Brevet FR2850388A1 — publié le 20040730

L'invention concerne de nouveaux polymères et copolymères cationiques et les intermédiaires nécessaires pour leur synthèse ainsi que l'utilisation de polymères et copolymères cationiques pour la vectorisation de biomolécules naturelles ou synthétiques, les complexes comprenant lesdits polymères et/ou copolymères cationiques et lesdites biomolécules. L'utilisation de matériel génétique dans une stratégie thérapeutique ou prophylactique semble être une voie prometteuse depuis ces dix dernières années. Cependant, ce matériel génétique, qu'il s'agisse d'ADN, d'ARN et/ou de leurs fragments, est assez fragile, in vivo (dégradation par les nucléases), lors d'administrations directes par les voies classiques parentérales ou invasives connues des industries pharmaceutique et biotechnologique. Des niveaux de transfection satisfaisants sont obtenus uniquement lorsque l'administration du matériel génétique nu est réalisée à proximité des cellules cibles (par exemple injection d'ADN nu directement dans les tissus musculaires au contact des myoblastes). A ce constat, il faut ajouter que ces molécules, chargées négativement, ont des difficultés à franchir les diverses membranes cellulaires elles-mêmes étant chargées négativement. L'ensemble de ces obstacles aboutit à l'heure actuelle à une efficacité réduite de ces biomolécules naturelles ou synthétiques et il a ainsi pu être démontré qu'une très faible proportion de la masse totale du matériel administré parvenait effectivement à atteindre le compartiment cellulaire visé et à y exercer le rôle qui lui est assigné. Afin de remédier à ces problèmes, l'utilisation de vecteurs constitue une méthode de choix originale. Ces vecteurs se divisent principalement en deux catégories : (i) les vecteurs viraux, qui ont été les premiers testés, et (ii) les vecteurs synthétiques. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, les adénovirus et les virus associés aux adénovirus (AAV). Si de nombreux essais sont en cours avec des vecteurs d'origine virale, cette stratégie soulève toujours un doute quant à leur innocuité (M. D. Brown et al., Word Markets Series, Business Briefing, Pharmatech 2001, Word Markets Research Center Ltd Ed., 158-164). En effet, bien que pouvant assurer un taux de transfection élevé, certains vecteurs viraux peuvent provoquer de fortes réactions inflammatoires et immunitaires (activation des oncogènes), les administrations répétées de doses devenant alors impossibles. De plus, ces vecteurs ne peuvent transférer que des fragments d'ADN de taille limitée, ce qui interdit la transfection de gènes de grande taille. Par ailleurs, des difficultés de production, de contrôle qualité et de stockage sont rencontrées avec de tels vecteurs. Comme alternative aux vecteurs dérivés de virus, les chercheurs se sont orientés vers d'autres vecteurs purement synthétiques, que l'on peut classer en deux familles : les lipides cationiques et les polymères cationiques. Ces composés chargés positivement s'associent au matériel génétique chargé négativement par des interactions électrostatiques pour former des complexes dits "lipoplexes" ou "polyplexes" selon la nature du vecteur. La formation d'un complexe présentant des charges positives excédentaires favorise l'interaction avec les diverses membranes des cellules. Il existe une grande variété de lipides cationiques conduisant à des efficacités de transfection variables (A. Aissaoui et al., Curr. Drug Targets 2002, 3,1-16). Un des inconvénients majeurs de ces composés est sans aucun doute leur toxicité plus ou moins élevée. De même, le pouvoir transfectant de nombreux polymères cationiques a été évalué (S. C. De Smedt et al., Pharm. Research, 2000,17, 113-126 ; M. C. Garnett, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1999,16, 147- 207). Parmi eux, on citera par exemple la polylysine, la polyéthylèneimine et certains dendrimères à motifs cationiques. Ces vecteurs synthétiques sont plus stables que les lipides cationiques et bénéficient d'une certaine facilité de production. Dans ce contexte, la présente invention a pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture de nouveaux polymères ou copolymères synthétiques aptes à former des structures de type polyplexe, dotés de propriétés spécifiques permettant, in vitro et in vivo, une vectorisation efficace des biomolécules naturelles ou synthétiques telles que ADN, ARN et/ou leurs fragments. L'invention concerne donc, selon un premier aspect, un polymère ou un copolymère cationique essentiellement formé à partir d'au moins un monomère de formule (I) dans laquelle : - R1 est H ou un C1-C4 alkyle ; - n est zéro ou un ; - X est -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NH-, -C(O)-NH- ou NH-C (O)- ; - Sp est un groupe espaceur tel que -(CH2)m- ou -(CH2)m-O-(CH2)I- ou n'existe pas ; - m et I, identiques ou différents, représentent un entier de 1 à 4 ; - Y est -O-C(O)-, -C(0)-0-, -NH-, -C(O)-NH- ou NH-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement (C1-C6) alkyle linéaire ou ramifié substitué par au moins une fonction amine primaire, secondaire 'ou tertiaire, éventuellement protégée par un groupement protecteur ou sous forme protonée. L'expression "essentiellement formé" utilisée dans le cadre de la présente description signifie que les unités récurrentes constituant les polymères ou copolymères selon l'invention sont dérivées exclusivement de monomères de formule (I), les polymères ou copolymères résultants pouvant le cas échéant contenir en des proportions très faibles, quelques impuretés générées en cours de synthèse. L'originalité des monomères de formule (I) réside dans le fait qu'ils comportent au moins une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire protonable, c'est-à-dire susceptible d'être rendue cationique par ajout d'un proton. Selon une hypothèse de mécanisme, ledit