Brevet FR2847590A1 — publié le 20040528

METHODE ET KIT POUR LE DOSAGE SPECIFIQUE DE RIBONUCLEOSIDES. La présente invention a pour objet un kit et une méthode de détection et de quantification spécifique de l'ARN ainsi que de ses monomères ribonucléosides. L'invention permet notamment de distinguer spécifiquement la présence de l'ARN par rapport à celle de l'ADN ainsi que des ribonucléosides des désoxyribonucléosides. Elle permet également de suivre l'incorporation de ribonucléosides utilisés pour la polymérisation de ces derniers. Enfin, l'invention peut servir à contrôler la dégradation de l'ARN en monomères. L'invention permet également de quantifier l'ARN ou les ribonucléosides de façon simple, précise et rapide. Les méthodes les plus communément utilisées pour quantifier les acides nucléiques impliquent la spectroscopie, soit d'absorption soit de fluorescence. En effet, les acides nucléiques possèdent des propriétés physico-chimiques utilisées pour leur quantification, comprenant l'absorption ultraviolet (UV), leur capacité d'intercaler ou de se lier avec une variété de colorants (marqueurs) et certaines réactions spécifiques aux sucres. La méthode utilisée en routine pour mesurer la concentration de l'ADN, de l'ARN ainsi que de leurs monomères, est basée sur la spectrophotométrie dans l'ultraviolet. En effet, les bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement dans l'ultraviolet à 260 nm [ The ultraviolet absorption spectra of desoxypentose nucleic acid Blout ER, Asadourian A (1954) 13 :161-170]. Ainsi, la quantité de la radiation ultraviolet absorbée à 260 nm est une indication de la concentration d'acides nucléiques présents dans l'échantillon. Les principaux inconvénients des méthodes basées sur l'absorption sont la large contribution des contaminants au signal (telles que les protéines), l' impossibilité de distinguer les ADNs des ARNs et de leurs monomères nucléosides ainsi que la faible sensibilité de la technique. L'utilisation d'intercalants fluorescents permet de résoudre certains de ces problèmes. En effet, l'ADN et l'ARN peuvent aussi être dosés avec plus de sensibilité et de spécificité par fluorimétrie après coloration par un produit spécifique. Ces fluorochromes se fixent sur les acides nucléiques et émettent une fluorescence proportionnelle à la quantité de l'ADN ou ARN présents. Une grande variété d'intercalants sont disponibles pour révéler la présence et quantifier l'ADN et l'ARN [Fluorometric assay using dimeric dyes for double- and single-stranded DNA and RNA with picogram sensitivity." A new fluorometric method for RNA and DNA détermination." Le Pecq JB, Paoletti C. Anal Biochem 17,100-107 (1966) PN28671 ; HS, Dabora JM, Quesada MA, Mathies RA, Glazer AN. Anal Biochem 208,144-150 (1993) ; US 5,658,751 ; US 5,436,134]. Cependant, ces marqueurs ne permettent pas la détection de mononucléosides, ni ne distinguent l'ARN de l'ADN. Parmi les fluorochromes, le RiboGreenTM a été développé pour quantifier spécifiquement l'ARN. Cependant, ce fluorochrome n'est pas sélectif des ARNs par rapport aux séquences ADN. Un pré-traitement de l'échantillon avec une ADNase peut en revanche permettre de supprimer partiellement la contribution de l'ADN vis-à-vis du signal. Parmi les réactions spécifiques des sucres, la méthode Bial pour les pentoses est utilisée. Le test utilise les réactifs orcinol, HC1 et FeCl3. L'orcinol forme un produit de coloration bleu après condensation avec le dérivé furfural généré par la déshydratation du pentose (Endo, Y. : A Simultaneous Estimation Method of DNA and RNA by the Orcinol Reaction and a Study on the Reaction Mechanism, J. Biochem., 67,629 (1970)). Cependant, ce test n'est pas spécifique des ARNs et est également utilisé pour quantifier l'ADN. La présente invention vise à offrir un kit et une méthode de détection et de quantification spécifique de l'ARN ainsi que de ses monomères ribonucléosides qui s'affranchit des différents problèmes techniques cités ci-dessus. Cette méthode utilise notamment une réaction connue qui consiste en la coupure du diol du (3-D-ribofurannose par le periodate. L'usage du periodate a été décrit par Leonetti et al. (1988) pour la préparation de 3'oligonucléotide conjugués via une fonction aldéhyde générée par oxydation du diol vicinal du