Brevet FR2859732A1 — publié le 20050318

La présente demande de brevet a pour objet des cellules révertantes 5 de lignées cellulaires issues de tumeurs solides de cancer du colon, du poumon et du mélanome.. La plupart des chercheurs dans le domaine du cancer ont essayé de répondre à la question suivante: comment une cellule normale devient-elle tumorale ? Les efforts de milliers de chercheurs durant ces vingt dernières années ont permis de répondre, du moins partiellement, à cette question. La mise au point de produits thérapeutiques à partir des résultats issus de ces travaux semble cependant poser d'importantes difficultés. En particulier, il ne semble notamment pas possible de réparer un chromosome cassé, un oncogène activé par une mutation ou une translocation, ou encore, un gène suppresseur de tumeurs ayant perdu sa fonction. Les inventeurs ont donc considéré qu'il était crucial de répondre à une question différente, mais plus pratique, et qui va droit au but thérapeutique, à savoir: comment une cellule tumorale peut-elle perdre son phénotype malin et donc réverter ? Certains chercheurs s'étaient d'ailleurs posé en partie cette question au début des années 80. Ils avaient remarqué que des fibroblastes transformés par l'oncogène ras pouvaient perdre leur phénotype malin. Ces fibroblastes révertants se distinguaient par leur morphologie, et ont été appelés les flat revertants . Des expériences ultérieures ont démontré que l'effet oncogénique du ras était antagonisé par le gène K-rev dans ces cellules révertantes. Néanmoins, ces chercheurs n'ont pas apporté de réponse quant à savoir si une cellule tumorale provenant de patients pouvait réverter. Leurs recherches étaient uniquement focalisées sur les single gene revertants , et n'abordaient pas le problème à un niveau plus global. Les premiers travaux des inventeurs dans ce domaine au début des années 90 ont essayé d'apporter des modèles de réversion à un niveau global. A partir de cellules provenant de lignées leucémiques humaines (K562, U937), ils ont réussi à isoler ces révertants (KS et US) (Telerman et al., PNAS, vol 90 pp8702-8706, 1993; Nemani et al., PNAS, vol 93, pp 9039-9042, 1996). Leur hypothèse de départ était la suivante: chez une personne normale, on sait que des cellules avec des mutations fréquentes aboutissent à la formation de cellules cancéreuses et que ces dernières sont détruites, notamment par le système immunitaire (de telle sorte qu'en fait le passage de certaines cellules d'un état normal à un état tumoral passe la plupart du temps inaperçu). Sur cette base, les inventeurs ont donc considéré, qu'en sens inverse , au sein d'une tumeur contenant des centaines de millions de cellules, de très rares cellules devaient décider de quitter la voie tumorale. Dans le but de pouvoir distinguer ces rares révertants au sein d'une population tumorale, les inventeurs ont employé comme outil le parvovirus H-1, qui tue de manière préférentielle les cellules tumorales et épargne celles qui ne le sont pas. C'est en appliquant cette technologie qu'à partir des cellules dérivées de lignées leucémiques, les inventeurs ont établi les clones révertants. Le problème était cependant entièrement à revoir dans le cas des tumeurs solides. Dans ce cas, notamment les tumeurs du colon, du poumon et du mélanome, les cellules ne poussent pas en suspension, mais sont adhérentes; il est donc plus compliqué d'isoler les cellules révertantes. Vu la fréquence très élevée de tumeurs du colon, du poumon et du mélanome, il était donc important de pouvoir résoudre la problématique. Les inventeurs ont mis au point un protocole permettant d'isoler les cellules de lignées cellulaires issues d'une tumeur solide de cancer du colon, de cancer du poumon et de mélanome ayant réverté. Par cellule révertante on entend une cellule d'origine tumorale ayant perdu une partie significative des propriétés la définissant comme cellule tumorale. Par exemple, alors qu'une cellule tumorale n'a pas besoin d'accrochage pour croître, la cellule révertante, comme la cellule saine d'ailleurs, a besoin d'un tel accrochage pour croître. Cependant, la réversion tumorale telle que mise en évidence