Brevet FR2847264A1 — publié le 20040521

La présente invention concerne une technique de génie microbien utile pour la production d'aminoacides et plus spécifiquement un ADN codant une protéine LysE mutante, un micro-organisme contenant cet ADN et un procédé de production de L-aminoacides comme la L-lysine ou la L-arginine par fermentation au moyen de ce micro-organisme. Les L-aminoacides comme la L-lysine, l'acide L-glutamique, la L-thréonine, la L-leucine, la L-isoleucine, la L-valine et la L-phénylalanine sont produits industriellement par fermentation au moyen de micro-organismes appartenant par exemple aux genres Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida. Les souches bactériennes isolées à partir de mutants naturels ou artificiels de ces souches bactériennes sont souvent utilisées pour améliorer la productivité de ces micro-organismes. De plus, différentes techniques ont été décrites pour augmenter la production de L-aminoacides à partir de ces souches en augmentant l'activité d'enzymes de biosynthèse de L-aminoacides au moyen de techniques de génie génétique. La production de L-aminoacides a augmenté considérablement par culture de micro-organismes tels que ceux mentionnés ci-dessus et du fait des améliorations correspondantes des procédés de production. Toutefois, pour pouvoir répondre à la demande croissante dans le futur, le développement de procédés permettant une production plus efficace de L-aminoacides à moindre coût est nécessaire. Le méthanol est une matière première de fermentation connue qui est disponible en grande quantité à faible coût. Des procédés pour produire des L-aminoacides par fermentation avec le méthanol sont connus et comprennent des procédés utilisant des micro-organismes qui appartiennent au genre Achromobacter ou Pseudomonas (demande de brevet japonais publiée (Kokoku) No. 45-25273), Protaminobacter (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) No. 49-125590), Protaminobacter ou Methanomonas (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) No. 50-25790), Microcyclus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) No. 52-18886), Methylobacillus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) No. 4-91793), Bacillus (traduction Japonaise de la demande PCT (Kohyo) No. 3-505284 (WO 90/12105). La demanderesse a développé des procédés pour produire des L-aminoacides par culture de bactéries appartenant aux genres Methylophilus et Methylobacillus au moyen de techniques de mutagenèse artificielle et de génie génétique (demande internationale publiée WO 00/61723 ; demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) No. 2001-120269). Au cours des dernières années, on a identifié des protéines qui ont pour fonction de sécréter spécifiquement un L-aminoacide à l'extérieur d'une cellule ou d'un micro-organisme, ainsi que les gènes codant ces protéines. En particulier, Vrljic et al. ont identifié un gène impliqué dans la sécrétion extracellulaire de L-lysine par une bactérie Corynebacterium (Molecular Microbiology 22 :815-826 (1996)). Ce gène a été appelé lysE et il a été décrit que l'aptitude à produire de la L-lysine de bactéries Corynebacterium pouvait être améliorée en augmentant l'expression de ce gène dans les bactéries (demande de brevet international publiée WO 97/23597). On sait aussi que la production de plusieurs types de L-aminoacides peut être améliorée en augmentant les quantités exprimées de protéines sécrétant des aminoacides dans Escherichia coli (demande de brevet japonais mise à la disposition du public No. 2000-189180). Par exemple, il a été décrit que la production de cystine et de cystéine pouvait être améliorée en augmentant l'expression du gène ORF 306 dans Escherichia coli (demande de brevet européen mise à la disposition du public No. 885962). Cependant, l'amélioration de la production de L-aminoacides par amélioration de leur sécrétion par des bactéries assimilant le méthanol pendant la fermentation n'a pas encore été décrite. De plus, un gène de sécrétion d'aminoacides qui peut présenter une activité de sécrétion dans des bactéries assimilant le méthanol n'a pas été décrit. Ainsi, la présente invention a pour but de fournir un procédé pour produire efficacement de la L-lysine ou de la L-arginine avec du méthanol, qui est disponible en abondance et a peu de frais. La présente invention a aussi pour but de fournir un ADN codant un mutant de la protéine LysE, ou une protéine homologue de celle-ci, d'une bactérie coryneforme où le mutant, ou la protéine homologue, confère une résistance à un analogue de la L-lysine à une bactérie assimilant le méthanol dans laquelle il est introduit. La présente invention concerne aussi un tel ADN où le mutant est une protéine définie de la manière suivante : (A) une protéine qui a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO: 2, où au moins le résidu glycine à la position 56 est remplacé par un autre aminoacide, ou (B) une protéine qui a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2 où au moins le résidu glycine à la position 56 est remplacé par un autre résidu d'aminoacide, et un ou plusieurs résidus d'aminoacides à des positions différentes du 56ème résidu sont substitués, délétés, insérés ou ajoutés, et, quand ledit mutant est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol, il lui confère une résistance à un analogue de la L-lysine. La présente invention concerne aussi un tel ADN où ledit ADN est choisi dans le groupe consistant en A) un ADN qui a la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 où une mutation conduit au remplacement d'au moins le 56ème résidu (glycine) de la protéine codée par un autre résidu d'aminoacide, ou B) un ADN qui est hybridable avec la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes, ou une sonde préparée à partir de ladite séquence nucléotidique, ADN ou sonde qui, quand il est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol, lui confère une résistance à un analogue de la L-lysine. La présente invention concerne également un tel ADN où l'autre résidu d'aminoacide est un résidu sérine. La présente invention concerne également ledit ADN où l'analogue de la L-lysine est la S-(2-aminoéthyl)cystéine. La présente invention concerne aussi ledit ADN où la bactérie assimilant le méthanol est une bactérie appartenant au genre Methylophilus ou Methylobacillus. La présente invention concerne aussi une bactérie appartenant au genre Methylophilus ou Methylobacillus dans laquelle l'ADN ci-dessus est introduit sous une forme pouvant être exprimée et qui est capable de produire de la L-lysine ou de la L-arginine. La présente invention concerne également un procédé pour produire de la L-lysine ou de la L-arginine comprenant les étapes de A) culture de la bactérie décrite ci-dessus dans un milieu pour produire et accumuler de la L-lysine ou de la L-arginine dans le milieu, et B) la collecte de la L-lysine ou de la L-arginine à partir de la culture. La présente invention concerne également un tel procédé dans lequel le milieu contient du méthanol comme source de carbone principale. Selon la présente invention, il est possible d'améliorer la productivité de bactéries assimilant le méthanol en ce qui concerne les L-aminoacides, en particulier en ce qui concerne la L-lysine et la L-arginine. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple et dans lequel : la figure 1 représente une carte du plasmide pRStac ayant le promoteur tac et du plasmide pRSIysE qui a été construit par insertion du gène lysE dans le plasmide pRStac. La demanderesse a trouvé initialement que, quand un L-aminoacide, en particulier la L-lysine ou la L-arginine, est produit au moyen de bactéries assimilant le méthanol, en particulier de bactéries appartenant aux genres Methylophilus et Methylobacillus, la sécrétion extracellulaire de ces L-aminoacides ne se produisait pas. Puis, la demanderesse a pu obtenir avec succès des gènes qui présentaient une activité de sécrétion d'aminoacides, en particulier dans ces micro-organismes, et a constaté ainsi qu'il était possible de produire efficacement des aminoacides en utilisant les gènes ainsi obtenus. La demanderesse a introduit le gène lyse déjà connu, qui provient de bactéries Corynebacterium, dans une bactérie assimilant le méthanol, et a examiné son effet sur la production d'aminoacides. Elle a constaté que l'introduction du gène lyse dans une bactérie assimilant le méthanol conduisait à une mutation ou une délétion de sorte que le gène lysE n'était pas fonctionnel. Typiquement, les protéines responsables de la sécrétion doivent être incorporées dans la membrane cellulaire pour être fonctionnelles de sorte que les conditions concernant la protéine et la membrane comme la composition en lipides doivent être compatibles entre elles. On en a conclu qu'il devrait être difficile d'exprimer une protéine membranaire hétérologue, comme LysE, pour que la protéine puisse être fonctionnelle, et cette conclusion était soutenue par le résultat mentionné précédemment. Ainsi, la demanderesse a trouvé un gène mutant qui était fonctionnel dans une bactérie assimilant le méthanol en recherchant le gène de sécrétion de L-aminoacides mentionné ci-dessus. De plus, la demanderesse a constaté un effet marqué lors de l'utilisation de ce gène mutant dans la production d'aminoacides au moyen d'une bactérie assimilant le méthanol. La demanderesse a obtenu avec succès une pluralité de gènes mutants qui sont fonctionnels dans les bactéries assimilant le méthanol. L'ADN de la présente invention code un mutant de la protéine LysE, ou une protéine homologue de la protéine LysE, issue d'une bactérie coryneforme, qui peut présenter une fonction de la protéine LysE quand il est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol. La "fonction de la protéine LysE" signifie au moins l'une des fonctions définies de la manière suivante : (1) une fonction conférant une résistance à un analogue de la L-lysine quand elle est exprimée dans une bactérie assimilant le méthanol lors de l'introduction de l'ADN codant le mutant mentionné ci-dessus. L'expression "conférant une résistance à un analogue de la L-lysine" à la bactérie signifie que lors de l'introduction de l'ADN codant le mutant de LysE dans la bactérie assimilant le méthanol mentionnée précédemment, la bactérie est capable de croître en présence d'une plus grande concentration d'analogue de L-lysine que dans le cas de bactéries qui ne contiennent pas cet