Brevet FR2852606A1 — publié le 20040924

Moyens pour inhiber simultanément l'expression de plusieurs gènes impliqués dans une pathologie L'invention concerne une méthode qui permet d'inhiber simultanément l'expression de plusieurs gènes impliqués dans une pathologie en induisant des lésions irréversibles sur ces derniers. Des oligonucléotides formant des triples hélices (OFT) ont été développés au laboratoire de Biophysique du Muséum National d'Histoire Naturelle 11SM 0503 Unité INSERM UR565, CNRS UMR 8646, dans le but d'interférer spécifiquement avec l'expression de certains gènes. Ces OFT ont été utilisés pour d'autres applications, par exemple la purification de plasmides ou la modification chimique de la séquence cible. En 1997, une étude in vitro a montré que le couplage chimique d'un dérivé de la camptothécine, un inhibiteur de topoisomérase I, à un oligonucléotide formant une triple hélice dirige la coupure de l'ADN par la topoisomérase I spécifiquement au niveau de la séquence oligopyrimidiqueoligopurique ciblée par l'oligonucléotide triple hélice (Matteucci et al.J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) pp 6939- 6940) . Comme déjà décrit dans la littérature et notamment dans les publications des inventeurs, l'inhibiteur de topoisomérase couplé à un ligand d'ADN spécifique devient spécifique du site de fixation du ligand d'ADN. Cette approche permet de développer des agents anti-tumoraux dont le mécanisme d'action repose sur la modulation sélective d'un ou plusieurs gènes dont l'expression contrôle le développement et le maintien de l'état tumoral des cellules (Figure 1). L'ensemble des gènes ciblés peut être adapté à chaque type de tumeurs. Certains inhibiteurs de topoisomérase I, comme la camptothécine, sont utilisés en clinique, mais présentent des toxicités importantes, potentiellement corrélées à leur faible spécificité de séquence. Les problèmes et inconvénients évoqués dans l'art antérieur sont surmontés selon l'invention dont les principaux objets sont les suivants. La présente invention vise tout d'abord une méthode pour inhiber simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles codant pour des protéines d'intérêt, notamment des protéines tumorigènes, comprenant les étapes successives consistant à : (i) mettre en présence desdits gènes, au moins un ligand capable de reconnaître la cible commune aux gènes et d'induire une coupure par la topoisomérase, (ii) obtenir la fixation dudit au moins un ligand sur lesdits gènes et, (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression. Conformément à l'invention, cette méthode est réalisée en particulier in vitro et ex vivo. Selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention comprend les étapes consistant à : (i) diriger l'action d'au moins un inhibiteur de toposiomérase vers un site spécifique desdits gènes en conjuguant ledit au moins un inhibiteur de topoisomérase audit au moins un ligand, (ii) obtenir la fixation dudit ligand sur lesdites cibles, (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression, Le ou les inhibiteurs de topoisomérase I sont choisis dans le groupe comprenant les agents intercalants, comme les indolocarbazoles, les agents non intercalants, comme la camptothécine, des ligands du petit sillon, comme les benzimidazoles. Ledit ligand est choisi parmi les acides ribonucléiques, les acides désoxyribonucléiques, les PNA, acides nucléiques peptidiques, les acides 2'OAlkyl ribonucléiques, les oligophosphoramidates, les LNAs (ARNs bloqués pour la conformation du ribose). La présente invention a encore pour objet un composé chimique tel qu'un conjugué d'inhibiteur de topoisomérase et de ligand. Ce composé forme un complexe ternaire caractérisé en ce qu'il comprend une partie ligand de l'ADN spécifique des séquences des gènes cibles codant pour des protéines d'intérêt, un bras de liaison, et un inhibiteur de topoisomérase I, tels que : OFT-L3-CPT, et (3+3)-CPT OFT- 18-L6-CPT OFT-18-L4-CPT, OFT 16-L6-10CPT, et OFT16-L4- 10CPT, OFT16-L6-7-CPT, OFT18-L6-7CPT, CPT-L6,OFT. Il s'agit avantageusement d'un conjugué comprenant un oligonucléotide formant triple hélice et un inhibiteur de topoisomérase 1 qui induit une coupure sur l'ADN, ce composé dirigeant un clivage au voisinage de chaque séquence desdits gènes cibles oligopyrimidique#oligopurique contenant un nombre de purines compris entre 2 et 30 avec un site de coupure de l'inhibiteur du côté 3' du triplex sur le brin oligopyrimidique de la cible. Ce composé chimique est encore caractérisé en ce que ledit site de clivage induit par l'inhibiteur de topoisomérase est positionné de 3 à 8 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice. Elle vise aussi un procédé pour sa préparation, ainsi que son utilisation dans une méthode pour inhiber l'expression d'un gène d'intérêt ou simultanément de plusieurs gènes, ce ou ces gènes codant pour une ou des protéines tumorigènes par exemple. On mesurera que, de manière avantageuse, un seul conjugué oligonucléotidique-inhibiteur peut avoir des effets analogues aux associations de médicaments anti-tumoraux utilisés en clinique aujourd'hui. Cette approche vise ainsi à maintenir cette efficacité antitumorale optimale tout en réduisant certains effets secondaires. Par exemple, il est établi que l'utilisation d'inhibiteurs de topoisomérases II est associée, dans environ 15% des cas, à l'apparition de leucémies secondaires caractérisées par des translocations réciproques de gènes, maintenant bien caractérisées. Diriger ces inhibiteurs vers certains gènes choisis peut diminuer leur pouvoir leucémogène en permettant une meilleure sélectivité de l'effet thérapeutique. Les compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un ligand tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte, font également partie de l'invention. Ces compositions se présentent avantageusement sous des formes permettant leur administration par voie injectable ou spray. Les doses unitaires et quotidiennes seront déLerminées par l'homme du métier selon le type de pathologie, notamment de cancer à traiter. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, en référence à la littérature scientifique ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la Figure 1 est un schéma qui illustre le principe de ciblage des clivages/coupures de l'ADN par la topoisomérase I sur des sites spécifiques ; - la Figure 2 illustre un système d'étude connu : le duplex de 324-pb contenant la séquence oligopuriqueeoligopyrimidique cible. Les oligonucléotides formant une triple hélice (OFT16, OFT18, OFT20, OFT23), ont été modifiés pour accroître la stabilité des complexes (par exemple, en utilisant des 5méthyl-désoxycytosines (M) et des 5-propynyl-déoxyuraciles (P) . Deux ligands du petit sillon, de type polyamides en épingle à cheveux (3+3) et (4+4), ont été couplés à la 10carboxycamptothécine (10CPT) et à l'acide 7-éthyl-10 éthyl oxycamptothécine acétique (SCPT). Le site de fixation du OFT16 et de 2 ligands du petit sillon est indiqué par des carrés. Les oligonucléotides se fixent sur la séquence oligopurique#oligopyrimidique en formant des liaisons hydrogène de type Hoogsteen avec les purines de la paire Watson-Crick. Les ligands du petit sillon, (3+3) et (4+4), se fixent en interagissant avec le petit sillon. Les formules chimiques des conjugués sont spécifiées dans la partie basse de la figure et le bras de liaison est représenté en italique. Les oligonucléotides proviennent de la société Eurogentec (Belgique) et sont couplés aux inhibiteurs selon les méthodes décrites dans Grimm et al. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 19 (2000) pp. 1943-1965. Les ligands du petit sillon ont été synthétisés comme décrit dans Arimondo et al. Angewandte Chem. Int. Ed. 40 (2001) pp. 3045-3048 ; - La Figure 3 représente les sites de coupure de la topoisomérase I. Le duplexe de 324-pb radiomarqué en 3' sur le brin oligopyrimidique (puits 1) a été incubé avec la topoisomérase I en présence de trois dérivés de la camptothécine (puits 2-4,10CPT, 7CPT, SCPT), ou de ces trois dérivés conjugués au OFT 16 (puits 5-7, OFT16-L4-10CPT, OFT16-L6-CPT, OFT16-L3-SCPT). Les sites de coupure sont indiqués par des lettres et le site de fixation du conjugué est schématisé. L3=diaminopropynyle ; L4= diaminobutyle, L6= diaminohexyle ; La Figure 4 montre que la présence de la triple hélice induit une coupure du côté 5' de la triple hélice sur le brin oligopurique de la cible et une du côté 3' sur le brin oligopyrimidique, qu'il s'agisse d'un site préférentiel ou non. La présence de l'inhibiteur sur l'oligonucléotide en 3' a pour effet d'amplifier le signal ; La Figure 5 représente une construction expérimentale : les plasmides utilisés ont été obtenus par clonage aux sites Hind III/Nco 1 dans la région transcrite et non traduite du vecteur pGL3Promoteur (Promega), contenant le gène de la luciférase de Pyralis sous le contrôle du promoteur de SV40. Les inserts de 54-bp contiennent : la séquence triple hélice intacte (pTUC), la séquence triple hélice mutée sur deux (pMTUC) ou trois sites (pMUT). Les sites de mésappariement sont indiqués en gras ; la Figure 6 illustre pour la première fois avec ces molécules l'inhibition de la transcription du gène luciférase de Pyralis dans les cellules HeLa. 24h après transfection avec le SuperfectTM, les cellules sont lysées et testées pour l'activité des luciférases de Pyralis et Renilla. Les plasmides sont cotransfectés avec un vecteur d'expression pour la luciférase de Renilla en l'absence ou en présence de différents oligonucléotides. Le rapport entre l'intensité de luminescence de Pyralis et de Renilla est représenté pour les trois plasmides en fonction des conjugués ajoutés à luM (concentration finale). Les valeurs sont normalisées par rapport à celle obtenue en l'absence d'oligonucléotides ; les Figures 7A et 7B montrent la formation d'un triplexe et la présence d'une forte coupure spécifique en présence du conjugué (Ex. 7A) et a contrario l'absence de formation du triplexe et de coupure spécifique de l'ADN en cas de mutation sur le site triple hélice (Ex. B) et la formation d'un triplexe mais l'absence de coupure de l'ADN dans le cas d'un duplexe muté aux sites de coupure b et c (Ex. C) ; la Figure 8 illustre l'efficacité (en terme d'intensité de coupure par rapport à l'inhibiteur seul et d'un site donné a, b, c et d) de certains conjugués/complexes utiles dans la méthode de l'invention. En conjuguant un inhibiteur de topoisomérase à un oligonucléotide capable de reconnaître spécifiquement une séquence d'ADN, il est possible de cibler l'inhibiteur sur un ensemble de gènes choisis, grâce à la formation d'un complexe spécifique en triple hélice sur une même séquence cible commune aux gènes choisis. Il devient alors possible d'induire les lésions irréversibles sélectivement sur ces gènes et d'inhiber leur expression. Ceci peut être réalisé de manière connue en soi, en particulier, à l'aide du couplage covalent d'inhibiteurs de topoisomérase I à des ligands de l'ADN spécifiques de séquence, tels que des oligonucléotides, ou non nucléiques tels que des ligands du petit sillon (polyamides composés de N-méthyl de pyrroles et d'imidazoles) ou encore des peptides à doigts de zinc. En effet, de tels ligands peuvent reconnaître spécifiquement certaines séquences de l'ADN en se fixant, respectivement, dans le grand et dans le petit sillon de la double hélice. Le couplage chimique d'inhibiteurs de topoisomérase I à ces ligands de l'ADN positionne l'inhibiteur sélectivement au site de fixation du ligand et dirige ainsi spécifiquement à ce site les coupures induites par la topoisomérase I. Les inventeurs ont ainsi développé un nouveau concept reposant sur le ciblage d'inhibiteurs de topoisomérases sur un ensemble de gènes sélectionnés pour leur implication dans la prolifération de cellules tumorales. Ces gènes sont choisis parmi les gènes contrôlant le cycle et la division cellulaire, ou parmi les gènes anti-apoptotiques. En fonction de la longueur de l'oligonucléotide choisi, la sélectivité peut être accrue, pour ne viser qu'un seul gène, soit relâchée, pour inhiber alors un ensemble de gènes. Cette stratégie innovante en chimiothérapie antitumorale peut être étendue à d'autres pathologies où l'inhibition simultanée de plusieurs gènes/fonctions serait d'un intérêt thérapeutique évident. L'intérêt de l'approche pharmacochimique qui va être rappelée ci-dessous réside essentiellement en la définition d'une nouvelle méthodologie bicéphale avec un ligand à 2 têtes, l'une reconnaissant l'ADN de la cible, l'autre recrutant la topoisomérase. La conception de ces composés doit être adaptée à la séquence visée et doit avoir les caractéristiques rappelées ci-dessus. L'approche pharmacogénique concerne le développement d'une stratégie thérapeutique nouvelle fondée sur le ciblage d'inhibiteurs des topoisomérases I et II vers des gènes spécifiques, impliqués dans la prolifération cellulaire des tumeurs cancéreuses. La conception de ces composés doit être adaptée à la séquence visée et doit avoir les caractéristiques suivantes : L'approche consiste à coupler chimiquement des inhibiteurs des topoisomérases I et II à des oligonucléotides modifiés ou pas, capables de se fixer sélectivement par formation de triples hélices stables sur des gènes impliqués en particulier dans la croissance cellulaire et/ou sur des gènes anti-apoptotiques. (Figure 2 : ciblage de la topoisomérase I par un