Brevet FR2858557A1 — publié le 20050211

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide ZKW et de certains peptides homologues, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement du phénomène d'agrégation plaquettaire. L'hémostase est l'ensemble des processus complexes aboutissant à l'arrêt de tout saignement provoqué ou spontané. L'agrégation plaquettaire est la phase initiale de l'hémostase aboutissant à la formation d'un clou hémostatique lors d'une brèche vasculaire. Les phospholipides membranaires plaquettaires constituent le support de la génération de la thrombine, enzyme clé de la coagulation, seconde étape de l'hémostase. La transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble aboutit alors à la formation d'un thrombus irréversible réparant une lésion éventuelle de la paroi d'un vaisseau sanguin. L'agrégation plaquettaire est un phénomène extrêmement rapide qui peut être responsable dans certains contextes d'accidents thrombotiques sévères. Ainsi, en cas de lésion d'une plaque athéroscléreuse, cette réponse exacerbée ou mal contrôlée entraîne la formation d'un caillot occlusif responsable de la symptomatologie ischémique : infarctus du myocarde, ischémie aigue d'un membre, accident vasculaire cérébral...Ces accidents constituent la cause la plus fréquente de mortalité dans les pays industrialisés (ex : plus de 600 infarctus par jour en France). Les voies d'activation plaquettaires sont multiples et impliquent des récepteurs différents, dont le mieux connu est une protéine membranaire appelée GPIIb/IIIa. Ce complexe est le plus représenté à la surface membranaire avec 40 à 80 000 exemplaires par plaquette. Les antiagrégants plaquettaires comprennent plusieurs catégories de substances de mécanismes moléculaires d'action différents mais aboutissent tous à l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Les inhibiteurs de la cyclo-oxygénase 1, tel que l'aspirine, qui inhibent la voie du thromboxane A2, les inhibiteurs de la voie de l'ADP et les antagonistes des récepteurs GPIIb/IIIa. Ces derniers sont de quatre types : a) Anticorps monoclonal : l'abciximax ou c7E3 (commercialisé sous la marque Reopro) est le fragment Fab d'un anticorps chimérisé humain/murin. Commercialisé par la Société Eli Lilly, il a été le premier anti-gpIIb-IIIa utilisé en clinique et il est le seul disponible en France ayant obtenu l'Autorisation de Mise sur le Marché pour l'angioplastie coronaire à haut risque. Il a été également utilisé en association avec des thrombolytiques et d'autres antithrombotiques au cours de l'infarctus du myocarde. b) Les disintégrines : il s'agit de peptides issus de venins de serpents possédant la triade peptidique caractéristique : la séquence RGD. Plusieurs peptides ont été ainsi isolés : Echsitatine, Kistrine, Decorsine. La Barbourine, qui possède une séquence KGD serait plus spécifique de la GPIIb-IIIa. Les disintégrines sont capables d'empêcher chez l'animal la formation d'agrégats plaquettaires provoqués artificiellement en obstruant une artère coronaire, et d'inhiber l'adhésion des plaquettes sanguine sur les tubules de perfusion. Elles pourraient être utilisées comme antithrombotiques dans certaines conditions comme les dialyses extra-corporelles. c) Les peptides synthétiques cycliques : différents peptides possédant la séquence RGD ont ainsi été élaborés tels que le MK-852, le SKF-106760 ou le G-4120. L'eptifibatide (commercialisé sous la marque Integrilin #) est un peptide cyclique possédant la séquence KGD qui a fait l'objet de plusieurs études cliniques. Il est indiqué pour la prévention d'un infarctus du myocarde précoce. Integriline # est destiné à être utilisé en association avec l'acide acétylsalicylique et l'héparine non fractionnée. d) Les peptidomimétiques : s'agit de molécules synthétiques non peptidiques dont le nombre ne cesse de croître. Il faut distinguer d'une part les agents actifs par voie parentérale