe en milieu aqueux, pour fabriquer ou obtenir un médicament à usage topique chez l'homme ou l'animal, ladite base étant constituée au moins par une multiplicité d'acides aminés, des vitamines, des oligo-éléments, et des sels métalliques, ladite base excluant tout facteur de croissance cellulaire, tout extrait biologique d'origine animale ou cellulaire, non tracés, caractérisée en ce que la base nutritive complexe présente au moins l'une des caractéristiques de composition suivante: (a) sa concentration en glucose est au moins de 0.45%, et par exemple comprise entre 0.1% et 0.6%, (b) sa concentration en L-hydroxyproline est au moins de 0.003%, et par exemple comprise entre 0.001% et 0.01%, (c) sa concentration en acide ascorbique est au moins de 0.0001%, et par exemple comprise entre 0.00001% et 0.001%, (d) sa concentration en chacun des composés suivants, à savoir adénosine, guanine, deoxyribose et ribose, est de 0.00001% au moins, et comprise entre 0.000001% et 0.0001%. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la base nutritive complexe présente la totalité des caractéristiques de composition pondérale (a) à (d). 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la base nutritive complexe comprend des peptides, par exemple extraits du lait, à une concentration comprise entre 0.1% et 1% en poids. 4. Utilisation selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que la base nutritive complexe comprend au moins 0.07% en poids de hyaluronate de sodium. 5. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la base nutritive complexe comprend au moins 0.20% en poids de L-glutamine. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le pH de la base nutritive complexe est ajusté entre 7.4 et 7.5. 7.Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'osmolarité de la base nutritive complexe est ajustée au plus entre 300 et 350 mOsm. 8. Utilisation d'une base nutritive complexe selon la revendication 1, en tant que médicament dermatologique, en particulier selon au moins l'une des indications suivantes, à savoir: - régénération de la peau chez les personnes âgées - ralentissement du vieillissement cutané - promotion de la cicatrisation - réparation ou reconstitution de l'épiderme et/ou du derme, traitement de brûlures post-chirurgicales, kératoses actiniques, brûlures "post peeling" ou post dermabrasion. 9. Utilisation d'une base nutritive complexe selon la revendication 1, en tant que pansement. 10. Utilisation selon la revendication 9, en tant que pansement compressif pour la prévention ou le traitement des chéloïdes. 11. Utilisation selon la revendication 9, selon laquelle la base nutritive complexe est reconstituée ou libérée à partir du pansement 12. Utilisation d'une base nutritive complexe selon la revendication 1, pour la déplétion en substances d'origine biologique ou médicamenteuse, d'épidermes humains de culture, avant la greffe de ces derniers.