Brevet FR2852427A1 — publié le 20040917

PROCEDE ET DISPOSITIF DE DÉTERMINATION DE PARUAMÈTRES QUANTITATIFS HISTOCHIMIQUES ET IMMUNOHISTOCHIMIQUES L'invention est relative à un procédé et à un dispositif de détermination de paramètres quantitatifs obtenus à partir de préparations tissulaires histochimiques et immunohistochimiques. Elle concerne, de façon plus précise, un procédé et un dispositif permettant la quantification de structures et de marqueurs moléculaires, susceptibles de fournir une information sur l'évolution des tumeurs cancéreuses et leur réponse potentielle au traitement. On rappelle ici que la technique de marquage histochimique ou immunohistochimique consiste à appliquer, sur de très fines sections de tissu, un colorant ou un anticorps spécifique, qui permettent la mise en évidence sélective de certains éléments de l'échantillon. Ainsi, la coloration est 15 directe ou constitue un marquage par une réaction enzymatique colorée du site de la réaction antigénique. Ces colorations peuvent être observées en lumière ordinaire ou en fluorescence. Dans ce qui suit, on considérera surtout des marqueurs repérables en lumière visible. Les colorations peuvent être appliquées à des sections de tissu congelé ou fixé et inclus en paraffine ou en résine plastique. Les procédés qui seront décrits ci-après, s'appliquent dans tous les cas. Toutefois, on préférera des coupes de tissu fixé et inclus en paraffine. L'analyse quantitative des structures tissulaires et 5 cellulaires colorées permet de déterminer des paramètres d'évaluation de l'évolution de la maladie qui peuvent constituer eux-mêmes des aides à la prise de décision pour établir le traitement. Ainsi, le dénombrement des vaisseaux sanguins se 10 trouvant dans une tumeur peut contribuer à établir le pronostic de cette tumeur et justifier ou non la mise en route d'un traitement anti-angiogénique. Il peut être également indispensable de disposer d'informations sur la fraction volumique du stroma des tumeurs 15 qui constitue le tissu de soutien et le tissu nourricier du cancer. Dans certaines localisations tumorales telles que le cancer du sein, le cancer de l'ovaire ou de la prostate, le pathologiste doit aussi disposer d'informations sur des 20 marqueurs de prolifération ou de différenciation cellulaires, notamment la proportion de cellules qui se multiplient ou la fraction de cellules cancéreuses équipées de récepteurs hormonaux. De façon plus précise, le pathologiste peut souhaiter 25 disposer des informations suivantes: 1. Informations relatives aux vaisseaux sanguins a) le nombre moyen de vaisseaux par unité de surface de tissu tumoral, b) la surface des vaisseaux par unité de surface de 30 tissu tumoral, et c) après identification des zones de concentration maximale, appelées Il hot spots "', les valeurs moyennes et maximales du nombre de vaisseaux par unité de surface et de la surface des vaisseaux par unité de surface dans ces Il hot 35 spots ". 2. Informations relatives au stroma le pourcentage de surface de stroma (ou à l'inverse le pourcentage de cellules cancéreuses) par rapport à la surface tumorale totale. 3. Informations relatives aux marqueurs cellulaires, et en particulier aux marqueurs localisés dans les noyaux: a) la densité de surface moyenne marquée sur l'ensemble des cellules cancéreuses de la section de tumeur, b) après identification des zones de concentration maximale, la densité de surface de marquage moyenne et maximale, dans ces " hot spots Il. Jusqu'à présent, les colorations histochimiques et immunohistochimiques sont observées au microscope et les divers paramètres mentionnés cidessus sont le plus souvent estimés à 15 partir d'une observation visuelle. Mais, les mesures obtenues de cette manière sont subjectives et peu reproductibles; en outre, les tumeurs sont souvent hétérogènes et les informations extraites de l'observation de quelques champs microscopiques ne peuvent rendre compte du comportement global des lésions. De 20 telles méthodes ne peuvent donc être introduites en routine de laboratoire d'analyse. Des tentatives de quantification semi-automatique, plus rarement totalement automatiques, ont été effectuées, mais les procédés utilisés restent peu satisfaisants, car trop 25 rudimentaires et trop dépendants des conditions de numérisation des images. Ils ne peuvent donc pas fournir des résultats reproductibles. L'invention a pour but de fournir un procédé de mesure, de préférence totalement automatique, d'au moins 30 certains paramètres. Elle s'appuie sur l'utilisation d'une image numérique unique, de préférence en millions de couleur et codée sur 24 bits et non compressée de la préparation histologique complète de la tumeur, cette image étant obtenue par exemple avec un scanner à diapositives professionnel acceptant un 35 passeur de lames histologiques et pour lequel les conditions d'acquisition, c'est-àdire la résolution, les conditions d'éclairement et le rendu des couleurs sur l'écran, ont été précisément définies. Elle fait donc appel à des procédures d'analyse 5 automatique d'images pour le dénombrement des sections vasculaires et/ou l'estimation de la fraction de stroma tumoral et/ou la quantification des structures cellulaires. - Vaisseaux intra-tumoraux. Selon un premier aspect de l'invention, on effectue 10 une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, par exemple scannée à une résolution d'au moins 2700 points par pouce, avec des conditions d'acquisition prédéterminées, pour mesurer automatiquement les paramètres relatifs aux vaisseaux présents dans cette tumeur. 15 Par exemple, le marquage vasculaire est obtenu au préalable par action d'un anticorps spécifique (facteur VIII ou facteur Von Willebrand) et le site de la réaction antigénique est révélé par la coloration brune de la diaminobenzidine (DAB) ou la coloration rouge de l'aminoéthylcarbazole (AEC), et le tissu non 20 marqué est contre-coloré en bleu par une laque nucléaire d'hématoxyline. Le traitement d'images comporte une étape de détection du tissu tumoral, une étape d'élimination des zones de nécrose et/ou de mucus, une étape de détection des structures 25 immunomarquées, une étape d'identification et de localisation des zones de plus forte concentration vasculaire et une étape de mesure. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de l'image, de préférence, on choisit une des composantes de 30 couleur, par exemple le vert, pour lequel il offre un bon contraste, on porte cette image au carré et on lui applique un seuillage automatique adaptatif, basé sur le calcul du moment de la distribution des valeurs de gris de l'image, et contraint à se situer entre 90 et 100% de ces valeurs. On rappelle que porter une image au carré signifie porter au carré l'intensité de la composante de couleur choisie pour chaque pixel. Cette étape peut être complétée par deux opérations de morphologie mathématique destinées à améliorer l'image 5 résultat: une fermeture puis une ouverture géodésiques. L'opération de fermeture permet de boucher les trous et vallées et améliorer les contours tandis que l'opération d'ouverture supprime le bruit autour du tissu. La seule étape interactive, c'est-à-dire manuelle, qui 10 peut intervenir à ce niveau est celle de la détermination du dessin des limites du tissu tumoral lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables constitués par des artéfacts de préparation, tels que des plis de la coupe. Il est également utile d'éliminer les zones de nécrose et/ou de mucus de l'image de tissu à analyser, car ces zones ne présentent pas d'intérêt pour la quantification et leur coloration non spécifique fausse les résultats de la mesure. Pour éliminer ces zones, on part de la constatation que celles20 ci sont colorées par les chromogènes sous forme de plages plus ou moins homogènes, étendues, de couleur rouge ou marron, alors que le tissu tumoral est à prédominante bleue (ou verte). On caractérise et on isole ces régions par traitement d'images comme des plages de couleur Il non bleue Il. A cette 25 fin, après un filtrage destiné à homogénéiser la texture et la couleur de ces plages, on calcule une image d'" excès de bleu ", définie comme la différence entre, d'une part, le double de la valeur de la composante de couleur bleue et, d'autre part, la somme des composantes rouge et verte, les valeurs négatives 30 étant conservées. En outre, l'identification et la localisation de ces zones de nécrose et/ou de mucus sont complétées par l'élimination des petites plages. Cette élimination s'effectue par une opération classique de morphologie mathématique portant le nom d'ouverture par reconstruction et consistant en une érosion suivie d'une dilatation géodésique. Ensuite, pour détecter les vaisseaux dans la tumeur, on part de la constatation que les cellules tapissant ces vaisseaux peuvent n'être que partiellement colorées. Par conséquent, pour isoler au mieux les sections de vaisseaux dans leur intégralité, de préférence, on combine deux étapes: on détecte le maximum de structures dans l'image et on ne reconstruit, pour les conserver, que les structures 10 partiellement ou totalement marquées par le chromogène brun ou rouge. Par " structures " présentes dans l'image on entend ici des régions qui sont plus contrastées que leur environnement, au sein de la composante bleue de l'image en couleur. Elles sont isolées par une procédure de morphologie mathématique dite de 15 " chapeau haut de forme " obtenue, par exemple, par la différence entre, d'une part, le résultat d'un filtrage passebas de la composante bleue et, d'autre part, l'image fermée (dilatation suivie d'érosion) de l'image filtrée. Les régions immunomarquées sont identifiées, sur une 20 image couleur corrigée par référence au fond, par translation de couleur. Cette opération est effectuée soit par seuillage des valeurs basses d'une image résultant de la soustraction entre la composante bleue et la moitié de la composante verte de l'image couleur, soit par conservation des valeurs positives d'une image 25 d'" excès de rouge " calculée comme le résultat de la différence entre, d'une part, le double de l'image rouge et, d'autre part, la somme de l'image verte et de l'image bleue. Ce résultat peut être combiné à un double seuil d'une image de teinte de l'espace couleur HSI (" Hue " ou teinte, Saturation, Intensité) qui ne 30 conserve que les couleurs du spectre allant du violet au jaune en passant par le rouge. Par double seuil, on entend ici que la valeur de la gamme de teintes conservée doit se situer entre deux limites. Grâce à une opération de morphologie mathématique, 35 dite de reconstruction géodésique, seules les structures comportant un ou plusieurs marqueurs de couleur rouge ou brune et correspondant aux vaisseaux que l'on veut détecter seront finalement retenues. Ces structures seront ensuite dénombrées et mesurées, à la fois dans la totalité de la zone d'intérêt 5 correspondant au tissu tumoral et dans les zones de plus forte concentration de vaisseaux, appelées " hot spots ". Pour détecter ces " hot spots ", on agrège les vaisseaux séparés par une distance inférieure à 200 pm grâce à une procédure de morphologie mathématique dite de fermeture. Du 10 point de vue théorique, on se base en effet sur le fait que la distance de perfusion des vaisseaux, c'est-àdire la distance jusqu'à laquelle un vaisseau peut nourrir des cellules, est d'environ 100 pm. Seules les régions de forte concentration ayant une surface au moins égale à la taille d'un champ 15 microscopique à faible grossissement (900 pm2), habituellemnt observé par le pathologiste, sont conservées, grâce à une opération complémentaire d'érosion-reconstruction. - Fraction stromale des cancers. Selon un second aspect de l'invention, qui peut 20 s'utiliser indépendamment de celui décrit ci-dessus, on effectue une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, scannée à une résolution de, par exemple, 2700 points par pouce, avec des conditions d'acquisition prédéterminées, c'est-à-dire parfaitement définies, pour déterminer automatiquement la fraction de surface de stroma fibro-nourricier (ou inversement la fraction de cellules tumorales) dans cette tumeur. Le marquage du stroma est, dans une réalisation, obtenu au préalable par action prolongée d'un colorant 30 histochimique jaune, le safran, en solution alcoolique saturée. La contre coloration du tissu est obtenue par une laque d'hématoxyline qui colore en particulier les noyaux des cellules cancéreuses en bleu. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de 35 l'image, de préférence, on choisit une des composantes de couleur, par exemple la composante bleue, pour lequel il offre un bon contraste, et on lui applique un seuil fixe. La seule étape interactive, c'est-à-dire manuelle, qui peut intervenir à ce niveau est celle du dessin des limites du tissu tumoral 5 lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables de mucus, de nécrose ou des artéfacts de préparation, tels que des plis de la coupe. On caractérise et on isole les zones de stroma par traitement d'images comme des plages de couleur jaune. A cette 10 f in, on applique un double seuil sur une image de teinte de l'espace couleur