Brevet FR2872431A1 — publié le 20060106

La présente invention est relative à l'utilisation de fibroblastes gingivaux en thérapie cellulaire vasculaire, notamment pour le traitement de pathologies artérielles. La paroi artérielle est constituée de trois couches superposées, dénommées tuniques. La tunique interne (intima) est constituée d'une couche de cellules endothéliales. La tunique intermédiaire (média) est principalement constituée de fibres musculaires lisses et de tissu conjonctif riche en fibres élastiques. La tunique externe (adventice) est une enveloppe conjonctive qui entoure l'ensemble. Les artères sont soumises à de nombreuses agressions d'origine diverse (hypoxie, surcharge lipidique, forces hémodynamiques, athérome, hypertension, etc.), pouvant induire des lésions de la paroi artérielle. Lors de la réparation de ces lésions, peut intervenir une réaction de cicatrisation anormale, résultant d'un déséquilibre entre la dégradation et la synthèse de la matrice extracellulaire, et induisant un remodelage artériel pathologique, qui peut se traduire par un élargissement vasculaire (anévrisme), ou au contraire par une constriction (sténose, survenant secondairement au cours de l'athérogénèse, ou resténose, consécutive notamment à une angioplastie évoluant au décours du remodelage cicatriciel vers la réapparition d'une sténose). Par exemple, dans les lésions anévrismales, on observe, au niveau de la media, une dégradation enzymatique des composants de la matrice extracellulaire, notamment des fibres élastiques, et une diminution du nombre de cellules musculaires lisses (CML) ; au niveau de l'adventice on observe une fibrose accompagnée d'une importante infiltration inflammatoire. La dégradation des composants de la matrice extracellulaire implique diverses protéases matricielles. Parmi celles-ci on citera notamment une élastase, la 2872431 2 métalloprotéinase-9 matricielle (MMP9) synthétisée par les leucocytes infiltrés et les cellules hôtes physiologiques (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et fibroblastes adventiciels) et qui est en grande partie responsable de la fragmentation des fibres élastiques (THOMPSON, J. Clin. Invest. 96: 318-326, 1995). Parallèlement, la raréfaction des CMLs dans la media entraîne une diminution de la synthèse des composants de la matrice extracellulaire, et de celle des inhibiteurs des protéases matricielles, qui sont principalement synthétisés par ces CMLs (LOPEZ-CANDALES et al., Am. J. Pathol. 150: 993-1007, 1997). Dans le cas de la sténose, et de la resténose intervient un remodelage fibreux rétractile qui peut également être considéré comme un processus de cicatrisation anormal. Ce remodelage se caractérise par une hyperplasie fibreuse intimale (LAFONT et al., Circ. Res. 76(6) : 996-1002, 1995), et apparaît relié à une augmentation du collagène au niveau de la néointima, de la média et de l'adventice (LAFONT et al., Circulation 100(10) : 1109-1115, 1999; DURAND et al., Arch. Mal. Coeur Vaiss. 94(6) : 605-611, 2001). A l'heure actuelle, le traitement des pathologies artérielles repose principalement sur la chirurgie et la cardiologie interventionnelle (chirurgie vasculaire, pontages aorto-coronaires et périphériques, prothèse aortiques en dacron, angioplastie artérielle coronaire et périphérique, endoprothèses aortiques, etc...). Cependant, ces techniques invasives ne traitent pas la cause mais les conséquences de la pathologie. Elles permettent une amélioration de la situation du patient sans pouvoir enrayer le développement de la maladie. Il apparaît donc nécessaire de disposer de nouveaux moyens de traitement moins invasifs, et permettant de traiter efficacement le remodelage artériel pathologique. 2872431 3 ALLAIRE et al. (J. Clin. Invest. 102(7) . 1413-1420, 1998) ont observé, dans un modèle d'anévrisme expérimental chez le rat, que l'implantation locale de CMLs dans la paroi artérielle induisait une inhibition de la dégradation des fibres élastiques et de la formation d'un anévrisme. Il a également été montré chez le rat que des anévrismes expérimentaux déjà formés peuvent être stabilisés par injection locale de CML. Cette stabilisation est associée à une sécrétion de TGF(3 d'origine paracrine au niveau de la transplantation cellulaire (LOSY et al., J. Vasc. Surg. 37(6) : 1301-1309, 2003). Cependant, un obstacle majeur à l'utilisation de CMLs pour le traitement des anévrismes par thérapie cellulaire provient de la nécessité d'obtenir ces CMLs à partir de cellules souches. Les cellules souches utilisées proviennent de la moelle ou du sang et sont très difficiles à obtenir. Les Inventeurs ont entrepris de rechercher si d'autres types de cellules que les CMLs de la paroi artérielle pouvaient éventuellement être utilisées en thérapie cellulaire, et ont eu l'idée de tester les fibroblastes gingivaux. Les fibroblastes gingivaux sont des cellules mésenchymateuses capables de migrer, d'adhérer, et de proliférer au sein des tissus conjonctifs mous de la gencive, maintenant ainsi l'intégrité du tissu gingival soumis à de nombreuses agressions telles que les forces mécaniques, les infections bactériennes, les variations de pH, de température, etc... (GOGLY et al., Clin. Oral Invest. 1: 147-152, 1997; GOGLY et al., Biochem. Pharmacol. 56(11) . 1447-1454, 1998; EJEIL et al., J. Periodontol. 74(2) : 188-195, 2003). Selon les conditions environnementales auxquelles ils sont soumis, les fibroblastes gingivaux sont capables de changer de phénotype, et de répondre aux stimuli provenant de l'environnement tissulaire gingival 2872431 4 par prolifération, migration, synthèse ou dégradation des composants de la matrice extracellulaire. Ils sont ainsi capables de synthétiser divers composants de la matrice extracellulaire: des collagènes (types I, III, V, VI, VII, XII), des fibres élastiques, des protéoglycanes et glycosaminoglycanes, des glycoprotéines. Ils peuvent produire aussi une variété d'enzymes, (notamment métalloprotéases) , capables de dégrader ces composants macromoléculaires. Enfin ils peuvent exprimer également des inhibiteurs tissulaires des métalloprotéases, qui inhibent les formes actives des MMPs. Les Inventeurs ont effectué des co-cultures de fibroblastes gingivaux et de CMLs, et ont observé que les interactions entre ces cellules conduisaient à l'inhibition par les fibroblastes gingivaux de la sécrétion de MMP9 par les CML, ainsi qu'à la potentialisation de la sécrétion de TGF0 par les deux types cellulaires. Il apparaît donc que les fibroblastes gingivaux ont d'une part un effet inhibiteur sur l'un des facteurs principaux de la formation des anévrismes, à savoir la MMP9 responsable de la dégradation du réseau élastique, et d'autre part un effet activateur sur un facteur favorable à la stabilisation des anévrismes, à savoir la sécrétion de TGF(3. Les Inventeurs ont en outre effectué, chez le lapin, des essais in vivo de transplantation de fibroblastes gingivaux obtenus à partir d'un prélèvement de tissu gingival d'un lapin, dans la paroi artérielle dudit lapin, et ont constaté que ces fibroblastes gingivaux autologues étaient capables de s'insérer dans la paroi, au niveau de la media. La présente invention a donc pour objet l'utilisation de fibroblastes gingivaux pour l'obtention d'une composition cellulaire destinée au traitement d'une pathologie du remodelage d'un tissu conjonctif non 2872431 5 minéralisé autre que le tissu gingival, en particulier d'une pathologie du remodelage artériel. Les fibroblastes gingivaux peuvent être utilisés, conformément à l'invention, dans toutes les pathologies vasculaires, notamment artérielles, avec altérations profondes de la matrice extracellulaire. On citera en particulier: l'athérosclérose, la plaque vulnérable, la resténose, les anévrismes artériels, la dissection aortique. En dehors du domaine vasculaire, les fibroblastes gingivaux pourraient aussi moduler le remodelage tissulaire dans les pathologies impliquant des altérations de la matrice extracellulaire: cicatrisation cutanée, réparation tissulaire (brûlés, cancer, perte de substances). Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ladite pathologie est un anévrisme. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ladite pathologie est une sténose ou une resténose après angioplastie. Lesdits fibroblastes sont de préférence des fibroblastes autologues, c'est à dire des fibroblastes issus de tissu gingival préalablement prélevé chez le sujet auquel est destiné le traitement, et mis en culture. De préférence ces fibroblastes sont cultivés pendant au 25 moins 14 jours, et avantageusement pendant 14 à 70 jours. Des cultures de fibroblastes gingivaux utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention peuvent être obtenues par techniques classiques, qui sont connues en elles-mêmes de l'homme du métier (BARLOVATZ-30 MEIMON et al., culture de cellules animales p.898, ill. Paris: INSERM, 2003). L'implantation des fibroblastes dans la paroi artérielle peut s'effectuer de diverses façons; soit localement par injection à l'aide de cathéters à ballonnets munis de micro-aiguilles (INFILTRATOR) injection par voie externe ou interne dans l'adventice ou le tissu périadventitiel, soit par voie générale (veineuse 20 2872431 6 périphérique ou artérielle en amont du site d'injection avec adressage réalisé par un guidage magnétique (incorporation intracellulaire préalable de nanoparticules superparamagnétiques) ou biologique (WILHEM et al., Eur. Biophys. J. 31(2) : 118-125, 2002; PANYAM et al., J. Drug Target 10(6): 515-523, 2002). On peut également associer aux fibroblates gingivaux des produits intervenant dans le remodelage matriciel, par exemple la décorine (protéoglycanne intervenant dans le remodelage matriciel) (AL HAJ ZEN et al, Matrix Biol. 22(3) : 251-258, 2003) ou l'acide hyaluronique. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant des effets des fibroblastes gingivaux utilisables en thérapie cellulaire vasculaire. EXEMPLE 1: SECRETION DE MMP2, MMP9 ET TGF(3 DANS DES COCULTURES DE FIBROBLASTES GINGIVAUX ET DE CELLULES 20 MUSCULAIRES LISSES Marquage des fibroblastes Les fibroblastes gingivaux sont marqués par des nanoparticules anioniques de maghémite comme décrit par WILHEM et al. (Biomaterials 24: 1001-1011, 2003). Les fibroblastes gingivaux (six cultures différentes) sont cultivés jusqu'à confluence dans du sérum de veau foetal (SVF) 10% ; et après 48 h, le surnageant de culture est prélevé, et les cellules sont cultivées dans du milieu sans sérum. La qualité de marquage des fibroblastes gingivaux par ces nanoparticules est contrôlé par coloration de Perl (bleu de prusse). Les nanoparticules sont absorbées et internalisées dans l'endosome des fibroblastes gingivaux, comme le montre la Figure 1. Pour vérifier que le marquage ne modifiait pas le phénotype des fibroblastes gingivaux, l'effet de 30 35 2872431 7 l'incorporation des nanoparticules sur la sécrétion de la métalloprotéinase-2 matricielle (MMP2) et des cytokines IL-10 et TGF(3 a été évalué à J1, J3 et J5 (jours de culture). A J1, on observe chez les fibroblastes marqués une augmentation de la production de MMP2 et d'IL-1(3 qui reviennent au niveau normal à J3 et J5. Cette augmentation transitoire est probablement due au stress consécutif à l'incorporation de nanoparticules. En revanche, aucune modification de la production de TGF(3 n'est observée pendant la période étudiée. Cocultures de fibroblastes gingivaux et de cellules musculaires lisses Des co-cultures de fibroblastes gingivaux (FG) marqués et de cellules musculaires lisses (CML) sont réalisées en gels de collagène selon la méthode décrite par GILLERY et al. (Experientia 45(1) : 98-101, 1989). Brièvement, les cellules sont obtenues à partir de prélèvements gingivaux pour les fibroblastes gingivaux, et à partir de la média artérielle pour les cellules musculaires lisses. Les prélèvements (gencive et média artérielle) sont mis en primoculture dans des boites de pétri dans du milieu DMEM/SVF20%. A confluence, les cellules sont trypsinisées et remises en culture dans un milieu DMEM/SVF10%. Après plusieurs passages dans ce milieu, les cellules sont mises en culture dans du collagène de type 1 (60 000 cellules dans 2 ml de collagène) pendant 3, 7, 14 ou 21 jours. Les milieux de culture (DMEM/SVF10%) dans lesquels les gels baignent sont changés toutes les semaines. A titre de contrôle, des cultures de fibroblastes gingivaux et des cultures de cellules musculaires lisses sont effectuées séparément, dans les mêmes conditions. 8 Sécrétion de MMP9 par les CML La sécrétion de MMP9 est localisée par immunodétection à J3, et observée par microscopie optique (x160). La MMP9 n'est pas détectée a niveau des fibroblastes: elle est détectée uniquement aux endroits correspondant à la localisation des CML dans le gel. Ces résultats corroborent de précédents travaux selon lesquels les fibroblastes n'expriment pas MMP9 (GOGLY et al., 1998, précité). Effets des interactions FG/CML sur la sécrétion de MMP9 Les interactions cellulaires sont étudiées à J3 et J21 par l'expression des gélatinases MMP2 et MMP9, sécrétées dans le milieu de culture. Les résultats sont présentés dans la Figure 2. A: sécrétion de MMP2 par 60 000 fibroblastes contrôle; B: sécrétion de MMP2 par 60 000 fibroblastes marqués cultivés en gel de collagène C: sécrétion de MMP2 et MMP9 par 60 000 CML cultivés en gel de collagène D: sécrétion de MMP2 et MMP9 par 60 000 fibroblastes marqués cultivés + 60 000 CML cultivés séparément en gel de collagène en gel de collagène (On ajoute les milieux des 2 cultures séparées, pour déterminer la sécrétion totale en l'absence d'interactions entre les deux types cellulaires). E: sécrétion de MMP2 et MMP9 par 60 000 fibroblastes marqués et 60 000 CML cocultivés en gel de collagène. Les résultats montrent que les fibroblastes en culture n'expriment pas MMP9 (A et B) contrairement aux CMLs (C et D). En revanche, les fibroblastes inhibent la sécrétion de MMP9 par les CML en co-culture (E). Les mêmes résultats sont observés à J3 et J21. En ce qui concerne la MMP2, on observe une diminution de la sécrétion dans les cocultures (E) par rapport à ce qui pourrait être attendu théoriquement (D). Cette diminution est toutefois moins significative que celle de la MMP9. Effets des co-cultures sur la sécrétion de TGF(3 Les interactions cellulaires sont étudiées au travers de l'expression de la cytokine TGF(3 à J3, J7, J14, J21/J28 (jours de culture), par test ELISA et dot blot. Résultats de tests ELISA Les résultats de tests ELISA à J3, J7, J14, J21 sont représentés dans la Figure 3. Légende de la Figure 3: Abscisse FG = culture de 105 FG non-marqués FG* =culture de 105 FG marqués CML =culture de 105 CML CML/FG* = co-culture de 105 FG marqués et 105 CML Ordonnée = sécrétion de TGF(3 (pg/ml/105 cellules) ** = Student Fischer T test p Légende de la Figure 4: FG = culture de 105 FG non-marqués FG* =culture de 105 FG marqués CML =culture de 105 CML CML/FG* = co-culture de 105 FG marqués et 105 CML Les résultats montrent la potentialisation de la sécrétion de TGF(3 par les cellules FG et CML en coculture. EXEMPLE 2: TRANSPLANTATION DE FIBROBLASTES GINGIVAUX AUTOLOGUES IN VIVO DANS DES ARTERES DE LAPIN Les fibroblastes gingivaux sont marqués en culture monocouche par les nanoparticules ferro-magnétiques, comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus puis trypsinisés. Ils sont injectés à différentes quantités (de 105 à 5x106 cellules) dans les artères iliaques de lapin à l'aide d'un cathéter INFILTRATOR (Boston Scientific) 2872431 10 (TEIGER et al., Eur. Heart J. 18: abstract suppl. 500, 1997). Les lapins sont sacrifiés 24h après l'injection et les lieux d'injections sont visualisés. A fort grandissement (X 100) la coloration de Perl permet de voir les nanoparticules sur les coupes histologiques de 61_lm. Les résultats sont présentés sur la figure 5. Les fibroblastes injectés sont localisés dans la media, et présentent une morphologie normale. 2872431 11 REVENDICATIONS 1) Utilisation de fibroblastes gingivaux pour l'obtention d'une composition cellulaire destinée au traitement d'une pathologie du remodelage d'un tissu conjonctif non minéralisé autre que le tissu gingival. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition cellulaire est destinée au traitement d'une pathologie du remodelage artériel. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite pathologie est un anévrisme. 4) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite pathologie est une sténose ou resténose après angioplastie. 5) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite pathologie est une dissection aortique. 6) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite pathologie est une 20 athérosclérose. 7) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits fibroblastes sont issus de tissu gingival préalablement prélevé chez le sujet auquel est destiné le traitement.