Brevet FR2872289A1 — publié le 20051230

La présente invention concerne l'utilisation de polypeptides et de polynucléotides dans le domaine du diagnostic d'infection à la bactérie Legionella pneumophila. Les légionelloses sont des infections respiratoires sévères résultant de l'inhalation d'aérosols contaminés par des bactéries à croissance intracellulaire du genre Legionella, et qui se manifestent sous forme sporadique ou épidémique. Ces infections surviennent aussi bien en ville (infections communautaires) qu'en milieu hospitalier (infections nosocomiales). Legionella pneumophila est responsable de 95% de l'ensemble des cas de légionellose. Les légionelloses se présentent principalement comme des infections pulmonaires aiguës. Elles se caractérisent par la sévérité du tableau clinique: après une incubation de 2 à 10 jours et un début pseudo-grippal, le malade présente une température élevée, un malaise général, des douleurs abdominales, voire des troubles psychiques. L'atteinte radiologique est souvent bilatérale. La mortalité associée, particulièrement élevée chez certaines personnes dites à risque (sujets âgés ou souffrant d'un cancer, d'une hémopathie), varie de 10 à 20% (13% des 835 cas recensés en France en 2002). Il est essentiel de pouvoir poser précocément le diagnostic de légionellose du fait de l'enjeu thérapeutique: en effet, les légionelles sont insensibles aux bêta-lactamines - qui sont les principaux antibiotiques prescrits en cas de pneumopathie - et il faut avoir recours à un traitement spécifique reposant sur les macrolides (érythromycine) ou les fluoroquinolones. A l'heure actuelle, le diagnostic est réalisé par trois méthodes générales: la mise en évidence des bactéries à partir de prélèvements broncho-pulmonaires (soit directement par immunofluorescence soit par culture sur milieux sélectifs) ; la détection d'antigènes urinaires spécifiques; la mise en évidence d'une augmentation significative du titre des anticorps dans le sérum (sérologie). L'examen direct des prélèvements réalisé par microscopie à fluorescence se pratique, pour la majorité des réactifs commercialisés, à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui reconnaissent l'ensemble des sérogroupes connus de L. pneumophila. Le principal inconvénient de cette technique est sa faible sensibilité. Sa spécificité est également imparfaite (-90%), du fait de réactions immunologiques croisées avec certaines bactéries comme Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertusis ou Bacteroides fragilis. La culture sur milieux spécifiques est la méthode de choix, notamment dans un but épidémiologique (typage des souches), mais donne des résultats tardifs puisque les légionelles cultivent en 3 à 4 jours, voire plus. Les tests urinaires sont rapides et très spécifiques. Néanmoins, leur sensibilité est très variable, de 50-90% ; cette forte variabilité est liée non seulement aux caractéristiques du patient mais aussi au fait que les tests actuels permettent seulement la détection de L. pneumophila 1. Enfin, en présence d'une recherche d'antigène de légionelles urinaire positive, il est indispensable de réaliser en parallèle une culture de prélèvements respiratoires pour l'isolement de la bactérie. Le sérodiagnostic est tout particulièrement utile chez les patients qui ne produisent pas d'expectoration et en cas d'enquête épidémiologique. Il repose sur la mise en évidence d'une augmentation significative du taux des anticorps entre un sérum précoce et un sérum prélevé 4 à 6 semaines plus tard. Environ 30% des cas de légionellose sont identifiées par cette méthode à l'heure actuelle. Néanmoins, les antigènes utilisés dans les tests actuels sont constitués de simples extraits préparés directement à partir de culture de légionelles inactivées par la chaleur ou après ensemencement des bactéries dans le sac vitellin d'oeufs embryonnés. Les anticorps détectés reconnaissent en majorité des déterminants du lipopolysaccharide (LPS), qui peuvent être proches de déterminants du LPS d'autres bactéries et provoquer des réactions croisées. De fait, des réactions de ce type ont été décrites avec d'autres bactéries Gram négatives tels que Pseudomonas sp., Bacteroides sp., Bordetella sp. et certaines entérobactéries. Enfin, la plupart des tests actuels permettent seulement la détection des anticorps de type IgG, ce qui nécessite deux prises de sang à 4-6 semaines d'intervalle pour faire un diagnostic d'infection récente. En résumé, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir le diagnostic précoce des légionelloses. En particulier, les tests sérologiques actuels reposent sur des méthodes de détection anciennes, non automatisables, ou utilisent des antigènes non caractérisés ( soupes antigéniques ), dont la spécificité et la sensibilité sont peu satisfaisantes. La technique d'immunofluorescence indirecte (IFI) est la technique la plus employée pour le diagnostic sérologique (McDade JE, Shepard CC, Fraser DW, Tsai TR, Redus MA et Dowdle WR (1977), Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease., N Engl J Med. 297 (22) : 1197-203). Environ 70% des diagnostics au niveau européen sont réalisés par cette méthode. Il existe pourtant de très grandes variations selon les malades: ainsi pour un titre élevé précoce, la sensibilité est basse et la valeur prédictive est très faible (de l'ordre de 10-15% seulement) (Jarraud S, Reyrolle M et Etienne J. dans Freney J, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000). Aucune technique de sérodiagnostic n'utilise donc actuellement d'antigènes purifiés spécifiques de L. pneumophila, et ne permet un diagnostic