Brevet FR2855270A1 — publié le 20041126

PROCEDE DE SELECTION DE REGULATEURS ALLOSTERIQUES DES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G DE CLASSE III La présente invention se rapporte au domaine des récepteurs couplés aux protéines G de classe III (RCPG-III), qui sont impliqués dans de nombreux phénomènes biologiques, pour la plupart vitaux, chez les organismes vivants. Plus précisément, l'invention s'inscrit dans le cadre de la mise au point de moyens efficaces destinés à l'identification et la sélection de régulateurs allostériques des RCPG-III. A cet effet, la présente invention concerne un procédé d'identification et sélection d'un composé agissant comme régulateur allostérique d'un RCPG-III. Selon ce procédé, le niveau d'activité d'un RCPG-III recombinant (RCPG-III-#), essentiellement dépourvu du domaine extracellulaire du RCPG-III natif correspondant, en présence d'un composé donné, est comparé à celui du même RCPG-III-#, en l'absence du composé en question. Ce procédé permet ainsi d'identifier et sélectionner des activateurs ou inhibiteurs des RCPG-III. L'invention vise en outre l'application d'un tel procédé à l'identification et la sélection de composés d'intérêt dans des domaines d'activités aussi variés que la pharmacie, l'industrie agro-alimentaire, l'environnement, l'écologie et la recherche fondamentale. La comparaison des séquences des domaines heptahélices des RCPG a permis de répartir ces derniers dans trois grandes classes (Bockaert et Pin, 1999). La classe I comprend les récepteurs semblables à la rhodopsine, tels que les récepteurs des catécholamines, des hormones glycoprotéiques et peptidiques. La classe Il rassemble non seulement les récepteurs de larges peptides tels que le glucagon et la sécrétine, mais également d'autres récepteurs tels que Frizzled, impliqués dans le développement. La classe III des RCPG, quant à elle, comprend les récepteurs activés par les deux principaux neurotransmetteurs, à savoir le glutamate et l'acide y-aminobutyrique (GABA), les récepteurs senseurs des ions calcium, les récepteurs putatifs de phéromones, ainsi que les récepteurs responsables de la détection des goûts sucrés et "umami" (acides aminés, en particulier le glutamate). La présente invention concerne plus particulièrement les RCPG-III. Huit gènes codant pour des RCPG-III activés par le glutamate (également appelés récepteurs métabotropiques du glutamate ou mGlu), ont été identifiés chez les mammifères (Conn et Pin, 1997 ; Pin et al., 2003). Ces mGlu peuvent être classés en trois groupes sur la base de leur pharmacologie, leur similarité de séquence et leur transduction. Dans le groupe I, les récepteurs mGlu1 et mGlu5 activent la phospholipase C (PLC) et semblent agir en synergie avec les récepteurs canaux du glutamate. Ils apparaissent souvent comme des agents qui facilitent la communication glutamatergique. Ainsi, les régulateurs des mGlu du groupe # semblent posséder des propriétés favorisant la mémoire, utiles pour le traitement de maladies telles que la maladie d'Alzheimer ou la schizophrénie. Les récepteurs du groupe II, mGlu2 et mGlu3, de même que les récepteurs du groupe III, mGlu4, mGlu6, mGlu7 et mGlu8, sont couplés négativement à l'adénylyl cyclase. Ils régulent également l'activité de canaux calciques et potassiques. Ils sont souvent localisés en présynapse, d'où ils inhibent la libération de glutamate. De fait, des agonistes ou des régulateurs allostériques positifs des mGlu des groupes Il ou III présentent des propriétés anxiolytiques, anti- épileptiques, antipsychotiques, anti-parkinsonniennes, et peuvent diminuer les effets de dépendance des drogues telles que le tabac et la cocaïne (Conn et Pin, 1997). Un seul gène codant un récepteur activé par les ions calcium a été identifié (Brown et MacLeod, 2001). Ce récepteur joue un rôle clef dans la régulation de la calcémie en contrôlant la libération de parathormone, l'absorption de calcium par les os, ainsi que l'excrétion du calcium au niveau du rein. Il aurait également un rôle au niveau central. Des mutations de ce gène sont à l'origine de maladies telles que l'hypocalciurie familiale, l'hyperparathyroidisme néonatal sévère (mutations entraînant une perte de fonction) (Pollak et al., 1993), ou l'hypocalcémie autosomale dominante (mutations entraînant un gain de fonction) (Pollak et al., 1994). D'autre part, l'inhibition de ces récepteurs permettrait de corriger certaines maladies telle que l'ostéoporose. A ce jour, seuls deux gènes codant des récepteurs GABAB, GB1 et GB2, ont été identifiés. Cependant, ni GB1 ni GB2 ne sont capables, lorsqu'ils sont pris isolément, de former un récepteur GABAB fonctionnel. L'association des deux protéines est en effet nécessaire à la formation d'un récepteur au propriétés proches du récepteur endogène (Marshall et al., 1999). Le récepteur GABAB a été le premier RCPG découvert comme ne fonctionnant que sous forme hétérodimérique. Il a ainsi été montré que le GABA ne se fixe que sur GB1 (Kniazeff et al., 2002), et que GB2 est nécessaire à l'adressage de GB1 à la surface (Pagano et al., 2001). GB2 est également nécessaire à la haute affinité des agonistes sur GB1 (Kaupmann et al., 1998). En outre, GB2 est crucial pour le couplage aux protéines G (Duthey et al., 2002). Le