Brevet FR2853908A1 — publié le 20041022

La présente Invention est relative à un produit immunomodulateur obtenu à partir d'une culture de Bifidobacterium, à son utilisation, notamment à titre de médicament ou d'ingrédient alimentaire, ainsi qu'aux compositions pharmaceutiques ou alimentaires le contenant. Le genre Bifidobacterium fait partie de la famille des Actinomycetaceae; il regroupe des bacilles à Gram positif, anaérobies stricts, fermentant le glucose par la voie de la fructose 6-phosphate phosphocétolase. Leur pH optimal de croissance est compris entre 6 et 7, et leur température optimale de croissance est comprise entre 37 et 46 C. Les bifidobactéries font partie de la flore intestinale humaine normale, et on leur reconnaît de nombreux effets bénéfiques pour la santé. Il est notamment connu que les nourrissons alimentés au sein, qui possèdent une flore intestinale dans laquelle les bifidobactéries prédominent, résistent mieux aux infections et présentent notamment un risque de diarrhée plus faible que les 15 nourrissons nourris avec des préparations lactées industrielles classiques. Le rôle des bifidobactéries dans cette résistance accrue aux infections n'a pas été complètement élucidé. Différentes études indiquent qu'elles possèdent un pouvoir immunomodulateur qui impliquerait des substances polysaccharidiques associées à la paroi bactérienne, ou secrétées par les bactéries au 20 cours de la fermentation anaérobie. Gomez et al., (FEMS Microbiol. Lett., 1988, 56, 47-52) décrivent l'effet immunomodulateur de fractions exocellulaires riches en polysaccharides produites par Bifidobacterium adolescentis; la demande de brevet FR 2 652 590 décrit un exopolymère immunopotentiateur de nature polysaccharidique produit par une souche du continuum Bifidobacterium infantis longum; Honoso et al. 25 (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 312-316 et Bioscience Microflora, 1998, 17, 97104) décrivent des polysaccharides immunopotentiateurs produits par différentes espèces de Bifidobacterium. L'action immunomodulatrice des bifidobactéries se manifeste également par la régulation de la microflore intestinale, en particulier au détriment du développement d'espèces bactériennes pathogène. Romond et al. 30 (Anaerobe, 1997, 3, 137-143 et J. Dairy Sci., 1998, 81, 1229-1235) décrivent ainsi des fractions riches en glycoprotéines, produites par Bifidobacterium breve en conditions de fermentation anaérobie, et induisent in vivo un effet régulateur de la microflore intestinale. On trouve ainsi sur le marché de nombreux produits fermentés par des bifidobactéries, éventuellement associées à d'autres bactéries lactiques, et dont 5 l'ingestion permet de bénéficier des effets immunomodulateurs des bifidobactéries et de leurs produits de fermentation. Cependant, et dans le cas particulier de l'alimentation infantile, ceuxci présentent l'inconvénient d'être trop acides et de présenter, notamment dans le cas des produits en poudre, un aspect non-homogène après reconstitution, du fait de la 10 coagulation des protéines du lait par l'acidité générée lors de la fermentation. Ils sont donc parfois mal acceptés par l'enfant et par la mère. Afin de remédier à ces inconvénients, il a déjà été proposé dans la demande internationale WO 01/01785, un procédé de préparation d'un produit lacté immunostimulant par bioconversion, sans fermentation et donc sans acidification du 15 produit final, d'un substrat laitier à l'aide de bifidobactéries, et en particulier de la souche Bifidobacterium breve, déposée selon le Traité de Budapest, le 31 mai 1999, sous le numéro 1-2219 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, à Paris. Cependant, le procédé de préparation décrit dans cette demande 20 internationale ne permet pas de préparer des produits alimentaires autres que des produits lactés et nécessite des conditions de mise en oeuvre contraignantes d'un point de vue industriel, notamment le maintien de conditions de culture aérobies, le maintien du milieu de culture à une pression osmotique correspondant à 0,93 à 0,97 d'activité de l'eau (AW), et/ou le maintien du milieu de culture à une température 25 comprise entre 40 et 480C. Par ailleurs, Clostridium perfringens est une bactérie anaérobie, Grampositif, sporulée qui est très répandue dans l'environnement (sol, eau, air, poussières) mais est aussi commensale de l'Homme et des animaux (flore de l'intestin, du vagin, des voies aériennes supérieures...). Les bactéries Clostridium 30 perfringens sont responsables de la libération de toxines et d'enzymes dans le tractus digestif qui provoquent l'endommagement de tissus. La production de ces différentes toxines est associée à la sporulation. Les spores persistent dans le sol, les sédiments et les surfaces exposées à la pollution fécale humaine et animale et leur