Brevet FR2870741A1 — publié le 20051202

L'invention concerne essentiellement des phases lamellaires hydratées ou des liposomes contenant une substance favorisant la pénétration intracellulaire d'une substance ou principe actif véhiculé par ladite phase lamellaire hydratée ou les liposomes. Plus précisément, l'invention concerne des phases lamellaires hydratées ou des liposomes comprenant, au moins en partie dans leur structure, une substance ou un mélange de substances capable de stimuler la pénétration intracellulaire d'au moins un principe actif présent ou véhiculé dans ladite phase lamellaire hydratée ou liposome, choisie parmi le groupe consistant soit de la polyéthylènimine, soit d'une monoamine grasse de longueur de chaîne carbonée comprise entre C10 et C18, défini dans la présente description et les revendications, soit d'un polymère cationique défini également dans la présente description et les revendications, contenant éventuellement un composé fluorescent sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire, par exemple la pentafluorobenzoylamine fluorescéine, permettant de visualiser cette pénétration, notamment dans le cadre d'un procédé de criblage de substance potentiellement active pour favoriser la pénétration intracellulaire. L'invention concerne aussi des compositions cosmétiques ou dermocosmétiques, ou pharmaceutiques ou dermopharmaceutiques contenant de telles phases lamellaires hydratées ou des liposomes. L'invention concerne également un procédé de soin cosmétique comprenant l'application sur les zones de la peau ou des cheveux concernés d'une composition cosmétique ou dermocosmétique selon l'invention. L'invention concerne aussi l'utilisation des phases lamellaires hydratées ou des liposomes comme agents cosmétiques notamment pour la fabrication d'une composition cosmétique notamment pour une activité anti-rides, antioxydant, amincissante, blanchissante de la peau, pigmentante de la peau ou des cheveux, selon la nature de la substance ou principe actif présent ou véhiculé dans les phases lamellaires hydratées ou les liposomes. 2870741 2 L'invention concerne encore une méthode de criblage pour la détection de substances potentiellement actives pour favoriser la pénétration intracellulaire. Etat de l'art Il a été décrit récemment dans le document US-A-6,071,535 (Hayward) des liposomes cationiques dénommés CATESOMESTM très sensibles à la fois au pH et à la force ionique du milieu environnant, constitués de sels acylés gras d'alkyle d'ammonium gras de diamine de type Nn, Nndiméthyl-1,n-diamino alkyle, diamine io dénommée DDA, la partie alkyl ayant un nombre d'atomes de carbone n compris entre 2 et 8 (voir colonne 5, lignes 37 à 39), la partie acylée grasse est fournie par un acide gras ayant de 10 à 30 atomes de carbone pour former une substance dénommée ADDA (colonne 5, lignes 41à 48). De telles substances ADDA sont dites comme étant disponibles dans le commerce sous le nom commercial CATEMOL auprès de la Société Phoenix Chemical, Somerville, New Jersey, USA, référence CATEMOL 220 et 260. Les CATESOMES sont formés en combinant un acide gras ayant de 10 à 28 atomes de carbone, par exemple, l'acide béhénique pour former des sels dits AADDA, le mélange étant réalisé en proportion équimolaire et a un pH compris entre 6 et 10 pour former un sel entre le groupe amine quaternaire de la substance ADDA, et le groupe carboxyl de l'acide gras (voir colonne 5, ligne 66 à colonne 6, ligne 4). Ce document Hayward, cite aussi le document US-A-4,721,612 relatif à des liposomes conventionnels dont les bicouches comprennent une forme sel d'un stérol et d'un acide organique tel que la forme tris-sel d'un stérol hémisuccinate (colonne 5, lignes 13 à 18). Résumé de l'invention La présente invention a pour but principal de résoudre de manière inattendue le nouveau problème technique qui consiste à fournir de nouvelles phases lamellaires hydratées ou des liposomes permettant une augmentation de la pénétration d'une substance ou principe actif au niveau intracellulaire, avantageusement au niveau des cellules de la peau ou des cheveux, tout en limitant la cytotoxicité ou l'induction de mort cellulaire desdites cellules. La présente invention a encore pour but principal de résoudre de manière io inattendue le problème technique de fournir de nouvelles phases lamellaires hydratées ou des liposomes qui non seulement favorisent la pénétration d'une substance ou principe actif au niveau intracellulaire, avantageusement au niveau des cellules de la peau ou des cheveux, mais permettent d'obtenir un taux relativement élevé d'encapsulation de ladite substance ou principe actif dans lesdites phases lamellaires hydratées ou les liposomes. La présente invention a encore pour but principal de résoudre de manière inattendue le nouveau problème technique qui consiste à fournir de nouvelles compositions cosmétiques ou dermocosmétiques, pharmaceutiques ou dermopharmaceutiques contenant des phases lamellaires hydratées ou des liposomes présentant une excellente pénétration d'une substance ou principe actif au niveau intracellulaire, avantageusement au niveau des cellules de la peau ou des cheveux, tout en limitant la cytotoxicité ou l'induction de mort cellulaire (ou apoptose) desdites cellules. La présente invention a encore pour but principal de résoudre de manière inattendue un nouveau problème technique qui consiste à fournir un nouveau procédé de criblage de substance potentiellement active pour améliorer la pénétration d'une substance ou principe actif au niveau intracellulaire, avantageusement au niveau des cellules de la peau ou des cheveux et de préférence d'évaluer aussi la cytotoxicité ou l'induction d'apoptose desdites cellules. 2870741 4 L'ensemble de ces problèmes techniques est résolu pour la première fois simultanément, de manière sûre et fiable, utilisable à l'échelle industrielle et cosmétique ou pharmaceutique. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit des phases lamellaires hydratées ou liposomes, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins en partie dans leur structure, une substance ou un mélange de substances capables de stimuler la pénétration intracellulaire d'au moins un principe actif présent ou véhiculé dans lesdites phases lamellaires hydratées ou liposomes, choisie(s) parmi le groupe consistant de: io a) la polyéthylènimine; b) une monoamine grasse de longueur de chaîne carbonée comprise entre C10 et C18, primaire, secondaire, ternaire ou quaternaire, avantageusement une monoamine comprenant une seule chaîne grasse en C10-C18, de préférence une monoamine primaire ou quaternaire comprenant une seule chaîne grasse en C10-C18; c) un polymère cationique, en particulier un polymère naturel cationique ou éventuellement rendu cationique, ou un polymère synthétique cationique, lesdits phases lamellaires ou liposomes contenant éventuellement au moins un composé fluorescent sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire, par exemple la pentafluorobenzoylamino fluorescéine, permettant de visualiser cette pénétration. Selon un mode de réalisation particulier, lesdites phases lamellaires ou liposomes sont caractérisés en ce que le polymère naturel éventuellement cationique est choisi parmi le groupe consistant de chitosane, polymère quaternisé de miel; des protéines végétales, en particulier protéines de blé ou protéines de blé quaternisé, protéines de riz ou protéines de riz quaternisé, protéines de soja ou protéines de soja quaternisé ; de collagène ou de collagène quaternisé, de kératine ou de kératine quaternisé, de caséine ou de caséine quaternisé, de cellulose ou de cellulose quaternisé, de guar ou de guar quaternisé. Ces polymères quaternisés sont généralement des produits commerciaux, la quaternisation étant généralement obtenue par greffage d'amines tertiaires sur les groupements chimiques du polymère initial. Selon un autre mode de réalisation avantageux, lesdites phases lamellaires ou liposomes sont caractérisés en ce que ce que la monoamine primaire est choisie parmi le groupe consistant de la décylamine, undécylamine, la dodécylamine, la tridécylamine, tétradécylamine, la pentadécylamine, I'octadécylamine, ou est un mélange d'amines primaires tel que les mélanges d'amines de coprah ayant une chaîne hydrocarbonée comprise entre C8 et C18. io Selon un mode de réalisation particulier, les phases lamellaires ou liposomes contiennent de la polyéthylènimine. Selon un autre mode de réalisation particulier, les phases lamellaires ou les liposomes comprennent dans la phase lipidique au moins un agent de modification de membrane des liposomes, par exemple un lipide polaire choisi parmi le groupe is consistant d'un triglycéride, d'un phospholipide polaire ou d'un sphingolipide polaire, seul ou en mélange. Selon un autre mode de réalisation particulier, le phospholipide polaire précité est choisi parmi la phosphatidylcholine ou lécithine, la phosphatidyléthanolamine ou céphaline, la phosphatidylsérine, le phosphatidyl-glycérol, diphosphatidyl-glycérol ou cardiolipine, phosphatidyl-inositol, seul ou en mélange. Avantageusement, ce phospholipide polaire est choisi parmi un céramide, un sphingophospholipide, un glycosphyngolipide seul ou en mélange. Selon une autre variante de réalisation, les phases lamellaires ou liposomes comprennent au moins un lipide polaire ou un sphingolipide polaire en particulier sous forme d'un sel d'un acide organique d'un stérol tel que le tris-sel d'un stérol hémisuccinate. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les phases lamellaires ou liposomes comprennent au moins une lécithine dans la phase lipidique extraite d'une source naturelle choisie parmi le groupe consistant de soja, 2870741 6 colza, tournesol, lupin, arachide, sésame, courge, huile de son, caméline, calendula, lin et chanvre, seul ou en mélange. Les phases lamellaires ou les liposomes peuvent aussi comprendre selon une autre variante de réalisation une phase lipidique contenant du cholestérol ou un dérivé de cholestérol tel que le cholestérol hémisuccinate comme agent rigidifiant les membranes. Selon encore un autre mode avantageux de l'invention, les phases lamellaires ou les liposomes peuvent comprendre dans la phase lipidique, au moins un agent tensioactif ou surfactant, comme agent fluidifiant la phase lamellaire ou la io membrane des liposomes. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les phases lamellaires ou liposomes contiennent un agent fluorescent sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire, en particulier la pénétration intracellulaire de la peau ou des cheveux dont un exemple actuellement préféré d'un tel agent is fluorescent comprend ou est constitué de la 5-pentafluorobenzoylaminefluorecéine, en particulier à une proportion d'environ 0,01% en poids de la composition contenant ladite phase lamellaire ou liposomes. Selon un mode avantageux de l'invention, la concentration en substance(s) stimulant la pénétration intracellulaire est comprise entre 0,05% et 25% en poids de la composition contenant les phases lamellaires hydratées ou les liposomes, de préférence entre 0,5% et 2,5% en poids de ladite composition. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, la monoamine grasse précitée à une longueur de chaîne carbonée comprise entre C10 et C13. Avantageusement, la monoamine grasse précitée est une monoamine primaire quarternisée comprenant une seule chaîne carbonée grasse comprise entre C10 et C18, de préférence entre C10 et C13. Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse de l'invention, la molécule quaternisée favorisant la pénétration intra-cellulaire des principes actifs est choisie parmi une solution de protéines végétales quaternisées, de préférence de protéines de soja, quaternisées de formule de type R-N(R1R2R3) dans laquelle R symbolise la molécule de protéine végétale, hydrolysée ou non, hydroxyalkylée, en particulier hydroxypropylée ou non; R1 et R2 étant indépendamment un groupe hydrocarboné en C1-C6, de préférence méthyle ou éthyle et R3 étant un radical alkyle comportant de 10 à 18 atomes de carbone, et de préférence majoritairement 12 atomes de carbone (lauryl). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la substance ou principe actif présent ou véhiculé dans les phases lamellaires hydratées ou les liposomes est choisie parmi le groupe consistant d'un agent antiradicalaire tel que la vitamine E, lo un flavonoïde, un caroténoïde, la vitamine C, ou leurs dérivés; un agent dépigmentant tel que la catéchine, l'hydroquinone, l'arbutine, l'acide phytique, l'acide élagique, la vitamine C, ou leur dérivés; un agent amincissant tel qu'au moins une xanthine, un agent pigmentant de la peau ou des cheveux tel que la tyrosine, le tryptophane, la phénylalanine, un extrait de Coleus ou leurs dérivés. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne aussi des compositions cosmétiques ou dermocosmétiques; pharmaceutiques ou dermopharmaceutiques, comprenant de telles phases lamellaires hydratées ou des liposomes comprenant au moins une substance stimulant la pénétration intracellulaire, éventuellement dans un excipient cosmétiquement, dermocosmétiquement, pharmaceutiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable. De tels excipients sont bien connus à l'homme de l'art et certains sont cités dans les deux documents de l'art antérieur indiqué dans la description de l'état de la technique antérieure. D'autres excipients résultent des exemples de compositions cosmétiques, dermocosmétiques, pharmaceutiques ou dermopharmaceutiques de la description suivante donnée simplement à titre d'illustration et qui ne saurait donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Selon un troisième aspect, l'invention concerne aussi une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique sur la peau ou les cheveux, d'une composition comprenant des phases lamellaires hydratées ou liposomes telles que décrites précédemment ou telles que résultant de la description suivante faite en relation avec les exemples qui font partie intégrante de l'invention. Selon un quatrième aspect, la présente invention couvre aussi une méthode de traitement thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application topique sur la peaux ou les cheveux, d'une composition comprenant des phases lamellaires hydratées ou des liposomes tels que décrites précédemment ou telles lo que résultant des exemples faisant partie intégrante de l'invention, en une quantité suffisante pour réaliser le traitement thérapeutique recherché. Généralement, les phases lamellaires hydratées ou les liposomes comprennent au moins un principe actif présent ou véhiculé dans lesdites phases lamellaires hydratées ou les liposomes ayant une activité liée au traitement thérapeutique recherché. Dans le cadre d'un soin cosmétique, la présente invention prévoit de réaliser un soin cosmétique choisi parmi le groupe consistant d'un soin anti-rides, anti-oxydant, amincissant, blanchissant de la peau, pigmentant de la peau ou des cheveux. Dans le cadre d'un traitement thérapeutique, l'invention prévoit de réaliser un 20 traitement thérapeutique approprié de la peau ou des cheveux en fonction de la pathologie à traiter. L'invention concerne aussi l'utilisation des phases lamellaires hydratées ou des liposomes comme agents cosmétiques, notamment pour la fabrication d'une composition cosmétique notamment pour une activité anti-rides, antioxydante, amincissante, blanchissante de la peau, pigmentante de la peau ou des cheveux, ou pour la fabrication d'une composition pharmaceutique, dans chacun des cas de préférence par voie topique. Selon un cinquième aspect, la présent invention concerne encore un procédé de criblage d'au moins une substance potentiellement capable de stimuler la pénétration intracellulaire d'une substance ou principe actif véhiculé par des phases lamellaires hydratées ou des liposomes, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la préparation d'un mélange hydrolipidique capable de former lesdites phases lamellaires hydratées ou lesdits liposomes; b) l'incorporation avant le procédé de dispersion dans ce mélange hydrolipidique d'un composé fluorescent, de préférence sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire; c) éventuellement l'incorporation avant ou pendant le procédé de dispersion dans le mélange hydrolipidique d'une substance d'essai choisie parmi ladite substance io potentiellement active, capable de stimuler la pénétration intracellulaire, et une substance de référence; d) la préparation desdites phases lamellaires hydratées ou desdits liposomes selon toute méthode appropriée de formation desdites phases lamellaires hydratées ou des liposomes à partir du mélange hydrolipidique tel qu'obtenu soit à l'étape b) soit is à l'étape c) ci-dessus. e) la détection au moins de la pénétration intracellulaire du composé fluorescent, par mesure de la fluorescence intracellulaire. Selon une autre variante de réalisation le résultat de la pénétration intracellulaire du composé fluorescent est comparé avec la pénétration intracellulaire obtenue avec une substance de référence, en particulier comprenant la polyéthylènimine. Selon encore une autre variante de réalisation, on mesure la cytotoxicité et/ou l'induction d'apoptose de la substance potentiellement active, notamment sur des fibroblastes, de préférence des fibroblastes humains normaux, en culture. Selon encore une autre variante de réalisation, le composé fluorescent essentiellement inerte relativement à la pénétration intracellulaire est un composé fluorescent qui ne pénètre pas spontanément dans ledit fibroblaste en culture. Selon encore une autre variante de réalisation le composé fluorescent comprend, ou est, la pentafluorobenzoylaminofluorescéine utilisée à une i0 concentration de 0,01% en poids de la composition finale contenant les phases lamellaires hydratées ou les liposomes utilisés pour évaluer la pénétration intracellulaire. Selon une autre variante de réalisation avantageuse du procédé, le composé 5 fluorescent est incorporé en présence de polyéthylénimine, le composé fluorescent et la polyéthylénimine étant à une concentration non cytotoxique. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la substance potentiellement capable dé stimuler la pénétration intracellulaire est choisie parmi une monoamine grasse primaire de longueur de chaîne alkyle io comprise entre C10 et C18, de préférence entre C10 et 13, ou un polymère cationique, en particulier un polymère naturel éventuellement rendu cationique ou un polymère synthétique cationique incorporé dans les phases lamellaires ou liposomes, tel que précédemment défini ou dans la description suivante en référence aux exemples, qui font partie intégrante de l'invention. L'invention concerne encore selon un sixième aspect, l'utilisation des phases lamellaires hydratées ou liposomes telle que précédemment décrite ou telle que résultant des exemples faisant partie intégrante de l'invention, comme agent cosmétique ou pour la fabrication d'une composition cosmétique et notamment pour une activité anti-rides, antioxydante, amincissante, blanchissante de la peau, pigmentante de la peau ou des cheveux. Dans le cadre de l'un quelconque des aspects précédents, avantageusement, des surfactants peuvent être rajoutés au mélange hydrolipidique afin de fluidifier les membranes des liposomes. La présente invention a nécessité la sélection d'un traceur fluorescent qui ne pénètre pas spontanément dans les fibroblastes en culture par exemple, induit très peu de cytotoxicité en lui-même ou après encapsulation en liposome, est incorporée avec un bon rendement dans les liposomes à base de lécithine de soja par exemple (environ 80%), est stable après encapsulation (pas de relargage et de changement de fluorescence), n'induit pas une instabilité des liposomes. Le traceur sélectionné Il est avantageusement la 5- pentafluorobenzoylamino fluorescéine ou PFB-F à une concentration à 0,01% soit 185pM finale. Avantageusement, lesdits procédés de dispersion pour réaliser les liposomes sont choisis de préférence parmi le cisaillement, les ultrasons, l'extrusion, l'hydratation/ déshydratation (lyophilisation), la congélation/ décongélation, l'évaporation en phase inverse. La présence de liposome (structure lamellaire) est attestée par microscopie électronique à transmission. La taille des liposomes est évaluée par microscopie électronique