récepteur GABAB constitue donc un excellent modèle d'étude du rôle de la dimérisation des RCPG dans leur mécanisme d'activation. De plus, des agents régulateurs de ce récepteur permettraient de développer de nouveaux traitements contre l'épilepsie et certaines formes de douleur. Il a également été montré que les récepteurs du goût T1 R1, T1 R2 et T1 R3 fonctionnaient sous forme hétérodimérique (Nelson et al., 2002). Ces récepteurs sont responsables de la détection des molécules sucrées, parmi lesquels les édulcorants tels que l'aspartame. La découverte d'agents régulateurs de ces récepteurs revêt un intérêt dans le domaine de l'industrie agro-alimentaire. Conformément à l'acception usuelle, l'on distingue les ligands dits orthostériques , se fixant au niveau du site actif des RCPG-III, des régulateurs allostériques , capables de se lier aux RCPG-III au niveau d'un site autre que le site actif. En l'occurrence, le site actif des RCPG-III est porté par le domaine extracellulaire. Des régulateurs allostériques se fixent sur le domaine membranaire des RCPG-III. De manière classique, un agoniste est une molécule capable, à elle seule, d'augmenter l'activité d'un récepteur. Un antagoniste est une molécule capable d'inhiber l'effet activateur d'un agoniste. Parmi les antagonistes, l'on distingue les antagonistes compétitifs , qui agissent au niveau du site orthostérique, des antagonistes non compétitifs , qui agissent au niveau d'un site allostérique. Un agoniste inverse est une molécule capable d'inhiber l'activité constitutive d'un récepteur, i.e., l'activité mesurable en l'absence de tout agoniste), lorsqu'une telle activité est effectivement mesurable. Un agoniste inverse est en outre capable d'inhiber l'effet d'un agoniste. Il s'agit donc également d'un antagoniste. Un régulateur allostérique positif est une molécule capable de faciliter l'action d'un agoniste. Un tel régulateur agit sur un site différent du site orthostérique, au niveau duquel se fixe le ligand naturel. L'on entend ici par faciliter l'action d'un agoniste , soit augmenter la puissance dudit agoniste (de plus faibles concentrations d'agonistes seront alors suffisantes pour produire le même effet), soit augmenter son efficacité (i.e., augmenter la réponse maximale obtenue avec une concentration saturante d'agoniste, c'est-à-dire une concentration suffisante pour occuper tous les récepteurs). Un régulateur allostérique négatif est une molécule capable de diminuer l'effet d'un agoniste, et ce, en agissant sur un site autre que le site orthostérique. Un tel régulateur est également appelé antagoniste non-compétitif . Comme dans le cas des antagonistes, un régulateur allostérique négatif peut ou non posséder une activité agoniste inverse. Au sens de l'invention, les expressions inhiber l'effet d'un agoniste et diminuer l'effet d'un agoniste sont équivalentes. Tous les RCPG-III connus à ce jour ont la particularité d'être constitués de deux domaines protéiques distincts : un domaine extracellulaire appelé Venus flytrap , responsable de la liaison des ligands naturels (ligands orthostériques), et un domaine membranaire heptahélice responsable du couplage aux protéines G et cible des régulateurs allostériques (Pin et al., 2003) (Figure 1). Ces deux domaines sont séparés par une région riche en cystéines. Une deuxième caractéristique spécifique des RCPG-III réside dans leur capacité à former des dimères constitutifs, souvent reliés entre eux par au moins un pont disulfure. La construction d'un récepteur calcium recombinant, tronqué de son domaine extracellulaire, a été décrite par Ray et Northup (2002). Les auteurs ont ainsi démontré que, à l'instar du domaine extracellulaire, le domaine transmembranaire heptahélice contient un ou plusieurs sites de liaison des ions calcium. Cependant, l'activation du récepteur recombinant par les ions calcium n'a été détectée qu'en présence d'un régulateur allostérique tel que la poly-L-arginine ou le composé phénylalkylaminé NPS 568. Les régulateurs allostériques positifs ou négatifs des RCPG-III jusque-là décrits ont été identifiés par des techniques de criblage à haut débit. Les "calcimimétiques" ont été mis en évidence pour leur capacité à réguler l'activité du récepteur calcium (Nemeth et al., 1998 ; Hammerland et al., 1998 ; Hammerland étal., 1999) Des régulateurs positifs du récepteur GABAB (Urwyler et al., 2001), du récepteur mGlu1 (Knoflach et al., 2001), mais aussi des récepteurs mGlu5, mGlu2 et mGlu4 ont été présentés lors du congrès mGlu2002 (Taormina, Sicile, Italie, septembre 2002). Selon les techniques de criblage à haut débit utilisées jusqu'à présent, des chimiothèques sont criblées grâce à des tests fonctionnels réalisés au moyen de lignées cellulaires exprimant un RCPG-III de façon stable. Les composés présents dans la chimiothèque sont testés pour leur capacité à potentialiser l'effet d'une concentration donnée d'agoniste. Cependant, une telle approche se heurte à des difficultés multiples. En premier lieu, il est nécessaire d'obtenir des lignées cellulaires exprimant ces récepteurs de manière stable. Or, il s'agit là d'une étape délicate, surtout dans le cas des récepteurs du glutamate, dans la mesure où cet acide aminé est présent dans tous les milieux de culture, ainsi que