Brevet FR2858569A1 — publié le 20050211

DISPOSITIF DE DIFFUSION D'UN PRODUIT LIQUIDE DANS UNE PHASE SOLIDE ET PROCEDE ASSOCIE La présente invention se rapporte à un dispositif permettant la diffusion, selon un gradient de concentration, d'un produit liquide dans une phase solide 5 comprenant des éléments particulaires dispersés. L'invention concerne également un procédé d'évaluation de l'interaction entre des éléments particulaires dispersés dans une phase solide et un produit liquide capable de diffuser dans ladite phase solide selon un gradient de concentration. Le dispositif de l'invention est particulièrement adapté à l'évaluation de l'activité 10 anti-infectieuse des huiles essentielles. L'utilisation des antibiotiques demeure la méthode de traitement la plus répandue en médecine anti-infectieuse. Cependant, il n'est pas rare d'observer que les antibiotiques classiques n'agissent plus sur certains germes entraînant le passage à une infection chronique. Dans ces cas on peut avoir recours à 15 I'utilisation des huiles essentielles comme agents anti-infectieux. Les huiles essentielles sont définies comme étant un mélange de divers composants chimiques présents dans une matière première d'origine végétale, obtenues par entraînement à la vapeur d'eau ou par expression de la matière première fraîche. Les huiles essentielles ont une efficacité anti-infectieuse communément 20 reconnue en médecine. Elles possèdent plusieurs avantages, notamment de ne pas entraîner, aux posologies recommandées en phytothérapie clinique, ni résistance aux germes, ni sélection de flores résistantes pathogènes, ni altération des systèmes de défense de l'organisme. Le phytothérapeute peut être amené à prescrire l'analyse d'un 25 prélèvement cytobactériologique réalisé au lit du patient avec aromatogramme. L'aromatogramme est une méthode de mesure in vitro du pouvoir inhibiteur des huiles essentielles sur le développement ou la croissance de nombreux agents pathogènes généralement identifiés (bactéries, virus, champignons, protozoaires, parasites) lorsqu'ils sont mis en présence. Trois types d'aromatogrammes sont connus: en milieu solide, en milieu liquide et en milieu gazeux. Une des techniques les plus utilisées, faisant partie des aromatogrammes en milieu solide, est la technique des disques. Elle consiste à disposer dans une boîte de Pétri, plusieurs disques de papier-filtre de diamètre voisin de dix millimètres, imprégnés chacun d'une huile essentielle différente, à la surface d'un milieu nutritif gélosé, préalablement inoculé par la 5 souche microbienne à tester. Après un certain temps de latence à l'étuve à la température appropriée, la croissance des germes in situ se traduit par la formation de colonies dont le développement entre en concurrence avec le gradient de diffusion de l'huile essentielle. Le point critique représente la zone de CMI (concentration minimale inhibitrice). Il est possible de mesurer le 10 diamètre du halo d'inhibition entourant les disques, dont la dimension est une caractéristique de l'interaction germe/huile essentielle. Chaque halo (zone claire) montre la destruction des germes et donne une indication de l'activité antibactérienne des huiles essentielles utilisées. Cette méthode présente l'avantage d'être simple et peu onéreuse. 15 Cependant, les résultats ainsi obtenus sont uniquement qualitatifs, sont peu reproductibles et donnent lieu à des interprétations erronées. Ceci est dû principalement au fait que, les huiles essentielles étant hautement volatiles, une partie de la quantité d'huile essentielle déposée sur chaque disque sera ainsi perdue, cette partie étant variable d'un disque à l'autre. De plus, cette méthode 20 ne permet pas la réalisation de grandes séries de tests car cela nécessiterait un grand nombre de boites de culture; en effet pour une meilleure sensibilité du test on ne peut tester plus de trois huiles essentielles par boîte de Pétri de 90 millimètres (mm) de diamètre: ainsi pour tester 96 huiles essentielles on doit disposer de 32 boites contenant chacune 22 millilitres (ml) de milieu