Brevet FR2849204A1 — publié le 20040625

PROCEDE DE DETECTION DE LA PR Ps C UTILISANT UN ANTIBIOTIQUE DE LA FAMILLE DES AMINOGLYCOSIDES POUR L'ELIMINATION ET LA DETECTION DE LA PR Psc DANS DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES La présente invention concerne une méthode de précipitation totale de Pr PSC par le sulfate de streptomycine 54 et son utilisation pour l'immunodétection ou l'élimination de la Pr Psc de liquides ou de solutions. 10 La protéine prion native ou normale, désignée Pr P ou Pr Pc pour la protéine prion cellulaire, est une glycoprotéine largement exprimée dans les cellules lymphodes et neuronales des mammifères. 15 Des changements conformationnels de Pr Pc conduisent à l'apparition et à la propagation de la protéine pathogène Pr Psc qui est résistante à la protéinase K L'accumulation de Pr Ps C dans les organes des animaux est à l'origine de 20 nombreuses maladies et notamment de la tremblante des petits ruminants, de la maladie cachectisante chronique (ou chronic wasting disease 'CWD') de l'élan et de l'antilope, de l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et de la maladie de Creutzfeldt-Jacob chez l'homme. 25 L'apparition tardive après une période d'incubation de 2 à 6 ans et le lent développement des symptômes chez le bétail infecté par l'ESB a considérablement ralenti le développement de modèles épidémiologiques L'ESB est 30 transmissible par ingestion à l'homme et a conduit à l'apparition d'une nouvelle forme de la maladie de CreutzfeldtJacob (v CJD). La détection de la protéine pathogène Pr Psc est difficile chez les animaux infectés sains avant le développement de la maladie et surtout dans le sang et l'urine chez les animaux malades Il est à présent établi 5 que la Pr Psc présente chez les animaux destinés à l'alimentation humaine se transmet à l'homme lors de l'ingestion des tissus infectés Un objectif majeur de santé publique est donc d'éviter cette transmission en détectant le Pr Psc chez des animaux destinés à la 10 consommation humaine en vue de les retirer de la chaîne alimentaire. La détection de la présence de Pr Psc dans des échantillons biologiques ou chez des animaux devient donc 15 d'une extrême importance et plusieurs équipes de chercheurs développent des méthodes de détections immunologiques (W 002/086511) Par ailleurs, des méthodes pour complexer à la Pr Psc des peptides, des petites molécules ou des inhibiteurs en vue du traitement de v CJD font l'objet de 20 recherches actives Toutefois, les méthodes en l'état de la technique se heurtent sans arrêt à la difficulté d'identifier la Pr Pscde manière fiable lorsqu'elle est en faible quantité dans un échantillon biologique. Les inventeurs ont mis en évidence une nouvelle propriété des aminoglycosides, et notamment des aminoglycosides du groupe II et plus particulièrement de la streptomycine, et ont démontré la capacité de ces antibiotiques à se complexer avec la Pr Psc et à la faire 30 précipiter. Les inventeurs ont ainsi observé que l'ajout d'un aminoglycoside dans un échantillon biologique provenant de diverses origines animales et contenant des prions a pour conséquence de faire augmenter la masse moléculaire apparente des 3 bandes des prions Cette observation et les expériences qui ont suivi leur ont permis de démontrer que l'aminoglycoside se complexe avec la Pr PSC et que cette complexation a pour conséquence de précipiter la Pr Psc et 5 d'augmenter considérablement les possibilités de détection de la Pr Psc par rapport aux méthodes classiquement employées par l'homme du métier. La présente invention a donc pour objet un procédé 10 de concentration par précipitation de la Pr Psc à utiliser lors du diagnostic des maladies dues aux prions ou pour l'élimination des prions présents dans un liquide biologique et caractérisé en ce que l'on met en présence une suspension du tissu ou un fluide biologique issu ou 15 obtenu d'un organisme animal ou humain avec un antibiotique de préférence choisi dans la famille des aminoglycosides et de préférence la streptomycine. Plus précisément, le procédé selon l'invention 20 comprend les étapes