Brevet FR2855177A1 — publié le 20041126

COMPOSITION CONTENANT DES ACIDES NUCLEIQUES LYOPHILISES EN PRESENCE DE COLLAGENE ET DE DISACCHARIDES La présente invention concerne une méthode d'obtention d'une composition contenant des acides nucléiques par lyophilisation d'une solution aqueuse d'acides nucléiques en présence de disaccharides et de collagène, de préférence de tréhalose et de collagène. Elle porte également sur les compositions lyophilisées contenant des acides nucléiques, notamment des mélanges lyophilisés prêt à l'emploi contenant des composants nécessaires à l'amplification des acides nucléiques par PCR. Les acides nucléiques et plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques sont utilisés dans de nombreuses applications de biologie moléculaire, notamment dans les milieux réactionnels pour la réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction, PCR), le séquençage ou la transcription inverse (Reverse Transcription, RT). En particulier, la réaction de polymérisation en chaîne (ci-après désignée par le terme PCR ) permet d'amplifier une séquence d'ADN jusqu'à un million de fois et de détecter ainsi des séquences présentes dans un échantillon en très faible quantité, détectable après amplification. Pour la mise en oeuvre d'une réaction PCR, des oligonucléotides capables d'hybrider aux extrémités de la séquence à amplifier sont préparés, en général par synthèse chimique. Ces oligonucléotides servent d'amorces pour la synthèse in vitro d'ADN catalysée par une ADN polymérase thermostable en présence de 2'-désoribonucléoside-5'-triphosphate. Chaque cycle de la PCR requiert une étape de dénaturation de l'ADN à amplifier, une étape d'hybridation des amorces et une étape d'élongation. Pour obtenir une amplification suffisante, la PCR comprend en général de 25 à 40 cycles. La PCR est décrite plus en détail, en particulier dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159. Différentes méthodes alternatives ont également été décrites dans l'état de la technique incluant notamment les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid séquence based amplification), la SSR (self sustained séquence replication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification). Il est par ailleurs possible de combiner préalablement à la PCR, une réaction de transcription inverse (RT-PCR). La réaction de transcription inverse permet de transcrire un ARN messager en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'une transcriptase inverse (reverse transcriptase). Il est connu que les acides nucléiques, et en particulier les dNTPs ou les oligonucléotides sont des produits peu stables en solution et sont rapidement dénaturés lorsqu'ils sont conservés en solution à température ambiante. Pour ces raisons, les oligonucléotides et les dNTPs utilisables pour une réaction de PCR sont en général conservés sous une forme cristallisée (ou séchée), puis réhydratés et ajoutés au mélange réactionnel au moment de la mise en #uvre de la réaction PCR. Les brevets américains US 5,861,251 et US 6,153,412 décrivent la préparation d'une composition lyophilisée formulée comme mélange prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre de réactions PCR, comprenant l'utilisation d'un agent stabilisant, une ADN polymérase, des dNTPs et du chlorure de magnésium, préalablement à l'étape de lyophilisation. Parmi ces agents stabilisants, sont cités la gélatine, la BSA, le Thesit, le PEG8000 et les polyols, tels que le ficoll, le sucrose, le glycérol, le glucose, le mannitol, le galacitol, le glucitol et le sorbitol. Le tréhalose est également cité comme agent stabilisant d'une composition lyophilisés formulée comme mélange prêt à l'emploi pour la mise en #uvre de réactions RT-PCR (US 5,832,254), et plus généralement pour la lyophilisation ou la déshydratation de macromolécules biologiques, plus particulièrement des protéines (US 5,834,254). Afin de maintenir la structure tri-dimensionnelle des protéines lorsque celles-ci sont dans des conditions d'environnement facilitant leur dénaturation, on a recours également à différents agents stabilisants et notamment des protéines telles que l'albumine ou le collagène. Le collagène est notamment connu comme agent stabilisant de protéines, notamment de protéines lyophilisées. Les techniques d'amplification d'acides nucléiques sont utilisées dans de nombreux domaines, notamment en agro-alimentaire ou en agriculture, pour le diagnostic médical, pour la mise en #uvre de tests génétiques, en archéologie, en criminologie. Compte tenu de l'utilisation croissante de ces techniques dans des domaines très variés, il existe un réel besoin de développer des kits pour la mise en #uvre de ces méthodes qui puissent être conservés à température ambiante, sur de longues périodes. En outre, afin de réduire les risques de contamination lors de la mise en #uvre de la réaction et la préparation des mélanges réactionnels, des mélanges prêt à l'emploi contenant une majorité de réactifs préaliquotés dans les quantités appropriées sont plus particulièrement recherchés. L'aspect des compositions lyophilisées est un facteur important dans le cadre d'une commercialisation de ces compositions, notamment pour la mise en #uvre de réactions de biologie moléculaire telles que la PCR. En effet, une présentation des compositions lyophilisées sous une forme compacte et dense est généralement considérée par l'homme du métier comme un gage de bonne qualité. La présente invention résulte en particulier de la constatation que la lyophilisation de compositions d'acides nucléiques en présence d'une combinaison de disaccharides et de collagène permet d'améliorer très significativement le temps de conservation à température ambiante des acides nucléiques et notamment des oligonucléotides ou de mélanges de dNTPs. La présente invention résulte également de la constatation que la lyophilisation de compositions d'acides nucléiques en présence d'une combinaison de disaccharides et de collagène permet d'obtenir un aspect compact et dense des compositions, tel que recherché dans le cadre d'une commercialisation. A la connaissance de la demanderesse, l'utilisation combinée de tréhalose et de collagène comme agent de stabilisation et/ou de compaction d'acides nucléiques lyophilisés n'a jamais été décrite ni suggérée dans l'état de la technique. Au sens de l'invention, le terme nucléotide signifie, sauf précision spécifique, une molécule constituée d'une base azotée (généralement l'adénine, la thymine ou l'uracile, la cytosine et la guanine), un sucre (ribose ou désoxyribose) et un ou plusieurs groupes phosphate. Un nucléotide est notamment un ribonucléoside-5'-triphosphate ou un désoxyribonucléoside- 5'-triphosphate et leurs dérivés qui peuvent servir de substrats pour les ADN polymérase ou les ARN polymérase. En particulier il s'agit du dATP, dGTP, dITP, dUTP, dCTP, dTTP, ou de l'ATP, GTP, ITP, UTP, CTP, TTP. Le terme dNTPs signifie, au sens de l'invention, un mélange équimolaire de dATP, dCTP, dGTP et dTTP. Le terme polynucléotide signifie, au sens de l'invention, sauf précision spécifique, un polymère de nucléotides comprenant au moins 50 nucléotides, simple brin ou double brin, ADN ou ARN notamment. Le terme oligonucléotide signifie, au sens de l'invention, sauf précision spécifique, un polymère de nucléotides simple brin comprenant au plus 50 nucléotides, de préférence de 10 à 30 nucléotides. Le terme acide nucléique fait référence indifféremment aux nucléotides, aux oligonucléotides ou aux polynucléotides simple brin ou double brins. La présente invention concerne en particulier une méthode d'obtention d'une composition lyophilisée contenant des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend la lyophilisation d'une solution aqueuse d'acides nucléiques en présence de disaccharides et de collagène. Tout disaccharide et leurs combinaisons peuvent être utilisés dans la méthode de l'invention. On citera en particulier le saccharose, le maltose, le lactose et le tréhalose. Dans un mode de réalisation particulier, on utilisera le tréhalose. Le collagène utilisé dans la méthode de l'invention peut être par exemple un collagène obtenu par hydrolyse thermique de collagène de derme d'un mammifère, et notamment un collagène obtenu par hydrolyse thermique à 145 C de collagène de derme de porc, hautement purifié. Les quantités de disaccharides et de collagène seront optimisées par l'homme du métier de sorte à obtenir la meilleure stabilité possible des acides nucléiques. La stabilité des acides nucléiques peut être mesurée par exemple par comparaison de la sensibilité d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques en présence des acides nucléiques testés après une période