dans le sérum. Il est de surcroît produit par la plupart des lignées cellulaires. En conséquence, il s'avère en pratique difficile, voire impossible, d'abaisser la concentration du glutamate dans le milieu de culture à un niveau suffisamment faible pour que les récepteurs ne soient pas activés par le glutamate environnant. Pour remédier à ce problème, le groupe Eli Lilly & Co a développé une lignée cellulaire qui exprime un transporteur à haute affinité du glutamate (cellules RGT établies sur la base d'une lignée AV12) (Kingston et al., 1998 ; Schoepp et al., 1997). Les cellules ainsi mises au point contrôlent la concentration extracellulaire du glutamate. Elles maintiennent cette concentration à des valeurs suffisamment faibles pour que les récepteurs exprimés ne soient pas activés en permanence par le glutamate présent dans le milieu. Ceci facilite l'établissement de lignées exprimant les récepteurs de façon stable. Cependant, un tel système présente des inconvénients. En effet, parmi les composés testés, certains peuvent être pris en charge par le transporteur du glutamate et transportés dans les cellules, ce qui peut abaisser leur concentration et prévenir leur action normale sur les récepteurs. En outre, la capacité de certaines des molécules testées à inhiber le transporteur du glutamate peut entraîner des difficultés dans la mise en #uvre du test de criblage. En pareil cas, la concentration en glutamate croît, ce qui se traduit par une augmentation artéfactuelle de l'activité du récepteur. Le composé apparaît alors comme un régulateur allostérique positif du récepteur, et ce, même s'il n'en est pas véritablement un. Un crible secondaire est donc nécessaire. En second lieu, les régulateurs allostériques n'ont bien souvent aucun effet sur le RCPG-III si celui-ci n'est pas simultanément activé par de faibles concentrations d'agoniste. La mise au point d'un test de sélection reproductible et fiable est alors rendue plus ardue par l'addition nécessaire d'agoniste. Se pose en effet la question de savoir à quelle concentration utiliser l'agoniste. Si cette concentration n'est pas suffisante ou, au contraire, est trop élevée, l'effet du régulateur allostérique ne sera probablement pas détectable. En outre, le rapport signal sur bruit de la réponse du régulateur allostérique se trouve réduit du fait de l'augmentation de la réponse de base due à la présence de l'agoniste. La présente invention permet précisément de contourner l'ensemble des problèmes mentionnés ci-dessus, via l'utilisation de récepteurs recombinants dépourvus de leur domaine de liaison extracellulaire. En effet, l'invention démontre pour la première fois que le domaine membranaire d'un RCPG-III est suffisant pour fixer des régulateurs allostériques, et ce, avec une affinité comparable à celle observée en utilisant le récepteur sauvage correspondant. Ainsi, d'une part, ces récepteurs recombinants sont insensibles au glutamate et, d'autre part, de manière surprenante, les régulateurs allostériques se comportent comme de véritables agonistes ou antagonistes de ces récepteurs. Cette dernière caractéristique confère à la présente invention un avantage considérable, dans la mesure où il est en pratique plus aisé d'étudier l'effet agoniste d'une molécule sur un récepteur tronqué, que l'effet régulateur allostérique positif de ladite molécule sur le récepteur sauvage correspondant. Ainsi, avantageusement, de tels récepteurs recombinants peuvent donc être exprimés de manière stable par les cellules. En outre, la présence additionnelle d'agoniste s'avère inutile. Enfin, le procédé objet de l'invention utilisant ces récepteurs recombinants permet d'obtenir un meilleur rapport signal sur bruit. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'identification et sélection d'un composé agissant comme régulateur allostérique d'un RCPG-III. Ce procédé comprend au moins les étapes suivantes : a) la production d'un RCPG-III recombinant (RCPG-III-A) essentiellement dépourvu du domaine extracellulaire du RCPG-III natif correspondant ; b) la mise en présence dudit composé avec ledit RCPG-III- ; c) la mesure du niveau N1 d'activité dudit RCPG-III- en présence dudit composé ; d) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape c) avec le niveau No d'activité du RCPG-III-# en l'absence dudit composé ; e) si N1 est significativement différent de No, l'identification et la sélection dudit régulateur allostérique. Avantageusement, ledit RCPG-III-# est totalement dépourvu du domaine extracellulaire dudit RCPG-III natif. La mise en #uvre du procédé susmentionné permet d'identifier et sélectionner des composés agissant comme des régulateurs allostériques d'un RCPG-III, en se fixant à ce dernier au niveau de son domaine heptahélice. Selon un premier mode de mise en #uvre du procédé objet de l'invention, si N1 est significativement supérieur à No, ledit régulateur allostérique est positif. Selon un deuxième mode de mise en #uvre du procédé objet de l'invention, si N1 est significativement inférieur à No, ledit régulateur allostérique est négatif. Dans le contexte de l'invention, la mesure du niveau d'activité du RCPG-III-# peut être effectuée par n'importe quelle méthode conventionnelle, connue de l'homme du métier, adaptée à la mesure de l'activité d'un RCPG-III. Parmi ces méthodes, l'on peut citer, à titre d'exemple, la mesure du niveau de production d'inositols phosphates (IP ; voir Partie Expérimentale, infra ; Berridge, 1983 ; Brandishet al. , 2003), la mesure de la liaison des GTPy (Milligan, 2003), la mesure des signaux calciques intracellulaires à l'aide de marqueurs fluorescents tels que le Fluo3 ou le Fluo4, et la mesure de la production d'AMPc, ces deux dernières méthodes étant classiques et bien connues de l'homme du métier. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en #uvre avec un RCPG-III-# comprenant : - un domaine membranaire heptahélice, sans signal d'adressage ; ou - un signal d'adressage et un domaine membranaire heptahélice. Au sens de la présente invention, l'on entend par signal d'adressage , une séquence d'acides aminés, de longueur variable, en général de 15 à 35 résidus environ, permettant l'insertion correcte d'un récepteur dans la membrane plasmique. En particulier, un tel signal d'adressage peut être : - un peptide signal conforme à l'acception usuelle ; ou - les 20 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale de la rhodopsine, notamment d'origine bovine (Ray et Northup, 2002). Dans le cas où ledit signal d'adressage est un peptide signal, ce peptide signal peut être celui du RCPG-III natif correspondant, ou celui d'un RCPG-III sauvage différent, ou encore n'importe quel peptide signal connu. De préférence, ledit peptide signal est celui dudit RCPG-III natif correspondant. Avantageusement, l'étape a) du procédé susmentionné comprend au moins les sous-étapes suivantes : a1) l'amplification par PCR d'un acide nucléique codant ledit domaine membranaire dudit RCPG-III- ; a2) le clonage du produit d'amplification dans un vecteur d'expression recombinant ; a3) la transfection dudit vecteur recombinant dans une cellule hôte recombinante ; et a4) la production dudit RCPG-III-# par ladite cellule hôte recombinante. De manière particulière, dans le cas où un signal d'adressage est utilisé, la sous-étape a2) consiste à cloner, dans un vecteur d'expression recombinant, le produit d'amplification en aval d'un acide nucléique codant ledit signal d'adressage. Dans le cas où le RCPG-III en cause possède, dans sa partie intracellulaire, un signal responsable de sa rétention dans le réticulum endoplasmique (Pagano et al., 2001), il convient au préalable de rendre ce signal non fonctionnel par mutation, selon des méthodes de mutagénèse conventionnelles, connues de l'homme du métier, afin de permettre un adressage du RCPG-III à la membrane plasmique. Il est avantageux de placer l'expression de l'acide nucléique codant le domaine membranaire du RCPG-III-#, ou la co-expression des acides nucléiques codant le signal d'adressage et le domaine membranaire du RCPG-III-#, sous le contrôle d'un promoteur fort porté par le vecteur recombinant. A cet effet, l'homme du métier pourra utiliser n'importe quel promoteur transcriptionnel fort connu. Par exemple, un tel promoteur fort peut être le promoteur du cytomégalovirus (CMV ; voir Figure 2) ou celui du virus SV40. De multiples vecteurs sont à la disposition de l'homme du métier pour construire le récepteur RCPG-III-#. Des vecteurs conventionnels appropriés sont, en particulier, les vecteurs pRK5-NHA (voir Partie Expérimentale infra), pcDNA3 (InVitrogene) et pCI (Promega). En outre, aux fins de la mise en #uvre du procédé selon l'invention, l'homme du métier pourra utiliser, à titre de cellule hôte recombinante, n'importe quel type de cellule permettant l'expression hétérologue d'une protéine. L'homme du métier pourra notamment choisir parmi les cellules eucaryotes, telles que les cellules de levure, les cellules HEK293 et COS, et les cellules procaryotes, telles les cellules bactériennes. Dans le contexte de la présente invention, le RCPG-III utilisé pour mettre en #uvre le procédé susvisé est choisi dans le groupe comprenant : - les récepteurs activés par le glutamate ; - les récepteurs activés par le GABA ; - les récepteurs activés par les ions calcium ; - les récepteurs putatifs de phéromones ; et - les récepteurs du goût. En particulier, ledit RCPG-III est un récepteur activé par le glutamate, et de préférence, le récepteur mGlu5. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne les applications du procédé tel que décrit ci-dessus, dans divers domaines, notamment dans les domaines de la pharmacie, l'écologie et l'environnement, l'industrie agro-alimentaire, la recherche, etc... Selon un premier mode de réalisation, l'invention vise l'application du procédé défini supra à l'identification et la sélection d'un composé utile dans le cadre d'un traitement prophylactique et/ou thérapeutique chez les mammifères, y compris l'homme. De manière particulière, un tel composé peut convenir à la mise en #uvre d'un traitement concernant au moins une maladie parmi : - la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie, les troubles nerveux, la dépression, l'épilepsie, la psychose, la dépendance aux drogues (RCPG-III activés par le glutamate) ; - l'ostéoporose (RCPG-III activés par le calcium) ; - l'épilepsie, la douleur (RCPG-III activés par le GABA). Selon un deuxième mode de réalisation, l'invention a trait à l'application du procédé décrit précédemment à l'identification et la sélection d'un composé utile dans le cadre d'un traitement destiné à augmenter ou, au contraire, à réduire la prolifération d'organismes vivants, tels les insectes et les vers, dont le génome contient au moins un RCPGIII (Parmentier et al., 1996 ; Pin et al., 2003). Selon un troisième mode de réalisation, l'invention concerne plus précisément les récepteurs du goût. A cet égard, la présente invention a pour objet l'application du procédé ci-dessus à l'identification et la sélection d'un composé utile comme additif alimentaire. En particulier, un tel additif alimentaire est destiné à conférer un goût sucré, tel un édulcorant, ou un goût umami. Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention. Figure 1 : schéma de la structure générale d'un RCPG-III. A : domaine externe dit "Venus flytrap", site de liaison des ligands orthostériques (ou agonistes) ; B : région riche en cystéines ; et C : domaine membranaire heptahélice, site de liaison des régulateurs allostériques. Figure 2 : schéma de construction du plasmide d'expression du récepteur tronqué mGlu5AS. PS : peptide signal ; VFTM : module Venus flytrap ; CR : région riche en cystéines ; HD : domaine membranaire heptahélice ; CT : domaine carboxy-terminal intracellulaire ; CMV : promoteur du cytomégalovirus ; HA : étiquette hémagglutinine. Figure 3: graphique représentant l'effet du glutamate sur les récepteurs mGlu5 et mGlu5AS, dans des cellules HEK293 ayant été transfectées transitoirement avec l'ADNc codant lesdits récepteurs. Barres blanches : production d'IP basale ; Barres grises : production d'IP en présence de 100 M de glutamate. Les résultats correspondent au rapport de la production d'IP sur la radioactivité restant dans les membranes. Ces données correspondent à la moyenne écart type à la moyenne de triplicatas provenant d'une expérience représentative. Figure 4 : graphique représentant l'effet dose du MPEP sur les récepteurs mGlu5 et mGlu5AS, dans des cellules HEK293 exprimant les récepteurs mGlu5 (carrés blancs) ou mGlu5AS (triangles noirs) de façon transitoire. Les résultats correspondent au rapport de la production d'IP sur la radioactivité restant dans les membranes et sont exprimés en pourcentage de la production basale d'IP. Ces données correspondent à la moyenne écart type à la moyenne de triplicatas provenant d'une expérience représentative. Figure 5 : graphique représentant l'effet dose du glutamate sur le récepteur mGlu5 en présence (triangles noirs) ou en absence (carrés blancs) de DFB, dans des cellules HEK293 transfectées avec l'ADNc codant ledit récepteur. Les résultats correspondent au rapport de la production d'IP sur la radioactivité restant dans les membranes. Ces données correspondent à la moyenne écart type à la moyenne de triplicatas provenant d'une expérience représentative. Figure 6: graphiques représentant l'effet dose du DFB sur mGlu5AS et son inhibition par le MPEP. A : effet de doses croissantes de DFB sur la production d'IP par des cellules HEK293 exprimant de manière transitoire le récepteur mGlu5AS. B : effet de différentes concentrations de MPEP sur la production d'IP par des cellules exprimant le récepteur mGlu5#S traitées avec 300 M de DFB. Les résultats correspondent au rapport de la production d'IP sur la radioactivité restant dans les membranes. Ces données correspondent à la moyenne écart type à la moyenne de triplicatas provenant d'une expérience représentative. La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, illustre de manière non limitative l'invention. PARTIE EXPERIMENTALE I. Construction du plasmide codant un récepteur RCPG-III tronqué (protéine mGlu5AS) La partie du cDNA du récepteur mGlu5 codant son domaine heptahélice entre le résidu P568, situé 11 résidus avant le premier domaine transmembranaire, et le résidu L864, situé 37 résidus après le 7ème domaine transmembranaire, a été amplifiée par PCR (amorces SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2) en incluant respectivement les sites de restriction des enzymes Mlu-I et Xba-I aux extrémités 5' et 3' (Figure 2). Le produit PCR ainsi obtenu a été digéré par les enzymes Mlu-I et Xba-I, sous-cloné dans le vecteur pRK5-NHA (Figure 2), et digéré par les mêmes enzymes. Le plasmide pRK5-NHA a été obtenu à partir du plasmide pRKG5a-NHA (Ango et al., 1999), en remplaçant la séquence codant le récepteur mGlu5, de la fin de l'étiquette HA jusqu'au site de restriction Xbal, par un site de restriction Mlul. Le plasmide obtenu code donc une protéine possédant le peptide signal du récepteur mGlu5, suivi de l'étiquette HA (PYDVPDYA, SEQ ID N 3), puis du domaine heptahélice du récepteur mGlu5 tronqué de la majorité de son domaine C-terminal intracellulaire. L'expression de cette protéine est placée sous le contrôle d'un promoteur fort CMV permettant son expression transitoire après transfection dans des lignées cellulaires HEK293 ou COS. II. Résultats Il. 1. Expression fonctionnelle de la protéine tronquée mGlu5#S : Après transfection du plasmide construit conformément à la procédure décrite en partie I, dans les cellules HEK293, l'expression d'une protéine reconnue par un anticorps anti-HA a pu être vérifiée par western blot ainsi que par immunohistochimie (résultats non montrés). En outre, les