par les inventeurs ne peut pas être considérée comme résultant simplement d'une inversion de la transformation maligne d'une cellule saine mais plutôt comme un phénomène biologique propre comprenant un processus de reprogrammation cellulaire conduisant à la suppression de la tumorigénicité telle que l'exigence d'ancrage pour la croissance. Les inventeurs ont donc réussi a isolé des cellules tumorales révertantes en soumettant plusieurs lignées cellulaires issues de tumeurs solides de cancer du colon, du poumon ou de mélanome à une infection au parvovirus H1. Une telle infection présente la caractéristique, comme indiqué précédemment, de tuer toutes les cellules malignes en épargnant seulement les cellules, qui ont perdu, de façon significative, leur pouvoir tumorigène. La présente invention a donc pour objet des cellules révertantes d'une lignée cellulaire issue d'une tumeur solide de cancer du colon, de cancer du poumon ou de mélanome susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes: d'infection des cellules de ladite lignée cellulaire avec un 20 parvovirus H1 présentant une MOI (multiplicité d'infection) comprise entre 100 et 5 000 pfu/cellule, d'isolement et récupération des cellules ayant survécu à l'effet cytopathique du parvovirus H1, ces cellules étant dites révertantes. En particulier, les cellules révertantes conformes à l'invention présentent la caractéristique, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de croissance normale: - de former un nombre de colonies réduit d'au moins 50 % par rapport au nombre de colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues, et - de former des colonies dont la taille est réduite d'au moins 40 % par 5 rapport à la taille des colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues. Par conditions de croissance normales , il faut entendre des conditions de croissance standard connues de l'homme du métier, c'est-à-dire mettant en oeuvre un milieu susceptible d'apporter à la cellule tout ce dont elle a besoin pour croître sans rechercher l'obtention d'un résultat particulier en dehors de la croissance desdites cellules. Plus particulièrement encore, les cellules révertantes conformes à la présente invention sont caractérisées en ce que la lignée cellulaire soumise à l'infection du parvovirus Hl est choisie parmi la lignée cellulaire du cancer du colon DLD-1 (ATCC n CCL-221), la lignée cellulaire du cancer du poumon A549 (ATCC n CCL-185) et la lignée cellulaire du mélanome WM266.4 (ATCC n CRL-1676). L'un des intérêts que présentent les cellules révertantes de l'invention est qu'elles peuvent être utilisées comme modèles cellulaires à des fins de 20 développement de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. FIGURES Figure 1: dosage de tumorigénicité in vivo: les cellules tumorales parentes et les cellules filles résistantes aux parvovirus ont été cultivées comme décrit dans les EXEMPLES . Le jour de l'injection desdites cellules, celles-ci ont été détachées avec de la trypsine, neutralisées avec le milieu de croissance et lavées au moyen d'un milieu de croissance sans FBS. 1 x 107 cellules ont été injectées dans 0,2 ml de milieu sans FBS. Chaque souris scid/scid a reçu 4 injections de cellules tumorales ou révertantes localisées à différents endroits: une dans chaque flanc et une dans chaque épaule, les cellules tumorales parentes (symboles solide) et les cellules révertantes isolées (symboles ouvert). La figure la illustre la croissance du cancer du colon DLD-1 et des deux cellules révertantes isolées appelées DLD-1 CL4 et DLD-1 CL16. Le volume est mesuré chaque jour et est exprimé en mm3. On peut observer une croissance rapide de la lignée DLD-1 parente. Au 23ème jour, les tumeurs atteignent une taille moyenne de 710 mm3. Les tumeurs deviennent nécrotiques et les animaux doivent alors être sacrifiés. D'autre part, on peut observer pour les deux cellules révertantes une forte inhibition de la croissance tumorale et que l'on observe au 23ème jour des volumes moyens de 308 mm3 et 216 mm3 pour les lignées DLD-1 CL16 et DLD-1 CL4 respectivement. La figure lb illustre la croissance du cancer du poumon A549 et des deux cellules