Brevet FR2861307A1 — publié le 20050429

La présente invention est relative à l'utilisation du facteur de transcription SOX9 dans le cadre du traitement de tumeurs exprimant l'antigène carcinoembryonnaire (ACE), et notamment du cancer du colon. L'antigène carcinoembryonnaire est une glycoprotéine membranaire apparentée à la superfamille des immunoglobulines. Il est exprimé en très faible quantité dans la muqueuse du colon normal, mais est surexprimé dans les carcinomes colo-rectaux, ainsi que dans d'autres carcinomes d'origine endodermique, tels que les carcinomes du poumon, du sein, de la prostate, ou des ovaires. La détermination des concentrations sanguines en ACE est utilisée comme outil de diagnostic et de suivi thérapeutique de ces tumeurs. Du fait de sa surexpression à la surface des cellules tumorales, l'ACE constitue également une cible pour l'immunothérapie antitumorale. Des anticorps dirigés contre cet antigène sont utilisés pour éliminer les cellules tumorales qui l'expriment. Il apparaît également que l'antigène carcinoembryonnaire est impliqué dans la progression tumorale et dans le développement de métastases. WIRTH et al. (Clin. Exp. Metastasis 19 : 155-160, 2002) ont observé qu'une diminution de 50% de l'expression de l'ACE dans des cellules de cancer du colon de la lignée HT 29 augmente la mort cellulaire par apoptose, et diminue la capacité de ces cellules à développer des tumeurs et à former des métastases chez des souris dépourvues de défense immunitaires. Il apparaît donc souhaitable de disposer de moyens de diminuer l'expression de l'antigène carcinoembryonnaire dans les cellules tumorales, afin de permettre d'inhiber la croissance tumorale et de diminuer le développement de métastases. Sox9 est un facteur de transcription de la famille SOX (pour : SRY-related HMG box), possédant un domaine de liaison à l'ADN de type HMG (High-Mobility Group). Il est fortement exprimé dans les chondrocytes, et est impliqué dans la chondrogenèse, notamment en augmentant l'expression du collagène de type II. Il apparaît également impliqué dans la différenciation sexuelle, et est exprimé de manière importante au cours du développement des testicules. Les mutations entraînant un déficit ou un dysfonctionnement de SOX9 se traduisent par une dysplasie campomélique, qui se manifeste par des déformations squelettiques importantes, et une inversion de sexe. AFONJA et al., (Oncogène 21 :7850- 7860,2002) ont récemment rapporté que SOX9 était également exprimé dans les tissus mammaires et rénaux, et que son expression dans des cellules tumorales de cancer mammaire #strogène dépendant sensibles à l'acide rétinoïque (lignée T- 47D) était augmentée par des agonistes des récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs), entraînant une inhibition de la croissance cellulaire en retardant la transition entre la phase GO-G1 et la phase S du cycle cellulaire. Les Inventeurs ont observé que le gène SOX9 est fortement exprimé dans tout l'épithélium du tube digestif, depuis l'estomac jusqu'au rectum, ainsi que dans les cellules tumorales humaines d'origine intestinale et pulmonaire. Ils ont entrepris d'étudier le rôle de ce facteur de transcription dans ces tissus. Dans ce cadre, ils ont transfecté des cellules provenant d'un adénocarcinome intestinal humain par une séquence d'ADN exprimant la protéine SOX9, et ont constaté que la surexpression de SOX9 qui en résultait entraînait une inhibition de l'expression de l'antigène carcinoembryonnaire, et une diminution de la croissance cellulaire. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation du facteur de transcription SOX9, ou d'un polynucléotide codant pour ledit facteur de transcription, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de tumeurs exprimant l'antigène carcinoembryonnaire, à l'exception des carcinomes mammaires sensibles aux agonistes des récepteurs de l'acide rétinoïque. Selon un mode de mise en #uvre préférée de la présente invention, ledit médicament est destiné au traitement du cancer du colon. Pour la mise en #uvre de la présente invention, dans le cas de l'utilisation directe du polypeptide SOX9, on peut coupler ledit polypeptide à un peptide transducteur, lui conférant la capacité de pénétrer à l'intérieur d'une cellule vivante, indépendamment de la présence de transporteurs