Brevet FR2861596A1 — publié le 20050506

Utilisation d'acides nucléiques comprenant un adduit exocyclique Les adduits exocycliques de l'ADN, dont la 1,N6ethenoadenine (#A) et la 3,N4-éthénocytosine (#C), sont générés dans l'ADN cellulaire par des processus endogènes à travers l'interaction avec l'ADN des aldéhydes et/ou des hydroxyalkenales produits par la peroxydation des lipides (el Ghissassi, Barbin et al. 1995 ; Nair, Barbin et al. 1995 ; Chung, Chen et al. 1996). Ils peuvent également être formés par réaction avec des époxydes résultant de la métabolisation de différents polluants industriels comme les chlorures de vinyle ou le carbamate de vinyle (Barbin 2000). Lorsqu'ils sont présents dans l'ADN les adduits exocycliques, sont normalement éliminés par la voie de réparation par excision de base (Saparbaev and Laval 1998) (Petronzelli, Riccio et al. 2000 ; Kavli, Sundheim et al. 2002). Cependant, l'efficacité d'excision des eC par des protéines humaines purifiées ou dans un extrait cellulaire total reste faible (Saparbaev and Laval 1998). La peroxydation des lipides (LPO), induite par le stress oxydatif, génère des aldéhydes réactifs, qui réagissent avec les bases de l'ADN pour former des adduits exocycliques génotoxiques, dont la 1,N6-ethenoadenine (sA) et la 3,N4-éthénocytosine (#C). Ainsi, le stress oxydatif entraîne une augmentation du niveau d'accumulation des adduits exocycliques dans l'ADN cellulaire. Le stress oxydatif est impliqué dans l'étiologie de nombreuses pathologies humaines dont l'athérosclérose (Witztum and Steinberg 2001), la maladie d'Alzheimer (Arlt, Beisiegel et al. 2002) ou le cancer du côlon (Owen 2001). Des données récentes ont également mis en évidence que les systèmes de réparation de l'ADN sont fortement stimulés dans les tissus soumis à un fort stress oxydant, ainsi certaines protéines de réparation majeures de la voie de réparation par excision de base (Ape1 et PARP-1) sont fortement surexprimées dans les plaques d'athérome (Martinet, Knaapen et al. 2002). Ces données ont conduit certains auteurs à proposer que les adduits-éthéno puissent être utilisés comme des bio-marqueurs des dommages de l'ADN, associés à l'instabilité génomique (Bartsch and Nair 2000) (Bartsch and Nair 2000) induite par le stress oxydant. Il est avéré que les résidus #C sont hautement mutagènes dans les cellules humaines (Moriya, Zhang et al. 1994). Aussi, les résidus #C et #A présents, en faible quantité (bruit de fond) dans les tissus humains dans des conditions physiologiques normales, ont été très étudiés de par leurs propriétés pro-mutagènes et génotoxiques. Ces adduits génèrent diverses altérations génétiques dont des mutations ponctuelles, des délétions (Ballering, Nivard et al. 1997), des recombinaisons homologues et des aberrations chromosomiques majeures que ce soit dans les cellules somatiques ou les lignées germinales (Nivard and Vogel 1999). Ainsi, les processus qui préviennent les mutations induites par les éthéno-adduits dans le génome cellulaire avant la division cellulaire, pourraient jouer un rôle majeur dans le maintien de la stabilité de l'information génétique. Les niveaux d'#A, induits de façon exogène, par le chlorure de vinyle ou les carbamates de vinyle, sont supérieurs aux niveaux d'#C (Marion and Boivin-Angele 1999). Au contraire, le rapport des éthénoadduits générés par la LPO endogène semble être déplacé vers la formation des eC. Il a été en effet démontré que, dans des échantillons chirurgicaux de cancer du côlon, le niveau d'accumulation des eC est 30 fois plus élevé que celui des eA (Bartsch and Nair 2002). L'interaction de certaines protéines cellulaires soit avec des structures particulières de l'ADN soit avec des adduits formés sur ce dernier est impliquée dans leur toxicité. Ainsi, in vivo, l'instabilité somatique des répétitions CAG dans la maladie d'Huntington est basée sur la capture de la protéine de réparation des mésappariements Msh2 par des boucles d'ADN formées de façon endogène dans les régions de répétition (Manley, Shirley et al. 1999 ; Kovtun and McMurray 2001). De même, l'effet curatif des adduits de l'ADN générés par le cisplatine est médié par la capture des protéines HMG (High-Mobility-Group proteins) sur ces adduits (Kartalou and Essigmann 2001; Kartalou and Essigmann 2001). L'alkyl-N-purine-ADN glycosylase humaine (ANPG) excise les #A ainsi que des bases endommagées variées dont les alkyl-purines, l'hypoxanthine et la 1,N2-éthénoguanine (1,N2-eG), mais elle n'excise pas les eC (Gros, Saparbaev et al. 2002). D'une façon intéressante-bien que les souris déficientes en ANPG n'aient aucun phénotype particulieril a été montré que les cellules progénitrices myeloïdes de la moëlle osseuse ou les cellules pancréatiques bêta de ces souris sont plus résistantes aux lésions de l'ADN induites par le MMS (alkylation) et la streptozotocine respectivement (Cardinal, Margison et al. 2001 ; Roth and Samson 2002) que leurs contreparties sauvages. A l'opposé, les cellules souches ou les fibroblastes embryonnaires des souris déficientes en ANPG, présentent une hypersensibilité aux agents alkylants (MMS, Nitrosourée ou Mitomycine C) (Engelward, Dreslin et al. 1996 ; Engelward, Weeda et al. 1997 ; Elder, Jansen et al. 1998). Ces données suggèrent, qu'en fonction du type cellulaire (tissu), la sensibilité cellulaire aux agents alkylants peut-être reliée au statut de la protéine ANPG. Il a donc été postulé que la protéine ANPG puisse moduler la sensibilité des cellules vis-à-vis des agents alkylants utilisés notamment en thérapie anti-cancéreuse. Dès lors, il est envisageable, que des inhibiteurs spécifiques de cette ADN glycosylase pourraient être utilisés pour augmenter le pouvoir cytotoxique des agents antitumoraux de la classe des alkylants et donc l'efficacité