Brevet FR2850378A1 — publié le 20040730

DESCRIPTION La présente invention concerne de nouveaux substrats enzymatiques chromogènes pour la détection d'activité aminopeptidase. Ces substrats sont utilisables dans les applications comportant une étape d'hydrolyse enzymatique produisant un signal physico-chimique notamment en microbiologie, biochimie, immunologie, biologie moléculaire, histologie, etc. L'invention concerne également des milieux de culture contenant de tels substrats, l'utilisation des substrats ou des milieux pour la détection d'activités aminopeptidases et/ou la différentiation de bactéries à Gram positif par rapport à des bactéries à Gram négatif et des procédés d'utilisation. Comparativement, aux substrats existants, la plupart fluorigènes, ils peuvent être utilisés notamment en milieu gélifiés pour la détection de micro-organismes car ils produisent une coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel donc concentrée au niveau des colonies. Des substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection d'activité aminopeptidase ne diffusant pas sont décrits et déjà connus de l'état de la technique. Ainsi, de tels substrats sont couverts par les demandes de brevet WO-A-98/04735 et WO-A-99/38995 déposées par la Demanderesse. Néanmoins, ces substrats présentent différents inconvénients : leur synthèse et difficile, la pureté est réduite et les rendements faibles. De plus, pour une utilisation en milieux de culture, il faut définir une composition de milieu très précise pour observer une couleur. Aucun des autres substrats actuellement décrits, ne peut être utilisé en milieux solides pour la détection de micro-organismes en cultures mixtes. D'autre part, des molécules à base d'acridine sont connues. Elles sont utilisées pour : # leurs propriétés de colorant, voir par exemples Rapposch S. et al. J. Dairy Sci. 2000 Dec ; 83 (12) : 2753-2758, ou bien par exemple Giorgio A. et al. Microbiologica 1989 Jan ; 12 (1) : 97-100, # leurs propriétés chimiothérapeutiques, par exemple Costes N. et al. J. Med. Chem. 2000 Jun 15 ; (12) : 2395-2402, ou # effectuer des intercalations dans l'ADN, par exemples Okwumabua O. et al. Res. Microbiol. 1992 Feb ; 143(2) : 183-189 ou encore par exemple Schelhorn T. et al. Cell. Mol. Biol. 1992 Jul ; (4) : 345-365. Le brevet EP-B-0. 270.946 propose des substrats enzymatiques chromogéniques à base d'acridinone, qui est un dérivé de l'acridine. Le radical, qui peut être clivé par une enzyme, est présent au niveau de la position 7 du groupement acridine. Sa structure ne permet la révélation que des activités enzymatiques suivantes : estérases et glycosidases. Conformément à la présente invention, il est proposé de nouveaux substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection chez des micro-organismes d'une activité aminopeptidase ou pour définir l'appartenance d'au moins une bactérie au groupe des Gram positifs ou des Gram négatifs selon sa coloration. L'invention concerne également des milieux de culture contenant de tels substrats, l'utilisation des substrats ou des milieux pour la détection d'activités aminopeptidases et/ou la différentiation de bactéries à Gram positif par rapport à des bactéries à Gram négatif et des procédés d'utilisation A cet effet, la présente invention concerne des substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection chez des micro-organismes d'une activité aminopeptidase ou pour définir l'appartenance d'au moins une bactérie au groupe des Gram positifs ou des Gram négatifs selon sa coloration. Ils ont la formule suivante : dans laquelle : # R1 est rien ou un groupement alkyle, allyle, aryle, # R2 est constitué par au moins un acide aminé, préférentiellement alanine, # R3, R4 R5 et R6 sont constitués indépendamment l'un de l'autre par H- ou -O-alkyle, préférentiellement -O-CH3, # R7 est constitué par H, O-CH3, alkyle ou halogène, ' Rg est constitué par H ou Cl, et # n est un chiffre entier correspondant à 0 ou 1 ou 2. Selon un mode de réalisation, le substrat a la formule suivante : ou il a la formule suivante : Selon un autre mode de réalisation, le substrat répond à la formule ci-dessus dans laquelle Ri est un groupement méthyle ou allyle. Selon encore un autre mode de réalisation, le substrat a la formule suivante : ou il a la formule suivante : L'invention concerne également un milieu de culture utilisant au moins un substrat chromogénique enzymatique, tel que décrit ci-dessus, seul ou en combinaison avec au moins un autre substrat enzymatique spécifique d'une