Brevet FR2870258A1 — publié le 20051118

PROCEDE DE FABRICATION D'ACIDES GRAS POLY-INSATURES PAR DES LEVURES OLEAGINEUSES La présente invention porte sur un procédé de fabrication d'acides gras poly-insaturés par des levures oléagineuses. Les quantités industrielles d'huiles sont la plupart du temps obtenues à partir de plantes. Des sources non végétales d'huiles sont utilisées dans l'industrie principalement parce que des huiles ayant des propriétés différentes, déterminées par les acides gras, sont disponibles. Des huiles sont également accumulées par certaines levures et champignons filamenteux. Parmi les quelques 600 différentes espèces de levure, seules 25 environ sont capables d'accumuler plus de 20 % de lipides (Ratledge, Biochem Soc Trans. 1989;17:1139-41), ce sont les espèces oléagineuses. Les lipides microbiens pourraient contribuer à couvrir la demande croissante de graisses et huiles. De plus, l'huile de cellules simples (SCO- single cell oil ) est d'intérêt particulier en raison de la capacité des levures oléagineuses à convertir de nombreuses matières premières en graisses et huiles à valeur ajoutée. Les voies biosynthétiques d'acide gras insaturé d'importance physiologique de mammifère sont représentées sur la Figure 1. La D12- désaturase, la D6-désaturase et la D15-désaturase, conjointement avec d'autres enzymes impliquées dans la conversion d'acides gras, par exemple celles décrites sur la Figure 1, sont les enzymes d'intérêt à introduire dans la levure oléagineuse. Les voies biosynthétiques d'acides gras n-6 and n-3 poly-insaturés d'importance physiologique de mammifère sont décrites sur la Figure 1. La D12-désaturase est responsable de la conversion de l'acide oléique (OA; 18:1, 6) en acide linoléique (LA; 18:2-9, 12). La D6-désaturase est responsable de la conversion de LA en GLA (18:3-6, 9, 12) et de l'acide a-linolénique (ALA, 18:3-9, 12, 15) en acide stéaridonique (SDA, 18:4-6, 9, 12, 15). Ces enzymes, conjointement avec d'autres importantes enzymes impliquées dans la conversion d'acides gras, par exemple celles décrites sur la Figure 1, sont les enzymes d'intérêt pour l'introduction dans une levure oléagineuse. Les attraits de Yarrowia lipolytica comme huile oléagineuse avec une capacité de croissance sur des sources de carbone bon marché telles que le glucose nous ont conduits à développer un système de production d'acides gras insaturés qui peut exprimer des gènes exogènes impliqués dans la biosynthèse des lipides. La production d'acide Gamma linoléique (GLA) par une D6-désaturase est décrite dans le brevet américain No. 5,552,306. La production d'acide 8'11-eicosadiénoïque utilisant Mortierella alpine est décrite dans le brevet américain No. 5,376,541. La production d'acide docosahexaénoïque par des dinoflagellés est décrite dans le brevet américain No. 5,407,957. Le clonage d'une D6- palmitoyl-ACP désaturase (ACP- protéine porteuse d'acyle) est décrit dans la publication de la demande internationale PCT WO 96/13591 et dans le brevet américain No. 5,614,400. Le clonage d'une D6-désaturase à partir de bourrache est décrit dans la publication de la demande internationale PCT WO 96/21022. Le clonage de la D9-désaturase est décrit dans les demandes de brevets publiées PCT WO 91/13972, EPO 550 162 Al, EPO 561 569 A2, EPO 644 263 A2 et EPO 736 598 Al et dans le brevet américain No. 5, 057,419. Le clonage des D12-désaturases à partir de divers organismes est décrit dans la publication de la demande internationale PCT WO 94/11516 et dans le brevet américain No. 5,443,974. Le clonage des D15-désaturases à partir de divers organismes est décrit dans la publication de la