Brevet FR2862661A1 — publié le 20050527

Les résidus L-isoaspartate et D-aspartate qui constituent le substrat de la L-isoaspartyl méthyltransférase résultent de la déamidation, de l'isomérisation et de la racémisation spontanées de résidus aspartate et asparagine, qui interviennent au cours du vieillissement des graines, et qui font partie des modifications pouvant affecter la fonctionnalité des protéines dans lesquelles ces résidus sont intégrés. La L-isoaspartyl méthyltransférase permet de convertir au moins une partie de ces résidus en résidus L-aspartate, permettant aux protéines ainsi réparées de retrouver leur activité. La L-isoaspartyl méthyltransférase est une enzyme cytosolique quasi universelle, que l'on retrouve dans de très nombreux organismes, depuis les bactéries (à gram négatif), jusqu'aux plantes et animaux (O'CONNER C. M et al, 1985; Biochem. Biophys. Res., 132: 1144-1150). Chez les plantes, l'activité L-isoaspartyl méthyltransférase apparaît présente dans la quasi-totalité des espèces végétales; l'activité Lisoaspartyl méthyltransférase a notamment été mise en évidence dans le germe de blé (TRIVEDI L. et al., Eur. J. Biochem., 1982, 128: 349-354, MUDGETT M.B. et al, Biochemistry, 1993, 32: 11100-11111, J. Biol. Chem., 1994, 269(41): 25605-25612) puis chez le lotus (SHEN-MILLER et al., Am. J. Bot., 1995, 82(11): 1367-1380), Arabidopsis thaliana (MUDGETT M.B. et al, PlanT. Mol. Biol., 1996, 30: 723-737; THAPAR N. et al, Protein Expr. Purif., 2000, 20: 237-251), l'orge (MUDGETT M.B. et al., Plant Physiol., 1997, 115: 1481-1489), la tomate (KESTER et al., J. Exp. Bot., 1997, 309: 943-949), le maïs, la carotte et le riz (THAPAR N. et al., Plant Physiol., 2001, 125(2): 1023-1035). Cette activité est détectable dans de nombreux organes chez les plantes, mais elle apparaît maximale dans les graines sèches (MUDGETT M.B. et al., Plan T. Mol. Biol., 1996, 30: 723-737). CLARKE S. (Mt. J. Pept. Protein Res., 1987, 30: 808-821) a montré in vitro que la IAMT a une activité de réparation d'environ 30% des résidus anormaux; son bon fonctionnement permet donc à la graine ou à la plante de ralentir la perte d'intégrité des protéines accumulant des acides aminés L- isoaspartate, mais pas de compenser en totalité les phénomènes de racémisation et d'isomérisation. SHEN-MILLER et al. (Am. J. Bot., 1995, 82(11): 1367-1380) ont dosé l'activité IAMT dans des graines de Lotus Sacré (Nelumbo nucifera) âgées d'environ 90 ans. Les graines qui se sont révélées capables de germer possédaient une activité IAMT élevée et le taux de résidus racémisés était équivalent à celui de graines fraîches, soit 2%. KESTER et al., (J. Exp. Bot., 1997, 309: 943-949) ont rapporté, chez des graines de tomates vieillies artificiellement, une diminution de l'activité 2862661 3 IAMT corrélée à une baisse de la capacité germinative. MUDGETT M.B. et al., (Plant Physiol., 1997, 115: 1481-1489), ont également observé, sur des graines d'orge vieillies naturellement, que l'activité L-isoaspartyl méthyltransférase diminuait en fonction de l'âge des semences et que cette diminution s'accompagnait de l'accumulation de résidus L-isoaspartyl racémisés ainsi que d'une perte de viabilité des semences; en revanche, dans le cas des graines d'orge vieillies artificiellement, ils ont aussi observé une accumulation de résidus racémisés et une diminution de la capacité germinative, mais pas de baisse de l'activité IAMT. Ces travaux suggèrent que la L-isoaspartyl méthyltransférase pourrait jouer un rôle dans la protection des graines contre le vieillissement. Cependant, ils ne permettent pas de conclure à l'existence d'une corrélation directe entre la quantité de L-isoaspartyl méthyltransférase et la capacité germinative des graines, qui permettrait d'utiliser cette enzyme comme marqueur de la capacité germinative. En outre, les résultats décrits dans les travaux mentionnés ci-dessus s'appuient soit sur des tests d'activité IAMT, soit sur la