cellules transfectées ont été marquées par l'anticorps anti-HA même si elles n'étaient pas perméabilisées. Du fait que l'épitope HA est placé à l'extrémité N-terminale de la protéine mGlu5AS (voir Figure 2), et se situe donc au niveau extracellulaire, il a été prouvé par immunohistochimie que la protéine était correctement adressée au niveau de la membrane plasmique. L'analyse du couplage du récepteur sauvage mGlu5 à la voie de production des inositols phosphates (IP) dans les cellules HEK293 a montré que ce récepteur était partiellement actif même en absence de glutamate (Joly et al., 1995). Selon le modèle de fonctionnement des mGlus, il avait été proposé que cette activité constitutive du récepteur provenait d'un équilibre dynamique entre des états inactifs et des états actifs du domaine heptahélice du récepteur (Parmentier et al., 2002). En accord avec cette hypothèse, l'expression de la protéine mGlu5AS dans les cellules HEK293 a conduit à une production basale d' IP plus importante que celle mesurée dans les cellules contrôles. Conformément au fait que le glutamate se fixe au niveau du domaine externe du récepteur, ce dernier stimulait la production d'IP dans les cellules exprimant le récepteur sauvage mGlu5, mais pas dans les cellules exprimant la protéine mGlu5AS (Figure 3). 11.2. Effet des régulateurs allostériques sur la fonction de la protéine tronquée mGlu5#S : La production basale d'IP dans les cellules exprimant le récepteur mGlu5 sauvage (témoin de l'activité constitutive du récepteur) pouvait être inhibée par le régulateur allostérique négatif MPEP (Pagano et al., 2000) avec un Cl50 (concentration en régulateur allostérique négatif nécessaire pour obtenir 50% de son effet maximal) de 5,7 0,6 M (n=4) (Figure 4). Cet effet du MPEP était également observé sur les cellules exprimant la protéine mGlu5AS, avec un C150 de 9,8 2,5 pM (n=3) (Figure 4), non différent significativement de la valeur déterminée sur le récepteur sauvage. Ceci a confirmé que le MPEP agit au niveau du domaine heptahélice du récepteur, et que le domaine extracellulaire n'a pas d'influence sur son affinité apparente. Ce résultat a également démontré que l'activité basale de production d'IP dans les cellules HEK293 exprimant la protéine mGlu5AS, résulte bien de la capacité de cette protéine à activer la voie intracellulaire de façon constitutive. Le DFB a récemment été décrit comme un régulateur allostérique positif du récepteur mGlu5 (Williams et al., 2002). Afin de tester son effet sur la protéine mGlu5AS, du DFB a été synthétisé par F. Acher (UMR Université R. Descartes, rue des Saints Pères, Paris 5). En accord avec les données publiées, le DFB n'activait pas de façon significative le récepteur mGlu5 sauvage dans des conditions où la concentration de glutamate dans le milieu d'incubation était maintenue au plus bas par la co-expression du transporteur du glutamate EAAC1, et par l'ajout de l'enzyme GPT (qui dégrade le glutamate en présence de pyruvate (2mM)) dans le milieu d'incubation (Figure 5). En revanche, le DFB potentialisait l'effet des agonistes glutamate et quisqualate, en abaissant la valeur de leur CE50 (concentration d'agoniste nécessaire pour obtenir 50% de son effet maximal) d'un facteur supérieur à 2 (Tableau 1 et Figure 5). En présence d'une faible concentration d'agoniste, le DFB augmentait la production d'IP de façon "dose-dépendante" avec un CE50 de 1,81 1,04 M. Le tableau 1 ci-dessous montre la potentialisation de l'effet du glutamate et du quisqualate sur mGlu5 par le DFB. Les valeurs de CE50 ont été déterminées à partir d'expériences d'effet dose du glutamate et du quisqualate en présence ou en absence de DFB, similaires à l'expérience décrite dans la figure 5. Les données correspondent à la moyenne écart type à la moyenne de (n) expériences. Tableau 1 Glutamate Quisqualate Base 47,6 10,1 M (5) 20,3 1,0 M (1) 100M DFB 25,8 5,7 M (4) 5,6 1,3 M (1) Sur les cellules exprimant la protéine mGlu5AS, le DFB stimulait la production d'IP, et se comportait donc comme un agoniste (Figure 6A). Cet effet du DFB dépendait de la concentration de DFB utilisée, avec une CE50 de 8,0 3,0 M (n=3), peu différente de la CE50 mesurée pour la potentialisation de l'effet du glutamate sur le récepteur sauvage, confirmant que le DFB agit au niveau du domaine heptahélice du récepteur. D'autre part, l'effet du DFB était inhibé par le MPEP, tant sur le récepteur sauvage (données non montrées) que sur la protéine mGlu5#S (Figure 6B), ce qui a confirmé que l'effet du DFB résultait de son action sur la protéine mGiu5AS. En conséquence, le domaine heptahélice du récepteur mGlu5 (mGlu5AS) est seul capable d'activer les protéines G, dans la mesure où cette partie du récepteur mGlu5 est seule capable d'atteindre un état conformationnel actif. En outre, le régulateur allostérique négatif (antagoniste non-compétitif doué d'activité agoniste inverse) MPEP inhibe l'activité basale de cette protéine mGlu5AS, et le DFB est capable d'activer cette protéine. Aussi ces molécules n'ont-elles pas besoin du domaine externe pour agir. Des protéines correspondant au domaine heptahélice des récepteurs RCPG-III constituent donc de bons outils pour identifier des régulateurs allostériques de ces récepteurs. REFERENCES Bockaert J and