à transmission et granulométrie laser. io Avantageusement, la réalisation des liposomes s'effectue à un pH compris entre 4 et 8, de préférence à pH 6. Avantageusement, la pénétration d'un principe actif au niveau intracellulaire visée est au niveau des cellules de la peau. Avantageusement la pénétration d'un principe actif au niveau des cellules de la peau cible principalement les fibroblastes, les kératinocytes et les mélanocytes. Les moyens de détections de la pénétration intracellulaire sont choisis parmi des méthodes de quantification et de visualisation et sont de préférence la quantification de l'intensité de fluorescence par spectrofluorométrie et la visualisation en microscopie optique à épifluorescence. Avantageusement, sont considérés efficaces les molécules permettant d'une part d'obtenir une stimulation de la pénétration intracellulaire du traceur fluorescent de plus de 10% supérieure au témoin négatif ne contenant pas de molécule cationique, avantageusement équivalente ou supérieure au témoin positif qui contient une molécule cationique de référence la polyéthylènimine utilisée à 50pM. D'autre part les molécules sélectionnées ne doivent de préférence pas induire de phénomènes cytotoxiques et/ou apoptotiques, ou induire des phénomènes cytotoxiques et/ou apoptotiques inférieurs à ceux de la molécule cationique de référence (polyéthylènimine utilisée à 50pM). Avantageusement, les molécules actives sélectionnées pour stimuler la pénétration intracellulaire sont choisies parmi le groupe consistant en: a) amine primaire à quaternaire, de longueur de chaîne carbonée variable et avantageusement décylamine, undécylamine, dodécylamine, tridécylamine, tétradécylamine, pentadécylamine, octadécylamine, benzyldimethyl (octadecyl) ammonium chloride (ou stearyalkonium chloride), mélange d'amines primaires (par exemple amines de coprah C8 à C18), polyquaternium 16; b) polymère cationique et avantageusement chitosane, ou miel quaternisé, protéines végétales, en particulier de blé, riz, soja ou leurs dérivés quaternisés; 10 cellulose ou guar quaternisés. Avantageusement les concentrations d'agents cationiques mises en oeuvre sont comprises entre 0,05% et 25%, de préférence entre 0,5 et 2,5%, de préférence 1%. Avantageusement, la stimulation de la pénétration intracellulaire est optimale pour des chaînes carbonées de longueur moyenne (C10 à C13), moyenne pour les chaînes de grandes longueur (C15 à C18) et moindre pour les chaînes courtes (moins de C10). Avantageusement, la stimulation de la pénétration intracellulaire est optimale pour une amine primaire (par exemple C10-NH2) en comparaison à une amine secondaire comprenant les deux mêmes chaînes carbonées par exemple (C10-NHC10) à cause de l'encombrement stérique induit. Avantageusement, certains polymères quaternisés permettent d'obtenir un meilleur facteur de stimulation de la pénétration intracellulaire par la nature même du polymère choisi, par exemple le lauridimonium hydroxypropyl de protéine de blé hydrolysé est environ 6 fois moins efficace que le lauridimonium hydroxypropyl de protéine de soja hydrolysé. Avantageusement, les molécules cationiques sélectionnées sont moins cytotoxiques et/ou induisent moins d'apoptose que la molécule de référence utilisée, la polyéthylènimine utilisée à 50pM. Avantageusement la quantification de la cytotoxicité est réalisée par un test de viabilité cellulaire évaluant l'activité phosphatase alcaline cellulaire et un dosage d'interleukine 1 alpha. L'apoptose est évaluée par la quantification de la caspase-1. Avantageusement, les liposomes fabriqués selon le procédé innovant décrit précédemment sont utilisés pour induire une augmentation de la pénétration intracellulaire de principes actifs cosmétiques, dermocosmétiques ou pharmaceutiques, utilisés en substitution du traceur fluorescent. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait 10 référence aux exemples suivants. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa 1s généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. Description des figures Les figures 1 à 4 annexées montrent la visualisation de la pénétration intracellulaire de deux traceurs présélectionnés selon l'invention, respectivement 25 PBF-F et TRITC: - la figure 1 représente des fibroblastes incubés pendant 24 heures avec des liposomes à 0,01 % de PBF-F avec un grossissement de l'objectif multiplié par 10. - la figure 2 représente des fibroblastes incubés pendant 24 heures avec des liposomes à 0,01 % de PBF-F avec un grossissement de l'objectif multiplié par 40. 2870741 14 - la figure 3 représente des fibroblastes incubés pendant 24 heures avec des liposomes à 0,01 % de TRITC avec un grossissement de l'objectif multiplié par 100. - la figure 4 représente des fibroblastes incubés pendant 24 heures avec des liposomes à 0,01 % de TRITC et PEI 3 % avec un grossissement de l'objectif multiplié par 100. Exemple 1: Préparation et purification de liposome encapsulant un traceur fluorescent Les traceurs fluorescents présentent non seulement l'avantage d'être sécurisants par rapport à la radioactivité par exemple, mais sont par ailleurs très simples d'utilisation lorsqu'il s'agit de faire une quantification et de mettre en évidence un aspect visuel de la pénétration intracellulaire sur des modèles de cultures de cellules. La sélection du traceur a nécessité la préparation de liposomes contenant 0,01% de différents traceurs hydrosolubles ou liposolubles, leur purification afin d'éliminer le traceur non incorporé avant leur application sur des fibroblastes humain normaux. Un témoin liposome est réalisé en parallèle sans traceur fluorescent. a) Sélection du protocole de préparation du liposome Des liposomes sont préparés avec une concentration de 20 % en lécithine de soja dissout en tampon de dilution Trizma (Sigma, France) 55mM 27mM NaCI ajusté à pH5. Après agitation magnétique pendant 30 minutes à température ambiante, le mélange est homogénéisé très énergiquement pendant 10 minutes. Les liposomes sont ensuite dilués en milieu DF [DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 glutamax 50/50 volume/volume, supplémenté de 10%de sérum de veau, de pénicilline à une concentration finale de 1000I/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre] afin d'obtenir des concentrations variable en lécithine de soja (0,5-1-2-3-4-5-7,5-10 %). 250 pl de suspension liposomale est ajoutée sur des cultures de fibroblastes humains normaux extraits de plastie abdominale et cultivés en plaque 96 puits. Chaque concentration est testée sur 6 puits différents. La viabilité cellulaire est évaluée par un test au paranitrophénylphosphate dosant l'activité phosphatase alcaline intracellulaire après trois rinçages en tampon phosphate pH 7,4. Le pourcentage de cellules vivantes est calculé par rapport à un témoin réalisé sans ajout de liposome dans le puits de culture (n=6). Les résultats obtenus démontrent qu'une viabilité cellulaire de plus de 85 0/0 est obtenue jusqu'à 7,5% en lécithine. A 10 % en lécithine, la viabilité passe en io dessous du seuil acceptable de 75 % de viabilité. La concentration de 5 % permettant d'obtenir une viabilité cellulaire de plus de 90 % est sélectionnée. b) Préparation de liposome 5 % de lécithine de soja incorporant un traceur fluorescent 0,5g de lécithine de soja, 0,01% de traceur fluorescent présolubilisé selon les recommandations fournisseur sont introduits dans un pilulier et dilué dans 10 ml de tampon Trizma. Après agitation magnétique pendant 30 minutes à température ambiante, le mélange est homogénéisé violemment pendant 10 minutes, en obtenant ainsi une solution liposomale dans laquelle les liposomes ont une dimension moyenne pouvant varier entre de 100 et 800 nanomètres selon les conditions exactes d'homogénéisation. L'étape de purification a pour but de séparer la fraction de traceur non encapsulée de la fraction de traceur encapsulée dans les liposomes. Pour cela, la solution liposomale est centrifugée dans un tube conique pendant 10 minutes à 1790 g à température ambiante. Les culots sont ensuite récupérés puis solubilisés dans 10 ml de milieu de culture. Le témoin négatif liposome est réalisé selon le protocole décrit précédemment sans traceur fluorescent. 2870741 16 Les échantillons sont conservés pendant 24 heures à 4 C à l'abri de la lumière. 26 séries de liposomes sont réalisés avec différents types de traceurs fluorescents, pH sensibles, calcium sensibles, ou autres. Exemple 2: Sélection d'un traceur fluorescent encapsulable dans un lipsome ne pénétrant pas spontanément dans des fibroblastes humains normaux en culture La sélection du traceur a nécessité la préparation et la purification de liposomes, selon le protocole décrit dans l'exemple 1, ces liposomes contenant des lo concentrations variables des différents traceurs hydrosolubles ou liposolubles (tableau 1, annexe 1). Les témoins - traceur fluorescent libre - sont réalisés par dissolution à la même concentration de traceur fluorescent dans le tampon de dilution afin de quantifier sa cytotoxicité et sa pénétration spontanée dans les fibroblastes. La comparaison avec un liposome ne contenant pas de traceur fluorescent en tant que témoin négatif est réalisée en parallèle. Pratiquement, après extraction à partir d'une biopsie issue de plastie chirurgicale abdominale, les fibroblastes sont amplifiés en milieu DF soit: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 glutamax 50/50 volume/volume, supplémenté de 10% de sérum de veau, de pénicilline à une concentration finale de 1000I/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre. Dans un premier temps, après centrifugation, les liposomes purifiés sont repris dans du milieu de culture DF, homogénéisés au vortex, déposés à raison de 1ml par puits sur les fibroblastes cultivées en plaques 24 puits (Costar MW24). Les témoins sont réalisés dans les mêmes conditions. Un témoin non traité est réalisé également. Les fibroblastes sont incubés 24 heures à 37 C en présence des liposomes puis rincés 3 fois en tampon phosphate pH 7,4. Dans un premier temps, la fluorescence est évaluée à sec par spectrofluorimétrie avec un Cytofluor 4000 (Millipore). Dans un second temps, la fluorescence intracellulaire