Brevet FR2847674A1 — publié le 20040528

I La présente invention concerne une nouvelle technique analytique utilisant la RMN et ses applications. L'analyse de composés revêt une très grande importance en chimie et dans les domaines apparentés comme la pharmacie. En conséquence de nombreuses techniques analytiques ont été mises au point. Les techniques analytiques peuvent être divisés en deux grandes catégories: les méthodes pour la séparation des mélanges et les méthodes pour l'identification des molécules (structure, formule en terme de constituants atomiques). Dans la première catégorie, on peut citer notamment les diverses chromatographies et l'électrophorèse capillaire, dans la seconde catégorie la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie infra-rouge, les spectroscopies atomique et électronique comme la spectrophotométrie d'émission, et la spectroscopie de masse. Il est en effet très souvent nécessaire d'identifier un composé par exemple pour en déterminer la structure, ou d'identifier plusieurs composés d'un mélange. Ce dernier travail est parfois très difficile, notamment quand les composés ont des structures très voisines. Il serait donc souhaitable de disposer d'une technique analytique simple et rapide pour l'identification des composants d'un mélange. Or après de longues recherches la demanderesse a découvert avec étonnement qu'en combinant simplement un support utilisé en chromatographie en phase liquide (phase stationnaire) et une méthode de la RMN pour l'analyse de solides et de la diffusion moléculaire, on obtenait une remarquable caractérisation des composants d'un mélange s'illustrant graphiquement par une remarquable séparation des composants. C'est pourquoi la présente demande a pour objet un procédé d'analyse caractérisé en ce que l'on soumet à une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire un échantillon à analyser placé dans un support permettant la diffusion de ses constituants. Dans la présente demande et dans ce qui suit, le terme " placé dans un support" signifie que l'échantillon à analyser peut être placé dans ou sur le support. Par "diffusion" des constituants, l'on entend un déplacement physique desdits constituants. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, le support est un support utilisable comme phase stationnaire pour effectuer une chromatographie. Rappelons que le principe de la chromatographie est la séparation physique des molécules dans un mélange par modification de leur vitesse de diffusion. Le mélange à séparer (appelé phase mobile) est introduit dans un environnement ou il entre en contact avec un solide (phase stationnaire). Les molécules dans le mélange peuvent avoir des interactions plus ou moins fortes avec la phase stationnaire en fonction de leur caractéristiques chimiques et structurales. Les molécules ayant les interactions les plus fortes sont retardées par rapport à celles qui ont de faibles interactions. Une fois séparés, les composants doivent être analysés par une technique de caractérisation structurale, telle que la spectrométrie de masse, la RMN, la spectrométrie UV, etc. Les différentes techniques chromatographiques existantes sont caractérisées par des différentes phases stationnaires, phases mobiles ou arrangement de la région de contact (colonne, couche mince, etc.) Plusieurs choix existent pour la nature des phases stationnaires: polaires, apolaires, ioniques, sélectives en taille, chirales, etc. Les propriétés de diffusion peuvent être aidées par l'application d'un champ électrique. Le mélange peut être analysé en phase gazeuse ou liquide (avec addition d'un éluant). Dans d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, le support utilisable pour effectuer une chromatographie comprend par exemple de la cellulose, de l'alumine, du talc, du carbonate de sodium, de préférence de la silice et est de préférence constitué d'un tel matériau. Il s'agit tout particulièrement d'un gel de silice. La silice peut être une silice non modifiée ou modifiée par une fonction amine, hydroxyle, cyano, alkyle en Cl à C18 avec ou sans réactifs d'appariement d'ions. La technique de résonance magnétique nuclé ire utilisable dans le cadre de l'invention peut être une RMN simple. Dans d'autres conditions préférentielles de mise en òuvre de l'invention, on utilise une méthode RMN de spectroscopie de diffusion. La méthode RMN de spectroscopie de diffus on (DOSY - Diffusion Ordered Spectroscopy) permet de mesurer la diffusion translationnelle de molécules en solution. Basée sur l'analyse de décroissances mono- et multiexponentielles de la hauteur d'un signal RMN, elle permet de séparer les spectres RMN mono dimensionnels des différents comppsants d'un mélange, en fonction de leurs coefficients de diffusion. Ces méthodes reposent sur la mesure du coefficient de diffusion des molécules en solution. L'acquisition et le traitement des données nécessitent un matériel R N et des logiciels spécifiques comme ceux commercialisés par la société BRUKER BIO-SPIN ( FRANCE), sous le nom Spectromètre Avance RMN a ec option HRMAS et gradient de champs puisés, logiciel Xwinnmr. Dans la méthode RMN de spectroscopie d e diffusion, un champ magnétique variable en fonction de l'espace (" gradient ") est appliqué à la sonde de mesure RMN, en juxtaposition au champ magnétique principal de l'analyse RMN, et beaucoup plus faible que ce dernier. La position du signal RMN dépendant de la yaleur totale du champ magnétique, deux molécules situées à endroits différents de l'échantillon analysé ont ainsi des spectres décalés. Le déplacement dans l'espace d'une moléc ule observée est donc suivi par rapport à la vitesse à laquelle elle char ige de fréquence. Le changement de fréquence pendant le temps d'analyse comporte un élargissement du signal observé, avec conséquente d minution de la hauteur maximale du pic même. La décroissance de la hauteur du pic en fonction de l'intensité du gradient de champ magnétique appliqué peut être décrite par une loi mathématique en fonction des paramètres temporel et par un coefficient de diffusion apparent. Le résultat de cette procédure d'analyse est organisé dans un diagramme bidimensionnel 2D avec dans une première dimension en abscisses les spectres RMN du proton, ordonnés par rapport à leur constante de diffusion apparente dans la deuxième dimension. Dans encore d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une méthode RMN de spectroscopie de diffusion de type pour l'analyse d'échantillons en partie de nature solide et en partie de nature liquide de type HRMAS (High-resolution Magic Angle Spinning). Le procédé d'analyse objet de la présente invention possède de très intéressantes qualités. La séparation des spectres des composants d'un mélange est notamment beaucoup plus marquée dans le cas d'un spectre obtenu avec le procédé d'analyse de l'invention, ce qui offre la possibilité de caractériser les constituants du mélange sans séparation préalable. Ces qualités sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des procédés d'analyse ci-dessus décrits, dans l'analyse de mélanges en toxicologie, cosmétologie, pharmacie, dans l'industrie agroalimentaire, l'analyse de mélanges dans des affaires de police scientifique, l'analyse dans la détection des fraudes etc. Les figures 1 et 2 représentent deux résultats d'analyse spectrométrique d'échantillons différents, le spectre de gauche étant obtenu avec un échantillon conventionnel (sans silice dans le porte-échantillons) et celui de droite étant obtenu avec la technique selon l'invention Les exemples qui suivent illustrent la présente demande. Exemple 1: Analyse d'un mélange On a réalisé une solution dans 10 pl de cyclohexane-d6 d'un échantillon à analyser ayant la composition suivante: - 3,5-dichlorophénol 5 mg - N-heptane 5 pl - éthanol 5 pl La sonde de mesure utilisée a été une sonde standard pour les expériences RMN sur les solides, o le porte-échantillons doit pouvoir tourner orienté à environ 55 degrés par rapport au champ magnétique (rotation à l'angle magique - en anglais MAS), du modèle dit "HRMAS" (High Resolution MAS), optimisée par le fabricant pour l'obtention de spectre du proton de qualité pour des matériaux de constitution non homogène, en partie liquide et en partie solide. Un tube porte échantillon cylindrique en oxyde de zirconium pour RMN standard pour Rotation à l'Angle Magique (MAS) de 50 pl de volume disponible et de 4mm de diamètre extérieur a été utilisé. La moitié de 50 mg d'un gel de silice 0,04-0,063mm (230-400 mesh) Macherey-Nagel (Allemagne) a été introduite dans le porte échantillons. 12 pl du mélange à analyser ont alors été introduits dans le porteéchantillons. Le reste des 50 mg de silice ont été ajoutés pour compléter le volume disponible du porte-échantillons. Le porte-échantillons a été fermé à l'aide de son bouchon muni d'ailettes et installé dans un spectromètre commercial Bruker Avance 400 (" narrowbore "), opérant à la fréquence de 400 MHz pour l'observation du proton. Le tube porte-échantillons a été mis en rotation à 4000 tours par seconde. La séparation des spectres RMN du proton des composants du mélange a été obtenue par rapport à leur vitesse de diffusion, dans une expérience de type DOSY (Diffusion-Ordered Spectroscopy) pour faciliter l'analyse du mélange. Un champ magnétique variable dont la séquence d'impulsion est celle dite des gradients bipolaires, fournie avec la librairie du spectromètre (séquence LEDBPGD2S), a été appliqué à la sonde de mesure, en juxtaposition au champ magnétique principal de l'analyse RMN, et donc beaucoup plus faible que ce dernier. La variation de l'intensité du gradient de champ magnétique dans le temps (dimension 1 du diagramme bidimensionnel) a été optimisée pour pouvoir distinguer un ensemble de molécules avec 2 vitesses de diffusion assez différentes comme suit: Les courbes de décroissance des hauteurs des pics sont échantillonnées régulièrement entre leur maximum (intensité de gradient nulle) et une valeur de hauteur négligeable (correspondant à la disparition du pic dans le spectre). Cette procédure est valable pour les pics correspondant à des molécules de différentes mobilités. Le résultat de l'analyse spectrométrique est présenté dans la figure 1 B. On a effectué la même expérience en installant l'échantillon dans le porte échantillons mais sur le mélange ci-dessus, sans addition de gel de silice. Le résultat de l'analyse spectrométrique est présenté dans la figure 1 A. On observe que la présence d'une phase solide augmente la différence dans le coefficient de diffusion apparent jusqu'à 100 fois. Cette amélioration de la séparation des valeurs des ordonnés pour chaque molécule dans le mélange permet d'en lire facilement le spectre RMN correspondant. En fait, pour une ordonnée donnée, ce dernier est représenté dans le diagramme bidimensionnel par la trace parallèle aux axes des abscisses. Ainsi la technique analytique selon l'invention permet d'obtenir des spectres RMN des composants d'un mélange sans séparation préalable. Exemple 2 On a réalisé une analyse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, avec les seules différences suivantes. La solution à analyser a été réalisée en dissolvant: pl de 1-decène, 5 pl d'éthanol et 3 mg de naphtalène dans 100 pl d'éthanol-d6. La phase solide utilisée a été 50mg de silice octadécylée (C18 chromabond Macherey Nagel - Allemagne). Le résultat de l'analyse spectrométrique est présenté dans la figure 2 B. On a effectué la même expérience en installant l'échantillon dans le porte échantillons mais sur le mélange ci-dessus, sans addition de silice octadécylée ci-dessus. Le résultat de l'analyse spectrométrique est présenté dans la figure 2 A. On observe que les 3 composants du mélange ne peuvent pas être distingués dans la figure 2A, obtenue en l'absence de phase solide. Par contre la présence de la silice octadécylée procure une remarquable amélioration (de plusieurs ordres de grandeur) de la séparation des spectres des composants dans la dimension de la diffusion. REVENDICATIONS 1. Un procédé d'analyse caractérisé en ce que l'on soumet à une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire un échantillon à analyser placé dans un support permettant la diffusion de ses constituants. 2. Un procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est un support utilisable comme phase stationnaire pour effectuer une chromatographie. 3. Un procédé d'analyse selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire est une méthode RMN de spectroscopie de diffusion (DOSY - Diffusion Ordered Spectroscopy). 4. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire est une méthode RMN de spectroscopie de diffusion de type pour l'analyse d'échantillons en partie de nature solide et en partie de nature liquide de type HRMAS (High-resolution Magic Angle Spinning). 5. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le support permettant la diffusion des constituants de l'échantillon à analyser comprend de la cellulose, de l'alumine, du talc, du carbonate de sodium, ou de la silice. 6. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le support permettant la diffusion des constituants de l'échantillon à analyser comprend de la silice. 7. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le support permettant la diffusion des constituants de l'échantillon à analyser est un gel de silice 8. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le support permettant la diffusion des constituants de l'échantillon à analyser est une silice non modifiée ou modifiée par une fonction amine, hydroxyle, cyano, alkyle en C1 à C18, avec ou sans réactifs d'appariement d'ions 9. Un procédé d'analyse selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le support permettant la diffusion des constituants de l'échantillon à analyser est une silice modifiée par une fonction amine, hydroxyle, cyano ou alkyle en C1 à C18.