Brevet FR2846331A1 — publié le 20040430

PHTALEINES DE PURETE ELEVEE ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION. La présente invention porte sur des phtaléines de pureté élevée et sur leur procédé de préparation. Elle porte plus particulièrement sur la fluorescéine de pureté élevée. Dans la présente description on entend par phtaléine de pureté élevée une phtaléine contenant au plus 1% en poids, de préférence au plus 0,5% en poids d'impuretés. Les phtaléines sont des molécules présentant le motif xanthène suivant : Ces produits sont utiles comme colorants dans diverses industries, notamment l'industrie textile, l'industrie du papier, l'imprimerie, la reprographie, l'industrie alimentaire, l'industrie cosmétique et l'industrie pharmaceutique. Les phtaléines font, actuellement, l'objet d'un important regain d'intérêt dans le domaine de la santé, pour leur utilisation diagnostique, notamment dans le cadre de l'imagerie médicale et dans le domaine des biotechnologies pour le marquage des molécules biologiques (acides nucléiques, protéines, lipoprotéines, lipides membranaires) et le suivi de l'activité biochimique intracellulaire ou extracellulaire des molécules biologiques. Par exemple, la fluorescéine est une phtaléine couramment utilisée en ophtalmologie pour la réalisation d'angiographies en fluorescence de la rétine. L'intérêt diagnostique de l'angiographie fluorescéinique est actuellement accru par l'apparition de nouveaux médicaments permettant le traitement des pathologies vasculaires de la rétine et de la choroïde et la disponibilité d'une nouvelle génération de rétinographes permettant la réalisation d'une imagerie numérisée en fluorescence plus performante et résolutive que les anciens systèmes d'acquisition sur émulsions photographiques. Parallèlement les exigences de qualité et de sécurité des nouvelles normes pharmaceutiques internationales (ICH : International Commission of Harmonisation, ICH Q Topic Q3A 1999) se sont considérablement accrues. Il en est de même en ce qui concerne les applications des phtaléines dans le domaine des biotechnologies qui nécessitent des réactifs de qualité de plus en plus élevée. Pour répondre aux exigences actuelles, le niveau de pureté des phtaléines utilisées dans le domaine pharmaceutique ou celui des biotechnologies doit nécessairement être très élevé. A titre d'exemple, dans la publication Effective differences in the formulation of intravenous fluorescein and related side effects , Am. J. Ophtalmol. 78,2 : 217-221,1974, L. Yannuzzi a montré qu'il existe une corrélation entre la pureté des phtaléines, en particulier celle de la fluorescéine, et la tolérance de ces substances lorsqu'elles sont administrées par voie injectable chez l' homme . Les phtaléines de pureté élevée selon l'invention présentent la formule générale (I) : (I) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5 qui sont identiques ou différents les uns des autres, sont choisis dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, hydroxyle, halogène, acétyle, amino, phosphate, nitro, sulfonate, carboxy, alkyl-carboxy de 2 à 30 atomes de carbone, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, carboxyalkyle ayant de 2 à 30 atomes de carbone, aminoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, sulfoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, aryl-alkyle, halogénoaryle, arylester, succinimidylester, isothiocyanate, maléimide, iodoacétamide, halogénoacétamide, chlorosulfonique, les bases puriques ou pyrimidiques, les oses, de préférence les hexoses ou les pentoses, les oligosides et les polyosides, les polypeptides, les protéines et les phospholipides, RI et R5 ne représentant pas chacun l'hydrogène lorsque RI représente un groupe -CH2-CH2-COOH, R2 représente un groupe hydroxy et R4 représente un groupe-COOH, ces phtaléines ne contenant pas plus de 1% en poids, de préférence pas plus de 0,5% en poids et plus préférentiellement encore pas plus de 0,2% en poids d'impuretés résiduelles. Une phtaléine particulièrement intéressante, notamment pour des applications ophtalmiques est la fluorescéine présentant une telle pureté. Il est connu de préparer les phtaléines de formule (I) par condensation d'un dérivé de l'anhydride phtalique et d'un dérivé phénolique ayant une position libre en ortho d'un groupe hydroxyle. Cette condensation est réalisée par chauffage à la température de fusion d'un mélange de l'anhydride phtalique et