ADN, par exemple des souches de type sauvage des bactéries assimilant le méthanol. Par exemple, après culture sur un milieu gélosé contenant un analogue de L-lysine à une certaine concentration pendant une certaine durée, si une souche transformante de la bactérie assimilant le méthanol dans laquelle ledit ADN est introduit forme des colonies, tandis qu'une souche non transformante ne forme pas de colonies, on peut conclure qu'une résistance à l'analogue de la L-lysine a été conférée à ladite souche transformante. L'analogue de la L-lysine peut être par exemple la S-(2-aminoéthyl)cystéine. (2) une fonction d'amélioration de la sécrétion extracellulaire de la L-lysine et/ou de la L-arginine, quand ledit mutant est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol. L'expression "amélioration de la sécrétion extracellulaire de la L-lysine et/ou de la L-arginine" signifie que, quand une bactérie assimilant le méthanol contenant l'ADN selon la présente invention est cultivée, la quantité de L-lysine et/ou de L-arginine sécrétée dans le milieu est augmentée par rapport à la bactérie assimilant le méthanol qui ne contient pas l'ADN de la présente invention. L'amélioration de la sécrétion extracellulaire de L-aminoacides se traduit par une concentration accrue du L-aminoacide accumulé dans le milieu pendant la culture d'une bactérie assimilant le méthanol contenant l'ADN de la présente invention, par rapport à une bactérie assimilant le méthanol qui ne contient pas cet ADN, par suite de l'introduction de l'ADN. De plus, l'amélioration de la sécrétion extracellulaire du L-aminoacide peut aussi être observée quand une plus faible concentration de L-aminoacide intracellulaire est détectée lors de l'introduction de l'ADN de la présente invention dans une bactérie assimilant le méthanol. Selon la présente invention, la bactérie assimilant le méthanol est une bactérie qui peut se développer en utilisant le méthanol comme principale source de carbone, et dans laquelle la fonction de la protéine LysE est exprimée quand l'ADN selon la présente invention est introduit. Une telle bactérie peut être par exemple une bactérie Methylophilus comme une bactérie Methylophilus methylotrophus ou Methylobacillus comme Methylobacillus glycogenes et Methylobacillus f7agellatum. La souche AS1 (NCIMB10515) est un exemple de bactérie Methylophilus methylotrophus. La souche Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume Uni). Les bactéries Methylobacillus glycogenes comprennent, mais sans limitation, la souche T-ll (NCIMB11375), la souche ATCC 21276, la souche ATCC 21371, la souche ATR80 (décrite dans Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)), la souche A513 (décrite dans Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)). La souche Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume Uni). La souche KT est un exemple de bactérie Methylobacillus flagellatum (décrite dans Arch. Microbiol., 149, p. 441-446 (1988)). Un mode de réalisation de l'ADN selon la présente invention est un ADN codant une protéine qui a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2, où au moins le résidu glycine en position 56 est remplacé par un autre résidu d'aminoacide. De plus, un mode de réalisation plus spécifique de l'ADN de la présente invention est un ADN codant une protéine qui a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2 et qui comprend une mutation quelconque parmi les suivantes : (i) remplacement du résidu glycine à la position 56 de SEQ ID NO: 2 par un autre résidu d'aminoacide ; (ii) remplacement du résidu glycine à la position 56 de SEQ ID NO: 2 par un autre résidu d'aminoacide, et remplacement du résidu alanine à la position 55 de SEQ ID NO: 2 par un autre résidu d'aminoacide, (iii) remplacement du résidu glycine à la position 56 de SEQ ID NO: 2 par un autre résidu d'aminoacides, et remplacement du résidu acide aspartique à la position 137 de SEQ ID NO: 2 par un autre résidu d'aminoacide. Le remplacement du résidu glycine par un résidu sérine est un exemple spécifique de remplacement à la 56eme position. Le remplacement du résidu alanine par un résidu thréonine est un exemple spécifique de remplacement à la 55ème position. Le remplacement du résidu acide aspartique par un résidu glycine est un exemple spécifique de remplacement à la 137ème position. Des modes de réalisation plus spécifiques de l'ADN selon la présente invention codant des protéines ayant les remplacements mentionnés précédemment sont les ADN appelés lysL562, lysE564 et lysE565 qui sont décrits ici dans les exemples qui suivent. Il s'agit de mutants de gènes isolés à partir de Brevibacterium lactofermentum sous forme d'homologues du gène lyse décrit pour les bactéries Corynebacterium. De ce fait, l'ADN selon la présente invention est appelé aussi "lysE mutant", et la protéine codée par l'ADN de la présente invention est appelée "LysE mutante". Comme ADN codant la protéine LysE de bactéries coryneformes, la séquence nucléotidique de lysE de type sauvage de Brevibacterium lactofermentum est montrée dans SEQ ID NO: 1 et la séquence d'aminoacides de la protéine codée est montrée dans SEQ ID NO: 2. On a constaté que la glycine à la position 56 depuis l'extrémité amino-terminale est transformée en sérine dans la séquence d'aminoacides de la protéine codée par lysE564, par rapport à la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2 codée par lysE de type sauvage. On a constaté que la glycine à la position 56 depuis l'extrémité amino-terminale est transformée en sérine et que l'acide aspartique à la position 137 est transformé en glycine dans la séquence d'aminoacides de la protéine codée par lysE562, par rapport à la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2 codée par lysEde type sauvage. On a constaté aussi que la glycine à la position 56 depuis l'extrémité amino-terminale est transformée en sérine et que l'alanine à la position 55 est transformée en thréonine dans la séquence d'aminoacides de la protéine codée par lysE565 par rapport à la séquence d'aminoacides codée par lysE de type sauvage. On a constaté que le point de mutation commun était le remplacement de la glycine par la sérine à la position 56. On a déterminé que la modification à cette position était importante, en particulier pour la production d'un support de sécrétion qui a une activité de sécrétion de la L-lysine dans une bactérie assimilant le méthanol. L'ADN de la présente invention peut coder une séquence d'aminoacides incluant une substitution, une délétion, une insertion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides à des positions différentes des positions 55,56 et 137, à condition que la LysE mutante codée comporte l'une des mutations mentionnées précédemment et présente la fonction de la protéine LysE dans une bactérie assimilant le méthanol. Le terme "plusieurs" tel qu'il est utilisé ici varie en fonction des positions des résidus d'aminoacides dans la structure tridimensionnelle de la protéine et des types d'aminoacides. Cependant, il signifie de préférence 2 à 10 résidus d'aminoacides, de préférence encore 2 à 5 et de manière particulièrement préférable 2 à 3 résidus d'aminoacides. Un ADN codant une protéine sensiblement identique à la LysE mutante mentionnée précédemment peut être obtenu en modifiant la séquence nucléotidique du lysE mutant. Par exemple, il est possible d'employer la mutagenèse dirigée si bien qu'il se produit une substitution, une délétion, une insertion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides à un site spécifique. De plus, il est possible aussi d'obtenir un ADN modifié comme décrit ci-dessus grâce à des traitements de mutation connus qui incluent par exemple un procédé de traitement de l'ADN avant le traitement de mutation in vitro avec l'hydroxylamine, par exemple, un procédé de traitement d'un micro-organisme, par exemple d'une bactérie Escherichia, contenant l'ADN avant le traitement de mutation avec des rayons ultraviolets ou un agent mutagène utilisé dans un traitement de mutation courant comme la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG) ou l'acide nitreux. Ces procédés sont décrits par Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., dans "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Il est possible d'obtenir un ADN codant une protéine sensiblement identique à la LysE mutante en exprimant un ADN incluant l'une quelconque des mutations mentionnées précédemment dans une bactérie assimilant le méthanol et en examinant l'activité du produit exprimé. Dans la présente invention, les positions des résidus d'aminoacides ne sont pas nécessairement des positions absolues dans chaque protéine LysE, mais des positions relatives aux positions dans la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2. Par exemple, quand un résidu d'aminoacide est délété du côté de l'extrémité N-terminale de la position 56, dans la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2, le 56ème résidu d'aminoacide devient le 55ème résidu d'aminoacide depuis l'extrémité N-terminale. Dans ce cas, comme le 55eme résidu d'aminoacide depuis l'extrémité N-terminale est un résidu d'aminoacide correspondant au 56ème résidu d'aminoacides dans SEQ ID NO: 2, on l'appellera 56ème résidu d'aminoacide. L'ADN codant la protéine LysE de bactéries coryneformes ou sa protéine homologue, c'est-à-dire le gène lyse ou son gène homologue, peut être obtenu à partir d'un micro-organisme quelconque à condition que le micro-organisme ait des variants de gènes qui peuvent exprimer l'activité de sécrétion de la L-lysine dans une bactérie assimilant le méthanol. Spécifiquement, de tels micro-organismes peuvent être par exemple des bactéries coryneformes comme Corynebacterium glutamicum et Brevibacterium lactofermentum, de bactéries Escherichia comme Escherichia coli, des bactéries Pseudomonas comme Pseudomonas aeruginosa, des bactéries Mycobacterium comme Mycobacterium tuberculosis. Des exemples de gènes homologues de lysE comprennent un ADN codant une protéine qui peut être hybridée à une sonde ayant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 ou une partie de celle-ci dans des conditions stringentes, et qui code une protéine qui présente la fonction de la protéine LysE dans une bactérie assimilant le méthanol par suite de la substitution d'aminoacides mentionnée précédemment. Les conditions stringentes mentionnées précédemment comprennent des conditions dans lesquelles un hybride appelé spécifique est formé, et un hybride non spécifique n'est pas formé. Il est délicat d'exprimer clairement cette condition en utilisant une valeur numérique quelconque. Toutefois, par exemple, les conditions stringentes comprennent des conditions dans lesquelles des ADN ayant une grande homologie, par exemple des ADN ayant une homologie de 80 % ou plus, de préférence de 90 % ou plus, de préférence encore de 95 % ou plus, sont hybridés entre eux, tandis que des ADN ayant une homologie inférieure à l'homologie ci-dessus ne s'hybrident pas entre eux. A titre d'alternative, les conditions stringentes sont illustrées par des conditions dans lesquelles des ADN s'hybrident entre eux à une concentration de sels correspondant à des conditions ordinaires de lavage dans l'hybridation de Southern, c'est-à-dire 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence de 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, à 60 C. Il est possible aussi d'utiliser comme sonde une séquence partielle de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1. Il est possible de produire des sondes par PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides basés sur la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1, et comme matrice un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1. Quand on utilise comme sonde un fragment d'ADN d'environ 300 pb, les conditions de lavage pour l'hybridation peuvent être par exemple 2 x SSC, 0,1 % SDS à 50 C. Pour améliorer l'expression du gène lysE mutant dans une bactérie assimilant le méthanol comme une bactérie Methylophilus ou une bactérie Methylobacillus, il est possible de ligaturer le fragment de gène contenant le gène lysE mutant à un vecteur qui est fonctionnel dans une bactérie assimilant le méthanol, de préférence un vecteur de type à copies multiples, pour préparer un ADN recombiné que l'on utilise ensuite pour transformer un hôte comme une bactérie assimilant le méthanol. A titre d'alternative, il est possible d'incorporer le gène lyse mutant dans un transposon que l'on introduit dans le chromosome. De plus, il est possible de ligaturer en amont du gène lysE mutant un promoteur qui induit une transcription active dans une bactérie assimilant le méthanol. Le document WO 97/23597 décrit lysE et montre seulement le gène lysE de bactéries coryneformes introduit dans une bactérie coryneforme. De plus, ce document mentionne seulement la L-lysine comme aminoacide sécrété, et décrit un système de sécrétion de protéines incluant LysE ayant une structure contenant 6 hélices transmembranaires. Cependant, la demanderesse a confirmé que LysE dérivée de bactéries coryneformes n'est pas fonctionnelle dans des bactéries assimilant le méthanol. De plus, le facteur obtenu est un support de sécrétion de L-lysine qui inclut une mutation par substitution d'un aminoacide à un site spécifique, et il n'est pas possible de déduire un tel facteur d'après les brevets précédents qui concernent lyse La bactérie assimilant le méthanol selon la présente invention est une bactérie assimilant le méthanol dans laquelle l'ADN mentionné précédemment selon la présente invention est introduit sous une forme pouvant être exprimée et qui est capable de produire de la L-lysine ou de la L-arginine. La bactérie assimilant le méthanol selon la présente invention peut être obtenue en introduisant l'ADN de la présente invention dans une bactérie assimilant le méthanol ayant une aptitude à produire de la L-lysine ou de la L-arginine. La bactérie assimilant le méthanol selon la présente invention peut aussi être obtenue en conférant l'aptitude à la production de L-lysine ou de L-arginine à une bactérie assimilant le méthanol dans laquelle l'ADN de la présente invention a été introduit. De plus, la bactérie assimilant le méthanol selon la présente invention peut être une bactérie à laquelle l'aptitude à la production de L-lysine ou de L-arginine a été conférée par introduction de l'ADN de la présente invention sous une forme pouvant être exprimée. Les bactéries Methylophilus et les bactéries Methylobacillus mentionnées précédemment sont des exemples de bactéries assimilant le méthanol. Il est possible d'obtenir une bactérie assimilant le méthanol qui est capable de produire de la L-lysine ou de la L-arginine en conférant une aptitude à la production de L-lysine ou de L-arginine à une souche de type sauvage d'une bactérie assimilant le méthanol. Il est possible d'utiliser des procédés utilisés conventionnellement pour cultiver des bactéries coryneformes ou des bactéries Escherichia pour conférer l'aptitude à la production de L-lysine ou de L-arginine. Par exemple, de tels procédés comprennent, mais sans limitation, l'obtention de souches mutantes auxotrophes, de souches résistantes à un analogue ou de souches mutantes concernant la régulation métabolique, la création de souches recombinées dans lesquelles une enzyme du système de biosynthèse de la L-lysine ou de la L-arginine est activée (voir "Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1ère édition, publié le 30 mai 1986, p. 77 à 100). Il est possible de conférer individuellement des propriétés d'auxotrophie, de résistances à un analogue, de mutation concernant la régulation métabolique, notamment, individuellement ou en combinaison, lors de la culture de bactéries produisant de la L-lysine ou de la L-arginine. L'enzyme du système de biosynthèse peut être activée individuellement ou bien il est possible d'activer deux ou plusieurs enzymes de ce type en combinaison. De plus, il est possible de conférer des propriétés incluant l'auxotrophie, la résistance à un analogue, la mutation concernant la régulation métabolique et de conférer en combinaison la stimulation de l'enzyme du système de biosynthèse. Par exemple, il est possible de cultiver des bactéries produisant de la L-lysine pour qu'elles soient auxotrophes pour la L-homosérine ou pour la L-thréonine et la L-méthionine (demandes de brevet japonais publiées n 48-28078 et 56-6499) ou pour qu'elles soient auxotrophes pour l'inositol ou l'acide acétique (demandes de brevet japonais mises à la disposition du public n 55-9784 et 56-8692), ou pour qu'elles soient résistantes à l'oxalysine, l'hydroxamate de lysine, la S-(2aminoéthyl)cystéine, la méthyllysine, l'a-chlorocaprolactame, le DL-a- amino-e-caprolactame, l'a-aminolauryllactame, un analogue de l'acide aspartique, un médicament de type sulfonamide, un quinoïde ou la Nlauroylleucine. Il est possible de cultiver des bactéries produisant de la L-arginine pour qu'elles soient résistantes à un certain agent, par exemple un médicament de type sulfonamide, la 2-thiazolalanine, l'acide a-amino- -hydroxyvalérique, pour qu'elles soient auxotrophes pour la L-histidine, la L-proline, la L-thréonine, la L-isoleucine, la L-méthionine ou le L-tryptophane en plus de la résistance à la 2-thiazolalanine (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 54-44096), pour qu'elles soient résistantes à l'acide cétomalonique, à l'acide fluoromalonique ou à l'acide monofluoroacétique (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 57-18989), pour qu'elles soient résistantes à l'argininol (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 62-24075), pour qu'elles soient résistantes à la X-guanidine (X représente un dérivé d'acide gras ou une chaîne aliphatique, demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-186995), pour qu'elles soient résistantes au 5-azauracile, au 6-azauracile, au 2-thiouracile, au 5fluorouracile, au 5-bromouracile, à la 5-azacytosine, à la 6-azacytosine, pour qu'elles soient résistantes à l'hydroxamate d'arginine et au 2-thiouracile, pour qu'elles soient résistantes à l'hydroxamate d'arginine et au 6-azauracile (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 57-150381), pour qu'elles soient résistantes à un analogue de l'histidine ou à un analogue du tryptophane (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 52-114092), pour qu'elles soient auxotrophes pour au moins une substance parmi la méthionine, l'histidine, la thréonine, la proline, l'isoleucine, la lysine, l'adénine, la guanine et l'uracile (ou un précurseur de l'uracile) (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 52-99289), pour qu'elles soient résistantes à l'hydroxamate d'arginine (demande de brevet japonais publiée n 51- 6754), pour qu'elles soient auxotrophes pour l'acide succinique ou résistantes à un analogue de base d'acide nucléique (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 58-9692), pour qu'elles soient incapables de métaboliser l'arginine et pour qu'elles soient résistantes à un antagoniste de l'arginine et à la canavanine et qu'elles soient auxotrophes pour la lysine (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 52-8729), pour qu'elles soient résistantes à l'arginine, à l'hydroxamate d'arginine, à l'homoarginine, à la D-arginine et à la canavanine, ou qu'elles soient résistantes à l'hydroxamate d'arginine et au 6-azauracile (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 53-143288), ou pour qu'elles soient résistantes à la canavanine (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 53-3586). Dans la suite, des procédés pour conférer ou améliorer l'aptitude à la production de L-aminoacides par amélioration d'un gène d'une enzyme de biosynthèse de L-aminoacides sont présentés à titre d'exemple. Il est possible de conférer une aptitude à la production de L-lysine par exemple en augmentant les activités de la dihydrodipicolinate synthase et de l'aspartokinase. Il est possible d'améliorer les activités de la dihydrodipicolinate synthase et de l'aspartokinase dans une bactérie assimilant le méthanol en transformant l'hôte constitué par la bactérie assimilant le méthanol avec un ADN recombiné qui a été préparé en ligaturant un fragment de gène codant la dihydrodipicolinate synthase et un fragment de gène codant l'aspartokinase avec un vecteur qui est fonctionnel dans la bactérie assimilant le méthanol, de préférence un vecteur de type à copies multiples. Les activités de la dihydrodipicolinate synthase et de l'aspartokinase sont améliorées par suite de l'augmentation du nombre de copies des gènes codant les enzymes dans la souche transformée. Dans la suite, la dihydrodipicolinate synthase, l'aspartokinase et l'aspartokinase III sont appelées également DDPS, AK et AKIII, respectivement. Un microorganisme quelconque peut fournir les gènes qui codent DDPS et AK à condition que le micro-organisme choisi contienne des gènes qui peuvent exprimer une activité DDPS et une activité AK dans une bactérie assimilant le méthanol. Un tel micro-organisme peut être une souche de type sauvage ou une souche mutante dérivée de la précédente. Spécifiquement, de tels micro-organismes peuvent être par exemple la souche de E coli (Escherichia colt) K-12, la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) et la souche de Methylobacillus glycogenes T-ll (NCIMB11375). Il est possible d'obtenir ces gènes par PCR en utilisant des amorces synthétisées sur la base des séquences nucléotidiques connues de DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) et AKIII (lyse, Cassan, M., Parsot, C. Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261,1052 (1986)) et en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique d'un micro-organisme comme E coli K-12. Des exemples spécifiques comprennent dapA et /ysCprovenant de E coli. De préférence, la DDPS et la AK utilisées dans la présente invention ne sont pas soumises à une rétro-inhibition par la L-lysine. On sait que la DDPS de type sauvage provenant de E coli est soumise à une rétro-inhibition par la L-lysine (voir les brevets US 5 661 012 et 6 040 160) et que la AKIII de type sauvage provenant de E coli est soumise à une suppression et à une rétro-inhibition par la L-lysine. De ce fait, dapA et lysC codent de préférence DDPS et AKIII, respectivement, contenant chacune une mutation qui élimine la rétro-inhibition par la L-lysine lors de l'introduction dans une bactérie assimilant le méthanol. Dans la suite, la DDPS qui contient une mutation qui élimine la rétro-inhibition par la L-lysine peut également être appelée "DDPS mutante" et l'ADN codant la DDPS mutante peut aussi être appelé "dapA mutant" ou "dapA*". La AKIII issue de E. coli qui contient une mutation qui élimine la rétro-inhibition par la L-lysine peut aussi être appelée "AKIII mutante", et l'ADN codant la AKIII mutante peut aussi être appelé "/ysCmutant". Cependant, il n'est pas toujours nécessaire que la DDPS et la AK soient mutées selon la présente invention. On sait que, par exemple, la DDPS dérivée de bactéries Corynebacterium ne subit pas de rétroinhibition par la L-lysine (voir la demande de brevet coréen publiée n 92-8382, et les brevets US n 5 661 012 et 6 040 160). Une séquence nucléotidique de dapA de type sauvage provenant de E. coli est présentée à titre d'exemple dans SEQ ID NO: 3, et la séquence d'aminoacides de la DDPS de type sauvage codée par cette séquence nucléotidique est présentée à titre d'exemple dans SEQ ID NO: 4. L'ADN codant la DDPS mutante qui ne subit pas de rétroinhibition par la L-lysine peut être un ADN codant la DDPS ayant la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 4, incluant le remplacement du résidu histidine à la position 118 de SEQ ID NO: 4 par un résidu tyrosine. De plus, l'ADN codant la AKIII mutante qui ne subit pas de rétro-inhibition par la L-lysine peut être un ADN codant la AKIII ayant une séquence d'aminoacides incluant le remplacement de la thréonine à la position 352 par un résidu isoleucine (pour la séquence de AKIII, voir les brevets US n 5 661 012 et 6 040 160). Le plasmide utilisé pour le clonage de gène peut être un plasmide quelconque à condition qu'il puisse se répliquer dans des microorganismes comme des bactéries Escherichia. Spécifiquement, de tels plasmides comprennent par exemple pBR322, pTWV228, pMW119 et pUC19. Les vecteurs qui sont fonctionnels dans les bactéries Methylophilus comprennent par exemple un plasmide qui peut se répliquer de manière autonome dans des bactéries Methylophilus. Spécifiquement, il peut s'agir de RSF1010 qui est un vecteur à large spectre d'hôtes, et de dérivés de celui-ci, de pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16,161-167 (1986)), et de pMFY42 (Gène, 44,53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287,396, (1980)). En outre, les vecteurs qui sont fonctionnels dans les bactéries Methylobacillus comprennent par exemple un plasmide qui peut se répliquer de manière autonome dans des bactéries Methylobacillus. Il peut s'agir par exemple de RSF1010 qui est un vecteur à large spectre d'hôtes et de dérivés de celui-ci comme pMFY42 (Gène, 44,53, (1990)). Pour préparer un ADN recombiné par ligature de dapA et lysCà un vecteur qui est fonctionnel dans une bactérie assimilant le méthanol, le vecteur est soumis à une digestion avec une enzyme de restriction appropriée pour les extrémités d'un fragment d'ADN contenant dapA et lysC. La ligature est habituellement accomplie au moyen d'une ligase comme l'ADN ligase de T4. Les gènes dapA et lysC peuvent être incorporés dans des vecteurs séparés ou dans le même vecteur. On connaît le plasmide à large gamme d'hôtes RSFD80 (WO 95/16042) que l'on peut utiliser dans la présente invention comme plasmide ayant un dapA mutant codant une DDPS mutante et un lysC mutant codant une AKIII mutante. La souche de E coli JM109 transformée avec ce plasmide a été appelée AJ12396 et a été déposée auprès du National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science and Technology le 28 octobre 1993, et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM P-13936. Par la suite, elle a fait l'objet d'un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 1er novembre 1994 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM BP-4859. RSFD80 peut être obtenu à partir de la souche AJ12396 par un procédé connu. RSFD80 contient un dapA mutant où la séquence nucléotidique de dapA de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 3 est modifiée à la position 623 de C en T. Le résidu histidine à la position 118 de la DDPS de type sauvage de SEQ ID NO: 4, qui est codé par le dapA de type sauvage de SEQ ID NO: 3, est transformé en un résidu tyrosine par suite du changement de nucléotide ci-dessus. De plus, RSFD80 contient un lysC mutant où la séquence nucléotidique de lysC de type sauvage est modifiée à la position 1638 de C en T. Cette mutation conduit à la AKIII mutante, mais la thréonine à la position 352 est transformée en une isoleucine. Il est possible d'utiliser un procédé quelconque pour introduire l'ADN recombiné préparé comme décrit ci-dessus dans une bactérie Methylophilus ou une bactérie Methylobacillus, à condition qu'il conduise à une efficacité de transformation suffisante. Par exemple, il est possible d'utiliser l'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). Il est possible d'accomplir une amélioration de l'expression d'un gène souhaité en introduisant des copies multiples du gène sur l'ADN chromosomique d'une bactérie Methylophilus. Il est possible d'introduire des copies multiples de dapA et lysC dans l'ADN chromosomique d'une bactérie Methylophilus par recombinaison homologue. Ceci peut être réalisé en ciblant une séquence présente sur l'ADN chromosomique en un certain nombre de copies multiples. Il est possible d'utiliser comme séquence présente sur l'ADN chromosomique en un certain nombre de copies multiples un ADN répétitif ou une répétition inversée présente à l'extrémité d'un élément transposable. A titre d'alternative, comme décrit dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-109985, il est possible d'introduire des copies multiples du gène voulu dans l'ADN chromosomique en les incorporant dans un transposon puis en le transférant. Dans ces deux procédés, l'activité des gènes souhaités sera amplifiée par suite du nombre de copies accru des gènes souhaités dans les souches transformées. Outre les procédés d'amplification de gènes ci-dessus, il est possible d'augmenter l'expression du gène souhaité en remplaçant une séquence de contrôle de l'expression, comme les promoteurs de dapA et lyse, par des promoteurs plus forts (voir la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 1-215280). De tels promoteurs forts peuvent être par exemple le promoteur lac, le promoteur trp, le promoteur trc, le promoteur tac, le promoteur PR ou le promoteur PL du phage lambda, le promoteur tet, le promoteur amyE ou le promoteur spac. L'utilisation de ces promoteurs augmente l'expression du gène souhaité, de sorte que l'activité du produit du gène souhaité est amplifiée. Il est possible de combiner de tels procédés d'augmentation de l'expression de gènes avec les procédés d'amplification de gènes décrits ci-dessus (augmentation du nombre de copies du gène souhaité). Il est possible de préparer un ADN recombiné en ligaturant un fragment de gène et un vecteur lorsque le vecteur a été digéré avec une enzyme de restriction correspondant à l'extrémité du fragment de gène. Habituellement, on réalise la ligature avec une ligase comme l'ADN ligase de T4. Il est possible d'utiliser des procédés courants bien connus de l'homme du métier qui comprennent la ligature de l'ADN, la préparation de l'ADN chromosomique, la PCR, la préparation d'ADN plasmidique, la transformation, la conception d'oligonucléotides utilisés comme amorces. De tels procédés sont décrits par Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. dans "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Il est possible d'améliorer non seulement l'expression ou l'activité des gènes de DDPS et AK mais aussi d'autres enzymes impliquées dans la biosynthèse de la L-lysine. De telles enzymes comprennent les enzymes de la voie du diaminopimélate comme la dihydrodipicolinate réductase, la diaminopimélate décarboxylase, la diaminopimélate déshydrogénase (voir WO 96/40934 pour toutes les enzymes précédentes), la phosphoénolpyruvate carboxylase (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 60-87788), l'aspartate aminotransférase (demande de brevet japonais publiée n 6-102028), la diaminopimélate épimérase et l'acide aspartique semialdéhyde déshydrogénase, et les enzymes de la voie de l'aminoadipate comme l'homoaconitate hydratase. L'aspartokinase, l'acide aspartique semialdéhyde déshydrogénase, la dihydrodipicolinate synthase, la dihydrodipicolinate réductase et la diaminopimélate décarboxylase provenant de Methylophilus methylotrophus sont décrites dans WO 00/61 723. De plus, les micro-organismes selon la présente invention peuvent avoir une activité diminuée d'une enzyme qui catalyse une réaction pour produire un composé différent de la L-lysine par une voie constituant une ramification de la voie de biosynthèse de la L-lysine, ou peuvent être déficients en une telle enzyme. L'homosérine déshydrogénase (voir