Brevet FR2858234A1 — publié le 20050204

NOUVEL AGENT ANTI-ANGIOGÉNIQUE ET SON UTILISATION, NOTAMMENT DANS LE CADRE DU TRAITEMENT DES CANCERS La présente invention a pour objet un nouvel agent anti-angiogénique, ainsi que son utilisation, notamment dans le cadre du traitement des cancers. L'angiogenèse est un processus de croissance de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Trois phénomènes particuliers sont notamment à la base de ce processus : la prolifération, la migration et la différenciation (la tubulogenèse) des cellules endothéliales. L'angiogenèse est activée par certains facteurs de croissances, dits facteurs angiogéniques, tels que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, facteur de croissance endothélial vasculaire), le FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, facteur de croissance des fibroblastes 1) ou le FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, facteur de croissance des fibroblastes 2). En temps normal, l'angiogenèse est essentiellement restreinte au système reproducteur femelle et à la cicatrisation des plaies. Cependant, l'angiogenèse est également impliquée dans de nombreux cas pathologiques, tels que la rétinopathie diabétique, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, et les cancers. En effet, dans ce dernier cas il a été montré que la croissance tumorale était grandement favorisée par l'apparition au sein de ces tumeurs d'une néovascularisation résultant en particulier de la sécrétion par les tumeurs de facteurs angiogéniques. De nombreuses tentatives de traitements thérapeutiques basées sur l'utilisation de protéines anti-angiogéniques sont en cours. Parmi ces composés, l'un des plus prometteur est l'endostatine (O'Reilly et al., 1997), qui est actuellement en essais cliniques de phase I (Herbst et al., 2002). L'endostatine est une protéine de 20 kDa correspondant à un fragment du collagène XVIII. Le mécanisme d'action de l'endostatine reste inconnu. Certaines tentatives thérapeutiques reposent sur l'élucidation de mécanismes d'action connus. Ainsi les cellules endothéliales en prolifération expriment l'intégrine avb3 alors que les cellules endothéliales quiescentes ne l'expriment pas (Brooks, 1994). Cette observation a permis de mettre au point des inhibiteurs de cette molécule actuellement en cours d'essais cliniques. Parmi tous les acteurs moléculaires impliqués dans l'activation de l'angiogenèse, seul le VEGF a fait la preuve de son efficacité dans pratiquement tous les modèles expérimentaux de mesure d'activité de l'angiogenèse (Ortéga, 1999). De plus, au printemps 2003, il a été rendu public par la société Genentech que des anticorps anti- VEGF exerçaient une activité anti-tumorale chez les malades atteints de cancer du colon. Ainsi donc il est de toute première importance de rechercher des molécules naturelles pouvant se lier au VEGF et par là même d'exercer une activité anti-tumorale comparable à celle des anticorps anti-VEGF. Le gène nov, tout d'abord identifié dans des néphroblastomes aviaires (Joliot et al., 1992 ; Martinerie et Perbal, 1991), a été cloné chez l'homme (novH)(Martinerie et al., 1994), la souris (novM)(Snaith et al., 1996) et Xenopus laevis (Ying et Ling, 1996). La protéine NOV, codée par le gène nov, dont la fonction est à ce jour inconnue, appartient à la famille CCN (Bork, 1993) qui comprend les protéines suivantes : CYR61 (Lau et Nathans, 1985), CTGF (Bradham et al., 1991), ELM-1 ou WISP-1 (Pennica et al., 1998 ; et al., 1998), R-COP ou WISP-2 (Pennica et al., 1998 ; et al., 1999 ; 1999) et WISP-3 (Pennica et al., 1998). Ces protéines sont toutes constituées de quatre domaines distincts : une protéine se liant à un facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), un domaine de répétition facteur Willebrand de type C, un domaine de répétition thrombospondine de type 1 et un domaine COOH- terminal. Les protéines de la famille CCN régulent différents procédés cellulaires normaux comprenant la prolifération, l'adhésion, l'apoptose et la chimiotaxie. Elles sont également impliquées dans l'implantation, la formation squelettique, le développement embryonnaire et dans différentes maladies telles que la fibrose, la cicatrisation et les cancers (Chevalier et al., 1998). @ La protéine NOV humaine (NOVH) peut être détectée dans les tissus normaux (reins, muscles, cartilage, cerveau, poumons, ovaires, coeur et corticosurrénale) à différents niveaux (Joliot et al., 1992 ; Martinerie et al., 2001 ; Kocialkowski et al., 2001 ; Perbal et al., 1999) et son expression varie au cours du développement. A ce jour les fonctions exercées par la protéine NOV ne sont pas