Brevet FR2854026A1 — publié le 20041029

i La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de plantes recombinantes du genre Cichorium aptes à la culture par forçage, et possédant un phénotype déterminé par l'expression d'une combinaison de caractères phénotypiques dérivés de Cichorium intybus L et de Cichorium endivia L, respectivement. Les plantes de l'espèce Cichorium intybus L aptes à la culture par forçage, aussi désignées endives, sont répandues dans toute l'Europe et les régions tempérées d'Asie. Il s'agit d'une plante très rameuse, à rameaux raides et écartés les uns des autres. Les feuilles inférieures sont 10 ordinairement divisées, à lobes ou segments disposés des deux côtés, écartées ou souvent renversées, avec un lobe terminal; les feuilles situées plus haut sont entières, embrassant la tige par leur base, et les feuilles supérieures sont réduites à des bractées relativement très petites. Les cellules parenchymateuses des racines élaborent des holosides (amidon, 15 inuline, etc.) à partir de substances provenant des organes verts o elles ont été synthétisées. Au cours de la phase de croissance, les racines se renflent constamment par suite d'une hyperplasie de leurs parenchymes, à l'intérieur desquels s'accumulent des holosides, afin de former des racines tubérisées. L'aptitude de l'espèce Cichorium i ntybus L, et plus spécifiquement de certaines variétés de cette espèce, telle que les variétés de type Witloof, à produire des racines tubérisées rend ces plantes aptes à être cultivées dans l'obscurité par " forçage ". La culture, pour un forçage de 21 jours, consiste à faire croître les endives dans des bacs contenant une solution 25 nutritive amenée à une température d'environ 180C à 210C avec simultanément une température de l'air de 1VC à 30C inférieure à la température de la solution nutritive. Les endives sont cultivées par forçage dans l'obscurité afin de provoquer un étiolement des feuilles dans le but de produire des plantes matures essentiellement blanches dont seul le bord 30 extérieur des feuilles possède une légère coloration jaune. Les producteurs d'endives sont à la recherche de nouveaux produits pour diversifier leur offre et leur permettre de présenter une gamme variée d'endives aux consommateurs finals. La production d'endives par forçage est réalisée classiquement à 35 grande échelle dans des salles ou sont empilés des bacs dans lesquels sont placées les racines d'endives qui baignent dans une solution nutritive, dans des conditions d'obscurité, des conditions de température de la solution et de l'atmosphère, et des conditions d'hygrométrie contrôlées de manière précise. Ainsi, la culture de l'endive par forçage nécessite des 5 investissements financiers lourds en moyens matériels et humains afin de réaliser les différentes étapes respectives de semis, de récolte des racines et de leur forçage en salle de culture, afin de produire des endives à grande échelle. La culture des endives par forçage est destinée à produire les 10 chicons qui seront commercialisés. Les chicons sont essentiellement constitués de feuilles étiolées à l'obscurité, issues du collet de la racine. Les cycles de forçage suivent des conditions de culture, des cycles et des calendriers très précis et planifiés afin d'optimiser les coûts de production. Pour pouvoir mettre à la disposition du public une gamme nouvelle et 15 variée de plantes dérivées de l'endive, qui puisse être commercialisée à des coûts raisonnables, il est nécessaire que les plantes nouvelles soient adaptées aux conditions de production qui sont conventionnellement utilisées pour l'endive. En effet, de nouveaux investissements industriels, qui devraient être spécifiquement adaptés à la production de nouvelles 20 plantes du genre Cichorium ne seraient pas économiquement compatibles avec le marché. Toute nouvelle variété destinée à être produite par forçage doit en conséquence pouvoir s'intégrer dans le système de production déjà mis au point pour l'endive. A la connaissance du demandeur, il n'a jamais été décrit dans l'état 25 de la technique de procédé de recombinaison entre Cichorium Intybus L à racines tubérisées et Cichorium endivia L ayant abouti à la production de plantes utilisables commercialement et possédant une combinaison de caractères phénotypiques exprimés à partir des caractères génétiques de chacune des lignées parentales initiales. Des hybrides inter-spécifiques de génération Fl entre Cichorium intybus L et Cichorium endivia L ont déjà été décrits dans l'état de la technique. On peut citer en particulier l'hybridation réalisée en 1953 par Charles RICK (1953, Proceedings of the American Society for Horticultural Science, vol.61: 459-466), qui a décrit des événements d'hybridation en 35 champ entre ces deux espèces. RICK décrit aussi l'obtention de plantes de génération F2 produites par autofécondation des plantes de génération F1 en champ. RICK observe une très grande variabilité des caractères phénotypiques exprimés par les plantes de génération F2, notamment en ce qui concerne leur vigueur. Cet auteur en conclut que les nombreuses 5 combinaisons de gènes provenant respectivement de la chicorée et de l'endive ne sont pas " harmonieuses " car elles réduisent de manière considérable le niveau de fertilité et de vigueur. Selon RICK, il existe une barrière génétique quasi-infranchissable entre la Cichorium intybus L. et Cichorium endivia, bien qu'un échange de gènes entre les deux espèces ait 10 pu être exceptionnellement observé (voir page 464 de Rick, 1953). RICK observe aussi que les différences entre les deux génomes, respectivement de Cichorium intybus L et de Cichorium endivia L sont suffisantes pour provoquer des méioses imparfaites et des stérilités dans les descendances par autofécondation. Les plantes hybrides de génération F1 du type " Castel Franco " ont longtemps été considérées comme le seul exemple d'échange de gènes entre ces deux espèces, par hybridation accidentelle, au 16ème siècle en Italie (Annemieke M Kiers: Endive, Chicory and their wild relatives. Gorteria Supplément 5, Juillet 2000). Les études moléculaires récentes (Kiers, 20 2000), montrent que les deux espèces ne sont pas apparentées et que le type Castel Franco se rattache à Cichorium intybus L. On a aussi décrit dans l'état de la technique un hybride de génération F1 entre Cichorium intybus L et Cichorium endivia L, qui a ensuite été propagé exclusivement in vitro par clonage, notamment aux fins 25 d'études d'embryogenèse (Blervaq A.S. et al., 1995, Protoplasma, vol.186:163-168). On a aussi montré que des plantes hybrides de génération F1 entre Cichorium intybus L et Cichorium endivia L présentaient un caractère phénotypique de résistance au virus de la mosaïque du navet (TuMV), vraisemblablement du fait de la dominance de 30 gènes de résistance au TuMV provenant de Cichorium intybus L (Providenti et al., 1979, J. Amer. Soc. Hort. Sci., vol.104 (6): 726-728). Il résulte de l'analyse qui précède qu'à la connaissance du demandeur, aucune chicorée à forcer issue de la recombinaison génétique entre Cichorium intybus L et Cichorium endivia L n'a été décrite à ce jour. Il 35 existait même un préjugé technique de l'homme du métier à l'encontre de l'obtention avec succès de plantes recombinantes entre ces deux espèces, et plus particulièrement des plantes recombinantes susceptibles de constituer des produits intermédiaires en vue de la sélection de variétés recombinantes à racines tubérisées, aptes à la culture par forçage et 5 possédant des caractéristiques techniques de vigueur et de fertilité permettant leur exploitation industrielle comme plantes légumières. il n'a pas été décrit, jusqu'à aujourd'hui, un procédé d'obtention de plantes recombinantes du genre Cichorium issues d'un croisement initial entre ces deux espèces, et dont l'ordre et la nature des étapes du procédé 10 auraient permis d'atteindre un tel objectif. Un tel procédé d'obtention de plantes recombinantes entre Cichorium intybus L et Cichorium endivia L à racines tubérisées, et aptes à la culture par forçage, est désormais fourni selon l'invention. Plus précisément, le demandeur s'est attaché à mettre au point un 15 procédé d'obtention de telles plantes recombinantes du genre Cichorium, qui comprend à la fois des étapes de croisement et de culture en champ ainsi que des étapes de culture et de clonage in vitro. En particulier, les étapes de culture et de clonage in vitro, essentielles pour la réalisation du procédé de l'invention, permettent de surmonter les nombreuses difficultés 20 techniques rencontrées du fait d'une infection massive des plantes recombinantes des premières générations par divers pathogènes bactériens et fongiques. L'invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une plante recombinante du genre Cichorium possédant des racines tubérisées, 25 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) réalisation d'un croisement entre une série de plantes femelles d'une variété de l'espèce Cichorîum intybus L possédant des racines tubérisées et d'une série de plantes mâles d'une variété de l'espèce Cichorium endivia L et obtention d'une population de plantes hybrides de 30 génération Fl issues dudit croisement, b) réalisation d'une autofécondation des plantes hybrides de génération Fl obtenues à l'étape a) et obtention de plantes recombinantes de génération F2 issues dudit croisement; c) sélection des plantes recombinantes de génération F2 dont les 35 bourgeons ou les racines ne possèdent pas d'altérations visibles dues à une infection virale, bactérienne ou fongique, notamment par Erwinia carotovora, par Scierotinia Sclerotiorum, ou encore par Phytophtora cryptogea; d) Forçage des plantes recombinantes de génération F2 5 sélectionnées à l'étape c) pendant une durée de 10 à 18 jours dans les conditions suivantes de forçage: température de la solution nutritive: 1 50C à 1 70C; - température de l'atmosphère: 150C à 170C; e) clonage des plantes F2 obtenues à la fin de l'étape d) et obtention 10 de bourgeons régénérés; f) repiquage des bourgeons régénérés sur un milieu de culture approprié jusqu'à l'obtention de plantules recombinantes. A l'étape a) du procédé, on réalise un croisement " manuel " entre une série de plantes femelles d'une variété de l'espèce Cichorium intybus L 15 possédant des racines tubérisées et aptes au forçage et une série de plantes mâles d'une variété de l'espèce Cichorium endivia L. Toute variété de l'espèce Cichorium intybus L peut être utilisée à l'étape a) du procédé. Notamment, l'homme du métier peut avantageusement avoir recours 20 à la variété de Cichorium intybus L désignée " VIDENA ", qui est apte au forçage hydroponique. La variété VIDENA est accessible au public auprès de la Collection Nationale du Groupe d'Etudes et de contrôle des Variétés Et des Semences (GEVES, Domaine de la Boisselière, 49250, Brion, France), sous la référence " Ref 500 " et le numéro d'accès No 925. A l'étape a) du procédé, toute variété de Cichorium endivia L peut être utilisée. Toutefois, l'homme du métier aura avantageusement recours à la lignée " Grosse Pommant Seule ", qui est accessible au public auprès de la Collection Nationale du GEVES ( Brion, France) sous la référence " Ref 13746 " et le numéro d'accès N0 693. A la fin de l'étape a), on obtient une série de plantes hybrides de génération Fl issue du croisement inter-spécifique décrit ci-dessus. A l'étape b) du procédé, on réalise un croisement par autofécondation des plantes hybrides de génération Fl obtenue à l'étape a). L'auto-fécondation est avantageusement réalisée de manière 35 conventionnelle, dans une enceinte fermée et en présence d'insectes, par exemple des mouches, l'autofécondation étant alors effectuée par le transport, par lesdits insectes, des gamètes mâles prélevés sur les fleurs des plantes hybrides de génération F1 jusqu'aux organes reproducteurs femelles des plantes hybrides de génération Fl voisines, avec lesquels les 5 gamètes mâles sont mis en contact. L'homme du métier peut avantageusement avoir recours à la technique classique d'autofécondation décrite par Hayes et al. (Methods of plant breeding, Mc Grow-Hill Book Company, 1955, Chapitre 5, pp 80-93) pour l'oignon, cette technique étant directement applicable à l'autofécondation de plantes du genre Cichorium. 