Brevet FR2854801A1 — publié le 20041119

La présente invention a pour but de fournir des préparations de globine utiles pour une administration à l'homme. Ces préparations peuvent se présenter, notamment, sous forme de pâtes injectables ou de matériaux solides implantables, ou d'implants. On a déjà décrit de nombreuses applications médicales du collagène, que ce soit sous forme de pâtes, par exemple pour le comblement, de formulations fluides ou solides, comme des films ou des compresses, ou sous forme d'implants divers. En fait, seul le collagène animal est généralement utilisé. La préparation de collagène humain, qui serait préférable au collagène animal, est envisageable à partir de tissus cutanés humains. Mais elle est rendue très difficile car le prélèvement de tissus humains à partir de cadavres pose des problèmes éthiques considérables et nécessite des tests coûteux pour éliminer les risques de transmission de maladies infectieuses, virales ou autres. La préparation de collagène humain à partir de placentas est coûteuse, complexe et difficile à organiser. La préparation de collagène humain par les méthodes modernes de recombinaison génétique ou de cultures cellulaires est aussi très coûteuse, ce qui gênera certainement le développement commercial de ce produit. La globine est la protéine constitutive de l'hémoglobine qui, elle même, contient 4 chaînes peptidiques (2 chaînes a et 2 chaînes ) chacune associée à un hème. L'hème est constitué d'une structure tétrapyrole contenant 1 atome de fer chargé positivement. Il y a 4 hèmes par molécule, responsables de la coloration rouge de l'hémoglobine. Les procédés de préparation de la globine sont connus depuis très longtemps et ont été développés dans le but d'application alimentaire ou pour la préparation de solutions pharmaceutiques injectables. Contrairement à l'hémoglobine qui est parfaitement soluble à pH physiologique, la globine est remarquablement insoluble dans les mêmes conditions. Le caractère insoluble de la globine dans des conditions physiologiques a gêné jusqu'à présent le développement de ses applications pharmaceutiques. C'est pourquoi la plupart des essais ont cherché à préparer des dérivés solubles de la globine à pH physiologique, notamment par succinylation à l'aide de l'anhydride succinique ou par acétylation à l'aide de l'anhydride acétique. Un produit injectable associant une préparation de globine soluble avec de l'insuline a été mis au point et commercialisé. Il permet après injection,une délivrance progressive de l'insuline à partir de ce complexe. La globine n'est pas l'élément actif, ni l'élément principal de ce produit. La présente invention se propose de fournir de nouveaux matériaux et préparations injectables ou implantables dans l'organisme, dont la globine est l'élément actif principal et qui ne présentent pas les inconvénients des matériaux et formulations connus, par exemple de collagène ou autres. L'invention a pour objet une préparation pâteuse ou solide de globine insoluble au pH physiologique, biocompatible, stérile et, de préférence, biodégradable, notamment sous forme de pâte injectable, de matériaux solides, par exemple de films, ou d'implants solides. La présente invention se propose de conserver le caractère insoluble, naturel à pH neutre, de la globine, par exemple en récoltant par centrifugation un précipité protéique de globine formé par suspension de ce précipité dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, par exemple une solution aqueuse physiologique de type PBS, contenant 9g/1 NaCl et tamponnée à pH neutre entre 6.8 et 7. 5. La pâte ainsi formée est injectable à l'aide d'une fine aiguille (diamètre 24 à 30g).Cette pâte peut être préparée en présence d'agents lubrifiants comme un polyéthylène-glycol, le hyaluronate de sodium, l'acide hyaluronique ou d'autres polysaccharides ou mucopolysaccharides. Un tel additif facilite le passage du précipité pâteux à travers une fine aiguille et son injection comme implant. L'originalité et l'intérêt de ce produit résident dans le fait qu'il s'agit d'une pâte protéique, parfaitement biocompatible avec les tissus environnants dans lesquels elle est injectée. Cette protéine n'a subi aucune altération ni modification chimique, elle est naturellement insoluble dès qu'elle se trouve dans un environnement physiologique. Une pâte