Brevet FR2848117A1 — publié le 20040611

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un extrait contenant un mélange de madécassoside et de terminoloside, un extrait de Centella asiatica comprenant plus de 95% en masse d'un mélange de madécassoside et de terminoloside par rapport au poids total de l'extrait et son utilisation dans la régulation des mécanismes inflammatoires. Centella asiatica, encore connue sous le nom de Violette marronne (Ile de la Réunion) de Gotu Kola ou d'Indian Pennywort (Inde) ou de Centella repanda (Amérique du Nord) et de Talapetraka (Madagascar), est une herbe polymorphe qui pousse à l'état sauvage dans des régions humides et ombragées à une altitude idéale de 600 mètres. Centella asiatica appartient à la famille des Ombellifères (Apiacées), particulièrement à la sous famille des Hydrocotyles. Centella correspond au nom du genre de la plante alors que asiatica correspond à son espèce. Centella asiatica inclut trois variétés dénommées Typica, Abyssinica et Floridana. Centella asiatica est connue et utilisée par les médecines traditionnelles malgache, indienne, chinoise, amérindienne ou indonésienne depuis plus de 3000 ans. Elle présente des utilisations variées et diverses selon les pays. Elle est particulièrement intéressante pour ces propriétés cicatrisantes, sédatives, analgésiques, anti-dépressives, anti-virales et anti-microbiennes. Elle est généralement utilisée par voie topique ou par voie orale. Paradoxalement, l'apparition de Centella asiatica dans la médecine moderne occidentale fut tardive, puisqu'elle ne fit son entrée au Codex qu'en 1884, et que le premier extrait sec ne fut réalisé qu'en 1941. Les actifs de Centella asiatica sont des triterpènes pentacycliques, qui se trouvent à l'état de génines, ce sont les acides asiatique et madécassique, et d'hétérosides, ce sont l'asiaticoside et le madécassoside. Les molécules d'asiaticoside, de madécassoside, d'acide asiatique et d'acide madécassique participent aux défenses naturelles de la plante. Pour pouvoir exploiter industriellement les actifs de Centella asiatica de manière satisfaisante, il est donc indispensable de collecter la plante à l'état sauvage, un stress environnemental étant nécessaire pour que cette plante vivace présente une teneur en triterpènes importante. Les hétérosides de Centella asiatica, madécassoside et asiaticoside, sont des complexes sucrés qui constituent les formes de réserve de l'acide madécassique et de l'acide asiatique de la plante, synthétisés essentiellement, en saison humide. L'agression de la plante par des bactéries, des levures ou des champignons active les hydrolases libératrices des génines. Les molécules triterpéniques sont particulièrement intéressantes du fait de leur action régulatrice et activatrice de la synthèse de collagènes. Les génines et hétérosides extraits de Centella asiatica favorisent notamment la synthèse des collagènes 1 et 3. Ces actifs sont utilisés dans le domaine pharmaceutique principalement pour faciliter la cicatrisation et dans le traitement de l'insuffisance veineuse. Ils sont utilisés dans le domaine cosmétique principalement en tant qu'agent anti-rides et anti-cellulite. Les actifs de Centella asiatica les plus couramment utilisées dans l'art antérieur sont les acides asiatique et madécassique, ainsi que l'asiaticoside. Le madécassoside étant très soluble dans l'eau, il est le plus souvent entraîné dans les eaux de lavage au cours des procédés d'extraction classiques des actifs liposolubles. Les procédés de l'art antérieur permettent l'obtention d'un mélange d'asiaticoside et de madécassoside. Ce mélange comprend environ 25% en poids d'asiaticoside, 60% en poids de madécassoside et 15% en poids de produits secondaires, principalement constitués d'acides gras et d'osides, par rapport au poids total du mélange. D'autres procédés de l'art antérieur permettent aussi l'obtention de madécassoside pur à 81 % en poids par rapport au poids total de l'extrait, ledit extrait comprenant en outre des isomères proches du madécassoside, des acides gras, principalement des acides linoléique, linolénique, palmitique ou oléique, et des sucres tels que des osides. De manière surprenante, la demanderesse a mis au point un nouveau procédé d'extraction qui permet l'obtention d'un mélange de madécassoside et d'une nouvelle molécule que l'on a appelé terminoloside, ledit mélange étant pur à plus de 95% en masse par rapport au poids total du mélange. De la même manière, la demanderesse a découvert un extrait de Centella asiatica comprenant un mélange de madécassoside et de terminoloside. De manière surprenante, la demanderesse a également découvert que le mélange de madécassoside et de terminoloside extrait des parties aériennes de Centella asiatica pouvait être utilisé dans un médicament pour réguler les mécanismes inflammatoires. En outre, le mélange de madécassoside et de terminoloside extrait des parties aériennes de Centella asiatica peut également être utilisé dans une composition cosmétique pour prévenir et retarder le vieillissement prématuré de la peau. Dans le cadre de la présente invention, on entendra par terminoloside la molécule chimique de nom général 2a, 3(3, ss, 23-tetrahydroxy oléa-12-ène 28-oate de l[O-a-L- rhamnopyranosyl-(l 1-4)-O-(3-glucopyranosol-( 1-6)]-O-(3-D-glucopyranose. Cette molécule présente le même enchaînement sucré que le madécassoside, à savoir un enchaînement glucose-glucose-rhamnose. La structure du cycle terpénique du terminoloside correspond à celle du cycle terpénique de l'acide terminolique. Le terminoloside est ainsi un isomère de position du madécassoside. Cette molécule n'a jamais été isolée dans l'art antérieur. De plus, le terminoloside n'a jamais été cité comme étant un extrait éventuel de Centella asiatica et, par voie de conséquence, aucun procédé d'extraction de terminoloside à partir de Centella asiatica n'est connu. Dans le cadre de la présente invention, l'extrait tel que défini est constitué d'un mélange de deux molécules d'origine naturelle qui sont le madécassoside et le terminoloside en mélange. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de préparation d'un extrait contenant un mélange de madécassoside et de terminoloside, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraction des parties aériennes de Centella asiatica au moyen d'un solvant alcoolique ; b) passage sur résine anionique de la solution alcoolique obtenue à l'étape a) ; c) délipidation sélective par extraction liquide/liquide de l'éluat obtenu à l'étape b); d) concentration de la phase hydro-alcoolique délipidée jusqu'en phase aqueuse avec filtrations successives ; e) passage successif sur résine cationique puis sur résine anionique de la phase aqueuse obtenue à l' étape d) ; f) stabilisation de la phase aqueuse obtenue à l'étape e) par addition d'alcool ; g) chromatographie sélective de la phase hydro-alcoolique pré-purifiée obtenue à l'étape f) ; h) récupération du mélange de madecassoside et de terminoloside dans sa forme finale. L'extraction des principes actifs de la plante de Centella asiatica est réalisée avantageusement à partir des parties aériennes de la plante, dans le but principal de ne pas détériorer ses racines et ainsi de permettre le renouvellement naturel de cette plante vivace. Dans une variante avantageuse du procédé selon l'invention, les parties aériennes sont mises à macérer dans un solvant alcoolique avant l'étape d'extraction. Les solvants alcooliques, qui peuvent être utilisés selon la présente invention, sont ceux traditionnellement usités par l'homme du métier, tel que l'éthanol et notamment l'éthanol à 70%. La solution alcoolique ainsi obtenue est ensuite purifiée au moyen d'un passage sur une résine anionique. La résine anionique utilisée dans le procédé selon l'invention est avantageusement une résine anionique forte possédant des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire. Ce passage de la solution alcoolique sur une résine anionique permet le piégeage des substances anioniques secondaires, notamment des substances phénoliques. Selon une variante avantageuse du procédé selon l'invention, la solution alcoolique obtenue suite à l'étape a) est clarifiée avant de passer sur la résine anionique. Cette étape avantageuse de clarification consiste à ajouter à ladite solution alcoolique une solution de base forte, telle qu'une solution d'hydroxyde de sodium, et du charbon activé. L'ajout de bases fortes permet la précipitation, et ainsi l'élimination