clairement établies. Il a été récemment proposé que NOV pourrait exercer une action proangiogénique (Lin, 2003) en permettant de se lier à certaines intégrines (avb3, a6bl et a5bl). De plus ces auteurs montrent que NOV exerce une activité proangiogénique dans le modèle de cornée de lapin. Cependant, il a été démontré que cet essai peut conduire à des résultats faussement positifs par relargage de facteurs angiogéniques synthétisés et stockés dans la cornée (Plouët, 1997). Ainsi la présente invention résulte de la mise en de l'activité anti-angiogénique de NOV du fait de sa liaison à VEGF. La présente invention a pour but de fournir un nouvel agent anti-angiogénique ainsi que son mécanisme d'action. La présente invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active : - - une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, - une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant : * soit pour la protéine NOV telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine NOV tel que défini ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine NOV telle que définie ci- dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine NOV telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, ou à la séquence SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO : 4, ou à la séquence SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, ou à la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, ou à la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, - un anticorps anti-idiotypique de la protéine NOV, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. La séquence SEQ ID NO : 2 correspond' à la protéine humaine NOV codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. La séquence SEQ ID NO : 4 correspond au fragment IGFBP (protéine se liant à un facteur de croissance analogue à l'insuline) de la protéine humaine NOV, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3. Ce fragment comprend 72 acides aminés et correspond au fragment de la protéine NOV allant du résidu 33 au résidu 104 de la séquence SEQ ID NO : 2. La séquence SEQ ID NO : 6 correspond au fragment VWC (domaine de répétition facteur Willebrand de type C) de la protéine humaine NOV, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5. Ce fragment comprend 67 acides aminés et correspond au fragment de la protéine NOV allant du résidu 108 au résidu 174 de la séquence SEQ ID NO : 2. La séquence SEQ ID NO : 8 correspond au fragment TSP-1 (domaine de répétition thrombospondine de type I) de la protéine humaine NOV, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7. Ce fragment comprend 45 acides aminés et correspond au fragment de la protéine NOV allant du résidu 206 au résidu 250 de la séquence SEQ ID NO : 2. @ La séquence SEQ ID NO : 10 correspond au fragment CT (domaine COOHterminal) de la protéine humaine NOV, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9. Ce fragment comprend 75 acides aminés et correspond au fragment de la protéine NOV allant du résidu 264 au résidu 338 de la séquence SEQ ID NO : 2. L'activité d'inhibition de l'angiogenèse est également désignée activité antiangiogénique. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la différenciation, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité. La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une blessure sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la différenciation (tubulogenèse) des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester. Parmi les modèles classiques de mesure d'angiogenèse, on peut citer les modèles par délivrance locale comme : - l'injection sous-cutanée de Matrigel (Becton Dickinson) imprégné du composé de l'invention (Inoki et al., 2002), ou - le dépôt sur la membrane chorio-allantoïdienne de poulet d'un implant contenant un composé de l'invention (Céleri er et al., 2002). Alternativement, le composé de l'invention peut être injecté par voie systémique (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée) à des animaux chez qui on a créé une maladie angiogénique expérimentale. Le composé de l'invention peut aussi être injecté directement dans une tumeur. Alternativement la protéine NOV ou les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention (décrits ci-après) peuvent être délivrés par une méthode de thérapie génique par voie locale ou systémique par toute méthode permettant l'expression de la protéine ou des fragments ou des anticorps antiidiotypiques selon l'invention (virus ou plasmide contenant la séquence de NOV). Alternativement la séquence de NOV ou des fragments ou des anticorps antiidiotypiques selon l'invention peut être insérée dans un