Brevet FR2859219A1 — publié le 20050304

La présente invention concerne un procédé de production de neurones à partir de cellules d'une lignée cellulaire apte à se différencier pour produire notamment des neurones, dans lequel: on cultive lesdites cellules en sphères, en les exposant à des facteurs de croissance, tels que, par exemple, EGF (epidermal growth factor) et/ou bFGF (basic fibroblast growth factor), dans un milieu de croissance, on induit la différenciation desdites sphères en les étalant sur un substrat adhésif, après élimination des facteurs de croissance EGF et/ou bFGF, et en les cultivant dans le milieu de croissance pendant un laps de temps approprié. De nombreux laboratoires de recherches travaillent à l'heure actuelle à la mise au point de techniques visant à permettre à la fois la compréhension et la maîtrise de l'architecture cellulaire du système nerveux central et périphérique, surtout à des fins thérapeutiques, mais aussi plus simplement dans le but d'obtenir des modèles utiles pour l'évolution de la recherche. Ainsi, le développement des procédés de production de neurones s'inscrit notamment dans les projets de mise au point de thérapies cellulaires qui, avec la greffe de cellules souches pluripotentes et progénitrices, représentent une alternative prometteuse permettant d'envisager le remplacement d'éventuelles cellules détruites de la moelle épinière et du cerveau et recréer un environnement propice à la régénération nerveuse. Maîtriser la production de neurones représente par conséquent un espoir de guérison pour de nombreux malades souffrant de lésions de la moelle épinière, ou de maladies neurodégénératives, dont les conséquences les plus manifestes se caractérisent par des disfonctionnements de la transmission des signaux nerveux envoyés par le cerveau aux structures périphériques, pouvant aboutir, dans les cas extrêmes, à des paralysies accompagnées de déficit sensoriel. Par ailleurs, le fait de pouvoir disposer de neurones humains de synthèse peut également favoriser notablement la conduite d'études menées in vitro sur des molécules d'intérêt thérapeutique, et permet d'envisager un modèle avantageux dans le cadre de la recherche des gènes importants pour le développement du système nerveux central et périphérique. Une des techniques employées actuellement pour produire des neurones repose sur la propriété de multipotence des cellules souches neurales, lesquelles sont amenées, après une phase de culture en présence de facteurs de croissance conduisant à des agrégats sphériques, à se différencier en neurones et glie par adhésion sur un support et élimination des facteurs de croissance. Bien que les cellules souches neurales soient considérées comme avantageuses du fait de leur absence de risques cancérigènes, et qu'elles font aujourd'hui l'objet de nombreux travaux de recherches, cette technique n'offre cependant encore que des perspectives restreintes, car la différenciation de ces cellules ne conduit presque exclusivement qu'à la production de cellules gliales, c'est à dire d'astrocytes et d'oligodendrocytes, au détriment de la production de neurones qui ne représentent que 1 à 5% de l'ensemble des cellules obtenues. Un rendement aussi faible ne permet évidemment pas 25 d'envisager une réimplantation de neurones sur une éventuelle lésion. Un autre procédé connu consiste encore à obtenir des neurones en provoquant la différenciation des cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains (NT2) en les traitant à l'acide rétinoïque. De manière connue, cette lignée cellulaire NT2 conduit ainsi à la production de 5% de neurones matures post-mitotiques, dont une succession de réensemencements dans des conditions spécifiques permet au final la purification à 99% de neurones NT2-N. Cette technique de production de neurones est cependant longue, fastidieuse et présente l'inconvénient d'une perte importante de matériel au cours des différents réensemencements. En outre, le traitement à l'acide rétinoïque suppose l'utilisation de sérum bovin, comportant pour certaines applications un risque potentiel d'encéphalite spongiforme bovine, ou d'hépatite. C'est en recherchant des solutions aptes à pallier à ces divers inconvénients que les inventeurs du présent procédé ont constaté qu'en appliquant aux cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains des conditions proches de celles utilisées pour la différenciation des cellules souches neurales, il était possible de manière tout à fait inattendue et étonnante de produire un pourcentage particulièrement important de neurones, sans perte de matériel, et