Brevet FR2861079A1 — publié le 20050422

La présente invention concerne l'utilisation de cations métalliques divalents, notamment du Zinc, pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques d'anticorps comprenant des cations métalliques divalents. L'immunothérapie passive, très répandue, est au c#ur des pratiques du LFB. Elle est fondée sur l'administration d'anticorps, par exemple des anticorps monoclonaux dirigés contre une cellule ou une substance donnée. L'immunothérapie passive au moyen d'anticorps monoclonaux a donné des résultats encourageants. Toutefois, si l'utilisation d'anticorps monoclonaux possède plusieurs avantages, comme des prix de revient raisonnables et une assurance de sécurité du produit quant à l'absence de contamination, il peut en revanche s'avérer difficile d'obtenir un anticorps monoclonal efficace. En effet, le risque est de développer un anticorps monoclonal qui s'avère peu efficace et pour lequel on observe des effets secondaires incompatibles avec une utilisation en thérapie clinique. Ces deux aspects sont étroitement liés sachant que des anticorps peu actifs sont administrés à fortes doses pour compenser et obtenir une réponse thérapeutique. L'administration de forte dose induit non seulement des effets secondaires mais est économiquement peu viable. Ces problèmes sont majeurs dans le développement industriel des anticorps monoclonaux, chimériques humanisés ou humains. A titre d'exemple, la société Protein Design Labs a suspendu les essais cliniques en phase I/II du Remitogen, qui est un anticorps anti-HLA-DR pouvant être utilisé pour traiter les cancers de cellules MHC de classe II positives, notamment les leucémies des cellules B et T. Aujourd'hui, la recherche est orientée sur le fragment Fcy de l'immunoglobuline afin d'améliorer les propriétés fonctionnelles des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui interagissent et activent les récepteurs des cellules effectrices (monocytes macrophage, lymphocyte B, cellules NK et dendritiques). La région Fc est constituée de 2 domaines globulaires nommés Cy2 et Cy3. Les 2 chaînes lourdes interagissent étroitement au niveau des domaines Cy3 tandis qu'au niveau des domaines Cy2, la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un oligosaccharide lié à l'Asn 297 contribue à un écartement des 2 domaines. Ainsi, le problème est de savoir si la structure tridimentionnelle de ces domaines peut influencer l'activité des anticorps. Dans notre demande de brevet WO 01/77181, nous avons démontré que la glycosylation du Fc est essentielle pour l'activité biologique des IgG, particulièrement pour la lyse cellulaire médiée par le complément (CDC) et la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC). Nous montrons qu'une structure de type biantennée, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, une faible fucosylation, des mannoses terminaux et/ou GlcNac terminaux non intercalaires est le dénominateur commun des structures glycanniques conférant une forte activité ADCC aux anticorps monoclonaux. Par la suite, notre découverte a été corroborée par les études de Shields et al., 2002 et Shinkawa et al., 2003. Dans le cadre de l'invention, nous avons déterminé la structure tridimentionnelle de différents anticorps et comparé les structures d'anticorps présentant une forte activité fonctionnelle avec des anticorps produits dans CHO qui sont peu efficaces, notamment en ADCC. Nous avons découvert la présence d'un ion zinc situé entre les domaines CH2 et CH3, plus précisément sur certains résidus localisés à l'interface CH2-CH3 impliqué dans la reconnaissance du fragment Fc de l'anticorps par le récepteur FcRn ainsi que dans la fixation à la protéine A, issue de la paroi bactérienne de Staphylococcus aureus. De manière inattendu, le Zinc est présent dans les anticorps présentant une forte activité fonctionnelle et est absent dans les anticorps présentant une faible activité fonctionnelle. De part sa localisation sur le fragment Fc, cet atome de zinc joue un rôle important dans la conformation générale du fragment Fc, et par là même est à l'origine de l'amélioration de la liaison du fragment Fc à ses récepteurs. On entend par récepteurs non seulement les molécules de Fc[gamma]R présentes sur les cellules du système immunitaire telles les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B et T, les cellules NK et les cellules dendritiques mais également les molécules du complément et celles des parois bactériennes. D'autre part, nos études de la structure tridimensionnelle de ces anticorps ont révélé une conformation dite ouverte dans les anticorps présentant une forte activité fonctionnelle se distinguant nettement des sssconformation dite fermée des anticorps peu efficaces, la conformation ouverte favorisant la liaison à un ion Zinc. Ainsi, il est désormais possible de potentialiser l'activité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux au moyen de cations divalents. Description Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention a pour objet une méthode pour potentialiser l'activité fonctionnelle des anticorps via le fragment Fc, comprenant une étape consistant à ajouter une quantité appropriée d'un ou plusieurs ion (s) notamment du Zinc, dans le système biologique produisant les anticorps ou dans une solution comprenant des anticorps avant ou après purification ou encore dans la formulation finale sous la forme d'une solution injectable des anticorps. En d'autres termes, l'invention concerne une méthode pour augmenter l'activité effectrice des anticorps comprenant l'ajout de cations métalliques divalents à des anticorps thérapeutiques. Cette potentialisation conduit à l'obtention et l'utilisation de nouveaux anticorps comprenant un cation divalent, notamment un ion zinc, lesdits anticorps présentant une efficacité accrue pour les traitements thérapeutiques. En effet, la présence d'un atome de zinc a été montré lors de la présente invention dans le domaine de liaison aux récepteurs Fc des anticorps présentant une forte activité ADCC. Dans un deuxième aspect, l'invention concerne des anticorps possédant un atome de zinc liés aux résidus His 310 et His 435. L'invention concerne aussi lesdits anticorps possédant un atome de zinc lié aux résidus His 310, His 435 et Asn 434. Par exemple, l'anticorps peut être sélectionné parmi les anti Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti CD-23, antiCD30, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD44, anti CD52, anti CA125 et anti ProteinC ; antiEp-CAM, anti HER2, anti CD52, anti HER1, anti-HLA-DR, anti GD3, anti CA125, anti GD, anti GD2, anti-CD20, anti CD-23 et anti ProteinC; les anti-viraux : HBV, HCV, HIV et RSV, des anti-idiotypes spécifiques d'inhibiteurs par exemple de facteurs de coagulation dont le FVIII et FIX. On entend par système biologique des lignées cellulaires, des plantes ou animaux transgéniques non humains. Parmi les cellules, on peut choisir des cellules provenant de lignées cellulaires, transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps, par exemple des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des cellules de mammifères, d'insectes, de plantes, de bactéries ou de levures. Plus spéciquement, on peut utiliser des cellules de myélome de rat telle que YB2/0. On peut également erutilisé des cellules CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr; Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7,293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8. 653. Dans ce cas, il est possible de modifier génétiquement ces cellules par introduction d'une ou plusieurs séquence(s) exprimant une ou plusieurs glycosyl transférase(s), notamment une galactfucosyltransférase. On peut également produire les anticorps dans tous les systèmes biologiques couramment utilisés pour la production d'anticorps monoclonaux, hormis le corps humain, qui seront modifiés par ingénierie moléculaire de manière à créer un site de fixation pour le zinc entre les deux domaines CH2 et CH3 sur le fragment Fc. Ces modifications comprennent la ,modification de la séquence en acide aminé de sorte à obtenir des anticorps présentant une conformation tridimensionnelle ouverte permettant la fixation du cation, notamment du Zinc. Ainsi, l'invention vise les anticorps produits par génie génétique de manière à ce qu'ils comportent un ou plusieurs sites de liaison pour des caactions métalliques divalents, de manière à améliorer la fixation des cations métalliques divalents sur les anticorps. De préférence, les cations métalliques divalents sont des ions zinc. Les anticorps selon l'invention sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, et sont préférentiellement des IgG humaines ou ayant un fragment Fc humain. Les anticorps monoclonaux venpeut être des anticorps monoclonaux chimériques, humanisés ou humains. De plus, l'invention concerne l'utilisation de cations métalliques divalents pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps. On entend par amélioration de l'activité fonctionnelle des anticorps l'augmentation de l'activité lytique des anticorps, c'est-àdire l'augmentation de leur activité ADCC et/ou CDC. Cette amélioration fonctionnelle s'accompagne d'un renforcement du pontage entre les domaines CH2CH3, qui est lui-même une cause de l'amélioration de l'activité fonctionnelle de ces anticorps. De manière préférentielle, les cations divalents sont des ions zinc. Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique d'anticorps thérapeutiques comprenant au moins un excipient et des cations divalents, de préférence du zinc. Les anticorps de la composition pharmaceutique sont des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Ces anticorps peuvent être des IgG. Préférentiellement des IgG humaines ou ayant un fragment Fc humain. Par exemple, l'invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant un anticorps monoclonal ou des anticorps polyclonaux, notamment un anticorps monoclonal chimérique, humanisé ou humain et une quantité au moins équimolaire d'un ion Zinc. Ladite composition peut être formulée sous la forme d'une solution injectable par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée... Ainsi, l'invention porte sur une solution injectable comprenant un anticorps monoclonal ou des anticorps polyclonaux et une quantité appropriée en ion zinc, par exemple une concentration en ion zinc au moins égale à la concentration en anticorps. A titre d'exemple, l'invention se rapporte à une composition ou solution injectable mentionnée ci-dessus contenant un anticorps choisie parmi les anticorps du Tableau Ici-après: Tableau I : Nom et marque Société cible indication commerciale de l'anticorps Edrecolomab Centocor anti Ep-CAM colorectal cancer colorectal PANOREX Rituximab Idec anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN Licensié à thrombocytopenia purpura Genentech/ Hoffinan la roche Trastuzumab Genentech anti HER2 ovarian cancer ovarien HERCEPTIN Licensié à Hoffman la roche/Immunogen Palivizumab Medimmune RSV SYNAGIS Licensié à Abott Alemtuzumab BTG anti CD52 leukemia CAMPATH Licensié à Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL tiuxetan Licensié à Schering ZEVALIN Cetuximab Merck/BMS anti HER1 cancers IMC-C225 Imclone Bevacizumab Genentech/ anti VEGFR cancers AVASTIN Hoffman la roche Epratuzumab Immumedics/ anti CD22 cancers: Amgen non hogkin e non hogkinienlymphoma Hu M195Mab Protein Design ND cancers Labs MDX-210 Immuno-Designed ND cancers Molécules BEC2 Imclone anti GD3 cancers Mitumomab Oregovomab Altarex anti CA125 Ovarian cancer ovarien OVAREX Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD malignant e KW-2971 malinmelanoma ABX-EGF Abgenix EGF cancers MDX010 Medarex ND Cancers XTL 002 XTL ND anti-viral : HCV biopharmaceuticals H11 SCFV viventia biotech ND cancers 4B5 viventia biotech anti GD2 Cancers XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV biopharmaceuticals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA Prostate cancer de la Prostate TNX-901 TANOX anti CD-23 IDEC-114 IDEC inhibition non-Hodgkin e non- ProteinC Hodgkinienlymphoma L'invention vise également une composition pharmaceutique comprenant des anticorps dans laquelle au moins 50%, 60%, 75%, 80%, ou 90%, ou encore 95%, ou 99% des anticorps possèdent un ion zinc lié, notamment lié aux acides aminés His 310, His 435 et Asn 434. Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'ions zinc pour améliorer la cristallisation d'anticorps thérapeutiques, et plus particulièrement des IgG monoclonaux, ladite cristallisation permettant d'obtenir la structure tridimensionnelle de tout ou partie de l'anticorps plus particulièrement en vue de vérifier si la conformation du Fc de l'anticorps est optimale pour assurer une bonne efficacité. L'invention porte donc également sur un test permettant d'évaluer l'efficacité d'un anticorps par étude de la conformation 3D du domaine impliquant His 310, His 435 et Asn 434 telle que montrée à la figure 1 ou 2 ou encore un dosage de la teneur en Zinc desdits anticorps, la présence de zinc étant une indication de l'efficacité de l'anticorps. EXEMPLE 1. Afin d'acquérir des données nouvelles sur les relations structure-fonction de la région Fc des anticorps, le demandeur a comparé la structure tridimensionnelle du fragment Fc de l'anticorps monoclonal T125 exprimé dans YB2/0 et CHO. Une étude en diffraction X des deux fragments cFC cristallisés a été entreprise. Anticorps monoclonal : R297 (T125-YB2/0). Il s'agit d'une IgGl(K) humaine, dirigée contre l'antigène Rh (D), dans la lignée cellulaire YB2/0 (myélome de rat, lignée ATCC n 1662) adaptée à la culture en milieu sans sérum. - Purification : R297 a été purifié par chromatographie d'affinité sur Sépharoseprotéine A. - Analyse glycannique : HPCE-LIF, il a été montré que la structure majoritaire est un oligosaccharide de type biantenné, contenant environ 25 % de fucose. - Activité biologique : l'activité ADCC de R297 est au moins égale à celle de l'anticorps polyclonal anti-Rh (D) de référence, WinRho. Préparation du fragment Fc : - Conditions d'hydrolyse : L'anticorps purifié T125-YB2/0 est dialysé une nuit contre du tampon Tris 50 mM, pH 8. 0. La solution d'Acm, ajustée à 50 mM CaC12 et 10 mM cystéine, est incubée 30 min. à 37 C avant d'ajouter la solution de trypsine (1 mg/ml) dans un rapport enzyme/substrat de 1/25. Après 5 h. d'incubation à 37 C, la réaction est arrêtée par l'addition de diisopropyl fluorophosphate (1 mM final). L'hydrolysat est dialysé une nuit contre du tampon Imidazole 50 mM, pH 7.8. - Purification du fragment Fc : L'hydrolysat dialysé est mis en contact avec de l'Affarose-protéine L à raison de 1 ml de gel pour 3. 