Brevet FR2872513A1 — publié le 20060106

Procédé d'extraction d'ADN incluant une étape de digestion enzymatique. L'invention concerne les procédés d'extraction d'ADN à partir d'une matière végétale (et plus particulièrement d'algues), l'ADN obtenu étant destiné à être amplifié par PCR ou extrait en vue d'être exploité en quantités massives. L'invention est susceptible d'être appliquée dans différents secteurs industriels, et notamment l'industrie cosmétique ou l'industrie des biotechnologies (via l'amélioration du procédé de Polymerase Chain Reaction (PCR) appliqué à l'ADN extrait de végétaux et plus particulièrement d'algues). Dans le domaine des techniques d'extraction d'ADN, à des fins d'analyse ou de régénération d'une espèce végétale, il est préférable de travailler sur des protoplastes. La production de ces protoplastes fait appel à l'hydrolyse enzymatique de la paroi des cellules, permettant ensuite un prélèvement ou un marquage plus aisé de l'ADN contenu dans le noyau du protoplaste. Par ailleurs, dans les contextes d'analyse et/ou de régénération d'espèces végétales, on cherche, au cours de la production des protoplastes, à maintenir la viabilité des cellules, notamment dans le but de produire à terme des plantes entières. Les conditions opératoires d'hydrolyse enzymatique de la paroi conduisant à la production des protoplastes, notamment d'algues, sont classiquement les suivantes (ex: Araki et al, 1998. Journal of Marine Biotechnology, 6: 193-197) : un pré-traitement enzymatique dans un milieu contenant généralement une protéase (ex: Papaine), un osmoticum (ex: Mannitol) et un tampon MES dont le pH est ajusté à 7,5; une macération enzymatique (ou d'hydrolyse enzymatique de la paroi) composé d'un mélange d'enzymes (macerozyme, cellulases...), d'un osmoticum et d'un tampon MES dont le pH est ajusté à 6,5; les conditions optimales d'incubation sont obtenues pour une durée de 2h30 et une température de 22 C. Or, de telles conditions opératoires sont clairement destinées à des applications expérimentales et au maintien de la viabilité des cellules débarrassées de leur paroi. Une autre technique d'extraction met en oeuvre une opération de broyage de la matière végétale et plus particulièrement algale pour extraire l'ADN. Cette technique d'extraction est limitée par la présence de polyssacharides pariétaux qui diminuent la solubilité de l'ADN extrait et/ou empêchent une fixation correcte de la TAQ polymérase en vue de l'amplification d'ADN via la technique de PCR. L'invention a donc notamment pour objectif de pallier les inconvénients de l'art antérieur. Plus précisément, l'invention a pour objectif de proposer un procédé d'extraction d'ADN qui permette de fournir des quantités adaptées à l'échelle industrielle. L'invention a également pour objectif de fournir un tel procédé qui soit simple de conception et aisé de mise en oeuvre. Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints grâce à l'invention qui a pour objet un procédé d'extraction d'ADN d'une matière végétale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: macération enzymatique de ladite matière végétale, à un pH compris entre environ 5 et environ 7 et à une température comprise entre environ 35 C et 40 C; centrifugation d'un extrait de ladite matière végétale macérée conduisant à l'obtention d'un culot contenant de l'ADN de ladite matière végétale; extraction dudit ADN de ladite matière végétale contenue dans ledit culot; une étape de purification dudit ADN; une étape d'amplification dudit ADN. De cette façon, la combinaison de la technique de macération enzymatique et de conditions opératoires particulières permet d'envisager l'extraction d'ADN avec un rendement notablement supérieur aux rendements des procédés de l'art antérieur. En effet, la dégradation de la paroi des cellules et l'éclatement de celles-ci provoqué par les conditions opératoires permet d'extraire des quantités d'ADN plus importantes qu'avec les procédés connus. Bien entendu, un tel procédé s'inscrit dans une approche fondamentalement différente de l'art antérieur, puisqu'il conduit à la destruction des cellules tandis que la production de protoplasmes a pour but de maintenir la viabilité des cellules. En outre, l'étape de macération enzymatique évite la contamination de l'ADN par les polysaccharides qui sont de nature à limiter la fixation de la polymérase. L'étape d'amplification peut donc être réalisée avec un excellent rendement. Avantageusement, ladite étape d'extraction est réalisée par mise en solution dudit culot dans un tampon salin dont le phH est d'environ 8, et par traitement au phenol/ chloroforme/isoamyl (25:24:1 v/v/v) Préférentiellement, ladite étape de purification est réalisée par précipitation à l'isopropanol. Selon une application avantageuse, le procédé est destiné à l'extraction d'ADN algal. On note qu'un procédé selon l'invention peut