par filtration, des métaux et des autres substances présentes susceptibles de réagir avec ces bases fortes. L'ajout de charbon activé permet en plus de décolorer, en la purifiant, la solution alcooloque de fixer des acides gras ou des produits d'oxydation. Suite à l'étape b) de passage sur résine, avantageusement précédée d'une étape de clarification, l'éluat obtenu est purifié de ces fractions grasses. Pour cela, il est soumis à une extraction liquide/liquide. Le solvant d'extraction utilisé est un solvant apolaire, avantageusement un alcane tel que l'heptane. Tous les procédés d'extraction liquide/liquide connus de l'homme du métier peuvent être mis en place dans le cadre du présent procédé selon l'invention. Notamment, ladite extraction peut être une centrifugation. Le madécassoside étant hydrosoluble, on récupère la phase hydro-alcoolique. La phase hydro-alcoolique ainsi obtenue est ensuite concentrée jusqu'en phase aqueuse et filtrée successivement, avantageusement plusieurs fois de suite, pour permettre la précipitation des composés insolubles dans la phase aqueuse. Suite à ces premières étapes du procédé selon l'invention, on obtient une phase aqueuse dans laquelle les deux hétérosides connus de Centella asiatica, à savoir l'asiaticoside et le madécassoside, ainsi que le terminoloside sont solubles. Cette phase aqueuse est ensuite purifiée par passage successif sur une résine cationique puis sur une résine anionique. Avantageusement, la résine cationique utilisée est une résine cationique forte possédant des groupements fonctionnels du type sulfonates. De manière avantageuse, la résine anionique utilisée est une résine anionique forte possédant des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire. Dans le cadre du procédé selon l'invention, l'ordre des résines échangeuses d'ions est important afin d'améliorer la fixation de fractions acides résiduelles. La phase aqueuse ainsi obtenue est ensuite stabilisée par ajout d'alcool. On obtient alors une phase hydro-alcoolique pré-purifiée dans laquelle les deux hétérosides connus de Centella asiatica et le terminoloside sont solubles. Selon une variante avantageuse de l'invention, suite aux passages successifs sur résine cationique puis anionique de l'étape e) et avant l'étape f), la phase aqueuse obtenue est aussi mis à passer au travers de charbon activé. Le charbon activé permet ainsi le captage des composés phénoliques secondaires responsables de la coloration de la solution. Selon une autre variante avantageuse de l'invention, la phase aqueuse obtenue suite à l'étape e), avant l'étape f), et éventuellement suite à une étape de passage sur charbon activé, subit une ou plusieurs étape (s) concentration. La phase hydro-alcoolique pré-purifiée ainsi obtenue est ensuite purifiée par chromatographie sélective. La technique de chromatographie sélective est bien connue de l'homme du métier. Elle permet de séparer les molécules selon leur affinité avec la phase stationnaire. Dans le cadre de la présente invention, l'éluant utilisé lors de la chromatographie sélective est un solvant polaire. Avantageusement, le solvant est un mélange d'eau et d'éthanol dans des proportions en eau/éthanol variant de 50/50 à 90/10 et typiquement, 75/25 en volume/ volume. Dans le cadre de la présente invention, la phase stationnaire utilisée lors de la chromatographie sélective est une phase stationnaire apolaire. Avantageusement, la phase stationnaire est constituée de silices apolaires greffées. Les greffons apolaires ont avantageusement 2 à 18 atomes de carbone, et encore plus avantageusement 12 à 18 atomes de carbones. Suite à ces étapes de procédé, un mélange de madécassoside et de terminoloside est obtenu. Avantageusement, ce mélange est obtenu avec une pureté supérieure à 95% en masse par rapport au poids total de l'extrait. La présente invention a également pour objet un extrait de Centella asiatica susceptible d'être obtenu par le procédé tel que décrit précédemment et contenant plus de 95% en masse d'un mélange de madécassoside et de terminoloside. Selon une variante avantageuse de l'invention, le mélange de madécassoside et de terminoloside a un rapport massique en madécassoside par rapport au totum compris entre 30% et 70% en masse de madécassoside. Avantageusement, l'extrait selon l'invention est un agent anti-inflammatoire et immuno-modulateur. La présente invention a aussi pour objet un médicament comprenant un extrait de Centella asiatica tel que décrit précédemment et un support pharmaceutiquement acceptable. Lorsqu'un corps étranger, tel qu'une bactérie ou un virus, pénètre dans notre organisme, ce dernier met en marche un système de défense, appelé système immunitaire, pour le combattre. Le système immunitaire doit éliminer le corps étranger sans pour autant détruire son propre organisme. Dans une maladie auto-immune, le système immunitaire ne reconnaît plus comme siennes certaines structures de soi de l'organisme, il se dérègle et devient capable d'agresser ces structures de soi . Dans le cas particulier du psoriasis, les antigènes de l'organisme, circonvenus par la défense immunitaire, agressent la peau du sujet, ce qui entraîne une dérive inflammatoire. L'hyperréaction du système régulatoire entraîne une hyperprolifération des kératinocytes et donc la formation de plaques très épaisses et non homogènes de kératinocytes et de cornéocytes. Le médicament selon l'invention est destiné à inhiber la production pathologique des défenses immunitaires. Ledit médicament est avantageusement destiné à réguler les mécanismes inflammatoires. De manière encore plus avantageuse, ledit médicament est destiné au traitement des maladies auto-immunes, des maladies inflammatoires chroniques ou des maladies intestinales. Avantageusement, ledit médicament est destiné au traitement du psoriasis, du vitiligo, du pityriasis, des sclérodermies, des dermatoses bulleuses ou de l'arthrite rhumatoïde. Dans le domaine de la dermatologie, le médicament selon l'invention est aussi destiné à la prévention et au traitement des dérives inflammatoires chroniques liées au vieillissement et ses conséquences. Ledit médicament est avantageusement destiné à la prévention et au traitement des maladies choisies parmi les sensibilisations anaphylactiques, les anomalies pigmentaires de la peau, l'hypervascularisation dermique et les fissurations inflammatoires. Ledit médicament est aussi avantageusement destiné à réguler l'homéostasie tissulaire dermique, via une protection et une stimulation cellulaire ayant pour conséquence l'amélioration de la matrice extra-cellulaire contribuant au dialogue dermo- épidermique. La présente invention a aussi pour objet une composition cosmétique comprenant un extrait de Centella asiatica tel que décrit précédemment et un support cosmétiquement acceptable. Ladite composition cosmétique est utilisée avantageusement pour prévenir toute dérive pathologique auto-immune pouvant résulter du vieillissement naturel de la peau. Ladite composition cosmétique est également utilisée avantageusement pour retarder le vieillissement naturel au niveau de l'amélioration de la fonctionnalité cellulaire. Ladite composition cosmétique est utilisée encore plus avantageusement pour prévenir le vieillissement accéléré de la peau soumise aux agressions extérieures, notamment pour prévenir le vieillissement photo-induit de la peau. Le milieu extérieur agresse en permanence la peau, que ce soit via un rayonnement ultraviolet ou via le rayonnement émis par les lampes à décharge ou les divers antigènes atmosphériques naturels ou existants du fait de l'activité humaine, la pollution urbaine, etc., ce qui engage des processus biologiques d'accélération du vieillissement naturel. Le système anti-inflammatoire est ainsi en action de manière permanente, ce qui entraîne une accélération du renouvellement des kératinocytes de la peau, voir une hyperprolifération, aggravant l'entropie du tissu par une surexpression de protéines spécifiques et à terme une déperdition de fonctionnalité. La conséquence en est, un renouvellement épuisant des réserves naturelles de cellules de kératinocytes et l'entraînement d'un vieillissement prématuré de la peau. L'utilisation cosmétique de la composition selon l'invention permet avantageusement d'inhiber les désordres inflammatoires et ainsi de prévenir le vieillissement de la peau Le médicament ou la composition cosmétique se présente avantageusement sous une forme solide, pâteuse ou liquide. Avantageusement selon la présente invention, le médicament ou la composition cosmétique est formulée pour être administré par voie topique, orale, sous-cutanée, injectable, rectale et génitale. De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le médicament ou la composition cosmétique est formulé pour être administré par voie topique, ledit médicament ou ladite composition se présente sous forme de solution aqueuse, de crème blanche ou colorée, de pommade, de lait, de lotion, de gel, d'onguent, de sérum, de pâte, de mousse, d'aérosol, de shampoing ou de stick. De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le médicament ou la composition cosmétique est formulé pour être administré par voie orale, ledit médicament ou ladite composition peut se présenter sous la forme de solution aqueuse, émulsion, comprimés, gélules, capsules, poudres, granules, solutions ou encore de suspensions orales. De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le médicament ou la composition cosmétique est formulé pour être administré par voie sous-cutanée, ledit médicament ou ladite composition peut se présenter sous la forme d'ampoules injectables stériles. De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le médicament ou la composition cosmétique est formulé pour être administré par voie rectale, ledit médicament ou ladite composition peut se présenter sous la forme de suppositoires. De manière avantageuse selon la présente invention, lorsque le médicament ou la composition cosmétique est formulé pour être administré par voie génitale, ledit médicament ou ladite composition peut se présenter sous la forme d'ovules. La quantité du médicament selon l'invention à administrer dépend de la gravité et de l'ancienneté de l'affection traitée. Naturellement, le médecin adaptera aussi la posologie en fonction du malade. Le traitement de patients souffrant d'une maladie auto-immune, par l'extrait de Centella asiatica contenant plus de 95% en masse du mélange de madécassoside et de terminoloside par rapport au poids total du mélange, consiste notamment en l'administration topique dudit médicament à raison de 1 à 3% en poids, par rapport au volume de l'excipient, dudit extrait dans le véhicule transdermique, par jour en une ou plusieurs fois. D'une manière particulièrement avantageuse, l'administration dudit médicament à des doses telles que définies ci-dessus est répartie en 1 à 3 administrations quotidiennes. Les exemples suivant illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 : composition d'une crème de soin cosmétique selon l'invention Ingrédients: INCI w/w Extrait selon l'invention 1.0% Beheneth - 10 1.5 % Beheneth - 25 1.5% Dycaprylyl Carbonate 5.0% Hexyl Laurate 5.0% Isohexadecane 5. 0% Cetearyl Isononaoate 5. 0% Dimethicone 1.0% Behenyl Alcohol 2. 0% Hydrogenated Vegetable Glycerides 2.0% Phenoxyethanol & parabens 0.5% Tocopheryl Acétate 0. 5% Eau déminéralisée qsp 100 Glycerin 3.0% Butylen Glycol 2.0% Xanthan gum 0.1 % Carbomer0. 2% Exemple 2 : composition d'une crème de soin cosmétique selon l'invention Ingrédients: INCI w/w % Extrait madecassoside/terminoloside 1 % Cetearyl Glucoside & Cetearyl Alcohol 5.0% Caprylic/Capric Trygliceride 5.0% squalane 5.0% Cetearyl Isononanoate 3. 0% Dimethicone crosspolymere 2.0% Stearyl Alcohol 1.5% Dycaprylyl Carbonate 5.0% Parabens 0.1 % Eau déminéralisée qsp 100 Phenoxyethanol & Parabens 0.5% Glycérine 2. 0% Carbomere 0.3% PEG 32 2. 0% Xanthan Gum 0.2% Aluminium starch octenylsuccinate 2.0% Exemple 3: Procédé d'extraction d'un mélange de madécassoside et de terminoloside pur à plus de 95% en masse par rapport au poids total de l'extrait : a) Défécation et purification sur colonne du jus alcoolique initial Les parties aériennes de Centella asiatica utilisées dans cet exemple comprennent les feuilles avec environ 2 à 3 cm de tige. 250 kg de parties aériennes de Centella asiatica sont séparés en trois lots de quantités égales. Les principes actifs de Centella asiatica sont extraits de ses parties aériennes selon le principe de l'extraction à contre-courant. Un lot de parties aériennes de Centella asiatica neuves, c'est-à-dire n'ayant encore subi aucune macération ni aucune filtration et donc très riche en principes actifs, est extrait une fois avec un jus de deuxième extraction, c'est-à-dire un solvant appauvri en presque saturé en principes actifs. Le jus ainsi obtenu, que l'on appelle jus final, est ensuite directement envoyé dans une cuve de défécation. Le lot est ensuite soumis à une deuxième extraction avec un jus de première macération, c'est-à-dire un jeu moins chargé que le jus utilisé précédemment et donc apte à solubiliser plus de principes actifs. C'est ce jus qui sert de jus de deuxième extraction. Le lot est enfin soumis à une troisième extraction avec un solvant neuf et ainsi apte à solubiliser les dernier pourcentages de principes actifs encore présents dans le lot. C'est ce jus qui sert de jus de première extraction. Dans le cadre de cet exemple le solvant de macération et de filtration utilisé est de l'éthanol à 70%. Pour 250 kg de parties aériennes de Centella asiatica, on utilise 1600L d'éthanol à 70%. Suivant si l'étape précédente d'extraction est réalisée en cuve statique ou en cuve dynamique, le temps de macération des parties aériennes de Centella asiatica dans l'éthanol à 70%, plus ou moins saturé en principes actifs, varie de un jour à quelques heures. Dans le cas particulier de cuves dynamiques chauffées à une température de 60 C, le temps de macération est de deux heures. On ajoute ensuite au jus final 10 L d'une solution d'hydroxyde de sodium à 30 % puis 10 kg de charbon activé, qui permet par agitation de décolorer la solution. La solution est laissée sous agitation 40 minutes puis elle est filtrée. On passe le filtrat à travers une résine anionique forte, possédant des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire, à un débit de 300L/h. L'éluat hydro-alcoolique ainsi obtenu est ensuite neutralisé par l'hydroxyde de sodium à un pH apparent compris entre 5,3 et 6,9 puis soumis à une extraction liquide/liquide qui est avantageusement centrifuge, par de l'heptane. La phase dégraissée ainsi obtenue est concentrée au moyen d'une évaporation continue sous pression réduite à une température ne dépassant pas 70 C. Cette concentration permet d'éliminer l'asiaticoside contenu dans la phase dégraissée. On concentre jusqu'à récupérer un volume d'éthanol correspondant à environ 90% en volume du volume initial de la phase dégraissée et jusqu'à la précipitation dans la phase dégraissée de l'asiaticoside. Cette phase est ensuite filtrée et on récupère les eaux mères. Le madécassoside est tellement hydrosoluble qu'il solubilise environ 20% en masse de l'asiaticoside ayant précipité lors de l'étape précédente de concentration. b) Etapes de préparation d'une phase hydro-alcoolique pré-purifiée La phase aqueuse concentrée récupérée est purifiée par passage sur résine cationique puis sur résine anionique. La résine cationique est une résine cationique forte possédant des groupements fonctionnels du type sulfonates La résine anionique est une résine anionique forte possédant des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire. L'éluat ainsi obtenu est une phase hydroalcoolique qui est ensuite neutralisée par l'acide chlorhydrique à un pH compris entre 6,75 +/- 0,25 et décolorée par passage sur du charbon activé. La solution ainsi obtenue est filtrée puis concentrée, en réacteur sous pression réduite, jusqu'à l'obtention d'une phase aqueuse selon le même principe que la concentration précédente. Elle est ensuite réajustée par ajout d'éthanol afin d'obtenir une solution hydro-alcoolique stabilisée ayant une teneur en matières sèches de 200 g +/- 20 par litre et un pourcentage d'alcool de 35% +/- 3,5 % volume/ volume On obtient ainsi une phase pré-purifiée riche en madécassoside et en terminoloside et contenant encore de l'asiaticoside. c) Etape de purification La phase hydro-alcoolique pré-purifiée ainsi obtenue est ensuite soumise à une séparation par chromatographie sélective. Lors de cette chromatographie sélective, la phase stationnaire utilisée est une phase constituée de silices apolaires greffées, les greffons apolaires ayant 18 atomes de carbone et mesurant 10 m. Le solvant utilisé est un mélange d'eau à 65% en volume et d'éthanol à 35% en volume par rapport au volume total du mélange. L'éluat ainsi obtenu est ensuite concentré, séché, broyé. Ces différentes étapes permettent l'obtention d'un extrait sec de Centella asiatica. L'extrait sec contient 99,8% en masse, par rapport au poids total de l'extrait, d'un mélange 51:49 en masse de madécassoside et de terminoloside. Exemple 4 : évaluation des effets modulateurs du mélan2e de madécassoside et de terminoloside vis-à-vis de la croissance cellulaire de kératinocytes humains hyperprolifératifs : Dans cet exemple ainsi que dans les exemples suivants, l'extrait contient 99. 