détection de l'ARNm de la L-isoaspartyl méthyltransférase. Or, le dosage de l'activité enzymatique fait appel à des méthodes lourdes et nécessitant l'utilisation de méthanol radioactif, qui sont difficiles à mettre en oeuvre dans le cadre de contrôle de routine. D'autre part, en ce qui concerne l'ARNm, il a été observé qu'il n'y avait pas toujours de corrélation entre la détection de transcrits de l'IAMT et l'activité enzymatique IAMT. Ainsi, MUDGETT M.B. et al (PlanT. Mol. Biol., 1996, 30: 723-737) ont rapporté que chez Arabidopsis thaliana, l'ARNm de l'IAMT était détectable dans les plantules (où l'activité enzymatique n'est pas détectable) mais pas dans la graine sèche (où l'activité enzymatique est maximale). Les Inventeurs sont parvenus à identifier des mutants de régulation de la L-isoaspartyl méthyltransférase chez Arabidospsis thaliana et ont ainsi pu constater que son expression est responsable d'une meilleure capacité de conservation de la graine sèche au cours du stockage. Ils ont en outre identifié des épitopes de cette protéine permettant d'obtenir des anticorps capables de reconnaître non seulement la L-isoaspartyl méthyltransférase d'Arabidospsis thaliana mais également ses orthologues chez d'autres espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. Le dosage de la L-isoaspartyl méthyltransférase à l'aide de ces anticorps a permis d'établir une corrélation entre la disparition de la protéine dans la graine sèche et la perte de vigueur germinative. En outre, les Inventeurs ont observé 2862661 4 que la diminution de la quantité de Lisoaspartyl méthyltransférase précède la baisse de vigueur germinative. Il apparaît donc que cette enzyme constitue un marqueur prédictif, qui permet non seulement d'évaluer la capacité germinative des semences, mais également de prédire une baisse de cette capacité au cours de la conservation. La présente invention a pour objet un procédé de détermination de la vigueur germinative et/ou de l'aptitude d'un lot de semences à la conservation, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification de la Lisoaspartyl méthyltransférase, sur un échantillon de semences prélevé sur ledit lot. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, la 10 quantification de la L-isoaspartyl méthyltransférase est effectuée à l'aide d'un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase. La présente invention a aussi pour objet un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide constitué par tout ou partie de la portion de ladite enzyme définie par la séquence peptidique (I) suivante: QX1 LX2VX3DKX4X5DGSX6X7X8X9X10X11X12SVR@VPLTSRX13X14QLX15XI6X17 (SEQ ID NO:1), dans laquelle XI représente D ou E, X2 représente Q ou K, X3 représente V ou I, X4 représente N ou S, X5 représente S, E, ou A, X6 représente soit un dipeptide choisi parmi VS, VT, et TS, soit une liaison peptidique, X7 représente I ou V, X8 représente K, Q ou R, X9 représente D, V ou N, X10 représente soit le dipeptide HT, soit une liaison peptidique, XII représente E ou D, X12 représente T ou A, X13 représente E, V ou S, X14 représente A ou E, X15 représente R, G ou Q, X16 représente G ou D, X17 représente D ou F. Q, D, G, S, V, R, Y, V, P, L, T, S, R, K, I, E, A, N, H, F ont ici leur signification 25 usuelle en code 1 lettre. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit anticorps est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant l'immunisation d'un animal avec un fragment de L-isoaspartyl méthyltransférase comprenant la séquence (I). Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide a une taille de 10 à 20 acides aminés, avantageusement de 13 à 18 acides aminés. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit peptide est choisi parmi: - un peptide de séquence (II) : QXILX2VX3DKX4X5DGSX6X7X8 (SEQ ID NO:2) 35 2862661 5 dans laquelle X1, X2, X3, X4 X5, X6, X7 et X8 sont tels que définis ci-- un peptide de séquence (III) : RYVPLTSRX13X14QLX15 (SEQ ID dans laquelle X13, X14 et X15, sont tels que définis ci-dessus. De manière particulièrement avantageuse, ledit peptide est choisi un peptide de séquence QDLQVVDKNSDGSVSIK (SEQ ID NO:4); - un peptide de séquence RYVPLTSREAQLR (SEQ ID NO:5) . La présente invention a également pour objet un procédé de quantification de la L- isoaspartyl méthyltransférase dans du matériel végétal, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériel avec un anticorps anti-Lisoaspartyl méthyltransférase conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase conforme à l'invention pour déterminer la vigueur germinative et/ou l'aptitude à la conservation d'un lot de semences. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant la mise en évidence de la corrélation entre la quantité de L-isoaspartyl méthyltransférase et l'aptitude des graines à la conservation, ainsi que l'obtention d'un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase et son utilisation pour évaluer la qualité germinative de semences de différentes espèces. EXEMPLE 1: IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D'UN MUTANT 25 DE REGULATION DE LA L-ISOASPARTYL METHYLTRANSFERASE CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA Le criblage de la collection de transformants ADN-T d'Arabidopsis thaliana de l'INRA de Versailles, a permis d'isoler un mutant d'insertion au niveau du gène de l'IAMT. Ce mutant a été dénommé atpcml.lT. Les données de séquençage montrent que l'insertion ADN-T est localisée à 173 paires de bases en amont de l'ATG, dans la région promotrice du gène de la Lisoaspartyl méthyltransférase, où elle a causé une délétion de 13 paires de bases, faisant disparaître une boîte de réponse à l'acide abscissique (boîte ABRE pour Abscissic acid-Response Element). Des plantes mutantes homozygotes pour l'insertion de l'ADN-T ont été sélectionnées pour l'étude des propriétés du mutant. dessus; NO:3) 5 parmi: 2862661 6 Expression du gène IAMT chez le mutant atpcml.l" L'expression du gène IAMT dans les plantules et dans les graines sèches chez le mutant atpcml.l", et chez la plante sauvage a été comparée par RTPCR semi-quantitative. A titre de contrôle on utilise le gène du facteur de transcription EF qui présente un profil d'expression constitutif au cours du développement chez la graine d'Arabidopsis thaliana. Les plantules sont obtenues par semis de graines sur un filtre de nylon (BUISINE, NYCOM, mailles de 5 m de diamètre) reposant sur un milieu eau gélosée 0.5%. Après stratification (4 C, 2 jours), les boîtes sont déposées en chambre de culture pendant 4 jours. Les filtres sur lesquels sont disposées les plantules, sont ensuite transférés sur un milieu eau gélosée pendant un jour, avant que les ARN soient extraits. Les ARN totaux sont extraits des plantules ou des graines sèches selon la technique au phénol chaud de VERWOERD et al. (Nucleic Acids Res., 1989, 17(6): 2362), modifiée par l'ajout d'une seconde précipitation au LiCl (2 M final) de 6 heures. La purification des poly(A)+ est réalisée à partir des ARN totaux à l'aide d'oligo(dT)25 fixés à des billes magnétiques s Dynabeads (DYNAL). Le premier brin d'ADNc est synthétisé par rétrotranscription (RT) des ARNm poly(A)+. L'amplification par PCR est réalisée sur 10 ng du produit de RT. On utilise pour le gène de la L-isoaspartyl méthyltransférase, l'un des couples d'amorces suivants: AMEAs: GCT ATG GAG GCT GTG GAT AGA GG (SEQ ID NO:6) AQLRa: TCA GTC CCC TCT CAG CTG CGC (SEQ ID NO:7) ou GTGYs: GGA CCG GGT ACT TAA CTG CTT (SEQ ID NO:8) AQLRa et pour le gène du facteur d'élongation EFa, le couple d'amorces suivant: FI aA4-low: TTG GCG GCA CCC TTA GCT GGA TCA (SEQ ID NO:9) F 1 aA4-up: ATG CCC CAG GAC ATC GTG ATT TCA T (SEQ ID NO:10) 2862661 7 La PCR est arrêtée à 15, 18 ou 21 cycles afin d'anticiper le moment où l'amplification n'est plus linéaire, donc plus interprétable en termes de quantités initiales. Les produits de PCR sont déposés sur un gel d'agarose (0.8%) puis transférés, en milieu alcalin (soude 0,4 N) sur membrane de nylon, et cette dernière est hybridée avec une sonde radiomarquée spécifique du gène IAMT (sonde IAMT) ou avec une sonde radiomarquée spécifique du gène EF. La quantification du signal d'hybridation est effectuée avec le logiciel MacBas . Résultats obtenus dans les plantules de 5 jours: Ces résultats sont illustrés par la Figure 1. Légende de la Figure 1: (A) Gel d'électrophorèse; (B) Autoradiographie après hybridation avec la sonde; (C) Quantification des signaux; WT: plantules sauvages; Atpcm: plantules du mutant atpcml.l- a: 15 cycles de PCR; b: 18 cycles de PCR; c: 21 cycles de PCR Ces résultats montrent que le gène s'exprime 1.5 fois plus chez le sauvage que chez le mutant. Cette expérimentation a également été effectuée à partir de plantules qui, après un passage de 4 jours en chambre de culture ont été transférées sur un milieu eau gélosée contenant 100 M d'acide abscissique, pendant un jour avant l'extraction des ARN. Les résultats sont illustrés par la Figure 2: Légende de la Figure 2: (A) Autoradiographie après hybridation avec la sonde; (B) Quantification des signaux; WT: plantules sauvages; Atpcm: plantules du mutant atpcml.l- a: 15 cycles de PCR; b: 18 cycles de PCR; c: 21 cycles de PCR Ces résultats montrent que les plantules sauvages surexpriment le gène IAMT en présence d'ABA, ce qui confirme les observations précédemment effectuées par MUDGETT M.B. et al (Plant. Mol. Biol., 1996, 30: 723-737, précité), et qu'elles accumulent 3 fois plus de transcrits IAMT que les plantules atpcml.T. Le mutant atpcml. ra visiblement perdu sa capacité d'induire l'expression de l'IAMT en présence d'ABA dans les plantules. Cette donnée permet de confirmer que la région 2862661 8 délétée par la mutation contient bien une séquence régulatrice (boîte ABRE) impliquée dans la réponse à l'ABA Résultats obtenus dans les graines sèches: Les résultats sont illustrés par la Figure 3: Légende de la Figure 3: (A) Autoradiographie après hybridation avec la sonde; (B) Quantification des signaux; WT: graines sauvages; Atpcm: graines du mutant atpcml.T a: 15 cycles de PCR; b: 18 cycles de PCR; c: 21 cycles de PCR. On n'observe aucune accumulation des transcrits IAMT dans les graines sèches de la plante sauvage, ce qui confirme les observations précédemment effectuées par MUDGETT M.B. et al (PlanT. Mol. Biol., 1996, 30: 723-737, précité). En revanche, le mutant atpcml.l- accumule le transcrit IAMT à un niveau non négligeable dans la graine sèche. EXEMPLE 2: INFLUENCE DU VIEILLISSEMENT ACCELERE SUR LA VIGUEUR GERMINATIVE DES GRAINES D'ARABIDOPSIS THALIANA DE TYPE SAUVAGE, OU DU MUTANT ATPCM1.1Des expérimentations de vieillissement accéléré ont été effectuées sur des graines fraîchement récoltées afin de tester s'il existe une différence de 20 viabilité entre le type sauvage et le mutant atpcml.l-. Le vieillissement accéléré est réalisé à 40 (étuve Jouan) et 48% HR (obtenu avec le sel Mg(NO3)2 saturé) (bocal hermétique et graines dans sachets en papier filtre stériles). La température et l'humidité sont contrôlées avec Testostor 175 (Testo). Des échantillons sont prélevés au bout de 2, 6 et 9 semaines de vieillissement et un test de germination est effectué sur 200 graines. La germination se fait en boîte de Pétri (diamètre 55 mm) sur milieu aqueux additionné de MES (acide 2-N-Morpholino Ethane Sulfonique) à 0,58 g/1, ajusté à pH 5,9, et solidifié par l'agar (7g/1). Le semis est effectué sous hotte à flux laminaire, à raison de 25 graines par boîte, disposées régulièrement sur le milieu pour mieux repérer le début de la germination. Les graines semées sont observées quotidiennement à la loupe. Une graine est considérée comme germée lorsque la radicule est visible à la loupe. Chaque essai comprend 8 répétitions de 25 graines et les moyennes 35 des pourcentages de graines germées après 3 jours d'imbibition sont reportées sur le graphe. Une graine est dite germée lorsque la radicule est visible. 