WO 95/23864) est un exemple d'enzymes qui catalysent une réaction pour former un composé autre que la L-lysine par une voie constituant une ramification de la voie de biosynthèse de la Llysine. Il est possible de même d'utiliser pour la L-arginine les techniques mentionnées précédemment pour augmenter les activités d'enzymes impliquées dans la biosynthèse de la L-lysine. Il est possible d'améliorer l'aptitude à la production de L-arginine en augmentant l'activité acétylornithine désacétylase, l'activité acide N-acétylglutamique-g-semialdéhyde déshydrogénase, l'activité N-acétylglutamokinase et l'activité argininosuccinase (voir la demande de brevet japonais publiée n 5-23750). Il est possible aussi d'améliorer l'aptitude à la production de L-arginine en augmentant l'activité de la glutamate déshydrogénase (EP 1 057 893 Al), de l'argininosuccinate synthase (EPO 999 267 Al), de la carbamoylphosphate synthétase (EP 1 026 247 Al) ou de la N-acétylglutamate synthase (voir la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 57-5693) ou en détruisant le gène codant un répresseur de l'arginine (argR). Production de L-lysine ou de L-arginine Il est possible de produire la L-lysine ou la L-arginine en cultivant une bactérie assimilant le méthanol comme une bactérie Methylophilus ou une bactérie Methylobacillus, ayant une aptitude à produire la L-lysine ou la L-arginine. Il est possible d'obtenir la L-lysine ou la L-arginine comme décrit ci-dessus à partir du milieu par production et accumulation, puis de recueillir la L-lysine ou la L-arginine à partir de la culture. Le micro-organisme utilisé dans la présente invention peut être cultivé par un procédé utilisé typiquement dans la culture de micro-organismes assimilant le méthanol. Il est possible d'utiliser un milieu naturel ou un milieu synthétique comme milieu dans la présente invention, à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et d'autres composants organiques à l'état de traces. Si le méthanol est utilisé comme principale source de carbone, la L-lysine ou la L-arginine peut être produite à faible coût. S'il est utilisé comme principale source de carbone, le méthanol est ajouté à un milieu à une concentration de 0,001 à 30 %. Du sulfate d'ammonium, par exemple, est ajouté au milieu comme source d'azote. Il est possible d'ajouter en outre en faibles quantités des composants à l'état de traces comme le phosphate de potassium, le phosphate de sodium, le sulfate de magnésium, le sulfate ferreux et le sulfate de manganèse. Habituellement, la culture est réalisée dans des conditions aérobies par agitation par secousses ou aération tandis que le pH est maintenu entre 5 et 9, et que la température est maintenue entre 20 et 45 C, et la culture est achevée typiquement en 24 à 120 h. Il est possible de recueillir la L-lysine ou la L-arginine à partir de la culture au moyen d'une combinaison d'un procédé faisant intervenir une résine échangeuse d'ions, d'un procédé de précipitation et d'autres procédés connus. La présente invention va être illustrée par les exemples non limitatifs suivants dans lesquels, sauf indication contraire, on a utilisé des réactifs produits par Wako Pure Chemical Industries ou Nakarai Tesque et des milieux dont les compositions sont présentées ci-dessous. Pour tous les milieux, le pH a été ajusté avec NaOH, KOH ou HCI. Milieu LB : Bactotryptone (Difco) 10 g/L Extrait de levure (Difco) 5 g/L NaCI 10 g/L pH 7,0 On a réalisé une stérilisation à la vapeur à 120 C pendant 20 min. Milieu gélosé LB : Milieu LB Bactogélose 15 g/L On a réalisé une stérilisation à la vapeur à 120 C pendant 20 min. Milieu SEII : K2HP04 1,9 g/L NaH2P04 1,56 g/L MgS04-7H20 0,2 g/L (NH4)2SO4 5 g/L CuSO4#5H2O 5 g/L MnS04-5H20 25 g/L ZnS04-7H20 23 ug/L CaCl2#2H2O 72 mg/L FeCl3#6H2O 9,7 mg/L CaC03 (Kanto Kagaku) 30 g/L Méthanol 2 % (v/v) pH 7,0 On a soumis les composants différents du méthanol à une stérilisation à la vapeur à 121 C pendant 15 min et on a ajouté le méthanol après avoir refroidi suffisamment le milieu. Milieu gélosé SEII : K2HP04 1,9 g/L NaH2P04 1,56 g/L MgSO4#7H2O 0,2 g/L (NH4)2SO4 5 g/L CuSO4#5H2O 5 g/L MnS04-5H20 25 g/L ZnSO4#7H2O 23 g/L CaCl2#2H2O 72 mg/L FeCl3#6H2O 9,7 mg/L Méthanol 0,5 % (v/v) pH 7,0 Bactogélose (Difco) 15 g/L On a soumis les composants différents du méthanol à une stérilisation à la valeur à 121 C pendant 15 min, et on a ajouté le méthanol après avoir refroidi suffisamment le milieu. Exemple 1 Construction d'une banque de gène /ysEmutant Tout d'abord, on a cloné le gène lyse, un gène homologue du gène augmentant la sécrétion de L-lysine connu pour les bactéries Corynebacterium, à partir d'une bactérie Brevibacterium, et on a tenté l'expression du gène dans une bactérie Methylophilus. (1) construction de pRSIysE Pour introduire lysE dans une bactérie Methylophilus, on a utilisé le plasmide connu pRS (voir la demande de brevet international en japonais (Kohyo) n 3-501682) pour construire le plasmide pRSIysE pour l'expression de lyse pRS est un plasmide ayant le segment de vecteur du plasmide pVIC40 (demande de brevet international publiée WO 90/04636, demande de brevet international publiée en japonais n 3-501682) et obtenu à partir de pVIC40 par délétion d'une région d'ADN codant l'opéron thréonine contenu dans le plasmide. Le plasmide pVIC40 est dérivé du vecteur plasmidique à large spectre d'hôtes pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986,16, 161-167) qui est un dérivé de RSF1010. Plus précisément, on a construit pRS de la manière suivante. On a digéré le plasmide pVIC40 avec EcoRI, on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a agité pour terminer la réaction. Puis on a centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN d'environ 8 kilopaires de bases (dans la suite kpb) contenant le côté vecteur en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). On a autoligaturé le fragment de région de vecteur du plasmide pVIC40 préparé de la manière décrite ci-dessus en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a appliqué les cellules sur un milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a incubé pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies qui sont apparues sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRS. Puis, on a construit à partir de pRS le plasmide pRStac contenant le promoteur tac selon le schéma de la figure 1. On a construit le plasmide pRStac de la manière suivante. On a digéré le vecteur pRS avec les enzymes de restriction EcoRI et PstI, et on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN de 8 kpb en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). D'autre part, on a amplifié la région du promoteur tac par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pKK223-3 (vecteur d'expression, Pharmacia) et les amorces montrées dans SEQ ID NOS : et 8 (on a réalisé 30 fois un cycle consistant en une dénaturation à 94 C pendant 20 s, une hybridation à 55 C pendant 30 s et une réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé pour la PCR l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo). On a purifié le fragment d'ADN contenant le promoteur tac amplifié en utilisant PCR prep (Promega) puis on l'a digéré au niveau des sites d'enzymes de restriction conçus préalablement dans les amorces, c'est-à-dire au niveau des sites EcoRI et EcoT22I. Puis, on a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN d'environ 0,15 kpb en utilisant EASY TRAP Ver. 2. On a ligaturé les produits de digestion du vecteur pRS et le fragment de région de promoteur tac préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a incubé pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRStac. On a choisi comme pRStac un plasmide dans lequel les directions de transcription du gène de résistance à la streptomycine sur le vecteur pRS et du promoteur tac étaient identiques entre elles. On a digéré pRStac obtenu comme décrit ci-dessus avec Sse8387I (Takara Shuzo) et SapI (New England Biolabs), on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 9,0 kpb. On a amplifié aussi par PCR le fragment de gène lyse en utilisant comme matrice le chromosome extrait de la souche de Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC13869) et les amorces montrées dans SEQ ID NOS : et 10 (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 90 s). On a utilisé pour la PCR l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo). A ce stade, pour que l'expression du gène lysE soit possible dans une bactérie Methylophilus, on a conçu les amorces de manière que les nucléotides situés à 9-15 pb du codon d'initiation de la traduction du gène lyse soient remplacés par une séquence dont on sait qu'elle est fonctionnelle dans une bactérie Methylophilus (Wyborn, N. R., Mills, J., Williamis, S. G. et Jones, C. W., Eur. J. Biochem., 240,314-322 (1996)). On a purifié le fragment obtenu avec PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec Sse8387I et SapI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a recueillis encore à partir d'un gel d'agarose à 0,8 %. On a ligaturé les produits de digestion du vecteur pRStac et du fragment de région de gène lyse préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et en déterminant la séquence nucléotidique pour obtenir pRSIysE (figure 1). Dans pRSIysE, le gène lysE était positionné de telle manière que sa direction de transcription était la même que celle du promoteur tac. (2) Introduction de pRSIysE dans une bactérie Methylophilus On a introduit pRSIysE obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). De plus, on a introduit aussi pRS dans la souche AS1 à titre de témoin, de la même manière que pour pRSIysE. On a ainsi obtenu plusieurs milliers de colonies par g d'ADN en utilisant pRS comme témoin, tandis que l'on a obtenu seulement quelques colonies avec pRSIysE. Quand on a extrait les plasmides à partir de souches transformantes considérées comme contenant pRSIysE et quand on a examiné leurs séquences nucléotidiques, on a constaté l'introduction d'une mutation spontanée dans une région codant lysE pour tous les plasmides examinés, et dans certains cas, il y avait introduction d'une mutation nonsens par laquelle un codon codant un aminoacide était remplacé par un codon d'arrêt qui terminait la traduction. De plus, dans l'autre plasmide, on a observé la délétion du gène lyse On a considéré que la fonction de lysE porté par de tels plasmides devait être perdue. Comme décrit ci-dessus, la fréquence d'introduction de pRSIysE portant le gène lyse de longueur intégrale dans Methylophilus methylotrophus était extrêmement faible, et seuls des plasmides ayant un gène lysE mutant contenant une mutation qui éliminait sa fonction ont pu être introduits. En prenant en compte ces faits en combinaison, on a estimé que l'introduction du gène lysE dans Methylophilus methylotrophus avait un effet létal. Ceci indique que le gène lyse ne peut pas fonctionner de manière universelle pour la sécrétion de la L-lysine dans des bactéries hétérogènes. On a appliqué la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant pRSIysE comportant une mutation à une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine et on a cultivé pendant une nuit à 37 C. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur environ 10 cm2de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine, et on a cultivé à 37 C pendant 34 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation et on a déterminé la concentration de L-lysine dans le surnageant de la culture au moyen d'un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à grande vitesse Nihon Bunko). A titre de résultat, on n'a obtenu sensiblement aucune souche dans laquelle la sécrétion de la L-lysine était augmentée malgré l'introduction du gène lysE mutant. Comme décrit ci-dessus, l'introduction du gène lysE déjà connu, issu de bactéries Corynebacterium, dans des bactéries assimilant le méthanol conduit à un effet létal. Dans les souches ayant un gène lysE introduit seulement en petit nombre, le gène lysE introduit subit une mutation ou une déficience, de sorte qu'il n'est pas fonctionnel. Comme les protéines responsables de la sécrétion d'aminoacides ne sont fonctionnelles que quand elles sont incorporées dans la membrane cellulaire, les conditions concernant les protéines et la membrane, comme la composition en lipides, doivent être mutuellement compatibles. De ce fait, on a considéré qu'il était difficile d'exprimer une protéine membranaire issue d'un organisme hétérologue de manière que sa fonction soit maintenue. Ainsi, on a estimé que si l'on utilisait un procédé d'introduction de mutations artificielles permettant d'introduire positivement un plus grand nombre de mutations que les mutations naturelles, il serait possible d'obtenir avec succès à partir de tels mutants un gène lysE mutant capable de sécréter la L-lysine. Sur la base de ce concept, on a construit une banque de /ysEmutant en utilisant un procédé d'introduction de mutations utilisant l'hydroxylamine. De plus, la demanderesse a considéré que si l'on introduisait dans une bactérie assimilant le méthanol un gène lysE mutant présentant une activité de sécrétion de la L-lysine dans une bactérie assimilant le méthanol, il serait possible d'augmenter le degré de résistance à l'AEC (S-(2-aminoéthyl)cystéine), un analogue de la L-lysine. Sur la base de ce concept, on a développé un système de criblage décrit dans la suite. Tout d'abord, on va décrire en détail la construction de la banque de lysE mutant. (3) Traitement de mutation du plasmide pRSIysE On a inoculé la souche E coli JM109 contenant le plasmide pRSIysE portant lysE de type sauvage (disponible auprès de Takara Shuzo) à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h en agitant. On a extrait chaque ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS. Puis, on a introduit une mutation dans le plasmide pRSIysE préparé par un procédé de mutation in vitro utilisant l'hydroxylamine, c'est-à-dire que l'on a préparé et incubé à 75 C pendant 2 h ou 3 h une solution contenant 250 mM de tampon phosphate de potassium ajusté à pH 6,0, une solution d'hydroxylamine 400 mM ajustée à pH 6,0, dans chaque cas à titre de concentration finale, et 2 g de plasmide pRSIysE que l'on a ajusté à 200 l avec de l'eau. Puis, on a recueilli le plasmide pRSIysE à partir de cette solution en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). On a mélangé les plasmides qui ont réagi avec l'hydroxylamine pendant 2 h et les plasmides qui ont réagi avec l'hydroxylamine pendant 3 h pour obtenir un agrégat de plasmides pRSIysE dans lesquels des mutations ont été introduites à différents taux. On a amplifié l'agrégat de plasmides pRSIysE mutants obtenus comme décrit ci-dessus, dans lesquels on a considéré que des mutations avaient été introduites à différentes positions, et on a transformé Escherichia coli (cellules compétentes de E, coli JM109, Takara Shuzo) avec cet agrégat de plasmides, on a appliqué ces cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a incubé pendant une nuit à 37 C pour construire une banque dans Escherichia coli. On a séparé par grattage toutes les colonies qui apparaissaient sur le milieu gélosé, on les a inoculés à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on l'a utilisé comme banque de plasmides pRSIysE mutants. Introduction du plasmide pRSIysE mutant dans une bactérie Methylophilus et production de L-aminoacides (1) Criblage de la banque de lysE contenant une mutation artificielle pour lysE de type fonctionnel On a introduit la banque de plasmides pRSIysE mutants obtenue comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). Comme témoin, on a introduit pRSIysE de type sauvage dans la souche AS1. A titre de résultat, avec pRSIysE utilisé comme témoin, le résultat de l'examen précédent a été reproduit, et on a obtenu seulement quelques colonies par g d'ADN. D'autre part, avec la banque de plasmides pRSIysE mutants, on a pu obtenir plusieurs centaines à plusieurs milliers de colonies. Les examens ont montré jusqu'à présent que, dans sensiblement toutes les colonies qui apparaissaient quand on introduit pRSIysE de type sauvage, lyse perdait sa fonction du fait de l'introduction d'une mutation naturelle. C'est-à-dire que la fréquence d'introduction de pRSIysE contenant le gène lyse de longueur intégrale dans Methylophilus methylotrophus était extrêmement basse, et qu'il était possible d'introduire seulement des plasmides ayant un gène lysE mutant contenant une mutation qui éliminait sa fonction. En considérant ces faits en combinaison, on a estimé que l'introduction du gène lysE dans Methylophilus methylotrophus devrait conduire à un effet létal. D'autre part, comme des colonies en bien plus grand nombre que ci-dessus apparaissaient quand on a introduit la banque de plasmides pRSIysE mutants, on a obtenu l'introduction d'une mutation par le traitement avec l'hydroxylamine avec un grand rendement. Comme décrit ci-dessus, on a pu obtenir la banque de lysE mutant sous forme d'une banque de plasmides pRSIysE mutants. Puis, on a développé un système de criblage pour obtenir lysE de type fonctionnel, qui exprime une activité de sécrétion extracellulaire de la L-lysine. On a dilué de manière appropriée la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant la banque de plasmides pRSIysE mutants obtenue comme décrit ci-dessus de manière que plusieurs centaines de colonies apparaissent par boîte, on a appliqué sur du milieu gélosé SEII contenant 50 mg/L de streptomycine et 3 g/L de L-thréonine et on a incubé à 37 C pendant 48 h. On a formé des répliques des colonies apparues sur du milieu gélosé SEII contenant 3 g/L de L-thréonine et 0,5, 7 ou 10 g/L de AEC. Quand on a formé des répliques des colonies sur une boîte qui ne contenait pas de AEC, les nombres de colonies qui apparaissaient sur la boîte initiale et sur la boîte répliquée après la formation de réplique étaient identiques. Cependant, quand on a formé des répliques des colonies sur la boîte contenant AEC, le nombre de colonies qui sont apparues sur la boîte répliquée diminuait notablement par rapport à la boîte initiale. On a transféré les colonies formées sur la boîte répliquée contenant AEC à chaque concentration sur un nouveau milieu gélosé SEII contenant AEC et on les a cultivées, et on a confirmé l'acquisition d'une résistance à AEC sur la base de l'observation qu'une seule colonie a pu être formée sur le même milieu. A partir de telles souches, on a sélectionné au hasard 100 souches et on les a soumises à un criblage supplémentaire. (2) Production de L-aminoacides par une souche dans laquelle le plasmide pRSIysE mutant a été introduit Parmi les souches de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant pRSIysE mutant dont on estimait qu'il contenait une mutation et qu'il conférait à un hôte une résistance à AEC, on a appliqué 100 souches à une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine et on a cultivé pendant une nuit à 37 C. Puis, on a retiré par grattage les cellules sur environ 10 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à un milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 48 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation, et on a isolé les L-aminoacides contenus dans le surnageant de culture par chromatographie en couche mince et on les a quantifiés grossièrement par un procédé utilisant la détection avec la ninhydrine. A titre de résultat, on a constaté que la L-lysine et la L-arginine étaient sécrétées à l'extérieur des cellules à différentes concentrations. On a classé grossièrement ces 100 souches en 5 groupes sur la base de leurs configurations. On a choisi une souche typique parmi chacun des 5 groupes, et on a appelé pRSIysE561, pRSIysE562, pRSIysE563, pRSIysE564 et pRSIysE565 les plasmides contenus dans ces souches. On a purifié ces plasmides et on a analysé les séquences nucléotidiques de leurs régions lyse. A titre de résultat, on a constaté que pRSIysE562 et pRSIysE563, et pRSIysE561 et pRSIysE564 avaient des séquences totalement identiques. De ce fait, on a examiné ensuite pRSlys562, pRSIysE564 et pRSIysE565. On a analysé les séquences nucléotidiques des régions codant la protéine LysE dans pRSIysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565. A titre de résultat, on a constaté que lysE564 incluait une substitution à la 166ème position de G (guanine) par A (adénine) dans la séquence d'ADN de lyse de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 1. A titre de résultat, Gly (glycine) a été remplacée par Ser (sérine) à la 56ème position de la séquence d'aminoacides de lysE de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 2. On a constaté aussi que lysE562 incluait des substitutions de G (guanine) par A (adénine) à la 166ème position, de G (guanine) par A (adénine) à la 410ème position de la séquence d'ADN de lyse de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 1. A titre de résultat, Gly (glycine) a été remplacée par Ser (sérine) à la 56eme position et Asp (acide aspartique) a été remplacé par Gly (glycine) à la 137ème position de la séquence d'aminoacides de lysE de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 2. On a constaté en outre que lysE565 incluait des remplacements de G (guanine) par A (adénine) à la 166eme position et de G (guanine) par A (adénine) à la 163ème position de la séquence d'ADN de lysE de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 1. Par suite, Gly (glycine) a été remplacée par Ser (sérine) à la 56ème position et Ala (alanine) a été remplacée par Thr (thréonine) à la 55ème position de la séquence d'acides aminés de lysE de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 2. Quand on a introduit de nouveau pRSlysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565 dans les souches AS1, on a pu introduire ces plasmides sensiblement à la même fréquence que pRS. On a cultivé les souches dans lesquelles les plasmides ont été introduits par le même procédé que celui décrit ci-dessus, et on a quantifié les concentrations de L-lysine et de L-arginine dans les surnageants de culture en utilisant un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à haute performance, Nihon Bunko). Les résultats des mesures sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Souche bactérienne Quantité de L-lysine Quantité de L-arginine produite (g/L) produite (g/L) ASl/pRS 0,01 0,010 AS1/pRSlyseE562 0,19 0,210 AS1/pRSlysE564 0,20 0,240 AS1/pRSlysE565 0,13 0,150 D'après les résultats précédents, on a constaté que pRSIysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565 avaient une activité pour augmenter sensiblement la sécrétion de L-lysine et de L-arginine. De plus, même quand on a réintroduit pRSIysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565 dans les souches AS1, l'activité d'augmentation de la sécrétion de L-lysine et de L-arginine était maintenue. Ainsi, on a démontré que la mutation de la souche ayant acquis une résistance à AEC n'était pas introduite dans l'hôte mais dans le plasmide. La mutation commune introduite dans pRSIysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565 consistait en un remplacement de Gly (glycine) par Ser (sérine) à la 56ème position de la séquence d'aminoacides de lysE de type sauvage montrée dans SEQ ID NO: 2. On a appelé AJ110086 la souche de E, coli JM109 transformée avec pRSIysE564 ayant seulement cette mutation commune. On a déposé cette souche auprès du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology le 26 septembre 2002 à titre de dépôt international conformément au traité de Budapest et cette souche s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM BP-8196. On peut obtenir aisément les gènes lysE562 et lysE565 à partir de lysE564 par des procédés bien connus de l'homme du métier. Spécifiquement, on peut obtenir le gène lysE562 en incorporant un fragment de la région codant lysE564 obtenu à partir de pRSIysE564, par exemple dans pSELECTIM-1, un vecteur pour l'introduction de mutations par mutagenèse dirigée produit par Promega, et en introduisant une mutation par mutagenèse dirigée avec Altered SitesTM, une trousse d'introduction de mutations par mutagenèse dirigée produite par Promega, pour remplacer A (adénine) par G (guanine) à la 410eme position dans SEQ ID NO: 1. Dans le processus ci-dessus, par exemple, il est possible d'utiliser l'oligonucléotide synthétique de SEQ ID NO: 5 comme amorce. Le 20ème nucléotide de SEQ ID NO: 5 est soumis à une substitution de nucléotides dans le gène lysE de type sauvage. De manière similaire, il est possible d'obtenir le gène lysE565 en remplaçant G (guanine) par A (adénine) à la 166ème position dans SEQ ID NO: 1. Pour l'introduction d'une mutation, il est possible par exemple d'utiliser l'oligonucléotide synthétique de SEQ ID NO: 6. Les 16ème et l9ème nucléotides de SEQ ID NO: 6 sont soumis à une substitution de nucléotides dans le gène lysE de type sauvage. Exemple 2 : introduction d'un gène d'enzyme de biosynthèse de la L-lysine et du gène lysE562, lysE564 ou lysE565 dans Methylophilus methylotrophus Comme on a constaté que la sécrétion extracellulaire de L-lysine était augmentée du fait de l'introduction du gène lysE562, lysE564 ou lysE565, on a augmenté la biosynthèse de L-lysine dans une souche dans laquelle le gène lysE562, lysE564 ou IysL65 avait été introduit pour tenter d'améliorer encore le rendement. (1) Construction du plasmide pRSdapA contenant le gène dapA* On a préparé un plasmide ayant un gène codant la dihydrodipicolinate synthase qui ne subissait pas de rétro-inhibition par la L-lysine (dapA*) à titre de gène d'enzyme du système de biosynthèse de la L-lysine. On a digéré avec Sse8387I et XbaI pRStac préparé dans l'exemple 1 et on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme, et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 9 kpb. On a amplifié le fragment de gène dapA* par PCR en utilisant comme matrice le plasmide connu RSFD80 (voir W090/16042) contenant ce gène et les amorces montrées dans SEQ ID NOS : et 12 (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé pour la PCR l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo). On a purifié le fragment de dapA* résultant avec PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec les enzymes de restriction Sse83871 et XbaI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 0,1 kpb. On a ligaturé les produits de digestion du vecteur pRStac et le fragment de région de gène dapA* préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture au moyen du procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction, et on a déterminé la séquence nucléotidique pour obtenir le plasmide pRSdapA. Dans le plasmide pRSdapA, le gène dapA* était positionné de telle manière que sa direction de transcription était la même que celle du promoteur tac. (2) Construction d'un plasmide contenant le gène dapA* et l'un quelconque des gènes lysE562, lysE564 et lysE565 Pour évaluer l'effet de la combinaison de l'un quelconque des gènes lysE:562, lysE:564 et IysE565 avec dapA*, on a construit les plasmides pRSIysE562, pRSIysE564 et pRSIysE565 en insérant le gène dapA*. On a digéré pRSIysE562, lysE564 et lysE565 préparés dans l'exemple 1 avec l'enzyme de restriction SapI et on les a munis d'extrémités franches en utilisant la trousse DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). De plus, on a digéré le plasmide pRSdapA avec les enzymes de restriction EcoRI et SapI, et on a séparé un fragment d'environ 1 kpb ayant le promoteur tac et la région dapA* sur un gel d'agarose à 0,8 %, et on l'a recueilli en utilisant EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). On a muni ce fragment d'extrémités franches comme décrit ci-dessus et on l'a ligaturé à chacun des produits de digestion de pRSIysE562, lysE564 et lysE565 mentionnés ci-dessus en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a transformé Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo) avec chacune des solutions de réaction de ligature mentionnées précédemment, on a appliqué sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a incubé à 37 C pendant une nuit. On a inoculé les colonies qui sont apparues sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture au moyen du procédé alcali-SDS, et on a confirmé sa structure par digestion avec des enzymes de restriction et par détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir les plasmides pRSIysE562dapA, pRSIysE564dapA et pRSIysE565dapA. Dans ces plasmides, les gènes étaient positionnés de telle manière que les directions de transcription de lysE562, lysE564 et lysE565 étaient opposées à celle de dapA*. Quand on a introduit chacun des plasmides pRSIysE562dapA, pRSIysE564dapA et pRSIysE565dapA obtenus par le procédé mentionné précédemment dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation, on a obtenu des souches transformantes avec pRSIysE562dapA et pRSIysE564dapA, tandis que l'on n'a obtenu aucune souche transformante avec pRSIysE565dapA. Ceci peut être dû au fait que la stabilité du plasmide diminuait dans la souche AS1. (3) Préparation de L-lysine au moyen de bactéries Methylophilus contenant lysE562 ou lysE564 et dapA* On a appliqué chacune des souches AS1 dans lesquelles pRSIysE562dapA ou pRSIysE564dapA obtenu comme décrit ci-dessus ou pRSIysEdapA à titre de témoin avait été introduit sur une boîte de SEII contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé pendant une nuit à 37 C, et on a prélevé par grattage les cellules sur 0,3 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 34 h en agitant. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation et on a quantifié la concentration de L-lysine contenue dans le surnageant de culture au moyen d'un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à haute performance, Nihon Bunko). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Les souches dans lesquelles pRSIysE562dapA ou pRSIysE564dapA avait été introduit présentaient une accumulation de L-lysine améliorée. L'accumulation de L-lysine dans les milieux était nettement améliorée par rapport à celle obtenue uniquement avec pRSIysE562 ou pRSIysE564. Ainsi, on peut voir que la limitation du taux de sécrétion était éliminée, et que l'effet d'amélioration du gène dapA* était manifesté de manière synergique. Tableau 2 Souche bactérienne Quantité de L-lysine produite (g/L) AS1/pRS 0,10 AS1/pRSlysE562dapA 1,42 AS1/pRSlysE564dapA 1,40 Exemple 3 : introduction du gène /ys564 dans Methylobacillus glycogenes et production de L-aminoacides (1) Préparation de pRS-lysE564-Tc On a décidé de confirmer le fait que lysE562, lysE564 et lysE565, qui contiennent /ysEmutant, sont fonctionnels dans des bactéries Methylobacillus. Dans ce but, on a choisi lysE564, et on a modifié le plasmide pRSIysE564, un plasmide pour l'expression de lysE564. Le plasmide pRSIysE564 contient un gène de résistance à la streptomycine. Cependant, comme Methylobacillus glycogenes est résistant initialement à la streptomycine, il n'est pas possible de cribler le plasmide pRSIysE. De ce fait, on a construit un plasmide modifié en insérant un gène de résistance à la tétracycline dans le plasmide pRSIysE qui a pu être utilisé dans Methylobacillus glycogenes. Tout d'abord, on a construit pRS-lysE564-Tc contenant le gène de résistance à la tétracycline à partir de pRSIysE564. On a digéré le plasmide pRS-lysE564 avec l'enzyme de restriction EcoRI et on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme, et on a mélangé pour terminer la réaction. On a centrifugé le mélange réactionnel, et on a recueilli la couche supérieure. On a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on a muni leurs extrémités digérées d'extrémités franches en utilisant la trousse DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). On a séparé les fragments d'ADN sur un gel d'agarose à 0,8 %, et on a recueilli un fragment d'ADN d'environ 9 kpb en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). De plus, on a amplifié la région du gène de résistance à la tétracycline par PCR en utilisant le plasmide pRK310 (Pansegrau et al., J. Mol. Biol. 239,623-663 (1994)) comme matrice et les amorces montrées dans SEQ ID NOS : et 14 (on a réalisé 30 fois un cycle consistant en une dénaturation à 94 C pendant 20 s, une hybridation à 55 C pendant 30 s et une réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo) pour la PCR. On a purifié le fragment d'ADN amplifié contenant la région du gène de résistance à la tétracycline en utilisant PCR prep (Promega), puis on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, on les a munis d'extrémités franches et on les a phosphorylés en utilisant la trousse Takara BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit, Takara Shuzo), on les a ajoutés à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN de 1,5 kpb en utilisant EASY TRAP Ver. 2. On peut aussi obtenir le gel de résistance à la tétracycline par un procédé de PCR similaire à celui décrit ci-dessus, en utilisant un autre plasmide, par exemple le plasmide pRK2, comme matrice, à la place de pRK310. On a ligaturé le fragment de vecteur pRSIysE564 préparé comme décrit ci-dessus et le fragment d'ADN contenant le gène de résistance à la tétracycline en utilisant la trousse DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a transformé Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Takara Shuzo) avec cette solution de réaction de ligature, on les a appliqués sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et 15 mg/L de tétracycline et on a cultivé pendant une nuit à 37 C. On a inoculé les colonies qui sont apparues sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et 15 mg/L de tétracycline et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture au moyen du procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRS-lysE564-Tc. (2) Introduction de pRS-lysE564-Tc dans une bactérie Methylobacillus et production de L-aminoacides On a introduit pRS-lysE564-Tc obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB11375 par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). A titre de témoin, on a introduit de même pRK310 dans la souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB11375. A titre de résultat, on a obtenu des colonies contenant pRS-lysE564-Tc sensiblement à la même fréquence que celle obtenue avec le témoin pRK310. On a construit pRSIysET en insérant une région du gène de résistance à la tétracycline dans le plasmide pRSIysE contenant lysE de type sauvage de la même manière que pour pRS-lysE564-Tc, et on a tenté de l'introduire dans la souche Methylobacillus glycogenes de la même manière. Cependant, on n'a obtenu aucune souche le contenant. Il s'agit du même phénomène que celui observé dans le cas de la souche de Methylophilus methylotrophus AS1, et on a estimé que lyse de type sauvage n'était pas fonctionnel non plus dans les bactéries Methylobacillus. On a appliqué la souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB11375 contenant pRS-lysE564-Tc sur une boîte de SEII contenant 10 mg/L de tétracycline et on a cultivé pendant une nuit à 30 C. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur environ 10 cm2 de la surface du milieu et on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 10 mg/L de tétracycline et on a cultivé à 30 C pendant 60 h en agitant. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation, et on a quantifié la concentration de L-lysine contenue dans le surnageant de culture au moyen d'un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à haute performance, Nihon Bunko). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Souche bactérienne Quantité de L-lysine produite (g/L) NCIMB11375/pRK310 0,10 NCIMB11375/pRS-lysE564-Tc 1,40 (3) Construction de pRS-lysE564-dapA-Tc On a constaté que la L-lysine s'accumulait dans un milieu du fait de l'introduction du gène lysE564 dans la souche de Methylobacillus glycogenes. On a considéré que ceci était dû à une augmentation de la sécrétion de L-lysine. Ainsi, on a examiné de la même manière que dans l'exemple 2 l'effet d'augmentation de l'expression d'un gène de biosynthèse de la Llysine et du gène lysE564 en combinaison dans Methylobacillus glycogenes. On a construit un plasmide en incorporant un gène de résistance à la tétracycline dans le plasmide pRSIysE564dapA préparé dans l'exemple 2 (2) par le même procédé que dans l'exemple 3 (1). On a appelé le plasmide obtenu pRS-lysE564-dapA-Tc. (4) Introduction du plasmide pRS-lysE564-dapA-Tc dans Methylobacillus glycogenes et production de L-aminoacides On a introduit pRS-lysE564-dapA-Tc obtenu de la manière décrite ci-dessus dans la souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB11375 par électroporation. On a examiné la concentration de L-aminoacides dans les surnageants des bouillons de culture pour la souche transformante obtenue (appelée également "NCIMB11375/pRSlysE564-dapA-Tc"), la souche de Methylobacillus glycogenes mentionnée ci-dessus, dans laquelle pRS-lysE564-Tc a été introduit (appelée également "NCIMB1 1375/pRS-lysE564-Tc") et la souche de Methylobacillus glycogenes dans laquelle le plasmide pRK310 a été introduit à titre de témoin (appelée également "NCIMB11375/pRK310"). On a cultivé chaque souche transformante sur une boîte de SEII contenant 10 mg/L de tétracycline pendant 2 jours à 30 C. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur 10 cm2 de la surface du milieu et on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 10 mg/L de tétracycline et on les a cultivées à 30 C pendant 60 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules d'une partie du bouillon de culture par centrifugation, et on a quantifié les concentrations de L-aminoacides contenues dans le surnageant de culture en utilisant un analyseur d'aminoacides. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Une quantité marquée de L-lysine s'est accumulée dans le milieu contenant la souche NCIMB11375/pRS-lysES64-dapA-Tc. L'accumulation de L-lysine dans le milieu contenant la souche NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc était améliorée par rapport au cas où seul pRSIysE564T avait été introduit. On considère que la limitation du taux de sécrétion était éliminée du fait de l'introduction du gène lysE564, et que l'effet de stimulation du gène dapA* était manifesté de manière synergique. Tableau 4 Souche bactérienne Concentration de L-lysine dans le surnageant de culture (g/L) NCIMB11375/pRK310 0,20 NCIMB11375/pRSIysE564T 1,40 NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc 1,62 Légende de la liste de séquences annexée : SEQ ID NO: 1 : séquence nucléotidique de lysE de type sauvage SEQ ID NO: 2 : séquence d'aminoacides de LysE de type sauvage SEQ ID NO: 3 : séquence nucléotidique de dapA de type sauvage SEQ ID NO: 4 : séquence d'aminoacides de DDPS de type sauvage SEQ ID NOS : et 6 : pour mutation par mutagenèse spécifique de lysE562 SEQ ID NOS : et 8 : pour amplification du promoteur tac SEQ ID NOS : et 10 : pour le clonage de lyse SEQ ID NOS: 11 et 12 : amorces pour le clonage de dapA* SEQ ID NOS : et 14 : amorces pour l'amplification de la région du gène de résistance de la tétracycline REVENDICATIONS 1. ADN codant un mutant de la protéine LysE d'une bactérie coryneforme, ou une protéine homologue de celle-ci, caractérisé en ce que ledit mutant est une protéine choisie dans le groupe consistant en : A) une protéine qui a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2, où au moins le résidu glycine à la position 56 est remplacé par un autre résidu d'aminoacide, et B) une protéine qui a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 2 où au moins le résidu glycine à la position 56 est remplacé par un autre résidu d'aminoacide, et un ou plusieurs résidus d'aminoacides à des positions différentes du 56ème résidu sont substitués, délétés, insérés ou ajoutés, et quand ledit mutant est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol, ledit mutant confère une résistance à un analogue de la L-lysine. 2. ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est choisi dans le groupe consistant en A) un ADN qui a la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 où une mutation conduit au remplacement d'au moins le 56eme résidu glycine de la protéine codée par un autre résidu d'aminoacide ; B) un ADN qui est hybridable à la séquence nucléotidique de SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes, ou une sonde préparée à partir de ladite séquence nucléotidique, et quand ledit ADN ou ladite sonde est introduit dans une bactérie assimilant le méthanol, ledit ADN ou ladite sonde code une protéine qui confère une résistance à un analogue de la L-lysine. 3. ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit autre résidu d'aminoacide est un résidu lysine. 4. ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit analogue de la L-lysine est la S-(2aminoéthyl)cystéine. 5. ADN selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite bactérie assimilant le méthanol est une bactérie appartenant au genre Methylophilusou Methylobacillus. 6. Bactérie appartenant au genre Methylophilus ou Methylobacillus caractérisée en ce que l'ADN selon la revendication 1 a été introduit dans cette bactérie sous une forme pouvant être exprimée et en ce qu'elle est capable de produire de la L-lysine ou de la L-arginine. 7. Procédé pour produire de la L-lysine ou de la L-arginine caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de A) culture de la bactérie selon la revendication 6 dans un milieu pour produire et accumuler la L-lysine ou la L-arginine dans la culture, et B) récupération de la L-lysine ou de la L-arginine à partir de la culture. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu contient du méthanol comme principale source de carbone.