Brevet FR2861178A1 — publié le 20050422

La présente invention concerne le domaine technique des microplaques, et plus particulièrement des supports de cartes d'analyse, nommées communément microplaques. Les cartes d'analyse permettent l'analyse d'un ou plusieurs échantillons liquides différents, dans lequel on cherche à identifier un ou plusieurs analytes, selon tous les processus simples ou complexes d'analyse mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents selon la nature chimique, physique ou biologique du ou des analytes recherchés. Les cartes d'analyse ne sont pas, en général, limitées à un analyte particulier, la seule condition requise est que l'analyte soit distribué dans l'échantillon à analyser en suspension ou en solution. En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut être effectué, sous forme homogène, hétérogène ou mixte. Une carte d'analyse peut, par exemple, permettre l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou leur quantification, l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Aussi, dans ce cas, les cartes d'analyse présentent en surface des ligands biologiques possédant au moins un site de reconnaissance leur permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Comme exemples d'application des techniques d'analyse, on peut citer les immuno essais, la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques, les tests enzymatiques... En terme de réalisation, ces cartes d'analyse peuvent se présenter sous différentes formes, par exemple carrée, rectangulaire ou circulaire. Ces cartes sont constituées d'un support et éventuellement d'un couvercle. Le support, nommé également microplaque, est souvent muni d'une pluralité de puits et/ou canaux dans lesquels les différents processus d'analyse sont mis en oeuvre. Les supports des cartes d'analyse et des microplaques sont en général réalisés par usinage de matériaux choisis parmi le verre, le quartz, le silicium, éventuellement revêtu d'une couche d'oxyde ou de nitrure ou bien dans des polymères du type polystyrène ou matériaux plastiques du type polycarbonate ou polymère hydrocarboné comme les polyoléfines, présentant une surface hydrophobe. Le plus souvent, pour permettre la fonctionnalisation du support avec les ligands biologiques souhaités, il est nécessaire, en préalable, de modifier physiquement ou chimiquement la surface du support. Ces modifications sont bien souvent lourdes à mettre en oeuvre et dépendent de la nature du ligand biologique que l'on veut greffer. L'étape de greffage ou d'immobilisation, risquant d'altérer les ligands biologiques, il est souvent nécessaire de contrôler la qualité des ligands biologiques sur la microplaque fonctionnalisée finale. Dans ce contexte, un des objectifs de la présente invention est de fournir un procédé de fabrication de microplaques aisé, peu coûteux, facilement industrialisable, s'adaptant à différents types de ligands réactifs. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé permettant de fonctionnaliser différemment la microplaque sur certains sites localisés. Pour atteindre les objectifs ci-dessus mentionnés, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une microplaque en élastomère présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, d'au moins un type de ligands réactifs, et qui comprend les étapes successives suivantes: a) déposer sur une empreinte destinée à servir de contremoule pour la grande face active, selon des sites localisés, une solution aqueuse contenant: - un solvant organique dont la température d'ébullition et la viscosité sont supérieures à celles de l'eau, - un sel, apte à cocristalliser avec le solvant organique lors de l'étape b) ultérieure, et - des particules micrométriques en surface ou à l'intérieur desquelles des ligands réactifs sont immobilisés; b) évaporer la solution aqueuse, à une température T suffisante mais inférieure à la température d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, de façon à obtenir sur les sites localisés une cocristallisation du solvant organique et du sel autour des particules micrométriques; c) polymériser l'élastomère sur l'empreinte servant de contremoule pour la microplaque, de façon à ce qu'il vienne recouvrir les sites localisés et épouser la 30 forme de l'empreinte; d) démouler la microplaque en élastomère obtenue, les particules micrométriques étant partiellement emprisonnées sur la face active de la microplaque, au niveau des sites localisés, au moins une partie des ligands réactifs étant accessibles pour une réaction ultérieure. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. Cette microplaque est essentiellement constituée d'un élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface ou à l'intérieur desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. La description ci-après, en référence aux figures annexées, va permettre de mieux comprendre l'invention. La Fig. 1 est un schéma illustrant les étapes (A), (B) et (C) de la fabrication d'une microplaque avec un réseau faible densité de sites localisés. (D) est la micrographie du réseau révélé par chimiluminescence. La Fig. 2 illustre différentes variantes de microplaques selon l'invention, fonctionnalisées avec différents ligands biologiques. La Fig. 3 est un schéma illustrant les étapes (A), (B) et (C) de la fabrication d'une microplaque avec un réseau de sites localisés à fluidique active. (D) est la micrographie du réseau révélé par chimiluminescence. La Fig. 4 illustre les performances de microplaques selon l'invention, fonctionnalisées avec différents ligands biologiques. Les microplaques, fabriquées selon le procédé de l'invention, peuvent être de différentes formes: carrées, rectangulaires, sous la forme d'un disque. Elles présentent deux grandes faces: l'une dite inerte qui est généralement plane et une dite active sur laquelle sont fixés des ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. La première étape du procédé, nommée étape a), consiste à déposer sur une empreinte et sur des sites localisés, une solution aqueuse contenant des microbilles porteuses de ligands réactifs. L'empreinte va servir de contre-moule pour la face active : elle peut donc être plane ou non plane et comporter, notamment, l'empreinte négative de puits ou canaux. De préférence, cette empreinte sera en un matériau présentant une bonne mouillabilité, tel que le PVC. La solution déposée contient un solvant organique et un sel destinés à cocristalliser autour des microbilles et ainsi les protéger lors des étapes ultérieures du procédé. Le solvant organique doit présenter une température d'ébullition et une viscosité supérieures à celles de l'eau. De préférence, le solvant organique présente une température d'ébullition, à pression atmosphérique, supérieure à 150 C. Sa viscosité est élevée et plus particulièrement, sa viscosité Brookfield mesurée à 20 C sera supérieure à 100 cps (centipoises). En tant que solvant organique adapté au procédé de l'invention, on peut citer la série des tween , en particulier le tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate), le tween 80 (polyoxyéthylène sorbitan monooléate), la série des triton (alkylarylpolyether alcool), en particulier le triton X100, les polyéthylèneglycol diacides, le glycérol... On utilise, de préférence du glycérol en tant que solvant organique et du chlorure de sodium (NaCl) en tant que sel. Avantageusement, un rapport molaire glycérol/NaCl compris entre 0,05 et 0,1 est utilisé. Par particules micrométriques, on entend des particules dont le diamètre moyen est inférieur ou égal à 1000 m. Les particules micrométriques utilisées ont, par exemple, un diamètre moyen inférieur à 500 m, de préférence compris entre 1 et 150 m. L'expression particules micrométriques englobe les particules de taille nanométrique, notamment de diamètre inférieur à 1 m. Ces particules micrométriques sont, avantageusement, en un polymère, tel que le latex, les polyosides, ou dans tout autre matériau, comme le verre par exemple. Les particules peuvent être de n'importe quelle forme, les particules de forme sphérique, nommées billes ou microbilles sont, néanmoins, préférées. Des ligands réactifs sont immobilisés en surface ou à l'intérieur de ces 25 particules. Certes, de façon préférentielle, les ligands réactifs sont des ligands biologiques. Néanmoins, on peut envisager d'utiliser d'autres ligands du type pesticides, métaux lourds, polymères, récepteurs synthétiques... Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple, on peut citer les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes et les cellules vivantes actives. Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique, au niveau du squelette. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides. Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un 25 anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires, les enzymes. Au sens de l'invention, le terme immobilisé désigne tout type 30 d'interactions, telles que des interactions électrostatiques, des interactions de Van Der Waals, des liaisons hydrogène, des liaisons hydrophobes, des complexations, des liaisons chimiques covalentes, des réactions moléculaires, des adsorptions physiques, permettant l'immobilisation. L'immobilisation peut donc être effectuée par tout moyen. L'immobilisation peut être réalisée de façon à ce que les ligands réactifs restent en surface de la particule ou bien soient à l'intérieur de celles-ci, par exemple emprisonnés dans les pores tout en restant accessibles pour des réactions ultérieures. Les ligands réactifs peuvent en particulier être greffés chimiquement sur les particules, par couplage classique, éventuellement précédé d'une étape d'activation. Dans ce cas, avant couplage, les particules sont porteuses de groupements fonctionnels tels que des groupements carboxylique, amine, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, époxyde ou anhydride à même de greffer au moins un ligand réactif. Dans le cas des enzymes, l'immobilisation sur les particules est le plus souvent réalisée par liaison électrostatique, mais peut être également de nature covalente. On pourra notamment se référer à Biosens. & Bioelectron. (2000), 15, 125-133; Anal. Lett. (2000), 33(9), 1779-1796 et Sensors and actuators B (2003), 90(1-3), 112-117 qui décrivent des exemples de telles particules fonctionnalisées. La fonctionnalisation a donc lieu directement sur les particules et non en étape finale sur la microplaque. De ce fait, il est possible d'effectuer en amont une chimie variée et de mieux maîtriser la nature et la qualité des ligands réactifs présents en surface de la microplaque. Le dépôt de la solution contenant les particules se fait simplement en déposant des gouttes sur les sites localisés désirés. En général, lorsque l'empreinte est non plane, les dépôts sont réalisés, avantageusement, au niveau des contre-empreintes des puits ou microcanaux. Il est possible de déposer une solution contenant différentes particules, par exemple, porteuses de différents ligands réactifs. Une autre variante consiste également, à déposer une solution contenant des particules porteuses de certains ligands réactifs, sur certains sites localisés et une autre solution contenant d'autres particules porteuses d'autres ligands réactifs sur d'autres sites localisés. La seconde étape du procédé, nommée étape b), consiste à chauffer la surface de l'empreinte sur laquelle sont déposées les gouttes, afin d'évaporer la phase aqueuse et obtenir la cocristallisation du solvant et du sel. Ces derniers viennent entourer les particules, assurant ainsi leur protection, notamment lors de l'étape suivante du procédé. La température de chauffage doit être suffisante pour obtenir cette cocristallisation, mais inférieure au point d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, dans les conditions de pression utilisées. En général, cette température sera de l'ordre de 70-80 C, pour un chauffage effectuée à pression atmosphérique. Une lampe à Tungsten pourra, par exemple, être utilisée pour le chauffage. La troisième étape, nommée étape c), consiste à mouler l'élastomère à la surface de l'empreinte fonctionnalisée avec les particules. Un élastomère peut être défini comme un matériel macromoléculaire qui, à température ambiante, est capable de recouvrir sa forme et sa taille initiale après avoir été déformé par une force d'étirement. Son moulage sur une empreinte en trois dimensions permet d'obtenir des facteurs de forme élevés. On peut citer les élastomères du type polyuréthane (notamment commercialisé par ASMA), polyether (notamment commercialisé par NUTEC), polyester (notamment commercialisé par Harvest), SU-8 photorésine ou polydiméthylsiloxane (PDMS). Le PDMS est particulièrement préféré. La polymérisation est, le plus souvent, réalisée par dépôt sur l'empreinte d'une solution contenant un prépolymère de l'élastomère, en combinaison avec un catalyseur de polymérisation, suivi d'un chauffage. De telles solutions sont notamment disponibles dans le commerce: on peut, par exemple, citer, dans le cas du PDMS, SYLGARD 184 commercialisée par DOW CORNING. Dans la cas du PDMS, cette polymérisation est réalisée par chauffage à une température comprise entre 70 et 90 C et pendant une durée comprise entre 20 et 30 mn. Le chauffage est précédé d'un dégazage sous pression