de certaines chimiothérapies. Le gène, codant pour la protéine ANPG humaine, est localisé sur le chromosome 16 (Samson, Derfler et al. 1991 ; Vickers, Vyas et al. 1993) et code pour deux transcrits issus d'un épissage alternatif : un ARNm pleine longueur codant pour la protéine ANPG70 (293 AA) (Vickers, Vyas et al. 1993) et un variant d'épissage codant pour la protéine ANPG60 (298 AA) (Pendlebury, Frayling et al. 1994). Deux versions tronquées de la protéine ANPG ont également été décrites : ANPG40 (O'Connor and Laval 1991 ; Boiteux, Gajewski et al. 1992 ; O'Connor 1993) et ANPG80, respectivement dépourvues des 63 et des 73 premiers acides aminés N-terminaux par comparaison à ANPG70 (O'Connor 1993) (Lau, Scharer et al. 1998). Le domaine N-terminal nonconservé ne paraît donc contribuer que marginalement à la reconnaissance des dommages de l'ADN et à l'activité ADN glycosylase des diverses formes d'ANPG (O'Connor 1993); La protéine ANPG, dans les cellules de sein normales, est localisée dans le noyau comme en attestent les expériences d'immunofluorescence (Cerda, Turk et al. 1998). Il a été trouvé précédemment qu'ANPG peut reconnaître certaines modifications de l'ADN sans les exciser : des expériences de retard sur gel ont en effet montré qu'ANPG interagit avec les pyrrolidines, des analogues de site abasique.(Scharer, Nash et al. 1998). De plus, des expériences de complémentation phénotypique suggèrent que l'enzyme pourrait interagir avec la, 7,8-dihydro-8oxoguanine (8-oxoG) (Bessho, Tano et al. 1993) bien que la protéine purifiée soit incapable de l'exciser. Par ailleurs, il a été démontré que la protéine ANPG reconnaît in vitro les adduits cis-platine sur l'ADN avec une affinité moyenne (KD 71-144nM) et pourrait, à l'instar des HMG, les protéger de la réparation en en interdisant l'accès aux protéines de réparation (Kartalou, Samson et al. 2000). Les inventeurs ont de manière surprenante et inattendue observé que les protéines ANPG de rat et humaine interagissent spécifiquement, et ce avec une très forte affinité, avec les résidus #C présents dans un ADN oligonucléotidique simple ou double brin. Dès lors, les résidus #C ne sont plus accessibles au système de réparation de l'acide désoxyribonucléique. En outre, les inventeurs ont montré par des expériences d'extension d'amorce que la liaison d'ANPG aux #C, en contexte double ou simple brin, inhibe l'activité du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. Coli. Par là même, le détournement, la capture de la protéine ANPG par les résidus eC, pourrait être un déterminant important de la génotoxicité des adduit-éthénos de la cytosine. L'ensemble de ces résultats suggère qu'in vivo la capture d'ANPG au sein des complexes #C#ANOPG pourrait entraîner la persistance des eC dans le génome et que ces complexes seraient susceptibles de provoquer l'arrêt des fourches de réplication entraînant des lésions (coupures doubles brin) de l'ADN hautement délétères. Ainsi, l'utilisation de pièges à ANPG endogène, empêchant la formation des complexes #C#ANPG sur l'ADN cellulaire, rendant ainsi accessibles les résidus #C présents dans le génome aux systèmes de réparation, pourrait permettre soit une stimulation de l'élimination des adduits exocycliques, particulièrement des #C, par la voie de réparation par excision de base, soit une stimulation de l'efficacité des chimiothérapies basées sur l'utilisation d'agents alkylants. Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, simple brin ou double brin, comprenant au moins un résidu éthénocytosine, dans la préparation d'un médicament pour piéger l'alkylN-purine-ADN glycosylase (ANPG) dans les cellules pathologiques soumises à un fort stress oxydant entraînant la peroxydation des lipides (en particulier l'athérosclérose). L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique, simple brin ou double brin, comprenant au moins un résidu éthénocytosine, dans la préparation d'un médicament destiné à améliorer les traitements anticancéreux basés sur l'utilisation d'agents alkylants. Par résidu éthénocytosine on entend selon l'invention, tout dérivé de la cytosine ayant un substituant exocyclique pontant de façon covalente les atomes 3N et N4de la cytosine. Préférentiellement selon l'invention, le résidu éthénocytosine est choisi parmi la 3,N4- éthénocytosine, la 3-N4-éthano-2,-déoxycytidine, la 8-hydroxyméthyl- 3,N4-éthénocytosine ou encore la 3,N4-benzéthéno-2'-déoxycytidine ou tout autre substituant chimique pontant d'une façon covalente les atomes 3N et N4de la cytosine et présentant les mêmes propriétés. Selon l'invention, l'acide nucléique comprenant au moins un résidu éthénocytosine peut être tout acide nucléique, simple ou double brin, ayant une longueur d'au moins 12 nucléotides, quelle que soit sa taille totale. Préférentiellement, selon l'invention, l'acide nucléique a une longueur de 40 nucléotides. Avantageusement, on utilise selon l'invention les acides nucléiques répertoriés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 4 suivants : SEQ ID N 1 AAATACATCGTCACCTGGGeCCATGTTGCAGATCC SEQ ID N 2 CTATTAACGCCAGCTGG-eC-AAATGGGGGATGTGCTGCAAGGCG SEQ ID N 3 TGACTGCATA-EC-GCATGTAGACGATGTGCAT SEQ ID N 4 TGGG-eC-CATGCATGGCCCA L'acide nucléique utilisé selon l'invention peut comprendre plusieurs résidus éthénocytosines. Lorsque le fragment comprend plusieurs résidus éthénocytosines, ceux-ci doivent être espacés d'au moins 12 nucléotides. Selon l'invention, la concentration en acide nucléique dans la cellule doit être d'au moins 40 M. Ainsi, la concentration en acide nucléique dans la composition selon l'invention doit être comprise entre 100nM et 1mM, de préférence entre 1 M et 100 M. Selon l'invention, l'acide nucléique comprenant au moins un résidu éthénocytosine peut être, dans la composition, sous une forme libre ou contenu dans un vecteur, par exemple un plasmide. La composition selon l'invention peut être destinée au traitement des pathologies associées à la peroxydation des lipides, dû au stress oxydatif, telles que les maladies cardiovasculaires, comme par exemple l'athérosclérose, ou des maladies neurodégénératives, comme la maladie d'Alzheimer ou encore les cancers comme par exemple le cancer du sein ou du côlon. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de l'invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 représente l'effet de différents oligonucléotides double brin contenant un résidu modifié unique sur l'activité eA-ADN glycosylase de la protéine ANPG70. La Figure 2 représente les résultats obtenus dans des expériences de liaison de différents oligonucléotides double brin contenant un résidu modifié unique sur l'activité EA-ADN glycosylase dans un extrait total de cellules humaines de Lich. La Figure 3 représente les résultats des analyses du retard de mobilité électrophorétique sur gel de différentes protéines de réparation de l'ADN en présence d'un oligonucléotide double brin contenant une paire #C#G. La Figure 4 représente les résultats obtenus dans des expériences montrant l'effet de la protéine ANPG40 sur l'excision des #C et des thymines mésappariées par la protéine hTDG. La Figure 5 représente les résultats de l'analyse de la spécificité de l'interaction ANPG40/eC par Résonance des Plasmons de Surface. La Figure 6 représente l'effet de la protéine ANPG sur la synthèse d'ADN analysée par extension d'amorces sur une matrice double brin normale (CG) ou contenant un résidu eC (eC'G). La Figure 7 représente les résultats d'expérience d'inhibition in vivo de la réparation médiée par ANPG par des oligonucléotides double brin contenant un résidu #C (#C#G). Les exemples suivants sont illustratifs de l'invention et ne la limitent aucunement MATERIELS ET METHODES Oligonucléotides. Tous les oligodéoxyribonucléotides, à l'exception de ceux contenant un résidu eC, ont été fournis par Eurogentec (Seraing, Belgique). Cela inclut : les oligonucléotides contenant un résidu modifié unique uracile (U), hypoxanthine (Hx), 5,6dihydrothymine (DHT), 5,6-dihydrouracile (DHU), 5-hydroxyuracile (5ohU), 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) (Table 1), ainsi que les oligonucléotides complémentaires contenant soit dA, dG, dC ou T en position opposée à la base modifiée. Les oligonucléotides contenant un résidu eC unique ont été fournis par Genset (Paris, France). Pour obtenir les oligonucléotides duplex, un oligonucléotides modifié a été hybridé à son complémentaire, les duplexes résultants sont référencés sous la forme X.C(G,A,T), où X est la base modifiée et C(G,A,T) la base qui lui est appariée. Les contextes de séquence ont été préalablement utilisés pour l'étude de la réparation des éthéno-adduits, de l'hypoxanthine et des produits de fragmentation de la thymine (Saparbaev and Laval 1998 ; Saparbaev, Mani et al. 2000). Table 1 : Nom Taille 5' # 3' oligodeoxyribonucleotides a A" 40-mer AA TTGCT A TCT AGCTCCGC-EACGCTGGTACCCATCTCATGA-b A2 40-mer AA TT ACA TCGTCACCTGGG-EA- ~~~ CATGTTGCAGATCCATGCAC eC40b 40-mer AATTGCTATCTAGCTCCGC-C- CGCTGGTACCCATCTCATGA-b M13-EC 41-mer CTATTAACGCCAGCTGG-ECAAATGGGGGATGTGCTGCAAGGCG M13-C 41-mer CTATTAACGCCAGCTGG-CAAATGGGGGATGTGCTGCAAGGCG X 34-mer AAATACATCGTCACCTGGG-XCATGTTGCAGATCC eC30 30-mer TGACTGCA T A-EC- GCATGTAGACGATGTGCAT T 30-mer TGACTGCATA-TGCATGTAGACGATGTGCAT RT-GC 30-mer ATGCACATCGTCTACATGCGTATGCAGT CA MSc 34-mer GGATCTGCAACATG-YCCCAGGTGACGATGTATTT DLc 40-mer GATCTCATGAGATGGGTACCAGCG-YGCGGAGCTAGATAGC PR13 13-mer CGCCTTGCAGCAC FLAP 7. 6 29-mer TAGAGGCCATTTGCCAGCTGGCGTAATA G Hairpin-C 18-mer TGGG-C-CATGCATGGCCCA Hairpin- 18-mer TGGG-eC-CA TGCA TGGCCCA #C FL- 26-mer FITCcontrole GCCCGGCCGCCGGCCCCCCCCCCCGG CGGCCGGGC FL- 26-mer FITCquensher GCCCGGCCGCCGGCCCCCCCCCCCGG CGGCCGGGC-Dabcyl FL- 26-mer FITCinosine GCCCIICCGCCIICCCCCCCCCCCIICIICCG IGC-Dabcyl a : X = C, T, U, Hx, ~A, THF, 8oxoG, DHT, DHU ou 5ohU Y= dA, dG, dC ou T b = biotine b : Oligonucléotides biotinilés à leur extrémité 3' c = Oligonucléotides complémentaires contenant un dA, dG, dC ou T en face de la base modifiée. Enzymes. La T4 polynucleotide kinase est fournie par New England BioLabs. La purification des protéines UNG, Tagl, AlkA, MUG, Fpg, Nth, Nfo d' E. coli et de la protéine TDG humaine ont été réalisées comme décrit précédemment (Saparbaev and Laval 1998). Les protéines ANPG70, ANPG60, ANPG40 et ANPG80 (Saparbaev, Langouet et al. 2002), hOGG1 (Roldan-Arjona, Wei et al. 1997) et APE1 (Privezentzev, Saparbaev et al. 2001) humaines ont été purifiées selon la méthode préalablement décrite. L'activité des différentes protéines a été testée sur leurs substrats classiques et vérifiée avant de les utiliser. Essais Enzymatiques. L'excision des résidus #A, eC et thymine a été mesurée par clivage d'un oligonucléotide contenant une lésion unique à une position définie. L'essai standard de mesure de l'activité d'excision des #C (volume final 20 L) contient 0.2 pmole d'oligonucléotide duplex radiomarqué en position 5' (5'-[32P]) en tampon Hepes-KOH pH 7. 8, 70 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoethanol 5 mM, BSA 100 g/mL et des quantités limitantes d'enzyme en deçà de l'état d'équilibre de la réaction. L'essai pour l'excision des #A contient du KCI à 100 mM. Les incubations ont été faites à 37 C sauf pour la protéine hTDG, 30 C. Les sites abasiques ont été révélés par un léger traitement à la pipéridine (pipéridine 10% à 37 C pendant 15 min) (Ye, Holmquist et al. 1998). Les produits de réaction ont été analysés comme décrit précédemment (Saparbaev, Langouet et al. 2002). Les gels ont été exposés sur un Storm 840 Phosphor Screen et la quantité de radioactivité dans chaque bande a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageQuanTTM. Technique de Résonance des Plasmons de Surface (RPS). Les cinétiques d'interaction ont été déterminées à l'aide d'un appareillage BIAcore 1000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden). L'oligonucléotide duplex eC40-G biotinylé et pré-hybridé (à 0.1 ng/pL en tampon HBS-EP contenant : pH=7. 