10 On obtient des semences F2 issues de l'autofécondation des plantes hybrides de génération Fl. A la fin de l'étape b) du procédé, on obtient des plantes recombinantes de génération F2, à partir des semences F2 ci-dessus. A la fin de l'étape b), le demandeur a observé que, très rapidement, 15 de nombreuses plantes recombinantes de génération F2 étaient déficientes et sont mortes. De nombreuses autres plantes de génération F2 se sont révélées extrêmement sensibles à divers pathogènes bactériens ou fongiques, notamment vis-à-vis des bactéries Erwinia carotovora et les champignons Sciérotinia sclerotiorum et Phytophthora cryptogea. En effet, l'arrachage des racines des plantes de génération F2 obtenues à la fin de l'étape b) du procédé a montré que les racines de Cichorium endivia L ainsi qẻ le matériel issu du croisement interspécifique était beaucoup plus sensible aux Sciérotinia sclerotiorum que les racines de Cichorium intybus L. Les racines de Cichorium intybus L étaient elles25 mêmes contaminées par les plantes voisines malades. En conséquence, l'étape c) du procédé a consisté en une sélection des plantes recombinantes de génération F2 obtenues à la fin de l'étape b) pour lesquelles les bourgeons ou les racines ne possédaient pas d'altération visible à l'oeil due à une infection virale, bactérienne ou 30 fongique, notamment par Erwinia carotovora, par Sclérotinia sclerotiorum ou encore par Phytophthora cryptogea. A l'étape d), les racines des plantes recombinantes de génération F2 sélectionnées à l'étape c) ont été cultivées par forçage dans des conditions non conventionnelles qui ont été spécifiquement adaptées afin d'obtenir, à la fin de l'étape d) de forçage, des plantules recombinantes de génération F2 sensiblement exemptes d'une infection bactérienne ou fongique. Les conditions spécifiques de l'étape d) de forçage consistent en une combinaison de caractéristiques techniques de durée et de température. Dans les conditions de températures prescrites, le demandeur a observé que l'étape d) de forçage pouvait être réalisée pendant une durée allant de 10 à 18 jours de forçage, une telle durée permettant à la fois l'obtention de plantules suffisamment développées pour être clonées à l'étape suivante e) tout en restant sensiblement exemptes d'altérations 10 visibles à l'oeil provoquées par des infections par des pathogènes, surtout des bactéries ou des champignons. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la durée de l'étape d) de forçage est comprise entre 11 et 17 jours, des résultats encore plus avantageux étant obtenus avec une durée de forçage variant de 12 à 16 jours. Pour l'obtention de conditions optimales 15 de croissance des plantules recombinantes sans altération notable due à une infection bactérienne ou fongique, la durée de l'étape de forçage est de préférence comprise entre 13 et 15 jours et est de manière tout à fait préférée de 14 jours, au lieu d'un cycle classique de forçage de 21 jours. L'étape de forçage d) est réalisée avec une solution nutritive de 20 forçage conventionnelle qui est maintenue à une température allant de 15'C à 17'C, de préférence allant de 15,50C à 16,50C, la température optimale étant de 160C, au lieu des températures allant de 180C à 21OC appliquées pour une culture par forçage conventionnelle. Simultanément, la température de l'atmosphère, c'est-à-dire de l'air ambiant, est identique à 25 celle à laquelle est maintenue la solution nutritive, c'est-à-dire allant de 150C à 170C, avantageusement de 15,50C à 16,50C et est de manière tout à fait préférée de 160C. La durée courte et les températures particulièrement basses utilisées pour l'étape d) de forçage ont permis, de manière surprenante, l'obtention 30 de plantules ayant des caractéristiques de qualité sanitaire suffisantes pour que ces plantules soient subséquemment clonées in vitro. Les autres conditions de l'étape d) de forçage, notamment la composition de la solution nutritive,. sont conventionnelles. Elles sont décrites notamment par Leteinturier et aI. (L'endive-Guide Pratique. édition 35 du CTIFL, Septembre 1991, pages 71. De préférence, selon le procédé de l'invention, après sélection des plantes hybrides de génération F2 à l'étape c), l'étape d) de forçage est précédée d'une étape cl) au cours de laquelle les racines sélectionnées à l'étape c) ont été traitées par trempage dans une solution désinfectante 5 contenant une combinaison d'agents anti-bactériens et anti-fongiques. Avantageusement, l'homme du métier a recours à la procymidone (Sumisclex liquide, commercialisée par la société SOPRA), notamment à la concentration finale de 60 g/hL, pour inhiber la croissance de Sciérotinia, et au mancozèbe (Dithane DG, commercialisé par la société ROHM & HAAS), 10 notamment à la concentration de 400g/hl, pour inhiber la croissance de Phytophtora. A la suite de l'étape d) de forçage ci-dessus, les chicons juvéniles ainsi obtenus sont avantageusement sélectionnés avant l'étape suivante e) de clonage, sur des critères d'expression de caractères phénotypiques 15 retrouvés dans la population très diverse et peu homogène de plantes recombinantes de génération F2. Ainsi, la population de plantules de génération F2 obtenue à la fin de l'étape d) de forçage est très hétérogène. Cette population recombinante F2 comprend des plantules de caractères phénotypiques très variés, certaines 20 plantules ayant des caractères phénotypiques tels qu'elles sont plutôt apparentées à la lignée parentale Cichorium intybus L, d'autres possédant des caractères phénotypiques tels qu'elles sont plutôt apparentées à la lignée parentale Cichorium endivia L. Toutefois, l'ensemble des plantules recombinantes de génération F2 25 ayant subi l'étape d) de forçage après sélection ont toutes en commun de posséder des racines tubérisées, ce qui les rend aptes à une culture par forçage, ce qui est l'objectif poursuivi par l'invention. Le caractère recombinant de possession de racines tubérisées a été apporté initialement par le génome du parent Cichorium intybus L. L'ensemble des plantules 30 recombinantes retenues de génération F2 ont aussi toutes en commun de posséder des feuilles découpées. Le caractère recombinant de possession de feuilles découpées a été apporté initialement par le génome du parent Cichorium endivia L. Cette combinaison de caractères phénotypiques que possèdent toutes les plantes recombinantes retenues de génération F2 qui 35 ont été obtenues selon le procédé de l'invention permettent de définir, de manière générale, les plantes recombinantes obtenues à la fin de l'étape f) du procédé, aussi bien que les plantes recombinantes susceptibles d'être obtenues à la suite d'étapes additionnelles du procédé, comme