présence dans l'eau est un critère de contamination fécale. Clostridium perfringens est responsable de gangrènes gazeuses, de toxiinfections alimentaires et d'entérites nécrosantes. Bien que d'autres germes soient impliqués dans la survenue d'une myonécrose, Clostridium perfringens reste l'agent principal de la gangrène gazeuse. Elle est généralement post-traumatique (consécutive à des accidents) mais peut aussi être postopératoire (surtout en chirurgie septique viscérale), purement médicale (consécutive à une injection musculaire) ou encore spontanée (sur cancer colique). La 10 gangrène gazeuse est mortelle dans 25 à 60 % des cas. Clostridium perfringens est impliquée dans 10 à 15 % des toxiinfections alimentaires. La contamination se fait par ingestion d'aliments tels que la viande, le lait, les fruits et les légumes qui sont fréquemment contaminés par cette bactérie. Une fois ingérés, si les conditions sont appropriées, l'organisme produit des 15 toxines dans le tractus gastrointestinal et provoquent les symptômes qui sont caractérisés, pour la forme commune d'infection, par d'intenses crampes intestinales, des douleurs abdominales aiguës, des diarrhées, des nausées, des vomissements et de la fièvre. Clostridium perfringens est également responsable d'une affection 20 digestive sévère appelée entérite nécrosante surtout chez le jeune enfant ou le nouveau-né. En absence de traitement approprié, elle est suivie d'une péritonite ou d'un état de choc qui est souvent fatal, la mort provenant de l'infection et de la nécrose de l'intestin et de la septicémie qui en résulte. Il peut donc être intéressant de pouvoir disposer d'un produit 25 immunomodulateur permettant de contrôler la prolifération de Clostridium perfringens. C'est donc afin de remédier à l'ensemble des inconvénients que présentent les produits décrits dans l'art antérieur et de pourvoir à un produit immunomodulateur pouvant être incorporé dans tout type de produit alimentaire ou 30 être utilisé pour la préparation de compositions pharmaceutiques immunomodulatrices, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention. Les Inventeurs se sont également donné pour but de pourvoir à une composition alimentaire ou pharmaceutique ayant un effet régulateur de la microflore intestinale, en particulier au détriment du développement d'espèces bactériennes pathogènes, notamment Clostridium perfringens. La présente Invention a donc pour premier objet un produit immunomodulateur caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon un procédé de préparation comprenant les étapes suivantes: - l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies, préférentiellement anaérobies, et à une température comprise entre 30 et 10 40'C environ, de Bifidobacterium comprenant au moins la souche Bifidobacterium breve 1-2219 dans un substrat aqueux présentant un pH compris entre 6 et 8 environ, et comprenant au moins les ingrédients suivants: i) du perméat de lactosérum, ii) un hydrolysat de protéines de lactosérum, 15 iii) du lactose, l'élimination des Bifidobacterium du substrat aqueux; - l'ultrafiltration du substrat aqueux sur des membranes de filtration ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa pour obtenir un rétentat concentré; la déshydratation du rétentat concentré, de préférence par lyophilisation; - la mise en solution du rétentat déshydraté dans un tampon; - la chromatographie d'exclusion sur gel sur colonne présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa de la solution du rétentat; - la récupération de la fraction filtrée à l'issue de la chromatographie qui constitue le produit immunomodulateur. La fraction filtrée obtenue en mettant en oeuvre le procédé conforme à l'Invention présente des propriétés immunomodulatrices; elle permet en particulier de stimuler la prolifération des Bifidobacterium et de diminuer la population en 30 Clostridium perfringens au sein de la flore intestinale. Selon l'Invention, le perméat de lactosérum entrant dans la composition du substrat aqueux peut se présenter sous la forme d'une poudre, obtenue par ultrafiltration de lactosérum, après séchage (par spray ou par toute autre technique de séchage), de la fraction liquide, déminéralisée ou non, qui franchit la membrane lors de l'ultrafiltration du lactosérum. Les hydrolysais de protéines de lactosérum utilisables dans le cadre 5 de la présente Invention, peuvent être obtenus par les méthodes habituellement utilisées pour la préparation des hydrolysats de protéines, notamment par hydrolyse enzymatique des protéines de lactosérum à l'aide de protéases telles que la trypsine, la chymotrypsine, etc... De nombreux concentrés ou isolats de protéines sériques de même que des hydrolysais de protéines de lactosérum, convenant pour la mise en 10 oeuvre de l'Invention sont connus en eux-mêmes et