Brevet FR2858976A1 — publié le 20050225

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides à protection uréthane. Le nouveau procédé permet la synthèse de N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides à protection uréthane à partir de N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides en présence d'une quantité catalytique de triéthylène-diamine, sans ajout de base de type amine tertiaire en quantités importantes. Les N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides (ci-après dénommés sous l'abréviation NCAs), éventuellement protégés, sont des agents d'acylation fréquemment utilisés pour la formation de polyalpha-aminoacides à haut poids moléculaire et pour la production de dipeptides. Les NCAs sont des composés très réactifs, qui ne forment pas, par réarrangement notamment, de produits secondaires indésirés et dont l'unique sous-produit de réaction est le dioxyde de carbone. Une fois que le NCA est mis à réagir avec une fonction amine libre d'un acide aminé, du dioxyde de carbone est immédiatement libéré et il se forme un dipeptide, contenant lui aussi une fonction amine libre. Cette amine va réagir avec le NCA pour former un tripeptide et ainsi de suite. Les NCAs peuvent ainsi être utilisés dans la formation de poly(alpha aminoacides) mais ils ne peuvent pas être utilisés facilement dans la synthèse séquentielle de polypeptides, les réactions secondaires multiples de condensation, telles qu'une oligomérisation, étant difficiles à contrôler. Des N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides substitués par des groupements uréthane ont été décrits dans la littérature, ils sont utilisés dans les synthèses peptidiques. Le substituant uréthane apporte un haut degré de protection et il permet de minimiser les réactions de polymérisation durant la réaction de couplage. Les NCAs à protection uréthane, ci-après abrégés UNCAs, présentent tous les avantages des NCAs non substitués sans les inconvénients de ces derniers. Les UNCAs permettent une synthèse contrôlée de polypeptides sans qu'une pré-activation des groupements carboxyles ne soit nécessaire et sans que l'ajout d'additifs, tels que le N-hydroxybenzotriazole, ne soit nécessaire. Ainsi, la purification des peptides préparés en solution est facilitée, étant donné que le seul sous-produit de la réaction de synthèse peptidique est le dioxyde de carbone. Les UNCAs sont également très utiles en tant que matières premières dans la synthèse d'hormones ou de médicaments anti-sida. Les UNCAs, qui sont sous forme cristalline dans des conditions de températures et de pression ambiantes, sont stables sous les conditions standard de manipulation au laboratoire, au stockage, et sous les conditions de synthèse peptidique. Les deux voies de synthèse principales des UNCAs à partir de NCAs sont les suivantes: 1) Les UNCAs peuvent être synthétisés par condensation d'un chloroformiate d'alkyle ou d'aralkyle, tel que le Fmoc-Cl (le chloroformiate de 9-fluorènylméthyloxycarbonyle) ou le chloroformiate de benzyle, avec un NCA en présence d'une quantité au moins stoechiométrique d'une amine tertiaire. Cette amine tertiaire, qui est classiquement la Nméthylmorpholine, permet de piéger l'acide chlorhydrique libéré. Le NCA est ainsi mis en solution dans un solvant inerte, tel que le THF, et refroidi. 1,1 à 1,3 équivalent de chloroformiate d'alkyle ou d'aralkyle est ajouté en une seule fois puis au moins 1,5 équivalent d'une amine tertiaire, la N-méthylmorpholine par exemple, est ajouté lentement. La suspension résultante est laissée reposer 1 à 2 heures, à une température comprise entre 25 et 5 C. Ensuite de l'acide chlorhydrique dissous dans du dioxane est ajouté doucement jusqu'à l'obtention de valeurs de pH d'environ 4-5. Le chlorhydrate de l'amine tertiaire ainsi formé est éliminé par filtration et le UNCA est concentré puis cristallisé. Toutes les étapes du procédé sont réalisées sous atmosphère inerte (N2) et tous les solvants sont séchés sur tamis moléculaire 4 À avant d'être utilisés (William D. Fuller et al, Urethane-protected-alpha-amino acid Ncarboxyanhydrides and peptide synthesis, Biopolymers, 1996, 40, 183-205). Cette voie de synthèse est peu appropriée pour préparer certains Ncarboxyanhydrides d'alpha-aminoacides protégés, notamment ceux protégés par un radical t-butoxylcarbonyle, le chloroformiate de t-butyle étant très instable au dessus de -20 C ou en présence d'amines tertiaires. 2) Les UNCAs peuvent également être synthétisés par condensation d'un dicarbonate de dialkyle avec un NCA. Cette réaction libère une molécule d'alcool et une molécule de dioxyde de carbone. Cette synthèse doit impérativement être effectuée en présence d'une quantité élevée, au moins 50% molaire par rapport à la quantité molaire de NCA engagée, d'une amine tertiaire telle que la N-méthylmorpholine associée à une quantité catalytique de DMAP (4-diméthylaminopyridine) ou une pyridine (William D. Fuller et al, Urethane-protected-alpha-amino acid N-carboxyanhydrides and peptide synthesis, Biopolymers, 1996, 40, 183-205). Cette voie de synthèse est particulièrement adaptée à la synthèse de N- carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides protégés par un radical t- butoxylcarbonyle en utilisant le ditertiobutyldicarbonate. La demande WO89/08643 décrit des N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides et des N-thiocarboxyanhydrides d'alpha-aminoacides à protection uréthane, de formule, R' o dans laquelle R et R' représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle, cycloalkyle, cycloalkyle substitué par un radical alkyle substitué, aryle ou aryle substitué et au moins un groupement R ou R' ne représente pas un atome d'hydrogène; R" représente un radical alkyle, aryle, alkyle substitué ou aryle substitué ; Z représente un atome d'oxygène ou de soufre et n vaut 0, 1 ou 2. Ces composés sont préparés par réaction d'un NCA avec un halogénoformate dans un solvant inerte, tel que le toluène, dans des conditions anhydre, en présence d'une base de type amine tertiaire ajoutée en excès. Les procédés existants de synthèse de UNCAs ne sont pas satisfaisants. En effet, le meilleur procédé décrit ci-dessus, qui utilise une base de type amine tertiaire en quantité au moins égale à 50 % molaire par rapport à la quantité de NCA engagée, donne des rendements seulement d'environ 60 % à condition de sécher les solvants au tamis moléculaire 4 Â et d'opérer entre 20 et -15 C. Il a été découvert que, de façon surprenante, l'utilisation de triéthylène-diamine (TEDA) en quantité catalytique très faible, inférieure à 5% molaire par rapport à la quantité molaire de NCA engagée, sans ajout de base de type amine tertiaire, conduit à d'excellents résultats. Dans le cadre de la présente invention, l'abréviation NCA(s) désigne le(s) N-carboxyanhydride(s) d'alpha-aminoacide(s) et UNCA(s) désigne le(s) Ncarboxyanhydride(s) d'alpha-aminoacide(s) à protection uréthane. Au sens de la présente invention, on entend par quantité catalytique, une quantité 10 nettement inférieure et plus précisément inférieure à 50% à celle requise par la stoechiométrie. La présente invention concerne un procédé d'obtention de Ncarboxyanhydrides d'alpha-aminoacides à protection uréthane (UNCAs), de formule I O Formule I R3 0 dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent ensemble ou indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou une chaîne latérale d'un alpha-aminoacide naturel ou synthétique éventuellement porteuse de groupements fonctionnels le cas échéant protégés; R3 représente un radical alkyle linéaire ou ramifié saturé ou insaturé en CI Clo ou un radical aralkyle ou alkaryle de 7 à 14 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'un N-carboxyanhydride d'alphaaminoacide (NCA) de formule II, Formule II dans laquelle RI et R2 ont la même signification que pour la formule I, est mis à réagir 25 avec au moins un équivalent, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II, de dicarbonate de formule III R3, R3 Formule III O O O dans laquelle R3 a la même signification que pour la formule I, en présence d'une quantité catalytique de 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, également dénommé triéthylènediamine (TEDA), par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II, dans un solvant organique inerte de point de fusion inférieur à environ -20 C. Un alpha-aminoacide naturel ou synthétique est acide aminé porteur sur le premier carbone de la chaîne d'une fonction amine et d'une fonction acide carboxylique. Le reste de l'alpha-aminoacide est appelé chaîne latérale de l'alpha-aminoacide. RI et R2 sont le cas échéant protégés par des groupements protecteurs habituellement utilisés dans le domaine des aminoacides et des peptides (Bodansky, principal of peptide synthesis, Springer-Verlag, 1984; Alpha amino-acids N-carboxyanhydrides and related heterocycles, Hans R. Kricherdorf). R1 et R2, identiques ou différents, représentent avantageusement un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 C8 linéaire ou ramifié comprenant éventuellement un ou plusieurs substituant(s) habituels dans le domaine des aminoacides et des peptides. Les substituants sont notamment choisis dans le groupe constitué par OH, SH, NH2, NHC(NH)NH2, CONH2, O-alkyle en C1-C6, 0-aryle en C6-C10, S-alkyle en C1-C6, COO-alkyle en C1-C6, COOaralkyle en C5-C8, notamment le radical ester benzylique. Un groupement Rl ou R2 peut avantageusement représenter un radical cycloalkyle en C5 C7 éventuellement substitué par un ou plusieurs groupement(s) habituel(s) dans le domaine des aminoacides et des peptides. Les substituants sont notamment choisis dans le groupe constitué par les halogènes, OH, 0-alkyle en C1-C6, 0-aryle en C6-C10, alkyle en C1-C6. Un groupement R1 ou R2 peut avantageusement représenter un radical phényle, naphtyle, hétéroaromatique à 5 ou 6 chaînons ou indole éventuellement substitué par un ou plusieurs groupement(s) habituels dans le domaine des aminoacides et des peptides. Les substituants sont notamment choisis dans le groupe constitué par les halogènes, OH, Oalkyle en C1-C6, 0-aryle en C6-C10, alkyle en C1-C6. Pour des raisons évidentes d'encombrements stériques, RI et R2 ne peuvent pas représenter simultanément un radical cyclique. Par radical cyclique, on entend ledit radical cycloalkyle en C5 C7 ainsi que ledit radical phényle, naphtyle, hétéroaromatique à 5 ou 6 chaînons ou indole. R1 et R2 peuvent également former ensemble un radical cycloalkyle en C5 C7 éventuellement substitué par un ou plusieurs groupement(s) habituels dans le domaine des aminoacides et des peptides. Les groupements sont notamment choisis dans le groupe constitué par les halogènes, OH, 0-alkyle en C1-C6, alkyle en C1-C6, 0-aryle en C6-C 1o. Dans le cas où R1 et R2 ne forment pas ensemble un radical cycloalkyle en C5-C7, avantageusement au moins un des groupements R1 et R2, tels que définis précédemment, représente un atome d'hydrogène. Dans les composés de formule II, les groupements fonctionnels sont avantageusement protégés par des groupes protecteurs adaptés. Selon une variante avantageuse de l'invention, R3 représente le radical méthyle, le radical éthyle, le radical tertio-butyle, le radical benzyle, le radical allyle ou le radical 9-fluorénylméthyle. En effet, bien qu'il existe une grande variété d'uréthanes qui peuvent être utilisés en tant que groupements protecteurs, seulement quelques uns de ces uréthanes sont largement utilisés dans la synthèse peptidique. On peut notamment citer le t-butyloxycarbonyle (Boc), le benzyloxycarbonyle (Cbz) et le 9fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). En conséquence, les Ncarboxyanhydrides d'alpha-aminoacides protégés par ces substituants