les étapes g) à j) qui sont décrites plus loin dans la présente description. Les plantes de génération F2 obtenues dès la fin de l'étape b) du procédé selon l'invention consistent en des plantes recombinantes, c'est à dire en des plantes, lesquelles, après de multiples événements de recombinaison entre l'ADN provenant de Cichorium intybus L. et l'ADN provenant de Cichorium endivia L., possèdent un génome recombiné de 10 même ploïdie que la ploidie de chacune des deux plantes parentes. Le génome recombiné des plantes de génération F2 selon l'invention exprime ainsi des combinaisons de caractères phénotypiques, certains caractères phénotypiques étant retrouvés initialement chez Cichorium intybus L., et certains caractères phénotypiques étant retrouvés initialement chez 15 Cichorium endivia L. Ainsi, selon le procédé, l'étape de forçage d) est suivie d'une étape dl) au cours de laquelle les chicons juvéniles obtenus sont sélectionnés avant l'étape e) de clonage, selon les trois classes de phénotypes suivants: (i) PPI: très nombreuses feuilles étroites sur un collet de racine en 20 plateau; (ii) GPI: typologie proche de l'endive, mais avec une feuille étroite et découpée. (iii) TFR et SCA: feuilles ramifiées très dentées. Les plantes recombinantes de génération F2 selon la classe de phénotype (iii) ci-dessus possèdent toutes des axes secondaires à l'axe principal de la feuille, comme cela est illustré dans le schéma général de la figure 1, ce qui est une caractéristique qui n'est jamais observée chez les Cichorium intybus L. Chez certains génotypes d'endive, telles que les 30 endives de génotype " Barbe de Capucin ", on peut observer que le bord du limbe peut porter des découpures de faible profondeur, c'est à dire dont le rapport entre (i) la profondeur de la découpure et (ii) la longueur entre la pointe de la découpure et l'axe de la feuille ne dépasse pas. 0,25 (voir figure 1), alors que ce rapport est considérablement plus élevé dans les plantes 35 recombinantes de génération F2 selon l'invention. De plus, chez ces génotypes d'endive telle que la Barbe de Capucin, les découpures ne sont présentes que dans le tiers supérieur de la feuille. Les trois classes de plantes recombinantes de génération F2 obtenues de manière reproductible à l'issue de l'étape d) du procédé selon l'invention 5 sont décrites plus en détails ci-dessous, en référence à la mesure de plusieurs caractères phénotypiques qui permettent de les définir, qui sont représentées sur la figure 1, et qui sont respectivement les caractères suivants: - Axe principal (1) et axes secondaires de la feuille (2); 10 Largeur de la base de la feuille (3); - Hauteur de la feuille (4); Profondeur de la découpure (5) et longueur entre la pointe de la découpure à l'axe de la feuille (6); - Présence d'une dentelure secondaire (7). Description de la classe de plantes recombinantes PPI: - Pus de 100 feuilles par racine à l'issu du forçage (caractère recombinant provenant de C endivia L. ), contre 20 à 35 au maximum chez une endive classique; Pas d'axe secondaire; - Base de chaque feuille très étroite: rapport largeur de la base de la feuille / hauteur de la feuille allant de 0,06 à 0,10 contre 0,25 au minimum pour une endive classique; - Découpures profondes du limbe: rapport profondeur de la découpure I longueur de la pointe de la découpure à l'axe de la feuille allant de 0, 60 à 0,85, contre un rapport allant de 0 à 0,25 pour certains génotypes de C intybus L.; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; La coloration des nervures est blanche ou rouge; 30 - La coloration du limbe est jaune ou rouge; Description de la classe de plantes recombinantes GPI: - De 20 à 35 feuilles obtenues par racine à l'issu du forçage, comme pour une endive classique - Pas d'axe secondaire; Découpures profondes du limbe jusqu'à la base de la feuille: rapport profondeur de la découpure / longueur de la pointe de la découpure à l'axe de la feuille allant de 0,60 à 0,85, contre un rapport allant de 0 à 0,25 pour certains génotypes de C intybus L.; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; - La coloration des nervures est blanche ou rouge; - La coloration du limbe est jaune ou rouge; Description de la classe de plantes recombinantes TFR et SCA: Description de la classe produit TFR: - De 20 à 35 feuilles obtenues par racine à l'issu du forçage, comme une endive classique; - 2 à 5 axes secondaires à l'axe principal naissant dans la moitié basale de la feuille; - Découpures profondes du limbe: rapport profondeur de la découpure / longueur de la pointe de la découpure à l'axe de la feuille allant de 0, 60 à 0,85; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; - La coloration des nervures est blanche ou rouge; 20 - La coloration du limbe est jaune ou rouge; Description de classe produit SCA: La définition est proche de celle des plantes recombinantes de la classe TFR. Les découpures sont peu profondes et les dentelures quasi-inexistantes. Comme pour les TFR, la caractéristique majeure est la présence l'axes secondaires ( caractéristiques uniquement trouvées chez certaines C endivia L. et jamais chez C intybus L.) La population de plantes recombinantes F2, ainsi que les souspopulations de plantes recombinantes F2 sélectionnées selon les trois classes de phénotypes (i) à (iii) cidessus ne sont pas homogènes dans l'expression d'autres caractères phénotypiques que ceux qui ont été indiqués ci-dessus. Par exemple, les sous-populations de plantes 35 recombinantes F2 (i) à (iii) comprennent elles-mêmes une grande diversité phénotypique entre elles, étant entendu qu'elles possèdent néanmoins en commun les caractères phénotypiques sur la base desquels elles ont été catégorisées dans la même classe. De plus, le demandeur a pu observer que l'expression des 5 caractères phénotypiques, autres que ceux sur la base desquels avaient été sélectionnées les différentes plantes F2, n'était pas stable au cours des générations successives, c'est-à-dire au cours des cycles successifs de reproduction, y compris par auto-fécondation des sous-populations (i) à (iii) définies ci-dessus. A l'étape e) du procédé, la population de plantes recombinantes de génération F2, ou encore les sous-populations de classes de phénotypes (i) à (iii) définies ci-dessus, sont clonées en vue de l'obtention de bourgeons régénérés. La sélection phénotypique et le clonage des plantes recombinantes 15 F2 après forçage, et éventuellement sélection phénotypique, sont réalisés de manière conventionnelle, par exemple sur un milieu de culture adapté pour la régénération de bourgeons, tel que le milieu " ER " à partir de fragments de nervures de feuilles prélevées sur les chicons juvéniles obtenus à la fin de l'étape d) de forçage, éventuellement sur les plantes F2 20 préalablement sélectionnées dans les classes phénotypiques (i) à (iii), par exemple selon la technique décrite par Margara (Margara J, 1989, Bases de la multiplication végétative, INRA ed.). De préférence, les fragments de nervures de feuilles sont désinfectés à l'hypochlorite de calcium préalablement à leur culture en vue de la régénération de bourgeons sur le 25 milieu de culture approprié. L'étape de clonage des plantes recombinantes F2, éventuellement après leur sélection dans les classes phénotypiques (i) à (iii) ci-dessus, rend possible le contrôle prophylactique d'une éventuelle infection des plantules issues du forçage par des pathogènes bactériens ou fongiques. 30 En effet, le demandeur a pu observer que les chicons juvéniles obtenus à la fin de l'étape d) du forçage étaient substantiellement sujets à une infection par Sciérotinia sclérotinorum, même lorsque l'étape de forçage était précédée d'un traitement des racines par une solution nutritive contenant une combinaison d'agents antibactériens ou antifongiques, comme cela est 35 décrit ci-dessus. L'étape e) de clonage, plus particulièrement lorsqu'elle comprend une désinfection des fragments de nervures de feuilles préalablement à la mise en culture sur le milieu de culture approprié en vue de la régénération des bourgeons, permet une amélioration considérable de l'état sanitaire du matériel végétal cloné. L'étape e) de clonage est suivie d'une étape f) de repiquage des bourgeons ainsi régénérés sur un milieu de culture approprié, dans des conditions conventionnelles de repiquage de bourgeons, jusqu'à l'obtention de plantules hybrides de génération F2, clonées et repiquées. L'étape f) de 10 repiquage est en soi classique et peut être réalisée par l'homme du métier selon toute technique connue en soi, par exemple sur le milieu spécifique " M4 " (Murashige T et Skoog F, 1962, Physiol. Plant., Vol. 15: 473-497) enrichi en AIA à la concentration finale de 0,2 mg/1. Par exemple, l'homme du métier peut avantageusement avoir 15 recours à la technique de repiquage décrite dans les exemples de la présente description. Les plantules recombinantes F2 clonées et repiquées obtenues à la fin de l'étape f) peuvent ensuite être acclimatées, comme décrit dans les exemples, puis enracinées et placées en serre ou en champ. Les plantes recombinantes F2 clonées et repiquées qui constituent le produit final de l'étape f) du procédé de l'invention, y compris les souspopulations de plantes recombinantes F2 clonées et repiquées préalablement sélectionnées selon leurs caractères phénotypiques dans les classes de phénotypes (i) à (iii), forment respectivement une population, ou 25 trois sous-populations, très hétérogène(s) du point de vue de l'expression de leurs caractères phénotypiques. Par exemple, selon une illustration concrète de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention spécifiée dans les exemples, les plantes recombinantes F2 clonées et repiquées produits finals de l'étape f) du procédé se composent comme suit: 30 - dix plantes recombinantes F2 de la sous-classe (i) PPI ayant en commun de très nombreuses feuilles étroites sur un collet de racines en plateau mais qui diffèrent entre elles par de nombreux autres caractères phénotypiques; - huit plantes recombinantes F2 de sous-classe phénotypique (ii) GPI possédant en commun une typologie proche de l'endive avec une feuille étroite et découpée mais qui diffèrent entre elles par de nombreux autres caractères phénotypiques. - quatre plantes recombinantes F2 appartenant à la sous-classe phénotypique (iii) SCA possédant en commun des feuilles ramifiées mais qui diffèrent entre elles par de nombreux autres caractères phénotypiques; trois plantes recombinantes F2 de la sous-classe phénotypique (iii) TFR possédant en commun des feuilles ramifiées très dentées mais qui 10 diffèrent entre elles par de nombreux autres caractères phénotypiques; et En outre, le demandeur a observé que, sur les 25 plantes recombinantes F2 obtenues à la fin de l'étape f) du procédé selon l'invention, seules 19 d'entre elles ont produit des semences après autofécondation, ce qui signifie que six plantes recombinantes F2 sur les 15 dix neuf obtenues à la fin de l'étape f) du procédé sont fortement autoincompatibles. Le procédé d'obtention d'une plante hybride du genre Cichorium selon l'invention est caractérisé en ce qu'il peut comprendre en outre les étapes additionnelles suivantes: g) culture en pleine terre des plantules recombinantes obtenues à la fin de l'étape f); h) autofécondation des plantes recombinantes F2 obtenues à la fin de l'étape g) et obtention de plantes recombinantes de génération F3 par culture en pleine terre. Les populations de plantes recombinantes F3 sont caractérisées du point de vue phénotypique leur aptitude commune à tubériser, c'est à dire à développer des racines adaptées à une culture par forçage. Avantageusement, les plantes recombinantes de génération F3 obtenues à l'étape h) ci-dessus sont soumises à une étape (i) de forçage, si 30 possible dans des conditions de forçage identiques à celles mises en oeuvre pour l'étape d) du procédé, à savoir une durée de l'étape i) de forçage de dix à dix huit jours avec une température de la solution nutritive allant de 150C à 170C et une température de l'atmosphère allant de 150C à 170C, les températures de la solution nutritive et de l'atmosphère étant de 35 préférence identiques. Avantageusement, l'étape i) de forçage ci-dessus est suivie d'une étape j) de clonage des chicons juvéniles recombinants de génération F3, ladite étape de clonage pouvant être réalisée indifféremment à partir des fragments de nervures de feuilles ou à partir des bourgeons terminaux des plantules de génération F3 issus de la culture par forçage. Selon une première alternative avantageuse, l'étape j) de clonage consiste en une étape de clonage des fragments de nervures de feuilles des plantules obtenues à la fin de l'étape (i) de forçage, qui est suivie d'une étape de régénération des plantules recombinantes de génération F4 Selon une seconde alternative avantageuse, l'étape j) de clonage consiste en une étape de clonage des bourgeons terminaux des plantules obtenues à la fin de l'étape (i) de forçage et régénération de plantules recombinantes de génération F4. Comme pour les étapes d) et e) du procédé, les étapes i) et j) ci15 dessus rendent possibles un contrôle de l'état sanitaire du matériel végétal: la combinaison de caractéristiques techniques de durée et de température de l'étape de forçage ainsi que la possibilité de " stériliser" le matériel végétal utilisé pour le clonage, par exemple par de l'hypochlorite de calcium, par exemple à la concentration finale de 2, 5% en poids, ont pour 20 effet de limiter, voire de bloquer complètement, d'éventuelles infections dudit matériel végétal recombinant par des bactéries ou des champignons. De préférence, selon le premier mode de réalisation de l'étape j) de clonage ci-dessus, la génération de plantules recombinantes de génération F4 est réalisée en cultivant les fragments de nervures des feuilles de 25 plantules sur un milieu spécifique " NF ", comme décrit dans les exemples. De préférence, selon le mode de réalisation de l'étape j) de clonage cidessus, la régénération des plantules recombinantes de génération F4, à l'étape k) du procédé, est réalisée par culture des bourgeons terminaux sur un milieu spécifique M4, comme décrit dans les exemples. Bien que conservant une grande diversité phénotypique, les plantes recombinantes de génération F4 obtenues à la fin de l'étape j) ci-dessus présentent une excellente qualité sanitaire. Elles sont en particulier exemptes d'une infection par Sclérotinia sclerotiorum, Phytophthora ou par Erwinia carotovora. Les différentes sous-classes phénotypiques (i) à (iv) définies dans la présente description sont retrouvées dans chacune des sous-classes phénotypiques des plantes recombinantes de génération F4. On a montré selon l'invention que les plantes recombinantes de 5 génération F4 pouvaient être facilement cultivées par forçage dans des conditions de forçage identiques à celles utilisées classiquement pour Cichorium intybus L, de type Witloof. On a ainsi montré l'efficacité du procédé selon l'invention pour l'obtention de plantes recombinantes du genre Cichorium possédant des racines tubérisées et aptes à la culture par 10 forçage pour obtenir un matériel végétal produit final possédant des typologies végétales originales non connues jusqu'à présent, notamment du matériel végétal produit final possédant les typologies végétales suivantes: - chicons présentant des feuilles profondément découpées ne ressemblant ni aux endives, ni aux chicorées frisées; - des racines aussi tubérisées que celles de l'endive permettant ainsi de respecter des protocoles de production et de forçage utilisés classiquement par les producteurs d'endives (Cichorium intybus L). De plus, il est envisageable de fixer les caractères phénotypiques des plantes recombinantes de génération F4 obtenues selon le procédé de 20 l'invention par plusieurs cycles successifs de reproduction de chacune des plantes de génération F4 obtenues à l'issue du procédé, par autofécondation conventionnelle, ceci en vue d'obtenir des lignées de plantes recombinantes capables d'exprimer de manière stable une combinaison de caractères qui résultent d'un génotype ou d'une 25 combinaison de génotypes, lesdits caractères étant exprimés de manière homogène, afin de conférer à certaines plantes recombinantes dérivées des plantes recombinantes de génération Fn (avec n représentant un nombre entier au moins égal à 6 un caractère de variété végétale stable et homogène. L'invention a également pour objet des plantes recombinantes obtenues par le procédé défini ci-dessus dans la présente description, lesdites plantes recombinantes étant caractérisées en ce qu'elles sont issues d'un croisement initial entre une plante femelle d'une variété de l'espèce Cichorium intybus L possédant les racines tubérisées et d'une plante mâle d'une variété de l'espèce Cichorium endivia L et en ce qu'elles présentent l'une des quatre classes de phénotypes suivantes: (i) PPI: très nombreuses feuilles étroites sur un collet de racine en plateau; (ii) GPI: typologie proche de l'endive avec une feuille étroite et découpée, ou (iii) TFR et SCA: feuilles ramifiées très dentées; Les plantes recombinantes selon l'invention englobent, notamment: 1) les plantes recombinantes de génération F2 obtenues à la fin de 10 l'étape f) du procédé; 2) Les plantes recombinantes de génération F3 obtenues à la fin de l'étape h) du procédé; 3) les plantes recombinantes de génération F3 obtenues à la fin de l'étape i) 4) les plantes recombinantes de génération F4 obtenues à la fin de l'étape f) du procédé. La présente invention est en outre illustrée par les figures et les exemples suivants. FIGURES La Figure 1 représente un schéma théorique d'une feuille étiolée d'une plante recombinante du genre Cichorium selon l'invention. Ce schéma théorique illustre les différents caractères phénotypiques permettant de définir une plante recombinante de l'invention, ou l'un de ses 25 soustypes. La figure 2 est un cliché photographique d'une plante recombinante de génération F4 possédant de très nombreuses feuilles étroites sur un collet de racine en plateaux de la sous-classe phénotypique PPI. La figure 3 est un cliché photographique d'une plante recombinante 30 de la génération F4 à feuilles ramifiées de la sous-classe phénotypique SCA. La figure 4 est un cliché photographique d'une plante recombinante de la génération F4 à feuilles ramifiées très dentées représentatives de la sous-classe phénotypique TFR. La figure 5 est un cliché photographique d'une plante recombinante de génération F4 d'une typologie proche de l'endive avec une feuille étroite et découpée représentative de la sous-classe phénotypique GPl. La figure 6 est un cliché photographique qui illustre la comparaison 5 entre quatre plantes recombinantes du genre Cichorium du type GPI de génération F4 selon l'invention (placées verticalement, en haut de la figure), avec une plante du genre Cichorium intybus L, aussi appelée endive (placée horizontalement, en bas de la figure). La figure 7 est un cliché photographique qui montre le détail des 10 découpures des feuilles d'une plante recombinante du genre Cichorium de type GPI de génération F4 selon l'invention. La figure 8 est un cliché photographique qui illustre une plante recombinante du genre Cichorium de type GPI de génération F4 selon l'invention, apte à la culture par forçage. EXEMPLES: EXEMPLE 1: Obtention de plantes de génération F2 selon les étapes a) à f) du procédé de l'invention. 