Brevet FR2867189A1 — publié le 20050909

s Nouveaux composés médicamenteux destinés au traitement des pathologies dépendantes de l'activité protéine kinase La présente invention concerne de nouveaux composés ayant une action d'inhibition, de régulation et/ou de modulation de l'activité de protéine kinase io ainsi que les médicaments et compositions pharmaceutiques destinés au traitement des pathologies dépendantes de l'activité protéine kinase. Les protéines kinases (PK) occupent une place centrale dans la transmission des signaux intracellulaires telles que: le métabolisme, la différenciation, la ls prolifération cellulaire et tissulaire, et l'apoptose. Il est estimé qu'il existe environ 2000 protéines kinases distinctes chez l'homme. Elles produisent grâce à la phosphorylation spécifique de protéines une modification stable de l'activité biologique qui ne sera annulée que sous l'action de protéines phosphatases. L'équilibre entre phosphorylation par des protéines kinases et déphosphorylation par des protéines phosphatases assure la régulation de nombreux processus cellulaires importants. Un grand nombre de produits proto-oncongènes fait partie des protéines kinases. On peut subdiviser la grande famille des protéines kinases selon le type d'activation et le type de substrat. Les protéines kinases A sont activées par l'AMPc, les protéines kinases G par le GMPc, les protéines kinases C par le diacylglycérol (DAG), et les kinases Cal+/calmoduline dépendantes par le Cal+. La classification est basée sur la nature du résidu acide aminé phosphorylé. II existe des tyrosines kinases et des sérines/thréonines kinases. Les kinases peuvent avoir une large spécificité de substrat ou bien être spécialisées pour quelques protéines. Le développement d'inhibiteurs sélectifs de PK pouvant bloquer ou moduler des pathologies dans lesquelles cette voie de signalisation est défectueuse, est une approche prometteuse pour le développement de nouveaux anti- cancéreux. Cependant, l'activité de ces inhibiteurs étant enzymatique cela impose un blocage constant du site et donc une prise constante de médicament. s Le but de la présente invention est de proposer d'associer un inhibiteur de protéines kinases à un composé photoactivable dans le but d'utiliser l'inhibiteur pour la reconnaissance du site à traiter, et le composé photoactivable pour la destruction du site récepteur par une action photochimique lo (photochimiothérapie) en vue d'un blocage plus durable et/ou plus efficace de l'activité kinasique visée. La photochimiothérapie repose sur l'activation à l'aide d'une radiation lumineuse de longueur d'onde adaptée au spectre d'absorption d'un composé is photoactivable. Les radiations lumineuses absorbées par le composé photoactivable entraînent des réactions de type 1 (production de radicaux hydroxyles) ou de type 2 (production d'oxygène singulet) par un mécanisme de conversion intersystème. Ces espèces radicalaires entraînent des réactions d'oxydation et de peroxydation conduisant à la destruction ou l'inactivation du site traité. A cet effet, le composé selon la présente invention associe une ou plusieurs molécules (I) photoactivables et une ou plusieurs molécules (Il) ayant une action d'inhibition, de régulation et/ou de modulation de l'activité d'une protéine kinase. Nous avons ainsi découvert que l'on pouvait conférer à ces composés renfermant au moins une molécule photosensible la possibilité de reconnaître spécifiquement des sites récepteurs des protéines kinases pour les inhiber à l'aide d'une réaction photochimique. Cette inhibition s'est révélée plus durable que celle obtenue avec les inhibiteurs de protéine kinase, seuls, c'est-à-dire non associés à des molécules photosensibles. De manière avantageuse, la molécule photoactivable (I), c'est-à-dire présentant une activité photochimique sous irradiation lumineuse, est un agent photosensibilisant choisi parmi: les porphyrines ou leurs dérivés, telles que