Brevet FR2856407A1 — publié le 20041224

Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt et protéine produite. L'invention a pour objet un nouveau procédé de production de protéine d'intérêt, en grande quantité, directement utilisable pour des analyses structurales. L'invention concerne également la protéine recombinante obtenue. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent une superfamille de protéines membranaires caractérisées par 7 domaines transmembranaires (TM # à VII) qui jouent un rôle primordial dans la communication intercellulaire et la réception des signaux sensoriels [1]. Avec plusieurs centaines de membres identifiés, les RCPGs constituent la famille structurale et fonctionnelle de récepteurs membranaires la plus importante. Ils représentent notamment une part significative du génome humain connu à ce jour (au moins 700 récepteurs, 0. 5 % du génome). Exprimés à la surface de toutes les cellules d'un organisme (de la levure à l'homme), ils sont activés par une très grande variété de messages extracellulaires (peptides, hormones, lipides, molécules odorantes, lumière, nucléotides, nucléosides, molécules du goût, etc...). Leur activation entraîne une cascade intracellulaire de signaux par l'intermédiaire de protéines G et résulte en un grand nombre de réponses cellulaires (par exemple division ou contraction cellulaire, neurotransmission). De façon générale, les RCPGs sont impliqués dans chaque fonction physiologique. L'importance de ces récepteurs ainsi que la connaissance de leur localisation cellulaire les désigne comme des cibles idéales de la thérapeutique. Et effectivement, on peut estimer que près de 50% des médicaments sur le marché agissent via les RCPGs. Beaucoup de pathologies sont la conséquence de mutations des RCPGs, et leurs manifestations cliniques sont bien connues, on peut citer par exemple cécité, diabète insipide néphrogénique, hypo- ou hyperthyroïdisme, puberté précoce, obésité [2]. La découverte que certains récepteurs des chémokines sont des cofacteurs de l'infection par le virus HIV renforce l'idée que les RCPGs sont impliqués dans une grande variété de situations pathologiques [3]. Ces considérations générales indiquent clairement la nécessité d'étudier l'architecture fonctionnelle de ces récepteurs, afin de mieux comprendre le processus de transduction du signal et la dynamique de leurs interactions avec diverses molécules (ligands ou partenaires intracellulaires), ainsi que pour développer de nouveaux outils pharmacologiques et thérapeutiques. Cependant, l'étude de l'architecture fonctionnelle des RCPGs par les méthodes expérimentales directes (cristallographie aux rayons X, RMN, spectrométrie de masse) reste encore très limitée. Une seule structure tridimensionnelle (3D) est actuellement connue, celle de la rhodopsine de b#uf [4], du fait du très fort niveau d'expression naturel de ce récepteur dans la rétine. La connaissance de leur architecture fonctionnelle est donc abordée actuellement par un faisceau de méthodes théoriques (modélisation), physico-chimiques (photomarquage, fluorescence) et biologiques (mutagénèse dirigée, pharmacologie moléculaire, knock-out, etc...). Ces études représentent un enjeu industriel et socio-économique de première importance, compte tenu des applications thérapeutiques potentielles. Cependant l'étude structurale et fonctionnelle des RCPGs est très difficile pour diverses raisons : - la nature transmembranaire de ces protéines et leur caractère hydrophobe rendent leur manipulation délicate et conduisent en général à une perte de la fonctionnalité et à une dénaturation après solubilisation ; - les obtenir dans la totalité de leur séquence primaire reste très difficile. La plupart du temps, ils sont exprimés sous forme tronquée [5]. - ils sont exprimés en quantité très faible (0.01% des protéines membranaires) ce qui constitue un blocage à leur purification en grande quantité ; - leur poids moléculaire est élevé (supérieur à 40 kD), et ils sont caractérisés par la présence de modifications post-traductionnelles (glycosylation, palmitoylation, phosphorylation) et de traits structuraux particuliers (ponts disulfure) ; - ce sont des protéines multifonctionnelles possédant des domaines avec des rôles différents : liaison des ligands, activation des protéines G, sites allostériques, zones impliquées dans leur régulation / désensibilisation On comprend aisément que l'étape critique qui constitue actuellement un réel blocage est certainement celle de l'obtention des RCPGs en des quantités compatibles avec les approches de biologie structurale directes . Jusqu'à présent, aucune stratégie de production en grande quantité, généralisable à tous les RCPGs, permettant en outre leur purification sous forme fonctionnelle d'une manière simple, n'a été mise au point. Ponctuellement, certains récepteurs ont été produits en quantité élevée (mgll de culture) [6-8], mais les méthodes mises en place ne s'appliquent pas à une majorité de RCPGs. Les RCPGs ne représentent dans ce domaine de la production