Brevet FR2855752A1 — publié le 20041210

La présente invention concerne une nouvelle utilisation cosmétique des sophorolipides comme agents régulateurs de la masse adipeuse. Les sophorolipides constituent une famille de produits généralement obtenus dans des procédés de fermentation de différents substrats par des levures, en particulier par Candida bombicola ou par Candida apicola. Les sophorolipides ont en commun d'être constitués d'une fraction glucidique d'un disaccharide commun, le sophorose (2-O-p-D- glucopyranosyl-D-glucopyranose), acétylé ou non, et d'une fraction lipidique qui fait intervenir des hydroxyacides gras différents. Il existe deux catégories de sophorolipides qui correspondent aux formules I et II données ci-dessous, correspondant respectivement à une forme lactone et à une forme acide. Dans la forme acide, le disaccharide est lié par une fonction éther à un acide gras alors que dans la forme lactone, l'acide gras forme une lactone avec le disaccharide. Ainsi, les sophorolipides répondent à l'une au moins des formules I (forme lactone) et II (forme acide) ci-dessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle, R2 est de l'hydrogène ou un groupement alkyle en Ci à Cg, et R3 est un groupement hydrocarboné saturé ou non en C7 à C17. La composition exacte des mélanges de produits de type sophorolipide dépend en fait à la fois des conditions de leur procédé de fabrication, en particulier de la nature de la levure mise en #uvre, et de la nature du substrat traité. Il est maintenant bien connu que les composés de type sophorolipide sont des composés particulièrement intéressants dans de nombreux domaines de l'industrie du fait de leurs propriétés tensioactives. Ils sont, en particulier, utilisables comme agents de nettoyage et comme agents émulsifiants, surtout, du fait de leurs propriétés amphiphiles liées à la présence du sophorose hydrophile et du reste d'acide gras lipophile. Les sophorolipides présentent, en outre, l'avantage d'être bien tolérés par la peau et ont pu être récemment développés dans différentes applications cosmétiques, en particulier dans la lutte contre le vieillissement cutané. Ainsi, la publication les sophorolipides : actif contre le vieillissement cutané , Parfums et Cosmétiques Actualité, N 129, juinjuillet 1996, décrit l'action stimulante des sophorolipides sur les cellules du derme et leur action réparatrice et préventive vis-à-vis du vieillissement cutané. Le brevet FR 2 757 766 décrit l'utilisation des sophorolipides en tant qu'agents stimulateurs du métabolisme des fibroblastes dermiques et met en évidence l'effet restructurant, réparateur et raffermissant de la peau des sophorolipides sous leur forme brute ou sous leur forme acide. Le brevet européen EP 0 209 783 décrit l'utilisation de sophorolipides de type lactone pour combattre les pellicules et comme agents bactériostatiques dans des déodorants. Ainsi donc, un certain nombre d'utilisations potentielles des sophorolipides dans le domaine de la cosmétique ou de la dermatologie sont connues à ce jour. Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de façon tout à fait surprenante une nouvelle utilisation des sophorolipides comme agents amincissants ou dans le traitement des surcharges adipeuses. Ils ont, par ailleurs, mis en évidence que cette nouvelle utilisation était liée à la propriété parfaitement inattendue des sophorolipides de favoriser la synthèse de la leptine par les adipocytes. La leptine de la souris a été récemment identifiée en 1994 comme étant le produit du "gène ob" (Zhang, y et al., Nature, 1994, 372 :425 et Tartaglia L.A., 1997, J. Biol. Chem. 272:6093). La structure de la leptine humaine (ou protéine humaine OB) et son utilisation dans la modulation du poids chez les animaux ont été décrites dans la demande de brevet britannique GB 2292382. Il s'agit d'une protéine sécrétée par l'adipocyte qui informe le cerveau de l'état des réserves adipeuses. Elle agit par l'intermédiaire de récepteurs membranaires situés en particulier au niveau de l'hypothalamus. D'abord étudiée chez le rongeur puis chez l'homme, elle joue un rôle clef dans la régulation du poids corporel. Chez les souris ob/ob, l'absence de leptine dans le sérum due à des mutations du gène ob (celui qui code pour la leptine) entraîne une obésité massive. Chez l'homme, les premiers travaux concernant la leptine ont été dirigés vers les patients obèses et/ou diabétiques. En effet, plus un adipocyte possède une teneur élevée en triglycérides, plus il produit de leptine, et inversement (Médecine/Sciences, 1998, n 8-9, 14,858-864, G. Ailhaud : L'adipocyte, cellule sécrétrice et endocrine). Ainsi chez les obèses, deux situations peuvent se présenter. Soit il existe une mutation du gène de la leptine, celle-ci est alors non fonctionnelle, en particulier sur les récepteurs du cerveau. Soit il existe un défaut du transfert de la leptine au niveau de la barrière entre circulation sanguine et cerveau. Une étude, au cours de laquelle une injection quotidienne de leptine synthétique a été réalisée sur des patients qui souffraient