Brevet FR2857265A1 — publié le 20050114

UTILISATION DE LYSO-PCDHA POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES. La présente invention concerne le domaine du traitement et de la prévention des maladies cardiovasculaires. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de Lyso Phosphatidyl Choline DHA (lyso-PCDHA) pour le traitement ou la prévention de pathologies dans lesquelles on observe une accumulation des vésicules lipidiques dans le macrophage. Il s'agit notamment de pathologie résultant de la fixation des oxLDL au CD36 et tout spécialement de pathologies dans lesquelles les métalloprotéases de matrice (T. Takino et al. 1995, J. Biol. Chem. 270,23013-23021) sont impliquées. Les métalloprotéases de la matrice (MMPs) jouent un rôle majeur dans la physiologie du développement des tissus connectifs, la morphogénèse et la cicatrisation. Leur activité a été rapportée dans un nombre considérable de maladies, comme l'arthrite, les cancers, l'artériosclérose. Les MMPs sont aussi impliquées dans la formation et la stabilité de la plaque d'arthérome, le remodelage de la matrice extracellulaire et la migration ou l'infiltration cellulaire. Ainsi, la plupart des décès résultant d'un infarctus du myocarde sont dus à des ruptures au niveau des lésions du réseau fibreux qui conduisent à des thromboses et a une rapide occlusion de l'artère. La présence de nombreux macrophages contribue à la vulnérabilité de ces zones d'artérioscléroses. Cette vulnérabilité est principalement liée à la libération de protéase dégradant la matrice et induisant des faiblesses, des fissures ou une rupture de la structure de la plaque. Plusieurs métalloprotéases de matrice sont produites par les macrophages dans la plaque d'artériosclérose, comme la stromolysine 1, les métalloprotéases de matrice MMP-3, MMP-1, MMP-7, MMP-9, MMP-12, la collagénase-1, la gélatinase, la matrilysine (Henney, A.M. et al., 1991, PNAS USA, 88,8154-8158 ; Galis, Z. S. et al., 1994, J. Clin. Invest. 94,2493- 2503 ; Brown, D. L. et al., 1995, Circulation 91,2125- 2131 ; Halpert, I. et al., 1996, PNAS USA, 93,9748- 9753). La sécrétion de ces divers métalloprotéases de matrice pourrait être responsable de la dégradation de plusieurs composantes du réseau fibreux. Ainsi, l'identification des molécules capables de contrôler l'activité ou la production des MMPs constitue un enjeu majeur, notamment pour limiter la vulnérabilité de la plaque d'artériosclérose. La Demanderesse a maintenant mis en évidence que la lyso Phosphatidylcholine comprenant de l'acide docosahexanoique (DHA) en position sn-1 ou sn-2 (lyso-PCDHA) est capable de bloquer de manière spécifique la captation de phospholipide et l'accumulation des vésicules lipidiques dans le macrophage. Le lyso-PCDHA est également capable de bloquer de manière spécifique la fixation des oxLDL au CD36 qui est le récepteur majeur des lipoprotéines modifiées. Ces propriétés du lyso-PCDHA sont spécifiques car ni le DHA, l'EPA (acide cicosanoique) ou l'AA (acide arachidonique), ni la lyso-PC oléate ou d'autres lyso-PC acide gras ne présentent ces propriétés. La Demanderesse a également mis en évidence que le lyso-PCDHA peut bloquer l'expression des métalloprotéases de matrice, alors que le DHA, l'EPA, l'AA ou d'autres lyso-PC ne sont pas capables d'une telle activité. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont également permis de mettre en évidence que le lyso-PCDHA est capable de bloquer l'expression de TollR4, qui est un membre de la famille des récepteurs Toll like, alors que le DHA non estérifié induit une augmentation deux fois supérieure de l'expression de cette molécule TollR4. TollR4 forme un complexe avec le CD14 à la surface des cellules endothéliales et de macrophages. Ce complexe fonctionne comme un récepteur des protéines de choc thermique heat shok proteins comme HSP60 impliquées dans diverses voies de signalisation (Kol, A. et al., 2000, J. Immunol. 164,13-17 ; Asea, A. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 15028-15034 ; Xu, Q., 2002, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 22, 1547-1575). Ainsi, TLR4 constitue un médiateur important du recrutement des monocytes au niveau des sites de lésions vasculaires. Les mécanismes de contrôle de la croissance, de l'érosion et de la rupture de la plaque d'artériosclérose conduisant aux épisodes thrombotiques sont méconnus. Il semble toutefois qu'ils mettent en jeu par exemple le dépôt et le retrait de lipide, la survie et la mort cellulaire, l'adhésion cellulaire, la dégradation et la mobilité de la matrice extracellulaire. L'artériosclérose est initiée à des sites spécifiques par des atteintes ou dysfonctionnement de l'endothélium. La production de lipoprotéines oxydées (oxLDL), d'autres oxydants et agents cytotoxiques est à l'origine des dommages vasculaires. Le lyso-PCDHA constitue selon l'invention un agent capable de stabiliser spécifiquement tant au niveau moléculaire que cellulaire la plaque d'artériosclérose. En effet, le lyso-PCDHA est capable de prévenir ou réduire l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose et constitue ainsi un moyen efficace pour traiter les maladies cardiovasculaires qui y sont liées, comme l'artériosclérose. En conséquence, l'invention vise à offrir une méthode de traitement ou de prévention de pathologies dans lesquelles les métalloprotéases de matrice et/ou le récepteur TollR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36 sont impliqués, consistant à administrer à un sujet une quantité efficace de lyso-PCDHA, l'un de ses dérivés ou un mélange de ceux-ci. Il s'agit plus particulièrement de maladies résultant d'une activité enzymatique excessive des métalloprotéases de la matrice, parmi lesquelles on peut citer la polyarthrite rhumatoïde, l'ostéoarthrite, le cancer de la prostate, l'ulcère de la cornée et les ulcères gastriques, l'artériosclérose, les stéatoses hépatiques non alcooliques, l'insuffisance cardiaque, les dermatites et l'infection du derme, les brûlures et les transplantations d'organes. L'invention a donc pour objet l'utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie dans laquelle les métalloprotéases de la matrice et/ou le récepteur TollR4 et/ou le CD36 (fixation des oxLDL) sont impliqués soit séparément soit simultanément. L'invention vise tout particulièrement l' utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies cardiovasculaires, dans lesquelles ledit médicament inhibe ou régule négativement les métalloprotéases de la matrice. Dans le traitement ou la prévention de ces maladies, le médicament selon l'invention est avantageusement également capable de bloquer l'expression de TollR4 et la fixation des oxLDL au CD36. Tout spécialement l'invention concerne l' utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies cardiovasculaires associées à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, site au niveau desquels ledit médicament inhibe les métalloprotéases de la matrice. Comme indiqué précédemment, le médicament selon l'invention est également capable de bloquer l'expression de TollR4 au niveau de ces sites et la fixation des oxLDL au CD36. Ainsi, parmi les maladies cardiovasculaires associées à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, l'invention concerne prioritairement le traitement de l'artériosclérose et de l'hypercholestérolémie. On entend par dérivés du lyso-PCDHA, les lyso-PCDHA dont le DHA est substitué en position sn-1 par un groupe chimique ou une substance capable d'augmenter l'activité du lyso-PCDHA. Il peut s'agir d'un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone, comme par exemple un groupe acétyle, propionyle ou butyle. Il peut aussi s'agir d'une autre molécule de DHA. Le médicament selon l'invention peut être administré par voie orale, sublinguale, nasale, pulmonaire, rectale ou parentérale (par exemple intravasculaire, intramusculaire, transcutanée, intraarticulaire) . A cet effet, il peut être présenté sous toute forme permettant l'administration par voie orale (en particulier sous la forme de gélules, de solutions ou émulsions buvables, de poudres, de gels, de granulés, de tablettes ou de comprimés), par voie nasale (par exemple