en grande quantité d'une protéine qu'un exemple des difficultés que l'on rencontre lorsqu'il s'agit d'obtenir une quantité importante d'une protéine d'intérêt. La présente invention a pour but de fournir un procédé de production en grande quantité d'une protéine d'intérêt, particulièrement des RCPGs. Les inventeurs ont de manière surprenante, montré que la construction de protéines recombinantes, particulièrement de protéines membranaires, très particulièrement de RCPGs, comprenant au moins un fragment d'une intégrine alpha et la protéine d'intérêt, permet d'obtenir des protéines recombinantes pouvant être exprimées en grande quantité. Cette stratégie permet en particulier d'obtenir une production desdites protéine en grande quantité dans des microorganismes, particulièrement dans des bactéries. Lorsque les protéines recombinantes de l'invention sont produites dans des bactéries, elle s'accumulent dans les corps d'inclusion du cytoplasme bactérien. Il est alors nécessaire de renaturer les protéines d'intérêt pour les obtenir sous forme active en une quantité compatible avec une analyse directe de leur structure par exemple par cristallographie aux rayons X ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). Le procédé de l'invention peut permettre en outre la production de protéines non tronquées, particulièrement lorsqu'il est appliqué aux RCPGs. Les intégrines forment une famille de récepteurs liés structurellement et fonctionnellement qui participent aux interactions cellule-cellule et cellule-matrice extra-cellulaire. Toutes les intégrines se présentent sous forme d'hétérodimères de sous-unités alpha et bêta, liées de manière non covalente. Sur la base de leur séquence primaire, toutes les intégrines alpha présentent une région N-terminale constituée de sept séquences en acides aminés répétées (répétition # à VII), chacune comprenant approximativement 60 acides aminés. Certaines sousunités alpha incluent un domaine d'insertion (domaine-1) d'environ 200 acides aminés, situé entre les répétitions Il et III. Les homologies entre les répétitions # et VII comprennent essentiellement des séquences consensus FG et GAP, correspondant aux enchaînements phénylalanine, glycyl-glycyl, alanyl, prolyl, d'où leur dénomination répétition FG-GAP . A la connaissance des inventeurs, la sous-unité alpha des intégrines (par ailleurs appelée intégrine alpha (intégrine a) dans le texte) n'a jamais été utilisée dans la construction de protéines recombinantes. Ainsi, l'invention a pour objet premier l'utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha dans la construction d'une protéine recombinante d'intérêt. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha pour la production d'une protéine recombinante d'intérêt. Par fragment d'une intégrine alpha, on entend aussi bien la séquence en acide aminé complète de l'intégrine alpha utilisée qu'une séquence partielle. La séquence de l'intégrine alpha utilisée peut être native ou mutée. Préférentiellement selon l'invention, la séquence utilisée est une séquence comprenant l'extrémité N-terminale de l'intégrine alpha utilisée, encore plus préférentiellement une séquence correspondant à l'extrémité N-terminale de l'intégrine alpha utilisée. Selon un mode particulier de l'invention, le fragment de l'intégrine alpha utilisée comprend au moins les modules FG-GAP IV à VII et une portion du module FG-GAP III de l'intégrine alpha utilisée. Le fragment de l'intégrine alpha utilisée peut être un fragment de toute intégrine alpha connue. On citera particulièrement les intégrines a1, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, a10, a11, aD, aE, aL, aM, aX, allb ou encore aV. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise un fragment de 287 acides aminés, correspondant à la partie de l'extrémité N-terminale de l'intégrine alpha 5 qui s'étend entre les positions 231 et 517, selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 190 (résidu G) à 476 (résidu G) de l'intégrine alpha5. Lorsque l'on utilise d'autres intégrines alpha, les fragments utilisables selon l'invention sont les fragments homologues aux fragments ci-dessus définis. Par exemple quand il s'agit de l'intégrine aV, le fragment utilisable selon l'invention correspond à la partie de l'extrémité N-terminale de l'intégrine aV qui s'étend des positions 211 (résidu G) à 495 (résidu G) selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 181 (résidu G) à 465 (résidu G) de l'intégrine aV. Quand il s'agit de l'intégrine allb, le fragment utilisable selon l'invention correspond à la partie de l'extrémité Nterminale de l'intégrine allb qui s'étend des positions 224 (résidu G) à 508 (résidu Q), selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 193 (résidu G) à 477 (résidu Q) de l'intégrine allb. Selon un mode particulier de l'invention, le fragment de l'intégrine alpha utilisée comprend au moins une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n 1 (fragment de l'intégrine a5 humaine), SEQ ID n 2 (fragment de l'intégrine V humaine) et SEQ ID N 3 (fragment de l'intégrine allb humaine), de la liste de séquence fournie en annexe. Selon un autre mode particulier de l'invention, le fragment de l'intégrine alpha utilisé comprend au moins une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences en nucléotides, choisie parmi les séquences SEQ ID N 4 (fragment de l'intégrine a5 humaine), SEQ ID N 5 (fragment de l'intégrine V humaine) et SEQ ID N 6 (fragment de l'intégrine allb humaine), de la liste de séquence fournie en annexe. Préférentiellement selon l'invention, le fragment d'intégrine alpha est situé dans la protéine recombinante d'intérêt préparée selon l'invention, en amont de la séquence de la protéine d'intérêt que l'on vise à produire, c'est-à-dire du côté N-terminal de la protéine recombinante d'intérêt que l'on cherche à construire et/ou à produire. L'invention a également pour objet une protéine recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend, fusionnés, au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment et une protéine d'intérêt. La protéine d'intérêt, partie de la protéine recombinante de l'invention, peut être toute protéine que l'on cherche à produire, particulièrement une protéine membranaire, très particulièrement un récepteur couplé aux protéines G (RCPGs). A titre d'exemple pour ces derniers, on peut citer les récepteurs de la vasopressine et de l'ocytocine (V1 a, V2, OTR), les récepteurs des leucotriènes (BLT1, BLT2, CysLT1, CysLT2), les récepteurs adrénergiques (bêta 3), les récepteurs canabinoïdes (CB1). La protéine recombinante de l'invention peut en outre comprendre toute séquence en acides aminés qui permet de la purifier de manière aisée. Ainsi selon un mode particulier de l'invention, la protéine recombinante une séquence de 6 résidus histidine (tag 6xHIS). Ce tag 6xHIS est incorporé dans la séquence de la protéine en vue de sa purification sur colonne de Ni-NTA (Nickelnitrilotriacetic acid) agarose. Préférentiellement, cette séquence est à l'extrémité C-terminale de la protéine recombinante de l'invention. De manière avantageuse, la séquence codant pour les derniers résidus de l'intégrine est mutée pour constituer un site de clivage pour une endoprotéase (facteur Xa, thrombine), qui permettra après expression et purification de la protéine recombinante, de séparer la protéine d'intérêt de son partenaire de fusion. Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le résidu L (position 285) peut être modifié par mutation en un résidu 1, les résidus E et G (positions 286 et 287) étant conservés. Un résidu R supplémentaire peut être introduit par mutagenèse. L'enchaînement ainsi constitué (IEGR) correspond au site de clivage par le facteur Xa qui coupe la protéine après le résidu R. Sous une autre forme de réalisation, le site de clivage au facteur Xa peut être transformé en un site de clivage à la thrombine. Pour cela les résidus 1, E, et G peuvent être remplacés par des résidus L, V et P. Le résidu R est conservé afin d'obtenir l'enchaînement LVPR. Comme le fragment intégrine a été incorporé dans le vecteur côté 3' par un site BamH1 (séquence ggatcc), on obtient donc la séquence ggatcc codant pour deux résidus G et S juste après LVPR. L'enchaînement LVPRGS constitue le site de clivage à la thrombine, qui coupe la protéine après le résidu R. On comprend donc que dans sa forme la plus élaborée, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d'intégrine alpha comportant le site de clivage par une endoprotéase, la protéine d'intérêt et le tag 6xHIS. Sous une forme particulière, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d'intégrine alpha comportant le site de clivage par le facteur Xa, la protéine d'intérêt et le tag 6xHIS. Sous une autre forme particulière, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d'intégrine alpha comportant le site de clivage par la thrombine, la protéine d'intérêt et le tag 6xHIS. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment, dans la construction d'une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment, pour la production d'une protéine recombinante d'intérêt telle que définie précédemment. L'invention a en outre pour objet une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt comprenant au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha, tel que défini précédemment, et une séquence en nucléotides codant pour une protéine d'intérêt, telle que définie précédemment. Préférentiellement, la séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha utilisable selon l'invention ou comprise dans la séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt selon l'invention, peut être choisie parmi les séquences en nucléotides SEQ ID n 4, SEQ ID n 5 et SEQ ID N 6, de la liste de séquence fournie en annexe. L'invention a encore pour objet un vecteur comprenant une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment, comprenant au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha et une séquence en nucléotides codant pour une protéine. Le vecteur peut être un vecteur eucaryote tel qu'un plasmide ou un virus. Le vecteur peut aussi être tout vecteur procaryote tel qu'un plasmide ou un phage. De préférence, le vecteur est un vecteur d'expression, c'est-à-dire capable de permettre la transcription et la traduction de la séquence en nucléotides qu'il contient. A titre d'exemple, il est possible de citer les vecteurs de la famille pET vendu par la société Novagen ou ceux de la famille pGEX vendus par la société AmershamBiosciences. L'invention a encore pour objet une cellule dans laquelle une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment, a été introduite. Selon un mode particulier de l'invention, la séquence a été introduite sous la forme d'un vecteur tel que défini précédemment. Par cellule, on entend ici aussi bien une cellule eucaryote qu'une cellule procaryote, particulièrement une bactérie. Toute bactérie capable de permettre l'expression d'une protéine à partir d'une séquence en nucléotide peut être utilisée selon l'invention. A titre d'exemple, il est possible de citer toutes les bactéries qui dérivent de BL21, BL21 star, Rosetta, BLR, Origami, Tuner, Novablue, toute disponible commercialement. L'invention a encore pour objet un procédé de production d'une protéine d'intérêt, caractérisé en ce que dans une première étape on introduit dans une cellule une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment, et que dans une deuxième étape on place la cellule dans des conditions suffisantes pour permettre l'expression de la protéine recombinante d'intérêt. Le procédé de l'invention peut en outre comprendre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt peut être coupée par action d'une endoprotéase, (facteur Xa, thrombine, par exemple), au site créé dans les derniers résidus de l'intégrine afin de séparer la protéine d'intérêt de son partenaire de fusion. Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt, ou la protéine d'intérêt séparée de son partenaire de fusion, peut être purifiée. Selon le procédé de l'invention, la séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt peut-être introduite dans la cellule par toute méthode connue. A titre d'exemple de méthodes utilisables, il est possible de citer pour les cellules procaryotes, le choc thermique ou l'électroporation. Pour les cellules eucaryotes, on peut citer l'électroporation, la méthode du précipité au phosphate de calcium, l'utilisation de polymères cationiques tels que le DEAEdextran ou encore toute méthode utilisant des liposomes cationiques ou des dendrimères activés. On peut aussi utiliser des rétrovirus pour faire du transfert de gènes ainsi que les techniques utilisant des microprojectiles pour délivrer de l'ADN dans des cellules cibles. De même, toute condition suffisante permettant l'expression de la protéine recombinante d'intérêt, connues de l'homme du métier, sont utilisables selon le procédé de l'invention. Enfin, toute méthode de purification de la protéine, connue de l'homme du métier, peut être utilisée selon le procédé de l'invention. A titre d'exemple, on peut citer les méthodes de chromatographie d'affinité, de chromatographie d'échange d'ions, de chromatographie d'interaction hydrophobes ou encore de filtration sur tamis moléculaire. Particulièrement, lorsque la protéine recombinante d'intérêt comprend le tag 6xHIS, la purification sur colonne Nickel-acide nitrilotriacétique agarose (NiNTA) représente une méthode de purification particulièrement satisfaisante dans le cadre du procédé de l'invention. Les techniques utilisables selon l'invention sont connues de l'homme du métier. Celui-ci peut se référer aux nombreux manuels disponibles et en particulier à "Molecular Cloning, a laboratory manual. 2nd édition, Sambrook, Fritsch, Maniatis eds., CSH laboratory press, (1989)". Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 représente une construction correspondant à un vecteur selon l'invention. La Figure 2 représente la production de la protéine de fusion intégrine a5-récepteur V2 de la vasopressine selon le procédé de l'invention (colonne de gauche : poids moléculaires des protéines de l'échantillon marqueur ; flèche : position de la protéine recombinante intégrine a5-récepteur V2 de la vasopressine, NI : protéines d'un échantillon non-induit, 2h, 3h et 4h : d'un échantillon induit après 2h, 3h et 4h d'induction). La Figure 3 représente la protéine recombinante intégrine a5-récepteur V2 de la vasopressine de la figure 2 après purification et migration sur gel d'électrophorèse. (colonne de gauche : poids moléculaires des protéines de l'échantillon marqueur ; flèche : position de la protéine recombinante intégrine a5-récepteur V2 de la vasopressine) Les exemples suivants sont illustratifs de l'Invention et ne la limitent aucunement Exemple 1 : Construction d'un vecteur permettant l'expression dans les bactéries d'une protéine recombinante d'intérêt : Un ADN complémentaire codant pour la protéine d'intérêt que l'on veut exprimer, est positionné, dans le vecteur pET21 a (+) (vendu par la société Novagen) en phase avec un fragment