monomère renfermant au moins une fonction amine protonable est susceptible d'assurer l'interaction avec des biomolécules naturelles ou synthétiques telles que ADN, ARN et/ou leurs fragments, donc de former des complexes, par l'intermédiaire de ses charges positives qui s'associent aux charges négatives du matériel biologique. Lesdits complexes représentent également un objet de l'invention. Etant formés exclusivement à partir de monomère (s) au moins une fonction protonable, les polymères ou copolymères cationiques selon l'invention présentent des propriétés d'hydrosolubilité aux pH physiologiques. Des monomères protonables préférés renfermant au moins une fonction amine de formule (I) sont ceux dans lesquels - R1 est H ou méthyle, de préférence méthyle ; - n est zéro ou un, de préférence zéro ; - X est -C(O)-O-ou -C(O)-NH- ; - Sp est un groupe espaceur choisi parmi -CH2- et -(CH2)2-, ou n'existe pas ; - Y est -O-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement -CH2-NH2, -CH(CH3)-NH2, -CH(CH2-NH2)2 ou CH(NH2)-(CH2)3-NH2, dont les fonctions amines sont éventuellement protégées par un groupement protecteur tel que le groupement tert-butyloxycarbonyle. D'autres monomères de formule (I) avantageux aux fins de l'invention sont les composés de formules (II), (III) et (IV) ci-dessous : Ces monomères de formule (II), (III), (IV) peuvent être utilisés : - soit, pour former des homopolymères ; - soit, pour former des copolymères exclusivement constitués d'unités récurrentes de formule (II), (III) et/ou (IV) ; - soit encore pour former des copolymères constitués d'unités récurrentes de formule (II) et/ou (III) et/ou (IV) et de formule (I). De manière générale, les monomères de formule (I) sont préparés par des procédés connus de l'homme du métier par couplage d'un dérivé méthacrylate, vinylique ou allylique, judicieusement fonctionnalisé, avec une molécule également fonctionnalisée portant une ou plusieurs fonction(s) amine (s) protégée (s) ou non. On peut par exemple condenser un résidu d'acide aminé dont la fonction amine terminale est protégée par un groupement protecteur avec un dérivé d'hydroxyéthylméthacrylate ou d'alcool allylique selon des méthodes connues, en présence, par exemple, de dicyclohexylcarbodiimide comme agent de couplage et de 4-diméthylaminopyridine, comme catalyseur, dans un solvant tel que le dichlorométhane. Les monomères de formule (I) peuvent comporter une ou plusieurs fonction (s) amine (s) protégée (s) ou non protégée(s). Lorsqu'ils renferment une ou plusieurs fonction (s) protégée(s), celle(s)-ci n'est(ne sont) de préférence déprotégée (s) qu'àl'issue de la synthèse du polymère ou copolymère afin de permettre l'utilisation de différents types de procédés de polymérisation et d'assurer une meilleure réactivité des monomères dans une plus large variété de solvants. Lorsque la ou les fonction (s) amine (s) du groupe R2 est (sont) protégée (s) par un groupement protecteur, celui-ci est choisi parmi les groupements habituellement utilisés à cette fin, tels que par exemple le groupement tertio-butyloxycarbonyle. L'invention concerne également l'utilisation des polymères et copolymères cationiques tels que définis ci-dessus pour la vectorisation de biomolécules naturelles ou synthétiques de préférence chargées négativement, en particulier de matière biologique, notamment de matériel génétique, tel que l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments (Le. oligonucléotides anti-sens, aptamères, "small interfering" ARN...) ; de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. Par "biomolécule", on entend désigner ici de manière générale toute molécule ayant une activité biologique prophylactique ou thérapeutique, notamment un agent anti-infectieux, en particulier un agent antiseptique, antibiotique, antiviral, antiparasitaire ou antimitotique, notamment anticancéreux. L'invention concerne également les complexes formés à partir desdits polymères ou copolymères cationiques selon l'invention et desdites biomolécules, en particulier l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments correspondants. Lesdits complexes sont obtenus par mise en contact desdits polymères ou copolymères cationiques et desdites biomolécules en solution. Les exemples ci-après illustrent non limitativement l'invention. Dans ces exemples, les abréviations suivantes sont utilisées : AIBN : a,a'-Azoisobutyronitrile BCA : Bicinchoninic Acid Solution t-Boc : tertioutyloxycarbonyle DCC : dicyclohexylcarbodiimide DMAP : 4-diméthylaminopyridine DMSO :diméthylsulfoxide DO : densité optique ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HEMA : hydroxyéthylméthacrylate I.p : indice de polymolécularité LB : Luria Bertani Me : méthyle MTT : (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) Mw : masse molaire moyenne en poids n.d : non déterminé Réf. : référence THF : tétrahydrofurane. 1 - Synthèse de monomères comprenant une fonction amine protégée Le dérivé d'acide aminé (Neosystem) et les autres réactifs (Aldrich, Merck, Fluka) ont été utilisés en l'état sauf indication précisant leur mode de purification. Les solvants ont été utilisés sans purification préalable sauf lorsque cela est expressément signifié. Les monomères sont caractérisés par chromatographie sur couche mince (ccm) réalisée avec des plaques revêtues de gel de silice 60F254 comme phase stationnaire. Les plaques de ccm ont été révélées successivement sous éclairage UV à une longueur d'onde de 254 nm puis par un chauffage à 100 C après pulvérisation d'une solution éthylique de ninhydrine à 1%. Selon les cas, les purifications des monomères ont été réalisées par précipitation, cristallisation ou chromatographie éclair. La pureté analytique des composés préparés a été contrôlée par l'obtention d'une seule tache en ccm pour deux systèmes d'éluants différents. Les systèmes d'éluants suivants ont été utilisés : A (acétate d'éthyle/éther de pétrole : 1/1 (v/v)) et B (méthanol/dichlorométhane : 5/95 (v/v)). La caractérisation a été effectuée par analyse spectroscopique (RMN du proton à 250 MHz) et les données RMN sont exprimées de la manière suivante : déplacement chimique (8) donné en ppm ; s singulet ; d doublet ; t triplet ; q quadruplet ; m multiplet ; la position (le domaine) et le nombre de protons sont précisés pour chaque raie de résonance. Exemple 1 : tert-butyloxyca rbonylami noéthyl méthacrylate (t-Boc-AEMA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = CH2 ; Y n'existe pas ; R2 = CH2-NH-t-Boc a/ Synthèse du précurseur tert-butyloxycarbonylaminoéthanol (t-BocNH-CH2-CH2-OH) Une solution de 10 mmoles de di-tert butyldicarbonate (t-BOC20) dans 30 ml de dioxane est ajoutée sur une période de 2 h à une solution de 30 mmoles d'aminoéthanol dissous dans 30 ml de dioxane. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation durant 22 h à température ambiante puis concentré. On ajoute alors 50 ml d'eau et la phase aqueuse est ensuite extraite par 3 x 50 ml de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange dichlorométhane/méthanol 95/5 (v/v). Rendement : 88% ; huile ; Rf(A) : 0,30, Rf(B) : 0,55 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 5,29 (m, 1H, NH) ; (dd, 2H, J1 = 5,00 Hz, J2 = 11,70 Hz, CH2) ; 3,52 (m, 1H, OH) ; 3,17 (dd, 2H, J1 = 5,00 Hz, J2 = 10,50 Hz, CH2) ; 1,36 (s, 9H, t-Boc). b/ Synthèse du monomère onomere Me han a A une solution de 10 mmoles d'aminoéthanol monoprotégé dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 12 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/4 (v/v). Rendement : 74% ; solide ; Rf(A) : 0,71, Rf(B) : 0,89 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 6,10 (s, 1H, CH) ; 5,57 (s, 1H, CH) ; 4,81 (m, 1H, NH) ; 4,18 (t, J = 5,25 Hz, 2H, CH2) ; 3,42 (m, 2H, CH2) ; 1,42 (s, 9H, t-Boc). Exemple 2 : Ester d'hydroxyéthylméthacrylate de tett-butyloxycarbonylalanine (t- Boc-AlaEMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; = -C(0)-0- ; Sp = - (CH2)2- ; Y = -O-C(O)- ; R2 = -CH(CH3)-NH-t-Boc A une solution de 10 mmoles de tert-butyloxycarbonylalanine (t-BocAlaOH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles de HEMA. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 20 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/4 (v/v). Rendement : 85% ; solide blanc ; Rf (A) : 0,70, Rf(B) : 0,90 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCl3) : # 6,07 (m, 1H, CH) ; (m, 1H, CH) ; (d, 1H, J = 6,70 Hz, NH) ; 4,37 (m, 1H, CHa) ; 4,30 (m, 4H, CH2) ; 1,88 (m, 3H, CH3) ; 1,38 (s, 9H, t=Boc). Exemple 3 : tert-butyloxycarbonylaminoéthylméthacrylamide (t-Boc-AEMAA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-NH- ; Sp = CH2 ; Y = n'existe pas ; R2 = -CH2-NH-t-Boc a/ Synthèse du précurseur tert-buylorcarbonyldiaminoéthane (t-Boc- NH-CH2-CH2-NH2) 87 mmoles de diaminoéthane dissous dans 40 ml de dioxane, sont additionnées goutte à goutte par l'intermédiaire d'une ampoule de coulée, à une solution de 11 mmoles de di-tert-butyldicarbonate (t-Boc2O) dissous dans 40 ml de dioxane sous agitation. L'ajout se fait sur une durée d'environ 45 min. Le milieu réactionnel est laissé 15 h sous agitation à température ambiante. La phase organique est ensuite concentrée sous vide et reprise dans 50 ml d'eau. Le produit de réaction est extrait de la phase aqueuse par 3 lavages successifs avec, à chaque fois, 25 ml de dichlorométhane. L'ensemble des phases organiques est ensuite séché sur MgS04 et concentré sous pression réduite. Le produit est séché totalement avant analyse. Rendement : 72% ; solide ; Rf(A) : 0,11, Rf(B) : 0,27 ; 1H-RMN (250 MHz ;CDCI3) : 8 4,90 (s, 1H, NH) ; 3,15 (m, 2H, CH2) ; 2,75 (m, 2H, CH2) ; 1,45 (s, 9 H, t-Boc) ; 1,25 (s, 2H, NH2)- b/ Synthèse du monomère A une solution de 13 mmoles de te/t-butyloxycarbonyldiaminoéthane (tBoc-NH-CH2-CH2-NH2) dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont ajoutées 16 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 4 mmoles de DMAP sont ajoutées. 16 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors additionnées goutte à goutte au milieu réactionnel. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le brut réactionnel est alors purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange dichlorométhane/isopropanol 9/1 (v/v). Rendement : 54% ; solide ; Rf(A) : 0,37, Rf(B) : 0,71 ; 1H-RMN (250 MHz ;CDCI3) : 8 6,65 (s, 1H, NH) ; 5,75 (s, 1H, CH) ; 5,30 (m, 1H, J = 5,30 Hz, CH) ; 4,90 (s, 1H, NH) ; (m, 4H, CH2) ; 1,95 (m, 3H, CH3) ; 1,45 (s, 9H, t-Boc). II - Synthèse de monomères renfermant deux fonctions amine protégées La purification des monomères ainsi que les méthodes de caractérisation de ces derniers sont effectuées dans les conditions mentionnées au point I cidessus pour les monomères comprenant une seule fonction amine. Exemple 4a : Méthacrylate de 1,3-di-tert butyloxycarbonylamino 2-hydroxy- propane (di-t-Boc-APMA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CH2-NH-t-Boc)2 a/ Synthèse du précurseur 1,3-di-tertbuyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane 27 mmoles de 1,3-diamino 2-hydroxypropane sont mises en solution dans un mélange constitué de 50 ml de dioxane et de 30 ml d'eau. A cette solution sont additionnées goutte à goutte 80 mmoles de di-teri-butyldicarbonate (t-Boc2O) solubilisées dans 50 ml de dioxane. Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite puis extrait par 3 x 50 ml de dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 1/1 (v/v). Rendement : 78% ; solide ; Rf(A) : 0,50, Rf(B) : 0,50 ; 'H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 5,10 (m, 2H, NH) ; (m, 1H, CH) ; (m, 1H, OH) ; (m, 4H, CH2); 1,43 (s, 9H, t-Boc). bl Synthèse du monomère }--o HN )v \O >- A une solution de 10 mmoles de 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide méthacrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées et 11 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont alors introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 90% ; solide ; Rf(A) : 0,47, Rf(B) : 0,61 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 6,23 (m, 1H, CH) ; 5,82 (m, 1H, CH) ; 5,00 (m, 2H, NH) ; (t, 1H, J = 5,20 Hz, CH) ; (m, 4H, CH2) ; 1,93 (s, 3H, CH3) ; 1,30 (s, 18H, t-Boc). Exemple 4b : Acrylate de 1,3-di-fe/t-butyloxycarbonylamino 2-hydroxypropane (di-t-Boc-APA) Composé de formule (I) dans laquelle R1 = H ; n = 0 ; X = -C(0)-0- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CH2-NH-t-Boc)2 a/ Synthèse du précurseur 13-di-terbutrfoxycarbony(amino 2- hydroxypropane Cette synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 4a ci-dessus. b/ Synthèse du monomère A une solution de 10 mmoles de 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide acrylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont alors ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 30 ml de dichlorométhane sont introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 50 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 90% ; solide ; Rf(A) : 0,71, Rf(B) : 0,86 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCb) : # 6,33 (m, 1H, CH) ; 6,02 (m, 1H, CH) ; 5,72 (m, 1H, CH) ; 5,00 (m, 2H, NH) ; 4,84 (t, 1H, J = 5,20 Hz, CH) ; (m, 4H, CH2) ; 1,30 (s, 18H, t-Boc). Exemple 5 : Ester d'hydroxyéthylméthacrylate de Adi-6?-buty!oxycarbony!ornithine (t Boc-Orn(t Boc)EMA) Composé de formule (I) dans laquelle Ri = CH3 ; n = 0 ; X = -C(O)-O- ; Sp = (CH2)2 ; Y = -O-C(O)- ; R2 = CH(NH-t Boc)-(CHZ)3-NH-t Boc a/ Synthèse du précurseur Adt-/butyfoxycarbonytomithtne o o ho # y- nh y # o V- (CH2)3 / ni 7(o-ç 20 mmoles de chlorhydrate de L(+)-Ornithine sont mises en solution dans un mélange constitué de 40 ml de dioxane, 20 ml d'eau et 20 ml d'une solution molaire de soude. La solution est placée sous agitation à 0 C et 44 mmoles de di-tert-butyldicarbonate (t-BOC20) sont ajoutées. Après 30 min, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite puis est repris par 50 ml d'éther éthylique et par 50 ml d'eau. Après lavage de la phase aqueuse, 50 ml d'acétate d'éthyle sont ajoutés, puis le mélange est acidifié à l'aide d'une solution 1M de KHS04 jusqu'à un pH = 2-3. La phase organique est alors isolée et conduit, après séchage sur MgS04, filtration et évaporation, à l'obtention d'un solide qui est caractérisé dans le système d'éluant suivant : chloroforme/méthanol/acide acétique dans les proportions 85/10/5 (v/v/v). Rendement : 20% ; solide ; Rf(A) :0,32, Rf(B) :0,44 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : # 7,88 (s, 1H, OH) ; 5,26 (d, 1H, NH) ; 4,82 (d, 1H, NH) ; 4,11 (m, 1H, CH) ; 3,11 (m , 2H, CH2) ; 1,68 (m, 2H, CH2) ; 1,50 (m, 2H, CH2) ; 1,42 (s, 18H, CH3). b/ Synthèse du monomère 0 Me 0 >-O = A une solution de 10 mmoles de di-tertutyloxycarbonylornithine (t- Boc-Orn (Boc)OH) dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'hydroxyéthylméthacrylate. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré, puis la phase organique est lavée successivement par 150 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 3/7 (v/v). Rendement : 73% ; huile ; Rf(A) : 0,74, Rf(B) : 0,91 ; 1H-RMN (250 MHz ; CDCI3) : 8 6,12 (m, 1H, CH) ; 5,59 (m, 1H, CH) ; 5,05 (d, 1H, J = 6,50 Hz, NH) ; 4,58 (m, 1H, NH) ; 4,45 - 4,26 (m, 4H, CH2) ; 3,86 (m, 1H, CHa) ; 3,12 (m, 2H, CH2) ; 1,86 - 1,45 (m, 6H, CH2) ; 1,42 (s, 18H, t-Boc). Exemple 6 : Vinyl acétate de 1,3 di-tertbutyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane Composé de formule (I) dans laquelle Rl = H ; n = 1 ; X = -C(O)-O- ; Sp n'existe pas ; Y n'existe pas ; R2 = -CH(CH2-NH-t-Boc)2 a/ Synthèse du précurseur 1,3-di-tert-butyloxycarbonylamino 2- hvdroxypropane Cette synthèse est décrite dans l'exemple 4a. b/ Synthèse du monomère 0)-0 HN /V O HN 0 HN /-0 A une solution de 10 mmoles de 1,3-di-tert=butyloxycarbonylamino 2- hydroxypropane dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont ajoutées 10 mmoles d'acide acétique vinylique. Après solubilisation complète, 2 mmoles de DMAP sont ajoutées puis 11 mmoles de DCC dissous dans 50 ml de dichlorométhane sont introduites au goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Après une nuit sous agitation, le mélange réactionnel est filtré puis la phase organique est lavée successivement par 150 ml d'une solution 1M de KHS04 et par 50 ml d'une solution saturée de NaCI. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée, puis concentrée sous pression réduite. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie éclair sur gel de silice dans un mélange acétate d'éthyle/éther de pétrole 4/6 (v/v). Rendement : 65 % ; solide ; Rf(A) : 0,80, Rf(B) : 0,94 ; 1H-RMN (250MHz ; CDCI3) 8 5,90 (m, 1H, CH) ; 5,14 (m, 2H, CH2) ; 5,03 (m, 2H, NH) ; 4,82(t, 1H, J=5,00 Hz, CH) ; (m, 4H, CH2) ; 3,06 (m, 2H, CH2) ; 1,41 (s, 18H, Boc). III - Préparation des (co)polymères cationiques Les (co)polymères sont caractérisés par : - RMN du proton (1H-RMN) Une analyse RMN avant déprotection dans CDCI3 permet d'observer la présence d'un pic caractéristique du groupement protecteur t-Boc à 8 = 1,45 (s, 9H, 3CH3) ainsi que l'éventuelle présence de monomère(s) résiduel(s) (pas de pic correspondant aux protons de la double liaison aux alentours de 6 ppm). Après déprotection, on observe dans D20 la disparition du singulet caractéristique du groupement protecteur t-Boc, démontrant que l'étape de déprotection est totale. Dans l'hypothèse où des copolymères sont préparés à partir de plusieurs monomères aminés, l'analyse RMN donne accès à la composition moyenne des chaînes de polymère. La composition finale moyenne du copolymère peut alors être donnée par le rapport entre l'intensité des pics caractéristiques de chacun des comonomères. - Chromatographie d'exclusion stérique (SEC) Cette technique d'analyse