Brevet FR2871076A1 — publié le 20051209

DISPOSITIF POUR DÉSORPTION PAR RAYONNEMENT LASER INCORPORANT UNE MANIPULATION DE L'ECHANTILLON LIQUIDE SOUS FORME DE GOUTTES INDIVIDUELLES PERMETTANT LEUR TRAITEMENT CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE. DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne un système intégré d'analyse microfluidique d'un échantillon de liquide, qui trouve notamment, mais pas uniquement, son application pour l'analyse par désorption par rayonnement laser, incorporant une manipulation de l'échantillon liquide sous forme de gouttes individuelles permettant leur traitement chimique et biochimique. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE La désorption par le rayonnement laser permet la vaporisation de substance présente sur une surface. Cet effet se combine avec l'ionisation des molécules présentes à la surface. Ce phénomène a été exploité en spectrométrie de masse sous le nom de MALDI (Matrix assisted Laser Desorption Ionization) dans lequel l'énergie du faisceau laser est emmagasinée puis restituée par la matrice qui est le plus souvent organique mais qui peut contenir aussi des nanoparticules dont l'absorption est dans la gamme de la longueur d'onde du faisceau laser. Pour conduire à des résultats satisfaisants en spectrométrie de masse MALDI l'échantillon, doit contenir une quantité très minime de sels inorganiques, typiquement une concentration de l'ordre de moins de un pour mille. Typiquement l'échantillon est donc dessalé avant son analyse par spectrométrie de masse MALDI ce qui conduit à des étapes supplémentaires et réduit la sensibilité de la méthode. Les techniques les plus couramment utilisées sont le dessalage sur des colonnes hydrophobes de type chaîne alkyle greffée. Des dessalages spécifiques utilisant des résines cationiques ou anioniques peuvent également être mises en oeuvre. Plus généralement, on utilisera par la suite indifféremment les adjectifs mouillant ou hydrophile pour une mouillabilité vis-à-vis d'un quelconque liquide, et non mouillant ou hydrophobe pour une non mouillabilité vis-àvis d'un quelconque liquide. Par ailleurs la plupart des échantillons biologiques sont complexes et comprennent des centaines voir des milliers de molécules différentes. Typiquement un digestat trypsique des protéines contenues dans un tissu contient dix mille à cent mille peptides différents. C'est pourquoi ces échantillons subissent un fractionnement préalable en utilisant des colonnes d'affinité comme dans la technologie ICAT (Isotope Coded Affinity Tags) qui en plus de sa complexité détériore considérablement la sensibilité de la méthode. Ces échantillons biologiques sont de plus disponibles en très faible quantité : il est ainsi nécessaire de disposer d'un gramme de biopsie pour pratiquer une analyse protéomique ce qui rend ces analyses non réalisables sur des prélèvements humains. La mise en oeuvre de la technique MALDI se fait le plus souvent à partir d'une surface métallique. Afin de minimiser les inconvénients mentionnés précédemment divers agencements de ces surfaces métalliques ont été décrites. Les premières solutions ont eu pour objectif d'améliorer la sensibilité. Tout d'abord des surfaces ou seules de petites zones sont métalliques, ce qui conduit à une concentration locale de l'échantillon. Pour supprimer les sels, des surfaces réalisées à partir d'un polymère de type brosse ce qui permet un dessalage in situ de l'échantillon. Pour réaliser le fractionnement, des surfaces de type résine cationique ou anionique qui permettent l'immobilisation d'une seule famille de composé de polarité opposée. Et enfin des surfaces greffées par des composés biologiques (biotine, avidine, anticorps) pour permettre la purification par affinité de mélanges complexes. Toutes ces surfaces sont statiques et ne comportent aucun système fluidique permettant le déplacement et le traitement de l'échantillon sur la plaque. Le dépôt est réalisé soit de manière manuelle soit par un robot comportant une tête d'aspiration-dépôt de liquide externe. La microfluidique est actuellement en plein essor et tente d'apporter des solutions innovantes, avec par exemple de nouvelles