Brevet FR2864966A1 — publié le 20050715

La présente invention est relative à des souches mutantes atténuées d'Apicomplexes de la famille des Sarcocystidae, tels que Toxoplasma et Neospora, et à leurs utilisations vaccinales. Le phylum des Apicomplexes (embranchement Apicomplexa), regroupe un grand nombre de parasites majoritairement intracellulaires. Ces parasites sont responsables de maladies telles que la toxoplasmose, la malaria, la néosporose, la coccidiose et la cryptosporidiose. Ils ont en commun un processus spécifique d'invasion de cellules hôtes en plusieurs étapes, conduisant à la formation d'une vacuole parasitophore dans laquelle le parasite se développe (MENARD et al., Cell Microbiol. 3: 63-73, 2001; SOLDATI et al., Int. J. Parasitol. 31: 1293-1302, 2001). Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, responsable de la toxoplasmose humaine et animale. Il appartient à la famille des Sarcocystidae qui regroupe également d'autres pathogènes majeurs de l'homme et de l'animal, tels que Neospora ou Sarcocystis (LEVINE, The Protozoan Phylum Apicomplexa. Vol.1, CRC Press, Boca Raton, FL, p.203, 1988; TENTER et al., Int. J. Parasitol. 32(5) : 595-616, 2002). Son cycle de vie présente deux aspects distincts: un cycle asexué chez un hôte intermédiaire, tel que l'homme, la souris, les ovins et les porcins, conduisant à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant des bradyzoïtes; et un cycle sexué chez le chat conduisant à la production d'oocystes (contenant des sporozoïtes) éliminés dans les fèces. La toxoplasmose animale pose un problème économique important dans le domaine de l'élevage agricole. Elle atteint tous les animaux de rente. La transmission à ces animaux se fait par l'ingestion d'oocystes, formes de résistance émises dans l'environnement par des chats infectés par un toxoplasme pathogène. Chez les ovins, les caprins et les porcs infectés pendant la gestation, elle provoque des avortements. Dans l'Union Européenne dont le cheptel ovin est estimé à 100 millions de têtes, 1 million d'agneaux sont perdus chaque année du fait d'avortements toxoplasmiques. Par ailleurs la consommation de viande (surtout mouton et porc) infectée par la présence de bradyzoïtes, est la principale source des infections humaines. Contractée pendant la grossesse, la toxoplasmose est la 2ème cause des malformations congénitales. En outre, au cours des vingt dernières années, ce parasite est apparu comme un pathogène opportuniste, à l'origine d'encéphalites chez les patients sidéens. La mise au point de vaccins conférant une protection contre les parasitoses à Apicomplexa, fait l'objet de nombreuses recherches. Deux stratégies principales sont employées: 1) l'identification d'antigènes parasitaires capables d'induire une réponse immune protectrice, et l'incorporation de ces antigènes dans des compositions vaccinales; 2) la sélection de souches de parasites atténuées. Par exemple, dans le cas de la toxoplasmose, il a été proposé d'utiliser différentes souches atténuées de Toxoplasma gondii (Brevet US 5,045,313; Brevet US 4,473,549; Demande de Brevet US 2002/0164754; Demande de Brevet GB 2 204 323), pour conférer aux mammifères une immunité anti-toxoplasmes. Les étapes clefs de l'infection par les Apicomplexes, et en particulier par Toxoplasma gondii, sont l'attachement du parasite aux cellules-hôtes, suivi de l'invasion de celles-ci. L'appareil invasif des Apicomplexes implique l'exocytose séquentielle de deux types d'organelles sécrétoires: les micronèmes et les rhoptries. De récentes études ont mis en évidence le rôle central des micronèmes dans la reconnaissance des cellules- hôtes, et l'adhésion à celles-ci. Les protéines des micronèmes, désignées sous l'appellation générique MICs contiennent des modules homologues aux domaines d'adhésion de protéines d'eucaryotes supérieurs (TOMLEY et SOLDATI, Trends Parasitol. 17: 81-88, 2001). Une douzaine de protéines MICs sont actuellement connues chez Toxoplasma gondii (SOLDATI et al., Int. J. Parasitol. 31: 1293-1302, 2001). Certaines d'entre elles sont des protéines transmembranaires, par exemple MIC2 de Toxoplasma gondii, dénommée TRAP chez Plasmodium (MATUSCHEWSKI et al., EMBO J. 21: 1597-1606, 2002) ; les autres sont des protéines solubles qui sont ciblées vers les micronèmes et redistribuées à la surface du parasite au cours de l'invasion, en association avec les protéines transmembranaires. Récemment, deux protéines solubles MIC1 et MIC3, capables de se lier à la surface de cellules hôtes, ont été caractérisées chez T. gondii (ACHBAROU et al., Mol. Biochem. Parasitol., 47, 223-233, 1991; FOURMAUX et al., Mol. Biochem. Parasitol. 83: 201-210, 1996; GARCIA-REGUET et al., Cell. Microbiol. 2: 353-364, 2002). La protéine MIC1 contient un domaine dupliqué en tandem possédant une lointaine homologie avec le domaine de type TSP-1 de TRAP, et présente une spécificité de liaison au lactose (LOURENCO et al., Glycobiol. 