de conservation déterminée et des acides nucléiques contrôle préparé extemporanément. Dans un mode de mise en #uvre particulier, la solution aqueuse comprend, 800 M d'acides nucléiques (4 X 200 M de dNTP), de 150 mM à 600 mM de disaccharides, et de 0,1 % à 1 % de collagène. La solution aqueuse peut comprendre au moins l'un des acides nucléiques suivants : # un 2'désoxyribonucléoside-5'-triphosphate; # un oligonucléotide ; # un polynucléotide. Les acides nucléiques de faible poids moléculaire sont plus particulièrement instables. La présente invention est appropriée pour fournir des compositions contenant des acides nucléiques de faible poids moléculaire stabilisés par lyophilisation en présence de disaccharides et de collagène. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon l'invention, les acides nucléiques contenus dans la solution aqueuse sont des oligonucléotides ou des nucléotides, et notamment des dNTPs. La méthode de l'invention permet en particulier d'obtenir des compositions lyophilisées pour la mise en #uvre de réactions de biologie moléculaire, comprenant des acides nucléiques et tout autre élément utile dans la mise en #uvre d'une réaction de biologie moléculaire. Parmi ces éléments, on citera les enzymes utilisant comme substrat ou co-substrat des acides nucléiques, les tampons de réaction, les agents stabilisants ou cofacteurs d'enzymes, les agents réducteurs et les colorants. Parmi les enzymes utilisant comme substrat ou co-substrat des acides nucléiques, on citera à titre d'exemples, les ADN polymérases et notamment les ADN polymérases thermostables, les ADN polymérases sur matrice d'ARN (transcriptase inverse), les ARN polymérase et les enzymes à activité correctrice 5'-3'. Parmi les agents stabilisants ou cofacteurs, on citera en particulier les sels de métaux tels que les sels de zinc ou de magnésium, les protéines, les disaccharides ou encore le polyvinylpyrrolidone (PVP). Parmi les colorants, on citera par exemple le bleu de bromophénol, le cyanole de xylène, le rouge de bromocresol ou le rouge de cresol. Selon les applications souhaitées, l'homme du métier choisira, parmi les composants décrits ci-dessus, les composants à ajouter dans la solution aqueuse avant la lyophilisation, dans les quantités appropriées pour que l'application puisse être mise en #uvre directement après réhydratation de la composition lyophilisée ou à tout le moins, en minimisant la quantité de composants à ajouter. La présente invention vise en particulier l'obtention de compositions formulées comme mélanges prêt à l'emploi pour l'amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Pour la préparation de tels mélanges, la solution aqueuse préparée avant lyophilisation comprend par exemple, en plus du tréhalose et du collagène, les composants suivants : # un mélange de 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates (dNTPs) ; # un tampon de réaction ;et # le cas échéant, un oligonucléotide ; du chlorure de magnésium ; une ADN polymérase ; une enzyme à activité correctrice 5'-3' et/ou un colorant. Le terme prêt à l'emploi signifie dans le texte que les composants du mélange sont présents dans des quantités appropriées pour la mise en #uvre d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) après réhydratation sans modifier les quantités respectives de chacun des composants présents initialement dans le mélange lyophilisé. Bien entendu, pour la mise en #uvre de la réaction, l'homme du métier devra le cas échéant ajouter certains composants non présents initialement dans le mélange lyophilisé. Dans un mode de réalisation particulier, une telle composition selon l'invention ne comprend pas d'enzymes, en particulier, ne comprend pas d'ADN polymérase. Un exemple de solution aqueuse en vue de la préparation de mélanges lyophilisés prêt à l'emploi pour l'amplification d'acides nucléiques par PCR est une solution comprenant, outre le tréhalose et le glycogène, # un mélange de 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates (dNTPs) ; # un tampon de réaction ; # un ou plusieurs couples d'amorces, chaque couple d'amorces permettant l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques particulière ; # une ADN polymérase ; et # du chlorure de magnésium. Il est bien connu que la conservation et la lyophilisation d'acides nucléiques sont d'autant moins efficaces que