Brevet FR2867485A1 — publié le 20050916

Identification de marqueurs diagnostic pour les encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles La présente demande concerne des marqueurs biologiques des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en oeuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence d'une infection chez les mammifères, y compris en phase précoce. Les maladies à prions, également appelées encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles ou maladies à agents transmissibles non conventionnels (ATNC) sont des maladies du système nerveux central rencontrées chez certains mammifères, dont l'homme. Les formes les plus connues de ces maladies sont la tremblante du mouton chez les ovins, l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme. L'agent infectieux n'est pas encore définitivement déterminé, mais l'hypothèse la plus acceptée est que ces maladies sont associées à l'accumulation dans le cerveau d'une protéine prion (PrP) de conformation anormale par rapport à la conformation observée chez les individus sains. La découverte d'une nouvelle variante de MJC (vMJC) après l'épidémie bovine de ESB en Angleterre confirme que ces maladies sont transmissibles et vraisemblablement peuvent franchir la barrière des espèces par le biais de l'alimentation. Leur évolution lente et fatale, est associée à des lésions qui affectent exclusivement le système nerveux central. Avec la découverte de vMCJ, des mesures d'urgences ont été mises en place pour évaluer l'ampleur de l'épidémie de l'ESB et pour protéger la santé publique. L'Union européenne impose désormais le test systématique de toute viande provenant de bovins abattus et âgés de plus de 30 mois. Le temps d'incubation de l'ESB étant autour de cinq années, période durant laquelle l'infection peut se propager latéralement et verticalement, le développement d'un test diagnostic sur des animaux vivants revêt une importance vitale. Un test précoce offrirait un moyen sûr d'exclure les animaux infectés de la chaîne alimentaire. Le test utilisé aujourd'hui détecte uniquement de façon post mortem les animaux infectés à un stade tardif de la maladie. Il y a un besoin urgent de mettre sur pied un test diagnostique capable de détecter des encéphalopathies à un stade précoce chez des animaux vivants et de façon rapide. Un tel test permettrait de suivre tous les animaux à risque en les testant de multiple fois au cours de leur vie. La demande WO02/074986, appartenant au demandeur, décrit plusieurs marqueurs génétiques des encéphalopathies. Par une recherche extensive utilisant une approche innovante, différents marqueurs supplémentaires de l'ESB ont été identifiés et validés dans des expériences d'hybridation, permettant d'établir un test pré-symptomatique utilisable à partir du sang d'un mammifère vivant. Les marqueurs identifiés ont été isolés par la technique DATAS (demande de brevet n WO99/46403). DATAS identifie des différences qualitatives de l'expression de gènes et fournit une analyse systématique de l'ARN épissé entre deux conditions: sains/infecté. DATAS mène à l'identification de variants ARN fonctionnellement distincts. La technique DATAS comprend trois étapes distinctes: la collecte de tissu, l'isolement des ARNs et la construction d'un répertoire contenant des différences qualitatives et identifiant des nouveaux fragments de gènes, qui ne peuvent pas être isolés par d'autres techniques génétiques. Par comparaison de l'expression qualitative des gènes dans les cellules sanguines de mammifères sains et infectés naturellement ou expérimentalement par l'ESB, différentes