Brevet FR2863273A1 — publié le 20050610

Milieu, dispositif et procédé de test de la sensibilité d'un inoculum de champignons à un agent antifongique La présente invention concerne un milieu de test de la sensibilité à un agent antifongique d'un inoculum de champignons, un dispositif de test intégrant un tel milieu de test ainsi qu'un procédé de test mettant en oeuvre un tel milieu de test. i0 Dans le domaine de la mycologie médicale, l'anti-fongigramme consistant en un examen de la sensibilité de champignons à un agent antifongique est devenu une nécessité liée à l'apparition croissante de résistance des champignons à certains antifongiques. Les recommandations actuelles indiquent que la sensibilité d'une souche à un antifongique doit être déterminée par sa concentration minimale inhibitrice (CMI), c'est-à-dire la plus faible concentration d'antifongique permettant d'inhiber totalement la pousse d'un agent fongique. La détermination étant parfois difficile, un point de rupture arbitraire mais fixe, correspondant à une inhibition partielle de la croissance des champignons a été défini. II est par exemple fixé à 90% pour l'amphotéricine B et à 80% pour les azolés et la 5-fluorocytosine. De nombreuses approches ont été mises au point pour apprécier la sensibilité d'une souche à un antifongique donné : le comptage des colonies, la mesure de la masse biologique par spectrophotométrie, les méthodes de dilution retenues par le "National Commitee for Clinical Laboratory Standard" (NCCLS), utilisées aux Etats-Unis, et les méthodes utilisant la cytométrie de flux. Cependant ces techniques sont lourdes et onéreuses et ne permettent pas une utilisation en routine dans un laboratoire de biologie médicale. Pour pallier ces inconvénients, des tests commerciaux de dilution et de diffusion sont apparus. Ainsi, il a été commercialisé un premier test (Etest, marque déposée) se présentant sous forme de bandelettes contenant chacune un gradient de concentration en antifongique. Ces bandelettes sont déposées à la surface d'une gélose préalablement ensemencée. L'inoculum est déposé à l'aide d'un écouvillon stérile sur toute la surface de la gélose. Après 48 heures d'incubation à 37 C, une ellipse d'inhibition apparaît. La concentration minimale inhibitrice correspond au point d'intersection entre le bord de l'ellipse et la graduation de la bandelette. La méthode de dépose de l'inoculum à la surface de la gélose et le mode de lecture des résultats constituent deux freins au succès de ce test. En effet, l'étape d'ensemencement est délicate et importante car l'inoculum doit être uniformément réparti sur toute la surface de la gélose. io Une répartition non uniforme ou une diffusion insuffisante de l'antifongique entraînent des résultats erronés. Par ailleurs, la détermination de la concentration minimale inhibitrice repose sur une détermination visuelle très subjective. II en résulte une variation importante des CMI mesurées d'un laboratoire à un autre mais également d'un lecteur à un autre au sein du même is laboratoire. Un autre test est commercialisé sous forme de galerie (ATB-fungus, marque déposée) comportant plusieurs paires de cupules. La suspension de champignons est dans un premier temps transférée dans un milieu ATBF. En fonction de la nature de l'agent antifongique, d'autres réactifs, en particulier des tampons doivent être ajoutés audit milieu. La galerie est ensuite ensemencée au moyen d'un tel inoculum. Après 24 heures d'incubation à 30 C, la lecture s'effectue de manière visuelle. On note l'apparition d'un trouble ou l'absence de croissance dans chaque cupule, comparativement au témoin de croissance correspondant. La concentration minimale inhibitrice est la valeur correspondant à la dernière cupule sans croissance. Outre l'inconvénient d'ores et déjà mentionné ci-dessus d'une lecture visuelle, donc subjective, ce test présente en outre l'inconvénient de ne pas être adapté aux nouveaux agents antifongiques apparus sur le marché, en particulier les composés azolés tels que l'itraconazole. Par ailleurs, ce test nécessite d'utiliser la totalité de la galerie, même lorsque cela n'est pas nécessaire. II en résulte un coût du test relativement élevé. Un but de la présente invention est donc de proposer un milieu et un dispositif de test du type précité dont les conceptions permettent d'une part une simplification des étapes de préparation du test grâce à un système prêt à l'emploi, d'autre part une automatisation de la lecture du résultat permettant une lecture objective et l'obtention de résultats identiques ou similaires d'un laboratoire à un autre(répétabilité et reproductibilité). Un autre but de la présente invention est de proposer un milieu et un dispositif io de test du type précité pour lesquels le nombre de concentrations en agent antifongique à tester est réduit comparativement à un test classique. A cet effet, l'invention a pour objet un milieu de test de la sensibilité à un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture de préférence liquide, ce milieu de test comportant au moins un agent antifongique à tester, caractérisé en ce qu'il comporte en outre comme constituant supplémentaire, au moins un substrat organique dont le catabolisme par les champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique produit un catabolite fluorescent, et éventuellement coloré, dont l'intensité du signal fluorescent et éventuellement coloré émis est fonction de la concentration en champignons viables dudit milieu. Le substrat organique du milieu de test transformé par les champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique constitue un indicateur fluorescent de viabilité des cellules. L'obtention d'un signal fluorescent lisible au moyen d'un système de détection par spectrofluorométrie rend la lecture du résultat parfaitement fiable. La lecture demeure en outre aisée et rapide puisqu'elle peut se faire directement à travers le support contenant le milieu de test. L'invention a encore pour objet un dispositif de test de la sensibilité à au moins un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture de préférence liquide, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un support solide, inerte vis à vis de l'agent anti-fongique ou des champignons à tester, ce support délimitant une pluralité de cavités, au moins une partie desdites cavités étant au moins partiellement remplie chacune d'un milieu de détection sous forme lyophilisée ou évaporée sous vide du type précité, ce milieu contenant au moins un agent antifongique à une concentration prédéterminée et un substrat organique transformable en un catabolite fluorescent au contact de champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique. Le dispositif de test se présente ainsi sous forme d'un dispositif prêt à l'emploi. II suffit, au moyen d'un tel dispositif, de procéder uniquement à l'introduction de l'inoculum dans chaque cavité devant être ensemencée. L'étape d'ensemencement est une étape simple, non délicate, contrairement à certains tests où l'inoculum doit être uniformément réparti sur toute la surface de la gélose. Grâce à un tel dispositif de test, seule la préparation de l'inoculum doit être effectuée par l'opérateur réduisant ainsi les sources d'erreurs. Par ailleurs, un tel dispositif de test présente une grande modularité. Il permet de pouvoir tester un ou plusieurs agents antifongiques et une ou plusieurs souches de champignons sur un même support en fonction de la demande. Un tel dispositif de test est en outre parfaitement adapté à l'arrivée sur le marché de nouveaux antifongiques. Enfin, un tel dispositif de test permet d'obtenir rapidement des résultats 25 permettant ainsi de donner une réponse plus rapide au clinicien pour une meilleure prise en charge du patient. Tous les tests connus actuellement sur le marché nécessitent une confirmation de la lecture des résultats après 48 heures d'incubation. Tel n'est pas le cas du 30 dispositif de test objet de l'invention. L'invention a encore pour objet un procédé de test de la sensibilité à un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture, de préférence liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le milieu de test du type précité avec un volume prédéterminé dudit milieu de culture ensemencé en une concentration connue de champignons, à laisser incuber pendant un temps compris entre 18 et 30 heures, de préférence entre 18 et 24 heures, et à mesurer à l'issue du temps d'incubation la fluorescence du milieu résultant de la mise en contact, la lecture de fluorescence étant de préférence effectuée au moyen d'un