Brevet FR2848223A1 — publié le 20040611

L'invention a pour objet un nouveau procédé d'extraction d'endotoxines à partir de bactéries, en particulier de bactéries Gram-négatives, ainsi que l'utilisation de ce procédé pour la préparation de compositions comprenant des endotoxines ou leurs dérivés et destinées à l'usage humain ou animal (usage scientifique, médical...). Les endotoxines sont de puissants stimulants du système immunitaire (induction d'Interleukines, TNF, NO...). Elles sont les constituants principaux des membranes externes des bactéries Gram-négatives. Les endotoxines sont des mélanges de lipopolysaccharides ou LPS. Parmi les colonies bactériennes, on distingue principalement deux 10 catégories: celles dites de type S, pour " smooth ", se rapportant à l'aspect lisse de la colonie; celles dites de type R, pour "rough ", ce terme rappelant la morphologie rugueuse de la colonie. Il existe également une troisième catégorie dite SR pour " semirough ". La structure des LPS constituants des endotoxines bactériennes est 15 différente suivant qu'il s'agit de bactéries de type R ou S. Les LPS sont constitués d'un domaine lipidique dit lipide A et d'une chaîne polysaccharidique, dite de noyau, rattachée au lipide A. Les LPS de type S comportent en outre une chaîne antigénique dite de type 0. Les LPS de type R ne comportent pas cette chaîne antigénique de type 0. Les LPS 20 de type SR comportent une seule unité de la chaîne antigénique de type 0. La présente invention porte plus particulièrement sur l'isolement des endotoxines à partir d'une culture bactérienne de type R et éventuellement de type SR. Toutefois, elle peut également être appliquée aux cultures bactériennes de type S. Dans les procédés de l'art antérieur, les endotoxines bactériennes étaient 25 isolées par extraction au moyen d'un mélange de solvants qui pouvait être un mélange de phénol et d'eau ou un mélange de chloroforme, d'éther de pétrole et de phénol. Ces méthodes présentent le grave inconvénient d'employer des solvants toxiques et donc d'entraîner des risques sanitaires pour les personnes amenées à les manipuler. Il existe également une méthode d'extraction à l'acide trichloracétique, toutefois cette méthode 30 entraîne trop de contamination pour être jugée satisfaisante. En outre, des résidus de solvants toxiques dans les extraits bactériens d'endotoxines les rendaient impropres à une administration humaine ou animale ainsi qu'à l'utilisation dans des expériences scientifiques. Enfin, l'élimination de ces résidus de solvants toxiques constituait une étape difficile et coteuse du procédé de l'art antérieur. Le document Caroff; M. and Karibian, D. " Several uses for Isobutyric Acid-Ammonium Hydroxide solvant in endotoxin analysis " Applied and Env. MVficrobiol. 56: 1957-1959 (1990), décrit l'utilisation du mélange de solvants acide isobutyrique / NH40H molaire (5:3) pour déterminer la pureté d'endotoxines bactériennes par chromatographie ainsi que pour différencier des endotoxines bactériennes issues de différentes souches. Ce document décrit aussi un procédé de purification d'endotoxines naturelles à partir d'endotoxines isolées suivant l'un des procédés traditionnels d'extraction au phénol dans une première étape. Dans la seconde étape de ce procédé, les endotoxines sont purifiées par extraction à l'aide du mélange de solvants acide isobutyrique / NH40H molaire (5:3). L'extrait est centrifugé et le surnageant récupéré. Les solvants sont évaporés. L'endotoxine est récupérée par trituration à 10 l'éthanol. A la lecture de ce document, l'homme du métier comprend que l'extraction au phénol constitue la première étape incontournable de tout procédé d'isolement d'endotoxines bactériennes. Le document Thérisod, H., Labas, V. and Caroff, M. " Direct 15 microextraction and analysis of rough-type lipopolysaccharides by combined thin-layer chromatography and MALDI mass spectrometry ". Anal. Chem. 73: 3804-3807 (2001), décrit un procédé d'isolement d'endotoxines bactériennes, directement à partir de bactéries par chromatographie sur plaque de silice, l'éluant employé étant le mélange de solvants acide isobutyrique / NH40H (5:3). Toutefois, la chromatographie sur plaque de silice et l'extraction aux solvants sont deux techniques séparatives bien distinctes et il n'existe pas de corrélation entre les résultats obtenus par ces deux techniques. Aussi, c'est avec étonnement que la Demanderesse a découvert