signatures de marqueurs génétiques ont été isolées. Les mammifères naturellement infectés étaient au stade final de la maladie, alors que les mammifères infectés par voie orale avec 1 g de cerveaux infectés par l'ESB, représentaient le stade précoce de la maladie. La mise en oeuvre de la méthodologie DATAS sur des cellules sanguines de vaches a permis l'identification et l'isolement de plusieurs milliers de marqueurs génétiques, répartis en deux répertoires représentatifs de l'expression qualitative des gènes entre des vaches saines et des vaches infectées naturellement d'une part, et entre des vaches saines et des vaches infectées expérimentalement d'autre part. Les différents clones des deux expériences DATAS ont été déposés sur lames de verre. Les lames ont été hybridées avec des sondes produites à partir de matériel biologique de vaches infectées naturellement ou expérimentalement et de vaches saines utilisées comme contrôle. Au travers de deux types d'analyses statistiques, SAM (Significance Analysis of Microarray) et PAM (Prediction analysis of Microarray) comparant les animaux sains versus les animaux infectés, 15 clones ont été observés comme présentant une dérégulation dans les conditions sain versus infectés.Les 15 séquences d'acides nucléiques sont décrites ci-dessous comme SEQ ID NO:1-15. La présente demande fournit ainsi un ensemble de marqueurs biologiques qui peuvent être utilisés, seuls ou en combinaison(s), pour détecter, caractériser ou suivre une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un mammifère. L'invention est utile notamment pour détecter la présence de maladies à prion chez des sujets mammifères, notamment ovins, bovins ou humains. Elle est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle peut être réalisée sur des mammifères vivants, à partir de fluides biologiques tels que le sang, plasma, plaquettes, etc. Un objet de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du mammifère, d'une molécule cible choisie parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1 à 30 15 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un analogue fonctionnel d'un acide nucléique selon a) ou b), ou d) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) à c), la présence (ou l'absence) d'une telle molécule cible dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer une encéphalopathie chez ce mammifère. Dans une variante particulière de mise en oeuvre, la méthode comprend la détermination (simultanée) de la présence ou absence d'au moins, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus des molécules cibles telles que définies cidessus. La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la protéine correspondant aux séquences SEQ ID NOs: 1-15, ou un fragment de celles-ci, par exemple comportant un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.). Un analogue fonctionnel désigne plus particulièrement un analogue provenant d'une autre espèce (par exemple homme, mouton, etc.), ou un variant naturel résultant par exemple de polymorphisme, épissage, etc. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c). Différentes techniques utilisables pour détecter une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative et ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective. L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. Les sondes peuvent également être synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc. Une telle sonde constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet. De manière particulièrement préférée, on utilise un ensemble de sondes nucléiques comprenant tout ou un fragment de 5 bases consécutives au moins de chacune des séquences SEQ ID NO: 1-15, ou d'un brin complémentaire de celles-ci, avantageusement immobilisées sur un support. L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook et al). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 62 et 67 C pendant 2 à 18 heures. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0, 1% SDS. Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon à 65 C pendant 30 min. Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes (typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65 C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléique de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65 C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon. L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible selon SEQ ID NO: 1-15, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet. Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence d'un polypeptide selon d). La mise en évidence d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence du polypeptide cible dans. l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables. et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94/02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter une encéphalopathie. La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, l'échantillon est un échantillon de sang ou plasma. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.). L'invention est applicable à tout mammifère, de préférence choisi parmi les bovins, ovins et humains. La méthode de l'invention est particulièrement utile pour la détection de la tremblante du mouton chez les ovins, de l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, et de la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme. Un objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du bovin, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15 15 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) ou b). Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin ou un ovin, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du bovin ou ovin contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence ou le risque de développer une ESB chez le bovin ou ovin. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles- ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un polypeptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 15 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés cidessus. Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403). Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs acides nucléiques cibles définis en a) à c). Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats. Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles- ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci-dessus pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère. Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-15, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce. L'invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression comportant ces acides nucléiques, ainsi que toute cellule recombinante comprenant un tel vecteur ou acide nucléique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-15, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce, pour la détection (essentiellement in vitro) d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère. Selon un exemple particulier de mise en oeuvre de l'invention, on prélève un échantillon de sang d'un mammifère à tester. L'échantillon de sang est traité de manière à rendre les acides nucléiques plus accessibles, et ceux-ci sont marqués. Les