Brevet FR2849203A1 — publié le 20040625

METHODE D'ANALYSE DE L'AGRESSIVITE TUMORALE DE CELLULES CANCEREUSES COMPRENANT LA MESURE DE LA QUANTITE D'ACTINE POLYMERISEE A L'ETAT STATIONNAIRE. La présente invention a pour objet un test diagnostic ou prédictif dans le domaine du cancer Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une méthode basée sur la mesure directe de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans un lysat cellulaire 10 non purifié, comme indicateur à la fois de l'agressivité tumorale et de la sensibilité au traitement anti-tumoral. Selon une forme de mise en euvre préférée, la a méthode de l'invention est remarquable en ce que, à part l'extrait cellulaire et l'actine fluorescente, aucun ajout 15 supplémentaire protéique purifié n'est nécessaire pour mettre en évidence une discrimination à la fois entre des cellules sensibles ou résistantes et des cellules à potentiel agressif ou non. Le cytosquelette d'actine est une structure protéique essentielle à la survie cellulaire Il permet notamment à la cellule de maintenir sa forme et son adhésion, de migrer, de communiquer avec les cellules adjacentes Le cytosquelette est une structure extrêmement 25 dynamique, en perpétuel remaniement. Les propriétés dynamiques du cytosquelette permettent à la cellule de communiquer avec l'environnement extérieur et de migrer pour former des métastases par exemple Ces deux propriétés sont à l'origine de la 30 cohésion tissulaire. Les propriétés dynamiques du cytosquelette rendent son étude extrêmement difficile. Il a été décrit dans l'art antérieur plusieurs mécanismes de régulation de la polymérisation de l'actine, parmi lesquels on peut citer les mécanismes dépendant soit du complexe Arp 2/3, soit faisant intervenir la famille de protéines reliées à Ena/VASP. Ainsi, le complexe Arp 2/3, constitué d'au moins 5 sept sous-unités protéiques, est régulé par les membres de la famille de protéines du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) pour activer la nucléation des filaments d'actine en structures en Y (Machesky, Mullins et al 1999). Pour Ena/VASP, il s'agit de la famille des 10 protéines dont le prototype est la zyxine, parmi lesquelles on peut citer LPP (LIM-containing lipoma preferred partner), et TRIP 6 (thiroid receptor-interacing protein-6), caractérisées en ce qu'elles possèdent un domaine riche en proline suivi par trois domaines LIM Les protéines 15 appartenant à cette famille interagissent avec les protéines de la famille Ena/VASP parmi lesquelles on peut cite VASP (Vasodilator stimulated phosphoprotein), Ena (chez la drosophile), Mena (équivalent de la protéine Ena chez les mammifères) et Evl Bien que ces deux dernières 20 familles de protéines soient clairement impliquées dans la régulation de ce mécanisme de polymérisation de l'actine, la séquence d'événements responsables n'est pas complètement élucidée (Fradelizi, Noireaux et al 2001). Il semble qu'une même cellule puisse contenir 25 plusieurs systèmes de polymérisation de l'actine, chacun étant responsable d'un type particulier de structure d'actine. Les propriétés dynamiques du cytosquelette rendent son analyse extrêmement complexe, compte tenu des systèmes 30 protéiques différents intervenant dans les processus de régulation de la polymérisation et de la dépolymérisation de l'actine Si les propriétés d'adhésion et de résistance sont liées (Damiano, Hazlehurst et al 2001; dit Faute, Laurend et al 2002), les propriétés invasives des cellules cancéreuses diffèrent selon leur résistance aux traitements anti-cancéreux (Lopes, Ernst et al 2002) In vivo, les cellules résistantes semblent avoir un pouvoir invasif plus grand (Mitsumoto, Kamura et al 1998). Ainsi, l'étude d'un seul des deux mécanismes dans un système purifié in vitro peut être incomplet pour juger du potentiel cellulaire de polymérisation de l'actine d'un extrait d'une lignée cellulaire ou d'un prélèvement biologique. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont maintenant mis en évidence une nette corrélation entre d'une part la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire, et d'autre part 15 l'agressivité tumorale. La présente invention a donc pour but d'offrir une méthode simple et efficace de diagnostic ou de prédiction de l'agressivité tumorale et de la sensibilité au 20 traitement anti-cancéreux chez un sujet Ce but est atteint grâce à une méthode consistant à mesurer la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans un extrait cellulaire d'un prélèvement d'un sujet. Plus particulièrement, l'invention a pour objet une 25 méthode d'analyse de l'agressivité tumorale de cellules cancéreuses chez un sujet comprenant la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans un extrait cellulaire du sujet. Avantageusement, l'extrait cellulaire est un lysat 30 desdites cellules cancéreuses. On entend par agressivité tumorale le caractère invasif d'un cancer ou d'une lignée cellulaire cancéreuse, c'est-à-dire aussi bien le potentiel métastatique de ceuxci que la rapidité avec laquelle une tumeur primitive se développe et croît On entend également par agressivité tumorale, la tumorigénicité, c'est-à-dire la capacité d'une lignée cellulaire à entraîner plus ou moins efficacement l'apparition d'une tumeur après injection en sous cutanée 5 dans un modèle murin apte à recevoir cette lignée On entend aussi par agressivité tumorale l'absence de sensibilité au traitement anti-cancéreux. La mesure réalisée sur l'extrait cellulaire du 10 sujet est comparée à une ou plusieurs valeurs de référence spécifiques du tissu analysé dans le cas de prélèvements biologiques, ou spécifiques du phénotype, dans le cas de lignées cellulaires. La quantité d'actine polymérisée correspond à la somme de toute l'actine sous forme F Cette somme dépend de la quantité totale d'actine, quelle que soit sa forme, forme F ou forme G, mais surtout de l'ensemble des mécanismes de régulation de la polymérisation et de la 20 dépolymérisation. On entend par actine F les polymères plus ou moins longs d'actine globulaire (actine G) La formation d'actine F est un phénomène dynamique, très précisément régulé par plusieurs mécanismes différents L'actine F peut subir de 25 manière concomitante un phénomène de polymérisation d'actine globulaire à une extrémité du filament et un phénomène de dépolymérisation à l'autre extrémité. Un but de la présente invention est de s'affranchir 30 des différentes voies de régulation de la polymérisation de l'actine, en utilisant un système intégré. Ce but est atteint selon l'invention, grâce à la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire, laquelle prend en compte la résultante de tous les mécanismes de régulation de la polymérisation et de la dépolymérisation des filaments d'actine, et plus précisément, aussi bien les mécanismes de stimulation que les mécanismes d'inhibition de la polymérisation et de la 5 dépolymérisation L'état stationnaire résulte de l'équilibre entre tous ces mécanismes de régulation de la polymérisation de l'actine à une extrémité du filament d'actine et de la dépolymérisation à l'autre extrémité. De façon avantageuse, la mesure de l'actine 10 polymérisée à l'état stationnaire ne nécessite pas une mesure d'expression d'une protéine (par exemple la zyxine ou l'une des protéines du complexe Arp 2/3 ou l'une des protéines de la famille Ena/VASP) et ne nécessite pas d'étape de purification protéique ou l'ajout de réactifs 15 solides (par exemple des billes). La présente invention permet de mesurer la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire d'un extrait cellulaire non purifié, o toutes les voies d'activation/inhibition des processus de polymérisation et 20 dépolymérisation de l'actine sont intégrées. Ainsi, on entend par quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire, la quantité d'actine polymérisée lorsque l'équilibre entre la polymérisation de l'actine à une extrémité des filaments et la dépolymérisation à 25 l'autre extrémité est atteint Comme indiqué précédemment, l'état stationnaire est la résultante de toutes les voies de régulation de la polymérisation de l'actine. La mesure de la quantité d'actine à l'état stationnaire peut être réalisée par toute technique connue 30 de l'homme du métier, comme par exemple la technique de polarisation statique de fluorescence aussi appelée anisotropie statique de fluorescence. L'anisotropie et la polarisation sont deux valeurs reliées mathématiquement et donc facilement interchangeables Elles décrivent le même phénomène La polarisation de fluorescence permet d'étudier les interactions entre molécules en mesurant les changements de taille de molécules fluorescentes en solution Cette mesure 5 est corrélée à la taille de la molécule fluorescente ou du complexe moléculaire fluorescent En l'occurrence, la molécule fluorescente est un monomère d'actine (ou actine G) lié