du dérivé phénolique, dans les proportions souhaitées. Cette condensation peut éventuellement être réalisée dans un solvant de dilution. Elle peut également être conduite en présence d'un catalyseur. En l'absence de solvant, lors du chauffage, le milieu réactionnel s'épaissit rapidement et a tendance à prendre en masse. Au sein du milieu réactionnel, il se forme alors des zones où la température est trop élevée et des zones où la température n'est pas assez élevée. Dans les zones où la température est trop élevée, les réactifs et/ou le produit de réaction sont dégradés et dans les zones où la température n'est pas assez élevée, la réaction n'est pas complète. Le produit obtenu est de médiocre qualité car il comporte des sous-produits très difficiles à éliminer. Afin d'améliorer ce procédé connu, on a proposé l'ajout d'un solvant inerte ou l'utilisation d'un catalyseur. Aussi, le brevet US 1,931,049 décrit l'ajout au milieu réactionnel d'un solvant inerte constitué par un hydrocarbure benzénique ou aliphatique, plus particulièrement l'orthodichlorobenzène. Cependant, la réaction de condensation est alors incomplète, et il se forme des produits intermédiaires difficiles à éliminer par la suite. Il s'en suit que le procédé décrit dans le brevet US 1,931,049 ne permet pas l'obtention d'une phtaléine de pureté élevée selon la définition de la présente demande. Par ailleurs, les hydrocarbures aliphatiques supérieurs ne sont pas miscibles avec le milieu réactionnel; par conséquent, ils n'apportent pas d'amélioration sur le plan du transfert thermique et gênent l'élimination de l'eau formée ce qui ralentit la réaction, laquelle a lieu exclusivement en milieu hydrophobe. Pour ce qui est des catalyseurs proposés pour améliorer le rendement de la réaction, il s'agit de l'acide sulfurique concentré, du chlorure de zinc anhydre et du chlorure d'étain. Dans le brevet allemand DE 360691, il a été proposé d'utiliser en tant que catalyseur, un acide sulfonique aromatique, tel que l'acide benzène sulfonique, seul ou associé à l'un des trois catalyseurs précités. Il se trouve toutefois que l'adjonction de ces catalyseurs entraîne une prise en masse rapide du produit de la réaction avec un emprisonnement des impuretés qui ne peuvent plus être éliminées du produit recherché. Afin d'éliminer les sous-produits formés et les impuretés, des procédés d'isolement et de purification ont été mis au point mais n'ont pas permis d'améliorer sensiblement la qualité des phtaléines. Un procédé classiquement utilisé consiste à alcaliniser la phtaléine en milieu aqueux pour la dissoudre puis à l'acidifier pour permettre sa précipitation. Ces deux étapes sont renouvelées successivement pour tenter d'éliminer les impuretés. Néanmoins, cette méthode ne permet pas une amélioration notable de la pureté du produit car si les impuretés se dissolvent avec la phtaléine au cours de l'étape d'alcalinisation, elles précipitent à nouveau en même temps que la phtaléine au cours de l'étape d'acidification. De plus, cette méthode de purification a pour inconvénient de produire une quantité importante de sels qui sont difficiles et coûteux à éliminer par la suite. Le brevet US 1,965,842 décrit la purification des phtaléines, dérivées de l'hydroxybenzéne, par une extraction directe des sous-produits à l'aide de dichlorobenzène utilisé seul ou en mélange avec d'autres solvants. Cette extraction directe du produit brut avec le solvant en question ne permet cependant pas une élimination poussée des impuretés qui restent en partie piégées dans les cristaux de phtaléine. Aucun des procédés de purification décrits dans l'art antérieur ne permet d'atteindre un niveau de pureté suffisant pour permettre un usage pharmaceutique des phtaléines. Etant donné l'intérêt de ces molécules pour le diagnostic médical, la fabrication de phtaléines de pureté élevée correspond à un réel besoin médical et répondrait à une forte demande, notamment pour des applications pharmaceutiques en ophtalmologie, pour le diagnostic notamment en imagerie médicale ou dans le domaine des applications en biotechnologie (par exemple pour le marquage de molécules). Les inventeurs, à l'issue de recherches approfondies, ont eu le mérite de trouver qu'il était possible d'obtenir des produits de pureté élevée par condensation d'un anhydride phtalique avec un dérivé phénolique ou naphtolique dans un solvant particulier qui est constitué par un ester d'acide organique. Ils