révertantes isolées appelées A549-CL1 et A549-CL46. On peut observer une croissance stable pour les cellules parentes A549 avec une augmentation exponentielle du volume tumoral à partir du 16ème jour. Lorsque les tumeurs atteignent un volume de 307 mm3, les animaux commencent à mourir et doivent donc être sacrifiés. D'autre part, les cellules révertantes A549-CL1 donnent lieu à une petite augmentation de croissance jusqu'à 83 mm3 au 27ème jour. Aucune croissance de la tumeur de la cellule révertante A549-CL46 n'est observée pendant cette période. La figure l c illustre la croissance du mélanome WM266.4 et du clone révertant isolé WM266.4-CL3. On peut observer pour la lignée cellulaire tumorale parente une augmentation rapide du volume tumoral sur l'ensemble de la période, pour atteindre un volume de 1 542 mm3 au 45ème jour. Les chiffres apparaissant sur les graphiques indiquent le nombre de tumeurs formées par rapport au nombre de points d'injection. Figure 2: Test in vitro de croissance en milieu semi-solide pour mesurer la dépendance d'ancrage des cellules cancéreuses parentes et leurs cellules révertantes dérivées. Les cellules parentes et révertantes ont été cultivées comme décrit dans les EXEMPLES et ont été prêtes pour ce dosage quand elles ont été en phase logarithmique. Les cellules ont été détachées du milieu de culture, comptées et mélangées à de l'Agar Noble à 0,3 % (Diffco). Différentes dilutions ont été ensemencées sur une sous-couche d'Agar Noble à 0,61 % afin d'éviter l'ancrage de cellules au plastique. Pour les deux couches, la force du milieu final est 1,0 x C et FBS à 10 %. Les cellules ont été incubées à 37 C, 5 % de CO2 et les colonies ont été comptées après 3 à 4 semaines. Dans ce but, les cellules ont été observées avec un objectif 4X et 20 champs microscopiques pris au hasard ont été sélectionnés. La figure 2a illustre le nombre de colonies observées pour le cancer du colon DLD-1 et les cellules révertantes DLD-1 CL4 et DLD-1 CL16. On peut observer un nombre moyen de formation de colonie de 96 colonies parentes et de 6 et 8 colonies de DLD-1 CL4 et DLD-1 CL16 respectivement. La figure 2b illustre la croissance du cancer du poumon A549 et des cellules révertantes A549-CLI et A549-CL46. Le nombre moyen de 163 colonies a été comptabilisé pour les cellules parentes A549. En ce qui concerne les cellules révertantes CLI, seule une colonie a été observée et en ce qui concerne les cellules révertantes CL46, un nombre moyen de 8 colonies pour 20 champs microscopiques observés. La figure 2c illustre la dépendance d'ancrage réduite du mélanome WM266.4 par rapport au clone révertant isolé WM266.4-CL3. Un nombre moyen de 110 colonies a été comptabilisé pour le parent WM266.4 et un nombre moyen de 20 colonies a été comptabilisé pour le révertant WM266.4-CL3. Figure 3: Analyse PCR pour la présence de l'ADN viral dans les cellules (partie supérieure) et la production de particules virales infectieuses (partie inférieure). L'ADN viral a été détecté par l'analyse PCR pour une région spécifique de 254 paires de bases du parvovirus H-1 dans les cellules NBE infectées par le parvovirus (CTRL+), les cellules NBE non infectées (CTRL-) et dans les cellules étudiées et leurs révertantes. L'ADN du parvovirus H-1 a été amplifié sous les conditions suivantes: 30 s à 94 C, 35 cycles composés de 2 s de dénaturation à 94 C et 2 s d'annelage à 55 C suivi par d'une élongation de 30 s à 72 C. Les amorces spécifiques H-1 suivantes ont été utilisées: - 3479f: 5' CTAGCAACTCTGCTGAAGGAACTC-3' et - 3732r: 5' TAGTGATGCTGTTGCTGTATCTGATG-3' pour parvenir au produit PCR de 254 pb. Afin de déterminer si les cellules révertantes produisent des particles virales infectieuses, le milieu qui a été en contact ave les cellules a été centrifugé (10 min, 1 000 g) et 0,2 M filtré puis incubé pendant 5 jours avec des cellules indicatrices NBE. Les cellules indicatrices ont été dénombrées pour la lyse induite par le virus après 5 jours d'incubation. L'analyse montre que les clones révertants du cancer du colon DLD-1 sont positifs pour l'ADN viral H-1 et produit des particules virales infectieuses. Pour les clones révertants du