à un fluorochrome, en l'occurrence l'Alexa 488, qui est incorporé dans les filaments d'actine (actine F) au 10 cours de la polymérisation. Ainsi, selon une forme toute préférée de réalisation, la mesure de la quantité d'actine à l'état stationnaire de la méthode d'analyse de l'invention est réalisée par polarisation statique de fluorescence en 15 présence de monomères d'actine liés à un fluorochrome, lesquels sont incorporés dans les filaments d'actine (actine F) formés au cours de la polymérisation de l'actine endogène du lysat. Dans cette forme de réalisation, les monomères 20 d'actine liés à un fluorochrome sont ajoutés au lysat cellulaire dans un rapport compris entre 1/80 e et 1/1600 e par rapport à la quantité d'actine endogène. Le résultat du test est une valeur d'anisotropie de 25 fluorescence au plateau (" STAFI ") correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire et une constante apparente (Kobs) de polymérisation de l'actine résultant de l'incorporation progressive des monomères d'actine marquées au cours du temps jusqu'à atteindre 30 l'état stationnaire, c'est-à-dire le plateau de la courbe. Grâce au logiciel Graph Pad Prism version 3 (Graph Pad Software Inc), les données expérimentales permettent de générer une courbe ajustée à une équation d'ordre 1 telle que: Y = Am A max ( 1 e-Kt) o Y = la valeur d'anisotropie mesurée à un temps t Am A max = " STAFI ", la valeur d'ordonnée maximum à l'équilibre K = la constante K Obs t = le temps en secondes Pour prédire un niveau d'agressivité tumorale et de sensibilité à un traitement anti-cancéreux, ces deux 10 valeurs doivent être comparées à des valeurs de référence soit spécifiques du tissu analysé dans le cas de prélèvements biologiques, soit spécifiques du phénotype, dans le cas de lignées cellulaires. Un échantillon provenant d'un prélèvement de cancer 15 très agressif, c'est-à-dire présentant soit un caractère invasif soit un caractère tumorigène ou bien encore ayant perdu le caractère de sensibilité aux traitements anticancéreux, présentera un STAFI et un Kobs plus faibles que la valeur de référence, c'est-à-dire la valeur obtenue à 20 partir de prélèvements similaires peu ou pas agressifs. Par exemple, la valeur normale d'anisotropie de fluorescence au plateau (" STAFI " = delta m A max) d'une lignée peu invasive de mélanome (B 16 F 0) est 47 m A (K Dbs = 0,07) Une lignée dérivée de celle-ci, décrite par ailleurs 25 comme très invasive (B 16 F 10) (Nakamura, Yoshikawa et al. 2002), présente une valeur de STAFI de 37 m A (Kobs = 0,02), nettement inférieure à la valeur des B 16 F O Les valeurs de STAFI et de Kobs obtenues à partir de lysats de cellules invasives sont nettement inférieures aux valeurs de la 30 lignée de référence (figure 3). Un autre exemple est la comparaison de la valeur du STAFI de lignées tumorigènes avec la valeur obtenue à partir de lignées cellulaires parentales non tumorigènes prises comme référence La valeur du STAFI des lignées tumorigènes est nettement inférieure aux valeurs des lignées de référence non tumorigènes. Dans l'exemple des lignées dérivées de NIH 3 T 3, le STAFI de la lignée tumorigène (NIH 3 T 3 EF) est égal à 35 m A 5 comparé aux lignées de référence non tumorigènes (NIH 3 T 3 et NIH 3 T 3 EF zyxine) pour lesquelles le STAFI est égal à et 57 m A respectivement (figure 1). La lignée tumorigène BAF 3 bcr-abl et la lignée non tumorigène BAF 3 présentent des valeurs de STAFI de 40 m A et 10 58 m A respectivement La répression de l'expression de l'oncogène de fusion, responsable de la tumorigénicité de la lignée BAF 3 bcr-abl, induit la restauration de la valeur du STAFI à une valeur proche du STAFI de la lignée de référence soit 52 m A et 58 m A respectivement (figure 2). Un dernier exemple est la comparaison de la valeur de STAFI de lignées cellulaires de cancer du sein plus ou moins sensibles au traitement anticancéreux Les valeurs de STAFI des deux lignées résistantes (MCF 7MDR et MCF 7-dox) sont nettement inférieures à la valeur de la lignée 20 sensible (MCF 7) prise comme référence soit 35 m A et 52 m A versus 71 m A (figure 4). Un exemple préféré de mise en oeuvre de la méthode selon 1 ' invention comprend les étapes suivantes: la lyse des cellules cancéreuses dans des conditions non-dénaturantes pour les protéines et l'élimination des débris cellulaires, le dosage des protéines totales du lysat, l'ajout de monomères d'actine liés à un fluorochrome, l'ajout