Brevet FR2853907A1 — publié le 20041022

L'invention concerne un procédé de préparation de fragments d'ADN par fragmentation sélective d'acides nucléiques et ses applications pour l'analyse des génomes et des transcriptomes. Les techniques d'analyse des génomes et des transcriptomes d'espèces (animaux, végétaux, microorganismes) différentes ou bien de sous-groupes ou d'individus différents au sein de ces espèces, reposent sur la détection de marqueurs ou d'empreinte(s) génétique (s) par fragmentation de l'ADN (génome ou ADNc) à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction puis analyse, par tout moyen approprié des fragments d'ADN ainsi obtenus. Ces techniques ont des applications dans des domaines extrêmement variés de la biologie comme la cartographie génétique, le génotypage d'espèces, de variétés, d'individus (animaux, végétaux, microorganismes), la détection de polymorphisme(s) (SNP ou Single Nucleotide Polymorphism) des gènes Iié(s) à des caractères phénotypiques, notamment à des maladies, ainsi que l'établissement de profils d' expression géniques. Toutefois, du fait notamment de la complexité des génomes, les techniques proposées ne permettent pas une analyse systématique à haut-débit des génomes et des transcriptomes par des techniques automatisées du type hybridation sur des puces à ADN. En effet : - la technique RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) qui comprend l'analyse par Southern-blotting des fragments générés par les enzymes de restriction possède une faible résolution, dans la mesure où elle ne permet d'analyser qu'un seul ou, au plus, quelques loci en une seule réaction. En outre, les fragments obtenus ne peuvent pas être analysés par hybridation sur des puces à ADN du fait du nombre trop important de fragments générés, qui entraîne une saturation de la puce. - la technique AFLP (Amplifiée Fragment Length Polymorphism) décrite dans la Demande de brevet européenne (EP 0 534 858) au nom de KEYGENE, qui a été adaptée à l'analyse sur puces à ADN (Jaccoud et al., N. A.R., 2001,29, 4e25), permet de réduire la complexité de l'échantillon de départ à une centaine de fragments par amplification sélective d'une fraction des fragments, par PCR à l'aide d'amorces comprenant en 3' de la séquence du site de restriction, une séquence spécifique de quelques bases (environ 1 à 10). Ainsi une paire d'amorces possédant n bases sélectives permet en théorie d'amplifier uniquement une fraction 1/42ndes fragments correspondant à ceux qui possèdent une séquence complémentaire de la séquence sélective, soit 1/16ème et 1/256ième des fragments pour respectivement n = 1 et n = 2. En outre, l'hybridation de produits PCR sur des supports du type puces à ADN, c'est-à-dire de cibles de plusieurs centaines de paires de bases avec des sondes de 10 à 20 bases est souvent de mauvaise qualité (signaux faibles, faux négatifs et faux positifs) pour les raisons suivantes : - la présence de structures secondaires dans la cible diminue l'efficacité de l'hybridation de la sonde, du fait de la diminution de l'accessibilité à la cible et de l'impossibilité d'optimiser les conditions d'hybridation en raison de la présence d'un grand nombre de fragments, de structures différentes, à hybrider avec une même sonde, et - des réactions d'hybridation non-spécifique ou d'hybridation croisée avec des séquences non-cibles possédant des similarités avec la séquence cible conduisent à des faux positifs qui réduisent la capacité à détecter de faibles quantités de séquences spécifiques et la capacité de discrimination de ces techniques, du fait de l'augmentation du bruit de fond. Il ressort de ce qui précède qu'il existe un réel besoin de disposer de méthodes d'analyse des génomes et des transcriptomes, mieux adaptées aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'elles sont à la fois fiables, reproductibles, sensibles, spécifiques, rapides et simples à mettre en #uvre. De telles méthodes, permettant ainsi d'analyser simultanément un grand nombre d'échantillons sur des supports du type puces à ADN, seraient donc parfaitement adaptées à l'analyse systématique des génomes et des transcriptomes pour les applications précitées. C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont mis au point un procédé de préparation de fragments d'ADN par fragmentation sélective d'acides nucléiques (ADN génomique, ADNc rétro-transcrit à partir d'ARNm) qui permet avantageusement d'obtenir un ou plusieurs ensemble(s) de courts fragments d'ADN (inférieurs à 100 bases ou 100 paires de bases) représentatifs) de la totalité du génome ou du transcriptome à analyser ; ce procédé permet ainsi d'obtenir une hybridation à la fois rapide, efficace, fiable, reproductible, sensible et spécifique de molécules d'acides nucléiques cibles (ADN, ARN) avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur des supports miniaturisés du type puce à ADN ; ledit procédé est utile aussi bien pour la préparation d'ADN-cibles aptes à s'hybrider avec des sondes nucléotidiques et en particulier avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur des supports miniatu- risés du type puce à ADN (détection de marqueur (s) d'empreinte(s) génétique(s)), que pour la préparation de sondes à ADN, notamment de puces à ADN aptes à s'hybrider avec des acides nucléiques-cibles (ADN, ARN), (préparation de marqueur (s) ou d'empreinte(s) génétique(s)). La présente invention a ainsi pour objet un procédé de préparation de fragments d'ADN, à partir d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la fragmentation sélective desdits acides nucléiques à l'aide d'au moins les étapes suivantes (figure 1) : I. Une première sélection de fragments courts comprenant : a) la préparation de premiers fragments d'ADN double-brin FI à l'aide d'au moins une enzyme de restriction El, apte à fragmenter de manière aléatoire l'échantillon d'acides nucléiques à analyser, en générant lesdits fragments FI d'ADN aux extrémités franches ou cohésives, b) la ligation des extrémités desdits fragments FI d'ADN obtenus à l'étape a) à un adaptateur AA', de manière à former un motif - situé à la jonction de l'extrémité complémentaire dudit adaptateur et de l'extrémité 5' desdits fragments FI, tel que : - la séquence dudit motif est celle des N-x premières paires de bases du site de reconnaissance-à N paires de bases- d'une enzyme de restriction E2 dont le site de coupure est situé en aval dudit site de reconnaissance, avec 1 II. Une deuxième sélection d'un ou plusieurs sous-ensembles de fragments à partir de la fraction de fragments courts F2 obtenue à l'étape d), conformément aux étapes suivantes (figure 3) : e) la ligation de l'extrémité libre (non liée à l'adaptateur AA') de fragments courts F2 obtenus en d) à au moins un second adaptateur complémentaire BB' (obtention de fragments F'2), et f) l'amplification des fragments courts F'2 liés auxdits adaptateurs (AA' et BB'), à l'aide d'au moins un couple d'amorces appropriées, l'une au moins étant éventuellement marquée à son extrémité 5', de façon à sélectionner au moins un sous-ensemble de fragments courts F'2, à partir de la fraction de fragments courts F2 obtenue en d). Au sens de la présente invention on entend par : # fragment d'ADN, un fragment d'ADN double-brin, # fragment court F2 ou F'2, un fragment d'ADN inférieur à 100 paires de bases, # fragment long FI ou F'1, un fragment d'ADN de plusieurs centaines de paires de bases, # adaptateur, un oligonucléotide double brin d'au moins 6 paires de bases, # extrémité 5' et extrémité 3', relativement à un fragment d'ADN, un adaptateur ou un site de reconnaissance ou de coupure d'une enzyme de restriction, respectivement l'extrémité 5' et l'extrémité 3' du brin positif dudit fragment d'ADN, dudit adaptateur ou dudit site de reconnaissance ou de coupure d'une enzyme de restriction, # extrémité libre, relativement à un fragment d'ADN, l'extrémité qui n'est pas liée à un adaptateur, # extrémité complémentaire d'un adaptateur, l'extrémité dudit adaptateur qui se lie à l'extrémité 3' ou 5' d'un fragment d'ADN ; lorsque ledit adaptateur se lie à l'extrémité 5' dudit fragment d'ADN, il s'agit de l'extrémité 3' dudit adap- tateur et inversement, # fraction de fragments, une fraction de fragments courts F2 préparée à partir des fragments (longs) FI obtenus à l'étape a) ou une fraction de fragments courts F'2, préparée à partir des fragments courts F2 ; lestermes fraction, ensemble ou groupe sont considérés comme équivalents et employés indifféremment dans ce qui suit et il en va de même pour les termes sous-ensemble (s) et sous- groupe (s), # site de coupure, le site de restriction d'une endonucléase (enzyme de restric- tion) ; dans ce qui suit le terme site de coupure ou site de restriction sont employés indifféremment. Le procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'invention, à savoir la combinaison des étapes a) à f), permet avantageusement à la fois (figure 2) : - d'obtenir des fragments courts F'2 représentatifs de la totalité du génome ou du transcriptome à analyser, c'est-à-dire d'une longueur équivalente à celle des sondes oligonucléotidiques ; - de réduire la complexité de l'échantillon à analyser par une première puis une deuxième sélection à l'aide des adaptateurs AA' et BB', d'un ou plusieurs sous-ensembles de fragments courts F'2 représentatifs du génome ou du transcriptome à analyser ; une telle sélection permet d'éviter les problèmes de saturation du support du type puce à ADN utilisé pour l'hybridation, et - de détecter à partir du ou desdits sous-ensemble (s) fragments courts F2 un nombre maximum d'empreintes ou de marqueurs génétiques différents représentatifs du génome ou du transcriptome à analyser, par une deuxième sélection de sous-ensembles de l'ensemble de fragments courts F'2 obtenus à l'étape d), à l'aide d'adaptateurs différents (BIBI', B2B2'..). L'utilisation de tels fragments courts F'2 comme cibles ou sondes dans des techniques d'hybridation sur puces à ADN, présente les avantages suivants par rapport aux techniques d'analyse de génomes ou de transcriptomes de l'art antérieur : # fiabilité et reproductibilité La fraction de fragments courts F'2 qui est sélectionnée uniquement par ligation d'adaptateurs et coupure par des enzymes de restriction est représentative de la totalité du génome ou du transcriptome à analyser. Ces fragments courts d'une part sont plus faciles à amplifier et d'autre part, permettent de travailler sur de l'ADN partiellement dégradé. En outre, la réduction de la complexité de l'échantillon à analyser par une première sélection, à l'aide de l'adaptateur AA', d'une fraction de fragments courts F2 représentatifs du génome ou du transcriptome à analyser, qui permet d'éviter les problèmes de saturation du support du type puce à ADN utilisé pour l'hybridation, contribue également à augmenter la fiabilité et la reproductibilité de l'analyse des génomes ou des transcriptomes. # sensibilité et spécificité La sensibilité et la spécificité de l'hybridation sont augmentées du fait de : - la réduction de la taille des fragments à hybrider (cibles ou sondes de moins de 100 bases ou paires de bases au lieu de plusieurs centaines de bases ou de paires de bases dans les techniques de l'art antérieur) ; réduction diminue les réactions d'hybridation croisée et les faux positifs par élimination des séquences non-cibles , et augmente le signal d'hybridation par diminution des structures secondaires de l'ADN, - l'harmonisation des conditions d'hybridation (température) pour des fragments de taille homogène, - la pureté de l'ADN (élimination de l'enzyme, des tampons et des longs fragments d'ADN restants. ) # simplicité La fragmentation des acides nucléiques (cible ou sonde) comprend des étapes simples à mettre en #uvre (digestion enzymatique, ligation). En outre, l'optimisation de la longueur, de la structure et de la composition de l'ADN (cible ou sonde) permet d'obtenir une hybridation de bonne qualité (pas de faux positifs, peu de bruit de fond..) et donc de minimiser le nombre de contrôles nécessaires et par conséquent de réduire la complexité de la puce. # rapidité La durée d'hybridation est réduite de façon importante et est infé- rieure à 1 h (environ 15 à 20 min), au lieu de 12 h à 18 h dans les techniques de l'art antérieur. # coût peu élevé La réduction de la complexité de la puce permet de réduire le coût de cette dernière. En raison de ces différents avantages, le procédé de préparation de fragments d'ADN par fragmentation sélective d'acides nucléiques selon l'invention est particulièrement bien adapté à : - l'analyse rapide d'un grand nombre d'échantillons d'acides nucléiques-cibles (ADN génomique ou ADNc obtenu par rétro-transcription d'ARNm) sur des puces à ADN, et - la préparation de sondes de taille réduite et contrôlée à partir d'ARN ou d'ADN génomique, notamment pour la fabrication de puces à ADN sur lesquelles sont immobilisées lesdites sondes représentant des marqueurs génétiques de génomes ou de transcriptomes. Conformément au procédé de l'invention, les fragments FI d'ADN double-brin de l'étape a) sont obtenus par les techniques classiques connues en elles mêmes. Par exemple, l'ADN génomique extrait de l'échantillon à analyser est fragmenté de façon aléatoire à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction El générant des fragments aux extrémités franches ou cohésives, sélectionnée (s) fonction de leur fréquence de coupure de l'ADN à analyser, de façon à obtenir des fragments inférieurs à 1000 pb, de l'ordre de 200 à 400 pb. L'ARN (ARNm, ARN génomique d'un microorganisme...) est extrait de l'échantillon à analyser, converti en ADNc double brin par rétro-transcription puis fragmenté de façon analogue à l'ADN génomique. Parmi les endonucléases de restriction El utilisables pour couper l'ADN de mammifères, on peut citer de façon non-limitative : EcoR I, BamH I, Pst I, Msp I, XmaC I, Eco 561, Ksp I, Dra I, Ssp I, Sac I, BbvC I, Hind III, Sph I, Xba I et Apa I. Conformément à l'invention l'enzyme El génère soit des extrémités franches, soit des extrémités cohésives ; elle génère de préférence des extrémités cohésives qui ont l'avantage de permettre la ligation avec une seule amorce. Conformément au procédé de l'invention, l'adaptateur tel que défini à l'étape b) est un oligonucléotide d'au moins 6 pb, formé de deux brins complémen- taires (A et A') ; adaptateur, en b), est lié aux extrémités dudit fragment d'ADN FI par tout moyen approprié, connu en lui-même, notamment à l'aide d'une ligase à ADN, telle que la T4 ligase. Conformément au procédé de l'invention, les étapes a) et b) sont réalisées successivement ou simultanément. Conformément au procédé de l'invention, l'extrémité 3' du site de coupure de l'enzyme de restriction El et l'extrémité 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2 se chevauchent sur au moins une paire de bases (figure 2), ce qui permet de sélectionner une fraction de fragments courts F2 par coupure avec l'enzyme de restriction E2 ; fragments courts F2 sont issus de la fraction de frag- ments longs F'1obtenus à l'étape b), qui comprend la totalité du site de reconnaissance de ladite enzyme de restriction E2 (N paires de bases). Parmi les enzymes de restriction E2, on peut citer de façon non-limitative : Bpm I, Bsg I et BpuE I qui coupent 16 nucléotides en aval de leur site de reconnaissance, et Eci I, BsmF I, Fok I, Mme I et Mbo II qui coupent respectivement 11, 10,9, 20 et 8 nucléotides en aval de leur site de reconnaissance. Conformément au procédé de l'invention, le chevauchement desdits sites peut-être parfait (absence de misappariement) ou il peut comprendre au moins un misappariement (voir par exemple la paire de bases située en deuxième position du site Ksp I (enzyme de restriction El) qui n'est pas complémentaire de la paire de base en première position du site Eci I (enzyme de restriction E2), figure 2) ; dans ce cas, la séquence du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2 est restaurée par ligation avec un adaptateur dont l'extrémité est complémentaire dudit site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2 (adaptateur comprenant la séquence GGC à l'extrémité 3' du brin A dans l'exemple précité). Le nombre 1 à N-l de paires de bases du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2 situées dans la région de la jonction de l'extrémité 3' complémentaire dudit adaptateur AA' et de l'extrémité 5' desdits fragments d'ADN FI et la longueur dudit site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2, déterminent la fraction de fragments courts qui peut être sélectionnée à partir de l'ensemble des fragments (longs) FI générés à l'étape a) ; un site de reconnaissance E2 de N pb et un chevauchement de n pb, entre El et E2, la fraction de fragments sélectionnés correspond à 1/4(N-n), cette valeur étant augmentée d'un multiple de 2 pour toute paire de bases puriques ou pyrimidiques reconnue indifféremment par ladite enzyme de restriction E2 (enzyme Mme I, figure 2). Ainsi, plus le chevauchement est important, plus le nombre de fragments contenus dans la fraction est grand (facteur de sélection ou de réduction de la complexité de l'échantillon faible), et inversement (facteur de sélection ou de réduction de la complexité de l'échantillon élevé), (figure 2). Conformément au procédé de l'invention, la coupure à l'extrémité 5' des fragments longs F'1 à l'étape c), permet d'obtenir de courts fragments d'ADN F2 représentatifs du génome ou du transcriptome à analyser, susceptibles de contenir un marqueur génétique apte à être détecté par hybridation avec une sonde nucléotidique spécifique, en particulier un oligonucléotide complémentaire dudit marqueur génétique. Alternativement, lesdits fragments sont immobilisés sur un support solide du type puce à ADN et utilisés comme empreinte ou marqueur génétique pour analyser des génomes ou des transcriptomes. Conformément au procédé de l'invention, la purification des fragments courts F2-éventuellement simple-brin- (étape d), est réalisée par tout moyen approprié connu en lui-même, par exemple : la chromatographie d'exclusion, la filtration, la précipitation à l'aide de mélanges d'éthanol et d'acétate d'ammonium ou de sodium. Selon un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, il comprend une étape additionnelle de purification des fragments inférieurs à 1000 pb, préalablement à l'étape b) de ligation. Ladite purification est effectuée par tout moyen approprié connu en lui-même, notamment par séparation des produits de digestion obtenus en a) par électrophorèse en gel d'agarose, visualisation des bandes correspondant aux différents fragments obtenus, prélèvement de (s) du gel correspondant aux fragments inférieurs à 1000 pb et extraction desdits fragments d'ADN double brin selon les techniques classiques. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend à l'extrémité 3' du brin A et/ou 5' du brin A', une zone 1 d'environ 1 à 8 bases ou paires de bases complémentaire du site de coupure de l'enzyme El, ladite zone 1 incluant éventuellement un ou plusieurs misappariements avec la séquence dudit site de coupure (complémentarité partielle ou totale) de manière à reconstituer la séquence des N-l premières bases ou paires de bases du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2, par ligation dudit adaptateur AA' aux extrémités desdits fragments d'ADN obtenus en a). Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend en amont de la zone 1, une zone 2 d'au moins 6 paires de bases qui permet d'améliorer l'hybridation par allongement de l'adaptateur. La séquence de cette zone 2 est sélectionnée par tout moyen approprié connu en lui même, notamment à l'aide de logiciels de prédiction de séquences appropriés permettant d'optimiser la longueur, la structure et la composition des oligonucléotides (pourcentage de GC, absence de structures secondaires et/ou d'auto-appariement...) ; de préférence, ledit adaptateur comprend au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans le site de coupure de l'enzyme de restriction El, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire précédente ; cette base permet de ne pas reconstituer ledit site de restriction après la ligation de l'adaptateur à l'étape b) et donc d'éviter le clivage de l'adaptateur lié à l'extrémité dudit fragment d'ADN double-brin. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin A' ; résidu de phosphate permet à une enzyme comme la T4 ADN ligase de lier ledit adaptateur aux extrémités 3'-OH du fragment d'ADN double brin (FI), par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'adaptateur tel que défini à l'étape b) est lié à l'extrémité 5' de son brin A à un marqueur approprié permettant la détection d'hybrides d'acides nucléiques (ADN-ADN ou ADN-ARN), par exemple un fluorophore. Conformément au procédé de l'invention, les dits fragments courts F2 obtenus à l'étape d) comprennent une extrémité constituée par l'adaptateur AA' et l'autre extrémité (extrémité libre) qui est, de préférence, cohésive comprend une séquence aléatoire de quelques bases (inférieure à 10) générée par clivage avec l'enzyme de restriction E2 (figure 2) ; en conséquence, il est possible de sélectionner un ou plusieurs sous-ensembles de fragments courts F'2 par ligation avec un adaptateur (BB') ou plusieurs adaptateurs différents (BIBI', B2B2'..), chacun comprenant à l'extrémité 5' du brin B ou à l'extrémité 3' du brin B', une séquence cohésive spécifique de 1 à 10 bases, complémentaire de l'extrémité 3' d'un sous-ensemble de fragments courts F'2 (figure 3). Le ou lesdits sous-ensembles de fragments F'2 sont amplifiés, de façon indépendante ou simultanée, par PCR à l'aide d'un couple d'amorces dont la séquence est complémentaire de celle des brins A et B' des adaptateurs tels que définis ci-dessus. Conformément au procédé de l'invention, l'adaptateur BB' tel que défini à l'étape e) est un oligonucléotide d'au moins 6 pb, formé de deux brins complémentaires (B et B'), sélectionné par tout moyen approprié connu en lui même, notamment à l'aide de logiciels de prédiction de séquences appropriés permettant d'optimiser la longueur, la structure et la composition des oligonucléotides (pourcentage de GC, absence de structures secondaires et/ou d'auto-appariement...). Conformément au procédé de l'invention ledit adaptateur en e) est lié aux extrémités desdits fragments courts F2 par tout moyen approprié, connu en luimême, notamment à l'aide d'une ligase à ADN, telle que la T4 ligase. Conformément au procédé de l'invention, l'amplification de l'étape f) est réalisée notamment par PCR à l'aide d'un couple d'amorces dont les séquences sens et anti-sens sont complémentaires de respectivement, le brin A et le brin B' des adaptateurs tels que définis ci-dessus. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre, l'étape e) comprend la ligation-de façon simultanée ou indépendante, de préférence indépendante- d'une extrémité des fragments courts F2 obtenus en d) à plusieurs adaptateurs différents (BIBI', B2B2'..), chacun comprenant-à l'extrémité 5' du brin B ou à l'extrémité 3' du brin B'- une séquence spécifique de 1 à 10 bases, complémentaire de l'extrémité 3' libre dudit fragment court F2. Une telle disposition permet avantageusement d'obtenir des sous-groupes de fragments F'2, chacun correspondant à une empreinte ou à un marqueur génétique différent ; ainsi des adaptateurs possédant des séquences spécifiques de n bases permettent d'obtenir 4n sous-groupes d'empreintes génétiques différentes (figure 2). Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre, ledit adaptateur BB' (étape e) comprend un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin B ; ce résidu de phosphate permet à une enzyme comme la T4 ADN ligase de lier ledit adaptateur à l'extrémité 3'-OH du fragment court F2, par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en #uvre, l'une des amorces (étape f) est liée à son extrémité 5' à un marqueur approprié permettant la détection d'hybrides d'acides nucléiques (ADN-ADN ou ADNARN), par exemple un fluorophore. Selon encore une autre disposition avantageuse des modes de mises en #uvre précédents, ils comprennent une étape additionnelle g) d'obtention, par tout moyen approprié, de fragments simple-brin à partir des fragments courts F'2 obtenus à l'étape f). De préférence, l'un des brins du fragment court obtenu à l'étape f) est protégé à son extrémité 5' par un marqueur approprié ; un tel marqueur permet notamment d'éliminer le brin complémentaire par l'action de la phosphatase puis de la 5' exonucléase. Selon encore une autre disposition avantageuse des modes de mises en #uvre précédents, ils comprennent une étape additionnelle de purification, par tout moyen approprié, des produits d'amplification obtenus à l'étape f) ou des fragments simple brin obtenus à l'étape g). La présente invention a également pour objet un fragment d'ADN, représentant un marqueur génétique susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une séquence inférieure à 100 bases ou paires de bases comprenant au moins une séquence spécifique constituée par un fragment de séquence génomique ou de séquence d'ADNc bordé respectivement par le site de reconnaissance et le site de clivage d'une enzyme de restriction E2 dont le site de clivage est situé en aval dudit site de reconnaissance et incluant à chaque extrémité au moins 6 bases ou 6 paires de bases de séquence non-spécifique. Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment d'ADN, il est lié à l'une de ses extrémités 5' à un marqueur approprié permettant la détection d'hybrides d'acides nucléiques (ADN-ADN ou ARN-ADN), par exemple un fluorophore. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit fragment d'ADN, il est immobilisé sur un support approprié. Les supports sur lesquels on peut immobiliser des acides nucléiques sont connus en eux-mêmes ; à titre d'exemple nonlimitatif on peut citer ceux qui sont réalisés dans les matériaux suivants : plastique, nylon, verre, gel (agarose, acrylamide...) et silicium. De préférence, ledit fragment d'ADN est immobilisé sur un support miniaturisé du type puce à ADN. Outre les fragments d'ADN tels que définis ci-dessus, l'invention a également pour objet les mélanges de fragments d'ADN correspondant aux sousensembles de fragments courts F'2 obtenus à l'étape f) ou g) ;lesdits fragments ou leurs mélanges tels que définis ci-dessus sont utiles comme marqueurs génétiques pour l'analyse de génomes et de transcriptomes, notamment pour la détection d'une espèce, d'une variété ou d'un individu (animal, végétal, microorganisme), la détection de polymorphisme des gènes, et pour l'établissement de profils d'expression géniques. En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus ou bien de mélanges de fragments d'ADN correspondant aux sous-ensembles de fragments courts F'2 obtenus à l'étape f) ou g) du procédé tel que défini ci-dessus, comme marqueurs génétiques. La présente invention a également pour objet une méthode d'hybridation d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle met en #uvre un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre d'une méthode d'hybridation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN (cible ou sonde) tel que défini ci-dessus ; de préférence, lorsque ledit fragment est une cible, ledit kit comprend également une molécule d'acide nucléique complémentaire dudit fragment d'ADN, notamment une sonde oligonucléotidique. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un des adaptateurs tels que défini ci-dessus, pour la préparation de fragments d'ADN tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un couple d'amorces tel que défini ci-dessus, pour la préparation de fragments d'ADN tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un adaptateur AA' tel que défini ci-dessus ; de préférence, ledit kit comprend également au moins un adaptateur BB' et un couple d'amorces tels que définis ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé selon l'invention et de son utilisation pour l'analyse de génomes par hybridation avec des sondes oligonucléotidiques immobili- sées sur un support miniaturisé du type puce à ADN, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre les étapes a) à d) du procédé selon l'invention ; pour simplifier la figure, seul le brin A de l'adaptateur AA' est annoté, - la figure 2 illustre à l'aide d'exemples de sites de coupure de l'enzyme de restriction El et de sites de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2, la fraction de fragments courts F2 qui est sélectionnée à l'étape d) et le nombre de sous-groupes potentiels d'empreintes obtenus à l'étape f), déduits à partir du nombre de bases sélectionnées, respectivement aux extrémités 5' (étape b) et 3' (étape e) desdits fragments courts d'ADN. - la figure 3 illustre les étapes e) et f) du procédé selon l'invention ; pour simplifier la figure, seuls les brins A et B des adaptateurs AA' et BB' sont anno- tés, - les figures 4-1 à 4-3 illustrent un premier exemple des étape a) à f) du procédé selon l'invention : figure 4-1 : a et b, figure 4-2 : étapesc et d, figure 4-3 : e et f ; - étape a) : les fragments d'ADN-double-brin sont générés par coupure avec EcoR I qui reconnaît le site GAATTC, - étape b) : l'adaptateur AA' (16/20 pb), comprend respectivement de 5' en 3': 15 paires de bases (zone 2 : GGAAGCCTAGCTGGA (SEQ ID NO:1) sur le brin A) et 1 pb de base non complémentaire du site EcoR I (C sur le brin A), ainsi que 4 bases complémentaires du site EcoR I (zone 1) incluant l'extrémité 5' du site Mme I (A) et un résidu de phosphate, à l'extrémité 5'du brin A' (5'phosphate-AATT). L'ADN ligase permet la liaison de l'adaptateur aux extrémités cohésives des fragments EcoR I par l'intermédiaire de liaisons phosphodiester, et - étapes c) et d) : les fragments liés à l'adaptateur sont coupés à l'aide de l'enzyme Mme I (enzyme E2) de façon à générer des fragments courts (45/43 pb) à partir des fragments qui ont restauré le site Mme I (TCCPuAC) par ligation de l'adaptateur AA' avec un fragment dont l'extrémité 5' correspond à la séquence CPuAC ; la sélection de 4 paires de bases spécifiques (CPuAC) permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 128 (4x2x4x4), par rapport à l'échantillon de départ. - étaped) : les fragments courts obtenus à l'étape c) sont purifiés, - étapee) : les fragments courts purifiés à l'étape