réduite. Les conditions sont choisies par l'homme du métier pour obtenir la polymérisation de l'élastomère choisi. En polymérisant, l'élastomère, et notamment le PDMS, vient emprisonner partiellement les particules. Le solvant et le sel viennent se solubiliser dans le PDMS. Une fois la polymérisation achevée, on refroidit pour avoir durcissement de l'élatomère et autoriser le démoulage. Ainsi, après démoulage, on obtient une microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures. Cette microplaque est essentiellement constituée d'élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. D'une manière générale, le relief des microplaques non-planes selon l'invention peut comprendre un circuit fluidique à base d'éléments tels que des canaux ou microcanaux, des vannes ou des intersections de canaux (en forme de T, en forme de Y ou en forme de croix), des parties de circuit qui autorisent l'incubation (des puits ou des canaux serpentant) ou la séparation (des longueurs de canaux équivalents à des colonnes par exemple). Ces microplaques constituent un autre aspect de l'invention. Leur épaisseur varie, de préférence, entre 1 et 5 mm. De façon avantageuse, les particules micrométriques émergent, pour majorité, de la face active de la microplaque d'au moins 10 % de leur diamètre. Le procédé selon l'invention permet de préparer des microplaques compartimentées. En effet, il est possible de déposer des particules de nature différente, c'est à dire porteuses de ligands réactifs différents, sur certains sites localisés, en fonction de l'application visée pour la microplaque. Dans le domaine du diagnostic, le procédé selon l'invention permet de fabriquer des microplaques capables d'effecteur différentes analyses sur un échantillon. Les exemples ci-après illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les anticorps anti-IgG humaine (spécifiques de chaîne y) marqués par la biotine, les oligonucléotides d(T)22 marqués par la biotine, la glucose oxydase (Gox, qualité I, EC 1.1.3.4, de Aspergillus niger), les IgG humaines, le luminol (3-aminophthalhydrazide), la streptavidine marquée par la peroxydase, les billes de Sepharose portant une IgG humaine, les billes de Sepharose portant d(A)22 ont été achetés chez Sigma (France). DEAE (diéthylaminoéthyl) Sepharose Fast Flow et IDA (acide imidodiacétique) Sepharose Fast Flow ont été obtenus auprès de Pharmacia. Le précurseur de PDMS et l'agent de durcissement (Sylgard 184) ont été fournis par Dow Corning. Tous les tampons et solutions aqueuses ont été préparés avec de l'eau déminéralisée distillée. Exemple 1: Préparation de microbilles bioactives 1 a) Des microbilles portant de la glucose oxydase (Gox) ont été préparées par interaction de IDA-Sepharose chargé avec Ni avec Gox modifiée avec l'histidine. Le greffage d'histidine sur Gox a été réalisé au moyen d'un procédé décrit antérieurement pour modifier la peroxydase de raifort (T V.C. Safack, C.A. Marquette, F. Pizzolato et L.J. Blum, Biosens. & Bioelectron., 15 (2000) 125). En bref, 5 mg de Gox dissous dans 200 l d'eau distillée et 80 l d'une solution 0,1 M de NaIO4 ont été ajoutés et mélangés sous agitation pendant 20 min. Puis, 40 l d'une solution 0,2 M d'histidine dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9, et 480 l de tampon carbonate 0,1 M, pH 9, ont été ajoutés à la glucose oxydase activée et incubés 2 h sous agitation. A ce moment, la réaction était complète et 20 l de solution 0,1 M de NaBH4 dans l'eau fraîchement préparée ont été ajoutés et mélangés pendant 15 min pour stabiliser la liaison de l'histidine à la Gox activée. La Gox-His a ensuite été séparée des espèces qui n'avaient pas réagi par élimination des sels sur une colonne de Sephadex G25-M. Ensuite, 500 l de microbilles de IDA-Sepharose ont été équilibrés avec du tampon Veronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5 et perfusés avec une solution de NiC12 100 mM. Sur la colonne de Ni-IDA-Sepharose ainsi obtenue, 5 mg de Gox-His débarrassée des sels comme décrit ci-dessus ont été déposés. La colonne a ensuite été lavée avec 10 ml de tampon de mise en équilibre et conservée à 4 C. lb) Du luminol a été immobilisé sur des microbilles de DEAE-Sepharose par interactions électrostatiques. 