nutritif soit 25 700 ml en tout. Chaque disque de papier filtre imprégné d'huile essentielle doit être déposé manuellement, à la pince et de manière stérile sur la boîte. La présente invention a pour but de proposer un dispositif d'évaluation de l'interaction entre des éléments particulaires dispersés dans une phase solide et un produit liquide capable de diffuser dans ladite phase solide, selon un 30 gradient de concentration, qui permette d'obtenir des résultats reproductibles sur des grandes séries d'échantillons (séries généralement composées de 25 à échantillons). A cet effet, selon le premier de ses aspects, I'invention a pour objet un dispositif de diffusion d'un produit liquide dans une phase solide caractérisé en 5 ce qu'il comporte une cuve et au moins un tube transparent de diamètre intérieur sensiblement constant placé sensiblement verticalement dans ladite cuve, la partie inférieure ouverte du tube étant exhaussée par rapport au fond de la cuve, de sorte que, la phase solide consistant en un milieu de remplissage solidifié contenant des éléments particulaires dispersés, la cuve est remplie 10 dudit milieu de remplissage à l'état liquide, ce qui provoque le remplissage partiel dudit tube par voie ascendante, et le produit liquide est introduit dans le tube après solidification du milieu de remplissage. De manière générale, le milieu de remplissage de la cuve est un milieu qui comprend des éléments particulaires dispersés de façon uniforme dans ledit 15 milieu. Par le terme élément particulaire on entend dans le cadre de la présente invention des éléments unitaires identiques bien définis (microorganismes unicellulaires ou pluricellulaires, eucaryotes ou procaryotes, microorganismes acellulaires (virus), particules solides (par exemple des substances chimiques)). Par le terme dispersé on désigne la propriété d'un 20 élément d'être répandu dans toute la masse dudit milieu. Par dispersés de façon uniforme >> on entend la propriété du milieu de remplissage de contenir sensiblement le même nombre d'éléments particulaires par unité de volume. Dans une variante de réalisation: - le milieu de remplissage est un milieu nutritif approprié pour la culture 25 de germes pathogènes spécifiques: bactéries, virus, champignons, protozoaires, parasites; - l'élément dispersé dans ce milieu de culture est constitué desdits germes pathogènes; - le produit capable de diffuser dans ledit milieu de culture inoculé est un 30 produit à propriétés pharmacodynamiques, en particulier un produit antiinfectieux, et de préférence une huile essentielle. Selon un deuxième aspect, I'invention se rapporte à un procédé d'évaluation de l'interaction entre des éléments particulaires dispersés dans une phase solide et un produit liquide capable de diffuser dans ladite phase solide, selon un gradient de concentration, ledit procédé comportant la diffusion, dans 5 un milieu de remplissage à l'état solide qui emplit partiellement un tube transparent, dudit produit déposé à la surface dudit milieu de remplissage, en créant ainsi un gradient de concentration. Dans un mode de réalisation particulier, I'invention se rapporte à un procédé d'évaluation in vitro des propriétés pharmacodynamiques d'un produit, 10 notamment les propriétés anti-infectieuses d'une huile essentielle. Pour mieux comprendre l'objet de l'invention, on va décrire maintenant, à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs, plusieurs modes de réalisation représentés sur les dessins annexés. Dans ces dessins: - la figure 1 est une vue schématique en coupe transversale d'un dispositif 15 selon l'invention; - la figure 2 est une vue schématique en coupe transversale d'un dispositif selon l'invention présentant un moyen de maintien des tubes dans un mode de réalisation particulier; - la figure 3 est une vue schématique tridimensionnelle d'un dispositif 20 selon l'invention; - la figure 4 est une vue schématique en coupe transversale d'un dispositif selon l'invention, dans un autre mode de réalisation. Dans la figure 1, le dispositif de l'invention 1 comporte une cuve 2 dans laquelle