réalisée sur les (co)polymères solubles dans le THF, c'est-à-dire avant leur déprotection, met généralement en évidence la présence d'un pic monomodal possédant toutefois une distribution assez large en masse molaire, mais parfois, également, la présence d'oligomères résiduels qui peuvent être éliminés par dialyse ou fractionnement. Les masses molaires indiquées dans la suite des exemples ont été déterminées en utilisant un détecteur réfractométrique et un étalonnage réalisé à partir d'une gamme polystyrène de faible indice de polymolécularité. Les (co)polymères selon l'invention ont été préparés par (co)polymérisation radicalaire. Les (co)polymérisations radicalaires ont été réalisées dans des tubes à essai (procédé de type "batch"). La température des tubes est régulée au moyen d'un bain chauffant thermostaté et l'agitation est de type magnétique. Après avoir introduit dans le tube le(s) monomère (s) (généralement entre 4 et 6 mmoles) ainsi que le solvant de polymérisation, le plus souvent du THF bidistillé, le mélange réactionnel est dégazé par barbotage d'azote, sous forte agitation pendant 5 min. Le contenu du tube est alors amené progressivement à la température de décomposition de l'amorceur et ce dernier est ajouté rapidement le plus souvent sous forme d'une solution dans le solvant de polymérisation. La polymérisation est poursuivie pendant 15 à 24 h puis le solvant est évaporé sous pression réduite. Le (co)polymère est précipité dans une phase aqueuse pour éliminer le(s) monomère (s) résiduel(s) éventuellement présent (s). L'acide chlorhydrique gazeux a été choisi à la fois, comme agent de déprotection permettant l'élimination du groupement protecteur t-Boc et, comme agent de protonation de la fonction amine ainsi libérée. Il est obtenu par addition d'une solution d'acide chlorhydrique (12M) sur de l'acide sulfurique concentré. Les (co)polymères comportant les fonctions amines protégées sont solubilisés dans de l'acétate d'éthyle (30 ml) et sont placés sous un courant de HCI gazeux. Après quelques minutes, les copolymères précipitent dans l'acétate d'éthyle. Ce phénomène est caractéristique de la perte des groupements t-Boc qui assuraient jusqu'alors aux (co)polymères leur solubilité dans la plupart des solvants organiques (THF, éthers...). Le produit final est alors isolé par filtration, solubilisé dans un petit volume d'eau distillé (15 ml), puis lyophilisé. Exemple 7 : Préparation du polymère P(HCI,AEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant du monomère de l'exemple 1. Tableau 1 Référence Masse totale du % massique Mw (g/mol) monomère (g) d'amorceur (I.p) 72. 000 7a 0,5 1,0 (2,6) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C pendant 24 h. Le monomère est dissous dans 3 ml de solvant et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous forme d'une solution dans 1 ml de solvant. Exemple 8 : Préparation de P(HCI,AlaEMA) On utilise le mode opératoire décrit précédemment, en partant du monomère de l'exemple 2. Tableau 2 Référence Masse totale du % massique Mw (g/mol) monomère (g) d'amorceur (I.p) 32. 600 8a 1,0 1,0 (3,9) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 24 h. Le monomère est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 9 : Préparation de P(HCI,AEMAA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant du monomère de l'exemple 3. Tableau 3 Référence Masse totale du % massique Mw (g/mol) monomère (g) d'amorceur (I.p) 8. 100 9a 1,3 1,0 (2,5) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 24 h. Le monomère est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 10 : Préparation de P(HCI,diAPMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant du monomère de l'exemple 4a. Tableau 4 Référence Masse totale du % massique Mw (g/mol) monomère (g) d'amorceur (I.p) 43. 000 10a 1,0 1,0 (3,3) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant le percarbonate de cyclohexyle comme amorceur, à 40 C, pendant 24 h. Le monomère est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 11 : Préparation de P(HCI,OrnEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant du monomère de l'exemple 5. Tableau 5 Référence Masse totale du % massique Mw (g/mol) monomère (g) d'amorceur (I.p) 0,5 1,0 27.800 11a 0,5 1,0 (3,1) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 20 h. Le monomère est dissous dans 3 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 12 : Préparation de P(HCI,OrnEMA-r-HCI,AEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant des monomères des exemples 1 et 5. Tableau 6 % molaire , , Masse totale des % massique Mw (g/mol) Référence HCI,OrnEMA/ monomères (g) HCI, AEMA d'amorceur (I.p) 48.900 12a 0,7 20/80 0,5 (2,4) 42. 900 12b 0,7 50/50 0,5 (2,4) 36. 900 12c 0,7 80/20 0,5 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~')~~~ La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 20 h. Les monomères sont dissous dans 1 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 13 : Préparation de P(HCI,OrnEMA-r-HCI,AEMAA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant des monomères des exemples 3 et 5. Tableau 7 Masse totale des % molaire % massique Mw (g/mol) Référence HCI,OrnEMA/ monomères (g) $HCl,AEMAA d'amorceur (I.p) 77. 800 12a 0,7 20/80 0,5 (3,5) 66. 400 12b 0,7 50/50 0,5 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~\,-3j~~~ 54. 800 12c 0,7 80/20 0,5 (2,7) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 20 h. Les monomères sont dissous dans 1 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. Exemple 14 :Préparation de P(HCI,AlaEMA-r-HCI,AEMA) On utilise le mode opératoire décrit plus haut, en partant des monomères des exemples 1 et 2. Tableau 8 % molaire Masse totale des % massique Mw (g/mol) Référence HCl,AlaEMA/ monomères (g) HCI AEMA d amorceur (I.p) 55. 500 12a 0,7 20/80 0,5 68. 300 12b 0,7 50/50 0,5 (2,6) 72. 