Brevet FR2848682A1 — publié le 20040618

Microscope optique à éclairage structuré modifiable Domaine technique de l'invention L'invention concerne un microscope optique adapté à l'observation de plusieurs sites d'un objet placé dans un plan objet du microscope, comportant une source de lumière, un objectif et un faisceau de lumière issu de la source de lumière. tat de la technique L'observation par microscope optique (la lecture) de bio-puces, plus particulièrement celles présentant un fort contraste, impose des techniques 15 d'éclairage adaptées: il est en effet difficile d'imager simultanément des zones très lumineuses et peu lumineuses d'une même puce en raison de la dynamique limitée des détecteurs. Soit l'amplification du détecteur est suffisante pour visualiser les zones peu lumineuses et les zones très lumineuses sont saturées, soit l'amplification du détecteur est correcte pour les zones très lumineuses et 20 trop faible pour distinguer les zones peu lumineuses du bruit. Des exemples d'objets fortement contrastés sont les lames à immunofluorescence dont les sites bio-actifs, présentant une fluorescence prédéterminée, sont entourés d'un revêtement hydrophobe très fluorescent. 25 Certaines bio-puces comportent des substances fluorescentes dont le but est de passiver les surfaces, d'éviter les contaminations mutuelles des sites bio-actifs ou d'isoler des contacts électriques. La fluorescence de ces substances est souvent plus forte que celle des sites bio-actifs. Ainsi, la mesure de fluorescence des sites bio-actifs est faussée par la fluorescence des zones qui entourent les sites bio-actifs. C'est le cas, par exemple, de certaines puces d'ADN à électropolymérisation ou aux micro-plaques à puits. Dans le cadre de mesures de cinétiques de réaction, l'illumination prolongée de 5 certaines zones peut détruire la fluorescence, entraînant ainsi une perturbation des résultats. Différentes solutions existent pour éviter les problèmes de contraste, par exemple l'emploi de matériaux de support peu fluorescents, de revêtements 10 protecteurs ou d'écrans. Ces solutions imposent des contraintes qui augmentent le cot des dispositifs d'expérience et qui ne sont pas applicables dans tous les cas. Un autre moyen consiste à utiliser des détecteurs équipés d'un système d'anti-éblouissement. Cette solution présente des limitations (la réponse nonlinéaire du détecteur ou la faible efficacité du système d'anti-éblouissement) et 15 ne permet pas de résoudre des problèmes liés à la diffraction de la lumière par les optiques de collection, phénomène qui étale l'énergie lumineuse des régions intenses dans les régions faiblement lumineuses. L'alternative consiste à utiliser un système de lecture point par point (un 20 scrutateur): l'éclairement de la surface est alors effectué par un petit point lumineux qui se déplace. Cette solution est très efficace lorsque la rémanence du détecteur est faible devant la vitesse de balayage et que le contraste reste modeste. Cette solution est mal adaptée lorsque la lecture doit se faire en fond de puits comme c'est le cas pour des micro-plaques ou certaines bio-puces car 25 les bords des puits réduisent le taille du faisceau lumineux, donc l'efficacité de la mesure au niveau des fonds des puits. Les composants mécaniques et électroniques nécessaires pour assurer le balayage sont coteux et difficiles à mettre en oeuvre. Objet de l'invention L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients et, plus particulièrement, de fournir un éclairage structuré adapté. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que le microscope comporte un écran de transmission optique modifiable, comportant des zones présentant chacune un premier état passant et un deuxième état fermé, placé sur le trajet 10 du faisceau optique en amont de l'objet et apte à générer dans le plan objet une image concidant sensiblement avec les sites à observer de l'objet. Selon un développement de l'invention, l'écran de transmission optique modifiable comporte une matrice de miroirs, chacun des miroirs présentant une 15 première position permettant de réfléchir le faisceau de lumière vers l'objet et une deuxième position permettant d'écarter le faisceau de lumière du trajet optique menant à l'objet. Selon un autre développement de l'invention, l'écran de transmission optique 20 modifiable comporte une matrice d'éléments à cristaux liquides chacun des éléments à cristaux liquides présentant un premier état transparent et un deuxième état opaque. Selon un mode de réalisation préférentiel, les éléments à cristaux liquides de la 25 matrice d'éléments à cristaux liquides présentent au moins un troisième état polarisant. Description sommaire des dessins D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention 5 donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels: Les figures 1 et 2 représentent respectivement un objet et un écran adapté à l'objet. Les figures 3 et 4 illustrent deux modes de réalisation particuliers d'un microscope selon l'invention. Les figures 5 et 6 représentent des écrans modifiables pouvant être utilisés respectivement dans les microscopes selon les figures 3 et 4. Les figures 7 et 8 illustrent deux modes de réalisation particuliers d'un 15 microscope selon l'invention. Description de modes particuliers de réalisation. Les figures 1 et 2 représentent respectivement un objet 1 comportant plusieurs sites 2 destinés à être observés par l'intermédiaire d'un microscope optique et un écran 3 de transmission optique modifiable, comportant des zones présentant chacune un premier état passant et un deuxième état fermé. Sur la figure 2, des zones 4 représentent des zones passantes et des zones 5 25 représentent des zones fermées. La figure 3 représente un mode de réalisation d'un microscope 6 optique adapté à l'observation de plusieurs sites 2 d'un objet 1 placé dans un plan objet 7 du microscope 6, comportant une source 8 de lumière et un faisceau de lumière issu de la source 8 de lumière selon un trajet optique 9. Un écran 3 de transmission optique modifiable est placé sur le trajet 9 optique. L'écran 3 est apte à générer une image dans le plan objet 7, l'image concidant sensiblement avec les sites 2 de l'objet 1. Un objectif 10, disposé entre l'écran 3 et l'objet 1, 5 permet d'observer l'objet 1. Sur la figure 3, l'écran 3 de transmission optique transmet la lumière par transparence. Ainsi, sur la figure 3, le trajet 9 optique traverse l'écran 3. L'écran peut être disposé dans un tube d'éclairage du microscope. La figure 4 illustre un autre mode de réalisation d'un microscope 6 optique, dans lequel l'écran 3 de transmission optique transmet la lumière par réflexion. Ainsi, le faisceau lumineux émis par la source 8 de lumière est réfléchi par un premier miroir 1 la, placé sur le trajet optique 9. Le faisceau réfléchi par le premier miroir 1la est ensuite réfléchi par l'écran 3, disposé sensiblement parallèlement à un 15 axe allant de la source de lumière 8 à l'objet 1. Le faisceau réfléchi par l'écran 3 est ensuite réfléchi par un second miroir 11 b, placé sur l'axe allant de la source de lumière 8 à l'objet 1, de manière à atteindre l'objet 1 à travers l'objectif 10. La figure 5 représente un écran 3 de transmission optique modifiable pouvant 20 être utilisé dans un montage en transmission, par exemple dans un microscope selon la figure 3. L'écran comporte une matrice d'éléments 12 à cristaux liquides, chacun des éléments 12 à cristaux liquides présentant un premier état transparent et un deuxième état opaque dépendant d'une commande appliquée. L'écran 3 est illuminé par des rayons 13 de lumière. Un rayon 13a de lumière 25 arrivant sur un élément 12a dans un état opaque est bloqué par l'écran, tandis qu'un rayon 13b de lumière arrivant sur un élément 12b dans un état transparent est transmis par l'écran. La figure 6 représente un écran 3 de transmission optique modifiable pouvant être utilisé dans un montage en réflexion, par exemple dans un microscope selon la figure 4. L'écran comporte une matrice de miroirs 14, chacun des miroirs 14 présentant une