disponibles dans le commerce. Avant son utilisation, le substrat aqueux est de préférence filtré sur membranes, telles que par exemple sur des membranes en polyéthersulfone, ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa, puis le perméat autoclavé à une température d'environ 120'C pendant environ 30 minutes de façon à éviter toute 15 contamination bactérienne indésirable du milieu culture. Avant emploi, le pH du substrat aqueux peut être ajusté à la valeur désirée à l'aide de tout agent alcalinisant classiquement utilisé par l'homme du métier tel que par exemple la soude ou la potasse. Les Bifidobacterium sont de préférence ensemencés dans le substrat 20 aqueux à raison de 1.1 O à 4.109 unités formant colonies (UFC) par ml de substrat. Cet ensemencement peut s'effectuer par exemple par addition au substrat aqueux, dans des proportions adaptées, d'un concentré congelé de Bifidobacterium, ou d'une pré culture sur milieu permettant la croissance de bifidobactéries. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le pH du 25 substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6 et 8 environ pendant toute la période d'incubation, et encore plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5. Le maintien du pH est de préférence réalisé par une neutralisation en continu du substrat aqueux à l'aide d'un agent alcalinisant tel que décrit précédemment ou par une solution d'ammoniaque diluée (de préférence au demi). Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, la température du substrat est maintenue à une valeur comprise entre 37 et 40C environ pendant toute la durée de l'incubation, celle-ci étant généralement comprise entre 10 et 20 heures. Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'invention, les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes: i) perméat de lactosérum: de 3 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 40 à 60 g environ, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum: de 2 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 5 à 15 g environ, iii) lactose: de 5 à 50 g environ et encore plus préférentiellement de 10 à 30 g environ, ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux. Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le substrat aqueux peut comprendre en outre au moins un ingrédient additionnel choisi parmi les 15 extraits de levure, les sels tampon et le chlorhydrate de cystéine. Lorsque le substrat aqueux comprend un sel tampon, celui-ci est préférentiellement choisi parmi le dihydrogénophosphate de sodium et le dihydrogénophosphate de potassium et représente alors de préférence de 0, 5 à 5 g environ et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat 20 aqueux. Lorsque le substrat aqueux comprend un extrait de levure, celui-ci représente alors de préférence de 0,5 à 5 g environ, et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat aqueux. Lorsque le substrat aqueux comprend du chlorhydrate de cystéine, 25 celuici représente alors de préférence de 100 à 500 mg environ et encore plus préférentiellement de 200 à 400 mg environ par litre de substrat aqueux. A la fin de la période d'incubation, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture peut être réalisée par exemple par microfiltration, ou par centrifugation du substrat aqueux. Selon une forme de 30 réalisation préférée de l'invention, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par centrifugation du substrat aqueux, par exemple à une vitesse de 3000 g pendant une durée d'environ 1 heure. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le procédé comporte en outre, après l'étape d'élimination des Bifidobacterium, une étape supplémentaire de destruction des activités enzymatiques résiduelles contenues dans le substrat aqueux après incubation, par exemple par un traitement thermique de celui5 ci à une température d'environ 750C pendant environ 3 minutes. L'étape d'ultrafiltration du substrat aqueux est de préférence réalisée sur des membranes en polyéthersulfone, à une température inférieure à 60'C environ. A la fin de l'étape d'ultrafiltration, le rétentat concentré ainsi obtenu est de préférence lavé plusieurs fois, par exemple à l'eau permutée avant d'être 10 finalement reconcentré avant d'être déshydraté par exemple par lyophilisation. Le tampon utilisé pour la mise en solution du rétentat déshydraté est de préférence choisi parmi les tampons présentant un pH compris entre 6 et 8 tels que par exemple le tampon Tris ajusté au pH voulu par ajout d'acide chlorhydrique. La nature des gels utilisables pour réaliser la chromatographie 15 d'exclusion n'est pas critique à partir du moment que ceux-ci présentent un seuil d'exclusion de 600 kDa. A titre de gel on peut notamment utiliser les gels composés de dextrane et d'agarose réticulé tels que le produit vendu sous