Brevet FR2849043A1 — publié le 20040625

PROCEDE DE FABRICATION D'UN VECTEUR b E MOLECULES ACTIVES APPLICABLE DANS LE DOMAINE DE LA DIFFUSION DE PRINCIPES ACTIFS ET VECTEUR OBTENU La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives, applicable dans le domaine biomédical pour la diffusion de principes actifs. Un tel vecteur est applicable à la diffusion de principes actifs dans les domaines humain, animal et végétal. L'invention couvre aussi le vecteur biomédical issu de ce procédé. bans le domaine du traitement du corps humain ou du traitement des végétaux par exemple, on sait que certains principes actifs sont métabolisés prématurément avant d'avoir atteint leur cible. Aussi afin que certaines molécules puissent présenter une activité thérapeutique suffisante, il faut greffer ces molécules sur des vecteurs. On peut citer comme molécules actives intéressant la présente invention et données à titre d'exemples des acides gras, des antioxydants, des hormones, des composés vitaminés, des médicaments ou des neurotransmetteurs. be telles molécules actives, présentées par un vecteur disposent d'activités bactériostatiques, anti-allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs ou antifongiques, immunomodulantes ou anti-inflammatoires. Une molécule de petite taille diffuse rapidement mais elle est rapidement métabolisée tandis que la même molécule greffée aura une durée de vie plus 20 longue car elle ne sera pas aussi rapidement métabolisée. La diffusion d'une molécule active greffée sur un vecteur adapté augmente ce qui permet de faire migrer le principe actif plus proche du lieu d'action avant qu'il ne soit métabolisé, et avec une forte action. Le but est donc de pouvoir utiliser des vecteurs avec leurs molécules greffées, 5 suffisamment importants en taille afin d'obtenir une forte efficacité mais de les greffer sur des vecteurs qui leur assurent aussi une forte diffusibilité. Il est un autre paramètre important c'est la capacité pour le vecteur de recevoir par greffage ces molécules actives. C'est l'objet de la présente invention de permettre la réalisation d'un vecteur du 10 type polymère qui assure ce rôle de support de molécule active avec une forte diffusibilité Plus particulièrement, en modifiant le taux de polymérisation, on peut ajuster cette diffusibilité. La présente invention propose aussi un procédé permettant de réaliser un vecteur de molécules actives sous forme d'un polymère ne nécessitant aucun 15 support inerte. Ce même vecteur peut aussi piéger les métaux lourds et les composés ayant un métal accroché à une protéine inductrice de réponses immunes comme le sérum albumine bovine. On connaît des techniques notamment décrites dans la demande de brevet 20 PCT/FR 99/00103 permettant d'obtenir des polymères à partir d'amines. On recourt pour cela à des diamines que l'on polymérise en présence d'un agent réticulant. Dans ces procédés connus, les polyamines sont la poly(Lornithine-R), la poly(putréscine-R), la poly(cadavérine-R), la poly(Lcarnosine-R), la 25 poly(spermidine-R) ou la poly(spermine-R) ou encore un mélange de celles-ci -R représente l'agent polymérisant réduit au borohydrure de sodium. Les agents de réticulation utilisés sont choisis parmi le formaldéhyde, le glyoxal, le malondialdéhyde bien que d'un prix de revient très élevé, ou le glutaraldéhyde. Un autre agent est le 1,1,3,3-tétraméthoxypropane. Le procédé de polymérisation utilisé consiste en une dissolution de la diamine dans une solution basique, au-delà de p H 8,0 et en un ajout de glutaraldéhyde. La réduction des doubles liaisons est obtenue également par une solution de borohydrure de sodium, suivie d'une série de dialyses. On obtient ainsi un rendement de polymérisation classé dans l'ordre suivant: poly(putréscine-G) > poly(cadavérine-G) > poly(L-ornithine-G) > poly(spermidineG) > poly(L-carnosine-G). Dans ces composés, -G représente le glutaraldéhyde réduit au borohydrure de 10 sodium. Si l'on connaît bien les couplages des amines réalisés au moyen du glutaraldéhyde on ne connaît pas de polymères réalisés avec le glutaraldéhyde. Le problème soulevé par ces polymères lorsqu'ils sont utilisés pour le traitement de fluides, est la nécessité de travailler en milieu fortement alcalin au-delà de 15 p H 8,0 La poly(putréscine-G) et, la poly(Lcarnosine-G) ne peuvent être polymérisées à des p H inférieurs à 8,0. be tels polymères sont également très intéressants car il est possible de générer des polymères tridimensionnels. Pour réaliser un vecteur biomédical, il n'est pas concevable de travailler à un p H 20 autre que proche du neutre à 7,0, celui du corps humain