des substances nécessaires à la polymérisation de l'actine endogène et à la protection des protéines du lysat, la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans le lysat. La présente invention vise aussi à offrir une 5 méthode d'identification de molécules susceptibles de présenter une activité anticancéreuse Un telle méthode comprend la mise en oeuvre de la méthode d'analyse de l'agressivité tumorale décrite précédemment selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en présence d'une 10 quantité adéquate d'une ou plusieurs molécules à tester, et la détermination de la capacité de ladite molécule à restaurer une quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire correspondant à celle de cellules non agressives. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis l'identification de molécules capables de restaurer la valeur du STAFI de cellules agressives au niveau de celle de cellules non agressives Ces molécules sont susceptibles de présenter une activité anti20 cancéreuse. Par exemple, la Jasplakinolide, ajoutée dans le lysat de cellules agressives (NIH 3 T 3 EF) juste au moment du test, permet la restauration de la valeur du STAFI de ces cellules à une valeur proche de celle du STAFI de 25 cellules de référence non tumorigènes (NIH 3 T 3) (figure 5). Le tableau 1 ci-dessous rapporte la restauration de la valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire) de cellules tumorigènes (NIH 3 T 3 EF, notées EF) au niveau de la valeur 30 de cellules non tumorigènes (NIH 3 T 3)par l'ajout de la jasplakinolide (notée jaspla). Tableau 1 Lignées cellulaires Am A max NIH 3 T 3 EF 30 NIH 3 T 3 62 NIH 3 T 3 EF + Jasplakinolide 65 L'invention concerne encore l'application de la 5 méthode d'analyse de l'agressivité tumorale décrite précédemment à : l'évaluation du caractère invasif desdites cellules; l'évaluation de la tumorigénicité des cellules; 10 la prédiction de la sensibilité desdites cellules à un traitement anti-cancéreux; le traitement anti-cancéreux consiste par exemple en une radiothérapie ou une chimiothérapie. On entend par sensibilité au traitement anti15 cancéreux aussi bien l'absence de résistance aux médicaments dépendant du système MDR (multi drug resistance) liée aux mécanismes de pompes de la famille de protéines P-gp, que la capacité des cellules cancéreuses à entrer en apoptose Ces deux phénomènes peuvent être en 20 réponse à un traitement anti-cancéreux consistant en une radiothérapie ou une chimiothérapie. L'invention vise également un kit pour un test diagnostic ou prédictif de l'agressivité tumorale, et plus 25 spécialement pour la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire pour 1 ' évaluation de l'agressivité tumorale dans un prélèvement biologique. Un tel kit comprend: l 1 un milieu de re-suspension des cellules pour la lyse des cellules, les substances nécessaires à la polymérisation de l'actine endogène et à la protection des protéines du lysat, les monomères d'actine liés à un fluorochrome, un tampon de polymérisation de l'actine, un tampon général de l'actine, éventuellement des extraits de référence de 10 cellules agressives et non agressives. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe o : 15 La figure 1 illustre la mesure de la polymérisation de l'actine à l'état stationnaire (STAFI = delta m A max) dans des lignées cellulaires parentales adhérentes murines, non tumorigènes (NIH 3 T 3 et NIH 3 T 3 EF zyxine) et tumorigène (NIH 3 T 3 EF). La figure 2 illustre la mesure de la polymérisation de l'actine à l'état stationnaire (STAFI = delta m A max) dans des lignées cellulaires parentales non adhérentes (cellules hématopoétiques murines), non tumorales (BAF 3 et BAF 3 Bcr-Abl-) et tumorale (BAF 3 Bcr25 Abl+). La figure 3 illustre la mesure de la polymérisation de l'actine à l'état stationnaire (STAFI = delta m A max) dans des lignées cellulaires parentales de carcinome du sein, sensible (MCF 7) et résistantes (MCF 730 Doxorubicine et MCF 7-MDR). La figure 4 illustre la mesure de la polymérisation de l'actine à l'état stationnaire (STAFI = delta m A max) dans des lignées cellulaires parentales de mélanome, ayant un potentiel plus ou moins métastatique (B 16 FO La figure 5 illustre l'identification d'une molécule (la jasplakinolide) capable de restaurer la 5 quantité d'actine à l'état stationnaire (STAFI = delta m A max) d'une lignée tumorigène au niveau de la quantité d'une lignée non