les quantités lyophilisées sont réduites. Or, dans la majorité des applications de mélange lyophilisé prêt à l'emploi , les quantités d'acides nucléiques, notamment de dNTPs ou d'oligonucléotides sont inférieures à 3000 M. Un des avantages de la présente invention est qu'elle permet de lyophiliser et de conserver sous une forme lyophilisée de très petites quantités d'acides nucléiques. Dans un mode de mise en #uvre de la méthode, la solution aqueuse contient une quantité d'acide nucléique inférieure à 3000 M, de préférence comprise entre 600 M et 1000 M et dans la majorité des applications une quantité de 800 M (4 X 200 M dNTP). Selon la méthode de l'invention, la lyophilisation consiste à congeler la solution, puis à sublimer l'eau par réchauffement sous vide de manière à éliminer l'eau et ne garder que les produits déshydratés. Les techniques de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier. Un exemple de protocole de lyophilisation est en outre décrit dans la partie expérimentale. Dans un mode de réalisation particulier, les paramètres suivants sont compris dans les plages indiquées ci-après : Température de congélation : entre - 20 C et - 50 C La température des plateaux : entre 0 C et 30 C La température du piège : entre - 10 C et - 60 C La valeur de vide : entre 0,1et 0,01mbar Et l'arrêt de la lyophilisation 3 à 10 heures après stabilisation de la température du produit lyophilisé entre 10 C et 40 C. Les valeurs de ces paramètres peuvent être adaptées selon le type de solution à lyophiliser. La présente inventive vise naturellement une composition lyophilisée contenant des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend des disaccharides et du collagène, par exemple du tréhalose et du collagène. De telles compositions sont notamment celles susceptibles d'être obtenues par la méthode décrite ci-dessus. Les compositions lyophilisées selon l'invention comprennent en général de 5 à 50 mmoles de disaccharides et 40 à 400 g de collagène. Dans un mode de réalisation particulier, une composition lyophilisée selon l'invention comprend une quantité d'acide nucléique inférieure à 100 Immoles, de préférence comprise entre 20 moles et 30 moles. A titre d'exemple, un acide nucléique compris dans la composition lyophilisée selon l'invention est un 2'désoxyribonucléoside-5'-phosphates; un oligonucléotide ; et/ou un polynucléotide, en particulier un mélange de dNTPs ou un ou plusieurs oligonucléotide(s). Dans un mode de réalisation particulier, les compositions selon l'invention sont formulées comme mélange prêt à l'emploi pour le séquençage de molécules d'ADN selon la méthode de Sanger (Sanger, 1977). Une telle composition lyophilisée comprend, outre le disaccharide et le collagène, des dNTPs et des didésoribonucléoside-5'-triphosphate (ddNTPs). Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition lyophilisée selon l'invention est un mélange lyophilisé prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre de réaction PCR, comprenant, en plus du disaccharide et du collagène, au moins les composants suivants : # un mélange de 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates (dNTPs) ; # un tampon ;et # le cas échéant, un oligonucléotide ; du chlorure de magnésium ; une ADN polymérase ; et/ou un colorant ; Par exemple, un mélange lyophilisé prêt à l'emploi selon l'invention pour l'amplification d'acides nucléiques par PCR est une composition lyophilisée comprenant : - des disaccharides de 5 à 50 mmoles - 40 à 400 g de collagène - un ou plusieurs couples d'oligonucléotides de 4 ).!moles à 20 immoles - des dNTPs de 20 à 30 ).!moles - une ADN polymérase : 0,1 à 5 unités La réaction de PCR pourra être mise en #uvre après réhydratation de la composition lyophilisée définie ci-dessus en ajoutant une solution susceptible de contenir en particulier la séquence d'acide nucléique à amplifier. Dans un mode de réalisation particulier de la composition définie ci-dessus, les quantités de chacun de ces composants sont appropriées pour la mise en #uvre d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques par PCR après réhydratation de la composition dans un volume d'eau ou d'une solution appropriée pour la mise en #uvre de réaction PCR, et notamment d'un tampon approprié, compris entre 10 et 100 \iL. Les compositions lyophilisées selon l'invention peuvent être contenues dans un