Brevet FR2851249A1 — publié le 20040820

La présente invention est relative à un nouveau facteur soluble sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, capable de bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse, et à ses applications, notamment pour le traitement de pathologies telles que le cancer, les rétinopathies, l'athérosclérose et la resténose. L'invention englobe les acides nucléiques codant ledit facteur (ADN génomique et ADNc), les sondes et amorces dérivées, la protéine correspondante et les fragments peptidiques et anticorps dérivés, ainsi que leurs applications. Le processus d'angiogénèse aboutit à la formation de nouveaux vaisseaux à partir du système vasculaire, en réponse à de nombreux facteurs angiogéniques. Les capillaires en formation sont composés essentiellement de cellules endothéliales et leur stabilisation, ainsi que leur maturation en vaisseaux fonctionnels dépendent du recrutement et de l'interaction avec des cellules périvasculaires constituées par les cellules musculaires lisses (CML) et les péricytes (Carmeliet, Nat. Med., 2000,6, 389-395). Le dialogue moléculaire complexe qui s'instaure pendant ce processus est essentiel pour le maintien ou l'élagage des capillaires néo-formés. Plusieurs molécules produites par chacun des deux types cellulaires (cellules endothéliales et cellules périvasculaires), qui participent à ces interactions ont été identifiées : les cellules endothéliales produisent des facteurs chimiotactiques, de croissance et de survie [PDGF (Platelet-Derived growth factor : Zerwes et al., J. Cell. Biol., 1987, 105,2037-2041) et FGFs (Fibroblast Growth Factors : Schweigerer et al., Nature, 1987,325, 257-259) qui recrutent les cellules musculaires lisses au niveau des vaisseaux néo-formés (Conway et al., Cardiovasc. Res., 2001,49, 507-521). Les cellules périvasculaires produisent des facteurs de croissance et des facteurs chimiotactiques pour les cellules endothéliales tels que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor : Ferrara et al., Growth factors, 1991,5, 141-148) et le FGF-2 (Winkles et al., P.N.A.S., 1987,84, 7124-7128), qui participent à la formation initiale et à la progression des capillaires, et probablement à la maturation des capillaires. Les cellules périvasculaires et endothéliales produisent également de l'angiopoïétine 1 et 2 (Davis et al., Cell., 1996,87, 1161-1169 ; Maisonpierre et al., Science, 1997,277, 55-60; Witzenbichler et al., J. Biol. Chem., 1998,273, 18514-18521), qui interagissent avec le récepteur spécifique des cellules endothéliales Tie-2 et jouent des rôles opposés dans la cohésion et la survie des cellules endothéliales (Maisonpierre et al., précité), en fonction de la disponibilité en VEGF (Lobov et al., P. N.A.S., 2002,99, 11205-11210). Les cellules périvasculaires produisent aussi du TGF-p (Transforming Growth Factor ss) qui, après activation par des contacts cellulaires, inhibe la prolifération et la migration des cellules endothéliales (Orlidge et al., J. Cell. Biol., 1987,105, 1455-1462 ; Sacchi et al., Oncogene, 1991,6, 2149-2154 ; Sato et al., J. Cell. Biol., 1989, 109, 309-315 ; Sato et al., J. Cell. Biol., 1990,11, 757-763), induit la différenciation des cellules musculaires lisses et la sécrétion de la matrice extracellulaire, stabilisant ainsi les vaisseaux sanguins (Dickson et al., Development, 1995,121, 1845-1854 ; Li et al., Science, 1999,284, 1534-1537). Les contacts directs entre les cellules périvasculaires et les cellules endothéliales, et avec la matrice extracellulaire participent également à ce dialogue. Ainsi, la formation d'un arbre vasculaire localement stable et fonctionnel dépend de l'ensemble de ces interactions complexes et la perturbation de ces échanges a des conséquences pathologiques majeures, par exemple : - dans l'athérosclérose, le recrutement et la prolifération des cellules musculaires lisses et un endothélium endommagé sont les facteurs clés de la lésion initiale (Behrendt et al., Am. J. Cardiol., 2002, 90,40L-48L), - dans les tumeurs solides, la formation d'un réseau vasculaire irrégulier et peu structuré est en partie le résultat d'un manque de coordination entre ces cellules (Carmeliet, Nature, 2000, 407, 249-257). Parmi les molécules qui ont été identifiées, plusieurs facteurs de croissance et facteurs chimiotactiques sont capables d'induire le recrutement initial et la prolifération des cellules musculaires lisses autour des capillaires (Berk, Physiol. Rev., 2001,81, 999-1030). D'autres facteurs répriment à la fois la prolifération et le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires, notamment le TGF-(3 (Bjorkerud et al., Arterioscler. Thromb., 1991,11, 892-902), le facteur suppresseur de tumeur PTEN (Huang et al., Arterioscl. Thromb. Vase. Biol., 2002,22, 745-751) et la sphingosine 1-phosphate (Payne et al., FEBS Letter, 2002,531, 54-57). En revanche, les facteurs qui diminuent et à l'extrême répriment spécifiquement le recrutement des cellules musculaires lisses lorsque les vaisseaux sanguins atteignent leur maturité n'ont pas été identifiés. Les cellules endothéliales forment une monocouche qui tapisse la bordure interne de tous les vaisseaux sanguins, en contact direct avec la circulation sanguine. A l'exception de certains endroits, comme le glomérule rénal, les corticosurrénales et le plexus choroïde, l'endothélium forme une barrière serrée et sélective, entre le sang et les tissus sous-jacents. Plusieurs protéines qui sont exprimées spécifiquement ou quasi-spécifiquement par les cellules endothéliales représentent des marqueurs capables d'identifier ces cellules. Ces marqueurs sont impliqués dans des fonctions essentielles des cellules endothéliales comme la prolifération, la survie et le maintien de l'intégrité de l'endothélium. Ils incluent les récepteurs du VEGF, Flt-1 (De Vries et al., Science, 1992,255, 989-991 ; Shibuya et al., Oncogene, 1990, 5, 519- 524) et flk-1 (Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 1992, 187, 1579-1586 ; Yamgushi et al., Development, 1993,118, 489-498), les récepteurs Tie (Partanen et al., Mol. Cell. Biol., 1992,12, 1698-1707 ;Sato et al., P.N.A.S., 1993,90, 9355- 9358 ;Schnürch et al., Development, 1993, 119, 957-968) ou la molécule d'adhérence VE-cadhérine (Vascular Endothelial-cadherin : Breier et al., Blood, 1996,87, 630- 641 ; Lampugnani et al., J. Cell. Biol., 1992,118, 1511-1522). Un facteur de fonction inconnue dénommé vezfl (vascular endothelial zinc finger 1) ou mDB1, homologue du facteur de transcription ubiquitaire humain hDB1, a également été décrit comme exprimé spécifiquement dans les cellules endothéliales chez la souris (Xiong et al., Developmental Biology, 1999,206, 123-141). Parmi ces marqueurs, aucun n'est sécrété ou n'agit sur les cellules musculaires lisses. De façon surprenante, les Inventeurs ont isolé un nouveau facteur, dénommé VE-statine, qui est spécifiquement exprimé par les cellules endothéliales et ils ont montré que la VE-statine est une protéine sécrétée qui réprime le recrutement des cellules musculaires lisses mais n'a pas d'effet sur leur prolifération. Ce nouveau facteur soluble qui ne présente aucune homologie avec des protéines connues, notamment les facteurs connus, sécrétés par les cellules endothéliales, est utile pour bloquer le recrutement des cellules musculaires lisses responsables de la stabilisation des vaisseaux sanguins néo-formés dans les pathologies liées à l'angiogénèse, telles que le cancer et les rétinopathies, mais également pour bloquer la formation des plaques d'athérosclérose et la resténose associée à la chirurgie vasculaire, qui sont dues à un recrutement excessif de cellules musculaires lisses. Les Inventeurs ont cloné l'ADNc codant pour la VE-statine humaine et murine et isolé le gène VE-statine qui est localisé, respectivement sur le chromosome 9 chez l'Homme et sur le chromosome 2 chez la souris. Les Inventeurs ont également montré que l'ADNc de 3681 pb décrit par Xiong et al. ne correspondait pas à un seul ADNc comprenant une longue région 3' non-codante, mais résultait d'un artéfact de clonage ayant généré la concaténation de deux ADNc correspondant à deux ARNm distincts, le premier situé entre les positions 1 à 2329 correspond à l'ADNc codant pour mDB 1 qui est transcrit à partir d'un gène localisé sur le chromosome 11 de la souris et non sur le chromosome 2 comme décrit dans Xiong et al. et le second situé 135 pb en aval de la séquence polyA authentique de mDB1(positions 2302 à 2329), correspond à une séquence d'ADNc de la VE-statine incorrecte et nonfonctionnelle, générée à partir d'un ARNm qui est transcrit à partir d'un gène localisé sur le chromosome 2 de la souris. Contrairement, à l'ADNc codant pour la VE-statine qui est fonctionnel et permet l'expression de la protéine VE-statine active, d'environ 275 acides aminés, qui est sécrétée dans le milieu extracellulaire et inhibe le recrutement des cellules musculaires lisses périvasculaires, l'ADNc de 3681 pb décrit dans Xiong et al. permet la production de la protéine mDB active mais uniquement d'une protéine VE-statine tronquée, inactive et ce, uniquement dans l'éventualité d'une réinitiation interne de la traduction à partir de l'ATG en positions 2519-2521. De manière plus précise, l'ADNc de 3681 pb décrit dans Xiong et al. présente un signal d'arrêt de traduction en positions 1594-1596 de la séquence codant DB1, une séquence non identifiable dans les bases de données et n'ayant aucun rapport avec des ADNc de la VE-statine (positions 2337-2471) et mutation de C en T en position 2602 mais ne possède pas les