ribose. Cependant, l'utilisation de cette réaction n'a jamais été décrite pour le dosage d'ARN ou de ribonucléosides. Il n'est pas évident pour l'homme du métier d'utiliser cette réaction pour doser l'ARN ou les ribonucléosides. En effet, la détection de l'ARN ou des ribonucléosides est réalisée par titrage en retour, consistant en le dosage du periodate n'ayant pas réagi avec l'ARN et/ou les ribonucléosides pour quantifier ces derniers. L'invention permet notamment de distinguer spécifiquement la présence de l'ARN par rapport à celle de l'ADN ainsi que des ribonucléosides des désoxyribonucléosides. Ce kit et cette méthode permettent également de suivre l'incorporation des ribonucléosides utilisés pour la polymérisation de ces derniers. Enfin, l'invention peut servir à contrôler la dégradation de l'ARN en monomères. Ainsi, l'invention peut servir par exemple à contrôler la qualité d'un échantillon d'ARN susceptible de se dégrader sous l'action d'ARNases. L'invention permet également de quantifier l'ARN ou les ribonucléosides de façon simple, précise et rapide. Ce but est atteint grâce : - d'une part, à une méthode de détection et de quantification de la présence de l'ARN et/ou des ribonucléosides dans un échantillon comprenant : la mise en contact de l'échantillon susceptible de contenir l'ARN et/ou des ribonucléosides avec un réactif (X) capable de réagir avec la fonction cis-diol en positions 2' et 3' du P-D-ribofurannose l'ajout d'un révélateur (R) capable d'interagir avec le réactif (X) la détection de la transformation du révélateur (R), - d'autre part, le kit pour la mise en #uvre de cette méthode de détection et de quantification de la présence de l'ARN et/ou des ribonucléosides, comprenant au moins : . un réactif (X) capable de réagir avec la fonction cis-diol en positions 2' et 3' du ss - D ribofurannose . un révélateur (R) capable d'interagir avec le réactif (X). L'échantillon contenant l'ARN ou les ribonucléosides peut provenir de différentes origines. Il peut être par exemple biologique, microbiologique, viral, animal, humain. Il peut provenir de tous types d'environnements et de prélèvements. Les définitions suivantes seront utilisées pour la description de l'invention : - L'ARN ou acide ribonucléique est un polymère constitué d'unités appelées nucléotides (monomères ou mononucléotides) qui sont reliées par des liaisons 3'-5' phosphodiester. L'ARN peut être synthétique ou naturel. Il peut correspondre à de l'ARN ribosomal, de transfert ou messager. - Un ribonucléoside résulte de la liaison d'une des quatre bases purines ou pyrimidines (Adenine (A), Guanine (G), Cytosine (C) et Uracil (U) ) avec le P-D-ribofurannose de formule ci-dessous. Le terme de ribonucléoside utilisé dans la présente invention englobe également les ribonucléosides-mono-, -di- et -triphosphate. Un ribonucléotide ou nucléosidemonophosphate est un ester phosphorique de ribonucléoside de formules suivantes : Ribonucléoside Ribonucléotide BASE base nucléique BASE f# (A, BASE (A, U, G, C) BASE HO O -O~'P~O O OH 0H OH OH 3-D-nbofurannose groupement (nbose) phosphate - Un ribonucléoside modifié correspond à toute modification au niveau du p-D-ribofurannose ou de la base nucléique. - Un ribonucléotide modifié correspond à toute modification au niveau du ss-D-ribofurannose, de la base nucléique ou du phosphate. - Interagir avec le réactif signifie réagir chimiquement ou se complexer avec le réactif. Dans le kit et la méthode de l'invention, le réactif (X) correspond à toute molécule capable de réagir avec un groupement chimique de type 1,2-diol et tout particulièrement avec la fonction cis-diol en positions 2' et 3' du (3-D-ribofurannose. Le réactif (X) est préférentiellement un oxydant chimique qui peut correspondre de manière avantageuse et de façon non limitative à un ou plusieurs des réactifs suivants H5IO6, RuO2, OsO4, (CH3CH2CH2)4N (RuO4), NaClO4, NaIO4, Na3H2IO6, NaMnO4, KZOs04, KI04, KMn04, KRu04, K2RuO4, LiOCl, l' acétate de plomb, le tétrapropyle ammonium periodate, l'acide chromique ou des sels de celui-ci, NaBiO3, Ph3BiCO3, Ca (OCl)2, les réactifs Ce(IV), Cr(VI), les sels de Co (II), IOAc, I(OAc)3, N-iodosuccinimide, VO(acac), MnO2, H2O2 ou le mélange des réactifs [H2O2, Na2WO4, H3P04] . Tout préférentiellement l'agent chimique oxydant est un sel