4 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3. 4 mM, polysorbate 20 5 %o (v/v) et supplémenté en NaCI 500 mM concentration finale) a été injecté à un flux de 2 uL/min dans une cellule recouverte de streptavidine sensorchip (SA sensor chip, Biacore). Afin d'éliminer le matériel lié de façon aspécifique, 30 L de SDS 0. 05% ont été injectés. La quantité de ligand immobilisé était de 600 - 900 UR (Unités de Résonance). Pour déterminer la constante de liaison apparente (Ko) par RPS, la protéine ANPG40 a été injectée à différentes concentrations à un flux de 30 uL/min en tampon HBS-EP. Après l'association protéine-ligand, la dissociation a été suivie sous injection de HBS. Les Kd ont été déterminés par analyse des sensogrammes résultants à l'aide du logiciel BIAevaluation. Expérience de retard de mobilité électrophorétique sur gel (EMSA). Le mélange réactionnel standard des tests de liaison (20pL) contient 70 mM HEPES-KOH pH 7. 8, 1 mM EDTA, 100 mM KCI, 5 mM 2-mercaptoethanol, 20-200 fmol d'oligonucléotide duplex radiomarqué 5'-[32P], des quantités croissantes de protéines et un compétiteur oligonucléotique non modifié froid. Le mélange a été incubé dans la glace pendant 20 min, et un aliquote a été analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% non dénaturant (37.5:1 acrylamide/bisacrylamide) en tampon TBE 0. 5 X (45 mM Tris-borate pH 8,1 mM EDTA) à 4mA/100V pendant 14 h à +4 C. Les gels ont été exposés et analysés sur un appareillage Storm 840 Phosphor Screen. La radioactivité présente dans chaque bande a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageQuaNTTM. Réaction d'extension d'amorce. Afin de générer un substrat double brin contenant soit une paire C#G soit une paire #C#G pour la synthèse d'ADN, un oligonucléotide matrice de 41-mer contenant soit une #C (M13-eC) ou une C (M13-CC) (Table 1) en position 17 a été hybridé à une amorce de 13-mer (PR13) radiomarquée au 32P en position 5' et à un oligonucléotide de 29-mer (Flap 7. 6), complémentaire à la matrice entre les positions 1 et 23 à un ratio molaire de 1:1,2, par chauffage à 95 C pendant 5 min suivi d'un refroidissement lent. Le mélange réactionnel standard (20 L) contient 10 nM de substrat 5'-32P- amorce/matrice, 10 mM de Tris-HCI pH 7. 5, 7. 5 mM de dithiothreitiol, 5 mM de MgCI2, 100 M de chaque dNTP et une unité de fragment de Klenow. Le mélange effectué, 20 nM à 500 nM des protéines ANPG80 ou ANPG70 ont été ajoutés. La réaction de synthèse d'ADN a été faite à 37 C pendant 5 min et stoppé par addition d'EDTA. Les produits de la réaction ont été analysés comme décrit précédemment (Saparbaev, Mani et al. 2000). Les gels ont été exposés sur un appareillage FUJI FLA 3000 Phosphor screen. Lignées cellulaires, culture cellulaire et transfection. Les cellules NIH3T3 ont été cultivées en plaque 6 puits en milieu Dubelcco's modified Eagle's medium (GIBCO) à 37 C sous une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Le milieu de culture a été supplémenté par 10% de sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 100mg/ml de streptomycine et 100 U/ml de pénicilline. Avant transfection, les cellules ont été lavées 2 fois au PBS et le milieu de culture a été remplacé par 1 ml de milieu OptiMEM (GIBCO). Pour les expériences de transfection, une solution (50 l0 contenant 100 mM de NaCI, 10 mM d'HEPES à pH 7.4 et 0.2 nmole de chaque oligodéoxynucléotide a été préparée selon les instructions du fournisseur. 4 g de Cytofectine GSV ont été dilués dans le même tampon (50 l) et ajoutés aux solutions d'oligonucléotides. Après 15 min d'incubation du mélange à température ambiante, les complexes cytofectine/ADN formés, ont été ajoutés, goutte-à-goutte, sur les cellules. Celles-ci ont été incubées 5 heures à l'étuve à 37 C puis fixées par une solution de formaldéhyde à 4% pendant 5 min à température ambiante et observées en microscopie de fluorescence 16 heures plus tard. Exemple 1 : Effet de différents oligonucléotides double brin contenant un résidu modifié unique sur l'activité EA-ADN glycosylase de la protéine ANPG70. Avant la réaction, la protéine ANPG70 a été pré-incubée avec les différents ADN compétiteurs pendant 30 mn à 0 C. Le mélange réactionnel, contenant 0,4 pmol de duplex #A#T marqué en 5' au [32P] (10 nM) a été incubé sans (piste 1) ou avec (pistes 2-16) la protéine ANPG70 (40 nM) pendant 20 min à 37 C en absence (piste 2) ou en présence des ADN compétiteurs non marqués suivants (pistes 3-16): pistes 3 et 4, C#G, 0,4 et 3,2 pmols ; pistes 5 et 6, G#T, 0,4 et 3,2 pmols ; pistes 7 et 8, G#U, 0,4 et 3,2 pmols ; pistes 9 et 10, #A#T, 0,4 and 3,2 pmols ; pistes 11 et 12, #C#G, 0,4 et 3.2 pmols ; pistes 13 et 14, THF-G, 0,4 et 3,2 pmols ;pistes 15 et 16, 8-oxoG-C, 0.4 et 3.2 pmols. Les produits de réaction ont été analysés comme décrit dans les procédures expérimentales. a et b indiquent respectivement le substrat (40-mer) et le produit de clivage (19-mer). Résultats : Dans cette expérience, les inventeurs ont testé si ANPG pouvait être inhibée par des bases modifiées qui ne sont pas des substrats pour elle. A cette fin, les inventeurs ont analysé l'effet d'oligonucléotides duplex contenant différentes lésions de l'ADN sur l'activité eA-ADN glycosylase d'ANPG. L'oligonucléotide duplex #A#T marqué au 32P en position 5' a été incubé avec la protéine ANPG purifiée en présence d'un excès molaire d'oligonucléotide X#MS duplex froid contenant où