Brevet FR2862306A1 — publié le 20050520

H2C O C -R3 O HC O Il R2 O Il CH3 o H2C O P-CH2-CH2 \ CH3 Ri CH3 (I) La présente invention est relative au domaine des vaccins et plus particulièrement à des vaccins adjuvés. En particulier, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un antigène vaccinal et au moins un dérivé ester phosphorique de phosphatidylcholine. Selon l'art antérieur, il est connu de vouloir augmenter ou orienter la réponse immunitaire induite par les antigènes présents dans un vaccin, au moyen d'adjuvants. Ceci peut être souhaitable car l'antigène, administré seul, n'est pas suffisamment immunogène, à cause notamment de son très haut degré de pureté, ou parce qu'on souhaite réduire la quantité d'antigènes présents dans le vaccin ou le nombre de rappels à effectuer, ou encore parce qu'on souhaite allonger la durée de protection conférée par le vaccin. Parfois, il s'agit de modifier qualitativement plutôt que quantitativement la réponse induite. Bien que l'art antérieur abonde en propositions de produits pouvant être utilisés comme adjuvants, on remarque que la plupart des vaccins adjuvés faisant l'objet d'une autorisation de mise sur le marché en médecine humaine, sont adjuvés au moyen d'un sel d'aluminium, ou d'une émulsion. Or, il existe une demande réelle de disposer de nouveaux adjuvants dont les qualités permettront de modifier la réponse immune tout en conservant les qualités d'une 20 administration en toute sécurité. Par ailleurs, dans un autre domaine qui est celui de la transfection, il a été proposé dans l'état de la technique, d'utiliser des lipides cationiques. Ainsi, par exemple, dans la publication intitulée Modulation of Cellular Immune Response Against Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3 by Cationic Liposome Encapsulated DNA Immunization , plusieurs lipides cationiques constituant des liposomes sont testés pour leur capacité à véhiculer l'ADN plasmidique d'intérêt vers les cellules. Cette publication est d'un intérêt dans le domaine des vaccins car l'ADN transfecté code pour des antigènes contre lesquels on souhaite une réponse du système immunitaire. Pour que la réaction du système immunitaire soit bonne, il faut tout d'abord que l'antigène soit exprimé, et donc que l'ADN soit délivré dans les meilleures conditions aux cellules capables de l'exprimer. Le rôle joué par les agents de transfection qui servent de véhicule à l'ADN est différent du rôle joué par un adjuvant qui accompagne un antigène vaccinal présent dans une composition pharmaceutique. Les résultats obtenus par les auteurs de cette publication montrent que la réponse obtenue est plus importante lorsque l'ADN est transporté au moyen de liposomes plutôt que lorsque l'ADN est injecté nu ; cependant, suivant la nature des lipides utilisés pour former les liposomes, les réponses obtenues varient en nature et en intensité. Malgré donc la littérature abondante sur les divers produits pouvant être utilisés comme adjuvants, il existe toujours un besoin de disposer d'un produit pouvant être utilisé sans risque pour l'organisme auquel il est administré, et qui permette d'accroitre et/ou de modifier la réponse du système immunitaire vis-à-vis de l'antigène vaccinal avec lequel il est administré. C'est un des buts de l'invention que de proposer un tel produit. Un autre but de l'invention est de proposer un adjuvant vaccinal facilement disponible, dont le coût est tel qu'il puisse être ajouté aux compositions vaccinales sans en augmenter le prix de revient de façon prohibitive. Pour atteindre ces buts, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un antigène vaccinal, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un dérivé ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure: H2Ç O Il R3 O HC O C R2 Il O O Il H3 H2C O P CH2 CH2 N CH3 ORi CH3 (I) dans laquelle: - RI est un alkyle inférieur, - R2 et R3 sont identiques ou différents, et peuvent chacun représenter des chaînes linéaires hydrocarbonées ayant de 7 à 21 atomes de Carbone. Selon un mode de réalisation particulier, R1 représente le radical éthyl; ainsi, la dégradation de ce dérivé dans l'organisme auquel il aura été administré produira des produits biocompatibles: les phosphatidylcholines et l'éthanol. 