Pin J-P (1999) Molecular tinkering of G-protein coupled receptors : an evolutionary success. EMBO J 18:1723-1729. Brown EM and MacLeod RJ (2001) Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling. Physiol Rev 81:239-297. Conn P and Pin J-P (1997) Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors. Ann Rev Pharmacol Toxicol 37 :205-237. Duthey B, Caudron S, Perroy J, Bettler B, Fagni L, Pin J-P and Prézeau L (2002) A single subunit (GB2) is required for G-protein activation by the heterodimeric GABAB receptor. J Biol Chem 277:3236-3241. Joly C, Gomeza J, Brabet I, Curry K, Bockaert J and Pin J-P (1995) Molecular, functional and pharmacological characterization of the metabotropic glutamate receptor type 5 splice variants: comparison with mGlu1. J Neurosci 15 :3970-3981. Kaupmann K, Malitschek B, Schuler V, Heid J, Froestl W, Beck P, Mosbacher J, Bischoff S, Kulik A, Shigemoto R, Karschin A and Bettler B (1998) GABA B-receptor subtypes assemble into functional heteromeric complexes. Nature 396:683-687. Kniazeff J, Galvez T, Labesse G and Pin J-P (2002) No ligand binding in the GB2 subunit of the GABAB receptor is required for activation and allosteric interaction between the subunits. J Neurosci 22:7352-7361. Marshall FH, Jones KA, Kaupmann K and Bettler B (1999) GABAB receptors - the first 7TM heterodimers. Trends Pharmacol Sci 20 :396- 9. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJ and Zuker CS (2002) An amino-acid taste receptor. Nature 416:199-202. Pagano A, Rovelli G, Mosbacher J, Lohmann T, Duthey B, Stauffer D, Ristig D, Schuler V, Meigel I, Lampert C, Stein T, Prézeau L, Blahos J, Pin J-P, Froestl W, Kuhn R, Heid J, Kaupmann K and Bettler B (2001) C-terminal interaction is essential for surface trafficking but not for heteromeric assembly of GABAB receptors. J Neurosci 21:1189- 1202. Pagano A, Rüegg D, Litschig S, Stoehr N, Stierlin C, Heinrich M, Floersheim P, Prézeau L, Carroll F, Pin J-P, Cambria A, Vranesic I, Flor PJ, Gasparini F and Kuhn R (2000) The non-competitive antagonists 2-Methyl-6-(phenylethynyl)pyridine and 7- hydroxyiminocyclopropan[b]chromen-1 a-carboxylic acid ethyl ester interact with overlapping binding pockets in the transmembrane region of group # metabotropic glutamate receptors. J Biol Chem 275:33750- 33758. Parmentier M-L, Prézeau L, Bockaert J and Pin J-P (2002) A model for the functioning of family 3 GPCRs. Trends Pharmacol Sci 23:268-274. Pin J-P, Galvez T and Prézeau L (2003) Evolution, structure and activation mechanism of family 3/C G-protein coupled receptors. Pharmacol Ther in press. Pollak MR, Brown EM, Chou Y-HW, Hebert SC, Marx SJ, Steinmann B, Levi T, Seidman CE and Seidman JG (1993) Mutations in the human Ca2±sensing receptor gene cause familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism. Cell 75 :1297-1303. Pollak MR, Brown EM, Estep HL, McLaine PN, Kifor 0, Park J, Hebert SC, Seidman CE and Seidman JG (1994) Autosomal dominant hypocalcaemia caused by a Ca2±sensing receptor gene mutation. Nature Genetics 8 :303-307. Williams DL, O'Brien JA, Lemaire W, Chen T-B, Chang RSL, Jacobson MA, Sur C, Pettibone DJ and Conn PJ (2002) DFB, an allosteric potentiator of mGlu5. Neuropharmacology 43 :abs. Ray and Northup (2002) Evidence for distinct cation and calcimimetic compound (NPS568) récognition domains in the transmembrane regions of the human Ca2+ receptor. J. Biol. Chem. 277 : 18908-18913.Hammerland L, Garrett J, Hung B, Levinthal C, Nemeth E (1998) Allosteric activation of the Ca2+ receptor expressed in Xenopus laevis oocytes by NPS 467 or NPS 568. Mol Pharmacol 53 :1083-1088. Hammerland LG, Krapcho KJ, Garrett JE, Alasti N, Hung BC, Simin RT, Levinthal C, Nemeth EF, Fuller FH (1999) Domains determining ligand specificity for Ca2+ receptors. Mol Pharmacol 55 :642-648. Nemeth E, Steffey M, Hammerland L, Hung B, Van Wagenen B, DelMar E, Balandrin M (1998) Calcimimetics with potent and selective activity on the parathyroid calcium receptor. Proc Natl Acad Sci (USA) 95 :4040-4045. Urwyler S, Mosbacher J, Lingenhoehl K, Heid J, Hofstetter K, Froestl W, Bettler B, Kaupmann K (2001) Positive allosteric modulation of native and recombinant GABAB receptors by 2,6-Di-tert.-butyl-4-(3hydroxy-2,2-dimethyl-propyl)-phenol (CGP7930) and its aldehyde analogue CGP13501. Mol Pharmacol 60 :963-971. Knoflach F, Mutel V, Jolidon S, Kew JN, Malherbe P, Vieira E, Wichmann J, Kemp JA (2001) Positive allosteric modulators of metabotropic glutamate 1 receptor: Characterization, mechanism of action, and binding site. Proc Natl Acad Sci U S A 98 :13402-13407. Kingston AE, Ornstein PL, Wright RA, Johnson BG, Mayne NG, Burnett JP, Belagaje R, Wu S, Schoepp DD (1998) LY341495 is a nanomolar potent and selective antagonist of group Il metabotropic glutamate receptors. Neuropharmacology 37 :1-12. Schoepp DD, Johnson BG, Wright RA, Salhoff CR, Mayne NG, Wu S, Cockerham SL, Burnett JP, Belegaje R, Bleakman D, Monn JA (1997) LY354740 is a potent and highly selective group Il metabotropic glutamate receptor agonist in cells expressing human glutamate receptors. Neuropharmacology 36 :1-11. Berridge M (1983) Rapid accumulation of inositol trisphosphate reveals that agonists hydrolyse polyphosphoinositides instead of phosphatidylinositol. Biochem J 