X est l'une des paires de bases suivantes : C#G, G#T, G*U, eA*T, sCG, THF-G, 8oxoG*C 8oxoG*A, à 37 C pendant 20 min. Comme représenté dans la Figure 1, lorsque l'oligonucléotide 40-mer duplex #A#T est traité avec la protéine ANPG70 puis à la pipéridine, de façon à révéler l'activité ADN glycosylase de cette dernière (coupure des sites abasiques générés par ANPG) , près de 70% de l'oligonucléotide est incisé (piste 2). Afin de valider l'essai d'inhibition, l'oligonucléotide #A#T froid a été utilisé comme compétiteur : l'addition d'une quantité équimolaire de ce compétiteur n'a que très peu, ou pas, d'effet inhibiteur (piste 9) et un excès molaire de 8 fois résulte en une réduction d'un facteur 4 de l'excision des #A (piste 10). Il faut noter que le défaut d'inhibition de l'activité d'ANPG par une quantité équimolaire d'oligonucléotide #A froid est dû au fait que la concentration finale d'#A utilisée piste 9 (20 nM) est de l'ordre de la valeur du Km de la protéine ANPG pour ce substrat (24 nM). D'une façon remarquable, l'activité d'excision des #A est respectivement réduite d'un facteur 2 à 20 en présence d'un excès molaire de 1 à 8 d'oligonucléotide #C#G (Figure 1, pistes 11-12). L'oligonucléotide #C#G est donc un inhibiteur d'ANPG plus efficace que l'oligonucléotide #A#T (Figure 1, pistes 10 et 12). De plus, les oligonucléotides compétiteurs contenant des paires C'G, G*T, G*U, THFEG, 8oxoGbC (pistes 3-8 et 13-16) n'ont aucun effet inhibiteur notable (quelques %) sur l'activité eA-ADN glycosylase de la protéine ANPG70 même à un excès molaire de 8 fois (pistes 4, 6, 8, 14 et 16). Une modulation similaire de l'activité À-ADN glycosylase en présence des différents compétiteurs a été obtenue, tant avec la protéine ANPG70, qu'avec sa forme tronquée ANPG40 et son homologue de rat APDG60. Cela indique que l'effet d'inhibition observé est indépendant du domaine N-terminal variable des isoformes d'ANPG. Par ailleurs, quand l'oligonucléotide duplex #A2#T, dont la séquence est différente de celle de l'oligonucléotide #A#T (voir Table 1), est utilisé, la même inhibition de l'activité eA-glycosylase est observée. Ces données indiquent que l'inhibition n'est pas sensible au contexte de séquence. L'ensemble de ces résultats indique que les alkyl-N-purine ADN glycosylases humaine et de rat reconnaissent spécifiquement les résidus eC parmi toutes les autres lésions de l'ADN testées. Exemple 2 : Effet de différents oligonucléotides double brin contenant un résidu modifié unique sur l'activité eA-ADN glycosylase dans un extrait de cellules de Lich. 0,2 pmol d'oligonucléotide #A2#T double brin marqué en 5' au [32p] (4 nM) ont été incubée sans (piste 1) ou avec (pistes 2-10) un extrait de cellules de Lich (100 g) pendant 60 min à 37 C en absence (piste 2) ou en présence des ADN compétiteurs froids suivant (pistes 3- 10) : pistes 3 et 4, #A#T, 1 et 5 pmols ; pistes 5 et 6, AT, 1 et 5 pmols ; pistes 7 et 8, 8-oxoG-C, 1 et 5 pmols ; pistes 9 et 10, #C#G, 1 et 5 pmols. Les produits de réaction ont été analysés comme décrit dans les procédures expérimentales. a et b indiquent respectivement le substrat (40-mer) et le produit de clivage (19-mer). Résultats : Etant donné qu'ANPG est la seule eA-ADN glycosylase connue chez les mammifères, les inventeurs ont cherché à savoir si les #C#G pouvaient l'inhiber dans un extrait cellulaire total. En fait, comme cela est représenté dans la Figure 2, l'addition de compétiteur #C#G froid à un extrait total de cellules de Lich inhibe complètement l'excision des #A (pistes 9 et 10). Dans ces conditions (extrait cellulaire), l'inhibition de l'activité eA-ADN glycosylase par #A#T est plus efficace qu'avec la protéine purifiée. Là encore, l'inhibiteur le plus efficace est l'#C (Figure 2, pistes 3-4) et un excès molaire d'oligonucléotides duplex compétiteurs C#G ou 8oxoG*C n'a aucun effet sur l'excision des #A (Figure 2, pistes 5-8). Cette expérience montre qu'un ADN contenant un résidu #C est un puissant inhibiteur de l'activité eA-ADN glycosylase dans un extrait cellulaire et probablement in vivo. Exemple 3 : Analyse du retard de mobilité électrophorétique sur gel de différentes protéines de réparation de l'ADN en présence d'un oligonucléotide double brin contenant une paire #C#G. L'oligonucléotide #C#G double brin marqué en 5' au [32P] (10 nM) a été incubé à 4 C pendant 30 min en absence (Figure 3, piste 1) ou en présence des protéines de réparation suivantes (100 nM): pistes : 2, UDG ; 3,AlkA ; 4, MUG ; Nth ; Fpg ; Nfo ; GSThTDG ; 9, ANPG40 ; 10, APDG60 ; 11,hNTH1 ; 12, hOGG1 ; 13, Ape1 ; 14, Apn1 ; 15, Tag1. Les produits de réaction ont été analysés comme décrit dans les procédures expérimentales. Résultats : L'observation de l'inhibition de l'activité eA-ADN glycosylase en présence d'oligonucléotide #C#G pourrait résulter de la capture de la protéine ANPG par les résidus eC. Les inventeurs ont ainsi examiné l'interaction d'un oligonucléotide double brin contenant une paire de base #C#G unique avec les protéines de réparation UDG, AlkA, MUG, Nth, Fpg, Nfo, GST-hTDG, ANPG40, APDG60, hNTH1, hOGG1, Ape1, Apn1 et Tagl par EMSA. Cet essai permet la détection et la mesure des proportions relatives de protéine libre ou liée à l'ADN. Afin d'éviter toute interaction non-spécifique, le mélange réactionnel standard contient un large excès molaire de BSA (17 fois) et d'un oligonucléotide double brin non modifié, C34#G, froid (10 fois). Les protéines MUG d'E. coli et TDG humaine sont des protéines eC-ADN glycosylases, spécifiques efficaces. Comme attendu, les résultats présentés dans la Figure 3 montrent que la protéine MUG interagit, de façon très spécifique, avec l'oligonucléotide #C34#G : près de 90% de l'ADN radiomarqué est présent sous forme de complexe (piste 4). A l'opposée, dans les conditions utilisées, il s'est avéré impossible de détecter les complexes formés entre la protéine GST-hTDG et l'oligonucléotide #C34#G (Figure 3, piste 8). En accord avec les données biochimiques présentées précédemment, la protéine ANPG40 humaine et son homologue de rat, APDG60, interagissent de façon spécifique avec l'oligonucléotide #C34#G. Comme avec MUG, 90% de l'ADN radiomarqué est présent sous forme liée (Figure 3, pistes 9-10). Comme attendu, les protéines UDG, Nth, hNTH1, Ape1 et Tagl ne forment pas de complexe détectable avec l'ADN #C34#G. Par contre, bien que les protéines AlkA, Fpg, Nfo, hOGG1et Apn1n'excisent pas les résidus #C, elles interagissent très faiblement avec #C34#G : moins de 10% de l'ADN radio-marqué est présent sous forme liée (Figure 3 pistes 3,6, 7,12 et 14). En fait, contrairement à ANPG40 et APDG60, des expériences de liaison compétitive, ont révélé que les interactions observées dans la Figure 3 pour les protéines AlkA, Fpg, Nfo, hOGG1 et Apn1 sont non-spécifiques. En conclusion, ces données montrent que, parmi toutes les protéines utilisées dans ces expériences, seules MUG, ANPG40 et APDG60 se lient aux adduits eC de façon spécifique. Exemple 4 : Effet de la protéine ANPG40 sur l'excision des #C et des thymines mésappariées par la protéine hTDG. Les oligonucléotides double brin, radiomarqués en 5' au [32p] , G/T (Figure 4, pistes 1-4) or eC/G (pistes 5-8) (10 nM chacun) ont été incubés avec les enzymes purifiées pendant 90 min à 30 C comme suit : pistes 1,5: contrôle, sans enzymes ; pistes 2,6: incubation avec la protéine ANPG à 100 nM ; pistes3, 7: incubation avec la protéine GSThTDG (TDG) à 50 nM ; 4,8: incubation avec la protéine ANPG (100 nM) et la protéine GST-hTDG (50 nM) (TDG-ANPG). Les sites abasiques générés par les ADN glycosylases ont été révélés par traitement à la pipéridine (10%, 10 mn à 37 C). Résultats : La protéine ANPG se lie très intimement aux oligonucléotides #C#G mais n'excise pas les résidus #C. Cela permet d'envisager qu'ANPG pourrait protéger les résidus #C présents dans l'ADN de la réparation modulée par les protéines MUG et hTDG. Les oligonucléotides #C30#G et T#G ont été incubés en présence des protéines ANPG40 et hTDG puis soumis à un traitement à la pipéridine afin de révéler les sites abasiques générés par l'activité ADN- glycosylase. Les résultats présentés dans la Figure 4, montrent qu'ANPG40, par elle-même, n'est capable d'exciser ni les résidus thymine mésappariés ni les résidus EC : aucun clivage n'est observé (Figure 4, pistes 2 et 6). En revanche, la protéine ANPG40 inhibe fortement l'excision des résidus #C par les protéines hTDG (pistes 7-8) et MUG. Remarquablement, ANPG40 présente également une faible capacité d'inhibition de l'activité ADN glycosylase de hTDG spécifique des thymines mésappariées (Figure 4, pistes 3-4). Ce résultat est inattendu dans la mesure où ANPG n'interagit pas avec les mésappariements T#G (Figure 4, piste 2). En conclusion, ces résultats fournissent la première évidence de l'existence d'une interaction forte entre ANPG et les résidus eC. Ils forment un complexe enzyme/substrat non réactif qui prévient l'accès à la lésion par les EC-ADN glycosylases MUG et hTDG. Ce complexe est formé entre la protéine ANPG et la base modifiée exocyclique mais pas avec un site abasique (AP), car ANPG n'excise pas les eC et le traitement subséquent à la pipéridine ne génère pas de coupure de l'oligonucléotide (Figure 4, piste 6). Une interaction protéineprotéine spécifique qui bloquerait l'excision des eC par la protéine hTDG n'est pas totalement exclue. Cependant, ANPG inhibe également l'excision des eC par la protéine MUG, et une interaction spécifique entre une protéine humaine et une protéine bactérienne est très improbable. Exemple 5 : Liaison des différentes isoformes de la protéine ANPG à un oligonucléotide contenant un résidu eC. Dans les cellules, la protéine ANPG est présente sous de nombreuses formes, dont les versions tronquées, produites par épissage alternatif. Les isoformes d'ANPG diffèrent dans la séquence des 80 premiers acides aminés N-terminaux non conservés, il a donc été conclu que son domaine N-terminal ne contribue apparemment que peu à la reconnaissance des dommages de l'ADN et à l'activité ADN-glycosylase. Afin de mieux définir l'affinité des différentes isoformes d'ANPG par rapport à l'oligonucléotide #C34#G, la constante apparente de liaison (Ko) a été mesurée par EMSA. Les mesures de Ko ont été réalisées dans des conditions telles que [ADN] (1 nM) confirmé que la liaison observée est spécifique. La protéine ANPG n'excise pas les lésions présentes dans un ADN simple brin, néanmoins elle se lie également spécifiquement aux résidus eC présents en contexte simple brin avec un KD=64 nM (Table 2). Table 2. Valeurs de Ko des protéines ANPG pour les duplex #C#G duplex et les simple-brins eC KD (nM) Protéine ############################# #C#G eC ANPG40 6,1 1,75 64 24 ANPG 60 8,0 3,6 nd ANPG 70 8,5 3,3 nd ANPG 80 7,0 ~ 1,4 nd Exemple 6 : Analyse de la spécificité de l'interaction ANPG40/eC par Résonance des Plasmons de Surface. Figure 5, courbe 1 : 60 L de protéine ANPG40 à 100 nM ont été passés à travers la surface contenant l'oligonucléotide C#G immobilisé. Figure 5, courbe 2 : quantité équivalente de protéine BSA a été passée à travers la surface contenant l'oligonucléotide #C#G immobilisé. Figure 5, courbe 3 : 60 L de protéine ANPG40 à 100 nM ont été passés à travers la surface contenant l'oligonucléotide #C#G immobilisé. Résultats : Afin de confirmer la spécificité d'interaction du complexe #C#ANPG40, les inventeurs ont employé une technique alternative aux expériences de retard de mobilité sur gel : la technique résonance des plasmons de surface (Surface Plasmon Resonance, RPS). L'oligonucléotide #C40#G a été