méthodes d'analyse, dans le domaine de la biologie, de la chimie analytique et du génie chimique. La réduction de la taille des systèmes engendrent de nombreux aspects positifs comme la diminution des volumes, celle des temps de réactions ou des temps d'échange plus courts, et une intégration de plusieurs modules avec des fonctionnalités différentes, comme des modules de transport, de traitement, d'analyse, sur un même wafer de silicium par exemple. Deux types de déplacement fluidique sont possibles: le pompage d'un flux continu et le déplacement de microvolumes calibrés de liquide. Le pompage de microvolumes calibrés nécessite des volumes moins importants de liquide que le pompage à flux continu et permet un contrôle plus facile du débit. Par un contrôle des constantes de temps qui permettent par exemple le mélange de liquides, sont ainsi plus facilement réalisables. Plusieurs modes de pompages de ce type sont décrits dans la littérature utilisant des pompages par action pneumatique ou par ondes acoustiques de surfaces, des pompages à effet diélectrophorétique, des pompages par électromouillage et électromouillage sur diélectrique. Ce dernier mode de pompage fait appel à une réalisation technologique simple, permet le contrôle du débit et la circulation du liquide dans un réseau de microcanaux. Actuellement, les dispositifs de déplacement utilisant le principe de l'électromouillage (electrowetting en anglais) nécessitent deux substrats en vis-a- vis ou un seul substrat (Creating, Transporting, Cutting, and Merging Liquid Droplets by Électromouillage-Based Actuation for Digital Microfluidic Circuits" Sung Kwon Cho, Hyejin Moon, and Chang-Jin Kim, Journal of Microelectromechanical Systems, VOL. 12, NO. 1, Feb. 2003, pp. 70-80). Le système avec deux substrats en vis-à-vis réclament des électrodes interdigitées sur au moins un des 2 substrats, au moins une couche isolante constituée d'oxydes inorganiques de non-métaux métaux, de métaux de transition, de polymères ou d'une combinaison de ces différentes substances sur l'un des deux substrats et une couche hydrophobe sur chaque substrat. Le système avec un seul substrat nécessite des électrodes interdigitées, une couche isolante constituée d'oxydes inorganiques de non-métaux métaux, de métaux de transition, de polymères ou d'une combinaison de ces différentes substances une couche hydrophobe et une ligne de masse ou non. La couche hydrophobe est la clé du déplacement, sans celle-ci, le déplacement est impossible comme il est décrit dans l'article cité (Electrowetting-based microfluidic devices: design issues, C.Y. Chen, E.F. Fabrizio, A. Nadim and J.D. Sterling, Summer Bioengineering Conference 2003, pp. 1241-1242). La couche hydrophobe est un matériau ayant une faible énergie de surface et une excellente résistance chimique. De ce fait, il est très difficile d'effectuer sur une couche hydrophobe un traitement de surface chimique local, des dépôts ou des greffages sans modifier et/ou dégrader l'intégralité de la surface de cette couche hydrophobe; et ceci diminue ou annule l'efficacité de l'électromouillage pour le déplacement de liquide. Ainsi, l'utilisation de ce système recouvert d'une couche hydrophobe se limite à priori au seul déplacement de liquide. Ainsi, pour avoir un système qui permet, par exemple de traiter des échantillons biologiques il faut des zones fonctionnalisées qui interagiront avec le liquide. Or La couche hydrophobe interdit toute fonctionnalisation préalable de zones sur lesquelles le liquide serait en contact. Pour remédier à ceci, la solution proposée consiste à créer des ouvertures hydrophiles dans le matériaux hydrophobe. Ces ouvertures hydrophiles encore appelées zones ouvertes ou ouvertures peuvent alors être traité chimiquement et le liquide peut interagir avec cette surface. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention concerne des dispositifs pour désorption par rayonnement laser incorporant une manipulation de l'échantillon liquide sous forme de gouttes individuelles permettant leur traitement chimique et biochimique. Le dispositif pour désorption par rayonnement LASER comporte au moins un plot de chargement de l'échantillon liquide, au moins une piste de transport composée d'électrodes interdigitées, au moins une zone de traitement chimique ou biochimique et un système d'aiguillage vers au moins un plot conducteur où une désorption par rayonnement LASER peut être réalisée. L'invention se présente sous la forme d'un substrat isolant sur lequel reposent des électrodes interdigitées, isolées des échantillons déplacés par une couche supérieure isolante et fonctionnalisable, d'oxydes inorganiques de non-métaux, de métaux, de métaux de transition ou de polymères ou d'une combinaison de ces différentes substances. Une couche non mouillante, laissant apparaître des zones mouillantes, est ensuite déposée. Cette couche dite partiellement mouillante laisse apparaître la couche isolante fonctionnalisable. Après traitement, ces ouvertures dans la couche non mouillante constituent les zones fonctionnalisées du module de traitement. Le système peut se présenter sous la forme de deux substrats en vis à vis. Sur un des substrats repose une piste de transport des échantillons ou réactifs. Sur le second substrat repose les zones fonctionnalisées. L'ensemble des deux substrats est séparé par un espace destiné à être rempli d'un fluide électriquement isolant et non miscible vis à vis des liquides transportés. En plus d'un module de traitement, le système peut comprendre. - un module qui permet l'introduction d'un échantillon biologique ainsi que des liquides nécessaires pour l'analyse (solution de rinçage...), - un module qui permet de fractionner les liquides en plusieurs gouttes, - un ou des modules d'interaction biochimique. Exemple pour l'analyse des protéines: module d'affinité, de digestion, de dessalage, - un module de transition entre la zone de traitement et la zone d'analyse - un module d'analyse qui par exemple place les échantillons à analyser sur des plots où une matrice peut être ajouté et sur lesquels une analyse par spectrométrie de masse de type MALDI est possible ou encore par détection optique ou fluorescence. Plus généralement l'invention se rapporte à un système intégré d'analyse microfluidique d'un échantillon de liquide caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen (100) de préparation de l'échantillon de liquide, ledit moyen (100) de préparation comprenant un moyen (101) de déplacement pour l'introduction dudit échantillon et de réactifs puis leur migration vers au moins un moyen (200) de traitement chimique ou biochimique de gouttes dudit échantillon de liquide, ledit moyen (200) de traitement comprenant un moyen (201) de déplacement desdites gouttes dudit échantillon puis leur migration vers au moins un moyen (300) d'analyse desdites gouttes dudit échantillon de liquide. Le moyen (300) d'analyse peut comprendre un moyen (301) de déplacement desdites gouttes dudit échantillon. Le moyen (100) de préparation de l'échantillon de liquide peut comprendre au moins un quai de chargement de liquide. Le moyen (300) d'analyse peut comprendre au moins une zone pour la désorption rayonnement LASER. Le moyen (100) de préparation peut comprendre au moins une zone (102) pour le dépôt de liquide. Au moins un des moyens (101,201,301) de déplacement peut comprendre au moins un plot conducteur, recouvert d'une couche partiellement mouillante comportant au moins une zone mouillante en vis-à-vis dudit plot conducteur. Le système peut comprendre une couche isolante insérée entre le plot conducteur et la couche 10 partiellement mouillante. Les zones mouillantes sont éventuellement fonctionnalisées chimiquement ou biochimiquement. Le moyen (201) de déplacement du moyen (200) de traitement chimique ou biochimique peut comprendre deux substrats en vis-à-vis, et/ou au moins un moyen de fractionnement d'une goutte en plusieurs, et/ou au moins un moyen d'élimination des réactifs en excès ou usagers. Au moins un des moyens {101, 201, 301) de déplacement est de type déplacement par électromouillage sur diélectrique. Les zones fonctionnalisées chimiquement ou biochimiquement sont des zones hydrophiles d'interaction avec le liquide déplacé. Le moyen (300) d'analyse comprend au moins un moyen d'aiguillage des gouttes vers des plots d'analyse indépendants. Le moyen (300) d'analyse comprend un moyen d'analyse de type MALDI par désorption-ionisation par 30 rayonnement laser, et/ou de type par détection optique. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement et de manière complète à la lecture de la description ci-après des variantes préférées de mise en oeuvre du procédé et de réalisation du dispositif, lesquelles sont données à titre d'exemples non limitatifs et en référence aux dessins annexés suivants: - figures la à ic représente schématiquement un dispositif d'analyse d'échantillons biologiques avec cible MALDI intégrée, - figure 2: représente schématiquement un dispositif 15 de déplacement d'une goutte entre 2 pistes, - figure 3: représente schématiquement un dispositif de déplacement d'une goutte entre 2 pistes avec des zones fonctionnalisées sur la piste supérieure, - figure 4: représente schématiquement un dispositif de déplacement d'une goutte sur une piste, - figure 5: représente schématiquement un dispositif d'analyse d'échantillons biologiques par spectrométrie de masse MALDI, - figure 6: représente schématiquement un dispositif d'analyse de protéines d'échantillons biologiques avec cible MALDI intégré avec 3 traitements biochimiques avant analyse (concentration, digestion et dessalage). EXPOSÉ DETAILLÉ DES MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Les figures la à 1c représentent schématiquement un dispositif d'analyse d'échantillons biologiques avec cible MALDI vues en perspective la et lb, et vue en coupe perpendiculaire au sens du déplacement de la goutte 1c. Dans ces figures la à ic, le dispositif comprend une piste avec un substrat 1. Au dessus de ce substrat 1 se trouvent les électrodes interdigitées 2. Sur ces électrodes 2, on trouve une couche diélectrique isolante 3, constituée par exemple d'oxydes ou de polymères. Sur cette couche électrique isolante 3 se trouve une couche non mouillante 4. Entre la couche 3 et la couche 4, une ligne conductrice 5 fait office de contreélectrode. En vis à vis de la première piste est placée une deuxième piste formée d'une couche partiellement mouillante 6 elle-même recouverte d'une couche supérieure 7 sur laquelle des fonctions biochimiques 8 peuvent être greffées. La couche 7 est sur un substrat 9 qui peut être utilisé comme contre-électrode. L'utilisation de cales 10 permet de maintenir un espace 11 de déplacement destiné à être rempli d'un fluide électriquement isolant non miscible vis à vis de la goutte transportée. Sur ce substrat, les plots 12 sont conducteurs et permettent d'immobiliser les gouttes transportant le matériel à analyser avant dépôt de matrice pour l'analyse MALDI. Sur le plot 13, les liquides (par exemple les gouttes d'échantillons, de réactifs, ...) sont déposés. Le liquide entre alors dans la zone de traitement chimique ou biochimique entre les substrats 1 et 9 et interagit avec les zones fonctionnalisées 8. Les plots de déplacement 2 permettent alors l'acheminement de chaque goutte individuelle (14) jusqu'à un des plots 12. Suit une étape de dépôt de matrice, une cristallisation et une analyse MALDI. La figure 2 représente schématiquement un dispositif de déplacement d'une goutte entre 2 pistes vue en coupe dans le sens du déplacement. Le dispositif comprend une première piste constituée des couches 1, 2, 3, 4 et une seconde piste constituée des couches 7, d'un substrat 9 ainsi que d'une couche non mouillante 15. En mettant une différence de potentiel entre l'électrode 2b et le substrat 9, la goutte se confine entre l'électrode 2b et le substrat 9, et nous obtenons un déplacement de la goutte depuis l'électrode 2a à l'électrode 2b. La figure 3 représente schématiquement un dispositif de déplacement d'une goutte 14 entre 2 pistes avec des zones fonctionnalisées sur la piste supérieure vue en coupe dans le sens du déplacement. Le dispositif comprend une première piste constituée des couches 1, 2, 3, 4 et une seconde piste constituée des couches 6, 7, d'un substrat 9 et des zones fonctionnalisées 8a à 8d. En mettant une différence de potentiel entre l'électrode 2b et le substrat 9, la goutte se confine entre l'électrode 2b et le substrat 9, et nous obtenons un déplacement de l'électrode 2a à l'électrode 2b. La goutte interagit alors avec la zone fonctionnalisée 8c et 8d. La figure 4 représente schématiquement un dispositif de déplacement d'une goutte sur une piste. La figure 4a est une vue en coupe perpendiculaire au sens du déplacement de la goutte et la figure 4b est une vue de dessus du dispositif. Le dispositif comprend une piste constituée des couches 1, 2, 3, 4 et 5. En mettant une différence de potentiel entre l'électrode 2c et la ligne 5, nous obtenons un déplacement de la goutte 14 de l'électrode 2b à l'électrode 2c. La figure 5 représente schématiquement et en perspective un dispositif d'analyse d'échantillons biologiques par spectrométrie de masse MALDI. En appliquant successivement des différences de potentiel entre les électrodes 2a à 2h et la ligne 5, nous pouvons déplacer la goutte 14 et l'immobiliser sur un des plots 12a à 12f. Suit une étape de dépôt de matrice, une cristallisation et une analyse MALDI. Les figures 6a à 6c représentent schématiquement un dispositif d'analyse de protéines d'échantillons biologiques avec cible MALDI intégrée avec 3 traitements chimique ou biochimiques avant analyse (concentration, digestion et dessalage) vues en perspective 6a et 6b, et vue en coupe perpendiculaire au sens du déplacement de la goutte 6c. Le dispositif comprend une première piste constituée des couches 1, 2, 3, 4, 5, d'une seconde piste constituée des couches 6, 7, d'un substrat 9 et de cales 10. Ce dispositif comprend un plot 16 permettant l'élimination des réactifs en excès ou déjà utilisés, des plots 12 pour l'analyse MALDI et trois zones fonctionnalisées pour l'affinité 8a, pour la digestion 8b et pour le dessalage 8c. Sur les plots 13, les liquides (par exemple les gouttes d'échantillons, de réactifs, de rinçage...) sont déposées. Le liquide entre alors dans la zone de traitement biochimique entre les substrats 1 et 9 grâce l'application d'une différence de potentiel. La transition entre les plots 17a et 17b permet de fractionner le liquide introduit en plusieurs gouttes. Les gouttes sont alors acheminées vers un premier plot d'affinité 8a où les protéines d'intérêt vont se fixer. Les gouttes sont alors conduites jusqu'au plot 16. Une solution de rinçage permet alors de rincer le plot 8a selon le même principe de déplacement que précédemment. Ensuite, une solution spécifique (comme un mélange tampon dénaturant) permet de libérer les molécules d'intérêt et les protéines sont amenées sur un plot 8b de digestion protéinique. Après l'étape de digestion, la goutte est acheminée sur le plot 8c de dessalage avant d'être conduite sur un des plots pour l'analyse de type MALDI. Les exemples suivants illustrent la fonctionnalisation et l'usage des dispositifs décrits 25 précédemment: Exemple 1. Réacteur d'affinité permettant le traitement d'échantillons biologiques. Dans le dispositif, les zones non recouvertes par la couche hydrophobe vont subir un traitement de surface et les transformer en surfaces réactives par exemple en utilisant une surface support comportant des groupements amino (NH2) sur lesquels sont greffés de la Streptavidine. Ainsi, nous immobilisons la goutte de liquide se déplaçant dans le chemin d'électrodes sur une zone traitée, et les molécules d'intérêt (protéines par exemple) qui ont une affinité pour les surfaces greffées vont se fixer sur ces surfaces. Quand la réaction chimique est terminée, la goutte poursuit son chemin dans le dispositif. Ensuite, le passage d'un mélange spécifique (par exemple un mélange tampon dénaturant) sur ces zones, libérera les molécules d'intérêt (avec par exemple destruction des interactions non covalentes) et les entraînera avec lui. Ce dispositif permet ainsi d'isoler des molécules d'intérêt. Exemple 2. Réacteur de digestion permettant le traitement d'échantillons biologiques. Dans le dispositif, les zones non recouvertes par la couche hydrophobe subissent un traitement de surface qui les transforment en surfaces réactives par exemple en utilisant une surface support comportant des groupements amino (NH2) sur lesquels sont greffés de la trypsine. Ainsi, nous immobilisons la goutte de liquide se