Brevet FR2848572A1 — publié le 20040618

MOLECULES INHIBITRICES DE LA SYNTHESE PROTEIQUE DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET PROCEDE DE CRIBLAGE DESDITES MOLECULES INHIBITRICES L'invention se rapporte au traitement de pathologies virales ou non virales dans lesquelles sont impliquées des protéines, dont la synthèse est initiée par le biais d'un site d'entrée interne des ribosomes (IRES), dont au moins une partie de la séquence est similaire d'un IRES à l'autre. Parmi ces pathologies figurent notamment mais de façon non limitative, parmi les pathologies virales, les virus appartenant à la famille des Flaviridae tels que le virus de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV), et parmi les pathologies non virales, les cancers dans lesquels sont impliquées certaines protéines, telles que par exemple les facteurs de croissance fibroblastiques responsables de la néovascularisation des tumeurs en développement, le proto-oncogène c-myc etc.... Plus précisément, le traitement proposé dans l'invention consiste à empêcher la fixation du facteur d'initiation de la traduction, eIF3, sur l'ARN constitutif de la partie 5'non codante de la séquence IRES (Internai Ribosome Entry Site) des génomes viraux ou de certains gènes impliqués dans les pathologies précitées, de sorte à inhiber la synthèse protéique. En conséquence, l'invention a également pour objet un procédé de criblage de molécules aptes à inhiber la formation du complexe : séquence de l'IRES / eIF3, en particulier la sous-unité protéique pi 10 (également dénommée pi 16 (BLAST P55884)) de eIF3. Le processus de recherche et développement de nouvelles molécules thérapeutiques Drug Discovery nécessite avant tout l'identification de nouvelles cibles associées aux maladies (protéine, ARN ou ADN) et leurs validation. La cible identifiée et validée est ensuite utilisés dans des tests de criblage de molécules, qui permettent de sélectionner des molécules actives. C'est cette approche qui est proposée par le Demandeur, la cible étant constituée par une séquence spécifique d'IRES. Dans la suite de la description, l'invention est plus particulièrement décrite en rapport avec le traitement du virus du VHC bien que celle-ci s'applique également au virus de la peste porcine (CSFV) ou celui de la diarrhée bovine (BVDV), et ce, compte tenu de la forte homologie existant entre ces virus appartenant à la même famille. Le virus de l'hépatite C a été identifié comme étant responsable de l'hépatite non A non B ' développée fréquemment au cours de pathologies chroniques malignes, du type par exemple cirrhose du foie ou encore carcinome hépato-cellulaire. Le VHC est transmis par transfusion sanguine ou de dérivés sanguins. Le génome du VHC se présente sous forme d'ARN simple brin d'une taille avoisinant les 9,4 kB et codant pour une polyprotéine unique constituée de 3 010 acides aminés (CHOO et al., 1989). Contrairement au schéma classique, l'initiation de la traduction de l'ARN messager de VHC ne se fait pas par reconnaissance de la coiffe (ou CAP), puisque celle-ci est absente (traduction dite "cap-dépendante"), mais par le biais d'un site d'entrée interne des ribosomes (IRES), positionné au niveau de la région 5' non traduite (5'-UTR) du VHC, entre les nucléotides 40 et 372 de la séquence du VHC (traduction dite "cap- indépendante"). Le mécanisme de synthèse des protéines virales étant très différent de celui de la cellule-hôte, une stratégie possible de développement de nouvelles molécules thérapeutiques consiste à inhiber la synthèse protéique virale sans influence aucune sur la synthèse protéique de la cellule hôte. De plus, la séquence de l'IRES étant une région très conservée chez ce virus réputé très variable (92% d'homologie), on peut s'attendre à ce que l'utilisation de cette séquence comme cible, soit particulièrement intéressante. Différentes études de structures ont montré que l'IRES du VHC était replié sur lui-même pour former trois domaines ou régions, en boucle, respectivement les régions II (lia, IIb), III (IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IlIf) et IV tels que représentées sur la figure 1 (ZHAO et al, 2001), l'IRES comprenant en outre un codon start AUG. L'ARN simple brin du CSFV et du BVDV contient également une séquence IRES contenant un codon start AUG, la structure de l'IRES étant similaire à celle du VHC (figure 1) En outre et comme le montre la figure 2, l'alignement des séquences constitué du génome de ces trois virus montre une forte homologie de la région II de l'IRES, notamment du site de reconnaissance MRR, ce qui tend à laisser penser que les molécules agissant sur l'IRES du VHC pourraient également agir sur celui du CSFV ou du BVDV. En pratique, l'initiation de la traduction de l'ARNm débute par la reconnaissance et la fixation par l'IRES de la sous-unité ribosomique 