immobilisé à la surface d'une cellule SA chip. Aucune liaison n'a été détectée lorsque la BSA (Figure 5, courbe 1) ou la protéine ANPG40 (Figure 5, courbe 2) ont été percolées à travers le capteur contenant, respectivement, les oligonucléotides immobilisés double brin eC40*G ou C40#G. A l'opposée, quand la protéine ANPG40 a été injectée sur l'oligonucléotide immobilisé double brin #C40#G, une forte augmentation de la réponse a été observée (Figure 5, courbe 3). Ainsi, ces résultats confirment la nécessité absolue de la présence d'un résidu eC pour la reconnaissance spécifique de l'oligonucléotide double brin par la protéine ANPG40. Pour les analyses cinétiques, la quantité d'oligonucléotide double brin immobilisé #C40#G a été limitée afin réduire au maximum les artefacts dus au transport de masse. L'analyse des profils des phases de dissociation, montre que le complexe formé entre l'oligonucléotide double brin et la protéine ANPG40 est extrêmement stable et se dissocie très lentement. Le KD apparent calculé est de 7,12 0,86 nM. Les résultats obtenus par la technique SPR sont en complet accord avec les données précédentes et confirment qu'une interaction intime très forte lie les résidus eC et la protéine ANPG40. Exemple 7 : Effet de la protéine ANPG sur la synthèse d'ADN analysée par extension d'amorces sur une matrice double brin normale (C#G) ou contenant un résidu eC (#C#G). Figure 6, partie A. Structure schématique de la matrice double brin utilisée et représentation des différents produits de réaction. 13-mer amorce seule (pistes 1-2,9-10), 41-mer : produit d'élongation pleine longueur (piste 3), 25-mer : de pause sur le résidu eC (piste 11). 20-mer : produit d'inhibition de la synthèse d'ADN par le complexe ANPG/eC*G. Figure 6, partie B. Incubation de la matrice double brin normale (M13-C/FLAP 4. 6) ou contenant une paire #C#G (M13-eC/FLAP 4. 6) hybridée à l'amorce PR13 radiomarquée en 5' au [32p] (10 nM), en absence d'enzyme (pistes: 1 et 9) ou en présence d'ANPG80 à 500 nM (excès molaire de 50 fois, X50, pistes 2 et 10). La réaction d'extension d'amorce a été faite pendant 5 mn à 37 C avec 1 U de fragment de Klenow en absence d'ANPG80 (pistes 3 et 11) ou en présence de 20 nM (excès molaire de 2 fois, X2, pistes 4 et 12), 50 nM (excès molaire de 5 fois, X5, pistes 5 et 13), 100 nM (excès molaire de 10 fois, X10, pistes 6 et 14), 250 nM (excès molaire de 25 fois, X25, pistes 7 et 15) or 500 nM (excès molaire de 50 fois, X50, pistes 8 et 16) de protéine ANPG80. Les produits de réaction ont été analysés comme décrit dans les procédures expérimentales. Résultats : Les résidus #C exocycliques présents dans l'ADN présentent des propriétés mutagènes tant in vivo qu'in vitro. Bien qu'ils puissent être dépassés par des ADN polymérases telles que l'ADN polymérase I d'E. coli (Simha, Yadav et al. 1994)et l'ADN polymérase de mammifères (Singer, Medina et al. 2002) avec une faible fidélité, leur accumulation dans le génome résulte néanmoins en des aberrations chromosomiques majeures (Nivard, Wijen et al. 1998 ; Nivard and Vogel 1999). Etant donné qu'ANPG se lie aux ADN double brin contenant des résidus #C avec une très haute affinité (KD=6 à 8 nM), nous avons évalué l'effet de l'interaction des protéines ANPG70/80 avec une paire #C#G sur l'activité ADN polymérase du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli par extension d'amorce sur une matrice double brin contenant soit une paire C#G ou une paire #C#G à une position définie (schématisée dans la Figure 6A). Les résultats présentés dans la Figure 6B, montrent que la présence d'un excès molaire (par rapport à la quantité de matrice) de 2 à 50 fois de la protéine ANPG80 (pistes 3-8) n'a aucun effet sur l'élongation de l'amorce radiomarquée en 5' au [32P] hybridée à la matrice double brin non endommagée (M13-C/FLAP4.6) (pistes 1-8). Pour chaque échantillon, l'oligonucléotide pleine longueur (41-mer) est synthétisé. La présence d'un résidu #C dans l'oligonucléotide matrice crée simplement un site faible de terminaison (Figure 6, piste 11) dû à la pause de l'ADN polymérase qui se traduit par la génération d'un produit de 25-mer (Figure 6A et 6B, piste 11). A l'opposé, l'addition de quantités croissantes des protéines ANPG80 (Figure 6) au mélange réactionnel d'élongation contenant la matrice modifiée, conduit à un très fort blocage de la synthèse d'ADN (pistes 12- 16) dès les faibles concentrations en ANPG (piste 12). En présence de quantités croissantes d'ANPG80, le produit majeur synthétisé est un 20mer. Cela est dû à la présence de la protéine ANPG80 complexée à l'ADN contenant la paire #C#G. Ce complexe inhibe l'activité de déplacement de brin du fragment de Klenow. L'interaction entre ANPG et un résidu eC en contexte ADN simple brin, inhibe également la synthèse d'ADN mais à un excès molaire >25-fois. Cela est dû à l'affinité plus faible d'ANPG pour les résidus eC dans ce contexte (Table 2). Ces 1 résultats démontrent que la liaison de la protéine ANPG aux résidus eC présents dans l'ADN est suffisante pour en bloquer la synthèse avec une haute efficacité. Exemple 8 : Inhibition in vivo de la réparation médiée par ANPG par des oligonucléotides double brin contenant un résidu eC (#C#G). Les cellules NIH3T3, ont été transfectées avec l'oligonucléotide FL-inosine (panneaux supérieurs) ou co-transfectées avec un mélange des oligonucléotides FL-ANPG/Hairpin-C (panneaux inférieurs). L'activité in vivo de la protéine ANPG a été analysée en microscopie de fluorescence 5 heures après transfection. Résultats : Afin de confirmer la capacité d'inhibition des résidus eC vis- à-vis de la protéine ANPG par titration de cette dernière in vivo, des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été transfectés avec l'oligonucléotide FL-inosine (voir Table 1). Cet