également être appliqué à d'autres matières végétales, par exemple des végétaux terrestres qui contiennent également des polysaccharides limitant la PCR (Polymerase Chain Reaction). Selon une première application particulière, le procédé est destiné à l'extraction d'ADN d'algues rouges de l'espèce Palmaria, ladite étape de macération enzymatique étant réalisée à l'aide d'une solution comprenant un mélange de xylanases et de cellulases. Selon une deuxième application particulière, le procédé est destiné à l'extraction d'ADN d'algues rouges de l'espèce Gracilaria, ladite étape de macération enzymatique étant réalisée à l'aide d'une solution comprenant un mélange de glucanases et de cellulases. Bien entendu, en sélectionnant des enzymes appropriées, l'invention est également applicable à toutes les autres algues (macro et microalgues) appartenant aux groupes des algues rouges (ex: Porphyridium sp), vertes (ex: Ulva sp, Enteromorpha sp) ou brunes (ex: Fucus sp, Ascophyllum sp, .. .). Selon une solution avantageuse, lesdites cellulases sont des celluclast. Dans le cas de la première application citée précédemment, lesdites xylanases sont préférentiellement des Shearzym. Dans le cas de la deuxième application citée précédemment, lesdites glucanases sont préférentiellement des Finizym. Selon un mode de réalisation préféré, ladite étape de macération enzymatique est réalisée pendant une durée comprise entre environ 6 heures et environ 12 heures. Une telle durée permet d'atteindre un éclatement suffisant des cellules et une dégradation complète, ou quasi complète, des polysaccharides. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de la description suivante de deux variantes de réalisation de l'invention, données à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, en référence à la figure unique. Tel que déjà mentionné, le principe de l'invention consiste à combiner des étapes et des conditions opératoires de nature à augmenter le rendement de l'extraction et celui de l'amplification d'ADN. En d'autres termes, le procédé permet: - l'amélioration du rendement d'extraction de l'ADN par hydrolyse enzymatique de la paroi cellulaire des algues; l'amélioration de la réaction de polymérisation de l'ADN algal (via PCR) par dégradation enzymatique des polysaccharides contaminant cet ADN. L'utilisation du procédé de macération enzymatique comme traitement préalable de l'ADN algal (extraction de l'ADN, élimination des polysaccharides limitant la fixation par exemple de la TAQ Polymérase), les conditions de pH (compris entre 5 et 7) et de température (entre 35 C et 40 C) sont notamment déterminantes pour l'obtention de ce résultat. Les applications attendues sont par exemple l'emploi de ce procédé pour l'obtention d'ADN algal à des fins cosmétiques (ex: principe actif hydratant...) ou autres. Dans le cadre du procédé selon l'invention, la description qui va être faite par la suite porte sur l'utilisation d'enzymes (xylanases, cellulases, ou glucanases) dégradant la paroi d'algues rouges (Rhodophycées) appartenant aux genres Palmaria et Gracilaria pour améliorer l'extraction de l'ADN et son amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction). Le protocole technique est le suivant. Les algues appartenant aux genres Palmaria ou Gracilaria, comme par exemple les algues Palmaria palmata (Dulse) ou Gracilaria verrucosa (Ogonori), sont mises à macérer en présence d'une solution enzymatique dont la composition pour chaque algue est la suivante: - un mélange de glucanases (ex: Finizym novo) et de cellulases (ex: Celluclast novo) pour l'espèce Gracilaria verrucosa; un mélange de xylanases (ex: Shearzyme novo) et de cellulases (Celluclast novo) pour l'espèce Palmaria palmata. Les conditions opératoires de la macération (minimales et optimales) applicables aux deux algues sont décrites ci-après, la macération étant réalisée pendant une durée pouvant aller de 6 heures à 12 heures. La quantité d'enzymes utilisée est fonction de la quantité en poids de l'algue à traiter. Elle est exprimée en unités/g d'algue (U/g). A titre de référence, une unité U correspond à la quantité d'enzymes capable de libérer un mole d'oses en une minute à une température de 40 C. Les conditions optimales d'hydrolyse pour chaque algue sont décrites dans les tableaux ci-dessous: Palmaria nalmata Matière Algue/Tampon Enzyme/substrat Tampon Température Combinaison première d'extraction d'enzymes Algue 3,3 % 12 U/g Acétate de 40 C Xylanases + lyophilisée sodium 50 Cellulases ou Algue mMpH5 fraîche Gracilaria verrucosa Matière Algue/Tampon Enzyme/substrat Tampon Température Combinaison première d'extraction d'enzymes Algue 3,3 % 12 U/g Acétate de 40 C Glucanases + lyophilisée sodium 50 Cellulases ou Algue mM pH 5 fraîche Une incubation sans enzymes a été effectuée dans les mêmes conditions et a servi de témoin pour évaluer l'efficacité relative