premières 236 pb de la VE-statine-a ou les premières 258 pb de la VE-statine-b, ni une base G entre les bases en positions 2870 et 2871 et une base G entre les bases en positions 2902-2903. En conséquence, dans l'éventualité d'une ré-initiation interne de traduction à partir de l'ATG 2519-2521 correspondant à l'ATG initiateur de la VEstatine, les absences précitées entraînent un changement du cadre de lecture considéré et la formation d'une protéine de 138 acides aminés de séquence MWGSGELLVA WFLVLAADGT TEHVYRPSRR VCTVGISGGS ISETFVQRVY QPYLTTCDGH RACSTYRTIY RTAYRRSPGV TPARPRYACC PGWKRTSGLP GACGAAICQP PCGNGGSSSA QDTAAALWMA GRYLPDRC, dont les 117 premiers acides aminés correspondent aux 117 premiers acides aminés de la VE-statine, les 21 acides aminés restant ne correspondant plus à la VE-statine du fait du premier changement de cadre (2870-2871), puis du second (2902-2903). Ces deux changements de cadre induisent la création d'un codon stop TGA d'arrêt de traduction en positions 2933-2935. En outre, des mutations additionnelles dans la séquence de la VEstatine sont présentes en aval du codon stop TGA en positions 2933-2935 : mutation de G en C en position 3043,mutation de G en C en position 3045,mutation de GG en TT en positions 3073-3074, mutation de GG en CC en positions 3076-3077, présence d'une séquence intronique en positions 3245-3410, absence des bases 1008-1085 de la VE-statine-a, correspondant aux bases 1030-1107 de la VE-statine-b, absence d'une base C entre les bases en positions 3448-3449, absence d'une base C entre les bases en positions 3465-3466, absence d'une séquence CT entre les bases en positions 3469- 3470, ajout des bases GA entre les bases en positions 3495-3496, absence d'une base G entre les bases en positions 3525-3526, et mutation de C en T de la base en position 3572. Ainsi, le profil d'expression spécifique des cellules endothéliales décrit dans Xiong et al., correspond à celui de la VE-statine et non à celui de vezfl mDB1 qui est ubiquitaire, étant donné que Xiong et al. ont utilisé pour l'hybridation in situ, une sonde issue de cet ADNc de 3681 pb s'hybridant à la fois dans la région codante de mDB1 et dans la région 3' adjacente décrite comme non-codante mais correspondant en fait à une séquence d'ADNc de la VE-statine incorrecte et nonfonctionnelle, comme précisé ci-dessus. La présente invention a, en conséquence, pour objet une protéine isolée et purifiée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence SEQ ID NO: 1 qui correspond à la VE-statine murine, et - les séquences présentant - sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1-, au moins 70 % d'identité ou au moins 85 % de similarité, de préférence au moins 80 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, et de manière préférée au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion des séquences présentant les numéros d'accès AAF01322, NP~057299, BAB22222 et AAH12377 dans la base de données du NCBI. La protéine selon l'invention représente un nouveau facteur soluble, sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, lequel facteur dénommé ci-après VE-statine, est capable de bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse ; le gène codant pour ladite VE-statine est dénommé ci-après VE-statine. L'invention inclut toute protéine (naturelle, synthétique, semisynthétique ou recombinante) de n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère humain ou non-humain, comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés d'une protéine VE-statine fonctionnelle. Elle inclut notamment les protéines naturelles isolées chez n'importe quelle organisme procaryote ou eucaryote, ainsi que les protéines recombinantes produites dans un système d'expression approprié. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine est une protéine eucaryote, de préférence une protéine de mammifère. On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une activité biologique normale, en l'occurrence une activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Cette protéine peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phénotypique. Une protéine VE-statine fonctionnelle présente les propriétés suivantes : - elle est produite sous la forme d'un précurseur intracellulaire d'environ 275 acides aminés possédant (i) un peptide signal clivable d'environ 20 acides aminés, situé à son extrémité NH2, et (ii) 2 domaines du type de ceux du facteur de croissance épidermique (domaines "EGF-like" ou Epidermal growth factor-like) caractérisés par la présence de résidus de cystéine et d'un résidu de glycine conservés tels que prédits par les logiciels SMART (v3. 3 du 13 décembre 2001: http://smart.embl-heidelberg.de) ou PROSITE (http://www.expasy.org/prosite/, version 17. 37 du 1-02-2003), lesdits domaines étant situés respectivement des positions 107 à 136 et 141 à 178, en référence à la séquence murine SEQ ID NO: 1 (figure 2), - elle est produite dans les cellules de mammifères, sous la forme d'une protéine soluble d'environ 30kDa, sécrétée dans le milieu extracellulaire ; cette forme mature dérive du précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles, - elle est exprimée de façon constitutive, spécifiquement dans les cellules endothéliales de tous les vaisseaux sanguins des précurseurs embryonnaires précoces aux cellules matures chez l'adulte, indépendamment de leur nature (artère ou veine), de leur taille ou de leur origine tissulaire, - elle inhibe le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. La mesure de l'activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse est réalisée par les techniques classiques connues en elles-mêmes notamment par le "test de la blessure" (Gotlieb et al., J. Cell. Physiol., 1979, 100, 563-578) ou par le "test de la chambre de Boyden" (TW Jungi, J. Immunol. Methods, 1978, 21, 373-382). L'invention inclut le précurseur de la VE-statine (forme intracellulaire) qui possède un peptide signal à son extrémité NH2, ainsi que la protéine mature (forme sécrétée dans le milieu extracellulaire), dérivée de ce précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, elle présente la séquence de la VE-statine murine ou humaine mature, laquelle séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275,19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, et - les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273,18 à 273,19 à 273,20 à 273,21 à 273,22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO: 2 (position 21 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1) et la séquence SEQ ID NO : 3 (positions 20 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42), correspondant respectivement à la VE-statine murine et humaine matures. Conformément à l'invention, l'homologie d'une séquence par rapport à la séquence SEQ ID NO:1 s'apprécie par rapport à une séquence de longueur équivalente à celle de la séquence SEQ ID NO: 1 (environ 275 acides aminés), c'est à dire que l'homologie est analysée sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1 et non uniquement sur une portion de celle-ci et par conséquent, le pourcentage de résidus qui sont identiques ou similaires est déterminé sur un nombre d'environ 275 résidus d'acides aminés. De manière plus précise : L'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences-chacune d'environ 275 acides aminés-sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence d'environ 275 acides aminés, peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence, en l'occurrence son activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui sont différents par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences chacune d'environ 275 acides aminés - sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine, en l'occurrence son activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence d'environ 275 acides aminés, peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Par exemple, parmi les protéines connues, aucune séquence identique ou similaire n'a été trouvée ; la comparaison de la séquence SEQ ID NO : 1 selon l'invention avec les séquences de protéines disponibles sur les bases de données, à l'aide du logiciel BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html), montre que : - la protéine CBL20 de rat (NP 620804,190 acides aminés) qui présente 90 % d'identité sur un fragment de 170 acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 1, ne présente que 56 % d'identité et 57 % de similarité sur la totalité de la séquence SEQ ID NO : 1, - la protéine NG3 (humaine, de rat et de souris, respectivement NP~085155, XP 228000 et NP~690886) présente environ 36 % d'identité et 50 % de similarité avec la VE-statine murine. La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la VE-statine, telle que définie ci-dessus ; de tels peptides sont particulièrement utiles pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement la VE-statine. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. De tels anticorps permettent notamment de déterminer le profil d'expression de la protéine VE-statine et une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique, et par voie de conséquence de diagnostiquer une maladie génétique ou acquise impliquant un dysfonctionnement de ce facteur. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences codant pour la VE-statine telle que définie ci-dessus (ADNc ou fragment d'ADN génomique représentant le gène VE-statine), - la séquence SEQ ID NO: 4 (VE-statine-b) codant pour la protéine VE-statine humaine de 273 acides aminés et - les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. L'invention englobe, les séquences des allèles du gène VE-statine issues de n'importe quel mammifère, ainsi que les séquences des mutants naturels ou artificiels du gène VE-statine codant pour une protéine VE-statine fonctionnelle telle que définie ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence codant pour la VE-statine est sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences SEQ ID NO: 5 et 6 qui correspondent aux deux espèces d'ADNc (VE-statine-a et VE-statine-b) codant pour la protéine VE-statine murine ; ces espèces d'ADNc qui diffèrent au niveau des 169 premières paires de bases de leur séquence 5' non-traduite, codent pour la même protéine de 275 acides aminés, - la séquence située entre les positions 85512 et 98730 de la séquence présentant le numéro d'accès AL590226 dans la base de données GENBANK, laquelle séquence qui correspond au gène humain, est localisée dans la région distale du bras long du chromosome 9 (région 9q34. 3-qter, à 151,488 Mb, près du marqueur WI-17482) et présente une organisation exon-intron comprenant 11 exons et 11 introns et incluant des exons 1 alternatifs (exon-la et exon-1 b) correspondant aux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b (Tableau I), Tableau I : Organisation exon-intron du gène VE-statine humain exon taille (bp) séquence 3' de site intron site séquence 5' de l'exon donneur (kb) accepteur l'exon CGCGCCACCT 1a 172 CTCTGGGAAG gtaaggcagc 3.29 ccggggggag CCTCCCTGCA 1b 189 GCAGCATCAG gtatggcagg 1. 58 ctccaaccag CAGCCCCCAG 2 96 CCTCCGCCAG gtgagtccca 3. 19 tgtgccccag GCCACCCAGA 3 122 ACCGGCCCG gtgagccaag 0. 19 acccccgcag CCGTAGGGTG G 4 117 GCACCTACCG gtgagtgccc 0. 93 caccccacag AACCATCTAT 5 116 TGTGGAGCAG gtgagggcta 0. 19 ccgcccacag CAATATGCCA 6 96 TGCCAGTCAG gtgaggctgg 0. 16 tttcctgcag ATGTGGATGA 7 162 AACCCGACAG gtaaacagcc 0. 62 ctgcccgcag GAGTGGACAG 8 65 GCTGGAGGA gtgaggcatt 0. 91 gcacccacag AAGCTGCAGC G 9 163 CTGGGGTCCT gtgagtgccc 0. 18 ccaaccctag GCTCCTGCAA 10 415 TGAAACGTGA - la séquence située entre les positions 4060576 et 4072108 de la séquence présentant le numéro d'accès Mm2~WIFeb01~25 dans la base de données GENBANK, laquelle séquence qui correspond au gène murin, est localisée sur le chromosome 2 (2B) et présente une organisation exon-intron similaire à celle du gène humain (Tableau II). Tableau II : Organisation exon-intron du gène VE-statine murin exon taille (pb) séquence 3' de site intron site séquence 5' de l'exon donneur (kb) accepteur l'exon GAGATGCCCA 1a 147 CTGTGGGAAG gtaaggcact 2. 67 cactcgggag CTGGCAGGCT 1b 169 GCAGCATCAG gtatgcagga 1. 54 tgacccgcag CCCCCGGCA G 2 91 CGGACCACAG gtgagtcccc 3.53 tttgccttag GCCACAAAAA 3 125 ACAGACCCAG gtgaggaagg 0. 17 ttccctgtag CCGTAGAGTG 4 117 GCACCTACCG gtgagtgctc 0. 96 ctcaccacag AACCATCTAC 5 116 TGTGGAGCAG gtgagggcag 0. 16 ctacccacag CAATATGCCA 6 96 TGCCAGACAG gtaagcaccc 0. 16 tttcttacag ATGTTGATGA 7 165 CCCACAGCAG gtaaacttgc 0. 61 ctgcccccag GAGTGGACAG 8 65 GCTAGAACAG gtgaggcttg 0. 40 ttccaaacag AAACTGCAGT 9 124 GATTCACTGA gtgagcaggt 0. 18 cctgccctag GCTCCTGCAA 9b 9b~ 163 CTGGGGTCCT gtgagtccca 0.14 10 264 TGAGACTTGA L'invention a également pour objet des fragments d'au moins 8 pb des molécules d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus, à l'exclusion de l'EST présentant le numéro d'accès BI910383 dans la base de données NCBI et du fragment d'ADNc présentant le numéro d'accès NM~016215 dans la base de données du NCBI. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits fragments sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - les amorces de séquence SEQ ID NO: 7 à 30, et - le fragment de 789 pb de l'intron lb du gène VE-statine murin (SEQ ID NO: 31). Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les fragments tels que définis ci-dessus peuvent notamment être utilisés comme sondes ou comme amorces pour détecter/amplifier des molécules d'acide nucléique (ARNm ou ADN génomique) codant une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus ou bien comme sondes pour isoler le gène VE-statine d'autres espèces ou des allèles de ce gène, notamment par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc. Ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent également, soit de déterminer le profil de transcription du gène VE-statine et une éventuelle altération de ce profil dans un tissu ou un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène VE-statine, des variants alléliques de ce gène et une éventuelle altération fonctionnelle de ce gène VE-statine (changement substantiel dans l'activité inhibitrice des cellules périvasculaires du type musculaire lisse) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau d'au moins un exon dudit gène ou d'une translocation chromosomique impliquant ledit gène. Par voie de conséquence, ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent de diagnostiquer un état pathologique ou une maladie génétique impliquant un dysfonctionnement de la VE-statine et de cribler des substances capables de moduler (activer ou inhiber) la transcription du gène VE-statine. La détection d'une mutation dans le gène VE-statine est réalisée par les techniques classiques qui sont connues en elles mêmes, par exemple : (i) par amplification d'une région dudit gène VE-statine susceptible de contenir une mutation, puis détection de ladite mutation par séquençage ou par digestion par une enzyme de restriction appropriée, du produit de PCR obtenu, ou bien (ii) par hybridation avec une sonde marquée spécifique d'une région dudit gène VE-statine susceptible de contenir une mutation, puis détection directe des mésappariements et/ou digestion par une enzyme de restriction appropriée. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une protéine VE-statine et leurs fragments tels que définis ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. La présente invention a également pour objet des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des protéines et des peptides VE-statine selon l'invention ou en thérapie génique substitutive. La présente invention a également pour objet un mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus. Les mammifères transgéniques non-humains et les cellules transformées tels que définis ci-dessus, sont utiles comme outils pour l'étude du gène VEstatine et du produit de ce gène. La présente invention a également pour objet un médicament, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : molécule d'acide nucléique nue codant pour une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus, un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ou une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la VEstatine humaine (SEQ ID NO: 42, numéro d'accès NCBI NP 057299) pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Un tel médicament qui est capable d'inhiber le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse est utile pour bloquer le recrutement des cellules musculaires lisses responsables de la stabilisation des vaisseaux sanguins néo-formés dans les pathologies liées à l'angiogénèse, telles que le cancer et les rétinopathies, mais également pour bloquer la formation des plaques d'athérosclérose et la resténose associée à la chirurgie vasculaire, qui sont dues à un recrutement excessif de cellules musculaires lisses. La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un agoniste ou d'un antagoniste de la VE-statine, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de cellules musculaires lisses périvasculaires, avec une protéine VE-statine telle que définie ci-dessus et une substance à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance à tester sur la migration desdites cellules musculaires lisses, et c) la sélection des substances capables d'augmenter ou de diminuer la migration desdites cellules musculaires lisses, par rapport au contrôle (VE-statine seule). L'étude de l'effet sur la migration des cellules musculaires lisses périvasculaires est réalisée, soit par mesure directe de la migration par les techniques classiques connues en elles-mêmes notamment par le "test de la blessure" (Gotleb et al., précité), par le "test de la chambre de Boyden" (TW Jungi, précité) ou bien à partir d'explants de vaisseaux sanguins cultivés ex-vivo sur collagène (Villaschi et al., Am J Pathol., 1993,143, 181-190), soit par des mesures indirectes, notamment par analyse de l'activation du facteur Rac, par exemple par détection de Rac (Immunofluorescence) ou de la polymérisation locale de l'actine, au niveau du front de migration cellulaire. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du gène VE-statine et de ses produits (ADNcs VE-statinea et VE-statine-b et protéine VE-statine) selon la présente invention ainsi qu'au Tableau III résumant les séquences de la Demande : Tableau III : Liste des séquences Numéro Séquence d'identification SEQ ID NO: 1 Protéine VE-statine murine (précurseur) SEQ ID NO: 2 Protéine VE-statine murine (mature) SEQ ID NO: 3 Protéine VE-statine humaine (mature) SEQ ED NO: 4 ADNc VE-statine-b humain SEQ ID NO: 5 ADNc VE-statine-a murin SEQ ID NO: 6 ADNc VE-statine-b murin SEQ ID NO: 7 à 30 amorces VE-statine SEQ ID NO: 31 fragment de 789 pb de l'intron lb du gène murin SEQ ID NO: 32 à 41 autre amorces utilisées dans les exemples SEQ ID NO: 42 Protéine VE-statine humaine (précurseur : numéro d'accession NCBI NP~057299 ) et aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la démonstration de la nature chimérique de l'ADNc codant pour vezfl (mDBl) décrite par Xiong et al. (précité) : - figure 1A : la séquence codant pour vezfl (mDBl), représentée par un rectangle, est suivie d'une longue séquence 3' décrite par Xiong et al., comme une séquence nontraduite. De façon inattendue, les inventeurs ont mis en évidence la présence dans cette séquence, d'une séquence polyA interne 2302-2336 correspondant à la séquence polyA authentique de l'ADNc codant pour vezfl (mDBl), et d'un site EcoRI. Les flèches indiquent la position des différents couples d'amorces (couples 1 à 4) utilisées pour l'amplification RT-PCR. - figure 1B : amplification des fragments de l'ADNc vezfl par RT-PCR. L'ARN total d'embryon de souris El 0,5 (0,28 g) a été analysé par RT-PCR à l'aide des couples d'amorces 1 à 4. L'amplification de fragments chevauchant la séquence poly A2302- 2336/EcoRI n'est pas possible (pistes 2 et 3 correspondant aux couples d'amorces 2 et 3), alors que l'amplification de régions situées de part et d'autre de cette séquence résulte en la production de produits de la taille attendue (pistes 1 et 4 correspondant aux couples d'amorces 1 et 4). - la figure 2 illustre la structure des ADNc VE-statine : la séquence complète de l'ADNc VE-statine-a murin est présentée (SEQ ID NO: 5,1371 pb) et la séquence quasi complète de l'ADNc VE-statine-b murin, qui diffère de celle de l'ADNc VE-statine-a au niveau des 169 premières paires de bases, est représentée en italique. La séquence codante représentée en capitales code pour une protéine de 275 acides aminés (SEQ ID NO: 1), correspondant à un poids moléculaire estimé de 29,7 kDa. La séquence minimale de Kozak est encadrée, le site de clivage du peptide signal est indiqué par une flèche, les séquences des 2 domaines EGF-like sont soulignées et les résidus de cystéine et de glycine conservés sont indiqués en gras. - la figure 3 illustre la séquence du gène VE-statine : la partie supérieure correspond à la représentation schématique de la structure des gènes VE-statine humains et murins. Les nombres et les lignes horizontales représentent les exons. Les exons la et lb résultent de sites d'initiation de la transcription alternatifs et codent respectivement pour les transcrits VE-statine-a et VE-statine-b. L'ATG d'initiation de la traduction est situé dans l'exon 3 et le codon stop dans l'exon 10. Les deux gènes possèdent de courtes séquences dispersées répétées du type SINE (Short Interspersed Nuclear Element). Les signaux de polyadénylation sont ATAATAAAGC et ACAATAAAAA, respectivement dans les gènes murin et humain. La partie inférieure illustre la localisation chromosomique des gènes humain et murin par hybridation (FISH) à l'aide de sondes spécifiques du gène VE-statine. - la figure 4 illustre l'analyse de l'expression des transcrits VE-statine : - figure 4A : analyse en Northern-blot de l'expression de la VE-statine-a (panneau du haut) et de la VE-statine-b (panneau du bas) dans différents tissus, chez la souris. Les transcrits VE-statine (1,6 kb, indiqués par une flèche) sont exprimés à des niveaux plus élevés dans le rein, les poumons et le c#ur). Les nombres indiquent la taille des marqueurs (kpb). Aucun signal n'a été détecté à la position attendue pour le transcrit vezfl de 4,2 kb décrit dans Xiong et al., précité. - figure 4B : analyse RT-PCR de l'expression des transcrits VE-statine (totaux), VEstatine-a et VE-statine-b, par comparaison avec les contrôles (dblet gadph) chez l'embryon de souris El 0,5, dans le c#ur et dans différentes lignées cellulaires. L'expression de la VE-statine est détectée dans les tissus de souris et dans les cellules endothéliales mais pas dans les fibroblastes alors que dblest exprimé dans tous les tissus et toutes les cellules. - figure 4C : par un test de protection à la RNase des transcrits VE-statine-a et VE-statine-b, à partir d'ARNt (Contrôle : Ctrl), d'ARN d'embryon de souris E10,5 ou d'ARN de cellules endothéliales (H5V). La VE-statine-a possède 5 sites d'initiation de la transcription couvrant une région d'environ 60 pb (indiqués par des flèches), alors que la VE-statine-b possède un site d'initiation unique. Les nombres sur la gauche indiquent la position des marqueurs. - la figure 5 illustre le profil d'expression in situ des gènes VEstatine et dbl : - Panneau supérieur : analyse par hybridation in situ de l'expression des gènes : VE- statine (A, D, G), vegfr-2 (B, E, H) et dbl (C, F, I), chez l'embryon de souris E7,5 (A à C) et El 0,5 (D à 1). Au stade E7,5, le gène VE-statine (A) et le gène vegfr-2 (B) sont exprimés dans les îlots sanguins primitifs et dans le sac vitellin (indiqués par des flèches). Le gène vegfr-2 est également exprimé dans le mésoderme intra-embryonnaire (B, étoile). L'expression de dbl n'est pas détectée à ce stade du développement embryonnaire (C). Au stade E10,5, les gènes VE-statine (D) et vegfr-2 (E) sont exprimés de façon similaire, dans les vaisseaux sanguins en formation. Un grossissement plus important de la région caudale de l'embryon montre que les profils d'expression des gènes VE-statine (G) et vegfr-2 (H) au niveau de l'endothélium (aorte dorsale (flèche)) et vaisseaux des membres postérieurs (pointes de flèches) sont superposables. A ce stade, dbl est exprimé de façon ubiquitaire chez l'embryon, avec un niveau d'expression plus élevé dans l'épithélium neural (F, flèche). L'expression de dbl n'est jamais détectée dans l'endothélium (I). L'échelle représente 100 m dans A à C et G à I et 1 mm dans D à F. - Panneau inférieur : analyse de l'expression du gène VE-statine chez l'embryon E10,5 (J à L), E13,5 (M à P), le nouveau-né âgé de 3 jours (Q) et l'adulte (R). L'expression du gène VE-statine est détectée dans les artères des 3ème et 4ème arcs branchiaux (J, respectivement flèche et pointe de flèche) ; la veine de l'artère ombilicale (K) et dans les précurseurs des cellules endothéliales du mésenchyme céphalique (L). Au jour 13,5 après la conception, le gène VE-statine est exprimé dans les cellules endothéliales de l'endocarde (M), dans le réseau vasculaire pulmonaire primitif (N), dans les vaisseaux sanguins entourant les côtes (0) et dans le réseau vasculaire associé à la couche pigmentaire de la rétine (P). Après la naissance, l'expression du gène VE-statine est détectée dans l'artère rénale (Q, flèche), la veine rénale (pointe de flèche), dans le réseau capillaire glomérulaire (Q, étoile) et dans les capillaires péritubulaires (Q, flèche ouverte). Chez la femelle gestante, le gène VE- statine est fortement exprimé dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la décidue du mésomètre (R, flèche). a : atrium, cm : mésenchyme céphalique, gl : glomérule, Li : foie,Rv : veine rénale , Lu : poumons, md : du mésomètre, n : épithélium neural, Ra : artère rénale, rb : tu : rénaux, na : artère ombilicale, uv : ombilicale, v : ventricule. L'échelle représente 100 m. - la figure 6 illustre l'analyse de l'expression, la localisation et la sécrétion de la VE-statine : - figure 6A : les ADNc de la VE-statine-a et de la VE-statine-b ont été traduits in vitro pour confirmer la présence d'un site d'initiation de la traduction commun aux deux transcrits ; une seule forme de VE-statine, correspondant au poids moléculaire attendu de 30 kDa, est produite à partir des deux transcrits. ctrl : contrôle ; a : VE-statine-a ; b : VE-statine-b, - figure 6B : l'expression de la VE-statine (transcrits et protéine) a été analysée respectivement par RT-PCR, par comparaison avec celle de la GAPDH (deux premières lignes) et par Western-Blot (dernière ligne), à partir de cellules 3T3 trans- fectées avec le plasmide pcDNA3-VE-statine-HA (+) ou le plasmide contrôle pcDNA3 (-). La flèche indique l'expression spécifique de la VE-statine dans les cellules transfectées par le vecteur pcDNA3-VE-statine-HA, - figure 6C : la localisation cellulaire de la VE-statine a été analysée par immuno- fluorescence directe ou par co-localisation, dans des cellules 3T3 transfectées respec- tivement par les plasmides pcDNA3-VE-statine-GFP (VE-stat-GFP, à gauche) et pcDNA3-VE-statine-HA (VE-stat-HA + PDI, à droite) ; 24 h après la transfection, les cellules ont été colorées par le colorant de Hoechst et observées directement en microscopie de fluorescence (GFP, à gauche) ou bien préalablement incubées avec des anticorps primaires anti-HA et anti-isomérase à liaison disulfure (marqueur spécifique du réticulum endoplasmique), puis avec des anticorps secondaires marqués respecti- vement à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou à la rhodamine (à droite). - figure 6D : fibroblastes 3T3 ont été transfectés par le plasmide pcDNA3-VE- statine-HA (VE-stat) ou le plasmide contrôle pcDNA3 (-) ou bien non-transfectées (mock). Le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par du milieu seul (panneau de gauche) ou du milieu contenant de la bréfeldine A (bref) ou de la monensine (Mon), (panneau de droite). Les cellules ont été cultivées pendant 6 h supplémen- taires, ensuite la VE-statine sécrétée dans le milieu extracellulaire a été immunopréci- pitée à partir du surnageant de culture filtré, puis détectée par Western-blotting. La flèche indique la VE-statine sécrétée ; ns : bande non-spécifique. - la figure 7 illustre l'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses : - la figure 7A montre que la VE-statine n'a pas d'effet sur la prolifération des cellules musculaires lisses (AoSMC) ensemencées à faible densité et cultivées pendant 8 jours dans du milieu contrôle (-#-) ou du milieu contenant de la VE-statine (-#-), addition- nés de PDGF-BB (50 ng/ml) ; les cellules ont été comptées chaque jour et le milieu a été changé tous les deux jours. - les figures 7B et 7C montrent que la VE-statine inhibe la migration des cellules musculaires lisses (AoSMC) ; les cellules AoSMC sont cultivées jusqu'à confluence puis les tapis cellulaires sont abimés avec des lames de rasoir et les cellules sont culti- vées pendant 2 jours supplémentaires en présence : de milieu contenant de la VE- statine avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml ; VE-statine ;VE-statine+ PDGF) ou de milieu contrôle (Ctrl ; Ctrl + PDGF). B : des cellules au microscope à contraste de phase : la barre noire indique la position de la lésion. C : nombre de cellules ayant migré correspondant à la moyenne déviation standard, a été déterminé sur 3 à 7 champs distincts. Exemple 1 : et méthodes Les oligonucléotides sont synthétisés par GENSET et GENOSYS et les réactifs de RT et de PCR sont fournis par PERKIN ELMER. Les sites de polyadénylation sont prédits à l'aide de la méthode de clustering de Hamming pour la prédiction des sites TATA et Poly-A (http://www.itba.mi.cnr.it/webgene). Les séquences SINE ALU/MIR ont été localisées à l'aide du serveur internet Repeat Master (version du 16/07/00 : http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker). Les domaines de protéines ont été prédits à l'aide du logiciel SMART (v3. 