d'obésité ou de surcharges pondérales a montré des résultats probants : une perte de poids significative chez les patients atteints d'une certaine forme d'obésité est apparue (travaux menés à la Tufts University aux Etats-Unis, présentés à l'occasion du congrès American Diabètes Association : Jean Mayer, USA Human Nutrition Research Center on Aging). En fait, la leptine déclenche un phénomène de satiété provoquant une diminution de la prise alimentaire et diminuant la fréquence des prises alimentaires. Lorsque la masse adipeuse augmente, la leptine produite par le tissu adipeux va inhiber la prise alimentaire et stimuler la dépense énergétique. Elle va donc s'opposer ainsi à une prise de poids excessive. Ainsi donc, on peut considérer que cette protéine est un régulateur de la masse adipeuse dont le rôle primordial est d'inhiber le dépôt d'adiposité en excès. Le rôle de régulation locale joué par la leptine est bien connu (voir Systemically and Topically Administered Leptin Both Accelerate Wound Healing in Diabetic ob/ob Mice. B. D. Ring, S. Scully, C. R. Davis, M. B Baker, M.J. Cullen, M.A. Pelleymounter, D. Danilenko. Endocrinology, 2000 vol. 141, n 1, p. 446-449). Par ailleurs, le rôle de la leptine dans l'expression de certains gènes conduisant à l'accumulation de lipides (gènes de différenciation) est également bien connu dans le sens de la régulation de la lipolyse. La leptine, d'une part réprime l'expression de certains gènes conduisant à l'accumulation de lipides (gènes de différenciation), et cela sans la participation du cerveau. D'autre part, la leptine induit une lipolyse directement sur les adipocytes. Ceci a été observé sur des adipocytes de souris in vitro (voir In vitro Lipolytic Effect of Leptin on Mouse Adipocytes : for a possible Autocrine/Paracrine Role of Leptin, G. Frühbeck, M. Aguado, J.A. Martinez, Biochemical and Biophysical Research communications 1997 : 240, p. 590-594). L'effet de la leptine sur la lipolyse des adipocytes est spécifique et opère via des récepteurs présents dans le tissu adipeux blanc. La leptine transforme l'oestrone de la circulation sanguine (hormone qui augmente le dépôt de lipides) en oléyl-oestrone qui est considéré comme un facteur "amincissant". L'apparition de ce facteur provoque une lipolyse généralisée et une thermogénèse (voir Leptin enhances the synthesis of oleyl-estrone from estrone in white adipose tissue, M. Esteve, J. Virgili, H. Aguilar, F. Balada, J. A. Fernandez-Lopez, W. Remesar, M. Alemany, Eur J. Nutr. 1999,38, p. 99-104). Administrée à des rats obèses ou normaux, l'oléyl-oestrone provoque une perte de masse grasse. On voit donc tout l'intérêt qu'il y a à disposer d'un moyen pour agir sur la synthèse de la leptine qui agira notamment: - directement au niveau cutané par l'intermédiaire des récepteurs présents à ce niveau, - sur le tissu adipeux en provoquant la lipolyse, - sur un facteur agissant comme régulateur du poids, à savoir l'oléyl-oestrone. Les essais réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de démontrer que les sophorolipides permettaient d'augmenter considérablement la sécrétion de la leptine par les adipocytes. Ainsi, l'utilisation en application topique des sophorolipides favorise la sécrétion de la leptine par les adipocytes et permet de traiter les surcharges graisseuses sous-cutanées. L'invention concerne, selon un premier aspect, l'utilisation cosmétique d'au moins un sophorolipide, en tant qu'agent amincissant pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées, lesdits sophorolipides répondant à l'une au moins des formules I ou II ci-dessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle, R2 est de l'hydrogène ou un groupement alkyle en Ci à Cg, et R3 est un groupement hydrocarboné saturé ou non en C7 à C17- Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un sophorolipide tel que défini ci-dessus, en tant qu'agent stimulant la synthèse de la leptine par les adipocytes, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées. Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé de traitement cosmétique amincissant du corps humain destiné à diminuer les surcharges graisseuses sous-cutanées, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer à la surface de la partie du corps concerné une composition cosmétique contenant au moins un composé de la famille des mêmes sophorolipides. Enfin, selon un quatrième aspect, l'invention concerne de nouvelles compositions cosmétiques, notamment destinées à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées contenant, à titre d'agent actif, au moins un sophorolipide tel que défini précédemment, en combinaison avec au moins un agent lipolitique. Les compositions cosmétiques utilisées selon les trois premiers aspects de l'invention ainsi que les compositions nouvelles qui font l'objet du quatrième aspect de l'invention contiennent, à titre de principe actif, au moins un produit de la famille des sophorolipides répondant à l'une des formules I et II données précédemment. Selon une variante avantageuse de l'invention, ces sophorolipides sont obtenus