Brevet FR2850462A1 — publié le 20040730

Procédé d'extraction et de détection de ciguatoxines de produits biologiques. La présente invention concerne le domaine des procédés d'analyse biologiques et biochimiques. La présente invention trouve son application principale dans le domaine agroalimentaire. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé d'extraction et de détection de ciguatoxines contenues dans des produits biologiques contaminés par ces composés, à savoir des tissus de poissons. Le procédé selon l'invention a pour principal objectif de permettre l'exploitation, en vue de leur consommation alimentaire par l'homme des poissons exotiques des lagons et des récifs coralliens présents sur quasiment tous les littoraux océaniques de la ceinture équato-tropicale (notamment, mais non exclusivement en Polynésie, dans les Caraïbes, dans les Mascareignes, etc. ). En effet, une telle consommation alimentaire est à ce jour, considérée comme impliquant des risques sanitaires importants. A la différence des poissons pélagiques, les poissons exotiques des lagons et des récifs coralliens, tels que à titre de simples exemples les poissonsperroquets et les carangues, peuvent absorber des microorganismes présents dans ces biotopes, principalement des protistes dinoflagellés (notamment Gambierdiscus toxicus) secrétant des ciguatoxines (ci-après désignées par l'abréviation "CTXs"). Ces biotoxines marines sont donc susceptibles de se retrouver dans la chair et dans les organes de ce type de poissons, et donc d'engendrer chez l'homme les ayant consommés une intoxication alimentaire grave connue, selon les régions du monde, notamment sous les noms de gratte ou ciguatéra . Les symptômes principaux de l'intoxication ciguatérique sont essentiellement des perturbations digestives, des éruptions cutanées, des atteintes articulaires, des perturbations du système de thermorégulation du corps ainsi que, dans les cas les plus graves, des atteintes neurologiques. Dans les cas les plus grave, cette intoxication peut être mortelle. Or, il est actuellement impossible de déterminer de façon rapide et efficace si un poisson pêché dans un lagon est susceptible ou non, lors de sa consommation alimentaire d'induire une intoxication ciguatérique. Une telle impossibilité de déterminer ce potentiel ciguatoxique est un frein à l'utilisation et notamment à l'exportation de ce type de poissons en tant que ressource alimentaire alors même que nombre de ceux-ci présentent, par ailleurs, des qualités nutritives et gustatives intéressantes. Ce problème est tel qu'il a empêché et empêche tout développement et mise en place d'une filière d'exportation des tels poissons du lagon, que cela soit en tant que poisson frais, séché ou salé. A ce jour, la structure moléculaire de vingt-trois CTXs est élucidée. Ces CTXs sont toutes des composés polycycliques polyéthers de masse moléculaire supérieure à 1000 grammes par mole. L'article "Structural Elucidation of Ciguatoxin Congeners by Fast-Atom Bombardment Tandem Mass Spectroscopy", de Yasumoto et al. ; J.Amer.Chem.Soc.2000, 122 : 4988-4989 donne notamment des informations sur ces différentes CTXs. A l'heure actuelle un seul test de détection des ciguatoxines est connu. Ce test, de type immunologique, est notamment décrit dans la demande de brevet européen EP-528895 publiée le 19 avril 1991 et ayant pour titre "Analyse immunologique simplifiée en phase solide effectuée à l'aide de billes colorées pour détecter la ciguatoxine ou des polyéthers apparents". Ce test est associé à un procédé d'extraction sur résine décrit quant à lui dans la demande de brevet européen EP-638170, publiée le 11 novembre 1993 et ayant pour titre "Extraction rapide de la ciguatoxine de tissus contaminés". Ce test et le procédé d'extraction associé présentent un inconvénient majeur. En effet, les différentes CTXs découvertes présentent des structures moléculaires variées. De plus, il a aussi été démontré que ces toxines montraient des activités biologiques (notamment des I.C.50 et D.L.50) et des caractéristiques chimiques (masse molaire, polarité, solubilité) spécifiques. Enfin, ces biotoxines ont des répartitions quantitative et qualitative distinctes en fonction des espèces de poisson. Cette diversité biologique et chimique des ciguatoxines est notamment décrites dans les articles suivants : - "Structures and Configurations of Ciguatoxin from the Moray Eel Gymnothorax javanicus and its Likely Precursor from the Dinoflagellate Gambierdiscus toxicus " de Murata et al. : J.Amer.Chem.Soc.1990, 112 : 11 4380- 4386 ; - "Isolation and Structure of Ciguatoxin-4A, a New Ciguatoxin Precursor, from Cultures of Dinoflagellate Gambierdiscus toxicus and Parrotfish Scarus gibbus " de Satake et al. : Biosci.Biotechnol.Biochem. 1996, 60 : 12 2103-2105 ; - " Structure of Caribbean Ciguatoxin Isolated from Caranx latus" de Lewis et al. ; J.Amer.Chem.Soc. 19698, 120 : 24 5914-5920 ; - "Isolation and Structures of New Ciguatoxin Analogs, 2,3DihydroxyCTX3C and 51-HydroxyCTX3C, Accumulated in Tropical Reef Fish " de Satake et al. ; Tetrahedron Lett. 1998, 39 : 10 1197-1198 ; - "Toxins involved in ciguatera fish poisoning in French Polynesia : ciguatoxins profiles of herbivorous and carnivorous fish muscles from highly endemic areas" de Legrand et al. ; Toxicon 1997, 36 : 1667. Or, tout concourre à penser que la toxicité des poissons renfermant de telles ciguatoxines est due à l'effet synergique de plusieurs CTXs. En conséquence, une telle toxicité ne peut être correctement évaluée que par l'utilisation d'une grande quantité de tissus contaminés ou ayant une forte concentration en CTXs. Une autre voie expérimentale de détection des CTXs a été menée par Richard J. Lewis et son équipe et est décrite dans l'article "HPLC/tandem electrospray mass spectrometry for the détermination of sub-ppb levels of Pacific and Caribbean ciguatoxins in crude extracts of fish " de Lewis et al. ; Anal.chem. 1999,71 : 1 247-250. Il est démontré dans cet article que la voie chimique, qui a permis d'isoler et de connaître la structure moléculaire de toutes les CTXs identifiées à ce jour, pouvait également constituer un outil d'analyse. Les travaux décrits portent sur l'analyse et la détection de CTXs dans la chair de poisson. Toutefois, la proportion de toxines dans la chair de poisson est souvent très faible. De ce fait, il est nécessaire d'utiliser une grande quantité de cette chair pour déterminer si celui-ci contient ou non des CTXs. Il est alors difficile de commercialiser le poisson ainsi testé. La présente innovation se propose de remédier aux différents inconvénients des procédés connus de détection et d'analyse des ciguatoxines. Notamment, un des objectifs de la présente invention est de proposer un procédé d'extraction et de détection de ciguatoxines ne nécessitant pas l'utilisation de chair de poisson et permettant donc la commercialisation des poissons testés. Encore un objectif de la présente invention est de proposer un tel procédé qui détecte non pas une ciguatoxine donnée mais un ensemble de ciguatoxine présentant des structures moléculaires distinctes. Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé d'extraction et d'analyse de ciguatoxines contenues dans un produit biologique caractérisé en ce que ledit produit biologique est constitué par l'hépatopancréas d'un poisson, et en ce qu'il comprend les étapes consistant à : prélever au moins un échantillon dudit produit biologique ; obtenir un extrait purifié renfermant au moins l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon ; analyser par chromatographie liquide haute performance couplée à une spectrométrie de masse en tandem (ci après désigné par l'abréviation CLHP/SM/SM) au moins une fraction dudit extrait purifié. Ainsi, la présente invention propose, en rupture avec l'art antérieur, d'extraire et de doser les ciguatoxines de tissus de poissons, non pas à partir d'un échantillon de chair de ceux-ci mais à partir de leur hépato-pancréas. En pratique, on utilisera préférentiellement un échantillon d'une masse de 1 g à 100 g. L'hépatopancréas des poissons constitue l'organe de ceux-ci dans lequel la quantité de toxine(s) accumulée(s) est, si le poisson en question en contient, la plus élevée. Selon l'invention, il est possible d'attester de la non-toxicité d'un poisson, si aucune ciguatoxine n'y est détectée. On notera également que la présente invention autorise la commercialisation du poisson testé, soit entier-éviscéré, soit en filet, si aucune ciguatoxine n'y est détecté dans la mesure où il n'aura pas été amputé d'une partie de sa chair pour les besoins de l'analyse. Ladite étape du procédé selon l'invention consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines dudit échantillon peut être un étape passive, et par exemple mettre en oeuvre une macération et/ou un étape active et mettre en oeuvre par exemple une agitation mécanique et/ou une agitation sonique et/ou une extraction chimique. Toutefois, préférentiellement, cette