Brevet FR2861463A1 — publié le 20050429

PROCEDE DE DETERMINATION DU POTENTIEL DE DEFENSE ANTIRADICALAIRE ET UTILISATION NOTAMMENT EN THERAPEUTIQUE PREVENTIVE HUMAINE ET VETERINAIRE La présente invention concerne l'évaluation des défenses antiradicalaires d'un organisme vivant. Plus précisément elle vise un procédé de détermination du potentiel de défense antiradicalaire d'un organisme vivant ou de la variation dudit potentiel antiradicalaire induite par un moyen physique (tel que notamment les rayons X, ss, y et UV), chimique ou biochimique chez un organisme vivant, d'une part, et l'utilisation de ce procédé notamment en thérapeutique préventive humaine et vétérinaire, d'autre part. Art antérieur Il est rappelé que les radicaux libres sont des substances oxydantes très réactives, qui ont un rôle important dans les phénomènes aigus (tels que traumatisme et ischémie) et qui sont impliquées dans de nombreuses pathologies chroniques. Dans les conditions biologiques normales, l'organisme vivant produit in vivo des radicaux libres et fournit naturellement les moyens nécessaires pour s'en protéger, principalement des systèmes de détoxification enzymatiques et/ou chimiques ; globalement il y a in situ un équilibre entre lesdits radicaux libres produits et lesdits systèmes de détoxification. Cependant des agressions (de diverses natures, notamment les rayonnements UV, le stress, la pollution, l'alcoolisme, le tabagisme, etc.) accroissent la formation in vivo de radicaux libres, ce qui conduit à des états pathologiques. En effet, bien que l'organisme vivant soit naturellement protégé contre les radicaux libres par lesdits systèmes de détoxification, ces derniers peuvent être débordés, la rupture de l'équilibre (i.e. le débordement) étant directement liée à des facteurs génétiques, à l'environnement, au mode de vie, etc., bref à la capacité de défense antiradicalaire dudit organisme vivant. Il est également rappelé que les radicaux libres exercent leurs effets nuisibles : au niveau cellulaire : peroxydation des acides gras polyinsaturés des membranes phospholipidiques d'où formation de peroxydes cytotoxiques entraînant phénomènes inflammatoires et mort cellulai re ; de plus, les intermédiaires radicalaires oxygénés représentent de véritables activateurs de la carcinogenèse et des maladies cardiovasculaires notamment ;et, au niveau extracellulaire : dégradation des principaux constituants d'où modification de la perméabilité et de la structure des tissus, notamment de la peau ; ces altérations contribuent à favoriser la sénescence cutanée et le vieillissement en général. Les facteurs de protection vis-à-vis des radicaux libres sont essentiellement de deux catégories : enzymatiques : la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la sélénium glutathion peroxydase ; et, chimiques : les "scavengers" (i.e. capteurs) qui bloquent les radicaux libres, d'une part, et les anti-oxydants (vitamine C, vitamine A, vitamine E, vitamine K, Se, cystéine, méthionine, ubiquinone ou coenzyme Q) qui limitent les effets des radicaux libres, d'autre part. On connaît du brevet européen délivré EP-B-0418335 un procédé d'évaluation de l'activité anti-oxydante (i.e. antiradicalaire) d'un agent chimique ou physique à tester, au moyen de la lyse d'un matériau cellulaire, notamment des hématies, par des radicaux libres. Selon ce procédé : (1 ) on met en contact, dans un milieu biologique liquide approprié, un générateur de radicaux libres et un matériau cellulaire (I) choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les cellules humaines, animales et végétales, (b) les fragments desdites cellules, et (c) les parois synthétiques contenant des liposomes, ledit matériau cellulaire, qui comporte un colorant libérable lors de la lyse par les radicaux libres, ayant été préalablement mis en contact avec un agent chimique ou physique (II) ; (2 ) on induit la libération des radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres ; et, (3 ) on évalue la lyse du matériau cellulaire par une mesure de densité optique, par rapport à un échantillon témoin contenant ledit matériau cellulaire qui n'a pas été mis en contact avec ledit agent chimique ou physique. L'un des modes préconisés pour l'évaluation de la lyse à l'étape (3 ) consiste à déterminer le temps (T) correspondant à la lyse de 50 % du matériau cellulaire, en particulier les cellules dudit matériau, et de préférence des hématies (voir à cet effet EP-B-0418335, page 4 lignes 52- 55). Ce procédé connu a été standardisé en utilisant du sang total, humain ou animal, qui est dilué, au lieu des hématies précitées isolées du sang total. Le procédé standardisé a été commercialisé avec succès sous la nomenclature de "Test KRL" (kit radicaux libres) pour déterminer notamment (i) la capacité de défense antiradicalaire d'un tissu cellulaire humain, animal ou végétal, ou (ii) les éventuelles propriétés antiradicalaires d'un agent physique, chimique ou biologique. Plus précisément, le test KRL est réalisé par 1 ) mise en contact, dans un milieu tampon approprié, (a) du sang total témoin préalablement dilué, avec (b) un agent à tester (notamment un matériau cellulaire, une substance ou une composition) et (c) un générateur de radicaux libres, 2 ) induction de la libération des radicaux libres, 3 ) suivi de la cinétique de la lyse des hématies du sang total témoin au moyen de la mesure de l'absorbance du milieu réactionnel, puis 4 ) comparaison de cette dernière avec celle du sang total témoin déterminée dans les mêmes conditions sans l'agent à tester. En variante, on peut avec ce procédé standardisé évaluer le potentiel antiradicalaire d'un sang total d'un sujet humain ou, respectivement, animal par rapport à un sang total témoin de la même variété. Selon le Test KRL on observe qu'il existe chez l'homme ou l'animal sain, une valeur moyenne de T pour exprimer la capacité de défense antiradicalaire. L'article récent de Jean-François LESGARDS et al., publié en mai 2002 dans Environmental Health Perspectives, 110 (No 5), pages 1 à 9, confirme que cette valeur moyenne constitue ou s'inscrit dans