Brevet FR2854328A1 — publié le 20041105

COMPOSITION COSMETIQUE OU DERMATOLOGIQUE OUPHARMACEUTIQUE CONTENANT UN FACTEUR DE CROISSANCE DU TYPEVEGETAL DE NATURE PEPTIDIQUE La présente invention concerne l'utilisation en cosmétique, en dermatologie, ou en pharmacie, de facteurs de croissance du type végétal, et des compositions contenant un tel facteur de croissance. A ce jour, l'unique facteur de croissance de nature protéique découvert chez les plantes est la phytosulfokine (PSK). En 1996, Matsubayashi et Sakagami de l'Université Japonaise de Nagoya ont mis en évidence qu'un peptide signal, la phytosulfokine était indispensable pour la culture in vitro de cellules végétales. La phytosulfokine (PSK) est un pentapeptide (H-TyrIle-Tyr-Thr-Gln-OH) dont les 2 tyrosines sont sulfatées (S03H) . On parle de PSK-a pour la structure H-Tyr (S03H) Ile-Tyr(S03H)-Thr-Gln-OH et de PSK-p pour la structure HTyr(S03H)-Ile-Tyr(S03H)-Thr-OH, présente naturellement à partir de la structure a par clivage par une carboxypeptidase. La PSK-(3 conserve une activité équivalente à la PSK-a, et il a été démontré que le noyau actif de la molécule est le peptide H-Tyr(S03H)-IleTyr (S03H) -OH. La synthèse biologique de ce peptide se fait par exemple chez Arabidopsis par un système complexe non encore élucidé (4 gènes qui codent pour des précurseurs ont été trouvés : AtPSKl- AtPSK4 ). Chez le riz, le gène de la phytosulfokine est un gène simple copie (OsPSK) qui consiste en un large intron et deux exons. Le précurseur de la PSK est une protéine constituée de 89 aa, où la séquence PSK existe une seule fois. Une séquence signal entraîne ce précurseur dans la voie de sécrétion extracellulaire, où le clivage protéolytique se fait ainsi que la maturation sulfatation, grâce à une tyrosylprotéine sulfotransférase. A ce jour, la phytosulfokine est le seul exemple de résidu tyrosine sulfatée post-traductionnelle connu chez les plantes.Le rôle fonctionnel de la phytosulfokine in vivo dans les plantes n'est pas connu, mais il a été observé in vitro que la phytosulfokine entraîne la différenciation de cellules en cultures, l'embryogenèse somatique, la formation de racines adventives et de bourgeons à partir de cals. Des récepteurs de la phytosulfokine ont été identifiés dans plusieurs végétaux et notamment l'asperge, le riz, le maïs, le tabac, la tomate et la carotte. La phytosulfokine a été mise en évidence dans un milieu conditionné (CM) d'Asparagus et d'au moins une douzaine de plantes (monocotylédones et dicotylédones), ce qui tend à indiquer qu'elle serait présente dans un grand nombre de plantes supérieures. Un milieu conditionné est un milieu obtenu en récupérant le milieu de culture de cellules végétales cultivées en haute densité. Ce milieu contient des éléments indispensables, non encore entièrement élucidés, qui permettent la croissance de cellules en culture en faible densité. Le brevet américain No. 6,514,759 décrit un peptide phytosulfokine utilisé en tant que facteur de croissance végétal, qui augmente la croissance des cellules de toutes les plantes supérieures, et en particulier la croissance des cellules des monocotylédones comme l'asperge, le riz ou le maïs. Le brevet américain No. 6,403,864 décrit un polypeptide précurseur de facteur de croissance végétal, le préprophytosulfokine, précurseur de phytosulfokine, un gène codant un polypeptide précurseur de facteur de croissance végétal et une méthode pour promouvoir la croissance des plantes. Ce brevet décrit que l'incorporation du gène codant pour un polypeptide précurseur de phytosulfokine rend possible l'augmentation de prolifération de cellules végétales. Le brevet japonais No.2000/0179826, des mêmes inventeurs, décrit un promoteur dérivé du gène du précurseur de phytosulfokine. Ce nouveau promoteur peut entraîner l'expression d'un gène structural exogène avec une plus grande potentialité que le promoteur conventionnel CMV 35S (Cauliflower Mozaic Virus). Enfin, Matsubayashi, Sakagami et Yang ont décrit dans la demande de brevet japonais JP20010052946, des polypeptides précurseurs de phytosulfokine dérivés de Arabidopsis thaliana (AtPSK2) et des ADNc codant pour ces polypeptides. La prolifération des cellules végétales peut être mise en u̇vre par l'incorporation du gène décrit dans l'invention. Ces brevets décrivent des facteurs de croissance végétaux de nature peptidique et leurs précurseurs, et leur utilisation pour promouvoir la croissance cellulaire végétale en vue de la multiplication de cellules végétales. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère que des facteurs de croissance végétaux de nature peptidique puissent être des composés susceptibles d'exercer une activité cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, et un objet de la présente invention est la mise en évidence de cette activité. L'invention a donc pour objet une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un facteur de croissance de nature protéique, du type végétal. Au sens de la présente invention, l'expression du type végétal signifie tout facteur de croissance d'origine végétal, c'est à dire obtenue à partir d'un végétal, ou tout facteur de croissance synthétique dont la structure est identique à un facteur de croissance d'origine végétale. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit facteur de croissance est la phytosulfokine ou un de ses précurseurs, d'origine naturelle ou d'origine synthétique. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le ou les facteurs de croissance entrant dans la composition de l'invention sont utilisés à de très faibles doses. Avantageusement, les quantités mises en u̇vre dans la composition de l'invention sont comprises entre 10-2 et 1010 M, préférentiellement entre 10-3 et 10-7 M. Le facteur de croissance du type végétal selon l'invention peut être obtenu à partir d'un végétal. Il peut notamment être obtenu par l'intermédiaire du milieu conditionné, ou encore par extraction d'un tissu végétal. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit tissu végétal est un tissu en forte prolifération du type méristème, ou grain, notamment de riz, en germination. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le facteur de croissance est extrait à partir d'un germe, notamment d'un germe de soja ou de blé, transformé industriellement, par exemple séché et/ou micronisé. Le facteur de croissance selon l'invention peut, plus généralement, être extrait de tout tissu végétal qui exprime le gène codant pour ce facteur de croissance.Il peut être également obtenu par un procédé biotechnologique selon lequel on induit l'expression d'un ou des gènes codant pour le facteur de croissance ou pour un précurseur du facteur de croissance, dans un organisme microbien, animal ou végétal. Suivant un autre mode de réalisation, le facteur de croissance selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique, notamment peptidique, en milieu solide ou en milieu liquide. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal en tant qu'agent d'induction de la prolifération des cellules et/ou en tant qu'agent de stimulation de la différentiation des cellules. Suivant un premier mode de réalisation, ces cellules sont des cellules de l'épiderme ou du derme, et de préférence des kératinocytes ou des fibroblastes, notamment des fibroblastes dermiques humains normaux. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un facteur de croissance du type végétal et de nature protéique pour la lutte contre le vieillissement de la peau. Le processus de vieillissement cutané peut être divisé en deux composantes : d'une part, le vieillissement intrinsèque, génétiquement programmé, et d'autre part le vieillissement extrinsèque, déterminé par l'environnement, dont le principal facteur est l'exposition solaire. Le vieillissement, qu'il soit intrinsèque ou extrinsèque, atteint à des degrés divers, les différentes structures de la peau. Le vieillissement du derme est l'altération qui provoque les modifications les plus visibles de la peau. Le vieillissement intrinsèque du derme est accompagné par une modification des propriétés des fibroblastes, cellules majoritaires de ce tissu. Les fibroblastes deviennent quiescents et prennent un aspect globuleux, mais surtout c'est leur nombre dans la matrice qui diminue de façon importante. L'épiderme, couche visible de la peau, est également touché par le vieillissement, qu'il soit intrinsèque ou extrinsèque. Si le vieillissement du derme à des implications préférentiellement d'ordre esthétique, le vieillissement des kératinocytes de l'épiderme a des conséquences de nature néoplasiques. Les cornéocytes, cellules de l'épiderme ayant subit le processus de différenciation, sont moins adhérents, perdent leur ligne de surface, présentent des modifications tinctoriales et une persistance du noyau. Ces anomalies de taille et de forme des cornéocytes sont associées aux modifications de l'épidermopoïèse liées au vieillissement de l'épiderme. Le turn-over épidermique diminue de 30 à 50 % entre la troisième et la huitième décennie.Cette diminution du turn-over des kératinocytes avec l'âge est à l'origine d'un allongement du temps de cicatrisation des plaies purement épidermique. Les conséquences des altérations du stratum corneum avec l'âge sont dominées par les modifications de la fonction barrière et de la présence d'une xérose cutanée. La sécheresse cutanée est fréquente, associée à la diminution du film hydrolipidique de surface. Enfin la pénétration percutanée de certaines substances est augmentée. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition destinée à accélérer la cicatrisation de plaies purement épidermiques. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à l'élimination ou à l'atténuation des tâches de pigmentation, et à l'éclaircissement de la peau. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition pharmaceutique, dermatologique ou cosmétique destinée au traitement des maladies liées à la diminution du nombre de cellules. Avantageusement, le facteur de croissance de nature protéique du type végétal est la phytosulfokine ou un de ses précurseurs, utilisé de préférence à des doses comprises entre 10-2 et 10-10 M, préférentiellement entre 103 à 10-7 M. Les exemples qui suivent sont des exemples de réalisation particuliers qui illustrent non limitativement l'invention. Exemple 1 : Procédé d'obtention de phytosulfokine à partir d'un milieu conditionné. Un milieu conditionné est obtenu à partir de cellules végétales en cultures, par exemple de cellules de riz. Le pH est ajusté à 8.0 et la solution est passée sur DEAESephadex A-25, équilibrée avec du tampon Tris-HCl pH 8.0. Après lavage de la colonne avec ce même tampon, un gradient de KC1 (400 à 1600 mM) est appliqué à la colonne. Les fractions contenant la phytosulfokine sont obtenues entre 800 et 1200 mM de KC1. On peut alors dessaler les solutions par dialyse, avant de les lyophiliser si besoin. Exemple 2 : procédé d'obtention de phytosulfokine par synthèse peptidique en milieu liquide. Le peptide non sulfaté est obtenu par la méthodologie classique du FastMoc avec un synthétiseur de peptide (Applied Biosystem). La sulfatation du peptide est conduite avec du p-nitrophenyl sulfate comme donneur de substrat. Le milieu réactionnel contient de la glycine-NaOH (pH 8.6), du p-nitrophenyl sulfate, le peptide non sulfaté, l'enzyme (arylsulfotransférase) et du MgCl2, pour une synthèse de durée 24 heures à 37[deg]C. Le peptide sulfaté est purifié sur une colonne Develosil ODS-HG5, avec de l'acétonitrile 10%. Exemple 3 : Utilisation de phytosulfokine sur des fibroblastes dermiques humains normaux. Cet exemple correspond à une série de tests in vitro réalisés sur des cellules animales, et notamment sur des cellules de la peau qui sont soumises à l'action de phytosulfokine obtenue par synthèse chimique. Les cellules sont cultivées à 37[deg]C, 5 % CO2, en milieu nutritif DMEM. Après 24 heures de cultures, les cellules sont traitées par la phytosulfokine, ainsi qu'après le 3è jour. Par rapport au milieu de base, la phytosulfokine testée à 10-4 M et à 10- M, après 6 jours de traitement, entraîne une augmentation respectivement de 15 % et de 59,4 % de la prolifération des fibroblastes en cultures.La phytosulfokine agit donc dans ce modèle in vitro selon un effet dose, et entraîne une régénération significative des fibroblastes dermiques humains normaux, ce qui permet de lutter contre la diminution du nombre de cellules, observée notamment dans les cas de vieillissement dermique. Cet exemple montre également que la phytosulfokine présente la propriété d'induire la prolifération de cellules humaines. Exemple 4 : Utilisation de phytosulfokine sur des kératinocytes humains normaux. Des kératinocytes humains normaux sont ensemencés en plaques 12 puits et sont cultivées pendant 6 jours dans un milieu de base type KBM (Keratinocyte Basal Medium) à 0.15 mM de calcium, auquel on ajoute 10 ng/ml d'EGF (Epidermal Growth Factor), des anti-bactériens et anti-fongiques, dans une enceinte à 37[deg]C, avec 5% de C02 et 95% d'humidité. Les cellules sont ensuite mises en contact avec de la phytosulfokine solubilisée dans le milieu de culture décrit ci-dessus, ou dans ce même milieu supplémenté de calcium (1.5 mM en concentration finale) et de lmM de butyrate de sodium pour induire la