11: 541-547, 2001). La protéine MIC3 est un dimère de poids moléculaire apparent de 90 kDa formé de deux sous-unités de 38 kDa reliées par des ponts disulfures. MIC3 contient cinq domaines de type EGF dont deux sont chevauchants, et un domaine de type domaine de liaison à la chitine , riche en ponts disulfures, et qui apparaît nécessaire pour la liaison à la surface de la cellule hôte (GARCIA-REGUET et al., 2000, précité; CEREDE et al., EMBO J. 21: 2526-2536, 2002). MIC1 et MIC3 s'associent à d'autres protéines MICs pour former deux complexes indépendants, MIC1/4/6 et MIC3/8. Les protéines transmembranaires MIC6 et MIC8 jouent le rôle de transporteurs pour cibler respectivement les protéines MIC1/4 et MIC3 vers les micronèmes. La protéine MIC1 est indispensable pour que le complexe MIC1/4/6 puisse quitter les compartiments précoces de la voie de sécrétion (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001). Il a récemment été montré que la protéine MIC3 de Toxoplasma gondii constitue un antigène vaccinal majeur, suscitant une réponse immunitaire humorale précoce et très forte (Demande PCT WO 01/64243). Dans le but d'étudier le rôle de MIC1 et MIC3 dans la capacité d'invasion et la virulence de Toxoplasma gondii, les Inventeurs ont construit des souches mutantes de T. gondii, dans lesquelles l'une et/ou l'autre des adhésines MIC1 et MIC3 ont été inactivées. Ils ont constaté que l'inactivation de MIC1 diminue d'environ 50% la capacité d'invasion des fibroblastes in vitro, alors que celle de MIC3 ne modifie pas cette capacité d'invasion; l'inactivation simultanée des deux protéines ne modifie pas significativement la capacité d'invasion par rapport à l'inactivation de MIC1 seule. La virulence in vivo n'est que très peu affectée par l'inactivation isolée de MIC1 et MIC3; en revanche, elle est fortement diminuée par l'inactivation simultanée des deux protéines. Les Inventeurs ont en outre constaté que malgré l'absence des antigènes majeurs que constituent MIC1 et MIC3, une souche double mutante de Toxoplasma gondii dans laquelle ces deux protéines sont inactivées permet d'obtenir une protection vaccinale efficace vis-à-vis de la toxoplasmose. Ils ont ensuite entrepris d'étudier les caractéristiques infectieuses et protectrices de ladite souche sur l'animal, en particulier sur les souris et les brebis. Ils ont ainsi mis en évidence que la vaccination par cette souche protège les animaux contre la formation de kystes cérébraux lors d'une réinfection par une souche sauvage pathogène de Toxoplasma gondii; ce qui diminue considérablement la portée d'une infection par cette souche sauvage pathogène, le risque de passage transplacentaire dans le cas de femelles gestantes, et la possibilité de transmission par consommation de la viande des animaux vaccinés, et donc à terme permet de faire baisser la prévalence générale de l'infection. La présente invention a donc pour objet une souche mutante d'un Apicomplexe de la famille des Sarcocystidae, comprenant une mutation inactivant l'adhésine MIC1 et une mutation inactivant l'adhésine MIC3. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit Sarcocystidae est choisi parmi Toxoplasma et Neospora. Selon une disposition préférée de ce mode de 5 réalisation ladite souche mutante est une souche de toxoplasme, notamment de Toxoplasma gondii. On entend ici par: - mutation inactivant l'adhésine MIC1 toute mutation résultant dans l'absence d'expression de MIC1, ou dans l'expression d'une protéine MIC1 non-fonctionnelle, c'est-à-dire incapable de former un complexe avec les protéines MIC4 et MIC6, ou incapable de lier le lactose. - mutation inactivant l'adhésine MIC3 toute mutation résultant dans l'absence d'expression de MIC3, ou dans l'expression d'une protéine MIC3 non-fonctionnelle, c'est-à-dire ayant perdu sa fonction de liaison à la surface d'une cellule-hôte. Des exemples de mutations résultant dans l'absence d'expression de MIC1 ou de MIC3 sont notamment la délétion de la totalité du gène correspondant, ou de sa région codante, ou de sa région promotrice. Des exemples de mutations résultant dans l'expression d'une protéine MIC3 nonfonctionnelle sont notamment des mutations affectant la région du gène mica codant pour le domaine de type: domaine de liaison à la chitine de la protéine MIC3 , à savoir les acides aminés 84-144 de ladite protéine. Il peut s'agir notamment de mutations affectant au moins le tryptophane en position 126 ou la phénylalanine en position 128 de la protéine MIC3. Ces mutations peuvent être effectuées de manière classique par insertion, délétion, ou substitution d'une ou plusieurs bases au niveau de la séquence visée. A titre d'exemples non-limitatifs de techniques de mutagenèse et de transformation utilisables chez les toxoplasmes, on citera notamment celles décrites dans les publications suivantes: KIM et al., (Science 262: 911-914, 1993) ; DONALD et ROOS, (Mol. Biochem. Parasitol. 63: 243- 253, 1994) ; SOLDATI et al., (Mol. Biochem. Parasitol. 74: 87-97, 1995) ; DONALD et ROOS, (Mol Biochem. Parasitol. 