Brevet FR2847167A1 — publié le 20040521

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un agent potentialisateur de l'action du TGFss pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des pathologies liées à une déficience du signal TGF|3 ou nécessitant une amplification de ce signal. Le TGFss (Transforming Growth Factor-p) est une cytokine jouant un rôle important de régulateur de la croissance et de la différentiation cellulaire. Les protéines Smads traduisent le signal des récepteurs TGFss en régulant la transcription de gènes cibles, soit directement, soit en combinaison avec d'autres facteurs de transcription séquences spécifiques. La cascade de signalisation intracellulaire des membres de la superfamille du TGF est initiée par la liaison de la cytokine à un complexe de récepteurs membranaires composé de deux types de récepteur à activité sérines/thréonines kinase, les récepteurs de type I et les récepteurs de type II. La fixation de la cytokine au récepteur de type Il induit le recrutement et la phosphorylation du récepteur de type I. La transduction du signal depuis la membrane jusqu'au noyau s'effectue alors grâce à une famille de protéines, les Smads. Selon des critères structuraux et fonctionnels, la famille des Smads peut être divisée en trois sous familles. Les R-Smads (Receptor-regulated Smad), qui sont spécifiquement activées par les récepteurs de type I, comprennent Smadl, Smad5 et Smad8 spécifiques de la voie des BMPs et, Smad2 et Smad3 spécifiques de la voie des TGF/activines. La phosphorylation par les récepteurs de type I des R-Smads s'effectue au niveau de résidus sérines situés à l'extrémité C-terminale de la protéine (motif SSXS). L'activation de ces RSmads permet la formation d'un hétérocomplexe avec un autre membre de la famille des Smads, commun aux différents R-Smads, Smad4. Cette protéine également appelée coSmad (common-partner Smad) est dépourvue de la séquence SSXS et permet la translocation du complexe R-Smad/Smad4 dans le noyau qui peut alors agir comme facteur de transcription. La troisième sous famille est constituée de Smad6 et Smad7 appelées I-Smads (Inhibitory-Smads), qui empêchent la phosphorylation des R-Smads et ainsi leur association avec Smad4 et/ou la translocation du complexe R-Smads/Smad4 dans le noyau en interagissant directement avec Smad4. TGFss est également impliqué dans d'autres voies de signalisation telles que celle de la MAP/SAP kinase ou encore la voie Ras. Il existe à l'heure actuelle une série de pathologies liées au TGFJ3 pour lesquelles des solutions thérapeutiques sont nécessaires. En effet, TGFss est une cytokine clé dans le contrôle de l'homéostasie des tissus conjonctifs et joue un rôle majeur dans l'activité profibrotique en augmentant l'expression des gènes spécifiques aux tissus conjonctifs (Mauviel A and Uitto J. (1993) Wounds 5:137-52). De plus, TGFJ3 joue un rôle important dans les processus d'immunomodulation, en agissant sur la différenciation des lymphocytes (Kehrl et al, 1986, J Immunol, 137,3855-3860, Gorelik et Flavell, 2002, Nature, 2,46-53). La Demanderesse a constaté de façon surprenante que l'utilisation d'un antagoniste des récepteurs RAR avait pour conséquence de potentialiser l'action du TGF. Ainsi, la présente invention propose une solution pour traiter les pathologies liées à une déficience du signal TGFss ou nécessitant une amplification de ce signal. Cette utilisation n'est aucunement évidente au vu de l'art antérieur car celui-ci ne permet pas à l'homme du métier d'identifier un quelconque intérêt pour l'utilisation des antagonistes des récepteurs RARs dans le traitement des pathologies liées à une déficience du signal TGF ou nécessitant une amplification de ce signal. En effet, l'art antérieur décrit que rétinoides et TGFJ3 suivent des voies de signalisation complexes, d'autant plus complexes qu'elles diffèrent suivant le sous-type de récepteur activé, à titre d'exemple pour les rétinoides, la voie de signalisation dépend des récepteurs RARs et RXRs et du sous-type concerné ([alpha], ss ou y). Enfin, il est à noter que ces voies de signalisation sont indépendantes. Ainsi, il n'était pas envisagé qu'un rétinoide puisse avoir un quelconque effet sur la voie de signalisation de TGFss. Deux classes de récepteurs nucléaires, les récepteurs RARs et RXRs sont impliqués dans la réponse transcriptionnelle à l'acide rétinoïque (RA). Les classes des récepteurs aux acides rétinoïques (RARs) et des récepteurs rétinoïques X (RXRs) sont respectivement subdivisés en sous-types [alpha], ss et y avec plus d'un isoforme pour chaque sous-type (Chambon, 1996). Les RARs, associés aux RXRs pour former les hétérodimères RAR-RXR, lient la séquence ADN cible, soit les éléments de réponses à l'acide rétinoïque (RAREs), consistant en une répétition directe de la séquence consensus 5'-PuG(G/A)(T/A)CA-3', séparées par deux ou cinq nucléotides. La famille RAR reconnaît deux stéréoisomères naturels du RA, RA tout-trans et RA 9-cis, alors que la famille RXR reconnaît exclusivement RA 9-cis. Les rétinoïdes sont une famille de composés présentant un large éventail d'activités thérapeutiques allant d'une activité anticancéreuse à une activité réparatrice de la peau (Altucci L et Gronemeyer H 2001 Nature Review 181-193, Sun SY et Lotan R (2002) Oncology Hematology 41: 41-55). Ainsi la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un antagoniste des récepteurs RARs pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinées au traitement des pathologies liées à une déficience du signal TGF ou nécessitant une amplification de ce signal. On entend par antagoniste des récepteurs RAR, un analogue structural synthétique ou naturel de l'acide rétinoïque capable de se fixer et d'activer spécifiquement les récepteurs RARs. On préférera les antagonistes synthétiques, de préférence, l'acide 4-(5,5-diméthyl-8-p- tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)-benzoique. On entend par agent potentialisateur, un composé potentialisateur de la transcription induite par les facteurs Smad via la signalisation TGFss. Ainsi, la composition utilisée selon la présente invention sera destinée au traitement des pathologies liées à un désordre de la transcription induite par les facteurs Smad via la signalisation TGFss. Par pathologies liées à une déficience du signal TGF ou nécessitant une amplification de ce signal, on entend : - des troubles de la cicatrisation, tels que les ulcères, en particulier, les ulcères veineux, diabétiques et les escarres ; - l'amélioration de cicatrisation normale, telles que la cicatrisation post-opératoire, notamment dans l'accélération de la cicatrisation (Bernstein E, Harisiadis L, Salomon G et al., Transforming Growth Factor-b is improves healing of radiation-impaired wounds. J Invest Dermatol 1991 ; 97 : 430-434 ; Mauviel A et Uitto J. The extracellular Matrix in Wound Healing: Role of the cytokine Network. Wounds 1993 ; (3): 137-152) ; - de certains cancers, notamment ceux liés à une perte de contrôle de TGFss sur la prolifération cellulaire (Engle SJ et al., 1999 Transforming growth factor beta1supresses nonmetastatic colon cancer at an early stage of tumorigenesis - Cancer Res. 59,3379- 3386 ;Tang B et al., 1998) ; - du rejet de greffes, notamment en favorisant la tolérance immune (Eikmans M et al., 2002 High transforming growth factor-beta and extracellular matrix mRNA response in rénal allografts during early acute rejection is associated with absence of chronic rejection - Transplantation. 73,4, 573-579) ; - de pathologies faisant intervenir le collagène de type VII (COL7A1), notamment des pathologies génétiques dans lesquelles un seul allèle est affecté telles que l'Epidermolyse bulleuse ou de certains cas de cicatrisation pouvant être améliorés par la stimulation de la synthèse du collagène de type VII favorisant l'épithélialisation (Christiano AM, Greenspan DS, Hoffman GG, Zhang X, Tamai Y, Lin AN, Dietz HC, Hovnanian A, Uitto J. A missense mutation in type VII collagen in two affected siblings with récessive dystrophic epidermolysis bullosa.Nat Genet. 1993 May;4(1):62-6. En particulier, l'utilisation selon la présente invention est adaptée au traitement des pathologies liées au collagène de type VII (COL7A1). Enfin, la présente invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un antagoniste des récepteurs RARs destinées aux traitements des pathologies liées à une déficience du signal TGFss ou nécessitant une amplification de ce signal. Exemple 1 : Mesure de la potentialisation de l'action des RARS sur la transactivation d'un promoteur Smad3-dépendant par des antagonistes RARs Une première approche pour examiner la potentialisation de la signalisation RAR et de celle TGFp/Smad, est de déterminer l'effet des différents agonistes et antagonistes RARs sur la transactivation