une plage moyenne. En dessous de cette plage, le sujet humain, animal ou végétal testé est réputé être dans un état pathologique ou prépathologique en raison d'une insuffisance de défense antiradicalaire. Malgré l'efficacité du Test KRL on a constaté des anomalies sur sang total dans certains cas particuliers : alors que l'on s'attendait à des valeurs de T inférieures à la normale (i. e. inférieures à la plage normale moyenne, comme cela est le cas sur les hématies), on pouvait obtenir des valeurs soit identiques soit supérieures à ladite normale. Ainsi, chez les patients diabétiques, la valeur T évaluée sur sang total est en général analogue ou supérieure à celle des sujets sains, et chez l'oignon fraîchement irradié, la résistance antiradicalaire est supérieure à celle de l'oignon non irradié. Ce sont ces anomalies, que l'on a voulu étudier, qui sont à l'origine de l'invention. Par ailleurs, de l'article de Jan STAGSTED et al., Free Radical Research, 2002, 36 (No 7), pages 779-789, on connaît le suivi de la lyse d'hématies (isolées du sang total de l'homme, de la vache, du porc, du poulet, du faisan, du rat ou du chat) induite par un agent oxydant, à savoir H202 ou des radicaux libres [provenant d'un générateur de radicaux libres qui est le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-amidinopropane)] au moyen de la mesure de l'activité de lactate déhydrogénase (LDH) ou de la teneur en hémoglobine du surnageant. Plus précisément, on suit ici la diminution de l'activité LDH ou, respectivement, la diminution de la teneur en hémoglobine. Cependant cet article, qui confirme les résultats, non publiés du Demandeur, obtenus notamment chez les chevaux, bovins, porcs et canards, ne décrit ni ne suggère la séquence des opérations selon l'invention, à savoir : hydrolyse, libération des radicaux libres et évaluation de la lyse induite par lesdits radicaux libres, pour déterminer la résistance antiradicalaire globale. Origine et but de l'invention On est parti de l'hypothèse que l'organisme vivant comprend : d'une part, des réserves antiradicalaires immédiatement disponibles, c'est- à-dire qu'il existe un potentiel antiradicalaire qui est directement mobilisé contre un choc radicalaire ou stress oxydatif, et d'autre part, des réserves antiradicalaires mobilisables (mais non directement accessibles de façon extemporanée) et qui sont normalement stockées par l'organisme ou bloquées dans l'organisme, le potentiel antiradicalaire global dudit organisme vivant étant représenté par la somme des réserves antiradicalaires immédiatement disponibles et des réserves antiradicalaires mobilisables qui sont stockées. Selon l'invention, l'on se propose de fournir un procédé permettant de déterminer le potentiel de défense antiradicalaire global en vue de remédier aux anomalies précitées. Selon l'invention, l'on se propose de fournir également une nouvelle solution technique pour résoudre le problème du dépistage, de la prévention ou de la surveillance des pathologies ou prépathologies liées à une résistance insuffisante aux radicaux libres de l'homme, des animaux (notamment les animaux à sang chaud) et des plantes. En effet, il existe un besoin (a) chez l'homme ou l'animal, de prévenir l'apparition de pathologies irréversibles telles que les maladies neurologiques dégénératives ; (b) chez le bétail, d'écarter (au plus tard au niveau de l'abattoir) les animaux susceptibles de constituer un risque pour l'alimentation humaine et d'apprécier le stress du transport ou du mode d'élevage ; et (c) chez les végétaux, de suivre la croissance puis le mode de conservation en vue d'optimiser la valeur nutritive des plantes. Un des buts de l'invention est de chercher à établir une normalité (ou plage de normalité) de défense antiradicalaire par espèce. Un autre but est de pouvoir évaluer un système de régulation des défenses par espèce. Objet de l'invention L'hypothèse visée ci-dessus s'est révélée exacte, comme démontré et illustré ci-après. En conséquence, on a pu pallier aux anomalies de l'art antérieur et atteindre les buts recherchés. Selon un premier aspect de l'invention, on préconise un procédé pour la détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global d'un organisme vivant ou d'un agent physique, chimique ou biologique, ledit procédé, qui comporte l'utilisation de radicaux libres en tant que moyen induisant la lyse cellulaire puis l'évaluation de ladite lyse cellulaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un matériau cellulaire avant ou pendant la libération, dans le milieu réactionnel résultant, de radicaux libres à partir d'un générateur de radicaux libres. On recommande en particulier un procédé pour la détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global d'un organisme vivant ou d'un agent physique, chimique ou biologique, ledit procédé, qui comporte l'utilisation de radicaux libres en tant que moyen induisant la lyse cellulaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) hydrolyse d'un échantillon (i) d'un premier matériau cellulaire d'un organisme vivant, ledit premier matériau cellulaire étant un tissu cellulaire, des cellules ou un fragment cellulaire, ou, respectivement, (ii) d'un second matériau cellulaire associé à un agent physique, chimique ou biologique, ledit second matériau cellulaire étant un produit de référence qui est un tissu cellulaire, des cellules, un fragment cellulaire ou une paroi synthétique contenant des liposomes, (ss) mise en contact, pendant ou après ladite hydrolyse, dudit échantillon avec un générateur de radicaux libres, (y) induction de la libération des radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, et (8) suivi de la lyse, par mesure optique, du premier ou, respectivement, du second matériau cellulaire, par rapport à un échantillon témoin, pour apprécier le potentiel antiradicalaire global dudit organisme vivant ou, respectivement, dudit agent physique, chimique ou biologique à tester. La mesure optique est ici réalisée au moyen d'un spectromètre. On mesure avantageusement la densité optique ou l'absorbance du milieu d'essai. Selon un second aspect de l'invention, on préconise l'utilisation de ce procédé pour dépister, prévenir ou surveiller in vitro les pathologies et états prépathologiques de l'organisme vivant liés à un potentiel de défense antiradicalaire anormal. Dans cette optique, on préconise une telle utilisation vis-à-vis des maladies neurologiques dégénératives, notamment : - l'encéphalite spongiforme, qu'il s'agisse de l'encéphalite spongiforme bovine (BSE ou maladie de la vache folle), de l'encéphalite spongiforme ovine (OSE ou tremblante du mouton) ou de l'encéphalite spongiforme humaine (CJD ou maladie de Creutzfeld-Jakob), - la maladie d'Alzheimer, et - la maladie de Parkinson. On préconise enfin une nouvelle utilisation, caractérisée en ce que l'on fait appel à une substance antiradicalaire pour la préparation d'un médicament destiné à un usage préventif en thérapeutique humaine ou vétérinaire vis-à-vis de l'encéphalite spongiforme, de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Brève description des dessins Dans les dessins annexés : - la figure 1 illustre le mécanisme de la variation de densité optique (DO) ou de l'absorbance par la lyse de cellules, ici des cellules sanguines ; - la figure 2, illustre schématiquement le mode de détermination de DO et des autres paramètres : on mesure la DO initiale (moyenne des cinq premières valeurs) et la DO finale (moyenne des cinq dernières valeurs minimales), on en déduit la valeur DO, qui est telle que DO = 0,5 x (DO initiale-DO finale), on calcule la valeur T qui est le temps de DO [la valeur T est le temps qui correspond à l'intersection de la droite horizontale passant par DO avec la courbe DO = f (T)] ; mesure la vitesse maximale (Vmax) de lyse radicalaire comme étant la pente de la courbe au voisinage de son point d'inflexion (DO, T ), et on détermine le temps de latence (LT, "lag time") comme étant le temps correspondant à l'intersection de la droite DO initiale avec la droite de Vmax ; - la figure 3 montre les courbes Absorbance = f (T) dela quercétine et de son homologue glycone, l'isoquercitrine, à des concentrations croissantes (0 à 100 M) sans l'hydrolyse préalable de l'invention ; - la figure 4 donne les courbes T = f (concentration en quercétine ou isoquercitrine) établies sans hydrolyse préalable à partir des courbes de la figure 3 ; - la figure 5 permet de comparer les courbes T = f (concentration) de la quercétine et de l'isoquercitrine obtenues avec hydrolyse enzymatique préalable, d'une part, et sans ladite hydrolyse préalable, d'autre part ; - la figure 6 montre l'influence du traitement de vignes au moyen d'un engrais foliaire par rapport aux vignes non traitées. Description détaillée de l'invention Les anomalies précitées sont expliquées, selon l'invention, par une mobilisation anormale des réserves antiradicalaires de l'organisme vivant. Ainsi chez les diabétiques, (i) la résistance antiradicalaire du sang total, qui est anormalement élevée, traduit une mobilisation anormale au niveau du plasma des réserves antiradicalaires, et (ii) eu égard au stress oxydant développé chez lesdits diabétiques, la résistance antiradicalaire des hématies, qui sont fragilisées par des réactions de glycosylation, est anormalement faible. Selon l'invention, on considère que les réserves antiradicalaires mobilisables résultent notamment : # d'une polymérisation de composés antioxydants et/ou # d'une conjugaison desdits composés antioxydants avec différents sucres (par exemple glucose, rhammose, acide glucuronique, etc. ), alcools et acides organiques ou inorganiques (tels que l'acide sulfurique), et que lesdites réserves antiradicalaires mobilisables sont stockées dans l'organisme vivant sous forme de polymères (en particulier des polyphénols), d'éthers, d'esters d'acides organiques et/ou de sulfates, notamment, au niveau des parois cellulaires et surtout dans le liquide enrobant les cellules. Lors d'une agression radicalaire, ces réserves antiradicalaires mobilisables, stockées dans l'organisme, ne sont pas directement disponibles. Elles sont libérées selon un mécanisme enzymatique complexe du type "cascade" avec semble-t-il un système d'inhibiteurs et d'activateurs (à l'instar de la cascade de l'hémostase), pour arriver à un équilibre final. Quand l'équilibre atteint n'est pas l'équilibre normal, on est en présence d'un état pathologique ou prépathologique. Dans le procédé de l'invention on libère par hydrolyse les réserves antiradicalaires mobilisables qui ont été stockées. L'hydrolyse de l'étape (a) est conduite dans un milieu approprié, notamment un tampon, à une température comprise entre 15 et 60 C. Elle est mise en #uvre soit avant l'étape (ss) précitée, soit en même temps que l'étape (ss). Dans ce dernier cas, on gagne du temps mais il est alors nécessaire d'utiliser un témoin car ladite hydrolyse peut ne pas être achevée avant la lyse du premier et du second matériau cellulaire par les radicaux libres. Cette hydrolyse est (i) une hydrolyse enzymatique, (ii) une hydrolyse acide ou alcaline, ou (iii) un clivage au moyen d'un agent physique, notamment un rayonnement. L'hydrolyse enzymatique est avantageusement effectuée pendant au moins 40 minutes (notamment quand ladite hydrolyse se poursuit pendant l'exposition au champ des radicaux libres), de préférence pendant 1-3 h et mieux pendant 2 h, à une température de 20 à 40 C, avec une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les osidases (notamment glucosidases, rhamnosidases, glucuronidases, etc.) les déalkylases (notamment déméthylases), les estérases, les sulfatases, et leurs mélanges. Un mélange d'enzymes, qui convient selon l'invention, peut notamment être du type "glucosidase + déméthylase + sulfatase" ou "glucosidase + glucuronidase + sulfatase". L'hydrolyse acide est avantageusement effectuée pendant au moins 40 minutes (notamment quand l'hydrolyse se poursuit pendant l'exposition au champ de radicaux libres), de préférence pendant 1-3 h et mieux pendant 2 h, à une température de 40 à 60 C, de préférence à 50 C, à un pH inférieur ou égal à 5,5. L'hydrolyse alcaline, qui n'est pas essentielle