2862661 9 La germination se fait en boîte de Pétri (diamètre 55mm), à raison de 25 graines par boîte, sur milieu aqueux solide (agar 7g/1) complété avec 0,58 g/l de MES (acide 2-N-Morpholino Ethane Sulfonique) et ajusté à pH 5,9. Ce test est effectué dans différentes conditions de température: (1) une alternance de températures 20-25 C, qui correspond aux conditions optimales pour la germination et permet de mesurer la viabilité des semences; (2) une température de 15 C, et une température de 27 C, qui sont légèrement pénalisantes pour la germination; une baisse de la capacité germinative dans ces conditions reflète une baisse de vigueur germinative du lot de semences. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Légende de la Figure 4: Capacité germinative 3 jours après semis, à 2025 C (A), 15 C (B), et à 27 C (C), en fonction de la durée de stockage. É : graines sauvages; ^: graines du mutant atpcml.l- La cinétique de germination effectuée avec une alternance de température 20-25 C (Figure 4 A) ne montre pas de différences significatives dans la capacité de germination des graines du mutant et du type sauvage. En revanche, lorsque les graines sont imbibées à 15 et 27 C (Figures 4 B et C), qui sont des températures pénalisantes pour la germination d'Arabidopsis thaliana et où des différences de vigueurs germinatives peuvent être mises en évidence, il apparaît que la vigueur germinative des graines de type mutant, à partir de 6 semaines de vieillissement accéléré, est supérieure à celle des graines de type sauvage d'environ 30%. EXEMPLE 3: PRODUCTION D'ANTICORPS ANTI IAMT. 2 peptides de la région C-terminale de l'isoaspartyl méthyltransférase d'Arabidopsis thaliana: QDLQVVDKNSDGSVSIK (SEQ ID NO:4; peptide 1), et: RYVPLTSREAQLR (SEQ ID NO:5; peptide 2) ont été choisis comme immunogènes. Les anticorps ont été préparés chez le lapin selon le protocole 30 suivant: Après prélèvement de 1,5 ml de sérum pré-immun , L'immunisation des lapins est effectuée par une première injection du peptide choisi (4 mg en solution dans 200. g de peptide dans 5 ml d'une solution contenant la protéine porteuse KLH mélangé à 5 ml de l'adjuvant de Freund's, suivie d'injections de rappel 1, 2, 4, 8 et 15 semaines après la lé' injection. Le sérum immun (50m1) est prélevé 20 semaines après la l fe injection. 2862661 10 Les anticorps sont purifiés par chromatographie d'affinité sur une colonne de SEPHAROSE 4F (PHARMACIA) activé au bromure de cyanogène, greffée avec 20 mg du peptide par gramme de gel Sépharosé utilisé comme immunogène. 5 ml de sérum préalablement dilué dans 5 ml de PBS lx (NaC-140-mM; KCl 2, 5 mM; Na2HPO4 8,1 mM; KH2 PO4 15 mM; pH 7,2) sont appliqués sur la colonne. Le gel est lavé 3 fois par 10.ml de PBS lx. L'élution est effectuée par passage de 10.ml d'une solution 0,2 M glycine/0,15 M Nacl pH2. Les fractions éluées sont collectées dans des tubes contenant Olml de Tris pH 8,8 (1,5 M) Les fractions contenant l'anticorps sont rassemblées, (dialysées contre une solution de PBS lx froid), puis complétées avec 0,02% d'azide de sodium. Les fractions sont conservées à 4 C. EXEMPLE 4: DETERMINATION PAR TRANSFERT DE WESTERN DE LA 15 TENEUR EN PROTEINE IAMT DANS LES GRAINES SECHES D'A. THALIANA, ET DE SON EVOLUTION AU COURS DU VIELLISSEMENT. Les anticorps anti-IAMT générés, comme décrit à l'Exemple 3 ci-dessus, contre le peptide I (anticorps 1) ont été utilisés pour déterminer la teneur en L-isoaspartyl méthyltransférase de graines sèches d'Arabidopsis thaliana de type sauvage et de type mutant fraîchement récoltées ou vieillies pendant 2, 6 et 9 semaines comme décrit à l'Exemple 2 ci-dessus. Extraction des protéines des graines: Les graines sont broyées dans l'azote liquide jusqu'à l'obtention d'une fine poudre. La poudre est transférée au tiers d'un tube EPPENDORF de 2 ml complété avec du tampon de LAEMMLI 2X (LAEMMLI U.K., Nature, 1970, 227: 680) préalablement chauffé à 100 C. Les échantillons sont incubés à 100 C durant 5 minutes avant d'être centrifugés à 4 C (6000g, 5 minutes). Le surnageant est récupéré, aliquoté et conservé à -20 C. Préalablement à l'utilisation, 100 l de surnageant sont précipités dans un volume équivalent d'acide trichloracétique à 20% (13000 rpm, 5 minutes). Le culot est lavé avec 200 l d'acétone 80%, séché et repris dans 1 ml de soude 0.2N. La concentration est déterminée par mesure de l'absorbance à 595 nm du complexe protéine-réactif de Bradford (Bio-Rad). La sérum albumine bovine est utilisée pour obtenir une courbe étalon. 2862661 11 Transfert de Western: L'électrophorèse des protéines (10 g) est conduite en conditions dénaturantes (SDS 0.1%) sur un gel de polyacrylamide (12%) conformément à LAEMMLI (Nature, 1970, 227: 680). Le transfert semi-sec est effectué sur une membrane de nylon de type HYBOND C (AMERSHAM) sous un courant de 20V pendant 50 minutes. La membrane est ensuite incubée 40 minutes dans une solution de PBS-T (NaCl, 1,4 M; KCl, 27 mM; Na2HPO4, 81 mM; KH2PO4, 150 mM; Tween 20, 0,001%) à laquelle est ajouté du lait en poudre (5%) afin de saturer les sites non spécifiques. _ L'anticorps primaire anti-IAMT est ajouté (dilution 1/5000eme) et l'incubation est réalisée pendant la nuit à 4 C sous agitation. Après 3 lavages de 10 minutes avec du PBS-Tween, la membrane est incubée avec du PBS-Tween + lait additionné de l'anticorps secondaire anti-Ig G de lapin couplé à la peroxydase (Bio-Rad), durant 2 heures à température ambiante sous agitation. La membrane est à nouveau lavée 2 fois avec du PBS-Tween. La révélation est effectuée par chimioluminescence, en utilisant le kit COVALIGHT, dans les conditions préconisées par le fabricant (CovalAb). Après 1 minute, la membrane est transférée sous un film autoradiographique et exposée 30 minutes. Les résultats sont illustrés par la Figure 5. Légende de la Figure 5: graines d'Arabidopsis thaliana sauvage (WT) ; graines du mutant atpcml. l - (MT) ; 2, 6, ou 9 en indice: graines vieillies 2, 6 ou 9 semaines. Dans tous les cas, une seule bande est observée. La protéine reconnue correspond à la taille attendue pour l'enzyme IAMT, ce qui montre la spécificité de l'anticorps 1 pour cette enzyme dans la graine sèche. On observe chez les graines de type sauvage, une diminution de la quantité de protéine L-isoaspartyl méthyltransférase, qui se manifeste dès 2 semaines de vieillissement accéléré, et qui se poursuit jusqu'à la fin de l'expérimentation. Au contraire, dans les graines du mutant atpcml. l- on observe une augmentation de la quantité d'enzyme au cours du vieillissement. Cette observation corrobore les résultats rapportés à l'Exemple 1, montrant l'accumulation du transcrit IAMT dans les graines sèches du mutant atpcml.l-, et peut être corrélée avec la meilleure vigueur germinative du mutant atpcml.l" après vieillissement accéléré rapportée à l'Exemple 2. Ces données indiquent que la protéine L-isoaspartyl 35 méthyltransférase constitue un marqueur intéressant de l'évolution de la vigueur germinative d'un lot de semences au cours du stockage. 2862661 12 EXEMPLE 5: UTILISATION DE L'ANTICORPS ANTI-IAMT POUR DETERMINER DE L'APTITUDE A LA CONSERVATION DE SEMENCES DE MAÏS ET DE HARICOT. Des expérimentations complémentaires ont été effectuées afin de vérifier si l'anticorps obtenu contre la L-isoaspartyl méthyltransférase d 'Arabidopsis thaliana reconnaissait également les enzymes orthologues d'autres espèces végétales, et si l'IAMT constituait également chez ces espèces un marqueur de l'aptitude à la germination. Deux espèces d'intérêt agronomique ont été choisies pour ces expérimentations: le maïs (monocotylédone) et le haricot (dicotylédone). Les graines de maïs (récoltes 1996, 1999, 2000 et 2001) et les graines de haricot (récoltes 2000 = lot 178 et 2001 = lot 197) sont d'abord surséchées à 20% HR ( 28 C) en étuve ventilée. Pour déterminer la teneur en eau, 10 g de graines sont grossièrement broyés et pesés avant d'être chauffés à sec (130 C, 1 heure). La poudre de graines est refroidie sous vide et repesée (la précision est au dix millième de gramme). On peut ensuite estimer la teneur en eau initiale des graines après surséchage selon la formule: Mi = masse de graines avant chauffage Mf = masse de graines après chauffage TEi = teneur en eau initiale Dans les conditions utilisées, la teneur en eau finale du maïs est calculée à 11.28% et celle des 2 lots de haricot est calculée à 9.35% pour le lot et 11.51% pour le lot. Afin de déterminer la masse d'eau à ajouter à une masse de graines connue pour fixer sa teneur en eau à la valeur souhaitée, on utilise la formule suivante: TEi = teneur en eau initiale TEf= teneur en eau finale Mi = masse de graines M2 = masse d'eau finale Les graines sont placées dans un récipient étanche contenant le volume d'eau calculé. L'imbibition est réalisée pendant 3 jours sous agitation. Vieillissement chez le maïs: Dans les conditions de conservation classique, les lots de semences 30 de maïs récoltés en 2001 et 2000 germent à 100 %, le lot de semences récolté en 1999 germe à 96 % et le lot de semences récolté en 1996 germe à 75 %. Mi - Mf Mi = TEi Mi(TEi -TEf) = M2 TEf - 1 2862661 13 Afin de réaliser la dégradation contrôlée du maïs, la teneur en eau de la graine est fixée à 17%. Le vieillissement est conduit à 45 C. Un échantillon est prélevé au bout de 1, 3 et 5 jours de vieillissement et un test de germination est effectué sur 200 graines. Dans ces conditions, on obtient une incapacité totale à germer en 5 jours, comme le montre la Figure 6A. Légende de la Figure 6A: Pourcentage de germination en fonction de la durée de la dégradation contrôlée. Les protéines sont extraites des graines sèches issues des récoltes de 1996, 1999, 2000, et 2001, et non vieillies artificiellement, ainsi que des graines récoltées en 2001 vieillies artificiellement, et analysées en transfert de Western en utilisant l'anticorps 1, comme décrit à l'Exemple 4 ci- dessus. Les résultats apparaissent sur la Figure 6B. Légende de la Figure 6B: 96, 99, 00, 01: année de récolte; (Tl), (T3), (T5) jours: 1, 3, et 5 jours de vieillissement. On observe 2 protéines de poids moléculaires 40 kDa et 55 kDa reconnues par l'anticorps 1. Ces protéines ne sont pas détectables dans les graines récoltées en 1996, pour lesquelles le pourcentage de germination, mesuré parallèlement, est de 75%. La teneur en protéine de 40 kDa est maximale dans les graines issues de la récolte de 2001, puis elle décroît ensuite avec l'âge de la récolte. Dans les grains de 1999, elle est à peine détectable, alors que le pourcentage de germination de ces graines, est encore de 96%. La teneur en protéine de 55 kDa demeure au contraire relativement stable entre les récoltes de 1999 et de 2001. En vieillissement accéléré, la quantité de protéine de 55 kDa demeure stable pendant le premier jour de vieillissement accéléré, puis elle n'est plus détectable. La protéine de 40 kDa n'est plus détectable dès le premier jour de vieillissement accéléré.. Il apparaît donc que la disparition des protéines de 40 et 55 kDa reconnues par les anticorps anti-IAMT précède le déclin de la capacité germinative. Ces protéines, et notamment la protéine de 40 kDa sont doncutilisables en tant que marqueur prédictif de vieillissement du grain. Vieillissement chez le haricot: 2 lots de semences de haricot sont équilibrés à 16% de teneur en eau et placés en bocaux hermétiques à 40 C. Un échantillon est prélevé au bout de 3, 7, 11 et 14 jours de vieillissement et un test de germination est effectué sur 50 graines. Les résultats sont illustrés par la Figure 7A. 2862661 14 Légende de la Figure 7A: Faculté germinative, exprimée pour 100 graines, en fonction de la durée de la dégradation contrôlée. O: lot 197 ^: lot 178 Ces résultats montrent que les 2 lots ne se comportent pas de la même manière dans des conditions semblables