Brevet FR2864960A1 — publié le 20050715

Molécules d'acide ribonucléique interférent à fonction antiproliférative et/ou pro-apoptotique. L'invention concerne le domaine de la génétique. Notamment, l'invention concerne le domaine de la thérapie génique. Plus précisément, l'invention se rapporte à de nouvelles molécules antiprolifératives et/ou pro-apoptotiques constituées par des molécules d'acide ribonucléique interférent (ARNi). Les molécules d'ARN interférent se présentent sous la forme de petites molécules d'ARN double-brin et permettent d'interférer avec l'ARN messager pour inhiber l'expression d'une protéine particulière. Cette approche par interférence avec l'ARN est une alternative à l'utilisation d'inhibiteurs chimiques classiquement utilisés pour inhiber certains sites d'activité des protéines. D'une manière générale, les ARNi permettent de cibler spécifiquement un ARN messager et par conséquence l'expression d'une protéine particulière alors que les inhibiteurs chimiques ne permettent pas d'accéder à une telle spécificité. L'utilisation d'ARNi a notamment été mis en oeuvre pour inhiber l'expression de gènes cibles dans une variété d'organismes et de cellules types provenant notamment de vers, de mouches et de plantes (notamment les pétunias). Selon cette technique, l'ARN interférent est introduit dans les cellules où il se conjugue avec des complexes contenant une endoribonucléase pour donner des complexes inhibiteurs appelés RISCs (pour RNA-induced silencing complexes). Les brins d'ARN interférents sont ensuite déroulés pour donner des complexes RISCs activés ne présentant plus qu'un seul brin. Ces complexes sont alors acheminés vers les molécules d'ARN messager complémentaires, coupent celles-ci et bloquent donc la traduction de l'ARN messager en protéine. La présente invention propose de nouvelles molécules d'ARN interférent permettant d'appliquer cette technique d'ARN interférence à l'inhibition de l'expression du gène de la protéine ERK2 appartenant à la cascade des MAP kinases MEK-ERK. Cette voie est en effet une voie majeure de régulation de la progression dans le cycle cellulaire de nombreuses cellules d'origines très différentes. On notera que les inventeurs ont participé à la démonstration de: i) l'implication majeure de la voie des MAP Kinases MEKIERK, dans la transduction du signal mitogène via l'induction de la cycline Dl (Talarmin et al. The mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase cascade activation is a key signalling pathway involved in the regulation of G(1) phase progression in proliferating hapatocytes, Mol Cell Biol, 1999 sep; 19(9) : 6003-11) ; ii) la dépendance de ce signal mitogène vis à vis de l'effet morphogène induit par le facteur de croissance en début de G1 via l'intégrine (31 (Rescan et al. Mechanism in the sequential control of cell morphology and S phase entry by EGF involved distinct MEKIERK activations - Mol Cell Biol, 2001, 725-738) ; iii) l'association de ce double signal morpho- /motogène à un signal de survie (anti-apoptotique) induit par la voie des MAP Kinases et lié au franchissement du point de restriction mitogène- dépendent situé aux 2/3 de la phase G1 (Coutant et al. P13K-FRAP/mTOR pathway Hepatology, 2002). Ces signaux inducteurs signent le triple rôle des facteurs de croissance: morphogène, mitogène et de survie. Par ailleurs, la démonstration a été apportée que l'Insulin Growth Factor 2 receptor (IGF2r) pouvait contribuer à contrôler l'arrêt de prolifération, via l'activation du TGF(3 ( Villevalois et al. The insulin-like growth factor II / Mannose-6-phosphate contributes to hepatocyte homeostasis through transforming-growth factor b activation Journal of Hepatology, 2003, 38, 156- 163) ; iv) l'importance fondamentale de la MAPK ERK2 dans ces mécanismes de régulation (Rescan et al. Mechanism in the sequential control of cell morphology and S phase entry by EGF involved distinct MEK/ERK activations - Mol Cell Biol, 2001, 725-738). L'objectif de la présente invention est de permettre l'inhibition par interférence ARN de l'expression de la protéine ERK2 impliquée dans les processus de prolifération cellulaire afin d'inhiber ces processus. Plus particulièrement, un objectif de la présente invention est de proposer des molécules d'ARN interférent présentant une très grande spécificité à l'égard de l'ARN messager de la protéine ERK2 et donc n'inhibant pas l'expression des gènes de protéines de structure très proche telles que la protéine ERK1 impliquée également dans la voie MAP Kinases. Un objectif parallèle de la présente invention est de proposer de telles molécules d'ARN interférent pouvant être intégrées dans des compositions à usage pharmaceutique, susceptibles de présenter une activité antiproliférative et pouvant être utilisées chez l'homme pour le traitement des cancers. L'art antérieur le plus proche connu des inventeurs concernant la présente invention est constitué par la demande de brevet internationale PCT WO 03072590 publiée le 4 septembre 2003. Cette demande de brevet internationale propose un très grand nombre de séquences d'acides nucléiques interférents susceptibles d'être utilisées pour inhiber l'expression de gênes correspondant à différentes protéines de la voie MAP Kinases dont les gènes de la protéine ERK2. Toutefois, parmi les centaines de séquences divulguées, aucune n'est validée pour sa capacité à effectivement inhiber l'expression du gène qu'elle cible, et surtout pour permettre cette inhibition de façon sélective. De plus, les séquences selon la présente invention ne sont pas divulguées dans ce document. A ce jour, à la connaissance des inventeurs, aucune séquence inhibitrice et spécifique de l'ARN messager de la protéine ERK2 n'est publiée. Les objectifs cités ci-dessus ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite sont atteints grâce à l'invention qui concerne: des molécules d'acide ribonucléique interférent (ARNi) double brin inhibant sélectivement l'expression de l'ARN messager de la protéine ERK2 de la voie MAP Kinases chez l'homme d'une part; et, des molécules d'acide ribonucléique interférent (ARNi) double brin inhibant sélectivement l'expression de l'ARN messager de cette protéine chez les murins. L'invention concerne ainsi une molécule d'acide ribonucléique interférent caractérisée en ce que son brin signifiant (sense strand) présente la séquence GUGUUGUGUCUUCAAGAGC (SEQ n 1) et l'autre de ses brins (antisense strand) présente une séquence complémentaire. Une telle molécule d'acide ribonucléique interférent permet d'inhiber l'expression de la protéine ERK2 dans les cellules humaine. Selon un autre aspect de l'invention, la molécule d'acide ribonucléique interférent est caractérisée en ce que son brin signifiant présente la séquence GUGCUGUGUCUUCAAGAGC (SEQ n 2) et l'autre de ses brins présente une séquence complémentaire. Une telle molécule d'acide ribonucléique interférent permet de d'inhiber l'expression de la protéine ERK2 dans les cellules de rat ou de souris. Selon encore un autre aspect de l'invention, le brin signifiant de la molécule d'ARN1 présente la séquence GGUGCCAUGGAACAGGUUG (SEQ n 3) et l'autre de ses brins présente une séquence complémentaire. Une telle molécule permet d'inhiber sélectivement l'expression du gène de la protéine ERK2 dans les cellules de souris (et pas dans celles du rat). Les molécules d'acide ribonucléique interférent ci-dessus décrites pourront donc être utilisées pour inhiber sélectivement l'expression de l'ARN et par répercussion l'expression de la protéine ERK2. Les différentes molécules d'ARN interférent proposé par la présente invention pourront être synthétisées de façon connue par l'homme de l'art, notamment à l'aide d'un synthétiseur automatique. L'invention concerne également tout réactif pharmacologique contenant en tant qu'agent actif au moins une des molécules d'acides ribonucléiques interférent (SEQ n 1, SEQ n 2,SEQ n 3) telle que décrites ci-dessus. L'inhibition de l'expression de la protéine ERK2 de la voie MAP Kinases ayant des conséquences majeures sur la physiologie des cellules puisque inhibant la prolifération et la survie de celles-ci, l'invention couvre également toute composition pharmaceutique comprenant en tant qu'agent actif au moins une molécule d'acide ribonucléique interférent dont le brin signifiant (sense strand) présente la séquence GUGUUGUGUCUUCAAGAGC (SEQ n 1) et l'autre de ses brins (antisense strand) présente une séquence complémentaire. Qu'elles soient utilisés en tant que simple réactifs pharmacologiques ou sous forme de composition pharmaceutiques, ces molécules pourront être associés à tout vecteur connu de l'homme de l'art permettant leur introduction dans les cellules et leur subsistance dans celles-ci pendant une temps suffisant pour leur permettre de remplir leur fonction. Le sousclonage dans des vecteurs rétroviraux et adénoviraux permettra une expression stable d'un hairpin ARNi (ARN en épingle à cheveux) dans les cellules. L'utilisation des vecteurs lentiviraux permettra également de contrôler l'expression de ERK2 plus efficacement dans les cellules humaines. On notera que les ARNi selon l'invention pourront être légèrement modifiés sans sortir du cadre de l'invention, notamment en ajoutant quelques nucléotides à leurs extrémités. Leur stabilité pourra être accrue en jouant sur la stéréochimie du ribose. Notamment, l'utilisation de ribose présentant une conformation bateau conférera une plus grande stabilité à ces ARNi. L'invention sera plus facilement comprise grâce à la description qui va suivre de tests effectuées in vitro sur des cellules provenant d'hépatocytes de souris de rat et d'hépatocytes humains démontrant l'efficacité des molécules d'ARNi revendiquées. Pour ces tests, les protocoles suivants ont été utilisés. Transfection par ARN Pour une transfection de duplex ARNi à 100 nM, on utilise 5 l de LIPOFECTAMINE 2000 à 1 mg/ml qui sont dilués dans 100 l d'OPTIMEM et ainsi laissés à temperature ambiante durant 10 minutes. On rajoute ensuite 5 l du duplex ARNi à 20 M dilués dans 100 l d'OPTIMEM, et on laisse ainsi à température ambiante durant 20 minutes, temps nécessaire à l'intégration des duplex de ARNi dans les liposomes. On obtient ainsi 200 l de duplex ARNi à nM qui sont alors directement mis en suspension dans le milieu de transfection. La transfection s'effectue dans un milieu spécifique qui se compose pour 50 ml de volume final de 47, 5 ml d' OPTIMEM, de 50 l d'insuline (5.,g/ml), de 1 l d'hémisuccinate d'hydrocortisone à 1,4.10-6M et de 2,5 ml de SVF. Ce milieu de culture est dépourvu d'antibiotique, car ceux-ci sont toxiques durant la phase de transfection. En effet, leur pénétration intracellulaire est trop largement favorisée par la LIPOFECTAMINE qui est utilisée durant cette période. Ainsi pour éviter cette toxicité, le milieu de culture est préalablement renouvelé par une solution d'OPTIMEM seul dans la demiheure précédant la transfection, puis les cellules sont à nouveau changées avec ce milieu de transfection à raison de 1 ml de milieu pour un boite de 35 mm de diamètre. Les cellules sont ainsi laissées en culture durant 3 heures, puis le milieu de transfection est remplacé par un milieu de culture basal modifie, "GAI", qui est dépourvu d'antibiotique durant les 24 premières heures suivantes. Par la suite, le renouvellement du milieu de culture se fait avec le milieu de culture basal, complété ou non en facteur de croissance selon l'expérience à réaliser. Toutes les transfections réalisées ont été comparées à un témoin ARNi spécifique d'une protéine exogène, la GFP, dénommé siGFP (contrôle). Analyse de l'expression des protéines par western blot L'expression des protéines ou leur état de phosphorylation peut être analysé par western blot. Les cellules sont récoltées et soniquées deux fois 6 secondes dans 70 l de tampon d'homogénéisation (60 mM (-glycérophosphate; 15 mM 4nitrophénylphosphate; 25 mM MOPS pH 7,2; 15 mM EGTA; 15 mM MgC12; 2 mM DTT; 1 mM Vanadate; 1 mM NaF; 1 mM phénylphosphate; anti-protéases: leupeptine 10 aprotinine 20 tg/ml, benzamidine 100 M, SBTI 10 p,g/ml). Les protéines sont ensuite dosées suivant la méthode de Bradford avec le réactif Bio-Rad Protein Assay par spectrophotométrie à 590 nm (Bradford, 1976). Les homogénats sont réduits et dénaturée dans du Sample Buffer (Tris HC1 0,15 mM pH 6,8; glycérol 10%, SDS 3%, (-mercaptoéthanol 4%, bleu de bromophénol 0,1%). Les protéines (30 g) sont séparées par SDS-PAGE 12% à 60V pendant 2h30 puis transférées sur une membrane de nitrocellulose en condition humide sous une intensité de 250 mA (ampérage constant) pendant 1 heure. Le transfert est vérifié par une coloration au rouge Ponceau (Ponceau 0,01%, acide acétique 5%), ce qui permet une analyse qualitative et semiquantitative de la migration et du transfert. La membrane est alors lavée au TBS (Tris HC1 50 mM pH 8; NaCl 150 mM) puis saturée 1 heure dans du tampon de saturation TBS contenant 5% de lait écrémé en poudre. Elle est ensuite incubée une nuit à 4 C sous agitation douce en présence d'anticorps reconnaissant les formes phosphorylées des protéines ERK 1 et 2 (Cell Signaling, ref. 9106) dilués au 1/2000eme dans du tampon de saturation, les formes totales de ERK 1 et 2 dilués au 1/1000eme, dans du TBS-lait à 5%. Apres plusieurs lavages dans du TBS, la membrane est incubée 1 heure à température ambiante en présence d'un second anticorps couple a la HRP dilué au 1/2000eme dans du tampon de saturation. Après plusieurs lavages dans du TBS, la membrane est révélée par chimioluminescence. Mesure de la synthèse d'ADN L'entrée et la progression des hépatocytes en phase S sont évaluées par l'analyse de la synthèse d'ADN. Elle est déterminée par incorporation de méthyl- [3H]thymidine d'activité spécifique de 5 Ci/mmole ajoutée aux hépatocytes en culture a la concentration de 1 Ci/ml de milieu à différents temps après l'ensemencement. Sous une sorbonne destinée au traitement des éléments radioactifs, les cellules sont lavées au PBS, recueillies par grattage dans 1 ml de PBS puis soniquées deux fois 6 secondes. 200 l sont prélevés à ce stade pour un dosage ultérieur des protéines. Pour le reste du lysat (800 l), l'ADN est précipité par addition d'l volume de TCA 30% une nuit a 4 C. Le culot obtenu par centrifugation (2500 t/min) est lavé une fois par 2 ml de TCA 10%, une fois par 2 ml de TCA 5% puis dissous dans 200 l d'acide formique. La radioactivité incorporée par les cellules est évaluée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. Les résultats seront exprimés en cpm/ g de protéine. Les résultats de ces tests sont donnés en référence aux dessins selon lesquels: la figure 1 représente un graphe montrant la réplication sur une période de 72 h chez des hépatocytes de rats grâce à l'ARNi présentant la SEQ n 2; - la figure 2 représente la vue d'un western blot obtenu dans le cadre d'un essai montrant l'inhibition de l'expression de la protéine ERK2 chez des hépatocytes de rats grâce à l'ARNi présentant la SEQ n 2; la figure 3 représente la vue d'un western blot obtenu dans le cadre d'un essai montrant l'inhibition de l'expression de la protéine ERK2 chez des hépatocytes de souris grâce à l'ARNi présentant la SEQ n 3; la figure 4 représente un western blot obtenu dans le cadre d'un essai montrant l'inhibition de l'expression de la protéine ERK2 chez des hépatocytes humains grâce à l'ARNi présentant la SEQ n 1; la figure 5 représente un western blot obtenu dans le cadre d'un essai montrant l'inhibition de l'expression de la protéine ERK2 chez des cellules transformées issues d'un hépatocarcinome de rat (cellules FAO) grâce à l'ARNi présentant la SEQ n 2. Comme on peut le voir sur la figure 1, l'utilisation de l'ARNi présentant la séquence n 2 permet d'observer une diminution très nette de la réplication, à savoir une réduction d'environ 70% sur 48 h et une réduction de plus de 50 % sur 72H. En référence à la figure 2, une disparition quasi complète de la protéine ERK2 peut être observée grâce à l'utilisation de l'ARN 1 présentant la séquence n 2 chez le rat alors que la protéine ERK1, très proche structurellement est toujours exprimée. En référence à la figure 3, une disparition quasi complète de la protéine ERK2 peut être observée grâce à l'utilsiation de l'ARN 1 présentant la séquence n 3 chez la souris alors que la protéine ERK1, très proche structurellement est toutjours exprimée. En référence à la figure 4, une disparition quasi-complète de la protéine ERK2 peut être observée grâce à l'utilisation de l'ARNi présentant la séquence n 1 chez l'homme. En référence à la figure 5, une disparition quasi complète de la protéine ERK2 peut être observée grâce à l'utilisation de l'ARNi présentant la Séquence n 2 chez le rat dans les cellules issues d'un hépatocarcinome. REVENDICATIONS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) double-brin inhibant sélectivement l'expression de l'ARN messager de la protéine ERK2 de la voie MAP kinase chez l'homme. Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) selon la revendication 1 caractérisée en ce que son brin signifiant présente la séquence GUGUUGUGUCUUCAAGAGC et l'autre de ses brins présente une séquence complémentaire. Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) inhibant sélectivement l'expression de l'ARN messager de la protéine ERK2 de la voie MAP kinase chez le rat ou la souris Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) selon la revendication 3 caractérisée en ce que son brin signifiant présente la séquence GUGCUGUGUCUUCAAGAGC et l'autre de ses brins présente une séquence complémentaire. Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) inhibant sélectivement l'expression de l'ARN messager de la protéine ERK2 de la voie MAP kinase chez la souris. Molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) selon la revendication 5 caractérisée en ce que son brin signifiant présente la séquence GGUGCCAUGGAACAGGUUG et l'autre de ses brins présente une séquence complémentaire. Molécule vectorisée constituée par l'association d'une molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et d'un vecteur permettant son introduction dans une cellule Molécule vectorisée selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi dans le groupe constitué par les rétrovirus, les adénovirus, les lentivirus. 9. Composition pharmaceutique contenant en tant qu'agent actif au moins une molécule d'acide ribonucléique interférent (ARNi) selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2. 10. Composition contenant en tant qu'agent actif au moins une molécule vectorisée selon la revendication 7.