première position permettant de réfléchir la lumière 5 vers l'objet et une deuxième position permettant d'écarter la lumière du trajet 9 optique. Ainsi, sur la figure 6, un rayon 13b de lumière arrivant sur un miroir 14b dans la première position (parallèle au plan de l'écran 3 sur la figure 6) est réfléchi selon un trajet optique lui permettant d'atteindre l'objet 1, tandis qu'un rayon 13a de lumière arrivant sur un miroir 14a dans la deuxième position 10 (inclinée par rapport au plan de l'écran 3 sur la figure 6) est écarté du trajet optique atteignant l'objet 1. De manière générale, la mesure peut être réalisée avec des techniques de mesure de transmission (photométrie d'absorption), de réflexion (photométrie en 15 réflexion) et de fluorescence. Les figures 7 et 8 sont des variantes de réalisation des microscopes des figures 3 et 4, dans lesquelles l'objet 1 est disposé entre l'objectif 10 et l'écran 3 de transmission optique modifiable. Ainsi l'objectif 10 mesure la transmission de la lumière par l'objet 1. Dans le mode de réalisation particulier représenté à la figure 7, l'écran 3 de transmission optique modifiable 20 est disposé directement sur l'objet 1. Certains matériaux comme les cristaux liquides ont des propriétés de polarisation de la lumière. Il est alors possible de programmer la direction de polarisation de l'excitation pour chaque site 2 en fonction des critères de 25 mesure. Dans un mode de réalisation particulier d'un microscope 6, comportant un écran 3 de transmission optique à base de cristaux liquides, les éléments à cristaux liquides présentent au moins un troisième état polarisant. Par exemple, les éléments peuvent présenter deux états polarisants orthogonaux. Ainsi, certains sites 2a (figure 1) peuvent être éclairés avec une première direction de polarisation à travers des zones passantes 4a associées (figure 2) et d'autres sites 2b peuvent être éclairés avec une polarisation orthogonale à la première direction à travers des zones passantes 4b associées (figure 2). Ces mesures polarisées permettent par exemple de différencier des molécules longues des 5 molécules courtes, dans des applications de séquençage de l'ADN ou de détection de mutation. Un microscope 6 selon l'invention permet d'adapter l'éclairage à l'objet 1, dans l'espace et dans le temps, en programmant l'écran 3 de transmission optique. Afin d'éclairer un objet 1 de structure connue, l'éclairage doit être adapté à l'orientation et à la position exacte de l'objet 1 dans le plan objet 7. Pour cela, une première image de l'objet 1, via un écran 3 complètement passant, révèle la structure, la position exacte et l'orientation de l'objet. Par comparaison ou 15 corrélation avec le modèle théorique de la structure connue, la transmission optique de l'écran 3 peut être adaptée automatiquement, par programmation, à la position exacte et à l'orientation de l'objet 1, de manière à ce que l'éclairage corresponde à l'éclairage des sites 2 destinés à être observés. Afin d'éclairer un objet 1 de structure inconnue, une analyse est effectuée sur une première image de l'objet 1, via un écran 3 complètement passant. Ainsi, les zones à observer sont repérées et la transmission optique de l'écran 3 est adaptée à la structure ainsi repérée, de manière à ce que l'éclairage corresponde à l'éclairage des sites 2 destinés à être observés. Ainsi, les zones 25 4 de l'écran prennent automatiquement la forme des sites 2 à observer. L'écran 3 de transmission optique modifiable permet également de changer l'image de l'écran 3 pendant une mesure. Il est ainsi possible de suivre de manière plus fiable une cinétique en s'affranchissant de la photoextinction d'un marqueur. Dans le cas d'un objet 1 structuré en plots contenant des molécules (oligonucléotides, complémentaires d'une séquence donnée, anticorps spécifiques d'un antigène, etc...), des sites 2a et 2b (figure 1) des plots réactionnels ne sont pas éclairés simultanément, mais un premier site 2a est 5 éclairé d'abord et un deuxième site 2b est éclairé ensuite, respectivement par