Brevet FR2855054A1 — publié le 20041126

Moyens pour bloquer ou retarder une mort cellulaire in vitro L'invention a pour objet une méthode et des produits pour bloquer ou retarder une mort cellulaire in vitro, en particulier de neurones primaires ou de lignées cellulaires. Depuis une dizaine d'années, l'apoptose et les formes associées de mort cellulaire sont devenues un sujet d'intérêt pour les neurobiologistes de par leurs implications dans différentes pathologies neurodégénératives. La mort cellulaire active (apoptotique et/ou autophagique) est intimement liée au développement du cerveau à travers l'organisation du système nerveux, par la destruction de neurones n'ayant pas établi de connexions synaptiques fonctionnelles (Clarke, 1990 ; Yuan, 2000). De plus, la mort neuronale a été impliquée dans des pathologies aigües comme l'hypoxie, l'ischémie/reperfusion, ou une atteinte traumatique du cerveau et/ou de la moelle épinière (Plesnila et al, 20001 ; Matson, 2000 ; Lipton, 1999). L'apoptose contribue également à la perte sélective des fonctions cognitives et motrices lors du développement de désordres neurodégénératifs chroniques tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie d'Huntington, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et les ischémies cérébrales (Yuan, 2000 ; Mattson, 2000). L'apoptose neuronale est un mécanisme actif de suicide cellulaire qui partage des voies communes avec l'apoptose des cellules non neuronales et qui peut être divisé en phases séquentielles incluant une phase d'initiation, une phase de décision, une phase d'éxécution et enfin une phase de dégradation. Cette dernière mène à la destruction de composants cellulaires par différents médiateurs en particulier les caspases, une famille de protéases cystéine-dépendante et aspartate-spécifique (Troy and Salvesen, 2002 ; Thornberry and Lazebnik, 1998 ; Metzstein, 1998). La caspase- 3 est une caspase effectrice impliquée dans l'apoptose morphogénétique du système nerveux central des mammifères (Kuida, 1996). Cependant, cette caspase est également impliquée dans des processus non physiologiques tels que la maladie d'Hungtington ou la maladie d'Alzheimer. In vitro, la caspase-3 a été impliquée dans l'apoptose des cellules hypoxiques de l'hippocampe (HN2-5) (Adayev, 1998) et est nécessaire à l'apoptose induite par déprivation en sérum dans la lignée PC12. D'autres caspases jouent un rôle important dans l'apoptose neuronale comme les caspases 2,8 et 9 (Troy, 2002). Il a également été suggéré que la mitochondrie pouvait jouer un rôle comme organelle de décision, sous le contrôle des protéines de la famille Bcl2, durant le processus d'apoptose neuronale (Davies, 1995 ; Reed, 1998 ; Sadoul, 1998 ; Chang, 2002). De fait, l'engagement dans le processus de mort est lié, dans certains modèles expérimentaux, à des altérations mitochondriales incluant la production excessive de radicaux oxygénés, la perméabilisation des membranes mitochondriales et le relargage de facteurs apoptogènes tels que : cytochrome c, Smac/Diablo, AIF (Apoptosis Inducing Factor), endonucléase G et Omi/Htra2 (Wang, 2001). Le relargage de ces facteurs déclenche alors des voies caspasesdépendantes et caspases-indépendantes aboutissant à la destruction du cytoplasme et du noyau cellulaires (Gorman et al., 2000 ; Mattson,2000 ; Chang and Johnson, 2002). De fait, l'action combinée des facteurs mitochondriaux et des caspases contribue à la phase de dégradation de l'apoptose menant à une condensation cellulaire, une condensation nucléaire, l'apparition de corps apoptotiques et l'ecto-exposition des résidus phosphatidyl-sérines (Kerr et al., 1972). Néanmoins, la contribution relative de la mitochondrie, des caspases et d'autres voies durant l'apoptose neuronale reste toujours à définir ou à redéfinir en fonction du couple inducteur de mort/type cellulaire étudié. Jusqu'à la fin des années 90, l'analyse individuelle des cellules apoptotiques neuronales, en particulier des neurones primaires, a été réalisée par microscopie à fluorescence. Malgré les avantages de cette technique, l'analyse d'un nombre important de cellules reste une manipulation longue et laborieuse. De plus, l'extinction de fluorescence de certaines sondes peut réduire la fiabilité de l'analyse. Enfin, l'agrégation des neurones primaires rend également la quantification automatique impossible sur des populations importantes de cellules. Ces inconvénients techniques ont amené les inventeurs à proposer une approche complémentaire et quantitative afin d'analyser la dynamique des phénomènes d'apoptose applicable en particulier aux neurones corticaux primaires ou à des lignées neuronales. L'approche suivie a permis de développer une méthode performante afin d'organiser et d'analyser les événements moléculaires liés à l'apoptose et d'élaborer des produits de grand intérêt à effet protecteur vis-à-vis de l'apoptose. L'invention vise donc à fournir une méthode constituant une plate-forme d'analyse multiparamétrique et quantitative de la biologie cellulaire de l'apoptose, en particulier de l'apoptose neuronale. Elle vise également, en mettant à profit les résultats obtenus par cette méthode, à fournir de nouveaux composés à effet protecteur vis-à-vis de l'apoptose, utilisables dans le traitement de maladies neurodégénératives. L'invention vise ainsi une méthode pour bloquer ou retarder une mort cellulaire in vitro, caractérisée en ce qu'on détermine, selon le mode d'induction, dans un type cellulaire donné, la cascade d'évènements en termes de machinerie d'apoptose et qu'on choisit de bloquer ou retarder un événement en amont du point de non retour de l'apoptose. Cette détermination est réalisée en combinant la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence et est appliquée, selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, sur des neurones primaires ou des lignées neuronales. Les protocoles utilisés, illustrés dans les exemples, permettent 1) d'analyser en temps fixe et en temps réel les processus cellulaires et biochimiques contribuant à l'apoptose neuronale; 2) d'étudier leur dynamique dans des neurones primaires corticaux ; d'obtenir des informations quantitatives et multiparamétriques sur la population de neurones en train de mourir. Plus particulièrement, l'analyse des événements moléculaires liés à l'apoptose neuronale, neurones primaires ou lignées neuronales, est conduite, selon une première approche, de manière à détecter les phases de décision, effectrice, dégradation de l'apoptose. La stratégie repose sur l'utilisation de la 7-AAD, l'Annexine-V, les paramètres FSC/SSC pour détecter la phase de dégradation, le FLICA caspase-3 pour la phase effectrice, le JC-1 pour la phase de décision. Les propriétés spectrales de la 7-AAD permettent de détecter facilement ces paramètres à la fois par cytométrie en flux et par microscopie de fluorescence. Ces combinaisons nous permettent de détecter, quantifier, et d'analyser des populations précises de neurones après déprivation en sérum ou traitement à la staurosporine. La deuxième approche comprend le suivi en temps réel de la chute de f1 \{lm. Ces approches en temps fixe et temps réel constituent des outils de grand intérêt