Brevet FR2864832A1 — publié le 20050708

CLONES DE TRICHODERMA HARZIANUM, PROCEDE D'ISOLEMENT ET DE CULTURE ET APPLICATION COMME PRODUIT PHYTOSANITAIRE DESCRIPTION La présente invention concerne essentiellement des clones de Trichoderma harzianum, un procédé d'isolement et de culture de ces clones et l'application de ceux-ci en tant que produits phytosanitaires utilisables dans le cadre de la lutte biologique contre les champignons responsables des maladies du bois de la vigne: Esca (Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia punctata, Phellinus igniarius, Phellinus viticola et Eutypa lata), Eutypiose (Eutypa tata et Botryospheria spp), Excoriose (Phomopsis viticola et Botryosphaeria spp), dépérissement de la Syrah (Botryospheria obtusa), Black Dead Arm (Botryospheria dothidea), Symptômes de greffés-soudés (Botryospheria Stevensii). Les clones de Trichoderma harzianum (Classification de Rifai), isolés par le déposant, ont été déposés auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur le 4 Mai 1995 sous le numéro I-1571 pour le premier et le 26 Décembre 2003 sous le numéro 1-3151 pour le second. On rappelle que le genre Trichoderma est un groupe agronomiquement important car il comprend des champignons agents de biocontrôle dont le mode d'action a fait l'objet de nombreux travaux. Des études récentes font en effet état d'une capacité de ce champignon filamenteux à intervenir selon divers mécanismes: mycoparasitisme, antagonisme (compétition), antibiose (production d'antibiotiques), stimulation racinaire, stimulation de la croissance par solubilisation de minéraux fertilisants, stimulation des défenses naturelles des plantes, etc. Le procédé d'obtention des clones selon l'invention, prévoit: - une phase de prélèvement dans un endroit approprié, c'est à dire connu pour renfermer des populations de champignons Trichoderma spp et plus spécifiquement le Trichoderma harzianum; - une phase d'isolement des champignons Trichoderma spp sur milieux sélectifs; - une phase d'isolement monoclonal (purification des isolements) de différents clones dans le but de générer une mycothèque , laquelle sera par la suite confrontée, pour chacun de ses membres, aux clones des différents pathovars revendiqués par la présente invention; - la sélection des clones les plus performants; - la méthode de culture et de développement de ces clones. Par la suite, l'aspect cultural de ces clones a été identifié. Il se caractérise par une colonie d'abord blanche puis devenant verte, d'aspect irrégulier et s'organisant en agrégats plus ou moins condensés. Le revers est incolore, jaune ou brun. L'observation microscopique à faible grossissement révèle des arborescences terminées par des formations sphériques irrégulières ( têtes ) qui se différencient à partir d'un mycélium plus ou moins dense, étalé sur le milieu gélosé. A plus fort grossissement, l'organisation des structures conidiogènes est telle que des ramifications se répartissent perpendiculairement et de façon opposée de part et d'autre d'un axe principal, le conidiophore. Les cellules conidiogènes (phialides) apparaissent ampulliformes. Les spores, à paroi lisse, sont de forme ovalaire et de couleur verte (environ 3 pm de diamètre). Les caractères culturaux des clones selon l'invention ont donc permis de confirmer qu'ils appartiennent bien à l'espèce Trichoderma harzianum décrite selon la classification morphologique de Rifai. La température de croissance optimale du Trichoderma harzianum est de 20 à 25 C sur milieux classiques comme le malt-agar, le PDA, pulpe de betterave, flocons d'avoine, avec un pH compris entre 4 et 7. La croissance est aérobie, la sporulation plus importante sur un milieu riche. Selon l'invention, le procédé d'isolement des clones et de confrontation aux pathogènes, a pour objectif d'obtenir des clones montrant: - d'une part une croissance rapide afin qu'ils puissent être les plus efficaces vis à vis des pathogènes et présentant la plus importante production de spores par unité de milieu gélosé; - d'autre part une production importante de composés antifongiques, production évaluée par comparaison des pouvoirs antagonistes à distance. Enfin, un pouvoir antagoniste puissant par contact. Les deux derniers points seront développés dans les exemples 1 et 2. Le procédé d'isolement selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - Prélèvement des champignons du genre Trichoderma dans un milieu adéquat comme un sol humide (sols maraîchers, viticole ou arboricole, matières organiques en décomposition) ou dans des bois pourris issus de ceps de vigne ou de branches d'arbres fruitiers. - Isolement de la population de champignons Trichoderma prélevée, sur des milieux spécifiques choisis. Les milieux nutritifs spécifiques sont: - Milieu TME de Papavizas (1982) : un mélange de glucose (1g), gélose (20 g) et d'eau distillée (800 ml) est autoclavé. On ajoute 200 ml de V-8, le pH doit être compris entre 3,8 et 4. Au milieu encore tiède, on ajoute alors du sulfate de néomycine (100 mg), de la bacitracine (100 mg), de la pénicilline G (100 mg), du chloronèbe (100 mg), de la nystatine (20 mg), de la chlortétracycline HCI (25 mg), du propionate de sodium (500 