Brevet FR2867475A1 — publié le 20050916

L'invention concerne de nouveaux sulfolipides antirétroviraux extraits de spirulines, leur procédé d'obtention, les compositions les contenant, leur utilisation comme inhibiteurs des virus de l'immunodéficience humaine VIH-1 et VIH-2, ainsi que la biomasse les contenant. Les glycolipides sont très répandus dans les organismes eucaryotes ou procaryotes où ils sont associés aux membranes de thylacoïdes. Dans les cyanobactéries en général, les glycolipides sont aussi associés aux parois cellulaires des hétérocytes (1). Les cyanobactéries telles que les spirulines possèdent quatre types de lipides membranaires: trois glycolipides (deux galactolipides et un sulfolipide) et un seul type de phospholipide (le phosphatidylglycérol). Plusieurs travaux ont montré que ces glycolipides peuvent avoir des activités antiinflammatoires, antitumorales ou antivirales (2). Gustafson et al. (3) ont étudié l'activité antivirale vis-à-vis du VIH-1 de sulfolipides extraits des microalgues Lyngbya lagerheimii et Phormidium tenue: les résultats montrent une activité inhibitrice de VIH1 de sulfolipides purs dans un essai tétrazolium ainsi que dans des essais relatifs à la formation de syncitia et à la protéine P24 dans des lignées cellulaires de lymphocytes humains. Récemment, Loya et al. (4) ont montré que les sulfolipides chez Schytonema sp., Oscillatoria trichoides, Oscillatoria raoi, Oscillatoria limnetica et Phormidium tenue sont des inhibiteurs puissants de la transcriptase inverse de VIH-1, considérée comme une enzyme clé dans le cycle de vie du virus VIH. La transcriptase inverse est une enzyme multifonctionnelle ayant deux activités enzymatiques, à savoir: ADN polymérase et RNAse-H. Ces deux activités sont responsables de la conversion de l'ADN génomique viral en ADN double-brin proviral. Cet ADN est ensuite transporté du cytoplasme vers le noyau de la cellule-hôte où il est intégré par la suite dans l'ADN cellulaire. L inhibition de chacune des deux fonctions catalytiques de la transcriptase inverse empêche la production virale dans la cellule- hôte. De ce fait, cette enzyme est une des cibles principales dans la recherche de traitements contre le SIDA. On a maintenant trouvé qu'il était possible d'isoler un groupe de sulfolipides de type procaryote et de type eucaryote à partir d'un extrait de spiruline cultivée en présence de linoléate d'ammonium, d'oléate d'ammonium ou de palmitate d'ammonium, lesdits sulfolipides ayant une activité améliorée comme inhibiteurs de la transcriptase inverse des virus VIH-1 et VIH-2. Chez les cyanobactéries en général, et la spiruline en particulier, la distribution typique des acides gras sur le squelette du glycérol des lipides (galactolipides, phospholipides et sulfolipides) correspond aux acides gras en C18 et en C16 estérifiés sur les carbones 1 et 2 respectivement. Cette distribution caractérise les espèces moléculaires C18/C16 et C16/C16 dites "procaryotes", plus ou moins insaturées. Dans la suite de la description, on entend par sulfolipides de type 10 procaryote (ou sulfolipides procaryotes ) les sulfolipides de formule (I) (I) dans laquelle R1 est un reste d'acide gras insaturé en C18 ou un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 et R2 est un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 et par sulfolipides de type eucaryote (ou sulfolipides eucaryotes ) les sulfolipides de formule ci- dessus dans laquelle R1 et R2 sont des acides gras insaturés en C18, identiques ou différents. Par reste d'acide gras saturé , on entend une chaîne hydrocarbonée ne 20 comprenant pas de double liaison. Par reste d'acide gras insaturé , on entend une chaîne hydrocarbonée comportant une ou plusieurs doubles liaisons, de préférence 1, 2 ou 3 doubles liaisons. Un procédé de culture mixotrophique de spiruline pour la production d'une 25 biomasse riche en acides gras polyinsaturés w6 et/ou en sulfolipides est décrit dans la demande FR 2 768 744. De manière surprenante, on a en maintenant trouvé que la supplémentation du milieu de culture des spirulines en linoléate d'ammonium, oléate d'ammonium ou OR1 palmitate d'ammonium entraînait une modification de la composition des sulfolipides totaux et l'augmentation des sulfolipides de type eucaryote et de type procaryote, tels que définis ci-dessus, et de ce fait une augmentation de l'activité inhibitrice des sulfolipides extraits de spirulines cultivées en milieu supplémenté vis-à-vis de la transcriptase inverse des virus VIH-1 et VIH-2. L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un nouveau procédé de culture de spirulines dans lequel le milieu de culture est supplémenté en acides gras exogènes sous