microtube utilisable dans un thermocycleur pour les réactions de PCR. En général, un microtube utilisable dans un thermocycleur pour les réactions de PCR, est un microtube en polypropylène à parois fines susceptible de contenir un volume réactionnel compris entre 50 l et 200 l, de préférence de 50 l à 100 l. L'invention concerne également un procédé d'amplification d'acide nucléique, comprenant la réhydratation d'une composition lyophilisée formulée comme mélange prêt à l'emploi pour la mise en #uvre de réaction PCR telle que définie ci-dessus, par l'ajout d'une solution aqueuse comprenant le cas échéant un ou plusieurs composants nécessaires à l'amplification d'acides nucléiques par PCR et en particulier une matrice d'ADN et/ou un couple d'oligonucléotides. L'invention vise également toute utilisation d'une combinaison de disaccharides et de collagène comme agent de stabilisation et/ou de compaction d'acides nucléiques lyophilisés, en particulier d'une combinaison de tréhalose et de collagène. La présente invention et ses avantages sont illustrées par les exemples suivants. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : La figure 1 illustre le protocole de lyophilisation. Courbe A : @ température du produit lyophilisé Courbe B : @ température des plateaux Courbe C : @ température de piège Courbe D : ...... valeur de vide Figure 2 : Aspect des lyophilisats La figure 2 illustre l'aspect des mélanges obtenus après lyophilisation - en absence de conservateur (mélange 1) - en présence de tréhalose (mélange 2) - en présence de collagène (mélange 3) - en présence de tréhalose et de collagène (mélange 4). Figure 3 : Electrophorèse des amplificons d'ADN de Bordetella pertussis obtenus par PCR à partir de : 1000 bactéries = piste a 100 bactéries = piste b 10 bactéries = piste c 1 bactérie = piste d Mélange 1 : Produit non lyophilisé contenant les éléments constituant le tampon de réaction, les dNTPs, l'ADN polymérase et les amorces. Mélange 2 : Produit lyophilisé dans des microtubes contenant les éléments constituant le tampon de réaction, les dNTPs, l'ADN polymérase, les amorces et le tréhalose. Mélange 3 : Produit lyophilisé dans des microtubes contenant les éléments constituant le tampon de réaction, les dNTPs, l'ADN polymérase, les amorces et le PrionexR (collagène obtenu par hydrolyse thermique de collagène de derme de porc, hautement purifié). Mélange 4 : Produit lyophilisé dans des microtubes contenant les éléments constituant le tampon de réaction, les dNTPs, l'ADN polymérase, les amorces, le tréhalose et le PrionexR. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'une composition lyophilisée formulée comme mélange prêt à l'emploi Dans un microtube [par PCR de 200 L], on dépose 40 l d'une solution aqueuse contenant : Tampon de réaction : Tris HCI (10 mM - pH 8,4); KCI (50 mM); MgCl2 (1,5 mM) Mélange dNTPs : 200 M de chaque ADN polymérase : 2,5 unités (Hotstart Taq) Amorces (facultatif): 1 M Disaccharides : 300 mM Collagène 0,5% La lyophilisation est effectuée selon le protocole suivant (tel qu'illustré à la figure 1) : - une congélation progressive des compositions jusqu'à -20 C - un chauffage des plateaux à 20 C - une température du piège à -50 C - une valeur de vide de 0,05 mbar - un arrêt de la lyophilisation lorsque la température des produits atteint 20 C. La composition ainsi lyophilisée peut être conservée à température ambiante jusqu'à au moins trois mois sans perte d'activité. Pour la mise en #uvre de la réaction PCR, la composition est réhydratée avec 45 l d'eau et 5 L de matrice d'ADN et le cas échéant les amorces à une concentration finale de 1 M. La réaction PCR est mise en oeuvre à l'aide d'un thermocycleur Perkins et comprend : 95 C 15 mn 1 cycle 95 C 30 s 65 C 30 s 40 cycles 72 C 1 mn 72 C 10 m 1 cycle 8 c Infini Exemple 2 : Composition lyophilisée contenant des dNTPs Un mélange lyophilisé de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) est préparé par lyophilisation d'un mL d'une solution aqueuse comprenant : Tréhalose...... 300mM Collagène...... 0,5% dNTPs.......... 2 mM de chaque dNTP Tampon........ Tris HCI (100 mM-pH 8,4) KCI (50 mM) MgCI2 (15 mM) Une réhydratation de cette solution dans un 1 ml d'eau distillée permet d'obtenir une solution de dNTPs à 8 mM prêt à l'emploi. (2 mM de chaque dNTP). Une telle solution ainsi réhydratée est utilisable en particulier dans un milieu réactionnel de PCR (5 l dans un milieu réactionnel de PCR final de 50 l permet d'obtenir une concentration appropriée de 200 M de chaque dNTP). Alternativement, il est possible de préparer des compositions lyophilisées pour chacun des dNTPs (dATP, dCTP, dGTP ou dTTP). Des kits comprenant 4 microtubes contenant chacun l'un des 4 dNTPs peuvent être ainsi obtenus. Ces solutions sont également utilisables pour le marquage d'ADN ou le séquençage. Exemple 3 : Exemples de mélanges prêt à l'emploi pour la mise en #uvre de réaction PCR Un mélange prêt à l'emploi peut être obtenu par lyophilisation selon les conditions décrites à l'exemple 1 d'un volume de 40 L d'une solution aqueuse suivante : Mélange PCR Tampon de réaction : Tris HCI (10mM pH 8,4) KCI (5mM) MgCl2 (1,5mM) dNTPs.......................... 200 M de chaque ADN polymérase............ 2,5 unités (Hotstart Taq) Amorces...................... 1 M DMSO........................ facultatif si oui 5% Collagène..................... 0,5% Tréhalose..................... 300mM Exemple 4 : Mélange prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre d'une réaction de réverse transcription. Les mélanges prêt à l'emploi sont obtenus par lyophilisation selon les conditions décrites à l'exemple 1 d'un volume de 40 L d'une solution aqueuse suivante : Tampon de réaction : Tris HCI (10 mM) KCI (5 mM) MgCI2 (2 mM) Amorce sens : 1 M Amorces antisens : 1 M dNTPs : 200 M de chaque Réverse transcriptase :MMLV RT Biolabs 10 unités Inhibiteur(s) de RNase :RNAsine 10 unités Taq polymerase Promega : 0,02 unité La composition est réhydratée avec 50 L d'eau distillée contenant les ARNm et le cas échéant des amorces. Elle permet la génération d'ADNc pour le clonage et l'analyse et/ou la mesure du niveau d'expression d'un gène par détection de l'ARNm correspondant après amplification quantitative (RT-PCR quantitative). Exemples comparatifs : Afin de mettre en évidence les avantages de l'utilisation d'une combinaison de disaccharides et de PrionexR, une étude comparative a été réalisée sur des mélanges pour l'amplification d'un fragment d'ADN de Bordetella pertussis. A - Les mélanges suivants ont été testés : Mélange 0 : Solution contenant : - les éléments constituant le tampon de réaction, Tris HCI (10 mM) KCI (5 mM) MgCl2 (2 mM) - les dNTPs : 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces : - Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' - Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' Mélange 1 : Produit lyophilisé dans des microtubes sous un volume de 40 l et contenant : - les éléments constituant le tampon de réaction, Tris HCI (10 mM) KCI (5 mM) MgCI2 (2 mM) - les dNTPs, 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces. Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' Mélange 2 : Produit lyophilisé dans des microtubes sous un volume de 40 l et contenant : - les éléments constituant le tampon de réaction, Tris HCI (10mM) KCI (5mM) MgCl2 (2mM) - les dNTPs, 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' - le tréhalose 300 mM Mélange 3 Produit lyophilisé dans des microtubes sous un volume de 40 l et contenant : - les éléments constituant le tampon de réaction,Tris HCI (10 mM) KCI ( 5 mM) MgCl2 (2 mM) - les dNTPs, 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' - le PrionexR 0,5% Mélange 4 : Produit lyophilisé dans des microtubes sous un volume de 40 l et contenant : - les éléments constituant le tampon de réaction, Tris HCI (10 mM) KCI (5 mM) MgCl2 (2 mM) - les dNTPs, 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' - le tréhalose 300 mM - le PrionexR 0,5% B - Les protocoles (i) Protocole pour l'étude de la réhydratation spontanée : 1 ) conserver les tubes contenant les produits lyophilisés à la température ambiante (18 à 22 C) pendant 120 jours ; 2) observer les lyophilisats tous les 2 ou 3 jours et noter leur aspect. (ii) Protocole pour l'étude de la sensibilité : 1) préparer des suspensions de bactéries de façon à avoir 103, 104, 105 ou 106 bactéries par ml, soit 1,10, 100 ou 1000 dans 10 pl ; 2) préparer les échantillons d'ADN à partir des suspensions de bactéries ; 3) pour l'amplification, déposer 90 l du mélange 0 préparé extemporanément dans des microtubes; 4) reprendre les mélanges lyophilisés 1, 2,3 et 4 avec 90 l d'eau distillée (ou équivalent); 5) ajouter dans tous les