Brevet FR2852329A1 — publié le 20040917

Cellules lyophilisées utilisées comme standards ou contrôles pour le dosage de séquence(s) d'acides nucléiques intra cellulaires, de leurs modifications épigénétiques ou de leurs produits, et procédé de lyophilisation permettant l'obtention desdites cellules. L'invention concerne des cellules lyophilisées non vivantes issues d'organismes procaryotes ou eucaryotes et leur utilisation comme standards ou contrôles pour le dosage de séquences d'acides nucléiques intra cellulaires (ARN ou ADN), de leurs modifications épigénétiques ou de leurs produits (protéines, 10 etc). L'invention vise également un procédé mis en oeuvre pour l'obtention de ces cellules. Il n'existe pas actuellement de matériel de référence de composition complexe permettant la comparaison et donc l'analyse de la reproductibilité des dosages 15 des technologies innovantes telles que la PCR quantitative en temps réel ou les analyses à grande échelle (de quelques marqueurs à des milliers/millions de marqueurs en une seule réaction). La disponibilité d'un tel matériel de référence (standards et contrôles) est indispensable tant dans le domaine de la recherche que dans le domaine des dosages biologiques en médecine ou pour établir des 20 éléments de traçabilité fiables dans les animaux et/ou plantes et/ou végétaux transgéniques. Notamment, il n'existe pas de matériel de référence universel: e ni pour les dosages innovants transférés actuellement dans les laboratoires 25 hospitaliers, et éventuellement à l'avenir dans les laboratoires de ville pour le monde médical * ni pour les technologies innovantes qui sont aujourd'hui du domaine de la recherche mais dont des applications ciblées vont représenter les dosages de demain notamment dans le domaine de la médecine. La solution apportée localement est le développement d'un échantillon de référence par constitution d'un grand stock de matériel (cellules ou acide ribonucléique) conservé soit dans l'azote, soit à - 800c au moins, posant le problème de la conservation de la chaîne du froid et celui de la quantité limitée du matériel disponible. Dans tous les cas, rien n'assure que le marqueur dosé possède la même fourchette de dosage entre les laboratoires. io Plus encore, pour les études de standardisation ou de contrôles de qualité sur les dosages des acides ribonucléiques qui sont particulièrement instables, leur transport doit se faire en colis spéciaux tout en respectant la chaîne du froid (utilisation de carbo glace), ce qui pose à l'évidence des problèmes de coût et des problèmes légaux notamment dans les transports aériens. L'utilisation de cellules lyophilisées permet de remédier à ces inconvénients. En effet, les cellules lyophilisées, contenant le produit à doser tel que par exemple une séquence d'acide ribonucléique, présentent les avantages ci-après 1. Elles permettent de comparer et contrôler toutes les étapes du dosage dès l'étape d'extraction du matériel à doser (acides nucléiques, leurs modifications épigénétiques ou leurs produits). 2. Elles représentent un matériel clairement identifié et stable, de composition homogène, qui, produit en quantité suffisante, permet de 25 disposer d'un élément de référence sur plusieurs années et permet de juger de la bonne qualité du dosage. 3. Elles permettent une facilité d'utilisation et une limitation des coûts de transport: ces cellules lyophilisées peuvent être distribuées à température ambiante (de l'ordre de 150C à 280C) par courrier simple 30 quelle que soit la distance à parcourir dans le monde. 4. Elles permettent d'isoler les acides ribonucléiques, très instables, de bonne qualité en vue de leur dosage. 5. Elles peuvent servir de référence pour la comparaison des résultats produits par des laboratoires et sont donc utilisables comme standards ou contrôles a. lors de la mise au point de techniques de dosage innovantes dans le domaine de la recherche permettant une standardisation des résultats telles que les analyses par puces à ADN (profils d'expression ou Comparative Hybridisation of Genomes (CGH) 10 sur puces). b. dans le domaine médical, pour les dosages biologiques de ces nouveaux marqueurs, afin de procéder à des contrôles de qualité De façon avantageuse quoique nullement limitative, les cellules lyophilisées 15 sont obtenues par la mise en oeuvre du procédé décrit ci-après: Les cellules devant être lyophilisées sont choisies parmis toutes cellules pouvant être produites en grande quantité. De façon avantageuse, il s'agira d'une seule lignée cellulaire, ou d'un mélange de lignées cellulaires issues d'un 20 même organisme ou de plusieurs organismes eucaryotes ou procaryotes. Le choix de la lignée cellulaire ou du mélange cellulaire à lyophiliser est adapté en fonction du ou des marqueur(s) à analyser ou doser. Les cellules sont cultivées dans leur milieu de croissance