protéique de globine humaine peut être utilisée chez l'homme pour combler des cavités, des rides, des cicatrices cutanées ou augmenter le volume de certains tissus (sphincters urinaires, digestifs, cordes vocales etc....). Les applications de comblement permises par cette pâte de globine sont donc nombreuses et inattendues pour cette. protéine. La globine humaine homologue est préférable et permet d'éviter toute réaction immunologique du patient à traiter, pendant ou après l'injection. Ce produit représente donc un avantage important par rapport au collagène qui jusqu'à présent est préparé à partir de peaux d'animaux (veau, porc, etc....) et qui nécessite un certain nombre de précautions et conditions pour éviter les réactions immunologiques chez les patients. # Nécessité de tester chaque patient pour une éventuelle allergie au collagène animal # Impossibilité de traiter les personnes allergiques La globine reste cependant soluble à des pH acides ou basiques et dans ces conditions peut être filtrée stérilement sur des membranes poreuses. Pour des concentrations appropriées de 20 à 300 mg/ml, de telles solutions peuvent être traitées comme des solutions de protéines et permettent de réaliser des produits tels que : éponges, films, granules, en utilisant ou combinant les techniques de séchage, lyophilisation, réticulation, précipitation. Quelques exemples sont développés cidessous. La globine humaine est facile à purifier à partir de globules rouges humains. Ceux-ci sont disponibles en quantité suffisante à partir des dons périmés restant en stock dans les centres de transfusion sanguine et pour lesquels tous les tests préalables sanitaires ont été réalisés au moment du prélèvement . La préparation de globine insoluble, injectable ou d'autres biomatériaux à base de globine représente donc de nouvelles applications médicales permettant de valoriser les dons de sang périmé et d'éviter ou de diminuer leur destruction. La mise en #uvre de l'invention est possible aussi à partir d'un prélèvement d'échantillon de sang du patient à traiter d'environ 5 à 100 ml, et sa transformation en globine autologue avec les mêmes méthodes que pour de grands volumes, puis l'injection de la pâte obtenue pour la correction des rides du même patient ou d'autres applications. Le nombre de seringues préparées à partir d'un prélèvement du patient peut être important et permettre le traitement du patient pendant plusieurs années. De même le placenta humain qui est expulsé après l'accouchement contient du sang qui est généralement détruit par incinération, mais qui peut servir aussi à l'invention. Les poches de sang de donneurs sont contrôlées officiellement par les organismes de transfusion sanguine, grâce aux examens biochimiques, bactériologiques, sérologiques et tests de screening des différents virus et d'autres agents infectieux. Dans le cas du sang placentaire, il serait évidemment nécessaire de réaliser les mêmes examens sur des échantillons de sang du cordon ombilical ou de la mère avant de pouvoir collecter, conserver et extraire le sang de cette matière première. Pour le sang autologue, les tests à effectuer peuvent être simplifiés. La réalisation de l'invention nécessite d'abord de recueillir et purifier les globules rouges dans ces échantillons de sang, ou liquides sanguins, par des opérations simples et déjà connues. Les globules rouges sont récupérés par centrifugation à basse vitesse. Le surnageant plasmatique est séparé et remplacé par un liquide salin physiologique de type PBS ; contenant 9g/1 de NaCl et tamponné à pH neutre. Après plusieurs lavages (3 à 5), la suspension de globules rouges est ainsi débarrassée des protéines du plasma. Le culot de globules rouges purifiés est additionné de 1 ou 2 volumes d'eau distillée pour réaliser un choc osmotique qui entraîne la lyse des membranes des globules rouges et libère l'hémoglobine en solution concentrée et purifiée. Une étape de centrifugation à haute vitesse (10 à 20 000 t/mn) permet d'éliminer les débris membranaires et cellulaires dans le culot. Une étape finale de filtration du surnageant sur membrane de porosité de 0. 