mg). - Milieu TSM d'Elad et al. (1981) : Ce milieu est constitué de MgSO4, 7 H2O (0,2 g); K2HPO4 (0,9 g); KCI (150 mg); NH4NO3 (1 g); glucose (3 g); Chloramphénicol (250 mg); Fénaminosulf (300 mg); quintozène (200 mg); rose bengale (150 mg); gélose (20 g); eau distillée (1000 ml). - Milieu de Davet (1979) : Ca(NO3)2 (1g) ; CaCl2, 2H20 (1 g) ; KNO3 (250 mg) ; MgSO4, 7H20 (250 mg) ; KH2PO4 (125 mg) ; saccharose (2 g) ; acide citrique (50 mg) ; gélose (25 g); eau distillée (1000 ml). Après autoclavage, le pH est ajusté à 4,5 avec du HCI 1 N et on ajoute au milieu tiède du sulfate de streptomycine (30 mg), de la vinchlozoline (2, 5 mg) et de l'alcool allylique (0,5 ml). Dans le cas d'un prélèvement de sol, la technique d'isolement utilisée est celle de l'incorporation directe du sol. Le milieu sélectif d'isolement étant coulé et maintenu en surfusion en boîtes de Pétri (37 à 40 C), une faible quantité de terre est saupoudrée et immédiatement dispersée dans le milieu par agitation jusqu'à solidification. Les cultures sont alors mises en incubation pendant plusieurs jours. On procède alors à l'examen, au dénombrement puis à l'isolement des colonies. Connaissant la quantité de l'échantillon de terre avant et après l'ensemencement, on peut donc connaître la masse de terre analysée et par voie de conséquence, calculer le nombre de propagules présentes par gramme de terre. Dans le cas d'un prélèvement de matières organiques en décomposition ou de bois pourris, la technique d'isolement utilisée est celle des suspensions dilutions Après tamisage et broyage en présence d'eau stérile, différentes dilutions successives de la suspension obtenue sont incorporées dans le milieu d'isolement. Pour ce faire, 10 ml de chacune des dilutions sont versés dans un erlenmeyer contenant 90 ml de milieu sélectif d'isolement maintenu en surfusion au bain-marie (entre 37 C et 40 C). Après homogénéisation, les 100 ml sont répartis dans des boîtes de pétri placées dans les conditions optimales d'isolement des Trichoderma. Après un temps d'incubation de 3 à 7 jours, on repère la dilution présentant un nombre de colonies suffisant mais sans confluence. La dilution étant choisie, on peut procéder à l'isolement des colonies. Après croissance des colonies de population de Trichoderma en boîte de Pétri à 24 C, à la lumière pendant 3 à 7 jours, on procède à la purification des isolements, c'est à dire à l'isolement monosporal de chacune des colonies. Pour cela, pour chaque colonie, les spores de couleur verte sont prélevées, puis mises en suspension dans l'eau stérile afin de les dissocier. On réalise une culture séparée pour chaque spore dissociée sur un milieu gélosé riche tel le PDA ou flocons d'avoine en boîte de Pétri. Après 48 heures, l'ensemble des spores est remis en suspension et le titre est ajusté à 106 spores/millilitre. Dans le but d'obtenir les clones présentant la meilleure croissance et la meilleure production de spores, différents tests ont été mis en place pour évaluer la qualité des clones: en ce qui concerne la croissance, l'objectif est de sélectionner les clones capables de se développer le mieux sur milieu pauvre ou à des températures basses de l'ordre de 15 C. Le procédé de sélection est caractérisé en ce qu'il comprend: - pour la croissance en milieu pauvre: un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans le point 3 que l'on inocule dans un milieu gélosé pauvre, par exemple à l'extrait de malt (20 g/I) en boîte de Pétri et incubé à 24 C. - pour la croissance à basse température: un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans le point 3 que l'on inocule dans un milieu gélosé riche, par exemple au PDA (40 g/1) en boîte de Pétri et incubé à 15 C. - pour l'évaluation de la meilleure production de spores par unité de surface de milieu gélosé : un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans le point 3 que l'on inocule dans un milieu gélosé riche, par exemple au PDA (40 g/1) en boîte de Pétri et incubé à 24 C. Dans le but d'estimer le pouvoir antagoniste des clones vis à vis des champignons, Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia punctata, Phellinus igniarius, Phellinus viticola, Eutypa tata, Phomopsis viticola et Botryosphaeria sp, on réalise un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans le point 3. On inocule chacun des prélèvements dans une boîte de Pétri contenant du milieu nutritif malt agar (20 g/I de gélose, 15 g/I de malt). Dans ces mêmes milieux, on place un implant prélevé dans une boîte de Pétri où l'on a réalisé préalablement la croissance du pathogène concerné. On mesure alors le pouvoir antagoniste des clones soit par contact, soit à distance par rapport à la croissance témoin de ce même pathogène. L'incubation est réalisée à 25 C pendant 1 à 50 jours. Les clones qui ont démontré la plus grande performance et l'efficacité la plus importante vis à vis de l'ensemble de ces essais décrits aux points 4 et 5 sont les clones selon l'invention référencés 1-3151 et 1-1571. La présente invention concerne également un procédé de culture des clones de Trichoderma ainsi isolés et sélectionnés et de préférence les clones de Trichoderma harzianum selon l'invention. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver lesdits clones et de préférence les clones de Trichoderma harzianum selon l'invention par une méthode de culture en surface réalisée dans un fermenteur à disques de capacité 12 litres: fermentation sur milieu gélosé PDA (dextrose [20 g/I] ; infusion de pomme de terre [200 g/I] ; Agar [15 g/I] ; eau distillée [qsp 1000 ml]. Exemple 1: Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - L'inoculation du milieu de culture: le milieu est directement stérilisé dans le réacteur. - L'inoculation se réalise au moyen de 3. 10$ spores/g de substrat carboné initialement présent. Une rotation des disques à faible vitesse (10trs/min) permet de retenir le milieu à la surface des disques. - L'incubation: le fermenteur est placé dans une enceinte thermostatée à 24 C. Le temps d'incubation est de 7 jours. L'aération de la culture est réalisée par passage d'un flux d'air stérile et humidifié par barbotage dans l'eau. Le débit d'aération est de 500 ml/min. - La récolte des spores: les spores produites à la surface des disques sont récoltées par 5 lavages successifs, en introduisant dans le réacteur 2 litres d'eau distillée stérile additionnée de tween 80 à 1% et de glycérol en maintenant une rotation rapide des disques (500 trs/min) pendant 30 minutes. Les spores mises en suspension sont ensuite dénombrées sur cellule de Malassez par comptage. Un procédé stérile de mise en ampoules scellées est alors engagé. Les ampoules sont conservées au froid. Les spores peuvent être aussi séchées. On procède alors à une filtration stérile du liquide contenant les spores. Le gâteau de filtre est alors séché puis finement broyé et tamisé. Le produit final est une poudre verte, fine présentant un diamètre inférieur à 200 pm et contenant les spores viables de Trichoderma harzianum; ce produit peut se remettre aisément en suspension dans l'eau afin d'être pulvérisé ou badigeonné. Ces poudres de spores viables de Trichoderma harzianium référencés 1-3151 ou 1-1571 constituent le produit fondamental selon l'invention et peuvent être déclinées en différentes formulations pour application phytosanitaire. Ces poudres sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins 1010 spores / gramme. En outre, les produits obtenus selon l'invention et issu des clones de Trichoderma harzianium 1-3151 et 1-1571 se sont révélés non cellulolytiques. En effet, certains clones de Trichoderma, comme de nombreux micro-organismes cellulolytiques produisent de la cellulase qui dégrade la cellulose des parois végétale. Cette dégradation fait intervenir un système à composantes multiples. Trois éléments associés en un complexe enzymatique sont nécessaires pour cela: la C,-cellulase, la Cx-cellulase et la (3-glucosidase. Or, les clones de Trichoderma harzianum l-3151 et 1-1571 ne présentent aucune activité C,-cellulase (test sur cellulose microcristalline [Avicel]). Il n'existe donc aucune dégradation possible de la cellulose, constituant principal de la paroi des végétaux. Par conséquent, les produits selon l'invention ne pourront en aucun cas être la cause de dommages sur les végétaux lors de son application comme produit phytosanitaire. Exemple 2 Essai de pouvoir antagoniste (contact) des Trichoderma harzianum l-3151 et 1-1571 vis à vis de Phaeomoniella chlamydospora Le champignon pathogène Phaeomoniella chlamydospora est isolé de plantes atteintes d'Esca. Pour la multiplication, il est repiqué à partir des tubes de conservation en boîte de Pétri contenant un milieu nutritif malt agar (20 g/I de gélose, 15 gll de malt, pour 1000 ml d'eau. Le milieu est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes). La technique de confrontation entre les deux champignons est la suivante: Deux implants mycéliens de 6 mm de diamètre de chacun des deux champignons Phaeomoniella chlamydospora et Trichoderma harzianum sont prélevés d'une colonie à croissance active sur milieu malt et déposés dans la boîte de Pétri de façon diamétralement opposée. La distance entre les deux implants est de 45 mm. Du fait de la croissance lente de Phaeomoniella chlamydospora, son ensemencement est avancé de 15 jours par rapport au Trichoderma harzianum mis en confrontation. L'incubation est réalisée à 25 C pendant 1 à 21 jours. Trois répétitions sont effectuées. Le témoin correspond à la croissance du champignon seul (sans la présence de Trichoderma). Pendant la première semaine, les boites sont observées tous les jours, notées et photographiées, puis toutes les semaines. Les notations consistent à évaluer l'inhibition de la croissance de la colonie mycélienne de Phaeomoniella chlamydospora. Le taux d'inhibition I, exprimé en millimètres, correspond à la différence entre le rayon R1 de la colonie de la boite témoin et le rayon R2 qui est situé sur la droite reliant le centre entre les deux protagonistes en confrontation (I = RI R2). Le taux d'inhibition est calculé au bout de 9 jours. La lecture des résultats se fait également par observation des mycéliums en confrontation: présence d'une zone d'inhibition, recouvrement d'un mycélium par un autre, compétition spatiale, zones de mélanisation, fructifications... A la fin des confrontations, chaque