Brevet FR2872430A1 — publié le 20060106

L'invention concerne un procédé pour inhiber l'effet probiotique des protéines alimentaires vis-à-vis de la microflore bactérienne de la cavité buccale des carnivores domestiques. L'invention consiste à inhiber cet effet par l'emploi de phosphates alimentaires hydrosolubles. La cavité buccale des chiens et des chats abrite une microflore bactérienne variée, se classant en microflore aérobie et microflore anaérobie. On trouve cette microflore sur les muqueuses buccales, sur les dents et dans la salive, cette dernière, par son état aqueux, étant le milieu de développement et aussi le véhicule de diffusion de la microflore. A la naissance, la cavité buccale de l'animal est stérile, mais elle est vite colonisée par les bactéries aérobies et anaérobies dès que le jeune animal absorbe des aliments. Non seulement ces aliments ne sont pas stériles, mais leurs protéines, diffusées dans la salive, ou restées résiduelles sur les muqueuses, sur et entre les dents, favorisent le développement de la microflore microbienne. On dit alors que ces protéines ont un effet probiotique vis-à-vis de la microflore (de pro, pour, et bios, vie, contrairement à antibiotique). Il est à noter que la salive, qui est produite stérilement par les glandes salivaires, n'aurait jamais pu être un milieu de développement et de diffusion de la microflore bactérienne sans la présence des protéines alimentaires. Malheureusement, chez les chiens et les chats, l'hygiène buccale est difficilement réalisable quotidiennement. Le rinçage de la bouche avec des désinfectants, le curetage et le brossage des dents avec du dentifrice après les repas, ne sont pas des pratiques courantes comme chez l'homme. D'un autre côté, les chiens et les chats sont de mieux en mieux nourris, souvent plusieurs fois par jour, soit avec des rations ménagères , soit avec des aliments du commerce qu'on appelle des petfoods . Ces derniers peuvent être des aliments secs, humides ou semi- humides, des snacks ou des friandises. Quelles que soient leur origine ou leur présentation, tous ces aliments apportent des protéines d'origine animale ou végétale, nécessaires certes à la nutrition des animaux, mais qui laissent des résidus favorables au développement de la microflore bactérienne buccale. Quand cette microflore bactérienne se développe de façon excessive dans la cavité buccale, l'animal hôte peut présenter de nombreux troubles bien connus des éleveurs et des vétérinaires, d'autant que les chiens et les chats ont des replis sur leurs gencives formant des poches gingivales : halitose (mauvaise haleine), gingivite (inflammation de la gencive), parodontite ou maladie périodontale (inflammation du parodonte, c'est-àdire de l'ensemble des tissus de support et d'attache des dents), pharyngite (inflammation de la muqueuse du pharynx) - etc... On peut traiter ces troubles par l'emploi d'agents antimicrobiens (Trevor Chin Quee, Trianthi Roussou and E.C.S. Chan, "In vitro activity of Rodogyl against putative periodontopathic bacteria", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 24, N 3, 1983, pp. 445-447; K.S. Kornman, B. Siegrist, W.A. Soskolne and K. Nuki, "The predominant cultivable subgingival flora of beagle dogs following ligature placement and metronidazole therapy", Journal of Periodontal Research, Vol. 16, 1981, pp. 251-258). Néanmoins, ces traitements avec des agents antimicrobiens sont souvent tardifs, car on ne leur fait appel que quand les troubles sont déjà bien visibles. Il est donc essentiel de trouver des moyens pour diminuer le développement excessif de la microflore bactérienne de la cavité buccale des chiens et des chats, avant qu'elle ne provoque des troubles pathologiques. La demanderesse a découvert de façon inattendue que des phosphates alimentaires sont capables d'inhiber l'effet probiotique des protéines alimentaires vis-à-vis de la microflore de la cavité buccale des carnivores domestiques. Il est essentiel que ces phosphates soient hydrosolubles pour