2 micron permet de préparer une solution d'hémoglobine purifiée et stérile, dépourvue de particules et dérivés d'origine tissulaire, cellulaire ou membranaire. Le clivage Héme-Globine à pH acide a été décrit en présence d'alcool par SCHULZ dès 1898. ANSON et MIRSKY en 1930 puis ROSSI-FANELLI et coll. en 1958 utilisent l'acétone en présence d'acide à 0 C. TEALE (1957) préfère l'utilisation de la methyl-ethyl cétone à la place de l'acétone. AUTIO et coll. (1984) séparent la globine à pH acide grâce à l'absorption et la précipitation de l'hème avec la carboxymethylcellulose soluble. La globine ainsi préparée est soluble à pH acide ou alcalin mais devient insoluble dès que le pH de la solution aqueuse est neutralisé entre pH 6 et 8. Des essais de solubilisation à pH neutre ont été réalisés par STRUMIA et coll. en 1951 et 1952 par un traitement alcalin prolongé qui entraîne une déamidation partielle de la globine au niveau des résidus asparagine et glutamine transformés respectivement en acide aspartique et acide glutamique (VARS 1952). D'autres essais de solubilisation ont été réalisés par VOLCKMANN en 1988 par succinylation. Le caractère insoluble en milieu physiologique explique la persistance de la globine après implantation tissulaire, ce qui la rend aussi résistante à une dégradation enzymatique, surtout si la quantité injectée est importante, ce qui est le cas dans les applications de comblement ou d'augmentation tissulaire. Au contraire, la plupart des autres protéines ne sont précipitables que par des concentrations élevées de sels ou d'alcool, ce qui rendrait leurs précipités non biocompatibles et non utilisables pour des injections intra tissulaires. De plus, de tels implants disparaîtraient très vite par diffusion des agents précipitants et dissolution progressive du précipité au contact du milieu physiologique des tissus. La vérification de l'intérêt de l'invention peut être facilement réalisée à partir d'une préparation de globine de lapin. La pâte de globine précipitée, physiologique, ainsi préparée peut être injectée par voie sous-cutanée en différents endroits sur le dos ou la paroi du lapin. Il est facile de vérifier l'innocuité par l'absence d'érythème localement. La persistance du produit sous la peau peut être observée par palpation en fonction du temps. L'absence de pouvoir antigénique du produit peut être vérifiée par immunisation de lapins avec ou sans adjuvant de Freund par voie sous cutanée et intra musculaire. Les prélèvements de sang effectués après l'immunisation permettent de vérifier l'absence d'anticorps anti-globine ou anti-hémoglobine par les tests habituels de contrôle. Exemples de réalisation deproduitsselonl'invention. Préparation de globine de lapin Cinq lapins anesthésiés sont saignés par ponction cardiaque. Le sang est récupéré en présence d'héparine ou en présence de citrate de sodium pour éviter sa coagulation. On obtient ainsi 210 ml de sang qui sont centrifugés pendant 30 minutes à 2500 t/mn. Le surnageant contenant le plasma est prélevé avec une pipette et le culot est lavé 5 fois par 3 volumes de tampon PBS, contenant 9 g/1 NaCl et tamponné à pH 7. 2. Le culot final, lavé, est additionné, sous agitation, d'un volume égal d'eau distillée pour lyser les hématies. La suspension finale est centrifugée à 12 OOOt/mn pour éliminer des débris cellulaires et membranaires. Le surnageant est filtré sur membrane d'acétate de cellulose de porosité 0. 22 micron. On obtient 82 ml contenant 97 g/1 d'hémoglobine. Cette solution est versée sous agitation dans 275 ml d'éthanol 96% contenant 1 ml d'HCL concentré. La concentration finale est de 74% d'éthanol et de 22g/1 d'hémoglobine à pH acide. On ajoute 3 g de charbon actif L4S de la marque CECA sous agitation vigoureuse pendant 15 heures à 4 C. La suspension est centrifugée à 15 OOOt/mn pendant 30 minutes pour éliminer le charbon sous forme de culot. Le surnageant contenant la globine acide décolorée est filtré sur une série de membranes poreuses jusqu'à la porosité la plus faible (0.2 micron)pour éliminer les particules fines de charbon. Le filtrat est dilué par un volume égal d'eau distillée, le pH est ajusté à 7. 4 par addition de NaOH et la globine précipite massivement. Après 15 heures, le précipité de globine est récupéré par centrifugation, puis lavé 2 fois par 3 volumes de solution physiologique PBS, contenant 9g/1 NaCl et tamponnée à pH 7. 4. On récolte 58,2 g de précipité de globine à pH 7. 