d'ADN complémentaire de l'intégrine a5, par l'utilisation de sites de restriction appropriés. Le fragment de l'intégrine a5 est délimité par les sites Ndel et BamHI. Le site Ndel a l'avantage d'incorporer un codon ATG qui est le codon initiateur de la traduction. Ce codon initiateur code pour une méthionine (M). Le site Ndel constitué par la séquence CATATG est donc intéressant pour sous-cloner un fragment d'ADN puisque la séquence cible se trouve directement en phase avec le codon ATG. Celui-ci constitue alors le résidu 1. En ce qui concerne l'intégrine alpha5, l'ATG du site Ndel est positionné en amont de sa séquence nucléotidique. Dans ce cas, l'ATG codera pour une M1 et le G de l'intégrine sera le résidu 2. Le fragment de 287 résidus sera couplé à la méthionine 1 et on obtient donc un partenaire de fusion de 288 résidus : M1- G288. Le vecteur fournit directement la séquence codant pour le tag 6xHIS qui sera localisé à l'extrémité C-terminale de la protéine recombinante d'intérêt. Un site EcoRI est localisé dans le vecteur du côté de l'extrémité N-terminale du site tag. Ainsi l'ADN complémentaire codant pour la protéine d'intérêt est inséré entre le site Bam HI marquant l'extrémité C-terminale du fragment d'ADN complémentaire de l'intégrine a5 et le site EcoRI situé du côté de l'extrémité Nterminale du tag 6xHIS. La figure 1 montre le schéma d'une telle construction. Exemple 2 : Expression du récepteur V2 humain de la vasopressine : Construction du vecteur : L'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine (Cotte et al., J. BIOL. Chem. 273,29462-29468, 1998), est inséré entre les sites BamHl et EcoRI du vecteur obtenu à l'exemple 1. Etape 1 : de l'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine : Des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction BamHl et EcoRI sont ajoutés de part et d'autre de la séquence de l'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine. Cela est réalisé par la technique de PCR classique. L'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine est amplifié à partir du vecteur pRK5-V2, (Cotte et al., J. BIOL. Chem. 273,29462-29468, 1998), à l'aide de deux oligonucléotides amorces permettant d'insérer les sites de restriction recherchés : oligo sens (permet l'incorporation du site BamHI) :5' ATG GGT CGC GGA TCC ATG CTC ATG GCG TCC ACC ACT TCC 3' oligo antisens (permet l'incorporation du site EcoRI) : 5' CGA CGG AAT TCT GCG ATG AAG TGT CCT TGG CCA G 3' . La réaction de PCR est réalisée dans 50 microlitres d'un mélange réactionnel comprenant : - pRK5-V2 20 ng - oligo sens 100 ng - oligo antisens 100 ng - Pfu Turbo polymerase (Stratagene) 2. 5 U - tampon Pfu 10X (Stratagene) 5 l - dNTP 80 M final pour chacun des 4 selon les paramètres de cycle suivants : - dénaturation initiale à 95 C pendant 2 minutes puis - 25 cycles :95 C, 30 secondes puis 55 C, 1 minute, 72 C, 1,5 minutes puis - élongation finale à 72 Cpendant 10 minutes. La présence du fragment amplifié (fragment PCR V2 amplifié) est contrôlée sur gel agarose 1 %. Etape 2 : du fragment amplifié (fragment PCR V2 amplifié) : La zone du gel d'agarose où l'on visualise le fragment d'ADN amplifié est découpée et l'ADNc est purifié à l'aide du kit de purification Qiaquick gel extraction kit (référence Qiagen 28706), en suivant strictement le protocole préconisé par le fournisseur. Etape 3 : du fragment PCR V2 amplifié par les enzymes BamHl et EcoRI : Cela est réalisé en une seule étape à l'aide des enzymes vendues par New England Biolabs (NEB) par une incubation de 3 heures à 37 C, dans un volume final de 50 microlitres contenant : - insert V2 (fragment amplifié) 100 à 200 ng 24 l - tampon EcoRI 10X NEB 5 l - sérum albumine bovine NEB 100X (10 mg/ml) 1 l - EcoRI ( 40 U ) 2 l - BamHI ( 40 U ) 2 l - eau 16 l En fin de réaction, les deux enzymes sont inactivées par chauffage à 80 C. pendant 20 minutes. Le fragment PCR V2 est alors purifié à partir d'un gel d'agarose 1 % selon le protocole décrit ci-dessus. Etape 3 : sous-clonage du fragment PCR V2 amplifié dans les sites BamHl et EcoRI du vecteur pET21a de l'exemple 1 : La ligation est réalisée par incubation à température ambiante (20-25 C) pendant 4 heures dans un milieu comprenant : - fragment PCR V2 BamHl / EcoRI (100 à 200 ng) 8 l - vecteur pET21a (30 ng) coupé par BamHI / EcoRI 3 l - tampon ligase 10X (NEB) 2.5 l - T4 DNA ligase (NEB) 2 ni - eau 9.5 [il. Le produit de ligation, protéine de fusion intégrine-récepteur V2 humain de la vasopressine, est ensuite utilisé pour une transformation des bactéries Rosetta (DE3) afin de réaliser les tests d'expression du récepteur. Introduction du vecteur d'expression dans une bactérie et expression de la protéine d'intérêt : Transformation : Le vecteur obtenu précédemment est ensuite introduit dans une bactérie de souche Rosetta (DE3) par la technique du choc thermique en suivant le protocole de transformation préconisé par le fournisseur, en l'occurrence Novagen. 