Brevet FR2861741A1 — publié le 20050506

Milieu de culture pour détecter un entérocoque ARRIÈRE-PLAN DE L'INVENTION Domaine technique concerné par l'invention La présente invention concerne un milieu d'isolement d'entérocoque et en particulier un milieu d'isolement pour différencier, sur le milieu d'isolement, Enterococcus faecium (désigné ci-après par l'abréviation E. faecium) d'Enterococcus faecalis (désigné ci-après par l'abréviation E. faecalis), qui sont des bactéries causant des maladies potentielles, et/ou un procédé pour différencier des entérocoques en utilisant celui-ci. État de la technique Les bactéries entérocoques sont indigènes dans l'appa- reil intestinal humain, la cavité orale, etc., et jusqu'à maintenant, on a trouvé 19 souches bactériennes. Bien que ces bactéries soient très faiblement pathogènes, dans certains cas, elles peuvent causer une endocardite, une affection de l'appareil urinaire, une septicémie, etc., en tant qu'infections opportunistes. Parmi les entérocoques isolés à partir d'une matière clinique comme les fèces ou 2861741 2 l'urine, 80 % à 90 % de ceux-ci sont constitués d'E. faecalis, et la majorité du reste d'E. faecium (site internet du ministère de la santé, du travail et des affai- res sociales du Japon, ). De ce fait, on considère que ces deux souches bactériennes sont cliniquement importantes. E. faecalis et E. faecium ont des sensibilités différentes vis-à-vis des antibiotiques et en particulier 70 % d'isolats cliniques d'E. faecium ont une résistance aux pénicillines. De ce fait, des procédés de traitement pour les deux souches bactériennes sont différents et on doit effectuer une différenciation des deux souches bactériennes à un stade précoce des essais. Récemment, on a découvert des entérocoques ayant une résistance à la vancomycine (entérocoques résistants à la vancomycine, désignés ci-après par l'abréviation ERV). Bien que les ERV présentent une résistance à la vancomycine, il n'y a pas de différence en ce qui concerne d'autres propriétés comme la pathogénicité et la résistance aux antibiotiques. En ce qui concerne ces ERV, E. faecalis et E.faecium représentent la majeure partie des cas détectés, et il est important de différencier les deux souches bactériennes. En ce qui concerne un procédé de détection d'entérocoques, il y a deux procédés dans lesquels du 5-bromo-4-chloro-3-in.dolyl-3-Dglucopyrannoside, de l'esculine, etc., sont ajoutés individuellement à des composants d'un milieu de culture (site internet de Merck KgaA, ), et ceux-ci sont disponibles dans le commerce essentiellement en tant que milieux de culture pour des aliments. Cependant, dans ces procédés, toutes les colonies d'entérocoques et leurs environnements virent à une couleur bleue unique ou noire à 2861741 3 une couleur gris foncé, et une différenciation des souches bactériennes est donc impossible. En ce gui concerne un procédé pour détecter des ERV, avec l'objectif de différencier les deux souches bactérien- nes E. faecalis et E. faecium, un milieu de culture contenant du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium, dans lequel les deux souches bactériennes sont différenciées par la couleur des colonies, est disponible dans le commerce pour une utilisation clinique (JP, A, 2003-70495, site internet de Nippon Becton Dickinson Company, Ltd., . Cependant, ce milieu de culture a le problème qu'étant donné qu'E. faecalis présente une réaction de coloration rouge foncé et qu'E. faecium présente une réaction de coloration rose, qui sont des couleurs similaires, il est difficile de différencier les deux souches bactériennes. Ainsi qu'on l'a décrit précédemment, bien qu'une différenciation et une détermination précoces et fiables soient désirées, en particulier dans un environnement clinique, les procédés et les milieux de culture usuels ne peuvent pas différencier de façon fiable les deux souches bactériennes E. faecalis et E. faecium, et l'objectif d'effec- tuer une différenciation simplement et rapidement n'est pas complètement satisfait. RÉSUMÉ DE L'INVENTION Un objectif de la présente invention est donc de fournir un milieu de culture et/ou un procédé pour séparer et détecter de façon commode des entérocoques sur le milieu de culture et: de