Brevet FR2849205A1 — publié le 20040625

PROCEDE D'AMPLIFICATION DE LA DETECTION DE LA PRPSC ET UTILISATION D'UN LIGAND ADJUVANT MACROCYCLIQUE POUR UNE TELLE AMPLIFICATION. La présente invention concerne un procédé d'amplification de la détection des formes du prion pathogènes responsables des encéphalopathies spongiformes subaiguÙs transmissibles. La protéine prion native ou normale, désignée Pr P ou Pr Pc pour la protéine prion cellulaire, est une glycoprotéine largement exprimée dans les cellules lymphoides et neuronales des mammifères. Des changements conformationnels de Pr Pc conduisent à l'apparition et à la propagation de la protéine pathogène Pr Psc qui est résistante à la protéinase K L'accumulation de Pr Psc dans les organes des animaux est à l'origine de nombreuses maladies et notamment de la tremblante des petit 20 ruminants, de la maladie cachectisante chronique (ou chronic wasting disease 'CWD') de l'élan et de l'antilope, de l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et de la maladie de Creutzfeldt-Jacob chez l'homme. L'apparition tardive après une période d'incubation de 2 à 6 ans et le lent développement des symptômes chez le bétail infecté par 1 'ESB a considérablement ralenti le développement de modèles épidémiologiques L'ESB est transmissible par ingestion à l'homme et a conduit à 30 l'apparition d'une nouvelle forme de la maladie de Creutzfeldt-Jacob (v CJD). La détection de la protéine pathogène Pr Psc est difficile chez les animaux infectés sains avant le développement de la maladie et surtout dans le sang et l'urine chez les animaux malades Il est à présent établi que la Pr Psc présente chez les animaux destinés à l'alimentation humaine se transmet à l'homme lors de 5 l'ingestion des tissus infectés Un objectif majeur de santé publique est donc d'éviter cette transmission en détectant le Pr Psc chez des animaux destinés à la consommation humaine en vue de les retirer de la chaîne alimentaire. La détection de la présence de Pr P Sc dans des échantillons biologiques ou chez des animaux devient donc d'une extrême importance et plusieurs équipes de chercheurs développent des méthodes de détections immunologiques 15 (WO 02/086511) Par ailleurs, des méthodes pour complexer à la Pr Psc des peptides, des petites molécules ou des inhibiteurs en vue du traitement de v CJD font l'objet de recherches actives Toutefois, les méthodes en l'état de la technique se heurtent sans arrêt à la difficulté 20 d'identifier la Pr Psode manière fiable lorsqu'elle est en faible quantité dans un échantillon biologique. La présente invention a donc pour objet un procédé permettant de détecter la protéine Pr Psc à des dilutions o 25 elle n'est pas détectable avec les méthodes utilisées actuellement, cette détection étant d'une fiabilité de 100 % sur les 119 échantillons testés par les inventeurs. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet d'amplifier d'un facteur 4 la détection de la Pr Psc. 30 Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr Psc caractérisé en ce que l'on ajoute dans un échantillon biologique susceptible de contenir de la Pr Psc un ligand adjuvant macrocyclique (AML), puis l'on traite la suspension obtenue par la protéinase K, et on fait réagir avec un anticorps anti-Pr Psc. Selon un mode de réalisation préféré de 5 l'invention, l'échantillon biologique provient d'un animal, y compris l'homme De préférence, cet échantillon provient du cerveau, des tissus du système nerveux central, ou des organes, et notamment la rate ou l'intestin. Avantageusement, le ligand adjuvant macrocyclique 10 est capable de se lier à des sites contigus, ou proches dans l'espace, de sites de liaison avec un anticorps et a pour action d'augmenter la liaison anticorps-Pr Psc Avantageusement, le ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la famille des métacyclophanes Parmi les 15 métacyclophanes les parasulfoanto-calix-arènes fonctionnalisés sur la face phénolique sont particulièrement avantageux Ces composés peuvent être obtenus suivant la méthodologie décrite dans Da Silva et al., J Supramol Chem 1, ( 2001), 135-138. 20 Avantageusement, le ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (I) ci-dessous, R 1 R 3 4 R 5 H (I) dans laquelle Rl représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe OR ou un groupe OCOR, R étant tel que défini ci-dessous, R 2 représente un atome d'hydrogène, un groupe R, 5 COR, CH 2 Pol, X, CH 2 X dans lesquels Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium, acide carboxylique et R et X sont tels que définis ci-dessous, R 3 représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe OR ou un groupe OCOR dans lesquels R 10 est tel que défini ci-dessous, R 4 représente un atome d'hydrogène, un groupe OR, un groupe OCH 2 R ou un groupe OCOR, dans lesquels R est tel que défini ci-dessous, Y est un groupement C 14 alkyle, un groupement 15 amine, un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupement alkyloxy, alkylamine ou alkylthio, R 5 représente X ou R tels que définis ci-dessous, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, m représente un entier égal à O ou 1, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, N est un entier compris entre 3 et 15, les substituants R 1 à R 5, R, X, Y et l'entier m peuvent être de nature différente suivant les motifs. Ainsi, le composé de formule (I) se présente sous forme d'une succession de N motifs caractérisés par la présence 30 d'un cycle benzénique, et les substituants de ce cycle peuvent être variables d'un motif à l'autre, dans la limite de leurs définitions ci-dessus. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (I) ci-dessus, et plus précisément à la formule générale (Ia) ci-dessous > 03 q (Ia) dans laquelle R 6 est un groupement (CH 2)r-Z dans lequel r est un entier compris entre 1 et 4, Z est un groupement COO Et, COOH, CN ou NH 2, p est un entier compris entre 1 et 10, q est un entier compris entre 1 et 10. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, le ligand adjuvant macrocyclique est le psulphonato-calix-l 4 l-arène, le p-sulphonato-calixl 6 l20 arène, le p-sulphonato-calix-l 8 l-arène, ou l'un de leurs dérivés. Selon un second mode de réalisation de l'invention, ledit ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la 25 famille des cyclodextrines et en particulier des cyclodextrines répondant à la formule générale (II) R *+ O O R 2 R 3 (I) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH, 10 OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, X, CH 2 X, OCH 2 R, SR, NR, X, Pol et R étant ci-dessous définis, R 2 et R 3, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, X, CH 2 X, OCH 2 R, X, Pol et R étant ci-dessous définis, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou 20 non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, n est un entier compris entre 6 et 8, les substituants R 1 à R 3 peuvent être de nature 25 différente suivant les motifs Ainsi, le composé de formule (II) se présente sous forme d'une succession de N motifs caractérisés par la présence d'un cycle, et les substituants de ce cycle peut être variables d'un motif à l'autre, dans la limite de leurs définitions ci-dessus. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, ledit ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la famille des cyclo-tétra-acide chromotropique, et en 5 particulier aux cyclo-tétra-acide chromotropique répondant à la formule générale (III) R 1 R 2 M SO 3 SO 3 M R 5 R 6 R 3 R 4 (III) dans laquelle R 1 et R 2, chacun indépendamment, représentent un 15 atome d'hydrogène ou un groupe X, R ou Pol tels que définis ci-dessous, R 3 et R 4, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe X ou R tels que définis cidessous, R 5 et R 6, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ou un groupe OR, OCH 2 R, OCOR, SR, SCH 2 R, SCOR, M représente un atome d'hydrogène, ou un atome choisi parmi Na, K, Li, Cs, Rb, Mg et Ca, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, N est un entier compris entre 3 et 15, les substituants R 1 à R 6, M, Pol, X, et, R peuvent être de nature différente suivant les motifs Ainsi, le composé de formule (III) se présente sous forme d'une succession de N motifs caractérisés par la présence d'un 10 cycle, et les substituants de ce cycle peuvent être variables d'un motif à l'autre, dans la limite de leurs définitions ci- dessus. Selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, ledit ligand adjuvant macrocyclique est choisi 15 dans la famille des cyclolnlveratrylenes, répondant à la formule générale (IV) R 3 R 1 R R 2 ( IV) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, X, CH 2 X, OCH 2 R, SR, NR, X, Pol et R 25 étant ci-dessous définis, R 2, R 3, R 4 et R 5, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, X, CH 2 X, OCH 2 R, X, Pol et R étant cidessous définis, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou 10 non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, n est un entier compris entre 1 et 10 les substituants R 1 à R 5, R, Pol, X et R peuvent 15 être de nature différente suivant les motifs Ainsi, le composé de formule (IV) se présente sous forme d'une succession de N motifs caractérisés par la présence d'un cycle, et les substituants de ce cycle peuvent être variables d'un motif à l'autre, dans la limite de leurs 20 définitions ci-dessus. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la réaction entre l'anticorps anti-Pr Psc et l'échantillon mis en présence du ligand adjuvant 25 macrocyclique puis traité à la protéinase K est mise en oeuvre par tout moyen connu, et notamment par immunoblotting, détection immunologique par la méthode des micro-cantileviers, spectrométrie de masse ou par des analyses optiques et spectroscopiques. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape supplémentaire de détection du complexe AML Pr Ps C De préférence, la détection du complexe AML Pr Psc s'effectue au moyen de techniques de scanning profilométrique et notamment la microscopie de balayage à réflectance, la microscopie de balayage en champ proche ou la microscopie de balayage confocale. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand adjuvant macrocyclique (AML) pour l'amplification de la détection du prion Pr Psc dans un échantillon biologique. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic des maladies dont la Pr Ps C est responsable, du type ESB, la tremblante des petits ruminants, Creutzfeldt10 Jacob, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation du ligand adjuvant macrocyclique. L'invention a également pour objet un kit de dosage immunologique de la Pr Pso caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation du ligand adjuvant macrocyclique. 15 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'amplification de la détection de la Pr Pso lorsque l'échantillon biologique est mis en présence 20 d'un ligand adjuvant macrocyclique. Il sera fait référence dans ces exemples aux dessins en annexe dans lesquels: la figure 1 est un exemple comparatif de la détection par immunoblotting de Pr Ps C d'une part dans un 25 échantillon mis en présence d'un ligand adjuvant macrocyclique spécifique (AML 1) dont la préparation est décrite ci-après et, d'autre part, dans un échantillon non mis en présence d'AM Ll; la figure 2 représente les courbes de densité 30 optique de détection de Pr Psc d'une part dans un échantillon mis en présence d'AM Ll et, d'autre part, dans un échantillon non mis en présence d'AM Ll; la figure 3 montre des images en microscopie de sonde à balayage (SPM) en mode non-contact pour des films séchés de la protéine prion recombinante (rec Pr P) seule (a), de rec Pr P en présence d'AML 1 (b) et d'AML 1 seul (c) ; la figure 4 montre des images en microscopie de sonde à balayage (SPM) en mode non-contact pour des films 5 séchés de rec Pr P en présence d'AML dans différentes proportions: 1/1000 AML 1/rec Pr P, 1/100 AML 1/rec Pr P, 1/10 AML 1/rec Pr P. Le ligand adjuvant macrocyclique utilisé pour 10 réaliser les exemples ci-après est le p-sulphonato-3,7-( 2carboxy- methyloxy)-calix l 6 l-arène (dénommé AML 1), de formule V 503 503 OH O OH (V) qui est synthétisé comme suit Une suspension de 20 calixl 6 larene dans l'acétonitrile en présence d'un équivalent de base (K 2 CO 3) est agitée à reflux Après 30 minutes, 0 5 équivalents d'agent alkylant (bromo-acetate d'éthyle) sont ajoutés dans le mélange réactionnel qui est maintenu à reflux et sous agitation pendant 24 heures. 25 Après refroidissement de la suspension, le solvant est évaporé sous pression réduite et le solide résultant est dissous dans 200 m L de CH 2 C 12 et lavé deux fois avec une solution d'acide chlorhydrique ( 1 M) et une fois avec de l'eau déminéralisée Après avoir été séché sur sulfate de magnésium (Mg SO 4) le solvant organique est évaporé sous pression réduite et permet l'obtention d'une poudre 5 blanche Celle-ci est purifiée sur une colonne de chromatographie de silice (éluant: CH 2 C 12:hexane; 4:1). Le produit purifié est analysé en RMN du 1 H, 13 C et en spectrométrie de masse electrospray La saponification de l'ester carboxylique est réalisée par l'hydroxyde de 10 potassium en solution dans un mélange eau: éthanol ( 30:70) sous agitation à température ambiante pendant 24 heures Le précipité formé est filtré puis lavé avec 50 m L d'acide chlorhydrique ( 1 M) et 50 m L d'eau puis purifié sur colonne de chromatographie de silice (éluant chloroforme: 15 méthanol: acide acétique; 95:5: 0 1 %) et permet d'obtenir, après évaporation du solvant, un solide blanc et cristallin Ce produit est analysé en RMN du '1 H, 13 C et en spectrométrie de masse electrospray La sulfonation est réalisée par un traitement avec l'acide sulfurique à 50 C 20 pendant 24 heures Le produit est précipité avec de l'éther et permet d'obtenir l'AML 1 sous forme d'une poudre blanche cristalline. Les échantillons qui ont servi à la réalisation des 25 exemples des figures 1 et 2 ont été préparés comme suit: Echantillon sans AML: 0,5 g de tissu de cerveau est broyé dans 4,5 m L de solution glucose 5 % pour obtenir une suspension à 10 % en poids/volume Pour 100 gl d'homogénat de cerveau à 10 % dans du glucose à 5 % (équivalent à 10 mg 30 de cerveau) est ajoutée 1 gg de protéinase K (Boehringer) dans 10 gl La solution est mise sous vortex et incubée à 37 C pendant une autre heure Après avoir ajouté 100 l de tampon Laemmli dénaturant, on chauffe 5 minutes à 100 C, on centrifuge à 12000 G pendant 5 mn, et on récupère les surnageants pour les faire migrer sur SDS PAGE. Echantillon avec AML: 0,5 g de tissu de cerveau est 5 broyé dans 4,5 m L de solution glucose 5 % pour obtenir une suspension à 10 % en poids/volume Pour 100 gl d'homogénat de cerveau à 10 % dans du glucose à 5 % (équivalent à 10 mg de cerveau), on ajoute 1 gl d'AML 0,l M Après une heure à 37 C, 1,5 gg de protéinase K (Boehringer) dans 10 gl est 10 ajoutée La solution est mise sous vortex et incubée à 37 C pendant une autre heure Après avoir ajouté 100 gl de tampon Laemmli dénaturant, on chauffe 5 minutes à 100 C, on centrifuge à 12000 G pendant 5 mn, et on récupère les surnageants pour les faire migrer sur SDS PAGE. 15 Après migration sur un gel d'électrophorèse unidimensionnelle de 15 % de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS PAGE) comme décrit par Laemmli, Nature 227 ( 1970), 680-685, les protéines sont transférées 20 par électrophorèse sur des membranes nitrocellulose et immunoblottées à température ambiante pendant 60 minutes avec un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope spécifique constitué des acides aminés 126-160 L'anticorps secondaire ( 1/5000) est un anticorps de chèvre dirigé 25 contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines de souris conjuguées à la peroxydase de radis (Ig G H+L). Les blots sont ensuite lavés et les signaux sont détectés par chimioluminescence soit avec un kit ECL (Amersham) sur des films (Biomex light, Kodak) ou avec un 30 super Signal Ultra (Pierce) et visualisation sur Fluor S. Multimager (Bio Rad). La figure 1 est un exemple comparatif qui montre que la détection du prion est amplifiée au moins quatre fois lorsque le procédé de l'invention est mis en oeuvre, par rapport à la détection de la même protéine en absence d'AML 1 En absence d'AM Ll, pour des dilutions supérieures au l/8 e, aucune Pr Psc n'est détectée En présence d'AML, la 5 détection de la Pr Psc dans le même échantillon est possible jusqu'à une dilution au 1/32 e Les échantillons qui ont servi pour les expériences en microscopie de sonde à balayage reportées dans les 10 figures 3 et 4 ont été préparés comme suit: Echantillons contenant du ligand adjuvant macrocyclique uniquement: des échantillons contenant du ligand adjuvant macrocyclique ( 50 m M) sont préparés par déposition sur du mica fraîchement clivé de 10 g 1 de 15 solution d'AML respectivement et de 10 g 1 d'eau et sont séchés pendant 24 heures à 37 C. Echantillons contenant du rec Pr P uniquement: des échantillons contenant du rec Pr P ( 50 m M) sont préparés par déposition sur du mica fraîchement coupé de 10 g 1 de 20 solution de 1/10 (v/v) AM Ll/rec Pr P, 1/100 (v/v) AM Ll/rec Pr P et 1/1000 (v/v) AM Ll/rec Pr P respectivement et de 10 1 d'eau et sont séchés pendant 24 heures à 37 C. Echantillons comprenant à la fois du ligand adjuvant macrocyclique et du rec Pr P: 1) des échantillons 25 contenant à la fois du ligand adjuvant macrocyclique et du rec Pr P sont préparés par déposition sur du mica fraîchement clivé de 1 g 1 de solution d'AML et de 1000 g 1 de rec Pr P respectivement et sont séchés pendant 24 heures à 37 C; 2) des échantillons contenant à la fois du ligand adjuvant 30 macrocyclique (AML 1) et du rec Pr P sont préparés par déposition sur du mica fraîchement coupé de 1 1 tl de solution d'AML et de 100 g 1 de rec Pr P respectivement et sont séchés pendant 24 heures à 370 C; 3) des échantillons contenant à la fois du ligand adjuvant macrocyclique et du rec Pr P sont préparés par déposition sur du mica fraîchement coupé de 1 il de solution d'AML et de 10 gl de rec Pr P respectivement et sont séchés pendant 24 heures à 37 C. On effectue une analyse par imagerie au moyen d'un Thermomicroscope Explorer AFM équipé avec un scanner trépied 100 gm, en mode non-contact, utilisant des fréquences de résonance élevées (F O = 320 k Hz) de 10 cantilever pyramidal avec des sondes silicones à une fréquence de balayage de 1 Hz Le traitement des images est réalisé avec le logiciel SP Mlab 5 1 et présentées nonfiltrées. Il ressort des figures 3 et 4 que les films de rec Pr P seuls montrent une structure en agrégats circulaires caractéristique En présence d'AML, les structures observées pour le rec Pr P sont modifiées séquentiellement, sont fonction croissante de la quantité d'AML et montrent 20 des motifs arrondis et éventuellement cristallite orthogonal Les images du ligand adjuvant macrocyclique seul (AML 1) montrent des structures ressemblantes, mais en plus petites, aux motifs des films rec Pr P AML. D'autres expériences ont été réalisées par microscopie à force atomique. Une analyse ultérieure par analyse de surface de la rugosité est donnée dans le tableau I L'utilisation de ces 30 mesures de rugosité peut être étendue à des techniques d'analyses profilométriques. TABLEAU 1 AML AML/ AML/ AML/ rec Pr P seul rec Pr P rec Pr P rec Pr P seul 1/1000 1/100 1/10 Ra (nm) 48 69,6 123,9 134,4 1,11 RMS (nm) 58,7 82,8 149 163,1 1,95 Hauteur 217,7 233,3 408,7 469,8 5,4 moyenne Valeur 448,9 484,3 894,66 1056,9 43,17 maximale de hauteur l N Ra = 7 IZ -il R Ms= l Avg Height = N Zi (Formule A) (Formule B) (Formule C) Les valeurs de rugosité calculées sont obtenues par le logiciel du Thermomicroscope SPML 5 01 La rugosité moyenne Ra est définie comme la moyenne arithmétique des 20 déviations de hauteur (formule A), la racine moyenne de la rugosité carrée (root mean square roughness RMS) est définie comme la racine carrée de la valeur moyenne des carrés des distances des points à la valeur moyenne d'image (formule B) et la hauteur moyenne de l'échantillon (formule C). REVENDICATIONS 1 Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr P So caractérisé en ce que l'on ajoute dans avec un 5 échantillon biologique susceptible de contenir de la Pr Ps C, un ligand adjuvant macrocyclique (AML), puis l'on traite la solution obtenue en ajoutant de la protéinase K, et on fait réagir la suspension résultante avec un anticorps antiprp SC. 2 Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr PSC selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique provient d'un animal, y compris l'homme. 3 Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr PSC selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit ligand adjuvant macrocyclique se lie à des sites contigus ou proches dans l'espace des 20 sites de liaison de la Pr PSC avec un anticorps. 4 Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr Psc selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique est 25 choisi dans la famille des métacyclophanes et en particulier parmi les calix-arènes. Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr PSC selon la revendication 4, caractérisé en ce que 30 les calix-arènes préférés sont les para-sulfonato-calixarènes fonctionnalisés sur la face phénolique. 6 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr PSC selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (I) ci-dessous R 3 4 R 5 H (i) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène, un groupe 10 hydroxyle, un groupe OR ou un groupe OCOR, R étant tel que défini ci-dessous, R 2 représente un atome d'hydrogène, un groupe R, COR, CH 2 Pol, dans lesquels Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium, acide carboxylique et 15 R tel que défini ci- dessous, R 3 représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe OR ou un groupe OCOR dans lesquels R est tel que défini ci-dessous, R 4 représente un atome d'hydrogène, un groupement 20 OH, un groupe OR, un groupe OCH 2 R ou un groupe OCOR, dans lesquels R est tel que défini ci-dessous, Y est un groupement C 1 _ 4 alkyle, un groupement alkyloxy, alkylamine ou alkylthio, R 5 représente ou R tels que définis ci-dessous, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, q représente un entier égal à O ou 1, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, n est un entier compris entre 3 et 15, les substituants R 1 à R 5, R, X, Y et l'entier m peuvent être de nature différente suivant les motifs. 7 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr PSC selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que ledit ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (Ia) ci-dessous 503 SO 3 oq OH O R 6 (Ia) dans laquelle R 6 est un groupement (CH 2)n-Z dans lequel Z est un groupement COO Et, COOH, CN ou NH 2, p est un entier compris entre 1 et 10, q est un entier compris entre 1 et 10. 8 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr PSC selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, 25 caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique est le p-sulfonato-calix-l 4 l- arène, le p-sulfonato-calix-l 6 larène, le p-sulfonato-calix-l 8 l-arène, ou l'un de leurs dérivés. 9 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr Psc selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la famille des cyclodextrines. Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr Psc selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule 10 générale (II) ci-dessous R +o *+O l l 0 +*, R 2 3 (II) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, OCH 2 R, SR, NR, Pol et R étant cidessous définis, R 2 et R 3, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, OCH 2 R, Pol et R étant ci-dessous définis, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, n est un entier compris entre 6 et 8. 11 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr Pso selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la famille des cyclo-tétra-acides chromotropiques. 12 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr Psc selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (III) ci-dessous RI R 2 MSO 3 03 R 5 R 6 R 3 R 4 (III) dans laquelle Ri et R 2, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe R ou Pol tels que définis ci-dessous, R 3 et R 4, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe R tel que défini ci- dessous, R 5 et R 6, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle ou un groupe OR, OCH 2 R, OCOR, SR, SCH 2 R, SCOR, M représente un atome d'hydrogène, ou un atome choisi parmi Na, K, Li, Cs, Rb, Mg ou Ca, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions 10 polaires ou non polaires, n est un entier compris entre 3 et 15, les substituants R 1 à R 5, R, X et Y peuvent être de nature différente suivant les motifs. 13 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr Psc selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand adjuvant macrocyclique est choisi dans la famille des cyclolnlveratrylenes. 14 Procédé d'amplification de l'immunodétection de la Pr PSC selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit ligand adjuvant macrocyclique répond à la formule générale (IV) R 4 R 5 R 1 R Rl R 3 / n R 3 R 3 R 5 R 4 (IV) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, OCOR, COR, CH 2 Pol, OCH 2 R, SR, NR, Pol et R étant cidessous définis, R 2, R 3, R 4 et R 5, chacun indépendamment, représentent un atome d'hydrogène ou un groupe OH, OR, 10 OCOR, COR, CH 2 Pol, OCH 2 R, Pol et R étant ci-dessous définis, Pol représente un groupe phosphate, sulfate, amine, ammonium ou acide carboxylique, X représente un groupement CH 2, ou un atome 15 d'azote, d'oxygène ou de soufre, R représente une chaîne hydrocarbonée, saturée ou non, ramifiée ou non, cyclique ou non cyclique, substituée ou non par un groupement halogène, et portant des fonctions polaires ou non polaires, N est un entier compris entre 1 et 10. Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr Psc selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la réaction entre l'anticorps 25 anti-Pr Psc et l'échantillon mis en présence du ligand adjuvant macrocyclique puis traité à la protéinase K est mise en oeuvre par tout moyen connu, et notamment par immunoblotting, immuno micro-cantilever détection, spectrométrie de masse ou par des analyses optiques et 30 spectroscopiques. 16 Procédé d'amplification de l'immuno-détection de la Pr PSC selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que qu'il comprend en outre une étape supplémentaire de détection du complexe AML-Pr Psc. 17 Procédé d'amplification de l'immuno-détection 5 de la Pr Psc selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite détection du complexe AML Pr Psc s'effectue au moyen de techniques de balayage profilemétrique telles que la microscopie à réflectance de balayage, la microscopie de balayage en champ proche ou la microscopie de balayage 10 confocale. 18 Utilisation d'un ligand adjuvant macrocyclique pour la fabrication d'une composition destinée à l'amplification de la détection de la Pr Psc dans un 15 échantillon biologique. 19 Kit de diagnostic des maladies dont le Pr PSC est responsable, du type ESB, la tremblante de petits ruminants, Creutzfeldt-Jacob, caractérisé en ce qu'il 20 comprend un ligand adjuvant macrocyclique. Kit de dosage immunologique de la Pr PSC caractérisé en ce qu'il comprend un ligand adjuvant macrocyclique.