8 % du mélange de madécassoside et de terminoloside en poids selon l'invention par rapport au poids total de l'extrait ; ledit mélange contenant 51% en poids de madécassoside et 49% en poids de terminoloside, par rapport au poids total du mélange. L'extrait selon l'invention contenant principalement le mélange de madécassoside et de terminoloside, ledit extrait sera indifféremment désigné, dans cet exemple ainsi que dans les exemples suivants, sous l'expression un mélange de madécassoside et de terminoloside ou sous l'expression un mélange selon l'invention. Le sujet de cet exemple est d'évaluer les effets modulateurs du mélange de madécassoside et de terminoloside vis-à-vis de la croissance cellulaire des kératunocytes humains hyperprolifératifs. L'exemple a été réalisé sur des kératinocytes humains HaCaT stimulés par le Keratinocyte Growth Factor (ci après dénommé KGF) et/ou l'Elastase Humaine Leucocytaire (ci après dénommée EHL). a) Etude de la cytotoxicité du mélange de madécassoside et de terminoloside Cette étude de cytotoxicité consiste à déterminer la dose maximale de produit n'entraînant pas de toxicité cellulaire. La cytotoxicité a été étudiée sur des kératinocytes humains HaCaT ensemencés dans des plaques 96-puits à raison de 20#103, gamme large, et 10#103, gamme restreinte, cellules par puits. La viabilité cellulaire est évaluée par un test colorimétrique au Rouge Neutre. Le Rouge Neutre est un colorant faiblement cationique qui pénètre les membranes cellulaires par un phénomène de diffusion non ionique et qui se fixe au niveau intracellulaire sur les groupements phosphate et/ou carboxylique de la matrice lysosomiale. Des modifications dans l'accumulation et la rétention du Rouge Neutre sont observées lorsque les membranes cellulaires sont endommagées. La densité optique de la solution obtenue après incubation des cellules en présence de Rouge Neutre est donc proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Une gamme large de 9 concentrations, de 0,001à 1 mg/ml, a été testée dans un premier temps. Les différentes solutions-tests ont été préparées dans du milieu DMEM, Dubelco Modified Essential Meduim, additionné de 10% en volume de SVF, sérum de veau f#tal. Après 24 heures de contact, les concentrations inférieures ou égales à 1 mg/ml n'induisent aucune modification significative de la réponse cellulaire vis-à-vis de Rouge Neutre. Une très faible diminution de la capture du Rouge Neutre, correspondant à 10% d'inhibition, est observée uniquement à la plus forte concentration testée de 1 mg/ml. A partir de ces résultats, une gamme restreinte, entre 0,05 et 5 mg/ml, a été établie afin de préciser la dose maximale non cytotoxique. La viabilité cellulaire est évaluée par un test colorimétrique au Rouge Neutre, après 72 heures d'incubation. Les résultats confirment la non toxicité des concentrations inférieures ou égales à lmg/ml. A partir de 1 mg/ml, on observe un léger effet cytotoxique dose-dépendant. La plus forte concentration testée, 5 mg/ml, inhibe de 43% la réponse cellulaire vis-à-vis du Rouge Neutre. Une seconde gamme restreinte comprise entre 0,075 et 5 mg/ml a été testée. L'essai a été réalisé sur des cellules HaCaT, après solubilisation du mélange de madécassoside et de terminoloside dans du diméthylsulfoxide, ci après dénommé DMSO, à une concentration de 1%. La viabilité cellulaire est évaluée par un test colorimétrique au Rouge Neutre, après 72 heures d'incubation. Les résultats obtenus sont similaires à ceux enregistrés en absence de DMSO. Le tableau ci-dessous regroupe l'ensemble des résultats, la viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage de l'essai témoin. Concentration Concentration 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2,5 5 (mg/ml) Gamme large 102% n.t. 105% n.t. 100% n.t. 90% n.t. n.t. (24h) Gamme restreinte n 1 99% 100% 98% 99% 97% 96% 91% 80% 57% (72h) Gamme restreinte n 2 n. t. 102% 101% 99% 97% 94% 91% 78% 55% (72h) L'abréviation n. t. signifie non testé. Compte tenu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration de 300g/ml, comme dose maximale, pour tester l'activité anti-prolifération du mélange de madécassoside et de terminoloside. b) Effet sur la prolifération cellulaire : Le principe du test repose sur l'évaluation de la croissance de kératinocytes humains hyperprolifératifs en absence et en présence du mélange de madécassoside et de terminoloside. La méthode est basée sur la mesure des densités cellulaires au niveau des cultures stimulées par le KGF ou par l'EHL. Les densités cellulaires sont appréciées par un test colorimétrique au Rouge Neutre. L'absorbance des solutions est lue à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque. 4 concentrations du mélange de madécassoside et de terminoloside ont été testées : Ci=10ug/ml C2=30ug/ml C3=100 g/ml C4=300 g/ml b.1) Stimulation par le KGF : On prépare 6 lots tests : Lot contrôle : cellules non stimulées ; Lot témoin KGF : cellules stimulées par KGF à une concentration de 100ng/ml ; 4 Lots traités :cellules stimulées par KGF et traitées avec le mélange de madécassoside et de terminoloside ; On mesure les densités otiques à t=0 jours, t=2 jours et t=5 jours. Les moyennes des densités optiques, D. O., sont converties en densités cellulaires, cellules/puits, à partir de la droite de régression : D.O.=0,00355#(103 cellules/puits) + 0,0018 Le tableau suivant regroupe les densités cellulaires enregistrées au bout de 2 et 5 jours après activation des cellules par le KGF. Traitement 2 jours Traitement 5 jours Croissance Croissance Stimulation KGF Cellules/puits Croissance Cellules/puits Croissance cellulaire cellulaire Témoin sans KGF 56465 +/- 2486 115802 +/- 988 Témoin avec KGF 85833 +/- 1742 100% 157616 +/- 6359 100% C1 et KGF 84388+/-2616 98% n.s. 161354 +/- 5165 102% n.s. C2 et KGF 85304 +/- 1312 99% n.s. 161248 +/- 4232 102% n.s. C3 et KGF 84317 +/- 1444 98% n.s. 152081 +/- 2536 96% n.s. C4 et KGF 83259 +/- 1960 97% n. s. 150071 +/- 7087 95% n.s. L'abréviation n. s. signifie que le résultat n'est pas statistiquement significatif. Les résultats obtenus ne montrent aucune modification significative de la croissance des cellules HaCaT stimulées par le KGF, après 2 ou 5 jours de culture en présence du mélange selon l'invention. b. 2) Stimulation par l'EHL : On prépare 6 lots tests : Lot contrôle : cellules non stimulées ; Lot témoin KGF : cellules stimulées par EHL à une concentration de 3nM soit 90 ng/ml; 4 Lots traités : cellules stimulées par EHL et traitées avec le mélange de madécassoside et de terminoloside ; On mesure les densités otiques à t=0 jours, t=2 jours et t=5 jours. Les moyennes des densités optiques, D. O., sont converties en densités cellulaires, cellules/puits, à partir de la droite de régression : D.O.=0,00458x(103 cellules/puits) + 0,041 Le tableau suivant regroupe les densités cellulaires enregistrées au bout de 2 et 5 jours après activation des cellules par l'EHL. Traitement 2 jours Traitement 5 jours Croissance Croissance Stimulation EHL Cellules/puits cellulaire Cellules/puits cellulaire Témoin sans EHL 66668 +/- 1380 89180 +/- 2202 875973+/- 157616+/Témoin avec EHL 100% 100% 1400 6359 114584+/CI et EHL 76764 +/- 799 101% n. s. 100% n.s. 2463 115539 +/- C2 et EHL 75891 +/- 1190 100% n.s. 101% n.s. 1261 97% 112428 +/- 98% C3 et EHLF 73408 +/- 1690 (p#0,05) 1548 (p#0,05) 95% 82% C4 et EHL 72016 +/- 1597 93355 +/- 1429 (p#0,05) (p#0,05) L'abréviation n. s. signifie que le résultat n'est pas statistiquement significatif. p Les résultats obtenus montrent une légère diminution de la croissance des cellules HaCaT stimulées par l'EHL, après 2 ou 5 jours de culture en présence du mélange selon l'invention. Ce léger effet inhibiteur n'apparaît qu'aux fortes concentrations. A 300 g/ml, le mélange de madécassoside et de terminoloside réduit de 18% par rapport au témoin la croissance des cellules activées par l'EHL après 5 jours de traitement. c) Conclusion : En conclusion, le KGF, à une concentration de 100 ng/ml, et l'EHL, à une concentration de 90ng/ml, stimulent la croissance des cellules HaCaT. Le mélange de madécassoside et de terminoloside n'est pas capable, dans la gamme des concentrations testées, de moduler la croissance des cellules HaCaT stimulées par le KGF. Le mélange selon l'invention est capable de moduler, de manière dose-dépendante, la croissance des cellules HaCaT stimulées par l'EHL. Le mélange de madécassoside et de terminoloside à la dose de 300 g/ml est capable de réduire de 18% la croissance des cellules HaCaT stimulées par l'EHL. Exemple 5 : mise en évidence de l'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside sur des kératinocytes humains en culture : Le sujet de cet exemple est d'évaluer l'activité anti-inflammatoire du mélange selon l'invention sur la production et la libération de cytokines épidermiques proinflammatoires ; IL-la et PGE-2, par des kératinocytes humains en culture, soumis à un stress irritatif. a) Etude de la cytotoxicité du mélange de madécassoside et de terminoloside Cette étude de cytotoxicité a été menée de la même manière que dans l'exemple 4 et les mêmes résultats ont été obtenus. De plus, l'étude de cytotoxicité a été complétée par un essai sur kératinocytes humains, souche K02-1H4, afin de confirmer la non-toxicité des concentrations sur les cellules cibles. Une gamme de 8 concentrations, de 0,075 à 5 mg/ml, a été étudiée. Le mélange de madécassoside et de terminoloside préalablement solubilisé dans du DMSO a été ajouté au milieu de culture aux concentrations choisies, la concentration finale en DMSO est de 1 %. La viabilité cellulaire a été effectuée par un test Rouge Neutre. Les résultats confirment la non toxicité des concentrations inférieures ou égales à 2,5 mg/ml, après 72 heures d'incubation. La plus forte concentration testée, de 5 mg/ml, entraîne une inhibition de 30% de la capture du Rouge Neutre. Le tableau ci-dessous regroupe les résultats. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage de l'essai témoin. Concentration 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2,5 5 (mg/ml) Viabilité (72h) 98% 96% 102% 96% 93% 98% 95% 70% Compte tenu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration de 1 mg/ml, comme dose maximale, pour tester l'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside. b) Activité anti-inflammatoire : Le principe du test repose sur l'évaluation de la production de cytokines proinflammatoires par des kératinocytes humains, en réponse à un stress irritatif. La méthode est basée sur la mesure du taux intracellulaire d'IL-la et du taux de PGE-2 libéré dans le milieu extracellulaire par des kératinocytes cultivés en absence et en présence du mélange de madécassoside et de terminoloside et stimulé par le PMA, c'est-à-dire par le phorbol-1,2-myristate 13-acétate. La mesure du taux de PGE-2 libéré dans le milieu extracellulaire est effectuée selon les instructions fournies par les laboratoires R&D SYSTEMS. La mesure du taux intracellulaire d'IL-la est effectuée selon les instructions fournies par les laboratoires IMMUNOTECH#. L'étude a été réalisée sur des kératinocyres isolés à partir de peau de prépuce de jeunes enfants, souche K02-1H4. 3 concentrations du mélange de madécassoside et de terminoloside ont été testées : C1=0,1 mg/ml C2=0,5 mg/ml C3=l,0mg/ml b.l) Libération de PGE-2 : Le tableau suivant regroupe les taux de PGE-2, exprimés en pg/g de protéine, obtenu après activation des cellules ainsi que les taux basaux. La production de PGE-2 induite par le PMA et l'activité anti-inflammatoire (par la suite dénommée AAI) ont été calculés pour chaque concentration selon : PGE-2 production = PGE-2avec PMA - PGE-2sans PMA et AAI = [(PGE-2productioI1cellu1es témoins - PGE-27rOCüCtlOIleellules traitées)/PGE- 2productioncellules témoins] X 100 mélange de 0 mg/ml madécassoside et 0,1 mg/ml 0,5 mg/ml 1 mg/ml cultures témoins de terminoloside PGE-2 sans PMA 4,96 +/- 0,52 4,96 +/- 0,52 4,96 +/- 0,52 4,96 +/- 0,52 PGE-2 avec 39,34 +/-,2,64 18,73 +/- 0,67 10,69 +/- 0,50 6,60 +/- 0,44 PMA PGE-2 34,38 +/- 2,64 13,77 +/- 0,67 5,73 +/- 0,50 1,64 +/- 0,44 production AAI (%) 60% 83% 95% L'exposition des kératinocytes au PMA se traduit par une très importante production et libération de PGE-2 dans les milieux de culture des cultures témoins. En effet, le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié par 8 après stimulation par le PMA. Ces résultats confirment que PGE-2 est une cytokine dont l'expression, la production et la libération peuvent être induites par un agent inflammatoire comme le PMA. Les taux de PGE-2 enregistrés après stimulation par le PMA au niveau des cultures traitées avec le mélange de madécassoside et de terminoloside sont très nettement inférieurs à ceux observés au niveau des cultures témoins. Cet effet inhibiteur du mélange selon l'invention vis-à-vis de la libération du PGE-2 induite par le PMA est dose-dépendant. Les différences enregistrées au niveau des lots Ci, C2, et C3 se sont révélées statistiquement significative (p# 0,01, test t de Student). La plus forte concentration du mélange de madécassoside et de terminoloside testée, de 1 mg/ml, est capable d'inhiber totalement la production de PGE-2 induite par le PMA. b.2) Production d'IL-la intracellulaire : Le tableau suivant regroupe les taux intracellulaires d'IL-la, exprimés en pg/ug de protéine, obtenu après activation des cellules ainsi que les taux basaux. La production de d'IL-la induite par le PMA et l'activité anti-inflammatoire (par la suite dénommée AAI) ont été calculés pour chaque concentration selon : IL-la production = IL-1[alpha]avec PMA - IL-la sans PMA et AAI = [(IL-la productiollcellules témoins - IL-la productiollcellules traitées)/ IL-la productioncellules témoins] X 100 mélange de 0 mg/ml madécassoside et 0,1 mg/ml 0,5 mg/ml 1 mg/ml cultures témoins de terminoloside IL-la sans PMA 2,88 +/- 0,23 2,88 +/- 0,23 2,88 +/- 0,23 2,88 +/- 0,23 IL-la avec PMA 12,11 +/- 0,41 8,94+/-0,11 6,86+/-0,47 4,70+/-0,30 IL-laproduction 9,23 +/- 0,41 6,06 +/- 0,11 3,98 +/- 0,47 1,82 +/- 0,30 AAI (%) 34% 57% 80% L'exposition des kératinocytes au PMA se traduit par une très importante production et libération d'IL-ladans les milieux de culture des cultures témoins. En effet, le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié par 4 après stimulation par le PMA. Ces résultats confirment que IL-la est une cytokine dont l'expression, la production et la libération peuvent être induites par un agent inflammatoire comme le PMA. Les taux d'IL-la enregistrés après stimulation par le PMA au niveau des cultures traitées avec le mélange de madécassoside et de terminoloside sont nettement inférieurs à ceux observés au niveau des cultures témoins. Cet effet inhibiteur du mélange selon l'invention vis-à-vis de la production et de l'accumulation d'IL-la induite par le PMA est dose-dépendant. Les différences enregistrées au niveau des lots Ci, C2, et C3 se sont révélées statistiquement significative (p La plus forte concentration du mélange de madécassoside et de terminoloside testée, de 1 mg/ml, est capable de réduire de 80% la production d'IL-la induite par le PMA. c) Conclusion : L'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside a été évaluée sur un modèle in vitro par sa capacité à moduler la production de deux cytokines épidermiques, PGE-2 et IL-la, qui jouent un rôle clé dans les étapes du processus inflammatoire. L'étude a été réalisée sur des cultures de kératinocytes humains normaux stimulés par un agent irritant, le PMA. Cet exemple montre que le PMA, à une dose non toxique de lOng/ml, induit, d'une part, une très nette augmentation du taux d'IL-la intracellulaire et provoque, d'autre part, la production et la libération de PGE-2 dans les milieux de culture. Le mélange de madécassoside et de terminoloside est capable de réduire très nettement la libération du PGE-2 induite par le PMA. Le mélange à la dose de 1 mg/ml est capable d'inhiber totalement la libération de PGE-2. Le mélange selon l'invention est capable de moduler, de manière dose-dépendante, la production et l'accumulation intracellulaire d'IL-la induite par le PMA. Compte tenu du rôle important de ces deux cytokines dans le processus inflammatoire, la capacité manifestée par le mélange de madécassoside et de terminoloside à moduler, de manière dose-dépendante, l'expression et la libération de PGE-2 ainsi que la production d'IL-la par des kératinocytes stimulés in vitro, peut être considérée comme une activité anti-inflammatoire. Exemple 6: évaluation de l'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside sur des kératinocytes humains en culture : Le sujet de cet exemple est d'évaluer l'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside sur la production de TNF-a et de IL-8 induite par l'interféron [gamma]. a) Etude de la cytotoxicité du mélange de madécassoside et de terminoloside Cette étude de cytotoxicité a été menée de la même manière que dans l'exemple 4 et les mêmes résultats ont été obtenus. Compte tenu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration de lmg/ml, comme dose maximale, pour tester l'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside. b) Effet de l'interféron-x sur la production de cytokines épidermiques L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains normaux. Les cellules sont d'abord traitées avec 4 concentrations d'interféron-gamma (IFN-y), pendant 24 heures. Ensuite, on mesure les médiateurs de l'inflammation au niveau des cultures témoins et traitées par IFN-y par un dosage d'IL-8 et de TNF-a dans les surnageants de culture et par un dosage des protéines cellulaires. La méthode de mesure utilisée est le test au bleu de Coomassie, c'est une méthode normalisée. Les résultats sont donnés dans les tableaux suivants : IL-8 (pg/g protéines) Témoin Interféron-'y (U/ml) 0 100 500 1000 2000 Moyenne 0,077 0,980 1,301 1,991 2,917 Ecart-type 0,060 0,119 0,102 0,113 0,138 TNF-[alpha](pg/ g Témoin Interféron-[gamma](U/ml) protéines) 0 100 500 1000 2000 Moyenne 3,260 3,198 8,605 10,773 14,545 Ecart-type 0,519 0,744 1,195 1,673 1,256 Les résultats obtenus montrent que l'interféron, dans la gamme des concentrations testées, de 100 à 2000 U/ml, induit, de manière dose-dépendante, une nette stimulation de la production de TNF-a et de IL-8. La lettre U est l'abréviation d'unité ; 1 U correspond à une unité d'interféron-7. Dans le cas de la cytokine épidermique TNF-a, le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié respectivement par 3. 3 et par 4. 5 après stimulation par l'interféron à 1000 et 2000 U/ml. Dans le cas de la cytokine épidermique IL-8, le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié respectivement par 26 et par 38 après stimulation par l'interféron à 1000 et 2000 U/ml. Ces résultats confirment que l'interféron est capable de stimuler l'expression, la production et la libération de ces deux cytokines épidermique. Au vu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration 1000 U/ml pour stimuler les kératinocytes. c) Activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains normaux. Les cellules sont d'abord traitées, pendant 48 h, avec le produit à l'étude avant induction du stress irritatif. Ensuite, un stress irritatif est induit par addition d'une solution d'interféron-gamma, IFN-y. Les cellules ainsi activées sont incubées pendant 24h en présence du produit à l'étude. Enfin, on dose les taux d'IL-8 et de TNF-a dans les surnageants de culture et on dose aussi les protéines cellulaires. c.1) Résultats sur la cytokine IL-8 : Les tableaux suivants regroupent les taux d'IL-8, exprimé en pg/ug de protéines, obtenus après activation des cellules ainsi que le taux basal. L'activité antiinflammatoire (AAI) a été calculée pour chaque concentration selon la formule : A.A.I = [(IL-8(cellules témoins + IFN) IL-8(cellules traitées + IFN)) / IL-8(cellules témoins + IFN)]x 100 a) Taux d'IL-8 dans les cellules traitées avec un mélange selon l'invention Les résultats, des échantillons de kératinocytes traités avec le mélange de madécassoside et de terminoloside, sont donnés dans le tableau suivant : Control Témoin IFN et mélange de madécassoside et de terminoloside sans IFN avec IFN 0 mg/ml O.lmg/ml 0. 25 mg/ml 0. 5 mg/ml lmg/ml IL-8 (pg/g 0,06 +/- 1,03 +/- 0,72 +/- 0,53 +/- 0,39 +/- 0,39 +/- prot. ) 0,01 0,04 0,09 0,06 0,03 0,02 AAI 31% 49% 62% 63% Les résultats obtenus montrent une très importante production et libération de IL-8 dans les milieux des cultures témoins après stimulation par l'Interféron [gamma], à une concentration de lOOU/ml. Le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié par 18 après stimulation par l'IFN-[gamma]. D'autre part, ces résultats montrent aussi une très importante diminution, dose dépendante, du taux de IL-8 au niveau des cultures traitées stimulées par l'IFN-y. La production de IL-8 induite par l'interféron est très nettement inférieure à celle observée au niveau des cultures du lot témoin. La plus forte concentration du mélange de madécassoside et de terminoloside est capable d'inhiber de 63% la libération de IL-8 induite par l'IFN-[gamma]. Les différences enregistrées au niveau des lots CI, C2, C3 et C4 se sont révélées statistiquement significatives (p#0.01, test t de Student) par rapport au lot témoin. c.2) Résultats sur la cytokine TNF-a : Les tableaux suivants regroupent les taux de TNF-a (pg/mg protéines) obtenus après activation des cellules ainsi que le taux basal L'activité anti-inflammatoire (AAI) a été calculée pour chaque concentration selon la formule : A.A.I = [(TNF-Ü'{cellules témoins + IFN) - -a'(cellules traitées + IFN)) / TNF-0ee];u!es témoins + IFN)]x 100 a) Taux de TNF-[alpha] dans les cellules traitées avec un mélange selon l'invention Les résultats, des échantillons de kératinocytes traités avec le mélange de madécassoside et de terminoloside, sont donnés dans le tableau suivant : Control Témoin IFN et mélange de madécassoside et de terminoloside sans IFN avec IFN Omg/ml O.lmg/ml 0.25 mg/ml 0.5 mg/ml 1mg/ml TNF-[alpha] (pg/ g 2,39 +/- 5,26 +/- 4,95 +/- 4,97 +/- 4,67 +/- 3,92 +/- 0,16 0,31 0,22 0,24 0,15 0,10 prot. ) AAI 6% 6% 11% 26% Les résultats obtenus montrent une importante production et libération de TNF-a dans les milieux des cultures témoins après stimulation par l'Interféron y, à une concentration de lOOU/ml. Le taux de base enregistré au niveau des cultures non stimulées est multiplié par 2,2 après stimulation par l'IFN-y, à une concentration de 1000 U/ml. Les résultats obtenus montrent aussi une légère diminution, dose dépendante, du taux de TNF-a au niveau des cultures traitées stimulées par l'IFN-y. La plus forte concentration du mélange de madécassoside et de terminoloside est capable d'inhiber de 26% la libération de TNF-a induite par l'IFN-7. d) Conclusion L'activité anti-inflammatoire du mélange de madécassoside et de terminoloside a été évaluée sur un modèle in vitro par sa capacité à moduler la production de deux cytokines épidermiques, IL-8 et TNF-a, qui jouent un rôle clé dans les étapes du processus inflammatoire. L'étude a été réalisée sur des cultures de kératinocytes humains normaux stimulés par un agent irritant, l'IFN-[gamma]. Cet exemple montre que l'IFN-y, à une dose non toxique de 1000 U/ml, induit, d'une part, une très nette augmentation du taux d'IL-8 et provoque, d'autre part, la production et la libération de TNF-a dans les milieux de culture. Le mélange selon l'invention est capable de moduler, de manière dose-dépendante, la production et l'accumulation intracellulaire d'IL-8 induite par l'IFN-[gamma]. Le mélange à la dose de 1 mg/ml est capable d'inhiber de 63% la libération de IL-8. Le mélange de madécassoside et de terminoloside est capable de réduire la libération du TNF-a induite par l'IFN-[gamma]. Le mélange à la dose de 1 mg/ml est capable d'inhiber de 26% la libération de TNF-a. Si nous devions extrapoler les résultats obtenus en système clos, c'est-à-dire les tests effectués in-vitro, à des hypothèses de mécanisme d'activités cliniques effectives, invivo, nous pourrions objectiver les observations suivantes : Le TNF-a est un des activateurs de la production d'IL8, non seulement au niveau kératinocytaire, mais aussi et surtout aux niveaux macrophagiques et lymphocytaires B. Le fait que le mélange d'une part, ne diminue que partiellement l'expression du TNF- [alpha], est, au delà de la modération de l'expression de signaux inflammatoires, la manifestation d'un contrôle de l'activité d'un système immunitaire non déprimé puisque TNF-a remplit un rôle majeur dans le contrôle et la surveillance cellulaires de la peau, notamment de la phase apoptotique. D'autre part ce mélange diminue l'expression d'IL8 avec pour conséquence une atténuation du chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles et basophiles et les conséquences sur la diminution de la pression protéolytique, avec pour conséquence, la modération de la propagation du signal inflammatoire, et en outre, la diminution de la perméabilité vasculaire. Une autre conséquence