de periodate. Dans le kit et la méthode de l'invention, le révélateur (R) est capable d'interagir avec le réactif (X) pour donner un composé détectable. Le composé détectable présente une variation de ses propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape de réaction avec le réactif (X), telles que notamment une variation de type spectral ou une variation de la solubilité. Ainsi, le composé détectable peut correspondre par exemple à un produit chromogène ou fluorescent. La transformation du révélateur (R) par ledit réactif (X) est détectable directement ou indirectement. La détection de la transformation du révélateur (R) par le réactif (X) peut correspondre par exemple à l'apparition d'un signal ou au contraire à l'extinction d'un signal. Le choix du révélateur (R) est effectué de manière à ce qu'un de ses groupements chimiques puisse interagir avec le réactif (X) n'ayant pas réagi avec le P-D-ribofurannose. Le dosage avec le révélateur (R) du réactif (X) n'ayant pas interagi permet de détecter le P-D-ribofurannose selon le schéma réactionnel 1 suivant : La quantité d'équivalents du révélateur (R) utilisée est avantageusement supérieure ou égale à la quantité d'équivalents de réactifs (X). Le révélateur (R) est choisi avantageusement parmi le 1,2-aminoalcool ou le 1,2diol et les catéchols de formules générales suivantes : 1,2-aminoalcool Catéchol 1,2 Catéchol 1,4 ou 1,2-diol Dans les formules ci-dessus : - Y1 et Y2 : identiques ou différents, sont choisis parmi 0, NH ; - R1, R2, R3, identiques ou différents, correspondent à un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non, un groupe fonctionnel substitué ou non ; R4 est un marqueur (nitrophenol, umbelliferone) - X est choisi parmi NO2, CHO, CO2H, CH2(OH)CH2NH2, etc Dans une forme de mise en #uvre particulière, le révélateur (R) correspond à un composé de formule (I) pouvant être détecté après avoir réagi avec le réactif (X). Selon un premier mode de mise en #uvre de révélation directe, le révélateur (R) répondant à la formule (I) est oxydé en présence du réactif (X), selon le schéma réactionnel suivant : oxydation HY, (Y2H chimique Y, Y2 R2 R3 en présence R1 Z2 R3 P4 du réactif X (1) réactif (II) (III) Les propriétés des produits de formules (II) et/ou (III) libérés peuvent alors être directement détectées. A titre d'exemples non limitatifs les propriétés des composés de formules (II) et/ou (III) correspondent avantageusement à une propriété physique, telle que la solubilité, une propriété physicochimique, telle qu'une propriété spectrale. Elles peuvent également correspondre à une propriété biologique, telle que l'activation d'une enzyme, une odeur, ou l'action d'une phéromone. Les composés de formules (II) ou (III) peuvent correspondre à des cétones aromatiques, par exemple une cétone beta-aromatique que l'on détecte par une variation spectrale, un aldéhyde comme le benzaldéhyde ou le citronellal que l'on détecte par l'odeur ou à une phéromone que l'on détecte par l'attraction d'insectes. (Suzuki et al., (1980), Agric.Biol.Chem. 44,2519 ; Millar et al. (1996), Bioorg. Med.Chem. 3,331-340). Selon un deuxième mode de révélation indirecte, au moins un des groupes R1 à R4 du composé de formule (I) répond à la formule (IV) suivante : dans laquelle : - R5, R6 et R7, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupe fonctionnel substitué ou non, et Z est un précurseur d'un produit détectable ZH ou Z-. Le révélateur (R) de formules (I), en présence du réactif, est oxydé pour libérer à titre d'exemple, les composés de formules (V) et (III). Le composé de formule (V) subit une réaction de beta- élimination avantageusement spontanée conduisant au produit détectable ZH, selon le schéma réactionnel suivant : oxydation HYi y2H chimique Y, R5 R6 Ri-)#(-R4 ###### -----R7 + (III) R2 R3 Ri H Z (I) B- (V) beta-elimination v Y, R5 Ri 7# Re R7 Cette réaction de beta-élimination, avantageusement spontanée, est réalisée préférentiellement en présence d'une base appelée Bqui peut correspondre à titre d'exemple à l'albumine de sérum bovin (BSA). Parmi les propriétés du composé ZH, on peut citer à titre d'exemples non limitatifs une propriété physique telle que la solubilité, une propriété physico-chimique telle qu'une propriété spectrale ou une propriété biologique telle que