implant est remis sur un milieu de culture malt agar (20 g/1 de gélose, 15 g/I de malt, pour 1000 ml d'eau. Le milieu est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes). La reprise ou non de la colonie est alors notée. Deux isolats de Phaeomoniella chlamydospora ont été testés (Pc LR81 et PcLR47) à l'encontre de deux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 11571. Les résultats sont représentés dans le tableau 1. Tableau 1: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de deux 20 isolats de Phaeomoniella chlamydospora face aux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 (mesuré au bout de 9 jours de confrontation) Pc LR81 Pc LR47 Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum I- 4,2 3 Taux d'inhibition par 5,3 4 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 16 14 L'étude du comportement des deux isolats de Phaeomoniella chlamydospora à 25 l'égard des 2 clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 a permis de montrer: Un recouvrement des deux isolats par Trichoderma harzianum l-3151 et 1-1571 L'existence de fructifications de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 sur les deux isolats. Ce test révèle donc l'importance de l'antagonisme par contact des Trichoderma harzianum 1-3151 et I-1571 vis à vis de Phaeomoniella chlamydospora: Les clones de Trichoderma harzianum I-3151 et I-1571 inhibent bien la croissance des deux isolats. Elle recouvre la colonie de Phaeomoniella chlamydospora et produit des fructifications à sa surface. La remise des implants de Phaeomoniella chlamydospora en culture montre que les deux isolats, Pc LR81 et PcLR47, ne se développent pas. Exemple 3 Essai de pouvoir antagoniste (contact) de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 vis à vis de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa tata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii Les champignons pathogènes Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata sont isolés de plantes atteintes d'Esca. Le champignon pathogène Eutypa tata est isolé de ceps atteints d'Eutypiose. Les champignons pathogènes Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea et Botryosphaeria stevensii sont isolés de ceps soit atteints par le dépérissement de la Syrah, soit manifestant des symptômes de Black Dead Arm ou encore de greffés-soudés. Pour la multiplication, ils sont repiqués à partir des tubes de conservation boîte de Pétri contenant un milieu nutritif malt agar (20 g/1 de gélose, 15 g/I de malt, pour 1000 ml d'eau. Le milieu est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes). La technique de confrontation est identique à celle utilisée dans l'exemple 2. Du fait de la croissance lente de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa lata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii leurs ensemencements sont avancés de 8 jours par rapport aux deux Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 mis en confrontation. L'incubation est réalisée à 25 C pendant 1 à 50 jours. Le taux d'inhibition est calculé au bout de 4 à 12 jours selon les cas. Deux isolats de Phaeomoniella aleophilum ont été testés (Pa LR3 et Pa LR23). Deux isolats de Fomitiporia punctata ont été testés (Fp LR30 et Fp LR14). Deux isolats d'Eutypa lata ont été testés (Elcc 260 et El MT 247). Deux isolats de Botryosphaeria obtusa ont été testés (Bo F 98-1 et Bo F 99-8) Un isolat de Botryosphaeria dothidea a été testé (Bd 021). Un isolat de Botryosphaeria stevensii a été testé (Bs 001). Les résultats sont représentés dans les tableaux suivants. Tableau 2: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de deux isolats de Phaeomoniella aleophilum face aux clones de Trichoderma harzianum I-5 3151 et l-1571 (mesuré au bout de 4 ou 12 jours de confrontation) Pa LR3 Pa LR23 Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum I- 10,7 3,5 Taux d'inhibition par 9,3 3,8 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 17,5 15,2 Tableau 3: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de deux isolats de Fomitiporia punctata face aux clones de Trichoderma harzianum l-3151 et 10 1-1571 (mesuré au bout de 7 jours de confrontation) Fp LR30 Fp LR14 Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum I - 10, 7 7, 7 Taux d'inhibition par 8,7 10,3 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 26,7 22,7 Tableau 4: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de deux isolats d'Eutypa lata face aux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 15 (mesuré au bout de 7 jours de confrontation) - 10 - Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum 1- 9 12 Taux d'inhibition par 11,1 13,6 Trichoderma harzianum 1- Rayon de la colonie témoin 36 38,7 Tableau 5: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de deux isolats de Botryosphaeria obtusa face aux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et I-1571 (mesuré au bout de 5 jours de confrontation) Bo F 98-1 Bo F 99-8 Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum I- 27,3 24,6 Taux d'inhibition par 28,2 24,6 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 48,2 43,9 Tableau 6: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de