un nouveau procédé d'isolement d'endotoxines (ou lipopolysaccharides) bactériennes 25 directement à partir de bactéries. Le procédé selon l'invention se caractérise en ce que: - le produit de départ est un ensemble de cellules bactériennes, ou éventuellement un surnageant de culture; - dans une première étape, les cellules bactériennes, ou le surnageant de 3O culture, sont suspendus dans un mélange de solvants constitué de: * 30 à 70% d'un solvant choisi parmi: les acides aliphatiques linéaires ou ramifiés comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, * 70 à 30% d'une solution aqueuse basique d'une amine aliphatique comprenant de 0 à 12 atomes de carbone, 35 * et l'ensemble est agité, pour donner une solution dans laquelle des particules sont en suspension, - dans une seconde étape, les particules en suspension sont séparées de la solution: * soit par filtration de la composition, * soit par centrifugation et récupération du surnageant, X soit par centrifugation suivie de la filtration du surnageant; - dans une troisième étape, les solvants sont éliminés du surnageant ou 5 du filtrat par tous moyens connus de l'homme du métier tels que notamment: dialyse, filtration / lavage, précipitation des LPS, par exemple par addition d'éthanol. Le procédé selon la présente invention présente de nombreux avantages par rapport aux procédés de l'art antérieur. Il est rapide: l'extraction des endotoxines se fait en 12 à 24 heures ou moins, tandis que dans les procédés d'extraction au phénol, 10 l'étape d'extraction elle-même durait au moins une semaine. Cette méthode n'utilise pas de silice, elle est plus simple à mettre en oeuvre, notamment à l'échelle industrielle. Cette méthode n'emploie pas de solvants toxiques, elle n'est donc pas dangereuse pour les manipulateurs qui la mettent en oeuvre. 15 Elle est très sélective. Les rendements sont 2 à 10 fois plus élevés que ceux obtenus par les méthodes de l'art antérieur pour les bactéries déjà testées. Les traitements enzymatiques habituels à la DNAse, RNAse et protéase, employés habituellement pour éliminer les contaminants en ADN, ARN, les peptides et les 20 protéines résiduels, ne sont pas nécessaires. En outre, l'absence de solvants toxiques, la rapidité et les bons rendements du procédé de l'invention permettent d'envisager son extrapolation à l'échelle industrielle. Enfin, de nombreux articles récents démontrent que certains LPS 25 commercialisés actuellement, et obtenus par extraction dans un système phénol/eau, sont porteurs de contaminants qui les rendent inexploitables dans des expériences scientifiques. Les LPS obtenus par le procédé de l'invention présentent l'avantage de ne pas être porteurs de contaminants. Parmi les acides aliphatiques utilisables dans la présente invention, on 30 choisit préférentiellement un acide ramifié. On préfère les acides aliphatiques comprenant 4 atomes de carbone, tels que les acides butyrique et iso-butyrique. L'acide aliphatique préférentiellement utilisé dans la présente invention est l'acide iso-butyrique. Parmi les amines aliphatiques utilisables dans la présente invention, on peut citer notamment: l'ammoniaque, la diisopropyléthylamine, la triéthylamine. On 35 choisit préférentiellement l'ammoniaque ou la triéthylamine. Les amines aliphatiques sont employées en solution aqueuse d'une concentration allant de 5 à 20%, préférentiellement d'une concentration aux environs de 10%. La composition résultant de la première étape est une composition hétérogène comportant d'une part des particules de débris cellulaires en suspension, d'autre part les endotoxines bactériennes en solution dans le mélange de solvants. L'élimination des particules de débris cellulaires par filtration et/ou centrifugation permet d'isoler les endotoxines. Si l'on souhaite purifier les endotoxines d'éventuels résidus contaminants, on peut extraire la composition issue de la troisième étape du procédé de l'invention (dialysat ou LPS précipité que l'on reprend dans l'eau) à l'aide de méthanol ou d'un mélange de chloroforme et de méthanol pour éliminer notamment des résidus 10 phospholipidiques ou lipoprotéiques contaminants. Suivant l'usage que l'on souhaite en faire, on peut conserver les endotoxines, issues du procédé de l'invention, en solution aqueuse ou les lyophiliser afin de les stocker sous forme de poudre, cette dernière solution ayant l'avantage de faciliter leur manipulation et leur dosage. Les cellules bactériennes utilisées comme produit de départ sont préférentiellement des cellules Gram négatives. Toutefois, on peut également envisager d'utiliser le procédé selon l'invention pour purifier d'autres phosphoglycanes ou lipoglycanes isolés d'autres types bactériens, notamment à des fins vaccinales. Des cellules préférentiellement utilisées dans le procédé de l'invention 20 sont: Bordetella pertussis, Escherichia Coli, Bordella parapertussis, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophihis. Les cellules bactériennes sont généralement obtenues par centrifugation d'un milieu de culture et récupération du culot bactérien. Toutefois, lors de cette opération de centrifugation il est possible de récupérer un surnageant qui peut être riche en 25 lipopolysaccharides et peut constituer un produit de départ pour l'application du procédé de l'invention. Les mélanges de solvants utilisés de façon préférentielle sont: l'acide isobutyrique et soit l'ammoniaque en solution aqueuse molaire soit la triéthylamine en solution aqueuse à 10% (pourcentage en volume). De façon préférée, on utilise un mélange d'acide isobutyrique et d'ammoniaque en solution aqueuse molaire dans un rapport volumique 5/3 ou un mélange d'acide isobutyrique et de triéthylamine en solution aqueuse à 10% dans un rapport volumique 5/3. De façon avantageuse, l'agitation correspondant à la première étape du 35 procédé de l'invention dure de 5 à 15 minutes. Encore plus avantageusement de 10 à 15 minutes. De préférence la filtration est faite sur un support d'une porosité allant de 0,1 à2 Htm. Encore plus préférentiellement, de 0,2 à 0,45 Iam. Lorsque l'on centrifuge le mélange issu de la première étape, cette centrifugation se fait préférentiellement dans les conditions suivantes: 1500 à 3000g, pendant 10 à 20 minutes à température ambiante. Préférentiellement 2000g pendant environ 15 minutes. Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir les endotoxines de façon rapide, avec de très bons rendements et sensiblement exemptes de contaminants biologiques ou de solvants. Toutes ces propriétés permettent d'envisager des applications qui jusqu'alors pouvaient difficilement être mises en oeuvre. Notamment la préparation de compositions destinées à l'administration humaine ou animale. En raison de la toxicité des solvants employés dans l'art antérieur et des difficultés de purification qu'ils entraînaient, de telles applications n'étaient pas envisageables. Grâce au procédé de l'invention, on peut à présent préparer des compositions, notamment des compositions thérapeutiques, qui peuvent être administrées à 15 l'homme ou à l'animal (sous réserve de la non-toxicité des molécules elles-mêmes) par toutes voies: orale, injection, application sur la peau ou les muqueuses. En particulier, il est possible de préparer, grâce à ce procédé, des compositions de vaccin comprenant des endotoxines, ou des dérivés d'endotoxines, à l'échelle industrielle. Parmi les dérivés d'endotoxines, on peut citer notamment les endotoxines détoxifiées, les fragments d'endotoxines, les endotoxines conjuguées avec d'autres molécules, notamment avec des protéines. L'utilisation d'endotoxines pour préparer des compositions de vaccins est citée notamment dans EP-976402. L'invention a donc également pour objet un procédé pour la préparation d'une composition comprenant une ou plusieurs endotoxines ou dérivés d'endotoxines, tels que notamment des fragments d'endotoxine, des endotoxines détoxifiées, destinée à l'administration humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'isolement des endotoxines telle que décrite ci-dessus. Dans un second temps, les 30 endotoxines isolées sont incorporées dans un véhicule approprié, notamment un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Elles peuvent aussi être conditionnées directement en vue d'une préparation extemporanée de la composition destinée à l'administration humaine ou animale. Les endotoxines peuvent également être directement commercialisées 35 pour un usage scientifique. Partie Expérimentale: Des cellules sont mises en culture suivant une méthode déjà décrite par Di Fabio, J.L.; Caroff, M., Karibian, D.; Richards, J. C. and Perry, M. B. FEMS Microbiol. Lett. 1992, 76: 275-281. L'homme du métier sait adapter les conditions de culture en fonction du type cellulaire concerné. Un gramme de cellules lyophilisées (ou l'équivalent de culot bactérien humide) est suspendue