Brevet FR2859218A1 — publié le 20050304

MICROVESICULES DE MEMBRANE EXTERNE MARQUEES, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet des microvésicules de membrane externe marquées, leur procédé de production et leurs utilisations. Les microvésicules membranaires sont des protrusions de la membrane externe de bactéries à Gram négatif, qui se détachent de la cellule pour s'échapper dans le milieu. Ces microvésicules sont des compartiments de forme sphérique. L'invention s'intéresse particulièrement aux microvésicules de taille inférieure à environ 250 nm. Certains micro-organismes produisent naturellement ces microvésicules, sans qu'il soit nécessaire d'apporter une quelconque stimulation. Ces microvésicules sont longtemps passées inaperçues, du fait qu'elles sont de très faible taille et que les techniques d'analyse ne permettaient pas de les identifier. Aujourd'hui encore, les techniques d'analyse à mettre en #uvre pour identifier ces microvésicules, en particulier la microscopie électronique utilisant ou non les techniques d'immunomarquages sont lourdes et coûteuses. Les microvésicules de membrane externe sont connues de l'art antérieur, et citées notamment par Beveridge, Journal of Bacteriology, Aug 1999, Vol. 181, N 16 pp. 4725-4733, ou encore par Bernadac et al. Journal of Bacteriology . Sep 1998 Vol. 180, N 18 pp. 4872-4878. Les microvésicules de membrane externe sont notamment utilisées pour élaborer des vaccins. EP 1248647 décrit un vaccin à partir de microvésicules de membrane externe contre les maladies causées par la Neisseria meningitidis Serogroup B. W097/05899 décrit un vaccin utilisant des microvésicules de membrane externe comme vecteur d'un antigène associé à la surface de la microvésicule. W097/05899 décrit également une composition pharmaceutique comprenant des vésicules membranaires d'un ou plusieurs microorganismes comprenant des enzymes et ayant des effets bactéricides. Les microvésicules utilisées dans cette demande de brevet sont soit des microvésicules naturelles, de tailles comprises entre 10-200 nm, soit des vésicules de nature différentes et de plus grande taille, comprenant de la membrane externe, de la membrane cytoplasmique ou plasmatique et du cytoplasme. L'utilisation de ces vésicules de taille plus importante est dictée par les difficultés de visualisation et de suivi des microvésicules naturelles, mais elle présente de nombreux inconvénients : en premier lieu, il est difficile d'assurer que ces vésicules sont homogènes et toutes de même nature ; par ailleurs, certaines vésicules contiennent du cytoplasme, et donc, statistiquement, certaines au moins d'entre elles contiennent de l'ADN cytoplasmique. L'utilisation de ce type de vésicules présente donc un risque de transmission d'ADN non souhaitée et difficilement contrôlable. La présente invention remédie aux inconvénients cidessus et propose des microvésicules de membrane externe qui sont marquées, ce qui permet de les visualiser rapidement et à moindre coût, par exemple avec l'analyse directe d'une culture bactérienne par microscopie de fluorescence, en évitant d'avoir recours aux techniques nettement plus lourdes et onéreuses de microscopie électronique ou de purification, et qui peuvent être produites massivement. Les microvésicules selon l'invention sont formées d'une seule membrane, la membrane externe. A ce jour, toutes les expériences réalisées par les inventeurs sur Escherichia coli montrent qu'aucun matériel cytoplasmique ne se retrouve dans les microvésicules selon l'invention. Les microvésicules selon l'invention ne contiennent donc que du matériel intermembranaire, en particulier périplasmique pour les bactéries à gram négatif. Les microvésicules de l'invention présentent de ce fait l'avantage d'être homogènes entre elles, et d' assurer la non-transmission de matériel génétique d'origine cytoplasmique. Par ailleurs, les microvésicules selon l'invention contiennent un seul compartiment contenant des protéines dans un état oxydé, donc plus aptes à l'utilisation. L'invention a donc pour objet de proposer des microvésicules détectables, alors même que leur taille est très faible. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une ou des microvésicules de membrane externe, de diamètre inférieur à 250 nanomètres, formée avec une seule membrane, et comprenant un marqueur ou une signature détectable, notamment par fluorescence, par des techniques type RPE ou par mesure de radioactivité, qui se trouve soit au niveau intravésiculaire, soit au niveau de la membrane. Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, cette signature est une protéine intravésiculaire détectable, de préférence fluorescente. De nombreuses protéines fluorescentes sont appropriées. A titre d'exemple, on peut citer la Green Fluorescent Protein. Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, cette signature intravésiculaire est une protéine qui fixe un cofacteur détectable. De nombreux cofacteurs sont susceptibles d'être fixés par les protéines adéquates. Parmi les cofacteurs convenables, on cite notamment les cofacteurs détectables par RPE. A titre d'exemple, on peut citer comme protéine liée à un cofacteur détectable les protéines du système d'oxydo-réduction et pour Escherichia coli, la triméthylamine N-oxide reductase (TorA). D'autres protéines à cofacteurs d'origine bactérienne périplasmiques comme les hydrogénases à centre Nickel-Fer ou des protéines recombinantes peuvent être aussi envisagées. Dans le cas de protéines membranaires réceptrices de fer sous forme ferrique couplé à un sidérophore, ces protéines issues de genre bactériens variés peuvent être surproduites et retrouvées dans les microvésicules purifiées. Ainsi on pourra procéder à un marquage membranaire via le complexe fer (ferrique)-sidérophore. Cette signature peut encore être issue d'un radiomarquage in vivo ou in vitro, mettant en #uvre les techniques de marquage radioactif connues de l'homme du métier ; la signature peut aussi consister en un marquage fluorescent in vitro, c'est-à-dire un marquage par couplage chimique de sondes fluorescentes commerciales sur des molécules présentes à la surface ou dans les microvésicules. Comme sondes on peut citer le Texas Red-X succinimidyl ester (Molecular Probes) ou l'Oregon Green 488 carboxylic acid succinimidyl ester (Molecular Probes) qui sont des sondes fluorescentes pouvant réagir et se coupler avec les fonctions réactives des molécules comme la fonction amine présente entre autres dans les protéines. Cette signature peut aussi être un anticorps couplé à un réactif fluorescent. Cet anticorps pourra reconnaître une protéine ou molécule exposée à la surface de la bactérie (voir l'utilisation d'un anticorps anti-Lamb : Lloubes et al. Research Microbiology Jul-Aug 2001 Vol. 152 N 6 pp. 523-529) Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, il est envisagé de combiner plusieurs signatures ou marquages, notamment de prévoir de marquer les microvésicules à la fois au niveau intravésiculaire et au niveau de la membrane. Les microvésicules selon l'invention présentent de nombreux avantages, et peuvent notamment être utilisées comme outils de ciblage. Suivant un mode de réalisation avantageux de l'invention, les microvésicules de l'invention sont associées à des molécules d'intérêt, destinées au ciblage ou à la thérapie, du type comprenant les saccharides et en particulier les oligosaccharides, les protéines et en particulier les enzymes, mais aussi les antibiotiques. Parmi les molécules d'intérêt, l'invention s'intéresse en particulier à associer aux microvésicules marquées des molécules d'adressages, des protéines pouvant être cibles de récepteurs cellulaires notamment des toxines, des récepteurs spécifiques notamment du type de celui permettant l'entrée de l'ADN décrit par Lambert et al. Molecular Microbiology Nov 1998 Vol 30 N 4 pp.761-765, ou des anticorps notamment de type scFv exposés à la surface de la membrane externe. Ces protéines d'intérêt seraient présentes sur la cellule bactérienne utilisée pour le procédé selon l'invention. La préparation d'une telle bactérie est réalisable conformément aux procédés décrits dans Francisco et al. (Production and fluorescenceactivated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. ) Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Nov 15;90(22):10444-10448. Francisco et Georgiou (The expression of recombinant proteins on the external surface of Escherichia coli.) Biotechnological applications. Ann N Y Acad Sci. 1994 Nov 30;745:372-382. Earhart (Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surface display.) Methods Enzymol. 