l'isolat de Botryosphaeria dothidea face aux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 (mesuré au bout de 4 jours de confrontation) Bd 021 Taux d'inhibition par 21,7 Trichoderma harzianum I- Taux d'inhibition par 31, 7 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 48,6 - 11 - Tableau 7: Taux d'inhibition (exprimé en mm) de la croissance mycélienne de l'isolat de Botryosphaeria stevensii face aux clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 (mesuré au bout de 5 jours de confrontation) Bs 001 Taux d'inhibition par Trichoderma harzianum I- 32,7 Taux d'inhibition par 38.1 Trichoderma harzianum I- Rayon de la colonie témoin 54,1 L'étude du comportement des deux isolats de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa tata, Botryosphaeria obtusa, et de l'isolat de Botryosphaeria dothidea, et Botryosphaeria stevensii à l'égard des clones de Trichoderma harzianum 13151 et 1-1571 a permis de montrer: La présence d'une zone d'inhibition entre chacun des deux protagonistes, Un recouvrement des isolats de chaque espèce par Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 L'existence de fructifications de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 sur chacun des isolats. Ce test révèle donc l'importance de l'antagonisme par contact de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 vis à vis de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa tata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii. Les clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 inhibent bien la croissance des isolats de chaque espèce. Ils recouvrent les colonies de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa lata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii et produisent des fructifications à leur surface. La remise des implants de Phaeomoniella aleophilum Fomitiporia punctata, Eutypa lata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii en culture montre que celles-ci ne se redéveloppent pas ou que très légèrement. Les clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 - 12 - limitent fortement le développement de la croissance mycélienne des isolats de chaque espèce. Un test identique est réalisé pour démontrer le pouvoir antagoniste par contact vis à vis d'autres champignons pathogènes tels que Phellinus igniarius, Phellinus viticola, Phomopsis viticola. Dans tous les cas, les tests ont montré des résultats similaires à ceux obtenus avec les tests de confrontation cités en exemples. L'ensemble de ces tests montre bien l'intérêt des clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 pour contrôler le développement de la majorité des champignons du bois. Exemple 4 Préparation de formulation phytosanitaire Le produit phytosanitaire est obtenu en mettant en suspension dans l'eau le concentré stérile ou la poudre obtenue selon l'exemple 1, de façon à obtenir une concentration de 108 spores viables / ml de solution. Selon l'invention, le concentré ou la poudre sont mis en suspension de préférence juste avant l'application par pulvérisation ou badigeonnage sur les ceps de vigne pour les protéger contre les maladies du bois citées. Exemple 5 Adaptation des clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 pour les rendre 20 résistants à différents fongicides et bactéricides. Afin de pouvoir intégrer l'utilisation des clones de Trichoderma dans un programme de traitement incluant soit des fongicides classiques soit des bactéricides, il est nécessaire de rendre ces clones résistants à divers agents chimiques, en particulier les désinfectants des bois (cuivres, molécules de synthèses, etc..) On procède donc à une adaptation des clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 en les confrontant à des quantités croissantes de fongicides ou de bactéricides chimiques. Le procédé d'adaptation est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: Evaluation des quantités minimales inhibitrices des antifongiques ou bactéricides: l'appréciation de ces quantités se fait en observant, pour chaque fongicide ou pour chaque bactéricide, le développement des clones de Trichoderma mis en culture sur milieu gélosé à base de flocon d'avoine auquel on a ajouté des quantités croissantes du fongicide ou du bactéricide. Lorsqu'il y a arrêt de la croissance des clones de Trichoderma harzianum, la quantité minimale inhibitrice du fongicide ou bactéricide est atteinte. - 13 - une quantité de fongicide ou bactéricide, inférieure à la quantité minimale inhibitrice est ajouté à un milieu gélosé à base de flocons d'avoine et sur lequel on étend une suspension de spores de Trichoderma harzianum 1-3151 ou 1-1571. Les boîtes sont mises à incuber pendant 5 jours, à 24 C, sous lumière. Suite à ce temps d'incubation, on voit apparaître quelques colonies de Trichoderma harzianum. Ces colonies sont prélevées puis repiquées sur un milieu gélosé à base de flocons d'avoine contenant une concentration de fongicide ou de bactéricide supérieure ou égale à celle précédemment utilisée. Cette opération est répétée jusqu'à l'obtention de colonies résistantes aux quantités du fongicide ou du bactéricide habituellement utilisé en viticulture. Exemple 6 Tests d'efficacité