Brevet FR2861546A1 — publié le 20050506

DESCRIPTION Procédé de production et de conservation des produits dits milieux physiologiques et produits obtenus selon ce procédé La présente invention concerne un procédé de production et de conservation des milieux physiologiques utilisés non seulement pour prolonger la survie des organes, des tissus et des cellules au cours des expérimentations biologiques, mais aussi pour conserver et transporter vivants les organes de transplantation. Ces milieux physiologiques peuvent également être des solutions de réhydrations ou des milieux utilisés pour la culture des tissus et des cellules. On appelle milieu physiologique, des solutions qui ont une composition proche du sang plus particulièrement du plasma. Ces milieux physiologiques sont utilisés pour rôle, de maintenir en vie des cellules biologiques, des tissus ou des organes. Selon leur utilisation, les milieux physiologiques peuvent être simples (par exemple le Ringer, la Tyrode) ou plus complexes (milieu de culture cellulaire, milieu de transport des organes de transplantations etc.). Ces solutions contiennent des ions de faible poids moléculaire comme le sodium, chlorure, potassium, bicarbonate etc., Ils peuvent également contenir des protéines plasmatiques, des immunoglobulines, des antibiotiques, des vitamines etc. Toutes ces particules dissoutes modifient l'osmolarité du milieu physiologique. Une solution de réhydratation est une solution physiologique que l'on utilise pour compenser la perte de l'eau chez les hommes et les animaux notamment au cours de la déshydratation due à la diarrhée ou à la chaleur. Il existe des solutions de réhydratations par voie orale (O.R.S) et des solutions de réhydratation par perfusion intraveineuse. En générale, les solutions de réhydratation contiennent tous du sodium, du potassium, du chlorure. Selon leur utilisation, ces solutions peuvent contenir du glucose, lactate et d'autres produits. En médecine, l'osmolarité est la concentration des particules actives qui provoquent une pression à travers la membrane biologique. Cette pression encore appelée pression osmotique est une sorte de phénomène de succion à travers la membrane biologique. L'osmole (osm) est dérivé de la mole du corps pur. Si l'on dissout par exemple une mole de glucose dans un litre d'eau, la concentration s'élève à 1 mole par litre. Une mole est la quantité de matière en gramme qui indique le poids atomique, ionique ou molaire de cette matière. On appèle concentration, la masse d'une substance par unité de volume. La concentration peut aussi se définir comme la quantité de matière par unité de volume ou encore le volume du gaz ou d'un liquide par rapport au volume total. Pour maintenir une cellule, un tissu ou un organe en vie, il faut lui apporter non seulement les substances nutritives nécessaires, mais également de l'oxygène pour respirer. Le bullage du milieu physiologie consiste à apporter à ce milieu de l'oxygène pour permettre au tissu de respirer. On peut ainsi apporter au tissu non seulement de l'oxygène, mais aussi du dioxyde de carbone (CO4. Le rôle du CO2 peut être nutritif dans le cas de la culture cellulaire, mais aussi il peut permettre de modifier la concentration des ions H+ (protons). La concentration en protons s'exprime par une unité spécifique qui est le pH. Le pH est l'exposant négatif (logarithme) de la concentration d'ion H+ en mole par litre. La conservation des milieux physiologiques est très importante en biologie, biochimie et en médecine. Elle permet, entre autres, à leurs utilisateurs non seulement de gagner du temps pendant les différentes expérimentations, mais aussi d'être certains d'utiliser le même lot de milieu physiologique. Le changement de lot des différents produits utilisés dans les expérimentations biologiques peut être pour les professionnels et les hommes du métier une source de variation des résultats. Il existe une grande variété de milieux physiologiques qui peuvent être les uns très différents des autres dans leur composition. Il existe des milieux physiologiques simples et des solutions très complexes. Les milieux physiologiques contiennent presque tous des sels. En plus des sels ils peuvent contenir des matières organiques comme le sérum, des nutriments comme le glucose, des acides nucléiques, des enzymes, des protéines etc.. Il existe plusieurs façons de conserver les milieux physiologiques. Certains procédés consistent à congeler les milieux physiologiques pour les garder le plus longtemps. On peut également les sécher ou bien les congeler tout en les séchant. Ce dernier procédé est appelé lyophilisation. La congélation comme le séchage de la matière biologique peuvent entraîner des effets secondaires non désirés par l'expérimentateur. Pour limiter