suivantes: a) préparation d'une suspension à 10 % par homogénéisation de tissu obtenu d'organisme animal ou humain en 5 % de solution de glucose, b) on ajoute aux 100 pl de la suspension obtenue la 25 protéinase K puis on incube à 37 C pendant une heure, c) on ajoute à la suspension un aminoglycoside puis on incube une deuxième heure à 37 C , d) on place la suspension dans un tampon adéquat, et on la soumet à un chauffage, puis on centrifuge la 30 solution obtenue et l'on sépare le culot du surnageant, e) on suspend le culot dans 50 1 pl d'une solution de % v/v d'urée 8 M et du tampon Laemmli dénaturant comme décrit par Laemmli, Nature 227 ( 1970), 680-685 Après une agitation vortex vigoureuse, on chauffe 5 mn à 1000 C, on centrifuge à 12000 g et on récupère les surnageants pour les faire migrer sur SDS PAGE, f) après migration sur une électrophorèse unidimensionnelle sur gel de polyacrylamide dodecyl sulfate 5 15 % (SDS PAGE) comme décrit par Laemmli, Nature 227 ( 1970), 680-685, les protéines sont transférées par électrophorèse sur des membranes nitrocelluloses et immunoblottées à température ambiante pendant 60 minutes avec un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope spécifique constitué 10 des acides aminés 126-160 L'anticorps secondaire ( 1/5000) est un anticorps de chèvre dirigé contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines de souris conjuguées à la peroxydase de radis (Ig G H+L) ; les blots sont ensuite lavés et les signaux sont détectés par 15 chimioluminescence soit avec un kit ECL (Amersham) sur des films (Biomex light, Kodak) ou avec un super Signal Ultra (Pierce) et visualisation sur Fluor S Multimager (Bio Rad) Le procédé selon l'invention présente l'avantage de 20 ne pas nécessiter d'ultracentrifugation Le procédé selon l'invention concerne également la complexation de l'aminoglycoside avec les protéines du prion et la précipitation des protéines du prion par l'aminoglycoside. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le tissu biologique est issu ou obtenu à partir d'un cerveau ou d'un autre tissu animal ou humain. La protéinase utilisée dans le procédé selon l'invention est une protéinase choisie pour sa capacité à 30 digérer les protéines présentes incluant les formes normales de la protéine du prion, et pour son incapacité à digérer les formes pathologiques de cette protéine. Avantageusement, il s'agit de la protéinase K. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, le tissu ou le fluide biologique, préalablement à sa mise en contact avec ledit aminoglycoside, est homogénéisé dans une solution de 5 glucose De préférence, il s'agit d'une solution de glucose à 5 %. L'étape de chauffage après avoir ajouté 100 pl du tampon Laemmli à la suspension résultant de la mise en contact de l'échantillon biologique avec la protéinase K et 10 l'aminoglycoside, correspond à une augmentation de température comprise entre 60 et 150 C, de préférence d'environ 100 C. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, l'aminoglycoside est un aminoglycoside du 15 groupe II et de préférence la streptomycine ou un de ses dérivés. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel aminoglycoside pour la précipitation, la détection même en immunohistochimie détection et/ ou le diagnostic de 20 la Pr Pso L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un tel aminoglycoside pour l'élimination de la Pr Psc d'un fluide biologique. Enfin, l'invention se rapporte également à un kit de diagnostic des pathologies liées à la présence de Pr Psc, caractérisé en ce qu'il comprend un tel aminoglycoside. D'autres avantages et caractéristiques de 30 l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'amplification de la détection du Pr Psc lorsque l'échantillon biologique est mis en présence d'un aminoglycoside. Il sera fait référence dans ces exemples aux dessins en annexe dans lesquels: la figure 1 A est un exemple comparatif de la détection après électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 5 15 %, transfert et immunodétection, de Pr Psc dans un échantillon de cerveau de mouton atteint de la