d) sont liés à l'une de leur extrémité à un adaptateur BIBI' (14/16 pb) comprenant 2 bases complémen- taires de l'extrémité dudit fragment (TT) à l'extrémité 3' du brin B'1, et un groupe- ment phosphate à l'extrémité 5' du brin B1; la sélection de 2 bases spécifiques (AA) permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 2048 (4x2x4x4x16) par rapport à l'échantillon de départ et d'obtenir des fragments courts de 59 paires de bases comprenant 28 paires de bases spécifiques de l'ADN à analyser, lesquels frag- ments correspondent à 16 sous-groupes potentiels d'empreintes génétiques, - étapef) : les fragments sélectionnés à l'étape e) sont amplifiés à l'aide d'amorces sens et anti-sens correspondant aux séquences complémentaires de respectivement les brins A et B'1 des adaptateurs AA' et BiB'i. - les figures 5-1 à 5-3 illustrent un deuxième exemple des étape a) à f) du procédé selon l'invention : figure 5-1 : a et b, figure 5-2 : c et d, figure 5-3 : e et f ; - étapea): les fragments d'ADN-double-brin sont générés par coupure avec BamH I qui reconnaît le site GGATCC, - étapeb) : l'adaptateur AA' (16/20 pb), comprend respectivement de 5' en 3' : paires de bases (zone 2 : GGAAGCCTAGCTGGA (SEQ ID NO:l) sur le brin A) et 1 pb de base non complémentaire du site BamH I (C sur le brin A), ainsi que 4 bases complémentaires du site BamH I (zone 1) incluant 2 bases de l'extrémité 5' du site Mme I (AG) et un résidu de phosphate, à l'extrémité 5' du brin A' (5'phosphate-GATC). L'ADN ligase permet la liaison de l'adaptateur aux extrémités cohésives des fragments BamH I par l'intermédiaire de liaisons phosphodiester, et - étapes c) et d) : les fragments liés à l'adaptateur sont coupés à l'aide de l'enzyme Mme I (enzyme 2) de façon à générer des fragments courts (44/42 pb) à partir des fragments qui ont restauré le site Mme I (TCCPuAC) par ligation de l'adaptateur AA' avec un fragment dont l'extrémité 5' correspond à la séquence PuAC ; la sélection de 3 paires de bases spécifiques (PuAC) permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 32 (2x4x4) par rapport à l'échantillon de départ. - étaped) : les fragments courts obtenus à l'étape c) sont purifiés, - étapee) : les fragments courts purifiés à l'étape d) sont liés à l'une de leur extrémité à un adaptateur BIBI' (14/16 pb) comprenant 2 bases complémen- taires de l'extrémité dudit fragment (TT) à l'extrémité 3' du brin B'1, et un groupe- ment phosphate à l'extrémité 5' du brin B1; la sélection de 2 bases spécifiques (AA) permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 512 (2x4x4x16) par rapport à l'échantillon de départ et d'obtenir des fragments courts de 58 paires de bases comprenant 28 paires de bases spécifiques de l'ADN à analyser, lesquels fragments correspondent à 16 sous-groupes potentiels d'empreintes génétiques, - étapef) : les fragments sélectionnés à l'étape e) sont amplifiés à l'aide d'amorces sens et anti-sens correspondant aux séquences complémentaires de respectivement les brins A et B'1 des adaptateurs AA' et B1B'1. - les figures 6-1 à 6-3 illustrent un troisième exemple des étapes a) à f) du procédé selon l'invention : figure 6-1 : a et b, figure 6-2 : c et d, figure 6-3 : e et f ; - étape a) : les fragments d'ADN-double-brin sont générés par coupure avec Ksp I qui reconnaît le site CCGCGG, - étapeb) : l'adaptateur AA' (18/16 pb), comprend respectivement de 5' en 3' : 15 paires de bases (zone 2 : GGAAGCCTAGCTGGA (SEQ ID NO:1) sur le brin A), ainsi qu'une paire de bases de la séquence 5' du site Eci I (G sur le brin A) et 2 bases complémentaires du site Ksp I (GC sur le brin A) et un résidu de phosphate, à l'extrémité 5'du brin A' ; adaptateur incluant 3 bases de l'extrémité 5' du site Eci I (GGC). L'ADN ligase permet la liaison de l'adaptateur aux extrémités cohésives des fragments Ksp I par l'intermédiaire de liaisons phosphodiester, et - étapes c) et d) : les fragments liés à l'adaptateur sont coupés à l'aide de l'enzyme Eci I (enzyme 2) de façon à générer des fragments courts à partir des fragments qui ont restauré le site Eci I (GGCGGA) par ligation de l'adaptateur AA' avec un fragment dont l'extrémité 5'correspond à la séquence A ; sélection d'une paire de bases spécifiques permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 4 par rapport à l'échantillon de départ. - étape d) : les fragments courts obtenus à l'étape c) sont purifiés, - étape e) : les fragments courts purifiés à l'étape d) sont liés à l'une de leur extrémité à un adaptateur BIBI' (14/16 pb) comprenant 2 bases complémentaires de l'extrémité dudit fragment (TT) à l'extrémité 3' du brin B'1, et un groupement phosphate à l'extrémité 5' du brin B1; la sélection de 2 bases spécifiques (AA) permet de diminuer le nombre de fragments d'un facteur 64 (4x16) par rapport à l'échantillon de départ et d'obtenir des fragments courts comprenant 28 paires de bases spécifiques de l'ADN à analyser, lesquels fragments correspondent à 16 sousgroupes potentiels d'empreintes génétiques, - étape f) : les fragments sélectionnés à l'étape e) sont amplifiés à l'aide d'amorces sens et anti-sens correspondant aux séquences complémentaires de respectivement les brins A et B'1 des adaptateurs AA' et BiB'i. Exemple 1 : de courts fragments d'ADN (cible ou sonde) selon le procédé de l'invention. La préparation des acides nucléiques, les digestions enzymatiques, les ligations, les amplification PCR et la purification des fragments ainsi obtenus, ont été réalisées en utilisant les techniques classiques, selon les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). L'ADN génomique a été extrait à partir de sang de bovin, à l'aide du kit PAXgene Blood DNA (référence 761133, QIAGEN), selon les instructions du fabricant. Les adaptateurs et les amorces suivants ont été synthétisés par MWG BIOTECH : -adaptateur AA' - brin A : 5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (SEQ ID N0:2) - brin A' : 5'-P-AATTCTCCAGCTAGGCTTCC-3' (SEQ ID N0:3) - adaptateur BB' B : 5'-P- GGTGAGCACTCATC-3' (SEQ ID N0:4) B' : 5'-GATGAGTGCTGACCTT-3' (SEQ ID NO:5) - amorces On peut utiliser