de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 vis à vis de Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata, Eutypa tata, Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii Différents types d'essais d'efficacité des clones de Trichoderma à l'encontre des pathogènes des bois directement dans les plants de vigne ont été testés. Les premiers concernent les capacités des Trichoderma à coloniser les porte-greffes, les seconds à constater les performances anti-pathogéniques. Sur des jeunes plants de vigne, on applique le processus suivant: traitement au cryptonol puis greffage et chauffage optionnel, puis stratification en caisse dans une eau variant entre 28 C et 30 C pendant 3 semaines. C'est dans cette eau de trempage que sont introduits les divers micro-organismes antagonistes ou pathogènes. a) Comportement de Trichoderma dans les plants après divers traitements Les modalités testées concernent: eau courante; eau + chauffage; eau + Trichoderma 107spores par ml de produit; eau + chauffage + Trichoderma 107spores par ml de produit; eau courante + sulfate de cuivre à 10g par 1001 d' eau; eau courante + sulfate de cuivre + Trichoderma 107spores par ml de produit. On observe alors la colonisation par les Trichoderma après différentes périodes de 15 jours, en réalisant des coupes dans les bois, en observant au microscope et en mettant en milieu de culture ces dernières. On pratique quatre niveaux de coupes: 1 = Base; 2 = Oeil; 3 = sous la greffe; 4 = au- dessus de la greffe. On observe aussi les taux de reprise exprimés par la création du cal, du système racinaire et foliaire. - 14 - Matériel végétal É Lots de 30 plants par modalité soit 180 plants par porte-greffe É Essai sur 3 porte-greffes types Richter 10,504,3309 É Un seul greffon étudié. Par la suite les boutures ont été plantées en terre et en pots et des observations ont été faites deux fois par an, en vue de voir les effets de l'inoculation de Trichoderma sur le comportement de ces plants en milieu réel. Ces observations ont consisté aux prélèvements de 20 coursons ( de longueur 10 cm aux moins) pour chaque modalité. Des tests biologiques ont été effectués au laboratoire pour connaître les aptitudes de Trichoderma à s'installer dans les tissus et à créer une barrière protectrice dans le bois. b) Efficacité du Trichoderma contre la maladie en pépinières Le principe de cette étude consiste à inoculer des boutures, racinées ou non, avec les champignons pathogènes respectifs. Les champignons pathogènes Phaeomoniella aleophilum, Fomitiporia punctata sont isolés de plantes atteintes d'Esca. Le champignon pathogène Eutypa lata est isolé de ceps atteints d'Eutypiose. Les champignons pathogènes Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria dothidea et Botryosphaeria stevensii sont isolés de ceps soit atteints par le dépérissement de la Syrah, soit manifestant des symptômes de Black Dead Arm ou encore de greffés-soudés. L'efficacité potentielle du produit est jugée en fonction du comportement des plantes traitées par rapport à celui de plantes témoins (et inoculées). Le type de résultat attendu est une diminution en fréquence et/ou en intensité des symptômes foliaires. Matériel végétal Plusieurs lots de boutures sont exploités, inoculés et cultivés en serre. Trois lots différents de boutures sont ainsi utilisés: - boutures fructifères âgées d'un an, - boutures non racinées courtes , à un seul mérithalle d'une longueur de 8 à 10 cm, - boutures foliaires à deux ou trois mérithalles, longues de 25 cm à 30cm. Production de mycélium Les isolats de pathogènes et de Trichoderma ont été cultivés en boîtes de Petri sur du milieu malt-agar (respectivement 15g/I et 20 g/1) à la température de 20 à 25 C durant 7 à 21 jours. Un volume d'eau d'environ 5mL est déposé dans chacune des boîtes. Le mycélium est séparé de la gélose en grattant la surface avec un râteau - 15 - en verre ou la lame stérile d'un scalpel. Il est ensuite récupéré avec une micro-pipette et un embout dont l'extrémité a été coupée au scalpel pour permettre l'aspiration des hyphes mycéliens. Le prélèvement de mycélium est alors placé dans un tube plastique. Le volume est ajusté si nécessaire (suspension trop dense) avec de l'eau stérile. Le tube est fortement agité manuellement afin d'homogénéiser la suspension. Inoculation des boutures La technique d'inoculation utilisée est celle précédemment exploitée avec succès par Laurence Chapuis (1995) pour reproduire des nécroses dans le bois. J.P. Péros a lui aussi de son côté mis au point en 1995 un autre modèle de reproduction des symptômes foliaires avec des boutures mises à raciner dans un support artificiel (pouzzolane) : ce modèle avait permis de comparer la sensibilité de différents cépages et l'agressivité de différents isolats en quelques mois seulement. Les boutures racinées ou non racinées et cultivées en serre ont donc été inoculées de la façon suivante: l'écorce sous l'oeil est désinfectée avec un coton imbibé d'alcool, un trou de 2 mm de diamètre est percé jusqu'à la moelle, environ 2 cm en dessous de l'oeil, sur l'axe orthoptique de la bouture (à la verticale de ('oeil) à l'aide d'une petite perceuse munie d'une mèche stérilisée à la