tubes 10 l de la matrice d'ADN à amplifier ; 6) après amplification, analyser les produits par électrophorèse et noter la présence et l'intensité des bandes à l'aide des indications suivantes : # absence de bande - # bande de faible intensité + # bande de forte intensité ++ à ++++. (iii) Protocole pour l'étude de la stabilité : 1) conserver le mélange 0 et les mélanges lyophilisés à 37 C pendant 120 jours ; 2) préparer des suspensions de bactéries de façon à avoir 103, 104, 105 ou 106 bactéries par ml, soit 1,10, 100 ou 1000 dans 10 NI ; 3) préparer les échantillons d'ADN à partir des suspensions de bactéries ; 4) pour l'amplification, déposer 90 l du mélange 1 préparé extemporanément dans des microtubes; 5) reprendre les mélanges lyophilisés 1, 2,3 et 4 avec 90 l d'eau distillée; 6) ajouter dans tous les tubes 10 l de la matrice d'ADN à amplifier ; 7) après amplification, analyser les produits par électrophorèse et noter la présence et l'intensité des bandes. C - Résultats 1. Aspect des lyophilisats et réhydratation La figure 2 illustre l'aspect des produits obtenus après lyophilisation en absence de conservateur (mélange 1 ) ou en présence de tréhalose (mélange 2) ou de PrionexR (mélange 3) ou en présence des deux conservateurs (mélange 4). Sur le plan présentation d'un produit commercialisable, le meilleur aspect (lyophilisât compact et dense) est obtenu lorsque la lyophilisation est réalisée en présence du tréhalose et du PrionexR. Une réhydratation des lyophilisats, lors d'une conservation à la température du laboratoire (18-22 C) est observée en 3 à 6 jours pour les lyophilisats ne contenant aucun conservateur (mélange 1) ou ne contenant que du tréhalose (mélange 2). Aucune réhydratation n'est observée pour les lyophilisats contenant du PrionexR seul (mélange 3) ou du tréhalose et du PrionexR (mélange 4) après une conservation pendant 120 jours. 2. Sensibilité La figure 3 montre que le mélange 4 contenant du tréhalose et du PrionexR permet d'obtenir une sensibilité au moins aussi élevée que celle obtenue avec le mélange 0 (1 à 10 bactéries). 3. Stabilité des produits On constate (tableau 1) pour les produits non lyophilisés (mélange 0) ou lyophilisés en absence de conservateur (mélange 1) ou en présence de PrionexR (mélange 3) une perte d'activité après une conservation supérieure à 7 jours à 37 C. En présence de tréhalose (mélange 2), une perte d'activité est observée après 30 jours à 37 C. Par contre, les produits lyophilisés en présence de tréhalose et de PrionexR (mélange 4) conservent leur activité pendant au moins 120 jours. Temps (en jours) de Quantité de bactéries détectées après amplification conservation à 37 C avec les différents mélanges Mélange 0 Mélange 1 Mélange 2 Mélange 3 Mélange 4 JO 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 J 7 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 J 30 10-100 10-100 1-10 10-100 1-10 J 60 10-100 10-100 10-100 10-100 1-10 J 90 > 1000 > 1000 10-100 100-1000 1-10 J 102 > 1000 > 1000 100-1000 100-1000 1-10 Tableau 1 : Stabilité des lyophilisats après conservation (JO à J120) à 37 C. Les résultats présentés ci-dessus montrent que les compositions contenant à la fois un disaccharide (le tréhalose) et du collagène (i) présentent un bel aspect compact et dense ; (ii) ne se réhydratent pas spontanément, et (iii) ont une excellente stabilité dans le temps. La présence concomitante du tréhalose et du collagène dans les mélanges prêt à l'emploi lyophilisés, formulés pour l'amplification des acides nucléiques, permet une meilleure stabilisation et une meilleure présentation du produit tout en conservant une bonne sensibilité de la réaction. Exemple 5 : Etudes d'amplification d'ADN de Bordetella pertussis réalisée à partir de mélanges lyophilisés formulés pour la mise en #uvre de réaction PCR et contenant du collagène en présence de différents oses (saccharose, glucose, lactose et tréhalose). Les mélanges lyophilisés contiennent : - les éléments constituant le tampon de réaction, Tris HCI (10 mM) KCI (5 mM) MgCl2 (2 mM) - les dNTPs, 200 M de chaque - l'ADN polymérase (Hot start Taq) 2,5 unités - les amorces Amorce 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Amorce 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3' Le PrionexR à 0,5% L'ose à 300 mM Le mélange 1 contient du saccharose Le mélange 2 contient du glucose Le mélange 