la dénomination commerciale Superdexe 200 par la société Amersham Biosciences. Les sels présents dans la fraction filtrée peuvent en outre 20 éventuellement être éliminés par ultrafiltration sur une membrane présentant un seuil de coupure d'environ 10 kDa. Enfin, la fraction filtrée constituant le produit immunomodulateur peut être utilisée directement ou congelée ou lyophilisée pour conservation et utilisation ultérieure. Cette fraction filtrée est constituée d'un complexe de polysaccharides et de protéines dans lequel la fraction glucidique représente de 10 à 20 % en poids environ, la fraction protéique représentant environ de 80 à 90 % en poids par rapport au poids total dudit complexe. Selon l'invention, la fraction glucidique de la fraction filtrée 30 présente la composition en monosaccharides suivante (exprimée en rapports molaires par rapport au rhamnose): galactose: 1 1 à 14; mannose: 2 à 5; glucose: 3 à 6; N-acétyl galactosamine: 2,5 à 4,5; N-acétyl glucosamine 0, 5 à 1,5; acide neuraminique: 4,5 à 6,5 et rhamnose: 1. L'Invention a également pour objet le produit immunomodulateur obtenu selon le procédé décrit précédemment à titre de médicament, et en particulier à titre de médicament immunomodulateur. Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé décrit précédemment, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. Par pharmaceutiquement acceptable on entend tout support qui tout en conservant au produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'invention ses propriétés, particulièrement ses propriétés immunomodulatrices, permet de véhiculer ledit produit. La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter 15 sous toute forme galénique souhaitée pour une administration par voie orale à l'homme ou à l'animal, comme par exemple sous forme liquide pour un sirop ou une solution, un spray, ou sous forme solide comme par exemple une poudre, un comprimé, une gélule, une capsule, un spray poudre, dans leurs formes diverses, libération immédiate ou programmée, une gomme, une pâte, des granulés, ou sous 20 toute autre forme adaptée à l'administration par voie orale. Le produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'invention peut également être incorporé, à titre d'ingrédient, dans des compositions alimentaires. Par conséquent, l'invention a également pour objet une composition 25 alimentaire caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre d'ingrédient, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'invention. De telles compositions alimentaires peuvent être destinées à l'alimentation humaine ou animale et peuvent notamment se présenter sous forme d'une préparation lactée ou non, fermentée ou non, d'origine animale ou végétale, y 30 compris notamment les formules infantiles ou pour adultes et seniors, et en particulier sous forme d'une préparation lactée infantile, de lait liquide ou en poudre, de produits frais, de céréales, de biscuits (fourrage), de petits pots, de desserts, etc ou bien encore sous forme de produits alimentaires ou diététiques pour adultes, dont les produits hospitaliers, ou de compléments nutritionnels. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du produit 5 immunomodulateur conforme à l'Invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles - la figure 1 représente le chromatogramme obtenu après injection sur une colonne garnie d'un gel de Superdex 200 d'un milieu de culture fermenté pendant 15 heures par la souche 10 Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 (absorbance en millivolts en fonction du temps écoulé en minutes); - la figure 2 compare les chromatogrammes obtenus après injection sur une colonne garnie d'un gel de Superdex 200 d'un milieu de culture fermenté par la souche Bifidobacterium breve 15 CNCM 1-2219 ou par la souche B. breve CFPL (Collection de la Faculté de Pharmacie de Lille) C7 (absorbance en millivolts en fonction du temps écoulé en minutes); - la figure 3 représente un agrandissement de la figure 2. EXEMPLE 1: PREPARATION D'UN PRODUIT IMMUNOMODULATEUR 20 OBTENU PAR CULTURE DE BIFIDOBACTERIUM On prépare un milieu de culture contenant les ingrédients suivants: - 50 g/i de perméat de lactosérum, - 10 g/l d'hydrolysat de protéines de lactosérum, - 20 g/l de lactose, - 2 g/l d'extrait de levure, - 2.5 g/l de dihydrogénophosphate de potassium, - 0,3 g/l de chlorhydrate de cystéine. Le milieu de culture est ultrafiltré sur cassettes Centramate vendues par la société PALL, munies de membranes en polyéthersulfone ayant un 30 seuil de coupure de 300 kDa et le perméat est autoclavé pendant 30 minutes à 120 C. Le pH du milieu de culture est alors ajusté à une valeur de 6,5 à l'aide d'une solution d'ammoniaque diluée au quart. Le milieu de culture est ensuite ensemencé avec les bifidobactéries à raison de 6 0/oo (v/v) d'un concentré