flamme. Le mycélium du pathogène en suspension dans l'eau (environ 20 pl) est injecté à l'aide d'une pipette dans le trou d'inoculation qui est immédiatement recouvert par de la paraffine chaude. Les modalités de traitement sont: - une seule dose de champignons antagonistes ( Trichoderma à 107spores par ml de produit), - une dose d'inoculum du champignon pathogène seul, - une dose d'inoculum du champignon pathogène suivit 24 heures après d'une dose de champignons antagonistes, - un témoin non traité. Analyses On observe alors la colonisation par les micro-organismes après différentes périodes de 15 jours, en réalisant des coupes dans les bois, en observant au microscope et en mettant en milieu de culture ces dernières. On pratique quatre niveaux de coupes: 1 = Base; 2 = Oeil; 3 = sous la greffe; 4 = au-dessus de la greffe. On observe aussi les taux de reprise exprimés par la création du cal, du système racinaire et foliaire. Par la suite les boutures ont été plantées en terre et en - 16 - pots en vue de voir les effets de l'inoculation de Trichoderma sur le comportement de ces plants en milieu réel. L'efficacité est évaluée par au moins deux observations par an en fonction de l'amélioration constatée sur chacun des ceps (rémission des symptômes ou stabilisation) et par comparaison du comportement des ceps traités par rapport à celui des témoins. c) Efficacité de Trichoderma contre Phaeomoniella chlamydospora (Esca) et Eutypa tata (Eutypiose et Esca) Le principe de ces études a consisté : dans un premier temps, à identifier et repérer des souches malades isolées (mise en évidence de l'effet curatif) ou des souches apparemment saines (mise en évidence de l'effet préventif) dans des parcelles de vignobles atteints d'Esca, - puis à appliquer le produit, - pour observer ensuite pendant deux années consécutives au moins l'évolution de la symptomatologie dans les zones traitées ou non. Les modalités de traitement sont: - une seule dose de champignons antagonistes (10v spores par ml de produit), - deux doses d'inoculum (1 et 1/3) du champignon pathogène; soit pour Eutypa tata: 150 et 200/3 spores, et pour Phaeomoniella chlamydospora: 500 et 500/3 spores, - une seule date d'inoculation: 24 heures après l'application des produits. Méthode d'évaluation de l'efficacité Chaque cep a fait l'objet au moins d'une observation par saison. L'efficacité a été évaluée en fonction de l'amélioration constatée sur chacun des ceps (rémission des symptômes ou stabilisation) et par comparaison du comportement des ceps traités par rapport à celui des témoins. Cette méthode a conduit, pour les besoins de l'analyse statistique, à répartir les ceps en trois classes: - cep montrant un symptôme plus grave que lors de la première notation, - cep montrant un symptôme équivalent (stabilisation), cep montrant un symptôme moins grave. Les résultats sont analysés par un simple test de X2 adapté à la comparaison de deux distributions observées. Le résultat est une différence significative entre les deux distributions autorisant ensuite l'interprétation des effectifs dans les différentes classes. Le résultat agronomique est une régression des dégâts dus à ces dépérissements se traduisant par un nombre de ceps montrant un symptôme moins grave plus grand chez les ceps traités et inversement un nombre plus petit de ceps montrant un symptôme équivalent ou moins grave . Selon l'invention, les clones de Trichoderma harzianum 1-3151 et 1-1571 utilisés dans le traitement des maladies du bois en viticulture sont de préférence les clones rendus résistants aux fongicides et bactéricides suivant le procédé cité ci-dessus. -18-REVENDICATIONS 1- Clones de Trichoderma harzianum caractérisés en ce qu'il s'agit des clones de Trichoderma harzianum déposés à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous les numéros 1-3151 et l-1571. 2- Clones de Trichoderma harzianum, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils possèdent les aspects culturaux suivants - des colonies d'abord blanches puis devenant vertes, d'aspect irrégulier et s'organisant en agrégats plus ou moins condensés; - des arborescences terminées par des formations sphériques irrégulières qui se différencient à partir d'un mycélium plus ou moins dense, étalé sur le milieu gélosé, - l'organisation des structures conidiogènes est telle que des ramifications se répartissent perpendiculairement et de façon opposée de part et d'autre d'un axe principal, le conidiophore; - des cellules conidiogènes (phialides) apparaissent ampulliformes; - des spores, à paroi lisse, sont de forme ovalaire et de couleur verte (environ 3 pm de diamètre) ; - une température de croissance optimale de 20 à 25 C sur milieux classiques comme le malt-agar, le PDA, pulpe de betterave, flocons d'avoine, avec un pH compris entre 4 et 7; - une croissance aérobie, la sporulation plus importante sur un milieu riche. 