activité enzymatique différente d'une activité de celle détectée par le substrat selon l'invention. Préférentiellement, ce milieu est constitué par un milieu gélifié. La présente invention a trait également à l'utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que décrits ci-dessus, ou d'un milieu de culture, également décrit ci-dessus, pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité aminopeptidase. La présente invention a toujours pour objet l'utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que décrits ci-dessus, ou d'un milieu de culture, également décrit ci-dessus, pour séparer les bactéries à coloration à Gram positif des bactéries à coloration à Gram négatif. L'invention concerne enfin un procédé pour la détection chez des microorganismes d'au moins une activité aminopeptidase, ce procédé consiste à : # disposer d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, # ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, # laisser incuber, et # révéler la présence d'au moins une activité aminopeptidase seule ou en combinaison avec au moins une autre activité enzymatique différente. L'invention concerne aussi un autre procédé pour la différentiation chez des bactéries de leur appartenance aux germes du type Gram positif ou aux germes du type Gram négatif, ce procédé consiste à : # disposer d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, # ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, # laisser incuber, et # révéler la présence d'au moins une coloration synonyme de la présence de germe(s) du type Gram négatif. Quelque soit le procédé utilisé, lorsque l'azote en position 10 du groupement acridine n'est pas quatemisé, la révélation de la présence d'au moins une activité aminopeptidase est réalisée par l'ajout d'acide, préférentiellement d'acide chlorhydrique, d'acide acétique ou d'acide citrique, sur la culture. Par quaternisé, il faut comprendre que l'azote en position 10 du groupement acridine est tétravalent, c'est-àdire qu'il est lié par trois liaisons classiques avec le cycle phényl et une liaison complémentaire avec un radical, de sorte que ledit atome d'azote est porteur d'une charge positive et est donc cationique. Dans ce cas, la molécule est sous la forme d'un sel, par exemple un sel de chlorure, bromure ou trifluoro acétate. Toutes les réactions, qui vont être décrites ci-dessous dans les exemples, ont été suivies en chromatographie sur couche mince (CCM) et les structures des produits ont été confirmées par spectrométrie de masse (MS) et résonance magnétique nucléaire (RMN). Exemple 1 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrats non quaternisés : 1.1 : Molécules utilisées : On a réalisé un étude comparative de deux substrats à base d'acridine le L-Alanyl-9- (4-aminostyryl)acridine, ci-après référencé L-Ala-4-ASA, et le L-Alanylaminophenylacridine (substrats non quatemisés), ci-après référencé L-Ala-APA, de formules respectives : L-Alanyl-aminophenylacridine L-Alanyl-9-(4-aminostyryl)acridine 1.2 : Synthèse des substrats.: 1.2.1 : Synthèse du L-Ala-4-ASA : Cette synthèse s'effectue en plusieurs étapes. Préparation de 9-chloroacridine : La préparation est effectuée en utilisant la méthode de Lehmstedt et Schrader qui a été référencée par Albert dans son livre 'The Acridines ', Arnold, second edition, (1966), page 33. Préparation de 9-méthylacridine La méthode de Campbell, Franklin, Morgan et Tivey (réf. J. Chem. Soc., 1958,1145) a été utilisée. Les rendements ont atteint 90%. Préparation de 9-(4-nitrostyryl) acridine par fusion Un mélange de 9-méthylacridine (4,83 g , 25,0 mmole), 4-nitrobenzaldéhyde (4,23 g, 31,25 mmole) et chlorure de zinc (5,06 g, 31,25 mmole) est chauffé à 130 C pendant 3 heures avec un bain d'huile. Le solide récupéré est chauffé dans une solution de sodium metabisulfite pour éliminer l'excès de l'aldéhyde et le mélange chaud est filtré. Des précipités obtenus sont dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofuranne et de l'eau est ajoutée dans la solution pour avoir le produit sous forme de précipités. Ces précipités sont récupérés par une filtration et séchés. Le produit peut être recristallisé dans l'éthanol. Le rendement est de 35%. Préparation de t-Boc-alanyl-9-(4-nitrostyryl) acridine Le produit t-Boc-alanine (3,79 g, 20,0 mmole) est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofuranne (THF) anhydride et la solution est refroidie à -15 C à l'aide d'un mélange éthylène glycol/carbone glace dans un bain. Le N-méthylmorpholine (NMM) (2,02 g, 20 mmole) est