en l'occurrence Il en est de même également pour le règne végétal dans la plupart des cas. La présente invention vise donc à déterminer un procédé permettant de générer des polymères, bi ou mieux tridimensionnels, à partir d'une diamine mais qui travaillent à p H neutre ou proche de cette valeur de 7, 0. Les avantages nombreux du produit selon la présente invention seront révélés à la lecture de la description qui va suivre. Ce procédé est maintenant décrit en détail suivant un mode de réalisation particulier, non limitatif. Le procédé consiste à recourir à une diamine la L-ornithine et à la polymériser en présence d'un composé de la famille des dialdéhydes, plus particulièrement le glutaraldéhyde pour obtenir une homopolyamine, la poly(L-ornithine-G). On peut réaliser le même procédé avec d'autres diamines, même si les 5 rendements sont plus faibles car dans le domaine du biomédical, les quantités nécessaires sont plus faibles On peut citer ainsi la C) ou Lcitrulline et la Llysine. La description de ce premier mode de réalisation préférentiel se limite à la Lornithine. Ce monomère comprend quatre carbones et deux groupes NH 2 Il faut en effet que les deux groupes NH 2 soient séparés par au moins quatre carbones On note que des essais avec des molécules ayant trois carbones ne donnent pas satisfaction car il n'y a pas de polymérisation possible. Dans ce cas de la L-ornithine, il est possible de réaliser non seulement un 15 homopolymère linéaire mais aussi un homopolymère en 3 b) moyennant un réticulant pour former ainsi un réseau. L'homopolyamine L-ornithine-G ainsi réalisée est nouvelle et particulièrement inventive dans sa fonction de vecteur de molécules actives, plus particulièrement sous sa forme tridimensionnelle. Le procédé de réalisation de l'homopolyamine L-ornithine-G selon la présente invention consiste à mélanger: la L-ornithine par exemple 10 g dans 25 ml d'eau avec ajustement à un p H compris entre 6,5 et 7,5, plus particulièrement 7,0. NH 2-(CH 2)3-CH(NH 2)-COOH, du glutaraldéhyde, 20 ml à 50 %. OHC-(CH 2)3-COH. La réaction qui se produit est une réaction de polycondensation avec formation d'imines. On obtient un polymère linéaire qui peut être utilisé moyennant le passage à travers un système de dialyse. Afin d'obtenir directement un polymère en 3 D, selon le procédé de la présente invention, on assure une réticulation de ce polymère en ajoutant au milieu un 5 réticulant tel du polyéthylène imine L'ajout est effectué dans des proportions de 1 ml pour 10 g d'ornithine, dans le cas présent. Le polymère obtenu se présente bien sous la forme d'un polymère tridimensionnel. Pour réaliser des perles de l'homopolymère obtenu et le rendre encore plus 10 aisément manipulable, on l'introduit dans un milieu organique hydrophobe pour obtenir un effet biphasique De plus, avantageusement ce milieu est chauffé pour diminuer encore le temps de la polymérisation de l'homopolymère qui devient quasi instantanée. Pour collecter les perles ainsi formées, on les retient tout simplement 15 mécaniquement sur un filtre puis on les sèche sous ventilation chauffante pour éliminer l'eau d'une part et pour finaliser la réticulation d'autre part. Ces billes sont ensuite dégraissées puis traitées au moins une fois à la soude par exemple dans 200 ml de soude à 1 M à 80 C pendant deux heures. Cette étape permet de retirer les protons sinon il se produirait une formation 20 d'hydrogène et un éclatement mécanique des perles, les rendant impropres à une manipulation aisée. Cette étape peut être renouvelée au moins un fois. On peut ainsi éviter de consommer inutilement du borohydrure de sodium puisque les perles sont ensuite placées dans une solution de soude à 1 M en 25 présence de lg/l de borohydrure de sodium pour réduire les doubles liaisons des imines formées. Les perles obtenues sont rincées sur eau et sur acide chlorhydrique à 0, 001 M pour neutraliser les éventuelles traces alcalines puis rincées abondamment sur eau. On obtient alors des perles d'homopolymère Lornithine-G susceptibles de 5 servir de vecteur de molécules actives, avec une forte efficacité On constate aussi qu'il est possible de choisir en fonction du degré de réticulation la taille du vecteur et donc la diffusibilité. Comme exemple de molécules de petites taille susceptibles d'être greffées sur la poly(ornithine-G), on peut citer les exemples suivants 10 MOLECULES COUPLAGES REALISES CONCENTRATION (M) Acide palmitique Ac palmitique-poly(ornitihine-G) 2,05 10-3 Acide myristique Ac myristiquepoly(ornitihine-G) 2,26 10-3 Acide olé'que Ac olé'que-poly(ornitihine-G) 1,96 10-3 Taurine-AG Taurine-Ag-poly(ornitihine-G) 3,92 10-3 L'homopolyamine poly(L-ornithine-G) obtenue par le procédé selon la présente invention, sur laquelle sont greffés des acides gras, est également testée du point de vue de la toxicité et des tests de base ont montré une non toxicité. Ces tests consistent à administrer à des rats mâles des solutions de poly(Lornithine-G) greffée avec des acides gras à 1 mg/ml à la dose de 0, 5 ml/j. On constate une augmentation significative du poids au cours des 150 jours qui suivent On a représenté les courbes en annexe sur les figures 1 et 2. Si l'on compare avec la L-citrulline ou la L-lysine, on constate que lors de la 20 polymérisation, le rendement est beaucoup moins élevé, mais on obtient une polymérisation en poly(citrulline-G) et en poly(lysine-G) avec possibilité de réaliser un polymère tridimensionnel. bans un test comparatif, on dispose de 100 mg de L-ornithine et de 100 mg de b, L-citrulline que l'on place en présence de 3 ml d'acétate 3 M, 1 ml d'eau et 3 ml de glutaraldéhyde à 5 %. Les valeurs du poids de polymères, atteintes après lyophilisation sont 5 respectivement de 23,2 mg de poly(ornithine-G) et de 7,2 mg de poly(citrullineG). Ceci est essentiellement d au groupement CONH 2 qui diminue la disponibilité pour la polymérisation du groupement NH 2. La poly(ornithine-G) sur laquelle sont greffés des acides gras par liaison amide a 10 été évaluée du point de vue de son activité biologique dans des modèles animaux expérimentaux d'affections chroniques. Sur le modèle d'encéphalite expérimentale, ce polymère greffé avec des acides gras en concentration de 4 à 5 10-5 moles a montré une activité biologique par diminution importante de la crise ( équivalente à une poussée de sclérose en 15 plaques). REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: diluer un monomère ayant au moins deux groupements NH 2 séparés par au moins quatre carbones dans l'eau, ajuster le p H à une valeur comprise entre 6,5 et 7,5. -ajouter du glutaraldéhyde, OHC-(CH 2)3-COH, et attendre la réaction de polycondensation et la formation d'imines, et récupérer le poly(monomère-G) obtenu. 2 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives applicable dans le 10 domaine biomédical, caractérisé en ce que le monomère est la Lornithine, la Llysine ou la L-citruline pour obtenir la formation de la poly(L-ornithine-G), poly(Llysine-G), poly(L-citruline-G), 3 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère 15 obtenu est linéaire. 4 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute un réticulant pour obtenir un réseau de poly(L-ornithine-G), poly(L-lysine-G), poly(Lcitruline-G) en 3 b. 5 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 4, caractérisé en ce que le réticulant est le polyéthylène imine. 6 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on disperse 25 l'homopolymère obtenu dans un milieu organique hydrophobe pour obtenir un effet biphasique pour réaliser des perles de poly(L-ornithine-G), de poly(Llysine-G) ou de poly(L-citruline-G). 7 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour collecter les 5 perles ainsi formées, on les retient mécaniquement sur un filtre puis on les sèche sous ventilation chauffante. 8 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on procède à un chauffage du milieu organique hydrophobe utilisé. 9 Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine du traitement de l'eau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour réduire les doubles liaisons des imines et obtenir des amines, on procède aux opérations suivantes: dégraissage du polymère obtenu en sortie de réaction de condensation, 15 traitement au moins une fois à la soude, et mise en présence de ce polymère en présence de borohydrure de sodium. Vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce qu'il comprend de la poly(ornithine-G), de la poly(L-lysine-G) ou de la poly(Lcitruline-G) sur laquelle sont greffées des molécules actives telles que des 20 acides gras, des antioxydants, des composés vitaminés, des hormones, des médicaments ou des neurotransmetteurs pour disposer d'activités bactériostatiques, anti-allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs, antifongiques, anti-inflammatoires ou immunomodulantes. 11 Utilisation du vecteur de la revendication 10, obtenu suivant le procédé de 25 I'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour recevoir des acides gras, des antioxydants, des composés vitaminés ou des neurotransmetteurs pour disposer d'activités bactériostatiques, anti- anti-prédateurs, anti-fongiques, allergisantes, anti-parasitaires, inflammatoires ou immunomodulantes. anti-