cancer du poumon, seul A549 CL-1 est positif pour l'ADN viral et produit des particules infectieuses. D'autre part, les clones révertants A549-CL46 et WM266.4-CL3 ne présentent aucun ADN viral indiquant que la présente du virus n'est pas nécessaire pour maintenir le phénotype révertant de ces clones isolés. Les exemples ci-après aideront à la compréhension de la présente invention mais ne sont mentionnés qu'à titre purement illustratif. EXEMPLES Exemple 1: La propagation du parvovirus Hi Matériels Parvovirus Hl Producteur et indicateur de cellules: NB-E, cellules de rein de nouveaux nés humains transformés par SV40 Milieu de propagation NB-E: milieu essentiel minimal de Eagle avec des sels de Earle (Life Technologies) supplémenté avec: 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Life Technologies) 1 % de L-glutamine (Life Technologies) gg/ml de gentamycine (Life Technologies) et % de sérum bovin foetal (inactivé par la chaleur) (Bio Whittaker) Eau: PPI Fresenius, France Solution Alsever pour 1 litre: 20,5 g de D-glucose 4,2 g de NaCl 8,0 g de citrate de Na (citrate de trisodium déshydraté) 0, 55 g d'acide citrique pour ajuster le pH entre 6,1 et 6,4 stérilisée par une filtration à 0,2 m Virus-TE: mM de Tris 0,5 mM de sel de sodium EDTA pH = 8,7 autoclave Tampon borax A = 0,2 M d'acide borie B = 0,05 M de borax de Na (= tétraborate de disodium) 50,0 ml de A 59,0 ml de B 91,0 ml d'H2O, pH = 9,0 stérilisé à travers un filtre de 0,2 m CsCI: 50,00 g de CsCl dans 90,0 ml de virus-TE Densité : 1,4 g/ml filtration à travers un filtre de 0,22 m Sucrose: 10 15 20 25 1 M dans le virus-TE autoclave Méthodes Les cellules NB-E ont été cultivées sur des boîtes de culture Nunc dans le milieu de culture décrit ci-dessus à 37 C, 95 % d'humidité relative et 5 % de CO2, et ont été maintenues pendant au moins 1 mois avant la production de virus. Les cultures confluantes ont été traitées avec une solution trypsine/EDTA (Life Technologies) et ont été divisées dans un rapport de 1 pour 8. Pour une production virale typique, 21 boîtes identiques de 10 cm ont été ensemencées. Quand la culture a atteint 80 % de confluence, une boîte a été traitée à la trypsine et la quantité de cellules a été déterminée avec un hémocytomètre. Toutes les boîtes ont été lavées avec du PBS contenant du Cam et du Mg++ (PBS++, Life Technologies) et infectées pendant 1 h avec le virus H1 avec une multiplicité d'infections (MOI) de 10-3 dans 800 l de PBS++ avec une agitation intermittente toutes les 10 min. Les cellules ont été ensuite remises dans le milieu de culture et incubées ensuite pendant 4 h. Toutes les boîtes ont été traitées avec de la trypsine/EDTA et divisées de façon égale en 200 boîtes. 5 jours après l'infection, les cellules ont été raclées avec une raclette en caoutchouc et la suspension a été introduite dans une bouteille d' 1 1 (bouteille roller Costar). La suspension a été refroidie dans la glace et le virus s'est agglutiné pendant 4 h sous agitation continuelle à 4 C avec 0,2 % de cellules de globules rouges de Guinea Pig. Les érythrocytes de Guinea pig ont été isolés à partir de 15 ml de sang complet (Charles River, France), supplémentés avec 0,3 ml de citrate de sodium à 1 M pour 15 ml de sang. Le sang a été centrifugé à 1 000 g pendant 5 min dans une centrifugeuse clinique et le plasma surnageant a été éliminé avec une pipette pasteur. Les cellules centrifugées ont été mises en suspension dans la solution Alsever et centrifugées comme indiqué ci- dessus. Le surnageant a été éliminé et cette étape a été répétée 5 fois pour éliminer les globules blanc et les plaquettes. Les érythrocytes ont été finalement mis en suspension, pour donner lieu à une suspension à 50 % (v/v), dans une solution Alsever réfrigérée à 4 C et utilisée pendant 15 jours. Le virus agglutiné a été centrifugé pendant 30 min à 805 g à 4 C dans une centrifugeuse Eppendorf 5810R équipée avec un rotor swingout avec des tubes de centrifugeuses coniques 4 x 225 ml (Falcon 352075). Le surnageant a été éliminé au moyen d'une pipette pasteur branchée à une ligne de vide et le reste du mélange a été additionné au culot et centrifugé dans les mêmes conditions. Les