dans 50 ml d'un mélange d'acide isobutyrique et de NH40H Molaire (5:3) et agitées doucement par agitation magnétique pendant 5 minutes. Le 10 mélange est centrifugé à 2 000 g pendant 15 minutes à température ambiante. Le surnageant clarifié, contenant l'endotoxine, est filtré sur papier de verre (Whatman GF/D), dilué par trois volumes d'eau distillée et dialysé. Une seconde extraction du culot peut être effectuée si nécessaire. Le rétentat de la dialyse est lyophilisé, et il est extrait par un mélange de chloroforme et de méthanol (1:2) pour éliminer les contaminants éventuels de 15 phospholipides. Le résidu de l'extraction est alors lyophilisé. Le rendement est de 2%. L'extraction est réalisée en 24 heures. Cette durée peut être encore réduite à quelques heures par des procédés de dialyse par filtration, applicables à l'échelle industrielle. Ces essais ont été effectués avec succès sur les bactéries du genre Bordetella (B. pertussis, agent de la coqueluche, et d'autres bactéries du même genre bactérien responsables d'infections respiratoires). Cette méthode a aussi été testée sur les cellules d'Escherichia coli K 12 et de Neisseria meningitidis. Une comparaison des endotoxines obtenues à partir de Bordetella 25 pertussis par la présente méthode (notée isobutyrique) et la méthode au phénol-eau est illustrée par la figure 1, qui représente une chromatographie sur couche mince comparative des endotoxines isolées par ces deux méthodes. REVENDICATIONS 1) Procédé d'isolement d'endotoxines caractérisé en ce que: - le produit de départ est un ensemble de cellules bactériennes ou un surnageant de culture; - dans une première étape, les cellules bactériennes, ou le surnageant de culture, sont suspendus dans un mélange de solvants constitué de: * 30 à 70% d'un solvant choisi parmi: les acides aliphatiques linéaires ou ramifiés comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, 10 * 70 à 30% d'une solution aqueuse basique d'une amine aliphatique comprenant de 0 à 12 atomes de carbone, * et l'ensemble est agité, pour donner une solution dans laquelle des particules sont en suspension, dans une seconde étape, les particules en suspension sont séparées de 15 la solution * soit par filtration de la composition, * soit par centrifugation et récupération du surnageant, * soit par centrifugation suivie de la filtration du surnageant; - dans une troisième étape, les solvants sont éliminés du surnageant ou 20 du filtrat. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont choisies parmi les bactéries Gram-négatives. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont choisies parmi les bactéries Gram-négatives de type R. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules sont choisies parmi: Bordetella pertussis, Escherichia Coli, Bordella parapertussis, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les solvants sont éliminés du surnageant ou du filtrat par une méthode choisie 30 parmi: la dialyse, la filtration / lavage, la précipitation. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on extrait la composition issue de la troisième étape du procédé à l'aide d'un mélange de chloroforme et de méthanol. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en 35 ce que le mélange de solvants est choisi parmi: l'acide isobutyrique et la triéthylamine en solution aqueuse à 10% dans un rapport volumique 5/3. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le mélange de solvants est un mélange d'acide isobutyrique et d'ammoniaque en solution aqueuse molaire dans un rapport volumique 5/3. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 8, caractérisé en ce que l'agitation dans la première étape du procédé dure de 5 à 15 minutes. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la filtration est faite sur un support d'une porosité allant de 0,1 à 2 tam. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la centrifugation se fait dans les conditions suivantes: 1500 à 3000g, pendant 10 10 à 20 minutes à température ambiante. 12) Procédé pour la préparation d'une composition comprenant une ou plusieurs endotoxines ou dérivé d'endotoxine, destinée à l'administration humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de préparation des endotoxines selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la composition est une composition thérapeutique. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la composition est une composition de vaccin.