conjugué oligonucléotideinhibiteur). L'approche ligand de l'ADN offre la possibilité d'agir simultanément sur l'expression de plusieurs ~gènes en choisissant une séquence cible commune à ces gènes. Pour traiter efficacement une pathologie multigénique comme le cancer, il est en effet essentiel de contrôler simultanément des familles de gènes, et plus précisément, 'un ensemble de gènes qui altèrent les circuits prolifératifs normaux des cellules. Ainsi, de manière très avantageuse, un seul conjugué oligonucléotidique-inhibiteur pourrait avoir des effets analogues aux associations de médicaments anti-tumoraux utilisés en clinique aujourd'hui. Cette approche peut permettre de maintenir cette efficacité antitumorale optimale tout en réduisant certains effets secondaires. Par exemple, il est établi que l'utilisation d'inhibiteurs de topoisomérases II est associée, dans environ 15% des cas, à l'apparition de leucémies secondaires caractérisées par des translocations réciproques de gènes, maintenant bien caractérisées. Diriger ces inhibiteurs vers certains gènes choisis peut diminuer leur pouvoir leucémogène en permettant une meilleure sélectivité de l'effet thérapeutique. Aussi dans un de ses aspects particulièrement essentiels, la présente invention concerne encore une méthode qui permet de diriger l'action d'inhibiteurs de la topoisomérase I ou II vers un site spécifique de l'ADN permettant d'induire, sélectivement à ce site, la coupure par la topoisomérase I ou II. Ce nouveau concept est détaillé ci-après à titre purement illustratif et non limitatif, en prenant deux ensembles de gènes impliqués dans le développement et le maintien du cancer (1) les gènes d'une voie de survie, comme celle qui se met en place quand le facteur de croissance IGF-1 (insuline like growth factor-1) se lie à son récepteur (IGF-1R) et (2) les gènes qui inhibent l'apoptose, tels que les IAP et les gènes anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Ces gènes sont surexprimés dans certains cancers et leur blocage conduit à un effet anti-tumoral. Les inventeurs ont effectué une recherche de séquences aptes à former des triples hélices et communes à l'ensemble des gènes d'intérêt à cibler. Cette recherche a été réalisée à l'aide du programme unix findpatterns du logiciel GCG (Genetics Computer Group, Infobiogen, Villejuif). Dans une recherche préliminaire, les inventeurs ont identifié une séquence oligopyrimidique de 12 paires de bases (pb) commune aux gènes IGF-1, IGF-1R et AKT/PBK et une séquence de 10 pb commune aux gènes anti-apoptotiques bcl-2, bcl-XL et survivine. Comme déjà mentionné, des ligands non nucléiques de l'ADN spécifiques de séquence, comme des ligands du petit sillon (polyamides composés de N-méthyl pyrrole et de N-méthyl imidazoles) peuvent aussi être utilisés pour diriger l'action d'inhibiteurs de toposiomérases vers un site donné. Leur utilisation devrait permettre de s'affranchir de la restriction de séquence cible oligopyrimidiqueeoligopurique imposée par la formation d'une triple hélice stable. Des résultats avec des ligands du petit sillon couplés à la camptothécine sont présentés ci-après. Cette recherche de séquence commune à un ensemble de gènescibles devrait permettre de définir la séquence cible optimale, choisie de manière à faire uniquement, ou principalement, partie de l'ensemble de gènes sélectionné. Dans les cas de l'utilisation des oligonucléotides triple hélice, la coupure par les conjugués est dirigée sur chaque séquence cible oligopyrimidique oligopurique contenant un nombre de purines de 2 à 30 avec un site de coupure induit par l'inhibiteur de topoisomérase I du côté 3' du triplexe sur le brin oligopyrimidique de la cible. De plus, le site de coupure induit par l'inhibiteur et positionné avantageusement de 3 à 10 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice et le bras de liaison est adapté en fonction du site de coupure, de l'inhibiteur utilisé et du point d'attachement de l'inhibiteur à l'oligonucléotide. Pour ce qui concerne les conjugués oligonucléotidesinhibiteurs de topoisomérases, les inventeurs ont réalisé le couplage à des dérivés de camptothécine, inhibiteurs de la topoisomérase . Dans un travail préliminaire, les inventeurs ont montré que le couplage covalent de dérivés de la camptothécine et de la rébeccamycine, qui sont des inhibiteurs de topoisomérase I, à un oligonucléotide long de 16 nucléotides, dirige in vitro la coupure par la topoisomérase I spécifiquement au site où l'inhibiteur est positionné par formation de la triple hélice (Arimondo et al., 1999, 2000a). Une même démarche peut être réalisée avec d'autres types d'inhibiteurs, qui sont des poisons de topoisomérase qui pourront être liés, de la même manière, à savoir de façon covalente à l'extrémité de ligands spécifiques de l'ADN. L'optimisation du bras de liaison qui unit la partie ligand et la partie inhibitrice est très importante et doit être adaptée en fonction du site de coupure de l'inhibiteur utilisé et du point d'attachement de l'inhibiteur à l'oligonucléotide. Après la synthèse des conjugués oligonucléotidesinhibiteurs, et avant l'évaluation de leur activité cellulaire, leur capacité à former une triple hélice-par des expériences sur gel et de dissociation thermiquedevrait être analysée. ACTIVITE CELLULAIRE DES INHIBITEURS SELECTIONNES Pour ce qui concerne l'activité des conjugués oligonucléotide-inhibiteurs des topoisomérases I et II, des systèmes moléculaires et cellulaires devraient permettre d'étudier l'effet des différents conjugués sur la cascade des gènes impliquant IGF-1 et son récepteur (Hamel et al., 1999 ; Shevelev et al., 1997). En particulier, pourront être évaluées, l'activité de coupure par analyse directe de l'ADN génomique, et la spécificité d'action par analyses au niveau du transcriptome (puces à ADN) et du protéome (gel bi-dimensionnel). Les gènes IGF-1 et IGF-1R étant impliqués dans la prolifération de glioblastomes, d'hépatocarcinomes et de tumeurs de la prostate. Leur inhibition par des constructions antisens bloque la prolifération de tumeurs greffées chez l'animal (Lafarge-Frayssinet et al., 1977). Les essais sur les cellules tumorales en culture devraient permettre de sélectionner les conjugués d'oligonucléotides les plus efficaces, et d'utiliser un modèle animal (par exemple avec des glioblastomes injectés à des souris nude ou des hépatocarcinomes chez le rat syngénique). Pour ce qui concerne les conjugués les plus efficaces, leur capacité à inhiber la prolifération des cellules cancéreuses devrait quant à elle être évaluée en ayant recours à différentes lignées cellulaires tumorales puis, pour les molécules les plus cytotoxiques in vitro, sur des modèles in vivo, à partir de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris. EVALUATION CLINIQUE DE NOUVELLES SUBSTANCES ANTITUMORALES L'évaluation clinique des nouvelles substances antitumorales découvertes au cours du criblage moléculaire ou conçues rationnellement par ailleurs, est prévue. EXEMPLES D'APPLICATIONS INDUSTRIELLES DE CERTAINS ASPECTS ET BUTS DE LA PRESENTE INVENTION Evaluation de ligands d'ADN couplés aux inhibiteurs de topoisomérases I et II comme agents anti-cancéreux. L'enjeu économique est considérable puisqu'il concerne des nouveaux axes thérapeutiques dans des pathologies aussi importantes que les cancers Ainsi l'identification d'acides nucléiques dérégulés dans les cancers pourra constituer la base de nouveaux produits de pharmacogénomique. Il est évident que les succès de la pharmacogénique auront de fortes conséquences sur : # la diminution des coûts liés au développement pharmaceutique # la mise au point d'un plus grand nombre de solutions thérapeutiques adaptées pour les patients # une réduction notable des dépenses de santé publique. Cet impact économique sera très important dans le domaine des cancers où il existe un choix entre de nombreux protocoles thérapeutiques ayant des taux individuels d'efficacité malheureusement réduits. EXEMPLES DE REALISATION Abréviations : CPT = camptothécine ; P= 5-propynyl-2'-deoxyuridine ; M=5méthyl-2'-déoxycytidine ; R= brin oligopurinique du duplexe, Y=brin oligopyrimidinique du duplexe. *=appariement de bases Watson-Crick Topo 1= topoisomérase MATERIEL ET METHODES Inhibiteurs Tous les inhibiteurs sont dissous dans du diméthylsulfoxyde et dilués ensuite dans l'eau. La concentration finale de diméthylsulfoxyde n'excède jamais 0,3% (v/v) dans tous les tests. Les inhibiteurs sont fixés à l'extrémité 3' ou 5' de l'OFT tel que déjà décrit à la Figure 2. Les dérivés de la camptothécine sont synthétisés selon les techniques décrites dans Arimondo et al. (2002) et dans Villemin et al. (1996). Oligonucléotides et fragments d'ADN Les oligonucléotides sont commerciales par Eurogentec et purifiés sur colonne quick spin et Séphadex G-25 fine (Boehringer, Mannheim). Les concentrations sont déterminées spectrophotométriquement à 25 C en utilisant des coefficients d'extinction molaire à 260 nm calculés à partir d'un modèle le plus proche (Cantor et al., 1970). Synthèse de conjugués CTP L'acide camptothécine CPT est conjugué au groupe aminoterminal de différents bras de liaison à l'extrémité 3' ou 5' de l'oligonucléotide ou du ligand petit sillon, N, N-dimethyl-N' {1 -méthyl-4-[ 1 -méthyl-4-[ 1 -méthyl-4-[4- {[ 1 -méthyl-4-[ 1 -methyl-4[ 1 -méthyl-4-(4aminobutiryl)aminopyrrol-2-carbonyl] ammopyrrol-2- carbonyllaminopyirol-2-carbonyl]}aminobutiryl]aminopyrrol- 2carbonyl] aminopyrrol-2-carbonyl]aminopyrrol-2- carbonyl}propylèndiamine (3+3), selon les techniques décrites dans Grimm et al. Nucleosides, Nucleotides (2000) avec de légères modifications. Les bras de liaison sont fixés par réaction de l'extrémité amino-terminale aux oligonucléotides phosphorylés en 3' ou 5' activé par traitement au N-méthylimidazole, dipyridyl disulfure et triphénylphosphine tel que décrit dans Arimondo et al. (2001) Angervandte Chem. ci-dessus Arimondo (2002). Les conjugués sont caractérisés par spectroscopie UV et spectroscopie de masse. Préparation des gènes (ADN) cibles Le plasmide pBSK(+/-) est commercialisé par Promega (USA) et le duplex cible de 77 pb est inséré entre les sites BamHI et EcoRI. La digestion du plasmide par PvuII et EcoRI produit un fragment 324-mer apte à un marquage à l'extrémité 3' par la polymérase Klenow (Ozyme, GB) et a[32P]ddATP (Amersham, U.S.A.). Le détail des techniques d'isolement, purification et marquage de cet ADN duplex sont décrites dans (Arimondo 2002). Les deux duplex de 59 pb sont obtenus par marquage d'un brin par une terminale transférase (Ozyme, GB) et a[32P]ddATP (Amersham, U.S.A.), suivi par une hybridation au brin complémentaire non-marqué pendant 5 min à 90 C et par lent refroidissement à température ambiante. Les fragments radio-marqués sont purifiés par chromatographie sur gel comme précédemment décrit (Arimondo 2002). La nomenclature des brins est comme suit : brins R pour brin oligopurinique et Y pour l'oligopyrimidinique. Tests de clivage par topoisomérase Les duplexes radiomarqués (50 nM) sont incubés pendant 1 h à 30 C, dans 50 mM Tris-HCl, pH-7.5, 60 mM KC1, 10 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA et 30 ug/uL BSA, en présence de l'OFT ou de MGB, à la concentration mentionnée (volume réactionnel total 10 uL). Pour analyser les produits de coupure Topo I ADN, 10 unités de l'enzyme (Invitrogen Inc) sont ajoutés, pré-incubés tel que décrit ci-dessus soit avec le ligand et/ou les inhibiteurs, suivi d'une incubation pendant 20 min à 30 C. Les complexes Topo I-ADN sont dissociés par ajout de SDS (concentration finale 0,25%). Après précipitation éthanolique, tous les échantillons sont remis en suspension dans 6 l de formamide, chauffés à 90 C pendant 4 min et refroidis sur glace pendant 4 min, avant le dépôt sur gel de polyacrylamide dénaturant [19/1 acrylamide :bisacrylamide] 8% et 10%, pour les cibles longues et courtes, respectivement, contenant 7,5 M urée dans lx tampon TBE (50 mM Tris-HCl, 55 mM acide borique, 1 Mm EDTA). Pour quantifier l'intensité de coupure, les gels sont scannés avec un Phosphoimager Dynamics 445SI. Pour la détermination des taux de coupure, une normalisation par rapport au dépôt total est réalisée. Les formules chimiques de l'acide (7-éthyl-10oxycamptothécine) acétique (2), un nouveau dérivé CPT utilisé dans la préparation de conjugués OFT-SCPT et SCPTOF fixés à l'acide par la position 10, ainsi que celles d'autres conjugués attachés soit en position 10 soit en position 7 tels que OFT-10CPT, et OFT-7CPT, (3+3) -CPT et (4+4)-CPT par exemple sont données à la Figure 2. Les inventeurs ont validé l'approche en couplant chimiquement trois dérivés de la rébeccamycime, apparentés à des molécules actuellement en essais cliniques comme agents anti-tumoraux, et trois dérivés de la camptothécine à des OFTs (oligonucléotides formant une triple hélice), et le dérivé 10-cartoxycamptothécine à deux ligands du petit sillon (MGB, minor groove binder) (Figure 2). Les inventeurs ont lié de façon covalente les inhibiteurs à une extrémité des oligonucléotides ou des ligands du petit sillon via des bras de liaison appropriés. Les conjugués ont été caractérisés par spectroscopie UV et spectrométrie de masse (Q-star I). La spécificité de coupure des conjugués a été mesurée in vitro par un test classique de coupure par la topoisomérase I. L'indice de coupure est calculé comme le rapport entre l'intensité de coupure en présence de l'inhibiteur couplé au ligand de l'ADN et celle en présence de l'inhibiteur non lié. Un exemple de ciblage est montré dans la Figure 3. Les trois dérivés non couplés de la camptothécine (puits 2,3,4) stimulent la coupure sur plusieurs site (sites a - i). Quand les dérivés sont liés de façon covalente à l'extrémité 3' du OFT avec un bras approprié, la triple hélice est formée (puits 5,6,7), et les conj ugués induisent la coupure uniquement du côté 3' de la triple hélice (site "b"). Ceci est dû au positionnement spécifique de l'inhibiteur du côté 3' du site triple hélice par fixation de la partie oligonucléotidique du conjugué sur sa cible. La présence du ligand, chargé négativement dans le cas des oligonucléotides, empêche la fixation de l'inhibiteur conjugué aux autres sites, comme le montre clairement la disparition du site "a" qui se trouve du côté 5' de la triple hélice ou d'autres sites situés à plus grande distance de ce site. Les inventeurs ont démontré ce ciblage de la coupure par la topoisomérase I au voisinage du site de fixation du ligand de l'ADN pour des OFT de longueur différente (16 18,20- et 23-nucléotides) (voir Figure 8), et pour différents dérivés de la rébéccamycine et de la camptothécine. La même approche a été étendue à d'autres ligands de l'ADN spécifiques de séquence, comme les polyamides de N-méthylpyrrole en épingle à cheveux, qui se fixent spécifiquement dans le petit sillon de l'ADN (Figure 2 : conjugués (3+3) CPT et (4+4)-CPT). Les inventeurs l'ont aussi étendue à une autre cible : le PPT (polypurine tract) du virus V1H-1 (5' AAAAGAAAAGGGGGGA 3/3' TTTTCTTTTCCCCCCT 5'). L'approche est donc valable notamment pour deux classes de ligands de l'ADN spécifique de séquence (OFT et MGB), pour différentes classes d'inhibiteurs de topoisomérase I et aussi pour des cibles différentes. Aussi la présente invention a encore pour objet une méthode telle que définie ci-dessus dans laquelle de manière avantageuse les ligands utilisés sont choisis dans le groupe constitué par des ligands de l'ADN spécifiques de séquence, tels que des~oligonucléotides, ou des ligands non nucléiques, tels que des ligands du petit sillon (polyamides en épingle à cheveux composés de N-méthyl pyrroles et de N-méthyl imidazoles, notamment les conjugués (3+3)-CPT et (4+4)-CPT) ou encore des peptides à doigts de zinc. Les inventeurs ont aussi mis en évidence que l'efficacité de coupure par la topoisomérase I ainsi stimulée au site de fixation du ligand dépend, d'une part de la taille du bras de liaison entre l'inhibiteur et le ligand et, d'autre part, de l'efficacité intrinsèque de l'inhibiteur. Par ailleurs les inventeurs ont observé que le positionnement de l'agent anti-tumoral par fixation du ligand a pour effet d'augmenter in vitro la concentration locale de cette molécule au site ciblé ; en effet, les conjugués stimulent la coupure par la topoisomérase I à des concentrations de 1-10 nM. De plus, le complexe de clivage ADN/topoisomérase/inhibiteur est beaucoup plus stable quand l'inhibiteur est conjugué à un OFT et que la triple hélice est formée. De fortes concentrations en sels sont nécessaires pour le dissocier. Cette approche, où l'action de ces agents anti-tumoraux est dirigée sélectivement vers les sites, dont la séquence est reconnue par fixation du ligand de l'ADN du conjugué ligand-inhibiteur, permet une approche radicalement nouvelle dans le développement de nouveaux médicaments anti-tumoraux. Etant donné qu'à l'heure actuelle, la structure du complexe ternaire, Topoisomérase I /ADN/inhibiteur n'a pas encore été entièrement élucidée, les inventeurs ont utilisé les conjugués pour l'analyse structurale du complexe ternaire ADN/topoisomérase/inhibiteur. En changeant le point d'attachement de l'inhibiteur à l'OFT, on modifie l'orientation de l'inhibiteur dans le complexe ternaire et donc l'efficacité de clivage par l'enzyme (voir Figure 8). Les inventeurs ont donc lié de façon covalente deux dérivés de la camptothécine, la 10-carboxycamptothécine et la 7aminoethylcamptothécine, à des OFT de longueur différente. L'étude de la position et de l'intensité de coupure au voisinage du complexe ternaire a ainsi mis en évidence que les modèles actuels qui décrivent le complexe ternaire ne sont pas adaptés et que d'autres conformations doivent être prises en compte. Une autre indication sur la flexibilité conformationnelle du complexe ternaire vient du fait que l'efficacité de coupure est comparable que la 10carboxycamptothécine soit liée à un ligand du grand sillon (le OFT) ou à un ligand du petit sillon (le MGB). De façon inattendue, la présence de la triple hélice ellemême, seule, induit un certain ciblage de la coupure par la topoisomérase I. Les auteurs ont mis en évidence que la coupure a lieu quand les conjugués ont les caractéristiques décrites cidessous : Aussi la présente invention a tout d'abord pour objet une méthode pour inhiber simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles codant pour des protéines, notamment des protéines tumorigènes, comprenant les étapes successives suivantes consistant à : (i) mettre en présence desdits gènes, au moins un ligand capable de reconnaître la cible commune aux gènes et d'induire une coupure par la topoisomérase, (ii) obtenir la fixation dudit au moins un ligand sur lesdits gènes et, (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression, L'étape de mise en présence est réalisée in vitro avec un échantillon biologique contenant lesdits gènes et une topoisomérase ex vivo avec des cellules d'une culture. La présence d'un inhibiteur de topoisomérase amplifie de manière avantageuse l'effet de ciblage du clivage par la topoisomérase I. Cette coupure induite par le triplexe est dépendante d'une géométrie précise : la fixation de l'oligonucléotide sur sa cible stimule la coupure uniquement du côté 3' de la triple hélice sur le brin oligopyrimidique de la cible et du côté 5' sur le brin oligopurique de la cible (Figure 4). Aussi la présente invention concerne encore un complexe d'au moins un ligand, notamment un complexe d'une triple hélice formée avec un oligonucléotide ( OFT) qui induit des coupures par la topoisomérase I du côté 5' (qui est un complexe formé de oligo/inhibiteur-cible d'ADN) sur le brin oligopurique de la cible et du côté 3' sur le brin oligopyrimidique d'un gène cible. La présente invention concerne en outre un oligonucléotide pyrimidique formant une triple hélice et couplé en 3' à un inhibiteur de topoisomérase I qui stimule une coupure sélective et forte de l'enzyme en 3' de la triple hélice. Le côté 3' du triplexe est défini comme le côté 3' de la séquence oligopurique reconnue par l'OFT par formation de liaisons hydrogènes. Cette orientation de la coupure est liée au fait que la fixation