ces effets secondaires de la congélation ou de lyophilisation, les agents protecteurs sont souvent utilisés dans les solutions. Parmi ces agents, on trouve couramment, les cryoprotecteurs et les lyoprotecteurs. D'autres procédés de conservation des solutions consistent à préparer plusieurs solutions individuellement pour mieux les conserver. Le mélange de ces différentes solutions pour obtenir la solution finale, est fait au moment de l'utilisation. Un autre procédé de conservation des milieux physiologiques contenant des sels consiste à conserver les différents composants sous forme de poudre jusqu'au moment de l'utilisation. Les différents constituants du milieu physiologique sont alors mélangés à l'eau pour obtenir la solution finale. Aux milieux physiologiques fragiles contenant le plus souvent des composés organiques comme le sérum, les nucléotides, l'albumine, les protéines etc., on peut également ajouter les protecteurs des solutions pour mieux les conserver. Un de ces procédés utilisant des protecteurs pour des solutions sous forme de mélange a été décrit dans le brevet WO0209515 déposé le 7 février 2002 par WISCONSIN ALUMNI RES FOUND (US). Ce mélange décrit par MILLER DANFORTH P et coll., est formé de composés polyhydroxyls tels que des polysaccharides, disaccharides, et monosaccharides. A ces polyhydroxyls, on ajoute des, ions phosphates. Ces polyhydroxyls sont ajoutés selon des pourcentages se situant entre 5 à 95 % de la solution. D'autres procédés de conservation des milieux physiologiques peuvent se présenter sous forme de milieu semi-solide. Un exemple a été décrit, dans le brevet US5736397 de CHACON Enrique et GARCIA David du 7 avril 1998, pour le transport des cellules. Ces milieux semi-solides contiennent plus ou moins de gel pour les solidifier. Il existe également les milieux de culture biologiques solides. Un tel milieu a été décrit dans le brevet WO02061051 du 8 août 2002 par YANO YOICHIRO et coll. Ces milieux sont essentiellement destinés à la culture des micro-organismes. La préparation de ces milieux consiste généralement au mélange des différents composants du milieu avec de l'eau, puis on retire ensuite une grande partie ou la totalité de l'eau après l'obtention du dit milieu. Mais ces milieux conservent toujours une petite quantité d'eau. On les appèles les milieux semi-solides. L'objet de la présente invention est de mettre à disposition un procédé simple de fabrication et de conservation des milieux physiologiques. Ce procédé est simple, rapide fiable et peu coûteux. L'invention concerne un procédé de production et de conservation des produits dits milieux physiologiques qui consiste à compresser à haute pression le mélange des formes sèches le plus souvent sous forme de poudre des différents composants du milieu physiologique à produire et à conserver en présence d'un liant et/ou d'un lubrifiant. Une fois compressé, ce mélange se transforme alors en un produit compact solide que l'on peut aisément mettre sous emballage par exemple sous blister. Le produit ainsi obtenu peut se conserver plus longtemps. Le procédé peut se réaliser dans un environnement stérile. Selon la présente invention, pour obtenir le milieu physiologique liquide prêt à l'emploi, le produit compact et solide obtenu (soluté) est introduit dans un volume d'eau adéquat. Le mélange (eau + soluté) est ensuite laissé au repos pour permettre la dissolution totale du soluté dans l'eau, de préférence de l'eau purifiée, distillée, bi-distillée ou permutée. Selon la présente invention, on peut éliminer par filtration, les particules non solubles du lubrifiant et/ ou du liant, s'il en existe. Les exemples des excipients utilisés sont connus des hommes du métier, qui les utilisent comme liants ou lubrifiants pour fabriquer les poudres, les granulés ou autres préparations. Les exemples des excipients qui sont utilisés selon l'invention sont: le lactose, l'amidon, la dextrine, le phosphate de calcium, le carbonate de calcium, le silicate d'aluminium naturel ou synthétique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde d'aluminium hydraté, le stéarate de magnésium, le bicarbonate de sodium. D'autres excipients non cités ci-dessus mais qui conviennent également sont décrits dans le Remington's pharmaceutical sciences par E.W. Martin, et peuvent être utilisés selon l'invention. A titre d'exemples non limitatifs mais portant sur un model de réalisation de l'invention pour le milieu très simple et très exploité comme le Ringer. Exemple de composition de Ringer simples. 