Brevet FR2848222A1 — publié le 20040611

La présente invention est relative à de nouveaux outils de détection de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae est l'agent causal du dépérissement bactérien de l'anthurium, maladie systémique sévère rencontrée dans la plupart des régions de culture de cette aracée. Les moyens de lutte contre cette bactériose sont très limités. Les stratégies actuelles consistent essentiellement en l'application de mesures prophylactiques (élimination des plants malades, désinfection des instruments de travail...) ainsi qu'en l'utilisation d'un matériel sain issu de la culture in vitro. Pour que ces mesures soient efficaces, il est nécessaire de disposer de méthodes permettant de détecter le plus rapidement possible une éventuelle contamination bactérienne aux différentes étapes de la production. Cependant, il n'en existe pas à l'heure actuelle. Les méthodes d'identification couramment utilisées sont basées sur l'isolement de la bactérie à partir du matériel végétal infecté et sa mise en culture sur un milieu approprié. L'isolement de la bactérie prend plusieurs jours, et l'identité de la bactérie doit ensuite être vérifiée par des tests bactériologiques et/ou sérologiques. Des tests utilisant un sérum polyclonal (BERTHIER-BAYLE et al., Plant Pathogenic Bacteria. Akademiai Kiado, Budapest, Hongrie, p.925-933, 1990) ou un anticorps monoclonal (LIPP et al, The American Phytopathological Society, p.677-681, 1992), et des test de pouvoir pathogène (inoculations sur plantes) ont ainsi été proposés. Les techniques sérologiques citées ne sont pas suffisamment sensibles pour la détection in planta, particulièrement dans le cas de matériel végétal asymptomatique. NORMAN et ALVAREZ (Plant Dis. 78 :954-958, 1994) ont développé une méthode sérologique ELISA pour laquelle il y une étape préalable d'enrichissement en bactérie cible. Cette méthode est sensible mais elle présente l'inconvénient d'être peu rapide (5 jours). De plus, la présence d'autres bactéries dans les échantillons peut dans certains cas diminuer la sensibilité du test. Des tests d'identification par amplification PCR de séquences spécifiques du microorganisme concerné ont été développés pour d'autres bactéries du genre Xanthomonas : Xanthomonas axonopodis pv. citri (HARTUNG et al., Phytopathology 86 :95-101, 1996 ), Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (OJEDA et VERDIER, Can. J. Plant Pathol. 22 :241- 247, 2000) , Xanthomonas oryzae pv. oryzae (ADACHI et OKU, J. Gen. Plant Pathol. 66 :303-309, 2000) ou encore Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var fuscans (TOTH et al., J. Appl. Microbiol. 85 :327-336, 1998). Toutefois, jusqu'à présent, aucun test de ce type n'était disponible pour Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. Les Inventeurs ont identifié une séquence d'ADN, conservée chez toutes les souches de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae pathogènes sur l'anthurium, quelle que soit leur origine géographique, et absente chez les plantes hôtes de cette bactérie, et également absente d'autres microorganismes génétiquement proches mais non pathogènes pour l'anthurium. Cette séquence constitue donc une séquencecible, dont la détection permet le diagnostic sélectif de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. Cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; elle est également représentée, sous forme double-brin, sur la Figure 1. En conséquence, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé susceptible d'être obtenu à partir de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ; b) tout fragment d'au moins 15 pb dudit polynucléotide ; c) tout polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides a) ou b) ; d) tout polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes avec l'un des polynucléotides a) b) ou c). Ceci englobe notamment des polynucléotides utilisables comme amorces d'amplification pour l'obtention d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, ou comme sondes d'acide nucléique pour la détection de ladite séquence. La présente invention englobe en particulier