Brevet FR2861744A1 — publié le 20050506

La présente invention concerne le domaine de la cancérologie. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour le pronostic d'un cancer du sein. Chez la femme, le cancer du sein est la première cause de mortalité par cancer dans les pays industrialisés. Il est estimé que la taille minimale d'une tumeur repérable par mammographie est de 1 cm. Les cancers du sein se développent lentement. Néanmoins, cette tumeur de petite taille présente un passé évolutif de 8 ans en moyenne lors du diagnostic. L'étiologie du cancer du sein n'est pas bien définie. Des prédispositions familiales ont été mises en évidence. L'âge est le facteur de risque le plus important. Ainsi, le risque augmente de 0,5% par année d'âge dans les pays occidentaux. D'autres facteurs de risques sont connus tels que le nombre des grossesses et l'âge de la première grossesse, l'allaitement, l'âge de la puberté et de la ménopause, les traitements oestrogéniques après la survenue de la ménopause, le stress et la nutrition. Il existe différents traitements pour lutter contre le cancer du sein, et on peut citer notamment l'hormonothérapie, qui est utilisée dans les cancers du sein hormonodépendants. Pour réagir à l'hormonothérapie, un cancer doit être hormonosensible, c'est-àdire que les cellules de la tumeur doivent posséder des récepteurs hormonaux à leur surface. On peut citer notamment les récepteurs à l'oestrogène ESR (ESR1 et ESR2) et le récepteur à la progestérone (PGR), qui sont les paramètres les plus connus pour prédire la réponse à une hormonothérapie dans le cancer du sein. Ainsi la teneur en ESR1 est utilisée comme indicateur pronostique, et pour prédire la réponse d'un patient à un traitement avec des anti oestrogènes, tels que le Tamoxifen (Osborne C et al, Brest Cancer Res Treat 51 :227- 238, 1998 ; Goldhirsch et al, J Clin Oncol 19 : 3817-3827, 2001). La présence du récepteur PGR est également utilisée pour le suivi d'une hormonothérapie, et comme marqueur de pronostic (Horwitz et al, Recent Prog Horm Res 41 : 1995). On peut également citer le récepteur HER2, qui serait surexprimé dans environ des cancers du sein invasif (Slamon et al, Science, 1987, 235 :177-182). On peut citer également la chimiothérapie, qui est, quant à elle, un traitement général du cancer puisque les médicaments, portés par la circulation sanguine, peuvent agir partout dans l'organisme. La chimiothérapie a une place importante dans l'arsenal thérapeutique, particulièrement depuis une dizaine d'années, avec l'apparition de nouvelles molécules. Les médicaments sont le plus souvent administrés en perfusion par voie veineuse, en voie sous-cutanée, en intra-musculaire. Parce qu'il existe différents types de cancers du sein, et différents pronostics du cancer du sein, les femmes qui en sont atteintes ne suivent pas toutes le même traitement et le médecin doit proposer à chaque patiente un traitement adapté à sa situation, afin d'obtenir les meilleures chances de guérison. En particulier, il existe des patientes présentant un fort risque de rechute après le traitement d'un cancer du sein, qui est étroitement lié au stade d'évolution du cancer au moment de son diagnostic. Cette rechute est généralement due à la persistance de cellules tumorales qui ont échappé au traitement. Il est donc très utile de disposer d'un outil permettant de déterminer les risques de rechute dès le 1 er diagnostic du cancer du sein afin de proposer à la patiente un traitement adapté le plus rapidement possible. Bien que l'on puisse citer comme indice de risque de récidive, la présence de cellules cancéreuses dans les ganglions lymphatiques, la taille de la tumeur, son grade, il n'existe pas d'outil reconnu pour discriminer aisément les patientes ayant un risque important de rechute, des patientes ayant un risque faible de rechute. La présente invention propose un nouveau procédé pour le pronostic du cancer du sein, qui permet de discriminer les patients ayant un risque de rechute important, afin d'adapter au mieux le traitement dès le 1 er diagnostic. D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'analyse de l'expression de gènes cibles sélectionnés parmi 68 gènes tel que présenté dans le tableau 1 ci après, est très pertinente dans la lutte contre le cancer du sein, puisque ces gènes sont exprimés différentiellement selon que la patiente présente un fort risque de rechute ou un faible risque de rechute. Tableau 1 - liste des 68 gènes cibles selon l'invention SEQ ID N Description de la séquence N Genbank 1 Hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit, transcript variant 1 NM 001530 2 Neurotrophic tyrosine kinase receptor type 3 NM 002530 3 Heat shock 70kD protein 8, transcript variant 1 NM 006597 4 Macrophage stimulating 1 -receptor NM 002447 5 Ubiquitin C NM 021009 6 Splicing factor, arginine/serine-rich 10 NM 004593 7 RNA binding motif protein 5 NM 005778 8 v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog NM 005252 9 Guanine nucleotide releasing factor (SOS2) L20686 10 Similar to immunoglobulin kappa chain variable région M20707 11 Homogentisate 1,2-dioxygenase NM 000187 12 Far upstream element-binding protein 3 U69127 13 Human clone 23801 mRNA séquence U79282 14 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:2413286 AI817548 15 Small nuclear RNA U2 BC003629 16 DNA excision repair protein 2 NM 000400 17 Biliverdin reductase A NM 000712 18 Phytanoyl-CoA hydroxylase precursor NM 006214 19 Rab3 GTPase-activating protein, non-catalytic subunit NM 012414 20 cDNA DKFZP564F0522 AL049943 21 Kinesin family member 5B NM 004521 22 Wolframin NM 006005 23 Hypothetical protein FLJ10849 NM 018243 24 Hypothetical protein FLJ31657 NM 152758 25 KIAA0792 gene product NM 014698 26 Signal transduction protein CBL-B NM 170662 27 cDNA DKFZp586F1922 AL050379 28 Splicing factor, arginine/serine-rich 2 NM 003016 29 Slow skeletal muscle troponin T NM 003283 30 Serine/threonine kinase 38 NM 007271 31 Human clone 23933 mRNA séquence U79273 32 ArgBPIB protein X95677 33 C1q globular domain-binding protein NM 001212 34 Parvin beta NM 013327 35 Hepatitis B virus x interacting protein NM 006402 36 MYST histone acetyltransferase NM 006766 37 Sperm associated antigen 7 NM 004890 38 KIAA0563 gène product NM 014834 39 E74-like factor 3 (ets domain transcription factor) NM 004433 40 Transmembrane protein claudin 5 NM 003277 41 Paternally expressed 10 NM 015068 42 Bromodomain containing protein 1 NM 014577 43 Human cDNA FLJ20717 AK000724 44 Splicing factor, arginine/serine-rich 5 NM 006925 45 Atrophin-1 NM 001940 46 Ubiquitin protein ligase NM 130466 47 Homo sapiens cDNA W28170 W28170 48 ATPase, H+ transporting, lysosomal accessory protein 2 NM 005765 49 cDNA DKFZp564D113 AL049250 50 ProSAPiP2 protein NM 014726 51 Activating transcription factor 4 NM 001675 52 Hypothetical protein MGC4022 NM 033420 53 Dexamethasone-induced transcript NM 014015 54 KIAA0794 protein AB018337 55 Hypothetical protein MGC5178 transcript variant 1 NM 024044 56 Protocadherin gamma subfamily C 3, transcript variant 1 NM 002588 57 G-protein alpha inhibiting activity polypeptide 3 NM 006496 4 58 Thymosin beta 10 M92383 59 Nucleolin NM 005381 60 HMT1 hnRNP methyltransferase-like 2 NM 001536 61 Coated vesicle membrane protein NM 006815 62 Estrogen receptor binding site associated antigen 9 NM 004215 63 dUTP pyrophosphatase NM 001948 64 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A member 1 NM 001539 65 SOCS box-containing WD protein SWiP-1, transcript variant 1 NM 015626 66 RAN binding protein 1 NM 002882 67 RNA binding motif protein 14 NM 006328 68 Syntaxin 6 6 NM 005819 Parmi ces gènes, on peut distinguer des gènes dont la fonction est connue mais qui n'ont jamais été mis en relation avec le cancer du sein (SEQ ID N 2 à 7 ; 9 ; 11 ; 12 ; 15 à 19 ; 21 ; 22 ; 26 ; 28 ; 29 ; 32 à 37 ; 40 à 42 ; 44 à 46 ; 48 ; 53 ; 55 à 61 ; 63 ; 64 ; 66 ; 68 ainsi que des gènes dont la fonction est inconnue (SEQ ID N 10; 13 ; 14 ; 20 ; 23 à 25 ; 27 ; 31 ; 38 ; 43 ; 47 ; 49 ; 50 ; 52 ; 54 ; 65 ; 67). Il est bien entendu que si différentes isoformes de ces gènes existent, toutes les isoformes sont relevantes pour la présente invention, et pas uniquement celles présentées dans le précèdent tableau. L'analyse de l'expression d'un panel de gènes cibles est connue dans la lutte contre le cancer du sein, et on peut citer notamment l'analyse d'un panel de 176 gènes qui est exprimé différentiellement entre des patientes exprimant le récepteur ESR et des patients n'exprimant pas le récepteur ESR (Bertucci et al, Human Molecular Genetics, 2000 ; 9 : 2981-2991). Toutefois, si ce panel de gènes permet de déterminer si une patiente répondra à une hormonothérapie, il ne permet nullement de connaître, après cette hormonothérapie, si la patiente présente un risque important de rechuter après ce 1er traitement. On peut citer également l'analyse d'un panel de 70 gènes qui est exprimé différentiellement entre des patientes développant une rechute après 5 ans (patientes de mauvais pronostic) et des patientes ne développant pas de rechute après 5 ans (patientes de bon pronostic) (Van't Veer et al, Nature, 2002,415 : 530-535). Toutefois, ce panel ne permet pas de classifier correctement toutes les patientes, et 17% des patientes étaient mal classifiées. A ce titre, l'invention concerne un procédé pour le pronostic du cancer du sein chez un patient atteint d'un cancer du sein caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 68 ; c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles. Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire, préférentiellement un échantillon de tumeur ou de moelle osseuse. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible. Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : # une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet: o WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO 99/53304 sur la lyse électrique, o WO 99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). # une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet : et WO-A- 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n 28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSil Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE- Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana : matriceXtra-Bind). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'éthanol 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en solution . Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement les ARN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter les ARN avec de l'éthanol 100%. Les ARN peuvent alors être culotés par centrifugation, lavés et remis en solution. Lors de l'étape b, et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par ) recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la ; thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau ) du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P. E. Nielsen et al, Science, 254,1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au ; moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique on entend un processus générant de multiples copies d'un ) fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159, - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, permettant l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend préférentiellement une sonde d'hybridation. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n 45 (4), p. 453-458 ou Keller G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où est fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : phénomène d'hybridation, c'est-à- dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), et les complexes ADNc ou ARNc marquées/ sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996,274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 40-44 ; F.Ginot, Human Mutation, 1997, n 10, p.1-10; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n 22 (15), p. 2915- 2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication. Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes présynthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques dizaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots, dit zones de reconnaissance, d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites macroarrays , qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. On peut toutefois déposer en fond de plaque de microtitration un certain volume d'échantillon dans chaque puits, comme c'est le cas dans les demandes de brevet WO-A-00/71750 et FR 00/14896, ou déposer au fond d'une même boîte de Pétri un certain nombre de gouttes séparées les unes des autres, selon une autre demande de brevet FROO/14691. La deuxième technique de fixation des sondes sur le support ou puce est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ (voir notamment les demandes de brevet WO 89/10977 et WO 90/03382), et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides. Elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre. Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. Il s'agit également d'une synthèse in situ. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (um2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs centaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont utilisables avec la présente invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) définie précédemment comprend au moins une sonde d'hybridation, qui est préférentiellement immobilisée sur un support. Ce support est préférentiellement une biopuce telle que définie précédemment. Lors de l'étape c) la détermination de l'expression d'un gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier. D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm. L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on détermine simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par la détection de plusieurs ARNm différents, chaque ARNm étant issus d'un gène cible. Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' ADNc spécifiques du gène cible ou d' ADNc provenant des ARNm issus du gène cible . Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. En PCR, on peut également amplifier simultanément plusieurs ADNc différents, chacun étant spécifique de différents gènes cibles par l'utilisation de plusieurs couples d'amorces d'amplification différents, chacune étant spécifique d'un gène cible : parle alors d'amplification en multiplex. 3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces techniques d'électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA, J Mol Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti AMethods, 2001, 25 : 386-401. Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. Préférentiellement, le support est une biopuce. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridés les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type T7 polymérase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible. 2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment. 3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybridé un grand nombre de sondes. L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 68 permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic du cancer du sein. On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le risque de rechute, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant un fort risque de rechute et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients ayant un faible risque de rechute. Ceci permet de déterminer si le patient a un fort ou un faible risque de rechute, afin de lui proposer un traitement adapté. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, lors de l'étape b), on met en contact le matériel biologique avec au moins 57 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 57 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins au moins 5, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50 ou au moins 55 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins au moins au moins 5, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50 ou au moins 55 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 10 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 10 desdits gènes cibles. Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ IDN 7;8;12;13; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 et on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 desdits gènes cibles. Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemples explicatifs et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 présente la classification de 40 échantillons de tumeurs issus de patientes ayant un fort risque de rechute (R) ou un faible risque de rechute (NR) grâce à l'analyse d'un panel de gènes selon l'invention (57 gènes ayant une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N 1 à 57 présentées précédemment dans le tableau 1). Les cercles représentent la probabilité qu'un patient donné soit un patient NR alors que les triangles représentent la probabilité que le patient soit un patient R. A titre indicatif, le patient 442 NR est classé comme un patient NR avec une probabilité d'environ 95 %. La figure 2 est établie selon les mêmes principes que la figure 1 et représente la classification de 40 échantillons de tumeurs issus de patientes ayant un fort risque de rechute (R) ou un faible risque de rechute (NR) grâce à l'analyse d'un deuxième panel de gène selon l'invention (10 gènes ayant une séquence nucléotidique choisis parmi les SEQ ID N 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 présentés précédemment dans le tableau 1). Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1: Recherche d'un profil d'expression pour lepronostic du cancer du sein Caractéristiques des échantillons biologiques : L'exemple présenté ci après a été réalisé à partir de 40 échantillons de tumeurs du sein, obtenus auprès du Centre Léon Bérard (CLB) à Lyon, France. Toutes les tumeurs ont été obtenues par un prélèvement chirurgical effectué préalablement à toutes thérapies (hormonothérapie, radiothérapie ou chimiothérapie). On pouvait distinguer des patientes ayant un fort risque de rechute (R) (18 patientes) et des patientes ayant un faible risque de rechute (22 patientes). Extraction du matériel biologique (ARN totaux) de l'échantillon biologique: les ARN totaux ont