Brevet FR2858413A1 — publié le 20050204

L'invention concerne une méthode analytique d'identification de 1 'origine naturelle ou fossile de l'acide tartrique et de quantification de la proportion de mélange, mettant en oeuvre la détermination de l'isotope Carbone 14 par comptage en spectrométrie à scintillation liquide. Nous rappelons que l'acide tartrique L(+) d'origine naturelle se trouve dans de nombreux fruits sous forme libre ou sous forme de sels comme le tartrate de potassium. A partir de différents substrats d'origine fossile, l'industrie sait fabriquer par voie chimique et/ou enzymatique de l'acide tartrique de forme D(-) ou L(+). Certaines réglementations imposent l'usage pour quelques aliments de l'acide tartrique 10 d'origine naturelle. L'objet de la présente invention est de permettre l'identification de l'origine de l'acide tartrique, naturelle ou fossile. Les mélanges pouvant permettre des gains financiers par les utilisateurs de l'acide tartrique et donc favoriser la fraude, la méthode proposée permet d'identifier des mélanges pour 15 une proportion supérieure ou égale à 15%. L'Union Nationale des Groupements de Distillateurs d'Alcool (U.N.G.D.A.) dispose d'un spectromètre à scintillation liquide et d'un mode opératoire n MO 028 (ou MO 504.1.028) rédigé Jean Paul VIDAL qui permettent d'effectuer la datation des alcools et eaux-de-vie par référence à la courbe d'activité du carbone 14 établie par MARTINIERE pour les vins du Midi. 20 En ce qui concerne l'acide tartrique, il présente des teneurs en Carbone 14 en corrélation avec la teneur en Carbone 14 des vins correspondants produits. Des valeurs inférieures aux teneurs en Carbone 14 de l'année traduisent l'addition de tout ou partie d'acide tartrique d'origine fossile. La méthode proposée reprend les matériels et procédures de calibration du spectromètre à 25 scintillation liquide et du tracé de la courbe de masquage déterminée spécifiquement pour l'acide tartrique, conformément à la méthode employée pour la datation des alcools et eaux-de-vie selon le mode opératoire n MO 028 (ou MO 504.1.028). L'acide tartrique proposé à l'analyse étant sous forme cristalline, à la différence des alcools analysés, il a fallu préparer l'échantillon pour le solubiliser. Plusieurs essais de solubilisations, suivis d'analyses, ont été réalisés dans la fourchette de à 700 gramme d'acide tartrique pour 1000 cm3 de mélange. Les faibles concentrations ne donnent pas une sensibilité analytique suffisante et les fortes concentrations présentent des risques de recristallisation de l'acide tartrique en présence du liquide scintillant. A la suite de ces essais nous préconisons d'effectuer la solubilisation de l'acide tartrique, dépourvu d'impuretés, dans de l'eau à une concentration comprise entre 200 et 600 grammes pour 1000 cm3 de mélange. Plusieurs 1 iquides s cintillants o nt é té t estés p our é valuer 1 a p récision d e 1 a m éthode e t 5 donnent des résultats intéressants. Nous avons sélectionné deux produits: Insta-Gel Plus utilisé pour les alcools et Ultima Gold AB recommandé pour les solutions acides. La durée de comptage, après introduction de l'échantillon dans le spectromètre à scintillation liquide, doit être définie avec précision et égale pour tous les échantillons testés de manière comparative. Les résultats obtenus sont intéressants pour une fourchette de temps 10 comprise entre 180 et 500 minutes. La procédure que nous avons sélectionnée est la suivante: - préparation de l'échantillon, par solubilisation à l'eau de 400 grammes d'acide tartrique pour 1000 cm3 de mélange. - mélange de cette solution dans la proportion de 1 volume pour 1 volume, avec 15 le liquide scintillant Insta-Gel Plus. - mise en comptage pendant 500 minutes permet d'établir une précision de la méthode de 8%. Le tableau des résultats figure en Annexe 1. Selon cette procédure, la courbe de masquage a été déterminée spécifiquement pour 20 l'acide tartrique, afin de calculer