Brevet FR2865736A1 — publié le 20050805

INHIBITEURS DE l'ANGIOGENESE, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEUR UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES LIEES A UNE DEREGULATION DE L'ANGIOGENESE. La présente invention se rapporte au domaine du traitement des maladies liées à une dérégulation de l'angiogenèse telles que les cancers, l'artériosclérose et le diabète. L'invention concerne des inhibiteurs de l'angiogenèse particuliers capables d'interférer avec les différentes interactions de TAL-1 susceptibles d'être conjugués à des vecteurs tels que des peptides, des particules (liposomes, nanoparticules, etc.) et des polymères. L'invention concerne également une composition pharmaceutique contenant de tels inhibiteurs et leur utilisation pour le traitement de maladies liées à l'angiogenèse, tout particulièrement pour le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. L'angiogenèse, processus de remodelage des capillaires préexistants, conduit à la formation de nouveaux vaisseaux [Riseau, Nature 386; 671 (1997)]. Dans des conditions physiologiques, l'angiogenèse est étroitement régulée sous le contrôle d'une balance locale entre facteurs stimulateurs (angiogéniques) et inhibiteurs (angiostatiques). Chez l'adulte, la plupart des cellules de l'endothélium (plus de 99 %) sont à l'état quiescent. En réponse à un signal angiogénique, les cellules endothéliales (CEs) sortent de leur dormance et deviennent "activées" pour enclencher un programme d'angiogenèse. Ce processus complexe inclut le mouvement des CEs pour sortir des capillaires et leur migration vers le site angiogénique, leur prolifération et leur différenciation pour former de nouveaux capillaires. Une dérégulation de l'angiogenèse est observée dans 35 certaines pathologies comme l'artériosclérose, le diabète et les tumeurs [Carmeliet, Nat Med 6; 389 (2000)]. Quand les tumeurs atteignent une taille critique créant des conditions d'hypoxie, les cellules tumorales relarguent des cytokines, telles que VEGF ou bFGF, connues pour initier ou stimuler l'angiogenèse. L'angiogenèse, requise pour la croissance des tumeurs, est également un facteur majeur de propagation des cellules malignes dans l'organisme (métastases). En dépit de progrès indéniables dans la lutte contre certains cancers, force est de reconnaître que globalement les cancers progressent et qu'ils constituent une cause majeure de mortalité. La découverte de nouveaux médicaments constitue une des priorités de la recherche médicale. Les progrès récents des connaissances scientifiques sur l'angiogenèse tumorale permettent de croire que le traitement fondé sur l'anti- angiogenèse offrirait une nouvelle modalité pour maîtriser la croissance tumorale chez les patients atteints de cancer. Plusieurs stratégies anti-angiogéniques ont été développées pour inhiber la fonction de facteurs activateurs (VEGF ou bFGF), notamment avec des anticorps neutralisants dirigés contre la cytokine ou contre son récepteur. D'autres molécules anti-angiogéniques ont été dérivées d'inhibiteurs physiologiques présents dans le système hémostatique, comme le plasminogène (angiostatine), le collagène (endostatine) ou encore le fibrinogène (alphastatine) ; ces molécules inhibent l'adhésion des CEs à la matrice extracellulaire requise pour leur morphogenèse. Une autre stratégie très peu explorée à ce jour est de cibler directement les évènements intracellulaires de la cellule endothéliale en réponse à des stimuli angiogéniques. Ainsi, la Demanderesse a montré que TAL-1, facteur de transcription de la famille basic-Helix-Loop- Helix (bHLH), module spécifiquement la réponse angiogénique 2865736 3 des cellules endothéliales: il contrôle leurs propriétés de migration et stimule leur différenciation en capillaires [Lazrak et al., J Cell Sci sous presse (2004)]. Les expériences de recombinaison homologue chez la souris ont démontré que le gène tai-1 est requis pour certaines étapes du développement hématopoïétique et vasculaire. Les embryons tai-1-/(n'exprimant pas tai-1) présentent une angiogenèse défectueuse dans le sac vitellin qui semble refléter un défaut intrinsèque des cellules endothéliales [Visvader et al., Genes Dev 12; 473 (1998)]. Chez l'adulte, en dehors de certains progéniteurs hématopoïétiques de la moelle osseuse, la protéine TAL-1 est exprimée dans les petits vaisseaux en formation, mais pas dans l'endothélium mature quiescent [Kallianpur et al., Blood 83; 1200 (1994)]; de manière significative, un haut niveau d'expression de TAL-1 est observé dans la vasculature de tumeurs humaines [Chetty et al., J Pathol 181; 311 (1997)]. TAL-1 constitue donc un marqueur des CEs angiogéniques. De ce fait, nous avons ciblé TAL-1 pour inhiber l'angiogenèse. La Demanderesse a développé de nouvelles molécules capables de bloquer spécifiquement l'activité de TAL-1 dans les cellules endothéliales. Le motif HLH de TAL-1 est requis pour toutes les activités du facteur TAL-1 connues à ce jour: fixation à l'ADN ou interaction avec d'autres facteurs nucléaires notamment E47 ou LMO 2 [Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci 91; 3181 (1994) ; Vitelli et al., Mol Cell Biol 20; 5330 (2000)](Figure 1). La Demanderesse a développé des inhibiteurs peptidiques capables d'entrer en compétition avec le domaine HLH de TAL-1. Ces inhibiteurs peptidiques ont été ensuite couplés à des vecteurs peptidiques pour permettre et/ou améliorer leur internalisation dans les cellules. 20 25 30 2865736 4 Les travaux et résultats concernant ces peptides vecteurs et leur utilisation comme vecteurs pour transporter des molécules actives ont été décrits dans la demande de brevet français N 97/10297 déposée le 08 décembre 1997. Dans les séquences peptidiques rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature cidessous. A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser sérine T Thr thréonine / Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine La présente invention a donc pour objet un inhibiteur peptidique (également appelé molécule peptidique) capable d'interférer avec le domaine HLH de TAL-1, constitué par ou comprenant au moins 10 acides aminés successifs et, de préférence, au moins 15 acides aminés successifs du domaine HLH de TAL-1 de séquence: QQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA correspondant à la SEQ ID No. 1 dans le listage de séquences en annexe ou une séquence équivalente. Par séquence équivalente , on entend la séquence d'un variant connu du domaine HLH de TAL-1 mais aussi une séquence présentant un ou plusieurs substitutions, délétions et/ou additions d'acides aminés par rapport à la séquence SEQ ID No. 1, lesdites substitutions, délétions et/ou additions d'acides aminés ne modifiant pas les activités du facteur TAL-1 ainsi obtenu comme sa fixation à l'ADN ou son interaction avec d'autres facteurs nucléaires notamment E47 ou LMO 2. L'homme du métier connaît différentes techniques pour vérifier les activités du facteur de transcription TAL-1 ainsi obtenu. De plus, dans le cadre de la présente invention, on entend par séquence équivalente , des peptides qui présentent une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation, une méthylation ainsi que les peptides qui portent un groupement protecteur. Les dérivés des peptides de l'invention peuvent également être ceux dont un ou plusieurs acides aminés sont des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment l' hydroxyproline, 1'hydroxylysine, l'allo-hydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N- éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo- isoleucine, la Nméthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique et les acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline, la cyclohexyl-alanine et les oméga-acides aminés. Les dérivés couvrent également les rétropeptides et les rétroinversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité antimicrobienne des peptides de l'invention. Par molécule peptidique , on entend dans le cadre de la présente invention une molécule constituée par ou qui comprend au moins une séquence peptidique, ladite molécule pouvant comprendre en outre des entités chimiques additionnelles autres que des acides aminés. De préférence, l'inhibiteur ou molécule peptidique objet de la présente invention est choisi parmi le composé 1 de séquence: QQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 1 dans la liste de séquences en annexe), le composé 2 de séquence: VRRIFTNSRERWRQQNVNGAFAELRKLI (SEQ ID No. 2 dans la liste de séquences en annexe) et le composé 3 de séquence: PTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 3 dans la liste de séquences en annexe) ou une séquence équivalente auxdites séquences. Ainsi, l'inhibiteur de la présente invention est constitué par ou comprend une séquence choisie parmi les séquences suivantes: - QQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 1 dans la liste de séquences en annexe), -VRRIFTNSRERWRQQNVNGAFAELRKLI (SEQ ID No. 2 dans la liste de séquences en annexe) et -PTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 3 dans la liste de séquences en annexe) ou une séquence équivalente auxdites séquences. Dans une forme de mise en uvre préférée, l'inhibiteur ou molécule peptidique objet de la présente invention est associé à un vecteur. De façon avantageuse, ce vecteur est capable d'augmenter le transport dudit inhibiteur dans les cellules et organes cibles. L'homme du métier connaît différents types de vecteurs peptidiques utilisables dans le cadre de la présente invention. Ainsi, à titre d'exemples et de façon non-limitative, le vecteur est choisi, parmi le groupe comprenant: - un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines [brevet français N 97/10297], - un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction tels que les domaines de transduction de la protéine Tat de HIV-1 [Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci 91; 664 (1994) ; Schwarze et al., Science 285; 1569 (1999)] et les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia [Derossi et al., J. Biol. Chem 269, 10444 (1994) ; Brevet US 5888762). - des particules comme les liposomes [Dass and Su.(2001) Drug Deliv. 8:191-213] ou des nanoparticules [Panyam and Labhasetwar (2003) Adv Drug Deliv Rev. 55:329-47; Douglas et al. (1987) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 3:233-61], - des polymères tels que le polyéthylène glycol (PEG) [Greenwald et al. (2003) Adv Drug Deliv Rev. 55:217-50]. L'invention envisage tout particulièrement comme peptide linéaire dérivé de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante: BX(X ou B)BXXXXBBBXXXXXXB (I) et comme peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante: (B ou X)XXXBXXXBXXXXBBXB (II), 2865736 8 dans lesquelles: - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et - les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés 10 successifs des peptides de formules (I) ou (II). La présente invention concerne également l'utilisation d'un vecteur tel que défini précédemment pour vectoriser dans les cellules, les tissus et/ou les organes un inhibiteur peptidique tel que défini précédemment. La liaison entre l'inhibiteur ou molécule peptidique de Tai-1 capable d'interférer avec les différentes interactions de TAL-1 tel que précédemment défini et du vecteur est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules. Cette liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le vecteur, soit sur l'inhibiteur, soit sur les deux. Ce bras de liaison, s'il est présent, doit être acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement tant du vecteur que de l'inhibiteur. On peut citer, à titre d'exemple et de façon non-limitative, des linkers contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle, aryle ou aralkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des 2865736 9 dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cyanogène, carbonyldiimidazole, des esters de succinimide ou des halogénures sulphoniques. Comme groupes fonctionnels, on peut citer: OH, -SH, -COOH, ou -NH2. Ainsi, l'inhibiteur peut être lié par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide vecteur. Un type de liaison préféré entre l'inhibiteur de l'angiogenèse et le vecteur implique au moins un pont dissulfure. De façon particulièrement avantageuse, l'inhibiteur de la présente invention est choisi parmi les deux composés suivants: - composé 4: ^ JIo s-s' v 'H-A W S F R V S Y R G I S Y R R S N-Q Q N V N G A F A E L R K L I P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A- NH, N - composé 5: s-s' v N-R R L S Y S R R R F-NH, QNV N G A F A E L R K LL I P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A-NH, La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur (ou molécule) peptidique tel que défini précédemment, avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. De préférence, ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale, par voie nasale, par voie transdermique, par voie pulmonaire ou par voie centrale. Par véhicule , on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée à 2865736 i0 l'inhibiteur de l'invention pour favoriser son transport, éviter sa dégradation substantielle dans ladite composition et préserver ses propriétés inhibitrices. Le véhicule est choisi en fonction du type d'application listé ci-dessus de la composition. La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement des maladies liées à une dérégulation de l'angiogenèse comme les cancers, l'artériosclérose et le diabète, consistant à administrer à un sujet soufrant d'une telle maladie une quantité efficace d'un inhibiteur ou d'une composition tels que décrits précédemment. L'invention concerne encore l'utilisation d'un inhibiteur ou d'une composition tels que décrits précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies liées à l'angiogenèse, et plus particulièrement des maladies liées à une dérégulation de l'angiogenèse, et de préférence au traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé capable d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, au traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. Dans une première forme de mise en uvre de la présente invention, un composé capable d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 est un inhibiteur compétitif du domaine HLH de TAL-1. De façon préférée, un tel composé est une molécule peptidique telle que précédemment définie. 2865736 Il Dans une deuxième forme de mise en uvre de la présente invention, un composé capable d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 est un composé capable d'inhiber la fixation de TAL-1 sur son partenaire E47. De façon préférée, un tel composé est un anticorps reconnaissant soit un épitope au niveau du domaine HLH de TAL-1, soit un épitope au niveau du domaine HLH de E47. Les applications et utilisations envisagées pour les inhibiteurs (inhibiteurs ou molécules peptidiques) précédemment décrites s'appliquent mutatis mutandis aux composés capables d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 (méthodes de traitement, compositions pharmaceutiques, etc...). Enfin, la présente invention concerne un procédé pour identifier un composé biologiquement actif susceptible d'être utilisé dans la prévention et/ou le traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète consistant à détecter l'inhibition de l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 en présence dudit composé. Par "composé biologiquement actif", la présente invention concerne plus particulièrement tout composé chimique naturel ou synthétique tels que, à titre d'exemples et de façon non exhaustive, des protéines, des polypeptides, des peptides, des aptamères, des lipoprotéines, des polysaccharides, de petites molécules, des molécules non-peptidiques, etc. . Après l'identification dudit composé biologiquement actif, il sera facile tester son activité dans la prévention et/ou le traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète par des méthodes bien connues de l'homme du métier...DTD: L'homme du métier a à sa disposition différentes techniques lui permettant de vérifier si le composé biologiquement actif à tester est capable d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47. Dans une première forme de mise en uvre, la méthode 10 de l'invention comprend les étapes suivantes: (a) mettre en contact la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) et le composé biologiquement actif à tester, (b) immunoprécipiter soit la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), soit le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1), (c) si, à l'étape (b), la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) est immunoprécipitée, détecter dans le immunoprécipitat obtenu à l'étape (b), la présence du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1), (d) si, à l'étape (b), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) est immunoprécipité, détecter dans l'immunoprécipitat obtenu à l'étape (b), la présence de la protéine TAL-1 (ou d'un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), dans le cas où le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) n'est pas présent à l'étape (c) ou si la 35 protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant 2865736 13 le domaine HLH) n'est pas présente à l'étape (d), ledit composé est un agent susceptible d'être utilisé dans la prévention et/ou le traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. L'homme du métier a à sa disposition différentes protéines susceptibles d'être mises en oeuvre dans le cadre de la méthode de l'invention. A titre d'exemples, la protéine E47 utilisable peut être la protéine de Gallus galles présente dans Genbank sous le numéro CAE30454 ou la protéine de Mus musculus présente dans Genbank sous le numéro AAK18618. De la même façon, la protéine TAL-1 utilisable est la protéine de Homo sapiens présente dans Genbank sous le numéro P17542 ou la protéine de Mus musculus présente dans Genbank sous le numéro P22091. L'homme du métier connaît dans ces séquences les domaines particulièrement intéressants dans le cadre de la présente invention. A l'étape (b) de la méthode objet de la présente invention, l'homme du métier saura quel type d'anticorps utilisé en fonction de la protéine à immunoprécipiter (anticorps spécifique du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) ou anticorps spécifique de la protéine TAL-1 (ou d'un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH)). La détection, à l'étape (c), de la présence, dans l'immunoprécipitat obtenu à l'étape (b), du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) peut être réalisée par toute technique de l'homme du métier comme, par exemple, un Western Blot utilisant un anticorps spécifique du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1), un dosage de l'activité du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) ou une méthode mettant en uvre un facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) marqué, ledit marquage pouvant être un marquage radioactif. La même mise en uvre peut être réalisée mutatis mutandis pour la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) à l'étape (d). Dans une seconde forme de mise en uvre, la méthode comprend les étapes suivantes: (a') mettre en contact la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) et le composé biologiquement actif à tester, (b') faire migrer sur un gel de polyacrylamide non dénaturant le mélange obtenu à l'étape (a'), (c') visualiser l'absence ou la présence du complexe TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) et E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1). L'absence de ce complexe à l'étape (c') met en évidence l'action inhibitrice du composé actif testé et donc que ce composé est un agent susceptible d'être utilisé dans la prévention et/ou le traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. A l'étape (c') de la méthode objet de l'invention, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être mises en uvre. A titre d'exemples, on peut réaliser un Western blot utilisant des anticorps spécifiques de l'une ou l'autre des protéines TAL-1 ou E47 ou de leurs fragments. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la préparation d'un composé constitué d'un inhibiteur de TAL-1 et d'un peptide vecteur ainsi que sur leurs effets in vitro et in vivo. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels: - la figure 1 représente schématiquement la représentation du dimère HLH. - la figure 2 illustre l'inhibition de l'interaction de TAL-1 et E47 in vitro par les différents inhibiteurs. - la figure 3 illustre l'inhibition de l'interaction de TAL-1 et E47 in vitro par l'inhibiteur couplé à un peptide vecteur, - la figure 4 illustre l'effet des composés sur la survie des cellules endothéliales HUVEC, - la figure 5 illustre l'effet d'un des composés de l'invention sur la tubulogenèse in vitro des cellules endothéliales humaines après 22 heures de culture, - la figure 6 présente l'effet des composés de l'invention sur l'angiogenèse in vivo chez la souris par analyse macroscopique des implants de Matrigel complémentés ou non par des composés de l'invention, - la figure 7 présente l'effet des composés de l'invention sur l'angiogenèse in vivo chez la souris par dosage de l'hémoglobine contenue dans lesdits implants de Matrigel. I - Synthèse Chimique. 1) Synthèse des inhibiteurs de TAL-1 libres et vectorisés. Les peptides ont été assemblés sur phase solide selon une stratégie Foc/tu, clivés et déprotégés par l'acide trifluoroacétique, puis purifiés par chromatographie haute pression préparative en phase inverse et lyophilisés. leur pureté (>95%) et leur identité ont été confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse. Séquence des peptides: SynB3 (H-RRLSYSRRRF-NH2; 1394.8 Da, SEQ ID No. 7 dans la liste de séquences en annexe), SynB4 (HAWSFRVSYRGISYRRSR-NH2; 2145,1 Da, SEQ ID No. 6 dans la liste de séquences en annexe), Tal-HLH (HQQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA-NH2, SEQ ID No. 1 dans la liste de séquences en annexe) 2) Couplage des inhibiteurs sur les peptides vecteurs. Activation des vecteurs: Les peptides vecteurs SynB3 et SynB4 ont été traités par SPDP (N-Succinimidyl 3-(2-Pyridylthio)propionate) dans Dimethylformamide (DMF) en présence de DIEA (Diisopropylethylamine). Les peptides résultants (2-Pyridylthio)propionyl-SynB3 (1591.8 Da) et (2Pyridylthio)propionyl-SynB4 (2342.1 Da) ont été purifiés par HPLC et lyophilisés. Préparation des conjugués Chaque peptide vecteur activé (2-Pyridylthio) propionyl-SynBx (leq) a été solubilisé avec C-TalHLH (leq) dans DMF, en présence de DIEA de façon à former un pont dissulfure entre la chaîne latérale de la Cystéine de C-Ta1HLH (composé Tal-HLH synthétisé avec une cystéine en plus) et le 3-Mercaptopropionate porté par le vecteur. Les conjugués résultants (Tal-HLH-SynB3; 6303 Da et Tal-HLH-SynB4; 7052.6 Da) ont été précipités par addition d'éther, puis purifiés par HPLC et lyophilisés. Le contrôle de qualité par HPLC analytique à 220 nm et par spectrométrie de masse MALDI-TOF a confirmé les masses molaires et a déterminé une pureté supérieure à 96%. II - Composés testés. Les composés testés sont présentés dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 Composé Nom Séquence 1 Tal-HLH QQN VNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 1 dans la liste de séquences en annexe) 2 Tal-hel lrb VRRIFTNSRERWRQQNVNGAFAELRKLI (SEQ ID No. 2 dans la liste de séquences en annexe) 3 Tal-hel 2b PTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 3 dans la liste de séquences en annexe) 4 Ta1HLH- s s H A W S F R V S Y R G I S Y R R S R coo. SynB4 N Q Q N V N G A F A E L R K L 1 P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A NH, N o (SEQ ID No. 4 dans la liste de séquences en annexe) TaIHLH- R R L S Y S R R R F NH, SynB3 Q Q N V N G A F A E L R K L 1 P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A NH, N o (SEQ ID No. 5 dans la liste de séquence en annexe) 6 SynB4 AWSFRVSYRGISYRRSR (SEQ ID No. 6 dans la liste de séquence en annexe) 7 SynB3 RRLSYSRRRF (SEQ ID No. 7 dans la liste de séquence en annexe) 1) Test de traduction/immunoprécipitation. Les deux protéines TAL-1 et E47 sont co-traduites in vitro en utilisant des plasmides permettant la transcription et la traduction des séquences codantes dans le système TNT-T7-coupled Reticulocyte Lysate, selon lesconditions proposées par le fournisseur (Promega). La traduction est réalisée en présence de méthionine S35, avec addition ou non de peptides dissous dans une solution d'urée 2M. Une aliquote (1 pl) de chaque traduction est contrôlée par électrophorèse et autoradiographie du gel; l'addition de peptide jusqu'à 0.7 pg dans le lysat de réticulocyte (volume final 25 pl) n'affecte pas l'efficacité de la traduction des deux protéines. Après une incubation de 30 min à 37 C, les produits de traduction sont immunoprécipités par un mélange d'anticorps monoclonaux anti-TAL-1 (BTL 73 + 2TL 136; [Pulford et al., Blood 85; 675 (1995)] )puis analysés par électrophorèse et autoradiographie du gel. On quantifie l'interaction TAL1-E47 pour chaque point en calculant le ratio E47/TAL- 1 obtenu d'après le scan de l'autoradiographie; l'intensité de la bande correspondant à TAL-1 sert ici de normalisation dans tous les puits. L'interaction en absence de peptide est arbitrairement établie à 100 %. 2) Test de cytotoxicité. Les cellules hématopoïétiques K562 ont été obtenues commercialement auprès de l'ATCC. Les cellules sont ensemencées à environ 104 cellules par puits, 24 h avant l'addition des produits. Elles sont alors à 60-80% de confluence le jour de l'expérience. Les cellules sont maintenues en culture à 37 C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de CO2 dans un milieu OptiMem . Les cellules sont incubées soit avec les composés à des concentrations croissantes pendant 48 heures. A la fin du temps de culture, le MTT (3-(4, 5-diméthylthiazole-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure) est rajouté dans les puits et les plaques de culture sont ensuite incubées pendant 4 heures dans l'étuve. Le dépôt cristallin de formazan résultant est alors dissous par addition de 200 pl de DMF/SDS. La densité optique (DO) est mesurée à 550 nm (référence 630 nm) en utilisant un lecteur de microplaques. La représentation graphique des pourcentages de DO des puits traités en fonction de la concentration de produits permet de déterminer la DL". Celle-ci correspond à la concentration du produit inhibant 50% de la croissance. 3) Test de survie des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales humaines dérivées de la veine du cordon ombilical, HUVEC, (Clonetics) sont cultivées sur boîtes coatées avec de la gélatine dans du milieu EBM-2 complet (Clonetics) supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté. Les cellules sont utilisées entre les passages 3 et 5. Les cellules ECV 304 (obtenues auprès de l'ATCC) sont cultivées en DMEM avec 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté. Les cellules sont décollées à la trypsine et suspendues dans un milieu sans sérum (OptiMEM, Invitrogen). Environ 8 103 cellules dans 200 pl sont incubées pendant 20 min en présence de différentes concentrations de peptides, centrifugées, puis ensemencées en milieu EBM2 complet dans des puits (plaque 48 puits) coatés avec du collagène I. Après 24 heures dans l'étuve, la survie cellulaire est estimée par un test MTT, réalisé selon les recommandations du fournisseur (Sigma). III Résultats. 1) Effet des peptides inhibiteurs sur l'interaction de TAL-1/E47 in vitro. Nous avons choisi de tester si les composés décrits dans le Tableau 1 (Composés 1, 2 et 3) pouvaient affecter la formation des hétéro dimères TAL-1-E47, médiée par le domaine HLH des deux protéines. Le composé 1 contient tout le domaine HLH de TAL-1 soit l'hélice 1- boucle-hélice 2; le composé 2 comprend la région basique et l'hélice 1; le composé 3 contient la boucle et l'hélice 2 (voir figure 1). Nous avons utilisé un test de co-immunoprécipitation de TAL-1 et E47 traduites in vitro par des anticorps dirigés contre l'une des protéines. 2865736 20 Nos expériences montrent que le composé Tal-HLH entier (composé 1) inhibe efficacement l'interaction de TAL-1 avec E47 et de façon dose-dépendante (50 à 60% d'inhibition avec 0.2 pg; 90 à 100% avec 0.5 pg) (Figure 2 A et B). Les deux autres peptides inhibiteurs (composés 2 et 3) ont un plus faible pouvoir inhibiteur ne dépassant pas 50% dans les plus fortes concentrations (Figure 2A). Nous avons donc choisi d'utiliser le peptide inhibiteur Tal-HLH (composé 1) pour la suite des expériences. 2) Effet des peptides inhibiteurs couplés avec des peptides vecteurs sur l'interaction de TAL-1/E47 in vitro. Nous avons voulu savoir si la vectorisation ou le couplage du peptide inhibiteur Tal-HLH ne modifiait pas son effet inhibiteur sur l'interaction de TAL-1 in vitro avec E47. L'inhibiteur a été couplé à deux peptides vecteurs (SynB3 et SynB4) via une liaison dissulfure (composés 5 et 4, respectivement). Ces deux peptides vecteurs ont la propriété d'augmenter le transport des molécules à travers les membranes cellulaires. Les résultats présentés dans la figure 3 confirment que la vectorisation du peptide inhibiteur Tal-HLH ne modifie pas son effet inhibiteur. De manière intéressante, l'inhibiteur couplé au vecteur SynB3 (composé 5) s'est révélé plus actif que l'inhibiteur Tai- HLH (composé 1). 3) Effet des peptides inhibiteurs couplés sur les cellules hématopoïétiques. Dans un premier temps, l'effet de l'inhibiteur vectorisé a été étudié sur une lignée hématopoïétique (K562) dont la survie requiert l'activité de TAL-1. La lignée hématopoïétique T (H9) a été utilisée comme contrôle car sa croissance est indépendante de TAL-1. Ces deux lignées leucémiques peuvent survivre plusieurs jours en l'absence de facteurs de croissance, ce qui permet de 2865736 21 tester l'effet des peptides dans un milieu dépourvu de sérum. Comme attendu, aucune différence significative n'a été observée dans les cellules H9 (TAL-1 négative), selon que le peptide Tal-HLH est vectorisé ou non (résultats non montrés). Par contre, le peptide Tal-HLH a un effet cytotoxique plus élevé sur les cellules K562 (nécessitant l'activité de TAL-1) lorsqu'il est vectorisé (Tableau 2). En effet la DL50, qui correspond à la concentration du produit inhibant 50% de la croissance, est deux fois plus faible pour l'inhibiteur vectorisé (composé 4) que pour l'inhibiteur seul (composé 1). Tableau 2 Composé nom DL 50 (lei) Composé 1 Tal-HLH 11.5 Composé 4 Ta1HLH-SynB4 5.7 Composé 6 SynB4 12.3 Ces résultats constituent une première validation que le peptide Tal-HLH vectorisé (Composé 4) est capable d'inhiber spécifiquement l'activité de TAL-1 dans les cellules. 4) Effet des peptides inhibiteurs couplés sur la survie des cellules endothéliales. Nous avons également étudié les effets de l'inhibiteur libre et vectorisé sur la survie des cellules endothéliales. La figure 4 montre que le composé 1 n'a aucun effet sur la survie des cellules HUVEC. Par contre, une fois couplé (composés 4 et 5) il affecte spécifiquement la survie des cellules HUVECs et de façon dose-dépendante. Le couplage du produit par un peptide vecteur était important pour avoir un effet sur la survie car l'addition simultanée de l'inhibiteur et du peptide vecteur non- 2865736 22 couplés n'avait aucun effet. Dans les cellules ECV 304, utilisées comme contrôle négatif, les composés ont induit une toxicité cellulaire non spécifique qu'ils soient couplés ou non-couplés (résultats non montrés). Ces expériences démontrent l'effet spécifique de l'inhibiteur de TAL-1 lorsqu'il pénètre dans les cellules endothéliales grâce au vecteur peptidique. 5) Effet des peptides sur la tubulogenèse in vitro 10 des cellules endothéliales humaines (gels de collagène en 3-D). Les cellules endothéliales HUVEC ensemencées au sein d'un gel de collagène I concentré (lmg/ml) s'arrêtent de proliférer et, en présence de milieu d'activation (MDCB131, 1% sérum de veau foetal, VEGF 2 ng/ml, bFGF 20 ng/ml et PMA 80 nM), elles s'organisent rapidement en cordons cellulaires pour constituer un réseau primitif; dans les 24-48 hrs, les cellules alignées s'allongent, fusionnent entre elles et forment progressivement des pseudos tubules. Nous avons testé les effets du peptide HLH vectorisé (composé 1) dans ce système de tubulogenèse in vitro de cellules endothéliales humaines issues de cordon ombilical (HUVECs). Des concentrations croissantes de peptide vectorisé (composé 5) ou de cargo seul (composé 1) ont été ajoutées à la fois dans la solution de collagène contenant les cellules et dans le milieu d'activation. La figure 5 illustre une de ces expériences: le peptide HLH vectorisé (composé 5) affecte très fortement la tubulogenèse entre 7 et 10 pM alors que le cargo seul (composé 1) n'a aucun effet dans cette gamme de concentration par rapport aux cultures contrôles (5% DMSO). 6) Effet des peptides sur l'anqioqenèse in vivo chez la souris (Matrigel plugs). Le test de Matrigel plugs consiste à injecter en sous-cutané chez la souris du Matrigel, matrice extracellulaire dérivée d'une tumeur murine, capable de déclencher une néovascularisation au sein de l'implant. En effet, les cellules endothéliales de l'hôte, sous l'influence des facteurs pro-angiogéniques contenues dans le Matrigel, migrent vers cette pseudo-tumeur et s'infiltrent dans le Matrigel pour organiser un réseau de capillaires entre 5 et 7 jours. Dans les expériences décrites ci-dessous, deux injections sous-cutanées de Matrigel (500 pl) ont été effectuées de par et d'autre de la ligne médiane de l'abdomen. Juste avant l'injection, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane (Forène ). Le Matrigel (BDBiosciences; lot 10403, 13 mg/ml) a été complémenté par du bFGF (500 ng/ml), de l'héparine (60 U/ml) et les différents peptides SynB3 (composé 7), SynB3-HLH (composé 5), SynB4 (composé 6), SynB4-HLH (composé 4) sont ajoutés à une concentration finale de 20 pM en 5% DMSO. Les souris ont été divisées en 3 groupes de six animaux identiques (mâles C57BL/6 âgés de 6 semaines). - chaque souris du groupe témoin (souris 1 à 6) a reçu deux injections de Matrigel contenant 5% de DMSO du côté gauche et un peptide témoin antiangiogénique du côté droit, - chaque souris du groupe SynB3 (souris 7 à 12) a 30 reçu deux injections de Matrigel contenant SynB3 du côté gauche et SynB3-HLH du côté droit, - chaque souris du groupe SynB4 (souris 13 à 18) a reçu deux injections de Matrigel contenant SynB4 du côté gauche et SynB4-HLH du côté droit. Six jours après l'injection, les souris ont été sacrifiées par inhalation de CO2 et les implants ont été récupérés pour évaluer l'angiogenèse (photographie et dosage de l'hémoglobine). L'angiogenèse a été quantifiée par dosage de l'hémoglobine contenue dans les implants de Matrigel avec une solution de Drabkin selon les recommandations du vendeur (Sigma Chemical Co). Les résultats présentés sur les figures 6 (analyse macroscopique) et 7 (dosage de l'hémoglobine), montrent que l'addition des peptides vecteurs seuls n'a pas d'effets significatifs sur l'angiogenèse; par contre le peptide HLH conjugué avec l'un ou l'autre des vecteurs inhibe efficacement la néovascularisation dans les implants (11 sur 12). Cette inhibition était beaucoup plus importante que celle obtenue par un inhibiteur (Tum) connu pour inhiber l'angiogenèse. 2865736 REVENDICATIONS 1) Molécule peptidique capable d'interférer avec le domaine HLH de TAL-1, constituée par ou comprenant au moins 10 acides aminés successifs et, de préférence, au moins 15 acides aminés successifs du domaine HLH de TAL-1 de séquence: QQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA correspondant à la SEQ ID No. 1 dans le listage de séquences en annexe ou une séquence équivalente. 2) Molécule peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend une séquence choisie parmi les séquences suivantes: - QQNVNGAFAELRKLIPTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 1 dans la liste de séquences en annexe), -VRRIFTNSRERWRQQNVNGAFAELRKLI (SEQ ID No. 2 dans la liste de séquences en annexe) et -PTHPPDKKLSKNEILRLAMKYINFLA (SEQ ID No. 3 dans la liste de séquences en annexe) ou une séquence équivalente auxdites séquences. 4) Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est associée à un vecteur. 5) Molécule peptidique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit vecteur est choisi, parmi le groupe comprenant: - un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines, - un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction tels que les domaines de transduction de la protéine Tat de HIV-1 et les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia, - des particules comme les liposomes, 26 2865736 - des polymères tels que le polyéthylène glycol (PEG). 5) Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que ledit vecteur est un peptide linéaire dérivé de Protégrines, répondant à la formule (I) suivante: BX(X ou B) BXXXXBBBXXXXXXB (I) ou un peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, répondant à la formule (II) suivante: (B ou X)XXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles: - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et - les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II). 6) Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que la liaison entre ladite molécule et ledit vecteur est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules. 7) Molécule peptidique selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le vecteur, soit sur la molécule peptidique, soit sur les deux. 27 2865736 8) Molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les deux composés suivants: - composé 4: }I s-s""^" 'g±A W S F R V S Y R G I S Y R R S R- Q N V N G A F A E L R K L I P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A-NH, - composé 5: 9) Composition pharmaceutique comprenant comme principe 10 actif au moins une molécule peptidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, avantageusement associée dans ladite composition à un véhicule acceptable. 10) Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale, par voie nasale, par voie transdermique, par voie pulmonaire ou par voie centrale. 11) Utilisation d'un composé capable d'inhiber l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, au traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète, ledit composé étant choisi dans le groupe constitué par une molécule peptidique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 et un anticorps reconnaissant soit un épitope au niveau du domaine HLH de TAL-1, soit un épitope au niveau du domaine HLH de E47. 12) Procédé pour identifier un composé biologiquement actif susceptible d'être utilisé dans la prévention et/ou le 1-R R L S Y S R R R F-HH, -QQN V N G A F A E L R K L I P T H P P D K K L S K N E I L R L A M K Y I N F L A-NH, traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète consistant à détecter l'inhibition de l'interaction entre le domaine HLH de TAL-1 et son partenaire E47 en présence dudit composé. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: (a) mettre en contact la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine HLH) et le composé biologiquement actif à tester, (b) immunoprécipiter soit la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), soit le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine HLH), (c) si, à l'étape (b), la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) est immunoprécipitée, détecter dans l'immunoprécipitat obtenu à l'étape (b), la présence du facteur de transcription E47 (ou d'un fragment de ce facteur comprenant le domaine HLH), (d) si, à l'étape (b), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine HLH) est immunoprécipité, détecter dans l'immunoprécipitat obtenu à l'étape (b), la présence de la protéine TAL-1 (ou d'un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), dans le cas où le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine HLH n'est pas présent à l'étape (c) ou si la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) n'est pas présente à l'étape (d), ledit composé est un agent susceptible d'être utilisé dans la prévention et/ou le traitement des maladies liées à l'angiogenèse et, de préférence, le traitement des cancers, de l'artériosclérose et du diabète. 29 2865736 14) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, ledit procédé comprend les étapes suivantes: (a') mettre en contact la protéine TAL-1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH), le facteur de transcription E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1) et le composé biologiquement actif à tester, (b') faire migrer sur un gel de polyacrylamide non dénaturant le mélange obtenu à l'étape (a'), (c') visualiser l'absence ou la présence du complexe TAL- 1 (ou un fragment de cette protéine comprenant le domaine HLH) et E47 (ou un fragment de ce facteur comprenant le domaine qui interagit avec TAL-1).