déplaçant dans le chemin d'électrodes sur une zone traitée, et les molécules d'intérêt (protéines par exemple) réagissent avec les surfaces greffées qui coupent les molécules, pour obtenir par exemple des peptides dans le cas d'une digestion par la trypsine. Ensuite, la goutte poursuit son chemin dans le dispositif. Ce dispositif permet par exemple d'analyser des longues chaînes de molécules par découpage préalable au moyen d'enzymes spécifiques par spectrométrie de masse. Exemple 3. Traitement d'échantillons biologique: module de dessalage. Dans le dispositif, les zones non recouvertes par la couche hydrophobe subissent un traitement de surface qui les transforme en surfaces réactives par exemple par greffage de chaînes hydrocarbonées de 18 carbones conduisant à l'équivalent d'une phase de chromatographie inverse dite C18. Ainsi, nous immobilisons la goutte de liquide se déplaçant dans le chemin d'électrodes sur une zone traitée, et les molécules d'intérêt (protéines par exemple) réagissent avec les surfaces greffées qui coupent les molécules. Ensuite, la goutte poursuit son chemin dans le dispositif. Ce dispositif permet par exemple d'effectuer un dessalage avant l'analyse par spectrométrie de masse MALDI. REVENDICATIONS 1. Système intégré d'analyse microfluidique d'un échantillon de liquide caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen (100) de préparation de l'échantillon de liquide, ledit moyen (100) de préparation comprenant un moyen (101) de déplacement pour l'introduction dudit échantillon et de réactifs puis leur migration vers au moins un moyen (200) de traitement chimique ou biochimique de gouttes dudit échantillon de liquide, ledit moyen (200) de traitement comprenant un moyen (201) de déplacement desdites gouttes dudit échantillon puis leur migration vers au moins un moyen (300) d'analyse desdites gouttes dudit échantillon de liquide. 2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit moyen (300) d'analyse comprend un moyen (301) de déplacement desdites gouttes dudit échantillon. 3. Système selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit moyen (100) de préparation de l'échantillon de liquide comprend au moins un quai de chargement de liquide. 4. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit moyen (300) d'analyse comprend au moins une zone pour la désorption rayonnement LASER. 5. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit moyen (100) de préparation comprend au moins une zone (102) pour le dépôt de liquide. 6. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que au moins un desdits moyens (101,201,301) de déplacement, comprend au moins un plot conducteur, recouvert d'une couche partiellement mouillante comportant au moins une zone mouillante en vis-à- vis dudit plot conducteur. 7. Système selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une couche isolante insérée entre ledit plot conducteur et ladite couche partiellement mouillante. 8. Système selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que ledites zones mouillantes sont fonctionnalisées chimiquement ou biochimiquement. 9. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit moyen (201) de déplacement dudit moyen (200) de traitement chimique ou biochimique comprend deux substrats en vis-à-vis, et/ou au moins un moyen de fractionnement d'une goutte en plusieurs, et/ou au moins un moyen d'élimination des réactifs en excès ou usagers. 10. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que au moins un desdits moyens (101, 201, 301) de déplacement est de type déplacement par électromouillage sur diélectrique. 11. Système selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que lesdites zones fonctionnalisées chimiquement ou biochimiquement sont des zones hydrophiles d'interaction avec le liquide déplacé. 12. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit moyen (300) d'analyse comprend au moins un moyen d'aiguillage des gouttes vers des plots d'analyse indépendants. 13. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le moyen (300) d'analyse comprend un moyen d'analyse de type MALDI par désorption- ionisation par rayonnement laser, et/ou de type par détection optique.