tremblante et mis en présence de quantités de plus en plus importantes de streptomycine; la figure l B est un graphe de comparaison du 10 poids moléculaire moyen mesuré de chaque bande Pr Psc de la figure l B avant et après le mélange avec des quantités croissantes de streptomycine la figure 2 est un exemple comparatif de la détection après électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 115 5 %, transfert et immunodétection, de Pr Psc, respectivement dans le surnageant et dans les précipités, obtenus à l'issu de la deuxième heure d'incubation d'une suspension très riche en protéine Pr Psc en absence et présence de quantité variable de streptomycine la figure 3 montre que l'addition en même temps de la protéinase K et de streptomycine à une suspension contenant une faible quantité du Pr Psc a pour conséquence la disparition de la Pr Psc du surnageant et son apparition dans les précipités. Les figures 4 A, 4 B et 4 C montrent, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15 %, transfert et immunodépressif, l'augmentation du seuil de détection de la Pr Psc lors de l'ajout de quantités croissantes de streptomycine. le tableau de la figure 5 se réfère à l'exemple 5 et présente une comparaison des résultats du diagnostic du Pr Psc sur 97 cerveaux d'animaux obtenus par la technique selon l'invention avec ceux obtenus par la technique de référence. la figure 6 montre des images en microscopie de sonde à balayage (SPM) en mode non-contact pour des films 5 séchés de la protéine prion recombinante (rec Pr P) seule (a), de rec Pr P en présence de streptomycine (b) et de streptomycine seule (c). Les échantillons biologiques sur lesquels les 10 exemples 2 et 3 cidessous ont été réalisés ont été obtenus à partir d'homogénat de cerveau bovin placé dans une solution de glucose à 5 % Des volumes de 100 pl de cette suspension, correspondant à 10 mg de tissu cérébral, sont utilisés pour les expériences qui suivent Chaque 15 échantillon est donc constitué de 100 pl, dans lesquels on ajoute de la protéinase K Après une heure à 37 C on ajoute ou non de la streptomycine La solution est agitée sous vortex et incubée à 37 C pendant une autre heure Après avoir ajouté 100 pl de tampon Laemmli dénaturant, on 20 chauffe à 100 C pendant 5 mn et on centrifuge à 12000 g pendant 5 minutes, puis on récupère les surnageants pour les faire migrer sur SDS-PAGE Les culots sont également récupérés et on leur ajoute 50 pl d'un solution à 50 % v/v d'urée 8 M et le tampon de laemmli Après une vigoureuse 25 agitation sous vortex, on chauffe à 100 C pendant 5 mn et on centrifuge à 12000 g pendant 5 minutes, puis on récupère les surnageants pour les faire migrer sur SDS-PAGE. Exemple 1 L'exemple 1 se réfère aux figures 1 A et l B relatives à des essais dans lesquels des concentrations croissantes ( O pg; 62,5 pg; 125 pg; 500 pg et 2000 pg) de streptomycine sont ajoutées à des quantités constantes du Pr Psc extrait de l'équivalent de 920 pg de cerveau d'un mouton atteint de tremblante puis le mélange est centrifugé Le surnageant est utilisé pour la détection immunologique par Western Blot (figure 1 A) et la mesure de la masse moléculaire moyenne des bandes de Pr PSC (figure 5 1 l B) Les résultats montrent que l'accroissement de la quantité de streptomycine, à savoir un ajout de O; 62,5, 125, 500,1000 et 2000 gg permet de constater que aux plus basses concentrations en streptomycine, la bande de la protéine non-glycosylée est la première à montrer une 10 augmentation de la masse moléculaire apparente Puis, la complexation concerne la bande de la protéine monoglycosylée et finalement la protéine bi-glycosylée est complexée quand la concentration en streptomycine est la plus importante. Le nombre de molécules de streptomycine liées à chacune des bandes de Pr Psc à une concentration donnée est évalué en mesurant le poids moléculaire de chaque bande. Les inventeurs ont estimé que l'augmentation du poids moléculaire apparente de chacune des bandes de Pr Psc en 20 présence de 2000 pg de streptomycine correspond à l'accrochage de 10 à 12 molécules de streptomycine par bande de Pr Psc. Exemple 