est observée pour les molécules ayant un intérêt sur un microscope inverse Olympus (IX70) en utilisant le filtre d'excitation correspondant (objectif x10, x40 et x100). Finalement la cytotoxicité des traceurs fluorescents est évaluée en plaque 96 puits par incubation pendant 24 heures tel que décrit dans l'exemple 1. Les résultats obtenus démontrent que parmi les 25 molécules testées, seules io la Pentafluofobenzoylaminofluoréscéine PFB-F (P12925 Molecular Probes) et la Tétramethylrhodamine isothiocyanate TRITC (T-490 Molecular Probes) donnent des résultats positifs intéressants après incorporation dans un liposome, application sur les fibroblastes pendant 24 heures et quantification de la pénétration du contenu liposomal. is Les figures 1 à 4 annexées sont des photographies visualisant la pénétration intracellulaire des deux traceurs présélectionnés PFB-F et TRITC à la concentration de 0,01 % dans des liposomes après incubation avec les fibroblastes pendant 24 heures. Tableau 2: Résultat du criblage de traceur Cytotoxicité (% Pénétration Pénétration du témoin non sonde libre (fluorescence traité) après lavage) PFB-F (485-530) 110,7% 8 (gain 45) 65 (gain 45) TRITC (530-620) 74,8 295 (gain 50) 1119 (gain 50) Toutefois, bien que la TRITC donne un marquage plus intense (tableau 1 et figures 1 à 4 annexées), elle est cependant légèrement cytotoxique, pénètre légèrement lorsqu'elle est ajoutée libre dans le milieu de culture. La PFB-F semble donc un meilleur traceur. Exemple 3: Etude de la pénétration intracellulaire en présence de PFB-F (pentafluofobenzoyl-aminofluoréscéine) ou TRITC Tétramethvlrhodamine isothiocvanate) en présence ou non de polvéthvlènimine La pénétration intracellulaire de liposomes contenant 5% de lécithine de soja, 0,01 % de PFB-F ou TRITC en présence ou non de polyéthylènimine (PEI) 25 kDa à 0,5 %, préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 1, est analysée après incubation pendant 24 heures sur des fibroblastes humains cultivés en plaque 24 puits, comme décrit à l'exemple 2. io Les résultats obtenus démontrent que l'adjonction de PEI stimule la pénétration des liposomes PFB-F de 13,7 fois alors que l'adjonction de PEI diminue la pénétration des liposomes TRITC de 16 fois (confère photographies des figures 1 à 4 annexées). Le traceur retenu est donc la PFB-F ou pentafluorobenzoylaminofluorescéine is à 0,01% dans le liposome. Exemple 4: Etude de la stabilité des liposomes contenant la pentafluofobenzoyl-aminofluoréscéine (PFB-F) La stabilité des liposomes est analysée par étude du relargage du traceur fluorescent dans le milieu de culture DF par spectro-fluorimétrie; cette étude est réalisé en fonction du pH, de la force ionique et de la présence de détergent. Pratiquement, des liposomes contenant 5% de lécithine de soja, 0,01 % de PFB-F et 50 pM de PEI 25 kDa sont préparés. Les solutions liposomales sont ajustés à pH 6-7-8-9; la concentration en chlorure de sodium (NaCl) est ajustée à 50-100- 150-200 mM et la concentration en Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) ou Triton X-100 est ajustée de 0,1-0,5-1-3 %. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3: Etude du relargage en fonction de la présence de détergents, de la force ionique et du pH. Molécules Concentrations Relargage: Relargage: Moyenne Ecart type Triton X-100 3 % 44027 177 1 % 45800 2888 0,5 % 40834 39 0,1 % 19829 103 SDS 3 % 62481 180 1 % 71809 1558 0,5 % 76676 200 0,1 % 22990 108 NaCl 200 mM 68527 2040 mM 7622 36 mM 6314 113 mM 5680 62 pH 9 25265 411 8 18816 226 7 8781 70 6 7640 55 Les résultats semblent indiquer que les liposomes contenant 50 pM de PEI 25 kDa commencent à se déstabiliser à partir de 200mM en NaCl, 0,5 % de Triton X-100 ou SDS et en dessus de pH7. Exemple 5: Rendement d'encapsulation du traceur fluorescent PFB-B en fonction de la concentration en polyéthylènimine lo Des liposomes sont préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 5 avec des concentrations croissantes en PEI 25 kDa de 0 à 100 pM. Après centrifugation à 1790 g pendant 10 mn, les surnageants sont quantifiés en spectrofluorimétrie. Les rendements d'encapsulation sont calculés par rapport à la concentration initiale. Les résultats sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4: Rendement d'encapsulation de PFB-F en fonction de la concentration en PEI Concentration en PEI 0 1 10 50 100 (PM) Rendement (%) 89,0 92,3 91,0 87,5 86,3 On constate que le rendement d'encapsulation n'est pas affecté par l'augmentation de concentration en PEI. Exemple 6: Mise au point des conditions de criblage avec des liposomes io fluorescents contenant des concentrations variables de polyéthvlènimine Des liposomes sont préparés, selon le protocole décrit dans l'exemple 1, avec des concentrations variables en ployéthylènimine (PEI 25 kDa neutralisée par de l'acide chlorhydrique 6N), soit de 0-5-10-50 pM et 0, 01 % de PFB-F. La quantification est réalisée par spectrofluorométrie après incubation sur des fibroblastes cultivés en monocouche en plaque 24 puits pendant 24-6-24 et 48 heures après 3 lavages en tampon phosphate pH 7,4 contre un blanc fibroblastes non traités et après normalisation contre la PFB-F libre à la même concentration. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5: Etude de la pénétration intracellulaire de la PFB-F en fonction du temps et de la concentration en PEI (n=4 pour chaque condition), exprimé en unités arbitraires de fluorescence. Concentra- 0 5 pM 10 pM 50 pM tion en PEI Temps Moyenn Ecart Moyenn Ecart Moyenn Ecart Moyenn Ecart e type e type e type e type 2h 6 0 49 4 67 7 116 6 4h 7 3 63 5 89 9 159 10 6h 6 0 65 10 94 13 203 12 24h 9 3 120 5 129 3 291 17 48h 6 1 160 18 171 13 306 6 Les meilleurs résultats sont obtenus pour une concentration de 50 pM en PEI et un temps minimal d'incubation sur les fibroblastes de 24 heures. Ces conditions seront retenues pour le criblage des molécules stimulant la pénétration intracellulaire. Les résultats sont statistiquement significatifs du témoin sonde libre (p Exemple 7: Analyse de la pénétration intracellulaire et de la cvtotoxicité de liposomes fluorescents contenant 50 uM de polvéthylènimine en fonction du temps is L'expérimentation est réalisée selon l'exemple 6 pour des concentrations en PEI de 0 à 100 pM. La quantification de la fluorescence est réalisée selon l'exemple 6. La stimulation de la pénétration intracellulaire est exprimée en facteur de stimulation par rapport au liposome sans PEI. La viabilité cellulaire est réalisée en plaque 96 puits (250 pl de solution liposomale 20 par puits) par un test évaluant l'activité phosphatase alcaline sur les tapis cellulaires (test au paranitrophénylphosphate, n=6). Les résultats de viabilité cellulaires sont exprimés en pourcentage de cellules vivantes par rapport à un témoin liposome fluorescent sans PEI. Le dosage de l'IL1 alpha (Kit Quantikine R&D System) est réalisé sur les milieux de cultures prélevés après 24 heures d'incubation en parallèle à un dosage de protéines totales (Bradford, Sigma). Les résultats sont présentés dans les tableaux 6 et 7. Tableau 6: Facteur de pénétration intracellulaire de la PFB-F et cytotoxicité en fonction du temps et de la concentration en PEI (n=4 pour chaque condition). Temps 0 5 pM 10 pM 50 pM Viabilité PEI 50 2h 0,7 5,4 7,4 12,9 93,8 4h 0,8 7,0 9,9 17,7 92,4 % 6h 0,7 7,2 10,4 22,6 83,9 % 24h 1,0 13,3 14,3 32,3 72,6 % 48h 0,7 17,8 19,0 34,0 48,4 % Tableau 7: Dosage d'IL1 alpha en pg/mg de protéines totales PEI 25 kDa 0 10 pM 50 pM 100 pM Protéines totales en pg/ml 132,8 136,2 119,5 79L2 IL1 en pg/ml 9,2 12,7 13,1 14,4 IL1 en pg/mg de protéines 69,3 93,2 109,6 181,8 Facteur de stimulation 1 1,3 1,6 2,6 Les résultats démontrent qu'il est possible d'augmenter jusqu'à 34 fois la pénétration du traceur fluorescent en présence de PEI dans cette expérience. Toutefois, on observe qu'à la concentration de 50 pM en PEI 25 kDa, dès 24 heures un phénomène de cytotoxicité non négligeable est observé, à 48 heures, plus de la moitié des cellules sont mortes. En ce qui concerne la synthèse d'IL1 alpha à la concentration de 50 pM, la stimulation est de 1, 6 fois et à 100 pM de 2,6 fois. Cette molécule génère donc un stress de nature inflammatoire conséquent. 2870741 23 Exemple 8: Criblage de molécules stimulant la pénétration intracellulaire d'un traceur fluorescent incorporé dans un liposome Les liposomes sont préparés avec 5% de lécithine de soja, 0,01 % de PFB-F et 1-0,1-0,01 % de molécule à tester neutralisée à pH7 par acide chlorhydrique si 5 nécessaire en tampon de dilution Trizma tel que décrit à l'exemple 5. molécules sont testées en triplicate dans un premier temps, en comparaison avec la PEI 25 kDa 50pM. La pénétration intracellulaire est quantifiée après 24 heure d'incubation sur les fibroblastes humains normaux cultivés en plaques 24 puits tel que décrit dans l'exemple 2. io La viabilité cellulaire est estimée en plaque 96 puits avec 200 pl de suspension liposomale. Les résultats obtenus pour la concentration de 1 % sont présentés dans le tableau 8 (annexe 2). Sur le criblage réalisé, 15 molécules ont été sélectionnées car elles sont capables de stimuler de plus de 10 % la pénétration intracellulaire du traceur fluorescent. Les viabilités cellulaires sont variables (de 37 à 99 %) à la is concentration de 1%. La visualisation du traceur fluorescent a confirmé la pénétration pour les molécules stimulant la pénétration de plus de 32 %. Ces molécules sont retenues en priorité. Exemple 9: Influence de la structure des molécules sur la stimulation de 20 pénétration intracellulaire La préparation des liposomes avec des monoamines grasses primaires de longueur de chaîne alkyle comprise entre 3 et 18 carbones et la quantification de la pénétration intracellulaire du marqueur fluorescent sont réalisées tels que décrit dans l'exemple précédent. Les résultats sont présentés dans le tableau 9. 