Brevet FR2863499A1 — publié le 20050617

La présente invention a pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier Echinococcus (E.) granulosus et donc de l'hydatidose. L'hydatidose est une zoonose à distribution mondiale provoquée par le cestode E. granulosus. La forme larvaire du parasite infecte les bovins, les ovins, les camelidés, cervidés, etc., et l'homme; elle forme des kystes hydatiques dont les localisations principales mais non exclusives sont le foie et les poumons. Ces kystes bourgeonnent sur leur face interne les larves proprement dites, les protoscolex, qui assureront l'infection des hôtes définitifs du parasite. La forme adulte se développe dans l'intestin des canidés au niveau du duodénum à partir des protoscolex ingérés; les oeufs produits par le parasite adulte sont évacués et disséminés avec les fèces. En zone d'endémie, la prévalence peut être très importante à la fois chez le bétail ( jusqu'à 95% des moutons dans certains districts en Tunisie et au Maroc) et chez le chien (70% des animaux dans la région de Fès, au Maroc) Le parasite est la source de pertes économiques considérables (par exemple, plus de la moitié des abats nobles doivent être détruits au Maroc; les brebis atteintes présentent des phénomènes d'émaciation et de perte en production de laine). Le parasite est également à l'origine d'un problème de santé humaine important: la prévalence chez l'homme atteint 1,43/1000 en zone rurale de la province du Rio Negro, en Argentine, 1,97/1000 dans le Xinjiang en Chine, 2,2/1000 dans le district du Turkana au Kenya, et des valeurs de 20 % ont été relevées localement dans des villages des Andes péruviennes. A titre d'exemple, la moitié des interventions chirurgicales hépatiques au Maroc sont liées à ce parasite. Les moyens de lutte actuels se situent essentiellement à 2 niveaux: - la modification des pratiques d'élevage, incluant la surveillance stricte des chiens, vecteurs de dissémination, qui se nourrissent des abats d'animaux d'élevage contaminés et rejetés; ces changements de pratique rencontrent souvent des difficultés d'application notamment dans les pays en voie de développement; - l'utilisation de vermifuges type Praziquantel ou Arécoline, qui ne sont cependant pas ovicides. Un vaccin pour ovins a été mis au point à partir de protéines recombinantes exprimées par l'embryon (Lightowlers M.W., 1996, Int. J. Parasitol., 26, pp836-842), mais son application se révèle lourde car si l'efficacité est satisfaisante, la durée de protection est courte et le nombre d'animaux à traiter, donc à manipuler, important (l'ensemble du cheptel pour un éleveur). On comprend aisément qu'il est urgent de trouver de nouveaux vaccins contre cette maladie. Pour cela, les inventeurs ont réalisés leurs essais chez le chien. En effet, La disparition ou la forte réduction du nombre de chiens disséminant les oeufs serait un moyen d'interrompre le cycle de vie du parasite, et donc de réduire ou de supprimer la contamination du bétail et de l'homme. Le choix du chien comme cible du traitement conduit à avoir un nombre d'animaux à traiter considérablement plus réduit que si la cible est le bétail lui même. Dans un travail antérieur (Fu et coll., Mol. Biochem. Parasitol., 102, p. 43 52, 1999), une protéine du parasite détectée en raison de son immunogénicité très importante lors des infections naturelles ou expérimentales chez le chien a été identifiée et préparée. Une banque ADNc d'Echinococcus granulosus dans le vecteur d'expression lambda gt22 avait été criblée à l'aide de sérum de chiens infectés par le parasite (3 mois en élevage protégé). L'ensemble des clones ADNc exprimant les protéines reconnues par les anticorps avaient été analysés une seconde fois avec les sérums individuels de chiens infectés et les intensités des réactions comparées: le clone fournissant la réaction la plus forte avec les sérums de tous les chiens avait été retenu et dénommé EgA31. Cette publication permet donc de mettre en évidence l'existance d'anticorps circulants dirigés contre la protéine EgA31 chez des chiens infectés par le parasite E. granulosus. Cet ADNc code pour une protéine riche en leucine, de structure putative hélicoïdale, comportant un domaine riche en proline de type SH3 (Sarc Homology 3 type 1) proche de la région C terminale de la protéine; ces domaines sont impliqués notamment dans des interactions protéine protéine. Par ailleurs, 28 sites de phosphorylation et 4 sites de myristylation putatifs peuvent être repérés grâce au logiciel PROSITE. La séquence SEQ ID N 1 de EgA31 a été déposée (SwissProt) sous le numéro AF 067 807. Dans Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000, on montre la stimulation de la proliferation cellulaire dans les ganglions poplités et préscapulaires du chien naïf après sensiblisation à la protéine EgA31. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que la protéine de séquence SEQ ID N 1 nommée EgA31, ainsi que certains de ses fragments ou variants, présentent une activité immunogène d' E. granulosus et entraînent, notamment chez le chien, une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par E. granulosus et peut donc de ce fait faire l'objet de vaccins contre les infections dûes à ce type de parasites. Aucune des deux précédentes publications (Molecular and Biochemical Parasitology 102, 43-52, 1999 et Veterinary Immunology and Immunopathology, 74, 195-208, 2000) ne laissaient présager les résultats présentés dans la présente demande de brevet à savoir: une réponse inflammatoire et une hypertrophie des organes de l'immunité strictement localisées au site de fixation des parasites chez des chiens immunisés avec un fragment de EgA31, puis infectés, la présence d'anticorps chez des chiens infectés, en quantité plus importante contre un des domaines de la protéine de séquence SEQ ID N 2, l'échec de l'infection expérimentale d'un chien présentant des anticorps circulants contre ce domaine, avant cette infection expérimentale. Ces différents résultats vont au soutien de l'activité immunogène protectrice de la protéine EgA31 et de ses fragments étudiés dans la présente invention. La présente invention a donc pour objet des nouveaux vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, dont l'agent vaccinant est (a) la protéine de séquence SEQ ID N 1, ou (b) un de ses fragments ayant une activité immunogène au moins équivalente à la protéine SEQ ID N 1, ou (c) un variant de (a) ou de (b) qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier. De préférence, les vaccins de l'invention sont destinés au traitement ou à la prévention de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. En effet, la protéine EgA31 d'Echinococcus granulosus est présente chez la larve (protoscolex, membrane germinative) mais surtout chez l'adulte du parasite. A ce stade, elle est la plus abondante dans le tégument, au niveau des microtriches, zones d'échanges trophiques entre le parasite et son hôte. Elle est aussi présente chez Echinococcus multilocularis, espèce parasitaire très proche de E. granulosus, et responsable dans l'hémisphère nord de l'échinococcose alvéolaire dont la transmission à l'homme s'effectue également par les canidés. Selon l'invention, il a été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés sont capables de générer une réponse immunogène face à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Par hôte sensible, on entend par exemple l'homme ou un animal, par exemple un chien. Par polypeptide présentant une activité immunogène , il faut comprendre au sens de l'invention, un polypeptide reconnu par des anticorps circulants produits chez un hôte sensible infectés par parasites de la famille Echinococcus. Il a également été démontré que les polypeptides ci-dessus mentionnés modifier la potentialité de réponse de l'intestin d'un hôte sensible, face à une infection par parasites de la famille Echinococcus. Les fragments (b) et les variants (c) ci-dessus mentionnés ne peuvent bien entendu pas englober la protéine de SEQ ID N 1 dans son entier. Par une une activité immunogène au moins équivalente à ce dernier , on entend un fragment ou un variant tel que défini ci-dessus qui possède la même, voire une meilleure, réponse immunogène à une infection par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier d'E. granulosus, chez un hôte sensible. Cette équivalence peut notamment être mesurée avec la méthode Elisa, par exemple selon le protocole décrit plus loin au paragraphe 1.2 de la partie expérimentale. L'invention a notamment pour objet des nouveaux vaccins tels que définis ci-dessus dont l'agent vaccinant est un fragment ayant une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N 1 choisi parmi: les polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et les variants de l'un de ces polypeptides qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunogène au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Le polypeptide de SEQ ID N 2 et ses variants ci-dessus définis, qui présentent la plus grande activité immunogène, sont particulièrement préférés en tant qu'agent vaccinant. L'agent vaccinant est associé à un ou plusieurs adjuvants appropriés et pharmaceutiquement acceptables. En tant qu'agent adjuvant acceptable, on peut citer les saponines et leurs dérivés, le muramyldipeptide, le dimycollate trehalose, l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, d'autres émulsions eau dans huile, les doubles émulsions, le dextran,le diéthylaminoéthyl-dextran, les sels minéraux tels que le potassium alum, le phosphate d'aluminium, l'hydroxide d'aluminium, la bentonite, zymosan, polyelectrolytes, rétinol, phosphate de calcium, protamine, sarcosine, glycérol, sorbitol, propylène glycol... Les adjuvants dotés de propriétés immunostimulantes seront particulièrement