mais concerne plutôt le clivage des fonctions ester et lactone, est avantageusement effectuée pendant au moins 40 minutes (notamment quand l'hydrolyse se poursuit pendant l'exposition au champ de radicaux libres), de préférence pendant 1-3 h et mieux pendant 2 h, à une température de 50 C, à un pH supérieur ou égal à 8,5. L'hydrolyse selon l'invention peut être un clivage par un agent physique tel qu'un rayonnement, par exemple un rayonnement y ou (mieux) analogue à celui utilisé pour la conservation des récoltes agricoles. L'agent physique peut même être constitué par un champ de radicaux libres appliqué pendant une période suffisante. Cette "hydrolyse", qui consiste à cliver les groupes ester (i.e. acyle), éther et sulfate, d'une part, ou à séparer le fragment oside de glycones, d'autre part, peut donc mettre en #uvre une irradiation de l'organisme vivant ou d'un matériau cellulaire provenant dudit organisme. Le matériau cellulaire, qui intervient dans le procédé de l'invention, est choisi parmi l'ensemble constitué par : (a) un tissu cellulaire (i.e. les cellules, qu'elles soient identiques ou différentes, plus le liquide ou le plasma qui les baigne naturellement ou une partie de celui-ci), par exemple le sang total, (b) les cellules isolées de leur environnement (et remises le cas échéant en suspension dans un tampon de dilution), (c) un fragment cellulaire (i.e. un fragment de paroi cellulaire avec le cas échéant la totalité ou une partie du matériel contenu dans la cellule par exemple les lipoprotéines), ou (d) une paroi synthétique contenant des liposomes. Le premier matériau cellulaire que l'on soumet à l'hydrolyse de l'étape (a) est avantageusement choisi parmi les éléments (a), (b) et (c) cidessus, les éléments (a) et (b) étant les préférés. Ledit premier matériau cellulaire est utilisé pour apprécier, selon l'invention, le potentiel antiradicalaire global d'un organisme vivant. Le second matériau cellulaire est choisi parmi les éléments (a), (b), (c) et (d) ci-dessus, les éléments (a) et (b) étant également les préférés. Il est utilisé pour apprécier les éventuelles propriétés antiradicalaires d'un agent physique, chimique ou biologique à tester, d'une part, ou le potentiel antiradicalaire global d'un organisme vivant par le biais d'un produit qui en provient (notamment tissu cellulaire, sang total, cellules isolées, plasma), d'autre part. L'agent physique, chimique ou biologique est dit associé au second matériau cellulaire. Cela signifie qu'il a déjà contaminé l'organisme à partir duquel on recueille le second matériau cellulaire ou qu'il a été mis en contact, pour la mise en #uvre du présent procédé, avec ledit second matériau cellulaire. L'agent physique peut être une exposition à la fumée, aux UV ou à un rayonnement dangereux. L'agent chimique peut être toute substance ou association de produits chimiques que l'on veut tester pour déterminer l'éventuelle protection qu'il peut conférer vis-à-vis des radicaux libres. L'agent biologique peut être toute substance ou association de produits biologiques, par exemple une plante, un extrait d'une substance naturelle, le plasma sanguin ou des cellules pouvant être différentes du tissu cellulaire ou des cellules isolées constituant le second matériau cellulaire. Comme indiqué dans EP-B-0 418 335 précité, on préfère parmi les générateurs de radicaux libres, ceux qui présentent une cinétique ou vitesse de réaction d'ordre 0 (la libération des radicaux libres est constante dans le temps) et mieux d'ordre 1 (la libération des radicaux libres est linéaire dans le temps). Les générateurs de radicaux libres oxydants préférés selon l'invention, sont, d'une part, le dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2amidinopropane) qui donne dans un milieu aqueux une cinétique d'ordre 1, et d'autre part, le 2,2'-azo-bis(2,4-diméthylvaléronitrile) qui donne dans un milieu liquide huileux ou organique également une cinétique d'ordre 1. La libération des radicaux libres à partir d'un générateur de radicaux libres est réalisée selon une méthode connue en soi, par exemple la chaleur, la lumière (notamment la lumière du spectre visible ou les UV), les protons, les électrons, les rayons X ; préférence cette libération sera initiée par des photons, ou par la chaleur. Par exemple, le fait de porter le dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane) [en abrégé AAPH] en solution aqueuse à la température de 37 C suffit pour déclencher la libération de radicaux libres selon la réaction : Après le déclenchement de la libération des radicaux libres, le suivi de la lyse du premier ou du second matériau cellulaire est réalisé par voie optique. Plus précisément, on observe la variation de la densité optique (ou de l'absorbance) en fonction du temps, et détermine la valeur T (en minutes) qui correspond à la lyse de 50 % du matériau cellulaire. Comme indiqué plus haut ledit matériau cellulaire sera de préférence un tissu cellulaire (sang total par exemple) ou des cellules isolées. En pratique, la mesure optique est réalisée en automatique, par exemple toutes les 50,100, 150,200 et/ou 300 secondes, pour suivre la cinétique de la lyse du premier ou du second matériau cellulaire. Quand on observe la variation de l'absorbance d'un milieu d'essai (contenant par exemple du sang total ou des cellules isolées) au cours du temps à partir de l'instant de l'induction de la libération des radicaux libres du générateur de radicaux libres (en particulier AAPH), on remarque : # au début une période au cours de laquelle l'absorbance est constante (et relativement élevée), il s'agit de la période de latence au cours de laquelle les cellules n'ont pas été lysées ; # dès que la lyse cellulaire commence, une phase pendant laquelle l'absorbance décroît de façon linéaire (le point d'inflexion de la courbe correspondante détermine la valeur T) ; puis, # quand toutes les cellules ont été lysées, l'absorbance est constante (et relativement faible). Ainsi, en opérant sur du sang total, on a selon la technique antérieure du Test KRL, lorsque la valeur T croît (voir schéma 1) : # une