pour étudier les dynamiques de l'apoptose des neurones en réponse à divers stimuli, comme les peptides P-amyloïdes, l'acide 3-nitropropionique, des protéines virales et les infections par des entérovirus. Cette plateforme technologique pourra aussi être appliquée pour caractériser l'activation d'autres caspases, telles la caspase-6 (Zhang et coll., 2000), la caspase-12, la caspase-9 et la caspase-8. De manière avantageuse, ces techniques d'investigation rapides fournissent un outil quantitatifpour l'analyse à haut rendement d'échantillons et sont utilisables pour permettre le criblage et la caractérisation de nouvelles drogues neuro-protectrices. L'évènement choisi dans la cascade pour élaborer des produits à effet neuro-protecteur est l'activation de la caspase-2. Le terme "caspase-2", tel qu'utlisé dans la description et les revendications couvre les différentes formes obtenues par épissage alternatif. L'invention vise ainsi des inhibiteurs de la caspase-2. De manière préférée, il s'agit d'une molécule d'ARN isolée à double brins, caratérisée en ce qu'elle est capable de cibler spécifiquement les ARNm de la caspase-2, ce qui conduit à une réduction ou une suppression de l'expression de la caspase-2. L'invention vise en particulier la réduction ou la suppression de l'expression de la caspase-2 dans des neurones primaires ou des lignés neuronales , en particulier d'origine humaine. Chaque brin d'ARN comporte avantageusement de 15 à 25 nucléotides, de préférence de 19 à 25 nucléotides. L'extrémité des brins est de préférence stabilisée contre leur dégradation. Il s'agit tout particulièrement de duplexes d'ARNsi capables de réduire ou de supprimer sélectivement l'expression de la caspase-2. En variante, les inhibiteurs de la caspase-2 sont des ARNsh. L'ARNsi double brin ou l'ARNsh est synthétique ou produit dans la cellule. L'invention vise également la synthèse de chacun des brins d'ARN, la combinaison des brins de manière à former une molécule à double brins capable de cibler de manière spécifique les ARNm de la caspase-2, spécialement de neurones primaires ou de lignées neuronales, en particulier d'origine humaine. Les ARN synthétisés sont introduits dans des cellules cibles humaines ou animales,ou des organismes d'origine humaine ou animale, dans des conditions conduisant à l'inhibition de l'expression de la caspase-2. L'étape d'introduction comprend l'utilisation de véhicules appropriés ou est réalisée par injection. En variante, on utilise des vecteurs contenant l'information génétique pour exprimer ces ARN. De tels vecteurs entrent également dans le champ de l'invention. Les inhibiteurs de l'invention sont encore caractérisés en ce qu'ils empêchent la mort cellulaire qu'elle soit de type apoptotique, nécrotique ou autophagique. Ces inhibiteurs sont utilisables à titre de médicaments en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes, à des doses adaptées au patient et à la pathologie à traiter. Pour l'administration de ces inhibiteurs on a avantageusement recours aux méthodes classiques d'introduction d'un acide nucléique dans une cellule cible. Compte tenu de leur effet neuro-protecteur, ces médicaments sont avantageusement utilisables pour le traitement des maladies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ischémies cérébrales. L'invention vise en outre l'application de la méthode pour bloquer ou retarder une mort cellulaire in vitro au criblage de molécules thérapeutiquement actives vis-à-vis de la mort cellulaire, en particulier de l'apoptose. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent , qui font référence aux figures 1 à 8, qui représentent respectivement, la figure 1, le protocole d'analyse par cytométrie en flux de dynamiques d'apoptose dans des neurones corticaux primaires ; la pureté des préparations a été déterminée en utilisant MAP-2 et GFAP Abs. La combinaison de la 7-AAD avec l'annexine V, FLICA ou JC-1 à permis la détection des phases de dégradations précoce, effectrice et de décision de l'apoptose. Hoechst 33-342 a été ajouté aux échantillons soumis à une analyse au microscope complémentaire. Une trypsinisation modérée permet de préserver la morphologie et la viabilité des neurones. Après re- suspension dans un milieu N5, les agrégats de neurones sont dissociés et les cellules analysées au cytomètre en flux ; la figure 2, la détection et la quantification de la phase de dégradation de l'apoptose neuronale par le 7-AAD et l'annexine V : (A) représente l'analyse de la cytométrie en flux de l'apoptose chez un témoin (Co) et chez des neurones déprivés en sérum (SD) par FSC/SSC et FSC/7-AAD. Les pourcentages de neurones positifs à 7-AAD sont indiqués ; (B) représente un micrographe de fluorescence de l'échantillon correspondant déprivé de sérum : bleu, coloration Hoechst ; rose - rouge colorations Hoechst et 7-AAD superposées ; (C) donne la corrélation entre les approches par cytométrie en flux et par microscopie (n=30) ; (D et E) représentent la détection combinée de 7-AAD et d'annexine V par cytométrie en flux (D) et microscope à fluorescence (E) de neurones vivants (7-AAD et annexine V- , sous-groupe L) et 3 sous- groupes apoptotique : précoce (annexine V+ , 7-AAD- , sous-groupe 1), apoptotique tardif (annexine V+ , 7-AAD+ , sous-groupe 2), et apoptotique final (annexine V- , 7-AAD+ , sous-groupe 3). On note une localisation périphérique de la coloration de l'annexine V ; (F) les cinétiques de l'apparition des sous-groupes apoptotiques au cours de 36 heures de déprivation en sérum (les pourcentages de chaque sous-goupe sont indiqués); la figure 3, la détection combinée de l'activation de la caspase-3 durant l'apoptose : (A) donne les résultats en cytométrie en flux de neurones après 24 heures de déprivation en sérum, ce qui révèle 4 sous-groupes neuronaux : neurones vivants (caspase-3-, 7-AAD-, sous-groupe L), neurones apoptotiques précoce (caspase-3+, 7- AAD-, sous-groupe 1), neurones apoptotiques tardifs (caspase-3+, 7-AAD+, sous-groupe 2), et neurones apoptotiques de fin d'étape (caspase-3-, 7-AAD+). Troie sous-groupes sont identifiés en FSC/SSC (partie droite ; (B) représente la visualisation au microscope à fluorescence de sous-groupes définis par cytométrie en flux en l'absence (gauche) ou en présence droite de l'inhibiteur Q-VD-OPH de la pan-caspase ; (C) l'analyse au microscope de sous-groupes neuronaux en utilisant la détection combinée de l'activité caspase-3 (FLICA-vert) avec Hoescht 342 ou 7-AAD. La déprivation en sérum est effectuée en l'absence (L, 1,2,3) ou en présence des inhibiteurs de protéase indiqués. On note une localisation granulaire de la caspase-3 (fluorescence verte) chez les neurones apoptotiques et la formation d'éléments apoptotiques dans les cellules caspase-négatifs 7-AAD+. Hoescht et FLICA-vert sont partiellement co-localisés dans le sous-groupe 1 (fluorescence turquoise, mélange de vert et de bleu) ; donne la distribution de neurones apoptotiques précoces (sous-groupe 1, 7-AAD- ) et tardif (2+3, 7-AAD+ ) selon leur expression relative de la coloration FLICA (déterminée avec un microscope à fluorescence) ; donne les comparaisons stastitiques des approches en cytométrie en flux (F. C.) et au microscope à fluorescence (F. M.) pour la quantification de différentes phases apoptotiques (n=20). Les valeurs p sont indiquées ; (F) donne les résultatss de la co-détection par cytométrie en flux et microscopie de l'activité de la caspase-3 et l'expostion PS au cours de la déprivation en sérum. L'analyse temps-réponse est donnée. Les images au microscope correspondent aux sous-groupes "a" à "d". La fluorescence en rouge révèle l'activité de la caspase-3 (FLICArouge), la fluorescence verte, l'exposition à PS (annexine V-FITC), la fluorescence bleue, la coloration nucléaire (Hoescht 342). la figure 4, la détection combinée de ATm par JC-1 avec la perméabilité à 7-ADD dans les neurones : (A et B) donne les images au microscocope à fluorescence de neurones vivants (témoins 24h- ; Co) et déprivés en sérum (SD) colorés avec JC-1 et Hoescht. Les neurones corticaux primaires peuvent être identifiés comme étant vivants (sous-groupe I) avec un ##m élevé (fluorescence orange cytoplasmique) et un noyau normal (fluorescence bleu indigo), ou apoptotiques (sousgroupe II) avec dissipation de ##m (fluorescence verte cytoplasmique diffuse) et une condensation nucléaire (fluorescence bleu turquoise) ; les résultats FS avec JC-1 et 7-AAD des neurones Co et SD. Les histogrammes de cytométrie en flux montrent deux sous-groupes de neurones avec des mitochondries : sous-groupe II' non réactif à 7-AAD et sous-groupe II", 7-AAD positif ; (C) la visualisation des sous-groupes I, II', II" par co-détection de ##m (JC-1) et de la perméabilité de la membrane plasmique (7-AAD) au miscroscope à fluorescence ; (D) la cytométrie en flux en fonction du temps des sous-groupes II' et II" de neurones déprivés en sérum ; (E) l'évaluation de l'effet protecteur de l'acide bongkrékique (BA) sur ATm et la perméabilisation de la membrane plasmique chez des neurones déprivés en sérum (FS orange JC-1/7-AAD) (voir les histogrammes correspondants). La ligne grise correspond à l'échantillon déprivé en sérum. Les pourcentages d'événements JC-1 orange pâle/7-AAD négatif (sous-groupe II') et d'événements JC-1 orange pâle/7-AAD positif (sous-groupe II") sont indiqués dans les quarts correspondants. la figure 5, la détection en temps réel de la variation de A Fm dans les neurones corticaux primaires : (A) représente le photoblanchiement induit par des irradiations répétées au microscope à fluorescence. Les micrographes des neurones colorés avec JC-1 après 1, 3, 5, 10 , 15 irrdadiations (1,2 s ; Watts). L'intervalle entre deux irradiations est de 1 min. On note une disparition progressive de la fluorescence orange. (B) la régression logarithmique de l'intensité de fluorescence JC-1 orange ; (C) le protocol de contrôle en temps réel de ##m en utilisant JC-1 et la cytométrie en flux ; (D) l'application à des neurones primaires : (Dl) image au microscope à fluorescence de neurones traités ou non avec mCICCP (100 M ; 30 min.) ; (D2) contrôle en temps réel des fluorescences JC-1 orange et JC-1 vert par cytométrie en flux ; (D3) dépolarisation des mitochondries (JC-1 orange, JC-1 orange/vert) et les variations de tailles (FSC)/granularité (SSC) obtenues avec les mêmes échantillons. la figure 6, l'application des analyses en temps réel de ##m à des neurones traités par MPTP et SNP par cytométrie en flux : (A) analyse en temps réel par cytométrie en flux (fluorescence JC-1 orange) durant 15 min. de traitement avec du milieu seul (Co), 0,6 mM de SNP ou 1 mM de MPTP (en rouge, neurone non dépolarisé et en vert, neurones dépolarisés ; visualisation à un temps donné par microscopie à fluorescence de ATm. Les neurones sont traités (Co : neurones non traités) avec 0,6 mM de SNP ou 1 mM de MPTP pendant 45 min. avant marquage avec JC-1/Hoescht ; (C) l'analyse en cytométrie en flux en temps réel du rapport FSC/SSC et de ##m de neurones traités par MPTP. Les lignes rouge correspondent à la moyenne des neurones non dépolarisés (comme défini en A) et les pointillés en vert correspondent aux neurones dépolarisés (comme défini dans A) : (CI) montre les modifications morphologiques parmi les neurones à ##m élevé (ligne rouge) et à L1\{lm faible (pointillés vert) pendant 15 min. de traitement avec MPTP. L1\{lm change dans la totalité de la population neuronale (moyenne de fluorescence JC-1 orange) (C2 ; ligne noire) ou dans les neurones à L1 \{lm élevé (lignes rouge) versus L1 \{lm faible (pointillés vert) (C3) ; la figure 7, la hiérarchie chronologique des événements d'apoptose établis en combinant les analyses de cytométrie en flux et au microscope. Les événements apoptotiques sont indiqués avec un trait plein et l'activation modérée de la caspase-3 ainsi que l'exposition à PS sont indiquées par des lignes plus fines. la figure 8, un Western blot montrant l'effet d'un ARNsi anti-caspase-2 double brins sur l'expression endogène de la caspase -2 dans les neurones corticaux de souris. la figure 9, un ARNsh selon l'invention, et la figure 10 un vecteur transfert selon l'invention. Plateforme d'analyse multiparamétrique et quantitative de la biologie cellulaire de l'apoptose neuronale Matériels et méthodes Isolement et culture de neurones corticaux. Les neurones corticaux primaires ont été isolés d'embryons de souris Swiss de 14 jours (Janvier, Le Genest-St-Isle, France). Les souris gravides ont été sacrifiées et leurs embryons ont été prélevés. Les néo-cortex ont été isolés, et une dissociation mécanique en milieu Eagle's Basal Medium (EBM, Eurobio, Les Ulis, France) supplémenté avec 5% de sérum de cheval (HS, Eurobio) et 2,5% de sérum de veau fétal (FCS, Eurobio) a permis d'isoler les neurones corticaux primaires. La viabilité a été évaluée par exclusion au bleu trypan, et était supérieure à 85%. Les neurones ont été ensemencés à une densité de 7,105 de cellules vivantes par cm2 dans 500 l de milieu EBM et sur puits recouverts de polyéthylènimine (PEI, 1 mg/mL, Sigma, St Quentin Fallavier, France) (plaques 24 puits) (Sarstedt). Pour les observations microscopiques à x1000, les neurones ont été cultivés sur lamelles Lab-Teck recouvertes de PEI (Nalge Nunc Internationnal, Naperville, IL, USA) à la même densité. Après deux jours, le milieu de culture a été remplacé par du milieu N5 contenant 180 mg/L glucose, 5% HS et 1% FCS, et changé quotidiennement. Un pulse de 24hr avec 100 M de cytosine -D-arabinofuranoside (Ara C, Sigma) a été réalisé afin d'inhiber la croissance d' astrocytes. L' excitotoxicité a été empêchée par l'addition de 1 M de l'antagoniste du NMDA 5-méthyl-10,ll-dihydro-5H-dibenzocycloheptèn-5,10-imine maléate (MK-801, Research Biochemicals International). L'apoptose a été induite sur des cultures de 5 jours par une déprivation en sérum ou par un traitement par 0.5 M de staurosporine (Sigma). A cet effet, les cellules ont été lavées trois fois avec du milieu N5 sans sérum avant l'incubation finale dans ce même milieu. Les expériences de cinétique ont été réalisées jusqu' à 100 heures de déprivation. Les cultures ont été gardées dans un incubateur à 5% CO2 et à 37 C. L'inhibition de la transition de perméabilité mitochondriale (MPT) a été réalisée par un prétraitement par 25 M d' acide bongkrékique (Oncogene Research, Nottingham, USA). La cyclosporine A (Sigma) a été testée à 1-20 