préférés. Dans les vaccins selon l'invention, il est possible d'associer plusieurs agents vaccinants. Le vaccin peut contenir directement le polypeptide immunogène ou bien la séquence ADN codant pour ce polypeptide, alors produit in vivo au sein de l'hôte. Ces derniers types de vaccins sont notamment décrits dans US 4603112 et Brochier et al. Nature, 1991, 354, 520. Le vaccin selon l'invention peut être administré selon toute technique connue par l'homme de l'art, notamment orale ou parentérale. L'administration parentérale est néanmoins préférée pour l'administration de vaccins contenant le polypeptide immunogène. Dans le cas de vaccins contenant l'ADN codant, on utilisera de façon avantageuse la voie orale. La dose de vaccin qui doit être administrée dépend du type, du poids, de la taille de l'homme ou de l'animal à qui le vaccin doit être administrée et du degré d'immunogénicité de l'agent vaccinant. De préférence, le vaccin sera formulé de façon à ce que des doses de l'ordre de 1 à 5 ml soient suffisantes pour obtenir un effet protecteur immunogène. L'invention a également pour objet les polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5, ainsi que leurs variants qui correspond à l'un de ces polypeptides modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. Ces variants contiennent au moins un épitope responsable de l'activité immunogène du polypeptide initial et qui reste donc fonctionnellement équivalent. Ils peuvent être obtenus à partir du polypeptide natif selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, par exemple par mutagenèse sur site spécifique (Adelman et al. DNA, 2, 183, 1983) et seront alors appelés mutant. Par exemple, il est possible par une telle technique de substituer dans une séquence des amino acides par d'autres amino acides équivalents. Les groupes d'amino acides ci-après sont généralement reconnus comme équivalents: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Lys, Met, Leu, Ife, Val, and - Phe, Tyr, Trp. De préférence, ces variants présentent un degré d'homologie avec le polypeptide dont ils sont le variant, au moins égal à 80 %. Ce degré d'homologie est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences protéiques ou nucléiques, et par exemple la technique BLAST telle que décrite par ALTSCHUL S.F. et al. dans Nucleic Acid Research 1997, 25, 3389-3402. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADNc ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour le polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. Ces séquences nucléotidiques peuvent être définies comme: al) les séquences d'ADNc codant pour le polypeptide ou l'un de ses variants tels que définis ci-dessus; b 1) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec les séquences ci-dessus; cl) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, résultent des séquences al) et b1) ci-dessus et codent pour ledit polypeptide ou ledit variant; et dl) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. En particulier, on pourra citer les séquences d'ADN correspondant à SEQ ID 30 N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9. Les polypeptides, fragments et variants peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de: culture d'un microorganisme transformé ou de cellules eucaryotes transformées à l'aide d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par le dit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Cette méthode comprend, par exemple, l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression. Ils peuvent également être préparés par les synthèses peptidiques classiques bien connues de l'homme du métier, par utilisation de la méthode Applied Biosystems. Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique, ou par génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. (supra). La présente invention a également pour objet des vecteurs d'expression tel qu'un plasmide comprenant une séquence d'ADN codant pour le polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, ainsi que les cellules hôtes transformées avec ce vecteur d'expression. Ces cellules hôtes peuvent être des microorganismes procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'ADN de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des microorganismes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du microorganisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Le microorganisme préféré aux fins de l'invention est E. coli alors qu'on utilise de préférence Saccharomyces cerevisiae comme levure. A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules COS, CHO, SF9 Jurkat, etc., toutes étant répertoriées à l'ATCC. La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés contre un polypeptide de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment. Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus par le procédé bien connu de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975) ou des anticorps polyclonaux obtenus selon les procédés classiques d'immunisation d'animaux (Antibodies, a laboratory manual. E. Harlow & D. Lane. Cold Spring Harbor laboratory press, 1988). Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre un polypeptide immunogène de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, dans lequel on met en contact le ou lesdits polypeptides ou variants immunogènes tels que définis, avec un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on prélève la présence des anticorps fixés. De préférence, les procédés de diagnostic de l'invention sont destinés au diagnostic de l'hydatidose ou de l'échinococcose alvéolaire. L'hydatidose est préférée. Le procédé de révélation peut être basé sur une méthode radioimmunologique 25 de type RIA, RIPA, IRMA ou une méthode de type immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA. Les éléments de l'invention relatifs au polypeptide de SEQ ID N 2 et ses variants sont préférés. L'invention va maintenant être décrite en détails à l'aide de l'exposé expérimental ci-après s'appuyant sur les figures lA à 5 présentées en annexe: Les Fig. lA à lE présentent la méthode de sous clonage des 4 fragments de restriction Sall-Hind3, Pstl-Hind3, Pstl- Dral, Sall-Pstl. Les éléments de séquences surlignées en noir dans les constructions correspondent à la séquence de pQE80L. Plus précisément, la Fig.1A représente le vecteur pQE-80 ( 475 lpb) (Qiagen) : Région du site de clonages multiples; la Fig.1B représente l'insertion de EgA31 [Sal I Hind III] dans pQE80L; Clone Sal/Hind 2A (CSD1) ; la Fig.1C représente l'insertion de EgA31 [Pst I Hind III] dans pQE80L; Clone Pst/Hind D (CSD2) ; la Fig.1D représente l'insertion de EgA31 [Pst I Dra I] dans pQE80L; Clone Pst/Dra 9 (CSD12) ; la Fig.1E représente l'insertion de EgA31 [Sal I - Pst I] dans pQE80L; Clone Sal /Pst. La Fig. 2 représente le positionnement des domaines ADNc correspondant aux 10 4 polypeptides de SEQ ID N 2 à 5 à produire. La Fig. 3 résume de façon synoptique les étapes de l'obtention des polypeptides recombinants de SEQ ID N 2 à 5. La Fig. 4 représente les résultats de dosage au spectrophotomètre des anticorps anti EgA31. La Fig. 5 représente les résultats d'absorption après test Elisa. 1. Comparaison de l'immunogénicité des différents domaines de la protéine. 1.1 Production de polypeptides correspondants à des domaines différents de EgA3 1 La détermination de la structure putative de la protéine par la méthode GOR (Garnier J., Osguthorpe DJ., Robson B., 1978, J Mol Biol, 120, pp 97-120) suggère l'existence de plusieurs domaines sur cette protéine (Fig. 2 et 3). L'ADNc de SEQ ID N 10, initialement cloné dans le plasmide pSK+ de Stratagène où il constitue un insert Sal-Notl de 1836 paires de bases a été sous cloné en 4 fragments d'ADN correspondant chacun approximativement aux domaines protéiques putatifs retenus. Ces polypeptides sont dénommés dans la suite du texte par les initiales des endonucléases de restriction qui déterminent les bornes du fragment d'ADN qui permet de les générer ([Sal-Pst], [Sal-Hind], [Pst-Hind], [PstDra] ). Les constructions ont été effectuées (Fig. lA à lE et Fig. 3) dans le plasmide pQE80L de Qiagen qui permet l'expression de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG (promoteur Lac z) ; le polypeptide recombinant obtenu porte à son extrémité N terminale une série de 6 histidines codées par les séquences du plasmide qui suivent le codon initiateur de traduction. Les constructions ont été faites en respectant la phase de lecture de LADNc originel (contrôle par séquençage sur Séquenceur Mégabace). Les plasmides recombinants ont été utilisés pour transformer la souche bactérienne BL21 (Fig. 3). Les étapes de la préparation des polypeptides sont alors: culture en masse des bactéries recombinantes en présence de chloramphénicol et ampicilline (100 microgrammes/ml chacun) ; addition d'isopropyl RD thiogalactoside (Sigma), à la concentration de 1 mM finale, lorsque la D. O. de la culture atteint 0,5 à 600nm; 3 heures de culture à 37 C sous agitation vigoureuse; centrifugation des cellules, lyse du culot dans un tampon pH 8,0 dénaturant (urée 8M) ; élution lente du surnageant de lyse sur des colonnes de billes d'agarose couplée au nickel acide nitriloacétique (Qiagen) qui retiennent les polypeptides portant les résidus histidine en N terminal; gradation de tampons de pH 6,3 puis 5,9 et 4,5 contenant de l'urée à la concentration de 8M pour éliminer les protéines retenues de façon non sélective par la colonne, puis libérer (pH 4,5) le polypeptide d'intérêt (résumé des étapes Fig. 3). Une électrophorèse en SDS PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie R250 permet de s'assurer de la taille et de la pureté du matériel synthétisé. Plus précisément, on opère comme suit: L'ADNc EgA31 (ref AF 067807) avait été initialement cloné dans le