été extraits de 40 échantillons tumoraux, par l'utilisation d'un tampon Trizol#. Après l'étape d'homogénisation dans 1 à 1,5 ml de tampon Trizol (Invitrogen, Cergy Pointoise, France), les homogénats ont été traités avec 300 (il de chloroforme pour éliminer les contaminants protéiques et lipidiques. Les ARN ont ensuite été précipités avec 750 L d' isopropanol, et lavés deux fois dans de l'éthanol 80 % ethanol (vol/vol) et resuspendus dans de l'eau DEPC. Les ARN totaux ont ensuite été purifiés dans des colonnes Qiagen RNeasy columns (Qiagen, Hilden, Germany) selon les instructions du fabriquant, à l'exception de l'élution finale qui a été réalisée dans 200 III d'eau RNAse free après une minute d'incubation à 65 C. Avant l'étape de transcription reverse, une étape de précipitation supplémentaire a été réalisée par une solution d'acétate d'ammonium (0,5 volumes, 7,5M) et éthanol (2,5 volumes) afin d'accroître la concentration et la purification des ARN totaux. L'intégralité et la qualité des ARN totaux ont été vérifiées par le bioanalyseur AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Exemple 2. Synthèse des ADNc et marquage des sondes ARNc Synthèse d'ADNc, obtention des ARNc et marquage des ARNc et quantification : Afin d'analyser l'expression des gènes cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux tels que purifiés ci dessus, ont été obtenus à partir de 10 g d'ARN totaux par l'utilisation de 400 unités de l'enzyme de transcription reverse SuperScriptII (Invitrogen) et 100 pmol d'amorce poly-T contenant le promoteur de la T7 promotor (T7-oligo(dT) 24-primer, Proligo, Paris, France). Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été extraits avec du phénol/chloroforme, et précipités tel que décrit précédemment par de l'acétate d'ammonium et de l'éthanol, et remis en solution dans 24 l d'eau DEPC. Un volume de 20 l de cette solution purifiée d'ADNc a fait l'objet ensuite d'une transcription in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase T7 qui reconnaît spécifiquement le promoteur de la T7 polymérase tel que mentionné ci dessus. Cette transcription permet d'obtenir l'ARNc de l'ADNc. Cette transcription a été réalisée par l'utilisation d'un kit Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), qui permet non seulement d'obtenir l'ARNc mais également l'incorporation de bases cytidine et uridine biotinylées lors de la synthèse de l'ARNc. Les ARNc purifiés ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie, et la solution d'ARNc a été ajustée à une concentration de 1 g/ l d'ARNc. L'étape de clivage de ces ARNc a ensuite été réalisée à 94 C pendant 35 min, par l'utilisation d'un tampon de fragmentation (40 mM de Tris acétate, pH 8,1,100 mM d'acétate de potassium, 30 mM d'acétate de magnesium) afin de provoquer l'hydrolyse des ARNc et obtenir des fragments de 35 à 200 bp. Le succès d'une telle fragmentation a été vérifié par une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%. Mise en évidence d'un profil d'expression des gènes dans les tumeurs de cancer du sein, permettant de discriminer les patientes R et NR L'expression d'environ 10 000 gènes a été analysée et comparée entre des patientes ayant un fort risque de rechute (R) et des patientes ayant un faible risque de rechute (NR). Pour cela, 10 g d'ARNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 l de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à 45 C sur une puce d'expression (Human Genome U95Av2 GeneChip (Affymetrix), qui comporte 12 625 groupes de sondes représentant environ 10 000 gènes selon le protocole d'Affymetrix tel que décrit sur le site internet d'Affymetrix (voir notamment à l'adresse suivante http://www.affymetrix.com/supportJdownloads/manuals/expression s2 manual.pdf). Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de lavage, des ARN qualifiés de contrôle biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (oligo B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, la solution d'ARNc biotinylée et hybridée sur la puce, a été révélée par l'utilisation d'une solution de streptavidine-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti-streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation GeneChip Hybridisation oven (Affymetrix), et le protocole Euk GE-WS2 du protocole d'Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station Fluidics Station 400 (Affymetrix). Chaque puce U95Av2 a ensuite été analysée sur un scanner Agilent G2500A GeneArray Scanner à une résolution de 3 microns afin de repérer les zones hybridées sur la puce. Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité de ARNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel Microarray Suite 5. 0 software (MAS5. 0, Affymetrix). Afin de prévenir les variations obtenues par l'utilisation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normalisation globale utilisant le logiciel Affy , qui permet d'harmoniser la distribution moyenne des données brutes obtenues pour chaque puce. Les résultats obtenus sur une puce peuvent alors être comparés aux résultats obtenus sur une autre puce. Le logiciel MAS5. 0 permettait aussi d'inclure un algorithme statistique pour considérer si un gène était exprimé ou non. Chaque gène représenté sur la puce U95Av2 était couvert par 16 à 20 couples de sondes de 25 oligonucléotides. Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridait parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ARNc issus d'un gène cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariement (on parle alors de sonde MM ou mismatched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithms Référence Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat. Genet. 1 Suppl., 20-24). Les 40 échantillons restants montraient une moyenne de 49,8 % de gènes exprimés. L'analyse des données d'expression a été réalisée par des algorithmes génétiques (Li et al, 2001, Bioinformatics, 17 : 1131-1142 ; Ooi et al, 2003, Bioinformatics, 19 : 37-44). A partir des 12625 groupes de sondes, représentant environ 10 000 gènes, de la puce, les inventeurs ont sélectionné les gènes pertinents qui étaient corrélés à un fort risque de rechute. Pour cela, une première étape a consisté à exclure les gènes présentant un niveau d'expression comparable entre tous les groupes de patientes (Li et al, 2001, Bioinformatics, 17 : 1131-1142). Les gènes non exprimés chez l'ensemble des patientes ont été exclus (logiciel MAS5.0). Certains gènes ont également été exclus si la médiane d'expression des 2 groupes (patientes R et patientes NR) était inférieur à 300 ou si le rapport des médianes d'expression entre les patientes R et NR était compris entre 0,7 et 1,3. L'expression des 1404 gènes restants a ensuite été analysée (algorithme GA, Ooi et al, 2003, Bioinformatics, 19 : 37-44). Cette analyse a permis de mettre en évidence 57 gènes pertinents selon l'invention (SEQ ID N 1 à 57). Une analyse complémentaire (test t) a également permis de mettre en évidence 11 gènes supplémentaires qui s'avéraient également très pertinents (SEQ ID N 58 à 68). L'augmentation ou la diminution d'expression de chacun de ces gènes, observée chez les patientes R par rapport aux patientes NR est indiquée dans le tableau 2. Tableau 2 - liste des 68 gènes exprimés différentiellement dans les cancers du sein des patients R et NR SEQ ID N Description de la séquence N Genbank Expression rechute vs. non-rechute Hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit, 1 transcript variant 1 NM 001530; augmentée 2 Neurotrophic tyrosine kinase receptor type 3 NM 002530 diminuée 3 Heat shock 70kD protein 8, transcript variant 1 NM 006597; augmentée 4 Macrophage stimulating 1-receptor NM 002447 diminuée 5 Ubiquitin C NM 021009 augmentée 6 Splicing factor, arginine/serine-rich 10 NM 004593 augmentée 7 RNA binding motif protein 5 NM 005778 diminuée v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene 8 homolog NM 005252 augmentée 9 Guanine nucleotide releasing factor (SOS2) L20686 diminuée Similar to immunoglobulin kappa chain 10 variable région M20707 diminuée 11 Homogentisate 1,2-dioxygenase NM 000187 augmentée 12 Far upstream element-binding protein 3 U69127 augmentée 13 Human clone 23801 mRNA séquence U79282 augmentée 14 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:2413286 AI817548 augmentée 15 Small nuclear RNA U2 BC003629 diminuée 16 DNA excision repair protein 2 NM 000400 diminuée 17 Biliverdin reductase A NM 000712 augmentée 18 Phytanoyl-CoA hydroxylase precursor NM 006214 augmentée Rab3 GTPase-activating protein, non-catalytic 19 subunit NM 012414 diminuée 20 cDNA DKFZP564F0522 AL049943 augmentée 21 Kinesin family member 5B NM 004521 diminuée 22 Wolframin NM 006005 augmentée 23 Hypothetical protein FLJ10849 NM 018243 diminuée 24 Hypothetical protein FLJ31657 NM 152758 augmentée 25 KIAA0792 gène product NM 014698 diminuée 26 Signal transduction protein CBL-B NM 170662 augmentée 27 cDNA DKFZp586F1922 AL050379 diminuée 28 Splicing factor, arginine/serine-rich 2 NM 003016 augmentée 29 Slow skeletal muscle troponin T NM 003283 augmentée 30 Serine/threonine kinase 38 NM 007271 diminuée 31 Human clone 23933 mRNA séquence U79273 diminuée 