étape met en oeuvre une ou plusieurs phases de solubilisation dans au moins un système solvant couplée (s) une ou plusieurs phases de séparation par passage sur une ou plusieurs colonnes de chromatographie. Selon une variante particulièrement intéressante de l'invention, ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon comprend les étapes consistant à : solubiliser ledit échantillon dans un premier système solvant ; récupérer ledit premier système solvant contenant ledit échantillon solubilisé et le déposer sur une première colonne de chromatographie ; utiliser un deuxième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la première colonne de chromatographie ; évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un premier résidu ; mettre en suspension ledit premier résidu dans un troisième système solvant ; récupérer ledit troisième système solvant contenant ledit premier résidu solubilisé et le déposer sur une deuxième colonne de chromatographie ; utiliser un quatrième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la deuxième colonne de chromatographie ; évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un deuxième résidu ; mettre en suspension ledit deuxième résidu dans un cinquième système solvant ; récupérer ledit cinquième système solvant contenant ledit second résidu solubilisé et le déposer sur une troisième colonne de chromatographie ; utiliser un sixième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la troisième colonne de chromatographie, évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un troisième résidu. Il est possible dans ce cas d'utiliser différents types connus de colonne de chromatographie. Selon un mode de réalisation, ces colonnes pourront ainsi être choisies dans le groupe constitué par : "phase inverse C-18 #", "phase normale Silice # " et "phase normale Florisil #" commercialisée par la société Waters Chromatography, 34 Maple Street, Milford Massachusetts 01757. Selon une variante préférentielle on utilise la "phase inverse C-18 #" en tant que phase stationnaire de ladite première colonne de chromatographie, la "phase normale Silice #" en tant que phase stationnaire de ladite seconde colonne de chromatographie et la "phase normale Florisil #" en tant que phase stationnaire de ladite troisième colonne de chromatographie. Les premier, deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième solvants cités ci-dessus pourront être de différentes natures, toutefois préférentiellement le premier système solvant est constitué par un mélange méthanol/eau (70/30) ou un mélange méthanol/eau/ammoniac (70/29/1), le deuxième système solvant est constitué par un mélange méthanol/eau (90/10) ou un mélange méthanol/eau/ammoniac (90/9/1), le troisième système solvant est constitué par un mélange acétate d'éthyle/dichlorométhane (30/70), le quatrième système solvant est constitué par un mélange dichlorométhane/méthanol (80/20), le cinquième système solvant est constitué par un mélange hexane/acétone (95/5), ledit sixième système solvant est constitué par un mélange acétone/méthanol (90/10). Selon une variante de l'invention, ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon peut comprendre au moins une étape complémentaire consistant à diluer ou à concentrer les premier et/ou troisième et/ou cinquième systèmes solvants contentant les extraits de toxines avant de les déposer respectivement sur les première et/ou deuxième et/ou troisième colonne(s) de chromatographie. Egalement selon une variante, ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon peut comprendre au moins une étape complémentaire consistant à filtrer lesdits solvants contenant les toxines sur filtre pour solvant organique ou à leur faire subir une précipitation à froid ou une centrifugation pour éliminer les graisses et les composés de poids moléculaire élevé. Préférentiellement, lesdites étapes d'évaporation à sec desdites toxines sont effectuées soit au moyen d'un évaporateur rotatif sous pression atmosphérique ou sous pression réduite soit au moyen d'un évaporateur concentrateur, soit par séchage sous flux d'azote. En ce qui concerne ladite étape consistant à analyser par CLHP/SM/SM au moins une fraction dudit extrait purifié, celle-ci comprend préférentiellement les étapes consistant à : injecter ladite fraction dudit extrait dans un appareil de CLHP/SM/SM ; obtenir un spectre représentatif de ladite fraction ; relever les caractéristiques suivantes : le temps mis lors de la séparation chromatographique , la masse moléculaire et l'aire des pics représentatifs de la ou des espèces moléculaires des ciguatoxines présentes dans ladite fraction ; comparer ces caractéristiques à des paramètres standards observés dans les mêmes conditions d'analyse pour des gammes de concentrations données de ciguatoxines standards associées à un extrait d'hépatopancréas de poisson atoxique ; en déduire la présence ou l'absence de ciguatoxine(s) dans ladite fraction ainsi que la concentration de la ou des ciguatoxines présentes dans ladite fraction. On utilise en tant que ciguatoxines standards préférentiellement tout ou partie des ciguatoxines suivantes bien identifiées dans l'art antérieur : la CTX, la 52-épi CTX, la 54-déoxy CTX, la 54-déoxy, 52-épi CTX, la CTX-3C, la 52-épi CTX 3C, la CTX-4A, la 52-épi CTX-4A, la 2,3-diol CTX-3C, la 2,3,51-triol CTX-3C et la M-seco CTX-4A. Toutefois d'autres ciguatoxines pourront également être utilisées. Selon une variante de l'invention ladite étape consistant à analyser par CLHP/SM/SM au moins une fraction dudit extrait purifié peut comprendre une étape préliminaire consistant à doper ladite au moins une fraction dudit extrait avec de l'acétate d'ammonium ou avec un sel équivalent ou encore à mettre en contact ladite fraction avec une résine échangeuse d'ions dans le but d'améliorer la détection des espèces moléculaires de ciguatoxines. Cette chromatographie liquide haute performance pourra par ailleurs être effectuée avec un système solvant d'élution qui peut être un mélange binaire ou ternaire de solvants par exemple choisis dans le groupe constitué par l'eau, le méthanol, l'acétonitrile, l'acide acétique, l'acide formique, l'ammoniac. On notera aussi que la chromatographie liquide haute performance pourra être menée en mode isocratique (c'est-à-dire avec une composition constante du système solvant d'élution) ou en mode gradient (c'est-à-dire avec une composition variable du système solvant d'élution). Enfin on notera que la ou les espèces moléculaires des ciguatoxines détectées et quantifiées grâce au procédé selon l'invention pourront être constitués par les ions moléculaires, les ions pseudomoléculaires, les ions neutres ou les ions fils des ciguatoxines. L'invention permet donc d'évaluer qualitativement et quantitativement la présence de ciguatoxines dans l'hépatopancréas de poissons et d'en déduire si ceux-ci sont ou non consommables par l'homme. L'invention concerne donc tout Procédé d'évaluation du caractère consommable en alimentation humaine d'un poisson caractérisé en ce qu'il comprend une phase de mise en oeuvre du procédé d'extraction et d'analyse de ciguatoxines décrits ci-dessus et une phase consistant, en fonction des résultats d'analyse, à considérer que ledit poisson est consommable si son hépatopancréas ne contient pas de ciguatoxine ou s'il contient une quantité de ciguatoxine(s) inférieur à un seuil prédéterminé ou qu'il est impropre à la consommation si son hépatopancréas contient une ou plusieurs ciguatoxines ou présente une concentration en ciguatoxine(s) dépassant ledit seuil prédéterminé. L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente, seront plus facilement compris grâce à la description qui va suivre d'un mode précis de réalisation de celle-ci donné à titre de simple exemple non limitatif, en référence aux dessins, dans lesquels : - la figure 1 représente un schéma des moyens de chromatographie liquide haute performance et de spectométrie de masse en tandem utilisés pour analyser l'extrait d'hématopancréas de poisson selon l'invention ; - la figure 2 représente le spectre de masse de la ciguatoxine codée CTX- 4A ; - la figure 3 représente le spectre de masse de la ciguatoxine codée CTX- 3C. ; - la figure 4 représente le ionogramme CLHP/SM/SM de la transition, ion pseudomoléculaire [MH+] : 1062. 1 m/z ~ ion fils [MH±(H20)] : 1043 m/z correspondant à la ciguatoxine CTX-4A ; - la figure 5 représente le ionogramme CLHP/SM/SM de la transition ion pseudomoléculaire [MH+] : 1024. 