HSI (" Hue ", c'est-àdire teinte, Saturation, Intensité) qui ne conserve que les couleurs du spectre allant du rouge au jaune. Les pixels de stroma ainsi isolés seront ensuite dénombrés et rapportés au nombre de pixels de la totalité de la 15 zone d'intérêt correspondant au tissu tumoral. Ce rapport constitue une estimation de la fraction de stroma tumoral. - Marqueurs cellulaires, et en particulier marqueurs localisés dans les noyaux: Selon un troisième aspect de l'invention, qui peut 20 s'utiliser indépendamment de ceux décrits ci-dessus, on effectue une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, scannée à une résolution de, par exemple, 4000 points par pouce, avec des conditions d'acquisition définies, pour déterminer automatiquement la 25 fraction de cellules tumorales ou de noyaux de cellules tumorales marqués par la présence d'une substance particulière dans cette tumeur. La molécule recherchée est, par exemple, une protéine associée à la prolifération, un récepteur d'oestrogènes ou de 30 progestérone, ou une protéine de différenciation cellulaire à localisation cytoplasmique ou membranaire. Le marquage de cette molécule est obtenu au préalable par action d'un anticorps spécifique, dont le site de fixation est mis en évidence, dans l'exemple, par une réaction enzymatique colorée dont la 35 coloration brune finale est due à la diaminobenzidine. La contre coloration du tissu est alors obtenue, dans cette réalisation, par une laque d'hématoxyline qui colore en particulier les noyaux des cellules en bleu. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de 5 l'image, de préférence, on choisit une des composantes de couleur pour lequel il offre un bon contraste et on lui applique un seuil fixe. Dans l'exemple, la composante de couleur sélectionnée est le vert. La seule étape interactive (manuelle) qui peut intervenir à ce niveau est celle du dessin des limites 10 du tissu tumoral lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables tels des artéfacts de préparation, notamment des plis de la coupe. On cherche ensuite à distinguer les cellules cancéreuses du stroma au sein de la tumeur, pour ne rapporter 15 ultérieurement le marquage qu'à ces seules cellules cancéreuses. On procède pour cela en trois étapes: - On tronque les valeurs hautes dans l'histogramme de l'image en couleur, puis on redynamise cet histogramme sur l'échelle de 0 à une valeur maximale, par exemple 255, afin de 20 blanchir la composante stromale. - On recherche la valeur optimale permettant de séparer le stroma des cellules cancéreuses en appliquant un seuillage automatique adaptatif, basé sur le calcul du moment de la distribution des valeurs de gris de l'image dans la région 25 d'intérêt représentée seulement par le tissu et, de préférence, contraint à se situer entre environ 33 et environ 90% de ces valeurs. - On applique ce seuil sur la totalité de l'image pour générer une image binaire des seules cellules cancéreuses. On cherche ensuite à distinguer, les cellules ou les noyaux de cellules qui ont été marqués en brun-violet par le marqueur immunohistochimique par rapport aux structures non marquées présentant une couleur bleue. A cet effet, selon une première réalisation, on fixe 35 un double seuil sur l'image de teinte de l'espace couleur HSI qui ne conserve que les couleurs du spectre allant du violet au rouge. On complète cette opération en conservant également les valeurs négatives d'une image " Excès de Bleu " résultant de 5 la soustraction de la somme des images rouge et verte au double de la composante bleue. Cette dernière opération permet de détecter les pixels bruns. Après ces diverses opérations, on peut déterminer de façon automatique le rapport entre les surfaces correspondant 10 aux cellules marquées, et la surface des cellules cancéreuses sur la totalité de la section de tumeur et dans les zones de plus forte concentration ou zones de " hot spots ". Pour identifier ou localiser les zones d'intérêt ou " hot spots ", correspondant à une agrégation de cellules 15 marquées sur une surface au moins égale à la taille d'un champ microscopique classiquement observé par les pathologistes (900 pn2), on détermine les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 pm. Cette distance correspond sensiblement au diamètre d'une 20 cellule. Dans ce cas, le paramètre à mesurer sur ces zones d'intérêt sera le rapport moyen et maximal de la surface des cellules marquées à la surface de la totalité des cellules tumorales. Ainsi, l'invention concerne, selon un premier aspect, un procédé de détermination de données numériques relatives à une tumeur cancéreuse, dans lequel on numérise, par exemple à l'aide d'un scanner de diapositives haute résolution, un échantillon coloré par immunohistochimie, en vue de rechercher 30 des marqueurs de différenciation ou de prolifération des cellules tumorales, qui est caractérisé en ce qu'on fait subir à l'image numérisée de la totalité de la coupe tumorale, un traitement comprenant les étapes suivantes: - on sépare le fond du tissu par comparaison de 35 l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels, avec un seuil, les pixels d'un côté du seuil correspondant au fond, par exemple les pixels de plus grande intensité, et les pixels d'intensité inférieure au seuil correspondant à l'épithélium et au stroma, - on établit un histogramme de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels du tissu et, dans cet histogramme, on détermine un seuil de séparation en intensité correspondant sensiblement à un minimum de l'histogramme, et on identifie les pixels se trouvant d'un côté du 10 seuil comme correspondant au stroma et on identifie les pixels se trouvant de l'autre côté du seuil comme correspondant à l'épithélium, les pixels du stroma ayant, par exemple, les intensités les plus élevées. De préférence, pour augmenter le contraste, on affecte 15 au fond, qui correspond aux plus grandes valeurs de luminance, la valeur maximale de luminance de façon à ce que les luminances correspondant à l'épithélium et au stroma, occupent toute la dynamique restante. Dans une réalisation, on limite la zone de recherche 20 du minimum d'intensité entre la zone d'épithélium et la zone de stroma en éliminant de cette zone de recherche, les valeurs les plus faibles et les valeurs les plus élevées d'intensité. Dans ce cas, la zone de recherche du minimum peut être limitée aux valeurs d'intensité comprises entre environ 33 à 90 % de la zone 25 d'intensité dans laquelle se trouvent l'épithélium et le stroma. Selon un mode de réalisation dans l'épithélium tumoral détecté, on identifie les noyaux des cellules marquées par détection de la différence de couleur entre les noyaux marqués et les noyaux non marqués. Dans ce cas, on peut coder les teintes de couleurs et les noyaux des cellules marquées sont alors identifiées comme étant celles se trouvant dans une gamme prédéterminée de teintes, la gamme de teintes étant comprise, par exemple, entre 4,3 et 6. On peut affecter à chaque pixel de l'épithélium tumoral une fonction de l'intensité de chaque composante de couleur afin que cette fonction ait un signe déterminé pour les noyaux des cellules marquées et le signe opposé pour les noyaux des cellules non marquées. Dans un exemple, les cellules non marquées présentent une couleur bleue et la fonction est le double de l'intensité de la composante bleue duquel on soustrait, d'une part, l'intensité correspondant au rouge et, d'autre part, l'intensité correspondant au vert. Dans une réalisation, on identifie les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 pm et dont la surface est au moins égale à un seuil prédéterminé de préférence de l'ordre de 900 pm2. L'invention concerne aussi un procédé dans lequel, pour déterminer des paramètres relatifs aux vaisseaux sanguins dans une tumeur, on effectue un traitement d'une image numérisée d'une section complète de tumeur qui comporte les étapes suivantes: - on détecte les tissus tumoraux, - on élimine les nécroses, - on détecte les structures immunomarquées, et - on identifie et on localise des zones de concentration. Pour identifier le tissu tumoral, on peut choisir une composante de couleur, ou une combinaison de composantes de couleurs, correspondant au tissu, les pixels correspondant au tissu étant ceux pour lesquels l'intensité de cette composante ou combinaison de composantes, dépasse un seuil prédéterminé. Pour éliminer les zones de nécrose, selon une réalisation, on isole les zones qui n'ont pas une composante prédominante de couleur correspondant au tissu, par exemple les zones qui n'ont pas de couleur prédominante bleue. Dans ce cas, pour détecter les zones de nécrose, à 35 chaque pixel on peut affecter une fonction de l'intensité de chaque composante de couleurs afin que les zones de nécrose correspondent à un signe déterminé de cette fonction et les autres zones correspondent au signe opposé. Dans une réalisation, les zones de nécrose ne sont 5 identifiées que pour les plages individuelles dont la surface dépasse un seuil de taille prédéterminée. Les plages de surface inférieure au seuil sont, par exemple, éliminées par une opération de morphologie mathématique qui comprend une érosion suivie d'une dilatation géodésique. Dans une réalisation, pour détecter des vaisseaux sanguins dans une tumeur, on détecte, d'une part, les contours plus sombres que l'environnement dans une composante de couleur déterminée, par exemple le bleu, on détecte les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux, et on 15 identifie les vaisseaux comme étant les structures sombres comportant au moins une zone colorée correspondant au marquage recherché. Les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux sont, par exemple, détectées par comparaison 20 à un seuil appliqué sur une image résultant d'une translation de couleur et/ou par sélection d'une gamme de teintes. De préférence, on détecte les zones de concentration dans lesquelles les vaisseaux sont séparés par une distance au plus égale à environ 200 pm et qui présentent une superficie au 25 moins égale à 900 pM2 environ. L'invention concerne aussi un procédé dans lequel, pour déterminer, dans une tumeur, la fraction de surface de stroma fibro-nourricier, ou la fraction de cellules tumorales, on détecte les zones de stroma par identification de leur 30 couleur, les zones de stroma correspondant aux pixels dont l'image de teinte est comprise dans une gamme prédéterminée, par exemple les couleurs du spectre allant du rouge au jaune. Le marquage du stroma peut être obtenu par l'action prolongée d'un colorant histochimique jaune, tel que le safran, 35 en solution alcoolique saturée, et la contre-coloration du tissu peut être obtenue par une laque d'hématoxiline qui colore les noyaux des cellules cancéreuses en bleu. Quel que soit son mode de réalisation, les images numérisées présentent de préférence des millions de couleurs et sont codées sur 24 bits et sont non compressées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront avec la description de certains de ses modes de réalisation, celle-ci étant effectuée en se référant aux dessins ci-annexés sur lesquels: - La figure 1 montre un détail d'une image d'une tumeur, - la figure 2 est un diagramme illustrant une étape du procédé selon l'invention. La figure 1 représente un détail de la composante 15 verte de l'image couleur obtenue à l'aide d'un scanner de diapositives de la coupe d'un cancer de l'ovaire. On distingue sur ce détail d'image, d'une part, un fond clair 10 qui ne contient pas d'informations utiles pour le pathologiste, d'autre part, une zone 12 de stroma nourricier du cancer et, d'autre 20 part, enfin, des zones sombres 14 d'épithélium (tissu) cancéreux. Un premier aspect du procédé de traitement d'image conforme à l'invention est basé sur les valeurs distinctes de luminance qu'on peut attribuer au fond, au stroma et à 25 l'épithélium cancéreux. La figure 2 est un histogramme sur lequel on a porté en abscisses des valeurs de luminance, valeurs de gris codées de 0 à 255 (8 bits) et, en ordonnées, la fréquence, c'est-à-dire le nombre de pixels qui présentent chaque valeur de luminance (ou 30 intensité) de la composante verte de l'image couleur. Sur ce diagramme, on peut distinguer trois zones. La première zone 16 de fond correspond aux luminances comprises entre 240 et 255. La seconde zone 18 correspond au stroma, les luminances étant comprises entre environ 200 et 240 dans cet exemple. Enfin la troisième zone 20 pour laquelle les valeurs de luminance sont inférieures à 200, correspond à l'épithélium cancéreux. Etant donné que le fond présente une accumulation de pixels à proximité de la valeur de luminance 255, les pixels du 5 fond peuvent être aisément séparés du reste des autres pixels à l'aide d'un simple seuil. Ainsi, dans l'exemple, on considère que tous les pixels de luminance supérieure ou égale à 230 correspondent au fond. Pour augmenter le contraste de l'image couleur, afin 10 de pouvoir mieux distinguer le stroma de l'épithélium tumoral, on affecte la valeur de luminance maximale (255) aux pixels dont la luminance initiale est comprise entre 235 et 255 sur les trois composantes de couleur: rouge, verte et bleue et on recalcule les valeurs de luminance des pixels restants de façon 15 à ce qu'ils occupent toute la dynamique, c'est-àdire que leur luminance soit comprise entre 0 et 255. Après transformation de l'histogramme de cette manière pour distinguer l'épithélium tumoral du stroma, on recherche le minimum de luminance entre les zones 20 et 18. Dans une réalisation, pour s'adapter à tous les types d'images, les proportions relatives de stroma, de cellules cancéreuses et de fond étant variables, on limite la zone d'exploration aux valeurs comprises entre 33et 90 % de la distribution des valeurs de luminance de la composante verte de 25 l'image en couleur et on ne calcule la valeur du seuil automatique par moment, qu'à la seule région de tissu tumoral identifiée au départ. Le seuil obtenu sera par contre appliqué à la totalité de l'image. Après identification de l'épithélium tumoral, il est 30 nécessaire, pour fournir une estimation du rapport de la surface occupée par les cellules cancéreuses marquées par immunohistochimie, sur la totalité de l'épithélium, de détecter les cellules marquées. Dans l'exemple, les noyaux des cellules présentent une couleur brun-violet alors que les noyaux non marqués présentent une couleur bleue. Dans l'exemple, on procède comme décrit ci-dessus, à savoir qu'on combine un procédé d'établissement d'un seuil sur une image de teinte et d'un autre seuil établi sur le résultat d'une translation des composantes de couleurs. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de données numériques relatives à une tumeur cancéreuse, dans lequel on numérise, par exemple à l'aide d'un scanner de diapositives haute résolution, un échantillon coloré par immunohistochimie, en vue de 5 rechercher des marqueurs de différenciation ou de prolifération des cellules tumorales, caractérisé en ce qu'on fait subir à l'image numérisée de la totalité de la coupe tumorale, un traitement comprenant les étapes suivantes: - on sépare le fond (10) du tissu par comparaison de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels, avec un seuil, les pixels (16) d'un côté du seuil correspondant au fond, par exemple les pixels de plus grande intensité, et les pixels (18, 20) d'intensité inférieure au seuil correspondant à 15 l'épithélium et au stroma, - on établit un histogramme de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels du tissu et, dans cet histogramme, on détermine un seuil de séparation en intensité correspondant sensiblement à un minimum de l'histogramme, et - on identifie les pixels se trouvant d'un côté du seuil comme correspondant au stroma et on identifie les pixels se trouvant de l'autre côté du seuil comme correspondant à l'épithélium, les pixels du stroma ayant, par exemple, les intensités les plus élevées. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que, pour augmenter le contraste, on affecte au fond, qui correspond aux plus grandes valeurs de luminance, la valeur maximale de luminance de façon à ce que les luminances correspondant à l'épithélium et au stroma, occupent toute la 30 dynamique restante. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'on limite la zone de recherche du minimum d'intensité entre la zone d'épithélium et la zone de stroma en éliminant de cette zone de recherche, les valeurs les plus faibles et les valeurs les plus élevées d'intensité. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la zone de recherche du minimum est limitée aux valeurs 5 d'intensité comprises entre environ 33 à 90 % de la zone d'intensité dans laquelle se trouvent l'épithélium et le stroma. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans l'épithélium tumoral détecté, on identifie les noyaux des cellules marquées par détection de la 10 différence de couleur entre les noyaux marqués et les noyaux non marqués. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'on code les teintes de couleurs et en ce que les noyaux des cellules marquées sont identifiées comme étant celles se 15 trouvant dans une gamme prédéterminée de teintes. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules marquées ayant la couleur violette, la gamme de teintes est comprise entre 4,3 et 6. 8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7 20 caractérisé en ce qu'on affecte à chaque pixel de l'épithélium tumoral une fonction de l'intensité de chaque composante de couleur afin que cette fonction ait un signe déterminé pour les noyaux des cellules marquées et le signe opposé pour les noyaux des cellules non marquées. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les cellules non marquées présentant une couleur bleue, la fonction est le double de l'intensité de la composante bleue duquel on soustrait, d'une part, l'intensité correspondant au rouge et, d'autre part, l'intensité correspondant au vert. 10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'on identifie les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 pm et dont la surface est au moins égale à un seuil prédéterminé de préférence de l'ordre de 900 pM2. il. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que pour déterminer des paramètres relatifs aux vaisseaux sanguins dans une tumeur, on effectue un traitement d'une image numérisée d'une section complète de tumeur qui comporte les étapes suivantes - on détecte les tissus tumoraux, - on élimine les nécroses, - on détecte les structures immunomarquées, et - on identifie et on localise des zones de 10 concentration. 12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que pour identifier le tissu tumoral, on choisit une composante de couleur, ou une combinaison de composantes de couleurs, correspondant au tissu, les pixels correspondant au 15 tissu étant ceux pour lesquels l'intensité de cette composante ou combinaison de composantes, dépasse un seuil prédéterminé. 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce que, pour éliminer les zones de nécrose, on isole les zones qui n'ont pas une composante prédominante de 20 couleur correspondant au tissu, par exemple les zones qui n'ont pas de couleur prédominante bleue. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que, pour détecter les zones de nécrose, à chaque pixel on affecte une fonction de l'intensité de chaque composante de 25 couleurs afin que les zones de nécrose correspondent à un signe déterminé de cette fonction et les autres zones correspondent au signe oppose. 15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que les zones de nécrose ne sont identifiées 30 que pour les plages individuelles dont la surface dépasse un seuil de taille prédéterminée. 16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que les plages de surface inférieure au seuil sont éliminées par une opération de morphologie mathématique qui comprend une 35 érosion suivie d'une dilatation géodésique. 17. Procédé selon l'une des revendications 11 à 16 caractérisé en ce que pour détecter des vaisseaux sanguins dans une tumeur, on détecte, d'une part, les contours plus sombres que l'environnement dans une composante de couleur déterminée, 5 par exemple le bleu, on détecte les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux, et on identifie les vaisseaux comme étant les structures sombres comportant au moins une zone colorée correspondant au marquage recherché. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en 10 ce que les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux sont détectées par comparaison à un seuil appliqué sur une image résultant d'une translation de couleur et/ou par sélection d'une gamme de teintes. 19. Procédé selon l'une des revendications 11 à 18 15 caractérisé en ce qu'on détecte les zones de concentration dans lesquelles les vaisseaux sont séparés par une distance au plus égale à environ 200 pm et qui présentent une superficie au moins égale à 900 pM2 environ. 20. Procédé selon l'une des revendications 20 précédentes caractérisé en ce que pour déterminer, dans une tumeur, la fraction de surface de stroma fibro-nourricier, ou la fraction de cellules tumorales, on détecte les zones de stroma par identification de leur couleur, les zones de stroma correspondant aux pixels dont l'image de teinte est comprise 25 dans une gamme prédéterminée, par exemple les couleurs du spectre allant du rouge au jaune. 21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que le marquage du stroma est obtenu par l'action prolongée d'un colorant histochimique jaune, tel que le safran, en 30 solution alcoolique saturée, et en ce que la contre-coloration du tissu est obtenue par une laque d'hématoxiline qui colore les noyaux des cellules cancéreuses en bleu. 22. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les images numérisées présentent des millions de couleurs, sont codées sur 24 bits et sont non compressées.