Brevet FR2847817A1 — publié le 20040604

UTILISATION D'UN INHIBITEUR D'HISTONE DEACETYLASE POUR LE TRAITEMENT DES DYSTROPHIES MUSCULAIRES. La présente invention concerne le traitement de 5 maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu grâce à la ré-expression du gène foetale homologue. L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement au long cours des dystrophies et des maladies semblables comprenant l'administration, à un sujet présentant un gène 10 défectueux, d'une quantité adéquate d'un inhibiteur d'histone déacétylase. Les inventeurs ont observé que des gènes foetaux s'éteignent au profit de leurs homologues adultes, ou plus généralement que des gènes moins adaptés à l'environnement 15 de l'organisme s'éteignent au profit d'homologues mieux adaptés à cet environnement. Ces derniers expriment alors des protéines régulées qui répondent de manière plus adéquate à cet environnement. On a ainsi décrit dans l'art antérieur une 20 nouvelle méthode de traitement des maladies o le gène adulte défectueux a un homologue foetal. Cette méthode est basée sur la réactivation de ce gène foetal. Il s'agit par exemple des myopathies de Duchenne et de Becker ou de la thalassémie et de la drépanocytose. La demande de brevet 25 français publiée sous le No. 2 794 647 montre que l'utilisation de L-arginine et de donneurs NO permet de réactiver l'expression de gènes foetaux dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et la localisation de protéines fotales. Des effets spectaculaires ont été 30 obtenus dans le cas de dystrophie musculaire chez la souris, o la réexpression d'utrophine améliore considérablement l'état des muscles déficients de la souris mdx qui est un modèle murin de la maladie humaine. Il a été par ailleurs rapporté que lors de son développement, le foetus humain possède une hémoglobine foetale de forte affinité pour l'oxygène, qui sera remplacée, chez le nouveau-né, par une hémoglobine de basse 5 affinité, laquelle sera, de surcroît, régulée négativement par le 23diphosphoglycerate (DPD). Lorsque l'hémoglobine adulte est défectueuse du fait d'une mutation (anémie falciforme), son ligand régulateur augmente (Abekile, 1998). Ce ligand peut alors servir de signal inducteur pour 10 exprimer l'hémoglobine foetale. Ce mécanisme d'extinction-substitution dépend d'un " double interrupteur ". Le premier est général, non spécifique et bien connu, il est lié à l'état des histones, on sait que leur désacétylation par exemple diminue l'expression des gènes en " resserrant l'enroulement du brin d'ADN ". Le second est spécifique et résulterait de la décroissance d'un inducteur qui n'est plus disponible lorsque le gène adulte ou le mieux adapté s'exprime car cet inducteur est alors lié au produit du gène spécifique. 20 L'existence de cet interrupteur spécifique est maintenant mise en évidence par les expériences montrant que le même " interrupteur général ", inhibiteur d'histone déacétylase, va " allumer " l'hémoglobine foetale dans l'anémie falciforme, l'utrophine dans la dystrophie de Duchenne ou 25 SMN2 dans l'amyotrophie spinale etc. Ainsi des produits actifs sur un mécanisme général d'expression sont rendus permissifs pour l'expression du gène silencieux dans chaque cas, par la disponibilité de l'inducteur sélectif (probablement le NO 30 ou le cGMP pour utrophine, le 2-3DPG ou dérivé pour l'hémoglobine foetale, Ch3SM, Ch3SmRNP ou dérivé pour SMN2). Ce ligand ne trouvant plus sa cible spécifique du fait de la mutation, autorise alors l'action de l'interrupteur général qui allume préférentiellement le gène silencieux 35 correspondant à la mutation. Ainsi il suffit que la mutation rende disponible le ligand d'un produit du gène muté sélectif dans chaque cas, pour que l'inhibiteur d'histone déacétylase puisse assurer préférentiellement l'expression 5 du gène homologue du gène muté. Ceci a des applications multiples car chaque fois qu'un produit a été actif dans une mutation donnée, en agissant sur l'interrupteur général et a permis l'expression du gène silencieux, il est à prévoir qu'il sera actif dans toute les autres pathologies. 