20 l de bactéries Rosetta (DE3) référence Novagen 70954-4 et 1 l de pET21a-intégrine/V2 (quelques nanogrammes) sont incubés sur glace 30 minutes, puis maintenus à 42 C pendant 30 secondes et de nouveau sur glace pendant 2 minutes pour réaliser un choc thermique. 80 l de milieu SOC (voir composition dans Molecular Cloning, a laboratory manual. 2nd édition, Sambrook, Fritsch, Maniatis eds. CSH laboratory press, 1989) sont alors ajoutés, puis l'ensemble est incubé à 37 C pendant 1 heure sous agitation à 300 tours/minutes. Le milieu d'incubation est alors étalé sur boîtes de pétri contenant du milieu LB agar + ampicilline à 100 microgrammes / ml. Les boîtes sont incubées à 37 C 16 heures. Les bactéries d'une colonie sont alors cultivées à 37 C dans 10 ml de milieu LB contenant 100 g/ml d'ampicilline (ou de son analogue la carbenicilline), et la suspension cellulaire est agitée à 300 tours/minutes. Expression de la protéine : Lorsque la densité optique de la culture atteint 0. 6 U, l'expression de la protéine recombinante est induite par addition d'IPTG 1 mM. Des échantillons sont prélevés 2,3 ou 4 heures après induction. Pour cela, 1 ml de suspension bactérienne, à densité optique de 0,6, est prélevé dans chaque culture. L'échantillon est centrifugé pendant 2 minutes à 12000 tours par minutes. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 60 l de tampon de lyse (25 mM Tris, pH8,3,185 mM glycine, 0,1% SDS). 60 l de tampon de dépôt au SDS (10% glycérol, 5% 2-mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCI, pH 6,5,8% SDS, bleu de bromophénol (quelques grains)) sont alors ajoutés et 10 l de l'échantillon lysé (extraits protéiques totaux) sont alors déposés sur gel d'acrylamide/bis-acrylamide 12% - SDS 0. 1 %. Après migration des protéines, elles sont colorées au bleu de Coomassie selon les techniques habituelles. La Figure 2 représente les résultats obtenus. Les échantillons induits sont comparés à des contrôles non induits (NI) mais ayant été cultivés pendant un temps équivalent. Il est évident que la protéine de fusion a5-récepteur V2, qui présente un poids moléculaire apparent autour de 65 kDa, constitue une des protéines majoritaires de la bactérie, ce qui est une condition requise pour une purification du récepteur en quantité compatible avec des analyses de sa structure via des approches de cristallographie ou RMN. 1 ml de culture ainsi réalisée a permis d'obtenir environ 3 g de récepteur de la vasopressine. Exemple 3 : Expression d'autres récepteurs : Le résultat obtenu à l'exemple 2 a été reproduit avec la même efficacité, pour d'autres RCPGs, tels que le récepteur (33-adrénergique, les récepteurs BLT2, Cys-LT1 et Cys-LT2 des leucotriènes LTB4, LTD4 et LTC4, le récepteur cannabinoïde de type 1, le récepteur V1a de la vasopressine et le récepteur de l'ocytocine. Exemple 4 : Purification de la protéine de fusion fragment d'intégrine a5récepteur V2 de la vasopressine obtenu à l'exemple 2 : La méthode utilisée est celle décrite par Porath J. et collaborateurs, (Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 598-599, 1975) L'exemple exposé ici est un essai qui a permis de purifier 3 mg de protéine fusion à partir d'une culture bactérienne de 100 ml. Une colonie isolée sur LB agar + Ampicilline (100 g / ml) est piquée et cultivée dans 10 ml de milieu de culture LB + carbenicilline (100 g / ml). La culture est réalisée à 37 C, sous agitation à 300 tours par minute. Lorsque la densité optique de la culture atteint 0,6, la culture est arrêtée et conservée au réfrigérateur (cet échantillon est appelé préculture). Le lendemain, dans un Erlenmeyer de 500 ml, 100 ml de milieu de culture LB + carbenicilline (100 g / ml) sont ensemencés avec 2 ml de préculture et laissé 37 C, à 300 tours par minute jusqu'à ce que la densité optique de la culture ait atteint 0,6.0,1 mM d'IPTG sont alors ajoutés à la culture afin d'induire l'expression de la protéine recombinante. La culture est poursuivie environ 3 heures, jusqu'à obtention d'un densité optique de 2,4 (facteur de stimulation de 4). La culture est alors centrifugée à 4000 tours par minute pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot peut être lysé directement ou conservé à -80 C. Pour la lyse, le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 6 ml de Tris-HCI 20 mM, pH 8,00 + inhibiteurs de protéases (leupeptine 5 g / ml ; benzamidine 10 g / ml et PMSF 10 g / ml). Ces trois inhibiteurs de protéases seront incorporés à tous les tampons utilisés par la suite. Les bactéries sont lysées par sonication à l'aide d'une microsonde conique Branson (duty cycle 50%, output control 5, fréquence 1 burst par seconde pendant 30 secondes, puis repos 30 secondes ; ce cycle est répété 5 fois). Le tube est conservé dans la glace pendant la sonication. Le milieu est alors centrifugé pendant 30 minutes à 15000 tours par minute à 4 C. Le surnageant est conservé pour contrôle sur gel d'électrophorèse. Le culot contient la protéine d'intérêt puisque celle-ci est accumulée en corps d'inclusion. Le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCI 20 mM, pH 8,00. Les étapes de lyse et de centrifugation