demande internationale PCT WO 93/11245. Toutes les publications et brevets ou demandes de brevets américains dont il est question dans la présente description sont incorporés dans cette dernière dans leur totalité par référence. L'une des limitations de l'utilisation de la voie métabolique de levure oléagineuse pour produire des huiles et graisses à haute valeur ajoutée est que les enzymes simples ou multiples requises pour convertir la source de carbone en le produit final sont manquantes. Il est connu depuis longtemps dans la technique de produire de l'huile non observée dans le type sauvage en introduisant génétiquement de l'enzyme nécessaire dans des plantes transgéniques. Cependant, il n'y a pas eu de tentative réussie pour parvenir au même résultat en levure transgénique. La présente invention a pour but de proposer un procédé de fabrication de nouveaux acides gras en levure oléagineuse, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations consistant à : (1) produire une levure oléagineuse en introduisant la levure avec des gènes codant pour des enzymes choisies dans le groupe constitué par la D5- désaturase, la D6-désaturase, la D12-désaturase, la D15-désaturase et l'élongase; et (2) cultiver la levure dans un milieu contenant des 30 taux élevés de sources de carbone. La présente invention a également pour but de proposer des résidus obtenus par le pressage de levure oléagineuse obtenue par le procédé de l'invention. La présente invention a également pour but de proposer des acides gras générés par le procédé de l'invention. L'invention a encore pour objectif de proposer 5 une composition comprenant l'acide gras généré par le procédé de l'invention. Le dessin annexé illustre la présente invention sans toutefois la limiter: - La Figure 1 décrit la voie biosynthétique d'acides gras polyinsaturés n6 and n-3 d'importance physiologique de mammifère; - La Figure 2 décrit la séquence de ADNc de la D6- désaturase de M. alpina (présentée également à la 15 fin de la présente description selon la norme ST.25) - La Figure 3 décrit la séquence d'ADNc la D12- désaturase de M. alpina (présentée également à la fin de la présente description selon la norme 20 ST.25) La Figure 4 décrit des amorces d'ADN utilisées pour la synthèse génique de la D6-désaturase de M. alpina - La Figure 5 décrit des amorces d'ADN utilisées pour 25 la synthèse génique de la D12-désaturase de M. alpina; La Figure 6 décrit la carte de construction de pINAl311-D6; - La Figure 7 décrit la carte de construction de 30 pINAl311-D12; La découverte qu'une souche de la levure oléagineuse a la capacité de se développer sur des sources de carbone bon marché telles que le glucose nous a conduits à développer un système de production d'acides gras insaturés qui peut exprimer des gènes exogènes impliqués dans la biosynthèse des lipides. L'invention consiste à proposer un procédé de fabrication de nouveaux acides gras en levure oléagineuse, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations consistant à : (1) produire une levure oléagineuse en introduisant la levure avec des gènes codant pour des enzymes choisies dans le groupe constitué par la D5- 15 désaturase, la D6-désaturase, la D12-désaturase, la D15-désaturase et l'élongase; et (2) cultiver la levure dans le milieu contenant des taux élevés de sources de carbone. Les gènes exogènes (tels que ceux codant pour des enzymes choisies dans le groupe constitué par la D5-désaturase, la D6-désaturase, la D12désaturase, la D15-désaturase et l'élongase) peuvent être clonés ou modifiés à partir d'autres souches de type sauvage de levure oléagineuse, ou peuvent ne pas exister du tout