1)-Composition de 200 g de RINGER standard. - NaCl 138,460 g - NaHCO 3 43,2681 g - MgC12, 6H2O 4,9796 g - CaC12, 2H2O 3,6296 g - K2HPO4 8,5711 g - KH2PO4 1,1145 g - Stéarate de magnésium 2 g 2)- Composition de 500 g de RINGER sans Sodium - . C5Hi4NOCl 10,8341 g KHCO3 1,6865 g - MgC12, 6H2O 3,2515 g - CaC12, 2H2O - K2HPO4 - KH2PO4 Mannitol - Stéarate de magnésium 2,3745 g 5,6126 g 0,7285 g 475,5120 g 5g 3)- Composition de 500 g de RINGER sans bicarbonate - NaCl - MgCl2, 6H2O CaC12, 2H2O - K2HPO4 - KH2PO4 - Mannitol - Stéarate de magnésium 139,7724 g 4,1169 g 3,0066 g 7,1065 g 0,9224 g 345,0750 g 5g 3)- Composition de 600 g de RINGER sans Chlorure - C2H5O4SNa - Na2SO4 - MgSO4, 7H2O - CaSO4, 2H2O - NaHCO3 - K2HPO4 - KH2PO4 - Mannitol - Stéarate de magnésium 173,6414 g 101,3809 g 3,0160 g 2,1065 g 21,4120 g 4,24162 g 0,5506 g 293, 6508 g 6g Selon l'invention, tous les milieux physiologiques peuvent être produits selon le procédé et, du fait de la présentation sous forme sèche, leur durée de vie globale (stockage et emploi) est considérablement plus longue que celle des produits existants avec ce que cela entend de gain en coût. Les résultats expérimentaux obtenus avec Ringer obtenu selon l'invention sont donnés ci-après. Le liquide de Ringer obtenu par la méthode classique est désigné par R-STD. C'est le milieu standard. Le liquide de Ringer obtenu selon l'invention est désigné par R-S. Toutes les comparaisons des résultats sont faits avec le test T de students après analyse de la variance (protocole GLM, SAS institute). Le test T de students permet de comparer deux moyennes. A- Paramètres physico-chimiques La figure l montre qu'au cours du test de dissolution, le pH de la solution se stabilise après 40 minutes. La figure 2 montre qu'au cours du test de dissolution, l'osmolarité (Osm) de la solution se stabilise également après 40 minutes. La figure 3 et la figure 4 montrent que lorsqu'on ajoute un mélange d'air formé du carbogène (un mélange O2/CO2 à la proportion de 95/5 %) par le bullage du milieu physiologique, le pH du milieu est réduit significativement (p La figure 5 montrent que la solution physiologique R-S obtenue selon le procédé de l'invention a une meilleure osmolarité (p B- Effet de la solution physiologique sur la viabilité du tissu in vitro en présence des agents pharmacodynamiques. L'effet du milieu physiologique selon l'invention (RS) sur la viabilité du tissu en présence des agents pharmacodynamiques ont été réalisées au niveau du jéjunum de rat par la mesure de la sécrétion électrogénique d'eau et des électrolytes. La variation du courant de court-circuit (Icc) et de la résistance électrique (R) tissulaire ont été mesurée. Les résultats sont ensuite comparés à ceux obtenus avec la solution du milieu physiologique classique R-STD. Les résultats obtenus sont les suivants: La figure 6 montre qu'il n'existe pas de différence de réponse du tissu à l'effet sécrétoire de la carbacholine lorsqu'on mesure le courant de court-circuit (Icc) après 3 heures et 4 heures d'expérimentation avec le milieu obtenu selon le procédé de l'invention (R-S) et classique (R-STD). Par contre selon le résultats de la figure 7, après 4h d'expérimentation, la résistance du tissu devient légèrement meilleure lorsqu'on utilise le milieu obtenu selon le procédé de l'invention R-S (p D'autre part, la figure 8 et la figure 9 montrent qu'il n'existe pas de différence entre les deux milieux physiologiques R-S et R-STD après 3 et 4 heures d'expérimentation sur les valeurs du courant de cours circuit et sur la résistance lorsqu'on stimule le tissu avec la forskoline. On note également une légère augmentation de la résistance électrique après 4 heures d'expérimentation sur les tissus conservés dans les milieux R-S. Par contre la figure 10 et la figure 11 montrent qu'il n'existe pas de différence entre les deux milieux physiologiques R-S et R-STD après 3 et 4 heures d'expérimentation sur les valeurs du courant de court-circuit (Icc) et sur la résistance électrique (R) du tissu après ajout de la bumétanide. REVENDICATIONS 1. Procédé de production et de conservation des produits dits milieux physiologiques caractérisés en ce que le mélange de la poudre de chacune des constituants du produit dit milieu physiologique à fabriquer et à conserver est compressé à haute pression en présence d'un liant et/ ou d'un lubrifiant pour obtenir un seul produit compact que l'on peut aisément mettre sous emballage. 2. Procédé de production et de conservation des produits dits milieux lo physiologiques et produits obtenus selon ce procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour obtenir le milieu physiologique liquide prêt à l'emploi, le produit compact solide obtenu selon la revendication 1, est dissout dans une quantité donnée d'eau. 3. Utilisation du procédé de production et de conservation des produits dits milieux physiologiques et produits obtenus selon ce procédé selon la revendication 1 et 2, pour l'application aux solutions dites de réhydratations par voie orale.