par fermentation de substrats végétaux, les procédés de fermentation mis en #uvre conduisant en général à des mélanges de produits répondant aux formules I et II. On utilisera avantageusement selon l'invention des sophorolipides produits par fermentation, de préférence par fermentation de substrats végétaux, plus précisément par bioconversion d'un substrat glucidique en présence d'un substrat lipidique. Ainsi, les sophorolipides peuvent être produits par fermentation avec une levure, à partir de glucose et d'huile végétale ou de leurs esters. En particulier, on peut utiliser comme levure une souche de Candida bombicola ou de Candida apicola sur un substrat de nature glucidique, suivi d'une phase de production par bioconversion de deux substrats, l'un glucidique et l'autre lipidique. Selon une variante avantageuse de l'invention, on utilisera des sophorolipides ou des mélanges de sophorolipides répondant à l'une au moins des formules II ou II' ci-dessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle. Selon une autre variante avantageuse de l'invention, on recourt à des sophorolipides ou des mélanges de sophorolipides répondant à l'une des formules III ou III' ci-dessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle et R4 est une chaîne hydrocarbonée linéaire présentant éventuellement une insaturation et comprenant 11, 13 ou 15 atomes de carbone. Selon une variante avantageuse, on utilise un mélange de sophorolipides contenant, à titre de sophorolipide majoritaire, le diacétate- 6', 6" - L - (2'-O-p-D-glucopyranosyl-p-D-glucopyranosyl)-oxy)-17- octadécénoïque lactone-1',4". Un tel mélange, obtenu par fermentation, se trouve actuellement dans le commerce. On citera, par exemple, les produits commercialisés par la Société Rhodia, en particulier le produit Miractive Ipoleose 30#, ainsi que le produit commercialisé sous la marque Sopholiance par la Société Soliance. Dans ces différents produits, lorsqu'ils sont obtenus par un procédé de fermentation mettant en #uvre un substrat lipidique, par exemple une huile végétale, la structure de la fraction lipidique reflète celle des hydroxy-acides gras présents dans le substrat lipidique de départ. Par ailleurs, la longueur relative des groupements R2 et R3 dépend de la position du groupement hydroxyle dans l'hydroxy-acide gras de départ. Ainsi, on recourt avantageusement à des hydroxy-acides gras dans lesquels le groupement hydroxyle se trouve en position co ou #-1 et, dans ces cas, les fractions glucidique et lipidique des sophorolipides sont reliées entre elles par une liaison acétal entre le carbone noté 1' de la molécule de glucose non impliquée dans la liaison sophorosidique et le carbone # ou #-1 de l'acide gras qui porte la fonction hydroxyle. Par ailleurs, les sophorolipides peuvent se présenter soit sous forme acide, soit sous forme lactone ou en mélange de ces deux formes. Par ailleurs, les essais réalisés par les inventeurs de la présente invention ont montré que les concentrations en sophorolipides des compositions cosmétiques utilisées selon l'invention sont avantageusement comprises entre.0,01% et 5%, et de préférence entre 0,1% et 1%, en poids de ladite composition. Par ailleurs, les compositions cosmétiques utilisées selon l'invention peuvent être formulées sous toute forme destinée à un usage topique. Comme exposé précédemment, les compositions utilisées selon l'invention peuvent également comprendre un agent lipolytique choisi dans le groupe constitué par l'AMPc et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase. De telles compositions constituent en elles-mêmes des produits nouveaux qui font l'objet du quatrième aspect de l'invention. De telles compositions contenant ces associations spécifiques s'avèrent particulièrement intéressantes, pour améliorer l'effet amincissant. Plus précisément, il est apparu que l'association d'au moins un sophorolipide tel que défini précédemment avec un ou plusieurs agents, ci-après désignés par agents lipolytiques, induisant une lipolyse, dans les adipocytes s'avère particulièrement intéressante dans le cadre de la présente invention, comme cela sera expliqué plus loin. En particulier, on choisira pour réaliser cette association au moins un agent lipolytique cosmétiquement acceptable dans le groupe constitué par l'adénosine-3',5'-cyclique monophosphate (AMPc) et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase. Comme agent activateur de l'adénylate cyclase, on choisira avantageusement la forskoline ou un extrait de plante en contenant, tel qu'un extrait de Coleus forskohlii ou Plectranthus barbatus, ou encore un extrait de la plante Tephrosia purpurea. Comme agent inhibiteur de phosphodiestérase, on pourra utiliser une xanthine telle que la 3-isobutyl-1-méthyl-xanthine ou IBMX, la caféine ou la théophilline. Les compositions cosmétiques renfermant de telles associations, qui sont nouvelles en elles-mêmes, constituent le quatrième aspect de la présente invention. Ainsi donc selon ce quatrième aspect, la présente invention concerne une composition cosmétique, notamment destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'agent actif, - au moins un sophorolipide tel que défini précédemment, - au moins un agent lipolytique cosmétiquement acceptable choisi dans le groupe constitué par l'AMPc et ses dérivés cosmétiquement acceptables, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase, dans un véhicule cosmétiquement acceptable. Dans les compositions nouvelles de l'invention, les sophorolipides sont contenus à une concentration comprise entre 0,01 % et 5 % et, de préférence, entre 0,1 % et 1 % en poids par rapport au poids total de ladite composition. Les compositions cosmétiques nouvelles contiennent en outre au moins un agent actif lipolytique choisi dans le groupe constitué par l'AMPc et ses dérivés lipolytiques, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase. Dans ces compositions cosmétiques, l'AMPc ou son dérivé sera avantageusement utilisé à une concentration comprise entre à 0,001 % et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. A titre de dérivé de l'AMPc, on pourra choisir tout dérivé de l'AMPc cosmétiquement acceptable et en particulier un sel ou un dérivé acylé, notamment un dérivé mono- ou dibutyryle. A titre d'agent activateur de l'enzyme adénylate cyclase, on choisit, de façon avantageuse, la forskoline ou un extrait de plante en contenant, de préférence à une concentration comprise entre 0,001 % et 1 % et, de préférence entre 0,05 % et 0,25 %, en poids par rapport au poids total de la composition. Comme extrait contenant de la forskoline, on choisira de préférence un extrait de Coleus forskohlii ou Plectranthus barbatus. Un tel extrait peut être obtenu par un procédé d'extraction tel que celui décrit dans la demande internationale WO 91/02516. On pourra également utiliser comme agent activateur de l'adénylate cyclase un extrait de la plante Tephrosia purpurea, à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 %, de préférence entre 0,01 % et 5 %, en poids par rapport au poids total de la composition. Un tel extrait peut être obtenu par un procédé d'extraction tel que celui décrit dans la demande internationale WO 95/03780. Enfin, comme exposé précédemment, selon une autre variante, les compositions nouvelles selon l'invention contiennent un agent inhibiteur de la phosphodiestérase, en particulier une xanthine et, tout particulièrement, la 3-isobutyl-1-méthyl-xanthine (IBMX), la caféine ou la théophilline, de préférence à une concentration comprise entre 0,001 % et 10 %, de préférence entre 0,01 et 1 %, en poids par rapport au poids de la composition. Les compositions nouvelles utilisées selon la présente invention et qui contiennent une association de sophorolipides avec un agent lipolytique tel que l'AMPc et ses dérivés lipolytiques, les agents activateurs de l'adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de la phosphodiestérase, s'avèrent particulièrement intéressantes du fait de l'action synergique des deux types de constituants. Sans que les inventeurs de la présente invention s'estiment totalement liés par cette explication, une interprétation plausible de l'effet de synergie observé est donnée ci-après. Il a en effet été déjà observé que les agents favorisant une lipolyse dans les adipocytes, tels que les extraits de Coleus par exemple, présentent une efficacité biologique remarquable qui associe en général un important pouvoir lipolytique à une activité inhibitrice de la maturation adipocytaire. La réduction importante en volume et en quantité des vacuoles lipidiques après un traitement par l'agent lipolytique conduit à une réduction de la production de leptine. Il est donc probable que cette perte locale de leptine dans l'environnement proche des adipocytes résultant du traitement par l'agent lipolytique puisse être compensée par l'effet d'un produit stimulant la synthèse de la leptine. Le maintien d'une concentration suffisante en leptine dans l'environnement proche des adipocytes exerce ainsi un rôle qui s'oppose à l'augmentation de la masse adipeuse. Tout semble donc se passer comme si le message était émis par des cellules grasses qui informent par une opération de rétro-contrôle de la nécessité de réduire le stockage sous forme de triglycérides. Ainsi, grâce à l'action combinée des sophorolipides, et d'au moins un autre agent lipolytique, on obtient un effet amincissant renforcé et plus prolongé. EXEMPLES Exemple 1 : Mise en évidence de l'effet des sophorolipides sur la synthèse de la leptine par les adipocytes de souris 1. Principe du test Le concept selon lequel la masse adipeuse peut être régulée via des facteurs circulants sécrétés est très intéressant. Le principe du test est de mesurer la sécrétion de la leptine par les adipocytes. Le test utilise une technique immunoenzymatique "en sandwich". On tapisse les puits des microplaques avec un anticorps polyclonal de la leptine de souris. Les standards, contrôles et échantillons sont déposés dans les puits et à ce moment là, toute la leptine présente se lie à l'anticorps immobilisé. La leptine liée est ensuite détectée par un anticorps anti-leptine de souris couplé à une enzyme, la peroxydase. Une solution substrat est ensuite ajoutée dans les puits. La réaction enzymatique conduit à une solution bleue qui vire au jaune après ajout d'une solution d'arrêt. L'intensité de la couleur mesurée est proportionnelle à la quantité de leptine présente. La lecture de la densité optique est faite à 450 nm au spectrophotomètre. 2. Matériel et méthodes Culture de cellules 3T3-F442A : A partir d'une lignée établie de préadipocytes de souris 3T3, a été isolé un clone qui a la capacité d'accumuler de grandes quantités de triglycérides. Les agents lipolytiques réduisent cette accumulation. Il est donc apparu pertinent de tester des agents lipolytiques potentiels sur cette lignée de préadipocytes murins 3T3-F442A. Ces préadipocytes (GREEN H. and KEHINDE 0. - Spontaneous Heritable Changes Leading to Increased Adipose Conversion in 3T3 Cells, Cell Vol. 7,105-113, 1976) peuvent se multiplier et se différencier en présentant le phénotype morphologique et biochimique caractéristique de la fonction différenciée de l'adipocyte mature. Lorsqu'ils sont en phase exponentielle de croissance, ils sont d'apparence fibroblastique, présentent une forme allongée et sont très adhérents au support. A confluence lorsque les conditions le permettent, une transition morphologique très précoce leur confère une forme arrondie. Les cellules connaissent alors un processus d'amplification clonale. A ces changements morphologiques s'ajoutent des accroissements de l'activité d'enzymes lipogénétiques ainsi que des augmentations de réponses de ces cellules à des facteurs hormonaux affectant la lipogénèse et la lipolyse. Les préadipocytes 3T3-F442A constituent donc un excellent modèle d'étude de la lipolyse du fait des transformations morphologiques et métaboliques acquises par les cellules pendant leur programme de développement. (Pairault J and Lasnier F : Control of adipogenetic différenciation of 3T3-F442A cells by retinoic acid, dexamethasone and insulin : a topographie analysis, J. cell Physiol. (1987), 132,279-86). D'après la littérature, la leptine est sécrétée par les adipocytes dans le milieu de culture. ("Insulin and cortisol promote leptin production in cultured human fat cells", Wabitsch M. and al, Diabetes, (1996), 45 (10), 1435-8 ; "Immunohistochemichal and ultrastructural localization of leptin and leptin receptor in human white adipose tissue and differentiating human adipose cells in primary culture", Bornstein S. R. et al, Diabetes, (2000), 49 (4), 532-8 ; "leptin, leptin receptors, and the control of body weight", Friedman J.M., Nutrition Reviews, 1998,56 (2), Part 2). Dans les cellules 3T3-F442A, l'expression du gène ob a été particulièrement étudié (Leroy P. et al, J. of Biol. Chem, 1996, 271 (5), 2365-2368 ; Considine R.V. and al., Horm. Res. 1996,46, 249-256). Les préadipocytes 3T3-F442A sont ensemencés à JO dans les boîtes de Pétri 35 mm (Corning) et mis à l'étuve à 37 C sous une atmosphère air-C02 (95: 5). Les cellules sont cultivées dans un milieu essentiel minimum de Eagle modifié (DMEM) selon Dulbecco (glucose 4,50 g/1) (GIBCO BRL) complémenté avec 5 % de sérum de veau (SV) (BIOMEDIA) et 5 % de sérum de veau foetal (GIBCO) pendant la phase de croissance. Le milieu est changé à J2 et J4. A la confluence cellulaire (à J7), le milieu est changé : Le milieu de base reste le même (DMEM) mais est supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (SVF) et 5 pg/ml d'insuline (SIGMA). Le milieu est ensuite changé à J9 et J11. A J14, J16 et J18, on effectue un traitement par les sophorolipides. Pour le présent test, on utilise des sophorolipides commercialisés par la société Soliance (France) sous la dénomination Sopholiance. A cet effet, on remplace le milieu par le milieu de composition ci-dessus auquel a été ajouté les sophorolipides aux concentrations indiquées ci-dessous. En raison de l'insolubilité des sophorolipides dans l'eau ou dans le milieu de culture, on utilise une solution-mère de sophorolipides préparée dans du DMSO, que l'on dilue dans du milieu de culture DMEM. Quatre concentrations différentes de sophorolipides sont ainsi testées : 10 g/ml, 5 g/ml, 2,5 pg/ml et 1 g/ml, en comparaison avec une culture témoin. Pour les besoins du test, on change le milieu de culture témoin également à J14, J16 et J18. La partie surnageante est collectée avant ledit traitement à J16, J17, J18 et J21, Le protocole est résumé dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau I J0 Ensemencement des 3T3-F442A dans DMEM, 5 % SV, 5 % SVF - densité cellulaire 2 x 104 cellules / boîte de Pétri 35 mm J2 Changement de milieu J4 Changement de milieu J7 Confluence - Changement de milieu (milieu de culture DMEM, 10 % SVF, 5 g/ml d'insuline J9 Changement de milieu J11 Changement de milieu J14 Traitement par composition contenant des sophorolipides (changement de milieu J16 Collecte des surnageants cellulaires, puis traitement par composition contenant des sophorolipides (changement de milieu) J17 Collecte des surnageants cellulaires J18 Collecte des surnageants cellulaires, puis traitement par composition contenant des sophorolipides (changement de milieu J21 Collecte des surnageants cellulaires 3. Dosage de la leptine La leptine sécrétée est déterminée au moyen d'une technique immuno-enzymatique de type ELISA dite "en sandwich", en recourant au kit de dosage Quantikine M mouse (R&D System, G-B). Ce dosage ELISA utilise la leptine de souris recombinée, exprimée dans E. Coli et des anticorps dirigés contre la leptine recombinante de souris. Les différentes opérations du dosage sont effectuées suivant les directives accompagnant le kit de dosage précité. Schématiquement, on tapisse, dans une première étape, les puits des microplaques avec l'anticorps polyclonal de la leptine de souris. Les standards permettant l'étalonnage des résultats, et les échantillons de surnageant témoins et de cultures traitées, sont ensuite déposés dans les puits. Toute la leptine présente se lie alors à l'anticorps ainsi immobilisé. La leptine liée est ensuite détectée par un anticorps anti-leptine de souris couplé à une peroxydase. Ainsi, après avoir introduit dans les puits la peroxydase, on ajoute ensuite une solution substrat. La réaction enzymatique conduit à une solution bleue qui vire au jaune après ajout d'une solution d'arrêt. La densité optique de cette solution est mesurée au spectrophotomètre à 450 nm. Elle est proportionnelle à la quantité d'anticorps fixé, elle-même proportionnelle à la quantité de leptine initialement présente. Les résultats sont exprimés en pg/ml de leptine présents dans les surnageants cellulaires. Chaque test est réalisé trois fois. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau II Concentrations en leptine (pg/ml) dans les surnageants Concentration des J16 J17 J18 J21 sophorolipides Témoin 1153 + 41 884 ~ 35 1203 ~ 24 1299 ~ 15 10 g/ml 1111 ~ 41 677 25 1249 + 25 1066 ~ 14 5 g/ml 1161 ~ 20 692 13 1522 33 1242 21 2,5 g/ml 1400 ~ 38 862 ~ 27 1891 ~ 23 1592 40 1 g/ml 1340 ~ 11 912 ~ 36 3338 ~ 23 2916 ~ 34 De l'examen des résultats contenus dans le tableau ci-dessus, on observe tout d'abord que, la comparaison des résultats obtenus à J17 et J18 montre une accumulation de leptine plus marquée dans la culture traitée que dans les cultures-témoin. La comparaison des résultats obtenus à J16, J17 et J18 montre, d'autre part que l'effet du traitement sur la sécrétion de leptine ne se fait sentir que 48 heures après le traitement. De plus, on observe qu'avec le temps, la production de leptine augmente. Ceci démontre que plus les cellules se différencient en adipocytes (le milieu de culture étant un milieu de différenciation), plus se constitue un potentiel de production de leptine. Exemple 2 - Mise en évidence de l'effet des sophorolipides sur la synthèse de la leptine par les adipocytes humains 1 - Principe du test Le but du test est de mesurer l'effet des sophorolipides sur la sécrétion de leptine par des adipocytes humains sous-cutanés. Les tests ont été réalisés avec trois concentrations du composé testé à 5 heures. Les quantités de leptine sécrétées ont été déterminées en recourant au kit de détermination de la quantité de leptine Quantikine Human Leptin Immunoassay kit (R&D System, GB). 2 - Protocole Des préadipocytes humains sous-cutanés sont cultivés dans des microplaques à 24 puits. Les concentrations de produits testés sont respectivement de 1,2,5 et 5 ng/ml. Le témoin négatif utilisé dans le test est la solution de DMSO correspondant à la concentration maximum. Le témoin positif est l'insuline à 100 nM. Les traitements ont été effectués pendant 5 heures et 24 heures. Les préadipocytes sont ensemencés et maintenus jusqu'à différenciation en absence des composés à tester pendant environ 3 semaines. Puis, ils sont introduits dans le milieu de base, en absence de toute hormone pendant 3 jours. Les étapes du traitement sont les suivantes : 1. Traitement des cellules avec les sophorolipides (Sopholiance) aux concentrations de ing/ml, 2,5ng/ml et 5 ng/ml. Des cultures non traitées par les sophorolipides sont également réalisées pour servir de témoins. De l'insuline (100 nM) est utilisée comme témoin positif. Chaque test est fait trois fois. 2. Incubation des plaques à 37 C pendant 5 heures et 24 heures. 3. A la fin de chaque période d'incubation, prélèvement de 100 l de chaque milieu dans chaque puits et congélation de l'échantillon. 4. La leptine sécrétée est déterminée au moyen d'une technique ELISA de type sandwich en recourant au kit de dosage Quantikine Human Leptin kit (R&D System, G-B). Pour réaliser ce dosage, on opère selon les instructions accompagnant le kit de dosage. Ainsi, on ajoute 100 l d'une base protéinique tamponnée dans chaque puits d'une microplaque tapissée d'un anticorps monoclonal humain contre la leptine. Puis, on ajoute 100 l de chaque échantillon et du témoin. On laisse ensuite incuber pendant 2 heures à 25 C. Après lavage de l'échantillon témoin, on ajoute 200 l d'un anticorps monoclonal humain contre la leptine conjugué à de la peroxydase de radis noir dans chaque puits et on laisse incuber pendant 1 heure à 25 C. Après cette étape, on ajoute dans chaque puits 200 l d'un substrat et on laisse incuber pendant 30 minutes à 25 C. On arrête finalement la réaction par addition de 50 l de solution d'arrêt et on note l'absorbance à 450 nm. Résultats Les résultats moyens obtenus en ce qui concerne la concentration en leptine obtenue, après 5 heures de traitement, dans les différents échantillons testés contenant respectivement 1 ng/ml, 2,5 ng/ml et 5 ng/ml de sophorolipides, en comparaison avec le témoin et le témoin positif (insuline 100 nM), sont donnés dans le tableau III ci-dessous : Tableau III Concentrations en leptine (pg/ml) dans les surnageants Concentration (ng/ml) Concentration moyenne en leptine (pg/ml) et écart-type 0 (Témoin) 75,36 8,71 1 620,59 42,12 2,5 694,79 271,51 5 988,03 0,68 Insuline 100 nM 1104,30 216,95 On observe que la sécrétion de leptine augmente avec la concentration en sophorolipides. Exemple 3 - Compositions cosmétiques contenant des sophorolipides On donne ci-dessous des formules cosmétiques contenant des sophorolipides. Dans ces formules, les compositions sont exprimées en pourcentage en poids. Dans toutes ces compositions, les sophorolipides utilisés sont un mélange commercial résultant de la bioconversion par Candida bombicola d'un substrat glucidique contenant des sucres extraits du blé et d'un substrat lipidique provenant de l'extraction des esters méthyliques d'acide gras de l'huile de colza. 1- Formule hydro/alcoolique amincissante Eau qsp 100,00 % Alcool éthylique 42,00 % PEG 32 1,50 % Menthoxypropanediol q. s. Parfum 0,20 % Sophorolipides (Sopholiance) 0,20 % 2 - Emulsion fluide amincissante PPG 2 isoceteth-20 acétate 2,00 % Poloxamer 407 0,50 % Propylèneglycol isoceteth-3 acétate 15,00 % Pentacyclométhicone 15,00 % Eau qsp. 100,00 % Butylèneglycol 3,00 % Conservateurs q.s. Gomme xanthane 0,05 % Acrylates/clO-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,04 % Neutralisant q. s. Polyacrylamide c13-14 isoparaffin laureth-7 0,50 % Parfum 0,20 % Sophorolipides (Ipoleose) 0,20 % 3 - Crème amincissante Steareth-2 0,50% Steareth-21 1,75% Alcool cétylique 0,30% Alcool stéarylique 0,30% Acide stéarique 0,50% Stearate éthyle-2-hexyle 4,00% Cetearyl isononanoate 3,00% Squalane 4,00% IBMX 1,00% Diméthicone 0,40% Eau qsp.100.00% Glycérine 2,00% Butylène glycol 3,00% Conservateurs q.s. Acrylates/c10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,35% Gomme xanthane 0,10% Sodium hyaluronate 0,02% Neutralisant q. s. Polyacrylamide cl3-14 isoparaffin laureth 7 0,50% Alcool dénaturé 5,00% Parfum 0,20% sophorolipides (Sopholiance) 1,00% Exemple 4 - Emulsion fluide amincissante PPG-2 isoceteth-20 acétate 2 % Poloxamer 407 0,50 % Propylène glycol isoceteth-3 acétate 15 % Pentacyclométhicone 15 % Eau qsp.100 % Butylène glycol 3 % Conservateurs q.s. Extrait de Coleus forskohlii (à 80 % de forskoline) 0,1 % Gomme xanthane 0,05% Acrylates/c10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,04% Neutralisant q. s. Polyacrylamide c13-14 isoparaffin laureth-7 0,50% Parfum 0,20% sophorolipides (Sopholiance) 0,50% REVENDICATIONS 1. Utilisation cosmétique d'au moins un sophorolipide, en tant qu'agent amincissant, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées, lesdits sophorolipides répondant à l'une au moins des formules 1 ou II cidessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle, R2 est de l'hydrogène ou un groupement alkyle en Ci à C9, et R3 est un groupement hydrocarboné saturé ou non en C7 à C17- 2. Utilisation cosmétique d'au moins un sophorolipide, en tant qu'agent stimulant la synthèse de la leptine par les adipocytes, pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées, lesdits sophorolipides répondant à la formule 1 ou II ci-dessous : dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle, R2 est de l'hydrogène ou un groupement alkyle en Ci à Cg, et R3 est un groupement hydrocarboné saturé ou non en C7 à C17. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite composition contient au moins un sophorolipide répondant à la formule II ou II' ci-dessous : II dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite composition contient au moins un sophorolipide de formule III ou III' : III dans lesquelles Ri est de l'hydrogène ou un groupement acétyle et R4 est une chaîne hydrocarbonée linéaire présentant éventuellement une insaturation et comprenant 11, 13 ou 15 atomes de carbone. 5. Utilisation selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que ladite composition contient, à titre de sophorolipide majoritaire, le diacétate-6', 6" - L - (2'-O-ss-D-glucopyranosyl-ss-D-glucopyranosyl)-oxy)- 17-octadécénoïque lactone-1',4". 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition contient de 0,01 à 5%, et de préférence de 0,1% à 1% en poids de sophorolipides. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre un agent lipolytique cosmétiquement acceptable, de préférence choisi dans le groupe de l'adénosine-3',5'-cyclique monophosphate (AMPc) et de ses dérivés cosmétiquement acceptables, des agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et des agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdits sophorolipides sont obtenus par fermentation avec une levure, à partir de glucose et d'huile végétale ou de leurs esters. 9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que la fermentation est réalisée au moyen d'une souche de Candida bombicola ou de Candida apicola sur un substrat de nature glucidique, suivi d'une phase de production par bioconversion de deux substrats, l'un glucidique et l'autre lipidique. 10. Procédé de traitement cosmétique amincissant du corps humain destiné à diminuer les surcharges graisseuses sous-cutanées, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer à la surface de la partie du corps concerné une composition cosmétique contenant au moins un composé de la famille des sophorolipides tels que définis dans la revendication 1. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite composition contient au moins un sophorolipide tel que défini dans la revendication 3. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que ladite composition contient au moins un sophorolipide de formule III ou III' tel que défini dans la revendication 4. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite composition contient à titre de sophorolipide majoritaire le diacétate-6',6" L (2'-O-ss-D-glucopyranosyl-ss-D-glucopyranosyl)-oxy)-17-octadécéoïque lactone-1',4". 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ladite composition contient de 0,01 à 5%, de préférence de 0,1% à 1% en poids de sophorolipides. 15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que lesdits sophorolipides sont obtenus par un procédé de fermentation à partir de substrats végétaux. 16. Procédé selon l'une des revendications 10 à 15, caractérisé en ce que ladite composition contient en outre un agent lipolytique cosmétiquement acceptable, de préférence choisi dans le groupe de l'adénosine-3',5'-cyclique monophosphate (AMPc), de ses dérivés cosmétiquement acceptables, des agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et des agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase. 17. Composition cosmétique, notamment destinée à réduire les surcharges graisseuses sous-cutanées, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'agents actifs, - au moins un sophorolipide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5, et - au moins un agent lipolytique choisi dans le groupe constitué par l'AMPc et ses dérivés lipolytiques cosmétiquement acceptables, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase, dans un véhicule cosmétiquement acceptable. 18. Composition cosmétique selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,01 à 5 %, et de préférence de 0,01 à 1 %, en poids de sophorolipides. 19. Composition cosmétique selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce que l'agent lipolytique est l'AMPc ou l'un de ses dérivés cosmétiquement acceptables, choisi de préférence parmi ses sels et ses dérivés acylés, notamment un dérivé mono- ou dibutyryle. 20. Composition cosmétique selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'AMPc ou son dérivé lipolytique est présent à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 % en poids par rapport au poids total de ladite composition. 21. Composition cosmétique selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'agent lipolytique est un agent activateur de l'enzyme adénylate cyclase. 22. Composition cosmétique selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit agent activateur de l'enzyme adénylate cyclase est la forskoline ou un extrait de plante en contenant. 23. Composition cosmétique selon la revendication 22, caractérisée en ce que la forskoline ou l'extrait en contenant est présent à une concentration comprise entre 0,001% et 1%, et de préférence entre 0,05% et 0,25% en poids par rapport au poids total de ladite composition. 24. Composition cosmétique selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que l'extrait de plante est un extrait de Coleus forskohlii ou Plectranthus barbatus. 25. Composition cosmétique selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit agent activateur de l'adénylate cyclase est un extrait de la plante Tephrosia purpurea. 26. Composition cosmétique selon la revendication 25, caractérisée en ce que l'extrait de Tephrosia purpurea est présent à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 % en poids, de préférence entre 0,01 % et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. 27. Composition cosmétique selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'agent lipolytique est un agent inhibiteur de l'enzyme phosphodiestérase. 28. Composition cosmétique selon la revendication 27, caractérisée en ce que ledit agent inhibiteur de la phosphodiestérase est une xanthine, en particulier la 3-isobutyl-1-méthyl-xanthine ou IBMX, la caféine ou la théophylline. 29. Composition cosmétique selon la revendication 28, caractérisée en ce que ladite xanthine est présente à une concentration comprise entre 0,001 % et 10 %, de préférence comprise entre 0,01 % et 1 %, en poids par rapport au poids total de la composition.