3- Procédé d'isolement des clones de Trichoderma harzianum, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) prélèvement de champignons Trichoderma harzianum dans un milieu adéquat comme un sol humide (sols maraîchers, viticole ou arboricole, matières organiques en décomposition) ou dans des bois pourris issus de ceps de vigne ou de branches d'arbres fruitiers; b) isolement des populations de champignons Trichoderma harzianum prélevées, sur des milieux spécifiques choisis, de préférence le Milieu TME de Papavizas (1982), le Milieu TSM d'Elad et al. (1981) ou encore le Milieu de Davet (1979) ; c) croissance des colonies de populations de Trichoderma en boîte de Pétri à 24 C, à la lumière pendant 3 à 7 jours; d) isolements monosporaux de chacune des colonies: les spores de couleur verte sont prélevées, puis mises en suspension dans l'eau stérile afin de les dissocier; e) réalisation d'une culture séparée pour chaque spore dissociée sur un milieu gélosé riche tel le PDA ou flocons d'avoine en boîte de Pétri; - 19 - f) après 48 heures, l'ensemble des spores est remis en suspension et le titre est ajusté à 106 spores/millilitre. 4- Procédé de sélection des clones de Trichoderma harzianum obtenus selon le procédé de la revendication 3, présentant la meilleure croissance, la meilleure production de spores et le pouvoir antagonisme le plus important vis à vis des champignons responsables des maladies du bois de la vigne, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une croissance des clones de Trichoderma harzianum en milieu pauvre par un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans la revendication 3, que l'on inocule dans un milieu gélosé pauvre, notamment à l'extrait de malt (20 g/I) en boîte de Pétri et incubé à 24 C avec observation de la croissance des clones toutes les 24 heures et évaluation de la qualité de cette croissance pour les différents clones; b) une croissance des clones de Trichoderma harzianum à basse température par un prélèvement de chaque clone issu de la suspension obtenue dans la revendication 3, que l'on inocule dans un milieu gélosé riche, par exemple au PDA (40 g/I) en boîte de Pétri et incubé à 15 C avec observation de la croissance des clones toutes les 24 heures et évaluation de la qualité de cette croissance pour les différents clones. ; c) une évaluation de la meilleure production de spores par unité de surface de milieu gélosé par un prélèvement de chaque clone issu de la suspension selon la revendication 3, que l'on inocule dans un milieu gélosé riche, par exemple au PDA (40 g/I) en boîte de Pétri et incubé à 24 C; d) une estimation du pouvoir antagoniste des clones vis à vis des champignons Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia punctata, Phellinus igniarius, Phellinus viticola, Eutypa tata, Phomopsis viticola et Botryosphaeria sp, par un prélèvement de chaque clone issu de la suspension de spores, que l'on inocule dans une boîte de Pétri contenant du milieu nutritif malt agar préalablement ensemencé par le pathogène concerné avec incubation réalisée à 24 C pendant 5 jours et mesure du pouvoir antagoniste des clones soit par contact, soit à distance vis à vis du pathogène. 5- Procédé de culture des clones de Trichoderma harzianum obtenus selon le procédé de la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver lesdits clones par une méthode de culture en surface réalisée dans un fermenteur à disques (fermentation sur milieu gélosé PDA) comprenant les étapes suivantes: a) inoculation du milieu de culture effectuée dans le réacteur au moyen de 3. 108 spores/g de substrat carboné initialement présent; b) incubation réalisée en plaçant le fermenteur dans une enceinte thermostatée à 24 C pendant 7 jours; c) récolte des spores produites à la surface des disques par lavages successifs à l'eau distillée stérile additionnée de tween 80 à 1% et de glycérol; d) comptage des spores en suspension sur cellule de Malassez; e) stérilisation de leur mise en ampoules scellées, puis conservation à températures négatives. 6- Procédé d'obtention d'un produit à base de clones de Trichoderma harzianum obtenus selon le procédé de la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste a) à filtrer stérilement le liquide contenant les spores; b) à broyer et tamiser finement le filtrat préalablement séché. 7- Utilisation de clones de Trichoderma harzianum selon la revendication 1 ou 2, ou obtenus selon le procédé de la revendication 3, 4 ou 5 ou d'un produit obtenu selon le procédé de la revendication 6, comme produits phytosanitaires en tant que moyen de lutte biologique. 8- Utilisation de produits obtenus à partir de clones selon la revendication 1 ou 2, ou obtenus selon le procédé de la revendication 3, 4, 5 ou d'un produit obtenu selon le procédé de la revendication 6, comme moyen de lutte biologique et comme produit phytosanitaire, par pulvérisation ou badigeonnage des ceps de vignes, ou autres plantes pérennes. 9- Application de clones de Trichoderma harzianum selon la revendication 1 ou 2, ou obtenus selon le procédé de la revendication 3, 4, 5 ou d'un produit obtenu selon le procédé de la revendication 6, en tant que produit phytosanitaire pour lutter contre les champignons responsables des maladies du bois de la vigne et en particulier: Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia punctata, Phellinus igniarius, Phellinus viticola, Eutypa lata, Phomopsis viticola et Botryosphaeria sp, mais aussi contre les maladies des bois des arbres fruitiers, d'ornement.