M. Immunochimie La pureté des échantillons de neurones a été évaluée par immunochimie. Les cellules ont été fixées en PBS contenant 4% paraformaldéhyde (Sigma) pendant 20 minutes. Après trois lavages en PBS, les cellules ont été perméabilisées pendant 30 min. en PBS contenant 0,025% Triton X-100 (Sigma). les plaques ont été traitées avec un tampon de blocage contenant 10% FCS et 1% Bovine Sérum Albumin (BSA, Sigma) et PBS pendant deux heures. Les anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine 2 associée aux microtubules (Microtubule Associated Protein 2, MAP-2, 1:1000, Sigma) ou l'anticorps polyclonal dirigé contre la "Glial Fibrillary Acidic Protein " (GFAP, 1:100, Dako) ont été incubés toute la nuit à 4 C en PBS contenant 1% BSA et 0,05% Tween 20 (Sigma). Les plaques ont été rincées en PBS et incubées avec un anticorps anti-souris ou-lapin conjugé a la CY3 (1:1000, Sigma) pendant 2 heures. Après un contre-marquage avec 1 M de Hoechst 33342, les cellules ont été montées sous lamelles avec vectashield (Vector Abcys, France). Toute préparation dont la contamination était supérieure à 5% a été éliminée. Trypsinisation de neurones corticaux Le détachement enzymatique des neurones a été réalisé après un lavage précautionneux en milieu N5 sans sérum. Ce milieu a été enlevé, et remplacé par 250 l de Trypsin-EDTA (Gibco BRL, UK) à 37 C pendant 15 min en incubateur sous 5% C02. Le détachement cellulaire a été réalisé par 5 allez-et-retours en utilisant des cônes de 1000 l (Gilson), et le reste des agrégats de neurones a été dissocié comme suit: les neurones ont été transvasés dans des tubes FACS de 5 ml tubes (Falcon), dilués dans 500 l de milieu N5, et dissociés au travers d'un cône de 200 l par 10 allez-et-retours précautionneux. Les échantillons ont ensuite été acquis au cytomètre (voir figure 1). Instrumentation La cytométrie en flux a été réalisée grâce à un FACSCalibur à 3 couleurs équipé d'un laser à Argon de 488nm (Becton Dickinson, San Jose, CA). Pour chaque échantillon, les données de 40 000 neurones ont été enregistrées et analysées avec le logiciel CellQuest ProTM (Becton Dickinson). Toute fluorescence, excepté celle de l'annexine-V-FITC, a été analysée en utilisant le mode d'amplification logarithmique. Un seuil d'exclusion a été introduit afin d'éviter le bruit de fond et l'analyse de débris. La vitesse du flux a été rêglée sur 12 l +/- 3 l / min pour les expériences de temps réel et sur 60 gel +/- 3 l / min pour les expériences en temps fixe. La microscopie à fluorescence a été réalisée à l'aide d'un microscope inverse DM IRB (Leica, Rueil-Malmaison, France) équipé d'une lampe à mercure de 100 Watts d'un objectif plan X 40 ou d'un objectif à immersion eau X 100 N PLAN (Leica, Wetzlar, Germany). Les images sont acquises à une résolution de 1300 x 1030 pixels à l'aide d'une caméra CCD couleur refroidie par effet Peltier (Leica DC 300F, Leica, France) et contrôlée par le logiciel Leica QFluoro (Leica Microsystem AG, Switzlerland). Les informations sont ensuite stockées pour une analyse ultérieure avec le logiciel IM1000 software (Leica Microsystem AG. Tous les blocs filtres et les filtres de densité pour la détection des sondes fluorescentes proviennent de Leica (Germany). Avant chaque observation, les neurones sont rincés deux fois avec du milieu N5 préchauffé à 37 C et observés rapidement. Les études quantitatives ont été réalisées sur environ 300 cellules par champs en comptant 5 à 10 champs sélectionnés de manière aléatoire. Détection de la taille et de la granulosité des neurones par les paramètres de dispersion de la lumière La lumière dispersée à faible angle (Forward scatter, FSC) est liée à la taille cellulaire, tandis que la lumière dispersée orthogonalement est plutôt liée à la structure interne et à l'indice de réfraction. La taille des neurones a été analysée par la photodiode FSC et les signaux ont été collectés en utilisant le mode E-00, avec un gain d'amplification linéaire de 1,33. La granularité des neurones a été évaluée par le tube photomultiplicateur SSC avec un voltage de 366 et un gain d'amplification linéaire ajusté à 2,25. Détection de la phase de dégradation de l'apoptose par l'incorporation de 7-Amino Actinomycine D La perte d'intégrité membranaire a été détectée par l'augmentation de la perméabilité à la 7-Amino Actinomycine D (7-AAD, Sigma). 20 g/ml 7-AAD ont été ajoutés en milieu N5 complet aux neurones adhérents pendant 15 min à 37 C à l'obscurité. La microscopie à fluorescence a été réalisée après excitation de 100 ms et un filtre de bande passante de 515- 560. La fluorescence de la 7-AAD a été détectée par un filtre LP 590 long-pass filter. Les cellules ont été trypsinisées, et immédiatement analysée au cytomètre. L'analyse de la fluorescence de la 7-AAD a été réalisée par le canal Fl-3 (> 650 nm), avec un voltage du PMT de 333. Les corps apoptotiques et les débris ont été exclus comme décrit précédemment (Lecoeur et al., 1997). Détection des phases de dégradation précoce et tardive par l' annexine-V et la 7-AAD L'exposition de résidus phosphatidylsérine (PS) au feuillet externe de la membrane plasmique a été détecté par la fixation d'annexine-V conjuguée au FITC (Apoptosis detection KIT, R&D System). Les neurones ont été lavés deux fois en tampon enrichi en calcium (Apoptosis detection KIT). 20 g/ml de 7-AAD et IX d'annexine V ont été ajoutés à 200 l de ce tampon pour 20 min à température ambiante. Pour les experiences de microscopie à fluorescence, l' annexine V-FITC a été excitée par un filtre BP 480/40 et la lumière émise a été collectée par un filtre BP 527/30. Pour les analyses en cytométrie de flux, les neurones ont été lavés deux fois en tampon enrichi en calcium et soumis à la trypsinisation. La fluorescence liée à l'annexine V-FITC a été détectée dans le canal Fl-1 (530 +/- 15 nm), et analysée en mode d'amplification linéaire en utilisant un voltage du PMT de 867, et un gain d'amplification de 9,00. Les recouvrements spectaux ont été évités en ajustant les compensations comme suit : - 22,9%FL1 and FL2 - 41,7% FL3. Détection combinée des phases de dégradation et effectrice par la sonde FLICA et la 7-AAD. La caspase-3 activée a été détectée par la sonde FAM-DEVD-FMK, (sonde Fluorochrome Labeled Inhibitor of Caspase, FLICA, CaspaTag TM fluorescein Caspase Activity Kit, Intergen, NY) comme décrit précédemment sur cellules en suspension (Lecoeur et al., 2002 ; et al., 2002). Les neurones ont été incubés avec la sonde à une dilution finale de neurones de 1/150 en DMSO (CaspaTag TM Kit), pour une heure à 37 C, sous atmosphère de 5% CO2 et à l'obscurité. Le co-marquage à la 7-AAD et au Hoechst ont été réalisés durant les 15 dernières minutes. Puis les neurones ont été lavés trois fois en tampon de lavage (CaspaTag TM Kit). Pour l'imagerie de fluorescence, la sonde FAM-DEVDFMK a été excitée au travers du filtre BP 480/40 et la lumière émise collectée par le filtre BP 527/30. L'intensité moyenne de fluorescence de la caspase-3 (unités arbitraires) a été mesurée par l'option " probe meter" du logiciel Leica QFluoro. Pour l'analyse cytométrie de flux, la fluorescence de la sonde a été collectée par le canal Fl-1 (Fig. 1) en utilisant un voltage du