de la topoisomérase I sur l'ADN au niveau du site de coupure n'est pas symétrique et que l'enzyme forme une liaison phosphorotyrosyle avec le 3' phosphate du brin coupé en laissant une extrémité 5'OH. La triple hélice peut donc être présente sur le côté 3' du site de coupure sur la cible sans encombrement stérique pour l'enzyme. Il faut souligner le fait que non seulement des sites préférentiels de la topoisomérase I sont induits par la présence de la triple hélice mais aussi de sites détectables seulement en présence de la triple hélice. On peut imaginer que cela soit dû au changement local de conformation de l'ADN lié à la présence du triplexe. Il faut en effet remarquer que l'efficacité de coupure n'est pas identique du côté 5' et du côté 3' de la triple hélice et qu'il est connu que les deux extrémités de la triple hélice ne sont pas équivalentes. D'autre part, on pourrait aussi imaginer qu'il se produise un arrêt de l'avancement de l'enzyme par blocage physique par la structure en triplexe qui fait faire une pause à l'enzyme et lui donne le temps de couper dans ce voisinage. Les deux hypothèses ne s'excluent pas mutuellement. Aussi la présente invention a encore pour objet une méthode telle que définie ci-dessus comprenant en les étapes successives suivantes consistant à : (i) diriger l'action d'au moins un inhibiteur de topoisomérase vers des sites spécifiques desdits gènes en les à un lingard capable de reconnaître la cible commune aux gènes et d'induire une coupure par la topoisomérase. (ii) obtenir la fixation dudit ligand sur lesdites cibles. (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression. Selon un mode de réalisation préféré de la méthode de l'invention, la séquence ciblée comprend le site reconnu par le ligand, qui, dans le cas des oligonucléotides, est chaque séquence cible oligopyrimidique#oligopurique contenant un nombre de purines compris entre 2 et 30 paires de bases. De manière encore plus préférée, ladite séquence ciblée comprend en outre le site de l'inhibiteur de topoisomérase dans son voisinage pour obtenir une plus grande efficacité. Le site de coupure induit par l'inhibiteur doit être positionné de 3 à 10 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice. Le bras de liaison doit être adapté en fonction du site de coupure, de l'inhibiteur utilisé et du point d'attachement de l'inhibiteur à l'oligonucléotides. Les inventeurs ont ensuite montré pour la première fois la validité de l'approche dans les cellules. Les expériences in vitro ne pouvant pas tenir compte de la barrière nucléaire, de la structure de la chromatine et de la spécificité des conjugués dans le noyau, les inventeurs ont testé les conjugués dans des systèmes cellulaires. Les conjugués induisent un effet spécifique dans les cellules qui dépend de la formation de la triple hélice et de la présence de l'inhibiteur couplé à l'oligonucléotide. Plus précisément, les inventeurs ont utilisé des vecteurs plasmidiques d'expression, transfectés dans les cellules HeLa, où la séquence de fixation de l'OFT et celle d'un site sensible à la camptothécine en sa proximité sont placées dans la région transcrite en amont du gène de la luciférase de Pyralis (lue). Les plasmides ont été obtenus après clonage de fragments de 54 paires de bases, contenant les séquences décrites dans la figure 5, dans le vecteur pGL3Promoteur (Promega) entre les sites Hind III et Nco I. pRL-TK (Promega) en Italie, codant pour le gène de la luciférase Renilla, est utilisé comme contrôle de transfection. Les cellules adhérentes humaines HeLa sont cultivées en milieu DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 10% FCS, à 37 C et 10% C02. Les cellules sont ensemencées (110000 cellules par mL) dans des boîtes de 96 puits à 125 L par puits. 24 h après, le milieu des cellules est remplacé par 112,5 uL de milieu frais avec sérum et 12,5 uL de mélange de transfection. Le mélange de transfection contient : 1 ug de pTUC ou pMTUC ou pMUT ; 0,5 ug de pRL-TK, des concentrations variables d'oligonucléotides, et 3 L de SuperfectTM (Qiagen) dans du milieu sans sérum. Les mélanges sont préparés en duplicate ou triplicate. 24h après, les cellules sont lysées pour dosage d'expression luciférase. Le dual-LuciféraseTM Reporter Assay System (Proméga) a été utilisé pour la détermination des activités des deux rapporteurs (Pyralis et Renilla) sur le même lysat cellulaire : chaque puits de plaque de 96 puits est lysé dans 30 uL de passive lysis buffer , 15 L sont analysés avec le kit dual- LuciféraseTM Reporter Assay System à l'aide d'un appareil automatisé (Victor/Wallac). Le rapport entre les deux activités (Pyralis/Renilla) est utilisé pour mesurer la sélectivité de l'effet. La figure 6 montre les valeurs de rapport entre les deux activités en présence de différents oligonucléotides, normalisées par rapport à l'expression des plasmides en absence de conjugués. Les trois plasmides pTUC, pMTUC et pMUT sont représentés ainsi que 4 conjugués qui se différencient par la longueur de la partie oligonucléotidique, par la longueur du bras et par le dérivé de camptothécine lié. L'oligonucléotide OFT16 lié en 3' à un bras (CH2)4-NH2 (oligo-NH2) est utilisé comme contrôle. Cet oligonucléotide forme une triple hélice très stable. La présence à 1 uM de l'oligonucléotide contrôle oligo-NH2, qui forme une triple hélice, inhibe l'expression de gène de la luciférase d'environ 30%. Le couplage à la camptothécine augmente l'effet d'inhibition (entre 45% et 60% d'inhibition selon les conjugués). Cette augmentation de l'inhibition peut être expliquée par une coupure de l'ADN au voisinage du site triple hélice induite par la topoisomérase en présence de la camptothécine positionnée par formation de la triple hélice, comme observée in vitro. Les conjugués ont des efficacités différentes : les dérivés de la 10-carboxycamptothécine du OFT16, OFT16-L6-10CPT et OFT16-L4-10CPT, sont les plus efficaces (env. 60% d'inhibition) (Voir Figure 8). La longueur du bras de liaison n'influence pas beaucoup l'efficacité d'inhibition. Les expériences in vitro montrent que ces conjugués stimulent efficacement la coupure au site "b" à 4-pb de l'extrémité 3' de la triple hélice (voire ci-dessus, figure 3). Le conjugué OFT18-L6-10CPT, aussi efficace in vitro mais moins spécifique que les 16-mères, n'inhibe qu'à 45% l'expression du gène luciférase. Le conjugué OFT16-L6-7CPT, contenant la 7-aminoéthylcamptothécine, est moins efficace que le conjugué correspondant OFT16-L6-10CPT, avec environ 50% d'inhibition. Ceci est en accord avec les résultats in vitro d'efficacité de coupure des inhibiteurs: la 10carboxycamptothécine stimule plus efficacement la coupure de l'ADN par la topoisomérase 1 que la 7-aminoéthylcamptothécine. L'effet observé est bien dû à la formation de la triple hélice sur la cible par la partie oligonucléotidique du conjugué. Ceci est confirmé par les mesures sur les cibles mutées dans la séquence triple hélice sur deux (pMTUC) ou trois sites (pMUT). La présence de deux mutations puriques diminue l'efficacité de l'inhibition, la triple hélice est toujours formée, mais moins efficacement : l'oligo-NH2 passe de 30% d'inhibition à environ 15%, et le conjugué OFT16-L6-10CPT de 60% à 45%. La présence de trois mutations pyrimidiques dans le site de fixation entraine une perte totale d'inhibition. Voir figures 7A et 7B. Avec cette approche, les inventeurs ont montré que les conjugués peuvent induire des coupures spécifiques par la topoisomérase sur des sites choisis dans des systèmes cellulaires. Différents inhibiteurs de topoisomérase I peuvent être utilisés et l'inhibition dépendra de l'efficacité intrinsèque de l'inhibiteur, comme les inventeurs ont observé avec deux dérivés de la camptothécine. Pour augmenter l'effet inhibiteur, des oligonucléotides modifiés chimiquement peuvent être utilisés, comme par exemple, les PNA, acides nucléiques peptidiques, les acides 2'OAIkyl ribonucléiques, les oligophosphoramidates, les LNAs (ARNs bloqués pour la conformation du ribose). Les conjugués peuvent viser : # soit une séquence unique, présente, par exemple, dans le génome humain pour des pathologies dépendantes de l'expression d'un gène particulier (unique), ou dans des progénomes viraux (par exemple, de gènes responsables du développement de certains virus, HIV et HSV) ou dans le génome de parasites. Le conjugué permet alors l'inactivation sélective d'un gène ; # soit des séquences cibles communes à plusieurs gènes impliqués dans le maintien d'une pathologie (par exemple, des oncogènes, des facteurs de croissance, des gènes anti-apoptotiques, des gènes contrôlant le cycle et la division cellulaire, qui participent aux dérèglements observés dans les cellules tumorales). Le conjugué permet alors le contrôle simultané de plusieurs gènes. - En effet, en fonction de la longueur et de la séquence du site de fixation choisi pour la partie ligand du conjugué, la sélectivité des conjugués peut être soit stringente, pour ne viser qu'un seul gène, soit relâchée, pour cibler un ensemble de gènes. Dans le premier cas, le génome d'un virus intégré peut être ciblé et coupé spécifiquement par un conjugué dirigé contre une séquence présente uniquement dans ce génome. Dans le cadre de cette application, les inventeurs ont étendue l'approche au PPT du virus VIH-1. Dans le deuxième cas, plusieurs gènes, qui sont impliqués dans certaines pathologies tumorales peuvent être spécifiquement et simultanément coupés par la topoisomérase I, en choisissant une séquence cible commune. L'inhibition simultanée de gènes associés à l'acquisition et au maintien des caractéristiques cancéreuses permet de cibler les processus biochimiques essentiels et spécifiques au caractère malin des cellules tumorales. Les inventeurs ont choisi deux groupes de gènes, impliqués dans la transmission d'un signal de croissance et dans l'inhibition de l'apoptose. Dans le premier cas, ont été sélectionnés le facteur de croissance IGF-1 (insulin-like growth factor-1), son récepteur IGF-1R et les gènes situés en aval dans la cascade de signalisation correspondante. Ces gènes activent des voies de survie cellulaire et sont impliqués dans la prolifération de glioblastomes, d'hépatocarcinomes et de tumeurs de prostate. L'inhibition des gènes IGF-1 ou IGF-1R par des constructions antisens bloque la prolifération de tumeurs greffées chez l'animal. Dans le deuxième cas, le but est d'induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses, en ciblant une séquence commune à des gènes suppresseurs d'apoptose (par exemple C-IAP1/2, XIAP, survivine, bcl-2, bcl-W, bcl-XL, Mcl-1). L'apoptose ou la mort cellulaire programmée est un désassemblage contrôlé de la cellule exécuté par les caspases. Le processus est contrôlé par un équilibre entre les protéines qui induisent l'apoptose et celles qui l'inhibent. Les gènes inhibiteurs d'apoptose en prolongeant la vie de la cellule augmentent la probabilité d'événements génétiques conduisant à la transformation cellulaire ; ils sont souvent surexprimés dans les cellules cancéreuses. Pour la recherche de séquences capables de former des triples hélices communes à l'ensemble des gènes que les inventeurs veulent cibler, ces derniers ont utilisé le programme unix findpatterns du logiciel GCG (Genetics Computer Group, package Wisconsin version 8. 1, par Infobiogen, Villejuif). Une recherche préliminaire d'une séquence oligopyrimidiqueoligopurique de 12 paires de bases (pb) (GGAGGAGGAGGG) communes aux gènes IGF-1, IGF-1R et AKT/PKB et d'une séquence de 10 pb (GAAGAAGAGG) commune aux gènes antiapoptotiques bcl-2, bel-XL et survivine a montré la faisabilité de l'approche. oligopyrimidique#oligopuriques n'est pas une limitation de l'approche, puisque ces séquences sont sur-représentées dans le génome humain et le gène entier (régions régulatrices, régions codantes et non codantes) est une cible potentielle pour les oligonucléotides formant une triple hélice. De plus, il ne faut pas oublier que les inhibiteurs de topoisomérases ont une certaine spécificité de séquence, normalement limité à des dinucléotides autour du site de coupure. En fait, les inventeurs ont observé que la fixation du conjugué au site triple hélice ne suffit pas à induire une coupure forte et que la présence d'un site propre à l'inhibiteur au voisinage du site triple hélice est très préférable pour le recrutement et l'induction de la coupure par la topoisomérase. Les inventeurs en ont déduit que la séquence ciblée devrait de préférence comprendre non seulement le site reconnu par l'oligonucléotide mais également le site de l'inhibiteur de topoisomérase I dans son voisinage, augmentant ainsi la sélectivité du conjugué. Enfin, les inventeurs ont validé l'approche pour des ligands de l'ADN comme les oligonucléotides et les polyamides de N-méthyl-pyrrole et de N-méthyl imidazole, mais on pourra étendre le principe à d'autres classes de ligands comme les peptides à doigts de zinc, par exemple. Aussi la présente invention a encore pour objets : # Une méthode telle que définie ci-dessus caractérisée en outre en ce que le clivage par un conjugué (comprenant notamment un OFT (oligonucléotide formant triple hélice)- inhibiteur de topoisomérase) est dirigé sur chaque séquence dudit gène cible oligopyrimidiqueeoligopurique contenant un nombre de purines compris entre 2 et 30, plus efficacement avec un site de coupure induit par l'inhibiteur de topoisomérase I du côté 3' du triplex sur le brin