40S et de facteurs d'initiation, en particulier, le facteur d'initiation dénommé "eIF3". Le facteur d'initiation eIF3 est un complexe multiprotéique constitué de 10 sous-unités différentes telles que par exemple p47, p66, pi 10/166 et p170. Les études de prédiction de structures ont montré que la sous-unité p1 10 présentait dans sa partie centrale, située entre les acides aminés 185 et 279, un motif de reconnaissance de l'ARN (MRR). La localisation du motif de reconnaissance de la sous-unité pi 10 de eIF3 est représentée sur la figure 2. Ce type de motif est retrouvé dans un grand nombre de protéines se liant à l'ARN (RNA binding protein), telles que par exemples les protéines hnRNP ou encore snRNP, mais également dans quelques protéines se liant à de l'ADN simple brin. D'après les algorithmes de prédiction de structure secondaire, la partie centrale de la sous-unité pi 10 est repliée selon une conformation similaire à celle des MRR connus pour les acides aminés conservés IVVD et TK/RGF/YVE localisés dans des feuilles 1 et 3 correspondants aux motifs de reconnaissance RNP-2 et RNP-1 (voir figure 2). Bien que de par sa structure secondaire et son homologie, le MRR de p116 de eIF3 réponde aux critères putatif RNA-binding protéines, sa réelle capacité à fixer l'ARN n'a jamais été mise en évidence auparavant. En effet, le document FR-A-2 815 358 décrit une méthode de traitement de l'hépatite C consistant à empêcher la synthèse protéique du VHC par inhibition supposée de la fixation de la sous-unité pi 10 de eIF3 sur la région III de l'IRES. Les molécules candidates à cette inhibition correspondent à des polypeptides présentant une affinité avec la région III de l'IRES supérieure à celle de la sous-unité pi 10 de eIF3. En pratique, les inhibiteurs polypeptidiques sont obtenus par criblage de protéines pi 10 mutées avec la séquence IRES de VHC. Plus précisément, seule la partie centrale correspondant au motif de reconnaissance (MRR) est mutée, le polypeptidique étant susceptible de se fixer sur la boucle IIIb de l'IRES de VHC avec une affinité supérieure ou égale à celle du MRR non muté de pi 10. En pratique, les mutations sont introduites dans le MRR par mutagénèse aléatoire ou par mutagénèse ciblée selon la technique de phage display. Là encore, aucune indication n'est donnée concernant la séquence nucléotidique de la région III de l'IRES susceptible d'interagir avec le MRR muté. En outre, aucun résultat d'une éventuelle inhibition n'est donné dans les exemples. Sizova et al, 1998, ont montré que eIF3 protégeait la région apicale IIIb de l'IRES du VHC et du CSFV, en particulier les Nt 204,212, 214,215 et 220 (voir figure 1 du document), du clivage enzymatique ou de modifications chimiques. Plus récemment, Kieft et al, 2001, en utilisant les mêmes méthodes que celles mises en #uvre par SIZOVA précité, ont identifié les nucléotides de la boucle IIIb comme étant les éléments principaux de l'interaction. De plus, en utilisant la technique dite filter-binding assay , ces différents auteurs ont montré que la délétion de la région apicale IIIb entraînait une diminution de l'interaction eIF3-IRES d'au moins 10-fois. Ainsi, la boucle apicale IIIb est actuellement considérée comme étant le site le plus probable de fixation de eIF3. Toutefois, aucun de ces documents ne montre de manière précise l'existence d'une interaction entre le domaine IIIb isolé et eIF3. De même, aucun d'entre eux n'identifie une séquence d'ARN spécifique se liant à eIF3. Buratti et al, 1998, a montré que les protéines p170 et 116/p110 de eIF3 se liaient à la région III de l'IRES de VHC sans toutefois, là encore, identifier la séquence d'ARN de l'IRES envisagée. On sait que les ARN-binding protéines et leur MRR ne reconnaissent que des séquences courtes ( 35nt) susceptibles d'inhiber la formation du complexe ARN/protéine ou dans le cas d'ARNi (ARN d' interférence ou silencing de taille comprise entre 21-23 nt) de cibler la région d'interaction. L'identification de la séquence minimale est également essentielle pour effectuer les études structurales nécessaires pour le criblage in silico ainsi que pour l'optimisation de molécules actives. Selon une technique connue de l'homme du métier, on recherche la structure atomique du complexe ARN/protéine ou ARN seul en 3 dimensions par RMN. On sait que cette technique ne peut être utilisée que pour des fragments d'ARN seul ou complexé, de faible taille (inférieure à 25 Nt). Une seconde technique correspond à la cristallographie aux rayons X, technique qui peut être appliquée aux fragments d'ARN de plus grande taille limitée toutefois à 70nt. Au contraire, la cristallographie des protéines n'est pas limitée par la taille mais ne peut cependant n'être appliquée que sur des protéines isolées et non sur des complexes multiprotéiques, tels que eIF3. Mais dans la mesure où