PMT de 501. Le recouvrement spectral a été évité en ajustant le réseau de compensation comme suit : FL1 - 7,8% FL2, FL2 - 40,8% FL1 and FL2 - 45,4% FL3. L'inhibiteur général de caspases Z-val-Ala-Asp(OMe)-FMK (Z-VAD-FMK, ICN, Orsay, France) et le nouvel inhibiteur de caspases à large spectre Quinoline-Val-Asp (OMe)-CH2-0-Ph (Q-VD-OPH, ICN) ont été ajoutés au début de la déprivation à la concentration de 100 M. Q-VD-OPH a été utilisé précédemment pour inhiber significativement l'activité de la caspase-3 et l'apoptose in vivo chez la souris soumise à une ischémie rénale. L'inhibiteur irréversible de sérineproteases, le fluorure de 4-(2-Aminoéthyl)- benzènesulfonyle (AEBSF, Pefabloc SC, Roche, Meylan, France) a été utilisé dans les mêmes conditions. Détection combinée de la phase de dégradation et effectrice par la sonde FLICA et l'annexine V La caspase-3 activée a été détectée par la sonde FLICA sulforhodamine-DEVD-FMK, du kit ÇaspaTagTM Red (Intergen, NY) qui a permi le co-marquage avec l'annexine V. Les neurones ont été incubés avec la sonde FLICA à une dilution finale de 1/900 en DMSO (CaspaTag TM Kit), et avec IX d' annexine V FITC dans 200 l de tampon "annexine" -pour 30 min à 37 C sous 5% de CO2 à l'obscurité. Puis, les neurones ont été laves trois fois en tampon composé de 50% de tampon de lavage (CaspaTagTM Kit) et 50% de tampon "annexine". L'activité de la caspase-3 a été détectée dans le canal Fl-2 (585 +/- 21 nm). Détection en temps fixe de la phase de décision de l'apoptose par JC-1 et la 7-AAD. Le potentiel mitochondrial transmembranaire (Am) a été étudié en utilisant comme sonde, le iodure de 5,5',6,6'-tetracholoro-1,1,3,3'-tetraéthylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1, Molecular Probes, Eugene, OR). Les neurones adhérents ont été co-marqués par 1 M de JC- 1 et par la 7-AAD en milieu complet pour 15 min à 37 C et à l'obscurité. Les monomères de JC-1 ont été détectés par cytomérie de flux dans le canal Fl-1 en utilisant un voltage de PMT de 644. Les agrégats J ont été détectés par le canal Fl-2 (voltage = 451) (Reers et al., 1991). Le voltage pour la détection de la 7-AAD était de 326. Le recouvrement spectral a été évité en ajustant les compensations comme suit: FL1 - 0,0% FL2, FL2 - 22,9% FL1 , FL2 - 41,7% FL3, et FL3 - 0,7% FL2. Pour l'analyse en microscopie à fluorescence, les fluorescences verte et orange ont été enregistrées simultanément après une excitation de 1,2 s par le filtre BP 450-490 couplé avec un filtre d'émission passé-haut LP515. Le photoblanchiement a été evité par atténuation de l'irradiation initale à 5% de la lumière incidente par unfiltre de densité N20. Détection en temps réel du ##m et de la morphologie neuronale Les expériences en temps réel ont été réalisées sur des neurones juste après trypsinisation. Les neurones de différents puits de cultures de 5 jours ont été mélangés, resuspendus en milieu N5 et ajustés à 0,7 106 cellules/ ml. Les neurones ont été chargés avec 800 nM JC-1 pendant 15 min à 37 C. Chaque échantillon sera constitué par 100 l de cette suspension diluée avec 700 l de milieu N5 en tube FACS. La morphologie basale et ##m initial ont été enregistrés pendant 5 minutes, les drogues ont été ajoutées, et les variations de ##m ont été enregistrées pendant les 15 minutes suivantes (Fig. 5A). L'agent découplant de la chaîne respiratoire carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (mCICCP, Sigma), a été utilisé à 100 M pour induire une dissipation compléte du ##m. Le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP, Sigma), et le Sodium Nitroprusside (SNP, Sigma) ont été testés à 1 mM et 0.6 mM respectivement. L'éthanol (Merck) a été utilisé à 0,34 mM. Le ratio de fluorescence JC-1 orange/ green a été calculé par le logiciel FCS Assistant. Les courbes ont été dessinées grâce au logiciel Microsoft Excel avec les valeurs moyennes de FSC, SSC, et de la moyenne de fluorescence des fluorescences orange et verte calculées pour chaque intervalle de 1 minute. Marquage nucléaire par le Hoechst 33342 et mesures de périmètres nucléaires Le Hoechst 33-342 (Ho 342, Sigma) se fixe sur les regions de l'ADN riches en A-T, et a été utilisé afin de compter chaque noyau (apoptotique ou vivant). Ce colorant peut être facilement associé avec les autres sondes (JC-1,7-AAD, FLICA, Annexine V-FITC). Les neurones ont été incubés 15 min avec 1 M Ho 342 et analysés en microscopie à fluorescence après une excitation UV de 5 millisecondes ( filtre BP 340-380). La fluorescence bleue a été collectée par un filtre passé-haut. Le périmètre des noyaux a été mesuré en créant des masques recouvrant les zones d'intérêt grâce au logiciel Qfluoro (Leica) et exprimé en unité arbitraire. Analyses statistiques Les statistiques ont été réalisées avec le logiciel Microsoft Excel software. Les corrélations ont été calculées par régression linéaire. Pour chaque analyse, le R2 est indiqué. Un test de student a été realisé pour comparer les pourcentages de cellules dans les différentes étapes de l'apoptose. Une valeur de p Résultats Analyse cytofluorométrique de neurones primaires. Des neurones primaires isolés à partir d'embryons de souris agés de 14 jours peuvent être maintenus en culture durant plus de 10 jours lorsqu'ils sont cultivés sur des plaques recouvertes de polyethyleneimine dans un milieu adapté contenant du glucose, du sérum de cheval et du sérum de veau f#tal. Dans ces conditions, l'évaluation simultanée par microscopie à fluorescence (MF) de la condensation chromatinienne (Hoescht 33-342, fluorescence bleue) et de l'intégrité de la membrane plasmique en utilisant l'agent intercalant 7-amino-actinomycine D (7-AAD ; fluorescence rouge) démontre qu'une déprivation en sérum mène progressivement à une perméabilisation de la membrane plasmique (PMP) des neurones (Fig. 1A). Cette PMP est un événement post-apoptotique puisqu'il apparaît uniquement dans les neurones présentant une rétractation somatique, une condensation chromatinienne et des neurites désagrégées (Fig.lA). Par contre, lorsqu'une PMP primaire (i. e. nécrose) est induite par une concentration faible de triton, ni un rétrécissement somatique ou une condensation chromatinienne ne sont détectés (contraste de phase et marquage Hoescht), par contre la 7-AAD pénètre rapidement dans les neurones et marque les noyaux (Fig. 1 B). Afin de quantifier de manière précise la rétractation somatique des neurones ainsi que la PMP par immunofluorescence à différents moments du déroulement du phénotype apoptotique, nous avons établi un protocole de trypsination permettant de maintenir l'intégrité des neurones (absence d'un marquage 7-AAD, rétention cellulaire d'un marqueur type CellTracker, (Fig.l B,C)). Les neurones peuvent donc être marqués puis observés par microscopie à fluorescence et dans un second temps trypsinés et rapidement soumis à une analyse par cytométrie (Fig. 1 D-G). Il apparaît que 88,4% (+/- 7 ,6) des neurones non traités présentent un marquage 7-AAD négatif alors que 47,1% (+/- 18,1) des neurones déprivés en sérum pendant 24 heures présentent une PMP (7-AAD +). Un compatge cellulaire par microscopie avant trypsination corrèle parfaitement avec ce résultat (Fig. 1E, F). Détection des phases