4. Le précipité est homogénéisé par transferts successifs entre 2 seringues de volume 5 ml reliées par un connecteur de diamètre intérieur de 1 à 2 mm, en appuyant successivement sur le piston de chaque seringue pour faire passer le précipité dans l'autre seringue. En final, le précipité homogénéisé est réparti dans des seringues de 1 ml. Il est possible d'expulser la pâte de globine précipitée à partir de la seringue, à travers des aiguilles pour injections intradermiques. La concentration de globine dans la pâte peut être ajustée à des valeurs comprises entre 30 et 150 mg/g. Préparation de globine humaine 200 ml de sang humain périmé, prélevé sur citrate de sodium sont centrifugés pendant 30 mn à 2500 t/mn. Le surnageant contenant le plasma est prélevé avec une pipette en aspirant aussi la couche cellulaire blanchâtre superficielle correspondant aux leucocytes. Le culot de globules rouges est lavé 5 fois avec 3 volumes de solution physiologique PBS, contenant 9 g/1 NaCl et tamponné à pH 7.2, par des centrifugations successives. Le culot final est additionné de 2 volumes d'eau distillée pour lyser les hématies. La suspension hémolysée est clarifiée par centrifugation pendant 30 mn à 12 OOOt/mn et filtrée sur membrane de porosité 0.2 micron. On obtient 210 ml contenant 52 g/1 d'hémoglobine qui sont conservés à 4 C. Un volume égal de 210 ml d'HCl 0. 1 N à 4 C est ajouté puis l'ensemble est versé dans 4 1 d'acétone, contenant 40 ml d'HCl 1 N. La suspension est agitée vigoureusement et laissée au repos pendant 1 heure à température ambiante, sous une hotte chimique. L'hème dissout dans l'acétone est éliminé par filtration sur toile poreuse et le précipité de globine est récupéré, lavé en acétone acide et séché sous courant d'air. -La globine est remise en solution aqueuse à pH 2 et peut être à nouveau précipitée par l'acétone acide pour compléter la décoloration de la globine. En final, la solution aqueuse de globine acide est filtrée stérilement sur membrane de porosité 0.2 micron, puis précipitée par neutralisation du pH par addition de NaOH jusqu'à pH 7. 4. Des seringues de pâte de globine, précipitée à pH neutre, peuvent être préparées comme dans l'exemple précédent. L'opération de neutralisation de la solution de globine acide peut s'effectuer en ajoutant du hyaluronate de sodium à pH alcalin. Dans ce cas il se forme une pâte de globine insoluble complexée et imprégnée par le hyaluronate, apportant une fonction lubrifiante qui améliore le caractère injectable à travers de fines aiguilles. Autre préparation de globine humaine On réalise le procédé de l'exemple 1 à partir de culot globulaire contrôlé et périmé obtenu auprès d'un centre de transfusion sanguine. On obtient des seringues contenant une pâte de globine humaine, précipitée, biocompatible et implantable par injection. Préparation de globine humaine ayant subi un traitement alcalin par la soude 0. 1 ou 1 M pendant 1 heure à 20 C On réalise le procédé de l'exemple 1 ou 2 jusqu'à l'obtention du précipité de globine à pH 7.4, avant lavages. Ce précipité est dissout, à nouveau, dans 3 volumes de soude NaOH 0. 1 M à 1M à 20 C pendant 1 heure, sous agitation. La solution est ensuite neutralisée par addition d'un volume égal d'HCl de la même molarité et le pH de la suspension est ajusté entre 7 et 7. 4. Le précipité de globine est alors récolté par centrifugation, puis lavé en solution physiologique PBS comme dans les exemples précédents. La pâte de globine précipitée, pouvant être additionnée d'acide hyaluronique, est répartie en seringues et on vérifie à nouveau le caractère injectable du produit obtenu. Ce traitement alcalin de la globine permet d'améliorer les garanties de sécurité sanitaire du produit sans modifier de manière significative le caractère insoluble de la globine à pH neutre. Préparation d'une pâte de globine précipitée et réticulée par le glutaraldéhyde. Ce traitement est possible pour augmenter le temps de résorption de l'implant. Le précipité final de globine est mis en suspension à 2% dans du PBS. Le glutaraldéhyde est ajouté sous agitation à une concentration de 1 mg/g de précipité. Après incubation de 1 heure à 20 C, le précipité de globine est lavé et mis en seringue comme dans les exemples précédents. D'autres agents de réticulation comme des dialdéhydes ou des polyaldéhydes peuvent être utilisés, notamment des polysaccharides oxydés par l'acide périodique tels que le dextran oxydé, l'amidon oxydé, ou l'acide hyaluronique oxydé. Préparation de seringues de pâte de globine précipitée stérile Pour préparer des seringues stériles, il est nécessaire de travailler dans des conditions aseptiques aussitôt la filtration stérilisante de la solution de globine acide sur membrane de porosité 0. 