91: 295-305, 1998) . La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une souche mutante d'Apicomplexa, et notamment de toxoplasme, conforme à l'invention, pour l'obtention d'un vaccin destiné à conférer une immunité protectrice contre une parasitose à Apicomplexa, en particulier contre la toxoplasmose. La présente invention a aussi pour objet un vaccin caractérisé en ce qu'il comprend en tant que principe actif, une souche mutante d'Apicomplexa et notamment de toxoplasme, conforme à l'invention, telle que définie précédemment. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction de mutants de Toxoplasma gondii dans lesquels MIC1 et/ou MIC3 sont inactivées, et d'utilisation vaccinale d'un double mutant dans lequel MIC1 et MIC3 sont inactivées. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: INACTIVATION DE MIC1 ET/OU MIC3 CHEZ T. GONDII. 25 Plasmides utilisés: Les plasmides pmic3KO-1 et pmic3KO-2 ont été utilisés respectivement pour construire le simple mutant mic3KO à partir de la souche RHhxgprt- et le double mutant micl-3K0 à partir de la souche mic1KO. Les plasmides pM3MIC3ty et pM2MIC1myc + pM3MIC3 été utilisés respectivement pour restaurer l'expression de MIC3 dans le mutant mic3KO (souche mic3KO+MIC3), et pour restaurer l'expression de MIC1 et MIC3 dans le double mutant micl-3K0 (souche micl-3KO+MIC1-3) Plasmide pmic3KO-1 La région 3'UTR du gène Mica (2136 pb) a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pBlueMIC3 (CEREDE et al., 2002, précité), qui résulte de l'insertion d'un fragment d'ADN génomique de 2247 pb (GenBank AJ132530) de T.gondii au site NotI du plasmide pBluescript II SK(-). Pour l'amplification, les amorces ML9: 5'-GTGTAAGCTTCAGCGAGTCTCTGAGAG-3' (SEQ ID NO: 1) et ML10: 5'- GGGGTACCGAGCTCATGAGCAGAAGCTGCCAG-3' (SEQ ID NO: 2) ont été utilisées. La zone amplifiée a été clonée entre les sites de restriction Hindlll et KpnI du plasmide pminiHXGPRT (DONALD ET ROOS, 1998, précité). Un fragment d'ADN de 1977 pb de la région 5'UTR de Mic3, a été obtenu par digestion XbaI/NheI d'un fragment EcoRI de 3,5 kb de la séquence génomique en 5' de Mic3, et cloné au site Xbal de pminiHXGPRT. Le plasmide résultant, qui contient le marqueur de sélection HXGPRT (hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyl transférase), encadré par les régions flanquant en 3' et 5' l'ORF de mic3, a été dénommé pmic3KO-1. Plasmide pmic3KO-2 Les régions 3'UTR et 5'UTR de mic3, obtenues comme décrit ci-dessus, ont été insérées dans le plasmide pTUB/CAT (KIM et al., 1993, précité), de part et d'autre de la séquence codant pour le marqueur de sélection chloramphénicol acétyl transférase (CAT), aux mêmes sites de restriction que ceux décrits pour le plasmide pmniHXGPRT. Le plasmide résultant, contenant le marqueur de sélection CAT, encadré par les régions flanquant en 3' et 5' l'ORF de mic3, a été dénommé pmic3KO-2. Plasmide pM3MIC3ty Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pT8GFPPfmyoAtail (HETMANN et al., Mol. Biol. Cell 11: 1385-1400, 2000), dans lequel a été ajouté un épitope TY (BASTIN et al., Mol. Biochem. Parasitol. 77(2) : 235-239, 1996) entre les sites NsiI et PacI. Ce plasmide contient le promoteur de la tubuline entre les sites KpnI et EcoRI et le gène codant pour la GFP bordé des sites EcoRI et NsiI. La région du promoteur de Mic3 (562 pb) a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pBlueMIC3 avec les amorces ML23: 5'CTGAATTCAGATCTTACCAGTGTTGGACAAGG-3' (SEQ ID NO: 3) et ML24: 5'GGGGTACCCCTTGCTAGGTAACCACTCGTGC-3' (SEQ ID NO: 4), et insérée à la place du promoteur de la tubuline aux sites KpnI et EcoRI. L'amorce ML24 permet d'introduire un site de restriction Bg1II en amont du site EcoRI et de cloner ensuite le gène Mica à la place du gène codant pour la GFP aux sites BgllI et Nsil. La séquence codant pour MIC3 a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pBlueMIC3 avec les amorces ML11: 5'-GCACAATTGAGATCTAAAATGCGAGGCGGGACGTCC3' (SEQ ID NO: 5) et ML15: 5'-TGCTATGCATTCCTAGGCTGCTTAATTTTCTCACACGTCAC3' (SEQ ID NO: 6) introduisant respectivement les sites de restriction BglII et Nsil. Plasmides pM2MIClmyc et pM3MIC3 Le plasmide pM2MIClmyc (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001) exprime la protéine MIC1, étiquetée par l'épitope myc à son extrémité C-terminale, sous le contrôle des séquences flanquantes en 5' et en 3' du gène Mic2 Le plasmide pM3MIC3 a été construit par clonage d'un fragment Pvul/Sacl de 2072 pb du vecteur pBlueMIC3, contenant le gène Mic3 et ses régions flanquantes en 5' et en 3', entre les sites Sacl et Pacl du vecteur pT/230-TUB5/BLE (SOLDATI et al., Mol. Biochem. Parasitol. 