plasmide BlueScript II SK+ (Stratagène) et multiplié dans la souche DH5 alpha de Escherichia coli. Afin de préparer les sous clones envisagés, une production en masse de l'ADNn plasmidien a été effectuée à partir d'une culture dans 30 ml de milieu LB contenant 100 microgrammes par ml d'ampicilline. La culture ensemencée avec la souche bactérienne transformée est maintenue une nuit à 37 C sous agitation. L'extraction de l'ADN plasmidien est faite à l'aide du kit MaxiPrep Qiagen Plasmid Midi Kit , selon les instructions du fournisseur. Le matériel préparé est stocké dans un tampon Tris HC1 10mM, pH 8,5 et conservé à -80 C. Le rapport des absorptions de l'ADN préparé mesurées à 260 et 280 nanomètres est de 1,91, ce qui atteste d'une qualité satisfaisante pour la suite des opérations. 111. Ouverture du plasmide recombinant pSK+EgA31 aux sites Sali ou Pstl. Environ 10 microgrammes de plasmide recombinant sont linéarisés en 1 heure à 37 C avec 20 unités d'endonucléase de restriction Sali (Roche) ou d'endonucléase de restriction Pstl (Roche) dans le tampon préparé par le fournisseur et selon ses instructions. L'ADN linéarisé est ensuite purifié (Kit Qiagen) pour éliminer l'enzyme résiduelle et le tampon de digestion, puis mis en solution dans le tampon Tris HC1 10 mM, pH 8,5. 112. Préparation des fragments d'ADNc Sall Hind III et Sali Pstl Pour chaque préparation, environ 5 microgrammes de l'ADN linéarisé ci-dessus avec Sali sont digérés pendant 1 heure à 37 C par 20 unités d'endonucléase de restriction Pstl ou Hind III dans le tampon préparé par le fournisseur. Les produits de digestion sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE x 0,5; 2 microlitres de bleu de bromophénol à 0,01% dans du glycérol à 50% sont ajoutés à chacun des échantillons analysés; la migration dure 30 minutes à 100 volts en présence de bromure d'éthidium dans le tampon. En fin d'électrophorèse, les fragments sont visualisés en UV sur un transilluminateur (Biorad) et des bandes d'agarose contenant le fragment d'intérêt sont très rapidement découpées à la lame de rasoir. 113. Préparation des fragments d'ADNc Pstl Hind III et Pstl Dral Environ 5 microgrammes de plasmide recombinant pSK+EgA31 linérarisés par Pst1 comme décrit en 111 sont digérés soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Hind III, soit par 20 unités d'endonucléase de restriction Dral dans les tampons adaptés préparés par le fournisseur. Les fragments d'ADN digérés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% comme supra. En fin d'électrophorèse, des bandes d'agarose contenant les fragments d'intérêt sont très rapidement découpées sur le gel. 114. Purification des 4 fragments d'ADN correspondant respectivement aux 25 séquences SEQ ID N 6, 7, 8 et 9. Les préparations décrites ci-dessus sont effectuées 3 fois et les bandes d'agarose contenant respectivement les séquences SEQ ID N 6, 7, 8 ou 9 sont regroupées. L'ADN en est extrait en utilisant le kit Cleanup Qiagen Gel Extraction selon les instructions du fournisseur. L'ADN est collecté et conservé dans le tampon Tris HC1 10mM, pH 8,5 à -80 C. 115. Insertion des fragments d'ADN préparés dans le plasmide pQE80L (Qiagen), vecteur d'expression procaryotique. Ce plasmide permet la transcription de l'insert sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG; le polypeptide produit comporte dans sa région N terminale une série de 6 histidines consécutives codées par les séquences du plasmide qui permettent sa séparation ultérieure par chromatographie d'affinité. Le site de clonage multiple comporte notamment les sites Sall, Pstl et Hind III. Les étapes de préparation des plasmides recombinants sont les suivantes: Digestion de 1 microgramme environ d'ADN plasmidien pour chaque construction souhaitée avec respectivement: Sali et Pstl; ou Sali et Hind III; ou Pstl et Hind III, dans les conditions décrites supra, pour les séquences d'ADNc SEQ ID N 6, 7, 8 ou 9. - Séparation des produits de digestion sur gel d'agarose 1% en tampon TAE 0,5 et récupération des fragments d'agarose contenant les plasmides ouverts aux 2 enzymes sous UV sur transilluminateur Biorad. L'ADN plasmidien ouvert est purifié avec le kit Cleanup Qiagen Gel Extraction . - Déphosphorylation des extrémités des plasmides linéarisés à la phosphatase alcaline (Roche) selon les instructions du fournisseur. - Ligation des inserts correspondant aux séquences SEQ ID N 6, 8 et 9 dans les plasmides ouverts. Les plasmides pQE80L ouverts et les fragments d'ADNc digérés par les mêmes endonucléases sont incubés pendant 1 heure a 37 C dans 32 microlitres de tampon Tris HC1, 10 mM, pH = 8,5, 4 microlitres de tampon de ligation 10x préparé par le fournisseur, et 4 microlitres de ligase T4 (Roche) . Les proportions d'ADNc et de plasmide ouvert sont les suivantes: Pstl Hind III (SEQ ID N 6) 74 nanogrammes (ng) pQE80L ouvert ng Sali Hind III (SEQ ID N 8) 136 ngpQE80L ouvert 200ng Sali Pstl(SEQ ID N 9) 60 ngpQE80L ouvert 200ng Ligation de l'insert Pstl Dral (SEQ ID N 7) : il n'existe pas de site Dral dans le plasmide pQE80L; celui-ci a donc été ouvert avec Pstl et Hind III comme ci dessus. L'extrémité 3 Pour toutes les constructions, l'efficacité de la ligation est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose et visualisation sous UV sur transilluminateur (disparition ou diminution des bandes correspondant aux fragments libres, apparition d'une nouvelle bande). 