Brevet FR2861731A1 — publié le 20050506

NOUVELLE PROTEINE DE FIXATION DU PHOSPHATE, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA CONTENANT ET SES UTILISATIONS La présente invention a pour objet une nouvelle protéine, issue du sérum humain, de fixation du phosphate, des compositions pharmaceutiques la contenant ainsi que ses utilisations, notamment dans le cadre du traitement de l'hyperphosphatémie et des maladies cardiovasculaires ou de l'arthrite. Le phosphate est une molécule très importante impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques. On retrouve notamment le phosphate dans les phospholipides, dans le mécanisme de production d'énergie (ATP, ADP), dans les processus de signalisation cellulaire, dans la composition du matériel génétique dans les os (sous forme de phosphate de calcium). L'hyperphosphatémie est une pathologie liée à un excès de phosphate dans l'organisme et provoque notamment une augmentation des risques de maladies cardiovasculaires, en favorisant les processus d'athérosclérose et de calcification des artères (Dorozhkin et Epple, 2002 ; Amann et al., 2003 ; Blazheevich et al., 1975). La calcification s'effectuant au niveau des articulations, l'hyperphosphatémie peut aussi provoquer de l'arthrite (pseudo-goutte). Les sels de phosphate de calcium produits dans le sérum lors d'une hyperphosphatémie précipitent dans les tissus mous avec calcification ectopique dans différents tissus : vaisseaux (accidents vasculaires cérébraux ou cardiaques), articulations (pseudo-goutte), cristallin, interstitium rénal (néphrocalcinose), sous- cutanées (prurit), pulmonaires, pancréatiques. Ainsi, la moitié des décès chez les personnes souffrant d'insuffisance rénale est due à des maladies cardiovasculaires liées à l'hyperphosphatémie. A cet égard, certains chélateurs du phosphate qui complexent le phosphate dans la lumière intestinale sont actuellement utilisés comme médicament. Cependant, tous ces chélateurs ne sont pas physiologiques. De là découlent certaines complications ou restrictions quant à leur usage. Les préparations contenant du magnésium sont limitées par la survenue de troubles digestifs (diarrhée) et sont à proscrire en raison du risque d'hypermagnésémie. De même, la prescription d'hydroxyde d'aluminium, longtemps utilisé du fait de son efficacité, doit être évitée, ou du moins limitée à de très faibles périodes, en raison du risque d'intoxication aluminique (anémie hypochrome microcytaire, ostéomalacie, myopathie, démence). La prescription de sels de calcium est le meilleur moyen pour corriger à la fois l'hypocalcémie et l'hyperphosphorémie, permettant d'une part d'augmenter la quantité de calcium absorbée par l'intestin grêle malgré le déficit en calcitriol, et d'autre part de complexer le phosphore dans la lumière intestinale sous forme de phosphate de calcium qui sera éliminé dans les selles. Cependant, l'inconvénient majeur des chélateurs contenant du calcium est d'induire une hypercalcémie, qui, dans certaines séries, a pu être notée chez 20% des malades. Ce risque a conduit à mettre au point d'autres produits capables de limiter l'hyperphosphorémie. Le médicament actuellement le plus utilisé est le Renagel (Ramsdell ; 1999). Il s'agit d'un polymère cationique, non absorbable capable de chélater le phosphate. La présente invention a pour but de fournir un nouveau chélateur protéique physiologique se liant au phosphate, ne nécessitant pas l'emploi d'autres ions qui peuvent entraîner des complications et offrant de plus larges perspectives d'utilisation que les chélateurs actuels. La présente invention concerne une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 1, - ou toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 1, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ladite séquence dérivée se lie au phosphate, - ou toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1, sous réserve que ladite séquence homologue se lie au phosphate, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit fragment se lie au phosphate, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 20 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 1. La séquence SEQ ID NO : 1 correspond à la protéine humaine de fixation du phosphate. Cette nouvelle protéine a été isolée dans le plasma humain et sa structure tridimensionnelle montre qu'elle appartient à la classe des "phosphate binding protein" (protéines de fixation du phosphate : PBP). La propriété de fixation du phosphate des séquences de l'invention peut être vérifiée par le test suivant de fixation du phosphate par marquage