différenciation. Au bout de 2 jours, on évalue l'augmentation de la prolifération, par rapport au témoin réalisé sans actif, par comptage des kératinocytes totaux en cellules de Malassez.L'évaluation de la différenciation est estimée également par rapport au témoin sans actif, par comptage des enveloppes cornées après extraction avec une solution de SDS à 1% et à chaud. Les résultats montrent que la phytosulfokine induit une augmentation de 9.6% en moyenne de la prolifération des cellules en présence, à une concentration de 10-5 M. A cette même concentration, la phytosulfokine a également une action sur la différenciation des kératinocytes avec une augmentation minimum de 48% par rapport au témoin. Cet exemple montre que la phytosulfokine, améliore de façon significative l'efficacité des conditions de culture, et en particulier augmente de façon surprenante les phénomènes de prolifération/différenciation des kératinocytes.La phytosulfokine agit sur les kératinocytes, cellules de l'épiderme, en stimulant la prolifération des cellules de la lame basale ainsi que leur différenciation en cornéocytes ; la phytosulfokine permet ainsi de lutter contre le ralentissement du turn-over cellulaire, responsable du vieillissement de la peau. De plus, une augmentation du processus de prolifération/différenciation des kératinocytes entraîne une augmentation du renouvellement cellulaire et de la desquamation, ce qui permet d'éliminer les hyperpigmentations locales (tâches de vieillesse), et plus généralement de contribuer à l'éclaircissement de la peau. Enfin, la cicatrisation des plaies purement épidermique est améliorée. REVENDICATIONS Exemple 5 : Émulsion anti-ride pour le visage Exemple 6 : Émulsion visage et corps 1. Composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un facteur de croissance de nature protéique, du type végétal. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance est la phytosulfokine ou un de ses précurseurs. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que qu'elle comprend des concentrations dudit facteur de croissance comprises entre 10-2 et 10-10 M, préférentiellement entre 103 à 10-7 M. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance du type végétal est obtenu à partir d'un végétal. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance du type végétal est obtenu par l'intermédiaire du milieu conditionné, ou par extraction d'un tissu végétal en forte prolifération. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit tissu végétal est un méristème ou un grain en germination. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance du type végétal est obtenu en faisant exprimer le gène codant pour ledit facteur de croissance ou pour un précurseur dudit facteur de croissance dans un organisme microbien, animal ou végétal. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance du type végétal est obtenu par synthèse chimique, notamment peptidique, en milieu solide ou en milieu liquide. 9. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition destinée à accélérer la cicatrisation de plaies purement épidermiques. 10. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à lutter contre les effets du vieillissement cutané. 11. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à l'élimination ou à l'atténuation des tâches de pigmentation. 12. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à l'éclaircissement de la peau. 13. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal pour la fabrication d'une composition destinée au traitement des maladies liées à la diminution du nombre de cellules. 14. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal en tant qu'agent d'induction de la prolifération des cellules. 15. Utilisation d'un facteur de croissance de nature protéique du type végétal en tant qu'agent de stimulation de la différentiation des cellules. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules de l'épiderme, et de préférence des kératinocytes. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules du derme, et de préférence des fibroblastes. 18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 17, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance est la phytosulfokine ou un de ses précurseurs. 19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 18, caractérisée en ce que ledit facteur de croissance est utilisé à des doses comprises entre 10-2 et 10-10 M, préférentiellement entre 10-3 à 10-7 M.