forme de linoléate, d'oléate ou de palmitate d'ammonium de manière à augmenter sélectivement certaines espèces moléculaires de sulfolipides. On utilisera de préférence l'oléate ou le palmitate d'ammonium. Cette biomasse est utilisée pour extraire les lipides. Puis, on sépare les classes de lipides pour récolter les sulfolipides totaux. Ceux-ci sont ensuite séparés en les différentes espèces moléculaires de sulfolipides. L'invention concerne également lesdits sulfolipides, les compositions les contenant, leur utilisation en tant qu'agents inhibiteurs de la transcriptase inverse des virus VIH-1 et VIH-2, ainsi que leur utilisation pour la préparation d'un médicament pour le traitement du SIDA. Les spirulines ont été découvertes et sont utilisées comme complément alimentaire pour l'homme depuis plusieurs siècles. Ce sont des microalgues bleues-vertes ayant une valeur nutritionnelle particulière chez les enfants malnutris. Riches en composés d'intérêt nutritionnel et biomédical tels que acides aminés essentiels, vitamines (A, B12, E) ou acides gras polyinsaturés essentiels, elles se développent principalement dans les eaux sodées d'un certain nombre de lacs tropicaux, en zone aride. Ces micro-algues appartiennent au Phylum Cyanophyta, classe: Cyanophyceae, ordre: Nostoca/es, famille: Oscillator/aceae, genre: Spiru/ina ou Arthrospira. Il en existe différentes espèces, notamment les espèces platensis et maxima (Bourrelly P. 1970. Les algues bleues ou cyanophycées, dans Les Algues d'eau 30 douce , Tome III, Editions N. Boubée). Le procédé de culture selon l'invention s'applique à toutes les souches de spirulines existantes, notamment à celles décrites dans les publications citées plus haut. La souche utilisée peut, par exemple, être choisie parmi les souches suivantes: - Spirulina platensis PCC 8005 (Institut Pasteur, Paris); - Spirulina maxima et Spirulina texcoco (Société Texcoco, Mexique) ; 5 - Spirulina crater (Laboratoire La Roquette, France). Les spirulines poussent assez bien dans les milieux de culture supplémentés en linoléate d'ammonium. Elles absorbent l'acide linoléique exogène sous forme de linoléate d'ammonium pour synthétiser l'acide ylinolénique dans leurs lipides comme les monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), le digalactosyldiacylglycérol (DGDG), le sulfoquinovosyldiacylglycérol (SQDG) et le phosphatidylglycérol (PG). On a maintenant trouvé que des conditions de culture particulières, utilisant en tant que supplément l'oléate ou le palmitate d'ammonium dans des conditions de température et d'éclairement optimisées, permettaient d'obtenir une biomasse de spirulines particulièrement riche en sulfolipides inhibiteurs de la transcriptase inverse de VIH-1 et VIH-2. La biomasse de spirulines peut être produite en bassin ou en photobioréacteur stérile. Les bassins et photobioréacteurs appropriés pour ce type de culture sont bien connus de l'homme du métier. L'invention concerne donc, selon un aspect préféré, un procédé de culture mixotrophique de spirulines pour la production d'une biomasse riche en sulfolipides inhibiteurs de la transcriptase inverse de VIH-1 et VIH-2., ledit procédé comprenant au moins une étape de culture de spirulines en présence de linoléate d'ammonium, d'oléate d'ammonium ou de palmitate d'ammonium. De préférence, ledit procédé comprend au moins une étape de culture de spirulines en présence d'oléate d'ammonium ou de palmitate d'ammonium. De préférence, la concentration en linoléate d'ammonium, en oléate d'ammonium ou en palmitate d'ammonium ajoutée dans le milieu est comprise entre 35 et 75 pM/I. Avantageusement, la température pendant l'étape de culture en présence d'oléate d'ammonium ou de palmitate d'ammonium est de 20 C à 30 C. De préférence, l'éclairement pendant ladite étape est compris entre 100 et 125pE/m2/s avec un cycle d'éclairement alterné par 24 h de 8 à 12 h de lumière blanche et 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence 12 h de lumière blanche et 12 h dans l'obscurité. Des conditions de culture particulièrement avantageuses pour la production d'une biomasse de spirulines riche en sulfolipides inhibiteurs de la transcriptase 5 inverse de VIH-1 et VIH-2 consistant à : - faire barboter 25 à 60 I d'air enrichi à 1% (en volume) CO2/1 de milieu/h; - maintenir le pH du milieu de culture pendant la croissance entre 8,5 et 10,5, de préférence de 9 à 10, pour éviter les contaminations par d'autres microorganismes qui ne peuvent pas se développer dans un milieu très basique; - maintenir les concentrations minimales en ions bicarbonate, phosphate et nitrate, adaptées aux besoins de la souche de spiruline au cours de la croissance. Selon un aspect