les couples d'amorces utilisables pour l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, ou d'un fragment d'au moins 100 pb, de préférence au moins 300 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 500 pb dudit polynucléotide. A titre d'exemples non-limitatifs de couples d'amorces conformes à l'invention, on citera notamment : - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides Al-1 (SEQ ID NO: 2) et Al-2, (SEQ ID NO: 3), qui permet l'amplification d'un fragment de 1570 pb de la séquence SEQ ID NO: 1 : - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides A2-1 (SEQ ID NO: 4) et A2-2, (SEQ ID NO: 5), qui permet l'amplification d'un fragment de 785 pb de la séquence SEQ ID NO: 1. La séquence et la position de ces couples d'amorces par rapport à la séquence SEQ ID NO:1 est représentée sur la Figure 1. La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules d'acide nucléique conformes à l'invention pour le dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. En particulier, la présente invention a pour objet un procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence d'ADN d'un échantillon biologique susceptible de contenir ladite bactérie avec au moins un polynucléotide conforme à l'invention, en conditions permettant une hybridation sélective entre ledit polynucléotide et la séquence cible SEQ ID NO: 1, si celle-ci est présente dans ledit ADN ; - la détection de ladite hybridation. La détection de l'hybridation peut s'effectuer par tous moyens connus en eux-mêmes de l'homme de l'art. Lorsque l'on utilise un polynucléotide conforme à l'invention, préalablement marqué à l'aide d'un marqueur approprié, en tant que sonde d'acide nucléique, l'hybridation de la séquence cible avec la sonde marquée est détectée directement. Lorsque l'on utilise deux polynucléotides, constituant un couple d'amorces conformes à l'invention, l'hybridation de la séquence cible avec ces amorces est détectée indirectement, par l'intermédiaire de la mise en #uvre d'une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, et détection du produit d'amplification. Dans ce cas, le procédé de dépistage conforme à l'invention comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase, comprenant : - la mise en présence de l'ADN à tester avec au moins un couple d'amorces conformes à l'invention ; - la détection du produit d'amplification. De manière particulièrement avantageuse, on peut mettre en #uvre une réaction d'amplification en chaîne par polymérase emboîtée (nested PCR). Dans ce cas, le procédé de dépistage conforme à l'invention comprend en outre une seconde étape d'amplification à l'aide d'un second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de la première étape. A titre d'exemple, la première étape du procédé conforme à ce mode de mise en #uvre peut être effectuée en utilisant le couple d'amorces constitué par les polynucléotides Al-1 (SEQ ID NO: 2) et Al-2, (SEQ ID NO: 3), et la deuxième étape en utilisant le couple d'amorces constitué par les polynucléotides A2-1 (SEQ ID NO: 4) et A2-2 (SEQ ID NO: 5). L'échantillon biologique utilisé peut être une culture de bactéries isolées à partir de la plante sur laquelle on souhaite opérer la détection. Toutefois, si l'on souhaite réaliser une détection précoce, notamment sur du matériel végétal asymptomatique, il est nécessaire de s'affranchir de la culture préalable du pathogène ; la présente invention permet d'effectuer la détection directement sur un échantillon de la plante potentiellement infectée. Dans ce cas, afin d'éviter une éventuelle inhibition de l'amplification, qui peut être provoquée par diverses substances végétales (notamment phénoliques) présentes en quantité importante chez l'anthurium et libérées au cours du broyage, il est préférable d'éliminer ces substances inhibitrices, afin d'assurer une amplification optimale. Les Inventeurs ont constaté que l'ajout de polyvinylpyrrolidone au broyat de matériel végétal, supprime cet effet inhibiteur et permet de détecter la bactérie avec un niveau de sensibilité égal à celui obtenu lorsque le test est réalisé sur la bactérie en culture pure. La polyvinylpyrrolidone est généralement ajoutée au broyat de matériel végétal à raison de 0,5 à 1,5 g, de préférence environ 1 g de polyvinylpyrrolidone, pour 1 g de matériel végétal (poids frais). L'ajout de polyvinylpyrrolidone s'effectue de préférence par ajout au broyat de matériel végétal d'un volume égal d'un tampon (par exemple du tampon phosphate à pH 7) comprenant de 2,5 à 7,5% (p/v) de polyvinylpyrrolidone La mise en #uvre de la présente invention permet de détecter la présence de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae aux différentes étapes de la filière de production. En outre, du fait que la séquence SEQ ID NO: 1 est présente dans des souches d'origine géographique diverses, il est possible d'évaluer de façon fiable l'état sanitaire du matériel végétal provenant de toutes les régions du monde touchées par la maladie. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en #uvre de la présente invention pour la détection de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. EXEMPLE 1 : DETECTION SPECIFIQUE DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. DIEFFENBACHIAE SUR LA BACTERIE EN CULTURE PURE. Les essais sont effectués sur des cultures pures de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. On prélève environ 1 l de culture à l'aide d'une anse calibrée à partir une colonie isolée de la bactérie que l'on suspend dans 1 ml d'eau ul-crapure. Après homogénéisation, la suspension est mise à bouillir pendant 1 min puis immédiatement refroidie sur de la glace. L'amplification par PCR est réalisée directement sur 1 (il de cette suspension. On ajoute 1 l de l'extrait à un mélange contenant les différents réactifs nécessaires à l'amplification (volume final 25 l) : du tampon Tris-HCl (20mM) -KCl (50mM) (pH 8, 4) , 1,1 mM MgCl2, 100 M de chaque dNTP, 0, 2 M de chaque amorce du couple SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:3, une unité de Taq polymérase. Les tubes contenant le mélange réactionnel sont ensuite placés dans un thermocycleur (GENEAMP PCR SYSTEM 9600, PERKIN-ELMER CORPORATION, Norwalk, USA) où vont se dérouler les cycles successifs de l'amplification : dénaturation initiale à 94 C pendant 4 min, - 35 cycles d'amplification comprenant chacun 3 phases : 94 C pendant 30s (dénaturation), 70 C pendant 30s (hybridation des amorces sur l'ADN) et 72 C pendant 2 min (polymérisation), extension à 72 C pendant 10 min. Les produits d'amplification sont soumis à électrophorèse en gel d'agarose et révélés par fluorescence après coloration au bromure d'éthidium. On observe un unique fragment d'ADN de 1570 pb sur le gel. Pour augmenter la sensibilité du test et donc détecter des concentrations en bactéries plus faibles, on effectue une deuxième étape d'amplification, à partir du produit de la première étape. Pour cette seconde étape, 1 l du produit d'amplification obtenu avec le couple d'amorces SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:3 est ajouté au même mélange réactionnel que précédemment (1,1 mM MgCl2, 100 M de chaque dNTP,une unité de Taq polymerase, en tampon Tris-HCl (20 mM) - KCl (50 mM) (pH 8,4), mais qui contient cette foisci 0,2 M de chaque amorce du couple SEQ ID NO:4/SEQ ID NO:5. Cette seconde amplification est réalisée dans le thermocycleur avec le programme suivant : - pré-dénaturation à 94 C pendant 4 min, - 20 cycles comprenant les trois phases : 94 C pendant 30s, 70 C pendant 30s, 72 C pendant 30s, - extension à 72 C pendant 5 min. Les produits d'amplification sont soumis à électrophorèse en gel d'agarose et visualisés sous UV après coloration au bromure d'éthidium. Pour les échantillons positifs, on détecte un fragment unique d'ADN d'une taille de 785 pb. Sensibilité du test : Afin d'évaluer la sensibilité de ce test, celuici est effectué sur différentes concentrations bactériennes, selon le protocole à deux étapes décrit ci-dessus. Les résultats sont illustrés par les Figures 2A et 2B. La sensibilité du test PCR a été déterminée pour différentes concentrations bactériennes après la première (figure 2A) et la seconde étape d'amplification (figure 2B) . La concentration des échantillons est indiquée sous chaque piste en bactéries/ml. La piste MW correspond aux marqueurs de taille moléculaire. Ces résultats montrent que la détection de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae est possible à partir d'une concentration de 106 bactéries/ml après le première étape d'amplification et à partir d'une concentration de 103 bactéries/ml après la seconde étape d'amplification. Spécificité du test : Le test a été effectué, selon le protocole à deux étapes décrit ci-dessus, sur des souches de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae de diverses provenances géographique. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Dans cette figure les pistes 1 et 20 correspondent aux marqueurs de taille moléculaire et la piste 19 au témoin négatif (eau) . Les pistes 2 à 18 correspondent à des souches de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae de diverses provenances géographiques : 2, Vénézuela ; 3 et 4, Hawaï ; 5 et 6, Martinique ; 7 et 8, Guadeloupe ; 9, USA ; 10 et 11, Porto Rico ; 12 et 13, Brésil ; 14 à 16, Réunion ; 17 et 18, Tahiti. Dans tous les cas, on observe la présence d'un fragment d'amplification unique de 785 pb. Le même test a été effectué sur d'autres espèces de Xanthomonas, ainsi que sur d'autres bactéries. La liste des bactéries testées est donnée dans le tableau I ci-après. Pour toutes ces bactéries, aucun fragment d'amplification n'a été détecté. Tableau # Xpv. mangiferaeindicae X. albilineans Pseudomonas putida X. hiacinthi X. vesicatoria Pseudomonas syringae pv. tomato X. bromi X. a. pv. axonopodis Clavibacter mich. Subsp. Mich. X. fragariae X. a. pv. phaseoli Acinetobacter sp. X. translucens pv. transluscens X. a.pv. citri Alcaligenes denitrificans X. campestris pv. campestris X. a. pv. vignicola Burkolderia cepacia X. arboricola pv. juglandis X. a. pv. begoniae Chryseomonas luteola X. oryzae pv. oryzae X. a. pv. manihotis Flavimonas oryzihabitans X. cucurbitae X a. pv. vasculorum Sphingomonas paucimobilis. X. vasicola pv. holcicola X. a. pv. cajani Citrobacter sp. X. cynarae X. a. pv. vesicatoria Enterobacter clocae X. sacchari X. sp. de l'oignon Pantoea spp2 X. cassavae Ralstonia picketii Pantoea spp3 X. melonis Burkholderia cepacia Proteus vulgaris X. pisi Ralstonia solanacearum biov. 3 Morganella morganii X. vesicatoria Ralstonia solanacearum biov. 2 Serratia maercescens X. codia Erwinia chrysanthemi Bacillus sp. X. theicola Pseudomonas fluorescens X. hortorum Pseudomonas cichorii EXEMPLE 2 : DETECTION DE XANTHOMONAS AXONOPODIS PV. DIEFFENBACHIAE SUR DES ECHANTILLONS VEGETAUX INFECTES Des fragments (environ 1 cm2) de feuilles de plants d'anthurium infectés par Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae sont dilacérés à l'aide d'un scalpel dans du tampon Tris (lOmM Tris-base, pH 7,2) à raison de 20 ml/g de poids frais. Après macération (10 mn), un volume égal de tampon PP (8,5 mM K2HPO4, 7,5 mM KH2PO4, pH 7,0, 5% polyvinylpyrrolidone (SIGMA) est ajouté au macérat. Chaque extrait est ensuite mis à bouillir pendant 1 min et refroidi aussitôt sur de la glace. L'extrait est alors prêt pour l'étape d'amplification par PCR. A titre de témoin, un extrait est préparé de la même manière à partir de fragments de feuilles prélevés sur un plant d'anthurium non-infecté. D'autre part, d'autres extraits sont préparés à partir de certains des plants infectés, en omettant le traitement par le tampon PP. L'amplification PCR est effectuée, selon le protocole en 2 étapes décrit ci-dessus, à partir de 2 l de chacun des extraits pour la première étape, et, pour la seconde étape, de 1 l de l'amplifiat issu de la première étape. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Dans cette figure la piste 18 correspond aux marqueurs de taille moléculaire et la piste 17 au témoin (plant non infecté). Les pistes 1 à 8 et 13 à 16 correspondent à des échantillons issus de plants infectés et traités avec le tampon PP, tandis que les échantillons 9 à 12 correspondent à des échantillons issus de plants infectés mais non traités avec le tampon PP. Ces résultats montrent que l'ajout du tampon PP lors du broyage du matériel végétal permet de détecter la bactérie in planta. Pour évaluer la sensibilité du test in planta, les expériences suivantes ont été effectuées : 1) Des dilutions successives d'une suspension de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae (de 109 à 10 bactéries/ml) sont réalisées. 100 l de chacune de ces dilutions sont ajoutés, soit à 900 l de tampon Tris, soit à un mélange de 450 l de broyat végétal obtenu comme décrit ci-dessus, à partir de feuilles non-infectées, et de 450 l de tampon PP. Pour chaque dilution, on réalise un témoin où le tampon PP est remplacé par 450 (.il de tampon Tris. Un test de détection par PCR est effectué selon le protocole en 2 étapes décrit ci-dessus. Pour les échantillons contenant les bactéries, le broyat végétal, et le tampon PP, on obtient des résultats identiques à ceux obtenus avec les échantillons ne comprenant que les bactéries et le tampon Tris. Dans les 2 cas on détecte la bactérie à partir d'une concentration de 103 bactéries/ml. Pour les échantillons témoin contenant les bactéries, le broyat végétal, et le tampon Tris, on n'observe pas d'amplification, quelle que soit la concentration en bactéries. 2) Des plants d'anthurium sont infectés artificiellement par Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. Des prélèvements sont faits tous les 2 jours sur ces plants, dès le deuxième jour suivant l'inoculation. Sur chaque échantillon on réalise un test de détection par PCR selon le protocole en 2 étapes indiqué ci-dessus, et parallèlement, un dénombrement bactérien. La comparaison des résultats du test PCR avec ceux du dénombrement bactérien montre que ce test permet de détecter Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae est détectée à des concentrations aussi faibles que 103 bactéries/ml. Le niveau de sensibilité du test in planta est donc équivalent à celui obtenu lorsque le test est réalisé sur la bactérie en culture pure. REVENDICATIONS 1) Polynucléotide isolé susceptible d'être obtenu à partir de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ; b) tout fragment d'au moins 15 pb dudit polynucléotide ; c) tout polynucléotide complémentaire de l'un des polynucléotides a) ou b) ; d) tout polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes avec l'un des polynucléotides a) b) ou c). 2) Couple d'amorces d'amplification utilisables pour l'amplification d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, ou d'un fragment d'au moins 100 pb dudit polynucléotide. 3) Couple d'amorces selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3 ; - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5. 4) Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 1, et/ou d'un couple d'amorces selon une quelconque des revendications 2 ou 3, pour la détection de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. 5) Procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en présence d'ADN d'un échantillon biologique susceptible de contenir ladite bactérie avec au moins un polynucléotide selon la revendication 1, en conditions permettant une hybridation sélective entre ledit polynucléotide et la séquence cible SEQ ID NO: 1 ou son complémentaire, si celle-ci est présente dans ledit ADN ; - la détection de ladite hybridation. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'amplification en chaîne par polymérase, comprenant : - la mise en présence de l'ADN à tester avec au moins un couple d'amorces selon une quelconque des revendications 2 ou 3, en conditions permettant l'amplification de la séquence cible SEQ ID NO: 1 ; - la détection du produit d'amplification. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une seconde étape d'amplification en chaîne par polymérase à l'aide d'un second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment interne du produit d'amplification de la première étape. 8) Procédé selon une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un broyat de matériel végétal obtenu à partir de la plante à tester. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout de polyvinylpyrrolidone audit broyat, préalablement à l'amplification en chaîne par polymérase.