des solutions à administrer sous forme de gouttes ou de pulvérisations), par voie pulmonaire (solutions en flacon pressurisé pour aérosols), par voie rectale (suppositoires), par voie cutanée (par exemple crèmes, onguents ou dispositifs transdermiques, encore appelés timbres ou patches), par injection (solutions injectables, poudres lyophilisées permettant de reconstituer des solutions injectables) ou par voie transmuqueuse, comme par exemple par voie sublinguale (solutions en flacon pressurisé, ou comprimés à délitement buccal). Ces formes pharmaceutiques sont préparées de façon usuelle et peuvent contenir des excipients et véhicules classiques appropriés. Les agents actifs, lyso-PCDHA ou ses dérivés sont administrés à des doses déterminées par des expériences de routine, en utilisant les tests connus de recherche d'une activité sur la plaque d'artériosclérose. Ainsi, à titre d'exemple, le lysoPCDHA, ses dérivés ou un mélange de ceux-ci, constituant l'agent actif, est présent dans le médicament selon l'invention dans une proportion comprise entre 10 et 100%, de préférence entre 30 et 70%, en poids de la composition totale du médicament. Bien entendu, on peut adapter la posologie en fonction notamment du poids corporel du sujet traité ou du mode d'administration. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 montre l'inhibition de l'accumulation de vésicules lipidiques dans des cellules macrophagiques et la spécificité du lysoPCDHA dans cette fonction. Les cellules, THP1, ont été incubées avec 10-7 M de PMA pendant 24 heures pour induire le phénotype macrophage. Les cellules ont ensuite été incubées dans du milieu RPMI contenant 1% de sérum de veau f#tal en présence ou en absence d'inhibiteur La figure 2 montre la spécificité et l'effet dose dépendant du Lyso PCDHA comparé au DHA acide gras, pour l'inhibition des vésicules de phospholipides. La figure 3 indique la courbe dose réponse et la valeur moyenne de l'IC50 pour l'inhibition de la formation des cellules spumeuses par le lyso PCDHA. La figure 4 montre l'effet inhibiteur du lyso PCDHA sur la fixation de LDL oxydées marquées au Cy3 à la surface des cellules HEK exprimant le récepteur des oxLDL, CD36. La figure 5 montre la spécificité du lyso PCDHA (carrés noirs) comparé au DHA acide gras (carrés blancs) pour l'inhibition de la fixation des oxLDL à la surface des cellules HEK exprimant le récepteur CD36. Le tableau 1 ci-dessous indique les valeurs comparées des IC50 pour l'inhibition de la fixation des oxLDL au CD36 pour le lysoPCDHA, le DHA acide gras, l'acide arachidonique, le lyso PC oleate, l'EPA acide gras et le lysoPC acide gras. Tableau 1 Produit IC50 LysoPCDHA 4 M DHA acide gras > 100 M EPA acide gras > 100 M Lyso PC Oleate > 100 M PC > 100 M Acide arachidonique > 100 M La figure 6 montre l'inhibition spécifique de l'expression des gènes appartenant à la famille des métalloprotéases et du gène TollR4 par le lyso PCDHA dans les cellules macrophagiques. Exemple 1 : Préparation du lysophosphatidyl-choline DHA (LPCDHA). Les phosphatidylcholines DHA (PCDHAs) contenant le DHA en position sn2 peuvent être isolés à partir d'huile de poisson ou à partir d'une biomasse obtenue d'une culture de crypthecodinium conhii par un procédé décrit dans les brevets EP 0 298 787 et US 5,654,290. Les PCDHAs peuvent être obtenus par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) selon le protocole décrit par Christie et col. (J.Lipid Res. 1985,26, 507-512 ). Les PCDHAs obtenus par ce procédé peuvent contenir jusqu'à 66% de DHA. Dans un deuxième temps, la chaîne acyle en position snl des PCDHAs est hydrolysée par une lipase ayant une activité phospholipase A : subi. La forme acyl-DHAsn2- glycerophosphorylcholine (Lyso PCDHA) peut être purifiée sur gel de silice 60G tel que décrit par Polette et col. ( Lipids, 1999,34, 1333-1337 ) ou par chromatographie. Les PCDHAs peuvent également être obtenus par semi-synthèse à partir de glycerophosphorylcholine et de glycérophosphate contenant des résidus acétiques, propioniques, butyrique, caproique ou DHA tel que décrit dans le brevet US 5,654,290. Exemple 2 Formation des cellules spumeuses et inhibition de l'accumulation des vésicules lipidiques (figures 1 et 2). La différenciation des macrophages et la formation de cellules spumeuses peuvent être obtenues de la manière suivante : les cellules qui peuvent être des cellules THP1 à titre d'exemple, sont ensemencées dans un milieu contenant 1% de RPMI 1640 et 5 % de sérum de veau f#tal. Leur différenciation en macrophage est obtenue en présence de 10-7 M de phorbol 12myristate-13-acétate (PMA) pendant une période pouvant durée 24 heures à 37 C en présence de C02. Les cellules sont ensuite lavées à l'aide du milieu RPMI pour retirer le PMA. Les cellules différenciées sont ensuite incubées en présence d'un milieu de culture RPMI contenant 1% de sérum de veau f#tal en présence de l'inhibiteur, lysoPCDHA ou autre compétiteur, à différentes concentrations pendant 6 heures. Les cellules sont ensuite fixées dans de la paraformaldéhyde 2% pendant 15 minutes à température ambiante, et colorées à l' aide d'une solution Oil Red Opour visualiser les lipides intracellulaires. La quantité de vésicules formées est ensuite déterminée par la mesure de la fluorescence intracellulaire en utilisant un microscope à fluorescence couplé à une caméra CCD. La viabilité des cellules pendant l'essai peut être mesurée à l'aide du Trypan bleu. Les valeurs illustrées dans la figure 2 démontrent l'effet inhibiteur spécifique du LysoPCDHA comparé à l' acide gras DHA sous sa forme purifiée. La courbe effet-dose illustrée dans la figure 3 a été obtenue en utilisant des concentrations de lysoPCDHA allant de 10-7 M à 10-4 M . Exemple 3 : Inhibition de la fixation des oxLDL au CD36 (figures 4 et 5). Les méthodes qui permettent d'exprimer le récepteur des oxLDL à la surface de cellules, et de mesurer la fixation des LDL oxydées à la membrane de ces cellules ont été décrites dans le brevet WO 01/94952 A2. Ces méthodes peuvent être résumées de la manière suivante : Des cellules fibroblastiques de type HEK, transfectées par un plasmide contenant la séquence codante du CD36, comprenant le domaine cytoplasmique de ce récepteur, sont ensemencées pendant 72 heures dans des plaques 96 puits contenant de la lysine et du milieu MEM contenant 10% de sérum de veau f#tal. Les LDL humaines sont isolées à partir de plasma frais à l'aide d'une méthode en deux étapes impliquant des ultracentrifugations sur gradient de KBr (Léger et col Free Rad Res. 2002,36, 127-142 ) . Les LDL sont dialysées pendant 24 heurs contre un tampon à pH 7,4 contenant NaCL 150mM, Phosphate de sodium 10 mM, DTPA 10 pM. Les LDL peuvent être oxydées en présence de cuivre en incubant dans des conditions stériles, 0,2 mg/ml de LDL avec 5 uM de CuS04 pendant 16 heures à 37 C. L'oxydation peut être stoppée par l'addition de BHT à 40 M final et du DTPA à 100 M final. Les LDL oxydées sont ensuite dialysées contre 150mM NaCl et du Phosphate de sodium à 10 mM, pH 7,4 pendant 24 heures. Les LDL et les oxLDL sont ensuite caractérisées en mesurant leur taux de ApoB, protéine totale, cholestérol total, et leur teneur en vitamine E, l'apparition de diènes conjugués, et leur composition en oxysterol et en acides gras. Les oxLDL sont marquées par l'ester de succinidyl Cyanine 3 (Amersham Pharmacia Biotech) tel que décrit par Stanton et col (JBC, 1992,267, 22446- 22451). Après une dialyse exhaustive, le rendement du marquage peut être évalué par la mesure de l'absorbance à 548 nm. Exemple 4 Mesure de l'expression différentielle des gènes (figure 6). Les cellules pré-incubées avec ou sans inhibiteur, sont utilisées pour extraire les ARN totaux à l'aide de kit d'extraction tel que le kit Quiagen, RNeasy Mini Kit selon les recommandations du fournisseur. La qualité des ARN totaux peut être estimée à l'aide du bioanalyser Agilent 2100. Les ARN totaux sont ensuite amplifiés sous forme d'ARNa selon la méthode suivante : - Synthèse d'ADNcomplementaire . les ARNtotaux sont dissous dans un mix contenant lui de dNTP lOmM et lui de primer T7-dT 24 à 20mM dans un volume final de 10 l ; incubés pendant 5minutes à 65 C et refroidis dans de la glace. On ajoute ensuite, 4 l d'un mélange contenant 2 l de 0,1 M DTT et lui d'inhibiteur de RNase recombinante RNaseOUT (40 U/pl). Le mélange est incubé à 42 C pendant 2 minutes et on ajoute 200 U de Superscript II RNase H RT (In Vitrogen). La réaction est poursuivie 1 heure à 42 C. On ajoute ensuite 30pL d'un mélange contenant 10 mM de dNTP (3 l), 4 l de DNA polymerase I (10 U/pl) , 1 l de DNA ligase (100 U/ l), 1 l de RNase H (2 U/ul) . 