32 ArgBPIB protein X95677 diminuée 33 Clq globular domain-binding protein NM 001212 augmentée 34 Parvin beta NM 013327 diminuée 35 Hepatitis B virus x interacting protein NM 006402 augmentée 36 MYST histone acetyltransferase NM 006766 diminuée 37 Sperm associated antigen 7 NM 004890 augmentée 38 KIAA0563 gène product NM 014834 diminuée E74-like factor 3 (ets domain transcription 39 factor) NM 004433 augmentée 40 Transmembrane protein claudin 5 NM 003277 augmentée 41 Paternally expressed 10 NM 015068 augmentée 42 Bromodomain containing protein 1 NM 014577 augmentée 43 Human cDNA FLJ20717 AK000724 diminuée 44 Splicing factor, arginine/serine-rich 5 NM 006925 augmentée 45 Atrophin-1 NM 001940 diminuée 46 Ubiquitin protein ligase NM 130466 augmentée 47 Homo sapiens cDNA W28170 W28170 diminuée ATPase, H+ transporting, lysosomal accessory 48 protein 2 NM 005765 augmentée 49 cDNA DKFZp564D113 AL049250 diminuée 50 ProSAPiP2 protein NM 014726 augmentée 51 Activating transcription factor 4 NM 001675 augmentée 52 Hypothetical protein MGC4022 NM 033420 augmentée 53 Dexamethasone-induced transcript NM 014015 augmentée 54 KIAA0794 protein AB018337 diminuée Hypothetical protein MGC5178 transcript 55 variant 1 NM 024044; augmentée Protocadherin gamma subfamily C 3, transcript 56 variant 1 NM 002588; diminuée G-protein alpha inhibiting activity polypeptide 57 3 NM 006496 augmentée 58 Thymosin beta 10 M92383 augmentée 59 Nucleolin NM 005381 augmentée 60 HMT1 hnRNP methyltransferase-like 2 NM 001536 augmentée 61 Coated vesicle membrane protein NM 006815 augmentée Estrogen receptor binding site associated augmentée 62 antigen 9 NM 004215 63 dUTP pyrophosphatase NM 001948 augmentée DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A member augmentée 64 1 NM 001539 SOCS box-containing WD protein SWiP-1, diminuée 65 transcript variant 1 NM 015626; 66 RAN binding protein 1 NM 002882 augmentée 67 RNA binding motif protein 14 NM 006328 augmentée 68 Syntaxin 6 6 NM 005819 augmentée Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de 57 gènes de séquence nucléotidique choisi parmi les SEQ ID N 1 à 57 du tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 1, qui présente la classification des 5 patientes NR et R selon leur profil d'expression. 85% des patientes étaient correctement classifiées. Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 58 gènes est un bon outil pour discriminer les patientes ayant un fort risque de rechute des patientes ayant un faible risque de rechute. 10 Les inventeurs ont également mis en évidence un panel de gènes plus restreint, permettant également de discriminer les patients R et NR. Tableau 3 - liste des 10 gènes exprimés différentiellement dans les cancers du sein des patients R et NR SEQ ID Description de la séquence N Genbank Expression R vs. N NR 7 RNA binding motif protein 5 NM 005778 0,6 v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene 8 homolog NM 005252 2,3 12 Far upstream element-binding protein 3 U69127 1,6 13 Human clone 23801 mRNA séquence U79282 1,7 22 Wolframin NM 006005 1,7 24 Hypothetical protein FLJ31657 NM 152758 2,1 41 Paternally expressed 10 NM 015068 4,3 47 Homo sapiens cDNA W28170 W28170 0,5 53 Dexamethasone-induced transcript NM 014015 1,5 Hypothetical protein MGC5178 transcript variant NM~024044; 55 1+2 NM 178044 2,0 Les résultats sont présentés dans la figure 2, qui présente la classification des patientes NR et R selon leur profil d'expression. 92,5 % des patientes étaient correctement classifiées. Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 10 gènes est un bon outil pour 5 discriminer les patientes ayant un fort risque de rechute des patientes ayant un faible risque de rechute. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le pronostic du cancer du sein chez un patient atteint d'un cancer du sein caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 68, c. on détermine l' expression d'au moins un desdits gènes cibles. 2. Procédé pour le pronostic du cancer du sein selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la au moins une sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support est une biopuce. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 57 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 57 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 57 desdits gènes cibles. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 10 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 7 ; 8 ; 12 ; 13 ; 22 ; 24 ; 41 ; 47 ; 53 ; 55 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 10 desdits gènes cibles.