oligonucléotide en épingle à cheveux (hairpin), couplé en 5' à un fluorophore (FITC) et en 3' à un extincteur (quenscher) de fluorescence (Dabcyl) , contient des résidus inosine, substrats d'ANPG. Lorsqu'il est transfecté dans les cellules, les inosines qu'il contient sont excisées par la protéine ANPG endogène et les sites abasiques générés sont clivés par les AP endonucléases cellulaires. Il en résulte une déstabilisation de l'oligonucléotide qui est converti en courts fragments d'ADN simple brin. Le fluorophore n'étant plus soumis à l'influence de son quenscher (Dabcyl), il fluoresce lorsqu'il est excité. L'observation des cellules transfectées en microscopie de fluorescence permet donc d'observer in vivo l'activité de réparation des résidus inosines par a protéine ANPG. Préalablement, l'efficacité de pénétration de l'oligonucléotide substrat dans les cellules ainsi que sa stabilité, ont respectivement été vérifiées par transfection de l'oligonucléotide fluorescent contrôle (FL-controle) et de l'oligonucléotide éteint (FLquenscher) (voir Table 1). Les résultats présentés dans la Figure 7 (panneaux supérieurs) montrent un fort marquage fluorescent des cellules NIH3T3 transfectées avec FL-inosine. Ces données attestent du fait que l'oligonucléotide pénètre efficacement dans les cellules où il est parfaitement reconnu par l'ANPG comme l'un de ses substrats. Le même résultat est obtenu lorsque l'oligonucléotide FL-inosine est cotransfecté avec l'oligonucléotide C-Hairpin ne contenant pas de lésion (voir Table 1). A l'opposé, quand l'oligonucléotide FL-inosine est cotransfecté avec l'oligonucléotide C-Hairpin (voir table 1), qui contient une paire #C#G une très forte diminution de l'émission de fluorescence est observée (Figure 7, panneaux du bas). Ces données indiquent, qu'en présence d'un oligonucléotide contenant une paire #C#G l'activité ADN glycosylase d'ANPG est inhibée dans les cellules. Cet effet inhibiteur est probablement obtenu par formation des complexes ANPG##C décrits précédemment qui titrent la protéine in vivo. Ces résultats montrent que l'inhibition de l'activité de la protéine ANPG par les résidus eC est aussi efficace in vivo qu'in vitro. BIBLIOGRAPHIE Arlt, S., U. Beisiegel, et al. (2002). "Lipid peroxidation in neurodegeneration : new insights into Alzheimer's disease. " Curr Opin Lipidol 13 (3): 289-94. Ballering, L. A., M. J. Nivard, et al. (1997). 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REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un acide nucléique, simple brin ou double brin, comprenant au moins un résidu éthénocytosine, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des affections liées à l'expression de l'alkylN-purine-ADN glycosylase (ANPG) dans les cellules. 2) Utilisation selon la revendication 1, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement à piéger l'alkyl-N-purine-ADN glycosylase (ANPG) dans les cellules pathologiques soumises à un fort stress oxydant. 3) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans la préparation d'un médicament destiné à piéger l'alkyl-N-purine-ADN glycosylase (ANPG) dans les cellules soumises à un fort stress oxydant entraînant la peroxydation des lipides. 4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation d'un médicament destiné à améliorer les traitements anticancéreux. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans la préparation d'un médicament destiné à améliorer les traitements anticancéreux basés sur l'utilisation d'agents alkylants. 6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le résidu éthénocytosine est dérivé de la cytosine ayant un substituant exocyclique pontant de façon covalente les atomes N3 et N4de la cytosine. 7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 6, caractérisée en ce que le résidu éthénocytosine est choisi parmi la 3,N4- éthénocytosine, la 3-N4-éthano-2,-déoxycytidine, la 8-hydroxyméthyl-3,N4- éthénocytosine, la 3,N4-benzéthéno-2'-déoxycytidine ou tout autre substituant chimique pontant d'une façon covalente les atomes 3N et N4de la cytosine et présentant les mêmes propriétés. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'acide nucléique comprenant au moins un résidu éthénocytosine est un acide nucléique ayant une longueur d'au moins 12 nucléotides. 9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'acide nucléique a une longueur de 40 nucléotides. 10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'acide nucléique comprend plusieurs résidus éthénocytosines. 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les résidus éthénocytosines, sont espacés d'au moins 12 nucléotides. 12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques suivants, répertoriés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 4 : SEQ ID N 1 AAATACATCGTCACCTGGGCCATGTTGCAGATCC SEQ ID N 2 CT A TT AACGCCAGCTGG-C-AAA TGGGGGA TGTGCTGCAAGGCG SEQ ID N 3 TGACTGCATA-C-GCATGTAGACGATGTGCAT SEQ ID N 4 TGGG-EC-CATGCATGGCCCA 13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la concentration en acide nucléique dans la cellule est d'au moins 40 M 14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la concentration en acide nucléique dans la composition est comprise entre 100nM et 1 mM, de préférence entre M et 100 M. 15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'acide nucléique comprenant au moins un résidu éthénocytosine est sous une forme libre ou contenu dans un vecteur. 16) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des maladies cardiovasculaires, particulièrement l'athérosclérose 17) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des maladies neurodégénératives particulièrement la maladie d'Alzheimer 18) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des cancers, particulièrement le cancer du sein ou du côlon.