l'intermédiaire de zones 4a et 4b (figure 2) correspondantes de l'écran 3. Par conséquent, chaque mesure ne tient compte que du site éclairé. Ainsi, on limite la photo-extinction et l'information recueillie est spécifique de la cinétique de la réaction qu'on souhaite étudier. Le passage de l'éclairage du premier site 2a au 10 deuxième site 2b peut être fait après un certain nombre de lectures, lorsque l'utilisateur considère que le premier site 2a n'est plus exploitable. Une autre application d'un écran 3 de transmission optique modifiable est l'éclairage de différents sites 2 pendant des durées différentes. Par exemple, un 15 premier site 2a de l'objet 1 (figure 1) peut être éclairé moins longtemps qu'un deuxième site 2b de l'objet 1. Pour ce faire, l'écran 3 est fermé dans la zone 4a correspondante au premier site 2a de l'objet 1 alors que l'écran 3 reste passant dans la zone 4b correspondant au site 2b, de manière à éclairer le deuxième site 2b. L'avantage d'une telle méthode est de permettre une grande dynamique 20 de détection malgré un détecteur saturant. Par exemple, deux sites (2a et 2b) dont les niveaux d'émission sont très différents peuvent être situés sur un objet 1. Le site 2a émet un équivalent de 200 NG (niveau de gris), le site 2b émet l'équivalent de 20000 NG et le détecteur sature à 255NG. Il faut intégrer cent fois moins longtemps le site 2b que le site 2a. Au départ de la mesure, l'écran 3 25 est transparent pour les sites 2a et 2b. Si la mesure pour obtenir un bon signal en provenance du site 2a doit durer 60s, on obture spécifiquement la zone 4b conjuguée au site 2b au bout de 0.6s pour éviter que le détecteur ne sature. Aujourd'hui, la résolution de l'écran peut atteindre 1024x768 pixels élémentaires pour les matrices de cristaux liquides. Des matrices de micro-miroirs, permettant de réfléchir la lumière de façon sélective en fonction d'une commande appliquée, peuvent atteindre une résolution du même ordre. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers représentés cidessus. En particulier, le trajet optique allant de la source de lumière 8 à l'objet 1 peut comporter un miroir semiréfléchissant ou une lame séparatrice de longueur d'onde disposée entre l'écran 3 et l'objet 1. Revendications 1. Microscope optique adapté à l'observation de plusieurs sites (2) d'un objet 5 (1) placé dans un plan objet du microscope, comportant une source de lumière (8), un objectif (10) et un faisceau de lumière issu de la source de lumière, microscope caractérisé en ce qu'il comporte un écran (3) de transmission optique modifiable, comportant des zones (4) présentant chacune un premier état passant et un deuxième état fermé, placé sur le trajet du faisceau optique 10 en amont de l'objet et apte à générer dans le plan (7) objet une image concidant sensiblement avec les sites (2) à observer de l'objet. 2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'écran (3) de transmission optique modifiable comporte une matrice de miroirs (14), chacun 15 des miroirs présentant une première position (14b) permettant de réfléchir le faisceau de lumière vers l'objet (1) et une deuxième position (14a) permettant d'écarter le faisceau de lumière du trajet optique menant à l'objet. 3. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'écran (3) de 20 transmission optique modifiable comporte une matrice d'éléments (12) à cristaux liquides chacun des éléments à cristaux liquides présentant un premier état transparent (1 2b) et un deuxième état opaque (1 2a). 4. Microscope selon la revendication 3, caractérisé en ce que les éléments à 25 cristaux liquides (12) de la matrice d'éléments à cristaux liquides présentent au moins un troisième état polarisant. 5. Microscope selon l'une quelconque des revendications 1, 3 et 4, caractérisé en ce que l'écran (3) de transmission optique modifiable est disposé directement sur l'objet (1). 6. Microscope selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'objet (1) est disposé entre l'objectif (10) et l'écran (3) de transmission optique modifiable.