Brevet FR2863616A1 — publié le 20050617

DOSAGE DE LA PROTEINE S LIBRE NON CLIVEE PAR LE FACTEUR Xa. UTILISATION DE CE DOSAGE POUR L'EVALUATION DU POTENTIEL DE COAGULATION. L'invention est relative au dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, intervenant dans la physiologie de la coagulation et notamment dans l'enchaînement des réactions enzymatiques conduisant à la coagulation du sang. L'invention concerne en particulier l'utilisation de ce dosage pour évaluer le potentiel de coagulation chez un patient. L'invention a notamment pour objet des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, utilisables pour réaliser le dosage ci-dessus, ces anticorps reconnaissant la Protéine S non clivée par le facteur Xa. La coagulation est un phénomène complexe comprenant une cascade de réactions in vivo, faisant intervenir différentes molécules, comprenant des constituants de nature protéique ainsi que des ions tels que l'ion calcium mais aussi des cellules, notamment celles de la paroi vasculaire, ainsi que les plaquettes. Parmi les constituants protéiques de la cascade de la coagulation, on distingue les protéines plasmatiques qui comprennent les facteurs de coagulation et les inhibiteurs de coagulation, ainsi qu'une protéine tissulaire, appelée encore facteur tissulaire, étroitement associée aux phospholipides des membranes cellulaires. Les facteurs de coagulation sont activés au cours du processus de coagulation et sont pour la plupart, synthétisés notamment dans les hépatocytes. Parmi ces facteurs, dont il sera fait mention dans le cadre de la présente invention, on citera le facteur Xa. Les autres protéines plasmatiques, inhibiteurs physiologiques de la coagulation, comprennent un grand nombre de protéines parmi lesquelles, appartenant à une famille particulière, la protéine appelée protéine C, ou plus exactement le système de la protéine C, qui comprend en réalité deux protéines plasmatiques vitamines K-dépendantes, les protéines C et S ainsi qu'une protéine membranaire, la thrombomoduline. La protéine C est un zymogène d'une sérine protéase, bicaténaire. La protéine S, appartenant à la même famille est une protéine monocaténaire qui porte un domaine Gla suivi de quatre domaines EGF puis d'une région carboxy-terminale étendue. Après avoir été synthétisée dans les hépatocytes, la protéine C et la protéine S sont sécrétées dans le plasma après carboxylation de résidus Glu en position amino-terminale. La protéine S renferme environ 7% d'hydrates de carbone et se trouve à une concentration plasmatique d'environ 25 mg/I. Les protéines C activées et S jouent un rôle essentiel dans les troubles de la coagulation, comme on l'a mis en évidence dans les maladies thromboemboliques dont souffrent les patients présentant un déficit de l'une de ces deux protéines (Comp P.C., et al: Recurrent venous thromboembolism in patients with partial deficiency of protein S.N. Engl. J. Med. 311, 1525-1528, 1984; Schwartz H., et al, Familial protein S deficiency is asociated with recurrent thrombosis. Blood 64, 1297-1300, 1984; Koster T. et al, Protein C deficiency in a controlled series of unselected outpatients: an infrequent but clear risk factor for venous thrombosis (Leiden thrombophilia study). Blood 85, 2756-2761, 1995; Gladson C.L. et al, The frequency of type I heterozygous protein S and protein C deficiency in 141 unrelated young patients with venous thrombosis. Thromb. Haemost. 59, 18-22, 1988; Pabinger I., et ai, Hereditary deficiency of antithrombin III, protein C and protein S: prevalence in patients with a history of venous thrombosis and criteria for rational patient screening. Blood Coag. Fibrinol., 3, 547-553, 1992; Pabinger I, et al: The risk of thromboembolism in asymptomatic patients with protein C and protein S deficiency: a prospective cohort study. Thromb. Haemost., 71, 441-445, 1994; Girolami A., et al, Severe arterial cerebral thrombosis in patient with protein S deficiency (moderately reduced total and markedly reduced free protein S): a family study. Thromb. Haemost. 61, 144-147, 1989; Aliaart C., et al, Hereditary protein S deficiency in young adult with arterial occlusive disease. Thromb. Haemost. 64, 206-210, 1990). Lorsque la protéine C est activée par la thrombine liée à la thrombomoduline, cette dernière constituant un récepteur membranaire des cellules endothéliales est capable, en présence de la protéine S jouant le rôle de cofacteur, d'inactiver les facteurs de coagulation Va et Vllla, ce dont il résulte une limitation de la génération de thrombine. La protéine S a été caractérisée et une séquence d'ADNc codant pour cette protéine a été obtenue à partir de l'ARNm isolé (Lundwall et al, Isolation and sequence of the cDNA for human protein S, a regulator of blood coagulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6716-6720, 1986) L'ADNc obtenu contient 3344 pb et code pour un polypeptide s'étendant de l'acide aminé en position -15 appartenant à la séquence Leader jusqu'à l'acide aminé 635. En outre, cet ADNc contient une région 3' non codante, de 1148 pb. Deux séquences potentielles de polyadénylation ont été identifiées dans cette région non codante, l'une en position 3274 et l'autre en position 3309. L'ADN génomique codant pour la protéine S (PS) humaine est transcrit en un ARNm majoritaire de 4 kb, représentant environ 0,01 % des ARNm hépatiques totaux (Hoskins et al, Cloning and characterization of human liver cDNA encoding a protein S precursor. Proc. Nat!. Acad. Sci. 84: 349-353, 1987). La protéine S est donc une glycoprotéine, qui peut être purifiée à partir du plasma humain, caractérisée pour la première fois par Di Scipio et al (A comparison of human prothrombin, factor IX (Christmas factor), factor X (Stuart factor), and protein S. Biochemistry 16: 698-706, 1977). La protéine S monocaténaire