du procédé de macération enzymatique. L'ADN est dosé par mesure de l'absorbance à 260 nm. Son degré de pureté est évalué par le rapport: Abs 260/ Abs 280 nm. En référence à la figure 1, l'étape de macération (étape 1) est suivie d'une étape de centrifugation (étape 2), paramétrée pour atteindre 10 000g à 20 000g. A l'issue de l'étape de centrifugation, on obtient d'une part un surnageant contenant entre autres des oligosaccharides et, d'autre part, un culot contenant l'ADN de la matière végétale macérée auquel on fait subir une étape d'extraction (étape 3), puis une étape de purification (étape 4). L'étape d'extraction est réalisée par mise en solution dans un tampon salin pH 8 et par traitement avec un mélange phénol/chloroforme du culot obtenu à l'issue de l'étape de centrifugation, l'étape de purification étant réalisée par précipitation à I'isopropanol. Le tableau suivant fournit une comparaison, en terme d'extraction de l'ADN de l'algue Palmaria palmata, entre le procédé classique (broyage de l'algue en milieu tamponné) et le procédé selon l'invention (sans broyage et incubation en présence de xylanases, en l'occurence des Shearzyme, et de cellulases, en l'occurrence des Celluclast). Palmaria nalmata Algue sans enzymes Algues + Enzymes (Xylanases et Cellulases) Quantité d'ADN extrait 45,4 64,4 bug /50 mg de culot Abs 260/ Abs 280 nm 1,7 1,7 On note par conséquent que, sur l'algue Palmaria palmata, le procédé selon l'invention permet un gain de 41% de récupération de l'ADN, comparé au procédé classique. Le tableau suivant fournit une comparaison en terme d'extraction de l'ADN de l'algue Gracilaria verrucosa, entre le procédé classique (broyage de l'algue en milieu tamponné) et le procédé selon l'invention (sans broyage et incubation en présence de glucanases, en l'occurrence des Finizym, et de cellulases, en l'occurrence des Celluclast. Gracilaria verrucosa Algue sans enzymes Algues + Enzymes (Glucanases et Cellulases) Quantité d'ADN extrait 54,4 65 ug/ 50 mg de culot Abs 260/ Abs 280 nm 1,6 1,9 On note par conséquent que, sur l'algue Gracilaria verrucosa, le procédé selon l'invention permet un gain de 20% de récupération de l'ADN comparé au 5 procédé classique. L'ADN ainsi extrait subit ensuite une étape d'amplification (étape 5 sur la figure 1). Tel que déjà mentionné, l'étape de macération enzymatique permet une amplification de l'ADN de Palmaria palmata et de Gracilaria verrucosa grâce à l'hydrolyse enzymatique des polysaccharides (xylanes ou glucanes, ou agar ou cellulose) qui contaminent l'ADN et empêchent la fixation sur ce dernier de la polymérase (ex: TAQ polymérase) utilisée pour l'amplification. Ce résultat a également été observé pour des microalgues appartenant au groupe des Diatomées et apparaît transposable à toutes les macro et microalgues pour lesquelles l'amplification de l'ADN par PCR est limitée par la fixation des polysaccharides sur cet ADN. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'ADN d'une matière végétale, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: macération enzymatique de ladite matière végétale, à un pH compris entre environ 5 et environ 7 et à une température comprise entre environ 35 C et 40 C; centrifugation d'un extrait de ladite matière végétale macérée conduisant à l'obtention d'un culot contenant de l'ADN de ladite matière végétale; extraction dudit ADN de ladite matière végétale contenue dans ledit culot; une étape de purification; une étape d'amplification dudit ADN. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape d'extraction est réalisée par mise en solution dudit culot dans du tampon salin dont le pH est d'environ 8 et par traitement au chloroforme/phénol/isoamyl 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ladite étape de purification est réalisée par précipitation à l'isopropanol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'extraction d'ADN algal. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'extraction d'ADN d'algues rouges de l'espèce Palmaria, ladite étape de macération enzymatique étant réalisée à l'aide d'une solution comprenant un mélange de xylanases et de cellulases. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'extraction d'ADN d'algues rouges de l'espèce Gracilaria, ladite étape de macération enzymatique étant réalisée à l'aide d'une solution comprenant un mélange de glucanases et de cellulases. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que lesdites cellulases sont des celluclast. 10 8. Procédé selon l'une des revendications 5 et 7, caractérisé en ce que lesdites xylanases sont des Shearzym. 9. Procédé selon l'un des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que lesdites glucanases sont des Finizym. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite étape de macération enzymatique est réalisée pendant une durée comprise entre environ 6 heures et environ 12 heures.