différencier de façon commode et fiable E. faecium d'E. faecalis. Pendant des recherches poussées effectuées par les auteurs de la présente invention de façon à résoudre les problèmes susmentionnés, de façon surprenante, on a découvert qu'une différenciation fiable d'E. faecalis et 2861741 4 d'E. faecium est possible grâce à l'utilisation d'un milieu de culture dans lequel les deux souches bactériennes pré-sentent des réactions de coloration différentes et, comme résultat de recherches supplémentaires, on a réalisé la présente invention. On a découvert aussi que quand, en plus d'un réactif chromogène réducteur, un substrat chromogène de (3-glucosidase est contenu dans un milieu de culture et quand on effectue la mise en culture dans le milieu de culture, on peut détecter des entérocoques au moyen de la couleur des colonies dans le milieu de culture unique, et ce milieu de culture est approprié pour la détection et la différenciation aisées d'E. faecium et d'E. faecium. En effet, la présente invention concerne un milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui ne donne pas de coloration avec E. faecium. En outre, la présente invention concerne le milieu de culture dans lequel le réactif chromogène réducteur est du chlorure de 2,3,5triphényltétrazolium. De plus, la présente invention concerne le milieu de 20 culture comprenant, en outre, de la peptone, du glucose, un extrait de levure et de la gélose. En outre, la présente invention concerne le milieu de culture comprenant de 4 à 6 g/1 de peptone, de 0,2 à 2 g/1 de glucose, de 1 à 4 g/1 d'extrait de levure et de 8 à 18 g/1 de gélose. De plus, la présente invention concerne le milieu de culture comprenant en outre un substrat chromogène de (3-glucosidase. De plus, la présente invention concerne le milieu de culture dans lequel le substrat chromogène de (3-glucosidase est du 5-bromo-4-chloro-3indolyl-3-D-glucopyrannoside. De plus, la présente invention concerne le milieu de culture comprenant en outre une substance antibactérienne contre les bactéries Gram négatives. 2861741 5 De plus, la présente invention concerne le milieu de culture dans lequel la substance antibactérienne contre les bactéries Gram négatives est du sulfate de thallium. De plus, la présente invention concerne le milieu de culture comprenant en outre de la vancomycine. De plus, la présente invention concerne un procédé pour différencier Enterococcus faecium d'Enterococcus faecalis dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) inoculer un milieu de culture avec l'échantillon, le milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui ne donne pas de coloration avec Enterococcus faecium; et b) effectuer une différenciation entre les deux souches bactériennes en observant la couleur des colonies pendant la mise en culture ou après la mise en culture. De plus, la présente invention concerne le procédé dans lequel le milieu de culture comprend en outre un substrat chromogène de (3-glucosidase. Un milieu de culture dans lequel E. faecalis et E. faecium présentent des degrés différents de coloration est connu dans l'art conventionnel (par exemple JP, A, 2003-70495, site internet de Nippon Becton Dickinson Company, Ltd., ), mais il n'y a pas de milieu de culture connu dans lequel un réactif chromogène réducteur donne une coloration seulement avec E. faecalis et dans lequel le réactif chromogène réducteur ne donne pas de coloration avec E. faecium. En effet, le milieu de culture de la présente invention est le premier milieu de culture qui comprend un agent chromogène réducteur et dans lequel le réactif chromogène réducteur dans le milieu de culture donne une coloration seulement avec des colonies d'E. faecalis et le réactif chromogène réducteur ne donne pas de coloration avec E. faecium. 