2870741 24 Tableau 9: Stimulation de la pénétration intracellulaire en fonction de la longueur de la chaîne carbonée Nombre de carbones FACTEUR DE STIMULATION Monoamine primaire avec une seule chaîne grasse alkyle Témoin PEI 25KDa 34,7 C3 0,9 C4 1,4 C6 0,2 C7 3,7 CIO 39,6 C11 95,3 C12 47,1 C13 44,5 C14 11,6 C15 14,9 C18 19,6 L'incorporation, dans la membrane des liposomes, d'amines grasses possédant des chaînes aliphatiques de tailles différentes, montre clairement l'impact de la longueur des chaînes carbonées sur l'activité stimulatrice de la pénétration intracellulaire de la PFB-F encapsulée dans des liposomes à 5% de lécithine. Il existe une classification grossière des acides gras en fonction de la longueur de chaînes. On distingue ainsi les chaînes courtes (moins de 8 carbones), les chaînes io moyennes (de 10 à 18 carbones) et les chaînes longues (plus de 18 carbones). En transposant cette classification aux amines grasses primaires testées dans le cadre de cette étude, il apparaît que les chaînes moyennes sont celles qui confèrent aux 2870741 25 liposomes leur propriété de stimulation de la pénétration intracellulaire aux liposomes. Exemple 10: Influence de l'encombrement stérique sur la pénétration 5 intracellulaire Dans l'optique de définir au mieux les caractéristiques des molécules ayant un effet stimulateur sur la pénétration intracellulaire d'un traceur fluorescent encapsulé dans des liposomes à 5% de lécithine, nous avons observé l'impact de l'encombrement stérique sur l'activité stimulatrice potentielle de ces molécules. Nous lo avons donc étudié la pénétration intracellulaire de la PFB-F encapsulée dans des liposomes en présence de monoamines grasses primaires d'une part, et de monoamines grasses secondaires d'autre part. La préparation des liposomes avec des amines grasses primaires ou secondaires et la quantification de la pénétration intracellulaire du marqueur fluorescents sont réalisées tels que décrit dans l'exemple 8. Les résultats sont présentés dans le tableau 10. Les di-amines ne permettent pas une meilleure pénétration intracellulaire du marqueur. Tableau 10: Stimulation de la pénétration intracellulaire en fonction du nombre de chaîne carbonée Nombre de chaînes Facteur de stimulation Alkyles de l'amine (longueur de chaîne) PEI 25KDa 34,7 1(C4) 1,7 2(C4) 0,7 1(C10) 39,6 2(C10) 1,2 Exemple 11: Influence de l'encombrement stérique sur la pénétration intracellulaire En procédant comme décrit notamment à l'exemple 9 ou 10, on a démontré que la longueur de la chaîne carbonée n'est cependant pas le seul facteur intervenant dans la stimulation de la pénétration intracellulaire du contenu liposoma. En effet, en effectuant la comparaison des structures chimiques présentée dans la figure suivante encapsulée en liposome, on montre une spécificité du lo groupement R qui interfère avec la chaîne carbonée en C12. Ry représente la protéine de soja hydrolysée et hydroxypropylée RA représente la protéine de blé hydrolysée et hydroxypropylée Les molécules Y ou A quaternisées sont des produits très courants pour l'homme de l'art, commercialement disponibles. L'encombrement stérique de la molécule quaternisée (molécules commerciales) incorporée joue un rôle dans la stimulation de la pénétration intracellulaire des liposomes à la lécithine. Les molécules des classes suivantes (tableau 11) peuvent être par exemple utilisées à 1% pour stimuler la pénétration intracellulaire à des degrés variables jusqu'à +39%. D'autres hydrolysats quaternisés de molécules extraites d'amandes, pois, pomme de terre, ou algues peuvent également être utilisées. ÇH 3 R,. N '\:117-C H 3(CH 2)u CH 3 Molécule Y: Lauryldimonium hydroxypropyle d'hydrolysat de protéines de soja Facteur de stimulation: 38,8 ÇH 3 Molécule A: Lauryldimonium hydroxypropyle d'hydrolysat de protéines de blé RA N----CH 3(CH 2)11 Facteur de stimulation: 6,2 CH 3 Exemples de Nom chimique Exemples de molécules fournisseurs quaternisées potentiels commercialement disponibles Blé Cocodimonium, steardimonium, Croda hydroxypropyltrimonium ou Lauryldimonium hydrolyzed wheat protein Wheat germ-amidopropalkonium chloride Soja Lauryldimonium hydroxypropyl hydrolyzed Croda soy protein, RITA Cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed corporation soy protein, hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride hydrolyzed soy protein Soy dihydroxypropyldimonium glucoside Kératine Hydroxypropyltrimonium hydrolyzed RITA keratin corporation Caséine Hydroxypropyltrimonium hydrolyzed RITA casein corporation Collagène Hydroxypropyltrimonium hydrolysed RITA collagen, corporation Lauryldimonium hydroxypropyl hydrolyzed Cognis collagen Soie Hydroxypropyltrimonium hydrolyzed silk RITA corporation Riz Cocodimonium hydroxypropyl hydrolyzed Sochibo rice protein Guar Hydroxypropyl guar Meyhall hydroxypropyltrimonium chloride, Rhodia Hydroxypropyl guar hydroxypropyltrimonium chloride, Guar hydroxypropyltrimonium, Miel Hydroxypropyltrimonium honey ARCH Cellulose Polyquaternium 4 et 10 Quimasso Polyquaternium 39 Exemple 12: Optimisation de la concentration en molécule fonctionnalisante (stimulant la pénétration intracellulaire) La stimulation de la pénétration intracellulaire du traceur fluorescent est optimisée en testant différentes concentrations en molécule fonctionnalisante. Pratiquement des liposomes sont formés avec 5 % de lécithine de soja, 0,01 % de PFB-F, et de 0,5 à 2,5 % de la solution de soja quaternisé en tampon de dilution Trizma. La pénétration intracellulaire et la cytotoxicité sont évaluées tel que décrit dans l'exemple 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 12. Tableau 12: Etude de la concentration en molécule stimulant la pénétration intracellulaire et le facteur de stimulation ainsi que la viabilité cellulaire Soja quaternisé en % 0,5 1 1,5 2 2,5 Facteur de 0, 6 1,6 38,9 97,2 99,9 stimulation Viabilité cellulaire (%) 92,4 97,9 87, 9 75,4 77,3 La pénétration intracellulaire souhaitée peut donc être ajustée en fonction de la concentration en agent fonctionnalisant et du maximum de cytotoxicité toléré. 1s Exemple 13: Effet inflammatoire comparé entre le polvéthvlènimine et le sofa quaternisé sélectionné La stimulation de la synthèse d'interleukine 1 alpha est comparée entre des liposomes fonctionnalisés par 50 pM PEI et différentes concentrations en solution de soja quaternisé. Pratiquement des liposomes sont formés avec 5 % de lécithine de soja, 0, 01 % de PFB-F, et de 0,5 à 2,5 % de la solution de soja quaternisé ou 50pM de PEI, en tampon de dilution Trizma. La teneur en IL1 alpha est évaluée par un kit (Quantikine R&D System) tel que décrit dans l'exemple 7. Un test au paranitrophénylphosphate (PNPP)est réalisé en parallèle pour évaluer le nombre de cellule par puits. Les résultats de teneur en IL1 alpha sont rapportés à la densité optique obtenue en PNPP. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 13. Tableau 13: Effet des molécules fonctionnalisantes (PEI et soja quaternisé) sur la synthèse d'interleukine 1 alpha Concentration en molécule PEI 50 Soja Soja 1% Soja Soja 2% fonctionnalisante pM 0,5% 1,5% PNPP 72,3 91,8 91,6 87,5 88,4 IL1 alpha 350 137,5 137,5 212,5 187,5 IL1 alpha/PNPP 484,1 149,8 150,1 242,9 212,1 Les résultats obtenus démontrent que la solution de soja quaternisé sélectionnée précédemment induit une cytotoxicité et un stress inflammatoire très io limité par rapport à la molécule de référence PEI. Exemple 14: Effet apoptoticiue comparé entre le polvéthvlènimine et le soja quaternisé sélectionné, La stimulation de la synthèse d'interleukine 1 alpha est comparée entre des 15 liposomes fonctionnalisés par 50 pM PEI et différentes concentrations en solution de soja quaternisé. Pratiquement des liposomes sont formés avec 5 % de lécithine de soja, 0, 01 % de PFB-F, et de 0,5 à 2,5 % de la solution de soja quaternisé ou 50pM de PEI, en tampon de dilution Trizma. La teneur en caspase 1 est évaluée par un kit (Caspase- 1 Colorimetric Assay R&D System). Un test au paranitrophénylphosphate (PNPP)est réalisé en parallèle pour évaluer le nombre de cellule par puits. Les résultats de teneur en caspase-1 sont rapportés à la densité optique obtenue en PNPP. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 14. 2870741 30 Tableau 14: Effet des molécules fonctionnalisantes sur la teneur en caspase-1 Concentration en molécule PEI 50 Soja Soja 1% Soja Soja 2% fonctionnalisante pM 0,5% 1,5% PNPP 59,8 91,8 91,6 87, 5 88,5 Caspase-1 642,8 76 87,7 78,3 117,5 Caspase-1/PNPP 1074,9 82,8 95, 7 89,5 132,8 Les résultats obtenus démontrent que la solution de soja quaternisé sélectionnée précédemment induit une cytotoxicité et un stress apoptotique 5 excessivement limitée par rapport à la molécule de référence PEI. Exemple 15: Observation de la structure la composition liposomale de l'exemple 14 en microscopie électronique à transmission Les liposomes fabriqués avec 2% de solution de soja quaternisé, sans io adjonction de principe actif et de traceur fluorescent, ont été observés en microscopie électronique à transmission. Une coloration négative des liposomes est réalisée en utilisant des sels de métaux lourds qui vont s'intercaler entre les bicouches des vésicules multilamellaires. L'observation est réalisée avec un microscope électronique à transmission Philips CM120 et un grossissement de 30 à 60 000. L'observation révèle la présence de couches lipidiques concentriques caractéristiques de structures multilamellaires. La taille moyenne des liposomes observée varie de 150 à 250 nm. Exemple 16: Stimulation de la protection antiradicalaire par l'emploi d'une solution de soja quaternisée de l'exemple 11 Des liposomes sont préparés avec 5 % de lécithine de soja, 0,2 % de vitamine E naturelle et 2 % de solution de soja quaternisé de l'exemple 11 (molécule Y). 