l'induction de croissance de bactéries. Le composé ZH est choisi parmi un alcool aromatique, un alcool hétéroaromatique, une amine hétéroaromatique, un halogénure, ou un ester phosphorique. A titre d'exemples non limitatifs peuvent être cités : la fluorescéine, la phénolphthaléine, le rouge de phénol, le para-nitrophénol, l'ortho- nitrophénol, le 2,4-dinitrophénol, l'acide 6hydroxynaphtoïque, l'acide 8-hydroxy-pyrène-1,3,6trisulfonique, la tyrosine, la luciférine, l'indoxyle, le 5-bromo-4-chloro-indoxyle, la quinoline, la nitroaniline, ou la pyridoxamine. Dans cette forme de mise en #uvre, le révélateur (R) est avantageusement choisi parmi : OH r(YN02 OH N02 HO 0 H2N O 4-(4-nitrophénoxy)-1,2-butanediol 4-(4-nitrophénoxy)-1-amino-2-hydroxybutane (diol-nitrophénol) (aminoalcool-nitrophénol) OH I \ \ OH I \ \ H00 / O O H2N/\/OO O 7-(3,4-dihydroxybutyloxy)-2H-1-benzopyran-2-one 7-(4-amino-3-méthyl-3-hydroxybutyloxy)-2H- (diol-coumarine) 1-benzopyran-2-one (aminoalcool-coumarine) OH \ \ OH \0 I / / 2-(6-méthoxy-2-naphthyl)-1,2-éthaned iol (métoxynaphthaldéhyde-diol) Dans un troisième mode de révélation, le révélateur répond à la formule I particulière suivante : Dans laquelle : - un des R1 à R2 et un des R3 à R4 ont la même signification que précédemment ; Les autres R1 ou R2 et R3 ou R4 interagissent. Dans ce cas, la coupure de la liaison C-C du révélateur de formule (I), mis en présence du réactif, provoque une variation spectrale détectable. Un exemple non limitatif d'interaction entre les R1 ou R2 et R3 ou R4 est un transfert d'énergie de type FRET (Fluorescent Résonance Energy Transfert). Dans une autre forme de mise en #uvre préférée de la détection directe, le révélateur (R) est choisi parmi : Dérivéscatéchols noradrénaline octopamine aesculetin 2,3-dihydroxynaphthalene Ce principe de détection de présence d'au moins un ribonucléoside (schéma 1) utilisant le periodate comme réactif (X) et l'adrénaline comme révélateur (R) est illustré sur le schéma ci-après. Comme le montre le schéma ci-dessus, dans le cas de la détection et/ou quantification d'un fragment d'ARN, seul le ribonucléoside à l'extrémité 3' du fragment d'ARN est détecté et/ou quantifié par la méthode de l'invention. Dans certains cas où l'un des hydroxyles en positions 2' et/ou 3' du ss - D - ribofurannose est substitué, la coupure oxidative du diol par le réactif (X) ne pourrait pas forcément avoir lieu. En revanche, dans le cas où l'un des hydroxyles en positions 2' ou 3' du P-D-ribofurannose est substitué avec un groupe amino, la coupure oxidative du diol par le réactif (X) aura lieu. Les catéchols (1,2-dihydroxybenzene) et (1,4-dihydroxybenzene) donnent de manière générale des réactions avec le periodate résultant en un changement de densité optique, et parfois en un changement de fluorescence. Parmi les catéchols, on peut citer l'adrénaline et la noradrénaline qui sont des révélateurs préférés de cette forme de mise en #uvre. Ils donnent une couleur rouge dans un temps extrêmement court en réagissant avec le periodate. Il n'est pas évident pour l'homme du métier que l'adrénaline puisse servir de révélateur quantitatif du periodate. En effet, les quinones, produits de l'oxidation, se décomposent au cours du temps pour former des polymères. De plus, cette révélation met en #uvre une double oxydation. Les exemples de la littérature (ElKommos et al.(1990). J. Assoc. Off. Anal. Chem., 73, 516-520) ne renseignent pas sur le fait que la deuxième oxydation est visiblement plus rapide que la première, ce qui permet une conversion de l'adrénaline en adrénochrome avec un seul équivalent de periodate dans un temps très court. De ce fait, il n'est absolument pas évident d'utiliser le couple (Réactif = periodate/ ARN et Révélateur = catéchol) pour détecter la présence d'au moins un ribonucléoside selon la méthode de l'invention. Dans une forme de mise en #uvre préférée de l'invention, l'échantillon contenant l'ARN à doser est préalablement traité par l'action d'une nucléase telle qu'une RNase (ribonucléase), nucléase P1 ou phosphodiestérase afin d'amplifier le signal obtenu. En effet, ces nucléases coupent les liaisons phosphodiesters à l'intérieur des chaînes d'ARN libérant ainsi des ribonucléotides possédant un diol non substitué en positions 2',3' qui seront ensuite dosés