Brevet FR2871341A1 — publié le 20051216

La présente invention concerne un procédé de production de jeunes plants et/ou de micro pieds mères de plantes ornementales herbacées, comprenant une phase de culture in vitro au cours de laquelle l'on soumet des explants issus de pieds- mères des espèces à multiplier, ou des dérivés de ces explants, à une micropropagation, réalisée dans des conditions et sur des milieux de culture appropriés, pour produire des micro plantules destinées à évoluer en plants ou en micro pieds mères lors d'une phase de culture in vivo. De manière connue, la micropropagation in vitro d'une plante consiste à obtenir un taux de multiplication végétative élevé en faisant débourrer un maximum de bourgeons axillaires d'une plantule maintenue sur un milieu de culture spécifique. Des méthodes de production de plantes, basées sur une phase de culture in vitro suivie d'une phase de culture in vivo sont connues de l'homme du métier depuis déjà de nombreuses années. L'on sait qu'elles présentent de nombreux avantages découlant principalement de la mise en oeuvre de la phase in vitro, et se répercutant non seulement en termes de quantités produites pour une même surface, mais également en termes de qualité phytosanitaire et d'aspect final de la plante. Cependant, leur déploiement dans l'horticulture est à l'heure actuelle encore grandement freiné, car elles nécessitent, pour chaque type de plante cultivée, des conditions de culture spécifiques, dont la mise au point est particulièrement longue, fastidieuse et par conséquent coûteuse. Il a en outre été constaté que certaines espèces de végétaux, telles que notamment le pélargonium, pour lesquels des tentatives de production par cette voie ont été entreprises, se prêtent mal aux méthodes connues de micropropagation. Le but de la présente invention est par conséquent de proposer un procédé de production de jeunes plants et/ou de micro pieds mères de végétaux parfaitement adapté à la culture de plantes ornementales herbacées, telles que notamment le pélargonium, le pétunia retombant, le poinsettia, le cyclamen, 2871341 2 le chrysanthème, l'impatience de Nouvelle Guinée, la verveine, ou le torenia. D'autre part, l'invention a également pour objectif de proposer un procédé intégrant une technique particulière de micropropagation in vitro, permettant d'obtenir des jeunes plants ou des pieds-mères plus vigoureux, présentant un taux de ramification exceptionnel, et une pousse plus rapide. Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé de multiplication végétative apte à garantir la qualité sanitaire et le maintien des critères génétiques des végétaux au fil des générations, et dans lequel la phase de culture in vitro est apte à la mécanisation, grâce à une miniaturisation et à une modélisation des produits. Enfin, le procédé objet de la présente invention se veut également à même d'améliorer la rentabilité de la production de plants de végétaux, en réduisant le délai et la surface nécessaires à leur multiplication, par la mise en oeuvre d'une micropropagation in vitro dans des conditions spécifiques. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de production de jeunes plants et/ou de micro pieds mères de plantes ornementales herbacées, comprenant une phase de culture in vitro au cours de laquelle l'on soumet des explants issus de pieds-mères des espèces à multiplier, ou des dérivés de ces explants, à une micropropagation, réalisée dans des conditions et sur des milieux de culture appropriés, pour produire des micro plantules destinées à évoluer en plants ou en micro pieds mères lors d'une phase de culture in vivo, caractérisé en ce que pour réaliser ladite micropropagation: - l'on place les explants en conditions axéniques, à l'obscurité, sur un milieu de prolifération de composition spécifique pour chaque espèce végétale à multiplier, pendant une durée appropriée, de sorte à induire la formation de filaments blancs comprenant des bourgeons axillaires, - l'on divise alors chacun des filaments blancs en 35 plusieurs tronçons comprenant chacun un bourgeon axillaire, 2871341 3 l'on place lesdits tronçons à la lumière en conditions axéniques dans un milieu racinaire, pendant une durée appropriée permettant à chaque bourgeon axillaire de produire une micro plantule présentant des racines. Selon une autre spécificité du présent procédé, lors de la phase