2 m/z ~ ion fils [MH±(H20)]1005.9 m/z correspondant à la ciguatoxine CTX-3C. 10 g d'hépato-pancréas de poisson ont été mis à macérer dans 20 ml de méthanol pendant 30 secondes à température ambiante avec une agitation aux ultrasons. Le produit macéré a ensuite été centrifugé à 1 000 G et le surnageant obtenu a été filtré à environ 20 C. Le filtrat obtenu a été dilué en y ajoutant 30 % d'eau, c'est-à-dire à peu près 8,5 ml. On notera qu'à ce stade, si une floculation est observée, le produit dilué peut être filtré sur un filtre présentant un pouvoir de coupure de 0,45 m. Ce filtrat dilué a été déposé sur une colonne Sep-Pak C-18 Vac 20cc #. Un lavage a été effectué sur cette colonne avec 30 ml d'un premier système solvant constitué de méthanol et d'eau dans des proportions volumiques respectives de 70 % et 30 % (MeOH/H20 (70/30)). Ce lavage permet d'éliminer les impuretés contenues dans le filtrat dilué mentionné ci-dessus. Les toxines contenues dans ce filtrat ont ensuite été éluées à l'aide de 30 ml d'un deuxième système solvant constitué également de méthanol et d'eau à raison de proportions volumiques respectives de 90 % et de 10 % (MeOH/H20 (90/10)). La fraction d'élution des toxines obtenue a été séchée à l'évaporateur rotatif de façon à obtenir un premier résidu. Ce premier résidu a été repris avec 2 ml d'un mélange constitué de 70 % en volume de dichlorométhane et de 30 % d'acétate d'éthyle CH2Cl2/AcOEt (70/30) et de quelques gouttes de méthanol si besoin. Ce résidu ainsi solubilisé a été déposé sur une Colonne SepPak Si02 PLUS #. 6 ml de CH2Cl2/AcOEt (70/30) ont été utilisés pour laver la colonne et éliminer les impuretés contenues dans ce premier résidu solubilisé, puis 6 ml de CH2Cl2/MeOH (80/20) ont été utilisés pour éluer les toxines contenues dans ce résidu. La fraction d'élution des toxines ainsi obtenue a été séchée à l'évaporateur rotatif pour obtenir un second résidu. Ce second résidu a été repris avec 2 ml de n-C6H14/Acétone (95/5). Ce deuxième résidu solubilisé a été déposé sur une Colonne SepPak Florisil PLUS #. 6 ml d'un cinquième système solvant n-C6H14/Acétone (95/5) a été utilisé pour laver la colonne et éliminer les impuretés contenues dans ce second résidu, puis 6 ml de système solvant Acétone/MeOH (90/10) ont été utilisés pour éluer les toxines contenues dans le deuxième résidu. On a ainsi obtenu une fraction d'élution qui a été séchée à l'évaporateur rotatif et pesée pour constituer un troisième résidu. Ce troisième résidu, constituant un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans l'échantillon d'hémato-pancréas de poisson, a ensuite été analysé selon la présente invention par chromatographie liquide haute performance couplé à une spectrométrie de masse en tandem. En référence à la figure 1, les moyens de chromatographie liquide haute performance (CLHP) comprennent un système de solvant 1, une cellule d'injection 2 du résidu à analyser, une pompe 3 et une colonne de chromatographie 4. Cette dernière permet de séparer entre elles les toxines contenues dans le résidu. Dans le cadre du présent mode de réalisation, la colonne de chromatographie utilisée est une colonne Xterra MS C18 3,5 m présentant des dimensions de 2.1x100 mm. Cette chromatographie liquide haute performance a été effectuée en mode isocratique méthanol/eau/acétate d'ammonium 90/9.9/0.1 avec un débit de 150 L par minute. Les moyens de spectrométrie de masse en tandem (SM/SM) comprennent un cône d'introduction 5 des toxines provenant de la colonne de chromatographie des moyens de chromatographie liquide haute performance, un premier analyseur 6 qui permet de sélectionner l'ion moléculaire de chaque toxine, une cellule de collision 7 et un second analyseur 8 qui permet d'obtenir un spectre de masse spécifique à chaque toxine. Le sens de déplacement des ions dans cet ensemble de spectrométrie de masse en tandem est indiqué par la flèche A. Un ordinateur 9 est relié à ces moyens d'analyse et permet d'enregistrer les données constituées par les temps de rétention des ionogrammes obtenus grâce aux moyens de chromatographie liquide haute performance et par les spectres de masse obtenus grâce aux moyens de spectrométrie de masse en tandem. Les temps de rétention et les spectres ainsi enregistrés peuvent être comparés à ceux obtenus avec des échantillons de référence contenant une ciguatoxine de référence. Les ciguatoxines présentes dans l'échantillon d'hépato-pancréas peuvent ainsi être décelées. Les figures 2 et 3 représentent les spectres de masse des ciguatoxines de référence CTX-4A et CTX-3C respectivement. Ces spectres de masse laissent apparaître un pic [MH+] correspondant au pic de l'ion moléculaire protoné ou de l'ion pseudo-moléculaire et d'autres pics [MH+] - x (H20) correspondant aux ions fils issus de la perte d'une ou de plusieurs molécules d'eau. Les ionogrammes selon les figures 4 et 5 ont été obtenus en co-injectant 8,5 nanogrammes de ciguatoxine avec 1 gramme équivalent d'extrait de foie atoxique de thon (Thunnus alalunga, thon germon). Selon les figures 4 et 5, on observe un temps de rétention de la ciguatoxine CTX-4A de 7,60 mn et un temps de rétention de la ciguatoxine CTX-3C de 7,22 mn. Des ionogrammes et des spectres de masse sont disponibles pour toutes les ciguatoxines connues. Grâce aux ionogramme et aux spectres de masse de référence, il est ainsi possible de détecter quelles sont les ciguatoxines contenues dans l'extrait purifié obtenu à partir de l'échantillon d'hépato-pancréas de poisson testé. REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction et d'analyse de ciguatoxines contenues dans un produit biologique caractérisé en ce que ledit produit biologique est constitué par l'hépatopancréas d'un poisson, et en ce qu'il comprend les étapes consistant à : prélever au moins un échantillon dudit produit biologique ; obtenir un extrait purifié renfermant au moins l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon ; analyser par chromatographie liquide haute performance couplée à une spectrométrie de masse en tandem (CLHP/SM/SM) au moins une fraction dudit extrait purifié. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines dudit échantillon met en oeuvre une macération et/ou une agitation mécanique et/ou une agitation sonique et/ou une extraction chimique. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon met en oeuvre une ou plusieurs phases de solubilisation dans au moins un système solvant couplée (s) une ou plusieurs phases de séparation par passage sur une ou plusieurs colonnes de chromatographie. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon comprend les étapes consistant à : solubiliser ledit échantillon dans un premier système solvant ; récupérer ledit premier système solvant contenant ledit échantillon solubilisé et le déposer sur une première colonne de chromatographie ; utiliser un deuxième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la première colonne de chromatographie ; évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un premier résidu ; mettre en suspension ledit premier résidu dans un troisième système solvant ; récupérer ledit troisième système solvant contenant ledit premier résidu solubilisé et le déposer sur une deuxième colonne de chromatographie ; utiliser un quatrième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la deuxième colonne de chromatographie ; évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un deuxième résidu ; mettre en suspension ledit deuxième résidu dans un cinquième système solvant ; récupérer ledit cinquième système solvant contenant ledit second résidu solubilisé et le déposer sur une troisième colonne de chromatographie ; utiliser un sixième système solvant pour extraire les contaminants et récupérer un extrait de toxines de la troisième colonne de chromatographie, évaporer à sec ledit extrait de toxines recueilli afin d'obtenir un troisième résidu. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'on utilise en tant que phases stationnaires des colonnes de chromatographie des phases choisies dans le groupe constitué par : "phase inverse C-18 #", "phase normale Silice " et "phase normale Florisil #" 6. Procédé selon les revendications 4 et 5 caractérisé en ce que l'on utilise la "phase inverse C-18 #" en tant que phase stationnaire de ladite première colonne de chromatographie, la "phase normale Silice #" en tant que phase stationnaire de ladite seconde colonne de chromatographie et la "phase normale Florisil #" en tant que phase stationnaire de ladite troisième colonne de chromatographie. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit premier système solvant est constitué par un mélange méthanol/eau (70/30) ou un mélange méthanol/eau/ammoniac (70/29/1), 8. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit deuxième système solvant est constitué par un mélange méthanol/eau (90/10) ou un mélange méthanol/eau/ammoniac (90/29/1). 9. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit troisième système solvant est constitué par un mélange acétate d'éthyle/dichlorométhane (30/70). 10. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit quatrième système solvant est constitué par un mélange dichlorométhane/méthanol (80/20). 11. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit cinquième système solvant est constitué par un mélange hexane/acétone (95/5). 12. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit sixième système solvant est constitué par un mélange acétone/méthanol (90/10). 