plage "1" d'hypoprotection vis-à-vis des radicaux libres, qui correspond à un état pathologique ou prépathologique, # une plage "N" de valeurs moyennes normales, qui peut contenir des résultats "faux vrais", qui sont anormalement élevés (comme dans le cas des diabétiques) du fait d'une libération anormale des réserves antiradicalaires non compensée par une induction des défenses, et # une plage "2" d'hyperprotection vis-à-vis des radicaux libres résultant de la libération anormale d'une part importante ou de la majeure partie des réserves antiradicalaires mobilisables, et qui correspond à un état pathologique ou prépathologique car l'organisme est alors en train d'épuiser lesdites réserves Schéma 1 (sang total sans hydolyse) En revanche, selon l'invention, comme on évalue le potentiel antiradicalaire global avec mise en #uvre de l'hydrolyse, on obtient lorsque VA croît (voir schéma 2) : # une plage anormale "A" d'hypoprotection vis-à-vis des radicaux libres, qui correspond à un état pathologique ou prépathologique, ou # une plage "Nh" de valeurs moyennes normales, qui ne contient que les résultats des sujets sains (une valeur de T au delà de ladite plage "Nh" signalerait une erreur de manipulation). Schéma 2 (sang total avec hydolyse) Chez le sportif, par exemple, la plage de normalité Nh est plus large que chez le non-sportif du fait de l'induction des défenses, notamment enzymatiques, stimulée par les efforts répétés ; même si sa défense antiradicalaire diminue ponctuellement lors d'un effort, elle reste régulée dans la plage de valeurs normales contrairement au non-sportif (ou au sujet qui fait du sport occasionnellement), qui lors d'épreuve à l'effort va se retrouver en dehors de la plage de régulation, d'où le risque d'accident cardiaque bien connu des cardiologues. En conséquence, le procédé de l'invention permet d'éviter tout doute quand la valeur T se situe dans la plage "Nh" de valeurs moyennes normales et de supprimer ainsi les anomalies précitées. Subsidiairement, outre la valeur T, on peut mesurer, comme indiqué plus haut, le temps de latence, la vitesse de la lyse des cellules par les radicaux libres (i.e. la pente de la courbe) ainsi que l'aire sous la courbe, pour disposer d'éléments complémentaires d'appréciation. Le potentiel antiradicalaire global peut être également exprimé en unités EAR ("Efficacité Anti-Radicalaire"), 1 unité EAR correspondant au pouvoir antiradicalaire d'une millimole de Trolox par litre de sang, le Trolox# (Hoffmann-La Roche Inc. ) étant un équivalent hydrosoluble de la vitamine E, pris comme antioxydant de référence, ayant pour formule développée : et répondant à la nomenclature systématique de 3,4-dihydro-2,5,7,8- tétraméthyl-2H 1-benzopyran-6-ol. Pour 1 litre de sang d'un homme sain, on a : 1 EAR = T1/2 s ou h x dilution s ou h x concentration t (en mM) x I/ATI/2 t où "s ou h" se réfèrent au sang total ou, respectivement, aux hématies, et "t" au Trolox. Pour standardiser le procédé de l'invention, on fait appel à un système, qui est préalablement incubé à la température d'essai (37 C), comprenant : # une macroplaque comprenant des puits de dilution, # une microplaque comportant une pluralité de puits d'analyse (notamment 96 puits), et # un spectromètre destiné à mesurer la DO ou l'absorbance d'une lumière traversant de bas en haut les puits de la microplaque, Les trois modes opératoires préférés pour la mise en #uvre du procédé de l'invention sont les suivants : # mode I, par détermination du potentiel antiradicalaire global sur sang total humain ou animal à sang chaud (notamment mammifère), # mode II, par détermination du potentiel antiradicalaire global sur hématies humaines ou animales, et # mode III, par détermination sur plasma. Par ailleurs en soumettant à l'action de radicaux libres des tissus cérébraux frais de bovins sains, qui étaient dépourvus du prion pathogène PrPsc insoluble, mais contenaient le prion non pathogène PrPc soluble, on a observé l'apparition dans lesdits tissus cérébraux du prion pathogène insoluble. Cette formation de PrPsc a été mise en évidence par utilisation de la technique décrite dans l'article de Sabrina CAPELLARI et al., J. Biol. Chem., 1999 :274 (No 49), pages 34846-34850, cet article signalant que le PrPc joue un rôle dans l'équilibre redox en prévenant ou contrecarrant les dommages oxydatifs. On a donc observé de façon inattendue que le tissu cérébral frais de bovin sain produit le prion pathogène de la forme PrPsc sous l'action de radicaux libres provenant d'un générateur de radicaux libres. De cette observation on a déduit que les maladies neurologiques dégénératives, et notamment BSE, OSE et CJD, sont essentiellement des maladies autoimmunes qui impliquent vraisemblablement deux voies possibles d'infection : (a) la forme PrPsc est administrée par inadvertance au sujet humain ou animal, et/ou (b) la forme PrPsc est générée in vivo sous l'action de radicaux libres pouvant être produits par l'organisme, dans les deux cas l'organisme, qui reconnaît la forme PrPsc comme étant étrangère, génère des radicaux libres, via le système immunitaire, pour lutter contre PrPsc. Ce sont ces radicaux libres ainsi générés qui vont transformer la protéine PrPs en protéine isoforme PrPsc pathogène, et produire une agression autoimmune qui explique le phénomène dit de multiplication du prion pathogène. Un mécanisme identique ou analogue se manifeste (semble-t-il) dans l'apparition des autres maladies neurologiques dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. Le système immunitaire attaque les protéines modifiées sous l'action des radicaux libres et reconnues comme étant des ennemis. Ces protéines modifiées étant stables de façon irréversible, le système immunitaire produit des radicaux libres qui attaquent les protéines normales du fait de leurs structures voisines. On a alors une réaction en chaîne. On préconise donc une nouvelle utilisation en thérapeutique de substances antiradicalaires pour prévenir les maladies neurologiques dégénératives précitées. Dans cette optique, on fournit une nouvelle utilisation d'une substance