de micropropagation, l'on utilise en tant que milieu de prolifération, un milieu de culture classique de type MS soit enrichi uniquement d'éléments appartenant à la famille des cytokinines, soit enrichi d'éléments appartenant à la famille des cytokinines et d'éléments appartenant à la famille des auxines, lesdits éléments étant spécifiquement choisis et dosés dans le milieu de prolifération en fonction de l'espèce végétale à multiplier. Une autre caractéristique du présent procédé est encore définie par le fait que l'on replace les tronçons issus d'une première génération de filaments blancs en conditions axéniques à l'obscurité sur un milieu de prolifération frais, pendant une durée appropriée, de sorte à induire la formation d'une nouvelle génération de filaments blancs, et l'on répète l'opération aussi souvent que nécessaire pour produire différentes générations successives de filaments blancs, jusqu'à l'obtention de la quantité de filaments blancs souhaitée. La présente invention permet ainsi avantageusement de proposer une technique pouvant être définie, pour une même espèce de plantes, notamment le pélargonium, par une séquence d'opérations standardisées, dans lesquelles la nature des milieux et les conditions de culture sont, le cas échéant, spécifiquement adaptées en fonction des variétés ou groupes de variétés au sein de ladite espèce, pour augmenter le taux de multiplication végétative. Selon une première variante de mise en oeuvre du présent procédé, l'on utilise, en tant qu'expiants, des méristèmes prélevés sur des pieds-mères, que l'on cultive en conditions axéniques, à la lumière, pendant un premier laps de temps, sur un milieu de développement commun à chaque variété végétale, de sorte à provoquer la formation de petites plantules présentant 2871341 4 de premières ébauches foliaires, puis, pendant un second laps de temps, sur un milieu d'enracinement, commun à chaque variété végétale, de sorte à obtenir des plantules enracinées, exemptes de bactéries et de virus, destinées à être placées sur le milieu de prolifération à l'obscurité pour produire lesdits filaments blancs. Dans ce cas de figure, selon une caractéristique du présent procédé, au cours de la phase d'enracinement desdites plantules, l'on augmente de manière appropriée le volume du milieu d'enracinement utilisé. Selon une autre caractéristique relative à cette première variante de mise en oeuvre, l'on supprime les feuilles et les racines desdites plantules avant de les placer en conditions axéniques à l'obscurité sur le milieu de prolifération spécifique à chaque variété, pendant une durée appropriée, pour produire lesdits filaments blancs. Selon une autre variante de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'on utilise en tant qu'expiants des microboutures prélevées sur des pieds-mères certifiés exempts de bactéries et de virus. Selon une caractéristique relative à cette dernière variante, l'on supprime les feuilles et les stipules de la partie apicale des microboutures, avant de les placer en conditions axéniques à l'obscurité sur le milieu de prolifération spécifique à chaque variété végétale, pendant une durée appropriée, pour produire lesdits filaments blancs. Selon une autre caractéristique avantageuse du présent procédé, l'on stocke, pendant un laps de temps donné, les filaments blancs présentant des bourgeons axillaires, préalablement à la phase d'enracinement au cours de laquelle chaque bourgeon produit un micro pied-mère enraciné destiné à la culture in vivo. D'autre part, la présente invention concerne également les micro plantules, jeunes plants et micro pieds mères issus de 35 la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus. 2871341 5 La présente invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre, et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons possibles. Cette description se rapporte à des exemples de mise en oeuvre du présent procédé, donnés à titre indicatif et non limitatif, relatifs à la production de plants de pélargonium, et plus spécifiquement à celle de plants appartenant à différentes variétés de pélargonium. Les différentes étapes du procédé de production de plants de végétaux conforme à l'invention sont détaillées en se référant aux diagrammes de production représentés sur les figures 1 et 2 jointes en annexe. Les caractéristiques des micro plantules, jeunes plants ou pieds