tumorigène. I Méthodes. La technique de polarisation de fluorescence aussi appelée anisotropie statique de fluorescence permet d'obtenir une valeur dépendant de la taille de la molécule fluorescente et du nombre de complexes moléculaires fluorescents C'est-à-dire qu'en ajoutant une faible 15 proportion d'actine monomèrique fluorescente dans un extrait cellulaire, ces monomères vont être incorporés dans le filament d'actine au cours de la polymérisation ce qui va entraîner une augmentation de la valeur d'anisotropie jusqu'à un plateau apparent, correspondant à l'équilibre 20 entre la polymérisation et la dépolymérisation des filaments d'actine contenant des monomères fluorescents Le niveau de ce plateau, appelé " STAFI ", reflète la quantité d'actine F à 1 ' état stationnaire, c'est-à- dire le potentiel adhésif de la cellule, et la vitesse d'obtention 25 du plateau dépend de la rapidité avec laquelle ces filaments se forment Ces deux paramètres sont des index de l'agressivité tumorale. Méthode de lyse des cellules: Pour les cellules en culture, les cellules peuvent devoir être trypsinées avant 30 d'être lavées (tampon de lavage: 135 m M Na Cl, 2 7 m M KC 1, 11.9 m M Na HCO 3 0 36 m M Na H 2 PO 4 2 m M Mg C 12 0 2 m M EGTA, 5 5 m M glucose, 0 3 % albumine, p H= 6,5) Les cellules sont mises en suspension dans un tampon de sonication ( 10 m M Tris-H Cl, p H 7,5, 10 m M EGTA et 2 m M Mg C 12 + inhibiteurs de protéases Roche) à raison de 50 106 cellules/ml puis soniquées sur glace, à raison de 10 runs de 10 secondes espacés de temps de pause de 30 secondes Le lysat est centrifugé 30 min à 8000 rpm à 4 C puis filtré sur 0 45 5 pm La concentration en protéines totales du lysat est mesurée par la méthode de Bradford pour être ajustée à 2 mg/ml avec du tampon de sonication 0,4 m M final d'ATP et de DTT sont ajoutés pour constituer le lysat cellulaire à tester. La solution de monomères d'actine liés à un fluorochrome est préparée de la manière suivante: la solution stock d'actine-Alexa 488 (Molecular Probes) ( 7,3 mg/ml) est diluée au 1:200 e dans du tampon G ( 5 m M Tris p H 8,1, 0,2 m M Ca C 12, 0,2 m M DTT, 0,2 m M ATP) supplémenté 15 par 10 % de sucrose puis ultracentrifugée à 35 000 rpm, 120 min, à 4 C afin d'éliminer d'éventuels filaments d'actine. Cette solution de monomères d'actine marqués est conservée à 80 C en aliquots. Au moment du test, la solution de monomères 20 d'actine marqués est diluée au 1/3 dans du tampon G. L'appareil utilisé est un Beacon 2000 Introduire dans un tube pour Beacon, 167 pl de tampon G et 3 pl de solution de monomères d'actine marqués préalablement dilué Après stabilisation de la valeur d'anisotropie des monomères 25 d'actine à environ 110 m A, ajouter 4 pl de tampon de polymérisation ( 2,5 M K Cl, 50 m M Mg C 12, 25 m M ATP) et 20 pl d'extrait cellulaire à tester à 2 mg/ml La valeur d'anisotropie de fluorescence est enregistrée pendant une période d'environ 200 secondes Les données sont traitées 30 avec le logiciel Graph Pad Prism version 3 0 (Ed Graph Pad Software) La valeur d'anisotropie de fluorescence des monomères d'actine marqués seuls (environ ll Om A) est retranchée des valeurs suivantes. L'ensemble des lignées cellulaires est cultivé à 37 C en atmosphère humide contenant 5 % de CO 2 Elles sont entretenues dans du milieu DMEM ou RPMI (Gibco) supplémenté par 10 % de sérum de veau nouveau-né ou de sérum de veau 5 fetal (Gibco) et d'antibiotiques (pénicilline à 100 UI/m L et streptomycine à 1001 ig/m L). La lignée NIH-3 T 3 est une ligné de fibroblastes murins non tumorigènes. La lignée NIH-3 T 3-EF est une lignée tumorale 10 dérivée de la précédente et contient un AD Nc codant pour l'oncogène de fusion EWS-FLI dans son génome L'expression de cette protéine est sélectionnée à l'aide de 2,5 ug/m L de puromycine. La lignée NIH-3 T 3-EF-zyxine est une lignée dérivée 15 de la précédente, qui a perdu son caractère tumorigène suite à la transformation par un AD Nc codant pour la protéine zyxine humaine L'expression de cette protéine est sélectionnée à l'aide de la généticine. La lignée BAF 3 est une lignée pré-lymphocytaire 20 murine Elle est entretenue en présence d'IL 3. La lignée BAF 3 Bcr-Abl est une lignée dérivée de la précédente, contenant un AD Nc codant pour l'oncogène de fusion Bcr-Abl, dont l'expression peut être réprimée par la doxicycline Lorsque cette lignée est cultivée en l'absence 25 de doxicycline et d'IL 3, l'oncogène est