ou de récepteurs spécifiques (Cf. par exemple : LINDGREN et al., Trends Pharmacol. Sci. 21(3) : 99-102,2000 ; SCHWARZE et DOWDY, Trends Pharmacol. Sci. 21(2) : 45-48,2000 ; SCHWARZE et al., Trends Cell. Biol. 10(7) : 290-295, 2000 ; PROCHIANTZ, Curr. Opin. Cell Biol. 12(4): 400-406,2000 ; TAKENOBU et al., Mol. Cancer Ther. 1 (12): 2002). Pour la mise en #uvre de la présente invention dans le cas de l'utilisation d'un polynucléotide codant pour SOX9, on peut employer les vecteurs et les méthodes de transfert de gènes habituellement utilisés en thérapie génique, qui sont connus en eux-mêmes. Classiquement, ledit polynucléotide est placé dans une cassette d'expression, sous contrôle de séquences appropriées permettant le contrôle de son expression dans les cellules cibles visées. Avantageusement, on choisira des séquences de contrôle de l'expression, et notamment un promoteur permettant une expression préférentielle dans les cellules exprimant l'antigène carcinoembryonnaire. A titre d'exemples, on citera le promoteur de l'antigène carcinoembryonnaire (OKABE et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129(6) : 367-373,2003 ; GOTO et al., Int. J. Cancer 94(3) . 414-419,2001), une séquence consensus sur laquelle se fixe le facteur de transcription TCF-4 (KWONG et al., Oncogene 21(54) : 8340-8346,2002 ; LIPINSKI et al., Mol. Ther. 4(4) : 365-371,2001), et le promoteur de la cyclooxygenase-2 (YAMAMOTO et al., Mol. Ther. 3 : 385-394, 2001). La construction ainsi obtenue peut être administrée par l'une quelconque des méthodes, connues en elle-mêmes, qui sont utilisées en thérapie génique. A titre d'exemples, on citera l'injection directe d'ADN nu, l'administration d'ADN encapsulé dans des liposomes ou associé à des protéines, ou l'utilisation de vecteurs viraux, par exemple de vecteurs dérivés de rétrovirus, de lentivirus, d'adénovirus, ou de virus associés aux adénovirus. Avantageusement, on pourra choisir un vecteur modifié pour cibler préférentiellement les cellules exprimant l'ACE, tels que ceux décrits par exemple par KHARE et al. (Cancer Res. 61,370-375, 2001), ou par MARTIN et al. (J. Virol. 77(4) : 2753-2756,2003). Selon un mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, on peut utiliser SOX9, ou un polynucléotide codant pour ledit facteur de transcription en association avec un autre traitement anti-tumoral. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément d'information qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en évidence des propriétés de SOX9 sur des cellules cancéreuses intestinales exprimant l'antigène carcinoembryonnaire. EXEMPLE 1 : EXPRESSION DE SOX9 DANS L'EPITHELIUM DU TUBE DIGESTIF Profil d'expression de sox9 dans l'intestin de souris 5 g/puits d'extrait protéique mesurés par la méthode de Bradford et provenant de différents tissus du tube digestif (duodénum, jéjunum, iléum, c#cum, colon central, colon terminal) ont été déposés sur gel, puis analysés par transfert immunoélectrophorétique à l'aide d'anticorps dirigés contre SOX9. La quantité de protéine totale déposée sur le gel a été contrôlée à l'aide d'un anticorps dirigé contre la P-actine (la quantité de (3-actine étant similaire dans tous les tissus et cellules). Les résultats sont présentés dans la Figure 1. Les résultats montrent que la protéine SOX9 est fortement exprimée dans tout l'épithélium du tube digestif depuis l'estomac jusqu'au rectum. Détection de l'ARN messager de SOX9 2 g/puits d'ARNs messagers (ARNm) isolés d'une lignée cellulaire de cancer pulmonaire humain (A549) et d'une lignée cellulaire de cancer du colon humain (SW480) ont été déposés sur gel, puis détectés en utilisant la technique de transfert de Northern à l'aide d'une sonde ADNc de SOX9. Les résultats sont présentés dans la Figure 2. Les résultats montrent que la protéine SOX9 est fortement exprimée dans les cellules tumorales humaines d'origine intestinale et pulmonaire. Expression de la protéine SOX9 dans différentes lignées cellulaires de cancer du colon humain 1 g/puits d'extrait protéique (mesuré par la méthode de Bradford) de différentes lignées cellulaires provenant de cancer du colon humain (LS174, DLD-1, HCT118, SW480, HT29CI16E) a été déposé sur gel, puis analysé par transfert immunoélectrophorétique à l'aide d'un anticorps dirigé contre SOX9. Les résultats sont présentés dans la Figure 3. Les résultats montrent que la protéine SOX9 est exprimée dans toutes les lignées cellulaires provenant de cancer du colon humain. EXEMPLE 2 : SUREXPRESSION DE SOX9 DANS DES CELLULES CANCEREUSES INTESTINALES. La lignée cellulaire HT29CI16E est un clone isolé à partir de la lignée HT29 provenant d'un adénocarcinome intestinal humain qui possède les caractéristiques des cellules caliciformes et exprime l'antigène carcinoembryonnaire (VELCICH et al., Cell Growth Differ. 