2861741 6 En outre, le procédé de la présente invention comprend l'inoculation d'un milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur avec un échantillon, le réactif chromogène réducteur ne donnant pas de coloration avec E. faecium, et ensuite l'observation de la couleur des colonies après la mise en culture et la confirmation de la présence d'E. faecalis quand on observe une coloration, différenciant ainsi E. faecalis d'E. faecium. Le milieu de culture de la présente invention comprend un réactif chromogène réducteur, et le réactif chromogène réducteur dans le milieu de culture donne une coloration seulement avec E. faecalis, le réactif chromogène réducteur ne donnant pas de coloration avec E. faecium. Conformément au milieu de culture de la présente invention, il est donc possible d'isoler et de détecter des entérocoques et de différencier E. faecalis d'E. faecium. En outre, parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture dans lequel le réactif chromogène réducteur est du chlorure de 2,3,5- triphényltétrazolium permet d'effectuer clairement la coloration par E. faecalis. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière plus fiable. Parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend en outre de la peptone, du glucose, un extrait de levure et de la gélose permet de cultiver des entérocoques plus efficacement et de supprimer la coloration du réactif chromogène réducteur par E. faecium. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière plus fiable. En outre, parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend de 4 à 6 g/1 de peptone, de 0,2 à 2 g/1 de glucose, de 1 à 4 g/1 d'ex- 2861741 7 trait de levure et de 8 à 18 g/1 de gélose permet de cultiver des entérocoques de façon encore plus efficace et de supprimer la coloration du réactif chromogène réducteur par E. faecium. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière encore plus fiable. En outre, parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend en outre un substrat chromogène de I3- glucosidase permet de détecter plus rapidement E. faecium et E. faecalis dans un échantillon. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier plus efficacement E. faecalis d'E. faecium. De plus, parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture dans lequel le substrat chromogène de 3-glucosidase est du 5bromo-4-chloro-3-indolyl-(3-D-glucopyrannoside permet d'effectuer plus clairement une coloration par E. faecium. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière plus fiable. En outre, parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend une substance antibactérienne contre les bactéries Gram négatives et en particulier un milieu de culture qui comprend du sulfate de thallium permet de supprimer la croissance de bactéries Gram négatives, qui ne sont pas des cibles de détection. Conformément à ce milieu de culture, il est donc possible de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière plus fiable. Parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend en outre de la vancomycine permet de supprimer la croissance d'entérocoques sensibles à la vancomycine et il fonctionne comme un milieu de culture de détection de ERV. Conformément à ce milieu de 2861741 8 culture, il est donc possible de différencier E. faecalis résistant à la vancomycine d'E. faecium résistant à la vancomycine d'une manière plus fiable. Ainsi qu'on l'a décrit ci-dessus, étant donné que le milieu de culture pour détecter des entérocoques selon la présente invention comprend le réactif chromogène réducteur ou à la fois le substrat chromogène de Rglucosidase et le réactif chromogène réducteur, il est possible de détecter des entérocoques au moyen de la couleur de la colonie, et des colonies d'E. faecium et d'E. faecalis présentent des couleurs différentes dans un milieu de culture de détection de ERV qui est le milieu de culture susmentionné contenant de la vancomycine. Conformément aux milieux de culture de la présente invention, il est donc possible de différencier E. faecium d'E. faecalis d'une manière simple et claire et de fournir des informations médicales appropriées à un médecin à un stade précoce avec le résultat de différenciation obtenu en utilisant les milieux de culture. Dans le procédé de la présente invention, après l'ino- culation d'un milieu de culture avec un échantillon, le milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui ne donne pas de coloration avec E. faecium, on observe la couleur de la colonie pendant la culture ou après la mise en culture, et la présence d'E. faecalis est confirmée quand on observe une coloration. Conformément au procédé de la présente invention, il est donc