sont particulièrement intéressants. Le procédé selon la présente invention permet d'éviter l'utilisation d'une amine tertiaire, en quantité très importante de 50 à 200 % molaire par rapport à la quantité molaire de NCA engagée. Les amines tertiaires utilisées dans l'art antérieur, la Nméthylmorpholine et la pyridine, posent en effet de nombreux problèmes. Notamment, leur utilisation implique un travail en haute dilution, la formation de produits parasites, une étape supplémentaire de séparation, un recyclage difficile et, de plus, elle est très coûteuse. Le procédé selon l'invention permet également de réduire de façon notable les durées de réactions qui sont désormais inférieures à 24 heures et avantageusement de l'ordre de 1 à 4 heures, alors que pour les procédés de l'art antérieur les durées de réaction variaient de 30 heures à 5 jours. Le procédé selon l'invention permet l'obtention de UNCAs, dont la pureté mesurée par GPC (chromatographie en phase gazeuse) est supérieure à 90%, avantageusement supérieure à 95%, avec un rendement très satisfaisant, supérieur à 60% en masse. Selon une variante avantageuse de l'invention, le solvant est choisi dans le groupe constitué des éthers, cycliques ou linéaires, en C4-C10 et des alcanes en C1 05 chlorés. Avantageusement, le solvant est le THF (tétrahydrofurane). Lorsque le solvant de la réaction est le THF, la quantité de solvant introduite est 10 généralement comprise entre 500 g et 2 kg de solvant pour une mole de NCA de formule II engagée. Selon une variante avantageuse du procédé selon la présente invention, la quantité introduite de TEDA varie de 0,1 à 5% molaire de TEDA, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. Encore plus avantageusement, la quantité introduite de TEDA varie de 0,2 % à 1 % molaire, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. Le NCA de formule II est avantageusement mis à réagir avec 1,1 à 1,5 équivalent de dicarbonate de formule III en présence de TEDA, en particulier en présence de 0,2 à 1% molaire de TEDA par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. Le dicarbonate de formule III est avantageusement introduit, sous forme de solution dans une partie du solvant, avantageusement dans 0,5 et 2,0 parts en poids par rapport à la quantité totale en poids de dicarbonate engagée, régulièrement dans le milieu réactionnel comprenant l'autre partie du solvant nécessaire, le NCA de formule II à transformer et le TEDA. Pendant l'introduction du dicarbonate la température du milieu réactionnel est maintenue entre -20 et 5 C, avantageusement entre -15 et 5 C, encore plus avantageusement entre -10 et 0 C. Selon une variante avantageuse de l'invention, la réaction a lieu sous atmosphère inerte. L'effet catalytique du TEDA autorise une technique d'introduction progressive du dicarbonate dans le milieu réactionnel, ce qui permet le contrôle de l'exothermicité par l'arrêt de l'introduction, évitant ainsi tout risque d'emballement réactionnel dangereux. Le procédé permet de travailler en milieu beaucoup plus concentré ce qui, couplé à des durées de réactions réduites, permet un gain de productivité substantiel et limite beaucoup les risques de polymérisation. A la fin de l'addition du dicarbonate de formule III, le milieu réactionnel est avantageusement laissé sous agitation, au moins 30 minutes à une température comprise entre -5 et 10 C. A la fin de l'addition du dicarbonate de formule III, une fois que le milieu réactionnel a éventuellement été laissé sous agitation, le milieu réactionnel est filtré, puis au moins 80 %, avantageusement environ 90 %, du solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite. Ensuite, un composé non-solvant est ajouté de préférence en quantité équivalente à la quantité de solvant de réaction éliminée par évaporation pour faire précipiter le UNCA de formule I qui est ensuite récupéré par filtration, le cas échéant après élimination