117. Transformation des bactéries On utilise les bactéries BL21 Gold (DE3) pLysS compétentes préparées par Stratagène, selon les préconisations du fournisseur (1 à 50 ng de plasmide recombinant pour 100 microlitres de bactéries compétentes). Les bactéries sont ensuite étalées sur boite de milieu solide LB contenant 100 microgrammes/ml d'ampicilline pour la sélection des bactéries transformées. 118. Contrôle des fragments d'ADN insérés Les constructions ont été dessinées en respectant les phases de lecture originelles des inserts; un contrôle est cependant fait. L'ADN plasmidien recombinant est préparé (kit Qiagen, mini prep) à partir d'une culture de 5 ml de chacun des clones retenus et séquencé sur séquenceur Megabace en utilisant les amorces universelles du plasmide pQE80L définies par Qiagen. Seuls les clones dont l'insert n'a subi aucune modification sont conservés. 1.2 Comparaison Des tests ELISA ont été réalisés sur, dans un premier temps, les sérums de 3 chiens (chiens A, B et C) dont l'infection par Echinococcus granulosus a été confirmée par nécropsie, et le sérum de 1 chien (chien D) jamais infecté. La réaction est faite dans des plaques 96 puits dont la paroi est recouverte par le fabricant de nickel-agarose (Ni NTA HisSorb, Qiagen). Chacun des 4 polypeptides recombinants de SEQ ID N 2 à 5 est dilué dans un tampon carbonate bicarbonate, pH 9,6, de façon à ce que les quantités finales qui seront déposées dans les puits soient de 1 g, 0,214, 40ng, 8 ng. Les plaques sont incubées 18 heures environ à 4 C, ce qui permet la fixation du polypeptide sur les parois des puits par l'interaction nickel-histidines. Les puits sont ensuite lavés doucement 5 fois de suite avec du PBS contenant 1% de tween 20 (Sigma) et la saturation des sites non spécifiques est faite par incubation d'albumine bovine à 3% dans du PBS pendant 2 heures. Après élimination de l'albumine, des dilutions au 1/1000 de chacun des sérums de chiens testés dans du PBS + 0,3% d'albumine bovine sont incubées dans les puits pendant 1 heure à 37 C. 2 rangées de puits contiennent un tampon PBS + albumine bovine au lieu de sérum et servent de témoins. Les puits sont ensuite lavés 5 fois doucement (tampon PBS tween 1%) puis un anticorps anti IgG de chien (produit chez le lapin, Sigma) couplé à la peroxydase de raifort est ajouté et maintenu à 37 C pendant 1 heure (concentration 1/3000 dans du PBS). Les puits sont ensuite lavés délicatement plusieurs fois et le substrat chromogène de la peroxydase ajouté (o-phénylènediamine dihydrochlorure, Dako). La réaction est arrêtée après 30 minutes avec de l'acide sulfurique 0,5N et la D.O. mesurée immédiatement à 492nm sur un spectrophotomètre lecteur de plaques (Dynatech MR 500). Tous les essais sont faits en triple exemplaires, la valeur retenue étant la moyenne des 3 essais. L'ensemble de l'expérience est répété 2 fois. La Fig. 4 montre que tous les domaines de la protéine EgA31 produits sont reconnus par les anticorps présents dans le sérum des chiens infectés mais pas par celui du témoin: les régions correspondantes de la protéine EgA31 des parasites ont donc toutes stimulé les réponses immunitaires des chiens pendant l'infection. Les anticorps ne sont pas présents avant l'infection (cette dernière propriété avait été observée sur des lots importants de chiens en utilisant la protéine entière, Fu et coll, 1999 supra). Toutefois, la région de la protéine native de SEQ ID N 2 correspondant au domaine recombinant [Pst-Hind] de EgA31 est systématiquement la plus immunogène. La même expérience a été reprise en utilisant 13 chiens infectés expérimentalement et 9 chiens témoins. Le protocole a été le même que cidessus, mais seul le polypeptide de SEQ ID N 2 correspondant au domaine recombinant [Pst-Hind] de EgA31 a été utilisé. La Fig. 5 montre qu'aucun sérum de chien non infecté ou avant infection (sauf 1, le chien n 15, voir plus loin) ne contient d'anticorps contre ce polypeptide. Les anticorps sont présents chez tous les chiens 28 jours après l'infection et les réponses des différents chiens sont homogènes. Le chien 15 qui contenait déjà des anticorps anti [Pst-Hind] avant l'infection est un chien dit de ferme , âgé de 3 ans et demi environ, recruté dans la campagne tunisienne en zone d'endémie pour E. granulosus. Après nécropsie, il est apparu que ce chien était le seul de tous les chiens infectés expérimentalement à n'avoir aucun parasite dans l'intestin. Chez cet animal, la résistance à l'infection est donc corrélée à une forte immunité, préalable à l'infection, contre EgA31, en particulier contre le domaine [Pst-Hind]. En conclusion, toutes les régions de la protéine EgA31 étudiées (polypeptides de SEQ ID N 2, 3, 4 et 5 correspondant respectivement aux domaines [Pst-Hind], [Pst-Dra], [Sal-Hind] et [Sal-Pst] de l'ADNc codant pour EgA31) provoquent la formation d'anticorps lors d'une infection naturelle ou expérimentale par le parasite. Ces régions sont donc toutes immunogènes. Toutefois, le polypeptide de SEQ ID N 2 correspondant au domaine [Pst-Hind] de l'ADNc est plus immunogène que les autres. 