Brevet FR2866347A1 — publié le 20050819

La présente invention est relative à de nouveaux polypeptides et polynucléotides utilisables pour lutter contre des champignons pathogènes des plantes, et notamment contre Sclerotinia. Sclerotinia sclerotiorum est un champignon phytopathogène qui peut infecter de nombreuses cultures (PURDY, Phytopathology, 69, 875-880, 1979) parmi lesquelles le tournesol, le colza, le chou, la laitue, le soja, le citronnier, la tomate, le melon, le concombre, ou encore le haricot de grande culture Chez le tournesol, il est l'agent de la pourriture blanche aussi appelée sclérotiniose ou pourriture sclérotique, qui constitue une maladie majeure contre laquelle il n'existe pas de lutte chimique efficace. L'infection par Sclerotinia est visible depuis la formation du bouton floral jusqu'à la fin de floraison du Tournesol. A partir de la floraison, sur feuille, pétiole et tige apparaissent une décoloration puis un ramollissement des organes atteints; un mycélium blanc et dense les colonise, et est souvent observable à l'extérieur de la tige où il se condense en certains points avant de former des sclérotes; du fait d'une moindre résistance des tissus, la tige peut casser et verser. A maturité, sur la face fleurie du capitule apparaissent des taches translucides; le mycélium blanc et dense se condense ici en grille de sclérotes. L'intégralité des tissus du capitule est désagrégée par l'agent pathogène. Ne vont subsister que les fibres libéro-ligneuses du sommet de la tige donnant à celui-ci un aspect de fouet. La culture du tournesol connaît par conséquent des irrégularités de rendement dues aux pertes de production causées par ce champignon. Parmi les stratégies de lutte actuellement proposées, on citera notamment la sélection de variétés résistantes, afin de les utiliser pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l'infection à Sclérotinia est une des voies actuelle majeure dans la recherche sur les interactions plantes-pathogènes. Cela inclut par exemple l'identification de facteurs pathogènes essentiels dans la virulence et le développement des moyens pour les inhiber ou encore le transfert de gènes de résistance dans les plantes sensibles, afin d'augmenter leur résistance. Par exemple, le gène de l'oxalate oxydase, qui est une enzyme capable de détruire les phytotoxines produites par Sclerotinia, a été utilisé et décrit dans la demande PCT WO 92/1568. Actuellement, les stratégies et outils de l'art antérieur ne sont pas suffisants pour lutter contre l'infection ravageuse de ce champignon pythopathogène et il existe un besoin réel d'isoler de nouveaux outils afin de permettre l'obtention d'une résistance à Sclérotinia dans les espèces qui en subissent l'infection, et notamment les espèces cultivées sensibles et d'intérêt industriel. Il est donc important d'identifier d'autres gènes impliqués dans la résistance à Sclerotinia afin de pouvoir augmenter le niveau de résistance des plantes cultivées sensibles et améliorer le rendement des cultures d'intérêt. Les Inventeurs ont isolé, à partir d'Helianthus annuus un nouveau gène codant pour une protéine de la famille des kinases à sérine et thréonine, et associé à la résistance du Tournesol à Sclerotinia. Ce gène, dénommé ci-après PK-P ou Ha-lecRK code pour une protéine de type lectine protéine-kinase. En comparant la séquence polypeptidique déduite de ce gène à celles de gènes connus, on révèle une homologie avec deux gènes, LRK-1 (SWARUP et al., Plant Physiol., 111, 347-347, 1996) et Lec-RK1 (HERVE et al., Plant Mol Biol., 39, 671-82, 1999) d'Arabidopsis thaliana. Le gène At-LecRK1 d'A.thaliana est activé au cours de la sénescence naturelle et en réponse aux blessures et aux oligogalacturonides; il joue vraisemblablement un rôle dans le programme de développement et les processus adaptatifs (HERVE et al., 1999, précité). L'analyse comparative de séquences polypeptidiques