congelé de la souche de Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 contenant 5.1010 UFC de bifidobactéries par ml de concentré congelé. La population initiale en bactéries est de 3.108 UFC de bifidobactéries par ml de 5 milieu de culture. Les bifidobactéries sont cultivées en anaérobiose, à une température comprise entre 37 et 40'C. Pendant la culture, le pH du milieu de culture est régulé à 6,5 au moyen d'une solution d'ammoniaque diluée au quart. Le temps de culture est de 15 heures, et la population de Bifidobacterium en fin de culture est environ de 2.107 UFC par ml de milieu de culture. En fin de culture, les bactéries sont éliminées du milieu de culture fermenté par une centrifugation de 1 heure à 3000 g. Les activités enzymatiques résiduelles contenues dans le surnageant de centrifugation sont détruites par un traitement thermique de 3 minutes à 750C. Le surnageant est ultrafiltré sur cassettes Centramateg vendues par 15 la société PALL, munies de membranes en polyéthersulfone ayant un seuil de coupure de 300 kDa à une température de 40'C environ. Il est ainsi concentré 3 fois, puis lavé 3 fois à l'eau permutée. Pendant le dernier lavage, on opère une concentration de 7 fois de la partie retenue par la membrane. On obtient ainsi un concentré appelé rétentat. Le rétentat est déshydraté par lyophilisation, puis repris dans un tampon Tris20 NaCl à pH 8. 1) Etude de la composition du rétentat obtenu La composition du rétentat est étudiée par chromatographie d'exclusion. Pour ce faire, 25 ffl de rétentat sont injectés à un débit de 0,6 ml par 25 minute sur colonne de gel Superdex 200 vendu par la société Amersham Biosciences et présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa, couplée à un détecteur UV à barrette de diodes (200-300 nm). L'intégration du signal est réalisée à l'aide du logiciel KromaSystemP 2000 vendu par la société Kontron Instruments. Deux fractions sont ainsi séparées: une fraction exclue du gel est éluée après 12,5 minutes à 30 partir de l'injection et une fraction filtrée est éluée de 16 à 32 minutes à partir de l'injection. 1 1 Les résultats obtenus sur le rétentat après 15 heures de fermentation sont reportés sur la figure 1 annexée qui représente l'absorbance (en millivolts) en fonction du temps écoulé (en minutes) depuis l'injection du rétentat sur la colonne. Ces résultats représentent un chromatogramme typique montrant la fraction exclue et la fraction filtrée du rétentat ainsi analysé. Les figures 2 et 3 représentent les chromatogrammes obtenus après analyse d'un rétentat issu d'une culture réalisée comme décrite précédemment et d'un rétentat issu d'une culture réalisée dans les mêmes conditions mais avec une souche différente de bifidobactéries (B. breve CFPL C7). La figure 2 représente l'absorbance (en millivolts) en fonction du temps écoulé (en minutes) depuis l'injection sur la colonne des rétentats correspondants aux deux cultures réalisées respectivement avec la souche B. breve CNCM 1-2219 et avec la souche B. breve CFPL C7. Ces résultats montrent que, contrairement au rétentat de la culture réalisée avec la souche de B. breve CNCM 115 2219, le chromatogramme du rétentat de la culture réalisée avec la souche de B. breve CFPL C7 ne présente aucun pic correspondant à la fraction exclue et à la fraction filtrée du rétentat. En revanche, la figure 3 qui représente un agrandissement de la figure 2, montrent qu'il est nécessaire d'agrandir considérablement l'échelle d'absorbance de la figure 2 pour faire apparaître la fraction exclue et la fraction filtrée 20 du rétentat correspondant à la culture réalisée avec la souche B. breve CFPL C7. Ces résultats démontrent ainsi que la souche B. breve CFPL C7 ne présente pas le potentiel de production de principes actifs que représente la souche B. breve CNCM 1-2219. 2) Préparation de la fraction filtrée du rétentat Le rétentat concentré, préalablement repris dans un tampon Tris25 NaCl pH 8, est soumis à une chromatographie préparative. La séparation est réalisée par chromatographie sur colonne de gel Superdex 200 de 50 mm de diamètre et 100 cm de hauteur, alimentée à un débit de 5 ml par minute et présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa. Les fractions sont collectées par 10 ml et leur absorbance est mesurée à 280 nanomètres. Deux fractions sont ainsi séparées: - une fraction exclue du gel de poids moléculaire supérieur à 600 kDa (temps de rétention de 130 à 180 minutes +/- 10 %), - une fraction filtrée de poids moléculaire compris entre 200 et 600 kDa (temps de rétention de 187 à 370 minutes +/- 10 %). Les sels sont éliminés de la fraction filtrée ou partie active par une ultrafiltration en utilisant une membrane présentant un seuil de coupure de 10 kDa. La fraction filtrée est concentrée lors du 3eme lavage de façon à revenir à