le rendement de l'appareil, conformément à ce qui est fait pour la datation des alcools et eaux-de-vie. Cette courbe est spécifique à l'acide tartrique et sert de référence. Elle ressemble beaucoup à la courbe de masquage des alcools, les rendements sont équivalents et excellents. La courbe de masquage obtenue est présentée dans le détail de la procédure donnée ci25 après et Annexe 2. Avec la même procédure, décrite ci-dessus, nous avons établi des mélanges d'acide tartrique des deux origines (naturelle et fossile). Nous avons obtenu le tableau de résultats et la courbe qui figurent sur FIG 1 et qui montrent qu'il existe une relation linéaire entre le pourcentage d'acide tartrique naturel dans le mélange et les résultats de comptage par 30 scintillation liquide. Ces résultats montrent également que l'on peut déterminer une proportion de mélange supérieure ou égale à 15%. Cette méthode s'applique sans difficulté à l'expertise d'autres acides sous forme cristalline comme l'acide tartrique, l'acide lactique...etc. Nous détaillons, ci-après, la procédure analytique complète d'expertise des échantillons: a. Réactifs Eau Millipore fraîchement prélevée Acide tartrique L (+) - Farmitalia réf: 411125 lot 1E1999161M Acide tartrique D(-) - Aldrich réf: 48,379-6 lot MO06605PR Liquide scintillant, INSTA-GEL PLUS et ULTIMA GOLD AB de PACKARD Etalon toluène 14C dont l'activité est certifiée permettant le calcul de l'efficacité (rendement) dont la dilution utilisée pour établir la courbe de masquage et le rendement est raccordée par un laboratoire COFRAC d'étalonnage. Standards 14C, 3H et bruit de fond pour la calibration du compteur à scintillation Nitrométhane à 99 % (courbe de masquage) 15 b. Matériels Spectromètre à scintillation liquide avec ordinateur et imprimante Flacons pauvres en potassium (40K) munis de bouchons à vis, à faible bruit de fond et identiques Pipettes de 10 ml à 2 traits Burette à distribution automatique s'adaptant au pas de vis du flacon de liquide scintillant verrerie de laboratoire c. Calibration IPA (Instrument Performance Assay) Les 2 standards 14C, 3H dont les activités sont certifiées et celui permettant le comptage du bruit de fond, doivent être laissés (dans cet ordre) sur le portoir SNC (Self Normalization and Calibration) dans l'appareil. Toutes les 24 heures d'utilisation, une calibration automatique est faite. Les données recueillies (bruit de fond, tSIE ou transformed Spectral Index of the External standard) sont absolument nécessaires à la bonne utilisation de ce matériel. 30 L'utilisation d'un nouveau jeu de standards nécessite 5 acquisitions avant que toutes les données nécessaires soient recueillies. Cette opération est automatique et ne nécessite aucune intervention sauf la saisie des données relatives aux standards qui doivent être saisies. Cette opération attribue arbitrairement au paramètre tSIE une valeur de 1000 (ce paramètre est 35 utilisé ultérieurement par l'appareil). d. Courbe de Masquage Le calcul du rapport entre les CPM (coups par minute) déterminés par comptage et les DPM (désintégration par minute) effectives correspondant à la désintégration du 14C correspond au rendement de l'appareil. Pour ce faire, à partir d'une solution d'acide tartrique D (-) à 400 g/l, dont on a vérifié la valeur de l'activité C14 (qui doit être celle du bruit de fond), préparer une douzaine de flacons avec 10 ml de cette solution d'acide tartrique D (-), rajouter ensuite 0.1 ml d'une dilution de l'étalon 14C toluène ( il faut avoir environ 400-1000 dpm au total par flacon, cette dilution 10 doit être raccordée), secouer fortement puis ajouter, des concentrations croissantes de nitrométhane, par exemple pour 12 tubes: 0, 0, 0, 5, 10, 15, 20, 35, 50, 100, 200 et 400 gl puis 10 ml de liquide scintillant. Il faut qu'il y ait au moins 3 échantillons sans nitrométhane. Sur le portoir, positionner les flacons par teneur croissante en nitrométhane, la plus faible à gauche. Le comptage