avantageux, ledit procédé comprend les étapes consistant à: - supplémenter le milieu en oléate d'ammonium ou en palmitate d'ammonium sous éclairement de 75 à 100 pE/m2/s, selon un cycle d'éclairement alterné par 24 h d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence à raison d'environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, en maintenant la température à environ 30 C, pendant 48 h, - puis maintenir un éclairement de 100 à 125 pE/m2/s à 24 C pendant 48 à 72 h, selon un cycle d'éclairement alterné par 24 h d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence à raison d'environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, - puis maintenir un éclairement de 100 à 125 pE/m2/s à 22 C pendant 72 à 96 h, ledit éclairement pouvant être maintenu jusqu'à 168 h (soit 7 jours) à 20 C, selon un cycle d'éclairement alterné par 24 h d'environ 8 à 12 h de lumière blanche et environ 16 à 12 h dans l'obscurité, de préférence à raison d'environ 12 h de lumière blanche et environ 12 h dans l'obscurité, éventuellement avec un barbotage d'air enrichi à 1% de CO2 à un débit de 251/1 de culture/h pendant 24 à 48 h après la supplémentation en oléate d'ammonium ou en palmitate d'ammonium, puis de 40-60 I /1 de culture/h pendant 48 à 96h. L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, une biomasse de spirulines riche en sulfolipides, contenant au moins 40% en poids de sulfolipides par rapport aux lipides totaux, lesdits sulfolipides ayant une activité inhibitrice de la transcriptase inverse de VIH-1 et VIH-2. De préférence, lesdits sulfolipides répondent à la formule (I) cidessous: HO3S /OH HO OR1 (I) dans laquelle R1 est un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 ou un reste d'acide gras saturé en C18 et R2 est un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 ou un reste d'acide gras saturé en C18. Des sulfolipides préférés sont ceux de formule (I) dans laquelle R1 est un reste d'acide gras insaturé en C18 ou un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 et R2 est un reste d'acide gras saturé ou insaturé en C16 (sulfolipides procaryotes). Parmi ceux-ci, des sulfolipides avantageux sont ceux de formule (I) dans laquelle: - R1 est un radical oléoyl et R2 est un radical palmitoyl, ou R1 est un radical linoléoyl et R2 est un radical palmitoyl, ou - R1 est un radical palmitoyl et R2 est un radical palmitoyl, ou - R1 est un radical y-linolénoyl et R2 est un radical palmitoyl, ou - R1 est un radical y-linolénoyl et R2 est un radical palmitoléoyl, ou - R1 est un radical palmitoléoyl et R2 est un radical palmitoyl. D'autres sulfolipides avantageux sont ceux de formule (I) dans laquelle R1 est un reste d'acide gras insaturé en C18 et R2 est un reste d'acide gras insaturé en C18, identiques ou différents (sulfolipides eucaryotes). Parmi ceux-ci, des sulfolipides avantageux sont ceux de formule (I) dans 25 laquelle: - R1 est un radical oléoyl et R2 est un radical linoléoyl, ou - R1 est un radical linoléoyl et R2 est un radical oléoyl, ou - R1 est un radical linoléoyl et R2 est un radical linoléoyl, ou - RI est un radical oléoyl et R2 est un radical oléoyl. Avantageusement, lesdits sulfolipides sont isolés à partir de la biomasse de spiruline riche en sulfolipides décrite plus haut, par des étapes d'extraction, de séparation et de purification des différentes espèces moléculaires de sulfolipides, et représentent un aspect ultérieur de l'invention. L'extraction des composés lipidiques peut par exemple être réalisée à l'aide de solvants tels que le méthanol et le chloroforme. La séparation peut être effectuée selon des techniques connues de l'homme du métier telles que la chromatographie sur couche mince ou la chromatographie liquide à haute performance. La séparation de différentes espèces moléculaires de sulfolipides est effectuée de préférence par chromatographie liquide à haute performance. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les sulfolipides de formule (I) tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation desdits sulfolipides, ou d'un extrait de biomasse de spiruline riche en sulfolipides telle que définie ci-dessus en tant qu'agents inhibiteurs de la transcriptase inverse de VIH-1 ou de VIH-2. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits sulfolipides en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ainsi que l'utilisation desdits sulfolipides ou d'un extrait de biomasse de spiruline riche en sulfolipides pour la préparation d'un médicament pour le traitement prophylactique ou curatif du SIDA. L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ciaprès. EXEMPLE 1: Culture de la spiruline en présence d'acides gras exogènes 25 (linoléate-, oléate- ou palimitate d'ammonium) pour obtenir la biomasse riche en sulfolipides La souche utilisée est Spirulina platensis PC 8005 (Institut Pasteur, Paris, France). 