spectrofluorimètre. L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante io d'exemples de réalisation. Comme mentionné ci-dessus, l'invention a pour objet un milieu de test de la sensibilité à un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture de préférence liquide ainsi qu'un dispositif de test utilisant un tel milieu. Le milieu de test, objet de l'invention, comporte, outre un agent antifongique à tester, au moins un substrat organique dont le catabolisme par les champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique produit un catabolite fluorescent dont l'intensité du signal fluorescent émis est fonction de la concentration en champignons viables, c'est-à-dire s'étant développés dans le milieu de test en présence de l'agent antifongique. Le substrat organique soumis au catabolisme des champignons est un composé hydrosoluble choisi dans le groupe des composés constitués par la résazurine, de ses dérivés et de ses sels. Dans les exemples décrits ci-dessus, le substrat organique choisi est un sel de sodium de la résazurine (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one-10-oxyde) commercialisé sous la marque déposée Alamar Blue ou Uptiblue. Ce composé a la particularité de pouvoir être absorbé par les champignons qui le réduisent par une déshydrogénase mitochondriale et le transforment en un catabolite fluorescent ou composé fluorochrome qui émet un signal fluorescent. Ainsi, les champignons ont pour fonction de réduire le substrat organique précité, ce substrat émettant, sous sa forme réduite, un signal fluorescent lisible par spectro-fluorimétrie. II en résulte ainsi une simplification de la lecture. Il doit être noté que ce composé comporte en outre la particularité d'émettre en parallèle un signal coloré dont la lecture peut s'effectuer à partir d'une mesure de la densité optique. L'intérêt de tels composés est de permettre une lecture directe du milieu de test après un temps d'incubation déterminé. Cette lecture peut s'effectuer directement dans le support du dispositif de test. L'agent anti-fongique est quant à lui choisi dans le groupe des composés constitué par la 5-fluorocytosine et l'amphotéricine B, la caspofungine ou les io composés azolés tels que l'itraconazole, le kétoconazole, le fluconazole, le voriconazole, cette liste n'étant pas limitative. Cet agent antifongique est présent à une concentration connue comprise entre 0,05 et 250 pg/mL dans le milieu de test. Généralement, cet agent anti- fongique est introduit dans le milieu à l'état dissous dans un solvant, tel que du diméthylsulfoxide (DMSO) et/ou dans un milieu aqueux, tel que le milieu RPMI additionné de glucose 2%. Les constituants sont chacun sous forme lyophilisée ou évaporée sous vide afin de faciliter la mise en oeuvre d'un dispositif de test incorporant un tel milieu. En variante, ces constituants peuvent être également chacun à l'état déshydraté. Un exemple de préparation d'un tel milieu de test va à présent être décrit ci-dessous: Dans un premier temps, il convient de préparer des solutions mères de l'agent antifongique. Ces solutions mères sont préparées à une concentration de 5mg/mL. Pour les agents antifongiques insolubles dans l'eau, tels que l'amphotéricine B, le kétoconazole et l'itraconazole, la préparation de chaque solution mère est effectuée dans du DMSO (diméthylsulfoxide) et non dans de l'eau distillée stérile. En ce qui concerne les concentrations mères de 5- Fluorocyosine et fluconazole, il convient d'ajouter 1 mL d'eau distillée stérile à 5mg d'antifongique. L'ensemble est agité jusqu'à dissolution complète de l'antifongique. En ce qui concerne l'amphotéricine B, l'itraconazole et le kétoconazole, il convient d'ajouter 1 mL de DMSO à 5mg d'antifongique. A nouveau, l'ensemble est bien agité jusqu'à dissolution complète de l'agent antifongique. Des solutions filles d'antifongique sont préparées à partir de la solution mère à 5mg/mL. En ce qui concerne la 5-Fluorocyosine, on réalise ainsi 3 solutions io filles à 2, 20 et 200 pglmL. Chaque fois, la dilution est réalisée dans un milieu A dont la composition est telle que suit: 10,40 g Pour 1 litre de milieu A: RPMI 1640 medium en poudre avec L-Glutamine MOPS 34,53 g Glucose 2 g Les trois poudres sont dissoutes dans 900mL d'eau distillée stérile. Le pH est ajusté à 7 avec une solution de soude 1M