plasmide qui est transfecté dans les cellules cancéreuses (ici la mesure consiste à mesurer l'évolution de tumeurs développées à partir de cellules cancéreuses transfectées par un plasmide contenant ou non la séquence de NOV ou d'un fragment). Tous ces procédés de mesure sont notamment décrits dans l'article de Jain et al. (1997). On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression voir la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention. Une composition pharmaceutique avantageuse selon l'invention contient, à titre de substance active, la protéine NOV ou le fragment TSP-1 susmentionné. Une composition avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce que l'activité d'inhibition de l'angiogenèse est mesurée selon le test de prolifération, de migration ou de différenciation, et en ce que cette activité d'inhibition correspond à un pourcentage d'inhibition compris de 20% à 100% de l'angiogenèse obtenue en présence du véhicule seul. Les tests de prolifération, de migration et de différenciation (angiogenèse in vitro) sont décrits plus loin dans la partie expérimentale. La présente invention concerne également une composition telle que définie cidessus, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la composition telle que définie ci-dessus est caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être administrée à raison d'environ 0,1à environ 20 mg/kg/jour. La présente invention concerne également une composition telle que définie cidessus caractérisée en ce qu'elle est administrée sous forme d'un gène, d'une protéine ou d'un peptide contenant la séquence de type TSP-1(SEQ ID NO : 8). Une composition avantageuse de l'invention est notamment administrée de préférence sous forme injectable. La présente invention concerne également l'utilisation : - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, - d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant : * soit pour la protéine NOV telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine NOV tel que défini ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine NOV telle que définie ci- dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine NOV telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, ou à la séquence SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO : 4, ou à la séquence SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, ou à la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, ou à la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, - d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine NOV, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, les angiosarcomes, en particulier la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi. L'expression "inhibition de la prolifération endothéliale" désigne toute substance capable de freiner la prolifération de cellules endothéliales selon le test décrit plus loin (partie expérimentale). La présente invention concerne également l'utilisation - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, - d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant : * soit pour la protéine NOV telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine NOV tel que défini ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine NOV telle que définie ci- dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine NOV telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, ou à la séquence SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO :4, ou à la séquence SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, ou à la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, ou à la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, - d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine NOV, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de l'activation endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : le rejet d'allogreffe et de xénogreffe, les acrocyanoses, les sclérodermies, ou dans le cadre de la préparation de greffons entre le prélèvement et la transplantation. L'expression "activation endothéliale" correspond à toute pathologie impliquant des cellules endothéliales soumises à une concentration accrue en VEGF par rapport à l'état non pathologique. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 correspond à la liaison de la forme iodée du VEGF165 sur la protéine NOV. La protéine NOV (4 g/ml) est immobilisée sur du plastique selon les conditions décrites dans la partie expérimentale, puis incubée avec du VEGF165 iodé (1 ng/puits) en absence (colonne PBS) ou présence de 2 g/ml de VEGF165 (colonne 0) ou de NOV (colonne NOV). Les résultats sont exprimés en cpm de VEGF165 iodé fixé par puits, après lavage. La Figure 2 correspond à la liaison de la forme iodée du VEGF189 sur la protéine NOV. La protéine NOV (4 u.g/ml) est immobilisée sur du plastique selon les conditions décrites dans la partie expérimentale, puis incubée avec du VEGF189 iodé (1 ng/puits) en absence (colonne PBS) ou présence de 2 g/ml de VEGF189 (colonne 0) ou de NOV (colonne NOV). Les résultats sont exprimés en cpm de VEGF189 iodé fixé par puits, après lavage. La Figure 3 correspond au test de migration des cellules. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne est représentée sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine NOV en g/ml. Les points représentés par des losanges correspondent aux cellules non incubées avec VEGF et les points représentés par des carrés correspondent aux cellules préalablement traitées avec du VEGF. La Figure 4 correspond au test de prolifération des cellules. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine NOV en g/ml et l'axe des ordonnées à la densité optique mesurée à 595 nm. Les points représentés par des losanges correspondent aux cellules qui n'ont pas été stimulées par le VEGF et les points représentés par des carrés correspondent aux cellules qui ont été stimulées par le VEGF. La Figure 5 correspond au test d'adhésion des cellules FBAE. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine NOV en g/ml et l'axe des ordonnées à la densité optique mesurée à 595 nm. Les points représentés par des losanges correspondent aux cellules non incubées avec VEGF et les points représentés par des carrés correspondent aux cellules préalablement traitées avec du VEGF. PARTIE EXPÉRIMENTALE Matériels : La molécule NOV est produite par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant l'ADNc correspondant (SEQ ID NO : l)(Thibout et al., 2003). Les isoformes de 165 et 189 acides aminés du VEGF sont produites par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant l'ADNc correspondant (Plouët et al., 1997). Des cellules endothéliales artérielles ombilicales humaines (HUAEC) ont été isolées à partir d'artères ombilicales perfusées avec du collagène (Sigma) pour digérer la membrane basale. Les cellules HUAEC ont été maintenues dans du SFM (Life Sciences) additionné de 20% de sérum de veau f#tal (SVF) inactivé par la chaleur. Les cultures souches ont reçu 1 ng/ml de VEGF chaque jour. Des cellules endothéliales d'aorte foetale bovine (FBAE) ont été isolées à partir d'aortes foetales obtenues auprès d'un abattoir local. Les cellules ont été maintenues dans du DMEM glutamax (Life Sciences) additionné de 10% de sérum de veau nouveau-né (NBCS) inactivé par la chaleur, 100 g/ml de pénicilline et 100 g/ml de streptomycine à 37 C dans 10% de C02 et 1 ng/ml de VEGF tous les 2 jours. Interaction directe entre VEGF et NOV Pour la liaison à la protéine NOV immobilisée, des plaques ELISA à 96 puits ont été recouvertes de 4 ug/ml de protéine NOV dans un tampon carbonate 0,05 M à pH 9,6 pendant la nuit à 4 C. Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués avec 5 mg/ml de BSA dans du tampon carbonate. Après avoir lavé deux fois les puits avec du PBS à pH 7,4, on a ajouté 1 ng de VEGF iodé à chaque puits en présence ou non de 2 g/ml de VEGF165 ou de NOV, dilués dans du PBS contenant 0,05 % de Tween 20,0,5% de BSA, 1 mM de MgCl2 et 1 mM de CaCl2. Les puits ont été lavés 3 fois avec un mélange PBS-Tween 20 0,1%-BSA 0,5% et les protéines liées ont été solubilisées dans du NaOH 0,2M. Les résultats de ces expériences sont représentés dans les figures 1 et 2. La Figure 1 montre que le VEGF165 iodé s'associe spécifiquement à NOV puisque l'addition de VEGF non radiomarqué (VEGF) inhibe cette liaison. De même, l'addition de NOV inhibe la liaison de VEGF165 radiomarqué à NOV. Tests de migration Des cellules FBAE sont inoculées dans des puits de 4 cm2 à haute densité (50 000 cellules/puits). Quand la monocouche est confluente, la prolifération est arrêtée par l'incubation, pendant une nuit, en présence de DMEM sans sérum. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, permettant de délimiter une surface libre de toute cellule. Les monocouches sont ensuite lavées 3 fois par du DMEM pour enlever les cellules non adhérentes. Une photographie est alors prise pour délimiter la surface avant toute migration cellulaire. Les puits sont ensuite incubés en DMEM seul ou en présence de 50 ng/ml de, VEGF en présence de concentrations variables de NOV. Après 24 h les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiées. Les photographies prises avant et après l'expérience sont alors superposées pour permettre le comptage des cellules ayant migré. Les résultats de ces tests sont indiqués dans la Figure 3. L'addition de NOV en l'absence de VEGF n'a pas d'effet sur la migration basale des cellules. En revanche, NOV inhibe l'activité du VEGF et 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 50-100 ng/ml de NOV. Tests de prolifération Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 1000 cellules FBAE par puits dans du DMEM additionné de 5% de NBCS. Les cellules ont été stimulées ou non avec 2 ng/ml de VEGF165 et différentes concentrations de NOV. Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés doucement avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de violet cristallisé (Kueng et al., 1989) : cellules ont été incubées dans 0,1% de violet cristallisé (Sigma) dilué dans 0,2 M de tampon borate à pH 9,5 pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant violet cristallisé incorporé a ensuite été solubilisé par 100 l de 10% d'acide acétique par puits. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées (voir Figure 4). Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits SD. La protéine NOV utilisée seule n'a pas d'effet significatif sur la prolifération basale (due au sérum seul). En revanche, la protéine NOV inhibe la prolifération induite par le VEGF sur un mode dépendant de la dose. 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 100-200 ng/ml de NOV. Tests d'adhésion cellulaire Des plaques ELISA à 96 puits (Nunc) ont été recouvertes de protéine VEGF165 selon le protocole décrit dans l'article de Hutchings et al. (2003), diluée dans du tampon carbonate 0,05 M à pH 9,6 pendant la nuit à 4 C. Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués pendant 1 heure à 37 C avec 5 mg/ml de BSA dans du tampon carbonate et lavés deux fois avec du DMEM avant les expériences. Les cellules ont été trypsinisées, lavées et remises en suspension dans 5 ml de DMEM avec 10% de SVF dans un tube de plastique non traité et incubées pendant 1 heure à 37 C avec 10% de CO2. Les cellules ont ensuite été concentrées par centrifugation et remises en suspension dans un mélange DMEM + 0,2% BSA sans sérum et la suspension cellulaire a été traitée pendant 20 minutes (37 C, 10% de CO2) avec la protéine NOV utilisée pour moduler l'adhésion. 40 000 cellules par puits ont été distribuées dans les puits dans un volume de 100 l de DMEM + 0,2% de BSA. Les cellules ont été laissées adhérer à 37 C sous 10% de C02 pendant le temps voulu. Les puits ont été lavés doucement trois fois avec du DMEM pour retirer les cellules non adhérentes et les cellules adhérentes ont été fixées avec 1% de glutaraldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al., 1989) : les cellules ont été incubées avec 0,1% de violet cristallisé (Sigma) dilué dans 0,2 M de tampon borate à pH 9,5 pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant cristal violet incorporé a ensuite été solubilisé par 100 l de 10% d'acide acétique par puits (voir Figure 5). Angiogenèse in vitro Quatre queues de rat ont été dépiautées et disséquées pour récupérer les faisceaux blancs qui sont constitués en majeure partie de collagène de type I. Le collagène est extrait de ces fibres dans 50 ml d'acide acétique 0,5 M froid et agités sur une nuit. Le liquide est ensuite centrifugé à 5000g pendant 40 minutes et le surnageant est récupéré. L'extraction est refaite une fois avec 20 ml d'acide acétique, les surnageants sont mélangés et puis dialysés contre 1 1 d'acide acétique 0,2 M. La concentration en collagène est ajustée à 3 mg/ml par pesée. La préparation des gels pour l'angiogenèse in vitro s'effectue sur de la glace pour conserver la solution de collagène sous forme liquide. Un ml de collagène (5 mg/ml) est mélangé à 0,5 ml de DMEM 10X (contenant une concentration 10X en antibiotiques et en glutamine), 0,9 ml de H20 stérile et 0,1 ml de bicarbonate de sodium 1M. Une fois le pH ajusté à 7,4, il est ajouté un volume égal de matrigel (Becton Dickinson). Le gel est coulé dans des puits de culture (2 mm d'épaisseur) et incubé à 37 C pour se solidifier. Les cellules sont rajoutées après 15 minutes (100 000 cellules/cm2) sur la surface du gel. Après 2 heures, les différents facteurs solubles sont ajoutés et les cellules sont observées et photographiées après 24 heures. Production d'anticorps anti-idiotypiques Dans un premier temps on prépare un anticorps neutralisant de NOV en injectant à un animal, notamment une souris, de la protéine NOV mélangée avec de l'adjuvant complet de Freund (1 volume par volume de protéine NOV). On choisira une quantité de NOV comprise entre 1 et 200 g/kg de poids corporel pour immuniser l'animal. La même opération est effectuée à 