est la moindre activation en retour des lymphocytes T de la peau par IL8. Exemple 7 : effet du mélange de madécassoside et de terminoloside vis-à-vis de la production de SKALP par des kératinocytes humains : Le sujet de cet exemple est d'évaluer l'activité anti-psoriasis du mélange de madécassoside et de terminoloside sur l'expression de la cytokératine 10, particulièrement de l'Elafin, ci après abrégées CK10 ou SKALP, par des kératinocytes en état de différenciation. a) Etude de la cytotoxicité du mélange de madécassoside et de terminoloside Cette étude de cytotoxicité a été menée de la même manière que dans l'exemple 4 et les mêmes résultats ont été obtenus. Compte tenu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration de lmg/ml, comme dose maximale, pour tester l'activité anti-psoriasis du mélange de madécassoside et de terminoloside. b) Expression de SKALP et différenciation des kératinocytes L'étude est réalisée sur des kératinocytes humains normaux. Les cellules sont mises en culture dans trois milieux différents : - Milieu de prolifération : milieu KGM avec gf, growth factor ou facteur de croissance, milieu supplémenté en facteurs de croissance - Milieu de différenciation normale : milieu KGM sans gf, milieu déplété en facteurs de croissance - Milieu de différenciation type psoriasis : milieu KGM avec SVF, milieu supplémenté en sérum de veau f#tal, ci après dénommé SVF (5%). Ensuite, on mesure le taux de SKALP dans les milieux d'incubation des cellules cultivées pendant 72h dans ces différents milieux. Le test de mesure est le test ELISA décrit dans Skin pharmacollogy and applied skinphysiology, 2002 ;15 :152-261. Les résultats sont les suivants : 1. Milieu KGM avec gf SKALP = 1.17 +/- 0.18 ng/g protéines 100 2. Milieu KGM sans gf SKALP = 1.34 +/- 0.20 ng/ug protéines 115 3. Milieu KGM avec FCS SKALP = 2. 76 +/- 0.08 ng/ g protéines 236 Les résultats obtenus montrent que l'expression de SKALP varie en fonction de l'état de différenciation des cellules. La production de SKALP est très nettement augmentée lorsque les cellules sont cultivées en milieu contenant du SVF. Le taux de SKALP en milieu de différenciation type psoriasis est multiplié par 2,4 par rapport au taux de SKALP enregistré en milieu de prolifération. c) Effet anti-psoriasis des produits étudiés Les conditions d'essai sont les suivantes : met en culture des cellules en milieu de différenciation normale , c'est-à-dire en milieu KGM sans gf, et en milieu de différenciation type psoriasis , c'est-à-dire en milieu KGM avec SVF, en absence, ce qui correspond au lot Témoin, et en présence du mélange selon l'invention, pendant 72h. On dose ensuite le taux de SKALP dans les surnageants de culture. On dose aussi les protéines cellulaires. Les tableaux suivants regroupent les taux de SKALP, exprimés en ng/ g protéines, obtenus après culture des cellules en milieu KGM sans gf et en milieu KGM avec FCS. a) Culture en milieu de Différenciation normale : Milieu KGM sans gf KGM avec KGM sans KGM sans gf + mélange selon l'invention SK-ALP Omg/ml O.lmg/ml 0.25 mg/ml 0.5mg/ml lmg/ml SKALP 1,17+/- 1,34+/- 1,01+/- 1,15+/- 1,05+/- 0,53+/- (ng/ g 0,18 0,20 0,24 0,16 0,18 0,14 SKALP PRODUCTION 100% 75% 86% 78% 40% Les résultats obtenus montrent une diminution du taux de SKALP au niveau des cultures traitées avec le mélange selon l'invention. Seule la différence enregistrée au niveau du lot C4 s'est révélée statistiquement significative (p#0.01, test t de Student) par rapport au Témoin KGM sans gf . La plus forte concentration du mélange de madécassoside et de terminoloside est capable d'inhiber de 60% la sécrétion de SKALP en milieu de différenciation normale . ss) Culture en milieu de Différenciation type Psoriasis : Milieu KGM avec FCS KGM avec KGM avec @ KGM avec KGM avec KGM avec FCS + mélange selon 1 invention ~~~~~~gt o mg/ml O.lmg/ml 0.25 mg/ml 0.5 mg/ml lmg/ml @ 1,13 +/- 2,76 +/- 2,22 +/- 2,34 +/- 2,06 +/- 1,64 +/- (ng/ g 0,19 0,08 0,24 0,12 0,15 0,10 SKALP PRODUCTION 100% 80% 85% 75% 60% Les résultats obtenus montrent une diminution dose-dépendante du taux de SKALP au niveau des cultures traitées avec le mélange selon l'invention. Les différences enregistrées au niveau des lots Cl, C2, C3 et C4 se sont révélées statistiquement significatives (p Cet exemple montre que l'expression de SKALP varie en fonction de l'état de différenciation des cellules et augmente très nettement dans un milieu type psoriasis , c'est à dire contenant du FCS. Le mélange selon l'invention est capable d'inhiber, de manière dose-dépendante, la sécrétion de SKALP en milieu de différenciation normale et en milieu de différenciation type psoriasis . Le mélange à la dose de 1 mg/ml est capable d'inhiber de 60% la sécrétion de SKALP en milieu de différenciation normale et de 40% la sécrétion de SKALP en milieu de différenciation type psoriasis . Compte tenu du rôle important de la sécrétion de SKALP dans le psoriasis, la capacité manifestée par le mélange de madécassoside et de terminoloside à moduler, de manière dose-dépendante, la sécrétion de SKALP par des kératinocytes dans différents milieux de différenciation in vitro, peut être considérée comme une activité anti-psoriasis. Ce résultat démontre l'effet protecteur du mélange selon l'invention vis à vis des cellules épidermiques dans le contexte protéolitique caractérisant un modèle de type psoriasis, selon un mode de désensibilisation cellulaire dans le contexte de la réaction hyperplasique inflammatoire. Exemple 8: effets du mélange de madécassoside et de terminoloside sur l'activation de NF#B dans des cultures de fibroblastes : Le Nuclear factor-KB est un facteur de transcription qui gouverne l'expression des gènes codants les cytokines, les chimiokines, les facteurs de croissance, les molécules d'adhésion cellulaire et certaines protéines à phase brève. NFKB est activé par plusieurs agents, incluant les cytokines, les radicaux libres, les particules inhalées, l'irradiation ultraviolet, et des bactéries ou des virus. Les agents inflammatoires tels que le TNF-a induisent la transcription de gènes proinflammatoires-cibles via l'activation, entre autres, du facteur de transcription NF#B. En conditions non stimulées, le facteur de transcription NF#B est lié dans le cytoplasme à une protéine inhibitrice IkB. La liaison de TNF-a à son récepteur conduit à la phosphorylation de ce complexe et à la dissociation de NF#B de l'inhibiteur. NF#B activé migre alors dans le noyau et se fixe sur une séquence promotrice, appelée séquence consensus NF#B, spécifique des gènes trans-activés par NF#B. Cette séquence conduit à la transcription des gènes-cibles. L'activation de NFKB peut donc se mesurer en mettant en contact des extraits nucléaires stimulés ou non avec des séquences oligonucléotidiques consensus NF#B immobilisées sur des supports et en quantifiant NFKB lié à l'aide d'une méthode immuno-enzymatique, telle que ELISA avec anticorps anti- NF#B. Cette étude permet d'évaluer les effets du mélange selon l'invention sur l'activation de NF#B en utilisant une méthode spécifique très sensible basée sur la mesure de la liaison du facteur de transcription NF#B à la séquence oligonucléotidique consensus immobilisée sur support plastique. NF#B lié est secondairement reconnu par un anticorps spécifique anti-NFKB. Cet essai a été réalisé sur des noyaux isolés de fibroblastes humains normaux. Le milieu de culture est le DMEM qui comprend : # L-glutamine 2mM # pénicilline 50 UI/ml streptomycine 50 ug/ml # sérum de veau foetal 10 % (v/v) pour la pré-culture puis passage en milieu sans sérum Produits à l'essai Solution-stock Dilution Concentration finale testée Mélange selon 10 % dans milieu de Milieu de culture 0. 