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12 caractérisé en ce que ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon comprend au moins une étape complémentaire consistant à diluer ou à concentrer les premier et/ou troisième et/ou cinquième systèmes solvants contentant les extraits de toxines avant de les déposer respectivement sur les première et/ou deuxième et/ou troisième colonne (s) chromatographie. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 13 caractérisé en ce que ladite étape consistant à obtenir un extrait purifié renfermant l'essentiel des ciguatoxines contenues dans ledit échantillon comprend au moins une étape complémentaire consistant à filtrer lesdits solvants contenant les toxines sur filtre pour solvant organique ou à leur faire subir une précipitation à froid ou une centrifugation pour éliminer les graisses et les composés de poids moléculaire élevé. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 14 caractérisé en ce que lesdites étapes d'évaporation à sec desdites toxines sont effectuées soit au moyen d'un évaporateur rotatif sous pression atmosphérique ou sous pression réduite soit au moyen d'un évaporateur concentrateur, soit par séchage sous flux d'azote. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que ladite étape consistant à analyser par CLHP/SM/SM au moins une fraction dudit extrait purifié comprend les étapes consistant à : injecter ladite fraction dudit extrait dans un appareil de CLHP/SM/SM ; obtenir un spectre représentatif de ladite fraction ; relever les caractéristiques suivantes : le temps mis lors de la séparation chromatographique , la masse moléculaire et l'aire des pics représentatifs de la ou des espèces moléculaires des ciguatoxines présentes dans ladite fraction ; comparer ces caractéristiques à des paramètres standards observés dans les mêmes conditions d'analyse pour des gammes de concentrations données de ciguatoxines standards associées à un extrait d'hépatopancréas de poisson atoxique ; en déduire la présence ou l'absence de ciguatoxine(s) dans ladite fraction ainsi que la concentration de la ou des ciguatoxines présentes dans ladite fraction. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que lesdites ciguatoxines standards sont constitués par tout ou partie de l'ensemble suivant de ciguatoxines, à savoir : la CTX, la 52-épi CTX, la 54-déoxy CTX, la 54-déoxy, 52-épi CTX, la CTX-3C, la 52-épi CTX 3C, la CTX-4A, la 52-épi CTX-4A, la 2,3-diol CTX-3C, la 2,3,51-triol CTX-3C et la M-seco CTX-4A. 18. Procédé selon la revendication 16 ou 17 caractérisé en ce que ladite étape consistant à analyser par CLHP/SM/SM au moins une fraction dudit extrait purifié comprend une étape préliminaire consistant à doper ladite au moins une fraction dudit extrait avec de l'acétate d'ammonium ou avec un sel équivalent ou encore à mettre en contact ladite fraction avec une résine échangeuse d'ions dans le but d'améliorer la détection des espèces moléculaires de ciguatoxines. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 18 caractérisé en ce que la chromatographie liquide haute performance est effectuée avec un système solvant d'élution qui peut être un mélange binaire ou ternaire de solvants. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que lesdits solvants utilisés pour la chromatographie liquide haute performance sont choisis dans le groupe constitué par l'eau, le méthanol, l'acétonitrile, l'acide acétique, l'acide formique, l'ammoniac. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 caractérisé en ce que la chromatographie liquide haute performance est menée en mode isocratique ou en mode gradient. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 caractérisée en ce que la ou les espèces moléculaires des ciguatoxines sont constitués par les ions moléculaires, les ions pseudomoléculaires, les ions neutres ou les ions fils des ciguatoxines. 23. Procédé d'évaluation du caractère consommable en alimentation humaine d'un poisson caractérisé en ce qu'il comprend une phase de mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22 et une phase consistant, en fonction des résultats d'analyse, à considérer que ledit poisson est consommable si son hépatopancréas ne contient pas de ciguatoxine ou s'il contient une quantité de ciguatoxine(s) inférieur à un seuil prédéterminé ou qu'il est impropre à la consommation si son hépatopancréas contient une ou plusieurs ciguatoxines ou présente une concentration en ciguatoxine (s) dépassant ledit seuil prédéterminé.