déduites du gène PK-P (Ha-lecRK) sur des génotypes de tournesol présentant des niveaux de sensibilité variable à Sclerotinia a été réalisée. La Figure 1 représente les résultats de cette comparaison. Légende de la Figure 1: Tournesols résistants sauvages: écotypes 101 et 103 (SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 9) ; tournesols cultivés (partiellement résistants) . lignées PAC1, PAC2, PSC8, et SD (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13) ; tournesols cultivés sensibles: lignées CP73, XRQ, et GH (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17) ; les acides aminés indiqués en gras et sur fond grisé dans les séquences des lignées partiellement résistantes PAC1, PAC2, PSC8, et SD correspondent aux principales mutations observées dans ces lignées par rapport aux plantes sauvages résistantes. Les positions du domaine lectine, du domaine transmembranaire, et du domaine kinase sont indiquées au dessus de l'alignement des séquences. Cette analyse met en évidence, chez les génotypes sensibles à Sclerotinia, une modification importante de la partie kinase' du gène: interruption ou décalage du cadre de lecture. Des différences existent en outre entre les lignées de tournesol sauvages résistantes à la maladie et les lignées de tournesol cultivé exprimant une résistance partielle. Ces différences portent sur la modification de divers acides aminés sur la protéine. Il est particulièrement intéressant d'isoler de nouvelles séquences polynucléotidiques permettant d'obtenir la résistance à l'infection pour les cultures sensibles et plus particulièrement pour les tournesols cultivés sensibles ou partiellement résistants. La séquence polynucléotidique (SEQ ID NO: 1) codant pour la protéine PK-P du tournesol sauvage écotype 101 est indiquée ci-dessous: ATGTCTCCTCATCCACCACCATGTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCCACCTCCACCTCCTC CCAATCCACCCCACTCTCTCCCAATCCTTCATCTACACCACCTTCAACCCCACCAACCTA ACCACCAACGGCAACGCCACCATCACCACCACCGGCATCCTTAAACTCACCAACGTAAGC TCCCACACCATCGGTCACGCTCTCTACCCACACCCCATCTGTTTCAAAACACCCCACACC AATACCACTCTCTCATTCTCCACCGCTTTTGTCTTCTCCATCGTCCCACGATACCGCAAA CTCGGTGGTCATGGCCTTGCTTTCACCATCTCTCCGACCAAACACTTCATCGGAGCCCAA CCTAGTCAATACCTCGGACTTGTCAACGTTACTTCAAACGGTAACTCATCAAACCATCTT TTTGCTATAGAGTTTGACACCGTTCAAGATCTTGAGTTTTCTGATATTAACGACAACCAT GTTGGTGTTAACATTAACCATATGAAGTCGGTTAATTCGACGAAAGCCGGATTTTTCGTT GATGGGAATGTTACTAAACAGGATCTTTGTTTACATAGTGGGAAAAAGATTCAAGCTTGG GTTGATTATGATGCTGAAAAACATCAAGTTGATGTTTATCTTTCTTTATTTTCAAACAAA CCAAGAAAGGCGATCATGTCGGTTTTCGTCGATTTAACACCGGTTTTTCAAGAGTTTATG TACGTGGGGTTTTCTTCATCAACCGGTGTTCTTGCTAGCTCGCATTATGTGTTTGGTTGG AGCTTTAACATGAGTGGAAATGCAAGTTCTTTGAATGTGGATCAGTTTCCTGAACCTGTT CTGCCATTTAAAAAGAACAATAATAAAGGTTTCGTGTTCCGGTTTGGTACTACTTTGTTT TTGGTTTTTTGTATTTTTGTGATAATGGGTGGTGTTTATATTATCAAGAAGTTTAAGATA ATTAAGAAGACAGAAGCGGTTGAAAGTTGGGAGCTTGATTTGGGCCCACATTCATATTGT TATAGAGAGTTGAAAGAGGGTACAAAGGGGTTTAATGAGAAGTTTTTAATTGGGTTTGGT GGGTCGGGTAAGGTTTATAAAGGGGTGTTGCCGGATTCGGGGATGGAAATCGCGGTGAAG CGGATTTCACGGCAGTCGAAACAAGGGCAGAAGGAGTTTTTGTCGGAGGTGTCGACGATT GGGCGGCTTCGGCACCGGAATTTGGTGCAGTTGTTGGGTTGGTCTAGGAATAAAGGTGAG TTGTTGTTGGTTTATGAGTTTATGGCTAATGGAAGTTTGGATAAGTGTATATATAGTGGT AATAAGCCTAAATTGGTTTTGAGTTGGGAACAAAGGTTTAAGGTTATAAAAGATGTGGCA AATGGGTTGCTTTATTTGCATGAAGGGTGGGAACAAACTGTGGTGCATAGAGATATTAAA GCAGGAAATGTGTTGTTGGATTCTGATTTGAATGGTAAGTTAGGCGATTTCGGGTTGGCT AAGTTGTATGAGCATGGGTCGAACCCGGTAACCACTAAAGTGGTGGGCACATTGGGTTAC TTGGCTCCTGAGCTAACCCGAACGGGTAAGCCCACCACGGGTTCGGATGTGTATGCATTC GGGGCTCTTTTGTTGGAAGTGGTGTGTGGACGGAGACCCGCTGAGCTCAAGGCGTCACCG GAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAGTGGCGAGAAGGGTGTTTACTTGAT GTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGTTGAAGTTACGATGGTTTTGAAG GTTGGGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATGAGGCAGGTGATT CGGTACTTGGAGAGGGAGGCGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTTATGGTATT GTGATGGAGATTGATCGGCATGCACCTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTGTGA La séquence polypeptidique déduite (SEQ ID NO: 2) est indiquée ci-dessous (en code 1-lettre) . MSPHPPPCLLLLFLLHLHLLPIHPTLSQSFIYTTFNPTNLTTNGNATITTTGILKLTNVS SHTIGHALYPHPICFKTPHTNTTLSFSTAFVFSIVPRYRKLGGHGLAFTISPTKHFIGAQ PSQYLGLVNVTSNGNSSNHLFAIEFDTVQDLEFSDINDNHVGVNINHMKSVNSTKAGFFV DGNVTKQDLCLHSGKKIQAWVDYDAEKHQVDVYLSLFSNKPRKAIMSVFVDLTPVFQEFM YVGFSSSTGVLASSITYVFGWSFNMSGNASSLNVDQFPEPVLPFKKNNNKGFVFRFGTTLF LVFCIFVIMGGVYIIKKFKIIKKTEAVESWELDLGPHSYCYRELKEGTKGFNEKFLIGFG GSGKVYKGVLPDSGMEIAVKRISRQSKQGQKEFLSEVSTIGRLRHRNLVQLLGWSRNKGE LLLVYEFMANGSLDKCIYSGNKPKLVLSWEQRFKVIKDVANGLLYLHEGWEQTVVHRDIK AGNVLLDSDLNGKLGDFGLAKLYEHGSNPVTTKVVGTLGYLAPELTRTGKPTTGSDVYAF GALLLEVVCGRRPAELKASPEELILVDWVWDKWREGCLLDVVDSRLKGEFNEVEVTMVLK VGLMCSNDEPSSRPSMRQVIRYLEREAPVPEIVGPSCYGIVMEIDRHAPALVKLKSL La présente invention a pour objet un polypeptide isolé intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il présente au moins 60%, de préférence au moins 65%, de manière tout à fait préférée au moins 70%, et avantageusement, par ordre de préférence croissante, au moins 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2. On entend ici par polypeptide intervenant dans la résistance d'une plante à Sclérotinia un polypeptide dont l'expression ou l'activité sont corrélés au niveau de résistance à Sclérotinia. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques et les pourcentages d'identité ou de similarité indiqués pour les séquences peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut. La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi: a) un polynucléotide codant pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider 30 sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b). Selon la présente invention, on définit comme polynucléotide codant pour un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide. Il peut s'agir par exemple d'une séquence codante, d'un ADNc ou d'un ARNm, ou d'un fragment d'ADN génomique. Un exemple non limitatif de polynucléotide conforme à l'invention, codant pour un polypeptide favorisant la résistance à Sclerotinia, est représenté par le polynucléotide SEQ ID NO: 1. La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 15 pb, avantageusement au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucléotide a) ou b) cidessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec ce polynucléotide ou son complémentaire. Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5 C à 10 C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire. On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique (par exemple une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres kinases, ou des séquences codant pour des protéines, autres que les polypeptides conformes à l'invention, possédant un domaine lectine, ou un domaine GDI. La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention, ou de fragments de ceux- ci, tels que définis ci-dessus. A titre d'exemples d'amorces d'amplification conformes à l'invention, on peut citer celles du couple suivant: PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3' PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' qui permettent d'amplifier la totalité de la séquence codant pour PK-P à partir d'une banque d'ADN de tournesol. La présente invention englobe aussi tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance à Sclerotinia, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention. Ceci inclut notamment les différents allèles du gène PK-P, du tournesol, et notamment les allèles capables d'augmenter la résistance à Sclerotinia, ainsi que des orthologues du gène PK-P, chez des plantes autres que le tournesol. La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante, et notamment la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia. Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, peuvent par exemple être définis à partir de la séquence SEQ ID NO: 1 ou des séquences d'ADNc ou d'ADN génomique correspondantes, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes de différents niveaux de résistance à Sclerotinia, afin de détecter les polymorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la forme associée à un niveau de résistance déterminé. Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène. De préférence, il s'agit de polymorphismes se traduisant par des modifications de la séquence peptidique de la protéine. Des exemples de polymorphismes de ce type sont ceux se traduisant par les modifications de séquence peptidique représentées sur la figure 1. Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène, qui peuvent se traduire par une modification de séquence de la protéine, ou par une modification de son niveau d'expression. Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes. Des plantes possédant un allèle du gène PK-P favorables à la résistance à Sclerotinia ainsi identifié peuvent être utilisées comme source de matériel génétique pour améliorer la résistance à Sclerotinia de plantes non-résistantes ou faiblement résistantes, par exemple par introgression dudit allèle dans lesdites plantes. La présente invention englobe également l'utilisation de polynucléotides conformes à l'invention pour la détection de la forme allélique du gène PK-P présente chez une plante et notamment pour la détection de la présence ou de l'absence d'allèles du gène PK-P favorables à la résistance à Sclerotinia. La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation du niveau de résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante. Ce procédé peut notamment être mis en oeuvre pour la sélection de plantes resistantes a Sclérotinia, par détection chez lesdites plantes d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclérotinia. Ladite plante peut appartenir à une quelconque des espèces sensibles à Sclerotinia. Avantageusement, il s'agit du tournesol, ou du colza. La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en uvre des méthodes de détection définies ci-dessus. En particulier la présente invention a pour objet tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène PK-P comprenant au moins un polymorphisme associé au niveau de résistance à Sclerotinia. La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification. La présente invention a aussi pour objet: - une cassette d'expression recombinante comprenant un polynucléotide conforme à l'invention, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; - un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe aussi des cellules hôtes génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention. De préférence, il s'agit de cellules hôtes comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention. On définit comme cellule hôte génétiquement transformée toute cellule hôte dont le contenu génétique a été modifié par introduction d'une information génétique étrangère. Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales. La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule. Le choix du vecteur-hôte et des séquences de régulation de l'expression sont effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour augmenter la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un polypeptide présentant au moins 45% de préférence au moins 50%, de manière tout à fait préférée au moins 55%, et avantageusement, par ordre de préférence croissante, au moins 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, ladite plante est transformée par une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe également des plantes transgéniques susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes et les hybrides obtenus par croisement, contenant un transgène comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. L'invention concerne de plus les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines transformés