l'hématoporphyrine, les éthers de dihématoporphyrine, les dimères d'hématoporphyrine, les trimères d'hématoporphyrine, la benzoporphyrine, les porphyrines vertes, les mérocyanines, les porphycènes, le porfimère de sodium, la verteporfine, les chlorines, de préférence choisies parmi les familles de molécules diphényles chlorine (SIM), les tétrahydroporphyrines, telles que la m-THPC, les bactériochlorines, la phthalocyanine de zinc, les purpurines et leurs dérivés, tels que l'éthyle étiopurpurine d'étain, les phéophorbides ou une association de plusieurs de ces molécules. La molécule photoactivable (I) peut également être un colorant de préférence choisi parmi: l'acridine orange, le rose de Bengale, le bleu de méthylène, le vert d'indocyanine, la fluorescéine et le rubrène, ou un de leurs polymères réagissant à la lumière, ou la chlorophylle a, la riboflavine, la phénaléone ou une association de plusieurs de ces molécules. De même, de manière avantageuse, la molécule (Il) du composé selon la présente invention, est choisie parmi les inhibiteurs suivants des kinases cibles ci-après: - STI 571 (inhibiteurs de Bcr-Abl) - ZD-1839, OSI-774, PKI 166, EKB-569, GW 57 2016 (inhibiteurs de EGF-R) 25 - CEP 2563 (inhibiteur de PKC/Trk) - UCN-01, GCP 41251 (STI 412), le safingol, la perifosine (inhibiteurs de PKC) - SU 5416, CGP 79787, CP-564959, ZD 6474, ZD 2171, SU-11248 (inhibiteurs de VEGF-R) - le flavopiridol, CI-202 (inhibiteurs de CDKs). Ces exemples d'inhibiteurs sont ATP-compétitifs de protéines kinases de faible poids moléculaire. L'association entre les molécules (I) et les molécules (II) du composé de la présente invention peut être réalisée: - soit par une liaison covalente selon la formule (I)n (II),,,, n et m étant compris entre 1 et 5, - soit au moyen d'un élément de liaison L selon la formule (1), L-(11),, n et m s étant compris entre 1 et 5, et L étant choisi parmi: - un groupement alkyle ou acyle substitué ou non; - un polymère, par exemple l'acide poly-l-glutamique, l'acide poly-d- glutamique, l'acide poly-dl-glutamique, l'acide poly-l-aspartique, l'acide poly-d-aspartique, l'acide poly-dl-aspartique, la polylysine, les polysaccharides, le io polyhydroxypropyl-méthacrylamide, le dextrane, la poly(hydropropylglutamine), la poly(hydroéthylglutamine), l'acide hyaluronique, le carboxyméthyle dextrane, l'acide polyacrylique, le chitosane, la polyglycine, la polytyrosine, la polyphénylalanine, l'oxyde polypropylène (PPO), le polyéthylène glycol (PEG), les copolymères de PEG avec PPO, l'acide polyglycolique, la polyvinyl ls pyrolidone, l'acide polylactique, l'alcool polyvinylique; - un anticorps ou un des ses fragments, un peptide ou une protéine. La liaison entre les molécules (I) et (Il) par l'intermédiaire de L peut être clivable par une enzyme, sensible au pH, détruite par la lumière ou tout autre procédé 20 physique ou chimique. Le composé selon l'invention trouve une application intéressante en photochimiothérapie. Dans cette optique, la présente invention porte aussi sur un médicament renfermant, en tant que principe actif, un composé tel que décrit cidessus. Un tel médicament est notamment destiné au traitement des pathologies dépendantes de l'activité protéine kinase, de préférence destiné au traitement de dysrégulation de l'angiogénèse, de la croissance tumorale, des cancers, de l'athérosclérose, de la dégénérescence maculaire liée à l'âge, de la rétinopathie diabétique ou des maladies inflammatoires. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme un composé du type précité associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les composés de l'invention peuvent être présentés sous toute forme de composition administrable au corps humain ou animal et appropriée à l'administration entérale, parentérale ou transdermique, tel que comprimé, dragée, crème dermique, gélule, capsule, suspension ou solution buvable ou injectable, tel que sirop ou ampoule, timbre transdermique, formulation liposomale (nanoparticules) etc. associés à des excipients convenables et dosés pour permettre une ou plusieurs cures comprenant une ou plusieurs io administrations journalières pendant un jour ou plusieurs jours à raison d'une dose comprise par exemple entre 0,1 et 20 mg/kg de poids. Les excipients peuvent être des solutions aqueuses ou contenant des lipides renfermant éventuellement des agents permettant la suspension, la stabilisation, la préservation et/ou la dispersion. Les composés peuvent aussi se présenter sous une forme lyophilisée tel qu'une poudre qui est additionnée, avant usage, d'un liquide stérile, tel que de l'eau stérile pour préparation injectable. Les formes administrables préférées sont les formes injectables, en particulier 20 sous forme d'une injection intramusculaire ou intraveineuse ou sous forme d'application transcutanée. Les composés de l'invention peuvent également être utilisés pour le traitement ex-vivo de cellules par exemple dans le cadre de purges de moelle osseuse dans le traitement des leucémies et plus généralement pour la mise en oeuvre des procédés inclus sous le terme de thérapie cellulaire. L'invention sera mieux comprise à la lecture d'exemples illustratifs de réalisation. Exemple I Le composé suivant ainsi que les effets qu'il induit avec et sans lumière illustre, à titre d'exemple, la préparation d'un composé selon l'invention constitué d'une fraction de l'inhibiteur de tyrosine kinase STI571 (Gleevec, Imatinib) et d'une porphyrine ainsi que ses effets. La synthèse de ce composé, répondant à la formule générale suivante: CH3 CH3 (GP) et qui sera appelé par la suite pour simplifier GP, comporte les étapes suivantes. io Etape 1: clivage de la liaison amide du ST1571 Hydrolyse NH NH2 Etape 2: Une porphyrine carboxylée est ensuite utilisée pour reformer la liaison amide régénérant ainsi en partie la structure du STI571. HO CH3 CH3 N H2 CH3 CH3 Les essais décrits ci-dessous portent sur l'activité de la molécule GP comparée à l'activité de STI571 seul. L'activité de cette nouvelle molécule GP a été testée in vitro avec des essais de toxicité et de phototoxicité. La GP montre, dans une solution d'alcool absolu, 5 pics principaux d'absorption respectivement à 415, 513, 548, 590 et 646 nm. La solution a été obtenue s comme suit: un milligramme de GP a été dissous dans 1 mL d'alcool absolu. La molécule ST1571 ne présente pas d'absorption dans le visible. Pour étudier la toxicité et la phototoxicité de la molécule GP, il a été procédé comme suit: Des cellules K562 (Leucémie myéloïde chronique, CML) ont été utilisées, car elles expriment le chromosome de Philadelphie. En effet le chromosome de Philadelphie trouvé dans les cellules leucémiques des patients atteints de la CML est produit par une translocation entre le chromosome 9 et le 1s chromosome 22, résultant l'expression d'une protéine chimère de Bcr et de la kinase Abl dans le cytoplasme, ce qui rend ce type cellulaire sensible à un traitement par l'antityrosine kinase tel que le STI 571. Les cellules ont été mises en culture dans des flacons Falcon de 25 cm2 (Polylabo, Strasbourg, France) en milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) supplémenté avec 10 % (VN) de sérum de veau foetal (FCS) , 100 unités de pénicilline 100 mg de streptomycine et 2 mM de glutamine. Les cellules ont été repiquées en culture suivant une dilution 1:3, ce qui a 25 maintenu ces cellules dans la phase exponentielle de croissance. L'absence de contamination par les mycoplasmes à été régulièrement contrôlée. Les cellules ainsi cultivées ont été soumises à un traitement photodynamique. STI571 a été dissoute dans du tampon phosphate. Pour la molécule GP, une solution mère a été réalisé à 1 mg/mL dans un tampon (50% eau, 30% PEG, 20% éthanol), les dilutions successives étant réalisées dans du tampon phosphate. Des quantités aliquotes (11 pL) de la solution photosensibilisante GP ou de STI571 ont été ajoutées à des cellules K562 dans des puits de plaques à 96 puits. La concentration cellulaire était de 5.104 cellules/mL (100 pL par puits). La concentration finale des solutions de GP ou STI571 était comprise dans la plage de 0,5 à 20 pg/ml. Immédiatement après addition du photosensibilisant GP ou STI571, les plaques de cellules ont été maintenues dans une obscurité complète jusqu'au traitement par PDT (Photodynamic therapy ou photochimiothérapie). Des milieux frais contenant du FCS mais exempt de GP ou STI571 ont été préparés et ajoutés après centrifugation à 1800 tours/min pendant 5 minutes, avant irradiation laser. Un laser argon émettant à 514 nm couplé à une fibre optique a été utilisé pour irradier les cellules. La puissance d'émission de la lumière à l'extrémité de la fibre a été réglée, en utilisant un dispositif de mesure de puissance (Coherent, France), à 200 mW. La lumière a été transmise à la cible par une fibre optique à une distance de 20 mm afin d'irradier des cellules dans un puits de 6 mm de diamètre à l'intérieur d'un champ unique fournissant une illumination de la totalité de la zone. Le temps d'exposition a été de 14 secondes par puits à 514 nm fournissant une densité d'énergie de 10 J/cm2. Les cellules ont été incubées avec GP ou STI571 pendant 2 heures. Pour les essais de phototoxicité, les cellules ont été lavées et le milieu a été remplacé immédiatement avant irradiation laser. Les comptages de cellules ont été réalisés 24, 48 et 72 heures après la fin des expériences. Au moment du comptage, 15 pL de solution PBS-MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés aux puits. Après 4 heures, 150 pL d'isopropanolHCI 0,04N ont été ajoutés conformément à la méthode décrite par Mosmann (T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1985). La densité optique de chaque puits des microplaques a ensuite été lue à 570 nm au moyen d'un appareil Opsys MR (Dynex Technologies, Chantilly, USA). Un puits contenant du RPMI sans rouge de phénol et 15 pL d'une solution MU (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl tetrazolium) a été utilisé pour déterminer les blancs pour les mesures d'absorbance. Les résultats sont présentés dans les figures 1 à 3: La figure 1 représente la toxicité de STI571 mesurée à 24, 48 et 72 heures sur les cellules K562 après incubation pendant 2 heures; La figure 2 représente la toxicité de GP mesurée à 24, 48 et 72 heures sur les cellules K562 après incubation pendant 2 heures; La figure 3 représente la toxicité et phototoxicité (irradiation à 514nm et 10 J/cm2) de GP mesurée à 48 heures sur les cellules K562 après incubation 10 pendant 2 heures; Au travers de ces figures, la molécule STI571 seule montre une inhibition de la croissance, dépendante de la concentration, sur les cellules K562. La molécule GP utilisée en absence de lumière entraîne une inhibition de la croissance comparable quoique un peu inférieure à ST1571 seule. Ceci suggère que la fraction de STI571 couplée sur la porphyrine est bien la fraction inhibitrice de l'activité anti-tyrosine kinase, et que la présence de la porphyrine n'empêche pas la reconnaissance du site. Les cellules K562 incubées avec GP et soumises à une irradiation lumineuse présentent une forte inhibition de la croissance statistiquement plus importante que lorsqu'elles sont incubées avec GP en absence de lumière. Aucune différence significative n'a été observée entre des cellules irradiées et 25 non irradiées avec STI571 seule, non associée à la porphyrine (résultats non représentés ici). Afin de confirmer la présence de la molécule GP au niveau des cellules K562, il a été procédé à une visualisation de la localisation in vitro de la molécule GP, par imagerie de fluorescence afin de confirmer que les composés précités étaient aptes à pénétrer dans les cellules. Ainsi, des cellules K562 ont été ensemencées à 105 cellules/mL sur des lames de verre circulaire. Après 2 heures, des cellules ont été incubées avec GP (20 