ajouté goutte à goutte dans le mélange. Le chloroformate d'isobutyle (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmole) est ensuite introduit goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Il faut que la température soit au-dessous de -10 C. Au bout de 3 minutes environ, le 9- (4-nitrostyryl) (5,4 g, 20 mmole), qui est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofuranne (THF) anhydride et refroidi à -15 C, est introduit. Le mélange réactionnel est agité et on le laisse revenir à la température ambiante. Le sel de N-méthylmorpholine est éliminé par une filtration avec un entonnoir à plaque filtrante. Le mélange est évaporé jusqu'à son quatrième volume original avec un évaporateur rotatif. Le filtrat est introduit goutte à goutte dans un mélange eau/glace en quantité importante sous agitation. Des précipités jaunes, formés, sont récupérés par une filtration, lavés avec de l'eau et séchés. Le produit peut être recristallisé dans le méthanol. Le rendement est de sensiblement 75 %. D'autres analogues des acides aminés protégés par le t-Boc ont aussi été utilisés pour former de nouveaux produits. Les acides aminés sont : la proline, la glycine, la sérine et la P-alanine. Les rendements pour ces produits sont dans la zone de 60 à 80 %, les résultats étant généralement les meilleurs pour les analogues de la P-alanine et les moins bons pour les analogues de la sérine. 1.2.2 : Synthèse du L-Ala-APA : La préparation de 9-(4-aminophényl) acridine par une réaction de soufre fondu peut être réalisée par deux méthodes différentes. Méthode A L'acridine chlorhydrique (9,7 g, 45,0 mmole), l'aniline (8,37 g , 90,0 mmole) et 10,0 g de soufre sont bien mélangés et chauffés à 130 C pendant 4 heures sous une hotte efficace. Le milieu réactionnel dans le ballon est refroidi à température ambiante et dissous dans le méthanol chaud pour donner une solution de couleur rouge sanguine. La solution est refroidie et le soufre est éliminé par une filtration. L'alcanilisation du filtrat est réalisée à l'aide d'une solution d'ammoniaque concentrée. Des précipités jaunes légers, formés, sont filtrés puis lavés avec le méthanol froid. Le rendement est de 65%. Méthode B L'acridine (8,06 g, 45,0 mmole), l'aniline chlorhydrique (11,61 g, 90 mmole) et 10,0 g de soufre sont bien mélangés et chauffés à 130 C pendant 4 heures. Le milieu réactionnel est ensuite traité comme dans la Méthode A ci-dessus. Ensuite on réalise une préparation sur la base de l'une et/ou l'autre des deux méthodes précédentes. Préparation de t-Boc-alanyl-9-(4-aminophényl) acridine Le produit t-Boc-alanine (3,79 g, 20,0 mmole) est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofuranne (THF) anhydride et la solution est refroidie à -15 C à l'aide d'un mélange éthylène glycol/carbone glace dans un bain. Le N-méthylmorpholine (NMM) (2,02 g, 20 mmole) est ajouté goutte à goutte dans le mélange. Le chloroformate d'isobutyle (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmole) est ensuite introduit goutte à goutte dans le mélange réactionnel. Il faut que la température soit au-dessous de -10 C. Au bout de 3 minutes environ, le 9- (4-aminophényl) (5,4 g, 20 mmole), qui est dissous dans une quantité minimum de tétrahydrofuranne (THF) anhydride et refroidi à -15 C, est introduit. Le mélange réactionnel est agité et on le laisse revenir à la température ambiante. Le sel de N-méthylmorpholine est éliminé par une filtration avec un entonnoir à plaque filtrante. Le mélange est évaporé jusqu'à son quatrième volume original avec un évaporateur rotatif. Le filtrat est introduit goutte à goutte dans un mélange eau/glace en quantité importante sous agitation. Des précipités jaunes, formés, sont récupérés par une filtration, lavés avec de l'eau et séchés, Le produit peut être recristallisé dans le méthanol. Le rendement est de 75%. D'autres analogues des acides aminés protégés par le t-Boc ont aussi été utilisés pour former de nouveaux produits. Les acides aminés sont : la proline, la glycine, la sérine et la (3-alanine. Les rendements pour ces produits sont dans la zone de 60 à 80% : les résultats étant généralement les meilleurs pour les analogues de la (3-alanine et les moins bons pour les analogues de la sérine. 1.3 : Préparation dumilieu.: Un milieu gélifié comprenant du L-Alanyl-9-(4-aminostyryl)acridine (ci-après référencé L-Ala-4-ASA) ou du L-Alanyl-aminophenylacridine (ci-après référencé LAla-APA) est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves. Ce milieu réactionnel est séparé en deux milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,3 g/1 de L-Ala- 4-ASA apporté par une solution mère dans du DMSO et 0,3 g/1 de L-Ala-APA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide chlorhydrique. 1.4: Résultats; Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. En absence d'HCl, les deux substrats ne donnent pas de coloration spontanée. En présence d'une goutte d'HCl, les colonies possédant l'activité L-Alanine-aminopeptidase sont colorées en gris-mauve à mauve. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolores. Ces substrats sont donc sensibles et spécifiques. Ils peuvent permettre dans le cas d'une culture mixte Gram positif et Gram négatif de séparer les deux types de germes. ~ ~ 0,3 g/1 ~#T 0,3 g/l 0,3 g/1 0,3 g/1 ESPECES (N souche L-Ala-4-ASA L-Ala-APA L-Ala-4-ASA L-Ala-APA interne) sans HCl sans HC1 avec HC1 avec HCI Escherichia coli incolore incolore gris mauve mauve pâle Proteus mirabilis incolore incolore gris mauve mauve très pâle pâle Klebsiella pneumoniae incolore incolore gris mauve mauve Enterobacter cloacae incolore incolore gris mauve mauve Citrobacter koseri incolore incolore gris mauve mauve Streptococcus agalactiae incolore incolore incolore incolore Enterococcusfaecalis incolore incolore incolore incolore Staphylococcus aureus incolore incolore incolore incolore Listeria innocua incolore incolore incolore incolore Candida albicans incolore incolore incolore incolore Tableau 1 : de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par la L-Ala-4-ASA ou la L-Ala-APA sur milieu gélifié Exemple 2 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide de substrat quatemisé : 2.1 : Moléculeutilisée : L'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié est réalisée par l'utilisation du L-Alanyl-9(4-aminophenyl)-10-allyl-acridinium chloride (substrat quatemisé), ci-après désigné L-Ala-4-AP-10-AA, de formule : L-Alanyl-9(4-aminophenyl)-10-allyl-acridinium chloride 2.2 : SynthèsedeL-Ala-4-AP-10-AA: Le composé de départ est le t-Boc-alanyl-9-(4-aminophényl) acridine dont la synthèse a déjà été exposée au paragraphe 1. 2.2 (Synthèse du L-Ala-APA). Dans un flacon de 10 ml qui peut être fermé, le t-Boc-alanyl-9-(4-aminophényl) acridine (0,88 g, 2,0 mmole) est introduit dans le tétrahydrofuranne anhydride (4,0 ml) et le mélange est mis en l' ébullition pour avoir une solution partielle. La solution / suspension est refroidie et l'allyle bromide (2,0 ml) est ajouté. Le flacon est ensuite fermé et incubé à 40 C pendant plus de 100 heures. Le réactif solide est dissous au fur et à mesure en formant une solution orange. Des cristaux orangés - noirs apparaissent dans cette solution. A l'issue des 100 heures, le mélange réactionnel est transféré dans l'acétate d'éthyle (100 ml) sous agitation. Après une durée nécessaire, le sel quaternaire est filtré et lavé avec l'éther éthylique. Le produit est dissous dans une quantité minimum d'éthanol et agité avec l'acétate d'éthyle (10 ml) saturé par HCl. Des précipités, qui sont formés quelques heures après, sont récupérés par une filtration sous pression réduite. L'introduction de l'éther éthylique dans le filtrat permet de récupérer le produit en plus. Les fractions réunies du produit sont lavées avec l'éther éthylique et séchées rapidement pour éviter l'absorption d'humidité. 2.3 : Préparation dumilieu.: Un milieu gélifié comprenant comme substrat du L-Ala-4-AP-10-AA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves. Ce milieu réactionnel est séparé en trois milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,1 g/1, 0,2 g/1, 0,4 g/1 de L-Ala-4AP-10-AA apporté par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. 2.4 : Résultats; Les résultats sont exprimés en intensité de coloration en se basant sur une échelle arbitraire allant de 0 à 4. Ces résultats sont présentés dans le tableau 2 cidessous . Ce substrat permet de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolores. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre dans le cas d'une culture mixte Gram positif et Gram négatif de séparer les deux types de germes. Le fait de quaterniser l'azote en position 10 du groupement acridine permet d'obtenir une réaction spontanée sans ajout d'acide comparativement à la même molécule non quatemisée décrite dans l'exemple 1. Temps 0,1 g/1 de 0,2 g/1 de 0,4 g/1 de SOUCHES d'incu L-Ala-4-AP-10-AA L-Ala-4-AP-10-AA L-Ala-4-AP-10-AA -bation Couleur Intensité Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 24 H beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 2,5 (032) 48 h beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 3 Proteus mirabilis 24 H beige traces rose-orange 0,5 rose-orange 3 (103) 48 h beige traces rose-orange 1 rose-orange 3 Klebsiella 24 H beige traces rose-orange 1 rose-orange 3 pneumoniae (023) 48 h beige traces rose-orange 2 rose-orange 3,5 Citrobacter koseri 24 H beige 0,5 rose-orange 1 rose-orange 3 (090) 48 h beige 0,5 rose-orange 2 rose-orange 3,5 Staphylococcus 24 H inhibé - inhibé- inhibéaureus (070) 48 h inhibé- inhibé- inhibéStreptococcus 24 H inhibé- inhibé- inhibépyogenes (067) 48 h incolore- incolore- incoloreEnterococcus 24 H incolore- orange traces orange traces faecalis (075) 48 h incolore- orange 0,5 orange 1 Listeria innocua 24 H incolore- incolore- incolore- (036) 48 h incolore- incolore- incoloreCandida albicans 24 H incolore- incolore- incolore- (056) 48 h incolore- incolore- incolore- Tableau 2 : de la concentration en substrat dans la révélation de l'activité L- Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par désigné la L-Ala-4-AP-10-AA Exemple 3 : de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un autre substrat quatemisé : 3.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé L-Alanyl-9(4-ammophenyl)-10-methyl-acridinium chloride (substrat quaternisé), ciaprès appelé L-Ala-4-AP-10-MA, dont la formule est la suivante : L-Alanyl-9(4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium chloride 3.2 : Synthèse de L-Ala-4-AP-10-MA: Cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 2. 2 ci-dessus, dans laquelle l'allyle bromide a été remplacé par l'iodure de méthyle. Il convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Ala-4-AP-10-MA. 3.3 : Préparation du milieu: Un milieu gélifié comprenant 300 mg/1 de L-Ala-4-AP-10-MA, est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves, le substrat est ensuite apporté par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur le milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. 3.4 : Résultats; Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous : SOUCHES Temps 0,3 g/1 de L-Ala-4-AP-10-AA d'incubation Couleur Intensité Escherichia coli 24 H rose-orange 3,5 (032) 48 h rose-orange 3,5 Proteus mirabilis 24 H rose-orange 1 (103) 48 h rose-orange 2 Klebsiella 24 H rose-orange 3 pneumoniae (023) 48 h rose-orange 3 Citrobacter koseri 24 H rose-orange 3 (090) 48 h rose-orange 3 Staphylococcus 24 H inhibéaureus (070) 48 h inhibéStreptococcus 24 H inhibépyogenes (067) 48 h inhibéEnterococcus 24 H rose traces faecalis (075) 48 h rose-orange 0,5 Listeria innocua 24 H incolore- (036) 48 h rose-orange traces Candida albicans 24 H incolore (056) 48 h incolore Tableau 3 : de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Ala-4-AP-10-AA dont la concentration en substrat est optimisée Ce substrat permet de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur rose-orange concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolores. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre dans le cas d'une culture mixte Gram +/Gram - de séparer les deux types de germes. Comparativement au substrat décrit dans l'exemple 2, il semble permettre d'obtenir des intensités de coloration plus fortes pour les souches positives. La différence entre ces deux substrats est le type de groupement en position 10 sur l'azote du noyau d'acridine. Exemple 4 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'autres substrats non quaternisés : 4.1 : Molécules, utilisées : La révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation de deux substrats appelés L-Alanyl-2methoxyaminophenylacridine, ci-après appelé L-Ala-2-MeOAPA, et L-Alanyl-2,5dimethoxyaminophenylacridine, ci-après appelé L-Ala-2,5-diMeOAPA, dont les formules sont respectivement les suivantes : L-Alanyl-2-methoxyaminophenylacridine L-Alanyl-2,5-dimethoxyaminophenylacridine 4.2 : Synthèse, des substrats.: 4.2.1 : Synthèse du L-Ala-2-MeOAPA : Sur la base de ce qui est décrit au point 1. 2.2 ci-dessus, d'autres analogues d'aniline sont aussi utilisés pour former des nouveaux produits, y compris l'anisidine (3-méthoxyaniline) qui donne le 9- (4-amino-2-méthoxyphényl) acridine.4.2.2 : Synthèse du L-Ala-2,5-diMeOAPA : Sur la base de ce qui est décrit au point 1. 2.2 ci-dessus, d'autres analogues d'aniline sont aussi utilisés pour former des nouveaux produits, y compris le 2,5-diméthoxyaniline qui donne le 9-(4-amino-2,5-diméthoxyphényl) acridine. 