par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention. Des plantes transgéniques ou parties de plantes conformes à l'invention peuvent avantageusement être obtenues à partir de plantes d'espèces sensibles à Sclerotinia, et notamment d'espèces telles que le tournesol ou le colza. La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les techniques classiques, qui sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Classiquement, le polynucléotide que l'on souhaite exprimer dans la plante transformée est associé à des séquences de régulation de l'expression appropriées incluant notamment un promoteur. Ces séquences de régulation de l'expression peuvent être les séquences endogènes du gène que l'on souhaite exprimer, il peut s'agir également, en totalité ou en partie, de séquences hétérologues. Le choix d'un promoteur approprié, parmi la très grande variété disponible, dépendra de la plante que l'on souhaite transformer, ainsi que du profil d'expression que l'on souhaite obtenir (par exemple constitutif, inductible ou tissu-spécifique). A titre d'exemples de promoteurs pouvant avantageusement être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment les promoteurs des gènes PR5- 2 ou BAP, inductibles par Sclérotinia, qui sont décrits dans le Brevet US 6667427. Un très grand assortiment de méthodes pour l'introduction de polynucléotides dans des cellules végétales, des tissus végétaux, ou des plantes est également disponible. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante que l'on souhaite transformer. A titre d'exemples non-limitatifs, pour la transformation du tournesol, on peut utiliser les techniques décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement de la séquence codant pour la protéine PK-P et l'utilisation de cette séquence pour la transformation de plantes. EXEMPLE 1: ISOLEMENT DU GENE PK-P La séquence codante du gène PK-P est obtenue à partir d'ADN génomique de tournesol en utilisant les amorces suivantes. PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3' PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' Les conditions d'amplification PCR sont les suivantes: Mélange réactionnel: Tampon "Advantage 2 PCR" 10X (BD BIOSCIENCES) 5 l Mélange de dNTP 10mM 1.5 l Amorce PKP Forward (100ng/ l) 1 l Amorce PKP Reverse (100ng/ l) l 1 Polymérase Taq "Advantage 2 polymerase Mix" (BD 1 1 BIOSCIENCES) ADN génomique 500 ng Eau qsp 50 l 15 Conditions de réaction - 95 C 5mn - (95 C, 30 s; 58 C, 30s; 72 C 2 mn) X 35 cycles - 72 C 5 mn - 4 C EXEMPLE 2: CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION ET TRANSFORMATION DU TOURNESOL Construction du plasmide pkp101.1pBIN La séquence codante du gène PK-P, (écotype 101, SEQ ID NO: 1) en orientation sens est clonée dans le vecteur pGemT easy (Promega). Un site BamHI est inséré en 5' et un site Pstl est inséré en 3' du gène PK-P, en utilisant le couple d'amorces: >PKP Forward/BamHI (SEQ ID NO: 5) CGGGATCCC GAT CAC CGA CAA ATG TCT CCT >PKP Reverse/Pstl (SEQ ID NO: 6) AACTGCAGAACCAATGCATTTCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT, (les sites introduits sont soulignés). Le produit PCR à bouts francs obtenu est sous-cloné dans le vecteur PCRBluntll-Topo (Invitrogen), pour donner le vecteur pkpl0l.l-BluntII-TOPO. L'insert BamHI/Pstl contenant la séquence PK-P est excisé du vecteur pkpl0l.l-BluntII-TOPO, et introduit dans un vecteur d'accueil (pUCNveaupolylinker), préalablement linéarisé par BamHI et Pstl, entre le promoteur 35S et le terminateur Tnos. Le vecteur obtenu est dénommé PucNveauPoly-P35S-PKP101.1. Le vecteur PucNveauPoly-P35S-PKP101.1 est digéré par StuI et EcoRI. L'insert 35S-PKP-Tnos résultant de cette digestion est introduit dans le vecteur binaire pBIN19 (BEVAN et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984), préalablement ouvert par Hind III, pourvu de bouts francs par action de la polymérase de Klenow, puis digéré par EcoRI. Le vecteur résultant, dénommé