oligopyrimidique de la cible. # Une méthode telle que définie ci-dessus caractérisée en outre en ce que ledit site de clivage induit par l'inhibiteur de topoisomérase est positionné de 3 à 8 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice. # Une méthode telle que définie ci-dessus caractérisée en outre en ce que la séquence dudit gène cible est soit une séquence cible unique présent dans le génome humain sur un gène impliqué dans une pathologie, soit une cible présente uniquement dans un gène viral ou parasitaire et absente du génome humain, soit une séquence présente sur un ensemble de gène impliqués dans le maintien ou le développement d'une pathologie. Les inventeurs ont par ailleurs suggéré et/ou montré que : # Les conjugués utiles dans la méthode selon l'invention devraient constituer de nouveaux agents anti-tumoraux efficaces aptes à agir sur un ensemble de gènes de prolifération cellulaire, de signalisation par des récepteurs de facteurs de croissance ou d'hormones, et anti-apoptotiques. # Lesdits ligands du petit sillon couplés à un inhibiteur de topoisomérase I dirigent aussi la coupure par l'enzyme sélectivement au site de fixation du ligand et ont les mêmes applications que les conjugués oligonucléotide- inhibiteur. REFERENCES Arimondo et; al., C. R. Acad. Sci. Paris, Série III, Sciences de la Vie/Life Sciences 322. (1999) pp.785-790. Arimondo et al., Bioorg. Med. Chem. 8 (2000) pp. 777- 784. Arimondo et al., Bioconj. Chem. 12 (2001) pp. 501-509. Arimondo et; al., Angewandte Chem. Int. Ed. 40 (2001) pp. 3045-3048. Arimondo et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) pp. 3132- 3140. Cantor et al., (1970) Biopolymers 9, pp. 1059-1077. Grimm et al. (2000) Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, pp. 1943-65 Villemin et al. 26(1996) Synthetic Communications pp. 4337-4341. REVENDICATIONS 1. Méthode in vitro pour inhiber simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles codant pour des protéines d'intérêt, notamment des protéines tumorigènes, comprenant les étapes successives consistant à : (i) mettre en présence desdits gènes, au moins un ligand capable de reconnaître la cible commune aux gènes et d'induire une coupure par la topoisomérase, (ii) obtenir la fixation dudit au moins un ligand sur lesdits gènes et, (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression. 2. Méthode selon la revendication 1, comprenant les étapes successives consistant à : (i) diriger l' action d'au moins un inhibiteur de toposiomérase vers un site spécifique desdits gènes en conjuguant ledit au moins un inhibiteur de topoisomérase audit au moins un ligand, (ii) obtenir la fixation dudit au moins un ligand sur lesdits gènes, et (iii) analyser la coupure sur les gènes et déterminer l'inhibition de l'expression. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'étape (i) consiste à diriger l'action dudit au moins un inhibiteur de l'activité de relaxation et de coupure de la topoisomérase I ou II vers un site spécifique de l'ADN permettant d'induire, sélectivement à ce site, la coupure par la topoisomérase I ou II. 4. Méthode selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que les séquences desdits gènes cibles comprennent au moins un site reconnu par ledit au moins un ligand. 5. Méthode selon la revendication 2,3 ou 4, caractérisée en ce que les séquences desdits gènes cibles comprennent le site de l'inhibiteur de topoisomérase dans leur voisinage. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que ledit au moins un inhibiteur de topoisomérase est choisi dans le groupe comprenant les agents intercalants, comme les indolocarbazoles, les agents non intercalants, comme la camptothécine, des ligands du petit sillon, comme les benzimidazoles. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit au moins un ligand est choisi dans le groupe constitué par des ligands de l'ADN spécifiques de séquence, tels que des oligonucléotides, ou des ligands non nucléiques, tels que des ligands du petit sillon (polyamides en épingle à cheveux composés de pyrroles et d'imidazoles, notamment les conjugués (3+3)-CPT et (4+4)-CPT) ou encore par des peptides à doigts de zinc. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit ligand est choisi parmi les acides ribonucléiques, les acides désoxyribonucléiques, les PNA, acides nucléiques peptidiques, les acides 2'OAlkyl ribonucléiques, les oligophosphoramidates, les LNAs (ARNs bloqués pour la conformation du ribose). 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que le clivage par un conjugué comprenant un oligonucléotide formant triple hélice-inhibiteur de topoisomérase est dirigé sur chaque séquence desdits gènes cibles oligopyrimidique#oligopurique contenant un nombre de purines compris entre 2 et 30 avec un site de coupure induit par l'inhibiteur de topoisomérase I du côté 3' du triplex sur le brin oligopyrimidique de la cible. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit site de clivage induit par l'inhibiteur de topoisomérase est positionné de 3 à 8 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences desdits gènes cibles sont soit des séquence cibles présentes dans le génome humain sur des gènes impliqués dans une pathologie, soit des cibles présentes dans un gène viral ou parasitaire et absentes du génome humain, soit des séquences présentes sur un ensemble de gènes impliqués dans le maintien ou le développement d'une pathologie. 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que les séquences desdits gènes cibles sont présentes sur un ensemble de gènes, notamment de gènes impliqués dans la transmission d'un signal de croissance et/ou dans l'inhibition de l'apoptose. 13. Composé chimique formant un complexe ternaire caractérisé, en ce qu'il comprend une partie ligand de l'ADN spécifique des gènes cibles codant pour des protéines d'intérêt, un bras de liaison et un inhibiteur de topoisomérase I, tels que : OFT-L3-CPT, et (3+3)-CPT OFT- 18-L6-CPT OFT-18-L4-CPT, OFT 16-L6-10CPT, et OFT16-L4- 10CPT, OFT16-L6-7-CPT, OFT18-L6-7CPT, CPT-L6, OFT. 14. Composé chimique, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un conjugué comprenant un oligonucléotide formant triple hélice et un inhibiteur de topoisomérase I qui induit une coupure sur l'ADN, ce composé dirigeant un clivage au voisinage de chaque séquence desdits gènes cibles oligopyrimidique#oligopurique contenant un nombre de purines compris entre 2 et 30 avec un site de coupure de l'inhibiteur du côté 3' du triplex sur le brin oligopyrimidique de la cible. 15. Composé chimique selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit site de clivage induit par l'inhibiteur de topoisomérase est positionné de 3 à 8 nucléotides de l'extrémité de la triple hélice.