2 L'exemple 2 se réfère à la figure 2 relative à des essais dans lesquels des concentrations croissantes ( O pl; 5 pl; 10 pl; 20 pl) de streptomycine à 1 g/ml sont ajoutées à des quantités constantes de l'échantillon biologique préparé comme indiqué ci-dessus En absence de 30 streptomycine, toutes les bandes Pr Psc sont identifiées comme étant dans le surnageant Et progressivement, elles vont être détectées simultanément dans le culot et dans le surnageant La quantité de Pr PSC présente dans le surnageant diminue progressivement pendant que la quantité augmente progressivement dans les précipités L'addition de 20 pl de streptomycine précipite totalement le Pr Psc qui n'est alors détectée que dans les précipités. Exemple 3 L'exemple 3 se réfère à la figure 3. On répète l'expérience de l'exemple 2 mais avec la même échantillon de cerveau dilué au 1/25 par rapport à l'exemple 2 et en diminuant la période d'incubation à une 10 heure après l'addition simultanée de la protéinase K et la streptomycine aux suspensions de cerveau Le résultat est que l'on ne détecte des bandes de Pr Psc que dans le surnageant en absence de streptomycine et que dans le culot en présence de n'importe quelle concentration de 15 streptomycine. Exemple 4 L'exemple 4 se réfère aux figures 4 A, 4 B et 4 C. A partir d'une dilution mère de 1:2 en série d'un homogénat à 10 % de cerveau bovin infecté par l'ESB dans une solution de glucose à 5 % on prépare 3 jeux de tubes contenant chacun 100 pl de la même dilution. A chaque tube du premier jeu de dilution (de pure 25 au 1/64)est ajouté 1 pg de protéinase K dans un volume de p 1. A chaque tube du second jeu (de 1/2 au 1/256)sont ajoutés simultanément 5 pl de streptomycine et 1 lg de protéinase K dans un volume de 101 l. A chaque tube du troisième jeu (de 1/2 au 1/256) sont ajoutés simultanément 10 Bl de streptomycine et 1 pg de protéinase K dans un volume de 10 pl. Tous les tubes sont incubés à 37 C pendant une heure puis on ajoute 100 4 l de tampon Laemmli dénaturant. On chauffe à 100 C pendant cinq minutes on centrifuge à 12000 g pendant 5 minutes, et on récupère les surnageants du premier jeu de tubes pour déposition sur SDS-PAGE Les surnageants des tubes du second et du troisième jeu de 5 tubes sont éliminés et on ajoute dans chaque tube 50 pl d'urée 8 M à 50 %v/v et du tampon Laemmli dénaturant Après une agitation vortex vigoureuse, on chauffe 5 mn à 100 C on centrifuge à 12000 g et on récupère les surnageants pour les second et troisième jeux de tubes. La figure 4 A montre que la limite de détection de Pr Psc détectée en l'absence de streptomycine est au 1/16. La figure 4 B montre la quantité de Pr Pso précipitée en présence de 5 pl de streptomycine: la Pr Psc est détectable jusqu'à la dilution 1/128, ce qui montre un 15 seuil de détection largement augmenté. La figure 4 C montre la quantité de Pr Psc précipitée en présence de 10 4 l de streptomycine: la figure 4 C montre que même sur les échantillons les plus dilués ( 1/256), la détection est possible et est représentative. 20 Exemple 5 Exemple comparatif La technique de référence est basée sur l'extraction de la Pr Psc à partir de 1,2 ml d'homogénat cérébral (Madec et al, Microbial Pathogenesis, 28 ( 2000) 25 353-362) Les homogénats sont forcés à travers une aiguille de diamètre 0,4 mm avant d'être traités pendant une heure à 37 C par 10 jg de protéinase K par 100 mg de tissu cérébral Après avoir ajouté du sarkosyl ( 10 %) et 10 m M de tampon Tris (p H 7,4), les échantillons sont incubés pendant 30 15 mn à température ambiante puis centrifugés à 245,000 g pendant 4 heures à 200 C sur un coussin de sucrose à 10 % (Beckman TL 100 ultracentrifugeuse) Le culot est finalement remis en suspension dans 50 gl de tampon dénaturant Laemmli chauffé pendant 5 mn à 100 C et centrifugé encore pendant 5 mn à 12000 g On récupère les surnageants pour migration sur SDS PAGE. Selon la technique de l'invention, on utilise 100 g 1 de suspension cérébrale obtenue après broyage du cerveau 5 décrit dans la technique de référence On ajoute 1 gg de protéinase K et on incube une première fois pendant une heure On ajoute ensuite 20 Rl de streptomycine et on incube une seconde fois pendant une heure On ajoute ensuite 100 gl de tampon dénaturant Laemmli Après 5 mn de 10 chauffage à 100 C, on centrifuge 2 mn à 12000 g On élimine les surnageants, puis on ajoute 50 jl de 50 % v/v d'urée 8 M et du tampon dénaturant Laemmli Après une agitation vortex vigoureuse, on chauffe 5 mn à 100 C et on centrifuge encore pendant 2 mn à 12000 g On récupère les surnageants 15 pour la migration sur SDS PAGE. Les résultats présents dans le tableau 1: en conclusion, l'utilisation de sulfate de streptomycine permet une meilleure détection des cas faiblement positifs et de plus permet d'éviter une ultracentrifugation longue 20 et coteuse. Exemple 6 Des échantillons de rec Pr P sont préparés en diluant une solution de rec Pr P ( 42 g M) avec un volume équivalent 25 d'eau ou avec une solution de streptomycine ( 1 g/ml) ; la référence pour la streptomycine seule est préparée en utilisant une solution de 0,5 g/ml. Les échantillons sont préparés par déposition de 10 gl de ces solutions sur du mica fraîchement clivé et 30 séchage pendant 24 heures à 37 C. On effectue une analyse par imagerie au moyen d'un Thermomicroscope Explorer AFM équipé avec un scanner trépied 100 gm, en mode non-contact, utilisant des fréquences de résonance élevées (F O = 320 k Hz) de cantilever pyramidal avec des sondes silicones à une fréquence de balayage de 1 Hz Le traitement des images est réalisé avec le logiciel SP Mlab 5 1 et présenté non5 filtrées. Il ressort de la figure 6 que les images de rec Pr P seuls montrent une structure en agrégats circulaires caractéristiques Les films de streptomycine seule montrent une organisation de surface pseudocristalline Les films 10 contenant le mélange montrent une surface amorphe: aucune organisation cristalline ou globulaire n'est constatée. L'interaction entre la streptomycine et la Pr P inhibe donc les propriétés d'organisation de surface des deux composants du mélange. REVENDICATIONS 1 Procédé de détection ou de diagnostic de la Pr Ps C caractérisé en ce que l'on met en présence un tissu 5 ou un fluide biologique issu ou obtenu d'un organisme animal ou humain avec un antibiotique de préférence choisi dans la famille des aminoglycosides. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 10 ce que: a) on ajoute à la suspension d'un tissu ou un fluide biologique issu ou obtenu d'un organisme animal ou humain de la protéinase, b) on met un aminoglycoside, c) on place la solution dans un tampon adéquat, et on la soumet à un chauffage, puis on centrifuge la solution obtenue et l'on sépare le culot du surnageant, d) on détecte la Pr Psc après migration sur 15 % SDS-PAGE, transfert et immunodétection. 20 3 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit tissu biologique est issu ou obtenu d'un cerveau ou autre tissu animal ou humain. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite protéinase est une protéinase K. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tissu ou le fluide biologique, préalablement à sa mise en contact avec ledit aminoglycoside, est homogénéisé dans une solution de glucose. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'étape de chauffage correspond à une augmentation de température comprise entre 60 et 150 C. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que ledit aminoglycoside est un aminoglycoside du groupe II. 10 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que ledit aminoglycoside est la streptomycine. 9 Utilisation d'un aminoglycoside pour la précipitation, la détection et/ou le diagnostic de la Pr Psc même lors de la détection en immunohistochimie 10.Utilisation d'un aminoglycoside pour l'élimination de la Pr Psc d'un tissu ou d'un fluide biologique. 11.Kit de diagnostic des pathologies liées à la présence de la Pr PSC, caractérisée en ce qu'il comprend un 25 aminoglycoside. 12 Kit selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit aminoglycoside est un aminoglycoside du groupe II. 13 Kit selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit aminoglycoside est la streptomycine.