a un poids moléculaire d'environ 75 kDa et une concentration plasmatique de 350 nM (25 mg/1) dans un plasma normal. Sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et en conditions réductrices, la protéine S plasmatique migre sous la forme d'un doublet suggérant qu'une fraction de cette protéine circule sous forme bicaténaire (Dahlbâck, B. Purification of human vitamin K-depenent protein S and its limited proteolysis by thrombin. Biochem. J. 209: 837- 846, 1983b). Une observation plus poussée montre que la protéine S, synthétisée dans plusieurs types cellulaires incluant les cellules hépatiques, endothéliales, les cellules de Leydig, et les plaquettes, est en premier lieu obtenue sous la forme d'un précurseur de 676 acides aminés, qui est ensuite clivé pour donner lieu à une protéine mature de 635 acides aminés et à un pré-propeptide de 41 acides aminés. Une fois clivée de son peptide signal, la protéine S subit des modifications post- traductionnelles avant d'être sécrétée dans la circulation. Ces modifications comportent notamment la N-glycosylation au niveau des résidus Asn458, Asn468 et Asn489 ainsi qu'une gamma-carboxylation des 11 résidus Glu N-terminaux en acides y -carboxy-glutamiques (Gla) et une 13- hydroxylation. La protéine mature ainsi obtenue comporte différents domaines, représentés à la figure 1, parmi lesquels on citera pour les besoins de la présente demande, le domaine de la boucle sensible à la thrombine (BST) codée par l'exon IV du gène PRO-SI (Ploos van Amstel et al. A mutation in the protein S pseudogene is linked to protein S deficiency in a thrombophilic family. Thromb. Haemost. 62, 897-901, 1989) de la protéine S. La boucle sensible à la thrombine, codée par l'exon IV du gène PRO-SI est constituée par les acides aminés 46 à 74 de la protéine et comporte deux résidus cystéine (en positions 47 et 72) liés entre eux par un pont disulfure. La structure secondaire et la structure tridimensionnelle ont été étudiées pour la boucle BST et une modélisation moléculaire de la BST a été réalisée (Villoutreix et al, A theoretical model for the Gla-TSR-EGF-1 region of the anticoagulant cofactor protein S: from biostructural pathology to species-specific cofactor activity. J. Comput. Aided Mol Des. 11: 293-304, 1997a). Il a par ailleurs été démontré que la protéine S circule dans le plasma sous quatre formes soit d'une part les formes libre ou liée à une protéine du système du complément, la C-4b-BP, d'autre part les formes intacte ou clivée dans le plasma. Le clivage de la protéine S a été examiné, montrant qu'il peut s'effectuer différemment in vivo et in vitro. Au niveau de la boucle BST, on observe in vitro un clivage par la thrombine (ou Facteur Ila) au niveau des sites potentiels marqués par les acides aminés 49 et 70 et par ailleurs un clivage par le facteur Xa en un site Arg60, ce dernier requérant la présence de calcium et de phospholipides. ln vivo des observations montrent que la protéine S clivée résulterait au moins en partie du clivage par le facteur Xa alors que le clivage par la thrombine ne peut pas se produire. On ne peut toutefois pas exclure le rôle d'autres enzymes dans le clivage observé in vivo. La protéine S liée (sous forme clivée ou intacte) est liée à une protéine du complément, la C4b-binding protein (ou C4b-BP) qui est une protéine de haute masse moléculaire (530 à 570 kDa) identifiée par Dahlbâck et al 1983 (Degradation of human complement component C4b in the presence of the C4b-binding protein-protein S complex. Biochem. J. 209: 857-863). L'interaction de la protéine S avec la C4b-BP ferait intervenir différentes régions d'un domaine dit SHBG ( sex hormone binding globulin ) codé par les exons IX à XV du gène PROS1 de la protéine S. Les quatre formes de la protéine S sont représentées à la figure 2, étant entendu que le clivage illustré est celui qui ferait intervenir le facteur Xa de la cascade de la coagulation. Les quatre formes plasmatiques de la protéine S se répartissent selon les proportions suivantes: 62 % de protéine S liée parmi lesquelles 53 % de protéine S liée, non clivée, et 9 % de protéine S liée et clivée, et par ailleurs 38 % de protéine S libre, dont 6 % de protéine S libre, clivée (inactive) et 32 % de protéine libre, non clivée (active). Ces valeurs ont été déterminées par Griffin et al (Reevaluation of total, free and bound protein S and C4b- binding protein levels in plasma anticoagulated with citrate or hirudin. Blood. 79: 3203-3211, 1992). Compte tenu de l'activité de la protéine S libre et intacte (non clivée), lorsqu'elle est cofacteur de la protéine C dans une activité anticoagulante, et de l'abolition de cette fonction anticoagulante après clivage de la protéine S par le facteur Xa généré au cours de l'activation de la coagulation, il est apparu intéressant d'envisager la détection et le dosage spécifiques de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa. Ainsi, l'invention a pour objet des moyens permettant de réaliser ce dosage, moyens qui permettraient avantageusement d'évaluer le potentiel anti-coagulant de patients souffrant de désordres de la coagulation. En particulier, les moyens de détection et de dosage de la protéine S libre et intacte peuvent être utilisés dans le cadre de la réalisation d'un diagnostic des troubles de la coagulation dans un échantillon biologique, notamment de plasma, prélevé chez un patient. La présente demande de brevet a donc pour objet des moyens pour le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, ainsi que l'utilisation de ces moyens pour la réalisation de kits de détection et de dosage, ainsi que dans des procédés de détection et de dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, en vue notamment d'une utilisation dans des protocoles de diagnostic. La protéine S libre non clivée par