desdits groupes protecteurs adaptés. Selon une variante de l'invention, le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite à une température comprise en 15 et 30 C, avantageusement à température ambiante. Le composé non-solvant du UNCA est avantageusement un alcane linéaire ou ramifié en C5-C10, notamment l'heptane B. Selon une variante de l'invention, le précipité est ensuite séché sous vide à une température inférieure à 30 C. Les exemples suivants illustrent la présente invention et ne sont pas limitatifs. Exemple 1: préparation du Boc-Val-NCA: L'abréviation Val représente l'alpha-aminoacide valine. Val-NCA représente donc le composé de formule suivante: Dans un réacteur double enveloppe de 1 litre équipé de cryothermostat, d'une ampoule de coulée, d'une circulation d'azote, d'une agitation mécanique et d'une sonde thermométrique, on introduit après inertage à l'azote et refroidissement à 5 2 C: - 204 g de THF, - 37,5 g (0,26 mol) de Val-NCA, - 0,15 g (1,3 mmol) de TEDA. On agite le milieu réactionnel %2 heure puis on introduit lentement, en 2 heures, par l'intermédiaire de l'ampoule de coulée une solution de 69 g (0,316 mol) de (Boc)2O dans 50 g de THF en régulant la température à -5 C 2 C. Un léger dégagement gazeux apparaît. On maintient le milieu réactionnel sous agitation durant 1 heure après la fin de la coulée de (Boc)2O. On filtre le milieu réactionnel à 0 C sur pré-couche inerte montée au THF et on rince le réacteur ainsi que la pré-couche inerte par 50 mL de THF. On replace les filtrats dans le réacteur double enveloppe toujours sous azote et on distille 300 mL de THF à une température de milieu réactionnel de 18 à 26 C sous une pression de 140 à 160 mbar. On ajoute, à une température de 25 C, 300 mL (215 g) d'heptane B. Le produit UNCA de valine précipite. On distille alors 300 mL de mélange THF / heptane B à 25 C sous 900 100 mbar jusqu'à un volume de milieu réactionnel d'environ 100 mL. On ajoute ensuite 200 mL d'heptane B à une température d'environ 25 C. On refroidit le milieu réactionnel à -10 C, température que l'on maintient pendant 1 heure. On filtre sur fritté n 3, sous atmosphère d'azote à - 10 C. On sèche le produit en étuve sous vide à une température de 25 5 C. On obtient ainsi 51,6 g (rendement 80,8 %) d'une poudre blanche de pouvoir rotatoire 59,1 (C = 1, THF) dont la pureté mesurée par GPC est de 100 %. Exemple 2: préparation du Boc-Ile-NCA: L'abréviation Ile représente l'alpha-aminoacide isoleucine. Ile-NCA représente donc le composé de formule suivante: -- H On opère comme à l'exemple 1 avec: - 200,9 g de THF, - 40,0 g (0,255 mol) de Ile-NCA, - 0,14 g (1,3 mmol) de TEDA, et une solution de 66 g (0,302 mol) de (Boc) 20 dans 66 g de THF. Après filtration et séchage, on récupère 51,5 g (rendement 78,6 %) du produit attendu de point de fusion 107,6 C et dont le pouvoir rotatoire est de 60,3 (C = 1, THF). La pureté mesurée par GPC est de 99,3 %. Exemple 3: préparation du Boc-D-Phe-NCA: L'abréviation Phe représente l'alpha-aminoacide phénylalanine. Phe-NCA représente donc le composé de formule suivante: H O CH2 O H N O On opère comme à l'exemple 1 avec la différence que la température est fixée à -17 1 C avec: - 427 g de THF, - 25g (0,131 mol) de D-Phe-NCA, 0,07 g (0,65 mmol) de TEDA, et une solution de 34,2 g (0,157 mol) de (Boc)20 dans 21,5 g de THF. Après filtration et séchage, on récupère 24,1 g (rendement 63 %) de produit conforme à la structure attendue en RMN'H et dont la pureté mesurée par GPC est de 95,2 %. REVENDICATIONS, 1. Procédé d'obtention de N-carboxyanhydrides d'alpha-aminoacides à protection 5 uréthane (UNCAs), de formule I Formule I O dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent ensemble ou indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou une chaîne latérale d'un alpha-aminoacide naturel ou synthétique éventuellement porteuses de groupements fonctionnels le cas échéant protégés; R3 représente un radical alkyle linéaire ou ramifié saturé ou insaturé en C1 CIo ou un radical aralkyle ou alkyl aryle de 7 à 14 atomes de carbone, caractérisé en ce qu'un N-carboxyanhydride d'alpha-aminoacide (NCA) de formule II, O Formule II dans laquelle Rl et R2 ont la même signification que pour la formule I, est mis à réagir avec au moins un équivalent, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II, de dicarbonate de formule III 0 0 R3, R3 Formule III O O O dans laquelle R3 a la même signification que pour la formule I, en présence d'une quantité catalytique de 1,4diazabicyclo[2.2.2]octane, également dénommé triéthylène-diamine (TEDA), par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II, dans un solvant organique de point de fusion inférieur à environ -20 C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 et R2, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle en CI C8 linéaire ou ramifié éventuellement substitué, un radical cycloalkyle en C5 C7 éventuellement substitué, un radical phényle, naphtyle, hétéroaromatique à 5 ou 6 chaînons ou indole éventuellement substitué, à la condition que R1 et R2 ne représentent pas chacun simultanément un radical cyclique; ou RI et R2 forment ensemble un radical cycloalkyle en C5 C7 éventuellement substitué, les substituants éventuels étant des substituants habituels dans le domaine des aminoacides et des peptides. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les substituants éventuels sont choisi(s) dans le groupe constitué par OH, SH, NH2, NHC(NH)NH2, CONH2, 0-alkyle en CI-C6, 0-aryle en C6-CIO, S-alkyle en C1-C6, COO-alkyle en CI-C6, COO-aralkyle en C5-C8. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R3 représente le radical méthyle, le radical éthyle, le radical tertio-butyle, le radical benzyle, le radical allyle ou le radical 9-fluorénylméthyle. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant est choisi dans le groupe des éthers en C4-CIO et des alcanes en C1 05 chlorés. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant est le THF. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité de TEDA varie de 0,1 % à 5 % molaire, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la quantité de TEDA varie de 0,2 % à 1 % molaire, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le NCA de formule II est mis à réagir avec 1,1 à 1, 5 équivalent de dicarbonate de formule III, par rapport à la quantité molaire engagée de NCA de formule II. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dicarbonate de formule III est introduit sous forme de solution dans 0,5 et 2 parties en poids de solvant, par rapport à la quantité en poids de dicarbonate engagée, régulièrement dans le milieu réactionnel comprenant l'autre partie du solvant nécessaire, le NCA de formule II à transformer et le TEDA. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la température du milieu réactionnel est maintenue, pendant l'introduction du dicarbonate, entre -20 et 5 C, avantageusement entre -10 et 0 C. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend ensuite les étapes successives suivantes: i) filtration du milieu réactionnel; ii) élimination d'au moins 80 %, avantageusement environ 90 %, du solvant par évaporation sous pression réduite; puis iii) ajout d'un composé non-solvant, en quantité équivalente à la quantité de solvant de réaction éliminée par évaporation, pour faire précipiter le UNCA de formule I; et iv) récupération du UNCA de formule I par filtration, le cas échéant après élimination desdits groupes protecteurs. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite à une température comprise en 15 et 30 C. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le composé non-solvant est un alcane linéaire ou ramifié en C5-C10. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce 5 que le précipité est ensuite séché sous vide à une température inférieure à 30 C.