Brevet FR2854239A1 — publié le 20041029

PROCEDE DE PREPARATION D'UN REACTIF DE COLORATION bE CELLULES ET REACTIF OBTENU La présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle ainsi que le réactif obtenu. On sait que l'observation au microscope nécessite une coloration qui permet de différencier les différentes cellules ou parties de cellules. Depuis de très nombreuses années, des réactifs sont utilisés de façon continue et commercialisés sans qu'ils aient été modifiés, ce sont les réactifs connus sous les noms de MGG, May-Grunwald Giemsa. be fait, l'analyse devenant de plus en plus pointue, les spécialistes de 10 l'interprétation souhaitent disposer de colorants plus performants en terme de définition, de contraste et de différentiation, plus faciles à utiliser et plus stables. Ces colorants se présentent sous forme de deux composés avec une composition connue et généralement appliquée: - May-Grunwald réalisé à partir de poudre de bleu de méthylène-éosine à 0,30 9 dilués dans 100 9 de méthanol, et - Giemsa réalisé à partir de poudres de bleu Azur II-éosine 3,0 9 et d'Azur II 0,8 9 dilué dans 375 9 de méthanol avec 125 9 de glycérine. Afin de réaliser une analyse, le praticien procède à un trempé d'une lame portant 20 les cellules à observer dans la première solution puis dans le réactif dilué avec de l'eau tamponnée, généralement au 1/2. La lame est à son tour trempée dans la seconde solution, généralement diluée entre 1/20 et 1/30 avec de l'eau tamponnée, puis rincée et séchée. On constate qu'il est nécessaire de réaliser deux opérations, ce qui prend du temps et nécessite une certaine application. Quant à la solution diluée avec de l'eau tamponée, elle reste instable et doit être utilisée rapidement. On sait aussi que le méthanol est un produit dont il est souhaitable de diminuer les quantités utilisées. On obtient alors des colorations connues de tous les praticiens qui font que ce 10 colorant MGG est devenu un standard, ceci afin de permettre des comparaisons. Il est nécessaire de conserver cette reproductibilité et d'établir un standard. Néanmoins, il est nécessaire de le faire évoluer afin d'améliorer la praticité mais aussi les performances, ce qui n'a jamais été réalisé. Le but recherché dans une bonne coloration est la différentiation de tous les 15 éléments cellulaires, notamment granulations éosinophiles, basophiles, neutrophiles, noyaux, cytoplasmes. Il s'agit aussi d'obtenir le meilleur contraste entre les globules blancs, les globules rouges et les plaquettes afin de faciliter la lecture de la lame. Il est important qu'il ne persiste pas de dépôts de colorants après le rinçage de 20 la lame. Ce sont les cytoplasmes qui sont parmi les éléments dont les couleurs sont els moins nuancées. Or il serait souhaitable de disposer d'une forte différenciation entre les divers types de cytoplasmes de façon à mettre en avant leurs structures. De même, avec le colorant MGG, les hématies apparaissent en couleur grisbeige au lieu d'un rouge clair, ce qui rend les contrastes moins nets, notamment pour la détection de parasites, mais aussi moins nets vis-à-vis des autres types cellulaires. De plus, l'amélioration de la stabilité de la solution est un objectif de la composition selon la présente invention. Il est important qu'il ne se produise pas de décantation avec le réactif selon la présente invention alors que de telles dépôts pouvaient apparaître dans les produits de l'art antérieur. La fabrication du réactif de l'art antérieur est de plus réalisée généralement en température, pour assurer une dilution satisfaisante, de l'ordre de 40C. Ce réactif de l'art antérieur présente aussi d'autres inconvénients lors de la fabrication et notamment celui de rendre difficile la filtration finale. La glycérine peut engendrer des colmatages des filtres lors de cette opération. 