mères issus de la mise en oeuvre dudit procédé sont également décrites en référence aux figures 3, 4, et 5 qui consistent en des photographies de différentes espèces végétales testées. En référence au diagramme représenté sur la figure 1, le procédé selon l'invention comprend une phase de culture in vitro , au cours de laquelle l'on soumet des tissus végétaux, en conditions axéniques, à différents traitements, notamment une micropropagation, réalisés dans des conditions particulières, pour les amener à se multiplier de façon exponentielle et à produire une quantité importante de plantules destinées à évoluer au cours d'une phase in vivo soit directement vers des plants, soit vers des micro pieds-mères destinés à servir eux- mêmes de matière première pour l'obtention de plants. En fait, en référence au diagramme représenté sur la figure 2, le présente procédé est prévu apte à être appliqué soit à des plantules issues de méristèmes prélevés sur des pieds mères quelconques, soit à des microboutures prélevées sur des pieds mères sains, à savoir certifiés exempts de bactéries ou de virus. Ainsi, la variante du procédé qui repose sur l'utilisation de méristèmes, et qui présente l'avantage de 2871341 6 conduire à un assainissement d'un pied mère éventuellement atteint par un agent pathogène quelconque, nécessite des étapes supplémentaires d'obtention de plantules. A cet effet, les méristèmes sont d'abord cultivés à la lumière, pendant une période d'environ 4 mois, dans des boîtes de Pétri, sur un milieu de développement, dont la composition est avantageusement commune à toutes les espèces végétales concernées par le présent procédé, par exemple un milieu de culture classique, de type MS (macro et micro éléments), additionné d'éléments appartenant à la famille des cytokinines. Les méristèmes développés avec les premières ébauches foliaires sont ensuite placés à la lumière, toujours en boîtes de Pétri, sur un milieu racinaire, de composition identique quelle que soit l'espèce végétale, à savoir de préférence un milieu de culture classique de type MS , pour obtenir des petites plantules, lesquelles sont transvasées, après environ un mois, dans des pots en verre, afin d'augmenter le volume du milieu racinaire. Suite à cette opération, l'on obtient des plantules enracinées prêtes à subir, au même titre que les microboutures prélevées sur des pieds-mères sains, la phase de micropropagation in vitro proprement dite. A cet effet les plantules ou microboutures sont d'abord rajeunies, par la suppression des racines et des feuilles, puis sont couchées sur un milieu de prolifération, spécifiquement élaboré en fonction de la variété végétale à multiplier, étalé dans des boîtes de Pétri. Selon le présent procédé, l'on utilise avantageusement un milieu de prolifération présentant sensiblement la même composition de base que le milieu de développement et le milieu racinaire précités, à savoir basé sur la présence classique de macro et de micro éléments, ladite composition de base étant enrichie, selon l'espèce végétale à multiplier, par l'addition d'éléments appartenant à la famille des cytokinines, ou par l'addition à la fois d'éléments appartenant à la famille des cytokinines et d'éléments appartenant à la famille des auxines. 2871341 7 Les boîtes de Pétri sont alors mises dans le noir absolu, pendant environ un mois, jusqu'à l'apparition d'une première génération de filaments blancs montrant des axillaires à l'emplacement des feuilles qui ne se sont pas développées sur l'axe. Ces filaments blancs sont alors divisés en tronçons, de manière à ce que chacun d'entre eux comprenne un bourgeon axillaire. A ce stade du procédé, deux alternatives sont 10 envisageables. La première consiste à placer les tronçons en conditions axéniques à la lumière pendant environ deux à trois semaines, dans des pots en verres remplis d'un milieu racinaire classique, par exemple de type MS . En présence de lumière, les tronçons issus des filaments blancs donnent alors chacun lieu à une micro plantule présentant des racines, apte à la culture in vivo , et pouvant être repiquée à cet effet de manière classique, par exemple dans un bouchon de 2 centimètres de diamètre, pour être placée en serre. Après un délai d'acclimatation en serre d'environ quinze jours à trois semaines, cette micro plantule est développée de manière à pouvoir fournir soit un jeune plant