2862306 3 Selon un mode particulier de l'invention, R2 et R3 sont choisis parmi les radicaux provenant des acides gras suivants: acide laurique, acide myristique, acide palmitique, acide stéarique, acide oléique. Selon un mode particulièrement avantageux, R2 et R3 sont tous 2 identiques et représentent le radical de l'acide oléique. Un tel produit pouvant être totalement préparé par synthèse chimique présente toutes les garanties de sécurité et de reproductibilité souhaitées pour un usage pharmaceutique. L'invention a également pour objet un dérivé ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure: H2C 0 I R3 II O HC O C R2 1I 0 0 1 e CH3 H2C O P CH2 CH2 N CH3 ORI CH3 (I) dans laquelle: RI est un alkyle inférieur, R2 et R3 sont identiques ou différents, et peuvent chacun représenter des chaînes linéaires hydrocarbonées ayant de 7 à 21 atomes de Carbone, pour son utilisation comme adjuvant vaccinal. L'invention a également pour objet une méthode d'immunisation d'un mammifère selon 20 laquelle on lui administre au moins un antigène vaccinal et on lui administre également un dérivé ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure: H2C O C R3 O HC O C R2 Il 0 C 01 H3 H2C O P CH2 CH2 \ CH3 ORI CH3 (I) dans laquelle: - RI est un alkyle inférieur, R2 et R3 sont identiques ou différents, et peuvent chacun représenter des chaînes 5 linéaires hydrocarbonées ayant de 7 à 21 atomes de Carbone. Ainsi, la réponse du système immunitaire est modifiée par rapport à la réponse qui serait obtenue si l'antigène vaccinal était administré sans dérivé de phosphatidylcholine. De nombreux autres avantages de la présente invention apparaitront à la lecture de la description détaillée qui va suivre. La présente invention est relative à une composition pharmaceutique comprenant au moins un antigène vaccinal. Par antigène vaccinal, on entend un antigène susceptible d'induire une réponse du système immunitaire lorsqu'il est administré à l'homme ou à un animal. Cette réponse du système immunitaire peut se traduire par une production d'anticorps ou par une activation de certaines cellules, notamment les cellules présentatrices d'antigènes ( ex: les cellules dendritiques), les lymphocytes T, les lymphocytes B. La composition pharmaceutique peut être une composition à visée prophylactique ou à visée thérapeutique, ou encore les deux. Elle peut être administrée par toutes les voies habituellement utilisées ou préconisées pour les vaccins: voie parentérale, voie muqueuse, et se présenter sous diverses formes: liquide injectable ou pulvérisable, formulation lyophilisée ou séchée par atomisation ou à l'air,... etc. Elle peut être administrée au moyen d'une seringue ou au moyen d'un injecteur sans aiguille pour injection intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. Elle peut aussi être administrée grâce à un nébuliseur capable de délivrer une poudre sèche ou un spray liquide au niveau des muqueuses, qu'elles soient nasales, pulmonaires, vaginales ou rectales. Les antigènes vaccinaux utilisés dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention sont des antigènes directs , c'est-à-dire qu'il ne s'agit pas d'ADN codant pour ces antigènes, mais les antigènes eux-mêmes; il peut s'agir d'un germe entier ou seulement d'une partie de ce germe; ainsi parmi les antigènes utilisés habituellement dans les vaccins, on peut notamment citer: les polysaccharides, qu'ils soient seuls ou conjugués à des éléments porteurs, tels que les protéines porteuses, les germes entiers vivants atténués, - les germes inactivés, les peptides et protéines recombinants, - les glycoprotéines, les glycolipides, les lipopeptides, les peptides synthétiques, les germes éclatés dans le cas de vaccins appelés vaccins splittés . Ces antigènes sont des antigènes utilisés ou susceptibles d'être utilisés pour le traitement ou la prévention de diverses maladies telles que par exemple: diphtérie, tétanos, polio, rage, coqueluche, hépatites A, B, C, fièvre jaune, fièvre typhoïde, varicelle, rougeole, oreillons, rubéole, encéphalite japonaise, méningites, infections à pneumocoques, infections à rotavirus, SIDA, cancers, tuberculose, maladie de Lyme, infections à RSV, herpès, affections bactériennes provoquées par Chlamydia, Neisseria gonorrheae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, ou Haemophilus influenza type B, la malaria, les leshmanioses, les listerioses, ...etc. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être une composition destinée à l'immunisation contre un seul pathogène ou cancer, c'est-àdire qu'elle comprend un ou plusieurs antigènes d'un seul pathogène ou cancer, ou bien être une composition destinée à l'immunisation contre plusieurs pathogènes ou cancers (on parle alors de ou de combinaison vaccinale). L'action du dérivé ester phosphorique de la phosphatidylcholine utilisé est d'adjuver la composition vaccinale, c'est-à-dire d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire de l'organisme auquel la composition vaccinale est administrée, par rapport à la réponse qui serait obtenue en absence d'un tel composé. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale, ou de la réponse cellulaire, ou des deux. L'action peut également être, non pas une augmentation de la réponse, mais une orientation différente de la réponse induite: par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres, production de certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation de certaines cellules plutôt que d'autres, etc.. . L'action de l'adjuvant peut également consister à augmenter la durée de la réponse immune dans le temps. Il peut aussi s'agir de permettre de diminuer le nombre d'administrations nécessaires pour obtenir une protection de l'individu immunisé, ou encore diminuer la quantité d'antigène contenue dans la dose administrée. L'action adjuvante du dérivé selon l'invention peut être obtenue, soit lorsqu'il est associé à l'antigène ou aux antigènes de la composition pharmaceutique lors de leur administration, i.e. lorsqu'il est présent directement dans la composition pharmaceutique, ou encore lorsqu'il est administré séparément de l'antigène ou des antigènes dont on veut modifier le pouvoir immunogène. On préfère cependant l'utiliser dans la même composition pharmaceutique que l'antigène ou les antigènes à administrer. Aux fins de la présente invention, on entend par phosphatidylcholine des phospholipides constitués d'une molécule de glycérol, de 2 acides gras, d'un groupe phosphate et de la choline. Ces composés encore appelés lécithines, varient en fonction de leurs acides gras. Pour les besoins de l'invention, les 2 acides gras peuvent être identiques ou différents, saturés ou insaturés; on utilise de préférence des phosphatidylcholines provenant de l'estérification d'acides gras ayant au moins 10 atomes de Carbone, et notamment des acides suivants: laurique, myristique, palmitique, stéarique, ou oléique. Selon l'invention, le dérivé de phosphatidylcholine est un ester phosphorique d'une phosphatidylcholine; il peut s'agir d'un ester provenant de la réaction de la phosphatidylcholine et de méthanol, d'éthanol, d'un propanol, d'un butanol ou d'un pentanol; on a obtenu de particulièrement bons résultats avec un ester provenant de l'éthanol. Les résultats obtenus sont surprenants dans la mesure où, dans le même test, les résultats obtenus avec une phosphatidylcholine ne possédant pas d'autre liaison phosphoester que la liaison à la choline s'est avérée, dans les mêmes conditions, non adjuvante. Les composés convenant aux fins de l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique complète, ou encore par estérification de phosphatidylcholines naturelles, telles que la phosphatidylcholine extraite du soja ou des oeufs. Ce sont des composés que l'on peut utiliser sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, et notamment de chlorure. Parmi les composés convenant particulièrement bien, on peut citer la 1,2dilauroyl-sn-glycero-3-éthylphosphocholine, la 1,2-dimyristoyl-sn-glycero3-éthylphosphocholine, la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3éthylphosphocholine, la 1,2- distearoyl-sn-glycero-3-éthylphosphocholine, la 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- éthylphosphocholine ou encore la 