91 l d'eau sont ajoutés au mélange. La réaction est poursuivie pendant 2 heures à 16 C. Elle est suivie par une incubation de 10 min à 16 C en présence de T4 DNA polymerase (5 U/ml) . La réaction est stoppée par l'addition de 10 l d'E DTA à 0,5 M. Les ADNc sont ensuite extraits du mélange par des techniques conventionnelles. - Amplification à l'aide de la RNA polymerase T7 : pour amplifier les ADNc on peut utiliser le kit MEGAscript TM T7 de Ambion et suivre les indications du fournisseur. Les ARNa obtenus peuvent être récupérés à l'aide du kit Quiagen RNeasy, leur concentration est mesurée et la qualité de l'amplification peut être évaluée à l'aide du bioanalyseur de chez Agilent. Un second tour d'amplification peut éventuellement être réalisé. - Expression différentielle : L'expression différentielle des gènes peut être évaluée de différentes manières en utilisant plusieurs technologies comme la RT-PCR, le Differential Display, ou la méthode SAGE. Dans la présente invention la technologie des puces à ADN a été préférée. Des réseaux contenant 24 000 sondes différentes (Agilent) ont été utilisés pour mesurer l'expression différentielle. Pour cette analyse, le marquage des cibles au Cy3 et Cy5, l'hybridation des cibles aux réseaux d'ADN, et la mesure des rapports d'expression Cy3/ Cy5 ont été réalisés selon les indications du fournisseur Agilent, après détection au scanner Agilent G2565AA les rapports d'intensité sont analysés. REVENDICATIONS 1) Utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie dans laquelle les métalloprotéases de la matrice et/ou le récepteur TolR4 et/ou le CD36 sont impliquées. 2) Utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés selon la revendication 1 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant d'une activité enzymatique excessive des métalloprotéases de matrice. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite maladie est choisie dans le groupe comprenant les maladies cardiovasculaires, la polyarthrite rhumatoide, l'ostéoarthrite, le cancer de la prostate, l'ulcère de la cornée et les ulcères gastriques, l'artériosclérose, les stéatoses hépatiques non alcooliques, l'insuffisance cardiaque, les dermatites et l'infection du derme, les brûlures et les transplantations d'organes. 4) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie cardiovasculaire, dans laquelle ledit médicament inhibe ou régule négativement les métalloprotéases de la matrice. 5) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit médicament bloque en outre l'expression de TollR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36. 6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie cardiovasculaire associée à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, sites au niveau desquels ledit médicament inhibe les métalloprotéases de la matrice. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit médicament bloque en outre au niveau desdits sites l'expression de TollR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que ladite maladie est l'artériosclérose ou l'hypercholestérolémie. 9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dérivés de lyso-PCDHA sont choisis parmi les lyso-PCDHA dont le DHA est substitué en position sn-1 par un groupe chimique ou une substance avantageusement capable d'augmenter l'activité du lyso-PCDHA. 10) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit groupe chimique est un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone, comme par exemple un groupe acétyle, propionyle ou butyle. 11) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite substance est une autre molécule de DHA.