culots ont été mis en suspension dans 20 ml de PBS4* et collectées dans un tube de 50 ml (TPP). Tous les tubes ont été rincés avec 1 x 20 ml de PBS4* et 1 x 10 ml de PBS+ +,l'ensemble a été centrifugé à 3 000 rpm dans le même rotor pendant 30 min à 4 C. Les culots ont été suspendus dans 7 ml de virus-TE et congelés dans de l'azote liquide pendant quelques minutes, ils ont été ensuite décongelés à 37 C pour détruire les cellules et ont été régulièrement soumis au vortex pendant la décongélation. Cette étape de congélation/décongélation a été répétée 3 fois. Le mélange de virus et débris cellulaires a été mis dans un tube de centrifugeuse de 10 ml (Nalgene ref 3119-0010) et a été centrifugé pendant 30 min à 12 000 g à 4 C (centrifugeuse Eppendorf 5810R). Le surnageant a été stocké dans un tube de 15 ml de polypropylène (TPP). Le culot a été suspendu dans 2 ml de virus-TE et a ensuite été placé dans un tube différent de 15 ml et a subi un cycle de congélation/décongélation 3 fois comme indiqué ci-dessus dans de l'azote liquide. La suspension a ensuite été placée dans un tube à centrifugeuse Nalgène, le tube de 15 ml a été lavé avec 1 ml de virus- TE et les suspensions ont été mises ensemble à centrifuger à 12 000 g pendant 30 min à 4 C. Les deux surnageant ont été mis ensemble et ont a été traités pendant 30 min à 37 C avec de la nucléase de micrococcus (Pharmacia-Amarsham) à une concentration finale de 0,01 mg/mI, solution stock à 1 mg/ml dans un tampon borax. La nucléase a été activée avec 5 mM de CaCl2 et la réaction a été stoppée avec 5 mM de EDTA. 5 ml de CsCI ont été ajoutés ensuite par tube d'ultracentrifugation (Beckman 331372), le contenu Il du tube a ensuite été recouvert par 1 ml de sucrose, puis avec une couche soigneusement étalée à sa surface de 6 ml d'une préparation virale. L'ensemble a été centrifugé pendant 24 h à 39 000 rpm à 15 C dans un rotor SW41 (Beckman). Le gradient a été fractionné et le profil du gradient ainsi que la position des virions et des capsides vides a été déterminé par un test d'hémagglutination. Les fractions d'intérêt ont été rassemblées et dialysées de façon extensive (Slide A-lyzer, PIERCE) contre la solution de virus-TE à 4 C. La concentration du virus a été déterminée par un plaque-assay avec NB-E en tant qu'indicateur cellulaire. Exemple 2: Isolement de cellules révertantes Matériels Cellules DLD-1, : ATCC n CCL-221 Nombre de passages: 21 Organisme: Homo sapiens (humain) Tissu: adénocarcinome, colorectal Genre: mâle Morphologie: épithéliale Milieu de propagation DLD-1: Milieu: RPMI 1640 (Life Technologies) supplémenté avec: 1 % de L-glutamine (Life Technologies) 4011g/ml de gentamycine (Life Technologies) 10% de sérum bovin foetal (inactivé par la chaleur) (Bio Whittaker) Collagénase/dispase (Roche) Méthodes Les cellules DLD-1 ont été obtenues à partir de la collection ATCC et ont été cultivées dans des flacons TC Nunc, propagées dans le milieu de DLD-1 ci-dessus décrit à 37 C, 95 % d'humidité relative et 5 % de CO2. Le milieu de culture a été remplacé 2 fois par semaine et les cellules ont été sous-cultivées quand la culture a atteint une confluence de 80-90 %. Le procédé de sous-culture des cellules était différent avant et après l'isolement de cellules révertantes. Quand les cultures ont atteint la confluence, en générale 1 fois par semaine, le milieu a été aspiré avec une pipette pasteur et les cellules ont été lavées avec 2 ml d'une solution chaude de trypsine/EDTA. La solution enzymatique a été directement remplacée par la même solution à raison de 2 ml/75 cm2 et les cellules ont été incubées à 37 C pendant 5 min. Les cellules ont été resuspendues dans 8 ml de milieu de culture complet et centrifugées à température ambiante pendant 7 min à 900 rpm (centrifugeuse Eppendorf 5810R). Le surnageant a été éliminé et le culot de cellule a été placé en suspension et divisé dans 4 flacons identiques. Les cellules DLD-1 ont été cultivées pendant 7 semaines comme décrit ci- dessus avant de procéder à l'isolement des révertantes. Pour l'isolement des révertantes, le contenu d'un flacon a fait l'objet d'une sous-culture comme indiqué ci-dessus et a été divisé de façon