son niveau de concentration dans le rétentat. Cette fraction peut ensuite être conservée sous forme congelée ou lyophilisée. La fraction exclue peut également être conservée de la même manière. EXEMPLE 2: ANALYSE DE LA COMPOSITION GLUCIDIGUE DE LA 10 PARTIE ACTIVE (FRACTION FILTREE) PREPAREE A PARTIR D'UNE CULTURE DE BIFIDOBA CTERIUM La poudre lyophilisée de fraction filtrée telle que préparée ci-dessus à l'exemple 1 (10 mg) est reprise par de l'hydrazine anhydre pure (200-300 microlitres). Le mélange est incubé une nuit à 11 00C, séché sous flux d'azote et repris 15 dans 1 ml d'eau. La solution est ensuite fractionnée par perméation de gel sur colonne Fractogel TSK, vendue sous la référence HW40 par la société Merck et l'élution est réalisée en eau. La présence de sucres dans les différentes fractions recueillies est recherchée par la méthode à l'orcinol et par chromatographie sur couche mince. Les résultats obtenus (non représentés) montrent que la majorité des sucres est dans la 20 fraction non retenue sur le gel (>10 kDa) et migre peu après chromatographie sur couche mince. La partie glucidique de la fraction filtrée constitue donc un polysaccharide de masse molaire supérieure à 10 kDa. La partie glucidique de la fraction filtrée représente environ 12 % à 16 % en masse de celle-ci. La composition molaire de la fraction glucidique de la partie active 25 est déterminée par chromatographie en phase gazeuse après méthanolyse à l'aide d'un mélange de 0,5 M d'acide hydrochlorique et de méthanol pendant 24 heures à 80 C. Un échantillon de la fraction filtrée (Echantillon F1), provenant d'un essai réalisé selon l'exemple 1, est analysé. A titre de comparaison, les mêmes analyses ont été réalisées sur un 30 échantillon o la souche Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 a été remplacée par la souche Bifidobacterium breve CFPL C7 (Echantillon C7) cultivée dans les mêmes conditions, ainsi que sur un échantillon o la souche Bifidobacterium breve CNCM 1- 2219 a été cultivée sur un milieu lactose non conforme à l'Invention (Echantillon milieu lactose: ML) de composition suivante: - 60 g/l de lactose, - 2 g/l d'extrait de levure, - 0,3 g/l de chlorhydrate de cystéine. Les étapes suivantes d'extraction et de purification étant comparables en tout point à celles décrites précédemment. Les rapports molaires en monosaccharides donnés (exprimés par rapport au rhamnose) obtenus pour la fraction filtrée de ces différents échantillons 10 sont regroupés dans le Tableau I suivant: TABLEAU I F1 l C7* ML* Galactose 12,8 7,7 5,8 Mannose 3,7 2,3 6,3 Glucose 4,5 2,3 2,7 N-acétyl galacto-samine 3,2 4,2 0,1 N-acétyl glucosamine 0,9 0,7 0,1 Acide neuraminique 5,4 8 0,1 Rhamnose 1 1 1 *: échantillon comparatif ne faisant pas partie de l'Invention On peut constater que la répartition des sucresde l'échantillon Fl est 15 différente de celles de l'échantillon C7 correspondant à la culture d'une souche de Bifidobacterium différente de la souche Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 sur un milieu conforme à l'Invention et à celle de l'échantillon ML correspondant à la souche Bifidobacterium breve CNCM 1- 2219 cultivée sur un milieu lactose non conforme à l'Invention. En particulier, l'échantillon Fl renferme plus de galactose et de glucose que les échantillons C7 et ML. EXEMPLE 3: ETUDE DE L'ACTIVITE IMMUNOMODULATRICE DE LA FRACTION FILTREE DU RETENTAT L'effet de la fraction filtrée (partie active), obtenue selon le procédé décrit ci-dessus à l'exemple 1, sur l'évolution de la flore intestinale des souris a été étudié. Le test a été réalisé sur des souris mâles C3H qui sont des souris de deuxième génération d'une lignée d'animaux axéniques, auxquelles est implantée une flore intestinale humaine adulte (provenant du CDTA, Centre de Distribution, Typage & Archivage animal, CNRS, Orléans, France). Les souris sont maintenues dans des isolateurs pour éviter toute modification de leur nouvelle flore intestinale. A leur réception, les souris sont âgées de 8 à 10 semaines. Un temps d'adaptation d'au moins 2 semaines est laissé aux souris après réception pour supprimer tout stress dû au transport et pour qu'elles s'acclimatent à leur nouvel environnement. Pendant toute cette durée d'adaptation et jusqu'au début de l'expérience, ces souris disposent d'eau stérile comme boisson. Pendant toute la durée de l'expérience, la nourriture utilisée comme base alimentaire est un régime standard de granulés R03 vendus par la société UAR stérilisés par irradiation, contenant 25 % de protéines, 49,8 % de glucides, 5 % de 20 lipides et 4 % de cellulose. A l'âge de 12 semaines, début de l'expérience, on constitue plusieurs groupes, un groupe de souris qui recevra pendant les 15 jours d'essai la fraction filtrée des métabolites de Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 (partie active) à la place de l'eau des biberons, à raison de 6 ml par jour et par souris, pendant que 25 deux autres groupes recevront respectivement la fraction exclue ou continueront de recevoir de l'eau (groupe contrôle). Un changement quotidien des biberons est réalisé afin d'éviter toute modification de la composition des produits à tester par prolifération bactérienne. Les selles sont récoltées pour l'analyse avant le traitement (TO), puis au 7ème et au 15ème 30 jour durant l'administration du produit (T7 et T 15). Chaque produit est testé sur un lot d'au moins 6 souris et on suit l'évolution des bactéries Bifidobacterium et Clostridium perfringens dans la flore intestinale des souris. Les prélèvements de selles sont faits dans des tubes à hémolyse 5 stériles et sont pesés aseptiquement puis dilués en solution préréduite de Ringer diluée au quart et supplémentée en chlorhydrate de cystéine (0, 3 g/l), de façon à obtenir des dilutions au dixième allant de 10-1 à 10-4. Le contenu est enfin déposé à raison de 100 pl par boite, sur différents milieux de culture contenus dans des boîtes de Pétri: - Milieu de Beerens (Be) (composé de 35 g/l de base gélose 10 Columbia, 5 g/l de glucose, 0,3 g/l de chlorhydrate de cystéine, 0,5 % d'acide propionique et ajusté à pH 5) pour la recherche et le dénombrement de Bifidobacterium, après étalement de dilutions allant de 1 0-1 à 10-4; - Milieu Columbia (CC) (composée de 35 g/l de base Columbia (Difco), 15 g/1 d'agar; ajusté à pH 7,3 et autoclavé 15 minutes à 120 C) pour la 15 recherche et le dénombrement des spores de Clostridium, après étalement de dilutions chauffées allant de 10' à 10-2. La recherche et la numération de Bifidobacterium est effectuée sur le milieu préréduit Be ensemencé directement alors que les spores de Clostridium perfringens sont recherchées après chauffage des dilutions à 75 C pendant 10 minutes 20 et ensemencement sur gélose CC supplémentée en glucose (5 g/l), en chlorhydrate de cystéine (0,3 g/l) et en sang de cheval (5 % v/v, vendu par la société Eurobio). L'étalement est réalisé à l'aide de billes de verre stériles sur les milieux indiqués et la lecture des milieux est réalisée après 5-7 jours d'incubation en anaérobiose à 37 C. L'identification des bactéries est réalisée d'une part après description des colonies obtenues sur chacun des milieux et d'autre part à l'aide d'une coloration de Gram. Les résultats concernant l'évolution de Bifidobacterium et de Clostridium perfringens dans les selles des souris sont reportés respectivement dans 30 les Tableaux II et III suivants: TABLEAUII Bifidobacterium TO T7 T15 Fraction exclue 4,02+0,74 (8) 4,54+1,0 (11) 4, 56+0,36 (12)* Fraction exclue n= 18 n= 18 n= 12 Fraction filtrée 3,66+0, 56 (7) 4,42+ 0,55 (8) 4,73+ 1,23 (8)** Fraction filltrfée n= 12 n= 12 n= 12 *: p TABLEAU III Clostridium perfringens TO T7 T15 Fraction exclue 3,41+0,34 (10) 3,68 0, 38 (7) 3,97 1,58 (3) n= 18 n- 18 n= 12 Fraction filtrée 3,95 0,3 (8) 3,4+ 0,4 (3) 3,26+0,38 (3)** nFraction filtrne12 n=12 n= 12 n= 12 n= 12 **: p tableaux). Ces résultats montrent que l'administration de l'une quelconque des deux fractions (exclue ou filtrée) conduit effectivement à une augmentation des 20 Bifidobacterium mais que seule la fraction filtrée est efficace pour provoquer une diminution de la population en Clostridium perfringens au sein de la flore intestinale des souris. L'ensemble de ces résultats démontre que la fraction filtrée (produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'Invention) a un effet immunomodulateur et permet d'augmenter la population de Bifidobacterium et de diminuer la population en Clostridium perfringens. REVENDICATIONS 1. Produit immunomodulateur caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon un procédé de préparation comprenant les étapes suivantes: l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies et à une température comprise entre 30 et 40'C environ, de Bifidobacterium comprenant au moins la souche Bifidobacterium breve 1- 2219 dans un substrat aqueux présentant un pH compris entre 6 et 8 environ, et comprenant au moins les ingrédients suivants: i) du perméat de lactosérum, ii) un hydrolysat de protéines de lactosérum, iii) du lactose l'élimination des Bifidobacterium du substrat aqueux; - l'ultrafiltration du substrat aqueux sur des membranes de filtration 15 ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa pour obtenir un rétentat concentré; la déshydratation du rétentat concentré; - la mise en solution du rétentat déshydraté dans un tampon; - la chromatographie d'exclusion sur gel sur colonne présentant un 20 seuil d'exclusion de 600 kDa de la solution du rétentat; - la récupération de la fraction filtrée à l'issue de la chromatographie qui constitue le produit immunomodulateur. 