10 Les travaux de recherche effectués dans le cadre de l'invention ont confirmé que cette régulation n'est déclenchée que si l'on lève une inhibition générale des gènes silencieux, qui est liée à l'état d'acétylation des histones (Zang and Reinberg, 2001). Il est en effet établi que dans sa forme hypoacétylée, l'histone freine l'expression de ces gènes. En présence de butyrate ou d'autres inhibiteurs d'histone déacétylase, on lève cette inhibition générale et l'on permet alors à l'inducteur sélectif, activé du fait de la 20 mutation, de déclencher le gène silencieux. Les inhibiteurs d'histones déacétylase, comme le butyrate sont, du reste, utilisés dans le traitement de l'anémie falciforme. Ce même principe peut aussi s'appliquer à l'amyotrophie spinale, SMN1 étant muté, son ligand CH325 SmRNP (méthyl, smallribonucléoprotéine) deviendrait inducteur, si toutefois le butyrate lui permet d'agir en favorisant la réacétylation des histones. L'expression de SMN2 a été ainsi obtenue par le butyrate (Chang et al., 2001). Il serait aussi dans ce cas utile de favoriser la 30 méthylation de SmRNP ou d'en augmenter l'expression. Les donneurs de NO pourraient être utiles ainsi que les donneurs de méthyle. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence qu'un inhibiteur d'histone déacétylase pouvait être utilisé 35 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu par la ré-expression du gène foetale homologue. Ce médicament selon l'invention est destiné à réactiver l'expression d'au moins un gène foetal 5 dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et/ou la localisation d'au moins une protéine foetale. Ainsi l'invention vise à réactiver le gène foetal codant la forme embryonnaire de la protéine codée par le gène adulte défectueux. L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement des dystrophies musculaires, comme la dystrophie de Duchenne ou de Becker o le gène adulte défectueux est le gène de la dystrophine et le gène foetal 15 homologue est le gène de l'utrophine. Il a en effet été observé que la dystrophine est spatialement très proche de la NOsynthase, et le NO produit localement va sans doute avoir des effets essentiels sur cette protéine, dont la mutation 20 s'accompagne d'un déficit de NOsynthase à la membrane. Le NO permet alors d'induire l'expression de l'utrophine, homologue silencieux de la dystrophine qui prédomine dans la vie fotale, et qui du reste ne subsiste chez l'adulte qu'en des lieux ou la NOsynthase est très 25 élevée (plaque motrice, vaisseaux). Ainsi, les Inventeurs ont démontré que l'arginine, substrat de la NOsynthase, et les donneurs de NO, entraînent une sur-expression d'utrophine. Cet effet a été obtenu sans lever l'interrupteur général lié à 30 l'acétylation des histones, car le NO bloque aussi des étapes essentielles du cycle de Krebs, ce qui entraîne une élévation de l'acétylCoA et des corps cétoniques (butyrate). Ainsi le NO agit comme ligand inducteur mais aussi via le butyrate sur l'histone déacétylase. La mise en oeuvre d'un inhibiteur d'histone déacétylase selon l'invention offre en outre l'avantage de disposer d'un médicament qui peut être administré par voie orale. L'action de la L-arginine et de ses dérivées sur la réactivation du gène foetale est obtenue par voie parentéale. Or il est difficile d'appliquer une telle thérapie sur le long terme et il est nécessaire de prévoir des périodes de repos. Les inhibiteurs d'histones 10 déacétylases avantageusement administrés par voie orale permettent de maintenir l'effet pendant ces périodes. En effet, les inhibiteurs d'histones déacétylases permettent de maintenir durant ces périodes Selon une première forme de mise en oeuvre de 30 l'invention, l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé dans ledit médicament avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules. Selon une seconde forme de mise en oeuvre de l'invention, le médicament comprenant l'histone déacétylase est administré à un individu ayant reçu concomitamment ou préalablement à l'administration dudit médicament une 5 quantité appropriée d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules. Le composé capable d'induire la formation de NO 10 est par exemple la Larginine, ou un de ses dérivés constituant un substrat de la NO-synthase ou favorisant la disponibilité du substrat. Ainsi, un exemple préféré de la première forme de mise en oeuvre de l'invention ci-dessous, concerne une composition pharmaceutique comprenant du 15 butyrate d'arginine. Le composé donneur de NO est par exemple la molsidomine ou de l'un de ses dérivés capable lors de sa transformation dans l'organisme de libérer du NO. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe o : - la figure 1 illustre la possibilité d'induire une augmentation de l'utrophine dans le muscle sous l'effet 25 d'inhibiteurs d'histone déacétylase, en utilisant le butyrate, chef de file de ces inhibiteurs sur des cultures de myotubes de souris; - la figure 2 représente l'analyse par immunofluorescence de l'utrophine présente dans les muscles 30 de souris dystrophiques mdx, le modèle animal de la myopathie de Duchenne, auxquelles ont été injectés du butyrate et à titre de comparaison de la L-arginine en tant que donneur de NO - la figure 3 représente l'analyse par 35 immunofluorescence de l'utrophine après application des mêmes molécules que pour la figure 2 à des myotubes humains en culture; - la figure 4 représente l'augmentation de l'utrophine dans des souris saines traitées par le butyrate d'arginine. Exemple 1: Augmentation de l'utrophine dans des myotubes de souris mdx traitées par le butyrate (Figurel). Des myotubes de souris mdx dystrophiques (lignée xlt) sont traités par 5 mM de butyrate pendant 48h. L'augmentation de l'utrophine est ensuite quantifiée en Western Blot. La mesure de l'intensité des bandes montre une augmentation d'expression d'utrophine d'un facteur 2 15 après traitement des myotubes par le butyrate. Exemple 2: Augmentation de l'utrophine dans des souris mdx traitées par le butyrate (Figure 2). Des souris mdx sont été injectées 20 quotidiennement, en i.p. et pendant 6 semaines avec 200 mg/kg/jour soit de butyrate, soit de L-arginine, soit de sérum physiologique. On observe que l'utrophine est peu exprimée dans le muscle des souris mdx injectées avec du sérum physiologique utilisé comme contrôle. Par contre dans 25 les souris injectées avec le butyrate ou la L-arginine, l'utrophine apparaît sous la membrane musculaire. Il faut noter que l'augmentation d'utrophine est supérieure dans le cas des souris injectées avec le butyrate. L'augmentation de l'utrophine a été quantifiée en Western Blot. La mesure 30 de l'intensité des bandes montre une augmentation d'expression d'utrophine d'un facteur 2 dans les souris mdx traitées par le butyrate. Exemple 3: Augmentation de l'utrophine dans 35 des myotubes humains traités par le butyrate (Figure 3). Des myotubes humains ont été obtenus après mise en culture de résidus opératoires fournis par la BTR (Banque de Tissu pour la Recherche). Ces myotubes, une fois différenciés ont été traités avec du butyrate ou de la L5 arginine. Comme dans le cas des souris injectées, l'augmentation d'utrophine visualisée par immunofluorescence est particulièrement importante après traitement par 0,5 mM de butyrate. Exemple 4: Augmentation de l'utrophine dans des souris saines traitées par le butyrate d'arginine. (Figure 4). Des souris OF1 sont été injectées quotidiennement, en i.p. et pendant 6 semaines avec 100, 15 200 ou 300 mg/kg/jour soit de butyrate d'arginine, soit de sérum physiologique. On n'observe pas d'utrophine à la membrane dans le muscle des souris injectées avec du sérum physiologique utilisé comme contrôle (" non traité"). Par contre dans les souris injectées avec le butyrate 20 d'arginine, l'utrophine apparaît très nettement sous la membrane musculaire. Cette augmentation est dosedépendante. L'induction d'utrophine sous la membrane musculaire est importante probablement en raison d'un effet additif de l'arginine via le NO et du butyrate via 25 l'activation de la transcription du gène de l'utrophine. R F RENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Adekile, 1998. Ann. Trop. Paediatr. 9: 165168. - Chang et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 : 9808-9813. - Chaubourt et al., 1999. Neurobiol. Diseases 6: 499-507. - Chaubourt et al., 2000. CR. Acad. Sci. III10 Vie 323, 735-740. - Chaubourt et al., 2001.J. Physiol. (Paris) 96, 43-52. - Chaubourt E. , Fossier P. , Baux G. , Leprince C. , IsraÙl M. , De La Porte S. (1999). Brevet N 15 99/07442 Composition pharmaceutique comprenant du NO ou au moins un composé capable de libérer ou d'induire la formation de NO dans les cellules. - Zang and Reinberg, 2001. Genes Dev. 15 2343-2360. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un inhibiteur d'histone déacétylase pour la préparation d'un médicament destiné au 5 traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience d'un gène adulte chez un individu par la réexpression du gène foetal homologue. 2) Utilisation selon la revendication 1, 10 caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à réactiver l'expression d'au moins un gène foetal dans des tissus adultes de façon à restaurer la présence et/ou la localisation d'au moins une protéine foetale. 3) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène foetal code la forme embryonnaire de la protéine codée par le gène adulte défectueux. 4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite maladie est une dystrophie. 5) Utilisation selon la revendication 4, 25 caractérisée en ce que ladite maladie est la dystrophie de Duchenne ou la dystrophie de Becker et en ce que le gène adulte défectueux est le gène de la dystrophine et le gène foetal homologue est le gène de l'utrophine. 6) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur d'histone déacétylase est choisi dans le groupe comprenant le butyrate, le phénylbutyrate, l'isobutyramide, le valproate, le dérivé hydroxamate de l'acide butyrique, l'apicidin, le CBHA (m35 carboxycinnamic acid bishydoxyamide), l'HC toxin, le M344 (4dimethylamino-N-(6-hydroxycarbamoyl-hexyl)-benzamide), le Nullscript (4(1,3-dioxo-lH,3H-benzo[de]isoquinolin-2yl)-N-hydroxybutanamide), le SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid), le Scriptaid (6-(1.3-dioxo-lH,3H5 benzo[de]isoquinolin-2-yl)-N-hydroxyhexanamide), la trichostatine (TSA; (R-(E,E)-7-[4-(dimethylamino)-phenyl]N-hydoxy-4,6-dimethyl-7-oxo-2,4heptadienamide). 7) Utilisation selon l'une quelconque des 10 revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit médicament est pour une administration par voie orale. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que 15 l'inhibiteur d'histone déacétylase est associé dans ledit médicament avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules. 9) Utilisation d'un inhibiteur d'histone déacétylase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant de la déficience 25 d'un gène adulte chez un individu par la ré-expression du gène foetal homologue, ledit individu ayant reçu concomitamment ou préalablement à l'administration dudit médicament une quantité appropriée d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant le NO, un composé donneur 30 de NO ou un composé capable de libérer, de favoriser ou d'induire la formation de NO dans les cellules. 10) Utilisation selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que le composé capable d'induire 35 la formation de NO est la L-arginine, ou un de ses dérivés constituant un substrat de la NO-synthase ou favorisant la disponibilité du substrat. 11) Utilisation selon l'une des revendications 5 8 ou 9, caractérisée en ce que le composé donneur de NO est la molsidomine ou de l'un de ses dérivés capable lors de sa transformation dans l'organisme de libérer du NO.