3 du 13 décembre 2001 : http://smart.embl-heidelberg.de). 1) Cellules Les lignées ou cultures primaires murines ou humaines suivantes ont été utilisées : L929 (fibroblaste murin), H5V (endothéliome cardiaque murin), 3T3 (fibroblaste murin), MBE (capillaire de cerveau murin), MAE (cellules endothéliales aortiques murines), EOMA (endothéliome murin), 1G11(lignée de cellules endothéliales pulmonaires murines) et AoSMC (culture primaire de cellules musculaires lisses aortiques humaines, CLONETICS). Les cellules sont cultivées à 37 C, en atmosphère humide (5 % C02-95 % air), dans les conditions recommandées par le fabricant. 2) RT-PCR L'ARN total est extrait à l'aide du réactif TRIzol# (LIFE TECHNOLOGIES). Les réactions de transcription inverse sont réalisées à partir d'1 g d'ARN, à l'aide d'oligonucléotides hexamériques aléatoires, selon les instructions du fabricant (PERKIN ELMER). Les réactions de PCR sont réalisées dans du tampon PCR II (PERKIN ELMER) contenant les produits de transcription inverse, 150 M de chacun des NTPs et 1,25 UI d'AmpliTaq Gold@, dans un volume final de 50 [il Pour les réactions RT-PCR de la figure 1, les couples d'amorces suivants ont été utilisés : - Couple 1: TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 32) TTT CGT CTT GCC AGC TAC TAT CC (SEQ ID NO: 33) - Couple 2 : ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 34) TGT CAG TCT CCT ATG GAA CC (SEQ ID NO: 35) - Couple 3: TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 36) GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 37) - Couple 4 : CTA CCC CAC TTA CAG ATG C(SEQ ID NO: 7) GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 8) Après une étape de dénaturation à 95 C pendant 2 min, l'amplification a été réalisée pendant 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94 pendant 30 s, une étape d'hybridation à 53 C pendant 30 s et une étape d'extension à 72 C pendant 1 min. Des amplifications PCR ont été réalisées dans des conditions similaires aux précédentes, en utilisant les couples d'amorces, la concentration en MgCl2, la température d'hybridation et le nombre de cycles suivants : - Amorces mDBl(2 mM, 53.4 C, 35cycles) : TGA ACC TGC CCA CTC CTA TGA (SEQ ID NO: 38) TTT CGT CTT GCC AGC TAC TAT CC (SEQ ID NO: 39). - Amorces mVE-statine (1 mM, 57.8 C, 30 cycles): AGG CTA CCC CAC TTA CAG ATG C (SEQ ID NO: 9) GAG GCC TTG CGG GAG TCA CC (SEQ ID NO: 10). - Amorces mVE-statine-a (2 mM, 54.7 C, 32 cycles): - AGA AGT TCA GTG GTG AGG (SEQ ID NO: 11) - TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 12). - Amorces mVE-statine-b (2 mM, 57.4 C, 32 cycles): TGG GCA GCA GAC ATT CC (SEQ ID NO: 13) TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 14). - Amorces mGAPDH (3 mM, 61 C, 25 cycles): ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA (SEQ ID NO: 40) CAT TGG GGG TAG GAA CAC GGA AGG (SEQ ID NO: 41). - - Amorces hVE-statine (2mM, 65 C, 27 cycles, produit de 372 pb) CCTGCAGGATGGCGGGGTGACA (SEQ ID NO: 25) GCGGCCGAGCTGCTGGAAGGAG (SEQ ID NO: 26) -3' - Amorces hVE-statine-a (2mM, 62 C, 30 cycles, produit de 188 pb) CGCGCCACCTGAGATGC (SEQ ID NO: 27) CCGGTCCTGGGGGCTGCTTCC (SEQ ID NO: 28) - Amorces hVE-statine-b (ImM, 61 C, 30 cycles, produit de 176 pb) CCCCAGCAAGGGCTAGGGTCCAT (SEQ ID NO: 29) TGGCGGAGGAGAATCAGTCAT(SEQ ID NO: 30) Les réactions de PCR sont réalisées à l'aide d'un thermocycleur (Gene Amp PCR system 2400 ou 9600, PERKIN ELMER). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose (1 %) et visualisés en lumière UV, après coloration au bromure d'éthidium. 3) Clonage De l'ARN total d'embryon de souris E10,5 a été rétro-transcrit et incubé avec 50 ng de chacune des amorces ACA AAA AGA AGA AGG CTA CC (SEQ ID NO: 15) et CAG CGG CAG TGT CCT GGG CG (SEQ ID NO: 16), dans un mélange High Fidelity PCR master mix (BOEHRINGER). L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes: 94 C pendant 2 min, puis 35 cycles de 94 C-30 s, 54 C-30 s et 72 C-1 min, suivis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 7 min. Le produit de 416 pb a été purifié, cloné dans le vecteur PCR II-TOPO (INVITROGEN), séquence et utilisé comme sonde pour cribler les banques d'ADNc d'embryon de souris et d'ovaire (respectivement 106 et 1,6 x 106 phages). L'ADNc complet VE-statine-a et VE-statine-b a ensuite été cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3 (STRATAGENE) et utilisé pour générer différentes sondes spécifiques de la VE-statine pour les analyses par Northern-blot et hybridation in situ. Le vecteur pGFP-VE-statine a été construit par clonage de la séquence codant pour la VE-statine entre les sites HindIII et BamHI du vecteur pEGFP-Nl (BD-CLONTECH). Le vecteur d'expression pHA-VE-statine a été construit par clonage de la séquence codant pour l'épitope de l'hémagglutinine du virus influenza (HA), en phase avec la séquence codant pour la VE-statine, entre les sites HindIII et BamHI du vecteur d'expression pcDNA3 (STRATAGENE). 4) 5'RACE et isolement de fragments génomiques. L'analyse par 5'-RACE a été réalisée sur de l'ADNc d'ovaire humain normal et d'embryon de souris E7,5, à l'aide du kit Marathon-ready cDNA (CLONTECH). Les amplifications ont été effectuées à l'aide du mélange High Fidelity PCR master mix (BOEHRINGER) et de thermocycleurs GENEAMP, selon les instructions du fabricant. Les paires d'amorces imbriquées murines et humaines sont respectivement CGG AGC CCC ACA TGG TCT GCA TC (SEQ ID NO: 17) et TCT TTT TGT GGC CTG TGG TCC GG (SEQ ID NO: 18), CCA CAT CAG CAG CAC CTC CTG AGA G (SEQ ID NO: 19) et GAG CCC CTC ATG GCC TGT GCC TCC A (SEQ ID NO: 20). L'isolement du gène VE-statine a été réalisé, à la fois par hybridation standard de banques de phages (1 à 1,8 x 10clones), à l'aide de sondes d'ADNc et d'ADN génomique spécifiques du gène VE-statine, et par amplification de fragments par PCR à l'aide du kit murin Genome Walker (CLONTECH) et de différents couples d'amorces spécifiques. Les fragments PCR ainsi obtenus ont été sous-clonés dans le vecteur PCR II-TOPO et séquences à l'aide d'un séquenceur à ADN (Abiprism 377, APPLIED SYSTEM). 5) Test de protection à la RNase 2 fragments génomiques spécifiques d'environ 850 à 900 pb comprenant 150 à 175 pb de l'exon la ou lb ont été amplifiés à partir d'un fragment génomique de 17 kpb de la VE-statine, à l'aide du mélange High Fidelity PCR master mixR (ROCHE). Les fragments amplifiés ont été clonés dans le vecteur pCR-TOPO et des sondes spécifiques de la VE-statine a ou b ont été synthétisées à l'aide de respectivement : les amorces TCC CAC AGG GAC AGG GAC AGG GGA TGG ACA GAG CC (SEQ ID NO: 21) and ATG CTG CCC AGG CCT GGC TGA GGC CAC CTC TGC TG (SEQ ID NO: 22) et du kit Riboprobe Gemini System III kit (Promega), selon les instructions du fabricant. Le test de protection à la RNase a été réalisé à partir de 5 g d'ARN total d'embryon de souris El 0,5, de cellules endothéliales H5V ou d'ARNt de levure (contrôle), à l'aide du kit RPA III (AMBION). Les réactions ont été analysées par électrophorèse en gel de 6 % polyacrylamide-8M puis les gels ont été séchés et autoradiographiés. 6) Northern-blotting Les membranes pour Northern Blot, préparées à partir de différents tissus humains ou murins (CLONTECH), ont été incubées à 68 C pendant une heure avec des sondes spécifiques de la VE-statine-a humaine ou murine ou avec une sonde anti-sens de la VE-statine-b, marquées au 32P dans une solution d'hybridation ExpressHybR (CLONTECH). Les membranes ont ensuite été lavées à 50 C dans du SSC 2X contenant 0,05% SDS, séchées puis autoradiographiées. 7) Cartographie par hybridation in situ (FISH) Le clone BAC 611D20 obtenu à partir d'une banque génomique (INCYTE), a été utilisé comme sonde humaine spécifique. Un plasmide comprenant un fragment de 17 kpb d'ADN génomique de souris a été utilisé comme sonde murine spécifique. L'ADN de BAC et l'ADN plasmidique ont été isolés selon les techniques classiques, en suivant les protocoles standards (QIAGEN). Un g d'ADN a été marqué, à l'aide du kit FITC-Nick translation, selon les recommandations du fabricant (VYSIS). 100 ng d'ADN marqué ont été mélangés avec 20 g d'ADN humain Cot-1 (GIBCO-BRL), précipité à l'éthanol, et repris dans 10 l de tampon d'hybridation (4X SSC, IX Denhardt's, 0,02 M NaP04 pH 6,7,1 g/ml d'ADN de sperme de saumon, 10 % de sulphate de Dextran, 50 % formamide). Les chromosomes en métaphase ont été dénaturés dans 70 % formamide, 2X SSC pendant 2 min à 70 C et déshydratés immédiatement dans l'éthanol froid. Les étalements de chromosomes humains et murins ont été hybridés avec les sondes correspondantes, pendant 16 à 18h, à 37 C dans une enceinte humide. Les lames ont été analysées à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Axisphot 2, ZEISS), les images ont été enregistrées à l'aide du logiciel Quips (VYSIS). 8) Cartographie par hybride de radiation (RH mapping) Le couple d'amorces GCT GTC TGG TGG TGC CTA TG (SEQ ID NO:23) et TTA TTA TGA CAA AGA TGG AG (SEQ ID NO:24) a été utilisé pour cribler l'ensemble G3 d'hybride de radiation de Stanford. Les réactions ont été réalisées dans du tampon PCR contenant 3 mM de MgCl2, 5 nmoles de chacune des amorces, 30 ng de matrice ADN et 0,5 UI d'AmpliTaq Gold polymérase (APPLIED BIOSYSTEM), à l'aide d'un appareil Gene Amp PCR System 9700 (APPLIED BIOSYSTEM). L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes : 35cycles comprenant 95 C-15 s, 55 C-19 s et 72 C-30 s, puis les produits ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose (2 %) et coloration au bromure d'éthidium. Un produit PCR de 163 pb a été détecté. 9) Hybridation in situ L'hybridation in situ a été réalisée à l'aide des sondes suivantes : un fragment de 1,3 kpb d'ADNc de la VE Statine cloné dans pcDNA3 (INVITROGEN), un fragment de 1 kpb d'ADNc de VEGFR-2 murin cloné dans pGEM-T-easy ou un fragment de 800 pb d'ADNc de DB1 murin cloné dans PCRII-TOPO. Les sondes sens et anti-sens ont été synthétisées à partir des plasmides linéarisés, à l'aide de 350 M de NTPs marqués à la digoxigénine (ROCHE), comme décrit dans Wilkinson et al., Methods Enzymol., 1993,225, 361-373. L'hybridation in situ a été réalisée sur des coupes en paraffine de 5 m, comme décrit dans Queva et al., Oncogene, 1993,8, 2511-2520 et Mattot et al., J. Cell. Sci., 1995,108, 529-535. La digoxigénine a été détectée comme décrit dans Wilkinson et al., en utilisant le NBT# et le BCIP (ROCHE) pour la détection de l'activité phosphatase alcaline. Les lames ont été montées dans du Dako-glycergelR (DAKO) et examinées à l'aide d'un microscope DM LB (LEICA). Les images ont été enregistrées à l'aide d'un appareil photographique (JVC KY-F55B) et du logiciel QWin (LEICA). 10) Production de la VE-statine recombinante Des vecteurs d'expression de la VE-statine, dénommés pcDNA3VE-statine-HA et pEGFP-VE-statine, contenant l'ADNc de la VE-statine en phase, respectivement avec un épitope de l'hémagglutinine du virus influenza et la protéine fluorescente GFP, sous le contrôle du promoteur CMV, ont été construits comme décrit à l'exemple 1.3. Des cellules 3T3 (15000 cellules/cm2) ont été ensemencées dans des flasques de culture de 78,5 cm2puis transfectées le lendemain avec 5 g de vecteur recombinant pcDNA3-VE-statine-HA ou pcDNA3-VE-statine-GFP, ou bien de vecteur pcDNA3 (contrôle), à l'aide du réactif EXGEN 500# (EUROMEDEX), selon les recommandations du fabricant. Après 6 h d'incubation, le milieu a été remplacé par du milieu de culture sans sérum et 24 h plus tard, le surnageant de culture contenant la VE-statine sécrétée et le milieu contrôle ont été récoltés. 11) Analyse de la localisation cellulaire de la VE-statine par immunofluorescence Des cellules (35000 cellules 3T3 et H5V) sont ensemencées sur des lames de verre de 14 mm de diamètre ; 24 h plus tard les cellules sont transfectées par 50 ng de l'un des plasmides suivants : pcDNA3-VE-statine-HA, pEGFP--VE-statine, pcDNA3 ou pEGFP-NI (contrôles). A 48 h (24 h post-transfection), les cellules sont lavées avec du PBS, fixées, pendant 20 min à 4 C, dans du PBS contenant 4 % de para-formaldéhyde, puis elles sont conservées dans du PBS (expériences de colocalisation avec les cellules transfectées par pcDNA3-VE-statine-HA) ou bien elles sont colorées pendant 3 min avec du réactif de Hoechst (1 g/ml), rincées, puis les lames sont montées avant d'être analysées (expériences de fluorescence directe avec cellules transfectées par pEGFP-VE-statine ou pcDNA3). Pour les expériences de colocalisation, les cellules conservées dans du PBS sont incubées pendant 10 min dans du PBS contenant 50 mM de NH4CI, perméabilisées pendant 4 min dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100, bloquées pendant 10 min dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre, puis incubées pendant 1 h à température ambiante, avec un anticorps de lapin anti-isomérase à liaison disulfure (1/250, STRESSGEN) et un anticorps monoclonal de souris anti-HA (1/200, BABCO), dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre. Les lames ont ensuite été incubées, pendant 1 h à température ambiante, avec des anticorps secondaires couplés à la rhodamine ou à l'isothiocyanate de fluorescéine (1/500, JACKSON IMMUNORESEARCH LABORATORIES). Les lames sont montées dans du milieu prolong antifade (MOLECULAR PROBES) et observées à l'aide d'un microscope à fluorescence (Axioplan 2, ZEISS). Les images sont enregistrées à l'aide d'un équipement d'enregistrement vidéo (PRINCETON INSTRUMENTS INC.) 12) Analyse de la sécrétion de la VE-statine Des cellules 3T3 (15000 cellules/cm2) ont été ensemencées dans des flasques de culture de 78,5 cm2puis transfectées le lendemain avec 5 g de vecteur recombinant pcDNA3-VE-statine-HA ou pEGFP-VE-statine, ou bien de vecteur pcDNA3 (contrôle), à l'aide du réactif EXGEN 500# (EUROMEDEX), selon les recommandations du fabricant. Après 6h d'incubation, le milieu a été remplacé par du milieu de culture complet. 24 h plus tard, le milieu a été changé à nouveau et les cellules ont été incubées pendant 5 h en présence de bréfeldine A (GolgiPlug@, PHARMINGEN) ou de monensine (GolgiStop, PHARMINGEN). Le surnageant de culture (5 ml) a ensuite été récolté, filtré (0,22 m) et additionné de : désoxycholate de sodium (0,5 %), Ipégal CA630 (1 %), SDS (0,1 %), inhibiteurs de protéases (Compléter, ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) et anticorps polyclonal anti-HA (50 l, EUROGENTEC), puis le mélange ainsi obtenu a été incubé une nuit à 4 C, sous agitation rotative. 50 l de protéine G-Sépharose (Protein-G Sepharose Fast Flow beads, AMERSHAM PHARMACIA) ont ensuite été ajoutés, puis l'incubation a été poursuivie dans les mêmes conditions, pendant 1 h. Les billes ont été lavées 4 fois avec du tampon PBS et lysées dans du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Les échantillons ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (12 % SDS-PAGE) suivi d'un Western-blot, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HA (1/500, EUROGENTEC). La VE-Statine a ensuite été révélée par luminescence, selon les instructions du fabricant (Aurora@, ICN). 13) Analyse de l'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration cellulaire L'effet de la VE-statine sur la prolifération cellulaire a été testé dans les conditions suivantes : des cellules AoSMC ont été ensemencées dans des boîtes de culture (4 cm2, 35000 cellules/cm2) et cultivées pendant 24 h, puis le milieu a été remplacé par du milieu contrôle) ou du milieu contenant de la VE-statine, préparé comme décrit ci-dessus (exemple 1. 10), additionnés de PDGF (PDGF-BB : homodimère de chaînes B ; 50 ng/ml). Chaque jour, les cellules ont été récoltées par trypsination puis dénombrées à l'aide d'un hémacytomètre (Coulter@, COULTRONICS). Alternativement, l'effet de la VE-statine sur la migration cellulaire a été testé par le test de la blessure , dans les conditions suivantes : des cellules AoSMC (50000 cellules) ont été ensemencées dans des boîtes de culture (28 cm2) et cultivées jusqu'à confluence, puis les tapis cellulaires ont été endommagés à l'aide d'une lame de rasoir et rincés 2 fois avec du milieu seul. Les milieux suivants ont été ensuite ajoutés aux cultures : milieu contrôle avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml) et milieu contenant de la VE-statine, avec ou sans PDGF-BB (80 ng/ml). Après 48 h d'incubation, les cellules ont été rincées avec du PBS, fixées pendant 20 min à 4 C avec du PBS contenant 4 % de para-formaldéhyde, rincées à nouveau avec du PBS et observées au microscope. Exemple 2 : Caractérisation des ADNcs VE-statine humains et murins (figures 1 et 2) L'analyse de la séquence 3' non codante de l'ADNc de vezf-1qui code pour l'homologue murin du facteur DBhumain (Xiong et al., Develop. Biology, 1999,206, 123-141) a révélé de façon inattendue, la présence d'une séquence polyA interne, située en aval de la séquence codante de la protéine vezf-1 (positions 2302 à 2336, en référence à la séquence de la figure 4 de Xiong et al., précité), qui pourrait représenter la séquence polyA authentique de vezf-1, immédiatement suivie par un site EcoRI. Ces résultats, indiquent que l'ADNc de 3681 pb décrit par Xiong et al. (précité) pourrait correspondre à la concaténation de deux ADNc correspondant à deux ARNm distincts ; la séquence (1-2336) correspondant à l'ADNc de vezf-1 (mDBl) et la séquence de 1,35 kpb située en aval de la séquence polyA (2302-2336) provenant d'un ADNc distinct de celui de vezf-1(mDBl), ont été vérifiées expérimentalement. D'une part, en dépit de nombreuses tentatives, il a été impossible d'amplifier la séquence complète de 3681 pb correspondant à l'ADNc décrit par Xiong et al.. D'autre part, la preuve formelle a été apportée par l'analyse RT-PCR d'ARN total d'embryon de souris, à l'aide de couples d'amorces s'hybridant de part et d'autre de la séquence polyA 2302-2336 qui a montré qu'il était impossible d'amplifier un fragment chevauchant la séquence polyA 2302-2336 (pistes 2 et 3 de la figure 1). En revanche, des produits correspondant à ceux attendus sont obtenus