2. Réaction de l'intestin de chiens immunisés contre le fragment SEQ ID N 3 à une infection expérimentale par des protoscolex d'Echinococcus granulosus. La potentialité conceptuelle d'obtenir une protection des chiens et des canidés en général par la stimulation, avant infection, des défenses immunitaires locales (ici l'intestin) est étayée par les observations déjà anciennes de Gemmel et coll. (1986, Parasitol. 92, pp 599-620; 1986, Biology of Echinococcus and hydatid disease, Thomson edit., pp 189-216) : après plusieurs cycles d'infection vermifugation, certains chiens deviennent résistants à une nouvelle infection. Nous avons donc analysé la réponse de l'intestin à l'infection par des protoscolex chez des chiens préalablement immunisés contre le fragment SEQ ID N 3 ou contre un mélange de 3 polypeptides en quantités équipondérales, fragment SEQ ID N 3, EgTM (une tropomyosine d'Echinococcus; Esteves A., Senorale M., Ehrlich R. A tropomyosin gene is differentially expressed in the larval stage of Echinococcus granulosus. Parasitol. Res. 89: 501-502, 2003), FABP1 (Fatty Acid Binding Protein d'Echinococcus; Esteves A, Portillo V, Ehrlich R. Genomic structure and expression of a gene coding for a new fatty acid binding protein from Echinococcus granulosus. Biochem Biophys Acta 65:2402-2412, 1997). Le travail a été effectué à l'Ecole Vétérinaire de Sidi Thabet (Tunisie) afin de se situer en zone d'endémie. Dans une première expérience, 7 chiens ont été utilisés, 1 témoin, 3 chiens recevant le mélange des 3 protéines et 3 chiens injectés avec le fragment SEQ ID N 3 seul. 2.1 Production des polypeptides Le fragment [Pst-Dra] de EgA31 de SEQ ID N 3 a été produit en masse comme indiqué préalablement. La pureté du produit fabriqué est vérifiée à chaque production par électrophorèse et la quantité de protéine produite est déterminée avec le Biorad Protein Assay après les étapes de désalinisation et de concentration sur colonne Amicon Ultra 10 000 (Millipore). La protéine recombinante de SEQ ID N 3 est conservée à -80 C en solution dans du sérum physiologique stérile jusqu'à utilisation. Les polypeptides EgTM et FABP1 nous ont été fournis respectivement par A. Esteves (laboratoire de biochimie, Pr R. Ehrlich, Montevideo) et F. Schreiber (à l'époque du travail, laboratoire de microbiologie, Newcastle, Pr C. Hormaeche). Ces polypeptides ont été désalinisés, concentrés, dosés et conservés comme ci dessus. 2.2 Protocole expérimental L'immunisation des chiens est obtenue par 3 injections intramusculaires aux jours 0, 75 et 97 de l'expérience. Les animaux sont infectés 15 jours après la dernière injection par ingestion de 150 000 protoscolex collectés la veille dans les abattoirs voisins et dont la viabilité a été contrôlée; la totalité des parasites est d'abord regroupée en un seul lot avant d'être répartie entre les chiens afin d'assurer une homogénéité de l'infection. L'infection est interrompue après 21 jours ( durée de sécurité qui permet de n'avoir aucun oeuf mature formé) par euthanasie des chiens (injection de Dolethal, laboratoires Vétoquinol). L'état de l'intestin est observé et le nombre de protoscolex dans le duodénum est déterminé. Chaque injection correspond à 500 g au total de polypeptide(s) recombinant(s) en solution dans 0,8 ml de sérum physiologique; juste avant l'injection, 0,2 ml de Montanide (adjuvant, SEPPIC France) sont ajoutés et la solution est homogénéisée lentement pendant 10 minutes puis filtrée sur membrane (Millex, 0,22 m) sous hotte stérile. L'injection intramusculaire (1 ml) est faite immédiatement, après désinfection du pelage à l'alcool. Les injections faites au chien témoin ne contiennent aucun des 3 antigènes recombinants mais incluent l'adjuvant. 