4.3 : Préparation du milieu.: Un milieu gélifié comprenant du L-Ala-2-MeOAPA ou du L-Ala-2,5diMeOAPA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves. Ce milieu réactionnel est séparé en deux milieux de volume équivalent. Chacun de ces milieux comprend respectivement : 0,3 g/1 de L-Ala-2-MeOAPA apporté par une solution mère dans du DMSO et 0,3 g/1 de L-Ala- 2,5-diMeOAPA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO. Des microorganismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur chacun des milieux par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées après ajout d'HCI. 4.4 : Résultats; Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous : SOUCHES Temps L-Ala-2- MeOAPA L-Ala-2,5-di MeOAPA d'incubation Couleur Intensité Couleur Intensité Escherichia coli 24 H orange 0,5 jaune orange 1,5 (032) 48 h rose 3,5 jaune orange 2 Proteus mirabilis 24 H orange 1 incolore 0, (037) 48 h orange 1,5 orange 0,5 Klebsiella 24 H rose 3 orange 1 pneumoniae (023) 48 h rose 3,5 jaune orange 2,5 Citrobacter koseri 24 H orange 2 orange 1 (012) 4g h rose 3,5 jaune orange 2,5 Enterobacter 24 H rose 2 jaune orange 1,5 cloacae (061) 48 h rose 2 jaune orange 2 Staphylococcus 24 H incolore* 0 incolore 0 aureus (035) 48 h incolore* 0 incolore 0 Streptococcus 24 H inhibé- incolore 0 agalactiae (001) 48 h inhibé- incolore 0 Enterococcus 24 H inhibé- jaune orange 0,5 faecalis (117) 48 h inhibé- jaune orange 3 Listeria innocua 24 H incolore* 0 incolore 0 (036) 48h incolore* 0 incolore 0 Candida albicans 24 H inhibé- incolore 0 (077) 48 h inhibé- incolore 0 * croissance très faible Tableau 4 : Révélation de l'activité L-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par les L-Ala-2-MeOAPA et L-Ala-2,5-diMeOAPA Ces deux substrats permettent après ajout d'une goutte d'HCl de révéler une activité L-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram positif. L'ajout de substituants (Méthoxy-) sur le groupement phényl permet en plus de réduire la toxicité des substrats, notamment vis-à-vis des bactéries à Gram positif. Cependant, ce gain en fertilité se fait au détriment de la spécificité, en effet, Enterococcus faecalis présente une activité avec le L-Ala-2,5-diMeOAPA après 48 heures d'incubation. Exemple 5 : Révélation de l'activité B-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié : utilisation du 13-Alan-9(4-aminophen)-10-methyl-acridinium chloride (substrat quatemisé) : 5.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité ss-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé P-Alanyl-9(4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium chloride (substrat quatemisé), ci- après appelé ss-Ala-4-AP-10-MA, dont la formule est la suivante : 13-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methyl-acridinium chloride 5.2 : Synthèse de ss-Ala-4-AP-10-MA: Le composé de départ est le t-Boc-alanyl-9- (4-aminophényl) dont la synthèse a déjà été exposée au paragraphe 1. 2.2 (Synthèse du L-Ala-APA). Le t-Boc-alanyl- 9- (4-aminophényl) acridine (0,67 g, 1,5 mmole) est dissous dans l'acétronitrile (volume minimum) et chauffé à reflux avec de l'allyl bromure (3-bromo-1-propène) (4,0 ml) pendant 4 heures. Des composés volatils sont éliminés par évaporation. Le résidu est dissous dans l'éthanol et isolé par recristallisation ou précipitation. La déprotection est la même que celle décrite précédemment. 5.3 : Préparation dumilieu.: Un milieu gélifié comprenant 300 mg/1 de B-Ala-4-AP-10-MA est préparé comme suit : 46,37 g d'agar Columbia sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves, le substrat est ensuite apporté par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur le milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation. La coloration de ces colonies ainsi que l'intensité de cette coloration ont été notées. 5.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous. Ce substrat permet de révéler une activité B-Alanine-aminopeptidase chez les bactéries à Gram négatif par l'apparition spontanée (sans ajout d'acide) d'une couleur orange concentrée au niveau des colonies. Les colonies ne possédant pas cette activité demeurent incolore. Ce substrat est donc sensible et spécifique. Il peut permettre d'identifier les souches de Pseudomonas aeruginosa et notamment de les différencier des autres bactéries. SOUCHES Temps 0,3 g/1 de ss-Ala-4-AP-10-MA d'incubation Couleur Intensité Pseudomonas 24 H orange 2 aeruginosa (052) 48 h orange 3 Pseudomonas 24 H orange 1,5 aeruginosa (165) 48 h orange 3 Burkholderia 24 H incolorecepacia (004) 48 h incolorePseudomonas 24 H inhibéfluorescens (016) 48 h incolorePseudomonas 24 H inhibéstutzeri (073) 48 h incolorePseudomonas 24 H incoloreputida (028) 48 H incoloreAcinetobacter 24 H incolorecalcoaceticus (034) 48 H incoloreEscherichia coli 24 H incolore- (032) 48 H incolore Klebsiella 24 H incolorepneumoniae (023) 48 H incolore- Tableau 5 : de l'activité P-Alanine-aminopeptidase de micro-organismes par de la P-Ala-4-AP-10-MA Exemple 6 : Révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes sur milieugélifié à l'aide d'un substrat non quatemisé à base de Proline : 6.