effectrice et de dégradation dans des neurones corticaux primaires en apoptose. Une analyse par microscopie à fluorescence permettant une co-détection de la PMP (marquage 7-AAD) et de l'ectoexposition des résidus phosphatidylsérines (PS) (Marquage FITC-annexine V ; fluorescence verte) révèle la présence de trois populations neuronales après déprivation en sérum : une population double positive pour le marquage 7-AAD et annexine V (population 2 ; Fig. 2A), et deux populations présentant un simple marquage 7AAD (population 3) ou un simple marquage annexine V (population 1). Le même type de populations est également détecté après trypsinisation par cytométrie et une analyse cinétique montre que l'apparition de la population 1 précède l'apparition de la population 2 qui précède elle-même l'apparition de la population 3 (Fig. 2 B, C) suggérant que l'ectoexposition des résidus PS précède la PMP. L'analyse en cytométrie des neurones peut être étendue à l'étude de l'activation des caspases (Fig. 3). En effet, la co-détection in situ d'une activité caspase 3 en utilisant un inhibiteur fluorescent de caspase (FLICA, FAM-DEVD-FMK) et de la PMP (marquage 7AAD) aboutit à des résultats similaires par microscopie (avant trypsination) ou par cytométrie (après trypsination) démontrant qu'une activité caspase 3 est détectable avant l'apparition de la PMP (Fig. 3 A,B). Des résultats similaires ont également été obtenus lorsque le marquage FLICA de l'activité caspase 3 est remplacé par un marquage à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement la forme activée de la caspase 3. L'étude en cytométrie montre également que les neurones positifs pour le marquage caspase mais sans PMP (marquage 7AAD négatif), gonflent, puis se rétractent au moment de l'apparition de la PMP (Fig. 3C). Le léger gonflement neuronal observé n'étant pas dû à la trypsinisation puisque l'observation en microscopie (contraste de phase et fluorescence) montre le même phénotype. Lorsqu'un nouvel inhibiteur à large spectre des caspases : (OMe)- CH2-O-Ph (Q-VD-OPH) ou un inhibiteur spécifique de l'adénine nucléotide translocateur mitochondrial, l'acide bongkrékique (BA), sont ajoutés au début de la déprivation en sérum, une inhibition importante de l'activation des caspases ainsi que de la PMP et de l'apoptose nucléaire est obtenue (Fig. 3 A, D). La quantification par cytométrie montre que contrairement à l'inhibiteur large spectre des protéases à sérine, le fluorure 2 (4-(2Aminoéthyl)-benzènesulfonyle, AEBSF,Pefabloc), l'inhibiteur Q-VD-OPH inhibe 82,3 (+/- 32,1%) de l'activité caspase 3 et 93,6 (+/- 33,8%) de la PMP (marquage 7-AAD) induites par la déprivation en sérum (Fig. 3D). De manière surprenante, il apparaît que l'inhibiteur large spectre Z-VAD-fmk inhibe l'activité caspase-3, mais pas la phase de dégradation (exposition PS et PMP) de l'apoptose neuronale (Fig. 3D). L'utilisation concomitante d'un marqueur FLICA couplé à la rhodamine pour la détection de l'activité caspase 3 à l'annexine V marqué au FITC (détection de l'ectoexposition PS) permet de démontrer que l'activation de la caspase 3 précède l'ectoexposition PS après déprivation en sérum des neurones corticaux (Fig. 3 E,F). Il est à noter qu'une analyse de l'état chromatinien (Hoescht, fluorescence bleue) par microscopie indique qu'une activité caspase précoce est associée avec un premier stade de condensation nucléaire (stade-1 selon la classification de Susin ; Susin et al., 1999) alors qu'une fragmentation nucléaire en corps apoptotiques (morphologie stade-II ; Susin et al, 1999) intervient après le début de l'ectoexposition PS (Fig. 3E, 4E). Détection de la phase mitochondriale de l'apoptose neuronale. Le marquage de neurones primaires à l'aide de la sonde JC-1 sensible au ##m suivi d'une analyse au microscope à fluorescence révèle une chute progressive ##m lors d'une déprivation en sérum de 15-24 heures (Fig. 4A). La chute du potentiel progresse de manière hétérogène dans la cellules donnant naissance à un phénotype transitoire intermédiaire (Fig. 4A ; Dec). Une complète abolition de ##m est observée avant tout signe d'apoptose nucléaire (marquage Hoescht ; Fig. 4A). Comme prévu, la quantification concomitante de la chute de ##m et de l'apparition de la PMP par microscopie et cytométrie démontre que la perte de ##m est inhibée par BA et précède l'apparition de PMP dans les neurones déprivés (Fig. 4B-E). De plus des expériences de cinétique, basées sur la co-détection du ##m (en utilisant cette fois-ci le marqueur CMX-Ros) et de la présence d'une activité caspase 3 (FLICA, FAM-DEVDFMK) confirment que la chute du ##m précède également l'activation de la caspase-3. Détection en temps réel du ##m La participation précoce de la mitochondrie dans l'apoptose neuronale requiert un suivi rapide de la réponse du 1m' La détection en temps réel du 1m par microscopie crée intrinsèquement un biais dans l'analyse puisque l'acquisition répétée provoque un photoblanchiement de la sonde (détecté comme une chute de la fluorescence orange de la sonde JC1) qui peut-être attribué de manière erronée à une chute du ##m (Fig. 5A, B). Afin de contourner cet inconvénient technique, les inventeurs ont développé une approche de cytométrie en temps réel. Cette approche consiste à trypsiner les neurones, puis à les marquer à l'aide de la sonde JC1 (pour suivre le ##m) et de la 7-AAD (PMP) (Fig. 5C). Dans ces conditions, une analyse en microscopie révèle que les neurones ainsi traités ne présentent pas de PMP et maintiennent un haut potentiel jusqu'à trois heures post-trypsinisation (Fig. 5C). L'analyse en temps réel par cytométrie durant 20 minutes confirme que des milliers de neurones ont un ##m élevé et ne présentent pas de PMM (Fig. 5D). L'ajout d'un agent découplant de la chaîne respiratoire tel que le carbonyl cyanide m-chlorophénylhydrazone (mCICCP) à des neurones non trypsinés induit une chute du ##m (Fig. 5D-1). Le suivi en temps réel par cytométrie met en évidence une perte maximale du ##m après deux minutes de traitement avec le mCICCP (Fig. 5D-2,3). Cette approche en temps réel par cytométrie permet donc de quantifier et de suivre de manière précise des modifications précoces du ##m et de PMP. La détection concomitante de la PMP (7-AAD) et du hdjhfh (JC-1) par microscopie sur des neurones non trypsinés, après traitement par une toxine mitochondriale (l-méthyl-4phényl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)), indique qu'après 45 minutes de traitement la plupart des neurones présentent un ##m faible sans aucune détection de PMP (Fig. 6A-1). Par contre le traitement par un inducteur de NO : le SNP n'induit pas une chute du ##m. Un traitement par l'éthanol conduit à une apparition rapide de PMP révélé par une incorporation massive de 7-AAD dans les neurones (Fig. 6A-1). Lorsque la technique de temps réel est appliquée à la détection simultanée de la PMP, du 'I. \P m, de la taille et de la granularité des neurones il apparaît qu'après 15 minutes de traitement avec le MPTP, 49,6% (+/- 8,2 ; n=4) des neurones ont un ##m faible, alors que seulement 16,2% (+/- 1,2) des neurones non traités et 15,0% (+/- 6,2) des neurones traités par SNP présentent un ##m faible. Un traitement éthanol, contrairement à un traitement avec MPTP ou SNP, induit l'apparition rapide d'une PMP précedant une perte de 'I.\Pm. De manière intéressante, l'induction de la perte de 'I.\Pm par MPTP est hétérogène puisque les neurones subissant une chute rapide de ##m présente une élévation de leur granularité alors que les neurones subissant une réduction modérée de ##m ne présente pas de modifications morphologiques (Fig. 6). Dans les tableaux 1 et 2 ci-après, on rapporte, respectivement, les résultats de l'analyse multiparamétrique FACS-microscopie de l'apoptose chez des neurones corticaux de souris soumis à une déprivation en sérum et les propriétés des inhibiteurs testés. TABLEAU 1 Protection par : Chute de Activité caspase Relargage Apoptose permabilité de Exposition des résidus dégéneration ##m -9 -3 -2 Cytochrome nucléaire la membrane phosphatityl-sérine à la des neurites C plasmique membrane plasmique acide + ND + + + + + + importante bongkrékique z-FA-fmk- - - aucune z-VAD-fmk - - - - - aucune z-BOC-D-fmk- - - ND- aucune Q-VD-OPH + + + + + + + + importante z-DEVD-fmk- - + ND- aucune z-VDVAD-fmk + + + + + + + + importante z-LEHD-fmk + ± Bloque en retard + partielle stade I Pefabloc- aucune Cycloheximide + ND + + ND + + + importante Rapamycine ND- - ND- - aucune Bafilomycine - ND ND- - aucune 3-Méthyl-- ND- - ND- - - aucune Adénine Amino- ND ND ND ND- - ND aucune purvalanol Roscovitine - ND ND ND ND- - ND aucune Ruthénium Red- ND ND ND ND- - ND aucune Cyclosporine A Cytotoxique dès 1 M - non utilisable sur les cultures de neurones corticaux de souris + : protection ; - : pas de protection ; ND : non déterminé TABLEAU 2 Tableau Il : propriétés des inhibiteurs Composé Inhibition Concentration acide bongkrékique Adénine Nucléotide Translocateur (ANT) du 25 M pore de transition de perméabilité mitochondrial z-FA-fmk Peptide contrôle pour z-xxxx-fmk 100 M z-VAD-fmk caspases (large spectre) 100 M z-BOC-D-fmk caspases (large spectre) 100 M Q-VD-OPH caspases (large spectre) 100 M z-DEVD-fmk Activité de type Caspase-3 100 M z-VDVAD-fmk Activité de type Caspase-2 100 M z-LEHD-fmk Activité de type Caspase-9 100 M Pefabloc Sérine protéases 100 M Cycloheximide Synthèse protéique 1 M Rapamycine Autophagie 1-10 M Bafilomycine Endocytose/autophagie 1 M 3-Méthyl-Adénine Autophagie 1 mM Amino purvalanol kinases cycline-dépendantes (Cdk-2) # 500 M Roscovitine kinases cycline-dépendantes (Cdk-2) Ruthénium Red Influx de calcium dans les mitochondries # 1 M Cyclosporine A Cyclophyline D du pore de transition de # 1 M perméabilité mitochondrial Les résultats obtenus démontrent que la caspase-2 a un rôle dans la mort induite par la déprivation en sérum des neurones corticaux de souris. Des ARNsi ciblant spécifiquement les ARNm codant pour la caspase-2 ont été développés. Duplexes d'ARNsi Choix des duplexes d'ARNsi pour la caspase-2 murine mCaspase-2 : SEQ ID N 1(aa)cacctcctagagaaggaca AT : 47% (185-203) SEQ ID N 2: caccuccuagagaaggacadTdT SEQ ID N 3: uguccuucucuaggaggugdTdT mCaspase-2mut : SEQ ID N 4: (aa) catctactcgagacggaca AT :47% 4 mutations SEQ ID N 5:caucuacucgagacggacadTdT SEQ ID N 6:uguccgucucgaguagaugdTdT Choix des duplexes d' ARNsi pour la caspase-2 humaine hCaspase-2 : SEQ ID N 7: (aa) catcttctggagaaggaca AT : 52% (82-100) SEQ ID N 8: caucuucuggagaaggacadTdT SEQ ID N 9: uguccuucuccagaagaugdTdT Choix des duplexes d'ARNsi pour la caspase-9 murine mCaspase-9: SEQ ID N 10 (aa)ggcaccctggcttcactct AT : 37% (247-269) SEQ ID N 11: ggcacccuggcuucacucudTdT SEQ ID N 12: agagugaagccagggugccdTdT Sur la figure 8 on rapporte les résultats d'un Western blot montrant l'effet de l'ARNsi correspondant au duplexe (SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3) sur l'expression endogène de la caspase-2 dans les neurones coticaux de souris. Sur le Tableau 3, on résume les expériences effectuées avec les ARNsi Tableau III : Effet des RNAi-caspase-2 (et-9) sauvage (WT) et mutant (m) dans divers modèles de mort neuronale. Activité caspase-2 RNAi caspase- RNAi caspase- RNAi RNAi Caspase- RNAi caspase- RNAi Caspase- 2/WT 2/mutant caspase-2/WT 2/mutant 9/WT 9/mutant [ ] , .tM 3.8 gg 3.8 .tg 0.38 gg 0.38 .g 3.8 / 0.38 gg 3.8 / 0.38 .tg Toxicité du RNAi sur la- - - - En cours En cours culture contrôle Déprivation en sérum 24h ± En cours En cours Déprivation en sérum 48h ± En cours En cours peptide beta amyloïde (25- En cours En cours En cours En cours En cours En cours 35) (24h-60 M) Ionomycine 6 M 20 h- - En cours En cours ##m disruption RNAi caspase- RNAi caspase- RNAi RNAi Caspase- RNAi caspase- RNAi Caspase- 2/WT 2/mutant caspase-2/WT 2/mutant 9/WT 9/mutant [ ] , M 3.8 ig 3.8 .tg 0.38 gg 0.38 ,g 3.8 / 0.38 8 tg 3.8 / 0.38 ig Toxicité du RNAi sur la- - - - En cours En cours culture contrôle Déprivation en sérum 24h ± - - En cours En cours Déprivation en sérum 48h ± - En cours En cours peptide beta amyloïde (25- En cours En cours En cours En cours En cours En cours 35) (24h-60 M) Ionomycine 6 M 20 h- - - - En cours En cours 5 + : protection - : pas de protection Elaboration d'un ARNsh spécifique pour l'extinction de l'expression de la caspase - 2 murine Dans un autre exemple de réalisation de l'invention, on utilise des structures en épingle à cheveux pour exprimer des séquences sens et antisens de l'ARNsi reliées par une séquence nucléotidique courte formant une région non appariée, et suivies par un site de terminaison de la polIII (TTTTT) (voir figure 9). Ce type de séquence est sous le contrôle transcriptionel du promoteur Hlde la Rnase P Hl ou du promoteur du gène codant pour l'ARN nucléaire U6 menant à l'expression de quantité importante de ARNsh (small hairpin ARN) dans les cellules transfectées. Après synthèse du shARN, la boucle de l'épingle à cheveux est clivée et mène à la formation d'un ARNsi fonctionnel.On peut également utiliser des vecteurs de transfert (plasmidiques ou rétro viraux) capables d'exprimer des structures ARNsi dans différents types cellulaires (pour exemple : (Brummelkamp TR et al (2002) Science 296,550-553). La figure 10 illustre l'utilisation de ces séquences dans un plasmide (exemple avec le plasmide pSUPER commercialisé par OligoEngine). Références Adayev, T. E.R., Meserole, S., Mazza B, Yurkow, E.J, Banerjee, P. (1998). Extemalization of phosphatidylserine may not be an early signal of apoptosis in neuronal cells, but only the phosphatidylserine-displaying apoptotic cells are phagocytosed by microglia. J. Neurochem. 71, 1854-1864. Buckman, J.F., and Reynolds, I.J. (2001). Spontaneous changes in mitochondrial membrane potential in cultured neurons. J. Neurosci. 21, 5054-5065. Castro-Obregon, S., Del Rio, G., Chen, S.F., Swanson, R. A., Frankowski, H., Rao, R. V., Stoka, V., Vesce, S., Nicholls, D. G., and Bredesen, D. E. (2002). A ligand-receptor pair that triggers a non-apoptotic form of programmed cell death. Cell Death Differ. 9, 807-817. Chang, L. K,. and Jonhson, E. M. (2002). Cyclosporin A inhibits caspase-independent death of NGF-deprived sympathetic neurons : apotential role for mitochondrial permeability transition. J. Cell Biol. 157, 771-81. Clarke, P. (1990). Developmental cell death : diversity and multiple mechanisms. Anat Embryol (Berl). 180,195-213. Daugas E, Susin, S. A, Zamzami, N., Ferri, K. F., Irinopoulou, T., Larochette, N., Prevost, M. C., Leber, B., Andrews, D, . Penninger, J., and Kroemer, G. (2000). Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14, 729-739. Davies, J.A. (1995). The Bcl-2 family of proteins, and the regulation of neuronal survival. 18 (8):355-8. Trends Neurosci. 18, 355-358. Fadok, V. A, Bratton, D. L., Frasch, S.C., Warner, M. L., Henson, P. M. (1998). The role of phosphatidylserine in récognition of apoptotic cells by phagocytes. Cell Death Differ. 5,551-562. Gorman, A. M., Ceccatelli, S., and Orrenius, S. (2000). Role of mitochondria in neuronal apoptosis. Dev Neurosci. 22,348-358. Green DR, and Reed, J. (1998). Mitochondria and apoptosis. Science 281, 1309-1312. Kerr, J. F., Wyllie, A.H., and Currie, A. R. (1972). Apoptosis : basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26, 239-57. Lassus, P., Opitz Ayara, X., and Lazebnik Y. (2002). Requirement for caspase-2 in stress-induced apoptosis before mitochondrial permeabilization. Science 297, 1352-4. Lecoeur, H., de Oliveira Pinto, L., and Gougeon, M.L. (2002). Multiparametric flow cytometric analysis of biochemical and functional events associated with apoptosis and oncosis using the 7-aminoactinomycin D assay. J. Immunol. Methods. 265, 81-96. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y. and, Gougeon, M. L. (2001). A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. Methods 253, 177-187. Lecoeur, H, Ledru, E., Prevost, M. C., and Gougeon, M. L. (1997). Strategies for phenotyping apoptotic peripheral human lymphocytes comparing ISNT, annexin-V and 7AAD cytofluorometric staining methods. J. Immunol. Methods 209, 111-123. Lee, C.S., Han, E. S., Jang, Y. Y., Han, J. H., Ha, H. W., and Kim, D. E. (2000). Protective effect of harmalol and harmaline on MPTP neurotoxicity in the mouse and dopamine-induced damage of brain mitochondria and PC12 cells. J. Neurochem. 75, 521-531. Lievre, V., Becuwe, P., Bianchi, A., Koziel, V., Franck, P., Schroeder, H., Nabet, P., Dauca, M., and Daval, J. L. (2000). Free radical production and changes in superoxide dismutases associated with hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of embryonic rat forebrain neurons in culture. Free Radie. Biol. Med. 29, 1291-1301. Lipton, P. (1999). Ischémie cell death in brain neurons. Physiol. Rev. 79, 1431-1568. Macleod, M.R., Allsopp T. E., McLuckie, J., and Kelly, J. S. (2001). Serum withdrawal causes apoptosis in SHSY 5Y cells. Brain Res. 889, 308-315. Maiese, K., and Vincent, A. (2000). Membrane asymmetry and DNA dégradation: functionally distinct déterminants of neuronal programmed cell death. J. Neurosci. Res. 59, 568-580. Mattson, M. P. (2000). Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 120-129. Metzstein, M. M., Stanfield, G. M., and Horvitz, H. R. 1998 Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. Trends Genet. 14 (10) 410-416 Nagata, S. (2000). Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res. 256, 12-18. Plesnila, N., Zinkel, S., Le, D.A., Amin-Hanjani, S., Wu, Y., Qiu, J., Chiarugi, A., Thomas, S.S., Kohane, D. S., Korsmeyer, S.J., and Moskowitz, M. A. (2001). BID mediates neuronal cell death after oxygen/ glucose deprivation and focal cerebral ischemia. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98, 15318-23. Ratan, R., Lee, P.J., and Baraban, J. M. (1996). Serum deprivation inhibits glutathione depletion-induced death in embryonic cortical neurons: evidence against oxidative stress as a final common mediator ofneuronal apoptosis. Neurochem. Int. 29, 153-157. Reed, J. C., Jurgensmeier, J. M., and Matsuyama, S. (1998). Bcl-2 family proteins and mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1366, 127-137. Reers, M., Smith, T.W., and Chen, L. B. (1991). J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential. Biochemistry 30, 4480-4486. Robertson, J.D., Enoksson, M., Suomela, M., Zhivotovsky, B., and Orrenius, S. (2002). Caspase-2 acts upstream of mitochondria to promote cytochrome c release during etoposide-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 277,29803-29809. Sadoul, R. (1998). Bcl-2 family members in the development and degenerative pathologies of the nervous system. Cell Death Differ. 5, 805-815. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., and Cossarizza, A. (1997). JC-1, but not DiOC6 (3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells : for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Lett. 411, 77-82. Smolewski, P., Grabarek, J., Halicka, H.D., and Darzynkiewicz, Z. (2002). Assay of caspase activation in situ combined with probing plasma membrane integrity to detect three distinct stages of apoptosis. J. Immunol. Methods 265, 111-121. Speciale, S. (2002). MPTP : insightsinto parkinsonian neurodegeneration. Neurotoxicol. Teratol. 24, 607-620. Susin, S. A., Lorenzo, H., Zamzami, N., Marzo, L, Snow, B.E., Brothers, G.M., Mangion, J., Jacotot, E., Costantini, P., Loeffler, M., Larochette, N., Goodlett, D. R., Aebersold, R., Siderovski, D. P., Penninger, J.M., and Kroemer, G. (1999). Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 397, 441-446. Thornberry, N. A., and Lazebnik, Y. (1998). Caspases : enemieswithin. Science 281, 1312-1316. Troy, C.M., and Salvezen G. (2002). Caspases on the brain. J. Neurosci. Res. 69, 145- 150. Viswanath, V., Wu, Y., Boonplueang, R., Chen, S., Stevenson, F. F., Yantiri, F., Yang, L., Beal, M. F., and Andersen, J. K. (2001). Caspase-9 activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine- induced Parkinson's disease. J. Neurosci. 21, 9519-28. Wang, X. (2001). The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-33. Yuan, J., and Yankner, B. (2000). Apoptosis in the nervous system. Nature 407, 802- 809. Zhang, Y., Goodyear, C., and LeBlanc, A. (2000). Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjected with active caspase-3,-6, -7, and-8. J. Neurosci. 20, 8384-8389. REVENDICATIONS 1- Inhibiteurs de la caspase-2, caractérisés en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ARN isolée à double brins, capable de cibler spécifiquement les ARNm de la caspase-2, ce qui conduit à une réduction ou une suppression de l'expression de la caspase-2, lesdits inhibiteurs étant des duplexes d'ARNsi dont les brins répondent aux séquences SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3 suivantes : SEQ ID N 2: caccuccuagagaaggacadTdT SEQ ID N 3: uguccuucucuaggaggugdTdT ou aux séquences SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9 suivantes : SEQ ID N 8: caucuucuggagaaggacadTdT SEQ ID N 9: uguccuucuccagaagaugdTdT 2 - Inhibiteurs selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils empêchent la mort cellulaire qu' elle soit de type apoptotique, nécrotique ou autophagique. 3 - Médicaments, caractérisés en ce qu'ils renferment un inhibiteur selon la revendication 1 ou 2, en une quantité thérapeutiquement efficace, en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes. 4 - Médicaments selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont destinés au traitement des maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la maladie de Huntington, ou de la sclérose latérale amyotrophique, et ischémies cérébrales.