Brevet FR2860319A1 — publié le 20050401

L'invention concerne un procédé de détermination de la position de puces d'échantillons tissulaires sur une lame en matériau transparent, préférentiellement en verre. Elle s'applique plus particulièrement à un procédé de détermination de 5 la position de puces d'échantillons tissulaires sur une lame obtenue par la technique dite de "Tissue MicroArray", ci-après appelée "TMA" dans un but de simplification. Dans le cadre de l'invention, le terme "puce" doit être compris comme étant relatif à de fines sections de tissus de très faibles étendue, a priori o sensiblement circulaires, déposées en surface des lames précitées. L'invention trouve une application particulière, bien que non exhaustive, dans le domaine de la cancérologie. Pour fixer les idées, on se placera dans ce qui suit dans le cas de cette application préférée de l'invention. Dans ce cadre d'application, il est bien connu de congeler des échantillons de tissus ou de les fixer puis de les enrober dans un bloc de paraffine ou de résine plastique. On effectue ensuite des coupes fines à l'aide d'un microtome, coupes d'épaisseurs typiquement comprises entre 5 et 8 dam. Ces coupes sont ensuite appliquées sur une lame de verre. L'étape suivante consiste à pratiquer des colorations et/ou des marquages, à l'aide de produits appropriés. Ces marquages sont appelés histochimiques ou immunohistochimiques. Le marquage par un colorant ou un anticorps spécifique permet la mise en évidence sélective de certains éléments de l'échantillon. L'analyse quantitative des structures tissulaires colorées permet de déterminer des paramètres d'évaluations de l'évolution d'une maladie, par exemple d'un cancer, qui peuvent constituer eux-mêmes des aides à la prise de décision pour établir le traitement. On conçoit que ce procédé est long et onéreux, car il nécessite la 30 réalisation d'autant de lames que de patients à traiter, voire plusieurs lames par patient si plusieurs colorations et marquages sont nécessaires. 2860319 2 Notamment, les produits nécessaires aux marquages et à la coloration coûtent chers. Comme il a été indiqué ci-dessus, il a été proposé récemment de faire appel à la technique dite "TMA", même si cette technique est encore appliquée essentiellement à la recherche. Il est utile d'en rappeler les caractéristiques essentielles. Cette technique permet d'obtenir sur une même lame plusieurs échantillons tissulaires par carottages successifs. En résumé, on part d'un bloc de paraffine contenant l'échantillon de o tissu à échantillonner que l'on appelle arbitrairement "bloc donneur" et d'un bloc vierge de paraffine que l'on appelle arbitrairement "bloc receveur". Le principe de base est de prélever une "carotte" sur un bloc donneur déterminé et de l'implanter sur le bloc vierge. Dans une phase préliminaire, il est nécessaire de préparer un plan (topologie) expérimental du "TMA". Pour ce faire, on définit les coordonnées futures de chaque échantillon sur le bloc vierge, de manière à pouvoir retrouver facilement la provenance de chaque spot ou puce. Ensuite, on effectue un carottage dans le bloc receveur pour une première coordonnée à l'aide d'une aiguille creuse et on expulse la paraffine à l'aide d'un piston, de manière à créer un "pré-trou". On effectue un carottage sur un bloc donneur, après avoir choisi la zone à prélever à l'aide d'un microscope, et on expulse l'échantillon dans le "pré-trou" du bloc receveur. La même opération est répétée de façon itérative en suivant bien le plan expérimental prédéfini dans la phase initiale, jusqu'à obtenir une grille complète de puces. Les carottes peuvent provenir a priori d'un seul bloc donneur et/ou de plusieurs blocs donneurs, dans ce dernier cas chaque bloc pouvant être associé à un patient prédéterminé et/ou à un prélèvement différent sur un même patient. Dans tous les cas, le plan expérimental permet d'établir une corrélation entre les carottes prélevées et les emplacements des échantillons implémentés sur le bloc receveur. Une fois le bloc "TMA" terminé, il est possible d'effectuer, comme dans la technique antérieure, des coupes fines au microtome de 5 à 8 pm. Pour cela, 2860319 3 il est recommandé (mais non obligatoire) d'appliquer un ruban adhésif spécial à la surface du bloc de