Brevet FR2863166A1 — publié le 20050610

PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF A BASE DE TOURTEAU D'OLIVES ET PRINCIPE ACTIF OBTENU La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un principe actif à base de tourteau d'olives avec des applications cosmétiques, à visée antivieillissement et plus particulièrement à des fins de protection et de réparation tissulaire. L'invention couvre aussi les compositions cosmétiques qui incorporent un tel principe actif sous forme de crèmes, onguents, lotions, gels, émulsions aqueuses, alcooliques ou grasses ou tout autre forme galénique, y compris en association avec d'autres actifs ayant un effet de synergie ou simplement une action complémentaire à celle du principe actif selon la présente invention, issu du tourteau d'olives. La peau possède des systèmes de protection et de réparation lui permettant de limiter les dégradations causées par les agressions telles que celles engendrées par les rayonnements solaires, la pollution ou encore le stress. Avec l'âge, ces systèmes de protection sont dépassés et il apparaît nécessaire de proposer des principes actifs à visée cosmétique aptes à lutter contre ces dégradations. Il convient que ces principes actif s anti-vieillissement puisse nt présente r une activité anti-radicalaire, limiter la libération des interleukines-8 et/ou des prostaglandines E2 (PGE2), en sorte de réduire les phénomènes d'inflammation. On sait que les interleukines-8 sont des facteurs chimiotactiques qui participent au recrutement cellulaire au niveau du site inflammatoire, provoquant la 2863166 2 dégranulation des neutrophiles et stimulant le stress oxydatif pour former des radicaux libres et des médiateurs de l'inflammation. Les prostaglandines E2 (PGE2) sont aussi des médiateurs de l'inflammation qui peuvent provoquer une vasodilatation et une augmentation de la perméabilité vasculaire en altérant les fonctions des cellules immunitaires en se couplant spécifiquement aux récepteurs cellulaires. Ces prostaglandines E2 (PGE2) sont issues de la métabolisation de l'acide arachidonique issu des phospholipides membranaires en présence d'enzymes et la production de ces prostaglandines est également fortement augmentée par les interleukines. De plus, il convient que ce principe actif anti-vieillissement puisse favoriser le renouvellement cellulaire et les mécanismes de formation de l'enveloppe cornée en agissant sur les synthèses des protéines impliquées dans la différenciation cellulaire. L'involucrine est une protéine particulière qui constitue le squelette protéique de la membrane plasmique des cornéocytes. La formation de l'enveloppe cornée débute notamment à partir de cette protéine précurseur, l'involucrine, et il est nécessaire pour le principe actif d'en permettre une augmentation de la synthèse. L'HSP-27 est une protéine de la famille des "Heat 5hock Proteins" de faible poids moléculaire qui est un marqueur de la différenciation des kératinocytes humains, lié aux phénomènes de stress, d'agression par des températures élevées ou des rayonnements UV. La Cadhérine-E est une des glycoprotéines et elle contribue à la cohésion entre 25 les kératinocytes. Elle est plus particulièrement impliquée dans la régulation de la différenciation terminale des kératinocytes. Le but de l'invention est d'obtenir un principe actif anti-vieillissement complet qui permette une protection contre ces stress et autres agressions de la peau tout en assurant une réparation de la peau lorsque les agressions parviennent à générer des dégradations. Le procédé d'obtention est maintenant décrit en détail selon un mode de réalisation particulier utilisant comme source d'obtention un tourteau d'olives. Le produit est également caractérisé par ses paramètres essentiels et la description qui va suivre inclut aussi les résultats des essais montrant les résultats significatifs pour chacune des actions du principe actif ainsi obtenu. 1/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF: - solubilisation en milieu aqueux de tourteau d'olives résultant de l'extraction par pressage à froid d'olives y compris les noyaux, à raison d'au moins 100g/I, - hydrolyse(s) enzymatique(s) en présence d'une ou plusieurs enzyme(s), de manière successive ou simultanée, préférentiellement de la famille des carbohydrases, - inactivation des enzymes par traitement thermique ou chimique - séparation des phases soluble et insoluble par décantation, filtration ou centrifugation, et - concentration de la phase active soluble. 2/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION: 2-1/ Taux de matière sèche Le taux de matière sèche est obtenu par passage à l'étuve à 105 C, d'un échantillon de 10 g de produit jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matière sèche est compris entre 10et 100 g/I plus particulièrement entre 20 et 30 g/l. 2-2/ Mesure du pH Le pH, déterminé par mesure potentiométrique, conduit à des valeurs comprises entre 4,0 et 8,0 spécifiquement entre 5,0 et 6,0. 2-3/ Détermination de la teneur en sucres totaux 2863166 4 Le dosage est effectué par la méthode de Dubois (Dubois M et al, (1956), Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). Le mesure est réalisée en mesurant la densité optique de la coloration prise par les sucres réducteurs en présence d'acide sulfurique concentré. Cette densité optique est rapportée à une gamme étalon de manoseglucosegalactose. Les résultats obtenus donnent des taux de sucres compris entre 5 et 50 g/I et plus particulièrement entre 10 et 20 g/I. 2-4 Caractérisation des carbohydrates: Cette caractérisation est réalisée avant et après hydrolyse acide du principe actif par chromatographie liquide dite HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Le solvant est de l'eau. Les résultats confirment la présence de mannose et de glucose. 2-5/ Taux de protéines: Le taux de protéines est obtenu par la méthode de Lowry. Les résultats donnent une teneur en protéines de 2 à 35 g/I, plus particulièrement 3 à 10 g/l. 2-6/ Caractérisation des polyphénols L'analyse est effectuée par chromatographie liquide dite HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Le solvant est de l'acétonitrile et une 20 solution d'acide formique. La détection est faite à 280 nm. Le chromatogramme HPLC fait apparaître la présence de composés hydroxybenzoïques et hydroxycinnamiques. 3/ EFFICACITE DU PRINCIPE ACTIF SUR LES FIBROBLASTES HUMAINS 3-1/ Action du principe actif sur le renouvellement cellulaire. L'objectif est de mesurer la capacité du principe actif à favoriser le renouvellement cellulaire de fibroblastes humains dans un milieu carencé, c'est-à-dire un milieu sans ajout de facteurs de croissance et pauvre en CaCl2, de l'ordre de 13 mg/l pour donner un ordre de grandeur. Le renouvellement cellulaire est évalué par l'étude de la croissance cellulaire. La densité optique après coloration au MTT, bromure de (3-4,5diméthylthiazole-2-yl-2,5-diphényltétrazolium) est mesurée dans le milieu de culture carencé en présence de principe actif selon l'invention. Augmentation du renouvellement cellulaire / témoin Principe actif à 1, 0% 15 Principe actif à 2,0% 38 Principe actif à 4,0% 59 Le principe actif à 2% dans le milieu selon la présente invention augmente de 38% le renouvellement cellulaire des fibroblastes en milieu carencé en facteurs de croissance et en calcium. 3-2/ Action du principe actif sur le métabolisme protéique: On évalue l'effet du principe actif selon la présente invention sur la synthèse de collagène I sur des cultures de fibroblastes humains. Les surnageants des cultures de fibroblastes humains sont incubés en présence du principe actif dosé à 0,5% ; 1,0% et 2,0%. On détermine les variations de la synthèse de collagène I au moyen d'un kit ELISA. Les résultats sont regroupés dans le tableau qui suit: Variation synthèse collagène I / témoin en % Principe actif 1,0% Non significatif Principe actif 2,0% + 44 Principe actif 4,0% + 65 On constate que le principe actif à 2% conduit à une augmentation significative de la synthèse du collagène I. 4/ EFFICACITE DU PRINCIPE ACTIF SUR LES KERATINOCYTES HUMAINS 4-1/ Action du principe actif sur la différenciation des kératinocytes humains: Des kératinocytes humains sont ensemencés et traités par le principe actif dosé à 2% dans un milieu de culture. On dose les protéines totales des extraits cellulaires par la méthode BCA (Bicinchoninic acid; Pierce USA). On réalise des électrophorèses des extraits cellulaires ayant la même quantité 10 de protéines et des immunomarquages spécifiques des protéines de différenciation (involucrine, HSP-27 et Cadhérine-E). L' involucrine est, ainsi qu'indiqué en préambule, une protéine essentielle à la constitution du squelette protéique de l'enveloppe cornée. L' HSP-27 est une protéine marqueur de la différenciation des kératinocytes 15 humains et la Cadhérine-E est impliquée dans la régulation de la différenciation terminale des kératinocytes. On obtient les résultats qui suivent par densitométrie après analyse d'images. Taux de protéines / Témoin en % Involucrine + 35 HSP-27 + 24 Cadhérine- E Non significatif Le principe actif selon la présente invention permet de favoriser la synthèse des 20 protéines impliquées dans le processus de différenciation. 4-2/ Action du principe actif sur le métabolisme cellulaire: L'étude consiste à mesurer par la méthode BCA (Bicinchoninic acid; Pierce USA) la capacité de synthèse des protéines totales des kératinocytes humains normaux. Des kératinocytes sont préparés dans un milieu K5FM (Keratinocyte Serum Free 5 Medium) complet et traités par le principe actif à 0,5% ; 1% et 2% dilués dans ce milieu de culture. Synthèse des Protéines totales / Témoin Variation en % Principe actif 0, 5% + 14 Principe actif 1,0% + 16 Principe actif 2,0% + 40 On obtient une augmentation de 40% de la synthèse des protéines totales avec une concentration de 2% de principe actif. 4-3/Action du principe actif sur le métabolisme lipidique: Le stratum corneum est constitué principalement des lipides type céramides, cholestérol et acides gras libres. Leurs synthèses sont régulées par des enzymes: - la HMG-coA réductase, enzyme impliquée dans la synthèse du cholestérol, 15 et - la SPT (Serine Palmitoyl Transferase) intervenant dans la synthèse des céramides. Le taux d' ARNm de ces enzymes notamment, augmente au cours du processus de réparation de la barrière. On incube des kératinocytes en présence du principe actif dosé à 1, 2 et 4% . On récupère les cellules et on extrait les ARN totaux. On détermine le pourcentage d'expression des ARNm codant pour ces enzymes par rapport à un témoin. Les résultats sont les suivants: HMG-CoA (%) 5PT (%) Principe actif à 1, 0% 20 6 9 4 Principe actif à 2,0% 35 9 21 7 Principe actif à 4, 0% 40 8 33 6 5/ ETUDE DE LA CAPACITE DE PROTECTION CELLULAIRE LORS D'UN STRESS 5-1/ Action du principe actif sur la libération des prostaqlandines E2 (PGE2): L'étude consiste à incuber en présence du principe actif selon la présente invention, une culture de kératinocytes humains soumis à une inflammation par un traitement à l'acide arachidonique On mesure alors la capacité de ce principe actif à limiter l'inflammation générée par l'acide arachidonique en mesurant le taux de PGE2 libérées. On constate dans le tableau qui suit une diminution de ce taux de prostaglandines libérées. Taux de PGE2 relarguées / Témoin Variation en % - 32 - 54 5-2/ Action photo protectrice du principe actif lors d'un stress UV: On soumet des cultures cellulaires de kératinocytes à des radiations UVA et UVB, traitées ou non traitées avec le principe actif selon la présente invention. Le stress provoque la formation de radicaux libres et ces derniers provoquent une augmentation de la mort cellulaire. Principe actif 2,0% Principe actif 4,0% On mesure la viabilité cellulaire, ce qui permet de déterminer l'effet photoprotecteur du principe actif pour les cultures de kératinocytes. Le principe actif est dosé à 1% ; 2% et 4% et les irradiations sont de 10 J/cm2 en UVA et 0,15 J/cm2 en UVB. On obtient un effet photoprotecteur certain comme le montre le tableau de résultats suivant: Activité anti-radicalaire / Témoin Variation en % Principe actif 1,0% + 10 Principe actif 2,0% + 27 Principe actif 4,0% + 32 On constate l'effet anti-radicalaire de plus de 30% pour une concentration de 10 4% de principe actif. 