en utilisant la méthode de l'invention. Ainsi cette étape de traitement à la RNase ou phosphodiestérase permet d'augmenter fortement la sensibilité du dosage de l'ARN. Dans le cas où le traitement ribonucléasique conduit à la libération de tous les ribonucléotides d'un brin d'ARN, la sensibilité du dosage est multipliée par un facteur égal à la longueur du brin d'ARN. La méthode de l'invention trouve de nombreuses applications. Elle peut être utilisée pour la détection et la quantification d'ARN polymérisé à partir de ribonucléosides. Une telle application comprend les étapes suivants : a) la détection selon la méthode de l'invention de ribonucléosides ou d'ARN avant la réaction de polymérisation, puis b) la polymérisation de ribonucléosides ou d'ARN, c) la détection selon la méthode de l'invention des ARN obtenus après l'étape (b), d) La mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (c). Dans une deuxième application, la méthode de l'invention peut être utilisée pour la détection et la quantification d'ARN dégradé en ribonucléosides. Une telle application comprend les étapes suivants : a) la détection selon la méthode de l'invention de ribonucléosides ou d'ARN avant la réaction de dégradation de l'ARN, b) la dégradation de l'ARN, c) la détection selon la méthode de l'invention de ribonucléosides obtenus à l'étape (b), d) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (c). Dans une troisième application, la méthode de l'invention peut être utilisée pour la détection spécifique d'ARN. Par exemple elle peut être utilisée pour détecter la présence d'ARN viral tel que celui de HIV de façon directe ou indirecte. On peut par exemple hybrider l'ARN d'intérêt avec une sonde ADN complémentaire. On traite ensuite l'échantillon avec une enzyme spécifique telle qu'une RNaseH qui clive spécifiquement les hétéroduplexes ADN/ARN pour générer des ribonucléosides S'-monophosphates qui seront dosés en utilisant la méthode de la présente invention. Une telle application comprend les étapes suivants : a) la détection selon la méthode de l'invention d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon, b) l'hybridation de l'ARN d'intérêt avec une sonde ADN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplex ARN/ADN avec une enzyme spécifique telle qu'une RNaseH d) la détection selon la méthode de l'invention des ribonucléosides 5'-monophosphates libérés après l'étape (c), e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d) De la même manière, on peut détecter la présence d'ADN spécifique en utilisant une sonde ARN. Une telle application comprend les étapes suivants : a) la détection selon la méthode de l'invention d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon, b) une hybridation de l'ADN d'intérêt avec une sonde ARN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplex ARN/ADN avec une enzyme spécifique telle qu'une RnaseH, d) la détection des ribonucléosides 5'monophosphates libérés après l'étape (c), e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d). Dans le cas où le kit et la méthode sont utilisés pour doser de l'ARN, l'échantillon peut être préalablement filtré par exemple par filtration sur gel afin d'éliminer les ribonucléotides non incorporés. Dans le cas où l'échantillon à doser contient des contaminants, tampons ou réactifs pouvant interférer avec le réactif (X), ces derniers peuvent être éliminés par toutes techniques connues par l'homme du métier par exemple un dessalage ou par un calibrage du test. Dans le cas où l'invention est utilisée pour la quantification d'ARN ou de ribonucléosides, une gamme étalon est réalisée permettant l'obtention d'une relation entre le signal obtenu et la concentration de ribonucléosides présents dans l'échantillon. Dans certains cas, la concentration d'ARN ou de ribonucléosides contenue dans l'échantillon peut être avantageusement déterminée grâce à la détection d'un contrôle interne contenant une quantité d'ARN ou de ribonucléosides connue. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui sont donnés à titre non limitatif et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe où : - La figure 1 représente la quantification de l'ARN. - La figure 2 montre la spécificité du dosage vis-à-vis de l'ADN. - La figure 3 montre que la présence d'une grande concentration de protéines n'affecte pas le dosage de brins d'ARN. Exemple 1 : quantification de l'ARN. Des brins d'ARN purs, dans l'eau, sont quantifiés par dosage en retour de periodate, à différentes concentrations. Les brins d'ARN, à des concentrations comprises entre 0 et 200 ng/microl, sont mis en présence de 100 ng/microl de Nucléase P1 (Sigma. N- 8630) pendant 20 minutes à 37 C, puis de 0. 5 mM de periodate de sodium (Aldrich. 31,144-8) pendant 10 minutes à température ambiante ; 0. 75 mM d'adrénaline (Fluka. 02250) sont ensuite ajoutés, et après 5 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance est mesurée à 490 nm. Les valeurs obtenues, présentées figure 1, montrent que la réponse en densité optique est linéaire sur la fenêtre de concentration choisie. Exemple 2 spécificité par rapport à l'ADN. La spécificité du dosage vis-à-vis de l'ADN peut être démontrée par une expérience visant à obtenir la même réponse dynamique d'un dosage de brins d'ARN en présence ou non d'ADN (figure 2). Un dosage de brins d'ARN (de 0 à 200 ng/microl) est réalisé en présence ou non de brins d'ADN (100 ng/microl). La digestion par 100 ng/microl de nucléase P1 est réalisée à 37 C pendant 20 minutes. Le temps d'oxydation par 0,5 mM de NaI04 est de 10 minutes, la révélation en présence de 0,75 mM d'adrénaline de 5 minutes. L'absorbance est lue à 490 nm. On observe que la réponse du dosage à l'ARN n'est pratiquement pas influencée par la présence d'une grande concentration d'ADN. Exemple 3 Dosage en présence de protéines. Un essai de dosage d'ARN est réalisé en présence de protéines. Différentes concentrations d'ARN, comprises entre 0 et 200 ng/microl, sont mélangées à 1, 2,5 ou 5 mg/ml d'albumine de sérum bovin (Sigma. A-9647), puis soumises à la digestion par 100 ng/microl de nucléase P1 à 37 C pendant 20 minutes, puis à l'oxydation par 0. 5 mM de periodate de sodium pendant 10 minutes à température ambiante. L'adrénaline (0. 75 mM) est alors rajoutée, et l'absorbance à 490 nm mesurée après 5 minutes d'incubation supplémentaires à température ambiante. Les résultats, présentés sur la figure 3, montrent que la présence d'une grande concentration de protéines n'affecte pas le dosage de brins d'ARN par la méthode de l'invention, même si la couleur s'atténue légèrement avec la concentration en protéines. Références Bibliographiques - Brevet US 5,658,751, Yue S.T. et al. - Brevet US 5,436,134, Haugland R. P. et al. - The ultraviolet absorption spectra of desoxypentose nucleic acid. Blout ER, Asadourian A (1954) 13 :161-170. - A new fluorometric method for RNA and DNA détermination. Le Pecq JB, Paoletti C. Anal Biochem 17, 100-107 (1966). - Fluorometric assay using dimeric dyes for double- and single-stranded DNA and RNA with picogram sensitivity. Rye HS, Dabora JM, Quesada MA, Mathies RA, Glazer AN. Anal Biochem 208,144-150 (1993). - El-Kommos et al.(1990). J. Assoc. Off. Anal. Chem., 73,516-520. - Endo, Y.: A Simultaneous Estimation Method of DNA and RNA by the Orcinol Reaction and a Study on the Reaction Mechanism, J. Biochem. , 67,629 (1970). - Leonetti, J. P., Rayner, B., Lemaître, M., Gagnor, C., Mihaud, P.G., Imbach, J. L., and Lebleu, B. 1988, Antiviral activity of conjugates between poly(Llysine) and synthetic oligodeoxyribonucleotides. Gene 72,323-332). REVENDICATIONS 1) Un kit de détection et de quantification de la présence d'au moins un ribonucléoside comprenant au moins : - Un réactif (X) capable de couper la fonction cis-diol en positions 2' et 3' du ss - D ribofurannose, - Un révélateur (R) capable d'interagir avec le réactif (X). 2) Un kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le révélateur (R) correspond à un composé chromogène ou fluorescent. 3) Un kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le révélateur (R) est choisi parmi l'aminoalcool nitrophénol, l'aminoalcool coumarine, le diol nitrophénol, le diol coumarine et les catéchols. 4) Un kit selon la revendication 3, caractérisé en ce que le révélateur (R) est choisi dans le groupe comprenant l'adrénaline, la noradrénaline et l'octopamine. 5) Un kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le réactif (X) est un oxydant chimique. 6) Un kit selon la revendication 5, caractérisé en ce que le réactif (X) est un sel de periodate. 