2000;326:506-516. Suivant un autre mode de réalisation, qui peut être combiné avec le précédent, les microvésicules de l'invention sont combinées à au moins un déterminant exposé à la surface de la microvésicule, par exemple le lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface des bactéries et aussi des microvésicules, et qui joue un rôle dans la réponse inflammatoire (Chen et al., J Cell Biochem. Aug 2003 Vol. 89, N .6 pp 1206-1214) ; l'enterotoxine issue des bactéries Escherichia coli pathogènes, qui est aussi retrouvée à la surface des microvésicules (Horstman et Khuehn J Biol Chem. Sep 2002 Vol. 277 N 36 pp. 32538-32545) ; la cytotoxine VacA d' Hélicobacter pylori, qui est aussi retrouvée active dans les microvésicules formées par cet organisme (Keenan et Allardyce, Dec 2000, Eur J Gastroenterol Hepatol. Vol. 12 N 12 pp. 1267-1273). Suivant une variante avantageuse de l'invention, la microvésicule marquée ou non contient un fragment d'acide nucléique, qui a été introduit in vitro, et peut ainsi servir de transport à une information génétique destinée à une cible particulière. Dans ce cas, on purifie des microvésicules contenant la protéine membranaire FhuA (surproduite à partir d'un plasmide). Cette protéine permettra l'entrée de l'ADN du phage T5 (Lambert et al. Molecular Microbiology Nov 1998 Vol 30 N 4 pp.761-765). Ainsi des gènes d'intérêt pourront être clonés dans l'ADN de ce phage. Cette variante est particulièrement destinée aux situations où les microvésicules selon l'invention sont utilisées en thérapie génique. L'invention a également pour objet un procédé de production de microvésicules marquées caractérisé en ce que : (a) on introduit ou l'on produit ou l'on repère une signature détectable, dans une cellule d'origine bactérienne sauvage ou mutée, productrice de microvésicules, (b) on cultive ladite bactérie en milieu solide ou en milieu liquide. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, la cellule est une souche bactérienne sélectionnée parmi les mutants tol, pal ou lpp ou parmi les genres bactériens qui produisent des microvésicules. Sont adaptées pour la réalisation du procédé selon l'invention les bactéries pathogènes présentant ces caractéristiques, du type, mais non exclusivement, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori... Dans le cas où la signature est protéique ou associée à une protéine, la cellule et en particulier la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention doit posséder un système d'exportation ou avoir la capacité naturelle d'exporter la signature présente dans le cytoplasme, vers la membrane externe ou vers le périplasme. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie utilisée pour la production des microvésicules selon l'invention possède un système Tol-Pal nonfonctionnel ; avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi les mutants tol, pal ou 1pp ou parmi les genres bactériens producteurs de microvésicules. Dans le cas où cette signature est une protéine repliée, notamment une protéine fluorescente ou liée à un cofacteur détectable, la cellule et en particulier la bactérie doit posséder un système d'exportation de protéines repliées ou permettre naturellement une telle exportation. Avantageusement, la bactérie utilisée dans le procédé selon l'invention possède le système TAT (Tween Arginine Translocation) d'exportation. Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, l'on introduit dans une cellule d'origine bactérienne un plasmide qui permet la production d'une signature détectable. Avantageusement, ce plasmide comprend un gène codant pour une protéine marquée, par exemple une protéine fluorescente. Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, l'on marque, notamment en utilisant des radiomarquages in vitro ou des marquages avec des sondes fluorescentes, ou l'on détecte sans marquage préalable, les composants naturels de la membrane externe ou du contenu intravésiculaire, sans qu'il soit nécessaire d'introduire un plasmide. Ce composant naturel peut être un cofacteur fixé par une protéine. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, on effectue préalablement à la culture cellulaire, une étape destinée à induire une production plus massive de microvésicules. Cette étape consiste par exemple à déstabiliser l'intégrité de la membrane externe, notamment par la production périplasmique de séquences protéiques déstabilisatrices. Ces séquences peuvent être des protéines chimères, de type protéine autofluorescenteprotéine déstabilisatrice de l'intégrité de la membrane externe ou des protéines co-produites avec la protéine détectable dans la même bactérie. De telles séquences déstabilisatrices de l'intégrité membranaire permettant la production de microvésicules ont été décrites par Bouveret et al. Biochimie. May-Jun 2002 Vol. 84 N 5-6 pp.413-421. Suivant un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend une étape de purification qui intervient après l'étape de culture cellulaire. Cette étape de purification consiste en premier lieu à éliminer toutes les bactéries, de manière à récupérer les microvésicules. En second lieu, une étape permet notamment de concentrer les microvésicules mais aussi de les suspendre dans un tampon de choix. Selon l'invention, on est aussi capable de fournir une production uniforme de microvésicules ayant un diamètre d'environ 40 nm. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de mesure quantitative ou qualitative du marquage des microvésicules, et en particulier quand la signature est une protéine fluorescente, une étape de mesure de la fluorescence des microvésicules marquées. Cette mesure permet de vérifier la production, et de la quantifier. Un autre objet de l'invention est d'utiliser les microvésicules en suivant et en quantifiant in vivo leur production. Ce suivi permet d'étudier le devenir des vésicules in vivo, en particulier leur devenir au contact d'autres bactéries ou cellules. Pour cette application, les microvésicules portant des déterminants naturels ou artificiels exposés seront de grande importance pour le ciblage. Les microvésicules selon l'invention sont utiles comme outil de ciblage de molécules d'intérêt thérapeutique ou de diagnostic, en particulier pour mesurer l'impact d'un principe actif ou d'une molécule active. L'invention a également pour objet l'utilisation des microvésicules marquées selon l'invention, en particulier de microvésicules contenant un fragment d'acide nucléique, comme outil de vectorisation. Une autre utilisation selon l'invention comprend l'utilisation des microvésicules marquées pour l'identification d'un agent actif, principe actif ou molécule active sur une bactérie, caractérisé en ce que l'on stimule la production de microvésicules de ladite bactérie, notamment par un agent de stimulation, et on identifie ledit agent par visualisation des microvésicules marquées. La simplicité de la détection et l'efficacité de la technique développée par la présente invention permet l'analyse par les techniques de criblage à haut débit où, sur des plaques multipuits. Ainsi, des cultures bactériennes seraient traitées par chacun des composés issus de chimiothèques. Les surnageants obtenus après centrifugation des cultures seraient analysés par microscopie de fluorescence automatisés. La présence de points fluorescents et la quantité de ces points étant liés à l'activité du composé testé. L'invention sera plus explicite au vu des exemples qui suivent, qui illustrent non limitativement l'invention. Exemple Unique Deux conditions de culture ont été utilisées: Conditions de production en milieu liquide. Les cellules tolA (Bernadac et al., 1998, J Bacteriol. 180, 4872-4878) transformées par le plasmide RR-GFP (Santini et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276,8159-8164) sont cultivées en milieu riche (Luria-Bertani ou LB) en anaérobiose et en présence de glucose (0,4 %). Après 4 heures d'incubation à 37 C, la culture est centrifugée et le surnageant est enlevé. Les cellules sont ensuite lavées en milieu minimum puis reprises dans le même milieu minimum (milieu M9 contenant du saccharose comme source de carbone, supplémenté avec les 20 acides aminés) contenant 0,2 % de L-arabinose pour permettre l'induction de l'expression de la GFP pendant une incubation de 2 heures à 30 C. Conditions de production en milieu solide. Les cellules tolA transformées par le plasmide RR-GFP ont été cultivées sur support solide en milieu LB-agar en présence de glucose 0,4 % (conditions de répression de la GFP) puis ensemensées sur milieu LB-agar contenant de l'arabinose (0,1 %, conditions d'induction de la GFP) et incubées une nuit (environ 16 heures) à 30 C. Les cellules récoltées du milieu solide (grattage de colonies sur boîte de Pétri et suspension en tampon TN: Tris-HCl pH8. 