74: 87-97, 1995) contenant une cassette d'expression exprimant le marqueur de sélection à la phléomycine. Construction des souches mutantes mic3KO et micl-3KO, et des souches mutantes complémentées mic3KO+MIC3, et micl-3KO+MIC1-3 L'haploïdie du génome des Apicomplexes lors de la phase proliférative permet l'invalidation du gène Mic3, en une seule recombinaison homologue. Tous les T. gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 g/ml de streptomycine. Ils ont été récoltés lors de la lyse des cellules hôtes. Souche mic3KO La souche de T. gondii utilisée pour la mutagenèse est la souche RHhxgprt- (DONALD et ROOS, 1998, précité), déficiente pour le gène de l'hypoxanthine-xanthineguanine phosphoribosyl transférase (HXGPRT), et de ce fait sensible à l'acide mycophénolique. 80-100 g de plasmide pmic3KO-1 purifié puis linéarisé par KpnI ont été ajoutés à 10' tachyzoïtes RHhxgprt- mis en suspension dans du milieu d'électroporation CYTOMIX (VAN DEN HOFF et al., Nucleic Acids Res. 20: 2902, 1992), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 l sur appareil BTX Electrocell Manipulator (Paramètres: 2 kV, R=48 ohms). Après électroporation, les tachyzoïtes ont été déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le lendemain de l'électroporation, le milieu de culture a été supplémenté par l'agent de sélection (25 pg/ml d'acide mycophénolique et 50 g/ml de xanthine), et trois passages en culture sont effectués dans ce milieu. Cinq jours après le dernier passage, les parasites sont clonés par dilution limite dans les puits d'une plaque à 96 puits de cellules HFF, en présence d'agent de sélection, et les clones retenus sont amplifiés. Souche micl-3KO La souche de T. gondii utilisée pour la mutagenèse est la souche mic1KO (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001) qui dérive de la souche RHhxgprt- décrite ci-dessus par délétion du gène Mic1 remplacé par le gène codant pour l'HXGPRT dans la souche mic1KO. 80-100 g de plasmide pmic3KO-2 purifié puis linéarisé par KpnI ont été ajoutés à 10' tachyzoïtes mic1K0 35 pour une électroporation dans les conditions décrites ci- dessus. Les mutants ont été sélectionnés et clonés comme décrit ci-dessus, en présence de 20 pM de chloramphénicol comme agent de sélection. Les mutants dans lesquels MIC3 a été inactivée 5 sont dénommés mic3KO, et ceux dans lesquels MIC1 et MIC3 ont été inactivées sont dénommés micl-3K0. Souche mic3KO+MIC3 L'expression de MIC3 a été restaurée par cotransfection des parasites mic3KO avec 100 pg du vecteur 10 pM3MIC3ty, et 10 pg du plasmide pTUB/CAT. La sélection a été effectuée en présence de 20 gM de chloramphénicol comme décrit ci-dessus. La souche mic3KO complémentée par MIC3 est dénommée mic3KO+MIC3. Souche micl-3KO+MIC1-3 L'expression de MIC1 et MIC3 a été restaurée par co-transfection des parasites micl-3K0 avec 100 g du vecteur pM2MIC1myc, et 10 pg du plasmide pM3MIC3. Les mutants ont été sélectionnés et clonés comme 20 décrit ci-dessus, en présence de 10 pg/ml de phléomycine comme agent de sélection. La souche micl-3K0 complémentée par MIC1 et MIC3 est dénommée micl-3KO+ MIC1-3. Les protéines totales des mutants mic3KO, micl- 3KO, mic3KO+MIC3, et micl-3KO+MIC1-3 ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE et transfert de Western. Après extraction des protéines totales par ébullition des cellules dans du tampon SDS (en présence ou non de DTT 0,1 M) et séparation sur gels de polyacrylamide 10%, les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose. Les transferts de Western ont été marqués comme décrit par GARCIA-REGUET et al. (1998, précité) à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-MIC3 (T42F3 au 1:400) et anti-MIC1 (T101F7) puis détectés par des IgG de chèvre anti-souris conjugués à la phosphatase alcaline (1:1000). Les résultats sont présentés dans la Figure 1. Légende de la Figure 1: 1 = souche sauvage de Toxoplasma gondii RH 2 = mutant mic3K0 3 = mutant mic3KO+MIC3 4 = mutant miclKO (REISS et al., 2001) 5 = mutant miclKO+MIC1 (REISS et al., 2001) 6 = mutant micl-3K0 7 = mutant micl-3KO+MIC1-3 Les résultats montrent que l'expression de MIC3 est indétectable dans mic3KO (2) et micl-3K0 (6) mais est restaurée dans mic3KO+MIC3 (3) et micl-3KO+MIC1-3 (7). L'expression de MIC1 est indétectable dans mic1KO (4) et micl-3K0 (6) mais est restaurée dans miclKO+MIC1 (5) micl-3KO+MIC1-3 (7). Ces résultats ont été confirmés par immunofluorescence. Les tachyzoïtes cultivés une nuit sur monocouche de cellules HFF, ont été lavés en PBS,et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 20 min. Après 3 lavages, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min, la réaction a été arrêtée par 10% de sérum de b uf foetal (FBS) pendant 30 min., puis les cellules ont été incubées avec l'anticorps primaire (mAb anti-MIC1 T101F7, mAb anti-MIC3 T42F3) dilué dans 2% FBS pendant 40 min., lavées et puis incubées avec un anticorps secondaire (chèvre anti-souris couplé au FITC, et rouge Texas chèvre anti-lapin). Les observations ont été réalisées sur un microscope Leica DMRA2 équipé pour l'épifluorescence et les images ont été enregistrées avec une caméra Princeton coolSNAP CCD. Les résultats montrent qu'aucune protéine MIC3 n'est détectable dans des tachyzoïtes mic3KO, alors qu'une expression de MIC3de type sauvage est observée dans les micronèmes des souches complémentées (mic3KO+MIC3, micl3KO+MIC1-3). La