aides nucléiques sont ensuite appliqués sur un produit tel que défini ci-avant et le profil d'hybridation est déterminé, permettant de diagnostiquer la présence ou non d'une encéphalopathie chez le sujet. La méthode de l'invention est simple, pratiquée ex vivo, sur des animaux vivants, et permet la détection précoce d'une maladie à prion. LISTE DE SEQUENCES SEQ ID NO: 1 EXB-NROA0576: Homologie avec NM_003576: Homo sapiens serine/threonine kinase 24 (STE20 homolog, yeast) (STK24), mRNA. 4/2003 5 1 GGTGTGGAGG TGTTCAAAGG CATTGACAAT CGGACTCAGA AAGTAGTCGC 51 CATAAAAATC ATTGACCTGG AGGAGGCAGA AGATGAGATC GAGGACATTC 10 101 AGCAGGAAAT CACAGTGCTG AGTCAGTGTG ACAGTCCCTA CGTAACCAAA 151 TATTACGGAT CCTACCTGAA GGACACTAAA TTGTGGATAA T SEQ ID NO:2 - Cluster NROA_c584_1: Homologie avec CB424646: 598918 MARC 6BOV Bos taurus cDNA 3', mRNA sequence. 3/2003 1 TATCTGCAGA ATTTCCCCTT GAGAAGCGTT ATGGGGTGCA GGTAAGTTAT 51 TACACAAGAG AAAGAAGTTT TCTTACTAAC AGCAAGATTA ATGGCACAAT 101 TCAACCAAAA CTCATATACA TTTTACTGCT TAATTTACAT ATTATTTTGG 151 TGGAAAAAAT AGTATTCTTT ATTCTTTCAG TTTCTTTATG CAAAAATACA 201 CTTCTACAGG GACATCACTT AGATGTTATG CAAACCTCCC CCCC SEQ ID NO: 3 EXB- NROA1108: Homologie avec NM_138402: Homo sapiens hypothetical protein BC004921 (LOC93349), mRNA. 4/2003 1 GAGACATTTG GCCAAAAGAG GAATTTCCAG GACACCAACA ACATCCATTA 51 TTCCATTATT CATTTGTTTC CTGAAGAGCA AACACTTCCT TGAAATTCTT 101 CTCAAATTCT GCCTCCAGTC TAAGCCCCAT TTGGCCAAAA TCATTGAACT 151 TGAAAGATGC CCTGTGGTTC TGAAAGATGA GACGCATGTC CCACACAAAC 201 CCTTCCACAT TGGAGTAGCC CTGCTCATTC AGCCTCTTCT TGATCTTGTC 251 CAGCCACATG GGCTCCTTGA GGTTTTTAGA AGCCTCTTTC ATATAATAAT 301 AATAGGGAAT CCTCACTATA ACGCT SEQ ID NO: 4 - Cluster NROA_c450_1: Pas d'homologie 1 AAGCGTTATG CAGGTAGGCC GACAAGGCGA AGTGGGATGC CGGAGAGCGG 51 CCGAGTTATT GCTCCGAGGA GACCACGTTC ACCGGTTACT ATGGCGACCG 101 CCCCATCCCG GATCACTATC AGCCGTTCAC CGCCGATGAG GCGACGTGGT 55 151 TCCAGCTCTG GGAGACGGTG AGCGAGGGCA CTCCTACGTC GCCGCCCTTC 201 GCGACGATTG AGGAACTGGC AGCCTACCTC GCCGAGTGGG GCGACTTCTG 251 TGATCACAGG CGCGCCGTCG AGTCCATGGA CGCGCGCGAG ATTGAGCGCC 301 TCCTGACGCT GAATGACCGG CACTAGTTCA AGGTGCGGCT GGGGGCAGCA 351 GCGCGCCTAA GCTTTCTGCA AGACTGGCTG GGCGCCCAGC ATGATGGTCC 401 GCGGCGGCGA GATCCTGACC AACCCTGGGG ACATGGTGTC GTCGTGACCC 451 TCGCCTAGCT CTCTCACACA CCTAGGAGGA AGAGATGACC ACCCCCAACA 501 TTCGCGGCCA CGAGACCGAA GCCAAGGCCC GCAAGGCGGC GATGAAGTGG 551 TTCACCTTCA CGGACGGCAC CAAGCCTGTC GAGGGCGTCC ACTTCCACAT 601 CAAGCAGAAC CACTTCGGGC TCTGGACCTT CCGGGAGGGC CCGGCTCCGA 651 AGTCCGCCGG ACCCCGCATC ACTCATAACG CTTCTCAA SEQ ID NO: 5 EXB-NROB1323: Homologie avec NM_000982: Homo sapiens ribosomal protein L21 (RPL21), mRNA. 5/2003 1 AGAAGCGTTA TTGCTGATAC CCGCTACATG TTCTCCAGGC CTTTCAGAAA 51 ACATGGAGTT GTTCCTTTGG CCACATACAT GCGAATCTAC AGGAAGGGTG 101 ATATTGTAGA TATCAAGGGA ATGGGTACTG TTCAAAAAGG AATGCCCCAC 151 AAATGTTACC ATGGCAAAAC TTGAAAAGTC TATAATGTCA CCCAGCATGC 201 TGTTGGCATC ATTGTAAACA AACAAGTTAA GGGCAAGATT CTTGCCAAGA 251 GAATTAATGT GCGTATCGAG CATATTAAGC ACTCTAAGAG CCGAGATAGC 301 TTCCTGAAAC GTGTGAAGGA AAATGATCAG AAAAAGAGGG AAGCCAAAGA 351 GAAAGGGACT TGGGGTTAAC ACC SEQ ID NO:6 EXB-NROA0588: Homologie avec AW325879: 17199 MARC 1BOV Bos taurus cDNA 5', mRNA sequence. 