est placé au moins un tube 3 transparent, vide, ouvert aux deux 25 extrémités et de diamètre intérieur sensiblement constant (par exemple une pipette Pasteur dont la partie effilée a été coupée). La partie inférieure 3a du tube 3, plus étroite (en forme conique), est exhaussée par rapport au fond de la cuve. Dans la figure 2 est représenté un moyen permettant le maintien d'un ou 30 plusieurs tubes 3 en position exhaussée par rapport au fond de la cuve 2. Le moyen peut être constitué, dans un mode de réalisation particulier, d'une plaquette 4 rigide transparente sur laquelle chaque tube 3 est fixé en position verticale et sur son côté long, par exemple à l'aide d'une colle. Dans le cadre de la présente invention, le terme > signifie la propriété d'un objet de laisser passer la lumière. La cuve 3 peut contenir une ou plusieurs plaquettes 4. Dans une variante de réalisation du dispositif 1, les tubes 3 peuvent être associés par douze et les plaquettes 4 par huit, de manière à s'adapter à un standard couramment utilisé dans les laboratoires de biologie (les pipettes multicanaux) (figure 3). La figure 4 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 1 de 10 I'invention, dans lequel il est possible d'utiliser des plaques transparentes plus épaisses 5 dans lesquelles on aura pratiqué des puits cylindriques, à l'extrémité resserrée ouverte. Ces plaques 5 peuvent être disposées dans la cuve 2 en série. Lesdites plaques font office de tubes et de moyens de maintien dès lors qu'elles ont été pourvues d'un moyen annexe apte à laisser un espace libre 15 suffisant entre le fond du tube ouvert et le fond de la cuve (moyen non figuré). Comme pour les plaquettes 4, les plaques 5 peuvent s'adapter à l'utilisation d'un dispositif de pipetage semi-automatique ou automatique; dans ce cas, les puits pratiqués sont équidistants. La partie supérieure 3b du tube 3 dépasse en hauteur la cuve 2 lorsque 20 le tube 3 y est placé, de façon à faciliter l'enlèvement du tube 3 et des moyens de maintien 4, 5 associés. Le dispositif 1 de l'invention permet la diffusion d'un produit liquide dans une phase solide contenant des éléments dispersés de façon uniforme, selon un gradient de concentration. Le dispositif 1 comprend au moins un tube 3 25 transparent, de préférence en verre, vide, de diamètre intérieur sensiblement constant et relativement réduit, de préférence inférieur à 1 cm, placé sensiblement verticalement dans une cuve 2. La partie inférieure 3a du tube 3, plus étroite, est exhaussée par rapport au fond de la cuve 2, permettant ainsi le remplissage du tube 3 par voie ascendante, quand un milieu de remplissage 30 liquide est introduit dans la cuve 2. Celle-ci est pourvue de moyens (non représentés) assurant le remplissage uniforme par un liquide. Les tubes 3 peuvent se trouver en position exhaussée par rapport au fond de la cuve 2 grâce aux moyens de maintien 4; dans ce cas, ils sont disposés de façon équidistante et respectant le même écart par rapport au bord inférieur 4a de la plaque 4, en sorte de conduire à un remplissage uniforme des tubes 3 (à la même vitesse et au même niveau) avec le milieu de remplissage. Lorsqu'on verse dans la cuve 2 le milieu de remplissage, les tubes 3 se remplissent, le niveau atteint dans tous les tubes 3 par ledit milieu étant identique et horizontal pour leur ensemble. La viscosité du milieu de remplissage doit être suffisamment faible pour permettre le remplissage 10 uniforme de tous les tubes 3 du dispositif 1 de l'invention, avant la solidification dudit milieu. En pratique, cette condition est assurée par l'emploi d'un milieu de remplissage liquide dont la température reste au dessus du seuil de solidification dudit milieu, pendant toute la durée du remplissage de la cuve 2 et des tubes 3 présents à l'intérieur de celle-ci. Le milieu de remplissage contient un élément dispersé de façon uniforme dans toute la masse dudit milieu. Dans une variante préférée de réalisation, le milieu de remplissage est un milieu nutritif approprié pour la culture de certains germes microbiens, notamment des bactéries (comme, par exemple, le milieu de Mueller-Hinton), I'élément dispersé dans ce milieu de culture étant constitué 20 desdits germes. Afin de rendre la composition de ce milieu de remplissage uniforme, le milieu de culture contenant les germes pathogènes est agité au bain marie, pour une durée déterminée, la concentration en germes pathogènes étant ajustée par dilution à une valeur souhaitée, selon les techniques connues par l'homme du métier. Une fois le milieu de remplissage solidifié, le produit liquide, capable de diffuser dans ledit milieu contenant des éléments dispersés de façon homogène, est déposé sur la surface dudit milieu présent dans chaque tube 3. Sa diffusion dans ledit milieu de remplissage va permettre de créer un gradient de concentration dudit produit dans ledit milieu. Dans une variante de réalisation, le produit liquide apte à diffuser dans le milieu de remplissage est une huile essentielle. Dans ce cas, le dispositif de I'invention convient parfaitement pour la réalisation d'aromatogrammes, mesurant l'activité anti-infectieuse d'une huile essentielle. Le procédé d'évaluation in vitro du pouvoir anti-bactérien d'un produit, notamment d'une huile essentielle, comporte la diffusion dans le milieu de 5 remplissage à l'état solide qui emplit le tube 3 du dispositif 1, d'une huile essentielle déposée à la surface dudit milieu de remplissage, créant ainsi un gradient de concentration. En pratique, on verse le milieu de culture inoculé avec des germes microbiens dispersés de façon uniforme comme décrit plus haut et à l'état 10 liquide, dans la cuve 2. Les tubes 3 se remplissent ainsi par voie ascendante de façon homogène, le niveau atteint dans tous les tubes 3 étant identique et horizontal. Une fois le milieu de remplissage passé à l'état solide, on dépose, à l'aide d'un dispositif de pipetage semi automatique ou automatique, sur la surface du milieu de culture présent dans les tubes 3 et de façon centrée, I'huile 15 essentielle à tester, dans un volume approprié, de préférence voisin de 50 microlitres. Les orifices supérieurs des tubes 3 peuvent être obturés à l'aide d'un film étanche. Les tubes 3 sont ensuite placés dans une étuve à la température appropriée. Une fois l'huile essentielle déposée en surface dudit milieu de culture 20 présent dans les tubes 3, elle va diffuser dans ce milieu, créant ainsi un gradient de concentration. Comme pour la méthode des disques en boîte de Pétri, après un temps de latence à la température appropriée, une zone claire d'inhibition peut être observée le long dudit gradient si l'huile essentielle testée présente un pouvoir inhibiteur sur le germe microbien inoculé dans le milieu de 25 culture. Cette zone d'inhibition correspond à la distance à laquelle la concentration en huile essentielle diffusée dans ledit milieu est égale ou supérieure au seuil nécessaire et suffisant pour inhiber les germes pathogènes présents dans ce milieu. A la fin de la période d'incubation à la température appropriée, les tubes 30 3 sont sortis de la cuve 2 et sont nettoyés, lavés à l'eau et séchés à l'aide d'un papier absorbant. La partie inférieure 3a des tubes 3, étant plus étroite que le reste du tube, empêche le milieu de remplissage de se déplacer dans le tube ou de sortir lors des ces opérations. L'appréciation du pouvoir anti-infectieux d'une huile essentielle testée peut se faire, avantageusement, par transillumination (procédé consistant à 5 examiner un objet par transparence devant une source lumineuse) à l'aide, par exemple, d'un scanner. Ceci est possible, car l'ensemble des tubes 3 et des moyens 4 ou 5 de maintien est transparent. L'acquisition et le traitement des données peuvent se faire par un moyen informatique usuel, ce qui permet d'avoir une haute précision de la mesure de l'activité microbicide, ainsi que le 10 stockage de ces données. Le dispositif de l'invention permet de réaliser un grand nombre de tests en parallèle, de manière très reproductible. Selon le procédé décrit, toute perte d'huile essentielle par évaporation au cours de l'analyse est évitée, car la diffusion de l'huile essentielle se fait dans un tube relativement étroit susceptible d'être obturé par un film étanche, et 15 l'évaporation minime ne modifie pas sensiblement les concentrations relatives des differents composants de l'huile essentielle qui diffusent dans le milieu solide. De ce fait, il devient possible non seulement d'obtenir un résultat qualitatif concernant le pouvoir antiinfectieux d'une huile essentielle donnée vis à vis d'un certain germe pathogène, mais également de quantifier son pouvoir 20 anti-infectieux. En effet, à température constante la vitesse du gradient de diffusion présente une zone de linéarité en fonction du temps. Connaissant la valeur de la constante de diffusion de chaque lot d'huile essentielle dans un milieu nutritif donné, il est possible de déduire la valeur de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI en mg d'huile essentielle par ml de milieu) de celle de 25 la longueur de la zone d'inhibition (en mm). Ceci est important pour le phytothérapeute, qui obtient ainsi des indications précieuses sur les doses d'huile essentielle actives sur un type donné de germes pathogènes. Le dispositif de l'invention permet la réalisation de grandes séries de tests, avec une économie importante de milieu de culture par rapport aux 30 techniques connues. Ainsi, pour réaliser 96 tests en utilisant le dispositif décrit, il est possible de consommer uniquement 300 ml de milieu nutritif, alors que 700 ml de milieu sont nécessaires pour tester le même nombre d'échantillons par la technique des disques. Ceci s'explique par le volume réduit de milieu de remplissage qui emplit les tubes 3, leur diamètre intérieur étant de préférence inférieur à i cm. De même, le mode de dépôt des échantillons d'huiles essentielles dans les tubes, à l'aide d'une pipette multi-canaux, autorise la réalisation de plusieurs séries de cuves de 96 tests en parallèle, rapidement (en quelques minutes) et facilement. Le dispositif et le procédé de la présente invention trouvent des 10 nombreuses applications dans la recherche et l'industrie: - en chimie: étude de l'interaction entre des éléments particulaires dispersés dans un milieu solide avec un produit liquide capable de diffuser dans ledit milieu selon un gradient de concentration; - en biologie: étude de la biochimie de cellules immobilisées dans un gel, 15 sous l'influence d'un gradient d'un produit, notamment pharmaceutique; - en médecine: possibilité de tester des produits: o antiparasitaires (si le parasite est de petite taille ou monocellulaire: larves et oeufs d'helminthes; protozoaires); o antiviraux (sur des cellules inoculées par des virus puis dispersées 20 dans un gel); o antibactériens ou antifongiques, comme mentionné plus haut. - en entomologie appliquée: recherche de produits larvicides; - en agronomie: étude des effets inhibiteurs de certaines substances sur des agents pathogènes végétaux. Le dispositif 1 présente l'avantage d'être simple, peu coûteux, recyclable et réutilisable. Ainsi, il peut être construit en verre et/ou matériaux plastiques compatibles avec les produits utilisés, les collages étant effectués à l'aide de colle silicone. Dans ces conditions, le dispositif de l'invention est autoclavable et sonicable (se nettoie facilement dans un bain d'ultrasons); il est résistant aux 30 acides, aux bases et aux détergents. REVENDICATIONS 1. Dispositif de diffusion d'un produit liquide dans une phase solide caractérisé en ce qu'il comporte une cuve (2) et au moins un tube (3) transparent de diamètre intérieur sensiblement constant placé 5 sensiblement verticalement dans la cuve (2), la partie inférieure (3a) ouverte du tube (3) étant exhaussée par rapport au fond de la cuve (2), de sorte que, la phase solide consistant en un milieu de remplissage solidifié comprenant des éléments particulaires dispersés, la cuve (2) est remplie dudit milieu de remplissage à l'état liquide, ce qui provoque le 10 remplissage partiel dudit tube (3) par voie ascendante, et le produit liquide est introduit dans le tube (3) après solidification du milieu de remplissage. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de maintien de chaque tube (3) en position exhaussée par 15 rapport au fond de la cuve (2). 3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits moyens de maintien comportent au moins une plaquette (4) rigide transparente sur laquelle chaque tube (3) est fixé en position verticale et sur son côté long. 4. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une plaque (5) transparente rigide dans laquelle des puits cylindriques ont été pratiqués à l'extrémité resserrée ouverte, ladite plaque faisant office de tubes et de moyens de maintien. 5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque tube (3) 25 présente un diamètre intérieur relativement réduit, de préférence inférieur à 1 cm. 6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie inférieure (3a) de chaque tube (3) est de forme conique et plus étroite que le reste du tube (3), de sorte que le milieu de remplissage solidifié 30 présent à l'intérieur dudit tube ne se déplace pas lors de l'enlèvement dudit tube (3) et des moyens de maintien (4,5) de la cuve (2) . 7. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de remplissage est un milieu nutritif approprié pour la culture de germes microbiens, inoculé avec lesdits germes microbiens de façon uniforme. 8. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une 5 pluralité de tubes (3) équidistants et en ce que le produit liquide est déposé en surface du milieu de remplissage dans les tubes (3) à l'aide d'un dispositif de pipetage semi automatique ou automatique. 9. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 8, caractérisé en ce que le produit liquide diffusé dans le milieu de remplissage est une substance à 10 propriétés pharmacodynamiques. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le produit liquide diffusé dans le milieu de remplissage est une substance à propriétés anti-infectieuses. 11. Dispositif selon l'une des revendications 9 à 10, caractérisé en ce que le 15 produit liquide diffusé dans le milieu de remplissage est une huile essentielle. 12. Utilisation d'un dispositif de diffusion d'un produit liquide dans une phase solide selon les revendications 1 à 11 pour l'évaluation de l'interaction entre des éléments particulaires dispersés dans ladite phase 20 solide et ledit produit liquide capable de diffuser dans ladite phase solide selon un gradient de concentration. 13. Utilisation selon la revendication 12 pour l'évaluation in vitro des propriétés pharmacodynamiques d'un produit liquide diffusé dans le milieu de remplissage, vis à vis des éléments particulaires dispersés dans 25 ledit milieu. 14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, dans lequel les éléments particulaires dispersés dans le milieu de remplissage comprennent: des microorganismes procaryotes ou eucaryotes, unicellulaires ou pluricellulaires, ou microorganismes acellulaires. 15. Procédé d'évaluation de l'interaction entre des germes pathogènes dispersés dans une phase solide et une huile essentielle capable de diffuser dans ladite phase solide, au moyen d'un dispositif selon les revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de dépôt de ladite huile essentielle à la surface du milieu de remplissage qui emplit partiellement le tube (3), de manière à entraîner 5 la diffusion de ladite huile essentielle dans ledit milieu de remplissage et la création d'un gradient de concentration de ladite huile essentielle dans ledit milieu de remplissage, et - une étape d'évaluation du pouvoir anti-infectieux de ladite huile essentielle vis à vis desdits germes pathogènes, consistant à mesurer la 10 zone d'inhibition desdits germes pathogènes le long dudit gradient de concentration de l'huile essentielle. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'évaluation du pouvoir anti-infectieux d'une huile essentielle sur un germe pathogène présent dans le milieu de remplissage se fait par transillumination. 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel l'acquisition et le traitement des données se font à l'aide d'un moyen informatique usuel.