600 12c 0,7 80/20 0,5 (2,8) La polymérisation est conduite dans le THF en utilisant l'AIBN comme amorceur, à 60 C, pendant 20 h. Les monomères sont dissous dans 1 ml de THF et l'amorceur est introduit dans le milieu de polymérisation sous la forme d'une solution de 1 ml de THF. IV - Transfections in vitro en présence de polymères cationiques Plusieurs polymères cationiques selon l'invention ont été testés en tant qu'agents de transfection. Les essais ont été réalisés par transfection de cellules BHK-21 (fibroblastes) et/ou SRDC (lignée de cellules dendritiques spléniques murines dont l'obtention est détaillée dans le paragraphe b/ ci-après) avec le plasmide pCMV-Luc (7,1 kb), contenant le gène codant pour la protéine luciférase. Les expériences de transfection sont menées avec des complexes de rapports molaires N/P variables (N, azote provenant du copolymère et P, phosphate provenant de l'ADN). Pour tous ces rapports, l'estimation de l'efficacité de transfection est directement réalisée par mesure de l'activité luciférase. Une estimation de la viabilité cellulaire est conjointement menée. a/ Production du plasmide pCMV-Luc Le plasmide pCMV-Luc, non disponible dans le commerce, a nécessité une étape de construction moléculaire. Ainsi, il a été obtenu par insertion du gène Luc dans le plasmide pCMV (Invitrogen), selon un protocole habituellement utilisé dans la littérature (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1987, Chapter 1). En pratique, la ligation du vecteur et de l'insert a en premier lieu été effectuée, puis des bactéries compétentes ont été préparées et la transformation a été mise en oeuvre {Le. les bactéries ont été soumises à un choc thermique). Des clones de bactéries recombinantes E.coli DH5a, porteuses du plasmide pCMV-Luc, résistantes à l'ampicilline (préalablement étalées sur boîtes de Pétri contenant du milieu LB agar et de l'ampicilline) sont incubés environ 8 h à 37 C sous agitation en milieu LB contenant de l'ampicilline. Cette pré-culture est ensuite incubée une nuit à 37 C sous agitation dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Après centrifugation des cultures, les culots bactériens contenant les plasmides sont traités selon le protocole décrit par Qiagen, fournisseur des colonnes échangeuses d'ions (EndoFree Plasmid Giga, Qiagen GmbH, Allemagne) nécessaires à la purification des plasmides. L'intégrité du plasmide pCMV-Luc produit a été analysée sur un gel d'agarose 1% (Tris-Acetate-EDTA 1X) avant et après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI (linéarisation des plasmides). La qualité des ADN (contamination protéique...) est analysée par l'évaluation du rapport D026o/D028o et leur quantité est également déterminée par spectrophotométrie UV (260 nm). b/ Culture cellulaire b.l/ Lignée BHK-21 La lignée BHK-21, issue de rein de hamster syrien (ATCC, CCL-10) est mise en culture en milieu BHK-21 (Gibco BRL) contenant 2% de tryptose phosphate, 1% de pénicilline/streptomycine et 5% de sérum de veau foetal (SVF). 24 h avant les expériences de transfection, les cellules sont réparties dans des puits de plaques de 24 puits sous 1 ml de milieu de culture, à raison de 7,5.104 cellules/puits. Les cellules sont mises en culture à 37 C dans une étuve à 5% de CO2 jusqu'à 60 à 70% de confluence. b.2/ Lignée de cellules dendritiques SRDC Les cellules dendritiques sont obtenues à partir des rates de 15 souris CBA/J (H2k) âgées de 8 semaines. Elles sont purifiées et mises en culture selon la procédure décrite par Iwasaki et Kelsall (J. Exp. Med., 190 (2), 229-239,1999) appliquée aux cellules dendritiques des plaques de Peyer. Après 1 mois de culture, certaines cellules représentant une très faible proportion cellulaire survivent et se mettent à proliférer. Ces cellules spontanément immortalisées sont cultivées en milieu IMDM complet : IMDM (Gibco BRL) complété avec 5% de sérum de veau foetal décomplémenté et filtré (filtre de porosité 0,22 m), 2 mM L-glutamine (Gibco BRL), 50 pm 3-mercaptoéthanol (SIGMA), 100 unités/ml pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine (SIGMA). Ces cellules immortalisées sont incubées à 4 C pendant 30 min avec des billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CDllc (clone N418) (MILTENYL BIOTECH), marqueur spécifique des cellules dendritiques. Les cellules exprimant l'antigène CDllc en surface sont sélectionnées sur des colonnes MACS (MILTENYL BIOTECH) à l'aide d'aimants et mises en culture dans du milieu IMDM complet, et clonées par deux dilutions successives à 0,1 cellule/puits dans des plaques de culture de 96 puits (CORNING). Dans ces conditions, 15 clones ont été obtenus. Les clones ont été analysés par cytométrie en flux pour vérifier l'expression du marqueur CDllc et rechercher l'expression d'autres marqueurs, tels que Mac-1, Mac-3, DEC205 (spécifique des cellules dendritiques)... Les résultats de cette analyse ont abouti à la sélection d'un clone, dénommé ci-après SRDC. 24 h avant les expériences de transfection, les cellules SRDC sont réparties dans les puits de plaques de 6 puits sous 2 ml de milieu de culture, à raison de 7,5.105 cellules/puits. Les cellules sont mises en culture à 37 C dans une étuve contenant 5% de CO2. c/ Préparation des polymères Les différents polymères lyophilisés sont mis en solution dans un tampon HBS (Hepes Buffered Saline, contenant 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,4) à une concentration de 2 mg/ml. Dans certains cas, une sonication de 3 à 5 min (300 UltraSonik, NEY) peut être nécessaire pour une dissolution complète. Les solutions sont ensuite stérilisées par filtration sur des filtres de porosité 0,22 m. d/ Protocole de transfection d.1/ Cellules BHK-21 Le milieu de transfection est un milieu Optimem 1 (Gibco BRL). Les complexes ADN/polymère cationique sont préparés par ajout de différentes quantités de polymères à 1 g de plasmide. Selon le cas considéré, les solutions stocks de polymères