puis il est complété à 1 litre avec de l'eau distillée stérile. Il est à noter que l'ajout de 2% de glucose au milieu permet d'obtenir, quelle que soit la souche testée, une fluorescence plus élevée que lors de l'utilisation d'un même milieu sans glucose. En ce qui concerne le fluconazole et le kétoconazole, il est réalisé 3 solutions 20 filles respectivement à 4, 40 et 400 pg/mL. L'amphotéricine B et l'itraconazole se présentent quant à elles sous forme de 3 solutions filles respectivement à 0,1, 1 et 10 pg/mL. Une fois ces différentes solutions de l'agent antifongique préparées à trois concentrations différentes connues pour chaque antifongique à tester, le dispositif de test peut être préparé. Ce dispositif de test se présente sous forme d'au moins un support solide inerte, vis à vis de l'agent anti-fongique ou des champignons à tester, ce support délimitant une pluralité de cavités, au moins une partie desdites cavités étant au moins partiellement remplie chacune d'un milieu de test sous forme lyophilisée ou évaporée (deshydratée), ce milieu contenant au moins un agent antifongique à une concentration prédéterminée et un substrat organique transformable en un catabolite fluorescent au contact de champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique. Ce support se présente de préférence sous forme d'une plaque ou barrette multi-puits, chaque puits présentant une contenance comprise entre 50 et 400 pL. Les cavités du support destinées à contenir le milieu de test sont organisées sous forme de séries de cavités, chaque série, correspondant à un agent antifongique à tester, étant constituée de cavités comprenant un milieu de test de composition identique d'une cavité à une autre de la série à l'exception de la io concentration prédéterminée en agent antifongique différente d'une cavité à une autre cavité de la série de manière à définir un gradient de concentration en agent antifongique permettant la détermination de la concentration minimale inhibitrice dudit agent antifongique. Ainsi, à partir des solutions filles d'agent antifongique décrites cidessus, il est déposé, dans au moins une partie des cavités du support, 100 pL de chaque solution fille d'antifongique dans laquelle l'agent antifongique est à une concentration différente d'une solution fille à une autre pour un même agent antifongique. Il est ajouté ensuite dans lesdites cavités ainsi remplies 10 pL de l'Alamar Blue (marque déposée) à l'exception des cavités contenant les solutions de kétoconazole. Par ailleurs, au moins deux cavités du support contiennent exclusivement le substrat organique transformable en un catabolite fluorescent du milieu de test en vue de servir l'une de blanc en présence du seul milieu de culture des champignons, l'autre de témoin de pousse en présence de l'inoculum formé du milieu de culture ensemencé en champignons. Ainsi, 10 pL d'Alamar Blue (marque déposée) sont également déposés dans deux autres puits, l'un servant de "blanc" et l'autre de "témoin de pousse". Pour la lyophilisation, la micro plaque ou la barrette ainsi préparée est congelée à une température de -20 C pendant une durée voisine de 18 heures puis la plaque est disposée dans un lyophilisateur pendant 9 heures. Il est alors ajouté, dans les 3 cavités contenant les solutions de kétoconazole lyophilisées, pL d'Alamar Blue (marque déposée). Le contenu des cavités est donc à nouveau congelé pendant 18 heures puis la micro-plaque est positionnée dans un lyophilisateur pendant une heure. Pour l'évaporation sous vide, la micro-plaque ou la barrette est placée dans un évaporateur rotatif sous vide à 50 C pendant environ 2 heures. La micro-plaque ou la barrette, une fois conditionnée peut alors être conservée à 4 C en présence d'un déshydratant (Silicagel par exemple). Le dispositif de test constitue ainsi un dispositif de test prêt à l'emploi, l'opérateur ayant simplement à remplir au moins une partie des cavités du support d'un inoculum. La préparation de l'inoculum s'effectue à partir d'une suspension de champignons issus d'une culture de 24 heures à 37 C sur tube Sabouraud. Les cellules prélevées sont mises en suspension dans de l'eau distillée stérile jusqu'à obtention d'une densité cellulaire ajustée de façon à obtenir une is suspension d'opacité équivalente à 0,5 Mac-Farland, correspondant à une concentration de 1 à 5.106 cellules/mL. L'inoculum (103)est alors préparé par dilution, généralement au centième puis au quarantième, de la suspension dans le milieu A dont la composition est décrite ci-dessus et 200 pL sont déposés dans chaque cavité du support. La souche testée peut être quelconque. Ainsi, par exemple, dans le cas d'une culture de Candida, il peut être utilisé des colonies en culture sur milieu Sabouraud. Les colonies s'étant développées dans un tel milieu sont prélevées et mises en suspension dans de l'eau distillée stérile jusqu'à obtention d'une solution mère de 1 à 5. 