lorsque l'amplification PCR est réalisée avec deux amorces s'hybridant dans la région en amont (piste 1 de la figure 1) ou en aval (piste 4 de la figure 1) de cette séquence polyA. L'ADNc de 1,35 kpb a été cloné à partir d'une banque d'ovaire de souris et de deux banques d'ADNc embryonnaire, à l'aide d'une sonde d'ADNc d'embryon de souris E10,5 correspondant, soit à la région 3' de l'ADNc vezf-1de 3681 pb (positions 2480-2894, sonde VE-statine), soit à la séquence codante de mDB du même ADNc (positions 1478-2294, sonde contrôle). Parmi 82 des clones d'ADNc complets obtenus, aucun n'hybride à la fois avec la sonde VE-statine et la sonde mDB 1, alors que 40 hybrident avec la sonde mDB et 42 avec la sonde VE-statine. Le clone le plus long qui hybride avec la sonde VE-statine possède une séquence de 1,37 kpb (VE-statine-a : SEQ ID NO: 5 et figure 2). L'analyse 5'-RACE à partir d'une banque d'embryons de souris E11, a permis de confirmer que la séquence de 1,37 kpb correspondrait à un ADNc complet, dénommé VE-statine-a et d'identifier un second ADNc VE-statine (VE- statine-b, 1,4 kpb : ID NO: 6 et figure 2) qui diffère de l'ADNc VE-statine-a au niveau des 169 premières paires de base. Chez l'homme, deux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b ont également été isolés. Le transcrit VE-statine-b complet (SEQ ID NO: 4) a été isolé par 5'RACE, à partir de la séquence partielle (GENBANK NM~016215) ; le produit obtenu contient 236 pb supplémentaires en 5' de la séquence déposée dans GENBANK. La comparaison de la séquence humaine avec les séquences murines (alignement multiple à l'aide du logiciel CLUSTAL.W (1.8)) montre que l'ADNc VEstatine-b humain possède 73 % d'identité avec l'ADNc VE-statine-b murin et 59 % avec l'ADNc VE-statine-a murin. L'ADNc VE-statine-a comprend l'EST BI 910383. Exemple 3 : du gène VE-statine (figure 3, Tableaux 1 et II) Le gène murin a été isolé à partir de deux banques indépendantes d'ADN génomique de souris, sous-cloné et séquence. Il a une taille de plus de 10 kpb et comprend 11 exons et 11 introns (figure 3 et Tableau II), incluant deux exons alternatifs (exon-la et 1b), correspondant respectivement aux transcrits VE-statine-a et VE-statine-b. L'exon 9 peut être épissé de façon alternative, dans la mesure où certains clones d'ADNc montrent des variations au niveau de cet exon. La structure du gène humain présente une organisation similaire à celle du gène murin (figure 3), incluant la plupart des jonctions introns-exons et la présence de courts éléments nucléaires dispersés. Les gènes ont été localisés par hybridation (FISH) à l'aide de sondes du gène VE-statine, sur les chromosomes 9 (9q34. 3-qter) et 2 (2B), respectivement chez l'homme et la souris (figure 3). La cartographie par hybride de radiation (RH mapping) a confirmé la position du gène humain dans la région distale du bras long du chromosome 9, à proximité du marqueur WI-17482, à la position de 151,488 Mb (en référence à la séquence de la base de données UDV http://bioinformatics.weizman.ac.il/udb/ et Santa Cruz : http://genome.ucsc.edu). Par comparaison, le gène dbl humain a été localisé sur le chromosome 17 (numéro d'accès Genbank NT 010651) et le gène db1murin sur le chromosome 11, confirmant davantage que les gènes dbl et VE-statine sont des gènes distincts. Les sites d'initiation de la transcription des transcrits VE-statine ont été précisés par des analyses complémentaires de celle effectuée par 5'RACE, à savoir : des essais d'extension d'amorce et de protection à la RNase, à partir d'ARN total de c#ur d'embryon ou de cellules endothéliales (H5V) et des fragments génomiques correspondant à la VE-statine-a et à la VE-statine-b. Ces expériences ont montré que le transcrit VE-statine-a possédait plusieurs sites d'initiation de la transcription, le transcrit le plus long couvrant environ les 75 bases en amont de la première base identifiée, les sites d'initiation se répartissent sur environ 60 pb (figure 4C). Ce variant est exprimé à des niveaux beaucoup plus faibles que le transcrit VEstatine-b, et ce à la fois dans les cellules endothéliales et chez l'embryon (figure 4C). En revanche, le transcrit VE-statine-b présente un site unique de transcription vraisemblablement en raison de la présence d'une boîte CATAAAAAGC, située 42 paires de bases en amont de la première base du transcrit (figure 4C). Exemple 4 : Mise en évidence de l'expression spécifique de la VE-statine dans les cellules endothéliales (figures 4 et 5) L'expression de la VE-statine (transcrits VE-statine-a et VE-statineb) a été analysée par RT-CPR à partir de différentes lignées cellulaires in vitro. Les 2 variants sont exprimés dans les cellules endothéliales (EOMA, H5V et 1G11) mais pas dans les fibroblastes (353 et L 929), (figure 4B). Par comparaison, mDBl est exprimé à un niveau équivalent dans toutes les lignées testées. L'expression des transcrits VE-statine-a et VE-statine-b a également été analysée par Northern-Blot dans les tissus adultes, à l'aide de sondes correspondant à la région 5' spécifique de chaque ADNc. Un transcrit majeur de 1,6 kb est reconnu par chacune des sondes (figure 4A) ; cette taille correspond à celle des ADNcs de la VE-statine. L'expression de la VE-statine-a et-b est détectée à des niveaux élevés dans le c#ur, les poumons et les reins et dans ces conditions, elle n'est pas détectable dans les autres tissus (figure 4A). Le profil d'expression du gène VE-statine a également été analysé par hybridation in situ chez l'embryon de souris et comparé à celui du gène dbl et de celui du facteur endothélial spécifique vegfr-2, utilisé comme contrôle de l'expression mésodermique précoce puis endothéliale spécifique. A E7,5, l'expression du gène VE- statine est détectée exclusivement dans les îlots sanguins primitifs dans lesquels se différencient les premières cellules endothéliales. En revanche, dbl n'est pas détecté dans ces îlots sanguins primitifs, et comme cela a déjà été montré, l'expression de vegfr-2 est détectée à la fois dans les îlots sanguins primitifs et dans le mésoderme intra-embryonnaire (Breier et al., Blood, 1996,87,630-641 ; Yamaguchi et al., Development, 1993,118, 489-498). A E10,5, l'expression du gène VE-statine se superpose à celle de vegfr-2 dans les cellules endothéliales de la veine et de l'artère ombilicale, des artères des 3ième et 4ième arcs branchiaux, de l'aorte dorsale, et du mésenchyme céphalique (figure 5). Comme cela a été montré pour le gène humain, l'expression de dbl est ubiquitaire à ce stade du développement embryonnaire chez la souris, avec une expression plus élevée dans l'épithélium neural (figure 5) mais n'est jamais détectée dans les vaisseaux sanguins en formation. A 13,5 jours post-conception, le profil d'expression du gène VE-statine est toujours restreint aux cellules endothéliales, comme le montre son expression dans le mésenchyme facial, le cerveau, le foie, l'endocarde, les poumons et le réseau vasculaire péri-costal, ou dans la couche pigmentaire de la rétine (figure 5). Le profil d'expression du gène VE-statine a également été étudié après la naissance, dans le rein, dans la mesure où les vaisseaux sanguins se développent encore et se remodèlent dans cet organe. Chez les nouveaux-nés âgés de 3 jours, l'expression du gène VE-statine est restreinte strictement à l'endothélium. De façon intéressante, le gène VE-statine est exprimé à la fois dans les veines et les artères (figure 5), ce qui indique que son expression n'est pas restreinte au réseau vasculaire artériel ou veineux, à ce stade. L'expression du gène VE-statine est également détectée dans les capillaires glomérulaires péri-lobulaires et fenestrés et dans les artères arquées et interlobulaires, indiquant que, dans cet organe, son expression n'est pas associée à un type particulier de vaisseaux. Chez la femelle gestante, l'expression du gène VE-statine a également été détectée dans les vaisseaux sanguins de la décidue du mésomètre de l'utérus. De façon intéressante, l'expression du gène vegfr-2 a été détectée à des niveaux beaucoup plus faibles dans cet organe. Exemple 5 : de la protéine VE-statine (figures 2 et 6A) Le codon d'initiation de la traduction de la protéine VE-statine a été localisé aux codons AUG281-283 et AUG309-311, de respectivement le transcrit VEstatine-a murin et humain, du fait de l'identification des éléments suivants : - la présence d'une séquence minimale d'initiation de la traduction (séquence de Kozak ; J. Cell. Biol., 1989,108, 229-241) dans les deux espèces, - la présence de codons stops dans les autres cadres ouverts de lecture, et - le degré élevé de similarité (79% d'identité) entre les séquences humaines et murines, à partir de ce point (figure 2). Ces cadres ouverts de lecture sont traduits en protéines de 275 (SEQ ID NO: 1) et 273 acides aminés (SEQ ID NO: 42) respectivement chez la souris et l'homme, correspondant à des poids moléculaires estimés de 29,8 kDa et 29,6 kDa. Des expériences de traduction in vitro ont permis de vérifier que ces cadres ouverts de lecture étaient fonctionnels ; les ADNc VE-statine-a et VE-statine-b sont tous les deux traduits en une protéine majeure d'environ 30 kDa, correspondant au poids moléculaire attendu d'après la séquence codante (figure 6A) ; aucun autre produit spécifique n'a été détecté. Les séquences humaines et murines présentent 78 % d'identité et 87 % de similarité entre elles. La recherche dans les bases de données de domaines analogues à ceux d'autres protéines a mis en évidence la présence : d'un peptide signal clivable de 19 et 20 acides aminés situé à l'extrémité NH2-terminale des séquences respectivement humaines et murines et de deux domaines semblables aux domaines du facteur de croissance épidermique (EGF-like domains) caractérisés par la conservation des résidus de cystéine essentiels desdits domaines EGF-like (figure 2). Aucune ressemblance entre la VE-statine et des facteurs connus n'a été identifiée. Exemple 6 : Analyse de l'expression, la localisation et la sécrétion de la VEstatine (figures 6B, 6C, 6D) Les analyses ont été réalisées à partir de cellules transfectées par les vecteurs recombinants pEGFP-VE-statine et pcDNA3-VE-statine-HA, qui surexpriment la VE-statine sous la forme d'une protéine de fusion avec la GFP ou l'épitope HA de l'hémagglutinine du virus influenza (figure 6B). La localisation cellulaire des protéines de fusion a été analysée par immunofluorescence dans des cellules endothéliales (1G11) et fibroblastiques (3T3, figure 6C). La VE-statine empêche la migration de la GFP dans le noyau (figure 6C, panneau de gauche) et des expériences de co-immunofluorescence, respectivement avec un anticorps anti-vinculine et anti-cytochrome C, montrent que la VE-statine n'est ni associée avec le cytosquelette, ni avec les mitochondries. En revanche, la VEstatine est présente dans le réticulum endoplasmique, comme le montre sa co-localisation avec l'isomérase à liaisons disulfures qui est un marqueur spécifique de ce compartiment (figure 6C, panneau de droite). Dans la mesure où la VE-statine (humaine et murine) possède un peptide signal, la présence de cette protéine, à la surface de la membrane plasmique et dans le milieu extracellulaire a été analysée de la façon suivante : - la présence de la VE-statine à la surface cellulaire a été vérifiée à partir de cellules 3T3 transfectées par le plasmide pcDNA3-VE-statine-HA, marquées à la biotine à l'aide d'un agent de couplage incapable de traverser la membrane plasmique (sulfo-NHS-biotine). Après solubilisation, les protéines membranaires (marquées à la biotine) ont été immunoprécipitées à l'aide de billes de streptavidine. Dans ces conditions, la VE-statine n'est pas détectable dans le matériel immunoprécipité, indiquant qu'elle n'est pas exposée à la surface des cellules. - la présence de la VE-statine dans le milieu extracellulaire a été analysée à partir de cellules transfectées dans les mêmes conditions, puis le surnageant de culture a été récolté 48 h après la transfection et analysé par immunoprécipitation. Dans ces conditions, la VE-statine est sécrétée dans le milieu extracellulaire (figure 6D, panneau de gauche), cette sécrétion est partiellement ou fortement inhibée en présence d'inhibiteurs de la sécrétion, respectivement la monensine et la bréfeldine A. Les résultats illustrés dans la figure 6 (6B, 6C ET 6D) démontrent que la VE-statine est produite dans les cellules, sous la forme d'un facteur soluble sécrété dans le milieu extracellulaire selon la voie classique de sécrétion des protéines. Le poids moléculaire apparent de la VE-statine sécrétée est supérieur au poids moléculaire apparent prédit à partir de sa composition en acides aminés, ce qui indique que la VE-statine subit des modifications post-traductionnelles au cours de la sécrétion. Exemple 7 : Analyse de l'effet de la VE-statine sur la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses (figure 7) L'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses a été testé à l'aide de VE-statine recombinante, produite comme décrit à l'exemple 1.10 et de cultures primaires de cellules musculaires lisses aortiques humaines (AoSMC), dans les conditions telles que décrites à l'exemple 1.13. De manière plus précise, l'effet de la VE-statine sur la prolifération des cellules musculaires lisses a été analysée sur des cellules AoSMC ensemencées à faible densité et cultivées pendant 8 jours dans du milieu contrôle ou dans du milieu contenant de la VE-statine, en présence ou en l'absence de PDFG-BB ; le PDGF-BB étant ajouté pour maintenir la stimulation de la prolifération. Les résultats montrent que la VE-statine n'a pas d'effet sur la croissance des cellules AoSMC, en présence ou en l'absence de PDGF-BB, comme le démontre la superposition parfaite des courbes de croissance des cellules traitées et non traitées par la VE-statine (figure 7A). L'effet de la VE-statine sur la migration des cellules musculaires lisses a été analysé à l'aide du test de la blessure , sur des cultures confluentes de cellules AoSMC. Les résultats montrent qu'après deux jours de culture dans du milieu contenant de la VE-statine, la migration est réduite à celle observée avec le milieu de base et le PDGF-BB n'a quasiment pas d'effet sur la migration des cellules AoSMC (figures 7B et 7C). Par comparaison, la migration en présence de milieu contrôle, avec et sans PDGF-BB est respectivement 3,4 fois et 2 fois plus importante qu'en présence de VE-statine (figures 7B et 7C). Des résultats similaires ont été obtenus par le test de la chambre de Boyden. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Utilisation d'une protéine dénommée VE-statine, sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence SEQ ID NO: 1 qui correspond à la VE-statine murine, - les séquences présentant - sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1-, au moins 70 % d'identité ou au moins 85 % de similarité, de préférence au moins 80 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, et de manière préférée au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275,19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, - les séquences SEQ ID NO: 2 et 3, correspondant respectivement à la VE-statine murine et humaine mature, - la séquence SEQ ID NO: 42 correspondant au numéro d'accès NCBI NP 057299, correspondant à la VE-statine humaine et, - les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273,18 à 273, 19 à 273,20 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. 2 ) Protéine isolée et purifiée, dénommée VE-statine, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : @ - la séquence SEQ ID NO: 1 qui correspond à la VE-statine murine, et - les séquences présentant - sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1-, au moins 70 % d'identité ou au moins 85 % de similarité, de préférence au moins 80 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, et de manière préférée au moins 95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion des séquences présentant le numéro d'accès AAF01322, NP-057299 BAB22222 et AAH12377 dans la base de données du NCBI. 3 ) Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est une protéine de mammifère. 4 ) Protéine selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275,19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQIDNO: 1, et - les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273,18 à 273,19 à 273, 20 à 273, 21 à 273, 22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42. 5 ) Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 2 et 3. 6 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la protéine selon l'une quelconque des revendications 2 à 5. 7 ) Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences codant pour la protéine selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, - la séquence SEQ ID NO : 4 codant la VE-statine humaine telle que définie à la revendication 1, et - les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. 8 ) Molécule d'acide nucléique isolée selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences SEQ ID NO: 5 et 6, - la séquence située entre les positions 85512 et 98730 de la séquence présentant le numéro d'accès AL590226 dans la base de données GENBANK, et - la séquence située entre les positions 4060576 et 4072108 de la séquence présentant le numéro d'accès Mm2~WIFeb01~25 dans la base de données GENBANK. 9 ) Sonde ou amorce, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un fragment d'au moins 8 pb de la molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou la revendication 8, à l'exclusion de l'EST présentant le numéro d'accès BI910383 dans la base de données du NCBI et du fragment d'ADNc présentant le numéro d'accès NM~016215 dans la base de données du NCBI. 10 ) Sonde ou amorce, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces de séquence SEQ ID NO: 7 à 30. 11 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 7 ou la revendication 8 et leurs fragments tels que définis à la revendication 9. 12 ) Cellules, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant selon la revendication 11. 13 ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre la protéine selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 ou le peptide selon la revendication 6. 14 ) Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : une protéine selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, un peptide selon la revendication 6, une molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou la revendication 8 et un vecteur recombinant selon la revendication 11. 15 ) Mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou la revendication 8. 16 ) Méthode de criblage d'un agoniste ou d'un antagoniste d'une protéine l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de cellules musculaires lisses périvasculaires, avec une protéine selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, et une substance à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance à tester sur la migration desdites cellules musculaires lisses, et c) la sélection des substances capables d'augmenter ou de diminuer la migration desdites cellules musculaires lisses, par rapport au contrôle.