radioactif : La protéine est fixée sur une membrane de nitrocellulose (dot blot par aspiration). On laisse incuber la membrane dans un tampon radioactif (32P (10 mCi/ml, AmershamBiosciences) 2M ; Tris 50 mM ; pH 8,0) La membrane est rapidement rincée 2 x 1 min dans un tampon Tris 50 mM, pH 8,0. En exposant un film photographique avec la membrane (environ 45 min) on peut détecter les zones qui fixent le phosphate radioactif (voir Figure 3 ci-après). La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, insérée dans ledit vecteur. La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une protéine telle que définie ci-dessus, notamment SEQ ID NO : 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également l'utilisation d'une protéine telle que définie ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à une hyperphosphatémie, telles que les maladies cardiovasculaires et l'arthrite (pseudo-goutte). Le terme "hyperphosphatémie" désigne un excès de phosphate dans l'organisme. Plus exactement, l'hyperphosphatémie est définie par une augmentation de la concentration plasmatique de phosphate au dessus de 1,44 mmol/1 (45 mg/1), ladite quantité étant obtenue par dosage du phosphate total (le dosage par méthode colorimétrique est effectué après un procédé de minéralisation). Selon un mode de réalisation avantageux, la protéine de l'invention pourra être administrée sous forme intraveineuse pour pouvoir fixer une quantité maximale de phosphate pendant une longue période. En éliminant ultérieurement la protéine, une grande quantité de phosphate sera ainsi éliminée rapidement. Ceci pourrait espacer et diminuer les temps de dialyse. La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'une protéine telle que définie ci-dessus dans le cadre de la prévention ou du traitement des maladies cardiovasculaires. La présente invention concerne également une méthode de dosage de la protéine telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - des anticorps monoclonaux de lapin dirigé contre différents épitopes de la protéine de l'invention (anti-HPB) sont fixés sur une plaque et le sérum humain à analyser contenant ladite protéine (HPB) est déposé sur la plaque susmentionnée, - la plaque est rincée et lavée, - on dépose sur la plaque des anticorps anti-anticorps de lapin (anti-IGrabbitper) marqués avec de la peroxydase durant 30 minutes, afin de former un complexe ternaire entre un anticorps monoclonal de lapin, la protéine selon l'invention et un anticorps anti-anticorps de lapin susmentionnés (anti-HPB - HPB - anti-IGrabbit-per), - la plaque est rincée et lavée, - on fait réagir la peroxydase fixée sur la plaque avec son substrat (kit disponible en commerce, Chemiluminescent Peroxidase Substrate (Sigma)) et la réaction est arrêtée au bout de 30 minutes avec la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB, Sigma), - la densité optique du produit formé à l'étape précédente est mesurée à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre, et la comparaison de cette mesure avec une courbe étalon permet de déterminer la concentration de la protéine selon l'invention (HPB) présente dans le sérum. Ainsi, la méthode de dosage susmentionné utilise une méthode par immunodosage du type ELISA (Engvall et al., 1971). D'autres méthodes peuvent être utilisées pour doser la concentration de la protéine de l'invention dans le plasma telles que : - les méthodes électrophorétiques, ou - la quantification de son activité. La présente invention concerne également l'application de la méthode de dosage telle que définie ci-dessus au diagnostic in vitro de maladies liées à une hyperphosphatémie notamment lorsque la quantité de protéine telle que définie ci-dessus, dosée selon la méthode telle que définie ci-dessus, est inférieure à la quantité de cette protéine normalement présente dans le sang d'un individu sain, ou au diagnostic in vitro de maladies liées à une hypophosphatémie notamment lorsque la quantité de protéine telle que définie ci-dessus, dosée selon la méthode telle que définie ci-dessus, est supérieure à la quantité de cette protéine normalement présente dans le sang d'un individu sain, ou au diagnostic in vitro d'une prédisposition d'un individu à de telles pathologies. Le taux de la protéine selon l'invention est un indicateur de prédisposition à un risque de maladie cardiovasculaire. Ainsi, les personnes ayant un taux faible de ladite protéine auront un taux plus important de phosphate libre qui précipitera avec le calcium du plasma pour former des plaques de phosphate de calcium, ce qui est un facteur aggravant