être actifs dans la salive des animaux. Il est donc préférable d'employer des pyrophosphates ou des polyphosphates de sodium. L'apport de phosphate peut se faire seul, ou à travers un aliment, ou par toute préparation vétérinaire ou non. Dans tous les cas, l'homme du métier apportera le phosphate à utiliser en quantité suffisante pour qu'il se retrouve au moins au taux de 0.50% de la salive. Selon le brevet WO 93/25087 de l'Université de l'Indiana, les phosphates, et particulièrement l'hexamétaphosphate de sodium, ont déjà été employés comme agents séquestrants et dissolvants pour empêcher la formation de cristaux de calcium qui constituent le tartre dentaire des animaux domestiques. Cependant, cet art antérieur n'a nullement décrit l'effet inhibiteur des phosphates vis-à-vis de l'action probiotique des protéines alimentaires à l'égard de la microflore bactérienne de la cavité buccale. La présente invention concerne donc un procédé d'inhibition de l'effet probiotique des protéines alimentaires vis-à-vis de la microflore bactérienne buccale des animaux carnivores domestiques, ledit procédé consistant à administrer à l'animal carnivore domestique un inhibiteur d'effet probiotique, l'inhibiteur comprenant un phosphate alimentaire hydrosoluble. Selon la présente invention, l'inhibiteur peut être constitué par un seul 20 phosphate alimentaire hydrosoluble ou par un mélange de phosphates alimentaires hydrosolubles. Les phosphates alimentaires hydrosolubles sont bien connus de l'homme du métier, particulièrement ceux autorisés par la Directive 70/524/CEE, publiée au Journal 25 Officiel de l'Union Européenne du 25.2.2004. De manière préférentielle, le phosphate hydrosoluble est différent d'un hexamétaphosphate de sodium, avantageusement choisi parmi les pyrophosphates et les polyphosphates. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le phosphate alimentaire est employé en quantité telle qu'il se retrouve dissous à au moins 0,5% dans la salive des animaux. Selon l'invention, le phosphate alimentaire peut être administré seul aux animaux ou être apporté en mélange avec des aliments pour animaux carnivores domestiques. Les aliments sont choisis parmi les rations ménagères , ou les aliments 5 industriels secs, humides, semi-humides, snacks ou friandises. Selon l'invention, l'inhibiteur peut être ajouté aux aliments de manière extemporanée ou encore préalablement mélangé. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'inhibiteur de l'effet probiotique est administré aux animaux carnivores domestiques dans une préparation 10 vétérinaire ou non. Les exemples non exhaustifs et non limitatifs ci-après permettent d'illustrer l'invention. EXEMPLES. Pour toutes les expériences, la microflore bactérienne de la cavité buccale a été prélevée, conservée dans un milieu de conservation, puis cultivée dans de la salive artificielle selon le protocole suivant: Prélèvement de la microflore bactérienne et préparation de l 'inoculum. Deux chats mâles de race européenne , pesant environ 5.50 kg, ont été anesthésiés avec 0.3 ml de médétomidine en solution à 0.085 g/100ml (Domitor, ND) et 25 0.26 ml de kétamine en solution à 10 g/ 1000 ml (Imalgène 1000, ND). Chez chaque animal ainsi immobilisé, on aspire stérilement la salive avec une pipette et on gratte la base des dents, les gencives, et les poches gingivales avec le dos d'un scalpel stérile. L'ensemble des prélèvements est transféré et bien dilué dans 100 ml d'un milieu de conservation stérile (milieu au thiocolate à la résazurine de Biokar additionné de 25% de glycérol). Le milieu de conservation contenant les prélèvements est transféré dans des tubes à microbilles (Cryobilles, ND de AES). Ces tubes sont ensuite incubés pendant 6 heures à l'étuve à 37 C, en jarre sous CO2, avant d'être congelés pour servir ultérieurement. Lors de l'utilisation ultérieure, chaque tube est décongelé à la température ambiante, puis mis à incuber pendant 12 heures à 37 C, en jarre sous CO2. On dénombre les bactéries aérobies et anaérobies