en toute sécurité, car la solution envisagée ne suppose plus l'emploi de sérum bovin. En conséquence, la présente invention constitue maintenant une solution concrète pour les différentes applications exposées précédemment, et permet donc d'envisager sérieusement leur développement. En fait, l'invention vise en général un procédé de production de neurones à partir de cellules d'une lignée cellulaire apte à se différencier pour produire notamment des neurones, dans lequel: - on cultive lesdites cellules en sphères, de préférence en les exposant à des facteurs de croissance, tels que, par exemple, EGF (epidermal growth factor) et/ou bFGF (basic fibroblast growth factor), dans un milieu de croissance, - on induit la différenciation desdites sphères en les étalant sur un substrat adhésif, après élimination des facteurs de croissance EGF et/ou bFGF, et en les cultivant dans le milieu de croissance pendant un laps de temps approprié. caractérisé en ce que l'on utilise les cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains NT2. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel, le présent procédé se caractérise en ce que pour cultiver les cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains (NT2) en sphères: on dissocie des cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains (NT2) cultivées en monocouches avec une solution de trypsine/EDTA, - on ensemence les cellules NT2, une fois dissociées, à 100 000 cellules/ml dans des récipients contenant le milieu de croissance, auquel est rajouté extemporanément le facteur de croissance EGF et/ou le facteur de croissance bFGF, - on les laisse proliférer pendant une période d'au moins 15 sept jours. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé considéré, l'on utilise un milieu de croissance défini et dépourvu de sérum bovin. Une caractéristique additionnelle du présent procédé suppose que l'on renouvelle régulièrement une fraction du milieu de croissance au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères. Ceci est de préférence réalisé par le fait que l'on renouvelle tous les trois à quatre jours 70% du milieu de 25 croissance. Une autre caractéristique dudit procédé est par ailleurs définie par le fait qu'au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères, l'on soumet régulièrement celles flottant à la surface du milieu de croissance à une centrifugation, et on les repique par dissociation mécanique, effectuée, par exemple, à l'aide d'une pipette Pasteur effilée. Il a pu être constaté que de manière tout à fait avantageuse, les présentes conditions permettaient d'ensemencer les sphères NT2 plus de 6 fois sur une période de 60 jours, sans perte de matériel. Une autre spécificité du présent procédé est encore définie par le fait que pour induire la différenciation des sphères NT2, l'on utilise de la poly-D-lysine (PDL) en tant que substrat apte à faire adhérer les sphères de cellules NT2. D'autre part, selon un mode de mise en oeuvre envisageable pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on étale ces dernières sur le substrat adhésif sans les dissocier au préalable. Dans ce cas de figure, le procédé prévoit d'étaler les sphères de cellules NT2 non dissociées à 50 000 - 100 000 cellules/cm2 en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote. Selon un autre mode de mise en oeuvre, pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on dissocie au préalable les sphères de cellules NT2 à l'état de cellules uniques avant de les étaler sur le substrat adhésif. De préférence, le procédé prévoit alors d'opérer la dissociation des sphères de cellules NT2 en les incubant pendant quelques minutes dans une solution de trypsine/EDTA puis en les exposant à une solution contenant 2mM de CaCl2, 0,01% de Dnase 1 et 0,5% d'inhibiteur de trypsine. Une caractéristique supplémentaire consiste encore à étaler les sphères de cellules NT2 une fois dissociées à 250 000 cellules/cm2 sur le substrat adhésif, en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote. Par ailleurs, le présent procédé se caractérise également en ce que lors de la phase de différenciation des sphères NT2, l'on cultive ces dernières pendant au moins dix jours. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre se rapportant à un exemple de réalisation donné à titre d'exemple indicatif et non limitatif. La compréhension de cette description sera facilitée au vu des dessins joints en annexe dans lesquels: - les figures 1 et 2 correspondent à des photographies en contraste de phase illustrant l'évolution des cellules NT2 au fil du déroulement du présent procédé, - la figure 3 représente des résultats d'études relatives à la réponse des cellules NT2 aux facteurs de croissance FGF et bFGF, - la figure 4 représente une photographie en contraste de phase de sphères NT2 différenciées, - les figures 5 et 6 représentent des résultats d'analyses d'immunofluorescence effectuées sur les sphères NT2 différenciées, - la figure 7 représente un western-blot montrant, sur les sphères NT2 différenciées, l'expression d'un marqueur spécifique des neurones, la 133 tubuline. L'invention concerne le domaine de la neurologie et propose un nouveau procédé de synthèse de neurones, dans lequel des cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains NT2 sont cultivées en agrégats sphériques puis amenées à se différencier en neurones par adhésion sur un substrat. Lors de la mise en oeuvre du présent procédé, des cellules de la lignée cellulaire NT2 sont d'abord cultivées de manière classique, en monocouches, dans des flacons à bouchons filtrants contenant un milieu de croissance Opti-MEM (marque déposée par la société Life Technologies) complété par 5% de sérum de veau foetal, et 5pg/ml de Gentamicine (marque déposée par la société Gibco BRL) à 37 C. Afin d'entretenir la lignée, les cellules cultivées en monocouches sont dissociées deux fois par semaine à l'état de cellules uniques avec une solution de trypsine/EDTA à 0,25% et repiquées au tiers. Pour cultiver les cellules NT2 en sphères, conformément au présent procédé, les cellules NT2 cultivées en monocouches sont récupérées et dissociées avec la solution de trypsine/EDTA. Cette étape permet d'obtenir le premier passage en sphères des cellules NT2 qui sont ensuite ensemencées de préférence à 000 cellules/ml dans des récipients contenant un milieu de croissance (NS) dépourvu de sérum bovin, défini par la composition suivante: DMEF/F12 (50%/50%), 2mM de glutamine, du complément N2, 0,6% de glucose, 20}ig/ml d'insuline, et auquel sont rajoutés extemporanément les facteurs de croissance EGF à 20ng/ml, bFGF à lOng/ml, et 2pg/ml d'héparine. Dans ces cultures, visibles à la figure 1, les cellules dissociées en cellules uniques adhérent faiblement au support plastique des récipients de culture. Au bout de 2 jours, les cellules forment de petits agrégats sphériques qui se détachent du plastique et flottent en suspension dans le milieu de croissance NS, tel que visible à la figure 2. Ces sphères continuent à augmenter en taille et en nombre pendant 7 à 10 jours, et, pour l'entretien de la lignée, celles d'entre elles flottant à la surface du milieu de croissance NS sont centrifugées une fois par semaine et repiquées par dissociation mécanique effectuée au moyen d'une pipette pasteur effilée, à raison de 10 à 12 aller-retours. Dans ces conditions, les cellules ont été ensemencées plus de 6 fois sur une période de 60 jours, en rajoutant des facteurs de croissance, ou en remplaçant le milieu de croissance NS, préférentiellement tous les trois à quatre jours à hauteur de 70%. La manière dont les cellules NT2 répondent aux facteurs de croissance EGF et bFGF a été étudiée en comptant les cellules sphériques viables obtenues après trois jours de culture en présence soit de l'un ou l'autre, soit de l'un et l'autre d'entre eux, puis dissociées. Les résultats représentés à la figure 3, montrent le nombre de cellules viables après trois jours, tandis que la ligne horizontale indique la densité d'ensemencement. Bien qu'il a pu être observé, de manière inattendue, que les cellules NT2 étaient capables de former des sphères en l'absence de facteurs de croissance, elles prolifèrent néanmoins de façon différente sous l'effet de ces derniers, et en fonction du type de facteurs de croissance ajouté au milieu de croissance NS. Ainsi, l'on constate qu'en présence uniquement du facteur de croissance EGF, le taux de prolifération des cellules NT2 est multiplié par 1,5 par rapport aux contrôles correspondant à des cultures sans facteurs de croissance. Ce taux est multiplié par 2,2 en présence du facteur de croissance bFGF seul, tandis que la présence conjointe des deux facteurs ne montre pas d'effet additionnel. Selon le présent procédé, pour réaliser la différenciation des sphères NT2, les milieux des récipients contenant les sphères NT2 sont centrifugés après 7 à 10 jours de prolifération, puis les culots sont lavés deux fois par du PBS (phosphate-buffered saline) afin d'éliminer toute trace de facteurs de croissance EGF et bFGF. Les cellules non dissociées sont ensuite réparties à 50 000 - 100 000 cellules/cm2 soit sur des plaques 24 puits contenant des lamelles recouvertes avec de la