indifféremment le couple d'amorces 1 : Sens : 5'-CCTTCGGATCGACCTG-3' (SEQ ID N0:6) Anti-sens : 5'-CTACTCACGAGTGGAA-3' (SEQ ID N0:7) ou le couple d'amorces 2 : Sens : 5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (SEQ ID N0:8) Anti-sens : 5'GATGAGTGCTGACCTT-3' (SEQ ID N0:9). Le couple d'amorces 2 permet notamment de réutiliser une partie des séquences des adaptateurs. Les fragments courts d'ADN (F2 et F'2) ont ensuite été préparés selon les étapes suivantes : 1) Digestion de l'ADN génomique par Eco RI et ligation des fragments à l'adaptateur AA' (étapes a et b) L'ADN génomique purifié (5 g) et l'adaptateur (5 g) ont été incubés, 3 h à 37 C, dans 40 l de tampon 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM ATP et 1 mg BSA, contenant 50 UI d'EcoR / et 2 UI de T4 ADN-ligase. Les fragments d'ADN liés à leurs extrémités à l'adaptateur AA' ainsi obtenus ont été purifiés par précipitation dans un mélange 1 : 4(V/V) d'acétate d'ammonium 3M et d'éthanol. 2) Digestion des fragments par Mme I et sélection des fragments courts F2 (étapes c) et d)) Le culot a été remis en suspension dans 40 l de tampon 50 mM acétate de potassium, 20 mM Tris-acétate, 10 mM acétate de magnésium, 1 mM DTT, pH 7,9 et incubé 1 h à 37 C en présence de 5 UI de Mme I. 3) Purification de la fraction de fragments courts F2 (étape d) L'enzyme a été éliminée à l'aide du kit Micropure-EZ (MILLIPORE), les sels ont ensuite été éliminés par filtration (Microcon YM3) puis l'ADN retenu sur le filtre YM3 a été élué et les fragments courts ont été purifiés par filtration (Microcon YM 30 ou YM 50, MILLIPORE) ; les fragments d'ADN de moins de 100 pb correspondant à l'éluat, les fragments de plus grande taille étant retenus sur le filtre. 4) Ligation des fragments courts F2 à l'adaptateur BB' (étape e) Les fragments courts obtenus à l'étape d) et l'adaptateur BB' (3 g) ont été incubés, 3 h à 37 C, dans 40 l de tampon 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM ATP et 1 mg BSA, contenant 2 UI de T4 ADN-ligase. 5) Amplification des fragments courts liés à l'adaptateur BB' (F'2) (étape f) Les fragments courts liés à l'adaptateur BB' obtenus à l'étape e) ont ensuite été amplifiés par PCR à l'aide du couple sens et anti-sens, correspondant aux séquences complémentaires des brins A et B' des adaptateurs AA' et BB', dans un volume réactionnel de 50 l contenant : 1 ng de fragments d'ADN, 150 ng de chacune des amorces et 2 UI d'AmpliTaq GOLD (PERKIN ELMER) dans un tampon 15 mM Tris HCI, pH 8,0, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2 et 200 M dNTPs. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur, pendant 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 s, suivie d'une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 s et d'une étape d'extension à 72 C pendant 2 min. Les fragments amplifiés par PCR ont été purifiés à l'aide du kit MinElute PCR Purification (référence LSKG, QIAGEN), en suivant les instructions du fabricant. L'enzyme, les sels et les dNTPs libres ont été éliminés par filtration sur Micropure-EZ (MILLIPORE) puis sur Microcon YM3 (MILLIPORE) et le produit d'amplification PCR retenu sur le filtre a ensuite été élué. Exemple 2 : des ADN-cibles pour hybrider des sondes oligonucléo- tidiques Les fragments courts d'ADN double-brin (ADN-cibles) obtenus à l'exemple 1 ont été convertis en ADN simple-brin par digestion, 30 min à 37 C, dans un volume réactionnel de 40 l contenant 3.10-3 UI de 5'-exonucléase dans un tampon 0,02 M citrate d'ammonium, pH 5. L'enzyme, les sels et les dNTPs libres ont été éliminés par filtration sur Micropure-EZ (MILLIPORE) puis sur Microcon YM3 (MILLIPORE) et l'ADN simple-brin retenu sur le filtre a ensuite été élué. Un support en verre du type puce à ADN, sur lequel sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques dont certaines sont complémentaires des fragments d'ADN-cible obtenus à l'exemple 1, a été préparé selon les techniques connues en elles-mêmes. Lesdits ADN-cibles ont ensuite été dilués dans du tampon d'hybridation (H7140, SIGMA) et 10 l ont été déposés sur le support en verre, entre lame et lamelle. L'hybridation a ensuite été réalisée, en chambre humide dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : 80 C pendant 3 min, puis la température est abaissée à 50 C par palier de 0,1 C/s et enfin la température est maintenue à 50 C pendant 10 minutes. La réaction d'hybridation a ensuite été stoppée par dépôt des lames de verre sur la glace. L'excès de fragments d'ADN-cible non-complémentaires des sondes a ensuite été éliminé par des lavages successifs : 30 s avec du SSC 2X (SIGMA, S6639), 30 s avec du SSC 2X additionné de 0,1% SDS (L4522, SIGMA), et 30 s avec du SSC 0,2X, à + 4 C. Les lames de verre ont ensuite été séchées et l'hybridation a été visualisée et analysée à l'aide d'un scanner (modèle Genetac, GENOMIC SOLUTION). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 0 Procédé de préparation de fragments d'ADN, à partir d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la fragmentation sélective desdits acides nucléiques à l'aide d'au moins les étapes suivantes : I. Une première sélection de fragments courts comprenant : a) la préparation de premiers fragments d'ADN double-brin FI à l'aide d'au moins une enzyme de restriction El, apte à fragmenter de manière aléatoire l'échantillon d'acides nucléiques à analyser, en générant lesdits fragments FI d'ADN aux extrémités franches ou cohésives, b) la ligation des extrémités desdits fragments FI d'ADN obtenus à l'étape a) à un adaptateur AA', de manière à former un motif - situé à la jonction de l'extrémité complémentaire dudit adaptateur et de l'extrémité 5' desdits fragments FI, tel que : - la séquence dudit motif est celle des N-x premières paires de bases du site de reconnaissance-à N paires de bases- d'une enzyme de restriction E2 dont le site de coupure est situé en aval dudit site de reconnaissance, avec 1# x #N-1et - son extrémité 3'-située en 5' desdits fragments d'ADN FI- est celle du site de restriction de l'enzyme de restriction El, de manière à obtenir des fragments