15 et 30 jours d'intervalle, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Au jour 40 une saignée est pratiquée, le sérum est séparé et les immunoglobulines sont purifiées par toute méthode de fractionnement habituelle, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie d'affinité pour la protéine A ou G. On mesure l'activité neutralisante des immunoglobulines par n'importe quel test décrit (liaison du VEGF iodé, prolifération, migration, adhésion cellulaire). Un lot d'immunoglobulines sera dit neutralisant quand il aura la capacité d'inhiber l'interaction de NOV avec le VEGF. Dans un deuxième temps on prépare des anticorps anti-idiotypiques de NOV en injectant à des souris par voie sous-cutanée 1-100 g de la préparation des immunoglobulines neutralisant l'activité de NOV précédemment décrites en association avec 100 l d'adjuvant, notamment de l'adjuvant complet de Freund (Sigma). L'injection est répétée 15,30 et 45 jours après. Cinquante-cinq jours après la première injection, on injecte à des souris 10 g du même anticorps par voie intrapéritonéale. Cinquante-huit jours après la première injection, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules AG8X 63 (Kearney et al., 1979), et incubés à raison de 100 000 cellules/puits. La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 l de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37 C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une période d'incubation de 4 minutes à 37 C, 4 ml sont ajoutés. La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT IX (50X : Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 M et Thymidine 0,8 mM) et distribuées à raison de 100 l par puits sur les macrophages. Après 5 jours, 100 l de milieu HAT sont ajoutés, et entre 8 et 14 jours le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer par ELISA les anticorps dirigés contre les anticorps ayant servi d'agent immunogène, c'est à dire les anticorps anti-NOV. On mesure alors l'activité des anticorps anti-idiotypiques par un test ELISA : Les fragments Fab des immunoglobulines anti NOV, préparés par toute technique conventionnelle, notamment une digestion à la papaïne, sont immobilisés sur des plaques de microtitration (0,1-20 ug/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps anti-idiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique. Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps anti-NOV sont alors clonés, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10jours. Après 15jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont- issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé comme précédemment par un ELISA sur Fab anti-NOV. A ce stade on peut sélectionner les clones producteurs d'anticorps et connaître leur spécificité. Une fois les clones identifiés, leur nature monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal. Un troisième clonage est alors effectué exactement dans les mêmes conditions pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux. Les anticorps anti-idiotypiques sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA sur VEGF immobilisé. Du VEGF est immobilisé (0,1-10 g/ml) dans du tampon carbonate comme précédemment et toutes les étapes de cet ELISA sont identiques à celles décrites dans l'ELISA sur Fab anti-NOV. Ce test permet de cribler parmi tous les anticorps anti-idiotypiques ceux qui miment les fonctions de la protéine NOV (SEQ ID NO : 2) ou des fragments de type TSP-1 (SEQ ID NO : 8), c'est-à-dire des anticorps reconnaissant le VEGF. RÉFÉRENCES - Bork P (1993) The modular architecture of a new family of growth regulators related to connective tissue growth factor. FEBS Lett. 327 : 125-130, - Bradham DM, Igarashi A, Potter RL, Grotendorst GR (1991) Connective tissue growth factor : cysteine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10. J Cell Biol. 114 :1285-1294, - Brigstock DR (1999) The connective tissue growth factor/cysteine-rich 61/ nephroblastoma overexpressed (CCN) family. Endocrine Rev. 20:189-206, - Brooks PC, Clark RA, Cheresh DA (1994) Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science, 264,569-71, - Celerier J, Cruz A, Lamande N, Gasc JM, Corvol P (2002) Angiotensinogen and its cleaved derivatives inhibit angiogenesis. Hypertension. 39 (2):224-8, - Chevalier G, Yeger H, Martinerie C, et al. (1998) nov H: Differential expression in developing kidney and in Wilms' tumors. Am JPathol. 