précoce de l'infection. La protéine appelée G5, de séquence polypeptidique ID SEQ N 2, est connue dans l'art antérieur. C'est une métalloprotéase de Legionella pneumophila décrite comme étant capable d'induire une réponse de type cellulaire (ce qui est logique pour une bactérie intracellulaire). Il a également été décrit une réponse anticorps vis-à-vis de cette protéine G5 suite à une injection directe de la protéine chez l'animal de laboratoire, mais, jusqu'ici, il n'a pas été observé de réponse anticorps vis-à-vis de cette protéine après infection par Legionella pneumophila, par voie respiratoire. L'invention a cependant mis en évidence la présence d'anticorps sériques dirigés contre la protéine G5, suite à une infection respiratoire par Legionella pneumophila, ce qui a permis l'utilisation de cette protéine G5 dans des tests de diagnostic améliorés pour détecter, in vitro, une infection à Legionella pneumophila. Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent les ADN ou ARN 2872289 5 avec des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée. Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines. Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou aminoterminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telles que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, tnd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48- 62 (1992)) . On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou jusqu'à 5% du nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2 peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements.(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Par analogie, un polynucléotide ayant une identité d'au moins 95% avec un second polynucléotide est donc un 35 polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides dudit second polynucléotide peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou jusqu'à 5% du nombre total de nucléotides peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle de fixer des anticorps sériques présents dans des échantillons biologiques de patients infectés par Legionella pneumophila et celle du polynucléotide conforme à l'invention est de coder ce polypeptide. On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique. Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant nonnaturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. On entend par anticorps sériques des molécules synthétisées par un animal, y compris l'être humain, en réponse à la présence d'une substance étrangère (antigène) et non fixées sur une cellule immunitaire. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide. Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. Comme indiqué plus haut, l'invention a pour objet l'utilisation, in vitro, de la protéine G5, d'une partie ou de variants de cette protéine, de cellules hôtes comprenant des vecteurs incluant un polynucléotide codant pour la protéine G5, une partie de la protéine G5 ou un variant de la protéine G5, dans la production d'anticorps et le domaine du diagnostic in vitro de Legionella pneumophila. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic. Utilisation de polypeptides La présente invention a pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le domaine du diagnostic in vitro d'infection à Legionella pneumophila, d'un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine G5), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention vise également un polypeptide isolé comprenant: a) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2. Ainsi, des polypeptides conformes à l'invention peuvent comprendre des variants de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Le diagnostic in vitro d'une infection à Legionella pneumophila est effectué par des tests classiques de réactions immunologiques, tels que Elisa ou Western Blot. Ces test utilisent l'un des polypeptides selon l'invention qui vient se fixer de manière spécifique aux anticorps sériques contre Legionella pneumophila présents dans les échantillons biologiques. Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polypeptide préparé à partir de la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant un polynucléotide codant pour ledit polypeptide inséré. De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. Utilisation de polynucléotides La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le diagnostic d'une infection à Legionella pneumophila, d'un polynucléotide comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 (appelée G5 et extraite à partir du génome de Legionella pneumophila), codant pour la protéine G5. L'invention vise également un polynucléotide comprenant: a) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou avec la partie de séquence telle que définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou à la partie de 35 séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b). 2872289 13 Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN. Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. Utilisation d'anticorps L'invention vise également l'utilisation d'anticorps immunospécifiques des polypeptides selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'antigènes de Legionella pneumophila et suivre, par ce moyen, l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum). Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention et des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des anticorps conformes à l'invention. Partie expérimentale A) Protocole d'obtention des antigènes Clonage de la séquence codant la protéine G5 Le gène codant pour les séquences de la protéine G5, qui est un antigène, est obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie Legionella pneumophila (souche Philadelphia-1, ATCC 33152) en utilisant comme couple d'amorces: É l'oligonucléotide sens contenant la séquence: 5'-GAAAAAGTTCAAGCAAAAGG- 3' ; et É l'oligonucléotide antisens contenant la séquence: 15 5'ATCGACATAACAAGATTG-3' Le fragment ainsi amplifié correspondant est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production de la protéine clonée sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). La protéine clonée correspond aux acides aminés 1 à 336 de la protéine mature Msp de Legionella pneumophila. Expression de la protéine Une souche d'Escherichia coli est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C sous agitation dans 30 ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 g/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50ème dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 g/ml qui est incubée à 30 C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5. Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF. La suspension est incubée 30 minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C à 15500xg. Le culot est congelé à -20 C pendant au moins une nuit. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Tris-HC1 25 mM à pH 7,5, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. L'extrait total obtenu est mélangé dans un rapport 1:1 avec un tampon Tris-HC1 187.5 mM pH 6,8 contenant du dithiotréitol 125 mM, du glycérol 30%, du sodium dodécyl sulfate 6% (poids/volume) et du rouge de phénol 0, 03% (poids/volume). B) Test de diagnostic in vitro Protocole du test 1l a été utilisé dessérums provenant de patients ayant eu une infection documentée à Legionella pneumophila (collection du laboratoire). Les sérums témoins correspondaient à des sérums de 25 donneurs de sang (collection du laboratoire). La fixation des anticorps présents dans les sérums a été évaluée par des tests en Western Blot sur des extraits totaux de bactéries produisant la protéine G5 (obtenus comme précédemment). La membrane de nitrocellulose sur laquelle les protéines de l'extrait sont transférées est saturée 30 minutes à l'aide d'une solution de "tampon salin phosphate" (PBS) contenant 3% de lait demi écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (soit 1/300eme) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps simultanément anti-immunoglobulines G ou G, A, M humaines de chèvre, marqués à la phosphatase alcaline (par exemple 170-6462, Biorad) sont ajoutés, pendant une période de 30 minutes après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi écrémé. Trois nouveaux lavages sont réalisés puis du 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-phosphate et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés selon les indications du fournisseur jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat "positif" correspond à une précipitation du substrat sur la membrane à la position G5. Résultats et interprétation Un résultat type obtenu est présenté dans le tableau ci-après, sachant que les sérums dits "positifs" dans ce tableau sont ceux contenant des anticorps contre Legionella pneumophila identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention: Tableau de résultats Nombre de sérums de malades 24 infectés par Legionella pneumophila, diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Sérums "positifs" parmi les 6, soit 25 % 24 testés Sérums de donneurs de sang 130 comme témoins Sérums "positifs" parmi les testés 0, soit 0 % D'après le Tableau, on constate que 25% des infections à Legionella pneumophila ont été identifiées in vitro grâce à l'antigène selon l'invention. Il est donc démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de)(,2 est inférieure à 0,05) vis-à-vis de la protéine G5 au cours des infections Legionella pneumophila et, d'autre part, que la protéine G5 est pertinente pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection. 18 REVENDICATIONS 1. Utilisation pour détecter, in vitro, la présence d'anticorps à Legionella pneumophila dans des échantillons 5 biologiques: a) du polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) d'une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence 10 ID SEQ N 2, ou c) d'une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide est préparé à partir de la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide et par isolement dudit polypeptide du milieu de culture. 3. Utilisation selon la revendication 2, quand elle dépend de la revendication 1 point a), caractérisée en ce que le polynucléotide est de séquence ID SEQ N 1. 4. Utilisation pour détecter, in vitro, la présence 25 d'anticorps à Legionella pneumophila dans des échantillons biologiques: a) du polynucléotide de séquence ID SEQ N 1, ou b) d'une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) d'une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) d'une séquence polynucléotidique complémentaire à une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c). 5. Utilisation d'anticorps pour détecter, in vitro, la présence d'antigènes Legionella pneumophila dans des échantillons biologiques, caractérisée en ce que les anticorps sont immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les anticorps sont obtenus par administration à un animal d'un polypeptide selon la revendication 1 ou 2 et récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. 7. Kit pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides. 8. Kit pour l'utilisation selon l'une quelconque des 15 revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps.