Brevet FR2859220A1 — publié le 20050304

Promoteur du gène humain FATP 5 et utilisations La présente demande a pour objet un acide nucléique humain isolé, caractérisé en ce qu'il correspond au promoteur de la protéine humaine FATP5 et un acide nucléique humain isolé, codant pour une protéine, particulièrement pour la protéine humaine FATP5, placé sous la dépendance dudit promoteur. L'invention se rapporte également à un vecteur comprenant ledit acide nucléique ou une cellule hôte dans laquelle ledit acide nucléique ou ledit vecteur ont été introduits. L'invention se rapporte enfin à l'utilisation dudit acide nucléique ou dudit vecteur ou de ladite cellule hôte dans un procédé d'identification d'un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance dudit promoteur de la protéine humaine FATP5 et audit procédé d'identification. L'invention se rapporte enfin au produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance dudit promoteur de la protéine humaine FATP5 et à l'utilisation dudit produit dans la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter le diabète ou destiné à induire la ssoxydation des acides gras dans le foie. Le diabète de type Il est un problème de santé publique majeur partout à travers le monde. Environ 125 millions de personnes sont aujourd'hui affectées par cette maladie, dont 15 millions rien qu'aux USA. Les prévisions montrent qu'en 2010 le nombre de patients atteints de diabètes aura doublé. Entre 90 et 95% des personnes souffrant de diabète actuellement aux USA sont atteints de diabète de type II. Le type Il est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l'insuline et une hyperglycémie, souvent associée à de l'hypertension, à un dérèglement lipidique et à l'obésité. Chez l'adulte, cette pathologie apparaît généralement à partir de 30 ans et se caractérise par des complications incluant des dommages cardiaques, des vaisseaux sanguins, des yeux des reins et/ou des nerfs. Malheureusement, il n'existe à ce jour aucun traitement curatif et/ou préventif des causes, les traitements s'attaquant en général plus aux conséquences. Il existe donc un réel besoin de produits capables de traiter les causes du diabète. Afin d'identifier lesdits produits capables de traiter les causes du diabète, il existe également un besoin toujours constant de procédés efficaces permettant d'identifier lesdits produits. Un des buts de la présente invention est de fournir un tel procédé. Les acides gras à longues chaînes (AGLC) sont une importante source d'énergie pour l'organisme en fournissant l'ATP au travers de leur bêtaoxydation dans la mitochondrie. Ils sont également substrats d'un grand nombre de processus cellulaires divers comme les voies de signalisation cellulaires ou encore la régulation de l'expression des gènes. A titre d'exemple, les acides gras sont essentiels pour fournir au c#ur un apport constant et efficace d'énergie. Les AGLC pénètrent les cellules de la muqueuse après lipolyse par la lipoprotéine lipase puis sont estérifiés en triglycérides dans le réticulum endoplasmique. Les triglycérides sont ensuite intégrés dans les lipoparicules compléxées avec des apolipoprotéines pour former les lipoprotéines de très faible densité (very low density lipoprotein : VLDL), ou chylomicrons, pour quitter la cellule par exocytose et être rejetés dans la circulation systémique. La lipoprotéine lipase transforme ces particules, à la surface des cellules endothéliales, en acide gras non estérifiés, qui par la suite peuvent se fixer à l'albumine. La cinétique de la capture des acides gras dans les cellules de rat se décompose en une phase linéaire rapide durant les 30 premières secondes, suivie d'une phase de transition avec diminution du taux initial de capture et une période tardive avec un taux d'accumulation lent. Le taux de capture initiale correspond à un flux unidirectionnel vectoriel d'acides gras et peut être caractérisé par une fonction calculée de la concentration en acide gras appliquée au milieu d'incubation. La cinétique, la compétition par les AGLC et l'inhibition du transport des acides gras par un traitement de la cellule par une protéase, plaident en faveur d'un processus médié par un transporteur. La première protéine transporteuse d'acide gras (Fatty Acid Transport Protein : FATP) a été identifiée en 1994 dans des adipocytes de rat. Deux gènes correspondants ont alors été identifiés, maintenant appelés FATP1 et Acyl Coenzyme A synthétase (ACS). Par la suite, des criblages de bibliothèques de gènes de souris ont permis de mettre en évidence une famille de protéines caractérisées par une séquence signature constituée de 311 acides aminés hautement conservés chez tous les membres de la famille FATP. Ceux-ci contiennent tous un site de fixation de l'AMP. A ce jour, 6 FATPs de souris et 6 humaines ont été identifiées. L'activité Coenzyme A synthétase est maintenant associée au FATP 1,2, 4 et 5. Leur rôle dans la capture des AGLC peut être déduit de leur activité enzymatique. Alternativement, l'expression de FATP peut conduire à une élévation du taux intracellulaire d'acides gras libres et dès lors induire une activité VLACS (Very Long Chain Acyl CoA Synthétase). En effet, les enzymes impliquées dans l'acylation, par exemple, l'acyl-CoenzymeA synthétase (ACS) sont régulés positivement par les facteurs de transcription PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) et certains acides gras à longue chaîne. L'acylation active les acides gras en dérivés métaboliques actifs de l'acyl CoA qui deviennent capables d'entrer dans n'importe quelle voie métabolique. Au niveau du réticulum endoplasmique, les acides gras peuvent être impliqués dans la synthèse des triglycérides. Dans la mitochondrie et dans les péroxysomes, les FATP peuvent conduire la dégradation des acides gras. Les FATP présentent des localisations subcellulaires différentes dépendamment de leurs terminaisons aminées. Leurs extrémités N-terminales pourraient interagir avec différents partenaires afin de distribuer les acides gras vers des compartiments subcellulaires différents et alors induire leur incorporation dans des voies métaboliques distinctes. Bien que présentant au moins deux motifs signatures homologues, les différentes FATP présentent une localisation chromosomique distincte, des promoteurs et une régulation génique spécifiques, un profil de distribution spécifique, une localisation cellulaire différente et des fonctions spécialisées. Dans l'art antérieur, la FATP5 apparaît sous différentes dénominations telles que "very long chain acyl CoA synthetase relative (VLACSR), very long chain acyl Co A synthetase homolog (VLCS-H2), cholate coenzyme A ligase, Bile acid coenzyme A synthetase (BACS) ", dépendamment des activités qui ont pu être détectées pour cette protéine. La protéine est exclusivement exprimée dans le foie chez l'être humain. Chez la souris, il est connu qu'un ARN messager de 2,6 kb est hautement abondant dans le foie. Des niveaux d'expression plus bas, d'ARN messagers plus courts ont été détectés dans le cerveau, les poumons, les testicules et la rate (2,5 kb) et dans le muscle squelettique (2,2 kb). Des transcrits peuvent être mis en évidence dans le c#ur mais pas dans le rein par la technique de PCR. A la différence de son homologue de souris, chez l'être humain, aucun transcrit n'a pu être détecté dans le fibroblaste, le cerveau ou le c#ur. Les analyses par Southern blots montrent que le gène VLACSR est présent tant chez l'humain que chez la souris en une seule copie. Il a été rapporté par exemple que FATP5 serait capable d'activer les acides gras à longue chaîne et très longue chaîne (par exemple C18 à C26). FATP5 est capable d'activer le chénodéoxycholate, le déoxycholate, le lithocholate et l'acide trihydroxycholestanoique. A la connaissance des inventeurs, l'implication de FATP5 dans la dégradation des acides gras n'a jamais été décrite. Le rôle de FATP5 pourrait n'être limité qu'à la réactivation des acides gras au travers du recyclage entérohépatique. Dans l'art antérieur, la Demande Internationale WO 01/21795 suggère que FATP5 joue un rôle comme transporteur des acides gras, jouant ainsi un rôle dans le processus de capture des acides gras par la cellule. Par ailleurs il est connu que des personnes atteintes de diabète ou des personnes susceptibles de développer un diabète présente un taux élevé d'acide gras libres dans la circulation sanguine. Un excès d'acide gras libres dans le plasma agit tel un compétiteur de l'utilisation du glucose pour la production d'énergie dans les tissus sensibles à l'insuline par exemple le muscle squelettique. Les acides gras interfèrent à différents niveaux dans le métabolisme du glucose. Ils inhibent indirectement la glycolyse, ils diminuent le stockage du glucose sous forme de glycogène et ils inhibent indirectement le transport du glucose. Ceci tend à démontrer une utilisation préférentielle des acides gras libres lorsqu'ils sont en excès et une augmentation de la concentration en glucose dans la circulation conduisant au développement de l'hyperglycémie. De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont maintenant découvert que la FATP5 joue un rôle dans la dégradation des acides gras dans le foie. De même, ils ont pu monter que cette propriété a pour conséquence une diminution significative de la concentration en glucose et en lipide dans le plasma. Ils ont en particulier pu montrer que le taux d'expression des ARN messagers de FATP5 est fortement diminué chez des rats diabétiques obèses (Zucker diabetic fatty rats (ZDF rats)) par rapport au taux d'expression des ARN messagers de FATP5 chez des rats non diabétiques (Zucker lean rats, (ZLC rats)). Ainsi il est possible d'imaginer qu'une sur-expression de FATP5 pourrait avoir comme conséquence une diminution du taux d'acides gras libres et ainsi il est permis d'envisager que tout produit présentant la capacité à augmenter le taux d'expression de FATP5 pourrait être un bon candidat pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, préventif ou curatif, de diabète. La présente invention s'inscrit dans ce domaine d'application. Les inventeurs ont isolé une séquence en acides nucléiques humaine caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe, comme étant le promoteur du gène humain de la FATP5. Cette séquence ne présente que peu d'homologie avec la séquence considérée dans l'art antérieur comme celle du promoteur FATP 5. Ainsi, l'invention a pour objet premier une séquence en acides nucléiques, humaine, isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence en nucléotides, identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. Ladite séquence correspond au promoteur du gène humain FATP5. L'invention a également pour objet une séquence en acides nucléiques, humaine, isolée, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. Selon une forme particulière de l'invention, la séquence en acides nucléiques comprenant au moins la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1, code pour une protéine, particulièrement pour la protéine humaine FATP5. Très préférentiellement ladite séquence en acides nucléiques comprenant au moins la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 et codant pour la protéine humaine FATP5, correspond à la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 2 dans la liste de séquences fournie en annexe. L'invention concerne également les séquences en acides nucléiques complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens, ainsi que toute séquence en acides nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % de préférence d'au moins 90 %, avec l'une des séquences en acides nucléiques selon l'invention. Une séquence en acides nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins X % avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une séquence en acides nucléiques dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 nucléotides de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées de nucléotides dans la séquence de référence. Sont inclus dans une séquence en acides nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, selon l'invention, l'ensemble des séquences correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire à des variations individuelles des séquences SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2. Ces séquences variantes naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain. L'invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression dans lequel est inséré la séquence en acides nucléiques de l'invention, telle que définie précédemment. Préférentiellement, le vecteur de l'invention contient une séquence en acides nucléiques comprenant au moins la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. Sous une forme particulière de l'invention, le vecteur de l'invention comprend en outre une séquence en acides nucléiques codant pour une protéine détectable placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques identifiée comme le promoteur du gène FATP5 humain tel que défini précédemment. Particulièrement ce promoteur correspond à la séquence SEQ ID N 1. Par protéine détectable, on entend toute protéine qui, une fois exprimée, pourra facilement être mise en évidence à l'aide de toute technique connue de l'homme du métier. Parmi les protéines utilisables, on peut citer la FATP5 ellemême ou encore des protéines utilisées comme marqueur comme par exemple la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protéine ou GFP), la Renilla ou la luciférase. Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte. Lesdits vecteurs comportent de préférence des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement comprendre des séquences codant pour des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. La séquence en acides nucléiques selon l'invention peut être inséré dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral. Les vecteurs plasmidiques utilisables selon l'invention peuvent être tout plasmide connu, permettant l'expression d'une séquence en acides nucléiques. Par expression d'une séquence en acides nucléiques, on entend selon l'invention la capacité qu'a le vecteur de l'invention à permettre la transcription de la séquence en acides nucléiques de l'invention en ARN, éventuellement suivi de la traduction dudit ARN en protéine. Préférentiellement, le plasmide selon l'invention permet l'expression de la séquence en acides nucléiques, humaine, isolée telle que décrite précédemment. Très préférentiellement, le plasmide selon l'invention permet l'expression d'une séquence en acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence en nucléotides, identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe, particulièrement d'un acide nucléique codant pour FATP5. A titre d'exemple de plasmide utilisable selon l'invention, on peut citer les plasmides pCMVTag (Stratagene, La Jolla, USA), pcDNA3 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), pSG5 (Stratagene, La Jolla, USA), ou encore pGL2 et pGL3 (Promega, Mannheim, Allemagne). Les vecteurs viraux peuvent notamment être des adénovirus, des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes. Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence en acides nucléiques dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus, ou les virus associés aux adénovirus (Adeno-associated virus ou AAV). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN ou l'ARN nu, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificiel chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificiel chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines. De préférence selon l'invention, le vecteur est un plasmide ou un adénovirus. De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les vecteurs recombinants en résultant peuvent être introduits dans l'hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire. L'invention a aussi pour objet les cellules hôtes transformées, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, dans lesquelles au moins une séquence en acides nucléiques selon l'invention ou au moins un vecteur selon l'invention a été introduit. Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes, les cellules de levure, les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en #uvre des baculovirus. L'invention a aussi pour objet une méthode de production d'une protéine caractérisée en ce que l'on cultive une cellule hôte telle que décrite précédemment, dans des conditions permettant l'expression sous forme d'une protéine, de la séquence en acides nucléiques selon l'invention ayant été introduite dans ladite cellule. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de la séquence en acides nucléiques de l'invention ou d'un vecteur ou d'une cellule hôte, tels que décrit précédemment, pour identifier un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous sa dépendance. L'invention a également pour objet un procédé d'identification d'un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisé en ce que a) on met en contact, dans un milieu propice à l'expression d'une séquence en nucléotides, une séquence en acides nucléiques ou un vecteur ou une cellule hôte tels que décrits précédemment, avec un produit susceptible de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite précédemment, b) on mesure le taux d'expression de ladite séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite précédemment. Par milieu propice à l'expression d'une séquence en nucléotides, on entend ici tout système d'expression permettant la synthèse, à partir de la séquence en acides nucléiques de l'invention, d'un ARN, particulièrement d'un ARN messager, et éventuellement d'une protéine. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comporte une étape supplémentaire de comparaison du taux d'expression déterminé en b) par rapport au taux d'expression de ladite séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite précédemment chez un témoin qui n'a pas été mis en contact avec le produit à identifier. La comparaison permet d'évaluer la capacité modulatrice du produit testée vis-à-vis de la séquence en acides nucléiques de l'invention. Par moduler ou capacité modulatrice, on entend selon l'invention la capacité du produit tester à stimuler ou à inhiber l'expression d'une séquence en nucléotides placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques selon l'invention. La mesure du taux d'expression de la séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques de l'invention peut être réalisée par les techniques classiques d'analyse d'ARNm ou de protéines qui sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple non-limitatif, on peut citer les techniques suivantes : RT-PCR, Northern-blot, Western-blot, RIA, ELISA, immunoprécipitation, techniques d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique. On peut se référer, ici et ailleurs dans la présente demande pour tout ce qui est des protocoles d'expérimentation en matière de biologie cellulaire ou moléculaire, ou encore d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique aux nombreux ouvrages parfaitement connus de l'Homme du métier, particulièrement à "Current Protocols in Immunology ; John Wiley et sons, Teton Data, System, Jackson, Wyoming, (ISBN 0-471-30660-6,2003)". Avantageusement, ladite mesure est réalisée à l'aide de sondes, d'amorces ou d'anticorps. Les produits capables de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques selon l'invention peuvent être des macromolécules biologiques comme par exemple un acide nucléique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques ou encore des molécules chimiques. L'invention a également pour objet un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques selon l'invention, susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention. L'invention a encore pour objet une méthode d'identification d'un produit susceptible d'interagir avec la séquence en acides nucléiques selon l'invention, caractérisée en ce que a) on met en contact une séquence en acides nucléiques ou un vecteur ou une cellule hôte, tels que décrits précédemment, avec un produit susceptible d'interagir avec la séquence en acides nucléiques selon l'invention, b) on évalue l'interaction entre ladite séquence en acides nucléiques et ledit produit testé. Selon une forme particulière de mis en #uvre de l'invention, ladite méthode d'identification est destinée à identifier un produit capable de se fixer à la séquence en acides nucléiques selon l'invention, comme la calorimétrie pour les interactions hétérologues ou le test double hybride pour les interactions peptidespeptides. L'invention a enfin pour objet un produit capable d'interagir ou de se fixer à la séquence en acides nucléiques selon l'invention, susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes d'identification telles que décrites précédemment. Selon l'invention, l'évaluation de l'interaction et/ou de la fixation entre ladite séquence en acides nucléiques et ledit produit testé peut être réalisée par toute technique connue. Les inventeurs ont montré que la FATP5 joue un rôle dans la dégradation des acides gras dans le foie. De même ils ont pu monter que cette propriété a pour conséquence une diminution significative de la concentration en glucose et en lipide dans le plasma. Ils ont en particulier pu montrer que le taux d'expression des ARN messagers de FATP5 est fortement diminué chez des rats diabétique (Zucker diabetic fatty rats (ZDF rats)) par rapport d'expression des ARN messager de FATP5 chez des rats non diabétiques (Rat ZLC). Ainsi, l'invention a encore pour objet l'utilisation du produit selon l'invention, dans la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter le diabète. L'invention a aussi pour objet, l'utilisation du produit selon l'invention, dans la préparation d'un médicament destiné à induire la béta-oxydation des acides gras dans le foie. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de l'invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 représente la distribution cellulaire et tissulaire de l'expression du gène FATP5 humain, analysé par PCR. NCI-H295 : lignée cellulaire surrénale, THP-1 : monocyte, THP1 D : macrophage différencié de monocyte THP-1, Jurkat et Jurkat JR : cellules T : CEM : cellule de lignée de cellules de leucémie lymphoblastoïde aiguë, HH : primaires humains, HepG2, HuH7 : cellules hépatiques humaines, CaCo2 cellules de colon, CaCo2D : cellules CaCo2 différenciées, CASMC : cellules musculaires lisses d'artère coronaire, ASMC : cellule musculaires lisses d'aorte. La Figure 2 représente les résultats obtenus lors des essais de capture des acides gras : A : essai sur cellules 3T3-L1 ; B : essai sur hépatocytes des rats (RH) (temps 1 minute). Les résultats représentent l'induction de la capture des acides gras en fonction du temps pour chaque condition. La condition contrôle représente la mesure de la capture par des cellules infectées par un adénovirus porteur d'un gène dont l'expression ne présente aucune influence sur la capture des acides gras par la cellule. La Figure 3 représente les résultats obtenus lors des essais visant à déterminer l'activité ACS (Figure 3A) et l'activité VLACS (Figure 3B) après infection par l'adénovirus porteur du gène de hFATP5. Résultats exprimés en taux d'induction. La Figure 4 représente les résultats obtenus lors des essais visant à déterminer l'effet de l'expression de hFATP5 sur la (3-oxydation des acides gras. 5A : HepG2 à 48 heures ; 5B : RH à 12 heures. Résultats exprimés en taux d'induction. La Figure 5 représente les résultats obtenus lors des essais visant à déterminer l'effet de l'expression de hFATP5 sur le taux d'estérification des acides gras dans des cellules HepG2 à 48 heures. Résultats exprimés en rapport 3H20/3TG. La Figure 6 représente les résultats obtenus lors des essais visant à déterminer l'effet de l'expression de hFATP5 la régulation de l'expression de hFATP5 pendant le développement du diabète dans les rats Zucker diabétiques obèse : A : mesure du taux de glucose B : mesure du taux d'insuline -#-: Rats mâles ZDF (fa/fa) -#- Rats mâles ZLC (fa/+) La Figure 7 représente les résultats obtenus lors des essais visant à déterminer le taux d'ARN messagers de hFATP5 chez les rats Zucker diabétiques obèse (ZDF : -#-) et chez les rats ZLC (-#-). La Figure 8 représente les résultats des analyses biochimiques. A : mesure du taux d'acides gras libres dans le foie (-8- : rats ZDF (fa/fa) ; o- : rat ZLC (fa/+)). B : courbes de prise de poids (-#-: rats ZDF (fa/fa) ; -#- Rats ZLC (fa/+)). La Figure 9 représente le taux d'acylation d'oléates chez les rats ZDF et ZLC à 8 semaines, à 5 et 30 minutes pour chaque condition. A : ZDF ; B : rats ZLC. La Figure 10 représente la réversion de l'inhibition des taux de bétaoxydation dans les hépatocytes primaires de rats ZDF par rapport aux rats contrôles ZLC. A : âgés de 8 semaines ; B : rats âgés de 10 semaines. (C = contrôle ; Z = LacZ ; h5 = hFATP5) La Figure 11représente la mesure de paramètres biochimiques chez le ZDF infectés avec l'adénovirus porteur de FATP5, comparé aux rats infectés avec l'adénovirus de contrôle LacZ (acides gras libres (A), triglycérides (B) et glucose (C)). La Figure 12 représente la localisation du site d'initiation de la transcription, (Transcription Start Site : TSS), du gène FATP5 : A méthodologie prédictive par bioinformatique ; B : méthodologie expérimentale par RACE. La Figure 13 représente la séquence du promoteur putatif du gène humain de la FATP5. Cette séquence est identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. La Figure 14 représente l'activité de la séquence promoteur du gène humain de la FATP5, dans des cellules HepG2, HeLa et Hek293. Résultats présentés en induction relative par rapport au contrôle mesuré sur des cellules transformées avec un plasmide pGL3 vide. La Figure 15 représente la variation du taux d'ARN messagers de FATP5 après traitement de rats ZDF (A) ou ZLC (B) par un composé connu pour être un sensibilisant à l'insuline. Les exemples suivants sont illustratifs de l'invention et ne la limitent aucunement. Exemple 1 : Démonstration de l'implication de hFATP5 dans la ss-Oxydation des acides gras Matériels et méthodes A) Profil d'expression de FATP5 a) Préparation de l'ARN L'ARN total est préparé à partir de cellules et de tissus utilisant la technique décrite par Chomczynski et Sacchi (Chomczynski et al. 1987). La quantification des ARN est réalisée par une mesure de la densité optique à 260 nm et la qualité des ARN est vérifiée par la mesure du rapport des densité optique 260/280. 1 g de chaque échantillon est utilisé en tant que matrice dans une réaction de transcription inverse (RT) en utilisant l'enzyme MMLV-RT (Gibco BRL, Paisley, UK) et la réaction d'amplification de polymérisation en chaîne est réalisée sur 2 l du produit de la RT. Des amorces spécifiques (Eurogentec, Seraing, Belgique) ont été réalisées pour hFATP5 et rFATP5. Pour assurer la spécificité des produits de la PCR, la température de dénaturation thermique (Tm) est optimisée pour chaque cible spécifique et le nombre de cycles situé entre 25 et 30, ceci dépendant de l'abondance du produit de la transcription. Tableau 1 : Description des amorces Id de l'amorce Séquence Tm : C Cycles Actine r sens GACTACCTCATGAAGATCCTGACTGA 55 20-25 GCG Actine r antisens GGGGCAATGATCTTGATCTTCATGGT GAPDH h sens CCACATACCAGGAAATGAGC 55 20-25 GAPDH h antisens GACATCAAGAAGGTGGTGAA FATP5hsens GCTCTAGAGCTGGTACCATGGGTGT 60 25 CAGGCAACAG FATP5 h antisens CGGAATTCGCTGGTACCATGGGTGT CAGGCAACAG FATP5 r sens GGGGTACCAATGCCATGGGTATTTG 60 25 GAAGAAACTAACC FATP5 r antisens GGGAACTGGACTTCGGGCAAATGTG TGG Les produits de la PCR de l'ADN sont analysés sur un gel d'agarose à 1%. Le signal est quantifié comme valeurs densitométriques à l'aide d'un instrument Gel DocTM 2000 (Bio-rad, Marnes La Coquette, France). Pour l'analyse transcriptionelle in vivo, la quantification est calculée par le rapport entre les valeurs de chaque cible spécifique et la valeur du contrôle interne (actine). Les résultats sont exprimés en niveaux d'induction par rapport au contrôle établi à 1. L'analyse quantitative est réalisée sur un appareil Light Cycler (Roche) à 32 capillaires avec du Sybergreen qui est un fluorophore marquant l'ADN doublebrin et par une PCR à deux étapes (Roche, Mannheim, Germany). Les résultats pour chaque cible, formulés comme étant les points de croisement de la différentielle de la courbe d'amplification (représentant l'augmentation de fluorescence au cours de la PCR) en ordonnée avec l'axe des abscisses représentant le nombre de cycles (Crossing Point), sont normalisés avec un gène de contrôle. Tableau Il : Les conditions de la PCR quantitative. Insert Pro ram Tm du roduit final ( C) RFATP5 8', 95 C, 40 cycles (15", 94 C ; 10", 55 C ; 83 15", 72 C 15", 72-C) B) Cinétique du développement des diabètes dans des rats obèses diabétiques Zucker Les rats mâles Zucker diabétiques obèses (ZDF/GMI-fa/fa) de 5 semaines d'âge et les rats mâles Zucker Lean du même âge provenant de Genetic Model Inc. (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) sont nourris en libre accès au Purina 5008 (PMI Nutrition International, Wellingtborough, Northamptonshire, UK). Aux âges de 6 semaines, 10 semaines et 20 semaines, 48 rats sont répartis en 3 groupes de 16 animaux (8 rats Zucker diabétiques obèses et 8 rats Zucker Lean). Le poids des animaux, et leur consommation de nourriture sont surveillés pendant toute la durée de l'expérience. Des échantillons de sang sont collectés par ponction retro-orbitale sous anesthésie après une période de diète de 8 heures pendant la journée. L'anesthésie est faite avec injection intra péritonéale de pentobarbital. Les animaux son sacrifiés par dislocation cervicale, le foie est prélevé, pesé et immédiatement congelé dans de l'azote liquide pour des analyses supplémentaires. a) Tableau de marche de l'étude : Semaine~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Age des animaux 0 - Réception de 24 ZDF et 24 ZLC 5 semaines 1 Sacrifice du groupe 1 (8 ZDF/8 ZLC) 6 semaines 5 Sacrifice du groupe 2 (8 ZDF/8 ZLC) 10 semaines 15 Sacrifice du groupe 3 (8 ZDF/8 ZLC) 20 semaines b) Analyses Le glucose du sérum, le cholestérol, les triglycérides et les acides gras libres sont déterminés en utilisant des essais biologiques enzymatiques. Les niveaux d'insuline sont déterminés en utilisant des analyses radioimmunologiques. Une partie du foie est conservée pour des études d'histologie. C) Clonage de la séquence complète de hFATP5 dans adénovirus : Sauf indication contraire, les techniques utilisées sont celles décrites par les fournisseurs ou celles décrites dans les nombreux ouvrages de biologie moléculaire classiques. La séquence codante complète de hFATP5 (à partir de l'ATG en position 1575 de la séquence SEQ ID N 2) est clonée dans le système d'expression PT3414-1 d'Adeno-X (Clontech, Palo Alto, USA). Les ARNs totaux d'une culture d'hépatocytes humains sont extraits par le kit RNeasy de Qiagen, miniprep (Qiagen, Courtaboeuf France). Un premier brin d'ADN est alors synthétisé selon : ARN qsp 1 g RNAs inhibitor (Promega, charbonnières, France) 1 L First strand buffer 5X(lnvitrogen) 6 L DTT (10mM) (Invitrogen) 3 L dNTP (10mM) 0 (Promega, charbonnières France) 0,375uL pdN6 (0,2pg.pL) (Amersham 1 L H20 qsp 30 L MMLV-RT (Invitrogen) 1 L Programme : 20 C 15 minutes 37 C 60 minutes 95 C 5 minutes Puis une réaction de PCR est réalisée à l'aide des amorces suivantes : Séquence h5~4 As (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 19 : GCTCTAGATCAGAGCCTCCAGGTTCCCTCACACACAGCC Séquence h5~1S (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 20 : GCTCTAGATGGTACCATGGGTGTCAGGCAACAG En utilisant le milieu réactionnel suivant Oligo Sens (10pM) Oligo AntiSens (1 OpM) 1 L Taq platinum Pfx + Buffer 10X + MgS04 (Invitrogen, Cergy-pontoise France) dNTP (Promega, Williamsburg, IA), dans un volume final de 20 L. L'amplification est alors réalisée selon le programme suivant : 1 cycle à 94 C pendant 5 minutes suivi de 25 cycles comprenant 30 secondes à 94 C, puis 30 secondes à 55 C et 2 minutes à 68 C. Le produit est alors conservé à 4 C. Le fragment PCR obtenu est purifié en utilisant un kit de purification "QIAquick PCR purification kit" (Qiagen, Courtaboeuf France). Le fragment purifié est alors digéré par Xba I (NEB, Beverly MA) et cloné dans le vecteur pShuttle du kit pAdenoX de Clonetech, suivant les recommandations du fournisseur. Le plasmide obtenu est introduit dans des bactéries Echerichia Coli de type DH5d et les clones sont sélectionnés par leur résistance à la kanamycine. L'ADN plasmidique des clones positifs est alors purifiés, vérifiés pour analyse de restriction et séquences. L'expression de la protéine est validée in vitro en utilisant le système d'expression T7. La cassette d'expression du pShuttle est coupée en utilisant PI-Scell-Ceul, et liée dans Adeno-XTM Viral DNA. Le produit de ligation est digéré avec Swal et introduit dans E coli. Les clones résistants à l'ampicilline sont sélectionnés. L'ADN adénoviral recombinant contenant le gène d'intérêt est digéré avec Pacl et introduit dans des cellules embryonnaires de rein humaines (cellules 293). Les recombinants adénoviraux sont récoltés et réamplifiés par 3 cycles d'amplification. Le virus est purifié par le procédé CICs puis nettoyé dans une colonne sephadex G50. Les particules virales sont titrées par un essai de formation de plaques (Pfu) en plaques 96 puits. D) Préparation des hépatocvtes de rat : Les hépatocytes de rats sont isolés par perfusion de collagénase à partir de foies de rats mâles. Les rats sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital. Les foies sont ensuite perfusés dans la veine porte d'abord avec 200 mL de milieu de perfusion du foie suivi par 200 mL de tampon Hanks additionné de 10mM de Hepes, 4mM de CaCl2 et 14 mg de Blendzyme3. Les foies sont disséqués, hachés dans du milieu Hepatocyte wash (Gibco BRL, Paisley, UK) et filtrés par des filtres de 70 m. Les cellules sont centrifugées et lavées 3 fois dans du tampon Hepatocyte Wash avant que la viabilité de la cellule ne soit estimée par la technique de l'exclusion du bleu Trypan (viabilité > 85%). Les cellules sont ensemencés en milieu de Williams additionné d'UltroserSF (2% par volume), de pénicilline (100 U/ml), de streptomycine (100 g/ml), d'acides gras libres-BSA (SIGMA, St. Louis MO, USA) (0,2% mass/volume), de I-glutamine (2 mM), de dexaméthasone (1 M), de Triiodothyronine (T3, (SIGMA, St. Louis MO, USA) (100 nM), et d'insuline (100 nM). Après 4 heures, le milieu de culture est remplacé par le même milieu Williams sans Ultroser et sans BSA. #) Infection des rats ZDF avec l'Adenovirus hFATP5 et l'Adenovirus LACZ dans le cadre du développement du diabète inverse : Les rats mâles Zucker diabétiques obèses (ZDF/GMI-fa/fa) de 5 semaines d'âge et les rats mâles Zucker Lean du même âge provenant de Genetic Model Inc. (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) sont nourris en libre accès au Purina 5008 (PMI Nutrition International, Wellingtborough, Northamptonshire, UK). A l'âge de 8 semaines, 5.109 Pfu d'Adenovirus ou du PBS (pour les contrôles) sont injectées, dans une veine de la queue des rats. Le volume injecté est inférieur à 2 ml par rat. 3 rats sont infectés par pAdLacZ, 3 avec pAdhFATP5. Les rats sont sacrifiés à 10 semaines. Les niveaux de glucose, d'acides gras libres et de triglycérides sont mesurés dans le plasma sanguin. F) Essais fonctionnels : a) Capture des acides gras : 320 M de d'acide oléique [9,10 3H] sont mélangés avec 80 M d'acide gras libre-BSA à partir d'un stock concentré à 20%, par agitation douce à 37 C pour obtenir une concentration finale de 80 M de BSA et un rapport molaire acide oléique/BSA de 4,0. Pour les essais, un aliquote de la solution stock d'acides gras/BSA est dilué au 1/8 avec du PBS. Les hépatocytes de rats (106 cellules/compartiment) sont ensemencés dans les puits de plaques 6 trous et sont incubés pendant 4 heures à 37 C. Les cellules 3T3-L1 (ATCC n CL-173), Manassas, VA, USA) (5.105 cellules/compartiment) ont été incubées dans du DMEM à 2% sérum de veau foetal (FCS). La multiplicité de l'infection est de 1 et l'infection est poursuivie toute la nuit. Les cellules sont trypsinées, récoltées, centrifugées et resuspendues avec du PBS pour obtenir une suspension de 5.105 cellules/ml. 200 l de suspension de cellules (105 cellules) sont placés dans des tubes à centrifuger en polypropylène de 5 ml. Les suspensions cellulaires en PBS sont pré-incubées pendant 5 minutes à 37 C sous agitation dans un bain d'eau. Un volume égal d'une solution stock d'acides gras/BSA concentrée 2 fois est ajouté à chaque tube afin de réaliser la capture des acides gras. À des intervalles donnés, la capture a été arrêtée en ajoutant, dans chaque tube, 5 ml d'une solution froide (0 C) de PBS contenant 0,1 % de BSA et 200 M de phloretine (SIGMA, St. Louis MO, USA) (solution de lavage). Les cellules sont centrifugées et lavées deux fois. Le culot de centrifugation est resuspendu avec 400 l de solution tampon de lyse (SDS 0,4% dans l'eau). 4 ml de solution scintillante sont ensuite ajoutés et les acides gras incorporés sont comptés par un compteur Tri-Carb 2100 (Packard, Meriden, CT, USA). Les résultats ont été présentés comme une proportion de l'induction du Lac Z normée à 1. b) Acylation des acides gras : Des hépatocytes de rats (106 cellules/compartiment) sont ensemencés dans les puits de plaques 6 trous et sont incubés pendant 4 heures à 37 C. Le milieu est ensuite retiré et 2 ml du mélange infectieux (DMEM, 2% FCS) est ajouté à chaque puit. La multiplicité de l'infection est 1. L'infection est poursuivie toute la nuit. Les cellules sont récoltées après un traitement à la trypsine et centrifugées. Le culot de centrifugation est resuspendu dans 300 l de solution tampon A (500 mM de tris HCI à un pH de 8,5,1 mM de MgCI2, 100 mM de NaCl, 1 mM d'ATP, 0,1% de TritonX 100). Les cellules sont ultrasoniquées et incubées 30 minutes dans de la glace. Les niveaux de protéine sont quantifiés par la méthode de Bradford. 20 L de l'extrait contenant 20 g de protéines sont utilisés par essai et placés dans un tube en verre. 180 l du mélange réactionnel (50 mM de tris HCL à un pH de 8,5,150 M de Coenzyme A, 300 M de DTT, 10 mM de ATP, 10 mM de MgCI2, 0,1% de TritonX 100,10 M de [3H] d'acide palmitique ou [3H] d'acide lignocérique) sont ajoutés pour démarrer l'essai. La réaction est stoppée après 5 à 30 minutes par l'addition de 800 l d'acide perchlorique à 1%. Pour évaluer les niveaux d'Oleyl CoA marqués, le mélange réactionnel est extrait avec 2,25 ml d'acide isopropyl/heptane/sulfurique (40/10/1). Les extraits sont mélangés et la phase organique est retirée. Deux extractions successives sont réalisées. 4 mL d'une solution scintillante sont ajoutés à 1 ml de phase aqueuse et comptés dans un compteur Tri-Carb 2100 TR. La radioactivité mesurée à partir d'extraits de contrôle de protéines bouillies est soustraite de l'essai correspondant pour déterminer la quantité d'acyl CoA. Les résultats sont exposés comme une proportion de l'induction du Lac Z normée à 1. c) Oxydation des acides gras : Des hépatocytes de rats (6.105 cellules/compartiment) sont ensemencés dans les puits de plaques 12 trous et sont incubés pendant 4 heures à 37 C. La multiplicité d'infection est de100 et l'infection est poursuivie toute la nuit. Le milieu est ensuite retiré et 500 l de DMEM additionné par 100 M d'acide oléique [9,10 3H] et 2% de BSA sont ajoutés dans chaque puit. Après 12 heures d'incubation à 37 C, le milieu est transféré dans un microtube et l'excès d'acide oléique [3H] est précipité avec 50 l d'acide trichloroacétique à 10% et 50 l de BSA à 20%. Le mélange est centrifugé à 12400 tours par minutes pendant 2 minutes. Le surnageant est transféré dans un microtube et on ajoute 500 l d'eau. L'incubation est poursuivie à 50 C pendant 18 heures. L'eau tritiée est mesurée après l'addition de 4 ml de solution scintillante et comptée par un compteur Tri-Carb 2100. Les résultats sont exposés comme une proportion de l'induction du Lac Z normée à 1. d) Estérification des acides aras : Bien que l'oxydation des acides gras ait été mesurée dans le milieu, les triglycérides sont extraits à partir des cellules incubées avec les acides gras marqués. Les hépatocytes de rats sont trypsinés et sont mélangés par triplicate dans un même tube. Les cellules sont centrifugées à 18500 tours par minutes pendant 2 minutes. Chaque puits est lavé avec une solution à base de bicarbonate (Tampon Krebs Ringer Bicarbonate : 1,2 mM de KH2PO4, 26 mM de NaHC03, 1,3 mM de MgCl2, 124 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 10 mM de glucose) et cette solution tampon est utilisée pour resuspendre le culot de la centrifugation. Les cellules sont centrifugées une seconde fois et le surnageant retiré. L'étape est répétée. Le culot de la centrifugation est ensuite resuspendu dans 100 l d'eau et peut être congelé dans de l'azote liquide pour des analyses complémentaires. Le culot de la centrifugation est ensuite laissé à la température ambiante (25 C). On ajoute alors 500 l d'acétone et l'on sèche sous vide à l'aide d'un concentrateur. Le culot est resuspendu avec 300 l d'un mélange chloroforme/méthanol (1/1) contenant 5 l de Trioléine 50 nM en tant que support. Après mélange, l'ensemble est centrifugé pour enlever le surnageant. Deux extractions sont réalisées. Le culot de la centrifugation est resuspendu dans 30 l d'un mélange chloroforme/méthanol (1/1) et déposé sur une plaque de chromatographie en couche fine préalablement recouverte de gel en silicone G60. La migration est réalisée pendant une heure et demi avec 200 ml de solution tampon (H-hexane/diéthyl éther/méthanol/acide acétique 90/20/2/3). Résultats : A) Distribution cellulaire et tissulaire de hFATP5 : L'étude par PCR confirme l'expression exclusive de FATP5 humaine dans le foie, les hépatocytes primaires et les cellules de la lignées cellulaires humaines HepG2. Ces résultats sont présentés à la Figure 1. B Caractérisation fonctionnelle de FATP5 : a) Construction des adénovirus : Pour caractériser les fonctions de FATP5 dans le métabolisme des acides gras du foie, il a été conçu un adénovirus porteur du gène de hFATP5 (pAdenohFATP5), un adénovirus de contrôle pAdeno-LacZ et un adénovirus pAdenoCD36. Ce dernier a été conçu comme contrôle positif du transport des acides gras. b) Capture des acides gras : La capture des oléates est testée sur cellules 3T3-L1 (Figure 2A) et sur des hépatocytes des rats (RH) (Figure 2B) isolés à partir des rats Wistar infectés par l'adénovirus. La sur-expression de FATP5 n'a pas d'influence sur l'activité de transport des acides gras dans les cellules 3T3-L1 (Figure 2A) mais augmente, de manière significative, le transport des acides gras des hépatocytes de rats. Ce résultat suggère que, dépendamment de la ligne cellulaire, l'activité de transport des acides gras est effectuée de manière différente. Ceci peut être dû au recrutement efficace de différents cofacteurs spécifiques à une ligne cellulaire. Des résultats antérieurs suggèrent que le FATP puisse agir en accord avec des partenaires comme ACS ou FAT. Les résultats présentés ici suggèrent que FATP5 n'agit pas de la même manière sur le transport des acides gras, selon les cellules dans lesquelles la protéine est exprimée. De plus, l'absence d'effet des FATP5 dans les lignées de cellules préadipocytaires et la rapide augmentation du transport des acides gras dans les hépatocytes de rats suggère que FATP5 possède une fonction spécifique qui influence le transport des acides gras dans les hépatocytes plutôt que d'être un simple transporteur ubiquitaire. c) Essais de l'activité ACS et VLACS : L'essai ACS est réalisé avec du palmitate et du lignocérate dans des hépatocytes de rats primaires infectés par l'adénovirus. Une hausse significative de l'activité VLACS après l'incubation de lignocérate due à la sur-expression de hFATP5 n'est seulement détectable qu'avec une période d'incubation de 30 minutes (Figure 3A). Il est suggéré que l'induction de l'activité ACS par la surexpression de hFATP5 puisse être un effet indirect. L'activité "very long chain acyl CoA synthétase" est augmentée légèrement mais est spécifique de hFATP5 sachant que la sur-expression de CD36 ne possède pas d'influence sur l'acylation de lignocérate (Figure 3B). Les résultats précédemment publiés sur l'activité VLACS des protéines FATP sont ainsi confirmés. Mais, il existe une différence spécifique sur la cinétique de l'induction. Les résultats suggèrent que FATP5 possède un spectre d'activité plus large sachant qu'elle démontre des effets significatifs sur les acides gras C16, tels que le palmitate, qui représentent une plus grande classe d'acides gras que les acides gras à très longue chaîne. d. Effet de l'expression de hFATP5 sur la (3-oxvdation des acides gras : Pour analyser si le taux de dégradation des acides gras est modulé par la sur-expression de hFATP5, la conversion de l'oléate tritiée en eau tritiée, produit final de la [3-Oxydation, a été mesurée. La sur-expression du gène de contrôle CD36 n'affecte pas la 0-oxydation dans les cellules HepG2 (Figure 4A) ou dans les hépatocytes primaires de rats (Figure 4B), ce qui est en accord avec l'hypothèse que CD36 dirige l'estérification des acides gras et non leur dégradation. Au contraire, une sur-expression de hFATP5 augmente considérablement le taux de p-oxydation dans les hépatocytes HepG2 (plus de 3 fois) (Figure 4A). La sur-expression de hFATP5 induit la dégradation des acides gras dans les hépatocytes primaires. e. Confirmation de l'implication de hFATP5 dans la (3-oxydation plutôt Que dans l'estérification des acides gras : Pour confirmer que l'expression de hFATP5 conduit seulement à la dégradation des acides gras et n'influence pas leur taux d'estérification, l'essai de (3-oxydation est complété avec un essai d'estérification dans la même expérience, sur les cellules HepG2. La sur-expression de hFATP5 n'affecte pas le taux d'estérification (Figure 5). Cela démontre bien une nouvelle activité fonctionnelle de hFATP5 consistant uniquement en la dégradation des acides gras dans le foie, alors que FAT/CD36 conduit les acides gras vers le processus d'estérification. hFATP5 est un activateur de la (3-oxydation. f) Régulation de l'expression de hFATP5 pendant le développement du diabète dans les rats Zucker diabétiques obèse : Une étude du niveau d'expression du gène FATP5 dans les rats Zucker diabétiques obèse pendant l'apparition du NIDDM dans ce modèle, a été menée et les résultats ont été corrélés avec la variation des niveaux d'insuline et de glucose. Les rats Zucker diabétiques obèses développent naturellement un diabète avec la même progression que pour l'homme (Figure 6A et 6B) avec : - Un état d'hyperinsulinémie et d'euglycémie qui est observé pour les rats mâles ZDF (fa/fa) de 6 semaines ; - Un état d'hyperinsulinémie et d'hyperglycémie, qui est observé pour les rats mâles ZDF (fa/fa) de 10 semaines ; - Un état de déficience en insuline et d'hyperglycémie, qui est observé pour les rats mâles ZDF de 20 semaines. Une étude par des analyses quantitatives et semi-quantitatives (Tableau III et Figure 7) de l'expression de hFATP5 démontre que le taux d'ARM messagers de hFATP5 diminue à 10 semaines chez les rats ZDF. À la même période, les niveaux de glycogène sont nettement plus élevés chez les rats ZDF que chez les rats ZLC (Tableau III). Tableau III : Analyse du métabolisme du glucose, du taux de glycogène et du taux d'ARNm de FATP5 (régulation de l'ARN messager), à 6,10 et 20 semaines chez les rats ZDF versus les rats ZLC 6 semaines 10 semaines 20 semaines Analyse SQ des FAT FAT5 FAT