poly-D-lysine à 40 g/ml, soit sur des boîtes de culture de 15mm de diamètre recouvertes de poly-D-lysine à 40 g/ml. Elle sont cultivées dans ces conditions pendant 10 jours sans changement de milieu. Selon une autre alternative destinée à permettre une évaluation précise du pourcentage de cellules différenciées, les sphères NT2 sont soumises à une dissociation à l'état de cellules uniques, par une solution de trypsine/EDTA en présence de 2mM de CaC12, 0,01% de Dnase 1 et 0,5% d'inhibiteur de trypsine, avant d'être étalées sur des plaques 24 puits contenant des lamelles recouvertes par de la poly-D-lysine. En traitant les sphères NT2 de cette manière, l'on observe qu'elles se différencient spontanément après le retrait des facteurs de croissance, et adhésion sur la poly-D-lysine. Cette dernière s'effectue en moins de 24 heures et s'accompagne de l'apparition de deux types cellulaires qui quittent les sphères. Au bout de 10 jours de différenciation, les différentes morphologies visibles à la figure 4 apparaissent, d'une part des cellules plates et grosses, et d'autre part des cellules neuronales plus petites, bipolaires. Des études ont également été menées pour vérifier les caractéristiques de multipotence des sphères NT2, et la présence de cellules neuronales après différenciation. Ainsi, l'expression des marqueurs spécifiques des neurones (133 tubuline, Map2ab), des oligodendrocytes(04) et des astrocytes (GFAP) a été étudiée par immunofluorescence, effectuée sur les sphères NT2 différenciées. Cette analyse a consisté, après perméabilisation et blocage par du PBS (phosphate buffered saline) contenant 0,5% de BSA, 0,1% de Triton X100 et 5% de sérum de chèvre (tampon de blocage), à incuber les sphères NT2 cultivées sur les lamelles recouvertes de poly-D-lysine, toute une nuit avec un premier anticorps dilué dans le tampon de blocage, puis avec un second anticorps pendant 2 heures. En outre, les noyaux ont été marqués au Hoechst (Sigma) 20 pendant 15 minutes à température ambiante. Les résultats obtenus montrent qu'à 10 jours de différenciation, 30 à 50% des cellules sont g3 tubuline (figure 5), ou Map2ab positives (figure 6), et qu'à ce stade, aucune cellule n'exprime 04 et GFAP. L'expression de certains neurotransmetteurs a également été étudiée par immunofluorescence, et a montré que le GABA est le neurotransmetteur majoritaire, suivi de la dopamine et de la sérotonine. Tous ces résultats montrent par conséquent que le procédé selon l'invention conduit à la production exclusive de neurones, contrairement à la technique basée sur l'utilisation de cellules souches neurales, et qu'en plus cette production donne lieu à une grande quantité de neurones, contrairement à la méthode qui consiste à traiter les cellules NT2 à l'acide rétinoïque. Par ailleurs, les sphères NT2 présentant l'avantage de pouvoir être dissociées pendant plus de deux mois, il a également été vérifié qu'au cours des passages successifs, elles conservaient la même capacité à se différencier en neurones. Pour cela, les protéines totales des sphères NT2 différenciées ont été extraites à chaque passage, et l'expression de la 83 tubuline a été étudiée à ces stades par western-blot. Pour cela, les sphères NT2 cultivées dans les boîtes recouvertes de polyD-lysine sont d'abord grattées dans du PBS (phosphate buffered saline) et centrifugées pour récupérer un culot. Les protéines sont dosées par la méthode de Bradford 15 (BioRad), et 20pg de protéines totales sont déposées sur un gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate à 8%. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de PVDF (BioRad) par la technique de transfert semi-sec. Les sites non spécifiques sont saturés par du tampon 20 phosphate PBS contenant 5% de lait Gloria, et 0,1% de Tween20 (BioRad), pendant 2 heures à température ambiante. L'incubation avec l'anticorps anti 83 tubuline dilué est réalisée pendant toute la nuit à 4 C. Après lavage de la membrane, celle-ci est encore incubée 25 pendant 2 heures avec le second anticorps couplé à la peroxydase. Finalement, la révélation est réalisée par la technique d'ECL (Enhanced chimio-luminescence, Amersham Pharmacia Biotech) Les résultats, visibles à la figure 7, montrent que l'expression de ce marqueur neuronal est toujours très forte, du premier au cinquième passage, ce qui correspond à une période qui s'étend sur plus de deux mois, et par conséquent que les sphères NT2 ne présentent aucune perte de leur potentialité de différenciation neuronale au fil des dissociations. Ainsi qu'il ressort clairement de ce qui précède, le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisées classiquement pour produire des neurones. Les cellules NT2 cultivées en sphères permettent de produire un taux important de neurones, et constituent un modèle particulièrement avantageux pour étudier le développement précoce du système nerveux central humain et la neurogenèse. D'autre part, du fait de l'absence de sérum bovin au cours du procédé, elles constituent également une solution extrêmement prometteuse permettant d'envisager en toute sécurité la transplantation de précurseurs neuronaux humains fondamentaux dans de nombreuses pathologies, notamment les maladies neurodégénératives, les accidents vasculaires cérébraux, les traumatismes de la moelle épinière et du système nerveux, ou les pathologies de la rétine. Bien que l'invention ait été décrite à propos d'une forme de réalisation particulière, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut y apporter diverses modifications de formes, de matériaux et de combinaisons de ces divers éléments sans pour cela s'éloigner du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1) Procédé de production de neurones à partir de cellules 5 d'une lignée cellulaire apte à se différencier pour produire notamment des neurones, dans lequel: - on cultive lesdites cellules en sphères, de préférence en les exposant à des facteurs de croissance, tels que, par exemple, EGF (epidermal growth factor) et/ou bFGF (basic fibroblast growth factor), dans un milieu de croissance, - on induit la différenciation desdites sphères en les étalant sur un substrat adhésif, après élimination des facteurs de croissance EGF et/ou bFGF, et en les cultivant dans le milieu de croissance, caractérisé en ce que l'on utilise les cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains NT2. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour cultiver les cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains (NT2) en sphères, - on dissocie des cellules de la lignée de tératocarcinomes embryonnaires humains (NT2) cultivées en monocouches avec une solution de trypsine/EDTA, - on ensemence les cellules NT2, une fois dissociées, de préférence à 100 000 cellules/ml dans des récipients contenant le milieu de croissance, auquel est rajouté extemporanément le facteur de croissance EGF et/ou le facteur de croissance bFGF, - on les laisse proliférer pendant une période d'au moins sept jours. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 30 2, caractérisé en ce que l'on utilise un milieu de croissance dépourvu de sérum bovin. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères, l'on renouvelle régulièrement une fraction du milieu de croissance. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on renouvelle tous les trois à quatre jours 70% du milieu 5 de croissance. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait qu'au cours de la période de culture des cellules NT2 en sphères, l'on soumet régulièrement les sphères NT2 flottant à la surface du milieu de croissance à une centrifugation, et on les repique par dissociation mécanique, effectuée, par exemple, à l'aide d'une pipette Pasteur effilée. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que pour induire la différenciation des sphères NT2, l'on utilise de la poly-D-lysine (PDL) en tant que substrat apte à faire adhérer les sphères de cellules NT2. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que, pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on étale ces dernières sur le substrat adhésif sans les dissocier au préalable. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on étale les sphères de cellules NT2 non dissociées de préférence à 50 000 - 100 000 cellules/cm2 en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que pour entreprendre la différenciation des sphères de cellules NT2, l'on dissocie au préalable les sphères de cellules NT2 à l'état de cellules uniques avant de les étaler sur le substrat adhésif. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on dissocie les sphères de cellules NT2 en les incubant pendant quelques minutes dans une solution de trypsine/EDTA puis en les exposant à une solution contenant 2mM de CaC12, 0,01% de Dnase 1 et 0,5% d'inhibiteur de trypsine. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 35 ou 11, caractérisé en ce que l'on étale les sphères de cellules NT2 dissociées de préférence à 250 000 cellules/cm2 sur le substrat adhésif, en estimant leur nombre par comptage d'une aliquote. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lors de la phase de différenciation des sphères NT2, l'on cultive ces dernières pendant au moins dix jours.