0, NaCl 100mM) ou du milieu liquide sont centrifugées à basse vitesse pour faire sédimenter les bactéries. Le surnageant contenant les vésicules de membrane externe est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions, puis filtré 2 fois sur filtre de 0,2 mm pour éviter tout risque de contamination par des bactéries ou des débris membranaires. Deux conditions de purification de vésicules sont utilisées : Soit les vésicules contenues dans les surnageants sont directement sédimentées par ultracentrifugation (45 min à 250 000 g moyen). Après lavage rapide du culot en tampon TN (et nouvelle ultracentrifugation) celui-ci est resuspendu dans le tampon TN (VesC). Soit le surnageant est déposé à la surface d'un gradient formé de trois couches de densité : 1,08,3ml (15 %), 1,16, 2 ml (30 %) et 1,24, 1 ml (45 %) (%OptiprepTM) . Après ultracentrifugation 1 heure à 30 000 rpm (SW41Ti) les fractions de 2 ml du gradient sont récupérées (VesG). Nous avons choisi de mesurer la quantité de GFP par dosage spectrofluorimétrique et de suivre l'activité blactamase par dosage enzymatique (utilisant un substrat chromogène de cephalosporine, CENTATM). Tous les résultats ont été exprimés en unité arbitraire utilisant pour référence (100) les mesures effectuées sur le contenu périplasmique des cellules productrices (obtenu après choc osmotique). L'analyse du contenu intravésiculaire est réalisée sur le culot de vésicules remis en suspension (VesC) ainsi que sur les microvésicules obtenues dans la fraction de densité 1,24 (VesG) . Afin de doser l'activité b-lactamase à l'intérieur de microvésicules membranaires et d'éviter de suivre la diffusion du substrat à travers la membrane, nous avons recherché la concentration minimale en détergent nécessaire pour solubiliser la membrane externe des microvésicules (tests réalisés par microscopie optique avec des vésicules fluorescentes). Ainsi le détergent Triton X100 a été ajouté à 0,02% dans toutes les expériences de dosage enzymatique. D'autre part nous avons mesuré l'effet des concentrations d'optiprepTM sur l'activité de la blactamase et tenu compte d'une faible inhibition dans l'expression de nos résultats quand celui-ci était présent : ces mesures sont reportées dans le tableau I cidessous, dans lequel les valeurs sont ramenées a la valeur 100 qui correspond au dosage du contenu périplasmique des bactéries. VesC et VesG correspondent respectivement aux microvésicules purifiées par ultracentrifugation et par gradient de sédimentation respectivement. b-lactamase GFP Milieu Liquide VesC 0,2 0,5 VesG 0,8 2,8 Milieu solide VesC 3,1 5,4 VesG 1,5 2,3 Tableau I . dosage de la b-lactamase par mesure enzymatique et dosage de la GFP par mesure de fluorescence. Le marquage fluorescent selon l'invention est donc particulièrement efficace. Les inventeurs ont même constaté que, de manière inattendue, le marquage obtenu en mettant en #uvre le procédé de l'invention avec une protéine fluorescente, est plus fort que celui d'une protéine périplasmique naturelle. Ainsi les microvésicules sont directement et facilement détectables par microscopie optique de fluorescence. Leur observation directe serait impossible en absence de fluorescence de par la petite taille des microvésicules. De plus, cette détection confirme la présence de microvésicules étanches qui renferment de la GFP dans un état concentré. REVENDICATIONS 1) Microvésicule de membrane externe de bactéries caractérisée en ce que son diamètre est inférieur à 250 nanomètres, qu'elle est formée par une seule membrane, et qu'elle comprend une signature détectable. 2) Microvésicule selon la revendication 1, caractérisée en ce que les bactéries sont des bactéries à Gram-négatif, 3) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la signature détectable se trouve soit au niveau intravésiculaire, soit au niveau de la membrane. 4) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite signature est détactable par fluorescence, par des techniques type RPE ou par mesure de radioactivité. 5) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle ne contient que du matériel intermembranaire, notamment périplasmique. 6) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite signature est une protéine intravésiculaire détectable, de préférence fluorescente. 7) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 6, caractérisée en ce que ladite signature est une protéine détectable, notamment par RPE, du type protéine intravésiculaire qui fixe un cofacteur ou protéine membranaire réceptrice de fer sous forme ferrique couplé à un sidérophore. 8) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite signature est issue d'un radiomarquage in vivo ou in vitro. 9) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit marqueur est une sonde fluorescente. 10) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite microvésicule est associée à au moins une molécule d'intérêt, du type comprenant les oligosaccharides, les protéines et notamment les enzymes, les antibiotiques. 11) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite microvésicule est combinée à au moins un déterminant exposé à la surface de la microvésicule. 12) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite microvésicule est associée à au moins un déterminant d'adressage. 13) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle contient un fragment d'acide nucléique introduit in vitro. 14) Procédé de production de microvésicules marquées caractérisé en ce que : (a) on introduit ou l'on produit ou l'on repère une signature détectable, dans une cellule d'origine bactérienne sauvage ou mutée, productrice de microvésicules, (b) on cultive ladite bactérie en milieu solide ou en milieu liquide. 15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que lorsque la signature est une protéine intravésiculaire détectable ou une protéine qui fixe un cofacteur détectable, ladite cellule possède un système d'exportation de protéines repliées. 16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que ladite bactérie est sélectionnée parmi les mutants tol, pal ou Ipp. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule d'origine bactérienne un plasmide qui permet la production d'une signature détectable. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit plasmide contient un gène codant pour une protéine fluorescente. 19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'on marque, notamment par radiomarquage, ou l'on détecte sans marquage préalable les composants naturels de la membrane externe ou du contenu intravésiculaire, sans qu'il soit nécessaire d'introduire un plasmide, notamment en utilisant des radiomarquages in vitro ou des marquages avec des sondes fluorescentes. 20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit composant naturel est un cofacteur fixé par une protéine. 21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape préalable d'exportation de séquences protéiques induisant la déstabilisation de l'intégrité membranaire et la production de microvésicules de membrane externe. 22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites séquences protéiques déstabilisatrices pourront être des protéines chimères, de type protéine autofluorescente-protéine déstabilisatrice de l'intégrité de la membrane externe ou des protéines co-produites avec la protéine détectable dans la même bactérie. 23) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 22, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape de purification des microvésicules. 24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 23, caractérisé en ce que l'on purifie des microvésicules contenant la protéine membranaire FhuA puis l'on introduit in vitro dans la microvésicule, marquée ou non, un fragment d'acide nucléique. 25) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de mesure quantitative et/ou qualitative du marquage des microvésicules. 26) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite signature est une protéine fluorescente, et que ledit procédé comprend une étape de mesure de la fluorescence des microvésicules marquées. 27) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans la préparation d'une composition pour la détection in vivo desdites vésicules, et notamment pour le suivi de leur devenir au contact d'autres bactéries ou cellules. 28) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, en particulier de microvésicules contenant un fragment d'acide nucléique, dans la préparation d'une composition pour la vectorisation. 29) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans la préparation d'une composition pour le ciblage de molécules d'intérêt thérapeutique ou de diagnostic. 30) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en vue de mesurer l'impact d'un principe actif ou d'une molécule active, notamment du type enzyme ou détergent, sur l'intégrité de la membrane de la microvésicule. 31) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour l'identification d'un agent actif sur une bactérie, caractérisé en ce que l'on stimule la production de microvésicules de ladite bactérie, notamment par un agent de stimulation, et on identifie ledit agent par visualisation des microvésicules marquées.