2 micron. Ceci peut se faire sous hotte à flux laminaire dans une zone stérile de classe 100 ou 1000, ou avec une enceinte stérile, accessible de l'extérieur par des gants souples de latex. Les opérations de précipitation et de centrifugation du précipité doivent s'effectuer dans des godets de centrifugation stérilisés et emballés sous film protecteur. Une autre méthode consiste à répartir une solution acide de globine soluble, filtrée stérilement dans une première seringue et une deuxième solution alcaline, filtrée stérilement dans une deuxième seringue. Le pH de chaque seringue est ajusté de manière que leur mélange ultérieur soit à pH neutre. La connection de ces deux seringues, grâce à un connecteur stérile permet de réaliser un mélange stérile, homogène, de pH neutre, par des transferts successifs d'une seringue dans l'autre. Une pâte est obtenue par précipitation spontanée de la globine. L'addition de hyaluronate de sodium dans la seringue alcaline permet d'incorporer le hyaluronate dans la globine finale. Lorsque la deuxième seringue alcaline ne contient pas de globine, il est possible d'y incorporer un agent de réticulation. Stérilisation finale des seringues de pâte de globine précipitée Une stérilisation des seringues peut être réalisée par irradiation à une dose comprise entre 5 et 30kilogray. Réalisation d'un gel ou d'un film insoluble à partir de globine soluble non modifiée. Une solution de globine soluble est réalisée en dissolvant la poudre acétonique de globine à pH 3, à une concentration de 20 à 120 mg/ml en solution aqueuse. Cette solution est filtrée stérilement sur membrane de porosité 0,2 , puis ajustée à pH 5 par addition de soude stérile NaOH 1 N sous agitation. Le mélange est additionné d'amidon oxydé à pH 3,5, ou d'un autre aldéhyde, polyaldéhyde ou autre agent réticulant, à une concentration de 0,5% sous agitation pendant 5 mn. Le mélange stérile est coulé sur une surface plane pour obtenir une épaisseur de 1 à 3 mm de liquide, à une température de 20 à 37 C, sous flux laminaire. Le produit liquide se gélifie progressivement grâce à la réticulation des chaînes de globine induite par l'amidon oxydé, puis se déshydrate sous le courant d'air, si on souhaite obtenir un film. Le film final d'épaisseur comprise entre 20 et 200, selon la concentration initiale de matière, peut être stérilisé par irradiation béta ou gamma ou par l'oxyde d'éthylène. Des agents de filmage bien connus peuvent être ajoutés tels que l'acide hyaluronique, d'autres polysaccharides ou mucopolysaccharides, le polyéthylèneglycol, le glycérol etc. Un tel additif permet de donner de la souplesse et de la résistance au film. Un tel film peut être utilisé seul pour protéger une plaie, ou peut être associé à diverses prothèses (prothèses vasculaires, treillis de renfort, matrices poreuses) pour les rendre imperméables, améliorer leur biocompatibilité, conférer des propriétés anti-adhérences ou un caractère adhésif, selon des techniques connues et déjà employées avec d'autres produits. Dans une variante, il est possible de réaliser un film à partir de globine soluble à pH 5 comme précédemment, mais sans introduire d'agent de réticulation. La réticulation finale du film séché est réalisée par l'irradiation finale qui crée des liens covalents entre les chaînes de globine. Les films et/ou compresses réalisées selon l'invention peuvent être utilisées pour la protection et/ou la réparation de plaies ou cicatrices externes ou internes, chirurgicales ou non. Bibliographie ANSON M. L. - MIRSKY A.E. (1930) Protein Coagulation and its reversal. The préparation of insoluble globin, soluble globin and heme. J. Gen. Physiol. 13,469-476 AUTIO K - KIESVAARA M. - MALKKI Y. - KANKU S. (1984) Chemical and functional properties of blood globin prepared by a new method Journal of Food Science 49,859-862 ROSSI-FANELLI A. - ANTONINI E.