identique en 3 flacons. Quand la culture a atteint 80 % de confluence, on a procédé au comptage d'un flacon parallèle de façon à déterminer la quantité de pfu (plaque formant une unité) de parvovirus H lwt. Le contenu des deux autres flacons soeurs DLD-1 a été infecté avec le parvovirus Hlwt comme indiqué ci-après. Le milieu a été aspiré avec une pipette pasteur reliée au vide, les cellules ont été lavées avec du PBS++ chaud et les cellules ont été recouvertes avec 0,4 ml de PBS++ présentant une multiplicité d'infection (MOI) de 5 000 pfu/cellule de Hlwt. Les cellules ont été incubées à 37 C pendant 1 h avec une agitation intermittente toutes les 10 min pour garder les cellules couvertes. Après l'infection, le virus n'a pas été aspiré, les cellules ont été recouvertes avec du milieu de croissance et ensuite incubées pendant 2 h dans l'incubateur. Les cellules ont été lavées avec 2 ml de solution chaude de trypsine et dissociée avec de la trypsine. Les cellules ont été lavées 1 fois dans le milieu de croissance et diluées dans du milieu de croissance à raison de 2 500 cellules/ml. Les cellules infectées ont été ensemencées dans des multi-puits d'un type à 6 puits (TPP) à raison de 10 000 cellules/puits. Une semaine après l'infection, la culture a été complètement lysée. On a observé les cultures 1 fois par semaine et le milieu a été remplacé 1 fois par semaine comme indiqué ci- après. Le milieu a été délicatement éliminé avec une pipette pasteur à partir du ménisque laissant 1/3 de milieu dans le puits. Les puits ont été rechargés avec 4 ml de milieu de croissance chaud en prenant soin de ne pas perturber le micro-environnement des colonies émergeantes. Les colonies ont été soulignées avec un marqueur et isolées dans un cylindre de clonage de 8 mm (Sigma) comme indiqué ci-après. Le contenu des puits contenant une colonie a été complètement aspiré et le cylindre de clonage a été placé avec une pince stérile sur la colonie marquée. Le cylindre a été rempli avec 150.il de collagénase/dispase et incubé pendant 30 min à 37 C. Les cellules se sont détachées du plastique mais sont restées comme une feuille ensemble. Les cellules DLD-1 CL4 et DLD-CL16 ont été isolées 2 semaines après l'infection et ensemencées dans un puits (plaque Nunc à 96 puits). Le milieu a été remplacé 1 fois par semaine comme décrit ci- dessus laissant 1/3 de milieu dans le puits. Quand la culture a atteint la confluence, le milieu a été aspiré avec une pipette et gardé pour servir plus tard à faire un milieu conditionné. Les cellules ont été lavées avec du PBS (sans calcium ni magnésium) et détachées avec la collagénase/dispase. Les cellules ont été resuspendues dans du milieu de culture et centrifugées pendant 7 min à 900 rpm. Le culot de cellules a été resuspendu dans du milieu conditionné, à savoir un nouveau milieu de croissance contenant 20 % du milieu ancien, et réparti selon un ratio de 1:2. La lignée cellulaire tumorale parentale DLD-la été cultivée de la même façon dans le but de comparer les lignées cellulaires selon un test de croissance en milieu semi-solide (soft agar) (figure 2) et sous l'aspect de la formation des tumeurs dans des souris scid-scid (figure 1). Ces tests ont confirmé l'exigence d'accrochage pour la croissance pour les cellules DLD-1 CL4 et DLD- CL16 contrairement aux cellules DLD-1 qui ont formé des colonies en milieu semi-solide (sort agar). Exemple 2B: Isolement d'un cancer du poumon révertant A549 Matériels Cellules A549: atcc n CCL-185 Organisme: Homo sapiens (humain) Espèce humaine, type caucasien Tissu: carcinome, poumon Morphologie: épithélial Milieu de propagation des cellules A549 milieu: modification de Kaighn de HAM F12 (Life Technologies) supplémenté avec: 1 % de L-glutamine (Life Technologies) g/ml de gentamycine (Life Technologies) % de sérum bovin foetal (inactivé par la chaleur) (Bio Whittaker) Trypsine/EDTA (Life Technologies) Col lagénaseldispase (Roche) Méthodes Pour isoler des cellules révertantes à partir de cellules A549 issues d'un carcinome de poumon, les Inventeurs ont utilisé la même approche que celle mise en oeuvre dans le cadre de l'isolement des cellules révertantes obtenues à