le facteur Xa sera aussi appelée dans la suite du texte protéine S libre non clivée pour notamment tenir compte de l'intervention éventuelle d'autres facteurs dans le clivage in vivo. Les moyens définis pour permettre le dosage de la protéine S libre non clivée sont en premier lieu des anticorps ayant une spécificité antigénique pour la protéine S non clivée par le facteur Xa. Une deuxième catégorie d'anticorps est mise en oeuvre pour réaliser le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa: il s'agit d'anticorps ayant une capacité à reconnaître la protéine S libre. Pour la réalisation de l'invention, les anticorps définis ci-dessus capables de reconnaître la protéine S plasmatique libre (première catégorie d'anticorps) et par ailleurs les anticorps capables de reconnaître la protéine S non clivée par le facteur Xa (deuxième catégorie d'anticorps), sont en outre caractérisés par le fait que les épitopes reconnus par chacune de ces deux catégories d'anticorps sont différents sur la protéine S. La spécificité de reconnaissance des anticorps reconnaissant la protéine S non clivée par le facteur Xa, peut en outre être caractérisée par le fait que ces anticorps ne reconnaissent ni la protéine S plasmatique libre clivée, ni les formes liées de la protéine S plasmatique clivée. Dans le cadre de l'invention, les anticorps sont donc mis en oeuvre pour leur spécificité de reconnaissance vis à vis de l'un ou l'autre des antigènes ci-dessus distingués. L'invention a pour objet des anticorps ayant une spécificité antigénique pour la protéine S non clivée par le facteur Xa, en tant que tels, obtenus spécifiquement contre cette protéine, c'est à dire contre un épitope qui ne se trouve pas être reconnu par des anticorps préparés contre la protéine S libre. La spécificité de la reconnaissance peut être évaluée par un test immunologique de compétition entre les différentes formes de la protéine S, étant entendu que les anticorps de l'invention réagissent dans un tel test de manière significativement plus forte avec la protéine S non clivée par le facteur Xa qu'avec les autres formes de cette protéine S. Un support plastique, par exemple une plaque micro ELISA, est mise en contact pendant une nuit avec la protéine S purifiée non clivée et avec la protéine S clivée par le facteur Xa pour réaliser le coating de la plaque. Les différents anticorps à tester sont déposés ensuite sur la plaque. Selon leur spécificité, les anticorps se fixent ou non sur le coating. Les anticorps fixés sont révélés à l'aide des anticorps polyclonaux anti-anticorps à tester et ils sont couplés à l'enzyme par exemple la peroxydase, la phosphatase alcaline ou l'acéthylcholinésterase. L'enzyme liée est visualisée par son activité sur le substrat spécifique par exemple ortho-phénilènediamine (O.P.D.) ou tétraméthylbenzidine (TMB) pour la peroxydase. L'anticorps de l'invention résulte de la coloration avec la protéine S non clivée par le facteur Xa et ne produit pas de réaction vis-à-vis de la protéine S clivée par le facteur Xa. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les anticorps sont des anticorps monoclonaux. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les anticorps sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent le peptide CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC (C26C) ou le peptide CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY (peptide Y29C). La présence du résidu Y facilite le couplage du peptide sur les protéines porteuses (telle KLH) utilisées pour l'immunisation. Des anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés par différentes méthodes incluant l'immunisation d'un animal, en particulier d'un mammifère, pour déclencher une réaction de son système immunitaire contre l'antigène administré constitué par la protéine S purifiée, non clivée ou par exemple par l'un des peptides ci-dessus identifiés. A partir des cellules productrices d'anticorps de l'animal immunisé on réalise une fusion cellulaire avec des cellules notamment des cellules immortalisées, pour obtenir des hybridomes permettant la production des anticorps par des lignées cellulaires en culture. D'autres techniques que celle de la production des hybridomes selon Kohler & Milstein (Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 1975, 256: 495-497) sont également disponibles pour produire des anticorps, telles que celle des hybridomes obtenus avec des cellules B humaines (Cote et al, 1983, PNAS 80: 20262030) ou la technique des hybridomes-EBV (Cole et al, 1985, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Dans le cadre de la présente invention, on a en particulier obtenu des anticorps de type IgM sécrétés par des hybridomes préparés avec des splénocytes de souris immunisées, fusionnés avec des cellules de myélome. L'invention concerne également des anticorps dont la spécificité antigénique est celle précisée précédemment, qui appartiennent à d'autres isotypes et en particulier des IgG. Le cas échéant, les IgG peuvent être dérivés des IgM selon des techniques connus notamment de switch class . Un anticorps monoclonal préféré selon l'invention est l'anticorps S2P11B6, sécrété par l'hybridome déposé à l'ATCC sous le n PTA-5425 le 27 Août 2003. Un protocole de préparation de cet anticorps S2P11B6 est décrit dans la partie expérimentale qui suit, y compris la purification de l'anticorps. Les anticorps selon l'invention peuvent également être obtenus par d'autres techniques, telles que par l'expression dans des cellules hôtes transformées avec des séquences d'ADN codant pour les anticorps de spécificité recherchée. Les anticorps anti-protéine S non clivée selon l'invention peuvent aussi être polyclonaux, par exemple préparés chez le lapin ou la poule. L'invention concerne également des fragments des anticorps définis dans le