en levure oléagineuse. L'expression levure oléagineuse utilisée dans la présente invention se rapporte à la levure qui suit, mais sans être limitée: Candida sp., Candida curvata D, Candida curvata 30 R, Candida diddensiae, Cryptococcus (terricolus) albidus var. albidus, Cryptococcus laurentii, Endomycopsis vernalis, Hansenula ciferri, Hansenula saturnus, Lipomyces lipofer, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis (gracilis), Rhodotorula graminis, Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon cutancum, Trichosporon pullulans, Trigonopsis variables, Yarrowia lipolytica et Yarrowia paralipolytica. Dans le procédé de l'invention, la levure oléagineuse préférée est Yarrowia lipolytica. Conformément à l'enseignement des exemples, la levure oléagineuse utilisée dans l'invention pourrait exprimer des enzymes exogènes telles que la D6-désaturase, la D5-désaturase, la D12-désaturase, la D15- désaturase et l'élongase. L'enzyme préférée devant être exprimée dans la levure oléagineuse est la D6-désaturase et la D12-désaturase. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, la D6-désaturase a la séquence telle que décrite sur la Figure 2. Introduire la D12-désaturase dans la levure oléagineuse peut augmenter la production de métabolites en aval (tels que LA, ALA et GLA). Le gène codant pour la D12-désaturase peut provenir de levure oléagineuse ou d'autres organismes. Dans le procédé de l'invention, la source de carbone (source de glucide) du milieu comprend, mais sans y être limité, un hexose, tels que le glucose, le fructose, le galactose, le mannose, etc. ou un disaccharide tel que le sucrose. L'hexose préféré est le glucose. Pour tester la production d'huile des levures oléagineuses, plusieurs souches de Yarrowia lipolytica ont été testées dans plusieurs milieux. Les souches soumises à l'examen sont ATCC8662, ATCC20226, ATCC48436 et po 1 f (un don de LGMC, INRA-CNRS, CBAI, INA P-G, Thiverval Grignon, France). Il a été découvert qu'en milieu riche en nutrition, par exemple YPD, Y. lipolytica se développe plus vite mais produit moins l'huile (données non présentées). En milieu restreint en source d'azote, Y. lipolytica peut produire de grandes quantités de graisse. Parmi toutes, les levures en milieu contenant une source d'azote restreinte, par exemple, 1/50 YPD, se développent le mieux. Le milieu YNB ou le milieu à haute teneur en sel suggéré dans Papanikolaou et Aggelis, 2002 ont été trouvé comme n'étant pas appropriés pour supporter la production de graisse (données non représentés). Par conséquent, nous sommes arrivés à la conclusion qu'une petite quantité de YP (1/2-1/1000) et un taux supérieur de glucose dans le milieu sont suffisants pour que Y. lipolytica génère de la graisse et en même temps nécessite un moindre coût. En conséquence, dans le procédé de l'invention, le taux élevé de sources de carbone est défini comme étant au moins 3 fois supérieur à la concentration de la source d'azote. À partir des expériences ci-dessus, le résultat de la production de graisse de Y. lipolytica peut être résumé comme indiqué dans le Tableau 1. Tableau 1. Croissance de la levure, production de OA et LA dans différents milieux Croissance Production Rendement de de graisse conversion de OA en LA Milieu YL ++ ++ +++ YPD ++++ + + YPD dilué +++ ++++ ++ YNB* + + +++ 9/10 YPD + 1/10 +++ ++ ++ YL *YNB est un milieu utilisant une base d'azote de levure (Yeast Nitrogen Base) comme source d'azote. Une pression de la levure oléagineuse transgénique seule peut ne pas extraire totalement l'huile à haute valeur ajoutée générée par le procédé de l'invention. Par conséquent, le résidu de la