2. Produit immunomodulateur selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les Bifidobacterium sont ensemencés dans le substrat aqueux à raison de 25 1. 104 à 4.1 O unités formant colonies par ml de substrat. 3. Produit immunomodulateur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait le fait que la température du substrat est maintenue une valeur comprise entre 37 et 40'C pendant toute la durée de l'incubation. 4. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des 30 revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6 et 8 pendant toute la période d'incubation. 5. Produit immunomodulateur selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6,5 et 7,5 pendant toute la période d'incubation. 6. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des 5 revendications précédentes, caractérisé par le fait que les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes: i) perméat de lactosérum: de 3 à 80 g, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum: de 2 à 80 g, iii) lactose. de 5 à 50 g ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux. 7. Produit immunomodulateur selon la revendication 6, caractérisé par le fait que les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes i) perméat de lactosérum: de 40 à 60 g, 15 ii) hydrolysat de protéines de lactosérum: de 5 à 15 g, iii) lactose: de 10 à 30 g ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux. 8. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le substrat aqueux comprend en 20 outre au moins un ingrédient additionnel choisi parmi les sels tampon, les extraits de levure et le chlorhydrate de cystéine. 9. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le substrat aqueux comprend un sel tampon choisi parmi le dihydrogénophosphate de sodium et le dihydrogénophosphate de potassium qui 25 représente de 0,5 à 5 g par litre de substrat aqueux. 10. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait l'extrait de levure représente de 0,5 à 5 g par litre de substrat aqueux. 11. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le chlorhydrate de cystéine représente de 100 à 500 mg par litre de 30 substrat aqueux. 12. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par microfiltration ou par centrifugation du substrat aqueux. 13. Produit immunomodulateur selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par centrifugation du substrat aqueux. 14. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le procédé comporte en outre, après l'étape d'élimination des Bifidobacterium, une étape supplémentaire de destruction des activités enzymatiques résiduelles contenues dans le substrat aqueux 10 après incubation. 15. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la chromatographie d'exclusion est réalisée sur un gel de dextrane et d'agarose réticulé. 16. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des 15 revendications précédentes, caractérisé par le fait que la fraction filtrée est constituée d'un complexe de polysaccharides et de protéines dans lequel la fraction glucidique représente de 10 à 20 % en poids, la partie protéique représentant de 80 à 90 % en poids par rapport au poids total dudit complexe. 17. Produit immunomodulateur selon la revendication 16, caractérisé 20 par le fait que la fraction glucidique de la fraction filtrée présente la composition en monosaccharides suivante (exprimée en rapports molaires par rapport au rhamnose): galactose: 11 à 14; mannose: 2 à 5; glucose: 3 à 6; N-acétyl galactosamine: 2,5 à 4,5; N-acétyl glucosamine 0,5 à 1,5; acide neuraminique: 4,5 à 6,5 et rhamnose: 1. 18. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des 25 revendications précédentes, à titre de médicament. 19. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, à titre de médicament immunomodulateur. 20. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, au moins un produit immunomodulateur obtenu 30 selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. 21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée par le fait qu'elle est destinée à l'administration par voie orale et qu'elle se présente sous forme liquide ou solide. 22. Composition alimentaire caractérisée par le fait qu'elle renferme, 5 à titre d'ingrédient, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17. 23. Composition alimentaire selon la revendication 22, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'une préparation lactée ou non, fermentée ou non, d'origine animale ou végétale, y compris de formules infantiles, pour adultes 10 ou pour seniors. 24. Composition alimentaire selon la revendication 23, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme de lait liquide ou en poudre, de produits frais, de céréales, de biscuits (fourrage), de petits pots, de desserts, de produits hospitaliers, de produits diététiques ou de compléments nutritionnels.