paraffine (du type connu sous la dénomination "PSA" , Marque déposée). Ce ruban adhésif permet de bien maintenir les tissus lorsque l'on passe le bloc au microtome et de limiter les déformations des structures tissulaires lors de l'opération de coupe. Cette coupe est appliquée sur une lame spéciale composée d'un polymère qui durcit lorsqu'elle est exposée à un rayonnement ultraviolet. Elle est donc placée quelques secondes sous une lampe à ultraviolet pour fixer définitivement la coupe sur la lame. Le ruban adhésif spécial peut ensuite être retiré en utilisant des solvants o organiques inertes. Le prix de revient du consommable n'étant pas négligeable, certains utilisateurs préfèrent coller leur ruban de paraffine directement sur une lame, et le faire adhérer par la chaleur. On obtient alors sur la lame une "matrice" de spots, que l'on appellera ci-après "puces", ces puces étant ordonnées suivant les lignes et colonnes de la matrice précitée. La matrice peut comprendre un "bloc" unique de puces ou être subdivisée en "sous-blocs". Il y a lieu ici de bien différencier la notion de blocs "physiques" de paraffine (se présentant le plus souvent sous la forme de parallélépipède rectangle) des blocs (ensembles) constitués d'une collection ordonnée de puces. L'étape suivante consiste à pratiquer des colorations et des marquages sur les lames de "TMA", de façon habituelle, en fonction des résultats recherchés. L'utilisation du ruban adhésif spécial permet de limiter les pertes de puces tissulaires qui sont de l'ordre de 10 à 30 % habituellement. La coloration la plus classiquement effectuée nécessite l'utilisation d'Hématoxyline et d'éosine (H&E). Des marquages par imunohistochimie ou hybridation in situ de diverses protéines intéressantes peuvent ensuite être entrepris, de façon à déterminer le "profil protéique" du tissu. Il est possible ainsi de pratiquer sur le bloc de "TMA" de trois cents à cinq cents coupes différentes à la recherche de marqueurs différents (p53, Ki67, etc. ...) Une fois les marquages et colorations adaptés effectués, les puces sont habituellement analysées visuellement une par une, à l'aide d'un 2860319 4 microscope couplé ou non à une camera numérique haute résolution, de façon à opérer une acquisition numérique. La figure 1A placée en fin de la présente description illustre de façon très schématique les principales étapes de ce procédé. On a représenté sur cette figure 1A, X blocs donneurs de paraffine, B, à B,c, supportant chacun un échantillon de tissus, E, à Ex. A l'aide d'une aiguille creuse A, on a réalisé X pré-trous, t, à tc, dans un bloc vierge de paraffine ou bloc récepteur Br, selon une configuration pré- établie: a priori selon une disposition régulière, comprenant quatre lignes et deux colonnes dans l'exemple décrit (X= 8). Toujours à l'aide d'une aiguille creuse, on prélève des carottes, c, à cx, dans des endroits prédéterminés des échantillons de tissus, E, à Ex., présents sur les blocs, B, à Bx, et on transfère les carottes obtenues, c', à cx, dans les pré-trous, t, à t x, toujours en suivant le plan expérimental précité. L'étape suivante, comme il a été décrit, consiste à obtenir une lame La supportant X puces, p, à Px, ordonnées suivant la même topologie que les carottes, c', à cX, sur le bloc récepteur Br. L'ensemble des puces forme un bloc b. Dans la réalité, le nombre de puces sur la lame La est beaucoup plus élevé que ce qui a été représenté sur la figure 1A, typiquement plusieurs centaines. Le bloc, désormais référencé b', comme illustré par la figure 1B placée en fin de la présente description, peut être lui-même subdivisé en sous-blocs, par exemple quatre, b, à b4. Pour fixer les idées, il existe typiquement quatre diamètres de carottage disponibles suivant les aiguilles utilisées, à savoir 0,6 mm, 1 mm, 1,5 mm et 3 mm. Le diamètre le plus couramment utilisé est 0,6 mm avec un espacement entre puces régulier, mais laissé au choix de l'utilisateur. Il s'ensuit que, compte tenu des dimensions des lames couramment utilisées, il est envisageable d'obtenir plus de 1000 puces par lame. Pour une description plus détaillée de la technique "TMA", on pourra se reporter avec profit, et à titre d'exemple non exhaustif, à l'article de KALLIONIEMI et al. : "Tissue microarray technology