tels que le Tirofiban (commercialisé sous la marque Aggrastat #), le lamifiban et le Fradafiban et d'autre part, les produits actifs per os tels que le Sibrafiban ou le Roxifiban. Ils sont à l'état de pro-drogue qui n'est activée qu'après métabolisation hépatique. La ticlopidine (commercialisée sous la marque Ticlid #) et son dérivé, le clopidogrel (commercialisé sous la marque Plavix #), inhibent fortement l'agrégation plaquettaire à l'ADP. Ils sont particulièrement utilisés au cours des interventions d'angioplastie coronaire avec mise en place des stents intra-coronaires pour éviter les complications thrombotiques. La molécule n'est pas active in vitro : ce sont les métabolites qui sont actifs. L'effet est retardé (3 à 4 jours) et irréversible. La récupération plaquettaire après l'arrêt est également différée. L'effet sur les plaquettes est irréversible. Il existe une variabilité importante dans la réponse individuelle avec une relation dose-effet sur les plaquettes. Pour que l'agrégation plaquettaire se produise, les plaquettes doivent être activées par différentes voies intracellulaires et extracellulaires. Il se produit un enchaînement complexe de modifications biochimiques et morphologiques induits par les agonistes de l'agrégation plaquettaire, en particulier l'activation des plaquettes, des changements dans leur forme et leurs sécrétions granulaires (Kroll and Schafer, Blood, 74, 118, 1989). Ces changements ont pour conséquence la liaison du fibrinogène à la glycoprotéine membranaire des plaquettes GPIIb/IIIa, liaison qui met enjeu une séquence RGD sur le fibrinogène comme cela a été mis en évidence par Nicholson et coll., Thromb. Research, 62,567, 1991. Cette séquence est également impliquée dans la liaison inter plaquettaire subséquente. Plusieurs protéines issues du venin de serpent et de la salive de sangsue ont été identifiées comme antagonistes potentiels de GPIIb/IIIa et inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire (Dennis et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. 87,2471, 1990; Scarabough et coll., J. Biol. Chem 266, 9359,1991; J. Biol. Chem. 268,1066, 1993 ; Seymour et coll.,. J. Biol. Chem. 265,10143, 1990; Mazur et coll.,. J. Biol. Chem. 266, 9359,1991). Parmi celles-ci, une famille de protéines homologues issues du venin de vipère, nommées désintégrines. A côté des désintégrines, on a identifié des inhibiteurs dépourvus d'activité enzymatique dans le venin des serpents Aykistrodon Rhodostoma (Huang et coll., Biochem. Biophys. Acta. 202,1073, 1987), Cerastes Cerastes (Marrakchi et coll., Toxicon, 30,265, 1997), Bothrops Jararaca (Zingali et coll., Biochemistry, 32, 10794,1993) et Botrops Alternatus (Castro et coll., Toxicon, 36,1903 1998). Enfin des inhibiteurs enzymatiques de l'agrégation plaquettaire tels que l'a-fibrinogénase, la phospholipase A2 et la nucléotidase, ont été identifiées avec des mécanismes d'action divers. Enfin deux groupes de peptides, les lebetines 1 et 2 ont été isolées du venin de Macrovipera Lebetina (Barbouche et coll., Toxicon, 36,1939, 1998 ; Marrakchi et coll., Haemostasis, 31(3). 207, 2001). En dépit de l'absence de la séquence RGD, ces deux familles de peptides montrent une forte activité antiplaquettaire in vitro et inhibent in vivo chez le rat la thrombocytopénie induite par le collagène (Barbouche et coll., FEBS Lett., 392, 6, 1996). Il existe de nombreux médicaments ayant des propriétés antiagrégantes plaquettaires. Mais l'activité de ces différents agents reste encore limitée ou imparfaite. Ainsi par exemple, de nombreux travaux ont confirmé l'efficacité à la phase aigue du produit commercialisé sous la marque Reopro@, et soulevé en même temps le problème hémorragique potentiel associé à son utilisation avec la possibilité de thrombopénie. Un autre problème est celui de l'activation paradoxale possible des plaquettes par liaison de l'anticorps sur la cible membranaire. Le Tirofiban, inhibiteur de nature non peptidique dérivé de l'acide aminé tyrosine, augmente les risques de saignements. Les complications hémorragiques demeurent l'un des principaux effets secondaires rencontrés. La Ticlopidine, exposant au risque très grave mais rare d'agranulocytose est progressivement remplacée actuellement par le Clopidogrel qui exposerait moins à un tel risque. Elle présente d'autres effets indésirables tels que le risque hémorragique, la thrombocytopénie, l'élévation des transaminases... En ce qui concerne les disintégrines, compte tenu de leur immunogénicité et de leur coût élevé, ils n'ont pas fait l'objet de développement clinique mais ils ont permis l'élaboration de peptides synthétiques. Il subsiste donc le besoin d'un médicament antithrombotique qui aurait non seulement une activité antiagrégante mais aussi une activité sur le caillot constitué, un médicament puissant de demi-vie courte, sans phénomènes indésirables comme on en a décrits pour certains concurrents, et dont la pharmacocinétique autorise une surveillance hématologique simple et un usage élargi dans un grand nombre de contextes pathologiques associés. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide de séquence ZKW pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'agrégation plaquettaire et qui ne présente pas les inconvénients des antiagrégants plaquettaires de l'art antérieur. Plusieurs études ont montré que des familles de serpents du type vipéridées et crotalidées contenaient de petits peptides endogènes contenant un résidu acide pyroglutamique ou PyroGlu comme la séquence pyroGlu-Asn-Trp ou pyroGlu-GlnTrp (Kato et coll., Experientia 22,49, 1966). Il a ensuite été démontré que ces peptides, présents dans le venin de nombreuses espèces de serpents, sont des inhibiteurs de métalloprotéases zinc-dépendantes (Robeva et coll., Biochem. Biophys. Acta. 50,769, 1991). Enfin Huang et al. ont isolé et identifié trois peptides du venin de Trimeresus mucrosquamatus dotés de propriétés d'inhibiteurs de nombreuses métalloprotéases (Huang et coll., Biochem. Biophys. Res. Comm. 248, 562, 1998) : PyroGlu-Asn-Trp, PyroGluGln-Trp et pyroGlu-Lys-Trp. Toutefois, aucun de ces documents ne divulgue ou ne suggère que l'un ou plusieurs des tripeptides comprenant un résidu acide pyroglutamique ait des propriétés d'antiagrégant plaquettaire. Au contraire, les métalloprotéases sont des antithrombolitiques dont l'administration est souvent la cause d'hémorragies. Les tripeptides cités ci-dessus ont pour effet de moduler l'action des métalloprotéases de façon à limiter leurs effets secondaires. Il est donc étonnant de découvrir que ces mêmes peptides sont dotés de propriétés d'antiagrégant plaquettaire. Le peptide ZKW ou pyroGlu-Lys-Trp a été isolé et purifié à partir du venin de vipère Cerastes Cerastes. Il a également été préparé par voie de synthèse chimique. Les effets de ce peptide sur les mécanismes d'agrégation plaquettaire ont conduit aux observations suivantes : - ZKW utilisé jusqu'à 500 micromolaire n'interfère pas sur l'activité procoagulante de la thrombine sur le fibrogène, - ZKW inhibe la rétraction du caillot induite par la thrombine en présence de plasma riche en plaquettes, - ZKW inhibe l'agrégation des plaquettes humaines induites par la thrombine, - ZKW inhibe faiblement l'agrégation plaquettaire induite par l'ADP, l'acide arachidonique, le Ca++ ionophore et PAF aceter (platelet activating factor ou facteur d'activation plaquettaire), - ZKW inhibe l'agglutination des plaquettes humaines induite par le facteur de Von Willebrand ou par la ristocitine. Les résultats obtenus avec le peptide ZKW et exposés en détail dans la partie expérimentale montrent que l'activité de ZKW comme antiagrégant plaquettaire est supérieure ou égale à celle des meilleurs antiagrégants plaquettaires. En outre, ZKW est doté d'une plus grande spécificité par rapport aux autres anti-agrégants plaquettaires. Enfin, s'agissant d'une molécule de structure simple, facile à préparer par voie de synthèse, il permet d'envisager la préparation d'un médicament inhibiteur de l'agrégation plaquettaire d'un coût bien moindre que celui des médicaments commercialisés actuellement dans cette indication thérapeutique. D'une façon plus générale, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une molécule répondant à la formule (I) : (I) dans laquelle X1, X2, identiques ou différents, représentent un groupement choisi parmi : O - une liaison peptidique -C-NH-, - une liaison -CH2-CH2-, - une liaison-CH=CH- - une liaison -CO-CH2- - une liaison -CH2-S-, - une liaison -CH2-NH-, - une liaison -CH2-O- , - une liaison -CH(OH)-CH2- - une liaison -CH2-SO-; X3 représente un groupement choisi parmi : - une fonction acide-COOH ; - une fonction ester -COORi, dans laquelle RI représente une fonction alkyle en C1-C12, saturée ou insaturée, éventuellement aromatique, linéaire, ramifiée ou cyclique ; - une fonction amide -CONH2 ; l'un de Y1 et de Y2 représente un groupement choisi parmi : - une fonction-(CH2)n - NH2 avec n entier allant de 1 à 3 ; l'autre de Y1 et de Y2 représente la chaîne latérale d'un tryptophane ; ou de l'un de ses sels , pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'agrégation plaquettaire. De façon préférentielle, l'une ou plusieurs des conditions suivantes sont vérifiées : - XI et X2 représentent une liaison peptidique, - X3 représente une fonction-COOH, - Y1 représente la chaîne latérale d'une lysine -CH2-CH2-NH2, - Y2 représente la chaîne latérale d'un tryptophane. Selon l'invention, le terme sels se rapporte à la fois aux sels d'amine d'une fonction carboxyle de la chaîne peptidique aussi bien qu'aux sels acides d'addition à un groupe amine de cette même chaîne polypeptidique. Les sels d'une fonction carboxyle peuvent être formés avec une base inorganique ou organique. Les sels inorganiques incluent par exemple les sels de métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium et de lithium ; les sels alcalino-terreux tels que par exemple les sels de calcium, de barium et de magnésium ; les sels d'ammonium, les sels ferreux, ferriques, les sels de zinc, de manganèse, d'aluminium, de magnésium. Les sels avec des amines organiques incluent ceux formés par exemple avec la triméthylamine, la tri éthylamine, la tri(n-propyl)amine, la dicyclohexylamine, la triéthanolamine, l'arginine, la lysine, l'histidine, l'éthylènediamine, la glucosamine, la méthylglucamine, les purines, les pipérazines, les pipéridines, la caféine, la procaine. Les sels d'addition acides incluent, par exemple, les sels avec des acides minéraux tels que par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide nitrique ; les sels avec des acides organiques tels que par exemple, l'acide acétique, l'acide oxalique, l'acide tartarique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide malique, l'acide ascorbique, l'acide benzoïque. Les molécules de formule (I) dont la structure a été décrite ci-dessus, et en particulier le peptide ZKW, peuvent être préparés par des méthodes bien connues de l'homme du métier comme la synthèse peptidique ou la synthèse d'analogues de peptides. On peut, par exemple, se reporter à : SPATOLA, Vega Data, Vol.l, issue 3 (1983) ; SPATOLA, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983). MORLEY.J.-S., Trends Pharm. Sci., 463-468 (1980); HUDSON et al, Int. J. Pept. Prot. Res. 14, 177-185 (1979) ; SPATOLA et al, Life Sci., 38, 1243-1249 (1986) ; Hann, J.Chem. Soc. Perkin Trans.I 307-314 (1982) ; ALMQUIST et al, J. Med. Chem., 23,1392-1398 (1980); JENNINGS-WHITE et al, EP-45665 ; HOLLADAY et al, Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (1983) . HRUBY et al, Life Sci. 31, 189-199(1982)). La présente invention a pour objet l'utilisation d'une molécule de formule (I), et en particulier du peptide ZKW pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Un tel médicament comprend la molécule de formule (I) dans un support pharmaceutique acceptable. Le choix du support et des adjuvants sera guidé par le mode d'administration qui sera adapté en fonction de la pathologie à traiter et de sa localisation. Le médicament préparé conformément à l'invention peut être administré par voie orale, par injection intraveineuse ou intramusculaire. La posologie est adaptée en fonction du poids du patient. Les molécules de formule (I) et en particulier le peptide ZKW peuvent être utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, au diagnostic et/ou au traitement des thromboses. Les molécules de formule (I) peuvent également être utilisées dans les tubes de prélèvement sanguin afin de prévenir l'agrégation plaquettaire provoquée par le traitement des échantillons sanguins prélevés. En effet, les plaquettes jouent un rôle central dans les mécanismes de l'hémostase par leur interaction avec les vaisseaux sanguins, la coagulation et la fibrinolyse. Lors d'une opération de diagnostic, un échantillon sanguin est prélevé chez le patient et placé dans un tube contenant du citrate. Il est important de limiter au maximum l'activation plaquettaire au sein des tubes de prélèvement contenant le sang du patient. Après centrifugation, il se forme un culot plaquettaire à la frontière entre les globules et plasma. Le risque d'activation plaquettaire augmente alors en raison de la nature auto-activatrice des plaquettes et le risque de modifier des paramètres de la coagulation sanguine en activant certaines proenzymes liées à la coagulation se trouve ainsi accru. Pour cette raison des tubes à prélèvement spéciaux comme le CTAD (CitrateThéphylline-Adénosine-Dipyridamole) ont été mis au point en rajoutant des inhibiteurs de l'agrégation plaquettaires non spécifiques au sein du tube citraté. Les molécules de formule (I), et en particulier le peptide ZKW, qui peuvent bloquer l'activation plaquettaire, en particulier l'activation plaquettaire liée à la thrombine, enzyme majeure de l'hémostase au sein du tube citraté, peuvent être utilisés dans les tubes de prélèvement comme agents de blocage de l'activation plaquettaire. Par rapport aux anti-agrégants plaquettaires de l'art antérieur déjà employés dans cette application, les molécules de l'invention offrent les avantages d'une réduction des coûts, de la spécificité de l'inactivation et permettent l'amélioration de la fiabilité des paramètres hémostatiques dosés. Les molécules de formule (I) peuvent également être utilisées pour la préparation d'un kit de diagnostic des thromboses. EXEMPLES Figures #Figures 1 A, 1 B et 1 C : Purification de ZKW de venin de Cerastes cerastes. - figure lA : filtration du venin de Cerastes cerastes sur gel G75. - figure 1B : la fraction IV de la figure lA est analysée sur colonne C8 en HPLC (chromatographie liquide à haute performance) en phase inverse. - figure 1 C : la fraction IV-3 de la figure 1 B est analysée sur colonne C18. # Figure 2 : Effet du peptide de synthèse ZKW sur la rétraction du caillot. # Figures 3A, 3B et 3C : de l'agrégation plaquettaire in vitro par le peptide ZKW. - figure 3A : de l'agrégation plaquettaire (lapin) induite par l'a-thrombine par ZKW extrait du venin de Cerastes cerastes. - figure 3B : de l'agrégation plaquettaire (lapin) induite par l'a-thrombine (--) (0,04 IU /ml) et le collagène (-o-) (5 g/ml), par le peptide ZKW de synthèse. - figure 3C : de l'agrégation plaquettaire (humain) induite par l'a-thrombine par le peptide ZKW de synthèse (lapin). # Figure 4 : Inhibition de l'agrégation plaquettaire par les peptides de synthèse ZWK(-A-), ZKY(-n-), ZQW (-±) (agrégation induite par l'a-thrombine). ' Figure 5 : Inhibition de l'agglutination plaquettaire (humain) par le peptide de synthèse ZKW en présence de VWF et de ristocétine. Matériel employé : Les venins de Cerastes Cerastes ont été fournis par l'Institut Pasteur de Tunis et stockés à -20 C. La thrombine de lapin (HY/CR) et humaine (R3235) ont été achetées à la Société Hoffmann la Roche Diagnostica. Le collagène, le PAF aceter, le Calcium ionophore A23187, l'acide arachidonique et la ristocétine ont été achetés à la Société Chronolog. L'EGTA vient de la Société Sigma. Le fibrinogène vient de la Société Viabivitrium. Les colonnes HPLC proviennent de la Société Beckman. La colonne Sephadex 675 est commercialisée par la Société Pharmacia. L'agrégomètre vient de la Société Coultronics. Purification du peptide : Un lot de venin (400 unités d'absorbance à 280 nM) a été filtré sur une colonne Sephadex 675 dans de l'acétate d'ammonium 200 nM à pH 6,8. L'activité antiagrégante a été suivie par un test d'inhibition de l'agrégation de la thrombine de lapin décrit ci-dessous. Les fractions présentant une activité antiagrégante plaquettaire ont été purifiées par HPLC analytique en phase inverse sur une colonne C8 (250x6,4 nM, 5 Fini) équilibrée par une solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. Les produits étaient détectés à l'aide d'un détecteur Beckman 166 à 280 nM. Le caractère homogène de la fraction peptidique isolée à été contrôlée sur la colonne C18comme décrit ci-dessus. Synthèse peptidique et procédure de purification : Le peptide ZKW a été préparé par synthèse manuelle selon la méthode Boc en phase solide (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85,2149, 1963). La pureté du peptide a été contrôlée par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse (Merck, C18 Lichosper 5 m, 4x250 nM). Les fractions contenant le peptide pur ZKW ont été lyophilisés, analysés sur un appareil Beckmann 6300 et utilisés ensuite dans les tests biologiques. Préparation des plaquettes et test d'agrégation in vitro : Des plaquettes de lapin ont été préparées à partir d'un échantillon de sang traité par une solution aqueuse d'EDTA 0,2 M (Ardli et coll., Br. J. Haematol. 19,7, 1970). Des plaquettes humaines ont été préparées suivant le protocole décrit par Connoly et coll., J. Biol. Chem 267, 6893,1992. Le sang a été collecté par ponction veineuse chez des volontaires sains n'ayant pris aucun traitement médical pendant au moins 7 jours. Ces échantillons ont été placés dans des flacons contenant un mélange citrate de sodium/dextrose (1:5 V/V). Les plaquettes ont été séparées du sang, lavées et resuspendues dans un tampon de Tyrod modifié (pH=7,4) à une concentration finale de 3.108 cellules/ml. Les tests d'agrégation ont été faits à 37 C avec une agitation de 1100 tours par minute dans un agrégat chronolog. Les échantillons ont été pré-incubés avec les plaquettes pendant 2 minutes à 37 C avant d'être mis en présence d'antagonistes (thrombine 0,04 IU/ml ; PAF acether 10-7 M ; collagène 5 g/ml ; ADP z M ; Ca++ ionophore A23187 1,25.1 0-7 M). La concentration de peptide donnant 50% d'inhibition d'agrégation plaquettaire (150) a été déterminée à partir de la portion linéaire de la courbe de dose réponse. Agglutination plaquettaire : Les plaquettes fixées ont été préparées conformément au protocole : les plaquettes de lapin lavées (3.108 cellules/ml) ont été incubées une heure à température ambiante. Les plaquettes fixées ont été lavées deux fois par le tampon de Tyrode (pH=7,4) avant d'être utilisées dans des expériences d'agglutination. Les plaquettes ont été incubées pendant 20 minutes avec des quantités variables de peptide en présence de VWF (1 IU/ml) et de ristocetine (800 g/ml) avant de mesurer l'agglutination avec un agrégomètre Chronolog en agitant de façon continue à 1100 tour/min. Inhibition de la rétraction d'un caillot de plasma : Du PRP (Plasma riche en plaquettes) de lapin (0,6 ml) a été mélangé avec 0,3 ml de différentes concentrations d'un peptide ou avec un tampon phosphate dans un tube en verre. Les mélanges sont incubés à 37 C pendant 3 minutes. Puis 0,1 ml d'athrombine (5 IU/ml concentration finale) est additionné à chaque tube, agité et laissé 2 heures à 37 C. Le volume de sérum de chaque tube est mesuré et comparé à un contrôle. Effet du peptide ZKW sur l'activité pro coagulante et amidolytique de l'a-thrombine : Le temps de coagulation du fibrinogène a été mesuré suivant le protocole suivant : le temps de coagulation de 0,2 ml de fibrinogène humain (4 mg/ml) dans un tampon imidazole (50 nM, pH=7,4) a été mesuré après addition de 0,2 ml d'a-thrombine (4 IU/ml) pré-incubé à 37 C pendant 30 secondes avec le peptide ou le tampon. S2238 (substrat synthétique qui peux être hydrolysé par la thrombine : D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilide) (80 M) dans 0,02 M. Tris-HCl, pH=8,5 a été incubé avec 1,5.10-2 à 15.10-2 IU/ml d'a-thrombine en absence ou en présence de différentes concentrations du peptide (à compléter) et l'absorbance à 405 nM a été enregistrée immédiatement. RESULTATS Identification et purification du peptide : Au cours de la filtration du venin de Cerastes cerastes sur colonne Sephadex 675, quatre fractions ont été collectées (figure lA). La quatrième fraction représente 7% d'absorbance. Cette fraction est sélectionnée en raison de son activité antiagrégante plaquettaire élevée en présence d'a-thrombine.Cette fraction est analysée par chromatographie sur colonne C8 HPLC. On peut séparer quatre pics (figure 13). Le pic IV3 est responsable de l'essentiel de l'activité antiagrégante plaquettaire. Le caractère homogène et unitaire du pic est démontré par analyse sur colonne Ci en phase inverse (figure 1 C). PROPRIETES MOLECULAIRES DU PEPTIDE : Détermination de la masse moléculaire : Le peptide inhibiteur de l'agrégation plaquettaire a une masse de 440 daltons mesurée par ESMS (Electro Spray Mass Spectrometry ou spectrométrie de masse par nébulisation). Détermination de la séquence : Après hydrolyse acide, deux acides aminés dans un ratio 1/1 sont identifiés : Lys, Glu. Néanmoins le spectre d'absorbance de ce peptide présente un profil caractéristique du tryptophane, ce qui permet de supposer la présence de ces trois acides aminés. Des essais de séquençage par dégradation d'Edmann ont échoué. Ceci a conduit à supposer que l'amine N-terminale est bloquée par la présence d'un groupement acétyl-Lys ou pyro-Glu. La fragmentation du peptide par spectrométrie de masse a permis l'identification de la séquence pyro-Glu-Lys-Trp-OH Activité d'inhibition du peptide : L'a-thrombine à 0.04 IU/ml hydrolyse entièrement le substrat chromogénique S2238 (80 M/ml) en 5 minutes. Le peptide synthétique ZKW à une concentration de 23nM à 11 OnM n'inhibe pas de façon significative l'activité amidolytique de la thrombine. Effet du peptide sur l'activité coagulante de la thrombine : Le peptide de synthèse ZKW, testé à différentes concentrations (de 25 à 500 M), n'a pas d'effet sur l'activité procoagulante de la thrombine sur le fibrogène. Effet sur la rétraction du caillot : Du PRP (plasma riche en plaquettes) de lapin citraté (0,6 ml) est mélangé à 0,3 ml de ZKW aux concentrations de 1, 2,3, 5 et 10 microM ou à un tampon phosphate. Après incubation à 37 C pendant 3 minutes, 0,1 ml de thrombine (50 IU/ml) sont ajoutés, l'ensemble est mélangé et gardé à 37 C pendant 2 heures. Le volume de sérum pour chaque tube est mesuré et comparé à un contrôle. Chaque mesure est triplée. Les valeurs moyennes sont données. Le peptide synthétique ZKW à 4,5 M inhibe de façon dose dépendante la rétraction d'un caillot de PRP induit par 5 IU/ml de thrombine. Le demi effet est observé à une concentration de 0,75 microM (figure 2). Activité antiagrégant plaquettaire : Le peptide isolé de Cerastes cerastes inhibe l'agrégation de plaquettes de lapin lavées induite par l'a-thrombine (0,004 IU/ml) de façon dose-dépendante. La quantité du peptide ZKW produisant 50% d'inhibition de l'agrégation plaquettaire (IC50) est de 50 nM (figure 3A). L'agrégation des plaquettes de lapin induite par la thrombine (--) (0,04 lU/ml) et le collagène (-o-) (5 g/ml) est inhibée par le peptide de synthèse ZKW avec un IC50 de 35 nM et 50 nM respectivement comme illustré sur la figure 3B. En revanche, le peptide de synthèse n'exerce qu'une activité antiagrégante plaquettaire réduite lorsque l'agrégation des plaquettes lavées de lapin est induite par l'ADP (10-4 M), l'acide arachidonique (10-5 M), le calcium ionophore A23187 (1,25.10-7 M) et le PAF aceter (10-7 M). Seulement 20 à 30% d'inhibition sont atteints lorsque d'importantes concentrations de peptide de synthèse sont utilisées (50 à 600 nM) les données indiquent que les voies d'activation de l'agrégation plaquettaire initiées par l'a-thrombine et le collagène sont préférentiellement inhibées par le peptide pyroGlu-Lys-Trp. Le peptide de synthèse pyroGlu-Lys-Trp est capable d'inhiber l'agrégation des plaquettes humaines induite par l'a-thrombine (0,04 IU/ml). Cette inhibition est dose-dépendante. La concentration de peptide requise pour obtenir 50% d'inhibition de l'agrégation est de 20 nM, comme illustré sur la figure 3C. Relation structure activité : Trois peptides de structure proche de celle de ZKW ont été synthétisés de façon à évaluer les possibilités de faire varier la séquence. Le peptide ZWK de synthèse inhibe de façon significative l'agrégation des plaquettes lavées de lapin induite par l'a-thrombine (0,04 IU/ml) (-À-). L'efficacité maximale (environ 50% d'inhibition) est obtenue avec 150 nM du peptide de synthèse ZWK (-#-, figure 4). Le demi-effet (environ 25% d'inhibition) est observé avec 75 nM de ZKW. A la même concentration du peptide pyroGlu-Lys-Tyr, environ 25% d'inhibition est observée (-#-, figure 4). Aucune activité inhibitrice significative de l'agrégation plaquettaire n'est observée avec une concentration micromolaire (non illustrée) de pyroGlu-Gln-Trp (-#-, figure 4). Ces observations sont illustrées par la figure 4. Effet du peptide de synthèse ZKW sur l'agglutination plaquettaire : Le peptide de synthèse pyroGlu-Lys-Trp inhibe l'agglutination des plaquettes humaines lavées fixées par la formaline induite par vWF (von Willebrand Factor) (1 IU/ml) en présence de ristocétine (0,8 mg/ml) avec une inhibition maximale (90%) à 280nM et un demi-effet à 55 nM comme illustré par la figure 5. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une molécule répondant à la formule (I) : (1) dans laquelle XI, X2, identiques ou différents, représentent un groupement choisi parmi : 0 - une liaison peptidique -C-NH-, - une liaison -CH2-CH2-, - une liaison-CH=CH- - une liaison -CO-CH2- - une liaison -CH2-S-, - une liaison -CH2-NH-, - une liaison -CH2-0- , - une liaison-CH(OH)-CH2- - une liaison -CH2-SO-; X3 représente un groupement choisi parmi : - une fonction acide-COOH ; - une fonction ester -COORI, dans laquelle RI représente une fonction alkyle en C1-C12, saturée ou insaturée, éventuellement aromatique, linéaire, ramifiée ou cyclique ; - une fonction amide -CONH2 ; l'un de Y1 et de Y2 représente un groupement choisi parmi : - une fonction -(CH2)n - NH2 avec n entier allant de 1 à 3 ; l'autre de Y1et de Y2 représente la chaîne latérale d'un tryptophane ; ou de l'un de ses sels , pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'agrégation plaquettaire. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'une ou plusieurs des conditions suivantes sont vérifiées : - X1 et X2 représentent une liaison peptidique, - X3 représente une fonction-COOH, - Y1 représente la chaîne latérale d'une lysine -CH2-CH2-NH2, - Y2 représente la chaîne latérale d'un tryptophane. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la molécule de formule (I) est le peptide ZKW. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, au diagnostic et/ou au traitement des thromboses. 5. Kit de diagnostic des thromboses, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule répondant à la formule (I) selon la revendication 1.