cadre de l'invention, en particulier des fragments fonctionnels, ayant conservé la spécificité antigénique des anticorps de l'invention, par exemple des fragments Fab, Fab', F(ab')2 ou des sous-fragments de ces derniers, tels que des fragments contenant tout ou partie des domaines CDR responsables de la spécificité antigénique, suffisants pour lier spécifiquement l'antigène PS non clivé par le facteur Xa. Les fragments des anticorps peuvent être préparés par digestion enzymatique, par exemple, avec la pepsine ou la papaïne avec du mercaptoéthanol, ou encore par expression de leurs séquences codantes dans des hôtes cellulaires ou par synthèse chimique. L'invention concerne aussi des anticorps ou des fragments d'anticorps chimères obtenus à partir de précédents et dont on a par exemple amélioré les propriétés pour une utilisation dans un immunoessai. L'invention a aussi pour objet un réactif pour le dosage de la protéine S plasmatique libre non clivée par le facteur Xa, comprenant des anticorps répondant à la définition donnée ci-dessus, ou leurs fragments fonctionnels ci-dessus définis, lesdits anticorps ou leurs fragments étant préparés pour être utilisés dans des tests immunologiques tels que les tests ELISA (anticorps sous forme d'immunoconjugués), la détection en immunochromatographie, la détection par l'aggrégation des particulies de latex associées aux anticorps 2863616 io spécifiques, ou des tests de détection microfluidique ou par des tests réalisés avec des microbilles recouvertes par les anticorps. Par exemple, les anticorps ou leurs fragments fonctionnels peuvent être conjugués avec la peroxydase ou avec la phosphatase alcaline, ou l'or colloïdal. Un protocole pour la réalisation des immunoconjugué est décrit dans la partie expérimentale. Un réactif ainsi constitué est de préférence tel que la concentration d'immunoconjugués en solution permet d'éviter les risques d'agrégation et est par exemple inférieur ou égal à 1 mg/ml. La présente invention a également pour objet une trousse de dosage de la protéine S plasmatique libre non clivée par le facteur Xa, comprenant: des anticorps ayant une spécificité antigénique pour la protéine S non clivée par le facteur Xa tels que définis précédemment, ou leurs fragments fonctionnels, ou un réactif tel que défini ci-dessus, - des anticorps reconnaissant la protéine S libre ou leurs fragments reconnaissant la protéine S libre. Les anticorps reconnaissant la protéine S libre sont utilisés en particulier lorsque la trousse permet le dosage immunologique, par exemple par un test fondé sur l'agrégation de microparticules de latex ou par un test ELISA. Les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels peuvent dans ce cas être utilisés pour sensibiliser un support plastique ou des particules de latex. Les anticorps ou leurs fragments fonctionnels peuvent également être couplés avec une enzyme par exemple la peroxydase, la phosphatase alcaline ou l'acétylcholinestérase. De tels anticorps sont par exemple ceux produits par la société STAGO et commercialisés sous les noms 15C4 et 34G2 (commercialisés dans les kits ASSERACHROM TOTAL PROTEIN S et ASSERACHROM FREE PROTEINS, de DIAGNOSTICA STAGO). Les deux anticorps monoclonaux reconnaissent la protéine S libre non liée à la C4b- BP, c'est à dire la protéine S fonctionnelle en tant que cofacteur de la protéine C activée. L'anticorps 15C4 est IgG1 kappa et l'anticorps 34G2 est IgG2b kappa. La trousse de dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa peut en outre contenir un réactif pour l'étalonnage du dosage, et/ou un réactif pour établir le contrôle de qualité du dosage. Le réactif d'étalonnage du dosage peut être un plasma humain lyophilisé contenant une quantité connue de protéine S libre non clivée proche de 100% après reconstitution et dilution (par rapport à un étalon secondaire du Standard International 93/590 de 1995). Le réactif de contrôle qualité du dosage peut être un plasma humain lyophilisé contenant une quantité connue de protéine S libre non clivée. Ce taux est déterminé par rapport à un étalon secondaire du Standard International 93/590 de 1995. Avantageusement, la trousse de dosage ainsi définie comprend en outre un tampon de dilution pour l'immunoconjugué, par exemple un tampon EDTA. La trousse de dosage contient également le cas échéant, des instructions pour procéder au dosage de la protéine S libre non clivée. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'anticorps tels que définis précédemment, ou leurs fragments fonctionnels pour le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon de plasma sanguin. Ce dosage inclut la réalisation d'un immunoessai, par exemple un essai de type radio-immunoessai (RIA) ou un essai de type ELISA. L'invention concerne également un procédé de dosage de la protéine S libre, non clivée par le facteur Xa dans un échantillon de plasma sanguin, caractérisé en ce que l'on réalise un test ELISA au moyen d'une part, d'anticorps spécifiques pour la protéine S non clivée par le facteur Xa ci-dessus définis ou de fragments fonctionnels de ces anticorps, utilisés de préférence sous la forme d'un immunoconjugué, ou au moyen d'un réactif ci-dessus défini, et d'autre part d'anticorps reconnaissant la protéine S libre ou de fragments d'anticorps reconnaissant la protéine S libre, utilisés pour le coating des plaques ELISA. L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine S plasmatique, non clivée par le facteur Xa comprenant: - l'immunisation d'un animal choisi par les mammifères, avec un antigène choisi parmi la protéine S, purifiée non clivée, un peptide ayant la séquence CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC ou la séquence CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY ou un de ces peptides couplé à une molécule porteuse, l'antigène