1.1. Procédé de culture de spiruline riche en sulfolipides en photobioréacteur en présence de linoléate d'ammonium On utilise le procédé de culture mixotrophique décrit dans le brevet FR 2 768 744 publié le 26 mars 1999. Cette biomasse est utilisée pour extraire des lipides. Puis, on sépare les classes de lipides pour récolter les sulfolipides totaux. Les sulfolipides totaux sont ensuite séparés en les différentes espèces moléculaires de sulfolipides purifiées qui seront utilisées dans la détection de l'activité anti-VIH. 1.2. Procédé de culture de spiruline riche en sulfolipides en photobioréacteur en présence d'oléate ou de palmitate d'ammonium a) Multiplication de Spirulina platensis La multiplication de souches est réalisée comme décrit dans l'exemple 3.1 du brevet FR 2 767 744. b) La préparation de 5 I de culture dans le ter photobioréacteur de 7 I est réalisée par les étapes citées dans l'exemple 3.2) a) de FR 2 768 744. c) On prélève 4 I de culture du ter photobioréacteur en recomplétant 4 I de milieu neuf stérile Zarrouk (dont la composition est donnée dans FR 2 768 744) dans ce photobioréacteur pour continuer à préparer une autre culture. Ensuite, on transfère stérilement 4 I de cette culture comme inoculum vers le second photobioréacteur de 7 I en supplémentant en oléate d'ammonium à concentration 35-75 pM d'oléate ou de palmitate d'ammonium/I pendant 5-7 jours, dans les conditions de culture suivantes: c.1) la première étape comprend 2 phases successives: - Phase 1: la culture est maintenue à 30 C sous éclairement de 75 à 100 pE/m2/s pendant 48 h. Simultanément, le cycle d'éclairement par 24 h doit être réglé à environ 8-12 h de lumière blanche / 16-12 h dans l'obscurité. En outre, le barbotage d'air enrichi en 1% de CO2 doit être abaissé et maintenu au débit de 25-35 1/1 de culture/h pendant 24 à 48 h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100-150 tours/min. - Phase 2: la culture est placée à 24 C sous éclairement plus fort de 100 à 125 pE/m2/s pendant 48 h. Le cycle d'éclairement par 24 h est d'environ 8-12 h de lumière blanche / 16-12 h dans l'obscurité. Le barbotage d'air enrichi en 1% de CO2 est augmenté et maintenu à 40-50 I/I de culture/h pendant 48-72 h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100-150 tours/min. c.2) Dans la seconde étape, la température de culture est abaissée à 2022 C, sous éclairement de 100-125 pE/m2/s. Le cycle d'éclairement par 24 h est d'environ 12 h de lumière blanche / 12 h dans l'obscurité pendant 72-96 h avant de récolter la biomasse. Le pH est d'environ 9-10,5 pour optimiser la synthèse de sulfolipide dans les cellules des spirulines. La culture est aérée par un mélange d'air enrichi en 1% de CO2 au débit de 50-60 I/I de culture/h. La vitesse d'agitation est maintenue à environ 100-150 tours/min. La durée de la seconde étape peut varier selon la souche cultivée et le type de photobioréacteur utilisé. d) la biomasse riche en sulfolipides est récoltée par le procédé de récolte ci-après: La culture de spirulines est maintenue dans les décanteurs à 20-24 C pendant 24-48 h pour éliminer le surnageant sous éclairement de 30-50 pE/m2/s. La biomasse précipite au fond des décanteurs et est récoltée par filtration ou centrifugation à 5000 tours/min pendant 15 min et ensuite rincée avec une solution de NaCl à 10 g/I à 24 C. Puis, la biomasse est récoltée par une nouvelle centrifugation à 5000 tours/min pendant 15 min et ensuite rincée 3 fois avec de l'eau distillée ou déminéralisée à 20-24 C avant lyophilisation ou atomisation. e) Résultats: La proportion de lipides totaux des spirulines cultivées selon le procédé de l'invention est d'environ 6,7-7,2% du poids sec. Le rendement de culture atteint de 1,6 à 2,1 g de poids sec/I. L'augmentation de la concentration cellulaire initiale permet de réduire la durée de culture tout en augmentant le rendement de production (de 2,2 à 2,6 g/I). e.1) Composition lipidique des spirulines cultivées en présence d'oléate, linoléate ou palmitate d'ammonium (% en poids). La proportion en sulfolipides obtenue est d'environ 38-41,5% des lipides totaux comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Culture MGDG1 DGDG2 PG3 SQDG4 Contrôles 31-33 15,7-17,3 24,8-26,2 24,8-26, 6 + oléate 34-35 10-10,8 13-13,5 40-41,5 + linoléate 33,8-34,9 9,8-10,8 11-11,3 40,9-43,0 + palmitate 40,0-43,5 8,5-9,3 10-11 38,0-39,7 1: monogalactosyldiacylglycérol 2: digalactosyldiacylglycérol 5 3: phosphatidylglycérol 4: sulfoquinovosyldiacylglycérol s: sans additif Les résultats montrent que la proportion de sulfolipides sous forme de sulfoquinovosyldiacylglycérol est significativement augmentée lorsque le milieu de culture est supplémenté en oléate, linoléate ou palmitate d'ammonium. e.2) Composition des acides gras totaux et composition des acides gras dans les sulfolipides chez S. platensis PC 8005 cultivée, soit sans additif, soit en présence d'oléate, de linoléate ou de palmitate d'ammonium (tableaux 2 et 3). Les sulfolipides répondent à la formule ci-dessous HO3S dans laquelle R1 et R2 ont les valeurs suivantes: R1 R2 y C18:3 (y -linolénoyl) C16:0 (palmitoyl) C18:2 (linoléoyl) C16:0 (palmitoyl) C18:1 (oléoyl) C16:0 (palmitoyl) C16:1 (palmitoléoyl) C16:0 (palmitoyl) OR1 Les formules de ces valeurs de R1 et R2 sont les suivantes: palmitoyl O CH3 C16:0 palmitoléoyl 0 C16:1 CH3 oléoyl 0 C18:1 CH 3 linoléoyl 0 C18:2 CH 3 y- linolénoyl 0 yC18:3 CH3 Tableau 2 Composition en acides gras totaux (% en poids)* Culture 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 y18:3 Rapport C16/C18 contrôle 50,2 1, 2 1,3 10,5 16,0 20,8 51,4/48,6 + oléate 34,7 1,2 1,0 20,1 18,0 25,0 35,9/64,1 + linoléate 35,2 1,7 3,2 7,4 25,6 26,9 36,9/63,1 + palmitate 55,4 1,9 1,6 3,7 12,8 24,6 57,3/42,7 * erreur standard 0,3 Les résultats montrent que la supplémentation du milieu en oléate d'ammonium et en linoléate d'ammonium entraîne une augmentation significative des acides gras totaux en C18 et une diminution des acides gras totaux en C16. La supplémentation en palmitate d'ammonium entraîne une légère augmentation (6%) des acides gras totaux en C16 et une diminution des acides gras totaux en C18. Tableau 3 Composition en acides gras des sulfolipides (% en poids)* Culture 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 y18:3 Rapport C16/C18 contrôle 55,8 1, 0 1,0 11,1 27,0 4,1 56,8/43,2 + oléate 45,2 1,5 0,5 18,6 29,0 5,2 46,7/53,3 + linoléate 44,6 1,0 0,6 10,5 37,9 6,4 45,6/54,4 + palmitate 58,9 1,9 1,0 9,0 25,5 4,7 60,8/39,2 *erreur standard 0,4 Les résultats montrent que la supplémentation du milieu en oléate d'ammonium et en linoléate d'ammonium entraîne une augmentation significative des acides gras en C18 et une diminution des acides gras en C16 dans les sulfolipides. La supplémentation en palmitate d'ammonium a l'effet inverse. Ceci montre qu'en présence d'oléate ou de linoléate d'ammonium, la spiruline utilise ces acides gras exogènes pour synthétiser préférentiellement des sulfolipides eucaryotes (C18/C18) alors que en présence de palmitate d'ammonium, la synthèse des sulfolipides procaryotes (C16/C16) est augmentée. EXEMPLE 2: Extraction, séparation et purification des espèces moléculaires de sulfolipides 2.1. Extraction et séparation des classes de lipides par CCM chromatoÉra. hie en couche mince ou CLHP chromatoÉra.hie li.uide à haute 20 performance) 2.1.1. Extraction Les lipides sont extraits selon la méthode de Bligh et Dyer (1959) à l'aide de méthanol et de chloroforme (5). La phase chloroformique est prélevée, mise à sec sous azote, puis reprise dans un volume de chloroforme ou de benzène/éthanol (4:1, v/v). 2.1.2. Séparation a) Par CCM: L'extrait de lipides totaux est déposé sous azote sur une plaque de gel de silice d'épaisseur 0,25 mm (Silicagel G60, Merck). La migration unidimensionnelle s'effectue dans une cuve fermée hermétiquement contenant un mélange chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau bidistillée (50:20:10:10:5, v/v) (6). Les spots sont révélés par pulvérisation d'eau distillée avec les témoins lipidiques révélés par pulvérisation d'une solution de primuline (10 mg/ 10 ml d'acétone à 80% dans l'eau) en observant sous UV. Les spots sont collectés et récupérés dans les tubes contenant un mélange de chloroforme/méthanol/eau (2; 1:0,5, v/v). Les échantillons sont placés à -20 C pendant 24 h, puis la fraction lipidique (phase chloroformique) dans chaque tube est récoltée et évaporée à sec sous vide sur un évaporateur rotatif ou sous azote. Enfin, les classes lipidiques sont remises dans un volume connu de chloroforme pour analyser les espèces moléculaires. b) Par CLHP: L'extrait lipidique, filtré à travers une membrane Millipore (0,5 pm de diamètre), est évaporé à sec sous azote, puis dissous dans 100 pl de chloroforme. La séparation des catégories lipidiques s'effectue sur la chaîne CLHP Waters (Milford, Ma, USA) avec une colonne de silice Parasil 10 pm 300 x 7,8 mm selon Demandre et al. (7, 8), l'extrait lipidique est d'abord élué pendant 2 min par un solvant A comprenant un mélange d'isopropanol et d'hexane (4:3, v/v). Les lipides sont ensuite élués pendant 20 min par un mélange de deux solvants suivant un gradient linéaire qui débute à 100% de solvant A pour finir