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé L-Prolyl-9 (4-aminophenyl)-acridine (substrat non quatemisé), ci-après appelé L-Pro-4APA, dont la formule est la suivante : L-Prolyl-9(4-aminophenyl)acridine 6.2 : Synthèse de L-Pro-4-APA: Cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 1. 2 ci-dessus, selon deux méthodes A et B, dans lesquelles l'acide aminé Alanine a été remplacé par l'acide aminé Proline. Il convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Pro-4-APA. 6.3 : Préparation du milieu.: Un milieu gélifié comprenant du L-Prolyl-9-(4-aminophenyl)acridine (ci-après référencé L-Pro-4-APA) est préparé comme suit : 45g d'agar Sabouraud sont additionnés à 1 litre d'eau distillée puis autoclaves. Ce milieu réactionnel comprend 0,3 g/1 de L-Pro-APA apporté aussi par une solution mère dans du DMSO. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu par isolement en trois cadrans à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide acétique, ci-après GAA (glacial acetic acid). 6.4 : Résultats; Les résultats sont présentés dans le tableau 6 ci-dessous : SOUCHES Goutte d'Acide 0,3 g/1 de L-Pro-4-APA Acétique Couleur Intensité Candida albicans avant GAA jaune 2 (138) après GAA jaune 3 Candida avant GAA blancparapsilosis (040) après GAA jaune 2 Candida avant GAA pas de croissancelusitaniae (045) après GAA pas de croissanceCandida avant GAA pas de croissanceguilliermondii (046) après GAA pas de croissanceCandida krusei avant GAA jaune 1 (026) après GAA jaune 3 Candida glabrata avant GAA jaune 2 (051) après GAA jaune 3 Tableau 6 : Révélation de l'activité L-Proline-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Pro-4-APA dont la concentration en substrat est optimisée Avec certaines souches de levures Candida, la nature inhibitrice du substrat est démontrée. Cependant, certaines levures produisent une coloration jaune, sans l'addition d'acide. Cette coloration est plus intense pour certaines souches, notamment Candida albicans, elle est également plus intense qu'en l'absence de culture. Ceci démontre bien que notre substrat, contenant la Proline comme acide aminé, permet de révéler l'activité L-Proline-aminopeptidase chez les levures. Exemple 7 : Révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié à l'aide d'un substrat non quaternisé à base de Sérine : 7.1 : Molécule utilisée : La révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes sur milieu gélifié s'effectue par l'utilisation d'un substrat appelé L-Séryl-9(4-aminophenyl)-acridine (substrat non quaternisé), ci-après appelé L-Ser-4APA, dont la formule est la suivante : L-Séryl-9(4-aminophenyl)acridine 7.2 : Synthèse de L-Ser-4-APA: A l'instar de ce qui a été exposé pour la L-Pro-4-APA (paragraphe 6. 2 cidessus), cette synthèse a déjà été réalisée au paragraphe 1. 2 ci-dessus, selon deux méthodes A et B, dans lesquelles l'acide aminé Alanine a été remplacé par l'acide aminé Sérine. Il convient de s'y reporter pour connaître la synthèse de la L-Ser-4-APA. 7.3 : Préparation dumilieu: Un milieu gélifié comprenant du L-Seryl-9(4-aminophenyl)acridine (ci-après référencé L-Ser-4-APA) est préparé comme suit : 30 milligrammes de L-Ser-4-APA sont ajoutés à 4 grammes d'agar Columbia, additionnés à 0,1 litre d'eau distillée puis autoclaves. Ce milieu réactionnel est mis à l'autoclave à 116 C pendant 20 minutes. La majeure partie du substrat se retrouve en solution, sans coloration résiduelle. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. Des échantillons de 10 l de chaque suspension sont ensuite cultivés pour produire des colonies. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18 à 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies a été notée avant et après ajout d'une goutte d'acide acétique, ci-après GAA (glacial acetic acid). 