jusqu'à la phase 25 exponentielle. Elles sont ensuite collectées à cette phase, puis lavées dans un tampon type tampon phosphate salin à concentration 2X, de préférence à ph 7,2, et resuspendues dans ce tampon à la concentration désirée par ampoule, par exemple de 3.106 cellules par mi. Les ampoules sont lavées à l'acide puis abondamment rincées, et ensuite séchées, marquées et mises au four. Les cellules sont alors réparties dans des ampoules (lml/ampoule) et tenues à +40C jusqu'à ce que l'aliquotage soit terminé. Les ampoules sont ensuite mises dans le lyophilisateur, et lyophilisées selon le protocole ci-après décrit: - congélation à une température de -50'C sur étagère pré refroidie, - séchage primaire progressif de -50 à 00C par paliers incrémentés - vide primaire entre 10 et 1000 pbar, et de préférence 1 00pbar 1o - séchage secondaire à des températures comprises entre 15 et 45 oC, et de préférence de l'ordre de 250C - resuspension des cellules avant la lyophilisation dans un tampon hypertonique de préférence choisi dans la gamme des produits ci-après: tris, phosphate, borate, acetate, hepes, etc. - vide de séchage secondaire entre 10 et 300 pbar séchage des cellules en suspension sous forme vaporisée ou séchée à l'air La concentration cellulaire peut être prise entre 104 et 109 cellules par mi en fonction du type de dosage. Le séchage des cellules peut être effectué avec ou sans assistance d'une réduction de pression. La présence d'un cryoprotecteur ou d'un protecteur de lyophilisation peut être nécessaire. Le dosage peut être soit absolu soit relatif (par comparaison entre échantillons) 25 et ceci quelles que soient les modalités utilisées pour exprimer les résultats. Dans les dosages relatifs comparatifs, il est avantageux d'utiliser deux ou plusieurs de ces mélanges de cellules lyophilisées. Les exemples ci-après décrivent des modes de réalisation de dosage de différents produits, effectués à partir de cellules lyophilisées. Exemple 1: Dosage du transcrit (acide ribonucléique) BCR ABL par la technique de PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) après transcription inverse dans la lignée lyophilisée K562. Contexte: A ce jour, il n'existe pas de Standards Internationaux pour les analyses de RQ-PCR notamment dans le cadre de protocoles multi-centriques visant à évaluer l'efficacité de drogues. En effet, ces protocoles nécessitent la comparaison des résultats obtenus dans différentes équipes et ces io comparaisons sont rendues difficiles par l'absence de standards ayant une valeur référence. En particulier, le dosage précis du transcrit BCR ABL devient nécessaire pour adapter le traitement en fonction de la réponse aux drogues notamment avec l'introduction du GLEEVEC (Novartis), agent thérapeutique qui bloque l'activité tyrosine kinase de la protéine BCR ABL. Nous avons développé 15 des cellules lyophilisées afin de pouvoir disposer de standards internationaux. Procédé: Les cellules de la lignée K562 ou la lignée Toml ont été cultivées jusqu'en phase exponentielle de croissance o elles sont récoltées et lyophilisées à une concentration de 2-3x106 cellules/aliquot. Les ampoules employées sont avec capuchon à vis. Ces capuchons silicones à l'halobutyl sont lavés dans un alcool léthylé industriel et séchés à l'air. Ils ont été mis dans un sac et autoclaves avant utilisation. Les bouchons sont fixés sur le cou des ampoules et celles ci sont lyophilisées en les mettant directement sur des étagères pré-refroidies dans un lyophilisateur de type Serail (CS -15 ou 25 CS-1 00). Après lyophilisation, les ampoules sont rincées à l'azote liquide. Ensuite, les bouchons à vis sont mis en place et verrouillés à la main. Le cycle de lyophilisation arrêté au jour 50 pour le lot (01/604) est de 50 jours. Les ampoules contenant les cellules (près de 1500) ont été placées sur des étagères prérefroidies à -50'C et congelées à -50'C pour 720 minutes (12 heures). Le vide a été ensuite appliqué jusqu'à un niveau de 100pbar et les étagères maintenues à -50'C pendant encore 780 minutes. La température des 5 étagères a été ensuite élevée jusqu'à -450C sur une période de 25 minutes puis maintenue à -450C pendant 720 minutes. La température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à -350C sur 50 minutes et maintenue à -350C pendant 360 minutes. . La température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à 25 C sur 50 minutes et maintenue à -25oC pendant 720 minutes. . La 10 température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à -150C sur 50 minutes et maintenue à -150C pendant 360 minutes. La sonde de température a indiqué une inflexion dans la température du produit à -250C ce qui suggère que le séchage primaire était complet pour l'ampoule contenant la sonde à ce moment. La température des étagères est ensuite élevée à 00C sur 75 minutes et maintenue à 0 C