7) Un kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une nucléase. 8) Un kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que la nucléase est choisie parmi la nucléase P1, la RNase ou la phosphodiestérase. 9) Un kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une RnaseH. 10) Une méthode de détection et de quantification de la présence d'au moins un ribonucléoside ou d'ARN dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - la mise en contact de l'échantillon avec un réactif (X) capable de couper la fonction cis-diol en positions 2' et 3' du P-D-ribofurannose, l'ajout d'un révélateur (R) capable d'interagir avec le réactif (X), - la détection de la transformation du révélateur (R). 11) Une méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le révélateur (R) est choisi parmi l'aminoalcool nitrophénol, l'aminoalcool coumarine, le diol nitrophénol, le diol coumarine et les catéchols. 12) Une méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que le révélateur (R) est choisi dans le groupe comprenant l'adrénaline, la noradrénaline et l'octopamine 13) Une méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le réactif (X) est un oxydant chimique. 14) Une méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que le réactif (X) est un sel de periodate. 15) Une méthode de détection et de quantification de l'ARN selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisée en ce que, avant la mise en contact avec un réactif (X), l' échantillon contenant l'ARN est soumis à un pré-traitement avec une RNase ou une phosphodiestérase. 16) Méthode de détection et de quantification d'ARN polymérisé à partir de ribonucléosides, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection de ribonucléosides ou d'ARN par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, avant la réaction de polymérisation, b) la polymérisation de l'ARN c) la détection de L'ARN obtenu à l'étape (b) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, d) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (c). 17) Méthode de détection et quantification d'ARN dégradé en ribonucléosides, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection de ribonucléosides ou d'ARN par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, avant la réaction de dégradation de l'ARN, puis b) la réaction de dégradation, c) la détection de ribonucléosides obtenus à l'étape (b) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, d) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (c). 18) Méthode de détection spécifique d'un ARN d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, b) l'hybridation de l'ARN d'intérêt avec une sonde ADN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplexe ARN/ADN avec une enzyme capable de dégrader l'ARN dudit hétéroduplexe, d) la détection des ribonucléosides 5'monophosphates libérés après l'étape (c) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d). 19) Méthode de détection spécifique d'un ARN d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, b) l'hybridation de l'ARN d'intérêt avec une sonde ADN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplexe ARN/ADN avec une RnaseH, d) la détection des ribonucléosides 5'monophosphates libérés après l'étape (c) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d). 20) Méthode de détection spécifique d'un ADN d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, b) une hybridation de l'ADN d'intérêt avec une sonde ARN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplexe ARN/ADN avec une enzyme capable de dégrader l'ARN dudit hétéroduplexe, d) la détection des ribonucléosides 5'monophosphates libérés après l'étape (c) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d). 21) Méthode de détection spécifique d'un ADN d'intérêt dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détection d'ARN ou de ribonucléosides présents dans l'échantillon par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, b) une hybridation de l'ADN d'intérêt avec une sonde ARN complémentaire, c) le traitement de l'échantillon contenant l'hétéroduplexe ARN/ADN avec une RnaseH, d) la détection des ribonucléosides 5'monophosphates libérés après l'étape (c) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, e) la mesure de la variation des signaux obtenus aux étapes (a) et (d).