500 l de DEAE-Sepharose en suspension dans l'éthanol ont été introduits dans une colonne en plastique, équilibrés avec 10 ml de tampon Veronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5 et perfusés avec 1 ml de solution de luminol 10 mM dans du tampon de mise en équilibre. La colonne a ensuite été lavée avec 25 ml de tampon de mise en équilibre et stockée à 4 C. Exemple 2: Préparation de microplaques 2a) Des microplaques ont été préparées en déposant, sur des sites localisés formant un réseau, des gouttes de 0,3 l de solutions de dépôt. Les solutions de dépôt ont été préparées en mélangeant 45 l d'une solution aqueuse composée de 2,5 % de glycérol, NaCl 0,05 M avec 5 pi de microbilles humides portant d(A)22, 5 l de microbilles portant une IgG humaine ou 5 pi de microbilles portant de la glucose oxydase avec addition de 5 l de microbilles portant du luminol. Ces différents types de fonctionnalisation, ainsi que leur mode de révélation sont illustrés Fig. 2. (A) Une bille de Sepharose portant un oligonucléotide émerge de la surface du PDMS. Un traceur biotinylé est hybridé à l'acide nucléique immobilisé et est révélé avec de la streptavidine marquée à la peroxydase. (B) Une bille de Sepharose modifiée avec une protéine est incluse dans le polymère PDMS. Un anticorps marqué à la biotine réagit avec l'antigène immobilisé et est révélé avec de la streptavidine marquée à la peroxydase. (C) Une bille de IDA-Sepharose portant de la glucose oxydase (Gox) et une bille chargée de luminol émergent de la surface du PDMS. La Gox oxyde le glucose présent dans le milieu réactionnel, en produisant H2O2 qui, pour sa part, réagit avec le luminol immobilisé pour produire de la lumière. 2b) Pour former un réseau à basse densité, des gouttes de 0,3 l ont été déposées sur un substrat en PVC plat tous les 3 mm et séchées sous une lampe à tungstène pendant 30 min. La présence de glycérol dans la solution de dépôt permet d'obtenir, sur les sites localisés, des dépôts de microbilles secs homogènes et uniformes. Les dépôts de microbilles secs ont ensuite été transférés à l'interface de PDMS en versant un mélange de précurseur et d'agent de durcissement sur le substrat en PVC et en durcissant pendant 90 min sous une lampe à tungstène. La préparation des microplaques a ensuite été achevée en séparant le polymère PDMS. Ces différentes étapes sont illustrées Fig. 1 (A), (B) et (C). Après le retrait du PDMS solidifié, une émergence des microbilles est apparue sur la surface du polymère en coïncidence avec les sites localisés. Aucun résidu de microbilles n'a été observé sur la matrice de PVC après le retrait de la couche de PDMS, ce qui montre la grande efficacité du transfert des microbilles à l'interface du PDMS. Ces îlots de microbilles sont donc capables d'ancrer des molécules bioactives à l'interface, par le biais des microbilles de Sepharose, comme illustré Fig. 2. 2c) D'une manière similaire, des microplaques comportant des canaux, pour une application en fluidique, nommées dans la suite, microplaque à fluidique active ont été préparées en déposant des gouttes de 0,3 l de différentes solutions de dépôt (voir paragraphe 2a)) sur une matrice en PVC composée de 12 canaux (largeur: 2,5 mm, hauteur: 1 mm, longueur: 15 mm), préparée en fixant ensemble différentes pièces en PVC avec un adhésif époxyde, et en suivant le même protocole que celui présenté au paragraphe 2b). La séparation du substrat de PDMS et son recouvrement avec une surface de PVC plane permet d'obtenir 12 canaux actifs. Ces différentes étapes sont illustrées Fig. 3 (A), (B) et (C). Exemple 3: Test pour microplaques fonctionnalisées avec des acides 5 nucléiques Un couple d(T)22-d(A)22 a été utilisé comme modèle de procédé d'hybridation d'oligonucléotides. Les microplaques à basse densité et à fluidique active ont été testées selon le même protocole général. En bref, la microplaque ou un canal particulier a été saturée pendant 30 min avec une solution de tampon A (Veronal (barbiturate de diéthyle) 30 mM, pH 8,5 contenant 30 mM de KC1, 0,2 M de NaCl, 0,1 % de Tween et 1 % de BSA), puis incubée pendant 1 h avec d(T)22 biotinylé à une concentration particulière dans le tampon A. La microplaque ou un canal particulier a ensuite été lavée 10 min avec du tampon B (Veronal 30 mM, pH 8,5 contenant 30 mM de KC1, 0,2 M de NaCl), puis saturée de tampon A pendant 20 min et ensuite incubée avec de la streptavidine marquée à la peroxydase à une concentration de 1 gg/ml pendant 30 min. La microplaque ou un canal particulier a ensuite été lavée pendant 20 min avec du tampon B après quoi elle était prête pour la mesure. Exemple 4: Test pour microplaques fonctionnalisées avec des protéines D'une manière similaire à celle utilisée pour la microplaque fonctionnalisée avec des acides nucléiques, les microplaques fonctionnalisées avec des protéines ont été saturées pendant 30 min par une solution de tampon A, puis incubées pendant 1 h avec un anticorps anti-IgG biotinylé à une concentration particulière dans du tampon A. Les microplaques ont ensuite été lavées pendant 10 min avec du tampon B, saturées de tampon A pendant 20 min, puis incubées avec de la streptavidine marquée à la peroxydase à une concentration de 1.g/ml pendant 30 min. Les microplaques ont ensuite été lavées pendant 20 min avec du tampon B après quoi elles étaient prêtes pour la mesure. Exemple 5: Mesure sur les microplaques Les microplaques à acide nucléique et à protéines prêtes pour la mesure ont été mises en contact avec une solution tamponnée (Veronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5) contenant en plus 200 M de luminol, 500 gM de peroxyde d'hydrogène et 20 M de paraiodophénol. A ce moment, les microplaques ont été introduites dans le système de mesure de la lumière CCD (Intelligent Dark Box II, Fuji Film) et la lumière émise a été intégrée pendant 3 min. La microplaque à substrat d'enzyme a été utilisée d'une manière similaire: une solution tamponnée (Veronal 30 mM, KC1 30 mM, pH 8,5) contenant une concentration particulière de glucose et 200 M d'agent déclencheur (1,3-dichloro-5,5diméthylhydantoïne) a été injectée dans chaque canal juste avant l'introduction de la microplaque dans le système de mesure, et le signal a été intégré pendant 3 min. Les images de microplaques obtenues ont été quantifiées avec un programme d'analyses d'images FUJIFILM (Image Gauge 3. 12). Exemple 6: Résultats 6a) Microplaques à basse densité Le réseau de sites localisés à basse densité a été utilisé pour concevoir des microplaques fonctionnalisées avec des protéines ou des oligonucléotides basées sur des microbilles de Sepharose portant une IgG humaine ou un homooligonucléotide d(A)22. La Fig. 1(D) présente une micrographie d'un réseau de 100 points de d(A)22 révélés par chimioluminescence, avec un conjugué streptavidine-peroxydase après une hybridation de la microplaque avec un d(T)22 marqué à la biotine. Un écart type de 8 % du signal chimiluminescent a été trouvé dans le réseau. Des résultats similaires ont été obtenus quand le réseau de protéines, composé d'IgG humaine immobilisée, a été incubé avec des anticorps anti-IgG humaine marqués à la biotine. Il est alors apparu que le présent processus de préparation de microplaques permet d'obtenir un réseau homogène des deux types de biomolécules les plus étudiées. De plus, une modification des propriétés des microbilles utilisées a pu conduire à une immobilisation de biomolécules à plus grande échelle. Ainsi, un oligosaccharide (S. Fukui, T. Feizi, C. Galustian, A.M. Lawson and W. Chai, Nature Biotech., 20 (2002) 1011) ou un substrat de kinase (B.T. Houseman, J.H. Huh, S.J. Kron and M. Mrksich, Nature Biotech., 20 (2002) 270) a pu être immobilisé aisément et utilisé comme outils analytique. Le signal non spécifique produit par l'adsorption non spécifique sur le matériau PDMS ou Sepharose a été évalué en préparant une microplaque avec des microbilles non modifiées (ne portant aucun ligand biologique) et en réalisant le test sur une protéine ou un acide nucléique en présence d'une quantité maximale d'anticorps marqué ou d'acide nitrique marqué (100.1g et 7 pmol respectivement). Un signal non spécifique extraordinairement faible, proche de la limite de sensibilité de l'instrumentation, a été observé. Avec les microplaques selon l'inventionj, on observe donc un faible écart type et un bruit de fond sensiblement inexistant. 6b) Mesure quantitative avec microplaques à fluidique active Une première étude a été réalisée pour évaluer l'aptitude de la microplaque à détecter quantitativement un acide nucléique. Des échantillons ayant différentes concentrations de d(T)22 marqué à la biotine ont été injectés dans chaque canal particulier, hybridés et révélés. La Fig. 4(A) présente l'évolution du signal chimiluminescent obtenu en fonction de la quantité d'oligonucléotide introduite dans chaque canal. Les mesures sur la microplaques ont été effectuées pendant 3 min et l'image a été quantifiée avec un programme de quantification FUJIFILM. Bo représente l'intensité lumineuse obtenue en l'absence d'IgG libre et B représente l'intensité lumineuse obtenue en présence d'une concentration particulière d'IgG. En fait, la microplaque à acide nucléique permet la détection quantitative de quantités d'oligonucléotides biotinylés dans le domaine de 58 pM-23 nM. Par rapport aux limites de détection obtenues avec les systèmes à fluorescence (D. Trau, T.M.H. Lee, A.I.K. Lao, R. Lenigk, I. Hsing, N.Y. Ip, M.C. Carles and N.J. Sucher, Anal. Chem., 74(13) (2002) 3168 et J.R. Epstein, M. Lee and D.R. Walt, Anal. Chem., 74(8) (2002) 18366) ou basés sur un radiomarquage (H. Salin, T. Vujasinovic, A. Mazurie, S. Maitrejean, C. Menini, J. Mallet and S. Dumas, Nucl. Acids Res., 30 (2002) e17), impliquant généralement des agencements de microréseaux très complexes, le présent procédé présente une sensibilité légèrement plus basse mais un domaine de détection plus étendu. La présente limite de détection de 58 pM correspond à une quantité de 1010 molécules dans un volume de test de 300 l. Néanmoins, quand la microplaque est utilisée dans un format de réseau à basse densité, un volume d'échantillon de 3 ul peut être utilisé, ce qui abaisse à 108 le nombre de molécules d'acide nucléique détectées, ce qui est proche des meilleurs résultats obtenus dans des travaux antérieurs. Dans une étude ultérieure, les performances d'une microplaque fonctionnalisée avec des protéines pour détecter un antigène libre dans un format de compétition ont été évaluées. Des échantillons contenant une IgG humaine à différentes concentrations ont été incubés dans un canal particulier, en même temps que des anticorps anti-IgG marqués à la biotine. La lecture chimilumiscente de la biopuce conduit à l'obtention de la courbe de compétition, qui est une linéarisation par la fonction "logit", représentée sur la Fig. 4(B). logit = ln B/(Bo-B) où B est le signal obtenu à une concentration d'antigène libre fixée et Bo est le signal obtenu en l'absence d'antigène libre. La microplaque fonctionnalisée avec des protéines permet la détection d'un antigène libre avec une limite de détection de 12 ng/ml et un domaine de détection qui s'étend sur quatre décades au moins. Cette quantité correspond à 1,5 x 109 molécules dans le format de fluidique active et a pu être abaissée, comme ci-dessus, à 1,5 x 10' molécules dans le format basse densité. Pour démontrer toutes les potentialités des microplaques à fluidique active, un système à base d'enzyme dans lequel des microbilles chélatantes portant de la glucose oxydase (S. Fukui, T. Feizi, C. Galustian, A.M. Lawson and W. Chai, Nature Biotech., 20 (2002) 1011) étaient co-piégées à l'interface du PDMS avec des microbilles chargées de luminol, a été conçu. Dans la suite des réactions, la glucose oxydase catalyse l'oxydation du glucose et la production de peroxyde d'hydrogène qui réagit en présence d'un agent déclencheur (Z. Rao, X. Zhang and W.R.G. Baeyens, Talanta, 57 (2002) 993) avec le luminol immobilisé pour produire de la lumière. Il a été montré antérieurement que cette configuration, avec un système d'immobilisation différent, permet de réaliser un réseau biocapteur sensible sans problème de contamination entre les différents points. Des échantillons contenant du glucose à différentes concentrations ont été injectés dans la microplaque et l'intensité lumineuse produite a été mesurée simultanément sur toute la microplaque. La courbe d'étalonnage obtenue est présentée sur la Fig. 4(C) . Là encore, les performances de la microplaque de l'invention sont apparues compétitives, compte tenu de la sensibilité et du domaine linéaire présentés dans différents articles concernant la détection chimiluminescente d'un substrat d'enzyme (T V.C. safack, C.A. Marquette, F. Pizzolato and L.J. Blum, Biosens. & Bioelectron., 15 (2000) 125; L. J. Blum, Bio-Chemi-Luminescent Sensors, World Scientific, Singapore, 1997; I. Moser, G. Jobst and G.A. Urban, Biosens. & Bioelectr., 17 (2002) 297 et C.A. Marquette and L.J. Blum, Anal. Chim. Acta, 381 (1999) 1). De plus, dans une étude antérieure, il a été démontré qu'il était possible d'utiliser six enzymes oxydases différentes en même temps dans les mêmes conditions expérimentales, ce qui permet d'obtenir un biocapteur à six paramètres. La présente invention est également applicable pour la conception d'une biopuce à substrat d'enzyme à base de PDMS pour la détection de paramètre multiples. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication d'une microplaque en élastomère présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, d'au moins un type de ligands réactifs, comprenant les étapes successives suivantes: a) déposer sur une empreinte destinée à servir de contremoule pour la grande face active, selon des sites localisés, une solution aqueuse contenant: - un solvant organique dont la température d'ébullition et la viscosité sont supérieures à celles de l'eau, - un sel, apte à cocristalliser avec le solvant organique lors de l'étape b) ultérieure, et des particules micrométriques en surface ou à l'intérieur desquelles des ligands réactifs sont immobilisés; b) évaporer la solution aqueuse, à une température T suffisante mais inférieure à la température d'ébullition du solvant organique et à la température de dégradation des ligands réactifs, de façon à obtenir sur les sites localisés une cocristallisation du solvant organique et du sel autour des particules micrométriques; c) polymériser l'élastomère sur l'empreinte servant de contremoule pour la microplaque, de façon à ce qu'il vienne recouvrir les sites localisés et épouser la forme de l'empreinte; d) démouler la microplaque d'élastomère obtenue, les particules micrométriques étant partiellement emprisonnées sur la face active de la microplaque, au niveau des sites localisés, au moins une partie des ligands réactifs étant accessibles pour une réaction ultérieure. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'élastomère est du polydiméthylsiloxane (PDMS). 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le solvant utilisé présente une température d'ébullition supérieure à 150 C et une 30 viscosité Brookfield à 20 C supérieure à 100 cps. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le glycérol est utilisé en tant que solvant organique et le chlorure de sodium 10 15 20 25 (NaCl) en tant que sel, de préférence dans un rapport molaire glycérol/NaCI compris entre 0,05 et 0,1. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules micrométriques utilisées ont un diamètre moyen compris entre 1 et 150 5 m. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les particules micrométriques utilisées sont en un polymère, de préférence en latex. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'empreinte utilisée est plane. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'empreinte utilisée est non plane, de façon à donner à la surface réactive de la microplaque un relief, par exemple formé de puits et/ou canaux. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'au moins un site localisé est porteur de ligands réactifs différents de ceux présents sur les autres sites. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les ligands réactifs sont des ligands biologiques. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les ligands biologiques utilisés sont choisis parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes et les cellules vivantes actives. 12 - Microplaque présentant deux grandes faces, dont l'une, nommée face active, est porteuse, sur des sites localisés, de ligands réactifs accessibles pour des réactions ultérieures, caractérisée en ce que la microplaque est essentiellement constituée d'un élastomère qui emprisonne partiellement, au niveau de la face active, des particules micrométriques à la surface ou à l'intérieur desquelles les ligands réactifs sont immobilisés. 13 - Microplaque selon la revendication 12, caractérisée en ce que, caractérisé en ce que l'élastomère est du polydiméthylsiloxane (PDMS). 14 - Microplaque selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que, pour 30 majorité, les particules micrométriques émergent, de la face active, d'au moins 10 % de leur diamètre. - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que les particules micrométriques ont un diamètre moyen compris entre 1 et 150 m. 16 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisée en ce que la face active présente un relief formé, notamment, de puits et/ou canaux. 17 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'au moins un site localisé est porteur de ligands réactifs différents de ceux présents sur les autres sites. 18 - Microplaque selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que les ligands réactifs sont des ligands biologiques. 19 - Microplaque selon la revendication 18, caractérisée en ce que les ligands biologiques sont choisis parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes ou les cellules vivantes actives.