antiradicalaire pour la préparation d'un médicament, ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une substance antiradicalaire pour la préparation d'un médicament destiné à un usage en thérapeutique humaine ou vétérinaire vis-à-vis de l'encéphalite spongiforme, notamment l'encéphalite spongiforme bovine (BSE), l'encéphalite spongiforme ovine (OSE) et l'encéphalite spongiforme humaine (CJD). Dans le cadre de cette nouvelle utilisation, on prévient l'encéphalite spongiforme par administration d'une composition thérapeutique humaine ou vétérinaire comprenant au moins une substance antiradicalaire en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces substances antiradicalaires sont principalement des polyphénols, les glycones qui en dérivent, et leurs dérivés sulfatés. Parmi ces substances, l'on peut notamment mentionner l'acide férulique sulfaté (I). L'hydrolyse de ce produit peut être réalisée selon deux routes distinctes schématisées comme suit : Le clivage par une sulfatase selon 1 conduit à l'acide trans- férulique (II), alors que le clivage par une déméthylase selon 2 conduit in fine à l'acide trans-caféique (III), via l'acide trans-caféique sulfaté (IV). L'acide férulique sulfaté (I) présente en conséquence une double réserve antiradicalaire utilisable par hydrolyse. L'activité antiradicalaire de ces produits a été entreprise selon le test ancien KRL précité sans hydrolyse, d'une part, et selon l'invention après hydrolyse, d'autre part. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 1 qui illustre l'intérêt de l'hydrolyse selon l'invention. Tableau I Activité antiradicalaire par rapport Produit à l'acide férulique sans hydrolyse après hydrolyse acide trans-férulique (II) 1,00 2,05 mélange d'isomères cis/trans 0,95 1,95 (47/53 p/p) de l'acide férulique acide trans-caféique (III) 2,06 2,06 acide férulique sulfaté (I) 0,01 2,06 Trolox# (produit de comparaison) 0,53 0,55 On obtient des résultats analogues quand on remplace l'acide férulique sulfaté (I) par un oside de l'acide férulique, notamment le glucuronide, et procède à l'hydrolyse avec une osidase appropriée au lieu de la sulfatase. Conviennent également les polyphénols de la famille des flavonoïdes, les glycones ayant une réserve antiradicalaire plus importante, du fait de la présence d'un ou plusieurs restes osides hydrolysables, que les aglycones, en particulier la cyanidine, la génistéine, la procyanidine, la catéchine et leurs glycones. Le procédé de l'invention a été standardisé pour opérer avec du sang total, des hématies ou du plasma sanguin en tant que second matériau cellulaire. Dans un réservoir, notamment un puits de macroplaque, on prépare une solution diluée (S) de : sang (60 l) dans solution de dilution (1440 l), hématies prédiluées à 50 % (60 l) dans solution de dilution (1440 l), ou plasma (60 l) dans solution de dilution (1440 l), on transfère 50 l) de ladite solution (S) dans des puits d'une microplaque contenant une solution de dilution (220 l), on hydrolyse par voie enzymatique le mélange résultant, on procède le cas échéant à un lavage, on introduit le générateur de radicaux libres (AAPH) puis on initie la libération des radicaux libres à 37 C. On détermine ensuite la valeur T et les autres paramètres indiqués ci-dessus. Le lavage intermédiaire après hydrolyse peut être omis car il n'est pas essentiel. L'échantillon à tester (50 l), qui contient ou est associé à du sang total, à des hématies ou, respectivement, à du plasma et est le cas échéant dilué, est introduit dans la solution de dilution (220 l) disposée dans des puits d'une microplaque. On hydrolyse, introduit le générateur de radicaux libres, initie la libération des radicaux libres et détermine la valeur T et lesdits autres paramètres selon les modalités indiquées plus haut. De façon pratique, on recommande d'utiliser les quantités suivantes d'enzymes, où U désigne l'unité internationale de l'enzyme concerné : (3-glucosidase à la concentration finale de Il,11U/ml (3 U/puits), sulfatase à la concentration finale de 3 U/ml (0,8 U/ puits), et/ou P-glucuronidase à la concentration finale de 2222,22 U/ml (600 U/puits), D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture des exemples et essais fournis ci-après. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est pas limitatif mais est donné à titre d'illustration. Exemple 1 Quercétine/ Isoquercitrine On a apprécié sur un sang total témoin de brebis la résistance à l'attaque radicalaire (au moyen de AAPH précité) en présence d'une forme aglycone de flavonoïde, la quercétine, et de sa forme glycone, l'isoquercitrine, sans l'hydrolyse de l'étape (a), d'une part, et avec ladite hydrolyse, d'autre part. La figure 3 indique les résultats obtenus avec des doses croissantes de quercétine ou d'isoquercitrine de 20 M à 100 M sans hydrolyse préalable. La figure 4, établie à partir des résultats de la figure 3, montre que la quercétine a un pouvoir antioxydant plus important que celui de l'isoquercitrine quand la valeur T est appréciée en fonction de la concentration. La figure 5 montre que, après hydrolyse au moyen d'un mélange enzymatique (3-glucosidase (3 U/puits) + sulfatase (0,8 U/puits) + ssglucuronidase (600 U/puits), la quercétine et l'isoquercitrine ont une résistance antiradicalaire identique. L'isoquercitrine a donc bien été hydrolysée en quercétine par le mélange enzymatique, et la libération de la fonction phénol génère une activité antiradicalaire disponible par rapport à une activité initialement non disponible mais "en réserve". La figure 5 montre en outre l'activité du mélange d'enzymes [ssglucosidase (3 U/puits) + sulfatase (0,8 U/puits) + ss-glucuronidase (600 U/puits)] quand la concentration en isoquercitrine ou quercitrine est nulle. Exemple 2 Essais sur plasma Des expérimentations ont été effectuées, selon le mode III cidessus, sur des plasmas congelés de brebis saines (A) ou malades de la tremblante (B), lesdits plasmas intervenant en tant qu'agent biologique en association avec des hématies contrôlées, sans et avec hydrolyse enzymatique préalable au moyen de p-glucosidase aux doses croissantes de 0 U/ml, 1,11 U/ml, 5,55 U/ml et 11,1U/ml. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-après (moyenne de cinq essais par lot, à raison de 3 lots de brebis A, et 3 lots de brebis B ; = écart par rapport à la moyenne ; CV = coefficient de variation). On observe que, sans hydrolyse préalable, les brebis B ont une meilleure résistance antiradicalaire. Il s'agit là d'une anomalie due à une libération des réserves en réponse à l'agression oxydative liée à la pathologie. Après hydrolyse préalable avec une dose de 1,11 U/ml de ssglucosidase, on constate qu'il n'y a pas de différence notable par rapport aux essais sans hydrolyse. Après hydrolyse préalable avec une dose de 5,55 U/ml de ssglucosidase, on remarque que le potentiel antiradicalaire global des brebis A est légèrement inférieur à celui des brebis B. Ceci signifie que la réserve antiradicalaire n'a pas encore été totalement libérée par hydrolyse. En revanche, après hydrolyse préalable avec une dose de 11,1 U/ml de P-glucosidase, on constate que le potentiel antiradicalaire global des brebis A est supérieur à celui des brebis B : la réserve antiradicalaire a été enfin mobilisée par l'hydrolyse. TABLEAU II Essais sur plasma de brebis (dilution 1/135) Lots Vmax Lag-Time T EAR. (mAU/min) (min) (min) (eq.mM) sans hydrolyse préalable (glucosidase : 0 U/ml) B-6,55 76,26 203,57 35,49 (SD) (0,24) (4,09) (7,32) (2,45) (CV) {3,67} {5,36)~ ~(3,60) (6,89) A ~~~~~~~~~~~~~~~ -7,82 ~~~ 77,21 186,35 29,73 (SD) (1,26) (2,50) (16,18) (5,41) (CV (16,11) (3,24) (8,68) (1,18) avec hydrolyse préalable (glucosidase : 1,11 U/ml) B-6,91 98,23 216,51 39,81 (SD) (1,22) (22,30) (3,59) (1,20) (CV) (17,70) (22,71) (1,66) (3,02) A -7,33 87,11 198,48 33,79 (SD) (0,55) (9,49) (11,95) (3,99) (CV) (7,47) (10,90) (6,02) (11,82) avec hydrolyse préalable (glucosidase : 5,55 U/ml) B-8,06 197,49 281,37 61,49 (SD) (1,15) (11,08) (1,74) (0,58) (CV) (14,28) (5,61) (0,62) (0,95) A-7,73 186,05 274,64 59,24) (SD) (0,60) (13,80) (8,92) (2,98) (CV) (7,71) (7,42) (3,25) (5,03) avec hydrolyse préalable (glucosidase : 11,1 U/ml) B-9,76 260,01 318,72 73,97 (SD) (0,56) (11,91) (0,44) (0,15) (CV (5,69) (4,58) (0,14) (0,20) @ A -13,00 308,91 328,84 77,35 (SD) (3,87) (40,97) (13,17) (4,40) (CV) (29,74) (13,26) (4,00) (5,69) Exemple 3 Essais sur vignes On a utilisé deux vignes, l'une produisant du raisin rouge de table, l'autre du raisin noir également de table. Dans chaque vigne deux lots ont été constitués, le premier recevant un engrais foliaire (contenant des polyphénols) par pulvérisation, le second non traité servant de témoin. Au cours de la croissance, on soumet le broyat de feuilles, le broyat de bourgeons et le jus du fruit exprimé par pression, chacun mis en suspension ou dilution dans un tampon de dilution, au procédé de détermination du potentiel de défense antiradicalaire selon l'invention. On constate que les vignes traitées présentent un potentiel supérieur aux vignes non traitées. Les résultats obtenus avec le jus de raisin sont consignés dans la figure 6. Exemple 4 Essais chez le porc Des essais ont été entrepris sur un lot de 15 porcs, en faisant appel à des animaux réputés sains, l'hydrolyse enzymatique étant mise en #uvre (pour gagner du temps) pendant l'exposition au champ de radicaux libres libérés à 37 C à partir du générateur de radicaux libres AAPH précité. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau III ci-après, où sont fournies les valeurs T, N' (plage de normalité, i.e. plage N en l'absence d'hydrolyse et plages Nh, ici ponctuelles, avec hydrolyse), temps de latence ("lag-time") et vitesse maximale de lyse radicalaire (Vmax), en fonction de l'hydrolyse enzymatique [sulfatase (à 3 U/ml) ou ss-glucuronidase (à 2500 U/ml)]. Exemple 5 Essais chez l'homme Des essais ont été entrepris sur un groupe de 97 sujets humains réputés sains (hommes et femmes adultes) et un groupe de 92 sujets humains diabétiques (hommes et femmes adultes). Le sang total de chacun des sujets des deux groupes a été soumis (1 ) dans une première série d'expériences à une exposition au champ de radicaux libres générés à 37 C à partir du générateur de radicaux libres AAPH précité, et (2 ) dans une seconde série d'expériences à une hydrolyse enzymatique [avec ss- glucosidase (3 U/puits), sulfatase (0,8 U/puits), P-glucuronidase (600 U/puits) ou le mélange ternaire précité] mise en #uvre pendant ladite exposition au même champ de radicaux libres, chaque groupe servant de contrôle par rapport à lui-même. Les résultats obtenus avec hydrolyse au moyen de ss-glucosidase (3 U/puits) sont fournis dans le tableau IV ci-après, qui permet d'observer que chez les sujets sains la valeur moyenne de T passe de 92,90 min sans hydrolyse à 263,85 min avec hydrolyse (soit une réserve libérée de 184 %), alors que chez les diabétiques la valeur moyenne de T passe de 99,54 min sans hydrolyse à 215,94 min avec hydrolyse (soit une réserve libérée de seulement 116 %). Les résultats obtenus sur plasma humain sont similaires. TABLEAU III Essais chez le porc Echantillon T N' Lag-time Vmax (min) (min) (min) (mAU/min) ~sang~total ~ ~~~~~~ ~ ~92~,40 84-100 ~ 69,29 -21,85 ~sang tota~1 +~sul~fatase J 00/70 91-1 10~ 74,63 z20,24 sang total + (3-glucuronidase 158,69 135-181 122,87 -9,24 hématies ~ ~ ~ ~ ~~~ ~ ~~ ~ 69~, I 9 ~~ ~~~~~~6~2-76 ~~~ ~ ~~~~5 5,16 ~~~ ~~~ -2 8,47 '~hématie~s + sulfa~ta~se~~~~~^ ~~~ ~~ 80~,96~~ 75-88~~ 6~2,23 ~ -23,51 hématies + ss-glucuronidase 169,35 158-180 149,92 -12,02 TABLEAU IV Essais chez ['homme Echantillon T (min) T(min) Echantillon sujets sains sujets diabétiques sang total 92,90 99,54 sang total + ss-glucosidase 263,85 215,94 L'ensemble de ces essais met en évidence que le procédé de l'invention permet le suivi de la croissance des animaux et des végétaux, en particulier celle des plantes stratégiques telles que les céréales (notamment blé, maïs et riz), les oléagineux (notamment soja, arachide et colza), la vigne et le coton. Ledit procédé permet également de suivre l'évolution de l'état sanitaire du bétail. Grâce audit procédé on peut déterminer, par espèce, une plage de normalité (i. e. une plage de valeurs normales) en dessous de laquelle il convient de surveiller attentivement les animaux en vue, le cas échéant, d'écarter ou retirer leurs tissus de la consommation. Par application desdits résultats, on recommande plus particulièrement d'administrer aux animaux devant être conduits à l'abattoir un régime complémenté en substances antiradicalaires, notamment l'acide férulique sulfaté, les osides dudit acide férulique et les polyphénols. Un tel régime peut comporter en tant que supplément nutritif un extrait de cacao riche en polyphénols, voire même une composition à base de cortex de cabosse additionnée du mucilage de la cabosse et/ou du jus des fèves de cacao. L'acide férulique sulfaté, les osides dudit acide férulique (notamment le glucuronide), les polyphénols, ledit extrait de cacao et/ou ladite composition à base de cortex de cabosse sont également utiles chez l'homme pour traiter et prévenir les états de stress. En bref, le procédé de l'invention (1 ) est particulièrement adapté au suivi in vitro de l'état de santé de l'homme, des animaux et des plantes, en ce qui concerne leur nutrition (et/ou au suivi in vitro de l'apport nutritionnel qui leur est fourni), à la gestion de leurs stress et au ralentissement de leur vieillissement, d'une part, et au suivi in vitro du potentiel génétique des animaux et des plantes, dans le cadre de leur sélection, d'autre part, et (2 ) met en évidence que les substances antiradicalaires sont essentielles pour prévenir l'encéphalite spongiforme (BSE, OSE ou CJD) et les maladies autoimmunes (notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et les allergies) qui induisent un dérèglement du système de régulation des défenses antiradicalaires globales. Ainsi, le procédé de l'invention est particulièrement utile pour apprécier, sur le plan antiradicalaire, l'intérêt nutritif ou la valeur nutritionnelle des aliments, des compléments alimentaires ou diététiques ("nutraseptiques") et des boissons, d'une part, et pour contrôler chaque étape du processus industriel d'élaboration desdits aliments, compléments alimentaires et boissons en vue de préserver la santé de l'homme, de l'animal ou de la plante et de respecter l'environnement. On recommande donc selon l'invention, d'une part, l'utilisation du présent procédé de détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre dudit procédé pour le suivi in vitro de la croissance des animaux et des végétaux et/ou le suivi in vitro de l'apport nutritionnel qui leur est fourni, et d'autre part, l'utilisation dudit procédé de détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre in vitro dudit procédé chez l'homme pour le suivi de l'état de santé, la gestion du stress et/ou le suivi du vieillissement. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global d'un organisme vivant ou d'un agent physique, chimique ou biologique, ledit procédé, qui comporte l'utilisation de radicaux libres en tant que moyen induisant la lyse cellulaire puis l'évaluation de ladite lyse cellulaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un matériau cellulaire avant ou pendant la libération, dans le milieu réactionnel résultant, de radicaux libres à partir d'un générateur de radicaux libres. 2. Procédé suivant la revendication 1, pour la détermination in vitro du potentiel de défense antiradicalaire global d'un organisme vivant ou d'un agent physique, chimique ou biologique, ledit procédé, qui comporte l'utilisation de radicaux libres en tant que moyen induisant la lyse cellulaire, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) hydrolyse d'un échantillon (i) d'un premier matériau cellulaire d'un organisme vivant, ledit premier matériau cellulaire étant un tissu cellulaire, des cellules ou un fragment cellulaire, ou, respectivement, (ii) d'un second matériau cellulaire associé à un agent physique, chimique ou biologique, ledit second matériau cellulaire étant un produit de référence qui est un tissu cellulaire, des cellules, un fragment cellulaire ou une paroi synthétique contenant des liposomes, (ss) mise en contact pendant ou après hydrolyse dudit échantillon avec un générateur de radicaux libres, (y) induction de la libération des radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, et (8) suivi de la lyse, par mesure optique, du premier ou, respectivement, du second matériau cellulaire, par rapport à un échantillon témoin, pour apprécier le potentiel antiradicalaire global dudit organisme vivant ou, respectivement, dudit agent physique, chimique ou biologique à tester. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'on détermine à l'étape (8) la valeur T qui correspond à la lyse de 50 % du premier matériau cellulaire ou du second matériau cellulaire et qui exprime le potentiel antiradicalaire global dudit premier matériau cellulaire ou dudit matériau cellulaire associé audit agent physique, chimique ou biologique. 4. Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit premier matériau cellulaire est du sang total. 5. Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit second matériau cellulaire est du sang total ou des hématies. 6. Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit agent biologique est le plasma d'un sujet humain ou d'un animal à sang chaud. 7. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'hydrolyse du stade (a) est (i) une hydrolyse enzymatique, (ii) une hydrolyse acide ou alcaline, ou (iii) un clivage au moyen d'un agent physique, notamment un rayonnement. 8. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre dudit procédé pour le suivi in vitro de la croissance des animaux et des végétaux et/ou le suivi in vitro de l'apport nutritionnel qui leur est fourni. 9. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en #uvre in vitro dudit procédé chez l'homme pour le suivi de l'état de santé, la gestion du stress et/ou le suivi du vieillissement. 10. Utilisation suivant la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que la substance antiradicalaire est l'acide férulique sulfaté ou l'un des osides dudit acide férulique, notamment le glucuronide.