pkpl01.1pBIN est schématisé sur la Figure 2. L'ensemble de ces constructions est réalisé dans 20 E.coli DH5a Construction de vecteurs antisens: pkpXantisenspBlN et pkpXantisenspBINGUS Une séquence de la région 3' du domaine kinase de PK- P, représentée ci-dessous (SEQ ID NO: 7), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBINl9. CGTCACCGGAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAGTGGCGAGACGGGCGTT TACTTGATGTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGGTGAAGTTACGATGG TTTTGAAGGTTGGGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATGAGGC AAGTGATTCGGTACTTGGAGAGGGAGGGGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTA ATGGTGTTGTGATGGAGATTGATCGGCATGCACTTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTG Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBlN est schématisé sur la Figure 3 A. La même construction a été réalisée en associant la séquence antisens de PK-P avec le gène rapporteur GUS. Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBINGUS est schématisé sur la Figure 3 B. pkpantisens(Lect-Kin) pBIN Une séquence de la région lectinekinase de PKP, représentée ci-dessous (SEQ ID NO: 8), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBIN19. GATCCGAAATCCGCTTCACCGCTATTTCCACCCCCGAATCCGGCAACACCCCTTTGTAAA CCTTACCCGACCCACCAAACCCAATTAACAACTTCTCATTAAACCCCTTTGTACCCTCTT TCAGCTCTTTATAACAATATGAATGTGGGCCCAAACCAAGCTCCCAACTTTCAACCGCTT CTGTCTTCTTAATTATCTTAAACTTCTTGATAATATAAACACCACCCATTATCACAAAAA TACAAAAAACCAAAAACAAAGTAGTACCAAACCGGAACACGAAACCTTTATTATTGTTCT TTTTCAATGGCAGAACAGGTTCAGGAAACTGGTCCACATTCAAAGAACTTGCATTTCCAC TCATGTTAAAGCTCCAACCAAACACATAATGCGAGCTAGCAAGAACACCGGTTGATGAAG AAAACCCCACGTACATAAACTCTTGAAAAACCGGTGTTAAATCGAAGAAAACCGACATGA TCGCCTTTCTTGGTTTGTTTGAAAATAAAGAAAGATAAACATCAACTTGATGGTTTTCAC CATCATAATCAACCCAAGCTTGAATCTTTTTCCCACTATGTAAACAAAGATCCTGTTTAG TAACATTCCCATCGACGAAAAACCCGGCTTTCGTCGAATTAACCGACTTCATATGGTTAA TATTAACACCAACATGGTTGTCGTTAATATCAGAAAACTCAAAATCTTGAACGGTGTCAA ACTCTATAGCGAAAAGATGGTTTGATGAGTTACCGTTTGAAGTAACGTTGACAAGTCCGA GGTATTGACTAGGTTGTGCTCCGATGCTGCA Le vecteur résultant, dénommé pkpantisens(Lect-20 Kin) pBIN est schématisé sur la Figure 4. Transformation du tournesol: Le plasmide choisi pour la transformation est introduit dans la souche GV2260 (DEBLAERE et al. Nucleic Acids Res 13, 4777--4788, 1985) d'Agrobacterium tumefaciens. La transformation du tournesol (lignée HA300 B) est effectuée selon le protocole décrit dans la Demande PCT WO 95/06741, avec les modifications suivantes: les graines sont stérilisées pendant 30 minutes dans de l'eau de javel additionnée de quelques gouttes de détergent (Tween 20), puis rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et la pellicule recouvrant la graine est éliminée en conditions aseptiques. Les graines sont stérilisées comme décrit ci-dessus pendant 20 minutes, rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et mises à tremper pendant une nuit dans l'eau distillée stérile, à 25 C et à l'obscurité. Le lendemain, les cotylédons et les radicules sont éliminés, et les apex sont immergés pendant 30 minutes dans une suspension de la souche GV2260 contenant le plasmide pkpl0l.lpBIN. Après la transformation, les apex sont mis en culture, dans les conditions décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. Caractérisation des transformants Les caractérisations moléculaires (présence et nombre de copies du gène) des transformants sont effectuées par Southern pour les transformants primaires TO et la descendance Tl. Les protocoles utilisés sont décrits ci-10 dessous: 1.1 Prélèvements du matériel biologique: Des disques sont prélevés à 1 emporte pièce sur des feuilles de transformants primaires cultivés en serre, ils sont immédiatement congelés dans l'azote liquide 1.2 Extraction et quantification de l'ADN Après broyage de 50 mg de matériel végétal dans l'azote liquide, l'ADN est extrait selon la méthode de Fulton et al. (Fulton T.M., Chunwongse J. et Tanksley S.D, Plant Molecular Biology Reporter, 1995,13,207-209). L'ADN obtenu est ensuite dosé par une méthode fluorimétrique utilisant le fluorochrome HOECHST 33258. 