pg/mL) à 37 C pendant 4 heures et ensuite lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline solution) (pH 7,2). L'analyse de la fluorescence de GP (émettant à 630 nm) a été réalisée après excitation entre 450 nm et 480 nm produite par une lampe Xénon 150 W en utilisant une caméra vidéo noir et blanc à détection de photons très sensible (Kappa CF 8/4; Fischer Scientific SA, France) reliée à un microscope optique (Olympus BX 40, France) équipé avec un objectif à immersion d'huile grossissant 100 fois. L'intensité de fluorescence (figure 4) la plus forte a été localisée principalement dans le cytoplasme des cellules K562. Les images produites immédiatement lo après incubation pendant 4 heures avec GP démontrent clairement que les composés sont aptes à pénétrer dans les cellules. Aucune fluorescence résiduelle n'a été détectée chez les cellules K562 seules ou incubées avec du STI571 (résultats non représentés ici). Exemple II Le composé suivant est constitué d'une fraction de l'inhibiteur de tyrosine kinase STI571 (Gleevec, Imatinib) et d'une chlorine SIM01 (décrite dans WO 0210173) 2,3 dihydro 5,15-bis (3,5-dihydroxy-1-phényl) porphyrine. Le procédé de synthèse est identique à celui de l'exemple I. Le composé résultant répond à la formule générale suivante (GC) : et sera appelé par la suite pour simplifier GC. Les essais concernant la toxicité et la phototoxicité de la molécule GC, sont identiques à ceux réalisés dans l'exemple I. La molécule GC montre des résultats comparables à ceux décrits dans l'exemple I, c'est à dire pour la molécule GC utilisée en absence de lumière entraîne une inhibition de la croissance des cellules K562 comparable quoique un peu inférieure à STI571 seule. Les cellules K562 incubées avec GC et soumises à une irradiation lumineuse présentent une forte inhibition de la croissance statistiquement plus importante que lorsqu'elles sont incubées avec GC en absence de lumière, plus importante aussi que GP en présence de lumière à dose équivalente. En effet, SIM est plus puissant que la porphyrine de part un rendement quantique en oxygène singulet plus important produisant ainsi une réaction photochimique plus intense. Exemple III Le composé suivant est constitué d'une fraction de l'inhibiteur ZD1839 (Iressa) 20 et d'une porphyrine. Le ZD1839 est un inhibiteur de la phosphorylation intracellulaire de nombreuses tyrosines kinases associées aux récepteurs transmembranaires de la surface cellulaire, incluant les tyrosines kinases associées au récepteur des facteurs de croissance épidermique (EGFR-TK). L'EGFR est exprimé à la surface cellulaire de nombreuses cellules normales et cancéreuses. Le ZD1839 agit en bloquant le signal de transduction impliqué dans la prolifération des cellules cancéreuses, la survie et les processus hôte-dépendant promouvant la croissance tumorale. Le composé préparé répond à la formule générale suivante: 14 CH3 H3C1,,,O CH3 CH3 et sera appelé par la suite pour simplifier IP. La synthèse de ce composé, comporte les étapes suivantes. Etape 1: clivage de la liaison amide du ZD1839 H3C.,,,O HN Hydrolyse O/\ NH2 H3C Etape 2: Une porphyrine carboxylée est ensuite utilisée pour reformer la liaison amide régénérant ainsi en partie la structure du ZD1839. CH3 HO CH3 CH3 O NH2 H3C,, HN CH3 CH3 Les essais concernant la toxicité et la phototoxicité de la molécule IP, sont identiques à ceux réalisés dans l'exemple I. La molécule IP montre des résultats comparables à ceux décrits dans l'exemple L C'est-à-dire la molécule IP utilisée en absence de lumière entraîne une inhibition de la croissance des cellules K562 comparable quoique un peu inférieure à ZD1839 seule. Les cellules K562 incubées avec IP et soumises à une irradiation lumineuse présentent une forte inhibition de la croissance statistiquement plus importante que lorsqu'elles sont incubées avec IP en absence de lumière. REVENDICATIONS 1. Composé comprenant une ou plusieurs molécules (II) ayant une action d'inhibition, de régulation et/ou de modulation de l'activité d'une protéine 5 kinase, caractérisé en ce que la ou lesdites molécule(s) (Il) est (sont) associée(s) à une ou plusieurs molécules (I) photoactivables. 2. Composé selon la revendication 1, io caractérisé en ce que la molécule photoactivable (I) est un agent photosensibilisant choisi parmi: les porphyrines ou leurs dérivés, telles que l'hématoporphyrine, les éthers de dihématoporphyrine, les dimères d'hématoporphyrine, les trimères d'hématoporphyrine, la benzoporphyrine, les porphyrines vertes, les mérocyanines, les porphycènes, le porfimère de sodium, la verteporfine, les chlorines, de préférence choisies parmi les familles de molécules diphényles chlorines (SIM), les tétrahydroporphyrines, telles que la mTHPC, les bactériochlorines, la phthalocyanine de zinc, les purpurines et leurs dérivés et les phéophorbides. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule photoactivable (I) est un colorant, de préférence choisi parmi: l'acridine orange, le rose de Bengale, le bleu de méthylène, le vert d'indocyanine, la fluorescéine et le rubrène, ou un de leurs polymères réagissant à la lumière, ou la chlorophylle a, la riboflavine, la phénaléone ou une association de plusieurs de ces molécules. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 30 caractérisé en ce que la molécule (Il) est choisie parmi les inhibiteurs suivants des kinases cibles ci-après: - STI 571 (inhibiteurs de Bcr-Abl) ZD-1839, OSI-774, PKI 166, EKB-569, GW 57 2016 (inhibiteurs de EGF-R) CEP 2563 (inhibiteur de PKCITrk) - UCN-01, GCP 41251 (STI 412), le safingol, la perifosine (inhibiteurs de PKC) - SU 5416, CGP 79787, CP-564959, ZD 6474, ZD 2171, SU-11248 (inhibiteurs de VEGF-R) - le flavopiridol, CI-202 (inhibiteurs de CDKs). 5. Composé selon l'une queconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'association entre les molécules (I) et (Il) est réalisée par une liaison covalente selon la formule (1)n (II)m, n et m étant compris entre 1 et5. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'association entre les molécules (I) et (II) est réalisée au moyen d'un élément de liaison L selon la formule (1)n L411)m, n et m étant compris entre 1 et 5, et L étant choisi parmi: - un groupement alkyle ou acyle substitué ou non; - un polymère, par exemple l'acide poly-l-glutamique, l'acide poly-d- glutamique, l'acide poly-dl-glutamique, l'acide poly-l-aspartique, l'acide poly-d-aspartique, l'acide poly-dl-aspartique, la polylysine, les polysaccharides, le polyhydroxypropyl-méthacrylamide, le dextrane, la poly(hydropropylglutamine), la poly(hydroéthylglutamine), l'acide hyaluronique, le carboxyméthyle dextrane, l'acide polyacrylique, le chitosan, la polyglycine, la polytyrosine, la polyphénylalanine, l'oxyde polypropylène (PPO), le polyéthylène glycol (PEG), les copolymères de PEG avec PPO, l'acide polyglycolique, la polyvinyl pyrolidone, l'acide polylactique, l'alcool polyvinylique; - un anticorps ou un des ses fragments, un peptide ou une protéine. 10. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la liaison entre (I) et (II) par l'intermédiaire de L peut être clivable par une enzyme, sensible au pH, détruite par la lumière ou tout autre procédé physique ou chimique. 11. Médicament, caractérisé en ce qu'il renferme, en tant que principe actif, un composé selon l'une des revendications 1 à 8. 9. Médicament selon la revendication 8, s caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement des pathologies dépendantes de l'activité protéine kinase, de préférence au traitement de dysrégulation de l'angiogénèse, de la croissance tumorale, des cancers, de l'athérosclérose, de la dégénérescence maculaire liée à l'âge, de la rétinopathie diabétique ou des maladies inflammatoires. i0 10. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme un composé selon l'une des revendications 1 à 7 associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable.