Brevet FR2854769A1 — publié le 20041119

L'invention se rapporte à l'utilisation d'un extrait soluble de luzerne dans le domaine de la nutrition humaine et animale, et en particulier des mammifères. Les régimes alimentaires des populations occidentales conduisent à 5 de nombreux dysfonctionnements dont certains signes sont l'obésité et des taux élevés de cholestérol sanguin, cause de nombreuses maladies. Les substances de synthèse développées par l'industrie pharmaceutique pour lutter contre ces dysfonctionnements métaboliques, présentent, dans un certain nombre de cas, beaucoup d'effets secondaires 10 dont certains peuvent être létaux. La prise de poids comme la cholestérolémie d'un individu est liée pour partie à ses habitudes alimentaires et notamment à la part de lipides ingérés. Le blocage d'une partie des lipides au cours du processus digestif conduisant à une non-absorption au niveau intestinal, permet de réduire 15 l'apport énergétique de la ration sous forme de lipides, et de diminuer l'entrée des précurseurs du cholestérol dans l'organisme. Il est connu de l'homme du métier que les saponines, qui sont notamment présentes dans de nombreux végétaux, ont des effets hypocholestérolémiants. Ainsi, d'après l'article " Alfafa saponins and their Implication in Animal Nutrition ", J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 131-140, il est connu que l'administration de saponines à des animaux tels que des poussins, des coqs adultes permet de diminuer le taux de cholestérol dans le plasma sanguin. De même, il est possible de prévenir l'hypercholestérolémie chez les alpins, 25 induite par l'ingestion de cholestérol, par l'incorporation de saponines dans le régime alimentaire. Toutefois, rien n'est dit dans cet article concernant un effet des saponines sur la prise de pois. En outre, rien n'est dit concernant le dosage quotidien nécessaire en saponines pour obtenir un effet significatif au niveau du taux de cholestérol sanguin. Par ailleurs, la demande de brevet français FR 2 794 616 décrit notamment un produit végétal issu de la luzerne, concentré en saponine ou en sapogénine, et exempt de la carnavanine d'accompagnement indésirable parce que toxique. La demande de brevet français FR 2 794 616 décrit également l'utilisation de ce produit végétal dans un procédé de production 35 d'un complément nutritionnel ayant des propriétés hypocholestérolémiantes 2 2854769 à l'égard du cholestérol présent ou introduit dans l'intestin. Dans cette demande de brevet, il est indiqué que l'absorption quotidienne par un être humain de ce produit végétal contenant 1,5 à 40 % en poids de saponines ou de sapogénines, à raison de 50 à 1 000 mg par jour, et en particulier de 200 5 à 400 mg par jour, permet de maintenir le taux de cholestérol plasmatique à un taux normal, et ceci même lorsque la personne qui l'absorbe s'alimente avec des produits réputés chargés en cholestérol. Toutefois, rien n'est dit dans cette demande concernant un effet de ce produit sur la limitation de la prise de poids induite par un tel régime alimentaire. En outre, le dosage 10 indiqué ne tient pas compte du poids de l'individu. Or, la demanderesse a découvert que l'administration à des rats, dans le cadre d'un régime hyperlipémiant, d'un extrait de luzerne soluble contenant au moins 1 % de saponine, à raison de 0,8 à 3 g par jour et par kilogramme de poids vif d'animal, permettait de limiter la prise de poids. La 15 demanderesse a également découvert que cela permettait de diminuer les taux de cholestérol total et de triglycérides dans le sang, tout en maintenant le taux de cholestérol VLDL à des valeurs constantes malgré le régime hyperlipémiant. Par taux de cholestérol VLDL (également appelé " mauvais 20 cholestérol ") on entend au sens de la présente invention, le taux de cholestérol contenu dans les lipoprotéines très basse densité (very low density lipoprotein >"). Ainsi, la présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un extrait soluble de luzerne obtenu par pressage de luzerne fraîche, et contenant au 25 moins 1% en poids de saponines par rapport au poids de l'extrait, pour limiter la prise de poids chez les mammifères, notamment dans le cadre d'un régime hyperlipémiant, consistant à ajouter à la ration alimentaire du mammifère 0,8 à 3 g, de préférence 0,9 g à 2,73 g, et mieux 0,91 g par jour et par kilogramme de poids vif du mammifère dudit extrait. De préférence, I'extrait soluble de luzerne utilisé selon l'invention se présente sous la forme d'une poudre ayant un taux d'humidité compris entre 3 et 10% en poids, et comprend, en poids par rapport au poids de poudre sèche: - 15 à 25% de protéines brutes, - 10 à 30% de matières minérales, 3 2854769 - 0 à 2% de cellulose brute, - 10 à 25% de sucres, et - 5 à 20% d'acides organiques. Les matières minérales sont de façon classique à base de potassium, de calcium, de magnésium, de phosphore, de zinc et de fer. Les sucres présents dans l'extrait soluble de luzerne utilisé selon l'invention sont généralement essentiellement représentés par le glucose et le fructose, et dans une moindre mesure par le galactose, le stachyose et le verbascose. Avantageusement, I'extrait soluble de luzerne comprend, en poids par rapport au poids de poudre sèche, 5 à 12% d'acide malique. L'extrait soluble de luzerne utilisé selon l'invention peut être obtenu par le procédé décrit dans le brevet FR 2 294 647. Il correspond en général à un jus de luzerne obtenu par pressage, débarrassé de ses protéines 15 précipitables, puis concentré. La luzerne d'origine ne subit de préférence pas de préfanage, ce qui permet de conserver un maximum de composés métaboliques présents dans la plante (vitamines, facteurs de croissance, métabolites intermédiaires par exemple) au moment de la récolte. En particulier, I'extrait soluble de luzerne peut être obtenu par 20 concentration et séchage d'un sérum obtenu à partir de luzerne fraîche selon un procédé comprenant les étapes suivantes: (a') pressage à froid de la luzerne fraîche, ce qui fournit un jus vert et un tourteau; (b') traitement du jus vert par alcalinisation à un pH voisin de 8,5, par 25 exemple à l'ammoniaque; (c') floculation des protéines du jus vert par traitement thermique, ce qui fournit un précipité de protéines et un extrait soluble (également appelé sérum); (d') centrifugation du mélange extrait soluble-protéines précipitées 30 jusqu'à obtention de l'extrait soluble de luzerne (ou sérum); (e') séchage de l'extrait soluble de luzerne par atomisation ou " spray drying ", ce qui fournit un extrait sec sous forme pulvérulente de couleur ocre. L'extrait soluble de luzerne est de préférence incorporé dans une préparation alimentaire (liquide ou solide) avant d'être administré par voie orale, en complément de la ration alimentaire. L'utilisation selon la présente invention d'un extrait de luzerne tel que 5 défini précédemment permet également, concomitamment à la limitation de la prise de poids, de diminuer les taux de cholestérol et de triglycérides total dans le sang, et de maintenir constant le taux de cholestérol VLDL dans le sang, et ce, même dans le cadre d'un régime hyperlipémiant. L'exemple suivant illustre l'invention de façon plus détaillée mais non 10 limitative. EXEMPLE Evaluation des effets d'un extrait de luzerne administré par voie orale, sur la prise de poids et la lipémie chez le rat mâle Wistar adulte. Dans cet exemple, on a étudié les effets de la consommation pendant jours d'un extrait de luzerne (ou sérum de luzerne) contenant 1,1 % en poids de saponines par rapport au poids de l'extrait, sur la prise de poids et la lipémie chez des rats mâles Wistar adultes. Trois groupes de 12 rats mâles adultes ont reçu pendant 45 jours un 20 régime hyperlipidique afin d'induire une légère hyperlipémie (triglycérides et cholestérol). On a administré à deux de ces groupes, le sérum de luzerne du 1 5ème au 45ème jour. Le troisième groupe de rats, non-traité avec le sérum de luzerne, sert de témoin. Des prélèvements sanguins sont effectués pendant l'induction de la 25 lipémie aux jours 0,7 et 15 et pendant le traitement avec le sérum de luzerne aux jours 30 et 45, afin de déterminer le statut lipidique des animaux. 1. Suiets Trente-six rats mâles adultes Wistar/AF EOPS (Centre d'élevage 30 Charles River/lffa-Credo, 69-St-Germain sur l'Arbresle, France) âgés de 16 semaines. Les rats sont marqués et répartis par groupes de deux dans des cages en polycarbonate de type F (43 x 28x 15 cm, U.A.R., 91 - Epinay-surorge, France). Les animaux sont stabulés dans une animalerie climatisée, à 2854769 une température de 22-24 C et soumis à un cycle lumière-obscurité inversé de 12 heures (lumière de 20 h à 08 h). Après familiarisation aux conditions du laboratoire pendant 7 jours, et suite aux 15 jours de traitement hyperlipémiant, les rats sont répartis en 3 5 groupes de traitements homogènes par rapport à leur statut lipidique (cholestérol et triglycérides): - un groupe témoin (constitué de 12 rats), et - deux groupes " Sérum de Luzerne " (chacun également constitué de 12 rats). io Les rats des trois groupes sont tous manipulés de la même façon et dans les mêmes conditions. Afin d'éviter les interférences éventuelles entre les divers produits, les deux rats d'une même cage reçoivent le même produit. 2. Produit testé Extrait soluble de luzerne fourni sous forme de poudre sèche par la société ALFALIS. Les caractéristiques de ce produit sont présentées ci-après dans le tableau 1. TABLEAU 1 Produit Sérum de Luzerne Origine ALFALIS France Numéro de lot 05877 Date d'expiration Non communiquée Stockage A température ambiante, protégé de la lumière, de la moisissure et de l'humidité 3. Procédure expérimentale L'eau de boisson et le régime hyperlipidique préparé spécifiquement pour augmenter la lipémie des animaux sont présentés ad libitum aux animaux. 6 2854769 Ce régime est constitué de nourriture standard (nourriture M20, Dietex, France) complémentée en lipides sous la forme de graisse de porc raffinée (Saindoux à 21.4 %), en cholestérol (1%, Acros Organics, NoisyleGrand, France), ainsi qu'en saccharose (3,8 %). Le régime préparé est s reconstitué sous forme de boulettes par ajout de 20 % d'eau. Les rats des deux groupes " Sérum de Luzerne " reçoivent quotidiennement, du 15ême au 45eme jour, 0,91 g et 2,73 g/kg de poids corporel de l'extrait " Sérum de Luzerne ", contenant 10 et 30 mg de saponines/kg. Le traitement quotidien des rats témoins est constitué d'une solution de 0,54 g/kg de saccharose équivalente à la quantité de glucide contenus dans l'extrait de " Sérum de Luzerne "> à la dose la plus concentrée. Aux jours 0, 7, 15, 30 et 45, les rats de trois groupes sont mis à jeun 12 heures avant les prélèvements sanguins. Le protocole d'administration des extraits de luzerne est indiqué cidessous dans le tableau 2. TABLEAU 2 Groupes Nombre de Dose Jours Jours rats par (g/kg) d'administration du d'administration de groupe régime hyperlipidique I'extrait de luzerne Véhicule 12 Luzerne 1 12 0.91 J1 à J45 J15 à J45 Luzerne 2 12 2.73 4 Administration des produits L'extrait " Sérum de Luzerne " est mis en suspension dans une solution aqueuse et administré par voie orale quotidiennement du 15ème au 45ème jour. - Variables étudiées Pour l'application de l'effet de l'extrait de luzerne sur la lipémie des rats mâles WISTAR, on a dosé dans le sérum les variables biologiques suivantes: le taux de cholestérol total, le taux de triglycérides, et le taux de cholestérol VLDL. Les poids des animaux sont relevés tous les trois ou quatre jours afin d'adapter les doses des traitements. La prise alimentaire des rats est évaluée une fois par semaine. 6. Résultats * Evolution pondérale L'évolution pondérale (en g) des 3 groupes de rats est représentée en terme de poids moyen (en g), du jour 1 au jour 43, sur la figure 1, et correspond aux résultats présentés dans le tableau 3. La figure 1 et le tableau 3 montrent les faits suivants: - pendant les 15 premiers jours de traitement avec le régime 15 hyperlipémiant, les poids des rats des trois groupes évoluent de manière équivalente; - à partir du jour 18, et jusqu'à la fin du traitement, le poids des rats du groupe Luzerne 2 reste significativement inférieur à celui des rats du groupe témoin; - du jour 25 et jusqu'à la fin du traitement, le poids des rats du groupe Luzerne 1 reste significativement inférieur à celui des rats du groupe témoin. Le traitement avec l'extrait de luzerne permet de limiter la prise de poids conséquente à un régime alimentaire hyperlipémiant. L'effet de la 25 limitation de la prise de poids est plus marqué lorsque l'extrait de luzerne est administré à 2,73 g/kg (Luzerne 2), qu'à 0,91 g/kg (Luzerne 1) . TABLEAU 3 Evolution pondérale (g) (moyenne + ESM) Véhicule Luzerne 1 Luzerne 2 Jours (n=12) (n=12) (n=9) J1 357.00 + 2.37 356.17 + 1.97 357.44 + 3.38 J5 376.33 + 3.07 376.67 + 3.04 376.44 4.48 J8 388.83 + 4.75 390.92 4.14 387.44 + 5.08 Jill 410.42+ 5.45 414.08+ 5.15 409.11 + 5.49 J14 426.25 + 6.14 428.25 + 5.38 421.00 + 6.64 J18 439.33 + 7.07 429.33 + 6.71 413.44 + 9.22 J22 456.25 + 7.05 440.25 + 7.40 429.00 + 10.12 J25 463.83 + 6.97 442.50 + 6.83 428.11 + 9.18 J28 473.00 + 7.06 448.75 + 7.68 435.00 + 8.91 J32 485.28 + 7.28 458. 08 + 7.37 442.67 + 10.24. J35 491.33 + 7.71 462.92 + 7.54 447.56 + 10.81 J39 504.17 + 7.77 475.75 + 8.53 455.67 +11.36 J43 510.00 + 8.26 481.67 + 10.00 457.00 + 11.78 o10 9 2854769 Evolution de la prise alimentaire L'évolution alimentaire du jour 1 au jour 43 des 3 groupes de rats est représentée en terme de prise alimentaire moyenne par rapport au poids corporel (en %) sur la figure 2, et correspond aux résultats présentés dans le tableau 4. La figure 2 et le tableau 4 montre qu'aux jours 1, 8, 16, 22, 29, 36 et 43, on n'observe pas d'hétérogénéité significative au niveau des prises alimentaires des rats des 3 groupes. Les rats traités avec l'extrait de luzerne prennent significativement 10 moins de poids que les rats témoins alors que les rats des trois groupes consomment la même quantité d'aliments relativement à leurs poids respectifs. TABLEAU 4 Evolution de la prise alimentaire en fonction du poids corporel (%) (moyenne +ESM) Véhicule Luzerne 1 Luzerne 2 Jours (n=12) (n=12) (n=9) J1 8.41 + 0.49 8.86 + 0.41 9.37 + 0.43 J8 7.58 + 0.25 7.92 + 0.24 8.07 + 0. 18 J16 5.87 + 0.21 5.36 + 0.21 5.22 + 0.31 J22 6.04 + 0.18 5.34 + 0.21 5. 71 + 0.14 J29 5.12 + 0.15 5.26 + 0.15 5.48 + 0.32 J36 5.34 + 0.23 5.42 + 0.27 5.13 + 0.09 J43 5.10 0.15 4.92 0.21 4.72 0.34 * Evolution du taux de cholestérol total L'évolution du taux de cholestérol total chez les rats des 3 groupes, du jour 1 au jour 43, est représentée en terme de taux de cholestérol total moyen dans le sang (en g/l) sur la figure 3 et correspond aux résultats présentés dans le tableau 5. Ces résultats montrent les faits suivants: - pendant les 45 jours de traitement avec le régime hyperlipémiant les taux de cholestérol total restent constants chez les rats des groupes Véhicule et Luzerne 2; 2854769 - chez les rats du groupe Luzerne 1, le taux de cholestérol total diminue significativement de J30 à J45; Le traitement avec l'extrait de luzerne pendant 30 jours à 0.91 g/kg fait diminuer le taux de cholestérol total. TABLEAU 5 Evolution du taux de cholestérol total (g/l) (moyenne + ESM) Véhicule Luzerne 1 Luzerne 2 Jours (n=12) (n=12) (n=9) J1 0.75 + 0.04 0.73 + 0. 04 0.72 + 0.54 J15 0.76 + 0.03 0.77 0.03 0.73 + 0.03 J30 0.75 + 0. 04 0.77 0.03 0.76 + 0.04 J45 0.75 + 0.03 0.67 0.03 0.70 + 0.04 Evolution du taux de triglycérides L'évolution du jour 1 au jour 43 du taux de triglycérides est présentée en terme de taux moyen sanguin en g/I sur la figure 4, et correspond aux 15 résultats présentés dans le tableau 6. Ces résultats montrent les faits suivants: - pendant les 15 premiers jours de traitement avec le régime hyperlipémiant, le taux de triglycérides augmente significativement chez les rats des trois groupes de traitements; - de J15 à J30, il diminue significativement chez les rats des groupes Véhicule et Luzerne 1; - de J30 à J45, il diminue significativement chez les rats des groupes Luzerne 1 et Luzerne 2; - au dernier jour des traitements (J45), le taux de triglycérides est 25 plus bas chez les rats des groupes Luzerne 1 et Luzerne 2 que ceux du groupe témoin. Le traitement avec l'extrait de luzerne pendant 30 jours permet de diminuer significativement le taux de triglycérides lorsqu'il est administré à 0.91 g/kg et tend à le diminuer lorsqu'il est administré à 2.73 g/kg. 30 Tableau 6 Evolution du taux de triglycérides (g/l) (moyenne + ESM) Jours Véhicule Luzerne 1 Luzerne 2 (n=12) (n=12) (n=9) J1 0.46 + 0.05 0.41 0.03 0.38 + 0.02 J15 1.96 + 0. 28 2.01 +0.24 1.77 + 0.35 J30 1.15 + 0.18 0.78 + 0.09 1.26 + 0.32 J45 0.78 + 0.11 0.44 + 0.06 0.50 + 0.09 * Evolution en taux de cholestérol VLDL L'évolution du taux de cholestérol VLDL, du jour 1 au jour 43, des 3 groupes de rats est représentée en termes de taux sanguin moyen sur la 10 figure 5, et correspond aux résultats présentés dans le tableau 7. Les résultats montrent que: - pendant les 15 premiers jours du traitement avec le régime hyperlipémiant, le taux de cholestérol VLDL reste constant chez les rats des groupes Véhicule et Luzerne 1, mais augmente 15 significativement chez les rats du groupe Luzerne 2. Cette augmentation est due à une variabilité individuelle importante au sein de ce groupe indépendante de l'administration de la luzerne qui n'a commencé qu'à partir du jour 15; - de J15 à J45 le taux de cholestérol VLDL tend à augmenter chez 20 les rats témoins malgré une tendance à la diminution entre J30 et J45; - au jour 45 le taux de cholestérol VLDL chez les rats témoins est significativement supérieur à celui des rats du groupe Luzerne 1 et tend à être supérieur à celui de rats du groupe Luzerne 2; - de J15 à J45 le taux de cholestérol VLDL tend à diminuer chez les rats du groupe Luzerne 2, et diminue significativement de J30 à J45 pour retrouver une valeur basale normale; - durant la durée des traitements le taux de cholestérol VLDL est resté constant chez les rats du groupe Luzerne 1. 12 2854769 Le traitement avec l'extrait de luzerne pendant 30 jours permet de maintenir le taux de cholestérol VLDL à des valeurs constantes malgré le régime hyperlipémiant. Le traitement des rats avec l'extrait de luzerne semble plus efficace à la dose de 0.91 g/kg/j que lorsqu'il est administré à la dose de 2.73 g/kg/j. Tableau 7 Evolution du taux du cholestérol VLDL (g/l) (moyenne + ESM) Jours Véhicule Luzerne 1 Luzerne 2 (n=12) (n=12) (n=9) J1 0.09 + 0.01 0.08 + 0.01 0.08 0.003 J15 0.10 + 0. 