possible d'isoler et de détecter de manière commode des entérocoques sur un milieu de culture et de différencier E. faecalis d'E. faecium d'une manière simple et fiable. Parmi les procédés de la présente invention, un procédé dans lequel le milieu de culture comprend en outre un substrat chromogène de 3glucosidase permet de détecter rapidement E. faecalis et E. faecium dans un échantillon. Conformément à ce procédé, il est donc possible de diffé2861741 9 rencier plus efficacement E. faecalis d'E. faecium. MODES DE MISE EN UVRE DE L'INVENTION Le milieu de culture pour détecter des entérocoques utilisé dans la présente invention est un milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui ne donne pas de coloration avec E. faecium. En effet, le réactif chromo-gène réducteur ne change pas pendant la croissance d'E. faecium mais donne une coloration en étant métabolisé en même temps que la croissance d'E. faecalis. Par exemple, on peut utiliser un sel de tétrazolium tel que le chlorure de 2,3,5triphényltétrazolium (TTC), le bromure de 3-(4,5-diméthyl-2--thiazolyl)-2, 5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) ou le 3,3-(3,3-diméthoxy-4,4-biphénylène) bis(chlorure de 2,5-diphényl-2H-tétrazolium) (bleu de tétrazolium). La concentration du réactif chromogène réducteur utilisé dans le milieu de culture est de préférence dans la plage de 0,001 g/1 à 10 g/l, de façon plus préférée dans la plage de 0,01 g/1 à 1 g/1 et de la façon la plus préférée dans la plage de 0,05 g/1 à 0,5 g/l. Étant donné que le milieu de culture de la présente invention dans lequel le réactif chromogène réducteur ne donne pas de coloration avec E. faecium est un milieu de culture ayant la propriété que le réactif chromogène réducteur donne une coloration en étant métabolisé en même temps que la croissance d'E. faecalis mais ne donne pas de coloration en étant métabolisé en même temps que la croissance d'E. faecium, il peut être un milieu de culture dont les composants tels qu'un composant nutritif et les quantités de ceux-ci sont ajustés de préférence de façon à ce que le réactif chromogène réducteur ne donne pas de coloration avec E. faecium. Les composants du milieu de culture selon la présente invention sont de préférence un composant source d'azote, un composant source de carbone, un composant vitamine et un 2861741 10 composant support. En ce qui concerne le composant source d'azote, des oligopeptid.es comme une peptone et des acides aminés sont préférables. En ce qui concerne le composant source de carbone, un sucre comme le glucose est préférable. En ce qui concerne le composant vitamine, une vitamine individuelle et/ou un mélange de divers types de vitamines, ou un extrait de levure sont préférables. En ce qui concerne le composant support, la gélose est préférable, et on peut ajouter un halogénure de métal comme le chlorure de sodium, le chlorure de magnésium ou le chlorure de calcium, si nécessaire en tant que composant osmorégulat.oire. Parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend en outre de la peptone, du glucose, un extrait de levure et de la gélose est donc préférable. De plus, un milieu de culture comprenant de 4 à 6 g/1 de peptone, de 0,2 à 2 g/1 de glucose, de 1 à 4 g/1 d'extrait de levure et de 8 à 18 g/1 de gélose est plus préférable. Parmi:Les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture qui comprend en outre un substrat chromogène de j3-glucosidase, c'est-à-dire un milieu de culture qui comprend un réactif chromogène réducteur et un substrat chromogène de (3-glucosidase, est préférable. La concentration du substrat chromogène de R-glucosidase utilisé dans le milieu de culture est de préférence dans la plage de 0,001 g/1 à 1 g/1, de façon plus préférée dans la plage de 0,005 g/1 à 0,5 g/1 et de la façon la plus préférée dans la plage de 0,01 g/1 à 0,1 g/l. Le substrat chromogène de p-glucosidase donne une coloration comme résultat d'un chromogène du substrat chromo-gène de (3-glucosidase libéré par la 3-glucosidase produite 2861741 11 par des entérocoques. Par exemple, on utilise des indolylglucopyranriosides comme le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-3-D- glucopyrannoside (X-Glu), le 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-j3-D- glucopyrannoside, le 