sont diluées en HBS pour obtenir des solutions de concentrations appropriées. La formation des complexes s'effectue en mélangeant et en incubant à température ambiante pendant 30 min, 125 l de solution de polymère à différentes concentrations et 125 l de solution de plasmide (20 g/ml) de manière à obtenir des rapports N/P variables. Ensuite, 100 l de la solution de complexe sont répartis sur les cellules mises en culture la veille et préalablement rincées avec du milieu Optimem 1, puis incubées avec 150 l d'Optimem 1. L'incubation est poursuivie pendant 4 h à 37 C (dans une étuve contenant 5% de COz). Le milieu de transfection est ensuite éliminé et remplacé par 1 ml de milieu de culture complet. Les cellules sont à nouveau mises en culture pendant 24 h. Toutes les expériences de transfection sont réalisées en 2 séries identiques sur 2 plaques de 24 puits différentes, l'une permettant l'estimation de l'expression du gène rapporteur, l'autre étant réservée à la détermination des effets cytotoxiques des complexes. Sur chaque plaque, un puits de cellules est réservé au contrôle. Il s'agit de cellules BHK-21 ne subissant pas de transfection, elles sont uniquement au contact de milieu Optimem 1 et de milieu de culture complet. d.2/ Cellules SRDC Le milieu de transfection est un milieu Optimem 1 (Gibco BRL). Les complexes ADN/polymère cationique sont préparés par ajout de différentes quantités de polymères à 1,5 g de plasmide pCMV-Luc. Des essais de transfections avec des agents de transfection commerciaux Lipofectamine (Gibco BRL) et DOTAP (Boehringer Mannheim) ont été réalisés en parallèle en suivant les recommandations du fournisseur. Dans le cas du DOTAP, la formation du complexe est effectuée en milieu HBS au lieu du milieu Optimem 1. La formation des complexes ADN/polymère cationique s'effectue en mélangeant et en incubant à température ambiante pendant 30 min, 100 l de solution de polymère et 100 l de solution de plasmide. Le mélange (200 l) est réparti sur les cellules mises en culture la veille et préalablement rincées avec 1 ml de milieu Optimem 1, puis incubées avec 800 l d'Optimem 1. L'incubation est poursuivie pendant 4 h à 37 C (dans une étuve contenant 5% de 002). Le milieu de transfection est ensuite éliminé et remplacé par 2 ml de milieu de culture complet. Les cellules SRDC sont mises en culture dans ces conditions pendant 36 h. e/ Evaluation de la cytotoxicité des complexes polymère cationique/ADN et détermination quantitative de l'activité luciférase Pour déterminer l'effet cytotoxique des complexes polymère cationique/ADN, le nombre de cellules vivantes est évalué à l'aide d'un test colorimétrique MTT (T. Mosmann, J. Immunol. Meth., 1983,65, 55-63). D'autre part, le kit GeneLux (PerkinElmer, Réf. L002-100) est utilisé pour le dosage de l'activité luciférase. e.l/ Test colorimétrique MTT 24 h après la transfection, le milieu de culture est remplacé par du milieu DMEM (sans SVF) (500 l par puits). 50 l de MTT de concentration 5 mg/ml (en PBS 1X), stérile (filtration sur filtre de porosité 0,22 m) sont ajoutés dans chaque puits pour atteindre une concentration finale de 0,5 mg MTT/m La plaque est incubée pendant 2 h à 37 C (5% de CO2). Le "milieu MTT" est ensuite éliminé doucement et 200 l par puits de DMSO stérile (ACROS ORGANICS) sont déposés sur les cellules afin de dissoudre les cristaux de formazan formés. La plaque est agitée doucement pendant quelques minutes pour assurer la dissolution totale des cristaux de formazan. 50 l par puits sont prélevés et déposés dans les puits d'une plaque de 96 puits. La lecture de la DO s'effectue ensuite à 540 nm (utilisation d'un lecteur de plaques ELISA, Wallac VICTOR). Une dilution des échantillons dans le DMSO ou dans l'eau distillée (1/4 ou 1/8) est souvent nécessaire afin d'observer des valeurs de DO proches de 1. Le pourcentage de cellules vivantes est calculé selon la formule : Cellules vivantes (%) = (DO 540 (échantillon) / DO 540 (contrôle)) X 100 où DO 540 (échantillon) représente la mesure des cellules transfectées avec les différents complexes polymère cationique/ADN et DO 540 (contrôle) représente la mesure des cellules non transfectées, ayant été uniquement au contact du milieu de transfection (Optimem 1) et du milieu complet de culture. La DO lue est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. e. 2/ Détermination de l'activité luciférase Cas des cellules BHK-21 24 h après la transfection, le milieu de culture est éliminé. 100 l de tampon de lyse (1 X) sont ajoutés aux cellules. Après 5 min d'incubation à température ambiante, 20 l d'échantillon sont transférés dans une plaque de 96 puits noire à fond blanc (PerkinElmer, Réf. 1450-581). Dans chaque puits, 50 l de réactif luciférine puis 50 l de réactif ATP sont ajoutés. L'émission de lumière émise est mesurée à l'aide d'un luminomètre (Wallac VICTOR), la durée d'une mesure étant fixée à 10 s. Les résultats sont exprimés en RLU ("Relative Light Unit") pour une prise d'essai de 20 l de lysat cellulaire. Afin d'exprimer ces résultats par rapport à la quantité de protéine extraite, un dosage BCA (SIGMA) est effectué. Cas des cellules SRDC 36 h après la transfection, le surnageant de culture est éliminé. Les cellules dendritiques adhérentes sont récupérées par grattage, lavées dans 1 ml de PBS puis centrifugées 5 min à 400 g. Après élimination des surnageants, le culot cellulaire est repris dans 150 l de tampon de lyse additionné de 150 l d'eau. Après 15 min d'incubation à température ambiante, 20 l d'échantillon sont transférés dans une plaque de 96 puits noire à fond blanc (PerkinElmer, Réf. 1450-581). Dans chaque puits, 50 l de réactif luciférine puis 50 l de réactif ATP sont ajoutés. L'émission de lumière émise est mesurée à l'aide d'un luminomètre (Wallac VICTOR), la durée d'une mesure étant fixée à 10 s. Les résultats sont exprimés en RLU pour une prise d'essai de 20 