4/2001 1 GGGCGGAGGT CACCCTGGGG ATCCTCCAGG GCCAGGCCCT GGCACAACTC 51 GTCTCCATCA CACAGATGGG CCGTCGCCTG GTCGTGGCTC TCAGGAGTCA 101 GACCGGAAAA AGCCAGCCCT GGGGCAACCA GGAGCACCGA GGTGATGAGC 151 AGGACAGCCC AGGAGGTCAT GTTGAGGCAG CTGAAAGGTC TGTGCAAGTC 201 AATCATGAAG AAATTTCTCC GTACCATCAC CTCCC SEQ ID NO:7 EXB-NROB1540: Homologie avec D37952: Bovine NB10 mRNA for MHC class II (BoLA-DQB), partial cds. 2/1999 50 1 CTTGTGTAGG CAGAGGTTCC AGGGTCAGTG GAGGAAGCAG CATCACAGCC 51 AGATCCATGG TTGGGGGATG GCCACGGGAA ATGACTTGGT GACTGACTCT 101 GATCTCAGAG TGGGACAGGC TGACAGGCAT CTGGGAATTC CGGGCAAGGT 151 CAGGCACGTA TTATAGAAGA GCAAACACCA ATCCCAAAAT ATCCTCAGGA 201 ATCAGCGCAT GAGCCCCTTC TGGCTCCTGT GATGGATGAT GAGGCCCAGC 251 CCAAGGAAGA TCAGCCCCAG CACAAAGCCT CCAAC SEQ ID NO: 8 Cluster NROB_cl_- 64: Homologie avec D76416: Bovine mRNA for MHC class II DM alpha-chain (BoLA-DMA), complete cds. 2/1999 1 TCTGCAGAAT TCGCCTCTGA GAAGCGTTAT CCGTTGGACC CAANNNNNNN 20 51 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNCAAGA GAAAAGATCA 101 GAGGGTGCTG GTGTGACGTT TAAGTAGGAA AAGGCCTGGA AGGTGAGTCC 151 ATCAACCGCG GAGACAAAAG TGGGCCCGGC TCCTTCCACA GGTGCCGACT 201 GATGCTGCCA GTTCACGGTC AGTGTGGGTC AACAC SEQ ID NO: 9 EXB-NROB1371: Homologie avec NM_006098: Homo sapiens 30 guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1 (GNB2L1), mRNA. 4/2003 1 AAGCGTTATT TAGATAANNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 35 51 NNNNNNNTAC ACCCAGAGTA TTCCATAGTT TGATGGTTTT GTCTCGGGAG 101 CCAGAGACAA TTTGCCGGTT GTCAGAAGAG AAGGCCACAC TCAGCACATC 151 TTTGGTATGG CCTACAAATC GGCGAGTGGT GGTGCCCGTT GTGAGATCCC 201 AAAGGCGAAG GGTTCCATCC CAGGAGCCTG AGAGGGCAAATTGGCCATCT 251 GAGGAAATGA CCACATCACT AACAAAGTGG GAGTGACCCC GAAGAGCACG 301 CTGTGGGATA CCATAGTTGG TTTCATCTCT GGTCAGCTTC CACATAATGA 351 TGGTCTTATC TCGAGAGGCG GACGATATCA TGTCCGGGAA CTGGGGAGTG SEQ ID NO:10 - NROB_c579_1: Homologie avec D87076: Homo sapiens mRNA for KIAA0239 gene, partial cds. 1/2003 1 GGGCCAGGGG ATGATATGAA TGTCACAGGA GGAGACACCT TCTGTCTTTG 55 51 TTTCAAAGAA AGTTGATGTG CCATTTGTTA ATATACAAGA GAAATATTGA 101 AAATATATTG AAAAGAGCAA TTTTAAATTA TTTTTGGCTT ATGTTGCAAT 151 ATTTATTTTC TTGTATTAGG AAAGATTCCT TTGTAGAAAA AAAATGTATT 201 TTTCATTAAC GCAAAAACCT ATTTCTCCTT TTTGTACATT GTCCATGTTC 251 GCTACCCTTA ACGAGCAATA GAATGTATGG CTGCCTCGGG GTGGCCGGTG 301 CCCGCGTGCC CTGCATGATT CTGTGGTCCC ACCACCATGT AGCTCCCAGT 351 CCCATCCTGT CCTGCTCACT CATGGGGGTT TCCAGAGCCT AGCCCCT SEQ ID NO: 11 Cluster NROA_c125_1: Homologie avec D45359: Bos taurus mRNA 15 for MHC class II DRB3, partial cds. 1/2003 1 TGGATTGCAG GTGACTGAGA AAACCATCGA GGACAGTTTT TAAGGGGTCA 51 CTGAGCCAGG AGCAAATGAG ATCCTGAGAA AGTACTTCAT TGTGGAAGAG 101 TTAGCACTAA GCAGGAAACC TTTCCATGCT GTGAAGAAGC TGGGACAGAA 151 GGTTCTTCCT TGAGTGTGAC CATCTTCACT TCAGCTCAGG AGCCCTGTTG 201 GCTGAAGTGT AGGGCGTCCT TTCTGATTCC TGAAGTATAT TTATTAGCCC 251 CACGGCAAGG AAGAACAGAC TCAGAACGAA GCCCCCGACT CCACTCATCA 301 TCTTGCTCTG AGCAGAGTCA GACCGTGCCC TCCATTCTAC TGTGATAGGG 351 CTTGTCTGGC TGGGGTGCTC CACTTGGCAA GTGTAGACCT GGCACCA SEQ ID NO:12 Cluster NROB_c0_1: Homologie avec J01394: Bos taurus 35 mitochondrion, complete genome. 4/2001 1 GCTGTCCAAA AAGGCCTCCG TTATGGAATA ATTCTTTTTA TTATCTCCGA 51 AGTACTATTC TTTACCGGAT TTTTCTGAGC TTTCTACCAC TCAAGCCTCG 101 CCCCCACCCC TGGGGGAGGC GGCTGCTGAC CCCCAACAGG CATTCACCCA 151 CTAAACCCCC TAGAAGTCCC ACTGCTCAAC ACCTCTGTCC TATTGGCTTC 201 CGGAGTTTCT ATTACCTGAG CCCATCATAG TTTAATAGAA GGGGACCGAA 251 AGCATATATT ACAAGCCCTA TTTATCACCA TCACATTAGG AGTCTACTTC 301 ACACTACTAC AAGCCTCAGA ATACTATGAA GCACCTTTTA CTATCTCCGA 351 CGGAGTTTAC GGCTCAACTT TTTTTGTAGC CACAGGCTTC CACGGCCTCC 401 ACGTCATCAT TGGGTCCAAC AAATAACGCT TCTCNNNNNN NNNNNNTGCA 55 451 GATA SEQ ID NO:13 - Cluster NROA c1045 -1: Homologie avec BM363411: BS320054B20G01 Subtracted Lewin Cattle Spleen Bos taurus cDNA clone BS320054B20G01 5', mRNA sequence. 