6 mg d' Acm. Après 4 h. d'incubation à température ambiante sous agitation, le gel est monté en colonne et lavé par le tampon Imidazole 50 mM, pH 7.8. L'effluent et le tampon de lavage qui contiennent le fragment Fc sont réunis, concentrés par centrifugation sur Vivaspin 20 en utilisant les conditions décrites par le fabricant. Cristallogénèse : Après mise au point, les conditions de cristallisation retenues sont les suivantes : le fragment Fc, à 2 mg/ml en tampon Imidazole 50 mM, pH 7. 8, est amené à 10% de monométhyl polyéthylène glycol 5 000,100 mM cacodylate de sodium, 0.1mM chlorure de zinc, pH 5.1. La température de cristallisation est de 17 C. Collecte des résultats et détermination de la structure : L'analyse du cristal obtenu est réalisée au ESRF de Grenoble et les informations collectées sont traitées par les programmes DENZO et SCALEPACK (Otwinowski and Minor, 1996). La structure est déterminée en utilisant la suite de programmes CCP4 (1994). Résultats Le cristal du fragment Fc de T125-YB2/0 appartient au groupe spatial C222i dont les dimensions en sont les suivantes : a = 50.2 ; b = 147.7 ; = 75.6. L'analyse tridimensionnelle du fragment Fc de T125-YB2/0 permet de mettre en évidence que : 1 ) la distance entre les 2 domaines Cy2 d'une même molécule est relativement grande (Fig.l). La superposition avec le fragment Fc de l'Acm bl2, IgGl humaine dont la région Fc présente une structure primaire identique, mais produite dans CHO, montre que les domaines CH2 de T125-YB2/0 sont en conformation dite "ouverte" par rapport aux domaines CH2 de b12. 2 ) la présence d'un atome de zinc entre les domaines CH2 et CH3 (Fig. 2). L'atome de zinc est lié aux résidus d'histidine 310 (CH2) et 435(CH3) et au résidu d'asparagine 434 (CH3). Figure 1 : cristallographique du fragment Fc de T125-YB2/0 (2 ). Figure 2 : de fixation d'un atome de zinc entre les domaines Cy2 et Cy3 REVENDICATIONS 1. Anticorps possédant un atome de zinc sur les résidus His 310 et His 435. 2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils possèdent un site de fixation pour le zinc comprenant les résidus His 310 et His 435 créé par ingénierie moléculaire. 3. Anticorps selon la revendication 1 possédant un atome de zinc lié aux résidus His 310, His 435 et Asn 434. 4. Anticorps selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils possèdent un site de fixation pour le zinc comprenant les résidus His 310, His 435 et Asn 434 créé par ingénierie moléculaire. 5. Anticorps selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux. 6. Anticorps selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'il s'agit d'IgG humaines ou ayant un fragment Fc humain. 7. Utilisation de cations métalliques divalents pour la préparation d'une composition d'anticorps pour améliorer l'activité fonctionnelle desdits anticorps. 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les cations divalents sont des ions zinc. 9. Utilisation de cations métalliques selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que les anticorps sont des anticorps monoclonaux. 10. Utilisation de cations métalliques selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que les anticorps sont des anticorps polyclonaux. 11. Méthode pour préparer une composition d'anticorps dans laquelle l'activité fonctionnelle des anticorps via le fragment Fc est potentialisée, comprenant une étape consistant à ajouter une quantité appropriée d'un ou plusieurs ion(s) divalent (s), notamment du Zinc, dans le système biologique produisant les anticorps ou dans une solution comprenant des anticorps avant ou après purification ou encore dans la formulation finale sous la forme d'une solution injectable des anticorps. 12. Méthode selon la revendication 11 caractérisée en ce qu'on ajoute une concentration en ion zinc au moins égale à la concentration en anticorps. 13. Composition pharmaceutique comprenant des anticorps selon l'une des revendications 1 à 6, des cations métalliques divalents et au moins un excipient. 14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce que les cations métalliques sont des ions zinc. 15. Composition pharmaceutique comprenant des anticorps dans laquelle au moins 50%, ou 90%, ou encore 99% des anticorps possèdent un ion zinc lié, notamment lié aux acides aminés His 310, His 435 et Asn 434. 16. Solution comprenant un anticorps monoclonal ou des anticorps polyclonaux et une quantité appropriée en ion zinc, en particulier une concentration en ion zinc au moins égale à la concentration en anticorps, ladite solution étant adaptée pour une injection par voie intraveineuse, intramusculaire, ou sous-cutanée. 17. Test permettant d'évaluer l'efficacité d'un anticorps comprenant l'étude de la conformation 3D du domaine impliquant His 310, His 435 et Asn 434 telle que montrée à la figure 1 ou 2 ou encore un dosage de la teneur en Zinc desdits anticorps, la présence de zinc étant une indication de l'efficacité de l'anticorps.