106 celluleslmL correspondant à une opacité de 0.5 Mac-Farland mesurée au moyen d'un spectrophotomètre à 530 nm. A partir de cette solution, il est réalisé une dilution dans le milieu A au centième puis une seconde dilution au quarantième toujours dans le même milieu. A partir de cet inoculum, il peut être procédé à la mise en oeuvre du dispositif de test. A cet effet, chaque cavité portant un milieu de test est remplie de 200 pL d'inoculum. Les cavités destinées à servir de blanc sont quant à elles uniquement remplies de 200 pL de milieu A. L'ensemble est laissé à incuber pendant 20 heures à 35 C. La lecture est ensuite effectuée sur un spectrofluorimètre après i0 excitation à 550 nm et émission à 590 nm. A chaque valeur de fluorescence mesurée dans les puits contenant l'antifongique et dans le puits témoin de pousse est retranchée la valeur du blanc pour obtenir une valeur corrigée. Le pourcentage d'inhibition obtenu en présence d'un antifongique à la concentration y utilise ces valeurs corrigées et se calcule de la façon suivante: %d'inhibition = [(fluorescence témoin corrigée fluorescence Y corrigée) /fluorescence témoin corrigée] xl 00. io A partir des pourcentages d'inhibition obtenus pour chacune des trois concentrations filles d'agent antifongique testées, la concentration minimale inhibitrice (CMI) propre à chaque agent antifongique est déterminée. Elle correspond à la concentration qui entraîne une inhibition de la croissance du témoin de pousse de 80 % pour la 5- fluorocytosine et les azotés et de 90 % pour l'amphotéricine B. II est à noter que le temps d'incubation optimisé est de 20 heures. En effet, parmi les résultats obtenus après 20 heures d'incubation et 24 heures d'incubation, seulement 7% diffèrent. Les expériences effectuées montrent que dans la routine, la lecture du test peut, compte tenu d'une réponse en terme de sensible, intermédiaire ou résistant, être effectuée dès 20 heures d'incubation à l'exception du fluconazole qui nécessitera 24 heures d'incubation. Les résultats de test relatifs à la sensibilité de souches au fluconazole sont 25 fiables contrairement à ceux fournis par les méthodes de test commercialisées. La méthode biochimique (technique d'or) qui a été employée, qui consiste à faire subir à un inoculum un traitement de fluconazole pendant 18 heures puis à faire agir de la potasse permettant d'extraire les stérols et de réaliser un dosage spectrophotométrique UV de l'ergostérol pour vérifier que la biosynthèse de l'ergostérol membranaire a été totalement inhibée montre clairement que les résultats du dispositif de test, objet de l'invention, sont pertinents. Pour tous les autres agents antifongiques et souches testés, les Il résultats sont concordants avec la méthode officielle. Ainsi, le dispositif de test décrit ci-dessus présente un grand nombre d'avantages. Il permet notamment d'obtenir rapidement un résultat après seulement 20 à 24 heures d'incubation permettant ainsi de donner une réponse plus rapide au clinicien. Il est très simple d'emploi puisque seule la préparation de l'inoculum reste à être effectuée par l'opérateur. L'ensemencement est facilité grâce à un format micro-plaque ou barrette, la lecture est automatisée et l'interprétation des résultats est objective et aisée réduisant ainsi les possibilités io d'erreurs d'interprétation. REVENDICATIONS 1. Milieu de test de la sensibilité à un agent antifongique, de champignons contenus dans un milieu de culture de préférence liquide, ce milieu de test comportant au moins un agent antifongique à tester, caractérisé en ce qu'il comporte en outre comme constituant supplémentaire, au moins un substrat organique dont le catabolisme par les champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique produit un catabolite fluorescent et éventuellement coloré dont l'intensité du signal fluorescent et éventuellement coloré émis est fonction de la concentration en champignons viables dudit milieu. 