6(6) : 749-757, 1995). Lorsque ces cellules sont maintenues en culture à confluence, la quantité d'antigène carcinoembryonnaire augmente considérablement. Le système T-Rex (Invitrogen) a été utilisé pour rendre les cellules HT29CI16E inductibles à la doxycycline. Les cellules HT29CI16E sont transfectées de façon stable avec le plasmide pcDNA6/TR (Invitrogen) qui permet de faire exprimer la protéine répresseur Tétracycline (tetR). Les cellules exprimant tetR sont ensuite transfectées avec le plasmide pcDNA4/TO (Invitrogen) dans lequel a été introduit la séquence nucléotidique codant pour la protéine SOX9 portant sur sa partie N-terminale un polypeptide correspondant à l'épitope FLAG, et placée sous le contrôle d'un promoteur inductible à la doxycycline. Deux clones (clones B et D) des cellules HT29CI16E, transfectées, qui expriment la protéine SOX9 après induction à la doxycycline, sont sélectionnés par transfert immunoélectrophorétique à l'aide d'anticorps anti-FLAG. EXEMPLE 3 : INHIBITION DE L'EXPRESSION DE L'ANTIGENE CARCINOEMBRYONNAIRE PAR SOX9 Quantité d'ARN messager de l'antigène carcinoembryonnaire La quantité d'ARN messager de l'antigène carcinoembryonnaire présent dans les deux clones B et D, cultivés pendant deux jours à l'état de non-confluence en absence et en présence de doxycycline, est estimée par RT-PCR en utilisant les deux amorces suivantes : GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG (SEQ ID NO : 1) et TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC (SEQ ID NO : 2) qui permettent l'amplification d'un fragment de 131 paires de bases correspondant à l'antigène carcinoembryonnaire. Les conditions de PCR sont : 30 secondes de dénaturation à 95 C, 30 secondes d'hybridation à 60 C, 1 minute d'amplification à 72 C, 30 cycles. Les résultats sont présentés dans la Figure 4. + = présence de doxycycline - = absence de doxycycline En présence de doxycycline, c'est à dire en conditions de surexpression de SOX9, les deux clones B et D expriment moins d'ARN messager de l'antigène carcinoembryonnaire. Quantité de SOX9 et d'antigène carcinoembryonnaire Le clone B des cellules HT29CI16E est cultivé pendant 5 jours à l'état de non-confluence et pendant 23 jours à confluence, en présence et en absence de doxycycline. Par transfert immunoélectrophorétique à l'aide d'anticorps anti-FLAG et anti-antigène carcinoembryonaire, la quantité de protéine SOX9 ainsi que celle de l'antigène carcinoembryonnaire ont été évaluées. Les résultats sont présentés dans la Figure 5. + = présence de doxycycline - = absence de doxycycline Après maintien des cellules en culture pendant 5 jours à l'état de non-confluence, la protéine SOX9 portant l'étiquette Flag est présente dans les cellules traitées à la doxycycline et absente dans les cellules non traitées. L'antigène carcinoembryonnaire est présent dans les cellules non traitées à la doxycycline, c'est-à-dire dans les cellules contenant peu de SOX9, et est absent dans les cellules traitées à la doxycycline, c'est-à-dire dans les cellules contenant une quantité plus importante de SOX9. Après maintien des cellules en culture pendant 23 jours à l'état de confluence, la protéine SOX9 portant l'étiquette Flag est toujours présente dans les cellules traitées à la doxycycline et absente dans les cellules non traitées. L'antigène carcinoembryonnaire est présent dans les cellules non-traitées à un taux bien plus élevé qu'après 5 jours de culture en absence de doxycycline. En revanche, l'antigène carcinoembryonnaire a pratiquement disparu des cellules cultivées pendant 23 jours en présence de doxycycline. Ces résultats montrent que la sur-expression de la protéine SOX9 diminue l'expression de l'antigène carcinoembryonnaire dans les cellules HT29CI16E provenant d'un adénocarcinome intestinal humain. EXEMPLE 