1/2002 1 GGGGAGGTAT CTGTCACCCA CGCAGAAATG CTTCTGACAG GCGGCANNNN 51 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 101 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN CTTGGCCGAA 151 AAGCCTGAGG TAGTCTCGGC GGCAGAGCTT CCGGCCCAGC TTGTAGTAGA 201 GGCGCCGGCC CACCTACCC SEQ ID NO: 14 Cluster NROA_c69_1: Homologie avec NM_003127: Homo sapiens spectrin, alpha, non-erythrocytic 1 (alpha-fodrin) (SPTAN1), mRNA. 4/2003 1 GAAGCGTTAT TGGAGGAGGC TAACCTAGGA GCAGAGGATC AGTTCACGAA 51 GAGCGAGCGG GTGAACTCGA CGTAGTCAAA AGCAGTGGGG AGTTCGCGGC 101 CCTTGCTGTC CACGTAGGGC TTCATGTGGG AGACGCAGTA GTCGGCTTGT 151 TCCCGAGTCA AGTTCTGGTA CAGCTCCTCC TTGGTCACAT AAGGCTTCCC 201 TTCAGAGCTC ACGGCCCGGA AGGCGCTCTC AATCTCCTCG CTGGACTTGA 251 CGTTCTCCGT CTCACGGCTG ATCATAAAGG ACATGTACTC TTGCATGGAG 301 ACGTGGACGT CCCTGTTAGG ATCCACAGTG TCCAAGATGG ACTCGAACTC 351 AAGGTCGGGC TCCCCTTCCT CCAACATGGG CAGGTC SEQ ID NO: 15 Cluster NROBcl_12: Homologie avec BM431390: lDuol5D10 Bos taurus Duodenum #1 library Bos taures cDNA, mRNA sequence. 1/2002 1 TCTGCAGAAT TCGCCTTTGA GAAGCGTTAT GGGGGCGAGG TGGTAAAGGA 51 AGCTTACAAA ACAACTATTC TTTAAAAAAA AACAAAAAAA CAAAAAAGCA 101 AAAAACAGCA AAAGCCAACC GGCCCAATTT TGTCTCCAGT TTTCAACGTG 151 TGCTTTCGAG CATTTCAGCT GTTTCCAGTT ACTTTAGTTT CCAGATATTA 201 GTCTTCCATT TAGTTTTAAG ACTAAATCTC ACTTTTGGAT AAACACAAGG 251 AAATATTTTA CTTGCTGAAA AATCACTTTA CTGGATAAAG TTACCTCTTA 301 TGCCTTTCAG TTTTCTAATC CAACTTTCTG ACAACCAGTG GTAATTAGGA 351 AGTTCTAAGT TGCAGTTGTC CCTATGACTT TGGGCTTCCC TGGTGGCTCA 55 401 GCTGGTCAAA AATCTGCCTG CAATGCGGGA GACCTCCACC CCATAACGCT 451 TCTCAAAGGC GAATTCTGCA GA 17 REVENDICATIONS 1. Méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, d'une molécule cible choisie parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un analogue d'un acide nucléique selon a) ou b) provenant d'une autre espèce ou un variant naturel d'un tel acide nucléique, ou d) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) à c), la présence d'une telle molécule cible dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer une encéphalopathie chez ce mammifère. 2. Méthode selon la revendication 1, comprenant la détermination (simultanée) de la présence d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus des molécules cibles. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective. 4. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un polypeptide selon d) au moyen d'un anticorps spécifique ou d'un fragment ou dérivé de celui-ci. 5. Méthode selon la revendication 1, pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du bovin, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, 2867485 18 b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) ou b). 6. Méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin ou un ovin, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du bovin ou ovin contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence ou le risque de développer une ESB chez le bovin ou ovin. 7. Utilisation d'une sonde nucléique spécifique d'un acide nucléique cible tel que défini dans la revendication 1, ladite sonde comprenant de 5 à 400 bases, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet. 8. Utilisation d'une amorce nucléique permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique cible tel que défini dans la revendication 1, ladite amorce étant simple-brin, d'une longueur comprise entre 5 et 50 bases, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet. 9. Produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. 10. Produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un polypeptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 15 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. 2867485 19 11. Kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 15, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. 12. Utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1-15, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet mammifere.