étant avantageusement associé à un adjuvant de l'immunisation, la fusion de splénocytes de l'animal immunisé avec des cellules immortalisées, par exemple des cellules de myélome compatibles pour la fusion, - la sélection des hybridomes produits par les cellules fusionnées, pour leur capacité à sécréter des anticoprs capables de reconnaître la protéine S non clivée par le facteur Xa et/ou les peptides utilisés pour l'étape d'immunisation et pour leur capacité à ne pas reconnaître la protéine S clivée par le facteur Xa, - la récupération des anticorps sélectionnés. Un tel procédé permet la production des anticorps monoclonaux soit sous forme d'ascites ou encore in vitro. Si nécessaire, les anticorps ainsi produits sont purifiés par les techniques connues. Un protocole de purification des anticorps, est notamment décrit dans la partie expérimentale qui suit. Ces anticorps appartiennent par exemple à la classe des IgM. L'invention concerne par ailleurs une méthode de détection du potentiel anticoagulant d'un patient comprenant le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa dans un échantillon de plasma prélevé chez le patient, au moyen d'anticorps ci-dessus définis, de leurs fragments fonctionnels, ou d'un réactif ci-dessus défini. La détection réalisée dans le cadre de l'invention est par exemple intéressante dans le cadre de la détection de thromboses, notamment de thromboses veineuses, ou d'embolie pulmonaire, ou plus généralement d'un risque thromboembilique qui serait lié à un déficit en protéine S. Cette méthode est telle qu'elle comporte avantageusement pour la détection, la réalisation d'un test immunologique, par exemple ELISA. L'utilisation des anticorps selon l'invention permet ainsi la détection et la quantification de la protéine S, non clivée par le facteur Xa, dans un échantillon biologique et notamment dans un échantillon de plasma sanguin. D'autres moyens et avantages de l'invention apparaîtront dans les figures ou dans les exemples qui suivent. Figure 1: Corrélation entre l'organisation du gène PROS 1 et les domaines structuraux de la PS. Figure 2: Concentration plasmatique moyenne des différentes formes moléculaires de protéine S en s'appuyant sur les valeurs déterminées par Griffin et al (1992) et en considérant le taux de PS clivée à 15%. Figure 3 (a et b) : Reconnaissance de la PS clivée et non clivée par deux systèmes de dosage. Figure 4: Inhibition du dosage de la PS libre non clivée par le Xa par la C4b-BP. Figure 5: Comparaison de deux dosages de la PS non clivée plasmatique: 15C4 ou 34G2 en coating et S2P11 C6 en conjugué. 1. PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX SPECIFIQUES PAR FUSION CELLULAIRE 1.1. Antigènes pour immunisation des souris La protéine S entière purifiée et les séquences peptidiques situées autour du site de clivage de la protéine S par le facteur Xa ont été choisis comme antigènes pour l'immunisation. Dans un premier temps, 3 peptides ont été synthétisés: - Peptide G13Y: GLFTAARQSTNAY - Peptide C26C: CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC - Peptide Y29 C: CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY Le peptide G13Y a été couplé à la protéine porteuse, la KLH. Le peptide C26C, étant assez long (26 acides aminés), a été utilisé tel que. Dans un deuxième temps, le peptide Y29C a été synthétisé. Ce peptide contient le peptide C26C et 3 acides aminés de la séquence physiologique de plus, afin de permettre le couplage à la KLH. Il a été utilisé seul ou couplé à la KLH par l'intermédiaire soit de BDM soit de bromoacétyl. 1.2. Immunisation des souris Deux stratégies d'immunisation ont été appliquées: Immunisation de courte durée (2 à 4 semaines), principalement avec adjuvant ImmunEasy (QUIAGEN). Cet adjuvant, développé récemment, contient les oligonucléotides avec les résidus cytosine/guanidine non méthylés. Le système immunitaire chez les mammifères reconnaît ces séquences, qui se trouvent dans l'ADN bactérien. La réponse est très rapide et forte. Seulement 2 ou 3 injections en l'espace de deux ou trois semaines suffisent. De plus, il est moinstoxique que les adjuvants classiques . Immunisation de longue durée (5-6 mois au minimum) avec les adjuvants classiques de Freund: complet et incomplet. Pour les deux stratégies, la dernière immunisation est effectuée 4 jours avant la fusion. 1.3 Préparation de la protéine S libre clivée par le facteur Xa La protéine S libre clivée par le facteur Xa a été préparée afin de tester la spécificité antigénique des anticorps produits. Pour préparer la protéine S clivée, la protéine S purifiée ou recombinante (concentration finale 300 nM) a été protéolysée par le facteur Xa purifié (concentration finale 6 nM) en présence de calcium et des surfaces phospholipidiques (Long G.L., Lu D., Xie R-L, Kalafatis M.: Human protein S cleavage and inactivation by coagulation factor Xa. J. Biol. Chem. : 273, 11521-11526, 1998). Pour la réaction enzymatique de clivage, différentes surfaces phospholipidiques peuvent être utilisées, par exemple les phospholipides synthétiques comme phosphatidylserine et phospatidylcholine ou les substituts plaquettaires comme céphaline ou lécitine. Les préparations de la protéine S clivée par le facteur Xa effectuées étaient suffisantes pour tester la spécificité des différents anticorps produits au cours des fusions cellulaires. 1.4 Fusions cellulaires Les fusions cellulaires ont eu lieu entre les cellules du myélome murin NS1 (Flow Lab) et les splénocytes de souris immunisées (BALBIC). Après sélection des hybridomes en milieu HAT, les surnageants de culture ont été testés sur les plaques micro-ELISA sensibilisées avec l'un des antigènes suivants: La protéine S purifiée non clivée par le facteur Xa La protéine S purifiée clivée par le facteur Xa Les peptides synthétiques correspondants couplés ou non à la KLH - La KLH, en cas d'immunisation avec les peptides couplés à la KLH. Dans les surnageants sélectionnés, la détermination de l'isotype a été réalisée. Dix fusions cellulaires ont été effectuées: neuf après immunisation de courte durée et une après immunisation de longue durée. Les résultats de ces dix fusions sont présentés dans le tableau 1. o Les fusions effectuées ont permis d'obtenir quelques hybridomes sécrétant des anticorps de la spécificité recherchée et ayant une réactivité plus ou moins forte. (ces hybridomes ont été obtenus après immunisation avec la protéine S libre non clivée purifiée, peptide C26C et Y29C non couplés à la KLH et le peptide Y29C couplé à la KLH). o La sélection des hybridomes spécifiques a été effectuée par le test de réactivité des surnageants des cultures vis-à-vis de la protéine S clivée et de la protéine S non clivée par le facteur Xa. Les deux formes de la protéine S sont coatées sur une plaque micro ELISA pendant 1 nuit. Après le lavage par la solution de lavage, les surnageants de culture à tester dilués au 1/5 en tampon de dilution sont incubés pendant 2 heures avec les antigènes fixés sur la plaque micro ELISA. Après l'incubation les puits sont lavés et le conjugué anticorps de mouton-anti-anticorps des souris-peroxydase est déposé. Durant l'incubation, ce conjugué se fixe sur les anticorps liés aux antigènes correspondants. La révélation est réalisée par l'ajout du substrat de la peroxydase, TMB, après le nouveau lavage. La réaction est arrêtée par l'addition de l'acide sulfurique 1 M. La densité optique (DO) est mesurée à 450 nm. Pour les surnageants retenus la DO avec la protéine S non clivée par le facteur Xa a varié de 0,9 à 3,7 et avec la protéine S clivée par le facteur Xa elle était de l'ordre de 0,1 à 0,3. o Tous les hybridomes obtenus, spécifiques de la protéine S, non clivée par le facteur Xa, sont des IgM. Pour utiliser ces pentamères, de très haut poids moléculaire (environ 900 000 daltons) il faut prévenir l'agrégation éventuelles des molécules. o Un hybridome (S2P11B6) sécrétant des IgM et ayant une forte réactivité (Do>3,0) avec la protéine S non clivée par le Xa et très faible (0,1) avec la protéine S clivée par le facteur Xa a été retenu pour étudier la faisabilité du dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa. Tableau 1 Fusions cellulaires: PROTEINE S NON CLIVEE PAR LE FACTEUR Xa Date Immunogène Adjuvant Nombre Hybridomes Isotype Réactivité DO à 492 Données complémentaires, Injectio Retenus pour nm commentaires ns tests nombre, nom PS n.c. PS c. 24/04/2001 C26C-KLH ImmunEasy 3 Aucun 12/06/2001 Ps purifiée ImmunEasy 3 3: P4E10 IgG2a 0,9 3,2 PS c > PS n.c. P8G8 IgM 1,1 0,2 Reconnaissance G13Y, Q12C et P1 0B9 IgM 0,8 0,1 C26C, r. faible, PS n.c. > PS c. 03/07/2001 Q12C-KLH Incomplet Freund 3 3: P8G4 IgG, 3,6 3,7 PS c = PS n.c. ImmunEasy 1 P13E2 IgG1 3,7 3,7 PS c = PS n.c. P11F7 IgG, 0 0 Reconnaissance Q12 PS uniquement 09/10/2001 PS purifiée Incomplet Freund 5 Aucun ImmunEasy 2 20/11/2001 G13Y-KLH ImmunEasy 3 7 2IgG2a 0 0 Pas de reconnaissance de la PS 2 IgM Reconnaissance G13Y 1IgG3 1 IgG1/IgM 1 IgG2a/IgM 18/12/2001 PS purifiée ImmunEasy 5 Aucun 12/02/2002 C26C ImmunEasy 4 12 7 IgM 0 - Reconnaissance C26C 4 IgM >1,0 >0,2 r.moyenne, PS n.c.>PS c 1/g M: S2P11B >3,0 >0,1 r. forte, PS n.c. > PS c. 16/04/2002 Y29C-bromo-KLH ImmunEasy 2 1: P24E3 IgM >3,0 0,2 r. forte, PS n.c. r. faible, PS n.c. 28/05/2002 Y29C6BDB-KLH ImmunEasy 4 2: 8G3 IgM 1,4 0,4 r. faible, PS n.c. + Y29C 14G2 IgM 0,6 0,2 r. faible, PS n.c. 08/10/2002 Y29C Complet Freund 1 4 1 IgM 6G8 3,6 3,5 PS n.c. = PS c. Incomplet Freund 4 1 IgM 8F2 1,7 0,3 r.moyenne, PS n.c. > PS c. 2 IgM et 1,9 0,6 r. moyennne, PS n.c. > PS c. IgG2a* : 0,4 0,1 r. faible, PS n.c. R= réactivité IV PS c. = protéine S clivée par le facteur Xa PS n.c. = protéine S non clivée par le facteur Xa Co 0) * difficultés de séparer IgM et IgG2a W 0) 0) 2. Faisabilité du dosaqe de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa 2.1 Production des anticorps S2P11B6 Les anticorps S2P11B6 ont été produits: * En ascite Les anticorps monoclonaux anti-protéine S non clivée par le facteur Xa sont préparés par la technique habituelle d'induction d'ascites chez la souris Balb c. Pour cela, des souris, au préalable sensibilisées par injection intra-péritonéale de pristane, sont injectées par voie intra-péritonéale 1 mois plus tard avec 10' cellules d'hybridome par souris. Lorsque les tumeurs ascitiques se développent les liquides d'ascites sont ponctionnés. Les anticorps monoclonaux sont précipités par sulfate d'ammonium avant la purification. * in vitro sur Cell Line Parallèlement, les hybridomes sont mis en culture in vitro dans la chambre de culture basée sur la technologie membranaire: Cell Line (Integra Biosciences SARL, Cergy, France). Les cellules et le SVF sont injectés dans le compartiment cellulaire et le milieu RPMI 1640 dans l'autre compartiment. Les anticorps monoclonaux secrétés sont prélevés régulièrement du compartiment cellulaire. La quantité d'anticorps produits par ces deux méthodes, n'a pas été évaluée, en l'absence de test commercial pour quantifier les IgM dans le milieu non purifié. Après purification des IgM, la concentration peut être déterminée par la mesure de DO à 280 nm. 2.2 Faisabilité de purification d'anticorps S2P11B6 Deux types de gels ont été essayés pour purifier l'anticorps S2P11B6: * Thiosorb M (Bioprocessing Inc., Princeton, USA) * Et HiTraplgM (petite colonne prête à l'emploi). La purification d'ascite S2P11B6 sur Thiosorb M n'a pas donné de bons résultats. Les anticorps purifiés ont perdu leur réactivité. Cependant, le traitement au préalable de cette ascite par sulfate d'ammonium n'influence pas cette réactivité. II est possible que l'éthylène glycol utilisé pour l'élution ne convienne pas à cet anticorps. La purification d'ascite S2P11B6 sur le HiTrap IgM n'a pas été possible à cause de colmatage. En revanche, la purification des surnageants de Cell Line sur ce gel, n'a posé aucun problème. Cinq purifications ont été effectuées avec succès (tableau 3). Tableau 3 Rendement des purifications du surnageant S2P11B6 sur HiTrap IgM récolte de Cell Volume déposé Quantité Quantité Line sur colonne ml d'anticorps purifiés d'anticorps purifiés mg / l ml surnageant (mg/ml) 1 7,8 11,02 1,4 2 6,2 9,36 1,5 3 14 20,8 1,5 4 9 71,0 7,9 7,7 11 1,4 Les quantités suffisantes de l'anticorps S2P11B6 ont été obtenues. Le plus grand rendement de la production et purification coïncide probablement avec la densité maximale des cellules dans la Cell Line. 3 Faisabilité de fabrication du conjugué S2P11B6 L'anticorps S2P11B6 reconnaît la protéine S non clivée par le facteur Xa. La protéine S circule dans le plasma sous deux formes libre et liée à la C4b-BP. Le clivage de cette protéine par le facteur Xa concerne aussi bien la forme libre que la forme complexée. L'anticorps de l'invention reconnaît ces deux formes. Afin de doser la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, donc l'activité anticoagulante de la protéine S en tant que le cofacteur de la protéine C activée, il est nécessaire d'avoir l'anticorps spécifique de la protéine S libre. Les anticorps de Diagnostica Stago 15C4 et 3402 conviennent tout à fait pour cette réalisation. Pour le dosage de la protéine S libre en ELISA, il est préférable, d'effectuer le coating avec l'anticorps spécifique de la protéine S libre. De plus, les IgM peuvent poser un problème de clivage en F(ab')2. En revanche, le coating des molécules entières IgM augmente un risque des réactions non spécifiques. Pour cette raison, l'anticorps S2P11B6 a été choisi comme conjugué. Actuellement, il n'existe pas de protocole standard pour la fabrication du conjugué entre les IgM et la peroxydase. II a donc été nécessaire de mettre au point une méthode pour l'anticorps S2P11B6. Avant le couplage les anticorps IgM sont dialysés en tampon carbonate à pH 9,6. La peroxydase (Roche) est activée par m-périodate et dialysée en tampon acétate à pH 4.2. Les anticorps dialysés et la peroxydase activée sont incubés pendant 2 heures à température ambiante. Les groupements actifs résiduels sont bloqués par la solution de borohydride de sodium (Nakane, J. Histochem. Cytochem.: 22, 1084-1091, 1974). Le conjugué S2P11B6 peroxydase est précipité le sulfate d'ammonium saturé et centrifugé pendant 15 min à 4000 tours/min à température ambiante. Le culot contenant le conjugué est repris par le tampon phosphate 0.2 M contenant NaCI 0.015 M et MgCl2 0,02 M à pH et dialysé dans le même tampon. Les anticorps S2P11B6 agrégent rapidement à la concentration supérieure à 1 mg/ml et au frais (2-8 C). Le protocole donnant les résultats satisfaisants inclut donc l'utilisation de cet anticorps à la concentration inférieure à 1 mg/ml et la température ambiante durant toutes les manipulations. De plus, la reprise du culot par de l'eau distillée a conduit l'agrégation du conjugué. En revanche, la suspension du culot dans le tampon de dialyse contenant MgCl2 et NaCI a permis d'éviter l'agrégation. 2.4. Essais du dosage de protéine S libre non clivée par le facteur Xa Principe Le coating d'une plaque microELISA avec un des deux anticorps Diagnostica Stago anti-protéine S libre: 15C4 ou 34G2 assure la spécificité du dosage à l'égard de la protéine S libre. Les susdits anticorps sont coatés à 10 pg/mI dans le tampon carbonate 50 mM à pH9,6 durant une nuit. L'anticorps S2P11B6 utilisé pour le conjugué se fixera uniquement sur la protéine S libre non clivée par le facteur Xa. La figure 3 présente une comparaison de deux dosages 15C41S2P11B6* et 34G2/S2P11B6* vis-à-vis de la reconnaissance de protéine S purifiée clivée et non clivée par le facteur Xa. La spécificité de deux dosages est bonne. Il semblerait qu'elle soit un peu meilleure pour l'anticorps 15C4 en coating. La figure 4 montre une comparaison pour ces deux dosages à l'égard de la protéine S libre non complexée à la C4b-BP. Les essais confirment que la C4b-BP ajoutée, inhibe le dosage de la protéine S. Plus on surcharge un plasma normal en C4b-BP, moins l'on dose de la protéine S. Les deux dosages donnent des courbes d'inhibition parallèles. L'essai suivant a porté sur le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa dans le pool des plasmas normaux (Figure 5). L'anticorps 34 G2 en coating donne le signal un peu plus fort. Finalement, l'anticorps 15C4, utilisé actuellement en coating dans I'ASSERACHROM PS libre (ASSERACHROM FREE PROTEINS), a été retenu pour le coating. 3 DOSAGE DE LA PROTEINE S LIBRE ET DE LA PROTEINE S LIBRE NON CLIVEE A titre d'exemple, le tableau ci-dessous montre les résultats du dosage comparatif de la protéine S libre et de la protéine S libre intacte chez des sujets normaux (15 femmes et 15 hommes), 11 sujets ayant une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), 18 sujets avec insuffisance hépatocellulaire (IHC) et 20 femmes enceintes. Une coagulation intravasculaire disséminée est un syndrome anatomoclinique caractérisé par une diffusion anormale du processus de la coagulation qui doit normalement rester localisé. Une CIVD s'accompagne typiquement d'anomalies biologiques qui associent une diminution de la concentration plasmatique de plusieurs facteurs de coagulation, en particulier le fibrinogène, les facteurs II, V et VII ainsi que les plaquettes, et une augmentation du taux circulant des produits de dégradation de la fibrine (D-dimères). Ce syndrome biologique complexe porte le nom de coagulopathie de consommation. Il peut également se rencontrer à l'occasion d'une coagulation intravasculaire localisée importante. Chez les sujets normaux, le taux de la protéine S libre clivée n'est pas diminué par rapport au taux de la protéine S. Dans les autres groupes étudiés, la concentration de la protéine S clivée est plus faible que la concentration de la protéine S libre ce qui est dû à son clivage par le facteur Xa dans ces conditions physiopathologiques. Au vu de ces résultats, il apparaît que le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa pourrait constituer un meilleur reflet de l'activité que la protéine S libre et pourrait ainsi se substituer avantageusement au dosage de la protéine S libre. Taux de la protéine S (PS) libre et de la protéine S libre non clivée Echantillon PS libre % PS libre Non clivée % Femmes 89.0 19.1 89.7 19. 