6-chloro-3-indolyl-(3-D- glucopyrannoside, le 3-indolyl-(3-D-glucopyrannoside et le 5-bromo-3indolyl-(3-D-glucopyrannoside, l' o-nitrophényl-(3-D-glucopyrannoside, le 4-méthylumbelliféryl-(3-D-glucopyranrioside, etc., dans le milieu de culture de la présente invention. Dans le milieu de culture de la présente invention comprenant en outre un substrat chromogène de (3-glucosidase, il est préférable que la coloration donnée par le réactif chromogène réducteur et la coloration donnée par le substrat chromogène de f3-glucosidase appartiennent à des famil- les de couleurs différentes entre elles. De façon spécifique, par exemple, quand on utilise du TTC comme réactif chromogène réducteur, la coloration donnée par le substrat chromogène de (3-glucosidase doit être une couleur différente du rouge. Dans ce cas, il est donc particulièrement préférable d'utiliser, comme substrat chromogène de f3- glucosidase, X-Glu qui donne une coloration bleue qui est nettement visible par rapport à la coloration rouge. Parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture comprenant de la vancomycine ou de la teicoplanine qui, comme la vancomycine, est un agent antibactérien glycopeptidique, est préférable étant donné qu'on peut l'utiliser en tant que milieu de culture pour la détection de ERV. Un milieu de culture comprenant de la vancomycine est particulièrement préférable. La concentration de l'agent antibactérien glycopeptidique utilisé est de préférence dans la plage de 1 mg/1 à 256 mg/1, de façon plus préférée dans la plage de 4 mg/1 à 128 mg/1 et de la façon la plus préférée dans la plage de 6 mg/1 à 64 mg/l. 2861741 12 Parmi les milieux de culture de la présente invention, un milieu de culture comprenant un inhibiteur de croissance de bactéries Gram négatives est préférable étant donné que la croissance de bactéries Gram négatives dans un échantil- lon est inhibée. Des exemples des inhibiteurs de croissance de bactéries Gram négatives utilisés comprennent les polymyxine B, aztréonam, azoture de sodium, Tween 80 et sulfate de thallium, et le sulfate de thallium est préférable. La concentration de l'inhibiteur de croissance de bac- téries Gram négatives utilisé dans le milieu de culture est de préférence dans la plage de 0,1 g/1 à 0,6 g/l, de façon plus préférée dans la plage de 0,2 g/1 à 0,5 g/1 et de la façon la plus préférée dans la plage de 0,3 g/1 à 0,4 g/l. On peut utiliser ces substances individuellement ou sous la forme d'un mélange de plusieurs types. Le pH du milieu de culture est de préférence de 6,5 à 7,5, auquel des entérocoques se développent efficacement, et de façon plus préférée de 6, 8 à 7,2. On utilise le milieu de culture de la présente inven- tion de la façon suivante. Premièrement, on inocule le milieu de culture avec un échantillon et on le cultive à 30 C à 45 C pendant 12 à 48 heures. Après la mise en culture ou pendant la culture, on inspecte des propriétés telles qu'une coloration ou une fluorescence des colonies. On détecte des entérocoques sous la forme de colonies colorées. Dans le milieu de culture de la présente invention qui emploie un réactif chromogène réducteur tel que le TTC, quand une colonie donne une coloration rouge, on détecte du E. faecalis. Quand il n'y a pas de coloration, il est clair qu'il n'y a pas d'E. faecalis présent. Dans ce cas, si nécessaire, on effectue une détection d'E. faecium en utilisant un milieu de culture comprenant d'autres composants. Dans le milieu de culture de la présente invention qui 2861741 13 comprend un. substrat chromogène de (3-glucosidase tel que X-Glu en plus du réactif chromogène réducteur tel que TTC, quand la colonie donne une coloration rouge, on détecte du E. faecalis, et quand la coloration est bleue, on détecte du E. faecium. Ainsi, les deux souches bactériennes sont différenciées. Dans le milieu de culture de la présente invention comprenant en outre le substrat chromogène de R-glucosidase en plus du réactif chromogène réducteur, le réactif chromogène réducteur et le substrat chromogène de (3-glucosidase peu-vent être ajoutés à l'avance au milieu de culture ou on peut les ajouter au milieu de culture pendant ou après une inoculation avec un échantillon. L'ordre