levure pressée, qui contient un peu de l'huile à haute valeur ajoutée, pourrait avoir une applicabilité industrielle et peut être utilisé dans l'alimentation humaine et animale, la médecine, la cosmétique ou l'alimentation de santé et la diététique. En conséquence donc, la présente invention porte également sur des résidus qui sont obtenus par le pressage de levure oléagineuse produite par le procédé de l'invention. La présente invention a également pour objectif de proposer des acides gras qui sont générés par le procédé de l'invention. En particulier, ces acides gras sont choisis dans le groupe constitué par l'acide gammalinolénique (GLA), l'acide alpha-linolénique (ALA), l'acide dihommogamma-linolénique (DGLA), l'acide arachidonique (AA), l'acide eicosatriénoïque (EPA), l'acide adrénique, l'acide docosa-hexaenoïque (DHA) et l'acide pinolénique. Les acides gras préférés générés par le procédé de l'invention sont le GLA, l'ALA ou l'acide pinolénique. Des huiles supplémentaires choisies dans le groupe constitué par l'huile de son de riz, l'huile de sésame, l'huile de poisson, l'huile de bourrache, l'huile d'onagre et l'huile de cassis pourraient être ajoutées à la composition de l'invention pour obtenir des avantages supplémentaires. La présente invention porte aussi sur des compositions comprenant les acides gras tels que définis ci-dessus, comme un acide gras choisi dans le groupe constitué par le GLA, l'ALA et l'acide pinolénique ou un acide gras choisi dans le groupe constitué par le GLA et l'acide pinolénique, le rapport du GLA à l'acide pinolénique pouvant notamment être de 10:1 à 1:10. Exemples Exemple 1: Clonage de la D6-désaturase La levure oléagineuse Y. lipolytica a été de trouvée produire le LA mais non des acides gras en aval de la voie représentée sur la Figure 1, tels que le GLA. La levure oléagineuse Y. lipolytica a été trouvé en manque de D6-désaturase, qui est l'enzyme critique responsable de la conversion de l'acide linoléique (LA) en GLA. Par conséquent, nous avons recherché à générer Y. lipolytica transgénique qui produit le GLA par l'introduction d'un produit de construction d'expression contenant la séquence d'ADNc de D6-désaturase dans Y. lipolytica. La procédure de clonage était la suivante: 25 Synthèse génique de Delta 6 and Delta 12 désaturases de M. alpina 1. La séquence d' ADNc de la D6-désaturase de M. alpina a été trouvée dans la base de données GenBank. La séquence d'ADNc de la D6- désaturase est représentée sur la Figure 2. 2. Conception de l'amorce: 60-mère comme unité, 20 paires de bases (bp) comme espace non superposé entre 2 unités. 60mer 30 3. Mélanger ensemble toutes les amorces et effectuer la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). À l'aide du premier produit PCR comme matrice, effectuer la seconde réaction PCR telle que dirigée par le document de référence: Assemblage en une seule étape d'un gène et d'un plasmide entier à partir de grands nombres d'oligodésoxyribonucléotides (Singlestep assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides) Gene. 1995 16:4953. 4. Cloner et séquencer les produits PCR, sélectionner les bons gènes de la D6-désaturase et de la D12-désaturase pour une nouvelle étude. La procédure ci-dessus peut être résumée comme suit: Synthèse génique PCR Clonage et séquençage d' ADN Sous-cloner les gènes dans des vecteurs d' expression plNA1311 Agencer des amorces: 60-mères, chevauchement avec un espace de 20bp Exemple 2: Construction des vecteurs d'expression pINA1311D6 et pINA1311-D12 Tableau 2. amorces pour la construction des vecteurs. Nom de Séquence Note l'amorce D6F 5'- AATGGCTGCTGCTCCCAGTGTG - Delta- 6 amorce 3' directe D6R 5'- TTACTGCGCCTTACCCATCTTG - Delta-6 amorce 3' inverse D12F 5'- AATGGCACCTCCCAACACTATC - Delta-12 3' amorce directe D12F 5'- TTACTTCTTGAAAAAGACCAC -3' Delta-12 amorce inverse 1. Construction du vecteur pINA1311-D6 Le vecteur pINA1311 (un don de LGMC, INRA-CNRS, CBAI, INA P-G, Thiverval Grignon, France, un système de vecteur décrit dans FEMS Yeast research 2: 371-379) est digéré par l'enzyme de restriction PmlI, dans le tampon de réaction de 100pl: 1X NEBuffer I. 1mM MgCl2 20pg pINC1311. 20U PmlI. 2U phosphatase alcaline de crevette (shrimp alkaline phosphatase) (SAP) ,37 C, 16h, à l'aide des kits d'extraction sur Gel ( Viogene) pour récupérer pINAl3110 Le gène de la Delta-6 désaturase a été amplifié par PCR avec D6F and D6R comme amorces, dans le tampon de réaction de 50 pl: 20mM Tris- HC1 (pH 8,8 à 25 C), 10mM (NH4) 2SO4, 10mM KC1, 0,1% Triton X-100, 0,lmg/ml BSA, 20mM MgSO4, 0,4pM amorce, 0,2mM dNTP, 2,5U Pfu ADN polymérase ( MBI Fermentas), 95 C 5min > 95 C 30sec > 55 C 30sec > 68 C 2.5min * 68 C 7min * 4 C t I 30 cycles Purifier le produit de Delta-6 PCR (kits d'extraction sur gel), phosphoryler l'extrémité 5' dans le tampon de réaction de 1041: 1X T4 kinase tampon, 1mM ATP, 441 produit de PCR, 12,5U T4 kinase, 37 C, 16h. Purifier avec des kits d'extraction sur gel. Dans la réaction de ligation, le rapport de pINA1311:Delta-6 est de 1:9, dans un tampon de réaction de ligation de 10p1: 40mM Tris-HC1, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0,5mM ATP, 5% PEG4000, 3U ADN ligase T4, 22 C, 30min. Prendre 5pl de produit de ligation et mélanger avec 100pl de cellules compétentes,le protocole de transformation est: 30 min bain de glace 45sec 42 C choc thermique, 30min bain de glace. Cultiver sur plaque d'agarose LBKm(avec 25pg/ml de kanamycine)de 20ml. Réaliser une PCR sur colonie le jour suivant à l'aide de D6R, 1311-SF comme ensemble d'amorces. Identifier les clones positifs par séquençage. 2. Construction du vecteur pINAl311-D12 Le vecteur pINA1311 (un don de LGMC, INRA-CNRS, CBAI, INA P-G, Thiverval Grignon, France, un système de vecteur décrit dans FEMS Yeast research 2: 371-379) est digéré par l'enzyme de restriction PmlI, dans le tampon de réaction de 100p1 1X NEBuffer I, 1mM MgC12, 20pg pINC1311, 20U PmlI, 2U phosphatase alcaline de crevette (shrimp alkaline phosphatase) (SAP) ,37 C, 16h. Utiliser des kits d'extraction sur gel ( Viogene) pour récupérer pINA1311. Le gène de Delta-12 désaturase est amplifié par PCR avec D12F et D12R comme amorces, dans le tampon de réaction de 50 pl: 20mM Tris-HC1 (pH 8.8 at 25 C), 10mM (NH4)2SO4, 10mM KC1, 0,1% Triton X-100, 0,lmg/ml BSA, 20mM MgSO4, 0,4pM amorce, 0,2mM dNTP, 2,5U Pfu ADN polymérase ( MBI Fermentas) 95 C 5min --> 95 C 30sec --> 55 C 30sec > 68 C 2.5min > 68 C 7min -+ 4 C t I 30 cycles Purifier le produit Delta-12 PCR (kits d'extraction sur gel), phosphoryler l'extrémité 5' dans le tampon de réaction de 100p1: 1X T4 kinase tampon, 1mM ATP, 40pl produit de PCR, 12.5U kinase T4, 37 C, 16h. Purifier par des kits d'extraction sur gel. Dans la réaction de ligation, le rapport de INA1311: Delta-12 est de 1:9, dans un tampon de réaction de ligation de l0pl: 40mM Tris-HC1, 10mM MgC12, 10mM DTT, 0.5mM ATP, 5% PEG4000, 3U ADN ligase T4, 22 C, 30min. Prendre 5pl de produit de ligation et mélanger avec 100p1 de cellules compétentes. Le protocole de transformation est: 30 min bain de glace -> 45sec 42 C choc thermique, 30min bain de glace. Cultiver sur plaque d'agarose LBKm(avec 25ug/ml de kanamycine) de 20ml. Réaliser une PCR sur colonie le jour suivant à l'aide de D12R. 1311-SF comme ensemble d'amorces. Identifier les