3 contient du lactose Le mélange 4 contient du maltose Le mélange 5 contient du tréhalose Résultats de l'amplification d'ADN de Bordetella pertissis Quantité de bactéries détectées après amplification avec les différents mélanges Sensibilite Mélange 1 Mélange 2 Mélange 3 Mélange 4 Mélange 5 saccharose Glucose Lactose Maltose Tréhalose à JO 1 à 10 10 à 100 1 à 10 1 à 10 1 à 10 Après 30 jours à 1 à 10 10 à 100 1 à 10 1 à 10 1 à 10 37 C Après 60 jours à 10 à 100 100 à 1000 10 à 100 10 à 100 1 à 10 37 C Les résultats obtenus démontrent la supériorité du tréhalose en terme de conservateur par rapport aux autres oses. REVENDICATIONS 1. Méthode d'obtention d'une composition lyophilisée contenant des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend la lyophilisation d'une solution aqueuse d'acides nucléiques en présence de disaccharides et de collagène. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le disaccharide est le tréhalose. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la solution aqueuse comprend de 150 à 600 mM de disaccharides et de 0,1à 1% de collagène. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la solution aqueuse comprend au moins l'un des acides nucléiques suivants : - un 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates; - un oligonucléotide ; - un polynucléotide. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la solution aqueuse comprend, en plus des disaccharides et du collagène, les composants suivants : - un mélange de 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates (dNTPs) ; - un tampon de réaction ;et - le cas échéant, un oligonucléotide ; du chlorure de magnésium ; une ADN polymérase ; et/ou un colorant ; lesdits composants étant présents dans des quantités appropriées pour la mise en #uvre d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) après réhydratation de la composition lyophilisée. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la solution aqueuse contient une quantité d'acide nucléique inférieure à 3000 M, de préférence comprise entre 600 et 1000 M. 7. Composition lyophilisée contenant des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Composition lyophilisée contenant des acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend des disaccharides, par exemple du tréhalose, et du collagène. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5 à 50 mmoles de disaccharides et 40 à 400 g de collagène. 10. Composition lyophilisée selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité d'acide nucléique inférieure 100 immoles, de préférence comprise entre 20 et 30 moles. 11. Composition lyophilisée selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'un des acides nucléiques suivants : - un 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates; - un oligonucléotide ; et/ou - un polynucléotide. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend, en plus des disaccharides et du collagène, au moins les composants suivants : - un mélange de 2'déoxyribonucléoside-5'-phosphates (dNTPs) ; - un tampon ;et - le cas échéant, un oligonucléotide ; du chlorure de magnésium ; une ADN polymérase ; et/ou un colorant ; lesdits composants étant présents dans des quantités appropriées pour la mise en #uvre d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) après réhydratation de la composition lyophilisée. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que les quantités de chacun de ces composants sont appropriées pour la mise en #uvre d'une réaction d'amplification d'acides nucléiques par PCR après réhydratation de la composition dans un volume d'eau compris entre 10 et 100 l. 14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est contenue dans un microtube utilisable dans un thermocycleur pour les réactions de PCR. 15. Procédé d'amplification d'acide nucléique, comprenant la réhydratation d'une composition lyophilisée selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 par l'ajout d'une solution aqueuse comprenant le cas échéant un ou plusieurs composants nécessaires à l'amplification d'acides nucléiques par PCR et en particulier une matrice d'ADN. 16. Utilisation d'une combinaison de disaccharides et de collagène comme agent de stabilisation et/ou de compaction d'acides nucléiques lyophilisés. 17. Utilisation selon la revendication 16, dans laquelle le disaccharide est le tréhalose.