Brevet FR2865217A1 — publié le 20050722

POLYMORPHISMES DU CHROMOSOME 9 IMPLIQUÉS DANS LA CANITIE PRÉCOCE Annuler ou atténuer autant que faire se peut les effets du vieillissement est une préoccupation qui ne cesse de croître. Dans ce contexte, faire disparaître des cheveux blancs jugés disgracieux grâce à des shampoings traitants colorants est désormais une activité très répandue. Il est clair cependant que, même si cette technique permet effectivement d'annuler les effets du phénomène, elle n'en affecte nullement les causes. De ce fait, cette solution est temporaire et doit être fréquemment renouvelée. Dans ce contexte, les inventeurs ont choisi d'explorer l'apparition des cheveux blancs, ou canitie, sous un angle totalement nouveau, celui de la génétique. En effet, explorer la canitie de par son aspect génétique permet de mettre en évidence les mécanismes profonds de la dépigmentation. Cela permet aussi d'identifier les gènes qui sont impliqués dans la canitie. Cette identification ouvre la porte à de très nombreuses applications, dans le domaine du soin des cheveux, tant cosmétiques que thérapeutiques ou diagnostiques. Il est hautement novateur de chercher à connaître les régions génomiques de la canitie par analyse de liaison génétique alors que d'autres études visent plutôt à décrypter la biochimie de la canitie. Les inventeurs ont choisi de tirer partie de l'hypothèse proposée depuis bien longtemps du caractère héréditaire de la canitie précoce (CP), ou apparition des cheveux blancs tôt dans la vie. Le caractère familial du blanchiment précoce des cheveux chez certains est en effet aisément observable. Un obstacle important à la mise en oeuvre des méthodes de génétique inverse concerne la définition exacte du phénotype. Une parfaite définition du phénotype étudié est en effet nécessaire. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette identification de gènes, le choix et la composition de l'échantillon utilisé dans la présente invention se sont déroulés selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype canitie précoce fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. De plus, il est vraisemblable que d'une part la canitie précoce ait une origine multigénique et non monogénique, et que d'autre part, des facteurs environnementaux aient une influence sur le phénotype. Il s'agit de fait de définir un ensemble de causes prédisposant à la canitie précoce. Dans ce contexte, la génétique inverse n'est pas, habituellement, une technique recommandée par les généticiens. Il est donc original de la part des inventeurs d'avoir utilisé cette méthode. Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs de définir dans un premier temps des zones chromosomiques et/ou génomiques comprenant des gènes impliqués avec une forte probabilité dans la canitie. Dans la présente demande, les inventeurs ont mis en évidence des polymorphismes, au sein des gènes DDX31 et GTF3C4 du chromosome 9, statistiquement impliqués dans la canitie. L'objet de la présente invention repose d'une part sur l'identification de 4 polymorphismes SNP (Single nucleotide polymorphism) dénommés rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 impliqués dans la prédisposition à la canitie précoce, et d'autre part sur l'identification d'une combinaison des polymorphismes rs3739902, rs2583805 et rs377090 définissant un haplotype impliqué dans la prédisposition à la canitie précoce. La présente invention concerne également l'utilisation de ces marqueurs dans des procédés et kits, dans les domaines de la cosmétique, de la thérapeutique et du diagnostic. Pour les domaines de la thérapie et de la cosmétique, la présente invention concerne successivement l'utilisation de l'un au moins des 4 marqueurs SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 pour effectuer un diagnostic, un procédé pour diagnostiquer une prédisposition à la canitie précoce, l'utilisation d'un moyen pour déterminer les allèles des 4 marqueurs en vue d'un diagnostic et un kit pour le diagnostic. La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic de la prédisposition à la canitie précoce basé sur l'haplotype défini par les marqueurs rs3739902, rs2583805 et rs377090. L'invention concerne enfin le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un mammifère non humain, basé sur l'utilisation des informations contenues dans la région génomique dudit mammifère homologue à la région du chromosome 9 humain comprise entre les marqueurs rs306534 et rs365297. GLOSSAIRE Dans le cadre de la présente invention, les termes énoncés revêtent la signification suivante: Par fragment polynucléotidique, on entend toute molécule résultant de l'enchaînement linéaire d'au moins deux nucléotides, cette molécule pouvant être monocaténaire, bicaténaire ou tricaténaire. Il peut donc s'agir d'une molécule d'ADN double-brin, d'un ADN simple brin, d'un ARN, d'un duplex ADN simple brin-ARN, d'un triplex ADN-ARN ou de toute autre combinaison. Le fragment polynucléotidique peut être naturel isolé, recombinant ou bien synthétique. Lorsque le fragment polynucléotidique comporte des brins complémentaires, la complémentarité n'est pas nécessairement parfaite, mais l'affinité entre les différents brins est suffisante pour permettre l'établissement de liaison stable de type Watson Crick entre les deux brins. Bien que l'appariement des bases soient de préférence de type WatsonCrick, d'autres types ne sont pas exclus, tels qu'un appariement de type Hoogsteen ou Hoogsteen inverse. On considère que la séquence S d'une molécule correspond à la séquence d'une molécule d'ADN donnée D si l'on peut déduire l'enchaînement des bases de S de celui de D par l'un des processus suivants 1. par identité, ou bien 2. par identité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile, ou bien 3. par complémentarité, ou bien 4. par complémentarité mais en changeant tout ou partie des Thymine en Uracile. De plus, on considère que deux séquences restent correspondantes s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans l'un des processus précédents (complémentarité ou bien identité, avec ou sans échange T,U), de préférence moins d'une erreur sur 100. Par conséquent, les deux molécules ont aussi nécessairement des longueurs voisines, la variation maximale de longueur étant de 10% d'après le taux d'erreur accepté, elles ont de préférence une différence de longueur inférieure à 1%. Cette définition ne suppose pas que les deux molécules soient de même nature, en particulier pour ce qui est de leur squelette, il s'agit d'une correspondance entre leur séquence uniquement. Par exemple, deux séquences d'ADN identiques correspondent l'une à l'autre. De même, si ces deux séquences sont substantiellement identiques, c'est-à-dire identiques à plus de 90%, elles correspondent l'une à l'autre. Une séquence d'ARN, issue de la traduction d'une molécule d'ADN quelconque, correspond à la séquence de cette molécule d'ADN. De même, une séquence synthétique, par exemple hybride ADN-ARN, peut correspondre à une séquence d'ADN. Il en va de même entre une séquence d'ADN et l'ARN anti-sens ayant pour cible cette séquence. Sur le même schéma, on considère que la séquence S d'une molécule d'ADN correspond à la séquence D si l'on peut déduire la séquence S de celle de D par le processus 1 ou 3 uniquement. La même latitude est autorisée concernant la possibilité d'introduction d'erreurs dans ces processus, c'est-à-dire que l'on considère que deux séquences d'ADN restent correspondantes s'il est introduit globalement moins d'une erreur sur 10 dans les processus de complémentarité ou bien d'identité, de préférence moins d'une erreur sur 100. Un marqueur génétique est une séquence d'ADN détectable. En génétique humaine, les marqueurs sont des séquences particulières de l'ADN pouvant prendre différentes formes selon les individus. Ce polymorphisme des marqueurs permet de suivre leur transmission dans le cadre des arbres généalogiques. Parmi les marqueurs classiques, on peut identifier deux grandes catégories de marqueurs qui sont les marqueurs microsatellites et les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Un microsatellite est une séquence d'ADN répétée, constituée d'un motif relativement simple: un di, un tri ou un tétra nucléotide le plus souvent. Le nombre de répétitions change pour un même motif selon les individus et peut varier de quelques unités (une douzaine au minimum pour un dinucléotide), jusqu'à plus d'une centaine. Ces séquences sont dispersées un peu partout dans le génome, de façon presque aléatoire, mais à des endroits identiques d'un individu à un autre. Elles sont très abondantes (environ une tous les 10000 nucléotides = 10 kb) et elles sont très polymorphes. C'est la variation de longueur de la répétition en tandem qui constitue le marqueur. Ces séquences microsatellites sont donc très utilisées comme marqueurs génétiques. Normalement, il n'y a pas de lien explicite entre un marqueur microsatellite et un gène, sinon une co-localisation. La longueur d'une répétition en tandem n'a pas, selon les connaissances actuelles, et en dehors de quelques rares cas de marqueurs intragéniques associés à certaines pathologies, de lien avec le rôle d'un gène. Dans le cadre de la présente invention, les marqueurs microsatellites sont des outils pour localiser les gènes impliqués dans la canitie précoce. Comme il existe beaucoup moins de polymorphisme dans les gènes que dans les marqueurs, un allèle génique sera représenté par plusieurs allèles d'un même marqueur microsatellite. Il existe différentes méthodes pour définir la localisation de séquences particulières d'ADN le long des chromosomes. L'unité de mesure physique est le nombre de paires de bases. Toutefois, le centimorgan est souvent utilisé, c'est une unité de recombinaison donc une unité de mesure génétique et non physique. Deux séquences particulières d'un même chromosome sont distantes d'un centimorgan si elles recombinent une fois sur cent lors de la méiose. Un centimorgan équivaut approximativement à 106 paires de bases. Une autre méthode pour localiser des séquences particulières d'ADN le long des chromosomes consiste à définir leur position relativement à des marqueurs jalonnant les chromosomes et dont la position est parfaitement déterminée et connue. Des marqueurs très utilisés sont les marqueurs microsatellites dont il existe des cartographies très complètes. En particulier le GDB Genome Database est une banque de données, connue mondialement pour répertorier entre autres les STSs (Sequence tagged sites), bornes spécifiques et uniques de l'ADN dont font partie les microsatellites. Les codes DxSxxxx (par exemple D6S257), servant à identifier ces marqueurs, sont leur numéro d'accession dans GDB. Ces codes sont un moyen d'identification non ambigu et universel car seul GDB attribue ce type de code. Comme on peut trouver de tels marqueurs microsatellites environ tous les 10 kb, il est donc possible de définir la position de toute séquence à 10kb près, en indiquant les marqueurs microsatellites