exprimé et elle est alors notée BAF 3 bcr-abl+ Lorsque cette lignée est cultivée en présence de doxicycline et d'IL 3, l'oncogène de fusion n'est plus exprimée et elle est notée BAF 3 bcr-abl_(Dugray, Geay et al 2001). La lignée B 16 F O est une lignée de mélanome murin ayant un faible potentiel métastatique (Nakamura, Yoshikawa et al 2002). La lignée B 16 F 10 est une lignée dérivée de la précédente, ayant acquis un fort potentiel métastatique à la suite de 10 sélections successives dans un modèle murin syngénique de métastases pulmonaires (Nakamura, Yoshikawa et al 2002). La lignée MCF 7 est une lignée de carcinome mammaire humain faiblement tumorigène. La lignée MCF 7-Dox est une lignée dérivée de la précédente, rendue résistante à la doxorubicine par ajout régulier de 10 Oi M de doxorubicine dans le milieu de culture. La lignée MCF 7-MDR est une lignée dérivée de la 10 lignée MCF 7, contenant un AD Nc codant pour la P-gp, responsable de la perte de la sensibilité à la chimiothérapie des cellules cancéreuses. II Résultats. 1) Corrélation entre la tumorigénicité de lignées cellulaires adhérentes de fibroblastes murins et les valeurs mesurées de STAFI et K b S. La figure 1 représente la détermination de la 20 valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire) dans trois lignées cellulaires parentales murines adhérentes, non tumorigènes (NIH 3 T 3 et NIH 3 T 3 EF zyxine) et tumorigènes (NIH 3 T 3 EF) Le tableau 2 ci-dessous rapporte la cinétique 25 de polymérisation de l'actine en présence d'extraits cellulaires par polarisation statique de fluorescence. Tableau 2 Lignées cellulaires Delta m A max Kobs NIH 3 T 3 65 0,086 NIH 3 T 3 EF 35 0,04 NIH 3 T 3 zyxine 57 0,033 La quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire (" STAFI " : valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau) de la lignée tumorigène (NIH 3 T 3 EF) est comparée à celle de la lignée parentale non 5 tumorigène (NIH 3 T 3)(figure 1) Le delta m A max (SATFI) de la lignée tumorigène (NIH 3 T 3 EF) est nettement inférieur au delta m A max de la lignée non tumorigène (NIH 3 T 3), soit et 65 respectivement. L'expression de la zyxine dans la lignée tumorigène 10 NIH 3 T 3 EF conduit à une importante diminution de la tumorigénicité de cette lignée (NIH 3 T 3 EF Zyxine) La diminution de la tumorigénicité de cette lignée est corrélée avec la restauration du delta m A max à une valeur proche de celle de la lignée de référence, en l'occurrence 15 la lignée NIH 3 T 3, soit 57 et 65 respectivement. 2) Corrélation entre la tumorigénicité de lignées cellulaires pré-lymphocytaires murines non adhérentes et les valeurs mesurées de STAFI et Kobs. La figure 2 représente la détermination de la valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire) dans différentes lignées cellulaires non adhérentes, non tumorigènes (BAF 3 parentales, BAF 3 Bcr-Abl) et tumorigène 25 (BAF 3 BcrAbl+) Le tableau 3 rapporte la cinétique de polymérisation de l'actine en présence d'extraits cellulaires par polarisation statique de fluorescence. Tableau 3 Lignées cellulaires Delta m A max Kobs BAF 3 parentales 58 0,12 BAF 3 Bcr-Abl' 40 0,05 Bcr-Abl 52 0,101 La quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire (" STAFI " : valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau, c'est-à-dire la valeur de delta m A maximum) de la lignée tumorigène BAF 3 Bcr-Abl+, transformée 5 par l'oncogène de fusion Bcr-Abl, est comparée à celle de la lignée parentale non tumorigène (BAF 3) (figure 2) (Dugray, Geay et al 2001) Pour la lignée tumorigène (BAF 3 Bcr- Abl+), le delta m A max est nettement inférieur au delta m A max de la lignée non tumorigéne (BAF 3), soit 40 et 58 10 respectivement. La même observation est faite pour la vitesse de polymérisation de l'actine, représentée par la constante Kobs Pour la lignée tumorigène (BAF 3 Bcr-Abl+), Kbs est nettement inférieur au Kobs de la lignée non tumorigène 15 (BAF 3), soit 0,05 et 0,12 respectivement. La répression de l'expression de l'oncogène de fusion par la doxicycline dans la lignée BAF 3 Bcr-Abl conduit à la perte de la tumorigénicité de cette lignée (Dugray, Geay et al 2001) La répression de l'expression 20 de l'oncogène restaure le delta m A max de cette lignée tumorigène à une valeur proche de celle de la lignée non tumorigène de référence, soit 52 et 58 respectivement. 