2870741 31 Pratiquement, 0,4 g de vitamine E naturelle sont ajoutés à 10 g de lécithine de soja et 10 ml d'éthanol 96 %. La solution est évaporée pendant une nuit sous agitation magnétique à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après évaporation de l'éthanol, 100 ml d'eau désionisée sont rajoutés. Le mélange est agité jusqu'à complète dissolution. Les liposomes sont ensuite préparés par ajout de 5 ml de la solution lécithine-vitamine E, 190 pl (soit 2%) de solution de soja quaternisé et 4,80 ml de tampon de dilution Trizma 55mM 27mM NaCI ajusté à pH5 sont mélangés sous agitation magnétique à l'abri de la lumière pendant 30mn. La solution est ensuite homogénéisée à vitesse maximale pendant 10mn pour former les liposomes modifiés. La même solution est préparée sans passage à l'homogénéisation et servira de témoin vitamine E libre. Les liposomes à base de vitamine E naturelle sont préparés en présence de PEI 25 kDa à 10pM afin d'éviter la cytotoxicité et également sans agent 15 fonctionnalisant. Des fibroblastes humains normaux sont ensemencés en plaque 24 puits et cultivés jusqu'à confluence. Après trois rinçages en tampon phosphate pH 7,4 avec calcium et magnésium (In vitrogen), les différentes solutions sont incubées diluée au demi (soit concentration en vitamine E finale de 0,1%) dans du milieu de culture pendant au moins deux heures. Des puits sont incubés avec du milieu de culture seul et serviront de témoin sonde par la suite. Après trois rinçages en tampon phosphate pH 7,4 avec calcium et magnésium afin d'éliminer les liposomes et la vitamine E libre, les tapis cellulaires sont incubés en présence de Dihydrorhodamine 123 (Molecular Probes) à raison de 200 pl/puits d'une solution préparée comme suit, 150 pl d'une solution 1 mM dissoute dans 15 ml de tampon HBSS. La plaque est lue en fluorescence à 490-530 nm, puis irradiée à 0,8 J/cm2 en UVB à 912 nm, puis de nouveau lue en fluorescence aux mêmes longueurs d'onde. Les résultats sont exprimés en ratios: A= irradié/non irradié (I/NI) B= (I/NI liposome)/(I/NI témoin sonde) C= Vitamine E Liposomée/Vitamine E libre La sonde fluorescente utilisée permet d'évaluer la présence d'intermédiaires d'oxygène réactif intracellulaire car elle diffuse passivement à travers les membranes cellulaires où elle peut alors être oxydée en rhodamine cationique. Elle réagit positivement par exemple au peroxyde d'hydrogène et peroxynitrites. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 15. Tableau 15: Protection antiradicalaire par les liposomes ainsi modifiés I NI A= B = C = I/NI liposome/témoin liposome/libre Produit de 118990 58786 2,01 79,3 % +23% l'invention Liposome non 114907 52306 2, 31 91,1 % +11% fonctionnalisé Liposome PEI 105257 40148 2,82 111,4 % -9% i0 Ces résultats indiquent que les liposomes fonctionnalisés par la protéine de soja quaternisé permettent d'obtenir plus de 20% d'effet protecteur contre le stress radicalaire par rapport à des liposomes non fonctionnalisés, alors que les liposomes fonctionnalisés par la molécule de référence PEI ne permettent d'une part pas d'observer un effet protecteur, voir génèrent un stress complémentaire. Exemple 17: Stimulation de la dépigmentation par les produits de l'invention Des liposomes ont été préparés selon le protocole suivant. 5 % de lécithine de soja additionné ou non de 2 % de solution de sojaquaternisé ou 10pM PEI. Des actifs sont également coencapsulés: Phytolight (Coletica, Lyon, France) sans conservateur à 0,05 % (cocktail d'actifs végétaux), Arbutine à 0,05 % et catéchine à 1mM (Sigma). Les molécules ont été appliquées libres, en liposome lécithine 5 %, en liposomes fonctionnalisés PEI 10 pM ou soja quaternisé 2% sur des mélanocytes humains normaux cultivés en plaques 24 puits et pré-confluent. Les actifs liposomés ou non sont incubés pendant 66 heures à 37 C sous 5 % de CO2 en milieu MMK2 (Sigma). Après 3 rinçages en tampon phosphate avec calcium et magnésium (Invitrogen), extraction en tampon phosphate contenant 0,5 % triton X-100, l'activité tyrosinase est quantifiée par un dosage en présence de L-DOPA et MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone). La formation d'un composé MBTH-oquinone se caractérise par une valeur d'absorbance à 490 nm quantifiée en cinétique. L'activité tyrosinase est exprimée par la pente (vitesse) de la réaction enzymatique. Les résultats sont présentés dans le tableau 16. Tableau 16: Effet dépigmentant d'actifs liposomés ou non liposomés (exprimé en vitesse de la réaction enzymatique) Libre Lipsosome Liposome PEI Liposome soja Arbutine 0,004 0,001 0 0 Phytolight 0,01 0,008 0,003 0, 0016 Catéchine 0,007 0,007 0 0,003 Ces résultats démontrent qu'en fonction des actifs coencapsulés, la fonctionnalisation permet une augmentation de l'inhibition de l'activité tyrosinase in vitro sur mélanocytes humains normaux. La fonctionnalisation par le soja quaternisé est plus performante que celle obtenue par adjonction de PEI pour le complexe d'extraits végétaux, équivalente pour l'arbutine et légèrement inférieure pour la catéchine. Dans tous les cas l'activité est au moins 2, 3 fois plus importante qu'avec un liposome non fonctionnalisé. Exemple 18: Procédé de diminution de la taille des produits de l'invention La taille des liposomes peut être diminuée par utilisation d'un homogénéisateur haute pression (pression de travail supérieure à 1000 bars, de préférence supérieure à 2000bars, encore de préférence supérieure à 3000 bars). A 3000 bars, cet appareillage permet d'obtenir des liposomes de 50 nm environ. La taille des liposomes a été analysée à l'aide d'un granulomètre laser (Beckman Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser) et par microscopie électronique à transmission tel que décrit dans l'exemple 15. Exemple 19: Mise en évidence de la pénétration de matériel véhiculé par io les produits de l'invention après perméation transcutanée: exemples avec un traceur fluorescent, de la vitamine E ou du matériel génétique La pénétration de molécule fluorescente (PFP-F 0.01%) libre ou incorporée dans un liposome tel que décrit dans l'exemple 12 comprenant ou non 2% de solution de soja quaternisée sélectionnée dans l'exemple 11 a été quantifiée par perméation transcutanée sur peau humaine. La cinétique de diffusion a été quantifiée par spectrofluorométrie de 3 à 24h. Le relargage a été quantifié après 24 heures supplémentaire. Le stockage a également été évalué en final. Le nombre d'échantillons testés est de 5 par condition. Les résultats obtenus présentés dans le tableau 17 démontrent que l'utilisation de liposomes fabriqués en présence de soja quaternisé stimule de façon significative la diffusion, le relargage et le stockage du traceur fluorescent par rapport à à la forme non vectorisée ou vectorisée sans agent quaternisé. Tableau 17: Libre Liposome Liposome quaternisé Diffusion 0,57 0,03 1,17 0,05 1,76 0, 13 Relargage 24h 0,691 0,06 1,398 0,07 1,77 0,21 Stockage 0,81 0,1 1,27 0, 17 2,61 0,33 La pénétration de molécule vitamine E (0.5%) libre ou incorporée dans un liposome tel que décrit dans l'exemple 12 comprenant ou non 2% de solution de soja quaternisée sélectionnée dans l'exemple 11 a été quantifiée par perméation transcutanée sur peau humaine. La cinétique de diffusion a été quantifiée par chromatographie liquide haute performance de 5 à 24h. Le relargage a été quantifié après 24 heures supplémentaire. Le stockage a également été évalué en final. Les résultats obtenus démontrent également que l'utilisation de liposomes fabriqués en présence de soja quaternisé stimule de façon significative la diffusion, le relargage et le stockage de la vitamine E par rapport à la forme non vectorisée ou vectorisée sans agent quaternisé. La même expérience de pénétration transcutanée a été réalisée avec incorporation ou non de matériel génétique fluorescent (200mM) dans un liposome tel que décrit à l'exemple 12 en présence de 2 % de solution de soja. Les obtenus par observation en microscopie optique à épifluorescence de coupes transversales de la peau démontrent que l'utilisation de liposomes fabriqués en présence de soja quaternisé permet la diffusion du matériel génétique jusqu'au derme profond. Séquence de la sonde fluorescente de l'élastine 19-20 duplexée: sens: 5'(FITC) AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3' antisens: 5'- AGCGCCAGCCUUAGCAGCUTT-3' Exemple 20: Utilisation des produits de l'invention dans des formulations cosmétiques ou pharmaceutiques de type émulsion huile dans eau, 25 Formulation 20a: Eau qsp 100 Butylene Glycol 2 Glycerine 3 A Sodium Dihydroxycetyl 2 Phosphate, Isopropyl Hydroxycetyl Ether B Glycol Stearate SE 14 C Triisononaoin 5 Octyl Cocoate 6 Butylene Glycol, 2 Methylparaben, D Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 Produits de l'invention 0,01 10 % Formulation 20b: A Eau qsp 100 Butylene Glycol 2 Glycerine 3 B Polyacrylamide, Isoparafin, 2,8 Laureth-7 Glycol, 2 Butylene Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben; Phenoxyethanol, Methyl paraben, 0,5 Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben D Butylene Glycol 0,01 10 % Produits de l'invention Formulation 20c: A Carbomer 0, 50 Propylene Glycol 3 Glycerol 5 Eau qsp 100 B Octyl Cocoate 5 Bisabolol 0,30 Dimethicone 0,30 C ISodium 1,60 Hydroxide D Phenoxyethanol, 0,50 E Methylparaben, 0,30 Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben Parfum F Produits de l'invention 0,01 10 0/0 Exemple 21: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type eau dans huile A PEG 30 3 d i po lyhyd roxystea rate Capric Triglycerides 3 Cetearyl Octanoate 4 Dibutyl Adipate 3 Grape Seed Oil 1,5 Jojoba Oil 1,5 Phenoxyethanol, 0,5 Produits de l'invention 0,01 10 2870741 Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben B Glycerine 3 Butylene Glycol 3 Magnesium Sulfate 0,5 EDTA 0,05 Eau qsp 100 C Cyclomethicone 1 Dimethicone 1 D Parfum 0,3 E Exemple 22: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation lo de tvpe émulsion triple Emulsion primaire W1/O PEG 30 4 d i po lyhyd roxystea rate Capric Triglycerides 7.5 Isohexadecane 15 PPG-15 Stéarul ether 7.5 B 1 Eau 65.3 C Phenoxyethanol, 0,7 Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben Emulsion secondaire W1/O/W2 A Emulsion primaire 60 B Poloxamer 407 2 Phenoxyethanol, 0.3 Methylparaben, qsp 100 Propylparaben,2-bromo- 2nitropropane-1,3 diol eau C Carbomer 15 D Triethanolamine PH 6.0-6.5 A Produits de l'invention 0,01 10 % Exemple 23: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type rouge à lèvres et autres produits anhydres A Mineral Wax 17,0 Isostearyl Isostearate 31,5 Propylene Glycol Dipelargonate 2,6 Propylene Glycol Isostearate 1,7 PEG 8 Beewax 3,0 Hydrogenated Palm Kernel Oil 3,4 Glycerides, 3,4 Hydrogenated Palm Glycerides Lanoline Oil Sesame Oil 1,7 Cetyl Lactate 1,7 Mineral Oil, Lanolin Alcohol 3,0 B Castor Oil qsp 100 Titanium Dioxide 3,9 CI 15850: 1 0,616 CI 45410: 1 0,256 CI 19140: 1 0,048 CI 77491 2,048 C Produits de l'invention 