à 100% de solvant B comprenant isopropanol/hexane/H2O (8:6:1,5, v/v/v). La colonne est enfin éluée pendant 20 min avec le solvant B dont le débit est de 2 ml/min. Les lipides détectés à 205 nm sont collectés. Leur identification s'effectue par chromatographie en couche mince selon la méthode Lepage (6) grâce à l'utilisation de témoins (MGDG, DGDG, SQDG et PG) et de réactifs spécifiques dont l'a-naphtol et l'acide sulfurique pour les galactolipides, réactifs de Zinzadze pour les phospholipides (9). Les classes lipidiques peuvent être remises dans l'éthanol pour les expériences avec VIH. 2.1.3. Dosage des acides gras et des lipides: Les spots lipidiques sur plaque de gel de silice sont grattés afin de méthyler leurs acides gras. La méthylation des acides gras de l'extrait lipidique total ou de ceux des classes lipidiques séparées par CCM se fait en présence d'un standard interne C17:0 (acide heptadécanoïque). Puis 3 ml de méthanol sulfurique (97,5:2,5 v/v) sont ajoutés à l'échantillon (10). Après 40 min à 75 C et en tube fermé, l'échantillon est immédiatement refroidi et les esters méthyliques sont extraits par 2 ml d'hexane et 1 ml d'eau bidistillée. L'analyse des esters méthyliques s'effectue sur CPG Hewlett Packard. La 10 quantité de chaque acide gras est calculée par comparaison avec le standard interne C17:0. 2.2. Séparation des différentes espèces moléculaires de sulfolipides par CLHP 2.2.1. Séparation des espèces moléculaires de sulfolipides par CLHP Le sulfolipide obtenue par CCM ou CLHP est séparé en espèces moléculaires sur une colonne en phase inverse. On utilise comme phase stationnaire, soit la phase ODS 5 pm (en colonne de 4,6 x 250 mm, Altex ou Spherisorb) éluée par un solvant de composition suivante: méthanol/ acétonitrile/ H20 (90,5:2,5:4; v/v/v) additionné de chlorure de choline 20 mM, soit la 10 pm de Bondapak C18 (en colonne de 3,9 x 300 mm, Waters) éluée par un solvant constitué par un mélange de méthanol/acétonitrile/H20 (90,5:2,5:7; v/v/v) additionné de chlorure de choline 20 mM. Le débit de solvant est de 1,5 ml/min. Les espèces moléculaires de sulfolipide sont séparées et détectées simultanément en masse à 205 nm. L'analyse des acides gras des espèces moléculaires de sulfolipide par CPG permet l'identification et la quantification de celles-ci (7). 2.2.2. Identification des espèces moléculaires de sulfolipides procaryotes et eucaryotes L'identification des espèces moléculaires de sulfolipides est réalisée par l'analyse de la position des acides gras sur le glycérol des molécules de sulfolipides. Les sulfolipides séparés par CCM ou CLHP sont grattés et mouillés par l'eau bidistillée. Puis des sulfolipides sont extraits trois fois avec un mélange méthanol/chloroforme (1:2; v/v) et une fois avec du méthanol pur. L'extrait de sulfolipide est mis à sec sous azote. La méthode utilisée est celle de Fischer et al. (1973) (14) : 20 ml de Triton X-100 (100 mg de Triton X-100 dans 2 ml de chloroforme) et 100 pl de chloroforme sont ajoutés à l'échantillon mis à sec. Ensuite, 1 ml de tampon Tris-HCI 0,04 M (pH =7,5) et 20 pl de lipase Al de Rhizopus arrhizus (50 000 U/ml, Boehringer) sont introduits dans le tube contenant l'échantillon remis à sec. Après une agitation vigoureuse au vortex de 1 à 2 min, les tubes sont mis à incuber pendant 30-60 min pour l'analyse des sulfolipides et phospholipides (20-30 min pour les galactolipides) dans un bain-marie à 30 C légèrement agité. La lipase Al hydrolyse exclusivement la fonction ester portée en position 1 du glycérol. La réaction est arrêtée dans la glace par addition de 15 pl d'acide acétique 1,8 N ou isopropanol. Le solvant est évaporé sous azote et l'échantillon hydrolysé est additionné de 3 ml de chloroforme/méthanol (1:1; v/v). Après une agitation vigoureuse, l'échantillon hydrolysé est centrifugé à 400 g pendant 10 min et le surnageant est repris pour analyse par CCM. Lesurnageant contient les produits hydrolysés par la lipase Al (acides gras libres et 2-acyl-lyso SQDG) qui sont séparés sur couche mince de silice (Silicagel G60, Merck) avec le solvant Lepage (6) comprenant un mélange chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/H2O (50:20:10:10:5, v/v/v/v/v). On utilise comme solvant un mélange chloroforme méthanol/acide acétique/H2O (65:35:4:4 en volumes) pour les dérivés de sulfolipides. Après migration, les acides gras libres venant de la position 1 du glycérol et les 2-acyl-lyso SQDG révélés avec une solution de primuline sont grattés et analysés par chromatographie en phase gazeuse après méthylation en présence de méthylate de sodium (0,2 ml) à 1% et de méthanol chlorhydrique 1,1 N (0,2 ml) (ou de méthanol sulfurique (97,5:2,5)). 2.3. Purification des espèces moléculaires de sulfolipides procaryotes (C18/C16) et eucaryotes (C18/C18) On peut utiliser une cartouche Seppaks silice pour séparer les lipides neutres, les galactolipides,les phospholipides et les sulflolipides. Les lipides neutres sont enlevés par le chloroforme, tandis que les galactolipides et phospholipides sont séparés par la suite respectivement avec un mélange chlorure de méthylène /méthanol (93:7; v/v) et du méthanol. Après avoir utilisé ce système de solvants, les sulfolipides sont dilués dans la fraction de phospholipides (méthanol). Puis les sulfolipides sont séparés à partir de la fraction de phospholipides (fraction de méthanol) par CLHP en phase normale avec une colonne MAXISIL 5 pm SI (150 X 10 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). La phase mobile est un mélange d'heptane-isopropanol-0,001M KCI (40:52:8; v/v/v) à un débit de 1,5 ml/min. Les pics de sulfolipides sont trouvés par détection à 208 nm (après 25 min de dilution). Enfin, la colonne est lavée par l'isopropanol 100% et rééquilibrée à 100% d'heptane après chaque opération (15). Les résultats sont rapportés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 Composition des espèces moléculaires de sulfolipides (% en poids de sulfolipides totaux) Espèces moléculaires culture procaryotes eucaryotes contrôle + oléate + linoléate + palmitate C18/C16 C18/C18 yC18:3/C16:1 1,0 1,0 1,0 1,0 yC18:3/C18:2 nd* nd nd C18:2/C18:2 nd nd 1,3 nd yC18:3/C16:0 0,8 1,5 2,3 1,0 C18:2/C18:1 nd 5, 6 4,3 nd C18:1/C18:2 nd 3,4 3,2 nd C18:1/C18:1 nd t ** nd nd C18:2/C16:0 76,9 76,4 79,7 73,2 C18:1/C16:0 5,5 10,1 5,6 4,1 C16:0/C16:0 15,8 2,0 2,6 20,0 C16:1/C16:0 nd nd nd 0,7 Rapport C18/C16 totaux/ 100 / 0 91 / 9,0 91,2 / 9,8 100 / 0 C18/C18 totaux * non détermin ** traces Les résultats montrent que la composition des espèces moléculaires de sulfolipides diffère suivant la supplémentation du milieu. En effet, dans le rapport C18/C16 totaux/C18/C18 totaux, la proportion de sulfolipides en C18/C16 (procaryotes) diminue et la proportion de sulfolipides en C18/C18 (eucaryotes) augmente de manière significative lorsque le milieu de culture est supplémenté en oléate d'ammonium ou en linoléate d'ammonium. EXEMPLE 3: Inhibition de la transcriptase inverse des virus VIH-1 et 5 VIH-2 par les espèces moléculaires de sulfolipides de la spiruline 3.1. Méthode de test 3.1.1. Enzymes Les transcriptases inverses utilisées dans cette étude sont les enzymes recombinantes exprimées dans E. Coli et purifiées à partir des extraits bactériens (16)). Le plasmide de l'expression VIH-1 transcriptase inverse provient de l'isolation provirale BH-10 (17)), tandis que le plasmide de l'expression VIH-2 transcriptase inverse provient de l'isolation pRod (18). Les transcriptases inverses VIH-1 et VIH-2 sont les hétéro-dimères p.66/p.51 et p.68/p.55 respectivement. 3.1.2. Tests enzymatiques Les abréviations utilisées sont les suivantes: dTTP: désoxythymidine triphosphates dATP: désoxyadénosine triphosphates dGTP: désoxyguanosine triphosphates dCTP: désoxycytosine triphosphates dNTPs: désoxynucléoside triphosphates. Les tests enzymatiques sont réalisés par la méthode de Loya et al.(19)). L'activité d'ADN-polymérase est mesurée par le contrôle de l'incorporation de poly (rA)n.oligo (dT)12_18 dans [3H] dTTP au produit insoluble dans l'acide trichloroacétique (TCA) en présence de différentes concentrations de sulfolipides. L'activité de la RNaseH est mesurée par la mesure de la délivrance du produit soluble dans le TCA à partir du substrat synthétique [3H]poly(rA)n.poly (dT)n. Ce substrat est préparé selon la procédure de Hizi et al. (1991) (20). Dans toutes les expériences d'inhibition, les enzymes sont préincubées pendant 5 min à 30 C en l'absence ou en présence d'inhibiteurs à différentes concentrations. Les réactions enzymatiques sont commencées par l'addition de substrat approprié à 37 C pendant 30 min. L'activité enzymatique résiduelle est calculée par rapport aux vitesses initiales de la réaction (linéaire) observée dans le cas d'absence de sulfolipides. La concentration d'inhibiteurs menant à 50% d'inhibition des activités enzymatiques (IC50) est calculée par les courbes d'inhibition en fonction de la concentration en inhibiteur (sulfolipides). Les activités enzymatiques sont définies comme ci-après: (a) une unité d'activité de l'ADN polymérase est la quantité d'enzyme qui catalyse l'incorporation d'un pmol de dNTP au produit d'ADN à 37 C pendant 30 min dans des conditions d'essai standard. (b) une unité d'activité de RNase-H est la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse d'un pmol d'AMP à 37 C pendant 30 min dans des conditions d'essai standard. 