1,2-palmitoyl-oleoyl-sn-glycero-3- éthylphosphocholine, disponibles notamment auprès de la Société Avanti Polar Lipids Inc. Ces composés sont disponibles sous forme de poudre ou en solution dans du chloroforme. Selon l'invention, les composés sont dispersés dans l'eau ou dans un tampon aqueux pour former une suspension qui est alors mélangée avec une solution comprenant les antigènes vaccinaux, ou bien la suspension contenant le dérivé ester phosphorique de phosphatidylcholine est utilisée pour reprendre un lyophilisat comprenant les antigènes vaccinaux. De façon alternative, il est possible de disperser ou d'hydrater le dérivé ester de phosphatidylcholine avec de l'eau ou un tampon comprenant déjà au moins un antigène vaccinal. Les dérivés esters phosphoriques de phosphatidylcholine utilisés forment alors des vésicules lipidiques, ou liposomes, dont la taille est avantageusement comprise entre 50 15 et 220nm. Les exemples qui suivent illustrent, de façon non limitative, des exemples de réalisation de la présente invention. Exemple 1: Préparation des compositions vaccinales. On prépare des compositions vaccinales comprenant à titre d'antigène vaccinal, une protéine recombinante susceptible d'être utilisée dans un vaccin contre le SIDA; il s'agit de la protéine TAT III B détoxifiée qui est obtenue par expression chez E. coli et purification par différentes étapes de chromatographie, puis inactivation chimique, ainsi que cela est décrit dans la demande WO99/33346, où elle est identifiée sous le terme de Tat carboxyméthylée. Les compositions sont préparées de la manière décrite ci-après. Les lipides (DPPC et Ethyl PC), en poudre, sont solubilisés chacun dans un mélange de chloroforme/méthanol 4/1 à la concentration de 2 mg/mL. 2,74 mL de solution DPPC soit 5,48 mg sont introduits dans un ballon en verre; le solvant est éliminé à l'aide d'un évaporateur rotatif jusqu'à obtention d'un film lipidique régulier sur les parois du ballon. Ce film est séché ensuite sous vide poussé pour éliminer toute trace de solvant résiduel. Le film est ensuite réhydraté par 4 ml d'eau distillée à 40 C en utilisant un bain à sonication. La dispersion des vésicules ainsi obtenue est ensuite extrudée à travers plusieurs membranes de polycarbonate (0,8 m; 0,4 m et 0,2 m) montées sur un Extruder (Lipex Biomembranes, Inc.) thermostaté à 50 C sous pression d'azote. Le même protocole de préparation est appliqué à 3,18 mL de la solution organique d'Ethyl PC soit 6.36 mg. Les suspensions liposomales alors obtenues sont aux concentrations de 1, 37 mg/mL pour la DPPC et 1,59 mg/mL pour l'Ethyl PC. Ces préparations sont alors mélangées volume à volume à la solution de Tat concentrée à 200 g/mL en tampon TRIS 100 mmol/L, NaCl 200 mmol/L à pH 7,4 pour obtenir les préparations dont la composition est indiquée ci-après et dans lesquelles les quantités d'antigènes et d'adjuvant sont indiquées par dose de 200 l. 1) 20 g de TAT 2) 201.tg de TAT et 1371 .tg de DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine) fourni par Avanti Polar Lipids Inc. 3) 20 g de TAT et 159 g d'éthylPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3ethylphosphocholine) fourni par Avanti Polar Lipids Inc. Exemple 2: Immunisation. On dispose de 3 groupes de 6 souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines, à qui l'on injecte une des compositions préparées à l'exemple 1, par voie sous-cutanée, à raison d'une dose de 2001_1l par souris; les injections sont réalisées à JO et à J21. On prélève des échantillons sanguins au sinus retro-orbital à J14 pour l'appréciation de la réponse primaire et à J35 pour la réponse secondaire. La détermination du taux d'IgGl et d'IgG2a spécifiques est effectuée grâce à des tests ELISA standardisés. Les souris sont sacrifiées à J37; on prélève leur rate et on isole les splénocytes. Les résultats obtenus en ce qui concerne les réponses humorales sont récapitulés dans le tableau ci-dessous, où les taux d'IgG sont exprimés en unités arbitraires ELISA (logl0). Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquée est le titre géométrique moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris. Groupes de Taux IgGI Taux IgG2a Taux IgGl Taux IgG2a souris à J14 à J14 à J35 à J35 Tat seule 1,943 1,045 3,950 2,437 Tat + DPPC 2,123 1,509 4, 187 2,771 Tat + EthylPC 2,931 2,429 4,889 4,368 Les résultats obtenus montrent que les compositions selon l'invention permettent d'obtenir une réponse humorale nettement supérieure à celle obtenu dans le cas où l'antigène est administré seul, et également nettement supérieure à celle obtenue en utilisant une phosphatidylcholine ne possédant pas de liaison phosphoester autre que celle existant avec la choline. On observe que l'effet adjuvant est nettement marqué vis-à-vis de la réponse en IgG2a, ce qui est une indication d'une réponse immune plutôt orientée vers une réponse de type 15 TH1. Pour apprécier l'effet des compositions pharmaceutiques selon l'invention sur la réponse cellulaire, on effectue des comptages des cellules spléniques capables de produire de l'interféron y par un test ELISPOT. Ce test est réalisé à la fois sur des cellules fraîches et sur des cellules restimulées. Pour la réalisation du test, on cultive les cellules spléniques dans des plaques de culture cellulaire, à raison de 200 000 cellules par puits, en présence soit du milieu seul, soit de l'antigène TAT recombinante. Après 16 heures de culture, on révèle l'ELISPOT, i.e. que l'on compte le nombre de spots correspondant aux cellules sécrétant de l'interféron y. Les résultats obtenus sont résumés dans les tableaux ci-après; les valeurs indiquées sont les valeurs moyennes (par groupe de souris), des différences calculées pour chaque souris entre le nombre de spots comptés par million de cellules dans les puits ayant de la TAT recombinante et le nombre de spots comptés par million de cellules dans les puits n'ayant que du milieu. Le tableau ci-après résume les résultats obtenus sur cellules fraîches. Composition pharmaceutique testée Nombre de spots par millions de cellules. TAT à 20 gg 31,67 TAT à 20 gg + DPPC 32,5 TAT à 20 gg + EthylPC 129,17 Le tableau ci-après résume les résultats obtenus sur cellules restimulées par de la TAT recombinante en présence d'IL2. Composition pharmaceutique testée Nombre de spots par millions de cellules. TAT à 20 gg 44,16 TAT à 20 gg + DPPC 133,33 TAT à 20 gg + EthylPC 411,66 Ces résultats montrent l'effet positif obtenu en utilisant une composition pharmaceutique selon la présente invention, sur la stimulation des cellules CD4+. Revendications 1. Composition pharmaceutique comprenant au moins un antigène vaccinal, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un dérivé ester phosphorique de 5 phosphatidylcholine ayant la structure: H2C 0 II R3 O HC O C R2 11O 3 H II o/ H H2C O P CH2 CH2 N CH3 ORS CH3 (I) dans laquelle: R1 est un alkyle inférieur, R2 et R3 sont identiques ou différents, et peuvent chacun représenter des chaînes linéaires hydrocarbonées ayant de 7 à 21 atomes de Carbone. 2. Composition selon la revendication précédentes, caractérisée en ce que R1 représente le radical éthyl. 3. Composition selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que R2 et R3 20 sont choisis parmi les radicaux provenant des acides gras suivants: acide laurique, acide myristique, acide palmitique, acide stéarique, acide oléique. 4. Composition selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que R2 et R3 sont tous 2 identiques et représentent le radical de l'acide oléique. 5. Dérivé de phosphatidylcholine ayant la structure: H2C 0 C R3 O HC O C R2 11O O Il oH3 H2C 0 P CH2 CH2; CH3 Ri CH3 (I) dans laquelle: RI est un alkyle inférieur, R2 et R3 sont identiques ou différents, et peuvent chacun représenter des chaînes linéaires hydrocarbonées ayant de 7 à 21 atomes de Carbone, pour son utilisation comme adjuvant vaccinal. 6. Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que RI représente le radical éthyl. 7. Dérivé selon une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que R2 et R3 sont choisis parmi les radicaux provenant des acides gras suivants: acide laurique, acide myristique, acide palmitique, acide stéarique, acide oléique. 8. Dérivé selon une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que R2 et R3 sont tous 2 identiques et représentent le radical de l'acide oléique.