3) Corrélation entre la sensibilité à un traitement 25 anti-cancéreux de lignées de carcinome mammaire humain et les valeurs mesurées de STAFI et K Obs La figure 3 représente la détermination de la valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'étatstationnaire) dans deux 30 lignées cellulaires de mélanomes parentales, ayant un potentiel plus ou moins métastatique (B 16 F O Tableau 4 Lignées cellulaires Delta m A max Kobs B 16 F O 47 0,071 B 16 F 10 37 0,028 La quantité d'actine polymérisée à l'état 5 stationnaire (" STAFI " : valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau, c'est-à-dire la valeur de delta m A maximum) de la lignée MCF 7-Dox, résistante à la doxorubicine, est comparée à celle de la lignée parentale sensible (MCF 7) (figure 3) Pour la lignée résistante 10 (MCF 7-Dox), le delta m A max est nettement inférieur au delta m A max de la lignée sensible (MCF 7), soit 52 m A et 71 m A respectivement. De plus, la valeur de delta m A max de la lignée résistante MCF 7-MDR, transfectées par le gène codant pour 15 la P-gp, est également comparée à la valeur de la lignée sensible (MCF 7) Pour la lignée résistante (MCF 7MDR), la delta m A max est également très nettement inférieur au delta m A max de la lignée sensible (MCF 7), soit 35 et 71 respectivement. 4) Corrélation entre le potentiel métastatique de lignées cellulaires de mélanome murin (B 16 F O et B 16 F 10) et les valeurs mesurées de STAFI et Kob S La figure 4 représente la détermination de la 25 valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire) dans différentes lignées cellulaires adhérentes, sensibles (MCF 7) et résistantes (MCF 7 Dox et MCF 7 MDR) à un traitement anticancéreux Le tableau 5 ci-dessous rapporte 30 la cinétique de polymérisation de l'actine en présence d'extraits cellulaires par polarisation statique de fluorescence. Tableau 5 Lignées cellulaires Delta m A max Kobs MCF 7 71 0,0034 MCF 7-Doxorubicine 52 0,0034 MCF 7 MDR 35 0,071 La quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire (" STAFI " : valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau, c'est-à-dire la valeur de delta m A 10 maximum) de la lignée B 16 F 10, sélectionnée pour son potentiel métastatique à partir de la lignée B 16 F O (Nakamura, Yoshikawa et al 2002), est comparée à celle de la lignée parentale moins métastatique (B 16 FO 0) (figure 4). Pour la lignée la plus agressive (B 16 F 10), le delta m A max 15 est nettement inférieur au delta m A max de la lignée non tumorigène (B 16 F 0), soit 37 et 47 respectivement. La même observation est faite pour la vitesse de polymérisation de l'actine, représentée par la constante Kob, Pour la lignée la plus agressive (B 16 F 10), Kobs est 20 nettement inférieur au Kobs de la lignée la moins agressive (B 16 F 0), soit 0,028 et 0,071 respectivement. 5) Identification de la jasplakinolide comme molécule restaurant le potentiel de polymérisation de 25 l'actine à l'état stationnaire. La figure 5 représente la restauration de la valeur de delta m A max (STAFI, correspondant à la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire) de cellules tumorigènes (NIH 3 T 3 EF, notées EF) au niveau de la valeur de cellules non tumorigènes (NIH 3 T 3)par l'ajout de la jasplakinolide (notée jaspla) La quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire (" STAFI " : valeur d'anisotropie de 5 fluorescence au plateau, c'est-à-dire la valeur de delta m A maximum) de cellules tumorigènes (NIH 3 T 3 EF, notée EF) a été mesurée après ajout de 10 p M de jasplakinolide dans le milieu de polymérisation Le delta m A max des cellules tumorales déterminé à une valeur initiale de 35 m A est 10 restauré par l'ajout de jasplakinolide à une valeur proche de celle de la lignée non tumorigène (NIH 3 T 3), 66 m A et 65 m A respectivement. La même observation est faite pour la vitesse de polymérisation de l'actine, représentée par la constante. 15 La jasplakinolide restaure le K Obs d'une valeur égale à 0,04 vers une valeur qui est proche de la valeur obtenue avec les cellules non tumorigènes, soit 0,15 et 0,086 respectivement. REF RENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) Damiano, J S, L A Hazlehurst, et al ( 2001). "I Cell adhesion-mediated drug resistance (CAM-DR) protects 5 the K 562 chronic myelogenous leukemia cell line from apoptosis induced by BCR/ABL inhibition, cytotoxic drugs, and gamma- irradiation " Leukemia 15 ( 8): 1232-9. 