7.4 : Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous : SOUCHES GAA 0,3 g/1 de L-Ser-4-APA Couleur Intensité Escherichia coli avant GAA crème- (009) après GAA orange pâle 2 Klebsiella avant GAA crème pneumoniae (012) après GAA orange pâle 2 Yersinia avant GAA crèmeenterocolitica (061) après GAA orange pâle 2 Candida albicans avant GAA crème- (138) après GAA crèmeStaphylococcus avant GAA crèmeaureus (008) après GAA crèmeEnterococcus avant GAA crèmefaecalis (117) après GAA crème- Tableau 7 : Révélation de l'activité L-Sérine-aminopeptidase de micro-organismes par de la L-Ser-4-APA dont la concentration en substrat est optimisée Encore une fois, certaines souches ont une inhibition partielle avec le substrat à base d'acridine. Les trois souches à Gram négatif testées produisent une coloration réactionnelle particulière après l'addition d'acide acétique. Autres expériences réalisées : D'autres substrats ont été testés qui permettent de valider les résultats présentés ici, on peut par exemple citer : #L-Alanyl 9-(4-amino-3-methoxyphenyl)-10-methylacridinium chloride, # L-Alanyl 9-(4-aminophenyl)-10-methylacridinium chloride hydrochloride, # L-Alanyl 9-(4-amino-2,5-dimethoxyphenyl)-l O-methylacridinium chloride hydrochloride, # ss-aLANYL 9-(4-aminophenyl)-10-methylacridinium chloride hydrochloride, # p-Alanyl-9-(4-amino-2-methoxy-aminophenyl) acridine, # P-Alanyl-9-(4-amino-2,5-dimethoxy-aminophenyl) acridine, #(3-Alanyl 9-( 4-amino-3-methoxyphenyl)-lO-methylacridinium chloride hydrochloride, # (3-Alanyl 9-(4-amino-2,5-dimethoxyphenyl)-l O-methylacridinium chloride hydrochloride. De même d'autres espèces de micro-organismes, généralement des bactéries, ont également été testés, telles que : # Salmonella typhimurium, # Staphylococcus epidermidis, # Serratia marcescens. REVENDICATIONS 1. Substrats chromogéniques enzymatiques pour la détection chez des microorganismes d'une activité aminopeptidase ou pour définir l'appartenance d'au moins une bactérie au groupe des Gram positifs ou des Gram négatifs selon sa coloration, caractérisés par le fait qu'ils ont la formule suivante : dans laquelle : # Ri est rien ou un groupement alkyle, allyle, aryle, # R2 est constitué par au moins un acide aminé, préférentiellement alanine, # R3, R4 R5 et R6 sont constitués indépendamment l'un de l'autre par H- ou -O-alkyle, préférentiellement -O-CH3, # R7 est constitué par H, O-CH3, alkyle ou halogène, # R8 est constitué par H ou Cl, et # n est un chiffre entier correspondant à 0 ou 1 ou 2. 2. Substrat, selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il a la formule suivante : ou qu'il a la formule suivante : 3. Substrats, selon la revendication 1, caractérisés par le fait que R1 est un groupement méthyle ou allyle. 4. Substrats, selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'il a la formule suivante : ou qu'il a la formule suivante : 5. Milieu de culture utilisant au moins un substrat chromogénique enzymatique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, seul ou en combinaison avec au moins un autre substrat enzymatique spécifique d'une activité enzymatique différente de celle détectée par le substrat selon l'invention. 6. Milieu, selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il est constitué par un milieu gélifié. 7. Utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité aminopeptidase. 8. Utilisation des substrats chromogéniques enzymatiques, tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, pour séparer les bactéries à coloration à Gram positif des bactéries à coloration à Gram négatif. 9. Procédé pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité aminopeptidase, caractérisé en ce qu'ilconsiste à : # disposer d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, # ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, # laisser incuber, et # révéler la présence d'au moins une activité aminopeptidase seule ou en combinaison avec au moins une autre activité enzymatique différente d'une activité aminopeptidase. 10. Procédé pour la différentiation chez des bactéries de leur appartenance aux germes du type Gram positif ou aux germes du type Gram négatif, caractérisé en ce qu'il consiste à : # disposer d'un milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, # ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, # laisser incuber, et # révéler la présence d'au moins une coloration synonyme de la présence de germe(s) du type Gram négatif. 11. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que, lorsque l'azote en position 10 du groupement acridine n'est pas quatemisé, la révélation de la présence d'au moins une activité aminopeptidase est réalisée par l'ajout d'acide, préférentiellement d'acide chlorhydrique, d'acide acétique ou d'acide citrique, sur la culture.