complémentation de MIC1 dans miclKO+MIC1 et micl-3KO+MIC13 conduit à une certaine accumulation de MIC1 dans la vacuole parasitophore et dans l'espace périnucléaire. EXEMPLE 2: EFFETS DE L'INACTIVATION DE MIC1 ET/OU MIC3 SUR LES PROPRIETES INFECTIEUSES DE T. GONDII Les mutants de Toxoplasma gondii décrits à l'exemple 1 ci-dessus, ont été entretenus par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ig/ml de streptomycine. Capacité d'invasion 2x105 tachyzoïtes de miclKO, miclKO+MIC1, mic3K0 et micl-3K0 purifiés ont été ajoutés à des cellules HFF cultivées sur des lamelles couvre-objet en verre. Les cellules ont été fixées pendant 12h puis colorées en utilisant un mélange bleu de méthylène-éosine (kit RAL 555), et montées sous lamelles, de façon permanente (PERTEX, Microm, France). Le nombre de vacuoles parasitaires, représentant la capacité d'invasion du parasite, a été compté dans 10 champs sélectionnés aléatoirement par lamelle, et les données ont été présentées comme la moyenne de vacuoles par champ provenant de 4 lamelles, sur la base de 5 répétitions indépendantes. Le contrôle a été réalisé dans les mêmes conditions avec la souche RHhxgprt-, dont la capacité d'invasion est comparable à celle de la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii. Les résultats sont présentés dans la Figure 2 (*** = invasion significativement inférieure, p Les résultats montrent que la capacité d'invasion des parasites miclKO est diminuée d'environ 50% par rapport à celle de la souche contrôle RHhxgprt-. En revanche, la capacité d'invasion des parasites mic3KO et de ceux de la souche contrôle est comparable (Figure 2A). La capacité d'invasion des parasites micl-3K0 n'est pas significativement différente de celle des mutants miclKO (Figure 2A), indiquant que MIC1 et MIC3 n'ont pas de fonction additive dans l'invasion des fibroblastes par Toxoplasma gondii. La complémentation de miclKO par MIC1 restaure la capacité d'invasion à un niveau comparable de celui de la souche contrôlé (Figure 2B). Virulence Les souris meurent généralement 9 jours après une infection par voie intrapéritonéale par 20 tachyzoïtes de la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii. L'étude de la virulence des mutants miclKO, mic3KO, micl-3K0, mic1KO+MIC1, mic3KO+MIC3 et micl-3KO+MIC1-3 a été réalisée sur un lot de 10 souris mâles OF1 par injection intrapéritonéale de 20 tachyzoïtes/souris de la souche micl-3K0, et en suivant le devenir des souris infectées. Les contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions sur un lot de 9 souris mâles OF1 en utilisant la souche RHhxgprt-, dont la virulence est comparable à celle de la souche sauvage RH de Toxoplasma gondi. Les résultats sont représentés par la Figure 3. Légende des Figures 3A, 3B et 3C: É = souche miclKO (A); souche mic3KO (B); souche micl-3K0 (C) ^ = souche miclKO+MIC1 (A) ; souche mic3KO+MIC3; souche micl-3KO+MIC1-3 (C) 8 = souche RHhxgprt (A, B et C) Toutes les souris infectées par la souche RHhxgprt- sont mortes 9 jours après l'infection. Les souris infectées par miclKO ou mic3KO présentent un léger retard de la mortalité (mort des souris entre 9 et 22 jours après l'infection), qui n'est pas observé dans le cas des souris infectées par les mutants complémentés mic1KO+MIC1 et mic3KO+MIC3. Une seule des souris infectée par mic3KO est demeurée en vie 44 jours après infection, et cet animal a développé une réponse anticorps spécifique de T. gondii (résultats non présentés). Ces résultats indiquent que l'inactivation isolée des gènes Mici ou Mica ne conduit qu'à une légère diminution de la virulence chez les souris. En revanche, dans le cas des souris infectées par la souche micl-3K0, on observe une survie quasi totale (90% de survie 40 jours après l'infection) . La complémentation de micl-3K0 par MIC1 et MIC3 (souche micl-3KO+MIC1-3) restaure complètement la virulence des parasites. Les souris ont également été infectées avec différentes quantités du double mutant micl-3K0 et la dose létale (DL100) de micl-3K0 a été comparée avec celle de la souche contrôle RHhxgprt-. Alors que la DL100 à 9 jours de la souche contrôle est inférieure à 20 tachyzoïtes, celle de la souche micl-3K0 est de l'ordre de 2x103 tachyzoïtes. EXEMPLE 3: IMPLICATION DE LA FONCTION D'ADHESION DE MIC3 DANS LA VIRULENCE DE TOXOPLASMA GONDII Détermination de résidus impliqués dans la fonction 15 d'adhésion de MIC3 Il a été montré (CEREDE et al., 2002, précité) que le domaine de type domaine de liaison à la chitine , de MIC3 est essentiel pour la liaison à la surface de la cellule hôte. Différentes mutations ont été introduites dans ce domaine, afin de déterminer les résidus essentiels à la fonctionnalité de MIC3. Les mutations effectuées sont les suivantes: -substitution de l'un des résidus cystéine aux 25 positions 102 (mutant C102G), 107 (mutant C107G), 108 (mutant C108G), par un résidu glycine; -substitution du résidu proline en position 103 par un résidu alanine (mutant P103A) ; -substitution