04 0.11 + 0.04 0.22 +0.05 J30 0.23 + 0.04 0.16 0.02 0.18 + 0.05 J45 0. 16 + 0.02 0.09 + 0.01 0.10 + 0.02 Les effets sur la prise de poids et la lipémie de la consommation de l'extrait de luzerne pendant 30 jours chez le rat mâle Wistar adulte sont donc les suivants: - limitation de la prise de poids conséquente à un régime alimentaire hyperlipémiant; - à la dose de 0.91 g/kg, diminution du taux de cholestérol total; - diminution significative du taux de triglycérides lorsque l'extrait de luzerne est administré à 0.91 g/kg, et tendance à la diminution 20 lorsqu'il est administré à 2.73 g/kg; - maintien du taux du cholestérol VLDL à des valeurs constantes malgré le régime hyperlipémiant; I'extrait de luzerne semble plus efficace à la dose de 0.91 g/kg/j qu'à la dose de 2.73 g/kg/j. 13 FR 03 05924 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un extrait soluble de luzerne obtenu par pressage de luzerne fraîche et contenant au moins 1 % en poids de saponines par rapport au poids de l'extrait, pour la fabrication d'une préparation alimentaire apte à 5 limiter la prise de poids chez les mammifères, notamment dans le cadre d'un régime hyperlipémiant, ladite préparation étant adaptée à l'ajout à la ration alimentaire du mammifère de 0,8 g à 3 g par jour et par kilogramme de poids vif de mammifère dudit extrait. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la 10 préparation alimentaire est adaptée à l'ajout à la ration alimentaire de 0,9 g à 2,73 g, et de préférence de 2,73 g par jour et par kilogramme de poids vif de mammifère dudit extrait. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait soluble de luzerne se présente sous la forme d'une poudre ayant un 15 taux d'humidité compris entre 3 et 10% en poids, ledit extrait comprenant, en poids par rapport au poids de poudre sèche: - 15 à 25% de protéines brutes, - 10 à 30% de matières minérales, - 0 à 2% de cellulose brute, - 10 à 25% de sucres, et - 5 à 20% d'acides organiques. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'extrait soluble de luzerne comprend, en poids par rapport au poids de poudre sèche, 5 à 12% d'acide malique. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'extrait soluble de luzerne est obtenu par concentration et séchage d'un sérum obtenu à partir de luzerne fraîche selon un procédé comprenant les étapes suivantes: (a') pressage à froid de la luzerne fraîche, ce qui fournit un jus vert et 30 un tourteau; (b') traitement du jus vert par alcalinisation à un pH voisin de 8,5, par exemple à l'ammoniaque; (c') floculation des protéines du jus vert par traitement thermique, ce qui fournit un précipité de protéines et un extrait soluble de luzerne; 14 FR 03 05924 (d') centrifugation du mélange extrait soluble-protéines précipitées jusqu'à obtention de l'extrait soluble de luzerne; (e') séchage du sérum par atomisation, ce qui fournit en extrait sec sous forme pulvérulente de couleur ocre. s 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit extrait est incorporé dans la préparation alimentaire avant d'être administré par voie orale, en complément de la ration alimentaire. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, io caractérisée en ce que, concomitamment à la limitation de la prise de poids, ledit extrait permet également de diminuer le taux de cholestérol total dans le sang. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que, concomitamment à la limitation de la prise en poids, 15 ledit extrait permet également de maintenir constant le taux de cholestérol VLDL dans le sang. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que, concomitamment à la limitation de la prise de poids, ledit extrait permet également de diminuer le taux de triglycérides dans le 20 sang.