clones positifs par séquençage avec l'amorce 1311-SF and 1311-SR. Exemple 3: Transformation de Y. lipolytica à l'aide du vecteur d'expression pINA1311-D6 et pINA1311-D12 Transformation de Y. lipolytica Matériels et méthodes Plaque YNBD+CG ( 1 1) Tampon de transformation en une étape Base d'azote de levure(w/o PEG 50% a.a 1,7 g 2M LiOAc 2M DTT et A.S.) Sulfate d'ammonium 5 g Acide casamino 1 g SSADN (10 - 12K) Glutamate de sodium 1 g glucose 2% agarose 2% a.a. Protocole de transformation 1. Sélectionner plusieurs colonies de levures (Po 1 f) . Dissoudre dans 1 ml ddH2O, faire tourbillonner pendant plusieurs secondes. 2. Vérifier la densité cellulaire sous microscope. Ajuster 20 la densité cellulaire à 1 - 5 X 10' / ml. 3. Cultiver chaque plaque de YPD avec une partie aliquote de 100 pl (1 - 5 X 106 / plaque). Faire incuber à 28 C pendant 20 - 24 heures. 4. Faire digérer le pINA1311D6 et le pINA1311D12 avec Not I R.E. La concentration finale est de 0,2 dag / dal. 5. Retirer les cellules de la plaque par grattage à l'aide d'une brosse à dents. Dissoudre les cellules dans 1 ml de ddH2O. Calculer la densité cellulaire. 6. Faire précipiter par centrifugation environ 5 X 10' cellules(3000 g, 5min. ) . Mettre au rebut le surnageant. Mélanger avec le tampon: PEG 50% 90 L LiOAc (2M) DTT (2M) SSADN (10K) Vecteur digéré (linéarisé) R.E. 5 pL 7. Bien mélanger par tourbillonnement à 39 C sur un bain d'eau pendant 1 heure. 8. Cultiver sur plaque de gélose YNBD+CG. Faire incuber à 28 C ou 30 C. 9. Des colonies transformées par un vecteur en monocopie apparaîtront au deuxième et au troisième jour. Le rendement est d'environ 1034/microgramme de vecteur. Exemple 4: Production de graisse et analyse de l'activité D6 désaturase Y. lipolytica polf a été transformé par les vecteurs pINAl311-D6 pour obtenir Y. lipolytica transformé pour la production de D6 désaturase. Culture et analyse de transformants p1311-D6 et p1311 D12 de Polf 1. Prendre au hasard 6 transformants de pINA1311D6 et pINA1311D12. Cultiver et analyser 2 fois. 2. Inoculer une simple colonie de transformants de polf de p1311-D6 et p1311-D12 dans un ballon de 50ml qui contient 10ml de YPD à la température ambiante. Secouer à 200 tpm, pendant toute une nuit. L 5 L 2,5 L 3. Effectuer une sous-culture de 5 x 10' - 1 x 108 cellule dans 50 ml d'un milieu YPD modifié (1/50 YP + D dans un ballon de 250m1) à la température ambiante. Secouer à 200 tpm pendant 48 heures. 4. La méthode d'analyse: les lipides sont extraits conformément au protocole de Folch et al., J Biol Chem 226:497-509, 1957. La méthylation de lipides est effectuée conformément à Morrison et al., J Lipid Res 5:600-608, 1964 ou Metcalfe et al., Anal Chem 38:514- 515, 1966. L'analyse GC est effectuée d'après le protocole suivant: les acides gras ont été quantifiés à l'aide d'un appareil de chromatographie en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne capillaire en silice fondue. La température de l'injecteur et du détecteur est de 23 C. L'ester méthylique d'acide gras a été identifié par comparaison du temps de rétention de pics échantillons avec des pics de standards du commerce. 