destiné à être mis en vente directement, soit un micro pied-mère. Ce dernier, cultivé pendant deux à quatre semaines dans 25 un pot classique de 11 centimètres de diamètre est apte à subir un prélèvement de boutures. Enfin, les micro plantules peuvent encore être réintroduites dans un nouveau cycle du procédé de culture selon l'invention, pour produire une nouvelle génération de filaments blancs. Selon la seconde alternative, l'on peut soumettre les tronçons issus de la première génération de filaments blancs à une nouvelle phase de micropropagation, en les replaçant dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant un volume frais dudit milieu de prolifération, de sorte à leur faire produire une seconde génération de filaments blancs. 2871341 8 Ainsi, la phase de micropropagation peut avantageusement être reconduite, par cycles d'environ un mois, aussi souvent que nécessaire, afin d'obtenir de grandes quantités de filaments blancs. Selon une caractéristique additionnelle du présent procédé, permettant de garantir la qualité sanitaire des végétaux produits, l'on soumet les filaments blancs à un test de type ELISA et l'on élimine les éventuels échantillons présentant un test positif, tandis que l'on conserve ceux présentant un test négatif. D'autre part, selon une autre caractéristique avantageuse, l'on peut stocker les tronçons de filaments blancs, à l'obscurité, à température ambiante sur un milieu de prolifération que l'on renouvelle périodiquement, aussi longtemps que nécessaire, avant la phase d'enracinement au cours de laquelle chaque bourgeon produit une micro plantule enracinée destinée à la culture in vivo. Plusieurs espèces végétales ont d'ores et déjà fait l'objet d'essais de multiplication par le biais du présent 20 procédé. Ainsi, il a pu être montré qu'en utilisant, en tant que milieu de prolifération, du milieu de type MS classique, enrichi en cytokinines, l'on arrivait à produire des micro plantules de pélargonium, par exemple de géranium zonale, de géranium lierre double ou de géranium lierre simple, ainsi que des micro plantules de chrysanthème. Par ailleurs, il a également pu être montré qu'en utilisant, en tant que milieu de prolifération, un milieu de type MS classique, enrichi à la fois en cytokinines et en auxines, l'on arrivait à produire des micro plantules de pétunia retombant, de kalanchoë, de torenia, de verveine, et de rosier. En outre, il a également été constaté que les jeunes plants ou micro pieds mères issus des micro plantules présentaient des caractéristiques particulièrement intéressantes, visibles notamment sur les figures 3, 4, et 5 jointes en annexe, correspondant respectivement à une micro 2871341 9 plantule de géranium zonale, un micro pied mère de géranium zonale en pot de 11 centimètres de diamètre, et un micro pied mère de pétunia retombant en pot de 11 centimètres de diamètre. Ainsi, les plantes produites au travers de ce procédé présentent naturellement une ramification très abondante, un enracinement rapide, une pousse en volume homogène, un durcissement rapide du pied, une surface de feuille plus petite que celle des plantes issus des procédés de culture classiques, et un caractère juvénile élevé. Le présent procédé offre également une solution avantageuse permettant d'améliorer la productivité par rapport aux techniques de cultures classiques, notamment en réduisant par quatre les surfaces allouées classiquement à la culture des pieds-mères. En outre, il a pu être montré que chaque filament blanc issu d'une plantule initiale pouvait fournir au moins cinq bourgeons axillaires par mois, pouvant eux-mêmes conduire à cinq micro plantules enracinées, aptes à fournir chacune à nouveau cinq filaments blancs par mois, ce qui conduit, au bout de 9 cycles de micropropagation d'un mois, à près de 2 millions de plants issus d'une seule plantule initiale. La mise en oeuvre du présent procédé offre par ailleurs encore de nombreux avantages se répercutant au niveau des différentes filières horticoles concernées, notamment au niveau d'une amélioration de la gestion des commandes, et au niveau de la qualité accrue des plantes. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut y apporter diverses modifications de forme, de matériaux et de combinaisons de ces divers éléments, sans pour cela s'éloigner du cadre et de l'esprit de l'invention. 