01 % l'invention culture Références Solution-stock Dilution Concentration finale testée Dexaméthasone 10-2 M en DMSO Milieu de culture 0.1 M (Sigma D1756) Sulfasalazine (Sigma S0883, 1 M en DMSO Milieu de culture 5 mM PM 398.4) a) Etude de la cytotoxicité du mélange de madécassoside et de terminoloside Cette étude de cytotoxicité a été menée de la même manière que dans l'exemple 4 et les mêmes résultats ont été obtenus. Compte tenu de ces résultats, on a décidé de retenir la concentration de 0,01 %, comme dose maximale, pour tester l'activité anti-psoriasis du mélange de madécassoside et de terminoloside. b) Traitements, extractions et dosages Les fibroblastes ont été pré-cultivés en flacons de 175 cm2 en milieu DMEM à 10 % en volume de SVF jusqu'à confluence, puis le milieu de culture a été remplacé par du milieu DMEM sans sérum. Les cellules ont ensuite été cultivées en présence des produits à l'essai ou des références pendant 1 heure. L'agent pro-inflammatoire transforming growth factor alpha (TNF-a, à 25 ng/ml final ; Sigma TOI 57) a ensuite été ajouté au milieu de culture et les cellules ont été à nouveau incubées pendant 1 heure à 37 C et 5 % de CO2. Après incubation, les cellules ont été récoltées sur glace et les noyaux cellulaires des différents échantillons ont été isolés à l'aide du kit Sigma NUC-101 suivant le protocole préconisé par le fournisseur. La quantité de protéines de chaque extrait de noyaux a été déterminée à l'aide du kit de dosage Biorad 500-0116. La quantité de NF#B activé, lié à l'oligonucléotide spécifique, a été mesurée sur une même quantité d'extrait nucléaire de chaque échantillon, soit 50 l, dilué à moitié, après révélation à l'aide d'un anticorps spécifique anti-NFKB. Ce dosage a été réalisé à l'aide du kit de dosage Mercury transfactor NF#B, BD Biosciences K2058-1, selon le protocole préconisé par le fournisseur. c) Dosage de NF#B Les résultats sont donnés dans le tableau suivant : Traitement NF#B (UA) moyenne % témoin p 10,71 8,39 9,55 Témoin non traité 100 8,90 10,19 0,00 0,62 Contrôle sans TNF-a 0,26 3 p 01 0,62 -0,21 4,93 Sulfasalazine 5mM 4,01 4,19 44 p 01 2,88 4,93 10,94 7,3 Dexaméthasone 0,1 M 9,46 99 p>0,05 9,90 9,67 10,16 Mélange selon l'invention 6,79 9,05 95 p>0,05 0,01 % 9,63 9,63 UA représente les unités arbitraires de NF#B dans l'extrait, c'est la différence entre la valeur mesurée et le bruit de fond. Le taux basal de NF#B dans les noyaux de fibroblastes est très faible, cf contrôle sans TNF-a. Le traitement par le TNF-a à 25 ng/ml a fortement activé le facteur de transcription NF#B, d'un facteur 37 environ par rapport au contrôle sans TNF-a. Des contrôles utilisant un excès d'oligonucléotide ont permis de montrer que la quasi-totalité de la réponse observée était spécifique de la liaison de NFKB. La sulfasalazine à 5 mM, inhibiteur de référence de la translocation de NF#B, a nettement réduit l'activation du facteur de transcription NF#B induite par le TNFa, 44 % du témoin avecTNF-a, p La dexaméthasone à 0.1 M, n'a pas inhibé la translocation nucléaire de NF#B induite par le TNF-a. En faits, la dexaméthazone réprime la trans-activation des gènes induite par NF#B, mais n'inhibe pas l'activation de NFKB et sa translocation vers le noyau. Il y a ainsi un effet inhibiteur de la transcription mais pas d'effet sur la translocation de NF#B ; l'action de la dexaméthazone a lieu au niveau nucléaire, via le récepteur aux glucocorticoïdes, elle est donc postérieure à l'action de la sulfasalazine. Le produit selon l'invention testé à 0. 01 % n'a pas modifié de façon significative l'activation de NF#B induite par TNF-a , 95 % du témoin. Ce résultat n'exclut pas une activité anti-inflammatoire via un autre mécanisme d) Conclusion La non ingérence du madécassoside et de son isomère dans l'activation du NF#B a pour conséquence la transcription autorisée des ligands, tels que les cytokines et les chimiokines, inflammatoires qui rendent la cellule opérationnelle dans un cas d'agression antigénique pathogène. Le madécassoside et son isomère n'ont aucune interaction avec ou contre l'activation du NF#B produit par les fibroblastes. La modération des ligands inflammatoires dans les dérèglements auto-immuns, IL1, IL8, TNF-a, PGE2 au niveau membranaire, indique que le madécassoside et son isomère agirait plus au niveau transductionnel (meilleure tolérance en cas de dérive inflammatoire), et au niveau des systèmes d'expression et/ou de synthèse des protéines, peptides, ou autres ligands (moindre expression intra-cellulaire des IL). Revendications 1. Procédé de préparation d'un extrait de Centella asiatica contenant un mélange de madecassoside et de terminoloside, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraction des parties aériennes de Centella asiatica au moyen d'un solvant alcoolique ; b) passage sur résine anionique de la solution alcoolique obtenue à l'étape a) ; c) délipidation sélective par extraction liquide/liquide de l'éluat obtenu à l'étape b) ; d) concentration de la phase hydro-alcoolique délipidée jusqu'en phase aqueuse avec filtrations successives ; e) passage successif sur résine cationique puis sur résine anionique de la phase aqueuse obtenue à l'étape d) ; f) stabilisation de la phase aqueuse obtenue à l'étape e) par addition d'alcool ; g) chromatographie sélective de la phase hydro-alcoolique pré-purifiée obtenue à l'étape f) ; h) récupération du mélange de madecassoside et de terminoloside dans sa forme finale. 2. Procédé d'extraction selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine anionique utilisée à l'étape b) est une résine anionique forte avec des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire. 3. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la résine cationique utilisée à l'étape e) est une résine cationique forte avec des groupements fonctionnels du type sulfonates. 4. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la résine anionique utilisée à l'étape e) est une résine anionique forte avec des groupements fonctionnels du type ammonium quaternaire. 5. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant utilisé lors de la chromatographie sélective est un mélange d'eau et d'éthanol dans des proportions eau/éthanol variant de 50/50 à 90/10 en volume/ volume. 6. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase stationnaire utilisée lors de la chromatographie sélective est une phase stationnaire apolaire, notamment une phase stationnaire constituée de silices apolaires greffées, les greffons apolaires ayant 2 à 18atomes de carbone. 7. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange de madecassoside et de terminoloside est obtenu avec une pureté supérieure à 95% en masse par rapport au poids de l'extrait. 8. Extrait de Centella asiatica susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, contenant plus de 95% en masse d'un mélange de madecassoside et de terminoloside. 9. Extrait de Centella asiatica selon la revendication 8 caractérisé en ce que le mélange a un rapport massique en madecassoside : totum compris entre 30% et 70%. 10. Extrait de Centella asiatica contenant plus de 95% en masse d'un mélange de madecassoside et de terminoloside, dans un rapport massique en madecassoside : totum exprimé en masse compris entre 30% et 70%, en tant qu'agent anti- inflammatoire. 11. Médicament comprenant un extrait de Centella asiatica selon l'une quelconque des revendications 8 à 9 et un support pharmaceutiquement acceptable. 12. Médicament selon la revendication 10 destiné à réguler les mécanismes inflammatoires. 13. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 destiné au traitement des maladies auto-immunes, des maladies inflammatoires chroniques ou des maladies intestinales. 14. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 13 destiné au traitement du psoriasis, du vitiligo, du pityriasis, des sclérodermies, des dermatoses bulleuses ou de l'arthrite rhumatoïde. 15. Médicament selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 destiné à la prévention et au traitement des dérives inflammatoires chroniques liées au vieillissement et ses conséquences. 16. Médicament selon la revendication 15destiné à la prévention et au traitement des maladies choisies parmi les sensibilisations anaphylactiques, les anomalies pigmentaires de la peau, l'hypervascularisation dermique, les fissurations inflammatoires. 17. Médicament selon la revendication 15 destiné à réguler l'homéostasie tissulaire dermique. 18. Composition cosmétique comprenant un extrait de Centella asiatica selon l'une quelconque des revendications 8 à 9 et un support cosmétiquement acceptable 19. Utilisation cosmétique de la composition selon la revendication 18, pour prévenir toute dérive pathologique auto-immune pouvant résulter du vieillissement de la peau. 20. Utilisation cosmétique de la composition selon la revendication 18 ou de l'extrait selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour retarder le vieillissement naturel de la peau. 21. Utilisation cosmétique de la composition selon la revendication 18 ou de l'extrait selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour prévenir le vieillissement accéléré de la peau soumise aux agressions extérieures, notamment pour prévenir le vieillissement photo-induit de la peau.