2. Milieu de test de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat organique soumis au catabolisme des champignons est un composé hydrosoluble choisi dans le groupe des composés constitués par la résazurine, ses dérivés ou ses sels. 3. Milieu de test selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le signal fluorescent émis par le catabolite fluorescent est lisible au moins par 20 spectro-fluorimétrie. 4. Milieu de test selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent antifongique est choisi dans le groupe des composés constitué par la 5-fluorocytosine, l'amphotéricine B, la caspofungine ou les composés azotés tels que l'itraconazole, le kétoconazole, le fluconazole, le voriconazole. 5. Milieu de test selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent antifongique est présent à une concentration 30 comprise entre 0,05 et 250 pg/mL. 6. Milieu de test selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent antifongique est introduit dans le milieu à l'état dissous dans un solvant, tel que du diméthylsulfoxide (DMSO) et/ou dans un milieu aqueux, tel q'un milieu RPMI. 7. Milieu de test selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les 5 constituants du milieu sont chacun sous forme lyophilisée ou évaporée sous vide. 8. Milieu de test selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les constituants sont chacun à l'état déshydraté. 9. Dispositif de test de la sensibilité à au moins un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture de préférence liquide, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'au moins un support solide, inerte vis à vis de l'agent anti-fongique ou des champignons à tester, ce support délimitant une pluralité de cavités, au moins une partie desdites cavités étant au moins partiellement remplie chacune d'un milieu de test sous forme lyophilisée ou évaporée sous vide conforme à l'une des revendications 1 à 8, ce milieu contenant au moins un agent antifongique à une concentration prédéterminée et un substrat organique transformable en un catabolite fluorescent au contact de champignons aptes à se développer en présence de l'agent antifongique. 10. Dispositif de test selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'au moins deux cavités du support contiennent exclusivement le substrat organique transformable en un catabolite fluorescent du milieu de test en vue de servir l'une de blanc en présence du seul milieu de culture des champignons, l'autre de témoin de pousse en présence de l'inoculum formé du milieu de culture ensemencé en champignons. 11. Dispositif de test selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que les cavités du support contenant le milieu de test sont organisées sous forme de séries de cavités, chaque série, correspondant à un agent antifongique à tester, étant constituée de cavités comprenant un milieu de test de composition identique d'une cavité à une autre de la série à l'exception de la concentration prédéterminée en agent antifongique différente d'une cavité à une autre cavité de la série de manière à définir un gradient de concentration en agent antifongique permettant la détermination de la concentration minimale inhibitrice dudit agent antifongique. 12. Dispositif de test selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le support est constitué d'une plaque multi-puits, chaque puits présentant une contenance comprise entre 50 et 400 pL. 13. Procédé de test de la sensibilité à un agent antifongique de champignons contenus dans un milieu de culture, de préférence liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le milieu de test conforme à l'une des revendications 1 à 8 avec un volume prédéterminé dudit milieu de culture ensemencé en une concentration connue de champignons, à laisser incuber pendant un temps compris entre 18 et 30 heures, de préférence entre 18 et 24 heures, et à mesurer à l'issue du temps d'incubation la fluorescence du milieu résultant de la mise en contact, la lecture de fluorescence étant de préférence effectuée au moyen d'un spectrofluorimètre.