5. Les résultats sont résumés dans les tableaus ci-après: 20 Tableau 3 Culture et analyse de transformants pINA1311D6 de polf. Échantillon No. D6-1 D6-2 D6 -3 D6-4 D6-5 D6-6 OA( acide oléique, 48, 13 46,80 47,66 45,30 48,96 47,44 C18:1w9) dans TG (%) 17,93 18,87 19, 84 22,25 19,67 20,21 LA( acide linoléique, C18:2w6) dans TG (%) GLA( acide y-linolénique 18:3w6) dans TG (%) 1,71 1,77 0,29 0,24 0,26 0,29 D6 taux de conversion (%) 8,69 8,57 1,44 1,07 1,.30 1,44 OA in TG (%) 48,13 46,80 47, 66 45,30 48,96 47,44 LA +GLA in TG (%) 19,64 20,64 20,12 22,50 19,93 20, 50 OA+LA+GLA in TG (%) 67,77 67,44 67,79 67,79 68,89 67,94 D12 taux de conversion 28,98 30,60 29,69 33,18 28,93 30,18 (%) Conversion moyenne (%) 30,26 Ecart-type 1,57 Table 4 - Culture et analyse de transformants pINA1311D6 de polf. Echantillon No. D6-1 D6-2 D6 -3 D6-4 D6-5 D6-6 OA( acide oléique, 46, 64 45,62 47,04 45,01 47,55 46,63 C18:1w9) dans TG (%) 18,89 19,82 20, 47 22,54 21,11 21,09 LA( acide linoléique, C18:2w6) dans TG (%) GLA(acide y-linolénique, C18:3w6) dans TG (%) 1,78 1,82 0,27 0,23 0,28 0,27 D6 taux de conversion (%) 8,63 8,43 1,30 0,99 1,29 1,25 OA dans TG (%) 46,64 45, 62 47,04 45,01 47,55 46,63 LA +GLA dans TG (%) 20,67 21,64 20,74 22,77 21, 38 21,36 0A+LA+GLA dans TG (%) 67,31 67,27 67,77 67,78 68,93 67,98 D12 taux de conversion 30,71 32,18 30,60 33,59 31,02 31,42 (%) Conversion moyenne (%) 31,59 Ecart-type 1,14 Table 5 - Culture et analyses de transformants pINA1311D12 de polf. EchantillonNo. D12- 1 D12-2 D12-3 D12-4 D12-5 D12-6 OA( acide oléique, 41, 95 42,66 42,43 39,77 42,48 41,63 C18:1w9) dans TG (%) 27,33 25,45 25, 58 29,13 27,37 26,89 LA( acide linoléique, C18:2w6) dans TG (%) D6 taux de conversion (%) Non détectable OA dans TG (%) 41,95 42,66 42,43 39,77 42,48 41,63 27,33 25,45 25,58 29,13 27,37 26,89 69,28 68,10 68,01 68,89 69,85 68,52 LA +G dans TG (%) OA+LA+GLA dans TG (%) D12 taux de conversion 39, 45 37, 36 37, 61 42, 28 39, 18 39, 25 (%) Conversion moyenne (%) Ecart-type 1,76 Table 6 - Culture et analyse de transformants pINA1311D12 de polf. Sample No. D12- 1 D12-2 D12 -3D12 -4D12- 5D12 -6 OA( acide oléique, 44, 42 43,91 43,51 25,25 24,68 24,89 C18:1w9) dans TG (%) 45,15 42,93 43,87 23,55 25,62 25,39 LA( acide linoléique, C18:2w6) dans TG (%) D6 taux de conversion Non détectable (%) OA dans TG (%) (%) 44,42 43,91 45,15 42, 93 43,87 43,51 LA +GLA dans TG (%) 25,25 24,68 23,55 25,62 25,39 24,89 OA+ LA+GLA dans TG 69,67 68,58 68,70 68,55 69,26 68,40 D12 taux de conversion 36,25 35,98 34,28 37,37 36,66 36,39 (%) Conversion moyenne (%) 36,15 Ecart-type 1,04 Il est montré que Y. lipolytica a produit une grande quantité de graisse dans un milieu YPD dilué. Après calcul, environ 3040% du poids net de la levure extraite est constitué par de la graisse. Parmi la graisse, 65-75% représente TG. L'activité D6-désaturase a été mesurée comme la conversion de LA en GLA. En comparant avec le témoin, les transformants D6-1 et D6-2 ont présenté une activité significative (environ 8-9% de LA ont été convertis en GLA), alors que les témoins ont ont montré seulement 1,0%-1,5% d'activité. Il y a une variation parmi les transformants D6. La souche hôte po 1 f (données non présentées) et ses transformants D12 n'ont pas montré d'activité D6-désaturase détectable. L'activité D12-désaturase a été trouvé être augmentée dans les transformants D12-1-6 (convertissant OA-->LA). Lors d'une comparaison avec le groupe témoin D6- 1-6, les activités de la D12-désaturase dans toutes les souches transformantes D12 ont été augmentées. Parmi toutes les souches, l'activité de la D12-désaturase dans D12-4 a augmenté le plus. Il y a eu également une variation de l'activité de la Dl2 désaturase parmi les transformants. Pour résumer les exemples ci-dessus, les inventions ont démontré une nouvelle stratégie d'amélioration de la quantité et de la qualité de l'huile produite par la levure transgénique. La production de LA a augmenté par comparaison avec son témoin hôte et le GLA peut-être produit par introduction du gène exogène de D6 désaturase. Les deux découvertes indiquent un nouveau procédé qui augmente la masse (pool) d'huile et produit également une nouvelle huile. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication de nouveaux acides gras en levure oléagineuse, caractérisé par le fait qu'il comprend les opérations consistant à : (1)produire une levure oléagineuse en introduisant la levure avec des gènes codant pour des enzymes choisies dans le groupe constitué par la D5désaturase, la D6-désaturase, la D12-désaturase, la D15-désaturase et l'élongase; et (2)cultiver la levure dans le milieu contenant des taux élevés de sources de carbone. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le taux élevé de sources de carbone est défini comme étant au moins 3 fois plus élevé que la concentration de la source d'azote. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la levure oléagineuse est choisie dans le groupe constitué par Candida sp., Candida curvata D, Candida curvata R, Candida diddensiae, Cryptococcus (terricolus) albidus var. albidus, Cryptococcus laurentii, Endomycopsis vernalis, Hansenula ciferri, Hansenula saturnus, Lipomyces lipofer, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis (gracilis), Rhodotorula graminis, Rhodotorula 25 mucilaginosa, Trichosporon cutancum, Trichosporon pullulans, Trigonopsis variables, Yarrowia lipolytica et Yarrowia paralipolytica. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la levure oléagineuse est Yarrowia 30 lipolytica. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'acide gras est choisi dans le groupe constitué par l'acide gamma-linolénique (GLA), l'acide alpha-linolénique (ALA), l'acide dihommo-gamma-linolénique (DGLA), l'acide arachidonique (AA), l'acide eicosatriénoïque (EPA), l'acide adrénique, l'acide docosa-5 hexaénoïque (DHA) et l'acide pinoléique. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'enzyme est choisie dans le groupe constitué par la D6-désaturase, la D5désaturase, la D12-désaturase, et la D15-désaturase. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la D6désaturase a la séquence telle que décrite à la Figure 2. 8 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la source de carbone est l'hexose or le 15 disaccharide. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'hexose est le glucose, le disaccharide est le sucrose. - Résidu qui est obtenu par le pressage de la 20 levure oléagineuse obtenue par le procédé tel que défini à la revendication 1. 11 - Résidu selon la revendication 10, qui est utilisé en alimentation humaine et animale, médecine, cosmétique ou alimentation de santé et diététique. 12 - Acide gras généré par le procédé tel que défini à la revendication 1. 13 - Acide gras selon la revendication de 12, caractérisé par le fait qu'il est choisi dans le groupe constitué par l'acide gamma-linolénique (GLA), l'acide alpha-linolénique (ALA), l'acide dihommo-gamma-linolénique (DGLA), l'acide arachidonique (AA), l'acide eicosatriénoïque (EPA), l'acide adrénique, l'acide docosahexaénoïque (DHA) et l'acide pinoléique. 14 - Acide gras selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il est choisi dans le groupe constitué par le GLA, l'ALA et l'acide pinolénique. - Composition comprenant les acides gras tels que définis à la revendication 13. 16 - Composition selon la revendication 15, caractérisée par le fait qu'elle comprend un acide gras choisi dans le groupe constitué par le GLA, l'ALA et l'acide pinolénique. 17 - Composition selon la revendication 16, caractérisée par le fait est qu'elle comprend un acide gras choisi dans le groupe constitué par le GLA et l'acide pinolénique. 18 - Composition selon la revendication 17, 15 caractérisée par le fait que le rapport du GLA à l'acide pinolénique est de 10:1 à 1:10.