-CAPUTO A. (1958) Studies on the structure of haemoglobin I-Physicochemical properties of human globin Biochem. Biophys. Acta 30,608-615 SCHULZ F.N. (1898) Der Eiweisskôrper des hâmoglobins Ztsch. F. physiol. chem. 24,449-460 STRUMIA M.M. - SAMPLE A. B. - MAWR B. (1951) Modifies globin I-Method for préparation from human erythrocytes. J. Lab.and Clin.Med. 37,959-968 STRUMIA M.M. - Mc GRAW J.J. - SAMPLE A. B. - MAWR B. (1952) Modified globin IV- Some of the physiological properties of modified human globin J. Lab.and Clin. Med. 40,2, 211-222 TEALE F. W.J. (1957) Cleavage of the haem-protein link by acid methyl-ethyl keton Biochem. Biophys. Acta 26,437 VARS H.M. -BOXER G. E. -MAWR B. (1952) Modified Globin II- Chemical changes in human globin by alkaline modification J. Lab.and Clin. Med. 39,5, 743-751 VOLCKMANN H. (1988) Essais de développement d'un substitut plasmatique d'origine placentaire Thèse d'ingénieur CNAM - Lyon REVENDICATIONS 1. Préparation injectable ou implantable dans l'organisme humain et animal caractérisée en ce qu'elle comporte, à titre de composant principal, de la globine insoluble au pH physiologique, biocompatible et stérile. 2. Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la globine est une globine d'origine humaine. 3. Préparation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que la globine, dans la préparation, est à l'état précipité. 4. Préparation injectable biocompatible selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comporte de la globine homogénéisée. 5. Préparation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la globine se présente sous forme d'une pâte homogénéisée, injectable. 6. Préparation selon l'une des revendications 4 et 5 caractérisée en ce que la pâte homogénéisée est injectable par voie sous-cutanée ou intradermique par aiguille. 7. Préparation selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisée en ce que la concentration de globine dans la préparation injectable est comprise entre 30 et 150 mg/g 8. Préparation selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisée en ce que le pH de la préparation est compris entre 6 et 8. 9. Préparation selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que la globine est en suspension. 10. Préparation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la globine est en solution, à un pH inférieur à 6 ou supérieur à 8 dans un véhicule liquide pharmaceutiquement acceptable. 11. Préparation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la globine est présente dans la préparation sous forme d'un gel. 12. Préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un agent lubrifiant. 13. Préparation selon la revendication 12 caractérisée en ce que cet agent lubrifiant est un hyaluronate. 14. Préparation selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisée en ce que la préparation comporte un agent réticulant. 15. Préparation selon la revendication 14 caractérisée en ce que l'agent réticulant est choisi parmi le glutaraldéhyde, les dialdéhydes et les polyaldéhydes, notamment les polysaccharides oxydés par l'acide périodique, y compris le dextran oxydé, l'amidon oxydé ou l'acide hyaluronique oxydé. 16. Préparation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comporte ou est constituée par un film de globine. 17. Préparation selon la revendication 16 caractérisée en ce que le film a été obtenu par déshydratation d'un gel ou d'une solution. 18. Préparation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est réalisée sous forme d'un implant solide. 19. Préparation selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce qu'elle est réticulée. 20. Préparation selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'elle est réticulée par adjonction d'un agent réticulant et/ou par une irradiation. 21. Utilisation d'une préparation selon l'une des revendications 1 à 14 pour la réalisation d'un matériau de comblement tissulaire. 22. Utilisation selon la revendication 21 pour le comblement de cavités, rides ou cicatrices cutanées. 23. Utilisation d'une préparation selon l'une des revendications 1 à 15 pour l'augmentation de volume de tissus. 24. Utilisation selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle est prévue pour l'augmentation de sphincters, notamment urinaire ou digestif ou de cordes vocales. 25. Utilisation d'une préparation selon l'une des revendications 16 à 20 pour la réalisation de films et/ou de compresses pour la protection et/ou la séparation de plaies ou cicatrices externes ou internes, chirurgicales ou non.