20 A. Matériels et Méthodes A. 1. Milieux de culture La composition qualitative et quantitative des milieux de culture " NF " et " M4 " utilisés dans les exemples sont indiquées dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous, respectivement. Tableau 1: Milieu " NF " NF (1 litre) Macroéléments MS (x10) 100 ml Microéléments MS (x1000) 1 ml Vitamines Gamborg (x1000)* 1 ml NaFeEDTA (x100) 10 ml Hydrolysat de caséine 1 g Saccharose 40 g Inositol 50 mg BAP (dissoudre dans NaOH 1 N) 0,2 mg pH = 5,6 Agar 10 g *Vitamines Gamborg sans inositol Tableau 2: Milieu " M4 " M4 (1 litre) Macroéléments MS (xO10) 100 ml Microéléments MS (x1000) 1 ml Vitamines MS (x 1000)* 1 ml NaFeEDTA (x 100) 10 ml Saccharose 30 g Inositol 100 mg AIA (dissoudre dans alcool 95 0.2 mg pur) pH = 5,8 Agar8 g *Vitamines MS sans inositol A.2. Méthode de clonage in vitro des plantules recombinantes, à partir 10 des nervures de feuilles de chicon. 1) Prélèvement - Choisir des feuilles internes du chicon; - Prélever la nervure des feuilles: - Placer les feuilles prélevées dans un pot de désinfection; 1) Désinfection L'étape de désinfection est réalisée avec une solution d'hypochlorite de calcium à la concentration finale de 2.5% + quelques gouttes de solution Tween pendant 10 minutes. Puis on procède à trois étapes 10 successives de rinçage avec de l'eau stérile, sous une hotte à flux laminaire. 2) Mise en culture - Régénération - Placer les nervures sur un papier buvard stérile; - Découper des fragments de nervure d'une surface d'environ 1 cm2; - Mettre en culture sur milieu NF, dans un tube de verre approprié ;. - Placer les tubes en chambre de culture, dans les conditions de température et de luminosité suivantes: - Luminosité équivalente au jour pendant 16 heures, à la 20 température de 250C; - Conditions d'obscurité de la nuit pendant 16 heures, à la température de 20'C. 3) Enracinement Après environ 3 semaines de culture sur milieu NF, lorsque les bourgeons régénérés se sont bien développés, on individualise les bourgeons et on repique chaque plantule dans des tubes sur du milieu M4, pour obtenir leur enracinement. On place les tubes en chambre de culture, dans les conditions de 30 température et de luminosité suivantes: - Luminosité équivalente au jour pendant 16 heures, à la température de 250C; - Conditions d'obscurité de la nuit pendant 16 heures, à la température de 200C. 4) Acclimatation Dès que des racines apparaissent, on acclimate les plantules sur du terreau (en sac), dans des plaques alvéolées de 4 cm de diamètre et à 200C à l'étouffée. B. Procédé d'obtention de plantes recombinantes du genre Cichorium de génération F2 selon l'invention a) Croisement manuel en serre de la lignée de Cichorium intybus 10 " 1089 " par la lignée de Cichorium endivia " Grosse pommant seule ", pour obtenir l'hybride Fl. Semis et élevage de 30 plantes Fl jusqu'au stade 3 feuilles, puis phase de 8 semaines de vernalisation à 50C pour obtenir l'aptitude à la montée à graine. b) Montée à graine et autofécondation (en serre chauffée) en présence de mouches pour obtenir les semences F2. c) Semis au champ de 20000 semences F2. Puis arrachage des racines en éliminant les plantes visiblement malades ou anormales (bourgeonnement adventif, éclatement de la 20 racine...). Traitement des 10 000 racines conservées (60g/hl de Procymidone et 400 g/hl de Mancozebe). Stockage des racines en attente du forçage dans un réfrigérateur à O C. d) Forçage court de 14 jours à 16'C. A l'issue de ce forçage, la quasi totalité du système était contaminé. D'o l'impossibilité de récupérer les plantes viables sur leurs racines. e) Après observations sur les parties feuillées, nous avons retenu 25 plantes sur 4 typologies différentes: 30 PPI: 10 choix SCA: 4 choix TFR: 3 choix GPI: 8 choix. Pour régénérer ces choix nous avons procédé à la désinfection à l'hypochlorite de calcium de fragments de nervures étiolées (1 cm2) et mise en culture in vitro sur milieu NF. Mise en culture de 24 fragments par choix. f) Trois semaines après, après avoir éliminé les fragments infectés, 5 nous avons repiqué les bourgeons régénérés sur milieu M4 pour enracinement. Cette étape s'est suivie d'une phase d'acclimatation à l'étouffée à 200C. EXEMPLE 2: Obtention de plantes de génération F3 selon l'invention. selon les étapes g) et h) du procédé. Les matériels et méthodes sont, sauf indication contraire, ceux qui ont été décrits à l'Exemple 1. g) Après 8 semaines de vernalisation à 50C, la croissance des plantes s'est faite en serre chauffée. h) Les plantes ont fleuri pendant le mois d'avril individuellement sous un manchon de toile, pour y mettre les mouches et réaliser les autofécondations. Au global, 19 choix ont donné des semences F3. Les autres plantes étaient incompatibles. Traitement et acclimatation des plantes recombinantes de génération F3 obtenues à l'étape h). Il a été procédé au semis de ces descendances F3 au champ. 1) A l'observation des plantes en croissance au champ, les typologies TFR se sont montrées très déficientes (dessèchement des feuilles...). Un choix SCA présentait des attaques de sclérotinia dès le 30 stade au champ. Il fallait de nouveau envisager un forçage bref, puisque les lots de racines se trouvaient porteurs d'inoculum. Arrachage des racines. Traitement des racines conservées (60g/hl de Procymidone et 400 35 g/hi de Mancozebe). Stockage des racines en attente de forçage dans un frigo à 00C. 2) En décembre nous avons dû une nouvelle fois forcer les racines en deux semaines à 16'C. 3) Très peu de plantes ont été gardées: PPI: 1 choix GPI:2 choix SCA: 3 choix. Pour régénérer ces choix nous avons procédé à la désinfection à l'hypochlorite de calcium de fragments de nervures étiolées (1 cm2) et mise 10 en culture in vitro sur milieu NF. Mise en culture de 24 fragments par choix. 4) 3 semaines après avoir éliminé les fragments infectés, nous avons repiqué les bourgeons régénérés sur milieu M4 pour enracinement. Cette étape s'est suivie par la phase d'acclimatation. EXEMPLE 3: Obtention de plantes de génération F4 de l'invention, selon les étapes i) et i) du procédé. Les matériels et méthodes sont, sauf indication contraire, ceux qui ont été décrits à l'Exemple 1. a) Après 8 semaines de vernalisation à 50C, la croissance des plantes s'est faite en serre chauffée. Les plantes ont fleuri pendant le mois d'Avril 1997 individuellement sous un manchon de toile, pour y mettre les mouches et réaliser les autofécondations. b) Puis semis au champ des générations F4. A ce stade F4, les plantes obtenues n'ont pas présenté de déficiences au champ et le forçage des racines récoltées a pu s'envisager dans un schéma classique de production de l'indice (3 semaines à 190C). La phase délicate des générations F2 et F3 étant passée. c) Pendant le forçage, les descendances retenues ont montré une bonne aptitude au forçage et des caractéristiques phénotypiques qui sont le point de départ d'une diversification des chicorées forçables. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'une plante recombinante du genre Cichorium possédant des racines tubérisées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) réalisation d'un croisement entre une série de plantes femelles d'une variété de l'espèce Cichorium intybus L possédant des racines tubérisées et d'une série de plantes mâles d'une variété de l'espèce Cichorium endivia L et obtention d'une population de plantes hybrides de 10 génération Fl issues dudit croisement, b) réalisation d'une autofécondation des plantes hybrides de génération F1 obtenues à l'étape a) et obtention de plantes recombinantes de génération F2 issues dudit croisement; 1 c) sélection des plantes recombinantes de génération F2 dont les 15 bourgeons ou les racines ne possèdent pas d'altérations visibles dues à une infection virale, bactérienne ou fongique, notamment par Erwinia carotovora, par Scierotinia sclerotiorum, ou encore par Phytophtora cryptogea; d) Forçage des plantes recombinantes de génération F2 20 sélectionnées à l'étape c) pendant une durée de 10 à 18 jours dans les conditions suivantes de forçage: - température de la solution nutritive: 1 5'C à 1700; - température de l'atmosphère: 15'C à 17'C; e) clonage des plantes F2 obtenues à la fin de l'étape d) et obtention 25 de bourgeons régénérés; f) repiquage des bourgeons régénérés sur un milieu de culture approprié jusqu'à l'obtention de plantules recombinantes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d) 30 de forçage est suivie d'une étape dl) au cours de laquelle les chicons juvéniles obtenus sont sélectionnés, avant l'étape e) de clonage, selon les trois classes de phénotype suivants: (i) PPI: très nombreuses feuilles étroites sur un collet de racine en plateau; 2854026 (ii) GPI: typologie proche de l'endive avec une feuille étroite et découpée; et (iii) TFR et SCA: feuilles ramifiées très dentées. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes: g) culture en pleine terre des plantules recombinantes obtenues à la fin de l'étape f); h) autofécondation des plantes recombinantes F2 obtenues à l'étape 10 g) et obtention de plantes recombinantes de génération F3 par culture en pleine terre, 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les plantes recombinantes de génération F3 obtenues à l'étape h) sont 15 soumises à une étape i) de forçage pendant une durée de 10 à 18 jours, dans les conditions de forçage suivantes: - température de la solution nutritive: 1 5'C à 1 700; - température de l'atmosphère: 1 50C à 170C. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape j) de clonage des chicons juvéniles recombinants obtenus à la fin de l'étape i) de forçage. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape j) 25 de clonage consiste en un clonage des fragments de nervure des feuilles des plantules obtenues à la fin de l'étape i) de forçage et régénération de plantules recombinantes de génération F4. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape j) 30 de clonage consiste en un clonage des bourgeons terminaux des plantules obtenues à la fin de l'étape i) de forçage et régénération de plantules recombinantes de génération F4. i. 26 8. Plantes recombinantes obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles possèdent (i) des racines tubérisées et (ii) des feuilles découpées. 9. Plantes recombinantes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont de la classe PPI et présentent les caractéristiques phénotypiques communes suivantes: - Pus de 100 feuilles par racine à l'issu du forçage; - Pas d'axe secondaire; - Base de chaque feuille très étroite: rapport largeur de la base de la feuille I hauteur de la feuille allant de 0,06 à 0,10; - Découpures profondes du limbe: rapport profondeur de la découpure I longueur de la pointe de la 15 découpure à l'axe de la feuille allant de 0,60 à 0,85; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; - La coloration des nervures est blanche ou rouge; - La coloration du limbe est jaune ou rouge; 10. Plantes recombinantes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont de la classe GPI et présentent les caractéristiques phénotypiques communes suivantes: - De 20 à 35 feuilles obtenues par racine à l'issu du forçage; - Pas d'axe secondaire; - Découpures profondes du limbe jusqu'à la base de la feuille: rapport profondeur de la découpure / longueur de la pointe de la découpure à l'axe de la feuille allant de 0,60 à 0,85; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; - La coloration des nervures est blanche ou rouge; 30 - La coloration du limbe est jaune ou rouge; 11. Plantes recombinantes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont de la classe TFR ou SCA et présentent les caractéristiques phénotypiques communes suivantes: - De 20 à 35 feuilles obtenues par racine à l'issu du forçage; - 2 à 5 axes secondaires à l'axe principal naissant dans la moitié basale de la feuille; - Découpures profondes du limbe: rapport profondeur de la découpure I longueur de la pointe de la découpure à l'axe de la feuille allant de 0, 60 à 0,85; - Le bord des découpures comporte ou non des dentelures secondaires; - La coloration des nervures est blanche ou rouge; - La coloration du limbe est jaune ou rouge;