2) dit Faute, M A, L Laurent, et al ( 2002). "Distinctive alterations of invasiveness, drug resistance 10 and cellcell organization in 3 D-cultures of MCF-7, a human breast cancer cell line, and its multidrug resistant variant " Clin Exp Metastasis 19 ( 2): 161-8. 3) Dugray, A, J F, Geay, et al ( 2001) "Rapid generation of a tetracycline-inducible BCR-ABL defective 15 retrovirus using a single autoregulatory retroviral cassette " Leukemia 15: 1658-62. 4) Fradelizi, J, V Noireaux, et al ( 2001) "Act A and human zyxin harbour Arp 2/3-independent actinpolymerization activity " Nat Cell Biol 3 ( 8): 699-707. 5) Lopes, E C, G Ernst, et al ( 2002). "Dissimilar invasive and metastatic behavior of vincristine and doxorubicin-resistant cell lines derived from a murine T cell lymphoid leukemia " Clin Exp Metastasis 19 ( 4): 28390. 6) Machesky, L M, R D Mullins, et al ( 1999). "Scar, a WA Sp-related protein, activates nucleation of actin filaments by the Arp 2/3 complex " Proc Natl Acad Sci U S A 96 ( 7): 3739-44. 7) Mitsumoto, M, T Kamura, et al ( 1998). 30 "Emergence of higher levels of invasive and metastatic properties in the drug resistant cancer cell lines after the repeated administration of cisplatin in tumor-bearing mice " J Cancer Res Clin Oncol 124 ( 11): 607-14. 8) Nakamura, K, N Yoshikawa, et al ( 2002). I'Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model " Life Sci 70 ( 7): 791-8. REVENDICATIONS 1) Méthode d'analyse de l'agressivité tumorale de cellules cancéreuses comprenant la mesure de la quantité 5 d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans un lysat desdites cellules. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure réalisée sur lysat est comparée à une 10 ou plusieurs valeurs de référence de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire soit dans des cellules en culture spécifiques d'un phénotype soit dans des tissus provenant de prélèvements biologiques. 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la quantité d'actine polymérisée correspond à la somme de toute l'actine sous forme F. 4) Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, 20 caractérisée en ce que la mesure de la quantité d'actine à l'état stationnaire est réalisée par polarisation statique de fluorescence en présence de monomères d'actine liés à un fluorochrome, lesquels sont incorporés dans les filaments d'actine (actine F) formés au cours de la polymérisation de 25 l'actine endogène du lysat. 5) Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que les monomères d'actine liés à un fluorochrome sont ajoutés au lysat cellulaire dans un rapport compris 30 entre 1/80 e et 1/1600 e par rapport à la quantité d'actine endogène. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend: la lyse des cellules cancéreuses dans des 5 conditions non-dénaturantes pour les protéines et l'élimination des débris cellulaires, le dosage des protéines totales du lysat, l'ajout de monomères d'actine liés à un fluorochrome, l'ajout des substances nécessaires à la polymérisation de l'actine endogène et à la protection des protéines du lysat, la mesure de la quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire dans le lysat. 15 7) Méthode d'identification de molécules susceptibles de présenter une activité anti-cancéreuse, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en 20 présence d'une quantité adéquate de ladite molécule, et en ce que l'on détermine la capacité de ladite substance à restaurer une quantité d'actine polymérisée à l'état stationnaire correspondant à celle de cellules non agressives. 8) Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à l'évaluation du caractère invasif desdites cellules. 9) Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à l'évaluation de la tumorigénicité desdites cellules. 10) Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à la prédiction de la sensibilité desdites cellules à un traitement anticancéreux. 11) Application selon la revendication 10, caractériséE en ce que ledit traitement anti-cancéreux consiste en une radiothérapie ou une chimiothérapie. 12) Un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend: un milieu de re-suspension des cellules pour la lyse des cellules, les substances nécessaires à la polymérisation de l'actine endogène et à la protection des protéines du lysat, une solution de monomères d'actine liés à un fluorochrome, un tampon de polymérisation de l'actine, un tampon général d'actine, éventuellement des extraits de référence de cellules agressives et non agressives.