152 :1563-1575, - Hashimoto Y, Shindo-Okada N, Tani M, et al. (1998) Expression of the Elm-1 gene, a novel gene of the CCN (CTGF, Cyr61/CeflO and nov) family, suppress in vivo growth and metastasis of K-1735 murine melanoma cells. JExp Med. 187 :289-296, - Herbst et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:3804-3814, - Hutchings H, Ortéga N, Plouët J (2003) Extracellular matrix bound vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell adhesion, migration and survival through integrin ligation. FASEB J. Apr 22 (Epub ahead of print) - Inoki I, Shiomi T, Hashimoto G, Enomoto H, Nakamura H, Makino K, Ikeda E, Takata S, Kobayashi K, Okada Y (2002) Connective tissue growth factor binds vascular endothelial growth factor (VEGF) and inhibits VEGF-induced angiogenesis. FASEB J. 16(2):219-21, - Jain RK, Schlenger K, Hockel M, Yuan F (1997) Quantitative angiogenesis assays : progress and problems. Nat Med. 3(11):1203-8, - Joliot V, Martinerie C, Dambrine G, et al. (1992) Proviral rearrangements and overexpression of a new cellular gene (nov) in myeloblastosis-associated virus type 1induced nephroblastomas. Mol Cell Biol. 12:10-21, - Kearney JF, Radbruch A, Liesegang B, Rajewsky K (1979) A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123,1548-50, - Kocialkowski SY, H. Kingdom, J. Perbal, B. Schofield, PN (2001) Expression of the human NOV gene in first trimester fetal tissues. Anat Embryol. 203:417-427, - Kumar S, Hand AT, Connor JR, et al. (1999) Identification and cloning of a Connective tissue growth factor-like cDNA from human osteoblasts encoding a novel regulator of osteoblast functions. JBiol Chem. 274:17123-17131, - Lau L, Nathans D (1985) Expression of a set of growth-regulated immediate early genes in BALB/c 3T3 cells : coordinateregulation with c-fos or c-myc. Proc Natl Acad Sei USA. 84 : 1182-1186, - Lin CJ, Leu S-J, Chen N, Tebeau CM, Lin S-X, Yeung C-H, Lau LJ, (2003) CCN3 (NOV) is a novel angiogenic regulator of the CCN protein family. J Biol. Chem., 278, 24200-24208, - Martinerie C, Gicquel C, Louvel A, Laurent M, Schofield P, LeBouc Y (2001) Altered expression of NovH is asociated with human adrenocortical tumorigenesis. JCEM. 86:3929-3940, - Martinerie C, Huff V, Joubert I, et al. (1994) Structural analysis of the human nov proto-oncogene and expression in Wilms tumor. Oncogene 9: 2729-2732, - Martinerie C, Perbal B (1991) Expression of a gene encoding a novel IGF binding protein in human tissues. C R Acad Sci Paris. 313 : 345-351, - O'Reilly et al. (1997) Cell 88 :277-285, - Ortéga N, Hutchings H, Plouët J (1999) Signal relays in the VEGF system. Front. Biosc., 4, D141-D152, , - Pennica D, Swanson TA, Welsh JW, et al. (1998) WISP genes are members of the connective tissue growth factor family that are up-regulated in human colon tumors. Proc Natl Acad Sci. 95:14717-14722, - Perbal B, Martinerie C, Sainson R, Werner M, He B, Roizman B (1999) The C-terminal domain of the regulatory protein NOVH is sufficient to promote interaction with fibulin 1 C: a clue for a role of NOVH in cell- adhesion signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 : 869-874, - Plouët J, Moro F, Coldeboeuf N, Bertagnolli S, Clamens S, Bayard F (1997) Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189 aa form by urokinae is required for its mitogenic activity. J. Biol. Chem., 272,13390-13396, - Snaith M, Natarajan D, Taylor L, et al. (1996) Genomic structure and chromosomal mapping of the mouse nov gene. Genomics. 38 : 425-428, - Thibout H, Martinerie C, Creminon C, Godeau F, Boudou P, Le Bouc Y, Laurent M (2003) Characterization of NOVH in biological fluids : enzyme immuno assay for the quantification of NOVH in sera from patients with diseases of the adrenal gland and of the nervous system. J Clin Endocrinol Metab. 88(1):327-336, - Ying Z, Ling ML (1996) Isolation and characterization of xnov, a Xenopus laevis ortholog of the chicken nov gene. Gene: 17 1:243-248, REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active : - une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO : 2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active la séquence SEQ ID NO : 8. 4. Utilisation : - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO:2 ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, les angiosarcomes, en particulier la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi. 5. Utilisation - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de l'activation endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : le rejet d'allogreffe et de xénogreffe, les acrocyanoses, les sclérodermies, ou dans le cadre de la préparation de greffons entre le prélèvement et la transplantation. 6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, pour la préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 3 destinée à être administrée à raison d'environ 0,1à environ 20 mg/kg/j our.