3.2. Résultats Les résultats sont rapportés dans les tableaux 5, 6 et 7 ci-dessous. 15 Tableau 5 Effet des sulfolipides totaux sur la transcriptase inverse de VIH-1 Sulfolipides totaux Concentrations de Activité enzymatique sulfolipides (pg/ml) résiduelle (%) contrôle 332 374,7 ( 4,7) 10 + 2 + oléate 215 267,7 ( 5,0) 10 2 + linoléate 291,5 342,2 ( 4,8) 10 2 + palmitate 347,5 393,0 ( 4,7) 10 + 2 Les résultats montrent que les sulfolipides totaux de la spiruline cultivée en présence d'oléate ou en linoléate d'ammonium présentent une activité inhibitrice de la transcriptase inverse de VIH-1 significativement supérieure à celle du contrôle. En effet, la transcriptase inverse de VIH-1 est inhibée à 90% à des doses inférieures à savoir 215 et 291,5 pg/ml pour les sulfolipides totaux extraits de spiruline cultivée en présence d'oléate ou en linoléate d'ammonium alors que la dose est de 332 pg/ml pour la spiruline cultivée en milieu non supplémenté. Ce phénomène peut être expliqué par la modification la composition des sulfolipides totaux due à la supplémentation du milieu, à savoir l'augmentation des sulfolipides procaryotes (C18/C16) et l'apparition des sulfolipides eucaryotes (C18/C18). Tableau 6 Inhibition de l'ADN polymérase et de la RNase-H de la transcriptase inverse de VIH-1 par les espèces moléculaires de sulfolipides Espèces ADNpolymérase (a) RNase-H (b) moléculaires % d'activité enzymatique initiale (c) IC50 IC90 pg/ml pg/ml - Procaryotes: C18:1/C16:0 23,9 3,8 73,6 2,8 64 6 C18:2/C16:0 75,4 2,9 281,4 4,8 100 -yC18:3/C16:0 178,0 12,4 533,1 13,0 100 C16:0/C16:0 106,1 12,0 451, 8 12,5 47 4 Eucaryotes: C18:2/C18:2 279,0 + 24,6 840,1 22,7 100 C18:2/C18:1 250,9 17,7 752,8 19,7 100 C18:1/C18:2 209,4 19,7 628,3 24,6 100 (a) IC50 et IC90: Concentrations des inhibiteurs (sulfolipides) inhibant respectivement 50% et 90% d'activité enzymatique initiale. Les concentrations d'inhibition sont exprimées par pg/ml. (b) L'activité de RNase-H est mesurée en présence des inhibiteurs avec une concentration de 100 pM de chaque espèce moléculaire de sulfolipide. (c) L'activité enzymatique résiduelle est calculée par le pourcentage du contrôle en l'absence des inhibiteurs. Les résultats montrent que les espèces moléculaires procaryotes ont une activité inhibitrice de l'ADN-polymérase de la transcriptase inverse de VIH-1 supérieure à celle des espèces eucaryotes, les activités les plus importantes étant celles des espèces C18:1/C16:0 et C18:2/C16:0. En ce qui concerne l'inhibition de la RNase-H de la transcriptase inverse de VIH-1, les activités les plus importantes sont celles des espèces procaryotes 5 C18:1/C16:0 et C16:0/C16:0. Tableau 7 Effet des espèces moléculaires de sulfolipides sur l'activité ADN polymérase de la 10 transcriptase inverse de VIH-2 Espèces moléculaires Concentrations de Activité enzymatique sulfolipides (pg/ml) résiduelle (%) C18:1/C16:0 4,8 0,9 100 1 9,6 0,9 93 2 19,1 0,9 74 2 33,5 2,0 50 1 38,3 1,8 42 2 76,5 2,0 24 2 C18:2/C16:0 9,5 0,9 100 1 23,8 0,9 96 2 47,7 1,8 70 2 95,4 2,0 56 2 105,0 5,0 50 1 190,8 4,8 25 2 Les résultats montrent que les espèces moléculaires de sulfolipides C18:1/C16:0 et C18:2/C16:0 présentent également une activité inhibitrice de 15 l'activité ADN polymérase de la transcriptase inverse de VIH-2. REFERENCES (1) GAMBACORTA A. et al., 1995, Phytochemistry, 39, 771-774 (2) GORDON D. et al., 1992, J. Am.Chem. Soc., 114, 659-663 (3) GUSTAFSON K.R et al., 1989, J. Nat. Cancer Inst. MD, vol. 81, 16, 1254-1258 (4) LOYA S., et al., 1998, J. Nat. Prod., 61, 891-895 (5) BLOCH E.G et ai., 1959, Can. J. Biochem. 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Chem., 1991, 266, 6230-6239 REVENDICATIONS ORi 1. Sulfolipides procaryotes de formule (I) : HO3S (I) dans laquelle: - Ri est un radical ?(linolénoyl et R2 est un radical palmitoyl, ou - Ri est un radical 'y-linolénoyl et R2 est un radical palmitoléoyl. 2. Sulfolipides eucaryotes de formule (I) : H03S (I) dans laquelle: - Ri est un radical oléoyl et R2 est un radical linoléoyl, ou - Ri est un radical linoléoyl et R2 est un radical oléoyl, ou - Ri est un radical linoléoyl et R2 est un radical linoléoyl, ou - Ri est un radical oléoyl et R2 est un radical oléoyl. 3. Utilisation des sulfolipides selon l'une des revendications 1 ou 2 pour la préparation de médicaments utiles pour inhiber la transcriptase inverse de VIH-1 ou de VIH-2. 4. Compositions pharmaceutiques contenant les sulfolipides selon l'une des revendications 1 ou 2 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. ORi 5. Utilisation des sulfolipides selon l'une des revendications 1 ou 2 pour la préparation d'un médicament pour le traitement prophylactique ou curatif du SIDA.