5-3/ Action du principe actif sur la libération des interleukines-8 (IL-8) lors d'une inflammation: l'étude est conduite sur des cultures de kératinocytes humains soumis à une inflammation provoquée par du PMA (phorbol-12 myristate 13-acetate). On détermine la capacité du principe actif selon l'invention à limiter cette inflammation en mesurant le taux d'IL-8 libérées dans les surnageants cellulaires grâce à un kit ELISA. Le principe actif est introduit à 1% ; 2% et 4%. Les résultats sont les suivants: Il-8 libérées / Témoin Variation en Principe actif 1,0% - 25 Principe actif 2,07. - 33 Principe actif 4,0% 45 On arrive ainsi à diminuer de 33% la libération d'IL-8 dans le cas de kératinocytes mis en présence de PMA. L'invention couvre aussi la composition cosmétique comprenant de 0,1 à 20%, de préférence de 1 à 4% de principe actif obtenu à partir de tourteau d'olives tels que décrit ci-avant introduits dans une forme galénique adaptée choisie parmi crèmes, onguents, lotions, gels, émulsions aqueuses, alcooliques ou grasses. Dans cette même composition, il est possible d'introduire tout autre actif qui pourrait avoir une action propre ou une action de synergie avec le principe actif de l'invention. 11 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif pour des applications cosmétiques anti-vieillissement, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - solubilisation en milieu aqueux de tourteau d'olives résultant de l'extraction par pressage à froid d'olives y compris les noyaux, à raison d'au moins 1008/1, - hydrolyse(s) enzymatique(s) en présence d'une ou plusieurs enzyme(s), de manière successive ou simultanée, préférentiellement de la famille des carbohydrases, inactivation des enzymes par traitement thermique ou chimique, 10 séparation des phases soluble et insoluble par décantation, filtration ou centrifugation, et - concentration de la phase active soluble. 2. Principe actif pour des applications cosmétiques anti-vieillissement obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en 15 ce qu'il présente les paramètres suivants: - taux de matière sèche: compris entre 10 et 100 g/l. - mesure du pH: compris entre 4,0 et 8,0. - détermination de la teneur en sucres totaux: compris entre 5 et 50 g/I. - caractérisation des carbohydrates: présence de mannose et de glucose. - taux de protéines: teneur en protéines comprise entre 2 à 35 g/I. caractérisation des polyphénols présence de composés hydroxybenzotques et hydroxycinnamiques. 3. Principe actif pour des applications cosmétiques anti-vieillissement obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en 25 ce qu'il présente les paramètres suivants: 2863166 12 taux de matière sèche: compris 20 et 30 g/I. - mesure du pH: compris entre 5,0 et 6,0. - détermination de la teneur en sucres totaux: compris entre 10 et 20 g/I. - caractérisation des carbohydrates: présence de mannose et de glucose. - taux de protéines: teneur en protéines comprise entre 3 à 10 g/I. - caractérisation des polyphénols présence de composés hydroxybenzoiques et hydroxycinnamiques. 4. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, caractérisée en ce qu'il augmente le renouvellement cellulaire des fibroblastes, 10 en vue de lutter contre le vieillissement. 5. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, caractérisée en ce qu'il favorise la synthèse des protéines impliquées dans le processus de différenciation notamment l'involucrine, l'HSP-27 et la cadhérine-E, en vue de lutter contre le vieillissement. 6. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, caractérisée en ce qu'il conduit à une augmentation de la synthèse des protéines totales, en vue de lutter contre le vieillissement. 7. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, caractérisée en ce qu'il conduit à une diminution du taux de prostaglandines E2 20 libérées, en vue de lutter contre le vieillissement. 8. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, pour disposer d'une protection face aux irradiations. 9. Utilisation du principe actif selon la revendication 2 ou 3 sur la peau, pour limiter la libération des interleukines-8, en vue de lutter contre le vieillissement. 10. Composition cosmétique destinée à lutter contre le vieillissement par application sur la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,1 à 20% de principe actif selon l'une des revendications 2 ou 3 introduits dans une forme galénique adaptée choisie parmi crèmes, onguents, lotions, gels, émulsions aqueuses, alcooliques ou grasses. 11. Composition cosmétique destinée à lutter contre le vieillissement par application sur la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend de 1,0 à 4% de principe actif selon l'une des revendications 2 ou 3 introduits dans une forme galénique adaptée choisie parmi crèmes, onguents, lotions, gels, émulsions aqueuses, alcooliques ou grasses.