212:849-858. Brandish PE, Hill LA, Zheng W, Scolnick EM (2003) Scintillation proximity assay of inositol phosphates in cell extracts : High-throughput measurement of G-protein-coupled receptor activation. Anal Biochem 313 :311-318. Milligan G (2003) Principles: Extending the utility of [35S]GTPgS binding assays. Trends Pharmacol Sci 24:87-90. Ango F, Albani-Torregrossa S, Joly C, Robbe D, Michel J-M, Pin JP, Bockaert J, Fagni L (1999) A simple method to transfer plasmid DNA into neuronal primary cultures: functional expression of mGluR5 in cerebellar granule cells. Neuropharmacology 38 :793-803. Parmentier M-L, Pin J-P, Bockaert J, Grau Y (1996) Cloning and functional expression of a drosophila metabotropic glutamate receptor expressed in the embryonic central nervous system. J Neurosci 16:6687- 6694. REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification et sélection d'un composé agissant comme régulateur allostérique d'un récepteur couplé aux protéines G de classe III (RCPG-III), ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) la production d'un RCPG-III recombinant (RCPG-III-#) essentiellement dépourvu du domaine extracellulaire du RCPG-III natif correspondant ; b) la mise en présence dudit composé avec ledit RCPG-III-# ; c) la mesure du niveau N1 d'activité dudit RCPG-III- en présence dudit composé ; d) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape c) avec le niveau No d'activité du RCPG-III-# en l'absence dudit composé ; et e) si N1 est significativement différent de No, l'identification et la sélection dudit régulateur allostérique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit RCPG-III-# est totalement dépourvu du domaine extracellulaire dudit RCPG-III natif. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, si N1 est significativement supérieur à No, ledit régulateur allostérique est positif. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, si N1 est significativement inférieur à No, ledit régulateur allostérique est négatif. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit RCPG-III- comprend un domaine membranaire heptahélice. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite étape a) comprend au moins les sous-étapes suivantes : a1) l'amplification par PCR d'un acide nucléique codant ledit domaine membranaire dudit RCPG-III- ; a2) le clonage du produit d'amplification dans un vecteur d'expression recombinant ; a3) la transfection dudit vecteur recombinant dans une cellule hôte recombinante ; et a4) la production dudit RCPG-III-# par ladite cellule hôte recombinante. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit RCPG-III-# comprend un signal d'adressage et un domaine membranaire heptahélice. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit signal d'adressage est un peptide signal. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit peptide signal est celui dudit RCPG-III natif correspondant. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que ladite étape a) comprend au moins les sous-étapes suivantes : a1) l'amplification par PCR d'un acide nucléique codant ledit domaine membranaire dudit RCPG-III- ; a2) le clonage, dans un vecteur d'expression recombinant, du produit d'amplification en aval d'un acide nucléique codant ledit signal d'adressage ; a3) la transfection dudit vecteur recombinant dans une cellule hôte recombinante ; et a4) la production dudit RCPG-III-# par ladite cellule hôte recombinante. 11. Procédé selon la revendication 6 ou 10, caractérisé en ce que ladite cellule hôte recombinante est choisie parmi les cellules eucaryotes, telles que les cellules de levure et les cellules COS, et les cellules procaryotes, telles les cellules bactériennes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit RCPG-III est choisi dans le groupe comprenant : - les récepteurs activés par le glutamate ; - les récepteurs activés par le GABA ; - les récepteurs activés par les ions calcium ; - les récepteurs putatifs de phéromones ; et - les récepteurs du goût. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit RCPG-III est un récepteur activé par le glutamate. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit récepteur activé par le glutamate est le récepteur mGlu5. 15. Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, à l'identification et la sélection d'un composé utile à la mise en #uvre d'un traitement prophylactique et/ou thérapeutique chez les mammifères, dont l'homme. 16. Application selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit traitement concerne au moins une maladie parmi : la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie, les troubles nerveux, la dépression, l'épilepsie, la psychose, la dépendance aux drogues, l'ostéoporose, la douleur. 17. Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, à l'identification et la sélection d'un composé utile à la mise en #uvre d'un traitement destiné à augmenter ou réduire la prolifération d'organismes vivants, tels les insectes et les vers. 18. Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, à l'identification et la sélection d'un composé utile comme additif alimentaire. 19. Application selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit additif alimentaire confère un goût sucré, tel un édulcorant, ou un goût umami.