1.3 Analyses par Southern L'ADN génomique (5 microgrammes) est hydrolysé par 100 Unités de l'Enzyme de restriction EcoRI pendant une 25 vingtaine d'heures à 37 C dans un tampon approprié fourni avec l'enzyme. L'ADN hydrolysé est ensuite separé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% puis transféré par capillarité sur une membrane de nylon ((Nylon Membranes positively charged: Roche Diagnostics 2, avenue du Vercors BP 59 38242 Meylan Cedex). Les membranes de nylon sont ensuite révélées avec du CDP star (Roche Diagnostics) après hybridation (une nuit) avec une sonde froide.selon les recommandations du fabriquant (Roche Diagnostics). La sonde froide est marquée à la digoxygénine par PCR selon les recommandations du fabriquant (Roche Diagnostics) à partir d'ADN plasmidique portant la séquence d'intérêt utilisée pour la transformation du tournesol (PKP sens ou antisens), et le gène de sélection NptII. Pour chaque série d'analyses, des témoins sont utilisés pour valider les résultats: de l'extrait d'ADN génomique du génotype non transformé utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin négatif, de l'ADN plasmidique provenant du vecteur binaire utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin positif. Une échelle de référence (DNA Molecular Weight III Dig labelled Roche Diagnostics) permet d'estimer la taille des fragments révélés par la sonde froide. Les résultats de Southern sur les TO montrent que les transgènes ont un nombre de copies compris entre 1 et 5. Ces résultats sont confirmés sur la descendance (Ti) de plusieurs transformants. REVENDICATIONS 1) Polypeptide isolé, dénommé PK-P, intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il présente au moins 60%, d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2. 2) Polynucléotide isolé choisi parmi a) un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la revendication 1; b) polynucléotide c) sélectivement, polynucléotide 3) un polynucléotide complémentaire du a) ; un polynucléotide capable de s'hybrider en conditions stringentes, avec le a) ; ou le polynucléotide b). Polynucléotide selon la revendication 2, 15 défini par codant pour un susceptible d'être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'une plante à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 2 ou 3. 5) Cassette d'expression recombinante comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 2 à 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 6) Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 2 à 4. 7) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5. 8) Cellule hôte génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 2 à 4. 9) Utilisation d'au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 2 à 4 pour détecter la forme allélique du gène PK-P présente chez une plante. 10) Procédé pour augmenter la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la la séquence SEQ ID NO: 1. 4) Polynucléotide isolé polypeptide selon la revendication 1, 35 transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un polypeptide présentant au moins 45% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2. 11) Plante transgénique susceptible d'être 5 obtenue par un procédé selon la revendication 10. 12) Plante transgénique transformée par une cassette d'expression selon la revendication 5. 13) Plante transgénique selon une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle est 10 choisie parmi le tournesol et le colza. 14) Procédé d'évaluation du niveau de résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante. 15) Procédé de sélection d'une plante résistante à Sclérotinia comprenant la détection chez ladite plante d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclérotinia.