Brevet FR2855771A1 — publié le 20041210

THERMOCYCLEUR L'invention concerne un thermocycleur, notamment pour l'amplification génique, comprenant au moins deux dispositifs de chauffage 5 qui prescrivent respectivement un niveau de température pour le chauffage d'un échantillon. On connaît un thermocycleur de ce genre, par exemple par le EP 1 252 931 A1. L'amplification génique (PCR, Polymerase Chain Reaction) est un procédé de la biologie moléculaire, qui permet de dupliquer plusieurs 10 fois de manière simple n'importe quelle séquence de base d'un segment d'ADN d'une information génétique. Pour obtenir au moyen de la duplication multiple d'une séquence de bases des facteurs d'amplification de, par exemple, plus de 100 000, un échantillon à traiter passe plusieurs fois, par exemple 30 fois, par un cycle défini de température. Dans le cycle 15 de température, il faut maintenir constants pendant une durée prescrite divers niveaux de température fixés, tandis que les transitions entre les divers niveaux de température doivent être aussi courtes que possible. Dans le cas d'un dispositif connu par le DE 38 08 942 A1, cela s'effectue en emplissant de liquide à mettre en température 20 successivement une chambre d'incubation qui contient des cuvettes d'incubation emplies d'échantillon. Mais le pompage des liquides prend beaucoup de temps. D'autres procédés utilisent pour la mise en température de récipients à échantillons de l'air, la capacité calorifique de l'air plus petite que celle d'un liquide ainsi qu'une vitesse de transmission 25 de la chaleur plus petite à la surface des récipients d'échantillons étant un inconvénient dans ce cas. Un procédé de ce genre est donc prévu principalement pour des récipients d'échantillons très petits. Un autre procédé en usage de mise en température des récipients d'échantillons opère à l'aide d'éléments à effet Peltier. 30 L'application de ce procédé est limitée aussi par la dimension des récipients d'échantillons puisque, au fur et à mesure que la dimension des éléments à effet Peltier augmente, leur inertie thermique augmente. En raison de cette limitation due à la dimension, la mise en température au moyen d'éléments à effet Peltier ne peut pas être appliquée en pratique dans des procédés dans lesquels un récipient d'échantillons sert en plus de l'amplification génique également à effectuer d'autres stades de traitement et d'analyse. Par le DE 19646 114, on connaît un thermocycleur dans lequel des blocs de chauffage doivent être mis en contact en alternance avec l'échantillon à mettre en température au moyen d'un dispositif de déplacement et de rotation coûteux à construire. L'invention vise un thermocycleur, notamment pour le procédé d'amplification génique particulièrement simple à construire, qui permet d'avoir une transition particulièrement rapide entre divers niveaux de température d'un échantillon, celui-ci se trouvant dans un récipient qui est approprié notamment pour effectuer, outre l'amplification génique, d'autres 15 stades de traitement et/ou d'analyse. On y parvient suivant l'invention par un thermocycleur comprenant une multiplicité de dispositifs de chauffage d'au moins un échantillon fixe pendant un cycle de température ayant plusieurs niveaux de température, dans lequel il est prévu, comme dispositif de chauffage, 20 plusieurs blocs mobiles de chauffage, ayant respectivement une surface de couplage pour le chauffage de l'échantillon et dans lequel les blocs de chauffage sont montés basculants, I'axe de basculement étant dirigé normalement aux surfaces de couplage. Le thermocycleur a comme dispositif de chauffage plusieurs blocs de chauffage pouvant être couplés 25 thermiquement à un échantillon fixe. Par la mise en position fixe de l'échantillon pendant un cycle de température, on empêche de manière sûre que des récipients d'échantillons ne soient endommagés par des stades éventuels de manipulation pendant le déroulement du cycle de température. D'une manière générale, le thermocycleur est particulièrement approprié 30 dans les cas dans lesquels une chambre d'échantillons ne peut pas être transportée ou ne peut l'être qu'avec beaucoup de difficultés. La mise en température de l'échantillon par des corps solides, à savoir par plusieurs blocs de chauffage ayant des niveaux de température différents, assure en outre, notamment par rapport à des procédés dans lesquels on doit passage très courts entre les divers niveaux de température. Les blocs de chauffage sont de préférence simples géométriquement, notamment parallélépipédiques et ont une surface de couplage plane pour le chauffage de l'échantillon. En variante, une surface de couplage peut avoir, par 5 exemple, aussi la forme d'une cavité dans le bloc de chauffage, ce qui donne une surface de transmission de la chaleur particulièrement bonne vers le récipient d'échantillon. Suivant un mode de réalisation particulièrement simple à construire, les blocs de chauffage sont montés basculants, notamment 10 dans une tôle support, I'axe de basculement étant parallèle à la normale aux surfaces d'accouplement des blocs de chauffage prévues pour le chauffage de l'échantillon. Dans ce mode de réalisation, les blocs de chauffage peuvent notamment de préférence être soulevés au moyen d'un dispositif de levage, normalement à la surface respective de couplage. Le 15 dispositif de levage comprend, en l'occurrence dans un mode de réalisation également simple à construire, de préférence un lever de renvoi, qui sert à donner le mouvement, notamment le déplacement des blocs de chauffage, et qui peut être actionné par un élément d'actionnement, par exemple par un électro-aimant d'attraction. Les dispositifs de chauffage constitués en blocs de chauffage ont typiquement une température supérieure à la température ambiante, notamment des températures comprises entre 20 C et 100 C. Pour minimiser le rayonnement calorifique provenant des plaques de chauffage, ceux-ci sont, suivant un perfectionnement préféré, entourés à 25 I'extérieur de la surface respective de couplage d'un manchon isolant. Le thermocycleur convient pour les échantillons à mettre en température de dimensions très différentes, le domaine d'application principal ne résidant pas dans le traitement d'échantillons miniaturisés. Les blocs de chauffage sont de préférence simples géométriquement en étant 30 notamment de forme parallélépipédique ou cylindrique et ont une superficie de la surface de couplage de préférence d'au moins 1 cm2. Par la grande aptitude à emmagasiner de la chaleur et à la transmettre des blocs de chauffage, ceux-ci sont particulièrement appropriés pour chauffer ou refroidir rapidement, même des échantillons assez grands ayant par 35 exemple une superficie de transmission de la chaleur de 18 mm x 18 mm. Indépendamment du fait que les blocs de chauffage aient un manchon isolant, il est prévu, suivant un perfectionnement préféré, un ventilateur de refroidissement des blocs de chauffage à l'extérieur des surfaces de couplage. L'utilisation d'un ventilateur de ce genre sert à 5 empêcher la surcharge thermique d'éléments constitutifs du thermocycleur et facilite le maintien constant particulièrement bon du niveau de température s'établissant pendant le cycle de température. On peut chauffer les blocs de chauffage par n'importe quel élément de chauffage, par exemple par des éléments de chauffage à 10 résistance. D'une manière particulièrement avantageuse, on utilise un transistor de puissance comme élément de chauffage. Le transistor de puissance, notamment le transistor bipolaire au silicium, a une tension de polarisation dans le sens direct qui dépend de la température de la section base-émetteur et peut être ainsi utilisé en même temps comme sonde de 15 température. Indépendamment du point de savoir si l'élément de chauffage est utilisé pour repérer la température, le bloc de chauffage a de préférence une sonde de température particulière, grâce à quoi on obtient, le cas échéant, un repérage redondant de la température et ainsi une plus grande sécurité des opérations. Pour établir de manière contrôlée les divers niveaux de température dans le cycle de température, ainsi que pour mettre en position exactement dans le temps et dans l'espace les blocs de chauffage, il est prévu de préférence des dispositifs correspondants de réglage et de commande, les opérations de mise en température et de mise en position 25 étant combinées par une commande commune de système. Le thermocycleur peut comprendre une commande de système coopérant avec le dispositif de réglage de la température et avec le dispositif de réglage de position. La capacité d'emmagasinage de la chaleur des blocs de 30 chauffage peut être utilisée avec profit pour obtenir des transitions rapides de température. Par exemple, dans le cas d'un échantillon à refroidir, on règle d'abord la température du bloc de chauffage à un niveau plus bas que le niveau de température à atteindre dans l'échantillon. L'invention a aussi pour objet un procédé de chauffage d'un 35 échantillon dans un cycle de température par un dispositif suivant l'invention, caractérisé en ce que l'on règle la différence de température, entre l'échantillon à mettre à température au moyen du bloc de chauffage et le bloc de chauffage avant le contact de l'échantillon avec la surface froide de couplage du bloc de chauffage, à une valeur plus grande que la variation de température de l'échantillon à obtenir. L'avantage de l'invention réside notamment dans le fait que par des blocs de chauffage qui peuvent être remplacés, un échantillon fixe subit de façon ménagée un cycle de température ayant des variations rapides de température, le récipient d'échantillon étant prévu de préférence 10 tant pour effectuer l'amplification génique que pour effectuer d'autres stades de traitement et/ou d'analyse. On explicite ci-après de façon plus précise un exemple de réalisation de l'invention au moyen d'un dessin, dans lequel: la FIGURE 1 est une vue en coupe transversale schématique d'un 15 thermocycleur pour le procédé d'amplification génique; la FIGURE 2 représente le thermocycleur en vue en plan schématique; la FIGURE 3 représente un bloc de chauffage du thermocycleur; la FIGURE4 est un schéma fonctionnel de la commande du thermocycleur; et la FIGURE 5 est un schéma synoptique d'un déroulement d'une réaction d'amplification génique s'effectuant à l'aide du thermocycleur. Des parties et des paramètres qui se correspondent sont munis dans toutes les figures des mêmes signes de référence. Un thermocycleur 1 représenté de manière simplifiée aux FIGURES 1 et 2 comportent trois blocs 2 de chauffage. Il est prévu un premier bloc 2a de chauffage pour établir une température de 95 C, un deuxième bloc 2b de chauffage pour établir une température de 55 C et un troisième bloc 2c de chauffage pour établir une température de 72 C dans 30 un récipient d'échantillons, qui n'est pas représenté, désigné aussi comme étant une cartouche à jeter. Le récipient d'échantillons est prévu en l'occurrence tant pour effectuer la réaction d'amplification génique au moyen du thermocycleur 1 que pour d'autres stades de traitement et d'analyse et est donc de dimensions plus grandes que ce qui serait 35 nécessaire seulement pour l'amplification génie. Une surface 3 de couplage de chaque bloc 2a, 2b, 2c de chauffage a respectivement une superficie de mm2 ou est plus grande. Les blocs 2a, 2b, 2c de chauffage sont montés coulissants dans un plateau 4 support ayant à peu près la forme d'un segment de 5 cercle comme cela est indiqué par des flèches doubles à la FIGURE 1, le plateau 4 support pouvant basculer par rapport à un axe A de basculement normal aux surfaces 3 de couplage de sorte que chacun des blocs 2a, 2b, 2c de chauffage peut être mis en contact au choix avec le récipient d'échantillons fixe. Dans la zone de l'axe A, le plateau 4 support est 10 traversé par un tourillon 5 qui est maintenu dans un coussinet 6 de palier. Un dispositif 7 d'entraînement en rotation est réalisé sous la forme d'un motoréducteur à indicateur d'angle et comporte un interrupteur 8 de fin de course et d'indication de position des bornes 9 de moteur et des bornes d'indicateur de position. Sur la partie de pourtour en forme d'arc de cercle du plateau 4 support est disposé un élément 11 de guidage de section transversale en forme de U. L'échantillon à chauffer est à proximité de l'élément 11 de guidage. Chaque bloc 2a, 2b, 2c de chauffage peut coulisser normalement à la surface 3 respective de couplage dans un 20 manchon 12 calorifuge servant de fixation. Les manchons 12 sont fixés rigidement dans le plateau 4 support. Les bornes 13, 14 électriques du bloc 2a, 2b, 2c de chauffage passent de manière souple dans une fente 15 du manchon 12. Une autre fente 16 du manchon 12 permet l'attaque d'un levier 17 de renvoi formant une partie d'un dispositif 24 de levage dans le 25 manchon 12 pour déplacer le bloc 2 de chauffage (FIGURE 1). Le levier 17 de renvoi est monté dans une fourche 18 formant palier et peut être actionné par un électro-aimant 19 d'attraction ayant des bornes 20 électriques. L'effet de protection du manchon 12 est renforcé par un ventilateur 25 qui envoie de l'air ambiant dans des zones à l'extérieur de la 30 surface 3 de couplage. Les blocs 2a, 2b, 2c de chauffage ont, dans l'exemple de réalisation, des formes identiques mais ils pourraient avoir, par exemple, aussi des masses différentes. Un bloc 2 de chauffage servant de dispositif de chauffage 35 est représenté en détail à la FIGURE 3. Le bloc 2 parallélépipédique de chauffage est en un matériau bon conducteur de la chaleur, par exemple en aluminium ou en cuivre et a comme élément 21 de chauffage un transistor bipolaire au silicium. Il y a en outre, à proximité de la surface 3 de couplage, dans un trou 22 une sonde 23 de température, par exemple une sonde 5 Pt100. La masse calorifique du bloc 2 de chauffage est nettement plus grande que la masse calorifique du récipient d'échantillons, y compris l'échantillon à mettre en température. Par un bon couplage thermique avec la surface 3 de couplage et par une mise en position rapide du bloc 2 de chauffage, on peut obtenir des temps de passage courts entre divers 10 niveaux de température dans l'échantillon. On peut obtenir encore une augmentation de la vitesse de refroidissement ou de chauffage dans l'échantillon par le fait que la température du bloc 2 de chauffage est plus basse ou plus haute avant l'opération de refroidissement ou de chauffage que la température finale à 15 obtenir dans l'échantillon. On tire parti ainsi également de la capacité d'emmagasinage de la chaleur du bloc 2 de chauffage pour la variation de température de l'échantillon. On facilite en outre ainsi la régulation exacte de la température à obtenir. Pour réguler la température et/ou pour la contrôler, on utilise en plus de la sonde 23 de température également le 20 transistor 21 dont la section base-émetteur qui représente, considérée du point de vue électrique, une diode au silicium à une tension de polarisation dans le sens direct dépend de la température. En l'occurrence, un abaissement de cette tension d'environ 2, 2 mV/ C est donné constamment par les propriétés de matière du silicium, de sorte qu'un repérage de la 25 température est possible en mesurant la tension de polarisation en sens direct. Le bloc 2 de chauffage a ainsi des'sondes 21, 23 diverses de température. La FIGURE 4 est un schéma fonctionnel simplifié de la commande électronique du thermocycleur. Une commande ST de système 30 est combinée dans ce cas à la fois à un dispositif PS de réglage de position et à un dispositif TR de réglage de la température. Une information sur le choix de l'élément 2a, 2b, 2c de chauffage est acheminée par la commande ST de système au dispositif PS de réglage de position qui, en fonction de cette prescription, interagit avec l'électro-aimant 19 d'attraction, le dispositif 35 7 d'entraînement en rotation ainsi que l'interrupteur 8 de fin de course donnant la position et, le cas échéant, avec d'autres dispositifs de mise en position et/ou de mesure. Le dispositif TR de réglage de la température comprend un microcontrôleur MC qui reçoit des valeurs T1l, T2s, T3s de température de 5 consigne prescrites par la commande ST du système pour le cycle de température à effectuer et renvoie des valeurs T1, T2, T3 instantanées de température à la commande ST du système. Au microcontrôleur MC sont raccordés par, respectivement, un convertisseur AD analogique-numérique ou un convertisseur DA numérique-analogique la sonde 23 de température 10 ainsi que l'élément 21 de chauffage de chaque bloc 2a, 2b, 2c de chauffage. Entre les sondes 23 de température et les convertisseurs AD analogiquesnumériques est monté un traitement SB du signal qui est prévu d'une façon analogue mais non représenté aussi pour l'élément 21 de chauffage dans la mesure o celui-ci est utilisé en même temps comme 15 sonde de température. La FIGURE 5 illustre au moyen d'un schéma synoptique un déroulement typique d'une amplification génique en soi connue effectuée à l'aide du thermocycleur. Le début VS du procédé s'effectue à la température ambiante, par exemple à 20 oC. Dans le premier stade S1 du 20 procédé est prescrit le nombre Nzyklus de cycles, typiquement de 25 à 35. Dans un deuxième stade du procédé s'effectue un chauffage au moyen du bloc 2a de chauffage à la première température Tsl de consigne de 95 OC. Cette température est maintenue dans le stade S3 du procédé pendant 4 minutes et 30 secondes. Les stades S2, S3 (A-A) du procédé servent à la 25 préparation du cycle suivant. Dans le quatrième stade S4 du procédé, la température Tsi de 95 C est maintenue pendant 30 secondes. Ce stade du procédé est désigné aussi comme fusion (melting). L'ADN à double brin est séparé dans ce cas comme une fermeture éclair en ses deux brins simples. Dans 30 le stade S5 suivant du procédé s'effectue un refroidissement à la deuxième température Ts2 de consigne de 55 C au moyen du deuxième bloc 2b de chauffage. Le bloc 2b de chauffage a été mis en température avant le contact avec l'échantillon, par exemple à seulement environ 50 OC, de sorte que lors du couplage avec le récipient d'échantillons (cartouche), il absorbe 35 d'abord un excès de chaleur de l'échantillon et la température du bloc de chauffage s'élève ainsi déjà à presque 55 C. Cette transmission rapide d'énergie de l'échantillon au bloc 2b de chauffage ayant une masse calorifique appropriée simplifie le réglage venant ensuite à la température TS2 de consigne de 55 C à l'aide du dispositif TR de réglage de la 5 température. Le stade S6 de procédé pendant lequel l'échantillon est maintenu pendant 30 secondes à la température TS2 est désigné comme étant un annelage (anealing). Des amorces de petits tronçons d'ADN artificiels d'environ 20 à 40 longueurs de paires de base s'annellent aux cordons d'ADN. Ensuite, l'enzyme ADN- polymérase s'annelle à l'amorce 10 annelée, Dans le septième stade S7 du procédé, on porte l'échantillon à l'aide du troisième bloc 2c de chauffage à la troisième température Ts3 de consigne de 72 OC et on maintient ensuite au stade S8 du procédé cette température Ts3 pendant 30 secondes. Dans ce que l'on 15 appelle l'allongement (élongation), I'ADN- polymérase passe le long de l'ADN monobrin en produisant le deuxième brin manquant. Lors du déroulement des stades S4 à S9 (B-B), du procédé, la boucle interne d'amplification génique (boucle PCR), I'ADN est dédoublé. Dans le stade S10 des procédés venant immédiatement ensuite, on se 20 pose la question de savoir si le nombre Nzyklus de cycles est déjà atteint. Si ce n'est pas le cas (symbole " 0 "), le cycle de température est recommencé en commençant au stade S4 du procédé. L'ensemble de tous les cycles S4 à S10 (C-C) de température est désigné aussi comme étant la boucle extérieure d'amplification génique. Après le stade S10 du procédé, 25 on atteint pour un nombre NZyklus de cycles complet (symbole " I ") la fin VE du procédé, la séquence de base étant présente en une quantité qui permet une détection simple par des méthodes chimiques. REVENDICATIONS 1. Thermocycleur comprenant une multiplicité de dispositifs (2a, 2b, 2c) de chauffage d'au moins un échantillon fixe pendant 5 un cycle de température ayant plusieurs niveaux (T1s, T2S, T3s) de température caractérisé en ce qu'il est prévu, comme dispositif de chauffage, plusieurs blocs (2a, 2b, 2c) mobiles de chauffage, ayant respectivement une surface (3) de couplage pour le chauffage de l'échantillon et en ce que 10 les blocs (2a, 2b, 2c) de chauffage sont montés basculants, I'axe (A) de basculement étant dirigé normalement aux surfaces (3) de couplage. 2. Thermocycleur suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les blocs (2a, 2b, 2c) de chauffage sont 15 maintenus dans un plateau (4) support basculant. 3. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce q u e les blocs (2a, 2b, 2c) sont montés coulissants au moyen d'un dispositif (24) de levage normalement à la 20 surface (3) respective de couplage. 4. Thermocycleur suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif (24) de levage comprend un levier (17) de renvoi. 5. Thermocycleur suivant la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le dispositif (24) de levage comprend un électro-aimant (19) d'attraction. 6. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les blocs (2a, 2b, 2c) de chauffage sont entourés à l'extérieur de la surface (3) respective de couplage d'un manchon (12) isolant. 7. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la surface (3) de couplage de chaque bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage a une superficie d'au moins 100 mm2. 8. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 7, ca ra ct é ri s é p a r un ventilateur (25) refroidissant un bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage à l'extérieur de la surface (3) de couplage. 9. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 8, 15 caractérisé en ce que le bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage a comme élément (12) de chauffage un élément de chauffage à résistance. 10. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le bloc de chauffage a un transistor de 20 puissance comme élément (21) de chauffage. 11. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 10, c a r a c t é r i s é en ce q u e le bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage a une sonde (21, 23) de température. 12. Thermocycleur suivant les revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le transistor (21) de puissance est prévu comme sonde de température. 13. Thermocycleur suivant l'une des revendications 10 à 12, caractérisé par un dispositif (TR) de réglage de la température. 14. Thermocycleur suivant l'une des revendications 1 à 13, ca ra c t é ri s é p a r un dispositif (PS) de réglage de position. 35 15. Thermocycleur suivant les revendications 13 et 14, caractérisé par une commande (ST) de système coopérant avec le dispositif (TR) de réglage de la température et avec le dispositif (PS) de réglage de position. 16. Procédé de chauffage d'un échantillon dans un cycle de température par un dispositif suivant l'une des revendications 1 à 15, c a r a ct é r i s é en ce q u e l'on règle la différence de température, entre l'échantillon à mettre à température au moyen du bloc (2a, 2b, 2c) de 10 chauffage et le bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage avant le contact de l'échantillon avec la surface froide de couplage du bloc (2a, 2b, 2c) de chauffage, à une valeur plus grande que la variation de température de l'échantillon à obtenir.