FAT5 FAT FAT5 niveaux d'ARNm ZDF/ZLC 1,6 0,9 2,6 0,5 1,5 0,9 SEM* 0,09 0,04 0,37 0,07 0,11 0,08 Histologie du foie Glycogène : + Glycogène : ++ Glycogène : + Insuline/glucose Hyperinsulinémie Hyperinsulinémie Hyperglycémie Normoglycémie Hyperglycémie D éf i c i e n ce en Insuline * :SEM : Standard Error Mean L'analyse biochimique révèle que les niveaux d'acides gras libres dans le plasma sont plus importants chez les rats ZLC de 10 semaines et 20 semaines tandis que les niveaux d'acides gras libres dans le foie chez les rats ZDF ont diminué par rapport aux rats ZLC (Figure 8A). Cette période de 10 semaines se caractérise par la séparation des courbes de gain de poids chez les rats ZDF par rapport aux rats ZLC, ce qui signifie le développement du diabète (Figure 8B). g) Effet de la surexpression de FATP5 sur l'acylation des acides gras : Les effets fonctionnels de la sur-expression de hFATP5 dans les hépatocytes de rats primaires ZDF et ZLC ont été analysés. La sur-expression de FATP5 augmente très significativement l'acylation des acides gras dans les hépatocytes primaires de rats ZDF de manière précoce à 5 minutes et tardive à 30 minutes. Ces résultats sont présentés à la Figure 9. h) Réversion du déficit de la dégradation des acides gras dans le foie de rats gras diabétiques : La béta-oxydation des acides gras est déficitaire dans les foies des rats ZDF par rapport à celle qui a lieu dans les foies des rats contrôles ZLC. La surexpression de FATP5 reverse ce déficit. La sur-expression de FATP5 n'a pas d'effet chez les rats contrôle. Ces résultats sont présentés à la Figure 10. i) La sur-expression de FATP5 diminue le taux de glucose et de lipides dans le sang des rats ZDF : Les niveaux de glucose sont significativement diminués à l'âge de 10 semaines pour des rats ZDF infectés avec l'adénovirus porteur de FATP5, comparé aux rats infectés avec l'adénovirus de contrôle LacZ (Figure 11 C). Cette baisse est corrélée avec celle des niveaux d'acides gras libres (Figure 11A), et au fort et rapide déclin du taux de triglycérides dans le plasma (Figure 11 B). Ceci est une preuve que l'expression de FATP5 affecte le métabolisme du glucose et diminue l'hyperglycémie in vivo. Exemple 2 : Caractérisation de la région promotrice putative du gène FATP5 humain et démonstration de l'activité promotrice : Les produits du gène FATP5 (AF064255 ou NM~012254) appartient à une famille protéique impliquée dans la synthèse des lipides. Le produit du gène FATP5 est impliqué dans la synthèse des lipides complexes et notamment dans l'élongation des acides gras. Le gène FATP5 est situé sur le chromosome 19. Les informations générales relatives à la séquence codant pour FATP5 sont les suivantes (Tableau IV) : Synonymes SLC27A5, FATP5, VLACSR, VLCSH2, VLCS-H2 Fonction Ligase Localisation 19q 13. 43 N accession GenBank NM 012254 Taille (pb) 2347 N accession GenPept NP 036386 Taille (acides aminés) 690 a. Localisation des sites d'initiation de la transcription (Transcription Start Site : TSS) de FATP5 par prédiction et identification par la technologie de l'amplification rapide des extrémités des ADN complémentaires (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) : Le gène FATP5 est situé sur le chromosome 19, il est composé de 10 exons répartis sur 14 kb. Le contig NT~011104 contenant le gène FATP5 a été publié en août 2002. La région 5' UTR cartographiée à partir de l'ARNm et d'ESTs montre une taille de 34 pb (5'UTR1). Ainsi, le site d'initiation de la transcription biologique le plus probable, déterminé par rapport à l'extrémité 5' de l'ARNm, d'ESTs publiées par GenBank et des informations provenant de la banque de donnée DBTSS (Data base of Human Transcriptional Start Sites), est situé comme indiqué Figure 12B. b. Localisation prédictive du promoteur de FATP5 : Matériel et méthodes Préparation des ARN de cellules HepG2 : L'ARN est purifié à partir d'un million de cellules HepG2, selon protocole RNeasy mini kit Qiagen (Qiagen, Courtaboeuf, France) 5' RACE : Les TSS sont identifiés par le kit GeneRacer. Catalog n L1500-01; L1500- 02 ; L1502-01; L150202Version J05300225-0355 suivant les recommandations du fournisseur. Résultats : Une région de 10000 pb en amont du site d'initiation déterminé comme indiqué précédemment a été sélectionnée à partir du contig NT~011104. La région analysée s'arrête juste en amont de la région codante en position 10023, c'est-à-dire en amont de l'ATG. Les prédictions provenant de logiciels d'identification de régions promotrices putatives ont été réalisées. Ces logiciels - Promoterlnpector, FirstEF, etc. - utilisent chacun un modèle mathématique construit à partir des caractéristiques des promoteurs eucaryotiques Polll (signaux TATA, biais de composition en GC, organisation hiérarchique, etc. ). Des logiciels se caractérisant par des approches différentes (Analyse discriminante quadratique, chaîne de Markov, etc. ) et basés sur différentes caractéristiques permettent de renforcer les prédictions trouvées à la même position. Les résultats des prédictions les plus pertinentes sont résumées dans le tableau V ci-après. Logiciel Position TSS Position Autres prédits promoteurs résultats prédits Dragon 7654,7787, Promoter 8055,8443, 8944 NNPP 8370-8420, 8618-8668 Promoter2. 0 9100 7458-7708 Promoter Scan 7458-7708 TSSGITSSW 8939 TATA box 8911 Human Core 8947,8948, Promoter 8949, 8950 Finder CpG Ilôt CpG report/plot 7620-8056 Promoter 2021-2580 inspector First EF 7409-7978, 1er exon : llôt CpG 7577-8146 7909-8699 7685-7886 1er exon Ilôt CpG 8077-8149 7685-7886 Tableau V. Prédictions de promoteurs pour le gène FATP5 Ces prédictions permettent de localiser le promoteur du gène humain de FATP5 entre la région 7400 et 10000 bp, déterminée par les positions extrêmes identifiées par les différents logiciels (Figure 12A). La région promotrice devrait se trouver entre les bases 8500 et 10000, puisqu'un autre gène se termine en position 8500 et 10000 étant la position du codon ATG. En effet, la région en amont de la position 8500 bp correspond au gène NM 032792 dont la fonction est inconnue et la région en aval de la position 10 000 bp correspond au gène FATP5. Cette information est à mettre en parallèle avec les prédictions de promoteurs réalisées avec les logiciels bioinformatiques qui localisaient le promoteur entre la région 7400 et 9100 bp. Cette région située en amont de l'exon 1 du gène FATP5 humain est supposée contenir le promoteur putatif ou des éléments de régulation importants pour la régulation de ce gène. La région analysée avec les matrices de la banque de donnée Transfac (The Transcription Factor Database) et déclarée moyennement conservée s'étend des bornes 7400 à 10023. Les données biologiques du type EST et ARNm pleine longueur ont permis de situer le site d'initiation de la transcription (Transcription Start Site : TSS) à la position 9990. Ainsi, la séquence décrite à la Figure 13, correspond au promoteur putatif du gène humain de la FATP5. Cette séquence est identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. Un autre TSS que celui à la position 9990 a pu être identifié en position 9928. D'autres TSS pourraient encore pourraient être utilisés alternativement selon les types cellulaires . c. Analyse de la séquence promotrice du gène humain FATP5 par rapport à l'art antérieur du brevet W00121795 : Une série de recherche de similarité entre la séquence du promoteur putatif du gène humain de FATP 5, objet de l'invention, et les séquences contenues dans différentes banques de séquences accessibles telles que Htgs (séquences non-terminées), Chromosome (génome complet, chromosomes et contigs terminés) et enfin nr (ensemble des séquences publiées) a été réalisée. Une recherche de similarité entre l'environnement génomique du gène FATP5 humain (contig NT 011104) et la région promotrice publiée dans la demande internationale WO 01/21785 ne montre aucune similarité de séquence. La recherche de similarité contre la sous-division Chromosome de Genbank ne favorise pas l'émergence d'une similarité significative avec l'humain ou d'autres espèces référencées dans cette banque (levure, drosophile, etc. ). La recherche de similarité dans les séquences contenues dans la banque Htgs ne permet pas de caractériser un contig humain avec lequel la séquence promotrice de la demande internationale WO 01/21785 pourrait correspondre. Afin de confirmer que la séquence promotrice de la demande internationale WO 01/21785 ne montre aucune similarité avec l'environnement génomique du gène FATP5 humain, un alignement entre ces deux séquences a été réalisé. Aucune similarité significative n'est mise en évidence. L'analyse de la séquence promotrice du gène FATP5 publiée dans la demande internationale WO 01/21785 montre que cette séquence ne correspond pas au promoteur du gène FATP5 humain, objet de l'invention, mais correspond au promoteur du gène FATP5 murin. En conclusion, les différentes recherches effectuées permettent de conclure que la séquence du promoteur du gène FATP5 humain, objet de l'invention, ne présente aucune similarité significative avec une quelconque séquence connue. d) Confirmation de l'activité promotrice de la séquence en nucléotide objet de l'invention : Matériel et méthodes Amplification de la séquence promotrice putative de hFATP5 : Matrice : ADN génomique placenta humain (Sigma, St Louis MO) ; Oligo sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 3 : CGCTCGAGCTGTGAGCACCTGGATCAGTGCGTGCC ; Oligo anti-sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 4 : CCCAAGCTTGGTACCAGCTCCTCCCTAGG ; Taq platinum Pfx + tampon 10X + MgS04 (Invitrogen, Cergy-pontoise France) dNTP (Promega, Williamsburg, IA). Purification de l'insert correspondant au promoteur de hFATP5 : taille de l'insert 1573 bases. Programme d'amplification : 1 cycle d'incubation à 94 C pendant 5 minutes, puis 25 cycles d'incubation à 94 C pendant 30 secondes , à 55 C pendant 30 secondes, à 68 pendant 2 minutes. Le produit obtenu purifié à l'aide du QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Courtaboeuf France) est conservé à 4 C. Restrictions pour le clonage du promoteur du gène FATP5 humain dans le vecteur pGL3 qui contient le gène de la luciférase : R1 R2 pGL3 (Promega, Williamsburg, IA) 5 g Produit PCR purifié 41 l Tampon 2 10X (NEB, Beverly MA) cat#B7002S 5 l 5 l Xho 1 (NEB, Beverly MA) cat#R0146S 2 l 2 l Hind III (NEB, Beverly MA) cat#R0104S 2 l 2 l H20 36 l Incubation pendant 2h à 37 C. Ligation Selon protocole standard Quick ligation kit (NEB, Beverly MA) cat#M2200S. Transformation Selon le protocole standard du choc de température pendant 30", à 42 C Bactéries : DH5 alpha (Invitrogen, Cergy-pontoise France) Etalement sur boites contenant du LB agar (Invitrogen, Cergy-pontoise France), contenant de l'ampicilline à 50 g/ml. Incubation pendant une nuit à 37 C. Criblage : Chaque clone est repiqué sur du LB agar contenant de l'ampicilline à 50 g/ml et repris en suspension dans 20 L d'eau. La suspension est chauffée 10' à 95 C. Conditions PCR pour la sélection des clones pGl3/promoteur hFATP5 : Matrice : lysat bactérien Oligo sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 5 : TTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG Oligo anti-sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : : SEQ ID N 6 : TATGCAGTTGCTCTCCAGCGGTTCCATCTTCC Goldstar + Tampon 10X + MgCI2 (Eurogentec, Seraing Belgique) cat#ME- 0064- 50 g/ml : Programme d'amplification : 1 cycle d'incubation à 94 C pendant 5 minutes, puis 25 cycles d'incubation à 94 C pendant 30 secondes , à 55 C pendant 30 secondes, à 72 C pendant 2 minutes ; puis 1 cycle à 72 C pendant 7 minutes. Le produit obtenu est conservé à 4 C. production du plasmide Selon protocole standard EndoFree Plasmide Maxi kit (Qiagen, Courtaboeuf France , cat#12362). Séquençage: Selon protocole standard BigDye terminator V2. 0 cycle sequencing kit (Applied biosystems, Foster City, CA, cat#4314415). Résultats : Le fragment de 1573 bases du promoteur humain de la FATP5 a été cloné dans pGL3 et séquence. Des constructions par délétions successives du fragment permettront d'identifier la région promotrice spécifique de l'expression hépatique FATP5. Transfection transitoire des hépatocytes HEP2, HELA et HEK 293 : Les cellules transfectée de manière transitoire sont utilisées pour identifier le fragment du promoteur le plus petit possible pour le cribblage. La transfection au jet PEI (Polytransfection, lllkirch, France) selon les recommandations du fournisseur est utilisée. Au 3ème jour : Lecture au luminomètre : Le milieu contenant les mélange de transfection est éliminé. Les plaques sont rincée 2 fois avec 250 l de PBS et 100 l de tampon de lyse diluée au 1/Sème sont ajoutés. Les plaques sont incubées sous agitation pendant 30 min à température ambiante. 10 l de lysat de chaque puit sont répartis dans une plaque blanche Greiner 96 puits (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne). L'activité luciférase est mesurée par lecture à l'aide du Dual kit Luciférase (Promega, Madison, Wl, USA). La lecture se fait avec un luminomètre type TR 717 Microplate Luminometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les résultats de luminescence luciférase sont normalisés par rapport à la rénilla et exprimés en induction de la construction comportant le promoteur relative au vecteur vide pGL3. Résultats : L'activité promotrice du fragment entier du promoteur de FATP5 est confirmée. Ces résultats, présentés à la Figure 14 confirme que la séquence en acides nucléiques est bien le promoteur de FATP5 et qu'il est fonctionnel. Les valeurs les plus élevées d'activité luciférase sont observées dans les cellules hépatiques humaines HepG2. Exemple 3 : Test de criblage sur cellules exprimant stablement le promoteur FATP5 humain : a) Clonage du promoteur putatif du gène FATP5 humain dans le vecteur pGL3 hydromycine comportant la résistance hvgromvcine : Production du vecteur pGL3 hygromycine : Le gène codant pour l'hygromycine sous le contrôle du promoteur TK (taille 1671 bases) a été amplifié à partir du vecteur pREP4 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) à l'aide des amorces suivantes : Matériel et méthode : Oligo sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 7 : GAAGATCTCTGCTTCATCCCCGTGGC ; Oligo anti-sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 8 GAAGATCTACCAGACCCCACGCAACGC; Goldstar + tampon 10X + MgCI2 (Eurogentec, Seraing Belgique). Le programme d'amplification et la purification du produit obtenu sont réalisés selon des protocoles identiques à ceux utilisés précédemment pour l'amplification et la purification de l'insert correspondant au promoteur de hFATP5. Le fragment obtenu est cloné dans le vecteur pGL3 - basic (Promega, Williamsburg, IA), au niveau du site Bglll. La restriction pour le clonage, la ligation et la transformation sont réalisés selon des protocoles identiques à ceux utilisés précédemment pour l'amplification et la purification de l'insert correspondant au promoteur de hFATP5. La sélection des clones ayant intégré le plasmide pGl3 avec le fragment TK hygromycine est réalisée par PCR selon un protocole identique à celui utilisé pour la sélection des clones pGl3/promoteur hFATP5 en utilisant comme matrice un lysat bactérien et : Oligo sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 9 : CTGCTTCATCCCCGTGGC Oligo anti-sens (Invitrogen, Cergy-pontoise France) : SEQ ID N 10 ACCAGACCCCACGCAACGC Goldstar + tampon 10X + MgCI2 (Eurogentec, Seraing Belgique) La sélection des clones pGL3 hygromycine contenant le promoteur hFATP5 la production des plasmides et le séquençage sont réalisés selon des protocoles identiques à ceux utilisés pour la sélection des clones pGl3/promoteur hFATP5 b) Transfection stable des hépatocytes HepG2 : Les milieux utilisés sont décrits dans le tableau suivant. Milieux de culture Concentration Concentratio Fournisseur initiale n finale Dulbecco's Modified Gibco Eagle Medium High Glucose SVF (Sérum de veau 10% Gibco foetal) Inactivé à 56 C pendant 30' Pénicilline/Streptomycine 10 000 U/mL 0,125% Biochrom AG Sodium Pyruvate MEM 100 mM 1% Gibco PBS Dulbecco's sans Gibco Ca, Mg, Na-bicarbonate Trypsine-EDTA Gibco L Glutamine 200 m M 1% Gibco (1 OOX) c. Mise en plaque des cellules : Une culture de cellules HepG2 est réalisée. Les cellules sont dissociées lorsqu'elles atteignent 80% de confluence et réensemencées à raison de 320000 cellules par puits en plaque 6 puits dans le milieu de culture. Les cellules sont incubées 24h à 37 C, 5% C02. d. Transfection et activation : La transfection est réalisée selon le protocole jetPEI (Polytransfection, lllkirch, France) selon les recommandations du fournisseur, avec 500 ng du plasmide préparé en a. Le milieu des cellules cultivées en plaque 6 puits est aspiré. 1 ml de milieu DMEM sans sérum et 80 l de mélange de transfection sont déposés dans chacun des puits. Les cellules sont ainsi laissées 2 heures à 37 C sous atmosphère contenant 5% de C02. Au bout de ces deux heures, 1 ml de milieu de culture sans SVF est ajouté avec une concentration finale de 2% Ultroser SF (USF, BioSepra, Cergy Pontoise, France). e. Sélection des cellules transfectées : Le milieu de chaque puits est aspiré au bout de 48 heures de culture. 2 ml de milieu de culture contenant 10% de SVF et de l'hygromycine à la concentration finale de 0,2 mg/ml sont ajoutés. Les cellules sont dissociées lorsqu'elles atteignent 80 % de confluence. Les cellules de 2 puits sont alors mélangées et ensemencées en boîte de pétri 150 mm, dans le même milieu de sélection. La culture sélective est maintenue jusqu'à l'apparition de clones cellulaires f. Isolement des clones : Lorsque les clones sont bien individualisés, ils sont isolés du reste de la culture à l'aide de cylindres. Les cellules qu'ils contiennent sont alors rincées au PBS et sont prélevées après aspiration du milieu. Les cellules sont placées en plaque 96 puits et 250 l de milieu DMEM 10% SVF contenant de l'hygromycine à la concentration finale de 0,25 mg/ml. La culture est poursuivie jusqu'à 80 % de confluence. g. Criblage des cellules HepG2 exprimant de manière stable le promoteur FATP5 humain : Les clones sont amplifiés afin de préparer un stock. Les cellules issues de chaque clone sont cultivées jusqu'à 80% de confluence en plaque 24 puits en milieu DMEM 10% SVF contenant un mélange de penicilline/streptomycine (0,125%) et de l'hygromycine à 0,25 mg/ml. Les traitements avec les composés à tester sont appliqués pour une durée de 24 heures. Au bout de ces 24 heures, l'activité luciférase est mesurée au lecteur de luminescence Applied Biosystem TR717 (Californie, CA) sur le lysat cellulaire. Les cellules présentant une activité luciférase montrent que l'activité luciférase est induite par le promoteur putatif contenu dans le plasmide qu'elle ont reçu. Ce résultat démontre que l'acide nucléique de l'invention est bien un promoteur capable de diriger l'expression d'un gène placé sous sa dépendance. Exemple 4 : Réversion du phénotype diabétique et régulation de l'expression du gène FATP5 chez le rat ZDF par un sensibilisant à l'insuline : Les agonistes du récepteur nucléaire RXR, appelés rexinoïdes, sont des sensibilisant à l'insuline et ont des effets bénéfiques sur les modèles animaux obèses et diabétiques (diabète de type 2). Le bexarotène Targretine (CAS 1543559-49-0) active sélectivement les hétérodimères de récepteurs nucléaires : RXR-PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) ou RXR-LXR (Liver X Receptor). Des rats mâles diabétiques obèses (Zucker Diabetic Fatty rats (ZDF)) sont maintenus en animalerie en respectant le rythme jour/nuit avec accès libre à la nourriture et à l'eau. Le composé LGD 1069 est ajouté dans la nourriture à la dose de 0,3 ; 1,0 ; 3,0 ; 10 et 30 mg/kg/jour et administré pendant 50 jours à partir de l'âge de 7 semaines. 4 animaux sont nourris sans addition de LGD 1069 : ZDF et 2 ZLC. Les animaux sont mis à jeun et sacrifiés le lendemain. Les tissus sont collectés et congelés immédiatement dans l'azote liquide. Les ARNs de foie sont extraits suivant la technique classique dérivée de Chomsyski et Sacchi. L'analyse de l'expression est réalisée par Northern blot avec hybridation avec une sonde ADNc spécifique de FATP5 radioactive. Les résultats sont présentés à la Figure 15. La régulation négative de l'expression de FATP5 dans le foie des rats ZDF par rapport aux rats ZLC est contrecarrée par un traitement avec l'agoniste RXR qui inverse le développement du diabète. Exemple 5 : Test de mesure du transport actif des acides gras par l'intermédiaire le récepteur FATP5 en cellules eucaryotes (CHO : Chinese Hamster Ovary cells) : L'utilisation d'une molécule mimique d'acide gras marquée de façon fluorescente permet la mesure rapide en format de plaque de microtitration de l'accumulation intracellulaire d'acides gras dans des cellules sur-exprimant le récepteur FATP. Description du test : Réactifs Catalogue Fournisseur No. Milieu Dulbecco sans 11880-028 Gibco BRL rouge de Phénol Sérum bovin foetal dialysé 10110-161 Gibco BRL Glutamine B-3000D HyQ Mélange 3-3001-D HyQ Pénicilline/Streptomycine (10,000U/ml/10000ug/ml) Solution de dissociation C 5914 Sigma des cellules L-proline P-4655 Sigma Rouge de phénol P-5530 Sigma C1-Bodipy-C12 (sonde) Molecular probes Equipement spécialisé nécessaire : - Incubateur CO2; - Microscope ; - Multidrop ; - Laveur de microplaques ; - Fluorimètre pour microplaques avec filtres type Fluoresceine. Protocole : 1er jour : Distribution des cellules dans des microplaques à 96 puits : Les cellules eucaryotes CHO surexprimant le récepteur FATP sont répartis en plaques de culture au format 96 puits à une densité d'environ 10000 cellules par puits selon la procédure suivante : - Sous une hotte à flux de laminaire, on ajoute 4 ml de solution de dissociation de cellule à 37 C à un flacon de culture de 225 cm3. - On agiter à la main la solution d'un mouvement rotatif orbital sur la monocouche de cellules pendant 10-15 secondes, puis on aspire à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. - On ajoute 4 ml de solution de dissociation de cellule et on remet le flacon dans l'incubateur pour 10 min (au plus). Après 10 minutes, on vérifie le décollement des cellules au microscope. On poursuit l'opération jusqu'à décollement total des cellules. - On ajoute 8 ml de milieu au flacon et on mélange du haut vers le bas plusieurs fois pour rompre les blocs de cellules. On ajoute ce mélange de cellules à 88 ml de milieu préchauffé à 37 C. Préparation du multidrop : - On place le multidrop dans la hotte à flux laminaire. On nettoie la tête du multidrop et le tuyau par pompage de 20-30 ml d'éthanol 70 %, suivi par 20-30 ml d'eau stérile et enfin 20-30 ml de milieu. - On place le tuyau du multidrop dans le flacon contenant les cellules et on prélève approximativement 5-10 ml de milieu. On ajoute 100 l de cellules par puits (10000 cellules). - On place les microplaques dans l'incubateur à 37 C, 10% C02 pendant 48 heures. 2ème jour : Ajout des molécules à tester. L'ajout des molécules à tester se fera selon le plan de plaque suivant : CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T CN t t t t t t t t t t~ cn CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T T CN CP T T T T T T T T T T CN - A l'aide du multidrop, on distribue 95 l de DMEM (sans phénol rouge) dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, - On distribue simultanément les molécules à tester à la concentration finale de 5mg/ml (1 % de DMSO) dans les puits marqués T, - On distribue 200 mM d'acide laurique dans les puits contrôles négatifs (CN), - On distribue 5 l de PBS dans les puits marqués : Contrôle positif (CP). 3ème jour : - On lave les cellules deux fois avec PBS, - On incube les cellules pendant 2 minutes à 37 C dans la solution d'assimilation d'acide gras contenant 0,1 mM BODIPY-FA et 0,1% BSA sans acides gras dans du PBS, - Après 2 minutes, les cellules sont lavées quatre fois avec le mélange PBS/0,1 % BSA, préalablement placé dans la glace, - La lecture de la plaque se fait au lecteur de microplaques à fluorescence en utilisant 485 nm pour la longueur d'onde d'excitation et 530 nm pour l'émission. Les résultats seront exprimés en pourcentage du contrôle des cellules sans sonde (CP) exprimés en unités de fluorescence arbitraires. Ce tel test permet de mesurer le transport actif des acides gras par l'intermédiaire le récepteur FATP5 en cellules eucaryotes. Ce test permet également de mesurer l'effet d'une molécule donnée sur le transport actif des acides gras par l'intermédiaire le récepteur FATP5 et ainsi de déterminer les capacité stimulatrice ou inhibitrice de l'activité du promoteur du gène humain de FATP5. Revendications 1) Séquence en acides nucléiques, humaine, isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. 2) Séquence en acides nucléiques, humaine, isolée, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 1 dans la liste de séquences fournie en annexe. 3) Séquence en acides nucléiques selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code pour la protéine humaine FATP5. 4) Séquence en acides nucléiques selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence en nucléotides identifiée sous le numéro SEQ ID n 2 dans la liste de séquences fournie en annexe. 5) Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides nucléiques telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1. 7) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence en nucléotide codant pour une protéine détectable placé sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques de la revendication 1. 8) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine détectable est une protéine choisie parmi la FATP5 la protéine fluorescente verte ( Green Fluorescent Protéine ou GFP), la Renilla ou la luciférase. 9) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'il est un plasmide. 10) Cellule hôte, dans laquelle la séquence en acides nucléiques selon l'une quelconque des revendication 1 à 4, ou le vecteur selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, a été introduit. 11) Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule procaryote ou eucaryote. 12) Cellule procaryote selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie. 13) Méthode de production d'une protéine caractérisée en ce que l'on cultive une cellule hôte telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 10 à 12 dans des conditions permettant l'expression de la séquence en nucléotides ayant été introduite dans ladite cellule sous forme d'une protéine. 14) Utilisation de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, ou d'une cellule hôte telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 10 à 12, pour identifier un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1. 15) Procédé d'identification d'un produit capable de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1, caractérisé en ce que a) on met en contact, dans un milieu propice à l'expression d'une séquence en nucléotide, une séquence en acides nucléiques telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 2 à 4 ou un vecteur tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 5 à 9 ou une cellule hôte telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 10 à 12, avec un produit susceptible de moduler l'expression d'une séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1, b) on mesure le taux d'expression par tout moyen approprié, de ladite séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1. 16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire de comparaison du taux d'expression déterminé en b) par rapport au taux d'expression de ladite séquence en nucléotides, placée sous la dépendance de la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1, chez un témoin qui n'a pas été mis en contact avec le produit à identifier. 17) Méthode d'identification d'un produit susceptible d'interagir avec une séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1, caractérisée en ce que a) on met en contact une séquence en acides nucléiques telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un vecteur tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 5 à 9 ou une cellule hôte telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 10 à 12, avec un produit susceptible d'interagir avec la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1, b) on évalue l'interaction entre la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1 et le produit testé. 18) Méthode d'identification selon la revendication 17, destinée à identifie un produit capable de se fixer à la séquence en acides nucléiques telle que décrite dans la revendication 1.