d'ADN F'1, c) la coupure des fragments F'1d'ADN obtenus en b)-à proximité de leur extrémité 5'- à l'aide de ladite enzyme de restriction E2, de façon à sélectionner une fraction de fragments courts F2, et d) la purification par tout moyen approprié de ladite fraction de fragments courts F2, II. Une deuxième sélection d'un ou plusieurs sous-ensembles de fragments à partir de la fraction de fragments courts F2 obtenue à l'étape d), conformément aux étapes suivantes : e) la ligation de l'extrémité libre (non liée à l'adaptateur AA') de fragments courts F2 obtenus en d) à au moins un second adaptateur complémentaire BB' (obtention de fragments F'2), et f) l'amplification des fragments courts F'2 liés auxdits adaptateurs (AA' et BB'), à l'aide d'au moins un couple d'amorces appropriées, l'une au moins étant éventuellement marquée à son extrémité 5', de façon à sélectionner au moins un sous-ensemble de fragments courts F'2, à partir de la fraction de fragments courts F2 obtenue en d). 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont réalisées simultanément. 3 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle de purification des fragments inférieurs à 1000 pb, préalablement à l'étape b) de ligation. 4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend à l'extrémité 3' du brin A et/ou 5' du brin A', une zone 1 d'environ 1 à 8 bases ou paires de bases complémentaire du site de restriction de l'enzyme El. 5 ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite zone 1 inclut un ou plusieurs misappariements avec la séquence dudit site de coupure de l'enzyme de restriction El de manière à reconstituer la séquence des N-1 premières bases ou paires de bases du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction E2, par ligation dudit adaptateur AA' aux extrémités desdits fragments d'ADN obtenus en a). 6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend en amont de la zone 1, une zone 2 d'au moins 6 paires de bases. 7 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans le site de coupure de l'enzyme de restriction El, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire correspondant à la zone 1. 8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'adaptateur tel que défini à l'étape b) comprend un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin A'. 9 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'adaptateur AA' tel que défini à l'étape b) est lié à l'extrémité 5' de son brin A à un marqueur approprié. 10 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend à l'étape e), la ligation de plusieurs adaptateurs complémentaires différents (BIBI', B2B2'..), chacun comprenant, à l'extrémité 5' du brin B ou à l'extrémité 3' du brin B', une séquence spécifique de 1 à 10 bases. Il') Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce ledit adaptateur BB' tel que défini à l'étape e) comprend un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin B. 12 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'une des amorces telles que définies à l'étape f) est liée à son extrémité 5' à un marqueur approprié. 13 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle g) d'obtention, par tout moyen approprié, de fragments simple-brin à partir des fragments courts F'2 obtenus à l'étape f). 14 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle de purification, par tout moyen approprié, des produits d'amplification obtenus à l'étape f) ou des fragments simple brin obtenus à l'étape g). 15 ) Fragment d'ADN représentant un marqueur génétique, caractérisé en ce qu'il est directement obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, lequel fragment d'ADN présente une séquence inférieure à 100 bases ou paires de bases, comprenant au moins une séquence spécifique constituée par un fragment de séquence génomique ou de séquence d'ADNc bordé respectivement par le site de reconnaissance et le site de clivage d'une enzyme de restriction E2 dont le site de clivage est situé en aval dudit site de reconnaissance et incluant à chaque extrémité au moins 6 bases ou 6 paires de bases de séquence non-spécifique. 16 ) Fragment d'ADN selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment simple-brin. 17 ) Fragment d'ADN selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est lié à l'une de ses extrémités 5' à un marqueur approprié. 18 ) Puce à ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 15 à 17. 19 ) Utilisation d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 comme marqueur génétique. 20 ) Utilisation d'un mélange de fragments d'ADN tel que défini à l'étape d) du procédé ou à l'étape f) ou g) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comme marqueur génétique. 21 ) Méthode d'hybridation d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 ou une puce à ADN selon la revendication 18. 22 ) Kit pour la mise en #uvre d'une méthode d'hybridation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 ou une puce à ADN selon la revendication 18. 23 ) Kit selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend également une sonde oligonucléotidique complémentaire dudit fragment d'ADN. 24 ) Utilisation d'un adaptateur AA' tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 9, pour la préparation de marqueurs génétiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 15 à 17. 25 ) Utilisation d'un adaptateur BB' tel que défini à l'une quelconque des revendications 1,10 et 11, pour la préparation de marqueurs génétiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 15 à 17. 26 ) Utilisation d'un couple d'amorces tel que défini à la revendication 1 ou à la revendication 12, pour la préparation de marqueurs génétiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 15 à 17. 27 ) Kit pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un adaptateur AA' tel que défini tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 9. 28 ) Kit selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il comprend également au moins un adaptateur BB' et un couple d'amorces, tels que définis à la revendication 1 ou à la revendication 12.