10 La présence de glycérine rend également plus difficiles les rinçages des lames. Enfin, il convient d'obtenir toujours une même coloration pour les mêmes éléments afin de pouvoir réaliser des comparaisons d'images réalisées à partir de lames colorées. La reproductibilité est essentielle. La composition selon la présente invention est maintenant décrite et les images 15 annexées permettent de récapituler les résultats montrant les améliorations des paramètres significatifs. Ainsi, sur les dessins annexés les différentes figures montrent: - figure 1A: une image d'hématies avec les colorants de l'art antérieur, - figure 1B: une image de granulations neutrophiles avec les colorants de 20 l'art antérieur, - figure 1C: une image de noyaux lymphocytes avec les colorants de l'art antérieur, - figure ltb: une image de cytoplasmes lymphocytes avec les colorants de l'art antérieur, - figure lE: une image de cytoplasmes monocytes avec les colorants de l'art antérieur, - figure 1F: une image de granulations polynucléaires éosinophiles avec les colorants de l'art antérieur, - figure 1G: une image de granulations polynucléaires basophiles avec les colorants de l'art antérieur, - figure 2A: une image d'hématies avec le colorant selon la présente invention, - figure 2B: une image de granulations neutrophiles avec le colorant selon la présente invention, - figure 2C: une image de noyaux lymphocytes avec le colorant selon la présente invention, - figures 2D: une image cytoplasmes lymphocytes avec le colorant selon la 10 présente invention, - figure 2E: une image de cytoplasmes monocytes avec le colorant selon la présente invention, - figure 2F: une image de granulations polynucléaires éosinophiles avec le colorant selon la présente invention figures - figure 2G: une image de granulations polynucléaires basophiles avec le colorant selon la présente invention, Le réactif selon la présente invention utilise comme composés colorants dans les bleus l'Azur I et éventuellement le bleu de méthylène et dans les rouges l'éosine et éventuellement l'érythrosine. Le procédé consiste à diluer les poudres de chacune des couleurs bleu et rouge dans un même volume de solvant, en l'occurrence le bMSO, diméthylsulfoxide. Les quantités sont données pour être diluées dans une quantité de 62,5 ml de bMSO pour chacune des couleurs. On prépare la composition dans le bleu avec de L'Azur I dosé entre 0,400 9 et 25 1,500 g, plus particulièrement entre 0,500 et 1,000 g Si du bleu de méthylène est ajouté, il est dosé dans la même plage. On prépare la composition dans le rouge avec de l'éosine, dont le dosage est compris entre 0,0100 et 0,1000 g, plus particulièrement 0,0300 et 0, 0800 g. Si la composition intègre de l'érythrosine, sel disodique de tétraiodofluorescéine, elle l'est à raison de 0,0100 à 0,1000 9, plus particulièrement à raison de 0,05 et 0,08 g. Selon le procédé, chacune de ces deux compositions est diluée ensuite dans du 5 méthanol en quantité suffisante pour réaliser un volume d'une composition unique de 500 ml de réactif. On constate que ce réactif permet une excellente dissolution car il n'y a pas de phase avec glycérine et également une excellente stabilité. La dissolution de chacun des composés ne pose pas de problème car elle ne 10 génère pas de complexes. Elle se déroule à température ambiante sans nécessiter de mise en température même faible. On peut donc ainsi réaliser différents produits issus de ce même procédé en utilisant les différents composés dans les plages indiquées notamment à savoir: 15 Azur I / éosine / bMSO / méthanol Azur I - bleu de méthylène / éosine / )MSO / méthanol Azur I - bleu de méthylène / éosine- érythrosine / DMSO / méthanol Azur I / éosine - érythrosine / I)MSO / méthanol. Selon un perfectionnement de l'invention, on ajoute une quantité comprise entre 20 0,05 et 1,000 g pour un volume final de réactif de 500 ml d'un composé appartenant à la famille des thiamines, différent de l'azur I ou du bleu de méthylène, pour augmenter le contraste notamment. La mise en oeuvre de ce réactif consiste généralement à immerger une lame portant des cellules dans le réactif pur puis à la placer dans du réactif dilué avec 25 de l'eau tamponnée, à la rincer et à la sécher pour en permettre l'observation. Les résultats comparatifs qui sont regroupés dans le tableau suivant montrent les variations des différents paramètres, ceci pour des mêmes échantillons cellulaires et dans des mêmes conditions d'analyse et d'interprétation. Résultats obtenus avec les réactifs de l'art antérieur MGG: Nb mesures May-Grûnwald Giemsa Couleur L Densité Optique Moyenne kmax (nm) Hématies Gris-Beige 5 0,38 527 Polynucléaires cytoplasmes Rose 0,34 525 neutrophiles granulations Rose Polynucléaires cytoplasmes Oui éosinophiles visibles ? Bleuté granulations Rose-Orangé 5 1,08 527 Polynucléaires granulations Oui 0,51 538 basophiles existence ? Violet foncé Monocytes cytoplasmes Bleuté 5 0,28 534 Ls cytoplasmes Bleu 5 0,33 544 Lymphocytes noyaux Violet-rose 5 1,52 544 Oui fort Plaquettes visibles? - - contraste Les mesures sont effectuées sur des zones sensiblement identiques. Quant au maximum de chaque courbe, il correspond à l'intensité donc à la saturation de la couleur. Les lames portant les cellules telles qu'utilisées sont réalisées de façon 10 identique et utilisées également dans les mêmes conditions de température et d'éclairage pour permettre une comparaison objective. Résultats obtenus avec le réactif selon la présente invention: Réactif selon l'invention Couleur Nb mesures Densité Optique Xmax (nm) - Hématies Rouge clair 5 0,5 531 cytoplasmes Polynucléaires cytoplasmes Rose-rouge + granulations 10 0,42 539 neutrophiles granulations Rose cytoplasmes Oui Polynucléaires cytoplasmes Oui- - visibles ? Bleuté éosinophiles granulations Rose 5 1,05 529 Oui++++ Polynucléaires Existence Violet très 1,12 555 basophiles granulations ? foncé / Violetnoir Bleuté Monocytes cytoplasmes 5 0,39 555 bleu-violacé cytoplasmes Bleu Azur 5 0,58 555 Lymphocytes cytoplasmes LGL Bleu violet clair - - noyaux Violet-rose 5 1,58 555 Plaquettes Visibles ? oui - - - On montre bien là une augmentation des différenciations colorées. On note particulièrement que lorsqu'il y a des polynucléaires basophiles, ils sont de couleur violet foncé, presque noir avec une très bonne définition. De même, la couleur des hématies est rouge clair et non plus beige rose. Le bleu azur des cytoplasmes des Iymphocytes est particulièrement discriminant. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, caractérisé en ce que en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - préparation d'une première composition en diluant au moins un colorent bleu, l'azur I dans un solvant adapté, préparation d'une seconde composition en diluant au moins un colorant rouge, l'éosine dans le même solvant que celui de la première composition, et - associer ces deux compositions dans du méthanol pour obtenir un 10 réactif unique. 2. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à la première préparation un second colorant bleu, le bleu de méthylène. 3. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter à la première préparation un second colorant rouge, l' érythrosine. 4. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, 20 notamment pour le sang et la moelle selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant des première et seconde préparations est le diméthylsulfoxide. 5. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute au réactif un composé de la famille des thiamines, différent de l'azur I et du bleu de méthylène. 6. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins de 0,400 à 1,500 g d'azur I, et - au moins de 0,010 à 0,100 g d'éosine, pour une quantité finale de réactif de 500 ml. 7. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, 10 selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins de 0,500 à 1,000 g d'azur I, et - de 0,030 à 0,080 g d'éosine, pour une quantité finale de réactif de 500 ml. 8. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, 15 obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend: - de 0,400 à 1,500 g d'azur I, - de 0,400 à 1,500 g de bleu de méthylène, - de 0,010 à 0,100 g d'éosine, et 20 - de 0,010 à 1,000 g d'érythrosine, pour une quantité finale de réactif de 500 ml. 9. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend - de 0,500 à 1,000 9 d'azur I, - de 0,500 à 1,000 9 de bleu de méthylène, - de 0,030 à 0,080 g d'éosine, et - de 0,050 à 0,080 9 d'érythrosine, pour une quantité finale de réactif de 500 ml. 2854239 10 10. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,010 à 1,000 9 d'un composé de la famille des thiamines différent de l'azur I ou du bleu de méthylène.