de l'un des résidus sérine aux 30 positions 109 (mutant S109A) et 130 (mutant S130A) par un résidu alanine; -substitution de l'un des résidus tyrosine aux positions 96 (mutant Y96A), 135 (mutant Y135A), et 141 (mutant Y141A), par un résidu alanine; -substitution de l'un des résidus phénylalanine aux positions 97 (mutant F97A), 121 (mutant F121A), et 128 (mutant F128A) , par un résidu alanine; -substitution du résidu tryptophane en position 126 par un résidu alanine (mutant W126A). Les positions des mutations sont indiquées par référence à la séquence polypeptidique du précurseur de MIC3 (Genbank CAB56644). Les mutations ont été effectuées par mutagenèse dirigée par PCR (Quickchange , Stratagène), de la séquence codant pour la forme mature de MIC3, contenue dans le plasmide pOC2 (CEREDE et al., 2002, précité). Les plasmides obtenus sont respectivement dénommés pC102 (mutant C102G), pC107 (mutant C107G), pC108 (mutant C108G), pP103 (mutant P103A), pS109 (mutant S109A), pS130 (mutant S130A), pY96 (mutant Y96A), pF97 (mutant F97A), pF121 (mutant F121A), pW126 (mutant W126A), pF128 (mutant F128A), pY135 (mutant Y135A), et pY141 (mutant Y141A). Les plasmides ont été purifiés en utilisant le kit Qiagen kit (Qiagen), et la présence des mutations attendues vérifiée par séquençage. Les protéines MIC3 mutantes ont été exprimées par transfection de cellules BHK-21 (Baby Hamster Kidney, ATCC CCL-10) cultivées dans du milieu BHK-21 (Gibco-BRL) supplémenté avec du sérum de veau foetal (FCS) 5%, 2 mM de tryptose, 100 U/ml de pénicilline et 100 1_1g/m1 de streptomycine. Pour chaque plasmide, 3x105 cellules BHK-21 préalablement cultivées surdes lamelles couvre-objet pendant 24h dans des plaques 24 puits, ont été transfectées avec le plasmide purifié, à l'aide de Lipofectamine , selon les conditions préconisées par le fabricant (Gibco-BRL). Les cellules ont été cultivées 24h de plus avant l'analyse. Les propriétés de liaison des protéines MIC3 mutantes ont été étudiées en analysant leur localisation dans les cellules BHk-21 transfectées. Les cellules BHK-21 transfectées ont été fixées par du paraformaldéhyde 3% dans du PBS pendant 15 min, puis lavées et perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min. Les lamelles portant les cellules ont ensuite été lavées dans du PBS contenant 0,5% de SAB, et incubées pendant 1h dans le même tampon contenant un anticorps anti-MIC3 (T82C10, 1:200) ou anti-V5 (1:500), puis pendant 1h avec une IgG de chèvre conjuguée à la TRITC (Sigma, 1:400), avec plusieurs lavages en PBS entre chaque incubation. Les lamelles ont ensuite été lavées et montées sur des lames de microscope. La visualisation a été effectuée à l'aide d'un microscope à épifluorescence. Quatre catégories de mutants ont été définies selon leur localisation. Dans la première catégorie (mutants C102G, C107G, C108G, Y141A, F121A), la protéine est retenue dans le système sécrétoire; dans la seconde catégorie (Y135A, Y96A, F97A, S109A, P103A) la protéine est sécrétée normalement et se lie à la surface des cellules transfectées, comme le fait la protéine MIC3 mature de type sauvage; dans la troisième catégorie, (W126A, Y128A) la protéine est sécrétée normalement mais ne se lie pas à la surface des cellules transfectées; dans la quatrième catégorie (S130A), la protéine est sécrétée normalement et se lie à un réseau de matériel cellulaire déposé par les cellules à la surface des plaques de verre. Ces résultats montrent que toutes les mutations affectant un résidu cystéine conduisent à un défaut majeur de sécrétion; les protéines MIC3 mutantes correspondantes s'accumulent sous forme de larges vésicules périnucléaires, indiquant que ces protéines sont mal repliées ou assemblées de manière incomplète. Ce résultat est cohérent avec le rôle des cystéines dans le repliement du domaine. En ce qui concerne les autres substitutions, les deux mutations F121A et Y141A affectent également la sortie des protéines. Les autres mutants (Y135A, Y96A, F97A, S109A, P103A, W126A, F128A, S130A) sont tous exprimés sous forme de dimère et sécrétés. Deux d'entre eux (W126A, Y128A) ne se lient pas aux cellules BHK-21 transfectées. Du fait de la perte de ces propriétés de liaison, ces deux mutants sont abondamment sécrétés dans le surnageant. Dans le cas du mutant S130A, le marquage par les anticorps anti-MIC3 n'est pas associé avec la membrane plasmatique de la cellule transfectée, comme dans le cas de la protéine MIC3 de type sauvage, mais avec l'espace intercellulaire, comme si la protéine R-MIC3 S130A était liée au matériel cellulaire déposé sur les plaques. Ces résultats montrent que les deux résidus aromatiques W126 et Y128 sont impliqués dans l'interaction avec le récepteur de la surface de la cellule hôte, et que le résidu S130 pourrait également contribuer aux propriétés de liaison de MIC3en participant à la spécificité d'interaction. Implication des résidus W126 et Y128 dans la virulence de T. gondii. Pour étudier le rôle de la fonction d'adhésion de MIC3 dans la virulence de T. gondii, des expérimentations de complémentation de la souche double mutante micl-3K0 par les mutants W126A et F128A ont été effectuées. Les plasmides pM3MIC3W126A, pM3MIC3F128A, et pM3MIC3Y135A, ont été construits à partir du plasmide pM3MIC3. Ces plasmides portent le gène de sélection à la phléomycine, et expriment respectivement les mutants W126A, F128A, et Y135A. La présence des mutations attendues a été vérifiée par séquençage. La souche micl-3K0 a été transfectée par les plasmides pM3MIC3W126A (souche micl-3KO+MIC3W126A) ou pM3MIC3F128A (souche micl-3KO+MIC3F128A). A titre de contrôles de liaison positifs la souche micl-3KO+MIC3 et la souche micl-3K0 transfectée par le plasmide pM3MIC3Y135A (micl-3KO+MIC3Y135A)ont été utilisées L'expression des protéines MIC3 dans les différentes souches a été analysée par transfert de Western, et leurs propriétés de liaison ont été analysées par transfert de cellules. Le transfert de cellules a été réalisé avec un double de la feuille de nitrocellulose utilisée pour le transfert de Western, incubée avec une suspension de cellules Mode-K (VIDAL et al., J. Immunol. Methods 166: 6373, 1993) cultivées dans du milieu RPMI (Bio Whittaker) supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (FCS), 25 mM d'Hepes, 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 g/ml de streptomycine. Les résultats sont présentés dans les Figures 4A (transfert de Western) et 4B (transfert de cellules). Légende des Figures 4A et 4B: 1 = souche sauvage de Toxoplasma gondii RH 2 = souche micl-3KO+MIC3 3 = souche micl-3KO+MIC3W126A 4 = souche micl-3KO+MIC3F128A 5 = souche micl-3KO+MIC3Y135A Les résultats du transfert de Western montrent l'expression de protéines MIC3 dans toutes les souches. Toutes ces protéines migrent à la taille attendue pour un dimère en conditions réductrices. Cependant, les protéines W126A et Y135A ont migré plus vite que les autres, ce qui suggère une modification de conformation. Les résultats du transfert de cellules montrent que comme attendu,les cellules se lient fortement à MIC3 native (1), MIC3myc (2), et à MIC3 Y135A (5). En revanche, les cellules sont incapables de se lier à MIC3 W126A (3) et MIC3 F128A (4). D'autre part, la modification de conformation de MIC3 Y135A n'affecte pas ses propriétés de liaison. Les souches micl-3KO+MIC3W126A, micl-3KO+MIC3F128A, et à titre de contrôle, micl-3KO+MIC3Y135A ont été utilisées pour analyser l'implication de la fonction d'adhésion de MIC3 dans la virulence chez la souris. Analyse de la virulence des souches Le test de virulence a été réalisé comme décrit à l'exemple 2: 20 tachyzoïtes de chaque parasite ont été injectées par voie intrapéritonéale dans des souris mâles OF1 (lot de 11 à 20 souris) dont la survie a été suivie pendant 40 jours. Les résultats sont présentés dans la Figure 5. Légende de la Figure 5: É = souche micl-3KO ^ = souche miclKO A = souche micl-3KO+MIC3 o = souche micl-3KO+MIC3Y135A + = souche micl-3KO+MIC3F128A x = souche micl-3KO+MIC3W126A Comme attendu, les souris infectées avec micl-3KO+MIC3 se comportent de la même façon que les souris infectées avec mic1KO, et meurent selon une cinétique similaire en 9-26 jours. La survie des souris infectées par la souche micl-3KO+MIC3Y135A est supérieure (ce qui peut être dû à un adressage partiellement défectueux de la protéine MIC3 Y135A dans les vacuoles parasitophores). En revanche, on observe, 40 jours après l'infection, une survie de respectivement 83,3% et 95% des souris infectées par la souche micl-3KO+ MIC3W126A et micl-3KO+MIC3F128A. Ces résultats montrent que la fonction de liaison 15 de MIC3 aux cellules hôte est essentielle pour la virulence du parasite. EXEMPLE 4: CARACTERISTIQUES PROTECTRICES DU MUTANT micl-3KO Des expériences de vaccination contre Toxoplasma gondii par le mutant micl3K0 ont été effectuées sur des 20 souris et des brebis. I- Chez la souris Protocole expérimental Des lots de souris mâles OF1 âgées de 9,5 semaines, ont été traités comme suit: - 21 souris (lot 1) ont reçu le mutant micl-3K0; - 21 souris (lot 2) ont reçu le mutant micl-3K0 puis ont été réinfectées environ 1 mois plus tard par la souche de Toxoplasma gondii kystogène 76K; - 10 souris (lot 3) ont été infectées par la 30 souche de Toxoplasma gondii kystogène 76K lors de la ré-infection du lot 2. A JO, les souris des lots 1 et 2 ont reçu 20 tachyzoïtes du mutant micl3K0 par voie intrapéritonéale. A J14, l'infection des souris a été contrôlée par recherche de la présence d'IgG anti-Toxoplasma gondii, à l'aide d'extrait total de toxoplasme (souche RH). A J37, les souris effectivement immunisées (présence d'IgG antitoxoplasmes) du lot 2 (8 souris), et du lot 3 (8 souris) ont été gavées par 70 kystes de la souche de Toxoplasma gondii 76K. A J61, les souris des trois lots ont été sacrifiées. On a recherché la présence d'IgG anti-MIC3, due à l'infection par Toxoplasma gondii 76K, (puisque la souche vaccinale micl-3K0 n'exprime pas cette protéine) et effectué un comptage des kystes cérébraux dans les broyats de cerveaux de ces souris (comptage sur cellule de Malassez; la limite de détection est de 30 kystes par cerveau). 