d'addition de ces substances au milieu de culture n'est pas limité. Du point de vue de La commodité, il est préférable de les ajouter à l'avance au milieu de culture. Quand le milieu de culture de la présente invention comprenant le substrat chromogène de (3-glucosidase en plus du réactif chromogène réducteur est inoculé avec E. faecalis, E. faecalis réagit à la fois avec le réactif chromogène réducteur et avec le substrat chromogène de f3-glucosidase. Dans le milieu de culture de la présente invention employant du TTC en tant que réactif chromogène réducteur et X-Glu en tant que substrat chromogène de f3- glucosidase, les colonies résultantes sont rouges. Cependant, au fur et à mesure que le temps s'écoule, une couleur bleue peut exsuder dans la zone autour du site coloré en rouge dans certains cas. Des exemples d'échantillons appliqués au milieu de culture de la présente invention comprennent des échantil- lons cliniques comme l'urine et le plasma, des échantillons d'aliment comme de la viande, et des échantillons hospita- liers comme des liquides utilisés pour essuyer des poignées de portes infectées, des rampes, des murs, etc. dans un 2861741 14 hôpital. On peut fournir le milieu de culture de la présente invention sous la forme de gélose, d'un liquide ou d'une poudre, ces formes contenant tous les composants, y compris le réactif chromogène réducteur ou à la fois le réactif chromogène réducteur et le substrat chromogène de (3-glucosidase. On peut aussi fournir le milieu de culture sous la forme d'une petite portion à usage unique de la forme susmentionnée dans un conteneur comme une boîte de Petri. Il est préférable de fournir le milieu de culture dans le conteneur tel qu'une boîte de Petri du point de vue de la portabilité et de la commodité. Il est possible aussi de fournir le milieu de culture ayant le réactif chromogène réducteur qui n'est pas métabo- lisé par E. faecium, et le réactif chromogène réducteur et le substrat chromogène de (3-glucosidase, dans un conteneur unique ou dans des conteneurs séparés sous la forme d'un kit. Dans ce cas, en prenant en considération la portabilité et la commodité, il est préférable que le kit contienne un équipement tel qu'un bâtonnet d'inoculation d'échantillon ou une anse de platine. Le procédé de la présente invention pour différencier E. faecium et E. faecalis dans un échantillon comprend les étapes suivantes: a) inoculer un milieu de culture avec l'échantillon, le milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui ne donne pas de coloration avec Enterococcus faecium; et b) différencier les deux souches bactériennes en ob-30 servant la couleur d'une colonie pendant la culture ou après la mise en culture. Quand une colonie donne une coloration, on détecte du E. faecalis. Quand la colonie ne donne pas de coloration, il est 2861741 15 préférable d'inclure une étape d'inoculation d'un milieu de culture comprenant un substrat chromogène de (3-glucosidase, tel que X-Glu avec le même échantillon et d'examen de la coloration. Dans ce cas, par exemple, quand il est confirmé qu'une coloration bleue est observée dans le milieu de culture qui comprend le substrat chromogène de F3-glucosidase, du E. faecium est détecté. Parmi les procédés de la présente invention, il est préférable que le milieu de culture comprenne en outre un substrat chromogène de (3glucosidase étant donné qu'on peut effectuer une détection d'E. faecalis et une détection d'E. faecium dans le même temps. Le temps de culture après l'inoculation dépend du type de chaque composant dans le milieu de culture mais il est de préférence de 12 à 48 heures à une température de 30 C à 45 C du point de vue de l'efficacité et d'un fonctionnement simple. On explique la présente invention ci-après de façon plus détaillée en se référant à des exemples, mais la présente invention n'est pas limitée à ces exemples. (Exemple 1; On prépare un milieu de culture selon la présente invention ayant la composition et la concentration indiquées dans le tableau 1. On cultive une souche d'essai dans un milieu de culture de gélose et de digesté de caséine de soja à 35 C pendant 24 heures et ensuite on échantillonne et on dilue une colonie avec une solution saline physiologique stérile. On inocule le milieu de culture de la pré-sente invention avec le liquide dilué et on le cultive à 35 C pendant 48 heures. Ainsi que cela est indiqué dans le tableau 2, du E. faecium forme une colonie bleue, du E. faecalis forme une colonie rouge, et la croissance de bacilles Gram négatifs est inhibée. De cette manière, conformément au milieu de culture de la présente invention, on détecte et on 2861741 16 différencie facilement E. faecalis et E. faecium. Dans le tableau, "tryptone" est un nom de produit d'une peptone fabriquée par OXOID Corp. [Tableau 1] Tableau 1 - Exemple de composition d'un milieu de culture Nom du composant Concentration Tryptone 5 (g/1) Glucose 1 (g/1) Extrait de levure 2,5 (g/1) Tween 80 1 (g/1) Sulfate de thallium 330 (mg/1) TTC 0, 1 (g/1) X-Glu 0,05 (g/1) Gélose 15 (g/1) pH 7,0 0,2 [Tableau 2] Tableau 2 - Résultats de croissance Classe Nom de la souche Croissance et cou- leur de la colonie Entérocoques E.faecalis ATCC51299 Rouge E.faecalis ATCC29212 Rouge E.faecium ATCC6569 Bleue E.faecium #1 Bleue Bactéries Gram E. coli ATCC25922 Pas de croissance négatives P. aeruginosa IF03445 Pas de croissance (Exemple 2) On prépare un milieu de culture en ajoutant 6 mg/1 de vancomycine aumilieu de culture ayant la composition indiquée dans le tableau 1. On cultive une souche d'essai dans un milieu de culture de gélose et de digesté de ca- séine de soja à 35 C pendant 24 heures et ensuite, on échantillonne et on dilue une colonie avec une solution saline physiologique stérile. On inocule le milieu de 2861741 17 culture de la présente invention avec le liquide dilué et on le met en culture à 35 C pendant 48 heures. Ainsi que cela est indiqué dans le tableau 3, du E. faecium résistant à la vancomycine forme une colonie bleue, du E. faecalis résistant à la vancomycine forme une colonie rouge, et la croissance d'entérocoques sensibles à la vancomycine et de bacilles Gram négatifs est inhibée. De cette manière, conformément au milieu de culture de la présente invention, on détecte et on différencie aisément E. faecalis et E. faecium résistants à la vancomycine. [Tableau 3] Tableau 3 - Résultats de croissance Classe Nom de la souche Croissance et cou- leur de la colonie ERV E.faecalis ATCC51299 Rouge E.faecium #1 Bleue Entérocoques la E.faecalis ATCC29212 Pas de croissance sensibles à vancomycine E.faecium ATCC6569 Pas de croissance Bactéries Gram E. coli ATCC25922 Pas de croissance négatives P. aeruginosa IFO3445 Pas de croissance (Exemple 3) - Étude d'une composition de milieu de culture On cultive une souche d'essai dans un milieu de culture de gélose et de digesté de caséine de soja à 350C pendant 24 heures et ensuite, on échantillonne et on dilue une colonie avec une solution saline physiologique stérile. On inocule des milieux de culture ayant les concentrations de composition indiquées dans le tableau 4 avec le liquide dilué et on les met en culture à 35 C pendant 24 à 48 heures. Ainsi que cela est indiqué dans le tableau 5, il s'avère que dans le milieu de culture 1 (SPCA), deux souches de E. faecalis réduisent toutes les deux le TTC et forment une colonie rouge, mais du E. faecium ne réduit pas le TTC et forme une colonie blanche, et on peut ainsi distinguer les souches bactériennes. D'autre part, dans les milieux de culture 2, 3 et 4, les deux souches bactériennes forment toutes les deux une colonie rouge et, par consé- quent, les souches bactériennes ne peuvent pas être distin-5 guées. [Tableau 4] Milieu de Milieu de Milieu de Milieu de culture 1 culture 2 culture 3 culture 4 (SPC gé- (substance (tryptone (BHI gélose) lose) nutritive soja gélose) gélose) Digesté de 5,0 g/1 15,0 g/1 pancréatine et de caséine Extrait de 2,5 g/1 2,0 g/1 levure Extrait de 1,0 g/1 boeuf pour bactéries Peptone 5,0 g/1 Peptone de 5,0 g/1 soja Protéose pep- 10,0 g/1 tone Poudre d'ex- 12,5 g/1 trait de cer- veau de vache Poudre d'ex- 5,0 g/1 trait de coeur de vache Glucose 1,0 g/1 NaCl 5,0 g/1 5,0 g/1 5,0 g/1 Phosphate 2,5 g/1 disodique Gélose 15, 0 g/1 15,0 g/1 15,0 g/1 10,0 g/1 TTC 0,1 g/1 0,1 g/1 0,1 g/1 0,1 g/1 pH 7, 0 0,2 7,4 0,2 7,3 0,2 7,4 0,2 [Tableau 5] E.faecalis E.faecalis E.faecium ATCC51299 ATCC29212 ATCC6569 Milieu de culture 1 Rouge Rouge Blanc Milieu de culture 