pendant 120 minutes. La température des étagères a été ensuite élevée à 250C sur 125 minutes. Le vide est alors accentué de 30pbar et la température maintenue à 250C pendant 24 heures pour le second séchage. La température des étagères est ensuite 20 réduite à 220C et le vide maintenu jusqu'à ce que les ampoules soient retirées. Différentes techniques d'extraction des ARN ont été testées et la qualité des ARN extraits a été vérifiée sur le Bioanalyseur 2100 (Agilent). Les analyses de RQ-PCR pour les gènes contrôle ABL et GUS ainsi que pour le transcrit de fusion BCR-ABL sont réalisées suivant le protocole établi dans le programme 25 EAC (Europe Against Cancer) (brevet Européen déposé le 7 Mars 2003 n0 03290572.1) Une fois la faisabilité établie dans notre laboratoire, une étude internationale strictement confidentielle a été lancée impliquant 22 laboratoires experts de par le monde, utilisant chacun leur procédé d'extraction, de transcription inverse et 30 d'amplification par PCR quantitative en temps réel. Résultats: 1. Bonne qualité des acides ribonucléiques extraits à partir de l'extraction des cellules lyophilisées appréciée par le Bioanalyseur 2100 Agilent (Figure 1) 2. Comparaison de l'expression des transcrits p2lOBCR-ABL et GUS dans les Cellules K562 lyophilisées versus Cellules K562 fraîches mesurée par PCR quantitative en temps réel sont tout à fait comparables (Figure 2) 3. Etude préliminaire de Stabilité des Cellules K562 lyophilisées par la 10 technique de dégradation accélérée (figure 3). Les cellules lyophilisées maintenues pendant 7, 21 ou 30 jours soit à 370C soit à 450C sont stables pour le dosage considéré pendant au moins 30 jours à 450C selon le modèle Arrhenius. Cette étude préliminaire montre qu'il n'existe pas de dégradation significatives des transcrits géniques mesurés par 15 RQ PCR après 30 jours à 450C ou moins. Les valeurs obtenues sont comparables à celles obtenues sur des cellules fraîches, et mettent en évidence la bonne stabilité des Standards de cellules lyophilisées. 4. Etude internationale strcitement confidentielle (Figure 4). Le dosage est réalisé sur 3 dilutions (pur, 1/10, 1/100) du matériel extrait à partir des 20 cellules lyophilisées. L'analyse statistique montre une distribution normale permettant la définition d'une valeur de référence de l'ordre de 90 à 100 copies du transcrit BCR ABL pour 1 copie du transcrit du gène ABL dans ce batch de cellules de K562 lyophilisées. Exemple 2: Analyse du profil d'expression de 2 ampoules de la lignée K562 lyophilisées. L'analyse est réalisée sur 10 000 séquences d'acide nucléique, représentant 30 autant de gènes, déposées sur une membrane de nylon. La détection utilise la radioactivité et la mesure est donc absolue dans cet exemple. (Figure 5) La reproductibilité est excellente apportant la démonstration du principe Le dosage à l'aide de cellules lyophilisées peut être appliqué à toute séquence d'acide nucléique ou ses produits, extraits à partir de cellules présentes dans 5 un organisme procaryote ou eucaryote notamment les végétaux, les animaux et l'homme. Les séquences d'acide nucléique ou leur(s) produit(s) que l'on souhaite doser peuvent être normaux ou modifiés notamment par mutation soit naturellement io soit artificiellement. Ces séquences d'acide nucléique peuvent être présents naturellement dans l'organisme, ou introduites artificiellement par n'importe quel procédé notamment par transfection ou transduction dans des cellules ou des organismes transgéniques. Les dosages permis par l'utilisation de cellules lyophilisées peuvent trouver une application dans divers domaines, et par exemple: 1. dosage d'acide nucléique 1.1. ADN génomique * Par des techniques de PCR, notamment la PCR quantitative en temps réel d'une ou quelques séquences d'acide nucléique du génome ou toute technique permettant un dosage précis. Les analyses par Hybridation génomique comparative notamment les analyses par "CGH array" qui permettent la détection et la mesure des 25 amplifications et des délétions des séquences génomiques entre 2 échantillons. Toute technique résultant de l'association des techniques mentionnées précédemment. 1.2. Dosage des transcrits (acides ribonucléiques) cellulaires Analyses de Polymerase chain reaction (PCR) après une étape de transcription inverse pour le dosage de l'expression d'un gène ou d'une combinaison de gènes et toute technique permettant ce dosage. * Profils d'expression génique depuis les puces à ADN pan-génomiques ou à 5 grande échelle jusqu'aux puces à ADN dédiées avec un nombre limité de gènes. Ceci quelle que soit la technique utilisée: * Quel que soit le support notamment le Nylon, le verre ou le plastique avec ou sans modification physiques, chimiques ou enzymatiques. a Quel que soit le type de séquences nucléotidiques déposées sur ce support (par exemple de produits de PCR ou des oligo nucléotides de 10 à 100 mers); * Quelles que soient les modalités de détection, notamment la radioactivité, la fluorescence ou la colorimétrie. 15 * Toute technique résultant de l'association des techniques mentionnées précédemment. 2. Dosage des modifications épigénétiques des séquences d'acide nucléique. Toute technique notamment à haut débit et/ou automatisable permettant la mesure des modifications des acides nucléiques sans changement de la séquence nucléotidique notamment la méthylation. 3. Dosage des protéines cellulaires. Toute technique notamment à haut débit et/ou automatisable permettant la mesure d'un mélange protéique cellulaire, en particulier les profils protéiques mesurés par des techniques faisant intervenir les techniques de spectroscopie de masse. Par exemple la spectrométrie de masse MALDI- TOF couplé avec l'électrophorèse bidimensionnelle des protéines ou la spectrométrie de masse 30 MS/MS couplée à de la chromatographie liquide nano-débit ou encore la spectrométrie de masse SELDI-TOF ou toute autre technique dérivée 4. Dosage des modifications post traductionnelles. Toute technique notamment à haut débit ou automatisable permettant la mesure des modifications des protéines cellulaires après la traduction notamment les histones comme par exemple la phosphorylation, la méthylation ou l'acétylation. L'utilisation de cellules lyophilisées selon l'invention permet également d'envisager différents types de mesure, et par exemple: 1. mesure dans une situation pathologique telle que mesure de l'acide ribonucléique BCR ABL par PCR quantitative en temps réel (voir exemple 1 précité). 2. mesure permettant d'apprécier les conséquences engendrées au niveau cellulaire par l'introduction de séquences d'acides nucléiques ou de cellules vivantes o dans des organismes transgéniques (animaux ou végétaux) o Mesure après thérapie cellulaire ou génique. REVENDICATIONS 1. Utilisation de cellules lyophilisées non vivantes issus d'organismes 5 procaryotes ou eucaryotes pour le dosage de séquences d'acides nucléiques intracellulaires, de leurs modifications épigénétiques, ou de leurs produits. 2. Utilisation de cellules lyophilisées selon la revendication 1 comme élément de référence (standard ou contrôle) 3. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour les techniques automatisées de mesure en une réaction d'un ou plusieurs éléments d'origine cellulaire ceci quel que soit le mode d'expression des résultats. 4. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour des dosages absolus ou relatifs de séquences d'acides nucléiques intracellulaires, de leurs modifications épigénétiques, ou de leurs produits. 5. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour doser des marqueurs cellulaires dans des situations pathologiques 20 6. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour le dosage de transcrit génique par une technique appropriée. 7. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en oeuvre de la revendication 1 caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes: a/ les cellules devant être lyophilisées sont cultivées dans leur milieu de croissance jusqu'à la phase exponentielle. b! lesdites cellules sont collectées, puis lavées dans un tampon type tampon phosphate salin, ph 7,2, et resuspendues dans ce tampon à la concentration désirée par ampoule. c/ les cellules sont alors réparties dans des ampoules et tenues à +40C jusqu'à ce que l'aliquotage soit terminé, les ampoules ayant été préalablement lavées à l'acide puis abondamment rincées, séchées, marquées et mises au four. d/ les ampoules sont ensuite mises dans le lyophilisateur, et lyophilisées selon selon le protocole ci-après décrit: - congélation à une température de -500C sur étagère pré refroidie, - séchage primaire progressif de -50 à 00C par paliers incrémentés - vide primaire entre 10 et 1000 pbar, et de préférence 100pbar - séchage secondaire à des températures comprises entre 15 et 45 'C, et de préférence de l'ordre de 250C - resuspension des cellules avant lyophilisation dans un tampon hypertonique choisi dans la gamme des produits ci-après: tris, phosphate, borate, acetate, hepes. - vide de séchage secondaire entre 10 et 300 pbar - séchage des cellules en suspension sous forme vaporisée ou séchée 15 à l'air 8. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en oeuvre de la revendication 1, selon la revendication 7, caractérisé en ce que les cellules devant être lyophilisées sont choisies parmis toutes cellules 20 pouvant être produites en grande quantité 9. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en oeuvre de la revendication 1, selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules sont issues d'une seule lignée cellulaire, ou d'un 25 mélange de lignées cellulaires issues d'un même organisme ou de plusieurs organismes eucaryotes ou procaryotes.