notamment les risques de maladies cardiovasculaires ou d'arthrite. Un taux anormal de cette protéine est aussi le signe d'une pathologie existante. Par exemple une hyperphosphatémie peut déclencher une production accrue de protéine dans le but de limiter le taux de phosphate. Un taux faible peut être lui aussi révélateur d'un dysfonctionnement. La présente invention concerne également l'application telle que définie ci-dessus au diagnostic in vitro de maladies liées à une hyperphosphatémie telles que les maladies cardiovasculaires, notamment les maladies cardiovasculaires liées à la formation de plaques d'athéromes, ou au diagnostic in vitro d'une prédisposition d'un individu au développement d'une des maladies susmentionnées. La présente invention concerne également l'application telle que définie ci-dessus au diagnostic in vitro de maladies liées à une hypophosphatémie, ou au diagnostic in vitro d'une prédisposition d'un individu au développement de ces maladies. Parmi les signes cliniques ou physiologiques caractérisant les maladies liées à une hypophosphatémie, on peut citer : - une déminéralisation des os, - les manifestations musculaires de l'hypophosphatémie qui comportent une myopathie proximale affectant le muscle squelettique et une dysphagie et un iléus affectant les muscles lisses, - des carences cardiopulmonaires par le manque d'ATP, et - une encéphalopathie métabolique. LEGENDES DES FIGURES La Figure 1 représente un gel SDS-PAGE des fractions finales dans le cadre de la purification de la paraoxonase humaine et de la protéine de l'invention SEQ ID NO : 1. La colonne A correspond au marqueur de poids moléculaire et les colonnes B, C et D à trois purifications différentes issues de différentes poches de plasma humain. Elles contiennent toute les 3 la paraoxonase humaine et la protéine de fixation du phosphate. La Figure 2 représente la structure schématique de la protéine de l'invention SEQ ID NO : 1 à laquelle est fixée une molécule de phosphate. La Figure 3 correspond à un test de fixation du phosphate par la protéine de l'invention. Les colonnes A à F correspondent à différents lots de purification de la protéine de l'invention provenant de différentes poches de plasma humain ; la colonne G au lysozyme 1 mg/ml et la colonne H à la P-lacto globuline. La Figure 4 représente les coordonnées moléculaires de la protéine cristallisée de l'invention. PARTIE EXPÉRIMENTALE Isolation de la protéine La protéine est obtenue à partir du plasma humain suivant le procédé de Gan et al. (1991) : La protéine est purifiée à partir de poches de plasma congelé (-200 ml) fournies par l'Etablissement de Transfusion Sanguine de Lyon-Beynost. Le caillot de fibrine, formé par l'ajout de 1 M (1% v/v) de CaCl2 au plasma est séparé du sérum par filtration. Le sérum est alors mélangé à 400 ml de Gel d'affinité (Cibacron 3GA-Agarose, C-1535, Sigma) équilibré avec un tampon A (Tris/HCl 50 mM, CaCl2 1mM, NaCl 4M, pH 8). Dans ces conditions, principalement les HDL ("high density lipoprotein" : lipoprotéines de haute densité) sont adsorbées. Après 6 à 8 heures d'incubation, les protéines non adsorbées sur le gel sont éliminées par filtration sur fritté de porosité n 2. Ce lavage s'effectue jusqu'à ce que l'on ne détecte plus de protéine dans l'éluat (absorption UV à 280 nm). Le gel est ensuite équilibré avec un tampon B (Tris/HCl 50 mM, CaCl2 lmM, pH 8) puis placé en colonne XK 50/30 (Pharmacia). L'élution est réalisée en rajoutant lg/1 de déoxycholate de sodium et 0,1% de triton X-100 au tampon B. Les fractions montrant une activité arylestérase sont injectées sur 50 ml d'un gel échangeur d'anions (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia) disposé en colonne XK 26/70 (Pharmacia) et équilibré avec le tampon B et 0,05% de triton X-100. L'élution se fait par gradient de NaCl. Un premier palier est réalisé à 87,5 mM de NaCl afin d'éliminer l'apo A-I, une protéine liée à la paraoxonase, et la majorité des protéines contaminantes. La paraoxonase humaine (PON1) est environ éluée à la concentration de 140 mM de NaCl. Toutes les fractions conservées montrent une activité paraoxonase et arylestérase, ces activités étant vérifiées selon les tests mentionnés plus loin. Les fractions éluées ne sont pas regroupées. Les gels SDS-PAGE des fractions obtenues montrent des bandes comprises entre 38 kDa et 45 kDa (voir Figure 1). Chaque purification n'apporte pas toujours la même distribution de masse apparente. Cette légère hétérogénéité peut s'expliquer par la présence de 2 chaînes glycosylées sur la PON1. En plus de la PON1 dans