sont répétées une fois. Les surnageants des centrifugations sont conservés pour contrôle sur gel d'électrophorèse. Le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCI, pH 8,00, urée 1 M. Un barreau aimanté est placé dans l'échantillon et celui-ci est agité doucement pendant 1 h30. Le tube est conservé dans la glace pendant cette étape qui correspond à un lavage des corps d'inclusion et permet d'éliminer des protéines membranaires ou cytoplasmiques associées aux corps d'inclusion mais qui sont considérées comme contaminantes par rapport à la protéine recombinante. L'ensemble est alors centrifugé à 15000 tours par minute pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant est conservé pour contrôle sur gel d'électrophorèse. Afin de solubiliser les corps d'inclusion et donc la protéine d'intérêt, le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCI 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0. 2%. Un barreau aimanté est placé dans l'échantillon et celui-ci est agité doucement pendant 3 heures, dans la glace. La protéine d'intérêt (la protéine de fusion fragment d'intégrine a5-récepteur V2 de la vasopressine) est alors complètement dénaturée. L'ensemble est alors centrifugé à 15000 tours par minute pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant contient la protéine d'intérêt et constitue l'échantillon qui sera mis en contact avec la résine Ni-NTA (Nickel-nitriloacetic acid) afin de purifier la fusion alpha5-V2 par chromatographie d'affinité. 3 ml de résine Ni-NTA agarose Superflow (Qiagen, ref 30430) sont équilibrés dans du Tris-HCI 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCI 150 mM, imidazole 5 mM. On rajoute dans l'échantillon contenant la protéine d'intérêt une quantité suffisante de NaCI et d'imidazole pour obtenir une concentration finale de 150 mM de NaCI et de 5 mM d'imidazole. L'échantillon et la résine sont mis en contact et on laisse incuber à 4 C pendant 16 heures et sous agitation douce. Le mélange échantillon/résine est déposé dans une colonne plastique. On laisse Après la décantation, la fraction "flowthrough" est récupérée à un débit faible, pour contrôle sur gel d'électrophorèse. La résine est alors lavée avec 3 x 9 ml d'une solution de Tris-HCI 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCI 150 mM, imidazole 20 mM, pour éliminer toutes les protéines non retenues de façon spécifique sur les groupements Nickel. Les éluats de lavage sont conservés pour contrôle sur gel d'électrophorèse. La protéine d'intérêt est alors détachée de la résine par passage de 3 ml d'une solution de Tris-HCI 20 mM pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCI 150 mM, imidazole 100 mM. Un aliquot de la protéine purifiée est conservé pour contrôle sur gel d'électrophorèse. 10 [il du milieu contenant la protéine purifiée sont mélangés à 10 ul de tampon de dépôt au SDS et l'ensemble est déposé sur un gel d'électrophorèse. 10 l d'échantillon purifié contiennent de 5 à 10 g de protéine soit dans 3 ml d'éluat, 1,5 à 3 mg de protéine recombinante. La figure 3 montre la protéine purifiée déposée sur gel d'électrophorèse. L'échantillon purifié est dialysé contre une solution de Tris-HCI 20 mM, pH 8,00, urée 6M, NaCI 150 mM pour éliminer le SDS et l'imidazole. Pour cela, l'échantillon est placé dans une cassette de dialyse Pierce (membrane de MWCO de 10000) et la dialyse se fait dans un Becher contenant un litre du tampon. La dialyse est effectuée à 4 C pendant au moins 24 heures. L'échantillon est récupéré et la quantité de protéine d'intérêt obtenue est dosée par mesure d'absorption (excitation à 280 nM, absorption entre 235 et 500 nM). En général, on obtient une D.O de 1 à 1. 5, ce qui est équivalent à une concentration de 0. 5 à 1 mg / ml, ce qui est équivalent à une concentration de l'ordre de 10 M. La protéine purifiée et dénaturée (car solubilisée dans l'urée 6M) est utilisée pour les essais de renaturation. Références 1. Bockaert J. and Pin JP. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors :an evolutionary success. EMBO J. 18,1723-1729, 1999. 2. Bockaert J. Les récepteurs à sept domaines transmembranaires : physiologie et pathologie de la transduction. Médecine/Sciences 11,382-394, 1995. 3. Samson M., Libert F., Doranz B. J., Rucker J., Liesnard C., Farber C.M., Saragosti S., Lapoumeroulie C., Cognaux J., Forceille C., Muyldermans G., Verhofstede C., Burtonboy G., Georges M., Imai T., Rana S., Yi Y., Smyth R.J., Collman R.G., Doms R. W., Vassart G. and Parmentier M. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 382,722-725, 1996. 4. Palczewski K., Kumasaka T., Hori T., Behnke CA., Motoshima H., Fox BA., LeTrong I., Teller DC., Okada T., Stenkamp RE., Yamamoto M. and Miyano M. Crystal structure of rhodopsin : G protein-coupled receptor. Science 289, 739-745,2000. 5. Kiefer H., Vogel R. and Maier K. Bacterial expression of G proteincoupled receptors : prediction of expression levels from séquence. Receptors and Channels 7, 109-119, 2000. 