de dégradation puisque le lot 178 (récolte de 2000) atteint 45% de germination au terme de 3 jours de vieillissement alors que ce pourcentage de germination est atteint en 9 jours pour le lot 197 (récolte de 2001). Les protéines issues des graines sèches de haricot, provenant des récoltes de 2000 et de 2001, ainsi que des graines vieillies artificiellement à partir de ces 2 récoltes, ont également été caractérisées en Western blot à l'aide de l'anticorps 1. Les résultats sont illustrés par la Figure 7B. Légende de la Figure 7B: 178 (récolte de 2000) ; 197 (récolte de 2001) ; (T3), (T7), 15 (Tl 1) jours: 3, 7, et 11 jours de vieillissement. L'anticorps 1 met en évidence 2 ou 3 protéines d'une taille d'environ 46 kDa. On observe que le lot 197, qui présente une meilleure aptitude à la conservation en vieillissement accéléré que le lot 178, contient une plus importante quantité de protéines reconnues par l'anticorps 1. En vieillissement accéléré, le lot 197 (récolte 2001) montre une baisse de la concentration de cet ensemble de protéines pour les temps de vieillissement qui précède la perte de viabilité. Le lot 178 (récolte 2000), dont la capacité germinative a chuté dès le 3ème jour de vieillissement, ne présente pas de diminution sensible de la quantité de protéines reconnues par l'anticorps 1. Ces résultats montrent qu'un anticorps anti-IAMT conforme à l'invention permet de mettre en évidence des différences d'aptitude à la conservation entre lots de semences, aussi bien dans des conditions de conservation naturelle, telles que celles utilisées par les semenciers, qu'en situation de détérioration contrôlée. 2862661 15 REVENDICATIONS 1) Procédé de détermination de la vigueur germinative et/ou de l'aptitude d'un lot de semences à la conservation, caractérisé en ce qu'il comprend la quantification de la L-isoaspartyl méthyltransférase, sur un échantillon de semences prélevé sur ledit lot. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantification de la L-isoaspartyl méthyltransférase est effectuée à l'aide d'un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase. 3) Anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide constitué par tout ou partie de la portion de ladite enzyme définie par la séquence peptidique (I) suivante: QXILX2VX3DKX4X5DGSX6X7X8X9XI0X11X12SVRYVPLTSRX13X14QLX 15X16X17(SEQ ID NO:1), dans laquelle X1 représente D ou E, X2 représente Q ou K, X3 représente V ou I, X4 représente N ou S, X5 représente S, E, ou A, X6 représente soit un dipeptide choisi parmi VS, VT, et TS, soit une liaison peptidique, X7 représente I ou V, X8 représente K, Q ou R, X9 représente D, V ou N, X10 représente soit le dipeptide HT, soit une liaison peptidique, X11 représente E ou D, X12 représente T ou A, X13 représente E, V ou S, X14 représente A ou E, X15 représente R, G ou Q, Xi6 représente G ou D, X17 représente D ou F. 4) Anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide choisi parmi: (i) un peptide de séquence (II) : QXILX2VX3DKX4X5DGSX6X7X8 (SEQ ID NO:2), dans laquelle XI, X2, X3, X4 X5, X6, X7 et X8 sont tels que définis dans la revendication 3; (ii) un peptide de séquence (III) : RYVPLTSRX13X14QLX15 (SEQ ID NO:3), dans laquelle X13, X14 et X15, sont tels que définis dans la revendication 3. 5) Anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide choisi parmi: (i) un peptide de séquence QDLQVVDKNSDGSVSIK (SEQ ID NO:4); (ii) un peptide de séquence RYVPLTSREAQLR (SEQ ID NO:5) . 6) Procédé de quantification de la L-isoaspartyl méthyltransférase dans du matériel végétal, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact dudit matériel avec un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase selon l'une quelconque des revendications 3 à 5. 7) Utilisation d'un anticorps anti-L-isoaspartyl méthyltransférase selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 pour déterminer la vigueur germinative et/ou l'aptitude à la conservation d'un lot de semences.