2 Rouge Rouge Rouge Milieu de culture 3 Rouge Rouge Rouge Milieu de culture 4 Rouge Rouge Rouge Ensuite, ainsi que cela est indiqué dans le tableau 6, on compare la croissance et la couleur des colonies des deux souches bactériennes en modifiant les quantités de digesté de caséine-pancréatine, d'extrait de levure et de glucose, qui sont les composants du milieu de culture 1. Ainsi que cela est indiqué dans le tableau 7, il s'avère que ni l'une ni l'autre des souches bactériennes ne se développe bien quand l'extrait de levure est exclu, et on ne peut pas améliorer la croissance même en augmentant la quantité de digesté de pancréatine et de caséine ou la quantité de glucose quand l'extrait de levure est absent. Quand on cultive le milieu de culture 8 pendant 48 heures, du E. faec__um forme une colonie partiellement rose. [Tableau 6] Milieu de Milieu de Milieu de Milieu de Milieu de culture 1 culture 5 culture 6 culture 7 culture 8 Digesté de 5,0 g/1 5,0 g/1 10,0 g/1 5,0 g/1 10,0 g/1 pancréatine et de caséine Extrait de 2,5 g/1 5 g/1 levure Glucose 1,0 g/1 1,0 g/1 2,0 g/1 Sorbitol 1,0 g/1 Gélose 15,0 g/1 15,0 g/1 15,0 g/1 15,0 g/1 15,0 g/1 TTC 0,1 g/1 0,1 g/1 0,1 g/1 0,1 g/1 0,1 g/1 pH 7,0 0,2 7,0 0,2 7,0 0,2 7,0 0,2 7,0 0,2 [Tableau 7] E.faecalis E.faecalis E.faecium ATCC51299 ATCC29212 ATCC6569 Milieu de culture 1 Rouge Rouge Blanc Milieu de culture 5 Blanc à rose Rouge Pas de croissance Milieu de culture 6 Pas de Pas de Pas de croissance croissance croissance Milieu de culture 7 Blanc à rose Rouge Pas de croissance Milieu de culture 8 Rouge Rouge Blanc à rose À partir de ces résultats, on peut constater que la présente invention peut être appliquée de la façon la plus appropriée avec la composition du milieu de culture 1. Applicabilité industrielle Étant donné qu'on peut utiliser le milieu de culture de la présente invention par exemple dans des installations médicales dans lesquelles on traite des infections de ERV, et dans des laboratoires pour tester par exemple un aliment dans lequel on utilise un agent antibactérien analogue à la vancomycine, le milieu de culture contribue considérable-ment au développement d'industries apparentées. 2861741 21 REVENDICATIONS 1. Milieu de culture pour détecter un Enterococcus, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif chromogène réducteur qui donne une coloration avec Enterococcus faecalis, mais ne donne pas de coloration avec Enterococcus faecium. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit réactif chromogène réducteur est du chlorure de 2,3,5triphényltétrazolium. 3. Milieu de culture selon la revendication 1 ou 2, ca-10 ractérisé en ce qu'il comprend en outre de la peptone, du glucose, un extrait de levure et de la gélose. 4. Milieu de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend de 4 à 6 g/1 de peptone, de 0,2 à 2 g/1 de glucose, de 1 à 4 g/1 d'extrait de levure et de 8 à 18 g/1 de gélose. 5. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un substrat chromogène de j3glucosidase. 6. Milieu de culture selon la revendication 5, caracté- risé en ce que ledit substrat chromogène de 3-glucosidase est du 5-bromo4-chloro-3-indolyl-(3-D-glucopyrannoside. 7. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une substance antibactérienne contre les bactéries Gram négatives. 8. Milieu de culture selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite substance antibactérienne contre les bactéries Gram négatives est du sulfate de thallium. 9. Milieu de culture selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre de la vancomycine. 10. Procédé de différenciation d'une souche d'Enterococcus faecium et d'une souche d'Enterococcus faecalis dans un échantillon, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) inoculer un milieu de culture avec l'échantillon, 2861741 22 le milieu de culture comprenant un réactif chromogène réducteur qui donne une coloration avec Enterococcus faecalis, mais ne donne pas de coloration avec Enterococcus faecium; et b) différencier les deux souches bactériennes en observant la couleur de la colonie pendant la mise en culture ou après la mise en culture. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend en outre un subs-10 trat chromogène de R-glucosidase.