le MRR de eIF3 a été préalablement identifié, cette seconde technique peut être également envisagée à la condition de travailler sur des ARN de taille la plus faible possible, inférieure à 70 Nt. En d'autres termes, l'un des problèmes que se propose de résoudre l'invention est ' d'identifier précisément la plus petite séquence d'ARN de l'IRES se liant au MRR de pi 10, de sorte à pouvoir utiliser cette séquence dans des méthodes de criblage de molécules d'intérêt, notamment par RMN ou cristallographie. Au cours de sa recherche, le Demandeur a non seulement découvert que la sous-unité p 110 de eIF3 ne se fixait pas sur la région III mais sur la région II de l'IRES de VHC, mais également réussi à identifier précisément la séquence nucléotidique de l'IRES, dénommée par la suite séquence consensus, interagissant avec le MRR de p1 10. Compte tenu de l'homologie existant entre la séquence IRES de VHC et celles du CSFV et du BVDV, la découverte de la séquence consensus permet d'envisager de traiter les différentes pathologies dans lesquels ces virus sont impliqués, en bloquant la synthèse protéique par inhibition de la fixation de la sous-unité protéique pi 10 de eIF3, en particulier de son MRR, sur la région II de l'IRES de VHC. Les molécules candidates peuvent être des molécules existantes ou futures dont les propriétés inhibitrices sont testées par criblage. En conséquence, l'invention concerne tout d'abord un procédé de criblage de molécules selon lequel, in vitro : a/ on incube ensemble la sous unité pi 10 (SEQ ID4) de la protéine eIF3, la séquence nucléotidique de la région II (SEQ ID2) de l'IRES de VHC ou toute séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2) de l'IRES de VHC et la molécule à tester, b/ on détecte ensuite la formation éventuelle de complexe p110 / région II IRES, l'absence de complexe témoignant de la capacité inhibitrice de la molécule testée, à inhiber la formation desdits complexes, c/ on sélectionne les molécules inhibant la formation des complexes. Par molécule, on désigne toute molécule chimique d'origine synthétique ou naturelle, connue ou future. Comme déjà dit, la sous unité pi 10 de eIF3 contient un motif de reconnaissance de l'ARN (MRR) situé dans la partie centrale, plus spécifiquement entre les acides aminés 175 et 279 de la séquence SEQ ID4. La séquence d'acides aminés du MRR de pi 10 correspond à la séquence SEQ ID5. En d'autres ternies et dans un mode de réalisation avantageux du procédé de criblage de l'invention, seule la séquence du motif de reconnaissance de la protéine pi 10 (SEQ ID5) est incubée. Par ailleurs et comme il sera démontré dans les exemples, le Demandeur à identifié précisément la séquence de la région II de l'IRES du VHC se liant au motif de reconnaissance de la protéine pi 10. Cette séquence dénommée dans la suite de la description "séquence consensus" contient 36 nucléotides situés entre les nucléotides 56 et 92 de la séquence IRES du VHC. La séquence de 35 nucléotides correspond à la séquence SEQ ID3. En conséquence et dans un mode de réalisation préféré, seule une partie de la région II est incubée et correspond à la séquence nucléotidique consensus SEQ ID3 ou une séquence comprenant au moins 8nt successifs de la séquence SEQ ID 3. En pratique, l'incubation est effectuée dans une solution tampon à température ambiante. Avantageusement, des concentrations croissantes de molécules à tester sont incubées afin de détecter une efficacité éventuellement dose dépendante. La seconde étape du procédé consiste à détecter la formation de complexe protéine / ARN. Toute méthode de détection connue de l'homme du métier peut être mise en #uvre. Avantageusement, la détection est effectuée par filtration du mélange au travers d'une membrane de nitrocellulose, puis par mesure de la radioactivité liée à la membrane correspondant à la quantité d'ARN fixée sur la membrane. D'autres techniques peuvent être utilisées telles que SPA (Scintillation Proximity Assay), HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence), LANCE (Lanthanide Chelation Excitation), FP(Fluorescence Polarization), FCS (Fluorescence Corrélation Spectroscopy), FL (Fluorescence Lifetime Measurements). Dans un mode de réalisation avantageux, le procédé de criblage de l'invention comprend deux étapes supplémentaires consistant à tester, ex vivo, l'influence de la molécule sélectionnée sur la traduction cap-indépendante et la traduction cap-dépendante, et à ne retenir que les molécules inhibant la traduction cap-indépendante du VHC sans influencer la traduction cap-dépendante. Cette étape peut être mise en #uvre par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier par la construction de vecteurs bicistroniques constitués de deux luciférase encadrant la séquence de la région II (SEQ ID 2) ou toute séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2), ou la séquence consensus (SEQ ID 3) ou une séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3 ; la première luciférase étant traduite de manière cap-dépendante et la seconde de manière cap-indépendante ou inversement. Des cellules sont ensuite transfectées par les vecteurs bicistroniques puis le taux de traduction par Dual Luciférase est mesuré. Les cellules susceptibles d'être transfectées sont choisies de manière classique par l'homme du métier, telles que par exemples les cellule HeLa ou encore Huh 7. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation des molécules identifiées à l'issue du procédé de criblage précédemment décrit pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). Plus largement, toute molécule apte à d'inhiber in vitro la fixation de la protéine p1 10, en particulier son motif de reconnaissance (MRR) sur la région II ou une séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2), notamment une partie de la région II correspondant à la séquence SEQ ID3 ou une séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3, peut être utilisée pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). Dans le cadre d'un premier essai mettant en #uvre le procédé de criblage de l'invention, le Demandeur a constaté que les aminoglycosides, en particulier la tobramycine, étaient aptes à inhiber la fixation du MRR de p1 10 sur la séquence consensus de la région II de l'IRES et qu'en outre, cette inhibition n'affectait pas la traduction cap-dépendante. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation d'aminoglycosides, en particulier de la tobramycine, pour la fabrication d'une composition destinée au traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). Par ailleurs, la découverte de la séquence consensus rend possible l'utilisation d'un oligonucléotide anti-sens complémentaire de la séquence SEQ ID 3 ou toute séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3 comme médicament, en particulier pour le traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). Dans le même sens, des ARNi contenant 19 nucléotides de la séquence SEQ ID 3 (séquence consensus) flanqués par UU peuvent être utilisés comme médicament pour le traitement des mêmes pathologies que ci-avant. Dans un premier mode de réalisation, l'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un oligonucléotide anti-sens complémentaire de la séquence SEQ ID 3 ou toute séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3. Comme déjà dit, les molécules testées dans le procédé de criblage peuvent être des molécules connues telles que par exemple les aminoglycosides mais également des molécules restant à développer. Dans ce dernier cas, il apparaît possible, d'identifier in silico, à partir d'une bibliothèque de molécules, des molécules capables d'inhiber la synthèse protéique des virus appartenant à la famille de Flaviridae. En conséquence, l'invention. concerne également un procédé de criblage d'une bibliothèque de molécules in silico consistant : - à déterminer les coordonnées atomiques soit de la région II de l'IRES (SEQ ID 2) du VHC ou de toute séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2) de l'IRES de VHC, soit de la séquence se liant spécifiquement au MRR de la protéine PI 10 de eIF3 (SEQ ID 3) ou une séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3, soit du complexe de la région II (SEQ ID 2) ou de la séquence spécifique (SEQ ID 3) avec le motif de reconnaissance de la protéine p1 10 de eIF3 (SEQ ID 5) - puis à cribler la bibliothèque de molécules chimiques avec les coordonnées atomiques ainsi déterminées. Toute logiciel connu de l'homme du métier pourra être utilisé pour la détermination des coordonnées atomiques. Les molécules ainsi identifiées pourront alors être testées dans le procédé décrit précédemment consistant à détecter in vitro des complexes ARN/protéine. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de l'exemple de réalisation suivant à l'appui des figures annexées. La figure 1A est une représentation de la structure de l'IRES de VHC. Celui-ci est constitué de 3 domaines en boucle, II (IIa, IIb), III (IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IIIf) et IV. La figure 1B correspond à un alignement de séquences d'une partie de l'IRES de VHC, du BVDV et du CSFV (Nt 1 à 120). Comme le montre cette figure, il existe une forte homologie entre ces trois virus, notamment entre les nucléotides 80 et 110 situés dans la région II. La figure 2 montre la localisation du Motif de Reconnaissance de l'ARN dans la sous-unité p1 10 de eIF3 et la prédiction de sa structure secondaire. La Figure 3 compare la capacité du MRR de p 110 à se fixer sur les régions II, IIIabc, IIIefIV et la totalité de l'IRES de VHC. La figure 4 est un schéma montrant le principe du procédé de production de sous-fragments aléatoires de l'IRES de