selon les méthodes décrites ci-après. On dilue ensuite le contenu de chaque tube avec le milieu de conservation stérile pour avoir un inoculum de 5000 (3.70 Log10) germes revivifiables dans 0,2 ml. Méthodes de dénombrement des bactéries. La microflore aérobie est cultivée puis dénombrée sur milieu trypticase soja (Biokar) incubé à 37 C pendant 48 heures. La microflore anaérobie est cultivée puis dénombrée sur milieu de Schaedler (Biokar) additionné de 5% de sang défibriné stérile de mouton, incubé à 37 C, sous CO2 en jarre, pendant 48 heures. Salive artificielle. La salive artificielle de base est préparée selon le tableau 31 de la page 244 de l'ouvrage Biological Hanbooks Metablism, compiled and edited by Philip L. Altman and Dorothy S. Dittmer, published by Federation of American Societies for Experimental Biology, 1968. Cette salive de base est additionnée de L-cystéine à raison de 0.5g/litre pour abaisser son potentiel redox afin de pouvoir y faire pousser à la fois la microflore bactérienne aérobie et la microflore bactérienne anaérobie. L'ensemble sera appelé par la suite salive artificielle . Expérimentation. On répartit la salive artificielle dans des tubes à essai à raison de 20 ml par tube. Chaque tube est additionné ou non de la protéine, en présence ou non du phosphate à tester. Chaque traitement est composé de deux tubes. L'ensemble est autoclavé à 110 C pendant 15 minutes. Chaque tube est ensuite ensemencé avec 0.2 ml d'inoculum décrit précédemment. L'ensemble est incubé à l'étuve à 37 C, sans agitation. Au bout de 24, ou 48 ou 72 heures d'incubation, on dénombre la flore aérobie et la flore anaérobie selon les méthodes décrites précédemment. Le résultat de chaque traitement est la moyenne des dénombrements de deux tubes d'essai exprimée en Log10 des C.F.U. (Colony Forming Units) par ml de salive 15 artificielle. Expérience 1. Les traitements ont été les incorporations d'une farine de viande de volaille déshydratée (protéine DSH, de la Société des Protéines Industrielles, 56230 Berric, France, titrant 70 % de matières azotées totales) à raison respectivement de 0, 0.5, 1.0 et 1.5% dans la salive artificielle. Le Tableau 1 montre que, en l'absence de la protéine, la microflore bactérienne aérobie et anaérobie ne pousse pas, ou très difficilement dans la salive artificielle seule. Mais dès que la protéine est présente, même au taux aussi bas que 0.5%, la microflore tant aérobie qu'anaérobie explose dès 24 heures d'incubation. Cette expérience montre clairement l'effet probiotique d'une protéine 30 alimentaire vis-à-vis de la microflore bactérienne buccale. Expérience 2. Dans cette expérience, on teste l'inhibition de l'effet probiotique d'un hydrolysat séché de protéine de volaille (protéine MP9007 de la Société des Protéines Industrielles titrant 72,5 % de matières azotées totales), incorporé au taux de 1% dans la salive artificielle, en présence du pyrophosphate trisodique aux taux de 5 ou 10%. Le Tableau 2 montre que l'effet probiotique de la protéine MP9007 est complètement inhibé par le pyrophosphate trisodique incorporé à 10%, tant pour la microflore aérobie que pour la microflore anaérobie. L'effet inhibiteur du pyrophosphate trisodique à 5%, bien que pas total, est aussi très important dès 24 heures d'incubation. Expérience 3. Dans cette expérience, on recommence à tester le pyrophosphate trisodique, mais incorporé seulement à 0.5%, vis-à-vis de l'effet probiotique de la protéine MP9007 incorporée au taux de 1% dans la salive artificielle. Fort de l'expérience précédente, on arrête l'essai après 24 heures d'incubation. Le Tableau 3 montre que le pyrophosphate trisodique incorporé à 0.5% diminue encore l'effet probiotique de la protéine MP9007, tant vis-à-vis de la microflore aérobie (7.75 versus 8.16 LoglO) que de la microflore anaérobie (7.75 versus 8.54 Log10). Expérience 4. L'essai consiste à tester l'effet inhibiteur du tripolyphosphate de sodium incorporé à 0, 0.5, 1, 1.5 et 2% vis-à-vis de l'effet probiotique de la protéine MP9007 incorporée à 1% dans la salive artificielle. Le Tableau 4 montre que le tripolyphosphate de sodium inhibe de façon importante l'effet probiotique de la protéine. Expérience 5. Dans cet essai, on teste l'effet inhibiteur du tripolyphosphate de sodium incorporé à 0, 0.5, 1, 1.5 et 2% vis-à-vis de l'effet probiotique d'un hydrolysat de soja déshydraté (Nurish 1500 IP, ND de Solea Company, titrant 83 % de matières azotées totales) incorporé à 1% dans la salive artificielle. Le Tableau 5 montre que le tripolyphosphate de sodium, quel que soit son taux d'incorporation, inhibe pratiquement tout l'effet probiotique de la protéine végétale utilisée. Tableau 1. EFFET PROBIOTIQUE DE LA PROTEINE DSH SUR LA MICROFLORE BUCCALE (C.F.U./ml, moyenne en Log10 de deux tubes par traitement Protéine DSH Microflore 0 heure 24 heures 48 heures 72 heures 0% Aérobie 3.70 Tableau 2. INHIBITION DE L'EFFET PROBIOTIQUE DE LA PROTEINE MP9007 PAR LE PYROPHOSPHATE TRISODIQUE A 5 ET 10% (C.F.U./ml, moyenne en LoglO de deux tubes par traitement) Protéine Pyrophosphate Microflore 0 heure 24 heures 48 heures 72 heures MP9007 trisodique 0% 0% Aérobie 3.70 Tableau 3. INHIBITION DE L'EFFET PROBIOTIQUE DE LA PROTEINE MP9007 PAR LE PYROPHOSPHATE TRISODIQUE A 0.5% (CRU/mi, U./ml, moyenne en LoglO de deux tubes par traitement) Protéine Pyrophosphate Microflore 0 heure 24 heures MP9007 trisodique 0% 0% Aérobie 3.70 Tableau 4. INHIBITION DE L'EFFET PROBIOTIQUE DE LA PROTEINE MP9007 PAR LE TRIPOLYPHOSPHATE DE SODIUM (C.F.U./ml, moyenne en LoglO de deux tubes par traitement) Protéine Tripoly- Microflore 0 heure 24 heures 48 heures MP9007 phosphate 1% 0% Aérobie 3.70 7.97 7.69 Anaérobie 3.70 7.90 7.97 1% 0.5% Aérobie 3.70 5.50 6.90 Anaérobie 3.70 5.41 7.04 1% 1% Aérobie 3.70 4.81 6.49 Anaérobie 3.70 Tableau 5. INHIBITION DE L'EI FET PROBIOTIQUE DE L'HYDROLYSAT DE SOJA PAR LE TRIPOLYPHOSPHATE DE SODIUM (C.F.U./ml, moyenne en LoglO de deux tubes par traitement) Hydrolysat Tripoly- Microflore 0 heure 24 heures 48 heures de soja phosphate 1% 0% Aérobie 3.70 6.93 8.31 Anaérobie 3.70 7.11 8.10 1% 0.5% Aérobie 3.70 REVENDICATIONS 1. Procédé d'inhibition de l'effet probiotique des protéines alimentaires vis-à-vis de la microflore bactérienne buccale des animaux carnivores domestiques, ledit procédé consistant à administrer à l'animal carnivore domestique un inhibiteur d'effet probiotique, l'inhibiteur comprenant un phosphate alimentaire hydrosoluble. 2. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur est choisi 10 parmi un pyrophosphate de sodium ou un tripolyphosphate de sodium. 3. Procédé selon l'une des Revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le phosphate alimentaire se retrouve dissous à au moins 0.5% dans la salive des animaux. 4. Procédé selon l'une des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le phosphate alimentaire est administré seul aux animaux. 5. Procédé selon l'une des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibiteur est apporté en mélange avec des aliments pour animaux carnivores domestiques. 6. Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce l'inhibiteur est ajouté aux aliments de manière extemporanée. 7. Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que l'inhibiteur est 25 préalablement mélangé aux aliments. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que les aliments sont choisis parmi les rations ménagères , ou les aliments industriels secs, humides, semi-humides, snacks ou friandises. 9. Procédé selon l'une des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le phosphate alimentaire est administré aux animaux à travers une préparation vétérinaire ou non. 10. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur est un mélange de phosphates alimentaires hydrosolubles. 11. Utilisation d'un phosphate alimentaire hydrosoluble défini selon l'une des revendications 1 à 10 pour inhiber l'effet probiotique des protéines alimentaires vis-à-vis de la microflore bactérienne buccale des animaux carnivores domestiques.