0,01 5 % Exemple 24: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de gels aqueux (contours de l'oeil, amincissants, etc.) E qsp 100 Carbomer 0,5 Butylene Glycol 15 Phenoxyethanol, Methylparaben, 0, 5 Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben B I Produits de l'invention 0, 01 10 Exemple 25: Préparation de formulations pharmaceutiques contenant le 5 produit de l'invention Formulation 25a: préparation de comprimés En g par comprimé 0,359 0,240 A Excipients Lactose Saccharose B I Produit de l'invention 0, 001 -0,1 Formulation 25b: préparation d'une pommade A Excipients Polyéthylène basse densité 5,5 Paraffine liquide qsp 100 Produit de l'invention 0,001 -0,1 Formulation 25c: préparation d'une formule injectable A Excipient 5 ml -0,1 g B Solution isotonique salée 0,001 Produit de l'invention A Eau B 2870741 42 La phase A et la phase B sont conditionnées en ampoules séparées et mélangées avant utilisation. Exemple 26: Evaluation de l'acceptation cosmétique des produits de 5 l'invention Les essais de toxicologie ont été réalisés sur les composés obtenus selon l'exemple 15 (sans incorporation de principe actif), par une évaluation cutanée et oculaire chez le lapin, par l'étude de l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le lo cobaye. Evaluation de l'irritation primaire cutanée chez le lapin: Les préparations décrites ci-dessus sont appliquées sans dilution à la dose de 0,5 mL sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE 15 concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur la peau . Les produits sont classés selon les critères définis par l'arrêté du 1/2/1982 publié au JORF du 21/02/82. Les résultats de ces essais, ont permis de conclure que la préparation contenant le composé obtenu selon l'exemple 12 était non irritante pour la peau. Evaluation de l'irritation oculaire chez le lapin: Les préparations décrites ci-dessus ont été instillées pure en une seule fois, à raison de 0,imL, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de l'OCDE n 0405 du 24 février 1987 concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur les yeux . Les résultats de ce test permettent de conclure que les préparations peuvent être considérées comme non irritante pour les yeux. Essai sur l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat: Les préparations décrites ont été administrées en une fois par voie orale à la dose de 5g/Kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n 401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques. Les DLO et DL50 sont trouvées supérieures à 5000 mg/Kg. Les préparations testées ne sont donc pas classées parmi les préparations dangereuses par ingestion. Evaluation du potentiel de sensibilisation cutanée chez le cobaye: Les préparations décrites sont soumises au test de maximisation décrit par lo Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE. Les préparations sont classées comme non sensibilisantes par contact avec la peau. Evaluation du potentiel de mutagénicité : Protocole en accord avec la ligne directrice de l'OCDE n 471 (directive 92/69/CEE). Les tests de mutagénèse ont été réalisés sur Salmonella typhimurium et sur Escherichia coli selon la méthode de Ames & coll. (Mutation Research, 1975, 31, 347-364). Cinq souches ont été exposées au produit de l'invention dans du milieu minimum avec ou sans systèmes exogènes d'activation du métabolisme (afin de distinguer promutagènes et mutagènes direct). Après incubation, les colonies mutées ont été comptées et comparées au nombre de colonies spontanément mutées parmi les témoins. Le produit de l'invention ne présente aucune activité mutagène au sens de la 25 directive 92/69 CEE. Evaluation du potentiel de sensibilisation sur volontaires sains: 2870741 44 Evaluation sur un panel de volontaires du potentiel allergisant du produit de l'invention. Le protocole est en accord avec la méthode de Marzulli et Maibach (Contact Dermatitis, 1976, 2, 1-17) comprenant une phase d'induction et une épreuve déclenchante. Ce test est réalisé sur un panel de 100 volontaires sains de sexe féminin et/ou masculin, d'âge compris entre 18 et 65 ans et ayant tout type de peau. Un patch occlusif contenant le produit de l'invention dilué à 20 % était appliqué sur la zone scapulaire de chacun des volontaires. Les patchs étaient laissés en contact direct avec la peau pendant 24 heures et étaient réappliqués tous les 2 io jours pendant 3 semaines pour un total de 9 applications. Après le retrait de chaque patch, les signes cliniques de l'irritation et de la sensibilisation cutanée étaient évalués = Phase d'induction. Après une période de 2 semaines, d'autres patchs contenant le produit de l'invention dilué à 20 % ont été appliqués sur la peau des volontaires et laissés en contact direct avec la surface cutanée pendant 24 heures. Les signes cliniques de l'irritation et de la sensibilisation cutanée étaient évalués 24, 48 et 72 heures après le retrait du patch = Phase "challenge". Aucun des 100 volontaires impliqués dans l'étude ne présentait de signes cliniques d'irritation ou de sensibilisation cutanée, que ce soit pendant la phase 20 d'induction ou la phase "challenge". Dans les conditions expérimentales retenues, le produit de l'invention dilué à 20 % est dépourvu de potentiel allergisant. Annexe 1: Tableau 1- Sélection des sondes fluorescentes en tant que traceurs Nom de la sonde Caractéristiques Exc/Em Concentration Encapsule fuite Cell- Toxicité Pénétration Retenue permeant en liposome #L7545L Lysosensor yellow/blue DND 160 pH sensible 329/440 10pM Oui Oui Oui Non Non Non #H-348 hydroxypyrene trisulfonic acid, 403/511 1mM Non NT Non NT Non Non trisodium salt #P-12925 pentafluorobenzoylamino 492/516 200pM Oui Non Non Oui Oui fluorescein #F-1200 Fura-2, pentapotassium salt Sensible au Cal+ 335/505 10pM Non Non Non Non Oui #C-369 carboxy dichlorofluorescein Fluoresce si 85pM Oui Oui Oui NT NT Non estérases #B-1151 carboxyethyl 482/520 50pM Non NT ? NT NT Non carboxyffluorescein #T-490 tetramethylrhodamine 555/580 Oui ? ? Non Oui Non isothiocyanate TRITC Interfère avec PEI #C-687 cascade blue hydrazine trisodium 399/421 200pM Oui NT Non Non Très faible Non salt #S-1129 sulfo fluorescein diacetate 200pM NT NT non Non Très faible Non #D-3329 dextran texas red 592/609 NT NT Non Oui Non Non Annexe 2: Résultat du criblage de molécules stimulant la pénétration (Tableau 8), Nom INCI Facteur Viabilité Visualisa de tion stimulati on Polyéthylènimine 25 kDa 34,7 74,1 + Cocodimonium hydroxypropyl 4,3 86 - hydrolyzed wheat protein Cocodimonium hydroxypropyl 18 85 - hydrolyzed rice protein Steardimonium hydroxypropyl 4,6 86,4 wheat protein _hydrolyzed Lauryldimonium hydroxypropyl 6,2 87,5 hydrolyzed wheat protein Hydroxypropyltrimonium hydrolyzed 1,3 91,7 wheat protein Hydroxypropyltrimonium honey 15 92 - Sodium lauroyl Oat amino acids 0,8 76,6 - Sodium lauroyl wheat amino acids 1,1 46,1 Cocoamine 32,7 79,7 + Lauryldimonium hydroxypropyl 38,8 87,9 + hydrolyzed soy protein Chitosan 10,3 99 - Hydroxypropyl guar 1,1 74,8 hydroxypropyltrimonium chloride Hydroxypropyl guar -0,2 91,1 Hydroxypropyl guar -0,4 97,5 - Hydroxypropyl guar 1,4 71,2 hydroxypropyltrimonium chloride Guar hydroxypropyltrimonium 0,6 53,3 Meypro 1 91,6 - Polyquaternium 7 0,3 80,1 - Polyvinylpyrrolidone (1) 1,4 85,1 - polyvinylcaprolactam 4,1 0 - Polyvinylpyrrolidone (2) 0,7 26,6 Polyvinylpyrrolidone (3) 0,7 71 - Polyquaternium 16 (1) 4,6 83,5 Polyquaternium 11 (1) 1,5 49,7 - Cocotrimonium methosulfate 0,1 55 Polyquaternium 16 (2) 8,4 33,8 - Polyquaternium 16 (3) 1 38,8 Polyquaternium 16 (4) 12,5 67,1 - Polyquaternium 16 (5) 0,2 85,3 Polyquaternium 44 0,8 59,7 - Cocoalkonium chloride 5,6 36,3 Cocotrimonium chloride -0,2 65,6 - Tetrahydroxypropyl ethyléne- 1,9 95,3 diamine Stéaramidopropyl cetearyl 13,1 93,2 - dimonium tosylate et PG Quaternium 70 et PG -0,2 63,9 - Quaternium 26 30,9 59,2 - Quaternium 22 2 98,9 - Polyquaternium 28 0,6 79,3 - Polyquaternium 11 (2) 2,9 50,7 Polyquaternium 11 (3) 2,9 77,1 - Polyquaternium 2 4,2 23,6 - Stearalkonium chloride 17,6 37,4 - Propylamine C3 0,9 103,3 - n-Butylamine C4 1,4 106,2 - Dibutylamine 2 C4 0,7 75,7 - Hexylamine C6 0,2 82,1 - Heptylamine C7 3,7 39,4 - Dioctylamine 2 C8 1 34,7 - Decylamine C10 39,6 68,5 + Didecylamine 2 C10 1,2 28,3 - Undecylamine C11 95,3 84 + Dodecylamine C12 47,1 57 + Tridecylamine C13 44,5 62,6 + Tetradécylamine C14 11,6 54,8 Pentadécylamine C15 14,9 73 - Octadécylamine C18 19,6 61,2 - Oleylamine C18:1 1,9 87,1 - 1' Annexe 2, tableau 8 (suite) Revendications 1. Phases lamellaires hydratées ou liposomes, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins en partie dans leur structure, une substance ou un mélange de substances capables de stimuler la pénétration intracellulaire d'au moins un principe actif présent ou véhiculé dans lesdits phases lamellaires hydratées ou liposomes, choisie(s) parmi le groupe consistant de: a) la polyéthylènimine; lo b) une monoamine grasse de longueur de chaîne carbonée comprise entre C10 et C18, primaire, secondaire, ternaire ou quaternaire, avantageusement une monoamine comprenant une seule chaîne grasse en C10-C18, de préférence une monoamine primaire ou quaternaire comprenant une seule chaîne grasse en C10-C18; is c) un polymère cationique, en particulier un polymère naturel cationique ou éventuellement rendu cationique, ou un polymère synthétique cationique, lesdits phases lamellaires ou liposomes contenant éventuellement au moins un composé fluorescent sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire, par exemple la pentafluorobenzoylamino fluorescéine, permettant de visualiser cette pénétration. 2. Phases lamellaires ou liposomes selon la revendication 1, caractérisés en ce que le polymère naturel éventuellement cationique est choisi parmi le groupe consistant de chitosane, polymère quaternisé de miel, protéines de blé ou protéine de blé quaternisée, protéine de riz ou protéine de riz quaternisée, protéine de soja ou protéine de soja quaternisé, collagène ou collagène quaternisé, kératine ou kératine quaternisée, caséine ou caséine quaternisée, cellulose quaternisée ou guar quaternisé. 3. Phases lamellaires ou liposomes selon la revendication 1, caractérisés en ce que la monoamine primaire est choisie parmi le groupe consistant de la décylamine, undécylamine, la dodécylamine, la tridécylamine, tétradécylamine, la pentadécylamine, l'octadécylamine, ou est un mélange d'amines primaires tel que les mélanges d'amines de coprah ayant une chaîne hydrocarbonée comprise entre C8 et C18. i0 4. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils contiennent de la polyéthylèneimine. 5. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que les phases lamellaires ou les liposomes comprennent dans la phase lipidique au moins un agent de modification de membrane des liposomes, par exemple un lipide polaire choisi parmi le groupe consistant d'un triglycéride, d'un phospholipide polaire ou d'un sphingolipide polaire, seul ou en mélange. 6. Phases lamellaires ou liposomes selon la revendications 5, caractérisés en ce que le phospholipide polaire précité est choisi parmi la phosphatidyl-choline ou lécithine, la phosphatidyl-éthanolamine ou céphaline, le phosphatidyl-sérine, le phosphatidyl-glycérol, le diphosphatidyl-glycérol ou cardiolipine, le phosphatidyl-inositol, seul ou en mélange. 7. Phases lamellaires ou liposomes selon la revendication 5 ou 6, caractérisés en ce que le sphingolipide polaire est choisi parmi un céramide, un sphingophospholipide, un glycosphyngolipide, seul ou en mélange. 8. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que les phases lamellaires ou les liposomes comprennent au moins une lécithine dans la phase lipidique extraite d'une source naturelle choisie parmi le groupe consistant de soja, colza, tournesol, lupin, arachide, sésame, courge, huile de son, caméline, calendula, lin et chanvre, seul ou en mélange. i0 9. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que les phases lamellaires ou les liposomes comprennent dans la phase lipidique du cholestérol ou le cholestérylhémisuccinate comme agent rigidifiant les membranes. 10. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que les phases lamellaires ou les liposomes comprennent dans la phase lipidique au moins un agent tensio actif ou surfactant comme agent fluidifiant la phase lamellaire ou la membrane des liposomes. 11. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce quelles contiennent un agent fluorescent ou composant fluorescent sensiblement inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire, comprenant environ 0,01% en poids de 5pentafluobenzoylamine fluorescéine, de la composition contenant lesdites phases lamellaires ou liposomes. 2870741 51 12. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la concentration en substance(s) stimulant la pénétration intracellulaire précitée est comprise entre 0, 05% et 25% en poids d'une composition contenant les phases lamellaires hydratées ou les liposomes. 13. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la concentration en substance(s) stimulant la pénétration intracellulaire précitée est comprise entre 0,5% et 2,5% en poids d'une composition contenant les phases lamellaires hydratées ou les liposomes. 14. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la monoamine grasse précitée a une 15 longueur de chaîne carbonée comprise entre C10 et C13. 15. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la monoamine grasse précitée est une monoamine primaire quaternisée comprenant une seule chaîne carbonée grasse comprise entre C10 et C18, de préférence entre C10 et C13. 16. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la monoamine primaire est quaternisée et est choisie parmi une solution de protéine végétale, de préférence de protéine de soja, quaternisée de formule de type RN(R1R2R3) dans laquelle R symbolise la molécule de protéine végétale, hydrolysée ou non, hydroxyalkylée, en particulier hydroxypropylée ou non; R1 et R2 étant indépendamment un groupe hydrocarboné en C1-C6, de préférence méthyle ou éthyle et R3 étant un radical alkyle comportant de à 18 atomes de carbone, et de préférence majoritairement 12 atomes de carbone (lauryl). 17. Phases lamellaires ou liposomes selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la substance ou principe actif présent ou véhiculé dans les phases lamellaires hydratées ou les liposomes est choisie parmi le groupe consistant d'un agent anti- radicalaire tel que la vitamine E, un flavonoïde, un caroténoïde, la vitamine C, ou leurs dérivés; un agent dépigmentant tel que la catéchine, io l'hydroquinone, I'arbutine, l'acide phytique, l'acide élagique, la vitamine C, ou leurs dérivés; un agent amincissant tel qu'au moins une xanthine, un agent pigmentant de la peau ou des cheveux tel que la tyrosine, le tryptophane, la phénylalanine, un extrait de Coleus ou leurs dérivés. 18. Composition cosmétique ou dermocosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend des phases lamellaires ou liposomes comprenant au moins une substance stimulant la pénétration intracellulaire, lesdites phases lamellaires ou liposomes et ladite substance stimulant la pénétration intracellulaire étant telle que définie à l'une quelconque des revendications précédentes, en mélange avec un excipient cosmétiquement acceptable. 19. Composition pharmaceutique ou dermopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des phases lamellaires ou liposomes comprenant au moins une substance stimulant la pénétration intracellulaire, lesdites phases lamellaires ou liposomes et ladite substance stimulant la pénétration intracellulaire étant telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 17, en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 20. Composition selon la revendication 19 ou 19, caractérisée en ce que la concentration en substance stimulant la pénétration intracellulaire est comprise entre 0,05% et 25% en poids de la composition finale, de préférence entre 0,5 et 2,5% en poids de la composition finale. 21. Composition cosmétique ou dermocosmétique, ayant un effet anti-rides, antioxydant, amincissant, blanchissant de la peau, pigmentant de la peau ou des cheveux, caractérisée en ce qu'elle comprend des phases io lamellaires hydratées ou des liposomes comprenant une substance stimulant la pénétration intracellulaire, ladite substance et lesdites phases lamellaires hydratées ou liposomes étant telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 17. 22. Procédé de soin cosmétique, caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur les zones de la peau ou des cheveux concernés, d'une composition cosmétique ou dermocosmétique telle que définie à l'une des revendications 18, 20 et 21. 23. Procédé de soin cosmétique selon la revendication 22, caractérisé en ce que le soin cosmétique est choisi parmi le groupe consistant d'un soin anti-rides, antioxydant, amincissant, blanchissant de la peau, pigmentant de la peau ou des cheveux. 24. Utilisation des phases lamellaires hydratées ou liposomes selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, comme agent cosmétique notamment pour la fabrication d'une composition cosmétique notamment pour une activité anti-rides, antioxydante, amincissante, blanchissante de la peau, pigmentante de la peau ou des cheveux. 25. Procédé pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement capable de stimuler la pénétration intracellulaire d'une substance ou principe actif véhiculé par des phases lamellaires hydratées ou des liposomes, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la préparation d'un mélange hydrolipidique capable de former lesdites phases lamellaires hydratées ou lesdits liposomes; b) l'incorporation avant le procédé de dispersion dans ce mélange hydrolipidique d'un composé fluorescent, de préférence sensiblement 10 inerte vis-à-vis de la pénétration intracellulaire; c) éventuellement l'incorporation avant ou pendant le procédé de dispersion dans le mélange hydrolipidique d'une substance d'essai choisie parmi ladite substance potentiellement active, capable de stimuler la pénétration intracellulaire, et une substance de référence; d) la préparation desdites phases lamellaires hydratées ou desdits liposomes selon toute méthode appropriée de formation desdites phases lamellaires hydratées ou des liposomes à partir du mélange hydrolipidique tel qu'obtenu soit à l'étape b), soit à l'étape c) ci-dessus; e) la détection au moins de la pénétration intracellulaire du composé 20 fluorescent, par mesure de la fluorescence intracellulaire. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que le résultat de la pénétration intracellulaire du composé fluorescent est comparé avec la pénétration intracellulaire obtenue avec une substance de référence, en particulier comprenant la polyéthylènimine. 27. Procédé selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce qu'on détermine la cytotoxicité et/ou l'induction d'apoptose de la substance potentiellement active, notamment sur des fibroblastes, de préférence des fibroblastes humains normaux, en culture. 28. Procédé selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que le composé fluorescent essentiellement inerte relativement à la pénétration intracellulaire est un composé fluorescent qui ne pénètre pas spontanément dans ledit fibroblaste en culture. 29. Procédé selon l'une des revendications 25 à 28, caractérisé en ce io que le composé fluorescent comprend ou est, la pentafluorbenzoylaminofluorescéine utilisée à une concentration de 0,01% en poids de la composition finale contenant les phases lamellaires hydratées ou les liposomes utilisés pour évaluer la pénétration intracellulaire. 30. Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que le composé fluorescent est incorporé en présence de polyéthylènimine, le composé fluorescent et la polyéthylènimine étant à une concentration non cytotoxique. 31. Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que la substance potentiellement capable de stimuler la pénétration intracellulaire est choisie parmi une monoamine grasse primaire de longueur de chaîne alkyle comprise entre C10 et C18, de préférence entre s C10 à C13, ou un polymère cationique, en particulier un polymère naturel éventuellement rendu cationique ou un polymère synthétique cationique incorporé dans les phases lamellaires ou liposomes telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 17.