ces lots une autre protéine a été isolée par cristallisation, en substituant le triton par le C12-maltoside et en utilisant le sulfate d'ammonium comme agent précipitant. Les cristaux obtenus sont ceux d'une protéine inconnue caractérisée par radiocristallographie. La cristallisation est actuellement le seul procédé existant pour purifier cette protéine. L'activité paraoxonase est mesurée dans un tampon Glycine 50 mM/NaOH, CaCl2 1 mM, en présence de 1 M NaCl, pH 10,5 et est déterminée au moyen d'un spectrophotomètre à double faisceau (Shimadzu UV 160A) thermostaté à 25 C. La vitesse d'hydrolyse est déterminée d'après la variation d'absorbance a 412nm, correspondant à la formation de p-nitrophénol libéré par l'hydrolyse de paraoxon, en fonction du temps, s = 18290 M-1cm-1(Smolen, 1991). L'activité arylestérase est mesurée dans un tampon tris 50mM/HCl, CaClz 1mM, pH 8 et est déterminée au moyen d'un spectrophotomètre à double faisceau (Shimadzu UV 160A) thermostaté à 25 C. La vitesse d'hydrolyse est déterminée d'après la variation d'absorbance a 270nm, correspondant à la formation de phénol libéré par l'hydrolyse de phényl acétate, en fonction du temps, s = 1310 M-1cm-1(Smolen, 1991). Structure La structure de la protéine cristallisée a été obtenue par cristallographie des rayons X. La structure à 1,9 de résolution a été obtenue par la méthode SIRAS (Single Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering)(Figure 2). Les données de diffraction des rayons X ont été collectées sur la ligne BM30 de l'ESRF (Grenoble). Un dérivé de sel d'atome lourd a été obtenu en trempant un cristal dans une solution contenant des sels d'uranium. Les images ont été intégrées, mises à l'échelle et combinées avec les programmes XDS2000 (Kabsch, 1993) et la suite CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4.1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50,760-763). Les programmes CNS (BRUNGER, 1998) et SnB (Weeks, 1999) ont été utilisés pour localiser les atomes d'uranium. Le programme SHARP (Copyright # 2001-2002 the Buster Development Group) a été utilisé pour obtenir les phases par la technique SIRAS. 372 acides aminés ont été construits automatiquement dans la carte de densité électronique par le programme ARP/wARP (Perrakis, 1997). Ce premier modèle a ensuite été affiné par le programme CNS. En raison de la très bonne qualité des cartes de densité électronique, la séquence primaire de la protéine a pu être assignée avec 80% de fiabilité. Une molécule de phosphate a aussi pu être localisée. La structure obtenue ne correspond pas du tout à la paraoxonase humaine. Le séquençage obtenu en identifiant les acides aminés à partir de la densité électronique indique que ni cette protéine humaine ni son gène n'ont été décrits auparavant. Il s'agit donc d'une nouvelle protéine. La structure de la protéine de l'invention montre une très forte homologie avec la protéine de fixation du phosphate ("phosphate binding") d'Escherichia coli. Cette protéine chez cette bactérie sert à transporter le phosphate à travers le périplasme. On la retrouve chez beaucoup de procaryotes mais chez aucun eucaryote. La densité électronique a aussi montré qu'une molécule de phosphate était fixée à la nouvelle protéine de l'invention, de la même façon que dans celle d'Escherichia coli. Ainsi, on peut conclure que la protéine de l'invention caractérisée à partir du plasma humain présente une très forte homologie avec la protéine bactérienne et qu'elle est capable de fixer le phosphate et de le transporter. Fixation du phosphate La fixation du phosphate par la protéine de l'invention a été mise en évidence selon le test suivant : On dépose 200 l de la protéine de l'invention (colonnes A-F de la Figure 3), ou du lysozyme 1 mg/ml (colonne G) ou de la sslacto-globuline sur nitrocellulose (dot blot par aspiration). L'ensemble est incubé pendant 2 h 30 dans un mélange comprenant : tris 50 mM ; pH 8,0 ; 32P (10 mCi/ml) 2 mM. On effectue ensuite un rinçage 2 fois pendant 1 minute avec du tris 50 mM à pH 8,0, puis on expose l'ensemble à température ambiante pendant 45 minutes. On constate alors (voir Figure 3) que la protéine de l'invention a fixé le phosphate radioactif (colonnes A à F), alors que les témoins tests ne l'ont pas fixée (colonnes G et H). Rôle et utilisation de cette protéine Pour doser la concentration de cette protéine dans le plasma les méthodes utilisables sont : - les methodes électrophorétiques, - la purification de la protéine, - la quantification de son activité, - l'immunodosage de la protéine en utilisant des anticorps polyclonaux/monoclonaux dirigé contre la protéine. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Amann K., Tomig J., Kugel B., Gross M. L., Tyralla K., El-Shakmak A., Szabo A., Ritz E. (2003) Kidney Int. 63 (4): - Blazheevich N. V., Spirichev V. B., Pozdniakov A. L. (1975) Kardiologiia. 15 (6): 67-71 ; - Brunger A.T., Adams P. D., Clore G. M., Delano W. L., Gros P., GrosseKunstleve R. W., Jiang J.-S., Kuszewski J., Nilges N., Pannu N. S., Read R.J., Rice L.M., Simonson T. et Warren G. L. (1998) Acta Cryst. D54 : 905-921 ; - Dorozhkin S.V., Epple M. (2002) Angew Chem Int Ed Engl. 41 (17): 3130-46 ; - Engvall E., Jonsson K., Perlmann P. (1971) Biochim Biophys Acta. 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Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : - la séquence SEQ ID NO : 1, - ou toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 1, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ladite séquence dérivée se lie au phosphate, - ou toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1, sous réserve que ladite séquence homologue se lie au phosphate, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit fragment se lie au phosphate, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 20 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 1. 2. Séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie dans la revendication 1. 3. Vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 2. 4. Vecteur recombinant selon la revendication 3, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par une séquence nucléotidique selon la revendication 2, insérés dans ledit vecteur. 5. Cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de champignons, les cellules de plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée à l'aide d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 3 ou 4. 6. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une protéine selon la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 7. , Composition pharmaceutique selon la revendication 6, comprenant à titre de substance active une protéine représentée par la séquence SEQ ID NO : 1. 8. Utilisation d'une protéine selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à une hyperphosphatémie, telles que les maladies cardiovasculaires. 9. Utilisation d'une protéine selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des maladies cardiovasculaires et de l'arthrite. 10. Méthode de dosage de la protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - des anticorps monoclonaux de lapin dirigé contre différents épitopes de la protéine selon la revendication 1 sont fixés sur une plaque et le sérum humain à analyser contenant ladite protéine est déposé sur la plaque susmentionnée, - la plaque est rincée et lavée, - on dépose sur ladite plaque des anticorps anti-anticorps de lapin marqués avec de la peroxydase durant 30 minutes, afin de former un complexe ternaire entre un anticorps monoclonal de lapin, ladite protéine et un anticorps anti-anticorps de lapin susmentionnés, - la plaque est rincée et lavée, - on fait réagir la peroxydase fixée sur la plaque avec son substrat et la réaction est arrêtée au bout de 30 minutes avec la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, - la densité optique du produit formé à l'étape précédente est mesurée à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre, et la comparaison de cette mesure avec une courbe étalon permet de déterminer la concentration de la protéine selon la revendication 1 présente dans le sérum. 11. Application de la méthode de dosage selon la revendication 10 au diagnostic in vitro de maladies liées à une hyperphosphatémie notamment lorsque la quantité de protéine selon la revendication 1, dosée selon la méthode de la revendication 10, est inférieure à la quantité de cette protéine normalement présente dans le sang d'un individu sain, ou au, diagnostic in vitro de maladies liées à une hypophosphatémie notamment lorsque la quantité de protéine selon la revendication 1, dosée selon la méthode de la revendication 10, est supérieure à la quantité de cette protéine normalement présente dans le sang d'un individu sain, ou au diagnostic in vitro d'une prédisposition d'un individu à de telles pathologies. 12. Application selon la revendication 11 au diagnostic in vitro de maladies liées à une hyperphosphatémie telles que les maladies cardiovasculaires, notamment les maladies cardiovasculaires liées à la formation de plaques d'athéromes, ou au diagnostic in vitro d'une prédisposition d'un individu au développement d'une des maladies susmentionnées.