l de lysat cellulaire. Les résultats sont comparés à un témoin négatif constitué de cellules SRDC incubées en présence de 1,5 g de plasmide pCMV-Luc. f/ Dosage protéique (BCA) Pour la détermination de la quantité de protéines présente dans les cellules BHK-21 lysées, préalablement transfectées avec différents complexes polymères cationiques/plasmide pCMV-Luc, le kit "Bicinchoninic acid protein assay" (SIGMA, BCA-1) a été mis en oeuvre. Le dosage des échantillons a été effectué selon les instructions du fournisseur. g/ Résultats g.l/ Cellules BHK-21 Pour tous les essais de transfection de cellules BHK-21, un contrôle positif de transfection est systématiquement introduit. Ce dernier est constitué de cellules transfectées avec un complexe PEI/ADN, la PEI étant la polyéthylèneimine branchée 25 kDa (Aldrich). Ce polymère cationique est parfaitement décrit dans la littérature pour son pouvoir de transfection élevé (W. T. Godbey et al., J. Control. Release 1999,60, 149-160 ; A. Kichler et al., J. Gene Med 2001,3, 135-144). Des expériences préliminaires de transfection avaient montré qu'avec un rapport N/P de 10 une efficacité de transfection élevée était obtenue. Les deux tableaux suivants représentent l'activité luciférase et le pourcentage de cellules vivantes à différents rapports N/P, pour les polymères cationiques AEMA et AEMAA des exemples 7 et 9. Tableau 9 Agent de N/P Quantité d'agent RLU/mg de Cellules vivantes transfection de transfection protéines (%) ( g/puits) 7a 1 1,24 2,0.104 100 7a 2 2,48 6,3.105 100 7a 3 3,72 8,5.105 100 7a 4 4,96 4,3.105 100 7a 5 6,20 3,4.105 100 7a 6 7,45 5,1.105 86 PEI 10 1,30 3,2.107 55 Tableau 10 Agent de N/P Quantité d'agent RLU/mg de Cellules vivantes transfection de transfection protéines (%) ( g/puits) 9a 1 1,23 1,8.104 100 9a 2 2,47 2,3.106 100 9a 3 3,70 2,5.106 100 9a 4 4,93 3,0.106 100 9a 5 6 17 8,2.106 80 9a 6 7,40 1,4.10' 100 9a 7 8,63 1,8.107 80 PEI 10 1,30 5,6.107 65 Au vu des résultats obtenus, il apparaît clairement que les polymères cationiques selon l'invention présentent des propriétés de transfectants. Ils permettent en effet de transfecter efficacement les cellules BHK-21 et de plus sont très peu toxiques vis-à-vis des cellules aux rapports N/P les plus favorables en terme de transfection. En revanche, le contrôle positif PEI, bien qu'étant un très bon agent de transfection, présente l'inconvénient d'être fortement toxique envers les cellules. A toxicité égale (90 - 100% de cellules vivantes), il a été démontré (résultats non reportés) que le pouvoir de transfection des polymères cationiques selon l'invention, pouvait être jusqu'à 100 fois supérieur à celui de la PEI (en particulier pour le polymère composé de AEMAA). g.2/ Cellules SRDC Le tableau 11 récapitule les conditions de transfection mises en #uvre. Tableau 11 Agent de Quantité d'agent de N/P transfection transfection ( g/puits) 9a 2,5 2,5 8a 45,0 48,0 Lipofectamine 11,3 20,0 DOTAP 1,4 5,0 Les résultats de transfection sont présentés sur la figure 1. Ils montrent que contrairement aux agents de transfection commerciaux, Lipofectamine et DOTAP, les deux polymères testés sont capables de transfecter des cellules dendritiques, en particulier le polymère 9a, à base de AEMAA. REVENDICATIONS 1. Polymère ou copolymère cationique, caractérisé en ce qu'il est essentiellement formé à partir d'un ou plusieurs monomères répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : - Ri est H ou un Cl-C4 alkyle ; - n est zéro ou un ; - X est -0-C(O)-, -C(0)-0-, -NH-,-C(O)-NH- ou -NH-C(O)- ; - Sp est un groupe espaceur tel que -(CH2)m- ou -(CH2)m-O-(CH2)I-; ou n'existe pas ; - m et I, identiques ou différents, représentent un entier de 1 à 4 ; - Y est -O-C(O)-, -C(0)-0-, -NH-,-C(0)-NH- ou -NH-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement (Cl-C6) alkyle linéaire ou ramifié substitué par au moins une fonction amine primaire, secondaire ou tertiaire, protégée ou non par un groupement protecteur ou sous forme protonée. 2. Polymère ou copolymère cationique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est essentiellement formé à partir d'un ou plusieurs monomères répondant à la formule (I) précitée dans laquelle : - Ri est H ou méthyle, de préférence méthyle ; - n est zéro ou un, de préférence zéro ; - X est -C(O)-O- ou -C(O)-NH- ; - Sp est un groupe espaceur choisi parmi -CH2- et -(CH2)2-, ou n'existe pas ; - Y est -O-C(O)- ou n'existe pas ; - R2 est un groupement -CH2-NH2, -CH(CH3)-NH2, -CH(CH2-NH2)2 ou CH(NH2)-(CH2)3-NH2, dont les fonctions amines sont protégées ou non par un groupement protecteur tel que le groupement tert-butyloxycarbonyle. 3. Polymère ou copolymère cationique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est essentiellement formé d'un ou plusieurs monomères répondant à l'une des formules suivantes : 4. Polymère ou copolymère cationique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est essentiellement formé à partir d'un ou plusieurs monomères de formule (I) répondant à l'une des formules (II), (III) et (IV) suivantes : O Me O /## Hic ) ' H2N 00 O H2N O 5. Utilisation d'un polymère ou copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la vectorisation d'au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite (lesdites) biomolécule(s) est (sont) constituée (s) de matériel génétique tel que de l'ADN, de l'ARN et/ou de leurs fragments (oligonucléotides), de protéines, de peptides naturels ou synthétiques. 7. Complexe comprenant au moins un polymère ou copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et au moins une biomolécule naturelle ou synthétique, de préférence chargée négativement. 8. Complexe selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite(lesdites) biomolécule(s) est (sont) constituée (s) de matériel génétique tel que l'ADN, l'ARN et/ou leurs fragments (oligonucléotides), de protéines, de peptides naturels ou synthétiques.