1 N=15 Hommes 96.1 17.4 102.4 22.8 N=15 CIVD 67.1 16.6 59.3 13.7 N=11 IHC 52.8 13.9 42.4 15.6 N = 18 Femmes enceintes N = 49.9 16. 2 45.5 16.3 REVENDICATIONS 1. Anticorps caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement la protéine S plasmatique non clivée par le facteur Xa. 2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont monoclonaux. 3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent le peptide CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC (C26C) ou le peptide CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY (Y29C). 4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils ne reconnaissent pas la protéine S plasmatique clivée par le facteur Xa. 5. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisés en ce qu'il s'agit d'IgM. 6. Anticorps monoclonal selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps S2P11B6 sécrété par l'hybridome déposé à l'ATCC sous le n PTA-5425. 7. Fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant le site de reconnaissance antigénique dudit anticorps. 8. Réactif pour le dosage de la protéine S plasmatique, non clivée par le facteur Xa, comprenant des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un fragment d'anticorps selon la revendication 7, sous la forme d'immunoconjugués. 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que les anticorps sont conjugués avec la peroxydase. 10. Réactif pour le dosage de la protéine S plasmatique libre, non clivée par le facteur Xa, comprenant des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un fragment d'anticorps selon la revendication 7 dans une présentation permettant la réalisation d'un dosage immunologique. 11.Trousse de dosage de la protéine S plasmatique libre non clivée par le facteur Xa comprenant: - des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un fragment d'anticorps selon la revendication 7, ou un réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, - des anticorps reconnaissant la protéine S libre ou leurs fragments reconnaissant la protéine S libre. 12. Utilisation d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, de fragments d'anticorps selon la revendication 7, ou un réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour le dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa, dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon de plasma sanguin. 13. Procédé de dosage de la protéine S libre non clivée par le facteur Xa dans un échantillon de plasma sanguin, caractérisé en ce que l'on réalise un test ELISA au moyen d'une part, d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 utilisés sous la forme d'un immunoconjugué ou de fragments d'anticorps selon la revendication 7, ou au moyen d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, et d'autre part d'anticorps reconnaissant la protéine S libre ou de leurs fragments reconnaissant la protéine S libre, utilisés pour le coating des plaques ELISA. 14. Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la protéine S plasmatique, non clivée par le facteur Xa comprenant: l'immunisation d'un animal choisi par les mammifères avec un antigène choisi parmi la protéine S, purifiée non clivée, un peptide ayant la séquence CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC (C26C) ou le peptide CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY (Y29C) ou un de ces peptides couplé à une molécule porteuse, l'antigène étant associé à un adjuvant, la fusion de splénocytes de l'animal immunisé avec des cellules immortalisées, par exemple des cellules de myélome, compatibles pour la fusion, la sélection des hybridomes produits par les cellules fusionnées, pour leur capacité à sécréter des anticorps capables de reconnaître la protéine S non clivée par le facteur Xa et/ou les peptides utilisés pour l'étape d'immunisation et pour leur capacité à ne pas reconnaître la protéine S clivée par le facteur Xa, la récupération des anticorps sélectionnés. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux sont produits en ascite. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux sont produits in vitro. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, comprenant une étape de purification des anticorps sélectionnés. 18. Méthode de détection du potentiel anticoagulant chez un patient comprenant le dosage de la protéine S non clivée par le facteur Xa dans un échantillon de plasma prélevé chez le patient, au moyen d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9. 19. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que la détection comporte la réalisation d'un test immunologique. 20. Méthode selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisée en ce que l'on recherche un déficit en protéine S libre non clivée par le facteur Xa. 21. Peptide caractérisé en ce que sa séquence d'acides aminés est la suivante CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSC (C26C) ou CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVLY (Y29C). 22. Utilisation d'un peptide selon la revendication 21, éventuellement associé à une protéine porteuse, pour la préparation d'anticorps.