l'encadrant. Un SNP (Single Nucleotide Pholymorphism) est un polymorphisme qui touche une unique base de l'ADN. C'est la forme de polymorphisme la plus répandue dans le génome humain, et elle se caractérise également par une grande stabilité lors de la transmission. La plupart de ces polymorphismes n'ont pas d'implications fonctionnelles. On compte environ 1 SNP sur 100 paires de bases. La connaissance de ces SNPs permet d'établir une cartographie du génome humain et les SNPs servent alors de véritables marqueurs du génome, d'autant plus qu'ils mutent lentement et ont peu de chance de réapparaître de façon récurrente. Les SNPs sont catalogués et référencés dans différentes banques librement accessibles, notamment à la GDB. Les séquences génomiques humaines encadrant les SNPs rs306534, rs3739902, rs575916, rs365297, rs2583805 et rs377090, permettant de les localiser de manière certaine, sont illustrées à la figure 12. Par région chromosomique entre deux marqueurs, on entend toute la séquence comprise entre ces deux marqueurs, les bornes étant comprises, donc la séquence des 5 marqueurs y compris. En génétique inverse, les indices permettant de localiser un gène proviennent de la comparaison de la transmission d'un phénotype, supposé induit par un gène muté ou par un allèle donné, avec la transmission de marqueurs connus, au sein d'une même famille. Ces données de coségrégation d'un phénotype et d'un marqueur permettent d'établir une analyse de liaison génétique. La co-transmission d'un phénotype et d'un marqueur suggère que le gène responsable du phénotype et le marqueur sont physiquement proches l'un de l'autre sur le chromosome. La liaison est déterminée par l'analyse du schéma de transmission d'un gène et d'un marqueur dans des familles qui s'y prêtent. L'analyse de liaison repose sur la co-transmission de certaines formes de marqueurs avec la forme défectueuse, ou modifiée d'un gène. Mais c'est une analyse indirecte dans le sens où d'une part, lors d'une première étape, un phénotype est associé à la forme défectueuse ou modifiée du gène. Une erreur dans l'assignation de certains phénotypes fausse l'étude. D'autre part, cette étude est basée sur des statistiques, ces statistiques reposant sur l'analyse d'un échantillon de la population, il s'agit donc d'un sondage. Enfin, il faut noter que lorsqu'il est possible d'associer un allèle particulier du marqueur avec un allèle du gène (en fait un phénotype), cette association n'est a priori valable que pour les échantillons inter-familiaux. Le résultat des analyses de liaison dépend évidemment du degré de liaison entre le marqueur et le locus de la maladie. Cinq centimorgans (5 cM) est considéré comme un minimum de liaison pour un diagnostic. Une liaison à 5 cM signifie que l'on a 95% de chances d'arriver à une conclusion correcte et seulement 1 chance sur 20 qu'une recombinaison soit survenue entre le marqueur et le locus de la maladie. Par le terme gène, dans le cadre de la présente invention, on entend non seulement la partie strictement codante, mais également les parties non codantes telles que les introns, et les parties régulatrices, en 5' et 3', les UTR (UnTranslated Region), notamment le ou les promoteurs, enhancers etc...associés. Un haplotype est une combinaison d'allèles donnés présents dans le matériel génétique d'un organisme. Certaines combinaisons d'allèles sont présentes à une fréquence supérieure à la fréquence obtenue théoriquement par combinaison aléatoire. Cet haplotype est alors considéré comme étant en déséquilibre de liaison. On considère qu'un polymorphisme est statistiquement impliqué dans l'apparition d'un phénotype lorsque la fréquence de ce polymorphisme chez des personnes ayant le phénotype est supérieure à la fréquence calculée si ces deux évènements étaient indépendants. Les inventeurs ont identifié une région chromosomique, appartenant au chromosome 9 et qui est impliquée dans la canitie précoce. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence l'implication de certains polymorphismes appartenant à cette région chromosomique, appelés polymorphismes de l'invention. Selon un premier aspect, l'invention concerne les marqueurs SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 du chromosome 9 humain identifiés par les inventeurs comme étant, chacun, impliqué dans la canitie précoce. Ces marqueurs appartiennent à la région chromosomique délimitée sur le chromosome 9 par le marqueur microsatellite D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long) et se trouvent au sein des gènes DDX31 et GTF3C4. L'invention couvre l'utilisation d'au moins un marqueur SNP du chromosome 9 humain, pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, où le marqueur est choisi parmi les marqueurs SNP rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. Dans le cadre de la présente invention, on considère qu'un individu est atteint de canitie précoce lorsqu'il présente des cheveux blancs, visibles par son entourage, avant 25 ans et de préférence avant 18 ans et que sa chevelure est grise à 50% avant l'âge de 30 ans. Comme il est très probable que des facteurs environnementaux jouent un rôle dans le phénotype canitie comme dans celui canitie précoce , il s'agit, grâce à l'invention, d'évaluer les risques de développer un tel phénotype, c'est-à-dire une prédisposition à la canitie précoce. Par prédisposition à la canitie précoce, on entend une probabilité d'être atteint de canitie précoce supérieure au pourcentage de la population atteint de canitie précoce. On peut parler de prédisposition quand la probabilité d'avoir le trait canitie précoce est égale à au moins 3 fois la probabilité moyenne de la population (environ 1% pour la population blanche e d'Europe occidentale). Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, un unique marqueur parmi les 4 cités, est utilisé en vue du diagnostic. Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, au moins deux marqueurs, trois ou bien quatre marqueurs sont utilisés parmi les marqueurs SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297, pour établir le diagnostic. La canitie précoce étant visiblement une affection multifactorielle, il est en effet parfois très informatif de combiner les informations obtenues à partir de différents marqueurs. De préférence, dans toute combinaison d'au moins deux marqueurs figure le marqueur rs3739902. De préférence, l'individu est un être humain âgé de moins de 20 ans ou un individu ne présentant aucun signe physique de canitie précoce. Cette utilisation selon l'invention peut consister notamment à déterminer les allèles du ou des marqueurs SNPs présents dans le matériel génétique de l'individu à diagnostiquer. Tout extrait du corps humain comprenant de l'ADN de l'individu à diagnostiquer convient comme matériel génétique. Il peut s'agir notamment d'un prélèvement sanguin, ou de cellules de la peau, ou bien de cheveux. L'échantillon contenant le matériel génétique peut être une unique goutte de sang qui est suffisante pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues de l'individu. Les techniques courantes, bien connues du biologiste moléculaire, peuvent être utilisées pour effectuer la détermination des allèles du ou des marqueurs choisis; des tests d'hybridation sont en particulier très courants dans ce genre d'étapes. Des tests basés sur l'amplification par PCR sont également très répandus et peuvent être réalisés sur des plaques contenant 96 ou 384 échantillons. De manière préférée, la présence de l'allèle T du SNP rs306534 permet de conclure à une prédisposition de l'individu à la canitie précoce. Si au contraire, l'utilisation concerne le SNP rs3739902, c'est la présence de l'allèle T qui permet de conclure à une prédisposition à la canitie précoce. Dans le cas du SNP rs575916, c'est la présence de l'allèle G qui permet de conclure à une prédisposition à la canitie et précoce. Enfin, dans le cas de l'utilisation du marqueur SNP rs365297, c'est la présence de l'allèle T qui permet de conclure à une prédisposition à la canitie précoce chez l'individu. La présente invention couvre également un procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu. Ce procédé de diagnostic comprend la détermination des allèles d'un marqueur SNP dans un échantillon de matériel génétique dudit individu. Selon cet aspect de l'invention, le marqueur SNP est choisi parmi les marqueurs SNP rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 du chromosome 9 humain. En effet, les inventeurs ont mis en évidence la liaison statistique existant entre un allèle de ces marqueurs et le trait canitie précoce. Comme le phénotype canitie précoce est transmis à la génération suivante, il peut s'avérer important, pour les individus dont un parent ou un proche est atteint, de déterminer, avant l'apparition des symptômes, s'ils seront ou non sujets à cette atteinte. Le procédé de diagnostic selon l'invention est parfaitement adapté aux individus âgés de moins de 18 ans. Le terme d'échantillon de matériel génétique a été explicité plus haut. L'homme de l'art saura déterminer quel échantillon pourra être utilisé dans le cadre de ce test, tout en minimisant le désagrément pour l'individu le subissant. Ce test diagnostic pourra éventuellement être couplé avec d'autres tests génétiques. Selon le procédé de l'invention, il est possible de ne déterminer l'allèle que d'un seul SNP aux fins d'établir le diagnostic. Cependant, selon une mise en oeuvre préférée de la présente invention, le procédé comprend la détermination des allèles d'au moins deux SNPs parmi les quatre mentionnés, afin d'établir un diagnostic. De préférence, l'un au moins de ces SNPs est le SNP rs3739902. Afin de diagnostiquer une prédisposition à la canitie précoce chez un individu ou de confirmer le diagnostic, il peut s'avérer avantageux de comparer la forme allélique déterminée à la forme allélique du ou des mêmes marqueurs chez d'autres individus, servant alors de contrôles. Ces individus peuvent être manifestement atteints de canitie précoce ou au contraire être manifestement non atteints de canitie précoce. Il peut s'agir notamment d'individus ayant plus de 30 ans et n'ayant aucun cheveu blanc apparent. Il est également avantageux de choisir des individus pour les contrôles qui soient ou bien de la même région géographique que l'individu à diagnostiquer, ou bien qui ait un lien de parenté sanguin avec cet individu, par exemple l'un de ses parents ou de ses frères ou soeurs. Si l'allèle du marqueur rs306534 est déterminé dans le cadre de ce procédé, alors il est de préférence conclu à une prédisposition lorsque l'allèle de ce marqueur est T. Si c'est le marqueur rs3739902 dont l'allèle est déterminé, alors l'allèle T permet de conclure à une prédisposition à la canitie précoce. Dans le cas du marqueur rs575916, c'est l'allèle G de ce marqueur qui informe d'une prédisposition à la canitie précoce. Enfin, si dans le cadre de ce procédé de l'invention, c'est l'allèle du SNP rs365297 qui est déterminé, alors il sera conclu à une