2871341 10 REVENDICATIONS 1) Procédé de production de jeunes plants et/ou de micro pieds mères de plantes ornementales herbacées, comprenant une phase de culture in vitro au cours de laquelle l'on soumet des explants issus de pieds-mères des espèces à multiplier, ou des dérivés de ces explants, à une micropropagation, réalisée dans des conditions et sur des milieux de culture appropriés, pour produire des micro plantules destinées à évoluer en plants ou en micro pieds mères lors d'une phase de culture in vivo, caractérisé en ce que pour réaliser ladite micropropagation: - l'on place les explants en conditions axéniques, à l'obscurité, sur un milieu de prolifération de composition spécifique pour chaque espèce végétale à multiplier, pendant une durée appropriée, de sorte à induire la formation de filaments blancs comprenant des bourgeons axillaires, - l'on divise alors chacun des filaments blancs en plusieurs tronçons comprenant chacun un bourgeon axillaire, - l'on place lesdits tronçons à la lumière en conditions axéniques dans un milieu racinaire, pendant une durée appropriée permettant à chaque bourgeon axillaire de produire une micro plantule présentant des racines. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise, en tant que milieu de prolifération, un milieu de culture de type MS enrichi d'éléments appartenant à la famille des cytokinines, ou enrichi à la fois d'éléments appartenant à la famille des cytokinines et d'éléments appartenant à celle des auxines, lesdits éléments étant spécifiquement choisis et dosés dans le milieu de prolifération en fonction de l'espèce végétale à multiplier. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on replace les tronçons issus d'une première génération de filaments blancs en conditions axéniques à l'obscurité sur un milieu de prolifération frais, pendant une 2871341 11 durée appropriée, de sorte à induire la formation d'une nouvelle génération de filaments blancs, et l'on répète l'opération aussi souvent que nécessaire pour produire différentes générations successives de filaments blancs, jusqu'à l'obtention de la quantité de filaments blancs souhaitée. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise en tant qu'expiants des méristèmes prélevés sur des pieds-mères, que l'on cultive en conditions axéniques, à la lumière, pendant un premier laps de temps, sur un milieu de développement, commun à chaque espèce végétale à multiplier, de sorte à provoquer la formation de petites plantules présentant de premières ébauches foliaires, puis, pendant un second laps de temps, sur un milieu racinaire, commun à chaque espèce végétale, de sorte à obtenir des plantules enracinées, exemptes de bactéries et de virus, destinées à être placées à l'obscurité sur le milieu de prolifération pour produire lesdits filaments blancs. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'au cours de la phase d'enracinement desdites plantules, l'on augmente de manière appropriée le volume du milieu racinaire utilisé. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on supprime les feuilles et les racines desdites plantules obtenues à partir des méristèmes avant de les placer à l'obscurité sur le milieu de prolifération pour produire lesdits filaments blancs. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on utilise en tant qu'expiants des microboutures prélevées sur des pieds-mères certifiés exempts de bactéries et de virus. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on supprime les feuilles et les stipules de la partie apicale des microboutures, avant de les placer à l'obscurité sur le milieu de prolifération pour produire lesdits filaments blancs. 2871341 12 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on stocke les filaments blancs, à température ambiante, à l'obscurité, dans un milieu de prolifération périodiquement renouvelé avant de les soumettre à la phase d'enracinement au cours de laquelle chaque bourgeon produit une micro plantule enracinée destinée à fournir un jeune plant ou un micro pied mère. 10) Jeune plant se distinguant notamment par un taux de ramification élevé, une croissance rapide, un feuillage de faible dimension, une autorégulation du pied, caractérisé en ce qu'il est issu d'une micro plantule obtenue à partir d'un expiant ou d'un dérivé d'expiant du végétal à multiplier, soumis aux conditions de culture du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.