6. Tucker J. and Grisshammer R. Purification of rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem J., 317, 891-899, 1996. 7. Kiefer H., Krieger J., Olszewski JD., Von Heijne G., Prestwich GD. And Breer H. Expression of an olfactory receptor in Escherichia coli : purification, reconstitution and ligand binding. Biochemistry 35, 16077-16084,1996. 8. Wei HM. and Grisshammer R. Purification and characterization of the human adenosine A2a receptor functionally expressed in escherichia coli. Eur. J. Biochem. 269,82-92, 2002. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha dans la construction d'une protéine recombinante d'intérêt. 2) Utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha pour la production d'une protéine recombinante d'intérêt. 3) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha est une séquence en acide aminé complète de l'intégrine alpha ou une séquence partielle. 4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha est une séquence comprenant l'extrémité N-terminale de l'intégrine alpha utilisée. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'intégrine alpha est native ou mutée. 6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha comprend au moins les modules FG-GAP IV à VII et une portion du module FG-GAP III de l'intégrine alpha utilisée. 7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha provient d'une intégrine alpha choisie parmi les intégrines a1, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, [alpha]9, a10, a11, aD, aE, aL, aM, aX, allb, ou encore aV. 8) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha provient d'une intégrine alpha choisie parmi les intégrines a5, aV ou allb. 9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le fragment de l'intégrine alpha 5 s'étend entre les positions 231 et 517 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 190 à 476 (en ne tenant pas compte de la présence du peptide signal). 10) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le fragment de l'intégrine aV s'étend entre les positions 211 et 495 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 181 à 465 (en ne tenant pas compte de la présence du peptide signal). 11) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le fragment de l'intégrine allb s'étend entre les positions 224 et 508 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 193 à 477 (en ne tenant pas compte de la présence du peptide signal). 12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha comprend au moins une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n 1, SEQ ID n 2 et SEQ ID N 3 de la liste de séquence fournie en annexe. 13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha comprend au moins une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences en nucléotides choisie parmi les séquences SEQ ID n 4, SEQ ID n 5 et SEQ ID N 6, de la liste de séquence fournie en annexe. 14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le fragment d'intégrine alpha est situé dans la protéine recombinante d'intérêt préparée selon l'invention, en amont de la séquence de la protéine d'intérêt que l'on vise à produire. 15) Protéine recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14 et une protéine d'intérêt. 16) Protéine recombinante selon la revendication 15, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est une protéine membranaire. 17) Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est un récepteur couplé aux protéines G. 18) Protéine recombinante selon la revendication 17, caractérisée en ce que le un récepteur couplé aux protéines G est choisi parmi les récepteurs de la vasopressine et de l'ocytocine (V1 a, V2, OTR), les récepteurs des leucotriènes (BLT1, BLT2, CysLT1, CysLT2), les récepteurs adrénergiques (bêta 3), les récepteurs canabinoïdes (CB1). 19) Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de 6 résidus histidine (tag 6xHIS). 20) Protéine recombinante selon la revendication 19, caractérisée en ce que la séquence de 6 résidus histidine est à l'extrémité C-terminale de la protéine. 21) Utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans la construction d'une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 15 à 20. 22) Séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 15 à 20. 23) Vecteur comprenant une séquence en nucléotides telle que décrite à la revendication 22. 24) Cellule dans laquelle une séquence en nucléotides telle que décrite à la revendication 22 ou un vecteur tel que décrit à la revendication 23 a été introduit. 25) Procédé de production d'une protéine d'intérêt, caractérisé en ce que dans une première étape on introduit dans une cellule une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que décrite à la revendication 22, et que dans une deuxième étape on place la cellule dans des conditions permettant l'expression de la protéine recombinante d'intérêt. 26) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt est coupée par action d'une endoprotéase. 27) Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt ou la protéine d'intérêt séparée de son partenaire de fusion, est purifiée.