Smad dépendante, induite par TGFss. du gène rapporteur luciférase (lux) dans des fibroblastes de poumon WI-26 transfectées par la construction (CAGA)9lux. Cette dernière est composée de neufs copies du motif nucléotidique CAGA, connu pour lier Smad3 et Smad4 avec une haute affinité, clonée en amont du promoteur majeur de l'adénovirus (MLP) contrôlant l'expression du gène rapporteur lux. Une culture à confluences de fibroblastes WI-26 a été co-transfectées avec (CAGA)9-lux et un vecteur d'expression codant pour RARy, en absence (-) ou en présence (+) du vecteur d'expression exprimant Smad3. Trois heures après la transfection, quatre composés sont ajoutés : - l'antagoniste RAR : l'acide 4-(5,5-diméthyl-8-p-tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)benzoique à 10-6M (1 (il d'une solution à 10-3M dans du DMSO introduit dans 1 ml de milieu 1 %) ; - l'agoniste RAR : l'acide 4-[(5,5,8,8-Tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2ylamino)-methyl]-benzoique à 10-7M (1 [il d'une solution à 10-4M introduit dans du DMSO dans 1 ml de milieu 1 %) ; - l'ATRA (all trans retinoic acid) à 10-7M (1 III d'une solution à 10,4M introduit dans du DMSO dans 1 ml de milieu 1 %) ; - contrôle (Ctrl) : 1 l de DMSO. L'activité de la luciférase est déterminé 24 heures après. Le rôle des agonistes et antagonistes synthétiques RARs sur les interactions fonctionnelles entre Smad3 et RARy a été examiné, les résultats sont représentés sur la figure 1. L'acide 4-(5,5-diméthvl-8-a-tolyl-5.6-dihydro-naphthalen-2-ylethyl -benzoique (antagoniste RAR) potentialise l'effet de RARy sur la transcription Smad3 dépendante alors que l'acide 4-iï5.5.8.8-Tetramethvl-5.6.7.8-tetrahvdro-naphthalen-2-vlarnino)methvll-benzoique (agoniste RAR) abolit l'effet de RARy. Exemple 2: Démonstration de l'effet potentialisateur dose-dépendant des antagonistes RARs sur la réponse transcriptionnelle Smad spécifique induite par TGFss. Une culture à confluence de fibroblastes WI-26 est transfectée avec le gène (CAGA)g-lux. Après un choc au glycérol, du DMEM contenant 1% de FCS (Foetal Calf Serum) est ajouté. Trois heures plus tard, des concentrations croissantes de l'antagoniste RAR synthétique, l'acide 4-(5,5-Dimethyl-8-p-tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)benzoique sont ajoutées. Ces résultats (représentés sur la figure 2) montrent que l'antagoniste, acide 4-(5.5- diméthvl-8-p-tolvl-5.6-dihvdro-naphthalen-2-vlethvnvlVbenzoique, potentialise de façon dose dépendante la réponse transcriptionnelle Smad dépendante induite par TGFss, avec un effet maximal (+190%) à la concentration de 10-6 M. A une concentration de 10-8 M, l'acide 4-(5,5-Dimethyl-8-p-tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)-benzoique double l'étendue de la réponse TGFss dépendante. Exempte 3 : Démonstration moléculaire de l'interaction antagonistes RAR/Smad par des expériences d'immuno-précipitations (IP) et d'immunoblottina. Des cellules Cos-7 sont transfectées avec les vecteurs d'expression Smad3 marqué par Flag et Gal4BD-RARy-D-E-F, en présence ou en absence (voir figure 3, lignes 1-3) de soit l'acide 4-[(5,5,8,8-Tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2-ylamino)-methyl]benzoique (lignes 4-6), soit l'acide 4-(5,5-diméthyl-8-p-tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2ylethynyl)-benzoique (lignes 7-9). Le vecteur d'expression vide Gal 4 (Gal4-e) est utilisé comme témoin. Trois heures après transfection, 10-6 M de l'acide 4-(5,5-diméthyl-8-p-tolyl-5,6-dihydronaphthalen-2-ylethynyl)-benzoique (antagoniste RAR) sont ajoutés. Quarante heures plus tard, le lysat cellulaire est immunoprécipité par des anticorps anti-Gal4 et la coprécipitation de Smad3 est détectée par immunoblotting avec des anticorps anti-Flag (marquage de Smad) (panneau du haut). L'expression de RARy et Smad3 est confirmée en Western Blot en utilisant des anticorps anti-Flag (panneau du milieu) et anti-Gal4 (panneau du bas). Les bandes de migrations au niveau des lignes 2,5 et 8 obtenues avec l'anticorps antiGal4 correspondent à la protéine Gal4BD non fusionnée à RARy exprimé par le vecteur Gal4BD vide. Après immunoprécipitaion avec un anticorps anti-Gal4BD (panneau du haut) un western blot avec des anticorps anti-flag révèle la co-immunoprécipitation de Smad3 avec RARy au niveau des lignes 3. La quantité de RARy liant Smad3 est sianificativement augmentée par la présence de l'acide 4-(5.5-Dimethvl-8-p-tolvl-5.6-dihvdro-naphthalen-2-vlethvnvl)-benzoique. liane 9. Ceci indique aue la potentialisation par l'antagoniste RAR. l'acide 4-(5,5-Dimethyl-8-r)tolvl-5.6-dihvdro-naphthalen-2-vlethvnvlVbenzoique, de l'action de TGF(3, c'est à dire l'augmentation de la réponse transcriptionnelle induite par TGFss passe par une augmentation de la quantité d'hétérocomplexe Smad3-RARy formé. Exemple 4 : Effets des antagonistes RARs sur l'activité du promoteur du collagène de type VII (COL7A1) induite par TGFB. L'effet des antagonistes RARs sur les promoteurs COL7A1 (promoteur du collagène de type VII) est quantifié via la transactivation du gène rapporteur luciférase (lux). On observe (figure 4), en présence de l'antagoniste RAR, acide 4-(5,5-Dimethyl-8-p-tolyl- 5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)-benzoique, et du TGFss, une augmentation dose dépendante de la transcription induite par le TGFss du gène rapporteur sous contrôle du promoteur du collagène de type VII(COL7A1). Exemple 5 : Effet des antagonistes et agonistes RARs sur la modulation de la réponse au TGFss de COL7A1 endogène Par ailleurs, la figure 5 représente un gel de Nothern Blot sur lequel on observe, en dehors de toute transfection, que la réponse au TGFss de COL7A1 endogène est potentialisée par l'antagoniste RAR. Cet essai permet également de confirmer toutes les expériences de transfection décrites précédemment. Cet essai a été réalisé selon le protocole suivant : des cultures d'HaCaT confluentes ont été traitées avec l'agoniste, acide 4-[(5,5,8,8-Tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2- ylamino)-methyl]-benzoique à 10-7M, et l'antagoniste, acide 4-(5,5-diméthyl-8-p-tolyl-5,6dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)-benzoique à 10-6M tels que décrits dans l'exemple 1, en présence ou en absence de TGFss (à 10 ng/ml) pendant 48 heures. Après extraction des ARN totaux, le taux d'ARNms du collagène de type VII a été quantifié par Nothern Blot à l'aide d'une sonde cDNA spécifique marquée au P32. Une sonde caractéristique des ARNms de la protéine GADPDH a été utilisée comme contrôle au dépôt. Les gènes cibles de l'action de l'antagoniste, acide 4-(5,5-Dimethyl-8-p-tolyl-5,6-dihydronaphthalen-2-ylethynyl)-benzoique, sont les gènes impliqués dans des pathologies particulières, faisant intervenir le promoteur du collagène de type VII (COL7A1 ), telles que : certaines pathologies génétiques comme l'Epidermolyse bulleuse et certains cas de cicatrisation pouvant être améliorés par la stimulation de la synthèse du collagène de type VII favorisant l'épithélialisation. Ainsi, la potentialisation de son activité par ces antagonistes peut prévenir ou traiter de telles pathologies. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un antagoniste des récepteurs RARy pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies liées à une déficience du signal TGFss ou nécessitant une amplification de ce signal. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antagoniste des récepteurs RARs est le l'acide 4-(5,5-Dimethyl-8-p-tolyl-5,6-dihydro-naphthalen-2-ylethynyl)-benzoique. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement des pathologies liées à un désordre de la transcription induite par les facteurs Smad via la signalisation TGFss. 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement : - des troubles de la cicatrisation, tels que les ulcères, en particulier, les ulcères veineux, diabétiques et les escarres ; - de situations physiologiques telles que la cicatrisation post-opératoire, notamment dans l'accélération de la cicatrisation ; - de cancers liés à une perte de contrôle de TGFss sur la prolifération cellulaire ; - de rejets de greffes, notamment en favorisant la tolérance immune ; - de pathologies faisant intervenir le collagène de type VII (COL7A1), notamment de certaines pathologies génétiques telles que l'Epidermolyse bulleuse ou de certains cas de cicatrisation pouvant être améliorés par la stimulation de la synthèse du collagène de type VII favorisant l'épithélialisation. 5. Utilisation selon la revendications 1 ou 2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies liées au collagène de type VII (COL7A1). 6. Composition pharmaceutique comprenant au moins un antagoniste des récepteurs RARy destinée aux traitements des pathologies liées à une déficience du signal TGFss ou nécessitant une amplification de ce signal.