2.3 Résultats Les nécropsies ont été effectuées après 21 jours d'infection. Les résultats bruts sont les suivants: Témoin 3 chiens immunisés 3 chiens avec les immunisés avec 3 polypeptides SEQ ID N 3 seul Quantité 0 166 g SEQ ID N 3 500 g SEQ ID d'antigène +166 g EgTM N 3 injectée +166 g FABP1 Nombre de 2500 22 2160 2800 6040 3340 5 parasites dans le duodénum après 21 jours Etat du normal inflammation, entérite sans rupture des duodénumnormal vaisseaux Reste de l'intestin normal Normal normal Etat des plaques normales hypertrophie considérable; pas d'aspect de Peyer hémorragique Il est donc possible de conclure que: - le duodénum, région exclusive de fixation des protoscolex puis des adultes, est la seule région de l'intestin à présenter un aspect différent entre chiens immunisés et chien témoin. - les plaques de Peyer, organes de l'immunité de cette région de l'organisme, sont très hypertrophiées en réponse à l'infection chez les chiens immunisés; elles ne le sont pas chez le chien infecté mais non immunisé préalablement: la réponse différentielle est donc liée à l'immunisation préalable, non à l'infection parasitaire seule. Plusieurs centaines de nécropsies de chiens infectés par Echinococcus granulosus, pratiquées dans la même région d'endémie par l'un des déposants (S. Lahmar), n'ont jamais conduit à observer les phénomènes d'inflammation localisés au duodénum et d'hypertrophie des organes immunitaires rapportés ici pour les chiens préalablement immunisés. L'immunisation du chien contre SEQ ID N 3 entraîne une modification de la réponse du duodénum à l'infection ultérieure par Echinococcus granulosus, jamais observée jusqu'à ce jour. Cette modification de réponse implique une forte stimulation des organes de l'immunité locale. - L'immunisation avec SEQ ID N 3 seul suffit à obtenir cette réponse: les 2 autres polypeptides ne sont donc ni indispensables, ni antagonistes. REVENDICATIONS 1 - Vaccins destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, dont l'agent vaccinant est (a) la protéine de SEQ ID N 1, ou (b) un de ses fragments ayant une activité immunogène au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N 1, ou (c) un variant de (a) ou de (b) qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à ce dernier. 2 - Vaccins selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites E. granulosus. 3 - Vaccins selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention de 1'hydatidose. 4 - Vaccins selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention des infections par parasites E. multilocularis. 5 - Vaccins selon la revendication 4 caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement ou à la prévention de l'échinococcose alvéolaire. 6 - Vaccins selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisés en ce que l'agent vaccinant est un fragment ayant une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide de SEQ ID N 1 choisi parmi: les polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5 ou un variant de l'un de ces polypeptides qui a été modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente au polypeptide dont il est le variant. 7 - Vaccins selon la revendication 6 caractérisés en ce l'agent vaccinant est le polypeptide de SEQ ID N 2 ou un de ses variants tels que précédemment définis. 8 - Polypeptides de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5, ainsi que leurs variants qui correspond à l'un de ces polypeptides modifié par l'insertion, la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs acides aminés et qui a une activité immunologique au moins équivalente à celle du polypeptide dont il est le variant. 9 - Polypeptides selon la revendication 8 caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi le polypeptide de SEQ ID N 2 et ses variants tels que précédemment définis. - Séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9. 11 - Séquences d'acides nucléiques selon la revendication 10 caractérisées en ce qu'elles sont constituées par: al) les séquences d'ADNc codant pour un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9; b1) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions strictes avec les séquences ci-dessus; cl) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, 10 résultent des séquences al) et b 1) ci-dessus et codent pour ledit polypeptide ou ledit variant; et dl) les séquences d'ARNm et d'ADN correspondantes. 12 - Vecteurs d'expression transformés avec une séquence d'acide nucléique telle que définie à la revendication 10 ou 11 et comprenant les moyens nécessaires à son expression. 13 - Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 12. 14 - Anticorps dirigés contre un polypeptide ou un de ses variants tel que défini à la revendication 8 ou 9. 15 - Anticorps selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il est monoclonal. 16 - Procédé de diagnostic in vitro des infections par parasites de la famille Echinococcus, et en particulier E. granulosus et E. multilocularis, chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre un polypeptide immunogène de SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 5, ou un de leurs variants tels que définis précédemment, dans lequel on met en contact le ou lesdits polypeptides ou variants immunogènes tels que définis précédemment, avec un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on prélève la présence des anticorps fixés.