for high-throughput 2860319 5 molecular pofiling cancer", paru dans "Human Molecular Genetic", octobre 2001, pages 657-662. La technique "TMA" qui vient d'être rappelée présente des avantages importants et notamment les suivants: - diminution considérable de la quantité de réactifs utilisée (en particulier les anticorps très onéreux), puisque toutes les puces à observer sont regroupées sur une seule lame, ce qui diminue le coût proportionnellement au nombre de tissus échantillonnés; et - gain de temps pour l'observation et de mémoire lors de l'acquisition o numérique, pour la même raison que précédemment; et II existe deux types principaux d'appareils pour opérer le carottage et le transfert sur le bloc de paraffine vierge ou bloc récepteur. Ces appareils sont connus sous la dénomination anglo-saxonne de "Tissue Arrayers" (ou constructeur de grilles d'échantillons de tissus). Les "Tissue Arrayers" manuels permettent à un utilisateur de choisir une zone d'intérêt dans le tissu à échantillonner en se référant au microscope. Ce dernier peut être monté en parallèle. On doit noter que le repérage effectué sur une lame histologique est très approximatif. Ce type d'appareil est, bien sûr, moins cher qu'un appareil automatique (qui va être décrit ci-après), mais la fabrication d'un bloc de paraffine "TMA" nécessite plus de temps et demande plus de manipulations. Pour fixer les idées, les opérateurs expérimentés réalisent entre 40 et 150 carottes par heure. Les "Tissue Arrayers" automatiques autorisent un choix de zones de carottage effectué de façon aléatoire: le critère unique étant l'aspect extérieur du tissu). On doit être conscient que, par exemple dans le cas de tumeurs solides (la plupart du temps hétérogènes), ce mode de fonctionnement peut fausser les résultats lors de l'analyse. Les appareils automatiques sont naturellement plus coûteux mais présentent l'avantage d'être plus rapides: typiquement 120 à 180 carottages par heure, ce qui n'est pas à négliger lors de la fabrication de "TMA" à grande échelle. 2860319 6 La technique "TMA", même si elle présente des avantages indéniables, au moins théoriques, n'est pas pour autant dépourvue d'inconvénients. Quelques uns ont été rappelés ci-dessus. On doit d'abord souligner que du fait que les zones observées, c'est-àdire celles obtenues par carottage, sont de faibles dimensions, leur représentativité peut souvent être mise en doute. Pour certains types de tissus, pour compenser l'hétérogénéité de ces tissus et obtenir des résultats plus reproductibles et plus fiables, on doit effectuer deux carottages par échantillon de tissu à analyser, voire trois ou cinq, comme par exemple pour les tissus riches en stroma (le sein par exemple). Des puces en grand nombre (par exemple 600 ou plus) doivent être repérées sur la lame et corrélées avec les origines des carottes: les emplacements des prélèvements sur les blocs donneurs et les blocs donneurs eux-mêmes. Enfin, on constate de nombreuses déformations et dérives dans l'espace essentiellement dues à la chaleur: formes des puces à proprement parler, aspect, emplacements sur des lignes et colonnes de la matrice finale du ou des blocs de la lame, orientations des puces et/ou des blocs/sous- blocs, pertes de puces, etc. II s'ensuit que l'un des problèmes à résoudre, pour que la technique "TMA" soit utilisable dans la pratique, de façon fiable, est la détermination correcte, sans ambiguïté possible, de la position des puces sur une lame. L'invention se fixe pour but un tel procédé et vise à pallier les inconvénients des procédés de l'Art Connu, et dont certains viennent d'être rappelés. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir la position des puces et l'enregistrement de ces positions dans une base de données numériques, en vue de leur indexage. Pour ce faire, selon une première caractéristique importante, on procède tout d'abord à une numérisation du ou des blocs de puces présents sur la lame, de façon à en obtenir une image numérique et à l'enregistrement de cette image dans des moyens de mémoire, cette numérisation ne 2860319 7 nécessitant qu'une résolution relativement faible. Cette numérisation peut être obtenue, de façon connue en soi, en mettant en oeuvre un scanner. Les dimensions des puces et l'écartement moyen inter-puces sont des paramètre a priori connus. Selon une autre caractéristique importante, à partir de la numérisation précédente, on crée une image binaire de la lame en appliquant un seuil, donc une image binaire des puces, et on enregistre les valeurs binaires créées dans des moyens de mémoire. Selon une autre caractéristique importante, on redresse les puces de o chaque bloc suivant des directions dites horizontale et verticale associées à l'image binaire précitée. Selon une autre caractéristique importante, on détermine l'ordre des puces et les localisations de ces puces suivant des lignes et des colonnes, et on dresse un tableau contenant les coordonnées de chaque puce par rapport à ces lignes et colonnes, ainsi que par rapport aux blocs les contenant. L'invention a donc pour objet principal un procédé de détermination de la position de puces d'échantillons tissulaires sur une lame en matériau transparent, notamment en verre, ladite lame comportant au moins un ensemble de ces dites puces et celles-ci étant disposées, de façon régulière, sensiblement selon des lignes et des colonnes orthogonales dans chacun des dits ensembles, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: - acquisition d'une image numérique de ladite lame et son enregistrement dans des moyens de mémorisation; - construction d'une image binaire de ladite image numérique et de chacun desdits ensembles en lui appliquant un seuil déterminé, de manière à obtenir une image binaire desdites puces, ces images de puces étant disposées initialement selon des lignes et des colonnes orthogonales entre elles; - agrégation desdites puces dans chacun desdits ensembles, de manière à former des blocs; 2860319 8 - redressement desdites images binaires de puces par rapport à des axes dits horizontal et vertical d'un dièdre de référence associé à ladite image binaire; - dilatation desdites images de puces à l'aide d'un élément structurant horizontal de manière à obtenir des rubans pleins alignés sur des lignes parallèles au dit axe horizontal et labellisation de ces rubans, ladite labellisation comprenant l'attribution d'un numéro à chacune desdites lignes - dilatation desdites images de puces à l'aide d'un élément structurant o vertical de manière à obtenir des rubans pleins alignés sur des colonnes parallèles au dit axe vertical et labellisation de ces rubans, ladite labellisation comprenant l'attribution d'un numéro à chacune desdites colonnes; - multiplication desdits numéros de labels horizontaux par un nombre déterminé, ledit nombre déterminé étant supérieur au nombre desdites lignes ou des dites colonnes, et addition desdits labels horizontaux multipliés avec lesdits labels verticaux, de manière à former une image dite de label; - transformation de ladite image de label en image niveaux de gris; application des coordonnées desdites images de puces comme masque pour déterminer une valeur d'intensité aux intersections desdits labels horizontaux et verticaux où lesdites puces sont présentes; et - détermination à partir desdites intensités des coordonnées de bloc, de lignes et de colonnes desdites puces. L'invention va maintenant être décrite de façon plus détaillée en se référant aux dessins annexés, parmi lesquels: - les figures 1A et 1B illustrent très schématiquement certaines étapes de la technique dite "TMA" selon l'art connu; - la figure 2 illustre schématiquement l'étape initiale du procédé 30 permettant d'acquérir une image numérique d'une lame obtenue par la technique "TMA" portant des groupes de puces; et 2860319 9 - les figures 3A à 3K illustrent schématiquement les principales étapes ultérieures du procédé selon l'invention. Le procédé de détermination de la position de puces d'une lame obtenue par la technique "TMA" va maintenant être explicité par référence aux 5 figures 2 à 3K. Sur ces figures, les éléments identiques portent les mêmes références et ne seront re-décrits qu'en tant que de besoin. La figure 2 illustre de façon schématique l'étape initiale du procédé selon l'invention. o On a supposé que l'on disposait d'une lame La portant des groupes de puces obtenue par la technique "TMA", conformément aux technologies mise en oeuvre dans l'art connu. On a également supposé que cette lame La, comme illustré sur les figures ci-après, portait quatre groupes de puces d'approximativement soixante puces, soit un total d'environ 240 puces. Comme il a été indiqué, le nombre total de puces peut être plus important ou plus faible. Le nombre de bloc peut être supérieur ou inférieur, voire réduit à l'unité dans ce cas. La lame La est disposée dans un scanner 1. Le scanner 1 est relié à un ordinateur 2 par toute liaison 10 appropriée, par exemple du type "USB" (pour "Universal Serial Bus" ou "Bus universel série). L'ordinateur 2 comprend, de façon habituelle, une unité centrale 21, munie notamment de moyens (non représentés) de calcul et de mémorisation (notamment une mémoire centrale à accès aléatoire et un ou plusieurs disques durs), d'un clavier 22 et d'un organe de pointage (souris) 23. De façon connue en soi, la lame La est scannée pour en acquérir une image numérique enregistrée dans les moyens de mémorisation de l'ordinateur 2, les valeurs acquises représentant des valeurs "RVB" pour chaque pixel de la lame. La résolution du scanner peut être relativement basse, au moins de l'ordre de 2000 à 4000 points par pouce. A partir de cet enregistrement, on construit une image binaire lB des blocs de puces en appliquant une valeur de seuil prédéterminée. De façon arbitraire, les intensités supérieures à ce seuil sont présentées par des "1" 2860319 10 (par exemple en blanc sur la figure 3A), les autres par des "0". La figure 3A représente l'affichage sur l'écran 20 de l'ordinateur 2 de cette image binaire lB, composée de quatre blocs d'images de puces, lb, à /b4. Pour cette opération, on peut faire appel aux moyens de calcul de l'ordinateur 2 (figure 2). La figure 3B illustre de façon agrandie, l'un des blocs: bloc Ib3. On constate sur la figure 3B que certaines images de puces sont absentes ou "détériorées" quant à leur aspect. En outre leur arrangement n'est pas régulier en lignes et colonnes, I1 à /6 et col à colt), respectivement, et ces lignes et colonnes présentent des o inclinaisons par rapport à deux axes d'un dièdre de référence que l'on appellera arbitrairement vertical V et horizontal H (bords de l'image des blocs lb, à /b4). Ci-après pour simplifier la description, on appellera les images des puces et des blocs simplement "puces" et "blocs", étant entendu qu'il ne s'agit plus d'entités physiques. Les puces sont référencées /p1, à /p610, par rapport aux numéros de lignes et colonnes, I, à /6 et col à colt). On constate que, dans le bloc /b3, les puces Ip19 et Ip27 sont manquantes, ces puces s'étant probablement décollées lors de l'opération de découpage en coupe fine au microtome. La puce /p72 (non expressément représentée sur la figure 3A) semble être décalée vers la gauche et se trouver en superposition de la puce /p71, si on considère la forme de cette dernière On a également représenté la pente moyenne a3 des lignes /, à /6 par rapport aux axes H et V, ces axes étant parallèles aux bords de l'image binaire lB (figure 3A). L'image binaire lB obtenue peut être améliorée par divers traitement numériques, de façon notamment à éliminer tout artefact. On peut avantageusement la recoller dans une image de taille plus importante pour éviter les effets de bords lors d'une dilatation qui sera opérée comme explicité ci-après. Ensuite, comme illustré par la figure 3C, on agrège les puces pour former des blocs pleins (opération de fermeture) : lb', à lb 4, ce qui permet d'examiner le contour des blocs de puces. On voit clairement que le contour n'est pas régulier, ce qui met en évidence, d'une part, l'absence de certaines puces en bordure de bloc (par exemple /P27 dans le bloc Ib3: figure 3B), et les décalages de celles-ci par rapport aux directions moyennes des lignes et/ou des colonnes (figure 3B: l à /6 et col à co,o). On détermine les coordonnées du centre de chacun des blocs, ainsi que les paramètres du polygone convexe les entourant. On récupère les coordonnées et l'inclinaison de chaque bloc. Pour chaque bloc, on exécute ensuite les opérations suivantes: - On découpe le groupe de puces correspondant à un bloc selon le polygone o convexe (par exemple cal, pour le bloc /b"2), comme illustré par une ligne sur la figure 3D, et on le colle dans une image. - On tourne le bloc de puces par rapport à son centre de son angle d'inclinaison a;. (pour un bloc d'indice 1) . S'il est incliné de moins de 45 , on le, redresse horizontalement, sinon, on le redresse verticalement. - On effectue une rotation desdites puces par rapport au centre du bloc. Le bloc de puces ainsi traité, /bH2, est maintenant censé être droit sur l'axe horizontal H, comme le montre plus particulièrement la figure 3F. II reste à le redresser par rapport à l'axe vertical V. Pour ce faire, et pour chaque bloc, on exécute ensuite les opérations suivantes: - On récupère les coordonnées des puces. - On agrège les puces pour obtenir des blocs. - On cherche ensuite à obtenir l'orientation verticale des blocs, par exemple lb"2. Pour ce faire, on recherche l'inclinaison du polygone convexe cac'2 entourant ce bloc /b'2. On trouve le polygone convexe polygone cac'2 entourant ce bloc lb"2 (représenté par une ligne), comme illustré de façon plus particulière par la figure 3E. On le remplit de "1". De façon plus précise, pour trouver les segments constituant le bord gauche du polygone cac'2, on peut avoir recours à une méthode de traitement d'image consistant à appliquer un filtre numérique. Cette méthode est connue sous la dénomination anglo-saxonne de "HitOrMiss". Cette méthode est bien connue de l'Homme de métier et il est inutile de la décrire plus avant. On pourra se référer, à titre d'exemple non limitatif, à l'ouvrage de Jean SERRA "Image 2860319 12 Analysis and Mathematical Morphology", 1982, Academic Press. Pour la détection du bord gauche on utilise préférentiellement le noyau suivant: "OXXO11 OXX", dans lequel les "X" représentent des valeurs indéfinies. - On recherche la droite de meilleure inclinaison du bord gauche obtenu, ainsi que son coefficient directeur. - On procède de même pour le bord droit, mais préférentiellement avec le noyau suivant: "XXO11OXXO" On retient le minimum des inclinaisons trouvées, par rapport à l'axe vertical V (angle [32). - On définit, relativement à la puce la plus proche de l'axe des ordonnées du bloc (puce 1p16 du bloc lb"2) et à l'inclinaison du bloc (figure 3E: P2) et à la position de chaque puce les coordonnées relatives à une translation nécessaire pour les redresser. - On soumet chaque puce à une translation selon ces coordonnées. Les puces sont maintenant redressées par rapport aux axes 15 horizontal H et vertical V: bloc IbHV2 comme le montre plus particulièrement la figure 3G. les puces sont désormais référencées lp" à 1p",9. Il va maintenant être possible de déterminer l'ordre des puces Ip" à lp"79. Pour ce faire on exécute pour chaque bloc, par exemple le bloc IbHV2 (figure 3G) les opérations suivantes: - On dilate l'image binaire des puces (par exemple 1p" à Ip"79, si on se reporte à la figure 3G) avec un élément structurant horizontal, comme illustré plus particulièrement par la figure 3H. On obtient une suite de rubans pleins formant des lignes horizontales: l', à l'7 (on a supposé ici, à titre purement indicatif, que le bloc traité comprenait sept lignes). On constate que les contours des ces rubans sont irréguliers et que leurs longueurs ne sont pas identiques. Cela traduit le fait que les puces ne sont pas parfaitement alignées sur les lignes à l'7, d'une part, et que certaines puces manquent en périphérie, d'autre part. - On labellise les lignes ainsi créées. Pour ce faire, on attribue à chacune un 30 numéro uniformément croissant de 1 à n (n étant le nombre maximum de lignes) ; - On dilate l'image binaire de puces avec un élément structurant vertical, comme illustré plus particulièrement par la figure 31. On obtient une suite de rubans pleins formant des colonnes verticales: co', à co'9 (on a supposé ici, à titre purement indicatif, que le bloc traité comprenait neuf colonnes). On constate que les contours des ces rubans sont irréguliers et que leurs longueurs ne sont pas identiques, pour les mêmes raisons que précédemment indiqué pour les lignes l', à 1'7. - On labellise les lignes ainsi crées (ex colonnes co', à co'9). - On multiplie les labels horizontaux par un nombre déterminé N, préférentiellement par mille. De façon plus générale, ce nombre N doit être supérieur au nombre total de lignes, l', à 1'7, ou de colonnes, co', à co'9, pour éviter toute ambiguïté (N étant la valeur la plus grande). - On additionne l'image de labels horizontaux ainsi multipliés avec l'image de labels verticaux, les lignes, l', à et colonnes, co', à co'9, (figure 3J), étant représentées superposées. - On transforme l'image obtenue en image niveaux de gris. - On se sert ensuite des cordonnées de chaque puce (par exemple /p" à lp"79, si on se reporte à la figure 3G) comme masque pour calculer l'intensité aux endroits où ces puces existent réellement, à l'intersections des labels (intersections des lignes, l', à 1'7, et des colonnes, co', à co'9), comme illustré plus particulièrement par la figure 3K. Les trois derniers chiffres de cette intensité correspondent à la colonne de la puce. Les autres chiffres au numéro de la ligne. On effectue ensuite des opérations inverses, de translation et de rotation, pour obtenir les coordonnées de la puce (par exemple /p à /ps, o) dans un bloc (par exemple lb3) de l'image originale lB (figure 3A ou 3B). On stocke dans un fichier les informations numériques de lignes, de colonnes préalablement trouvées et de blocs, avantageusement sous forme de nom de couleur. A la suite de ces étapes, il est donc possible de déterminer sans ambiguïté la position d'une puce (par exemple figure 3A ou 3B: Ip à /p61o), dans un bloc lb3 de cette image originale IB. On peut donc procéder à une opération d'indexation et enregistrer les coordonnées des puces dans des moyens de mémoire, par exemple de l'ordinateur 2 (figure 2) , de manière à constituer une base de données. Cette base de données pourra être exploitée ultérieurement par tout logiciel du commerce ouspécifique approprié, avantageusement un tableur, par exemple "EXCEL" (marque enregistrée). A la suite de ces étapes, dans des variantes de réalisation du procédé non explicitement illustrées, on peut procéder à des étapes supplémentaires optionnelles. Selon une première variante de réalisation supplémentaire, on o "découpe" chaque puce, et on la recolle "redressée" dans une image finale, en vue de son enregistrement dans des moyens de mémoire, par exemple de l'ordinateur 2 (figure 2), de manière à constituer une image de contrôle de la méthode. Selon une deuxième variante de réalisation supplémentaire, on "découpe" chaque puce, et on la sauvegarde avec son identification comme nom, en vue de son enregistrement dans des moyens de mémoire, par exemple de l'ordinateur 2 (figure 2), de manière à constituer une banque d'images. Pour aider à la localisation des blocs, on dessine le contour de chaque bloc selon sa couleur. A la lecture de ce qui précède, on constate aisément que l'invention atteint bien les buts qu'elle s'est fixés. Elle permet d'identifier les puces supportées par une lame de verre, notamment obtenue par la technique "TMA" précitée, d'en déterminer 1 eurs positions sans ambiguïté et, de ce fait, pouvoir procéder à leur indexation. Il doit être clair cependant que l'invention n'est pas limitée aux seuls exemples de réalisations explicitement décrits, notamment en relation avec les figures 2 à 3K. Enfin, les exemples numériques n'ont été fournis que pour mieux fixer les idées et ne sauraient constituer une quelconque limitation de la portée de l'invention. Ils procèdent d'un choix technologique à la portée de l'Homme de Métier et/ou dépendent de l'application particulière visée. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de la position de puces d'échantillons tissulaires sur une lame en matériau transparent, notamment en verre, ladite lame comportant au moins un ensemble de ces dites puces et cellesci étant disposées, de façon régulière, sensiblement selon des lignes et des colonnes orthogonales dans chacun des dits ensembles, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: acquisition d'une image numérique de ladite lame (La) et son enregistrement dans des moyens de mémorisation; o construction d'une image binaire (/B) de ladite image numérique et de chacun desdits ensembles (Ib1-1b4) en lui appliquant un seuil déterminé, de manière à obtenir une image binaire desdites puces, ces images de puces étant disposées initialement selon des lignes et des colonnes orthogonales entre elles; - agrégation desdites puces dans chacun desdits ensembles, de manière à former des blocs (Ib',-Ib 4) ; redressement desdites images binaires de puces par rapport à des axes dits horizontal (H) et vertical (V) d'un dièdre de référence associé à ladite image binaire; - dilatation desdites images de puces à l'aide d'un élément structurant horizontal de manière à obtenir des rubans pleins alignés sur des lignes parallèles (f1-f7) au dit axe horizontal (H) et labellisation de ces rubans, ladite labellisation comprenant l'attribution d'un numéro à chacune desdites lignes; - dilatation desdites images de puces à l'aide d'un élément structurant vertical de manière à obtenir des rubans pleins alignés sur des colonnes (Co'1-Co'9) parallèles au dit axe vertical (V) et labellisation de ces rubans, ladite labellisation comprenant l'attribution d'un numéro à chacune desdites colonnes; multiplication desdits numéros de labels horizontaux par un nombre déterminé, ledit nombre déterminé étant supérieur au nombre desdites lignes (f,-f,) ou des dites colonnes (Co'1Co'9), et addition desdits labels horizontaux multipliés avec lesdits labels verticaux, de manière à former une image dite de label; transformation de ladite image de label en image niveaux de gris; application des coordonnées desdites images de puces comme masque pour déterminer une valeur d'intensité aux intersections desdits labels horizontaux et verticaux où lesdites puces sont o présentes; et détermination à partir desdites intensités des coordonnées de bloc, de lignes (f1-f7) et de colonnes (Co'1-Co'9) desdites puces. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite acquisition d'image numérique est obtenue pas scannérisation (1) à basse résolution de ladite lame (La) et ce que ladite résolution est au moins de l'ordre de 2000 à 4000 points par pouce. 3. Procédé selon les revendications 1, caractérisé en ce que ladite étape de redressement desdites images binaires de puces par rapport aux dits axes horizontal (H) et vertical (V) comprend les phases suivantes: le redressement desdites images de puces (lp' ) par rapport au dit axe horizontal (H), ledit redressement étant obtenu: - en acquérant les coordonnées desdits blocs et l'angle d'inclinaison (c 3) desdits blocs par rapport au dit axe horizontal (H) ; - en tournant lesdites puces dudit angle d'inclinaison (u3) par rapport au dit centre dudit bloc auquel elles appartiennent; et le redressement desdites images de puces par rapport au dit axe vertical (V), ledit redressement étant obtenu: - en agrégeant lesdites images de puces redressées selon ledit axe horizontal (H) ; en déterminant le polygone convexe (cac'2) de chacun desdits blocs (lb2) ; 2860319 17 en déterminant l'inclinaison du bord gauche dudit polygone convexe (cac'2) par rapport au dit axe vertical (V) ; en déterminant l'inclinaison du bord droit dudit polygone convexe (cac'2) par rapport au dit axe vertical (V) ; et en appliquant une translation aux dites puces calculée à partir de ladite détermination d'orientation verticale, cette orientation verticale étant obtenue en retenant le minimum desdites inclinaisons des dits bords gauche et droits. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite o détermination de pente est réalisée en appliquant un filtre binaire par la méthode dite de "HitOrMiss", et en ce que le dit filtre binaire comprend un noyau égal à "OXX0110XX" pour déterminer ladite inclinaison de bord gauche et un noyau égal à "XX0110XXO" pour déterminer ladite inclinaison de bord droit, les valeurs "0" et "1" représentant des "0" et "1" binaires, respectivement, et "X" une valeur indéterminée. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite labellisation comprend l'association d'un attribut numérique distinct à chacune desdites lignes horizontales (lb',-lb 4) et desdites colonnes verticales (Co'1-Co'9). 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit nombre déterminé de multiplication desdites numéros de labels horizontaux est égal à mille. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes supplémentaires consistant à découper chacune desdites puces et à les replacer redressées dans une image dite finale. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes supplémentaires consistant à découper lesdites puces, à les enregistrer dans lesdits moyens de mémorisation et en 2860319 18 les associant à une identification déterminée, avec des informations de coordonnées desdites lignes, colonnes et blocs.