prédisposition à la canitie précoce en présence de l'allèle T. La présente invention concerne également l'utilisation d'un moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce. Selon cette utilisation de l'invention, le moyen permet de détecter l'allèle du SNP dans un échantillon de matériel génétique de l'individu qui doit être diagnostiqué. Le SNP dont on veut détecter les allèles est choisi parmi les quatre marqueurs SNPs suivants: SNP rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 du chromosome 9 humain. Selon une variante de cette utilisation, il est utilisé au moins deux moyens permettant de détecter les allèles d'un des quatre SNPs. Selon une autre variante, il est utilisé plusieurs moyens permettant de détecter les allèles d'au moins deux SNPs distincts parmi les SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297, de préférence des moyens pour détecter les allèles de 3 des 4 SNPs, ou bien des moyens pour détecter les allèles des 4 SNPs. Il est également envisageable d'utiliser des moyens permettant de détecter les deux allèles d'un SNP choisi parmi les SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. Enfin, il peut être avantageux d'utiliser une combinaison des différents moyens décrits dans les paragraphes précédents. De préférence, au moins un des moyens permet de déterminer un allèle du SNP rs3739902. Comme moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP, on comprend notamment les appareils de séquençage qui permettent de déterminer la séquence d'un échantillon d'ADN ou d'ARN. Pour détecter les allèles d'un SNP, il est également envisageable d'utiliser des sondes nucléiques qui s'hybrident, sous conditions stringentes, à un seul des allèles et pas à l'autre. Des conditions de stringence élevées permettant l'hybridation de la sonde sur l'échantillon uniquement en cas de stricte complémentarité peuvent être déterminées par l'homme du métier. Elles dépendent notamment de la longueur de la sonde. La stringence va en augmentant lorsque les concentrations de sels (par exemple NaCl), de détergent (par exemple SDS), de matériel non spécifique (par exemple sperme de saumon) et la température vont en augmentant. De telles sondes sont par exemple des fragments polynucléotidiques correspondant à la région entourant le marqueur SNP, sur le chromosome 9 humain. Un tel fragment a en général une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence 12 à 35 ou 15 à 25 nucléotides. Il peut s'agir d'un fragment d'ADN ou d'ARN, naturel ou synthétique. D'autres moyens ou méthodes permettant de détecter des polymorphismes de 10 l'ADN sont bien connus (allélotypage ou génotypage) et font parfois usage de chip microarrays sur lesquels des oligonucléotides sont immobilisés. Il est également possible de détecter un polymorphisme de l'ADN par la technique de l'amplification PCR. Dans cette situation, on utilise par exemple une technique qui est une évolution de la technologie de Spectrométrie de masse MALDI-TOF dans laquelle est incluse une étape sur microarray (chip) qui permet de traiter plusieurs dizaines d'échantillons (384) à la fois. Selon cette technique, dans une première étape, les échantillons sont amplifiés par la PCR pour la cible, qui est le fragment d'ADN qui contient le SNP à analyser. Ensuite, une réaction d'extension (à partir d'une amorce proche du SNP) est réalisée. Selon l'allèle présent, l'extension sera plus ou moins longue (car pour l'un des allèles, l'extension sera bloquée par un "marqueur-dideoxynucléotide, ddNTP" qui reconnaîtra cet allèle par défaut). C'est la différence de taille (infime, en général, entre 1 et 4 nucléotides de différence) entre le produit obtenu par extension pour l'allèle par défaut (A par exemple), et celui de l'autre allèle (G par exemple), détectée par le MALDI-TOF, qui est enregistrée et permet de typer le génotype AA ou AG ou GG par exemple. Le traitement des résultats obtenus peut être réalisé grâce à la méthode MassARRAY . D'autres techniques classiques de génotypage sont indiquées dans les références suivantes: Tang K, et al (1999) Chip-based genotyping by mass spectrometry . Proc Natl Acad Sci USA 96: 10016-10020; Bansal, et al. (2002) Association Testing by DNA pooling - An effective initial screen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Dec.24; 99(26):16871- 16874; Werner M, et al Large-scale determination of SNP allele frequencies in DNA pools using MALDI-TOF mass spectrometry. Hum Mutat. 2002 Jul;20(1):57-64; Stoerker J, Mayo et al, Rapid genotyping by MALDI- monitored nuclease selection from probe libraries. , Nat Biotechnol. 2000 Nov;18(11):1213-1216. D'autres méthodes sont bien connues de l'homme du métier, notamment celle basée sur un miniséquençage de l'ADN à proximité du site polymorphique, grâce à une élongation derrière des amorces aux environs du polymorphisme.Il est également envisageable d'obtenir l'information sur les allèles d'un SNP présent dans un échantillon par PCR en temps réel. En fonction du nombre d'échantillons à traiter et du coût acceptable pour la détermination des allèles, l'homme de l'art saura quelle technique adopter parmi les nombreuses techniques proposées. Lorsqu'il s'agit d'une sonde nucléique, elle est avantageusement liée à un moyen 10 de détection, par exemple un marqueur radioactif, enzymatique, luminescent ou fluorescent. Selon une application, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs306534. De préférence, il permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle C du marqueur. Selon une autre application, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs3739902. De préférence, il permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle A du marqueur. Ce marqueur est tout particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention. Selon une autre application, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs575916. De préférence, il permet de détecter l'allèle G de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle C du marqueur. Selon une autre application, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs365297. De préférence, il permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle G du marqueur. La présente invention concerne également un kit pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce. Un tel kit selon l'invention comprend au moins un moyen pour déterminer la forme allélique d'un marqueur SNP dans un échantillon de matériel génétique d'un individu. Dans le cadre de la présente invention, le marqueur SNP dont on cherche à déterminer les allèles est choisi parmi les marqueurs SNPs suivants présents sur le chromosome 9 humain: rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. Le kit tel que décrit comprend également un contrôle positif ou négatif. Par contrôle positif, on entend un matériel génétique traduisant une prédisposition à la canitie précoce. Par contrôle négatif, on entend un matériel génétique traduisant une absence de prédisposition à la canitie précoce. Comme précisé dans les paragraphes précédents, par moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP, on comprend notamment les appareils de séquençage et les sondes nucléiques qui s'hybrident, sous conditions stringentes, à un seul des allèles et pas à l'autre. On comprend également toutes les amorces qui, sous certaines conditions, vont permettre d'obtenir des produits issus de la PCR de taille différente selon l'allèle qui est amplifié. Dans ce cas, le moyen permet de détecter simultanément les deux allèles d'un SNP, ce qui indique si l'individu est homozygote ou hétérozygote. Si des sondes sont utilisées, il s'agit par exemple de fragments polynucléotidiques correspondant à la région entourant le marqueur SNP, sur le chromosome 9 humain. Un tel fragment a en général une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence 12 à 35 ou de 15 à 25 nucléotides. Il peut s'agir d'un fragment d'ADN ou d'ARN, naturel ou synthétique. La sonde est avantageusement immobilisée sur un support (chip microarray). Les conditions stringentes qui peuvent être mises en oeuvre ont déjà été explicitées dans les paragraphes précédents. La sonde nucléique est avantageusement liée à un moyen de détection, par exemple un marqueur radioactif, enzymatique, luminescent ou fluorescent. Selon un kit, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs306534. De préférence, il permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle C du marqueur. Selon un autre kit, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs3739902. Ce marqueur est un marqueur tout particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention. De préférence, le moyen mentionné permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle A du marqueur. Selon un autre kit, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs575916. De préférence, il permet de détecter l'allèle G de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle C du marqueur. Selon un autre kit, le moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP permet de déterminer l'allèle du marqueur rs365297. De préférence, il permet de détecter l'allèle T de ce marqueur, alternativement, il peut permettre de détecter l'allèle G du marqueur. Il est également avantageux, dans un kit de l'invention, de combiner au moins deux moyens permettant de détecter les allèles d'un des quatre SNPs, par exemple deux sondes différentes, permettant chacune de détecter l'allèle C du SNP rs306534. Selon une autre variante, le kit comprend plusieurs moyens permettant de détecter les allèles d'au moins deux SNPs distincts parmi les SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297, de préférence des moyens pour détecter les allèles de 3 des 4 SNPs, ou bien des moyens pour détecter les allèles des 4 SNPs. De préférence, au moins un des moyens permet de détecter un allèle du SNP rs3739902. Il est également envisageable que le kit comprenne des moyens permettant de détecter les deux allèles d'un SNP choisi parmi les SNPs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. Par exemple, le kit peut comprendre un premier moyen permettant de détecter l'allèle T du marqueur rs3739902 et un second moyen permettant de détecter l'allèle A de ce même marqueur. Un kit selon l'invention peut aussi comprendre une combinaison des différents moyens évoqués dans les paragraphes précédents. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les marqueurs SNP rs3739902, rs2583805 et rs377090 du chromosome 9 humain identifiés par les inventeurs comme formant un haplotype lié à la prédisposition à la canitie précoce. Ces marqueurs appartiennent à la région chromosomique délimitée sur le chromosome 9 par le marqueur microsatellite D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long) et se trouvent au sein des gènes DDX31 et GTF3C4. Les inventeurs ont en effet montré que certains allèles de ces 3 marqueurs se retrouvent avec une fréquence significative, supérieure à la fréquence normale, chez les individus atteints de canitie précoce, ce qui définit un haplotype lié à la canitie précoce, dénommé HAP25-27. La présente invention couvre un procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu. Ce procédé de diagnostic comprend la détermination des allèles des trois marqueurs SNPs dans un échantillon de matériel génétique dudit individu, afin d'identifier l'haplotype de l'individu relatif à ces trois marqueurs. Afin de diagnostiquer une prédisposition à la canitie précoce chez un individu ou de confirmer le diagnostic, il peut s'avérer avantageux de comparer l'haplotype HAP25-27 déterminé à l'haplotype d'autres individus, servant alors de contrôles, ces individus pouvant être manifestement atteints de canitie précoce ou au contraire étant manifestement non atteints de canitie précoce. Il peut s'agir notamment d'individus ayant plus de 30 ans et n'ayant aucun cheveu blanc apparent. Il est également avantageux de choisir des individus pour les contrôles qui soient ou bien de la même région géographique que l'individu à diagnostiquer, ou bien qui ait un lien de parenté sanguin avec cet individu, par exemple l'un de ses parents ou de ses frères ou soeurs. Certains haplotypes, retrouvés avec une fréquence importante chez les individus atteints de canitie précoce sont en effet synonymes d'une probable prédisposition à la canitie précoce chez les individus présentant ces mêmes haplotypes. La présente invention concerne également l'utilisation de moyens pour détecter les allèles des trois marqueurs SNPs rs3739902, rs2583805 et rs377090 définissant l'haplotype HAP25-27 pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce. Selon cette utilisation de l'invention, les moyens permettent de détecter les allèles des SNPs rs3739902, rs2583805 et rs377090 dans un échantillon de matériel génétique de l'individu qui doit être diagnostiqué. Comme précisé dans les sections précédentes relatives au premier aspect de l'invention, par moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP, on comprend notamment les appareils de séquençage (ADN ou ARN), les amorces pour PCR et les sondes nucléiques qui s'hybrident, sous conditions stringentes, à un seul des allèles et pas à l'autre. De telles sondes sont par exemple des fragments polynucléotidiques correspondant à la région entourant le marqueur SNP, sur le chromosome 9 humain. Un tel fragment a en général une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence de préférence 12 à 35 ou de 15 à 25 nucléotides. Il peut s'agir d'un fragment d'ADN ou d'ARN, naturel ou synthétique. Les sondes sont avantageusement immobilisées sur un support (par exemple chip microarray). Les conditions de stringence applicables ont déjà été explicitées dans les sections précédentes. Les sondes nucléiques sont avantageusement liées à un moyen de détection, par exemple un marqueur radioactif, enzymatique, luminescent ou fluorescent. Il peut être avantageux, si 3 sondes distinctes sont utilisées pour déterminer les allèles des 3 marqueurs de l'haplotype, d'utiliser trois moyens de détection distincts, par exemple, trois fluorophores émettant à des longueurs d'ondes différentes. Selon une utilisation préférée, il est fait usage de trois moyens différents, pour détecter l'allèle de chacun des 3 SNPs. Alternativement, il peut être fait usage de plus de trois moyens différents, on peut utiliser notamment au moins deux moyens pour détecter un même allèle d'un des SNPs, ou bien deux moyens pour détecter chacun des allèles d'un même SNP. Toute combinaison des différents moyens exposés plus haut est également envisageable. De préférence, les moyens utilisés dans le cadre de l'invention permettent de détecter l'allèle T du marqueur rs3739902, l'allèle G du marqueur rs2583805 et l'allèle T du marqueur rs377090. Il est important de noter que toute autre combinaison est également envisageable dans le cadre de la présente invention, par exemple des moyens pour détecter l'allèle T du marqueur rs3739902, l'allèle C du marqueur rs2583805 et l'allèle C du marqueur rs377090. En effet, il peut être par exemple aussi informatif de détecter l'absence de l'haplotype (T, G, T) que de détecter la présence de l'haplotype (T, C, C) afin d'établir le diagnostic. La présente invention concerne également un kit pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce. Un tel kit selon l'invention comprend des moyens pour déterminer la forme allélique des marqueurs SNPs rs3739902, rs2583805 et rs377090, dans un échantillon de matériel génétique d'un individu. Ces marqueurs SNPs sont présents sur le chromosome 9 humain et permettent de définir un haplotype particulier, lié statistiquement à la canitie précoce et traduisant donc une prédisposition à la canitie précoce chez des sujets ne présentant encore aucun symptôme. Le kit tel que décrit peut également mais pas nécessairement comprendre un contrôle positif ou négatif. Par contrôle positif, on entend un matériel génétique traduisant une prédisposition à la canitie précoce, par exemple un échantillon d'ADN d'une personne atteinte de canitie précoce. Par contrôle négatif, on entend un matériel génétique traduisant une absence de prédisposition à la canitie précoce. Par définition, les moyens de détecter les allèles des 4 marqueurs SNPs, présents dans le kit, permettent de conclure à un résultat négatif quand il est appliqué sur le contrôle négatif, alors qu'il permet de conclure à un résultat positif quand il est appliqué sur le contrôle positif Comme précisé dans les paragraphes précédents, par moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP, on comprend notamment les appareils de séquençage, les amorces et les sondes nucléiques qui s'hybrident, sous conditions stringentes, à un seul des allèles et pas à l'autre. De telles sondes sont par exemple des fragments polynucléotidiques correspondant aux régions entourant les marqueurs SNPs, sur le chromosome 9 humain. De tels fragments ont en général une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, de préférence 12 à 35 ou 15 à 25 nucléotides. Il peut s'agir de fragments d'ADN ou d'ARN, naturels ou synthétiques. Ils sont avantageusement immobilisés sur un support (par exemple chip microarray). La sonde nucléique est avantageusement liée à un moyen de détection, par 15 exemple un marqueur radioactif, enzymatique, luminescent ou fluorescent. Il est également avantageux, dans un kit de l'invention, de combiner plus de 3 moyens permettant de détecter les allèles des trois SNPs. Par exemple, un kit selon le deuxième aspect de l'invention peut comporter, par exemple, deux sondes différentes, permettant chacun de détecter l'allèle T du marqueur rs3739902. Il est également envisageable que le kit comprenne des moyens permettant de détecter les deux allèles d'un des 3 SNPs, de 2 ou même des 3 SNPs. Par exemple, le kit peut comprendre un premier moyen permettant de détecter l'allèle T du marqueur rs3739902 et un second moyen permettant de détecter l'allèle A de ce même marqueur et deux autres moyens permettant de détecter l'un des deux allèles des marqueurs rs2583805 et rs377090. Un kit selon l'invention peut aussi comprendre une combinaison des différents moyens évoqués dans les paragraphes précédents. Selon un troisième aspect, la présente invention concerne l'application des résultats sur l'implication de polymorphismes au sein du chromosome 9 dans la prédisposition à la canitie précoce, au diagnostic de la canitie précoce (ou blanchiment précoce des poils) chez d'autres mammifères non humains. Dans cette situation, le diagnostic génétique de la canitie précoce est effectué grâce à l'information portée par la région du génome dudit mammifère qui est homologue à la région du chromosome 9 humain encadrée par les marqueurs SNPs rs306534 et rs365297. Selon cet aspect, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un fragment nucléotidique d'au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région chromosomique du génome dudit mammifère, qui est homologue à celle du chromosome 9 humain encadrée par les marqueurs SNPs rs306534 et rs365297, pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez ce mammifère non humain. Cette région chromosomique du génome du mammifère non humain qui est homologue à celle du chromosome 9 humain encadrée par les marqueurs SNPs rs306534 et rs365297, sera dénommée dans la présente demande région homologue . Selon cet aspect de l'invention, le mammifère non humain est de préférence le cheval, pour diagnostiquer un blanchiment précoce du crin. La présente invention couvre des fragments polynucléotidiques ayant une longueur minimale de 18 nucléotides, dont la séquence correspond au moins partiellement à la région homologue et qui permettent de diagnostiquer une prédisposition à la canitie précoce. Le fragment polynucléotidique dont il est fait référence dans le cadre de l'invention correspond à un fragment d'un chromosome. Ce fragment a une longueur minimale de 18 nucléotides, et une longueur maximale qui peut aller jusqu'à la longueur totale de la région homologue en question. De préférence, le fragment a un nombre de nucléotides supérieur à 18. Une longueur particulièrement préférée est comprise entre 18 et 10000 nucléotides, de préférence entre 30 et 8000 nucléotides. Concernant la nature chimique de ce fragment polynucléotidique, il peut s'agir d'une molécule d'ADN, simple ou double brin, circulaire ou linéaire, d'une molécule d'ARN ou de toute autre molécule envisagée dans la définition de fragment polynucléotidique donnée plus haut. C'est de préférence une molécule capable d'interagir avec le matériel génétique du mammifère à diagnostiquer. Le fragment polynucléotidique tel que décrit peut se trouver sous forme naturelle ou bien être de nature synthétique, ou bien être en partie l'un et en partie l'autre, en particulier s'il s'agit d'une molécule duplex constitué de deux brins aux origines différentes. Selon différents cas envisagés par la présente invention, le fragment polynucléotidique peut être isolé, il peut avoir subi une étape de purification. Il peut s'agir aussi d'un fragment recombinant, par exemple synthétisé dans un autre organisme. Selon un exemple préféré, il s'agit d'un fragment d'ADN ayant été amplifié par PCR (Polymerisation Chain Reaction) puis purifié. Cette utilisation selon l'invention peut consister notamment à déterminer les allèles de marqueurs SNPs présents dans le matériel génétique du mammifère à diagnostiquer, dans la région homologue. Tout extrait du corps du mammifère non humain comprenant de l'ADN de ce mammifère convient comme matériel génétique. Il peut s'agir notamment d'un prélèvement sanguin, ou de cellules de l'épiderme, ou bien des poils. L'échantillon contenant le matériel génétique peut être une unique goutte de sang qui est suffisante pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. D'autres échantillons de fluides corporels peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Il est aussi envisageable d'utiliser quelques cellules issues du mammifère. Selon d'autres constructions envisagées par la présente invention, la première utilisation fait usage d'un fragment polynucléotidique associé à une sonde. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation du fragment, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. La sonde peut aussi permettre de suivre la dégradation du fragment. La nature de la sonde est de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. L'homme du métier saura quelle sonde est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre. Le fragment polynucléotidique, dont il est fait usage dans le cadre de cette utilisation selon l'invention, peut être utilisé dans un test d'hybridation, un séquençage, un microséquençage ou bien un test de détection de mésappariement. Ce fragment selon l'invention contient au moins 18 nucléotides successifs, ces 18 nucléotides constituant une séquence qui correspond à tout ou partie de la séquence 25 homologue. Selon un autre cas particulier, le fragment décrit peut correspondre à un ou plusieurs exons d'un gène de la région homologue. Il peut être fait usage de plusieurs fragments polynucléotidiques dont la séquence correspond, au moins en partie, à tout ou partie de la région homologue, par exemple de 30 deux ou trois fragments ayant une séquence distincte. Légende des figures Figure 1: Schéma récapitulatif des différentes étapes de l'analyse de la région B à l'aide de la technologie basée sur les SNPs. Figure 2: Composition des 4 pools. Le pool AI et AII sont composés d'individus atteints de canitie précoce. Les deux pools contrôles BI et BII sont composés d'individus croisés pour origine et âge avec les individus atteints de canitie précoce. Figure 3: Graphe indiquant la significativité des 171 SNPs testés sur les pools pour la régions B. L'abscisse représente les SNPs, numérotés de 1 à 171 le long de la région B (du télomère p vers le télomère q), chaque SNP étant séparé de ses voisins par une région de 30kb en moyenne. L'ordonnée représente 1/p, p étant la significativité statistique. Cependant, les valeurs 1/p supérieure à 500 (c'est-à-dire p Figure 4: Tableau répertoriant les 33 SNP retenus pour le génotypage individuel. La première colonne indique leur numéro (numéro attribué à l'étape précédente de 1 à 171 le long de la région B, du télomère p vers le télomère q). La seconde colonne indique le nom du SNP. Les colonnes suivantes indiquent les valeurs des différentes comparaisons A-B (AI-BI; AII-BII; AI-BII) avec la valeur p associée. La mention M signifie que la valeur de la significativité p est inférieure à 0,05. La dernière colonne précise le gène éventuellement chevauché par ledit SNP. Figure 5: Tableau répertoriant les 33 SNP retenus pour le génotypage individuel. La première colonne indique la position sur le chromosome, la seconde leur identifiant, la colonne suivante leur numéro (numéro attribué à l'étape précédente de 1 à 171 le long de la région A, du télomère p vers le télomère q). Les colonnes suivantes indiquent s'il s'agit de SNPs présents au sein d'un cluster ou de doubles spots. Figure 6: Représentation schématique des résultats de déséquilibre de liaison sur la région B. La significativité des associations entre SNPs pris deux à deux est représentée par un code de couleur. Figure 7: Graphique représentant la comparaison des fréquences alléliques/ génotypiques pour chaque SNP de la région B dans les groupes canitie précoce' et contrôle, mettant en lumière les associations SNPs/phénotypes. Les gènes concernés sont indiqués en abscisse avec les SNPs. Figure 8: Graphique représentant la valeur logp, p étant la p-value pour les 10SNPs utilisés dans un premier temps dans la région d'intérêt. La valeur p-value a été obtenue par comparaison des fréquences haplotypiques entre les individus atteints présentant un score de 4 ou 5 et les individus contrôles, correspondant aux individus des groupes 4 et 5. Le graphique représente également la séparation entre les deux haplotypes 86- 88 et 90-92. L'espacement entre les SNPs sur l'axe des abscisses est arbitraire et n'est pas proportionnel à la distance inter-SNP. Les gènes au sein desquels se trouvent les SNPs sont également mentionnés. Figure 9: Graphique représentant la valeur logp, p étant la p-value pour les 30 SNPs ajoutés dans un second temps dans la région d'intérêt. Les indications sont les mêmes que pour la figure 8. En abscisse est indiqué le numéro du SNP de 1 à 30 pour les 30 SNPs ajoutés. La correspondance entre le numéro du SNP (sur 30) entre l'identifiant du SNP est explicité dans le tableau de la figure 11 (old number DGM SNP#). De nouveau, l'échelle des X ne représente pas la position relative des SNPs les uns par rapport aux autres. Figure 10: Graphique représentant la valeur logp, p étant la p-value pour les 40 SNPs (10+30) dans la région d'intérêt. En abscisse est indiqué le numéro du SNP de 1 à 40 pour les 40 SNPs au total examinés. La correspondance entre le numéro du SNP (sur 40) entre l'identifiant du SNP est explicité dans le tableau de la figure 11, partie droite (analysis number). L'échelle des X représente la position relative des SNPs les uns par rapport aux autres, dans la carte physique du chromosome 9. La région où la liaison est la plus significative est indiquée. Figure 11: Tableau répertoriant les 40 SNPs examinés dans la région d'intérêt (région B86-92). La première colonne indique la position de certains SNP sur le chromosome 9, selon le Freeze de UCSC de Décembre 2001 , basé sur le Build NCBI 28 (hg10 Dec2001 NCBI Build 28) alors que la deuxième colonne indique la position selon la version V14.31.1 de la bibliothèque de séquences ENSEMBL, qui est basée sur le Build NCBI 31 (Novembre 2002). Les colonnes suivantes indiquent respectivement l'identifiant GDB du SNP, la numérotation du SNP dans la première phase de l'exemple 3 (10 + 30) et la numérotation dans la seconde phase (40) et enfin la valeur de l'association (-logp). Figure 12: Cette figure indique, pour les 6 SNPs de l'invention, la séquence adjacente sur le chromosome 9 humain, ainsi que les deux allèles du SNP que l'on peut trouver. Figure 13: Les tableaux indiquent les valeurs d'association pour les deux haplotypes (S.E. signifie standard error). En effet, les SNP 86-88 et 9092 se distribuent finalement en 2 régions en déséquilibre de liaison. EXEMPLES EXEMPLE 1 Pour explorer la canitie de par son aspect génétique, il a été réalisé une étude de ségrégation de l'ADN chez des familles dont la canitie apparaît très tôt dans la vie. Afin de garantir les meilleures chances de succès pour cette chasse aux gènes, la composition de l'échantillon pour l'étude s'est déroulée selon un protocole rigoureux pour l'attribution du phénotype et la sélection des familles. Le phénotype CP fut attribué aux seuls individus qui présentaient des cheveux blancs avant 25 ans et dont la moitié de la chevelure était grise à 30 ans. Les familles furent retenues pour l'étude sur la base de leurs performances statistiques dans l'analyse de ségrégation. Au terme d'une série de présélections sur la base de la puissance statistique de l'échantillon et de la confirmation des phénotypes, douze familles sont retenues pour participer à une étude de liaison et l'ADN fut préparé à partir d'un échantillon de sang périphérique de chacun des individus informatifs (présentant et ne présentant pas le trait). L'étude réalisée est décrite selon trois époques principales: Epoque 1: Détermination du potentiel de l'étude. Une première sélection des familles les plus informatives est réalisée par une simulation d'analyse de liaison. Epoque 2: Confirmation médicale des phénotypes et collection des échantillons sanguins chez les familles présélectionnées. Cette campagne de vérification aboutit à une nouvelle liste de familles candidates pour l'étude. Une nouvelle simulation de liaison permet d'estimer le potentiel de l'échantillon corrigé. Epoque 3: Analyse de liaison génétique globale de la CP sur tout le génome humain. Analyse de ségrégations familiales sur l'ADN des 22 chromosomes autosomiques et le chromosome X afin de détecter les régions qui se lient au trait CP. De l'ensemble des analyses réalisées en fixant ou ne fixant pas des paramètres pour la transmission du trait de CP (canitie précoce), un locus potentiel se dégage sur le chromosome 9 entre le marqueur microsatellite D9S290 et la région télomérique (télomère du bras long). Le locus (chromosome 9g31-q32) montre des signes suggestifs de liaison à la canitie précoce (CP). Cette étude, et en particulier la discordance entre les scores obtenus pour les analyses paramétrique/non-paramétrique, suggère que la canitie précoce ne serait pas provoquée par un petit nombre de gènes à effet majeur, mais serait plutôt gouvernée par un système multifactoriel incluant l'action de plusieurs gènes de prédisposition. EXEMPLE 2: Analyse de la région d'intérêt avec des SNP Single Nucleotide Polymorphism' A la suite des travaux présentés dans l'exemple 1, les inventeurs ont poursuivi l'analyse de la région du chromosome 9 à l'aide la technologie basée sur les SNPs, afin de mettre en évidence les gènes impliqués dans la canitie précoce. Les SNP (single nucleotide polymorphism) représentent une forme de polymorphisme particulièrement répandue dans le génome humain et très stable. On évalue le nombre de SNP à environ 1 SNP tous les 100 nucléotides, ce qui permet d'établir une véritable cartographie du génome humain à l'aide des SNPs. Les SNP sont souvent classés en différentes catégories, notamment selon qu'ils sont dans une région codante ou non, dans une région régulatrice ou dans une autre région non codante du génome, que le polymorphisme modifie l'acide aminé codé ou non, etc... A l'issue du programme Human Genome Project , les SNP sont désormais mieux connus et référencés, ainsi que leur position dans le génome (GDB). Différentes méthodes ont été mises au point pour mettre en évidence ces polymorphismes entre différents individus, souvent basées sur les méthodes utilisées pour détecter des mutations ponctuelles (RFLP-PCR, hybridation avec des oligomères spécifiques des allèles, mini-séquençage, séquençage direct...). Dans le cadre de la présente demande, les inventeurs ont utilisé la technologie MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry) pour détecter les différents allèles des SNPs candidats. De plus amples détails sur cette technologie sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans diverses publications (Stoerker J, et al, Nat Biotechnol 2000 Nov;18(11):1213-6 et Tang K et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 Aug, 96, 10016-20). Dans un premier temps, les inventeurs ont défini très précisément la région du chromosome 9 à analyser avec les SNPs. Dans une seconde étape, environ un millier de SNPs appartenant à cette région ont été présélectionnés sur certains critères (SNPs candidats in silico) et 232 ont été retenus suite à une étape de validation expérimentale. Dans une étape suivante, les inventeurs ont assemblé les ADN des différents individus atteints de canitie précoce et des individus contrôles' en différents groupes, puis effectué le génotypage de ces différents groupes grâce à 167 SNPs choisis parmi les 232. A l'issue de ce génotypage, les résultats ont permis de définir 33 SNPs pour effectuer ensuite un génotypage individuel (et non plus sur des groupes). Les différentes étapes sont décrites plus amplement dans les sections suivantes et représentées schématiquement dans la figure 1. 1- Définition des régions à analyser par les SNP Dans un premier temps, les inventeurs ont défini plus précisément la région d'intérêt sur le chromosome 9, à partir des résultats obtenus grâce à l'analyse avec les marqueurs microsatellites (voir les travaux décrits dans l'exemple 1) sur les 12 familles sélectionnées lors de cette étude. La région sur le chromosome 9, dénommée région B, est définie par sa position chromosomique ainsi que par trois autres types de coordonnées pour une précision et une sécurité optimale dans la définition de cette région pour les étapes ultérieures. Région B: position chromosomique 9g34. 13-9g34.3 (qter) Entre le marqueur D9S290 et le télomère 9q Entre le SNP rs2096071 et le SNP rs1378955 Entre les positions 123'405'258 bp* et 133'021'490 bp*. * La position de la séquence (en terme de paires de bases bp) est exprimée en fonction de la version de la banque de données sur le génome humain mise à jour en décembre 2001 (soit NCBI Build28). 2- Recherche des SNP candidats (in silico) et validation (expérimental). A partir de la région B telles que définie plus haut, une seconde étape a consisté à déterminer une collection de SNPs appartenant à cette région, de façon à obtenir une carte de marqueurs de la région. Ces marqueurs ont également été définis de telle façon qu'ils couvrent la longueur totale de la région d'une façon homogène et équidistante. La distance entre les différents SNPs a été fixée en moyenne à 30 kb. Cette opération a été réalisée par la sélection de presque un millier de SNPs répondant à ces critères (SNPs candidats in silico). Parmi ces SNPs ainsi présélectionnés lors de la première étape, environ 90% des SNPs se sont avérés opérationnels. Par opérationnel, on entend amplifiables à l'aide des réactifs définis de manière usuelle. Les SNPs sélectionnés ont été analysés sur 92 individus contrôles (individus du Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) afin de valider la présence d'au moins deux allèles pour chacun des SNP (validation du polymorphisme). A l'issue de cette sélection expérimentale, seuls les SNPs présentant une fréquence allélique de l'allèle le plus rare d'au moins 10%, ont été retenus. Par cette méthode, 232 SNPs ont été validés sur la région B. 3Assemblage des ADN (Pooling) Afin d'augmenter la capacité de génotypage, une stratégie de pooling a été effectuée sur les différents ADN. La puissance de cette méthode est rapportée dans différentes publications (notamment Werner et al, Hum Mutat 2002 Jul; 20(1):57-64, Bansal et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Dec 24; 99(26):16871-4). Pour effectuer ce pooling, les ADN des différents individus avec le trait canitie précoce' (CP) et celui des individus contrôles ont été assemblés. Cet assemblage a été réalisé de façon à ce que chacun des ADN soit représenté de manière équimolaire, afin de garantir qu'aucun individu n'ait d'influence prépondérante sur le résultat par rapport à un autre. A cette fin, la concentration exacte de chacun des ADN a été mesurée par la méthode Picogreen dans les différents échantillons des individus. Des groupes ont été constitués en tenant compte d'un score phénotypique d'intensité de canitie qui a été attribué pour chaque individu de la façon suivante. Dans un premier temps, deux sortes de critères ont été définis, les critères primaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 2, et les critères secondaires auxquels sont affectés des valeurs de score de 1. Il y a 2 critères primaires (valeur de score=2 pour chacun d'eux) qui sont: (i) premiers cheveux blancs avant 18 ans; (ii) chevelure poivre et sel claire à 30 ans: Il y a 3 critères secondaires (valeur de score=1 pour chacun d'eux) qui sont: (i) premiers cheveux blancs avant 25 ans; (ii) Chevelure poivre et sel foncée à 30 ans, (iii) notion familiale de canitie précoce. En additionant pour chaque individu les scores obtenus avec de chacun des critères diagnostics, on peut définir pour chaque individu un score d'intensité du phénotype de canitie précoce. Il a ainsi été possible de définir plusieurs groupes différents selon le score phénotypique. Parmi les individus atteints, 72 individus dont le score est supérieur ou égal à 4 ou 5 et 132 individus dont le score phénotypique est supérieur ou égal à 2. Groupe AI: ce groupe est constitué par l'ADN des 72 individus CP dont le score phénotypique est de 4 ou 5. Groupe AII: ce groupe est constitué par l'ADN des 132 individus CP, dont le score phénotypique est de 2, 3, 4 ou 5. Groupes BI et BII: ces groupes sont constitués par l'ADN des individus contrôles dont l'origine géographique est proche de celle des individus CP. Pour ces individus contrôles, les critères de sélection ont été : (i) un âge supérieur à 40 ans, (ii) l'absence de signe de canitie chez l'individu contrôle, (iii) l'absence de notion familiale de canitie. Les critères d'appariement avec un individu du groupe AI ou AII sont une origine géographique identique, un même sexe et une couleur des cheveux identique à 18 ans. Ainsi de cette façon outre l'appariement atteint versus non atteint par le trait phénotypique (CP), chaque individu CP du groupe AI est représenté par un individu contrôle dans le groupe BI dont le lieu d'origine géographique est proche ou identique. Il en va de même pour chaque individu du groupe AII. La constitution des différents groupes est représentée schématiquement sur la figure 2. L'utilisation de ces méthodes rigoureuses de diagnostic clinique des sujets atteints et des sujets contrôles donnent une garantie de fiabilité sur la qualité des données phénotypiques. Par ailleurs, la rigueur de l'appariement selon les règles fixées par les inventeurs est la garantie de la pertinence des analyses statistiques comparant les données génomiques issues de ces individus qu'ils soient regroupés en pools ou comparés individuellement. 4- Sélection des SNPs validés pour le génotypage sur les ADN groupés. Parmi les 232 SNPs validés à l'étape 2, 167 ont été choisis lors d'une nouvelle étape de sélection. Cette nouvelle sélection est basée sur l'intervalle entre les SNPs, fixé en moyenne entre 30 et 50 kb. Les différents SNPs utilisés pour les étapes successives sont répertoriés dans les tableaux suivants. Ces tableaux comportent également 4 SNPs additionnels, qui ont été rajoutés à une étape suivante pour compléter la liste. Ces 4S NPs additionnels sont les SNPs n 86, 97, 131 et 137. Les 171 SNPs de la régions B ont été numérotés par ordre croissant le long (télomère p vers télomère q) de la région B qu'ils couvrent de manière quasi-équidistante 15 et homogène. Région B: SNP Identifiant SNP SNP Identifiant SNP N (GDB) N Identifiant N (GDB) N Identifiant 1 2096071 44 2987903 87 787469 130 2989736 2 2282394 45 2314027 88 rs302919 131 2989728 3 2805103 46 1544012 89 913705 132 3012797 4 1331336 47 1997242 90 932886 133 1038193 1533967 48 928677 91 429269 134 2279265 6 2282179 49 928678 92 2526008 135 964138 7 2011978 50 2315073 93 2072058 136 515078 8 955910 51 933093 94 rs739441 137 484397 9 1147360 52 2315076 95 2905078 138 518630 rs940373 53 2315078 96 64967 139 752835 11 2498905 54 981759 97 2905179 140 1778993 12 2542248 55 2483469 98 rs649168 141 1891996 13 1220653 56 2478858 99 645841 142 1106256 14 1867099 57 2966373 100 rs644234 143 2382867 ucla34k 454177 58 540621 101 532861 144 2065385 16 2241271 59 2994056 102 59071 145 872667 17 1017509 60 2275500 103 1179040 146 914400 18 rs1182 61 10K-56700 104 1887519 147 ucla34k 923462 SNP Identifiant SNP SNP Identifiant SNP N (GDB) N Identifiant N (GDB) N Identifiant 19 rs732074 62 rs943851 105 1179001 148 1412512 rs1125962 63 2282006 106 ucla34k_576465 149 rs968569 21 ucla34k_598296 64 1887786 107 954052 150 210086 22 1322671 65 2076 108 2492057 151 783770 23 1570381 66 928013 109 2506715 152 872006 24 rs676492 67 869381 110 2506696 153 1537414 2286792 68 3012757 111 1079783 154 574840 26 53558 69 2987378 112 rs77905 155 1001523 27 1860641 70 3012717 113 129891 156 755722 28 885345 71 1331631 114 2027963 157 1318383 29 rs1043368 72 1412075 115 628936 158 730399 1557126 73 1331625 116 rs602990 159 1009473 31 947507 74 2149171 117 2428091 160 47713 32 914977 75 ucla34k_694625 118 2428123 161 2297690 33 2210623 76 2296868 119 2519770 162 2139881 34 1475731 77 rs1185193 120 2428083 163 1335099 928518 78 10K-52978 121 2789861 164 55096 36 1864709 79 563521 122 414848 165 2501566 37 944605 80 507998 123 1536474 166 2501559 38 2304812 81 2362369 124 943435 167 2183138 39 1866974 82 577416 125 943429 168 1054864 2269337 83 944812 126 2182640 169 2275781 41 2583839 84 rs1470190 127 ucia34k_177347 170 1891629 42 2791743 85 2247393 128 16832 171 1099298 43 2855181 86 418620 129 ucla34k_642641 5- Génotypage sur les ADN assemblés. Pour les 171 SNPs retenus lors de l'étape 4, l'étape suivante a été de déterminer leur allélotype, c'est-à-dire la fréquence de chacun des allèles, et ce pour les 4 groupes d'ADN assemblés (poolés) selon la sévérité et la précocité du phénotype (voir la définition des 4 groupes à l'étape 3 et figure 2). La fréquence allélique des deux allèles a été déterminée pour chacun des SNP dans les 4 groupes. La signification statistique des écarts de fréquences alléliques entre les groupes AI et BI ou AII et BII est estimée par la valeur p représentant la significativité. Plus la valeur p est faible, plus l'écart est statistiquement significatif Les expériences ont été reproduites 3 fois (3 PCR), chacune des trois PCR étant ensuite testée 5 fois sur le MALDI-TOF afin d'obtenir une valeur moyenne fiable. La figure 3 illustre les résultats obtenus sur la région B pour chaque SNP (numéroté de 1 à 171 le long de la région B). L'ordonnée représente 1/p, mais les valeurs supérieures à 500 (soit p Le tableau 1 résume les résultats obtenus: Chromosome 9 AI-BI Le tableau 2 récapitule les différentes particularités dans la répartition des SNPs dans la région B. Chromosome 9 Clusters (3 SNPs consécutifs positifs ou plus) 2 Paires (2 SNPs consécutifs positifs) 4 Double spots' (2 SNPs positifs séparés par un SNP négatif) 2 Tableau 2: Particularités de la répartition des SNPs positifs dans la région B. Les différents gènes de la région B qui sont mis en évidence par des SNPs positifs répartis en clusters, isolés ou répartis en double spots' constituent une première série de 20 gènes candidats, y compris les gènes prédits. Leur liste est la suivante: Région B: DDX31, GTF3C4, C9ORF9, TSC1, ABL1, L0057109, FREQ, ADAMTS13, LAMC3, SURFS, SURF6, FCN2, FCN1, OLFM1, VAV2, ABO, CELL, SARDH. Une analyse plus fine a été réalisée qui a permis d'élaborer une nouvelle liste de gènes chevauchés par un SNP positif, grâce à ENSEMBL (ENSEMBL v. 8.30a.1 17 sep 2002). Cette liste comprend les gènes chevauchés (codants, UnTranslated Region UTR, et intronique) par un SNP positif, à l'exclusion des gènes qui sont proches d'un SNP positif situé dans une région régulatrice. a donné les résultats ENST00000298489, ENST00000266097, ENST00000263612, ENST00000245590, ENS T00000298545, ENST00000298546, ENST00000298552, ENST00000298554, ENST00000298555, ENST00000277434, ENST00000277433, ENST00000298632, ENST00000291687, ENST00000298656, ENST00000298658, ENST00000298660, ENST00000277355, ENST00000298678, ENST00000298676; ENST00000298656, ENST00000298658, ENST00000298660, ENST00000277355, ENST00000298678, ENST00000298676, ENST00000298682, ENST00000298683, ENST00000291744, ENST00000291741, ENST00000223427, ENST00000198253, ENST00000277527, ENST00000263604, ENST00000266109, ENST00000298467, ENST00000266100, ENST00000277422, ENST00000263609. Les tableaux suivants répertorient les gènes prédits de la région B dans les clusters, les doubles spots (DS) et les SNP positifs individuels, à partir de la version NCBI Build 28 (Déc. 2001). CDS indique la séquence codante et tx le transcrit. 10 15 Intronique: Q96RU3, ABL1, LAMC3, Q96MA6, Q9NXK9, Q9GZR2, VAV2, COL5A1, KCNT1, Q8WX41 Une nouvelle analyse pour les gènes prédits, grâce à ENSEMBL, suivants: REGION B chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin SNP# NOM Nb EXONS 47à49DS NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298489 chr9 125457741 125470257 125373136 125470567 + 28 ENST00000266097 chr9 125373234 125470257 125373136 125470567 + 28 86 à 92 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000263612 chr9 127045062 127120443 127044482 127120595 20 ENST00000245590 chr9 127120792 127139136 127120534 127139622 + 5 ENST00000298545 chr9 127175884 127328449 127175884 127328449 13 97 à 99 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298555 chr9 127469679 127471065 127469615 127471372 + 1 ENST00000277434 chr9 127501047 127508171 127501047 127508171 + 8 ENST00000277433 chr9 127481205 127508171 127480906 127508695 + 11 86 à 99 DS chr9:127094511-127505542 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000263612 chr9 127045062 127120443 127044482 127120595 ENST00000245590 chr9 127120792 127139136 127120534 127139622 + 5 ENST00000298545 chr9 127175884 127328449 127175884 127328449 13 ENST00000298546 chr9 127334141 127338631 127328556 127340224 + 4 ENST00000298552 chr9 127346431 127379066 127341543 127394815 - 23 ENST00000298554 chr9 127436872 127441241 127436872 127441244 + 6 ENST00000298555 chr9 127469679 127471065 127469615 127471372 + 1 ENST00000277434 chr9 127501047 127508171 127501047 127508171 + 8 ENST00000277433 chr9 127481205 127508171 127480906 127508695 + 11 118 à 120 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298632 chr9 128877580 128878579 128877580 128878579 - 1 ENST00000291687 chr9 128750384 128978689 128750384 128978689 - 27 128 à 129 chr9:129656527-129827634 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298656 chr9 129757553 129770881 129757553 129770881 - 16 ENST00000298658 chr9 129757607 129781523 129757607 129781523 - 13 ENST00000298660 chr9 129757553 129786638 129757553 129786638 - 26 ENST00000277355 chr9 129607564 129789067 129607564 129789067 + 29 ENST00000298678 chr9 129811215 129812613 129811213 129812613 + 2 ENST00000298676 chr9 129814180 129826506 129607438 129826534 + 37 133 à 134 chr9:129947144-129977399 137 à 138 chr9:130035429-130045373 128 à 134 DS chr9:129656527-129977399 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298656 chr9 129757553 129770881 129757553 129770881 - 16 ENST00000298658 chr9 129757607 129781523 129757607 129781523 - 13 ENST00000298660 chr9 129757553 129786638 129757553 129786638 - 26 à 156 chr9:130714327-130728681 NOM chrom ENST00000277527 chr9 ENST00000263604 chr9 ENST00000277355 chr9 ENST00000298678 chr9 ENST00000298676 chr9 ENST00000298682 chr9 ENST00000298683 chr9 ENST00000291744 chr9 ENST00000291741 chr9 ENST00000223427 chr9 ENST00000198253 chr9 SNP + individuels pas de gènes pas de gènes NOM chrom ENST00000266109 chr9 pas de gènes 129607564 129789067 129607564 129789067 + 29 129811215 129812613 129811213 129812613 + 2 129814180 129826506 129607438 129826534 + 37 129864608 129868564 129864598 129870351 + 5 129864608 129869270 129864598 129871307 + 7 129864608 129871199 129864598 129871307 + 8 129864608 129871199 129864598 129871307 + 7 129893584 129901655 129893369 129901747 - 9 129896270 129901655 129893369 129901747 - 8 cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS 130609471 130715656 130609471 130715656 4 130691065 130775279 130691064 130775281 + 29 cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS 124213577 124360885 124213576 124360901 - 15 44 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000298467 chr9 125063030 125234391 125063030 125234391 + 11 ENST00000266100 chr9 125184157 125234391 125183776 125236384 + 11 57 pas de gènes pas de gènes 104 NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000277422 chr9 128045772 128056657 128044878 128056857 - 8 108 pas de gènes NOM chrom cdsDébut cdsFin txDébut txFin Brin Nb EXONS ENST00000263609 chr9 129380168 129507477 129380168 129507477 + 9 141 pas de gènes 6- Sélection des SNPs pour le génotypage sur les ADN individuels. Parmi les 171 SNPs utilisés pour le génotypage sur les ADN assemblés, 33 ont été retenus pour le génotypage des ADN individuels. Les SNPs retenus montrent en effet un écart statistiquement significatif lors du génotypage sur les pools, c'est-à-dire p La liste des SNPs ainsi choisis et la comparaison A-B sont données dans la figure 4. Le tableau 3 résume les résultats obtenus. Chromosome 9 AI-BI Le choix des 33 SNPs pour le génotypage individuel s'est concentré sur les SNPs présents dans les clusters, ceux formant des paires (2SNPs consécutifs positifs) et ceux formant des double spots' (2 SNPs positifs séparés par un SNP négatif). La figure 5 illustre la répartition des 33 SNPs choisis. En effet, il a été observé que l'estimation des fréquences alléliques sur des pools (et non sur des individus) peut conduire à des faux positifs' et que cette tendance est majorée lorsque les pools contiennent moins de 200 ADN. De ce fait, les SNPs positifs isolés ont en partie été écartés ainsi que ceux ayant une discordance dans les contrôles (BI et BII). Les 33 SNPs ont été analysés individuellement sur tous les ADN disponibles (187 individus avec le phénotype CP et 186 individus contrôles sans phénotype CP). Sur les 33 SNPs choisis, 16 SNPs sont en clusters, 6 SNPs sont en doubles spots et 12 SNPs sont positifs individuellement. Ce génotypage individuel permet de calculer précisément la fréquence des allèles et des génotypes observés dans les différents groupes. L'ensemble de ces données permet également de comparer la distribution des haplotypes observés au niveau des SNPs positifs organisés en clusters'. Par haplotype, on entend la combinaison d'allèles tendant à être transmis ensemble. L'analyse intégrée de l'ensemble de ces données permet de déterminer les SNPs ou 30 des groupes de SNPs qui montrent une association avec le trait CP, c'est-à-dire un allèle ou un ensemble d'allèles qui, dans une population, sont transmis plus fréquemment avec ce trait. 7- Etude du déséquilibre de liaison. Le déséquilibre de liaison (LD, Linkage Desequilibrium) a été analysé par le programme GenePop, en l'absence de données sur la phase des haplotypes sur les chromosomes analysés. Le déséquilibre de liaison est une situation où 2 gènes (allèles) ségrègent ensemble à une fréquence plus haute que la fréquence prédite par le produit de leurs fréquences individuelles. Cela signifie que les deux gènes ne sont pas indépendants puisqu'ils ségrègent ensemble plus fréquemment que prévu par les statistiques, il y a donc un déficit d'indépendance entre des allèles situés proche l'un de l'autre sur un même chromosome. Cette analyse de déséquilibre de liaison a permis de définir des blocs d'ADN qui sont matérialisés par plusieurs marqueurs dont la coségrégation des allèles dévie d'une coségrégation régie par le seul hasard. Cette situation est produite par une absence ou un déficit de recombinaison au sein de ce bloc. La taille des régions présentant un déséquilibre de liaison est variable selon les régions chromosomiques, elle semble s'étendre sur 10kb à 200kb. Les résultats sont présentés dans la figure 6. 8- Comparaison des fréquences alléliques/génotypiques pour chaque SNP. Cette comparaison des fréquences alléliques/génotypiques a été réalisée pour chaque SNP dans les groupes canitie précoce (1 à 5) et dans les groupes de contrôles. Les résultats obtenus sont reproduits dans les tableaux suivants et représentés dans la figure 7. La colonne con-con indique la comparaison entre les différents groupes d'individus contrôles. La colonne aff indique les comparaisons pour chaque groupe d'affectés, contre tous les autres groupes d'affectés ou de contrôle. SNP Con-con aff counts SNP Con-con aff counts 6 0 5 5 104 0 1 1 24 2 0 2 118 0 4 4 27 0 21 21 120 0 6 6 44 0 2 2 125 0 2 2 49 0 4 4 128 0 2 2 57 3 2 5 129 0 3 3 86 2 4 6 131 2 5 7 88 0 7 7 133 4 4 8 0 6 6 134 2 6 8 91 0 1 1 137 0 10 10 92 0 5 5 138 0 1 1 97 2 3 5 141 0 3 3 99 0 6 6 155 0 5 5 0 4 4 9- Conclusions. Les principales conclusions qui peuvent être tirées des résultats sont les suivantes: Tout d'abord, il y a une grande similitude entre les observations faites sur l'analyse des pools et les génotypages individuels. Les grands clusters sont confirmés. La région B révèle un intervalle, en déséquilibre de liaison (cluster majeur) qui est fortement associé au trait canitie précoce (SNP 418620 à SNP 2526008, position 126'544'533 nt à position 126'745'296 nt, soit une taille de 201 kb). Ce cluster comprend les gènes DDX31, GTF3C4 et Q96MA6. Les gènes ou gènes prédits identifiés dans les intervalles associés à un haplotype positif ou un cluster de SNPs positifs sont les suivants: Haplotype 27 > FREQ PubMed on Product: frequenin homolog/ Mouse Ortholog: Freq Début (position sur chrom.): 124490317 Fin (position sur chrom.): 124554366 > NT 030046.18 Début (position sur chrom.): 124458070 Fin (position sur chrom.): 124489558 > NT 030046.17 Début (position sur chrom. ): 124371672 Fin (position sur chrom.): 124452860 20 Haplotype 97-100 > GTF3C5 PubMed on Product: general transcription factor IIIC, polypeptide 5 Début (position sur chrom.): 127480920 Fin (position sur chrom.): 127508694 > CEL PubMed on Product: carboxyl ester lipase (bile saltstimulated) Début (position sur chrom.): 127512178 Fin (position sur chrom.): 127522054 > CELL PubMed on Product: carboxyl ester lipase-like (bile salt-stimulated) Début (position sur chrom.): 127532733 Fin (position sur chrom.): 127537549 30 >FS PubMed on Product: Forssman synthetase Début (position sur chrom.): 127603661 Fin (position sur chrom. ): 127614093 > ABO blood group (transferase A, alpha) Début (position sur chrom.): 127907180 Fin (position sur chrom.): 127924298 Haplotype 86-92 > BARHL1 > DDX31 > GTF3C4 > Q96MA6 (Adenylate cyclase) EXEMPLE 3: Analyse plus fine de la région de l'haplotype 86-92 A la suite des travaux présentés dans l'exemple 2, les inventeurs ont poursuivi l'analyse de la région du chromosome 9 définie par l'haplotype 86-92 toujours à l'aide la technologie basée sur les SNP, afin de mettre en évidence les allèles impliqués dans la canitie précoce. 1- Addition de 5 nouveaux SNPs dans cette région Dans la région de l'haplotype 86-92, telle que définie à l'issue du génotypage individuel réalisé dans l'exemple 2, les 5 SNPs suivants sont conservés: SNP 86: 418620; SNP 88: rs302919; SNP 90: 932886; SNP 91: 429269; SNP 92: 2526008. Dans un premier temps, les inventeurs ont défini 5 nouveaux SNPs dans cette région afin de compléter la liste précédente. Ces 5 SNPs additionnels ont été choisis parmi des SNPs dont le polymorphisme a déjà été validé par d'autres équipes. Ces 5 SNPs additionnels sont numérotés 86a, 86b, 86c, 86d et 91a en fonction de 20 leur position relative par rapport aux 5 SNPs précédemment cités le long du chromosome 9 (du télomère p vers le télomère q). SNP 86a: 306537; SNP86b: 3739902; SNP 86c: 371169; SNP86d: 3780813; SNP91a: rs106906. Pour les 10 SNPs ainsi définis, la valeur "p-value" a été calculée, c'està-dire l'écart statistique entre les groupes AI et BI (AI: personnes atteintes de CP avec un score phénotypique de 4 ou 5 et BI: contrôles liés aux personnes du groupe AI; voir l'exemple 2 pour les définitions précises). La figure 8 illustre les résultats obtenus. 2- Addition de 30 nouveaux SNPs dans cette région A l'issue de l'étape précédente, en raison des résultats particulièrement positifs concernant la liaison de la région 86-92 avec le trait phénotypique canitie précoce', les inventeurs ont décidé de sonder cette région avec une batterie de SNPs plus fournie. Ils ont donc intégrés 30 nouveaux SNPs dans cette région. La figure 11 reporte le nom de ces 30 SNPs additionnels, leur numérotation de 1 à 30 ainsi que leur position relative sur le chromosome 9 par rapport aux 10 SNPs déjà définis. Le tableau indique également la re-numérotation de 1 à 40 qui a été effectuée pour l'intégralité des 30 SNPs additionnels et des 10 SNPs précédemment choisis. Le tableau indique également Pour les 30 SNPs additionnels, les inventeurs ont également calculé la valeur p de l'écart statistique entre les individus du groupe AI et ceux du groupe BI. La figure 9 illustre les résultats obtenus. Enfin, les inventeurs ont intégré les résultats sur la valeur de p obtenuspour les 40 SNPs couvrant la région 86 à 92. Les résultats sont illustrés à la figure 10. Sur cette figure, l'axe des abscisses, qui comporte les SNPs, est gradué en tenant compte des intervalles réels entre les SNPs sur le chromosome 9. La figure 11 reporte également les valeurs de p (en fait de logp). Il est rappelé qu'une valeur de p inférieure à 0,001 indique une liaison significative. L'analyse des résultats présentés dans la figure 11 montre que 4 SNPs présentent des résultats tout à fait remarquables, avec une valeur d'association logp supérieure à 2,3. Il s'agit des SNPs: rs306534 (SNP 16/40) ; rs3739902 (SNP 25/40), rs575916 (SNP 30/40) et rs365297 (SNP 31/40). Ces SNPs, qui présentent une valeur d'association au trait canitie précoce' sont donc particulièrement indiqués pour toute utilisation liée au diagnostic de la canitie précoce. 3- Analyse des haplotypes Les inventeurs ont observé que les SNPs de la région 86-92 se distribuent finalement en 2 régions, une région 86-88 et une région 90-92, qui sont en déséquilibre de liaison. Les inventeurs ont donc ensuite réalisé une étude d'association de ces deux haplotypes avec le trait canitie précoce. Les résultats sont présentés dans les deux tableaux de la figure 13. Il est apparent sur cette figure que les résultats d'association sont tout à fait significatifs (p A partir des résultats obtenus sur les haplotypes et de l'excellent résultat obtenu pour le marqueur rs3739902 (-logp> 3), les inventeurs ont analysé plus précisément la région proche du SNP rs3739902 pour définir un haplotype plus précis montrant une liaison à la canitie précoce particulièrement élevée. Les inventeurs ont ainsi pu définir l'haplotype HAP25-27 défini par les SNPs 25 à 27 (voir figure 10), dont le score de liaison à la canitie précoce est très élevé. Les 3 SNPs 25 à 27 constituant l'haplotype sont rs3739902, rs2583805 et rs377090. Revendications 1. Utilisation d'au moins un marqueur SNP du chromosome 9 humain, choisi parmi les marqueurs suivants: rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297, pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu. 2. Utilisation selon la revendication 1, où la forme allélique T du SNP rs306534 indique une prédisposition à la canitie précoce. 3. Utilisation selon la revendication 1, où la forme allélique T du SNP rs3739902 indique une prédisposition à la canitie précoce. 4. Utilisation selon la revendication 1, où la forme allélique G du SNP rs575916 indique une prédisposition à la canitie précoce. 5. Utilisation selon la revendication 1, où la forme allélique T du SNP rs365297 indique une prédisposition à la canitie précoce. 6. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant la détermination, dans un échantillon du matériel génétique dudit individu, des allèles d'au moins un marqueur SNP du chromosome 9 humain, choisi parmi les marqueurs suivants: rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. 7. Procédé selon la revendication 6 comprenant l'étape supplémentaire de comparaison de la forme allélique du marqueur à celle d'autres individus pour établir le diagnostic. 8. Procédé selon la revendication 7 où les autres individus sont des individus qui ne sont pas atteints de canitie précoce. 9. Procédé selon la revendication 7 où les autres individus sont des individus qui sont atteints de canitie précoce. 10. Procédé selon la revendication 7 où les autres individus sont des individus ayant un lien sanguin avec l'individu à diagnostiquer. 11. Procédé selon la revendication 6, où la forme allélique T du SNP rs306534 indique une prédisposition à la canitie précoce. 12. Procédé selon la revendication 6, où la forme allélique T du SNP rs3739902 indique une prédisposition à la canitie précoce. 13. Procédé selon la revendication 6, où la forme allélique G du SNP rs575916 indique une prédisposition à la canitie précoce. 14. Procédé selon la revendication 6, où la forme allélique T du SNP rs365297 indique une prédisposition à la canitie précoce. 15. Utilisation d'un moyen pour détecter les allèles d'un marqueur SNP du chromosome 9 humain, dans un échantillon du matériel génétique d'un individu, pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez cet individu, ledit marqueur étant choisi parmi les marqueurs suivants: rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297. 16. Utilisation selon la revendication 15, où ledit moyen est une sonde nucléique. 17. Utilisation selon la revendication 16 où ladite sonde est couplée à un marqueur radioactif', enzymatique, luminescent ou fluorescent. 18. Utilisation selon la revendication 15, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique T du SNP rs306534. 19. Utilisation selon la revendication 15, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique T du SNP rs3739902. 20. Utilisation selon la revendication 15, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique G du SNP rs575916. 21. Utilisation selon la revendication 15, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique T du SNP rs365297. 22. Kit pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce, comprenant un moyen pour détecter, dans un échantillon de matériel génétique humain, l'allèle d'un marqueur SNP du chromosome 9 humain choisi parmi les marqueurs rs306534, rs3739902, rs575916 et rs365297 et un contrôle positif ou négatif. 23. Kit selon la revendication 22, où ledit moyen est une sonde d'hybridation s'hybridant spécifiquement avec un allèle. 24. Kit selon la revendication 23, où ladite sonde est couplée à un marqueur radioactif, enzymatique, luminescent ou fluorescent. 25. Kit selon la revendication 22, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique T du SNP rs306534. 26. Kit selon la revendication 22, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique T du SNP rs3739902. 27. Kit selon la revendication 22, où ledit moyen permet de déterminer la forme allélique G du SNP rs575916. 28. Kit selon la revendication 22, où ledit moyen permet de déterminer la faune allélique T du SNP rs365297. 29. Procédé pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez un individu, comprenant la détermination, dans un échantillon du matériel génétique dudit individu, des allèles des 3 marqueurs SNPs du chromosome 9 humain suivants: rs3739902, rs2583805 et rs377090, afin de déterminer l'haplotype de cet individu relatif à ces 3 SNPs. 30. Procédé selon la revendication 29 comprenant l'étape supplémentaire de comparaison de l'haplotype formé par les 3 SNPs à celui d'autres individus pour établir le diagnostic. 31. Procédé selon la revendication 30 où les autres individus sont des individus qui ne sont pas atteints de canitie précoce. 32. Procédé selon la revendication 30 où les autres individus sont des individus qui sont atteints de canitie précoce. 33. Procédé selon la revendication 30 où les autres individus sont des individus qui ont un lien sanguin avec l'individu à diagnostiquer. 34. Utilisation de moyens pour détecter les allèles de trois marqueurs SNPs du chromosome 9 humain dans un échantillon du matériel génétique d'un individu pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez cet individu, lesdits marqueurs étant: rs3739902, rs2583805 et rs377090. 35. Utilisation selon la revendication 34, où lesdits moyens sont des sondes nucléiques. 36. Utilisation selon la revendication 35 où lesdites sondes sont couplées à des marqueurs radioactifs, enzymatiques, luminescents ou fluorescents. 37. Kit pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce, comprenant des moyens pour détecter, dans un échantillon de matériel génétique humain, les allèles des marqueurs SNPs du chromosome 9 humain suivants: rs3739902, rs2583805 et rs377090. 38. Kit selon la revendication 37, comprenant de plus un contrôle positif ou négatif. 30 39. Kit selon la revendication 37, où lesdits moyens sont des sondes d'hybridation s'hybridant spécifiquement avec un allèle donné de chaque marqueur SNP. 40. Kit selon la revendication 39, où lesdites sondes sont couplées à des marqueurs radioactifs, enzymatiques, luminescents ou fluorescents. 41. Utilisation d'au moins un fragment polynucléotidique comprenant au moins 18 nucléotides consécutifs dont la séquence correspond à tout ou partie de la région homologue chez un mammifère non humain à celle du chromosome 9 humain définie par les bornes SNP rs306534 et rs365297, pour le diagnostic d'une prédisposition à la canitie précoce chez ledit mammifère. 42. Utilisation selon la revendication 42, où ledit mammifère est un cheval.