VHC. La figure 5 est un schéma montrant le principe du procédé de sélection des sous-fragments aléatoires spécifiques du MRR de p110 de eIF3 obtenus selon le schéma de la figure 4, (SA) et les séquences des matrices de transcription et des amorces utilisées (5B). La Figure 6 représente les résultats d'alignement de séquences d'ARN (orientation antisens) sélectionnés a la fin des 4ème et Sème cycle de selection/amplification (6A) et la localisation de la séquence consensus (orientation sens) dans l'IRES du VHC (6B). La figure 7 montre la capacité de la séquence consensus à inhiber l'interaction entre IRES et MRR de pi 10. La figure 8 représente l'effet des aminoglycosides sur la traduction cap-dépendante ex vivo. La figure 9 représente la capacité des aminoglycosides à inhiber la fixation du MRR ' d'eIF3 sur la séquence consensus de la région II de l'IRES de VHC. Exemple 1 : Mise en évidence de la capacité du motif de reconnaissance (MRR) de p110 à se fixer sur la région II de l'IRES de VHC 1/ Clonage et expression du motif de reconnaissance de pi 10 de eIF3 La séquence d'acides aminés du motif de reconnaissance (MRR) de la protéine pi 10 correspond à la séquence SEQ ID5 située entre les acides aminés 175 et 279 de la séquence SEQ ID4 (correspondant à la séquence de la protéine p110). L'ADNc codant pour le MRR est amplifié par RT-PCR à partir d'ADN extrait de cellules HeLa en présence des amorces suivantes : - SEQ ID6 : CATATGGATCGGCCCCAGGAAGCAGATGGAATC - SEQ ID7 : GTGCTCGAGCCACTCGTCACTGATCGTCATATA Le fragment amplifié est clone dans un plasmide pET-30b (Novagen) en fusion avec His6-Tag C-terminal entre les sites Nde et Xho. La protéine est ensuite produite dans E. Coli (souche BL21lysS) puis' purifiée sur Ni2+ - NTA agarose dans des conditions natives. 2/ Synthèse de l'IRES total et ses fragments IIIabc, IIIefIV et IIab a/ Principe On synthétise et on clone 4 séquences nucléotidiques différentes, respectivement : - une séquence nucléotidique correspondant à la totalité de l'IRES située entre les nucléotides 40 et 372 de l'ADN de VHC (b), - une séquence nucléotidique correspondant à la région IIIabc, située entre les nucléotides 141 et 252 de l'ADN de VHC (c), - une séquence nucléotidique correspondant à la région IIIefIV située entre les nucléotides 250 et 372 de l'ADN de VHC (d), - une séquence nucléotidique correspondant à la région IIab située entre les nucléotides 40 et 119 de l'ADN de VHC (e). b/ Clonage de la totalité de la séquence nucléotidique de l'IRES (SEQ ID1) ' L'ADNc de l'IRES (SEQ ID1) est amplifié par RT-PCR à partir d'ARN total isolé de patients atteints du VHC (génotype lb) en présence des amorces nucléotidiques suivantes : SEQID8:ACCGCTAGCCTCCCCTGTGAGGAACTACT SEQ ID9GAAAGCTTTTTTCTTTGAGGTTTAGGATTTGTGCTCATGATGC ACG Le fragment amplifié est d'abord cloné dans un plasmide pGEM-T puis ensuite dans pSP-luc+ (Promega) entre des sites NheI et Hind III. Le plasmide pSP-IRES-luc+ ainsi obtenu contient l'IRES du VHC cloné en fusion avec la luciférase sous contrôle du promoteur SP6. Une fois séquencée (GenomeExpress, Grenoble), la séquence de l'IRES a été alignée et comparée aux autres séquences d'IRES déposées dans les banques (telles que D49374 ou AF139594). L'identité observée était de 96,6% ce qui correspond au taux moyen de variabilité génomique des IRES entre différentes souches du VHC. c/ Synthèse de la région IIIabc La synthèse de l'ADNc de la région IIIabc est effectuée de la manière suivante. Deux oligonucléotides chevauchant, dont le premier, SEQ ID10, est constitué du promoteur de la T7 polymérase et de la séquence nucléotidique de la région IIIa et IIIb (Nt 139-215 de l'ARN de VHC) et le second, SEQ ID11, de la séquence nucléotidique de la région IIIb et IIIc (Nt 193-252 de l'ARN de VHC) sont hybridés en présence d'un fragment de Klenow. Les oligonucléotides ont les séquences suivantes : - SEQIDlO:TAATACGACTCACTATAGGGTAGTGGTCTGCGGAACCGGT GAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATAAACCCGCT CAA - SEQ ID11 : TAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTG AGCGGGTTGATCCAAGAAAG Le fragment d'ADNc double brins obtenu est ensuite amplifié par PCR en présence de T7 correspondant à la SEQ ID 12 : TAATACGACTCACTATAGGG. et d'un oligonucléotide flanquant dont la séquence est la suivante : - SEQID13:TAGCAGTCTCGCGGGGGCACG d/ Synthèse de la région IIIefIV L'ADNc correspondant à la région IIIefIV (Nt 250-372) a été obtenu par amplification PCR du plasmide pSP-AIRES-luc+ à l'aide des amorces dont les séquences nucléotidiques correspondent à celles de SP6 (SEQ ID 14 TATTTAGGTGACACTATAGAAT) et SEQ ID13. Le plasmide pSP-AIRES-luc+ résulte de la digestion du plasmide pSP-IRES-luc+ par NheI, les sites de coupure étant situés entre les nucléotides 39/40 et 248/249 de l'IRES. Le produit d'amplification SP6-> SEQ ID13 est ensuite utilisé comme matrice dans la réaction de transcription in vitro à l'aide de la SP6-polymerase (SP6 MEGAscript, Ambion). e/ Synthèse de la région Ilab L'ADNc correspondant à la région IIab a été obtenu par amplification par PCR du plasmide pSP-IRES-luc+ à l'aide des amorces SP6 (SEQ ID 14) et SEQ ID 15 GTCCTGGTGGCTGCAGGACACTCATAC. Le produit d'amplification SP6 -> SEQ ID est ensuite utilisé comme matrice dans la réaction de transcription in vitro à l'aide de la SP6-polymerase. 3/ Fixation du MRR de pl 10 sur l'IRES et ses domaines IIIabc, IIIeflV, Ilab Des fragments d'ARN radiomarqués sont obtenus par transcription in vitro des matrices précitées en présence de [a-32P]UTP. Les fragments d'ARN sont purifiés dans un gel à 6 % d'acrylamide-urée et précipités. Les culot d'ARN sont repris dans 25mM Tris-HCI, pH 7,4. Afin de permettre la rénaturation, l'ARN a été incubé à 65 C dans le tampon précité pendant 5-7min puis lentement refroidi jusqu'à température ambiante. Les ARN rénaturés ont été incubés avec des concentrations croissantes de protéine dans le même tampon 25mM Tris-HCl, pH 7,4, à température ambiante pendant 5 min. Le mélange de protéines et d'ARN est ensuite déposé sur une membrane de nitrocellulose préalablement lavée avec le même tampon. La radioactivité du filtre contenant les complexes ARN-protéine a été mesurée à l'aide de compteur de radioactivité MicroBeta Trilux (PerkinElmer). Dans l'hypothèse d'une inhibition compétitive, le MRR de pi 10 a été préalablement incubé avec de l'ARN non radiomarqué (concentration : protéine 0,7 uM, ARN : 0,1 à 1 M) pendant 30 min à température ambiante suivi de l'ajout de l'ARN de l'IRES radiomarqué. L'analyse de fixation de l'ARN sur la protéine a été effectuée exactement comme décrit ci-dessus. 4/ Résultats L'affinité des motifs de reconnaissance d'ARN (MRR) de la sous-unité pi 10 de eIF3 pour l'IRES entier et ses fragments II, IIIabc et IIIeflV a été étudié par rétention sur nitrocellulose. Comme il apparaît sur la Figure 3, la protéine fixe l'IRES avec un Kd apparent de 0,8 M. Cependant, l'affinité de MRRpllO pour le fragment IIIabc (site putatif de fixation de eIF3) est significativement inférieure à celle pour l'IRES et comparable à celle pour IIIeflV utilisé comme témoin négatif. Cela était inattendu, d'autant que les résultats publiés antérieurement supposaient que la partie apicale de la boucle formant la région IIIb était le site probable de fixation de eIF3 ( Sizova D, 1998, Buratti, 1998 Kieft et al, 2001), FR-A-2 815 358. En réalité et comme montre cette figure, le motif de reconnaissance de eIF3 se trouve non pas sur la région IIIabc mais sur la région II. Exemple 2 : Identification de la séquence consensus se liant au MRR pi 10 1/ Production de sous-fragments aléatoires de l'IRES de VHC et procédé de sélection de fragments spécifiques se fixant au MRRpl 10 de eIF3 La méthode dénommée SERF (Selection of Random Fragments) décrite par STELZ (2000) est utilisée pour synthétiser les séquences aléatoires de l'IRES. Son principe est représenté sur la figure 4. a/ Production des sous-fragments 2 ug ADNc de l'IRES sont digérés par 5U d'une Dnase 1 (Rnase-free, Amersham), à température ambiante, pendant 15 minutes, permettant d'obtenir des fragments d'ADNc, dont la taille varie entre 30 et 100 nucléotides. Des bouts francs sont générés à l'extrémité des fragments d'ADNc obtenus, par Taq-polymérase à 72 C, pendant 10 minutes dans un tampon PCR à base de dNTP 1 mMol. La Taq-polymerase ajoute en même temps des résidus supplémentaires dA à l'extrémité 3' de fragments (Figure 4). Ceci permet d'augmenter l'efficacité de ligation des fragments obtenus dans le vecteur pGEM-T-Easy (Promega), muni à son tour de dT complementaires à l'extremités 5' (Figure 4). Les fragments d'ADN sont ensuite clonés en présence de T4 DNA ligase (BioLabs) dans un vecteur pGEM-T Easy (Promega) entre les promoteurs T7 et SP6. Les fragments d'ADN sont ensuite amplifiés en présence des oligonucléotides T7 et SP6 puis le produit d'amplification est utilisé comme matrice pour la transcription par SP6 (MEGAscript, Ambion). Les transcrits de taille supérieurs à 200nt correspondant aux transcrits avec l'insert > 60nt ont été purifiés sur gel d'acrylamide 10 % 8M urée (figure 4, M correspondant à des marqueurs ARN "Century markers", Ambion). b/ Sélection des sous-fragments La protéine recombinante MRRp110 de eIF3 est purifiée sur colonne Ni-NTA-agarose dans des conditions natives (figure 5). La protéine purifiée est ensuite incubée avec la bibliothèque constituée des fragments d'ARN purifiés obtenus ci-avant dans un tampon 25mM Tris-HCl, pH 7,4 pendant 15 min à température ambiante. La concentration de l'ARN est, au départ égale à 0,2 M et celle de la protéine, égale à 0,8 M. Le mélange protéine / ARN est ensuite déposé sur une membrane de nitrocellulose préalablement lavée avec le même tampon. Le filtre contenant les complexes ARN-protéine est ensuite coupé en morceaux et l'ARN est extrait avec une solution SDS, 0,1%, sodium acetate 0,3M pH 5,0 pendant une heure à température ambiante. L'ARN est ensuite récupéré par précipitation dans l'éthanol en présence d'ARNt utilisé pour faciliter la précipitation. Le culot d'ARN est ensuite repris dans 10 l d'eau et soumis à une transcription inverse en présence de la reverse transcriptase Stratascript de l'oligonucléotide T7 (Stratagene). Les fragments d'ADN simple brin sont ensuite amplifiés par PCR au moyen de l'oligonucléotide T7 (SEQ ID 14), de l'oligonucléotide SP6 (SEQ ID 14) et de la séquence SEQ ID 16 correspondant à la région linker adjacente à SP6. - SEQ ID 16: TATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCAT CCAACGCGTTG Une PCR de contrôle est conduite parallèlement avec les oligonucléotides SP6 et T7 afin de confirmer l'absence d'ADN-matrice contaminant, parmi les ARN sélectionnés. Les fragments amplifiés par PCR sont ensuite purifiés puis utilisés comme matrice de transcription dans le cycle suivant. Le cycle de sélection / amplification est répété 5 fois. Les produits de RT-PCR sont analysés sur gel d'agarose 2 % (figure 5 : #x sont des markers ADN (stratagène), 1 et 2 sont des produits d'amplification obtenus avec les amorces SP6 ou SEQ ID16. La concentration d'ARN lors des cycles ultérieurs est égale à 0,058 M et celle de la protéine est diminuée régulièrement d'une valeur de 1,2 uM lors du second cycle à une valeur de 0,2 M au cinquième cycle. Les produits de RT-PCR obtenus après les quatrième et cinquième cycles sont clonés dans un plasmide pTrcHis2TOPO (Invitrogen) choisi pour faciliter le procédé de clonage en l'absence du promoteur T7. Les plasmides ont été purifiés et séquences. Les séquences obtenues ont été alignées à l'aide de logiciel Clustal W DNA (Thompson , J.D.et al CLUSTAL W : improving the sensitivity of progressive multiple séquence alignment through séquence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. (1994) Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680 ) disponible sur le site du Pôle Bio-Informatique Lyonnais. 2/ Résultats Comme illustré figure 6A, parmi 16 séquences d'ARN sélectionnés, clonés au bout de 4 et 5 cycles et séquences à l'aide T7 amorce, 13 clones contiennent la séquence ACGCCATGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTA correspondant à l'anti-sens de nt 56-92 de la séquence SEQ ID1, 2 clones contiennent CGCCTCATGCCTGGAGAT (nt 61-72 de SEQ ID1) et un clone montre une homologie avec la partie 84-90 de SEQ ID 1. Ainsi, ces résultats identifient la région de l'IRES 56-92 SEQ ID3 TACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTT comme correspondant au site de fixation de MRR pi 10 (figure 6B). L'hypothèse de l'inhibition compétitive offre un moyen supplémentaire d'étude de la spécificité de l'interaction en question. Comme il est indiqué sur la figure 7, les séquences consensus des clones 4-35 (DOR 4-35) et 5-4 (DOR 5-4) sont les inhibiteurs les plus efficaces (après l'IRES lui-même) de l'interaction IRES-MRR de pi 10. Ces résultats confirment que la séquence consensus identifiée est un déterminant de la fixation de MRR p 110 sur l'IRES entier. Exemple 3 : de criblage in-vitro L'intérêt de la présente découverte est de chercher à inhiber la fixation du MRR de p110 sur la séquence consensus SEQ ID 3 de la région II de l'IRES pour empêcher l'initiation de la traduction et par conséquent la synthèse protéique par le VHC. Parmi les molécules potentielles, le Demandeur a sélectionné les aminoglycosides. Le test de criblage est effectué comme suit. On incube le MRR de p110 et la séquence consensus de la région II en présence de différents aminoglycosides. Le mélange d'ARN est ensuite déposé sur une membrane de nitrocellulose dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2. Les résultats sont représentés sur la figure 8. Parmi les 15 aminoglycosides testés à 4 concentrations différentes, la tobramycine est le seul aminoglycoside capable d'inhiber la formation des complexes ARN-protéines à toutes les concentrations testées. Exemple 4 : de la traduction cap-indépendante ex vivo Dans cet exemple, on confirme les résultats de l'exemple 2 en démontrant que l'inhibition de la formation du complexe protéines/ ARN empêche la traduction cap-indépendante dans des cellules ex vivo. a/ Préparation de vecteurs bicistroniques Des construits bicistroniques constitués d'un premier cistron correspondant au gène de la luciférase Renilla, suivi de la séquence IRES, suivi d'un second cistron correspondant au gène de la luciférase Firefly (pRluc-IRES-Fluc) sont préparés de la façon suivante. Un plasmide pRL-SV40 (Promega) est linéarisé avec Xba I et déphosphorylé. Parallèlement, l'IRES est amplifié avec le gène de la luciférase Firefly par PCR, en présence d'oligonucléotides complémentaires contenant les sites XbaI. Les produits de PCR sont ensuite sous-clonés dans le plasmide pTrcHis2-TOPO (Invitrogen) afin de contrôler la digestion. La ligation de l'insert contenant l'IRES avec le gène de la luciférase Firefly et le vecteur pRL-SV40 linéarisé est effectuée à l'aide de T4 DNA ligase (Biolabs). b/ Transfection de cellule HeLa 107 cellules HeLa suspendues dans du DMEM exempte de sérum sont transfectées par 1 à 2,5 ug de plasmide pRluc-IRES-Fluc par électroporation à 0,5 V pendant 30 millisecondes au moyen d'un Gène Pulser (BioRad). Les cellules sont ensuite cultivées dans des plaques 24 ou 96 puits en présence de différentes aminoglycosides, à des concentrations comprises entre 2 et 5 mM pendant 24-36hs. L'activité de luciferase Renilla (traduction cap-dépendante) et celle de la luciférase Firefly (traduction cap- indépendante=virale) dans les lysats cellulaires est mesurée et comparée au moyen du test Dual-luciférase (Promega) et dé luminometre Lumat LB9507 (Berthold). c/ Résultats D'après les résultats apparaissant figure 9, la tobramycine bloque la traduction "IRES dépendante" sans affecter la traduction cap-dépendante. Les aminoglycosides bloquent l'interaction IRES/ eIF3 dans la cellule et donc la synthèse de protéine virale. Cela signifie que les aminoglycosides, et plus particulièrement la tobramycine, peuvent être utilisés pour traiter l'hépatite C. BIBLIOGRAPHIE 1. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. (1989) Science 244 :359-62 "Isolationof a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome." 2. 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Stelz U, Spahn C, Nierhaus KH, (2000) Proc Natl Acad Scie USA 97, 4597-4602 Selecting rRNA binding sites for the ribosomal proteins L4 et L6 from randomly fragmented rRNA application of method called SERF REVENDICATIONS 1/ Procédé de criblage de molécules selon lequel, in vitro : a/ on incube ensemble la sous unité pi 10 (SEQ ID4) de la protéine eIF3, la séquence nucléotidique de la région II (SEQ ID2) de l'IRES de VHC ou toute séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2) de l'IRES de VHC et la molécule à tester, b/ on détecte ensuite la formation éventuelle de complexe p110 / région II IRES, l'absence de complexe témoignant de la capacité inhibitrice de la molécule testée, à inhiber la formation desdits complexes, c/ on sélectionne les molécules inhibant la formation des complexes. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que seule la séquence du motif de reconnaissance de la protéine pi 10 (SEQ ID5) est incubée. 3/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que seule une partie de la région II est incubée et correspond à la séquence nucléotidique consensus SEQ ID3 ou une séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3. 4/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule à tester est incubée à des doses croissantes. 5/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection est effectuée par filtration du mélange au travers d'une membrane de nitrocellulose, puis par mesure de la radioactivité liée à la membrane correspondant à la quantité d'ARN fixée sur la membrane. 6/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on teste ensuite, ex vivo, l'influence de la molécule sélectionnée en c) sur la traduction cap-indépendante et la traduction cap-dépendante pour ne retenir que les molécules inhibant la traduction cap-indépendante sans influencer la traduction cap-dépendante. 7/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on construit des vecteurs bicistroniques constitués de deux luciférase encadrant la séquence de la région II (SEQ ID 2) ou toute séquence contenant au moins 10 nucléotides successifs de la région II (SEQ ID 2), ou la séquence consensus (SEQ ID 3) ou une séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3 ; première luciférase étant traduite de manière cap-dépendante et la seconde de manière cap-indépendante ou inversement. 8/ Utilisation des molécules sélectionnées à l'issue de l'étape c/ du procédé de criblage objet de la revendication 1 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). 9/ Utilisation d'un aminoglycoside pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV). 10/ Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'aminoglycoside est la tobramycine. 11/ Composition pharmaceutique comprenant un oligonucléotide anti-sens complémentaire de la séquence SEQ ID 3 ou toute séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3. 12/ Utilisation d'un oligonucléotide anti-sens complémentaire de la séquence SEQ ID 3 ou toute séquence comprenant au moins 8 nucléotides successifs de la séquence SEQ ID 3 comme médicament, pour le traitement de l'hépatite C (VHC), de la peste porcine (CSFV), de la diarrhée bovine (BVDV).