8 souris mâles OF1 naïves âgées de 15 semaines ont été gavées avec 1/3 du cerveau de chacune des 8 souris du lot 2 (contrôle de l'absence de parasites cérébraux). Une souris contrôle a reçu 60 kystes de la souche de Toxoplasma gondii 76K issus d'une souris du lot 3 (contrôle positif). A J82, on a recherché la présence d'IgG anti-MIC3 chez les souris gavées à J61. A J103, les souris ont été sacrifiées et un 20 comptage des kystes cérébraux a été effectué. Résultats A J14 Sur les 42 souris des lots 1 et 2, 8 sont mortes vers J10, lors de la phase aiguë d'infection (ce qui reflète la sensibilité élevée des souris à la virulence résiduelle du mutant MIC1-3KO). Le contrôle de l'infection par détection des IgG dirigés contre les antigènes parasitaires montre que 16 souris sont négatives et donc non infectées. Les lots 1 et 2 sont donc respectivement réduits à 10 et 8 souris. A J61 Recherche d'IgG anti-MIC3 Aucune IgG anti-MIC3 n'a été détectée dans le sérum des souris du lot 1 (contrôle négatif), alors que la présence d'IgG anti-MIC3 a été détectée dans le sérum des souris du lot 3 (contrôle positif). La présence d'IgG anti- MIC3 a été détectée dans le sérum des souris du lot 2, à l'exception d'une souris qui ne présente une très faible réponse. Comptage de kystes cérébraux A l'examen microscopique,Les cerveaux des souris du lot 1 ne contiennent pas de kystes cérébraux (contrôle négatif), alors que cerveaux des souris du lot 3 contiennent de 2250 à 7250 kystes/cerveau soit une moyenne de 4037 kystes/cerveau (contrôle positif). Chez les souris du lot 2, 7 souris ne contiennent pas de kystes cérébraux et une souris contient 30 kystes cérébraux (soit un seul kyste observé sur 16 comptages de 10 l sur cellule de Malassez). A J82 Les souris naïves gavées avec les cerveaux des souris du lot 2 présentent des IgG anti-MIC3. La souris contrôle ayant reçu 60 kystes de la souche de Toxoplasma gondii 76K issus d'une souris du lot 3 présente également des IgG anti-MIC3. A J103 Les souris naïves gavées avec les cerveaux des souris du lot 2 présentent respectivement 500, 375, 1000, 250, 165, 125, 310 et 375 kystes cérébraux. A titre de comparaison, la souris contrôle ayant reçu 60 kystes de la souche de Toxoplasma gondii 76K présente 2250 kystes cérébraux. Conclusion Les souris immunisées par le mutant micl-3KO ne forment pratiquement pas de kystes cérébraux lors d'une ré-infection avec la souche de Toxoplasma gondii 76K (protection de 99,9%). En revanche, plusieurs des cerveaux de souris reinfectées sont infectieux par voie orale, donc l'immunisation par la souche vaccinale micl-3KO n'est pas totalement stérilisante lors d'une ré-infection. II- Cas du mouton Protocole expérimental A JO, 2 brebis ont été vaccinées par voie sous-cutanée par 2x106 parasites mutant micl-3K0. La vaccination n'a provoqué qu'une fièvre passagère de 41 C (température normale = 39 C) à J2-3. A J47, Les brebis ont été mises à la reproduction. A J133, les brebis vaccinées ont subi l'infection d'épreuve par administration per os de 400 oocystes, à 86 jours de gestation. Un groupe témoin constitué de 7 brebis non vaccinées a subi la même infection d'épreuve. A partir de J133, les brebis ont été mises en observation clinique quotidienne. Résultats Les 2 brebis vaccinées ont mis bas un agneau cliniquement sain à J196. Dans le lot témoin non vacciné, les 7 brebis ont avorté, respectivement à J141 (1), J143 (2), J145 (1), J153 20 (1), J173 (1) et J183 (1). III- Conclusion La vaccination par le mutant micl-3K0 protège les animaux contre la formation de kystes cérébraux lors d'une éventuelle réinfection. Cette protection reflète la capacité du sujet vacciné à éliminer considérablement la portée d'une infection par une souche naturelle et donc de limiter aussi, dans le cas d'une femelle gestante, le passage transplacentaire qui est la source des pertes économiques dues à Toxoplasma gondii. Par ailleurs, la diminution considérable de la charge kystique minimise considérablement la possibilité de transmission par consommation de la viande des animaux vaccinés, et permet donc à terme de faire baisser la prévalence générale de l'infection par Toxoplasma gondii. REVENDICATIONS 1) Souche mutante d'un Apicomplexe de la famille des Sarcocystidae caractérisée en ce qu'elle comprend une mutation inactivant l'adhésine MIC1 et une mutation inactivant l'adhésine MIC3. 2) Souche mutante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de toxoplasme. 3) Souche mutante selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Toxoplasma gondii. 4) Utilisation d'une souche mutante selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'un vaccin. 5) Utilisation selon la revendication 4, 15 caractérisée en ce que ledit vaccin est un vaccin antitoxoplasmose. 6) Vaccin comprenant une souche mutante selon une quelconque des revendications 1 à 3