s'effectue pendant 60 minutes. L'efficacité (%eff) est calculée directement par le scintillateur, en tenant compte du masquage du au nitrométhane (voir Annexe 2). On calculera également une valeur moyenne obtenue (Rdtmoy) en faisant la moyenne des pourcentages d'efficacité (% Eff) des 3 échantillons sans nitrométhane utilisés pour la courbe 20 de masquage. e. Détermination du bruit de fond A partir la solution d'acide tartrique D (-), par exemple celui utilisé pour le calcul du rendement, analyser le bruit de fond avec le protocole prévu. Cette analyse doit être réalisée 25 immédiatement après la courbe de masquage puis environ tous les mois. f. Préparation de l'échantillon Dissoudre très exactement 20 g d'échantillon d'acide tartrique exempt d'impuretés dans 50 ml d'eau Millipore; Bien homogénéiser le mélange. 30 g. Comptage de l'échantillon Introduire à la pipette 10 ml de l'acide tartrique dissous dans l'eau dans le flacon; ajouter à la burette automatique 10 ml de liquide scintillant. Visser le bouchon et secouer fortement puis attendre 15 minutes avant de mettre en comptage 35 pendant 500 minutes. h. Résultats L'activité spécifique 14C de l'échantillon est donnée par la formule suivante. 5 activité en désintégrations/minutes et par gramme de carbone: A (Dpm/gC) A= [(Y - Y') x 100*3.125(')]/[Rdtmoyx m] avec Y: DPM (du flacon) de l'échantillon Y': DPM (du flacon) pour l'acide tartrique de synthèse utilisé en bruit de fond m masse d'acide t artrique dans 1 a prise d'essai de 1 0 m 1 de 1 a solution à 400 g/l soit 4 g d'acide il y a 3.125 grammes d'acide tartrique pour un gramme de carbone (rapport de la masse molaire de l'acide (152.03) sur la masse totale de carbone (soit 4 x 12 = 48). 15 i. Origine de l'acide tartrique L'acide tartrique de synthèse est obtenu à partir de l'industrie du pétrole donc fossile, dont l'activité du carbone 14 est négligeable. A partir de cette manipulation simple on peut confirmer de l'origine naturelle ou synthétique 20 de l'acide tartrique. REVENDICATIONS 1) Méthode Analytique d'identification de l'origine naturelle ou fossile de l'acide tartrique et de quantification de la proportion de mélange, mettant en oeuvre la détermination de l'isotope carbone 14 par comptage en scintillation liquide, caractérisée en ce qu'elle associe: a. l'utilisation de matériels, de procédures de calibration et de détermination du tracé de la courbe de masquage, employés pour la datation des alcools et eauxde-vie. b. un mode particulier de préparation d'un échantillon d'acide tartrique dépourvu d'impuretés par solubilisation dans de l'eau à une concentration utilement 10 comprise entre 200 et 600 grammes d'acide tartrique pour 1000 cm3 de mélange. 2) Méthode selon la Revendication 1, caractérisée en ce que divers liquides scintillants comme Insta-Gel Plus et Ultima Gold AB, normalement utilisés pour les alcools, sont employés. 3) Méthode s elon 1 a R evendication 1, c aractérisée en c e q ue 1 a d urée d e c omptage en scintillation liquide est comprise entre 180 et 500 minutes. 4) Méthode selon la Revendication 1, caractérisée en ce que la courbe de masquage a été obtenue spécifiquement pour l'acide tartrique. 5) Méthode selon les Revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la procédure: a. de préparation de l'échantillon, par solubilisation à l'eau de 400 gramme d'acide tartrique pour 1000 cm3 de mélange, b. de mélange volume à volume de la solution au liquide scintillant Insta-Gel, c. de mise en comptage en scintillation liquide pendant 500 minutes, permet une précision de mesure de 8%. 6) Méthode selon les Revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle permet d'identifier un mélange d'acide tartrique d'origine fossile, rajouté à de l'acide tartrique d'origine naturelle dans une proportion supérieure ou égale à 15% d'acide tartrique fossile dans le mélange et vice-versa. 7) Méthode selon les Revendication 1 à 3 applicable aux acides organiques cristallisés. 30