4 : INHIBITION DE LA CROISSANCE CELLULAIRE PAR SOX9 Le clone B des cellules HT29CI16E est cultivé pendant 1,2 et 3 jours, en présence et en absence de doxycycline. Dans une autre série d'expérience, le clone B des cellules HT29CI16E est cultivé pendant 5 jours à l'état de non-confluence. La croissance cellulaire est estimée en mesurant la quantité de protéines totales dans la boîte de culture par la méthode de Bradford. Les résultats sont présentés dans les Figures 6 et 7. + = présence de doxycycline - = absence de doxycycline abscisse = durée de la culture (jours) ordonnée = quantité de protéines totales par boîte de culture (mg) Après 1 jour de culture, il y a 0,25 mg de protéines en absence de doxycycline et 0,24 mg en présence de doxycycline. Après 2 jours de culture, il y a 0,38 mg de protéines en absence de doxycycline et 0,34 mg en présence de doxycycline. Après 3 jours de culture, il y a 0,58 mg de protéines en absence de doxycycline et 0,48 mg en présence de doxycycline. Après 5 jours à l'état de non-confluence, en absence de doxycycline, la quantité de protéines totales cellulaires est de 4 mg. Lorsqu'on induit l'expression de SOX9 à la doxycycline, la quantité de protéines totales est de 2,6 mg. Dans une autre série d'expérience, le clone B des cellules HT29CI16E est cultivé pendant 5 jours dans une boîte de culture de six puits en présence (3 puits) ou en absence (3 puits) de doxycycline. Les cellules sont ensemencées à raison de 2x105 cellules/puits. Après 5 jours, les cellules sont marquées au cristal violet (marquage de l'ADN). Les résultats sont représentés dans la Figure 8A. En présence de doxycycline, une diminution significative du marquage de l'ADN est observée par rapport à celui du clone B cultivé en absence de doxycycline. Afin de quantifier la quantité de cellules, après coloration au cristal violet, les cellules sont solubilisées au SDS puis la densité optique est mesurée à 570 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage du clone B non induit par la doxycycline. Les résultats sont représentés dans la Figure 8B. + = présence de doxycycline - = absence de doxycycline En présence de doxycycline, c'est à dire en conditions de surexpression de SOX9, une diminution d'environ 40% de la prolifération cellulaire est observée par rapport à celle du clone B cultivé en absence de doxycyline. Ces résultats montrent que l'expression de la protéine SOX9 diminue la croissance cellulaire des cellules HT29CI16E provenant d'un adénocarcinome intestinal humain et exprimant l'antigène carcinoembryonnaire. EXEMPLE 5 : AUGMENTATION DE L'APOPTOSE CELLULAIRE PAR SOX9 Le clone B des cellules HT29CI16E est cultivé pendant 4 jours, en présence et en absence de doxycycline. L'apoptose cellulaire est mise en évidence en utilisant le DeadEnd Corimetric TUNEL System (Promega). Les résultats sont présentés dans la Figure 9. 3 = présence de cellules apoptotiques Après 4 jours, en présence de doxycycline, une augmentation significative du nombre de cellules apoptotiques est observée par rapport au clone B cultivé en absence de doxycycline. Afin de réaliser une étude statistique, le nombre de cellules totales par champs de microscope (n=4), ainsi que le nombre de cellules en apoptose par champ (n=22) ont été déterminés dans les deux conditions (absence ou présence de doxycycline). Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 @ présence de absence de doxycycline doxycycline Nbr. cellules par champ (n=4) 233 +/- 17,2 328+/-53,3 Nbr. cellules apoptotiques par champ (n=22) 1,64 +/- 0,34 0,27 +/- 0,1 Les résultats montrent que l'inhibition de la croissance des cellules HT29CI16E provenant d'un adénocarcinome intestinal humain et exprimant l'antigène carcinoembryonnaire lorsque l'expression de la protéine SOX9 est induite à la doxycycline, est due au moins en partie à une augmentation de l'apoptose cellulaire. REVENDICATIONS 1) Utilisation du facteur de transcription SOX9, ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour ledit facteur de transcription pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de tumeurs exprimant l'antigène carcinoembryonnaire, à l'exception des carcinomes mammaires sensibles aux agonistes des récepteurs de l'acide rétinoïque. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement du cancer du colon.