partir des cellulesDLD-1 et appelées DLD-1 CL4 et DLD-CL16, à l'exception de la modification suivante et des caractéristiques de cette tumeur. Les cellules A549 ont été obtenues à partir de la collection ATCC et propagées dans du milieu de croissance A549. Ces cellules ont été cultivées pendant 5 semaines avant que l'isolement des révertantes ne commence. Les cellules A549 ont été infectées par une multiplicité d'infections (MOI) de 1 000 pfu/cellule et ont été réparties dans 10 15 des plaques à 6 puits (TPP) à une densité de 20 000 cellules par puits. L'isolement des clones qui ont survécu à une infection par le parvovirus Hlwt, a commencé 4 semaines après l'infection. Les cellules ont été gardées dans du milieu conditionné et détaché du récipient de culture au moyen de la collagénase/dispase. Deux clones ont été sélectionnés pour leurs propriétés comprenant une réversion du phénotype malin, ces clones ont été appelés A549-CL1 et A549-CL46. Les cellules A549-CL1 et A549-CL46 ont été isolées 6 mois après l'infection avec le parvovirus Hlwt. Exem s le 2C: Isolement de cellules révertantes à s artir de la li_née de mélanome WM266.4 Matériels Cellules WM266.4: ATCC n CRL-1676 Organisme: Homo sapiens (humain) Espèce humaine: type caucasien Tissu: mélanome; peau Morphologie: épithélial Milieu de propagation des cellules WM266.4 milieu essentiel minimum Eage avec les sels Earle (Life Technologies) supplémenté avec: 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Life Technologies) . 1 % de L- glutamine (Life Technologies) 1 % de NaPyruvate (Life Technologies) gg/ml de gentamycine (Lige Technologies) 25. 10 % de sérum bovin foetal (inactivité par la chaleur) (Bio Whittaker) - Trypsine/EDTA (Life Technologies) Collagenase/dispase (Roche) Méthodes Pour isoler des cellules révertantes à partir de la lignée de mélanome WM266.4, la même approche a été utilisée que celle mise en oeuvre pour l'isolement des cellules révertantes à partir de la lignée DLD-1 et appelées DLD-1 CL4 et DLD-CL16 à l'exception de la modification suivante et des caractéristiques de cette tumeur. La lignée cellulaire WM266.4 a été obtenue à partir de la collection ATCCet propagée dans le milieu de croissance WM266.4. WM266.4 a été adaptée à l'environnement pendant 12 semaines. Les cellules de WM266.4 ont été infectées avec une multiplicité d'infection (MOI) de 100 pfu/cellule et ont été réparties dans des plaques à 6 puits (TPP) à une densité de 10 000 cellules/puits. L'isolement des clones qui ont survécu à l'infection du parvovirus Hlwt a commencé 10 semaines après l'infection. Les clones survivants ont été très rares. Un clone a été sélectionné pour ses propriétés comprenant une réversion du phénotype malin, ce clone a été appelé WM266.4-CL3. REVENDICATIONS 1. Cellules révertantes d'une lignée cellulaire issue d'une tumeur solide de cancer du colon, du poumon ou du mélanome susceptibles d'être obtenues par la 5 mise en oeuvre d'un procédé comprenant les étapes: d'infection des cellules de ladite lignée cellulaire avec un parvovirus H1 présentant une MOI (multiplicité d'infection) comprise entre 100 et 5 000 pfu/cellule, d'isolement et récupération des cellules ayant survécu à l'effet 10 cytopathique du parvovirus H1, ces cellules étant dites révertantes. 2. Cellules révertantes selon la revendication 1, caractérisées par le fait que lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de croissance normales: - elles forment un nombre de colonies réduit d'au moins 50 % par rapport au nombre de colonies formées dans les mêmes conditions par les cellules de la ligné cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues, et - elles forment des colonies dont la taille est réduite d'au moins 40 % par rapport à la taille des colonies formées dans les mêmes conditions par les 20 cellules de la lignée cellulaire dont lesdites cellules révertantes sont issues. 3. Cellules révertantes selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que ladite lignée cellulaire est choisie parmi la lignée du cancer du colon DLD-1 (ATCC n CCL-221), la lignée du cancer du poumon A549 (ATCC n CCL-185) et la lignée du mélanome WM266.4 (ATCC n CRL-1676).