ont également trouvé que l'utilisation des esters d'acide organique comme solvants permettait de réaliser cette condensation, avec un excellent rendement, supérieur à 75%. En effet, ces solvants ont la particularité - d'une part, de conduire à une cristallisation spécifique de la phtaléine issue de la condensation et d'exclure, des cristaux formés, toutes les impuretés qui restent dissoutes dans le milieu réactionnel et - d'autre part, de permettre que la réaction de condensation soit totale et prédomine au détriment des réactions secondaires indésirables, ce qui conduit à la consommation totale des réactifs et minimise la formation des sous-produits. Le procédé conforme à l'invention permet ainsi d'obtenir des phtaléines de pureté élevée avec un rendement satisfaisant sur le plan industriel. Plus particulièrement, l'invention a donc pour objet un procédé de préparation de phtaléines, débarrassées de leurs impuretés résiduelles, présentant la formule générale (I) : (I) dans laquelle RI, R2, R3, R4, R5 qui sont identiques ou différents les uns des autres, sont choisis dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, hydroxyle, halogène, acétyle, amino, phosphate, nitro, sulfonate, carboxy, alkyl-carboxy de 2 à 30 atomes de carbone, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, carboxyalkyle ayant de 2 à 30 atomes de carbone, aminoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, sulfoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, aryl-alkyle, halogénoaryle, arylester, succinimidylester, isothiocyanate, maléimide, iodoacétamide, halogénoacétamide, chlorosulfonique, les bases puriques ou pyrimidiques, les oses, de préférence les hexoses ou les pentoses, les oligosides et les polyosides, les polypeptides, les protéines et les phospholipides, R1 et R5 ne représentant pas chacun l'hydrogène lorsque RI représente un groupe -CH2-CH2-COOH, R2 représente un groupe hydroxy et R4 représente un groupe-COOH, par condensation d'un dérivé de l'anhydride phtalique de formule (II) avec un composé phénolique ou naphtolique de formule (III) (II) (III) dans lesquelles R1, R2, R3, R4, R5 ont les mêmes significations que ci-dessus, au sein d'un solvant constitué par un ester d'acide organique. De façon particulièrement avantageuse, le composé de départ (III) qui est condensé avec l'anhydride phtalique (II) est choisi dans le groupe comprenant notamment le résorcinol, l'orcinol, le naphtol, le pyrogallol, l'alkylaminophénol et l'arylaminophénol. Dans le cas où le résorcinol est utilisé comme produit de départ, le procédé conforme à l'invention permet la préparation de la fluorescéine. De façon avantageuse, le solvant utilisé dans le procédé conforme à l'invention est un ester d'acide organique de formule (IV) R6-COOR7 (IV) dans laquelle R6 est choisi dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, alkylaryle, aryl-alkyle, aryl-alkyle substitué, halogénoaryle, arylester, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, R7 représentant un groupe alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, alkyl-aryl, aryl-alkyle, aryl-alkyle substitué, halogénoaryle, arylester, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone. De façon particulièrement avantageuse, le susdit solvant est choisi dans le groupe comprenant les benzoates, les heptanoates, les octanoates, les laurates, les myristates et les palmitates de méthyle, d'éthyle, de propyle ou de butyle, et leurs mélanges. Le solvant est choisi en fonction de sa température d'ébullition, de façon à permettre de conduire la réaction de condensation à une température comprise entre 150 C et 250 C. La réaction de condensation peut être conduite à la pression atmosphérique ou sous une pression adaptée en fonction de la différence existant entre la température correspondant au point d'ébullition du solvant utilisé et la température nécessaire pour conduire la réaction, en particulier sous une pression supérieure à la pression atmosphérique lorsque le point d'ébullition du composé(IV)est plus bas que la température de la réaction. La réaction de condensation peut être conduite en présence d'un catalyseur choisi dans le groupe comprenant notamment les acides de Lewis, tels que ZnCl2 ou A1C13, les acides de Bronsted tels que H2SO4, l'acide polyphosphorique ou leurs sels. De façon avantageuse, le catalyseur utilisé est un sel alcalin d'hydrogénosulfate. De façon particulièrement avantageuse, le catalyseur utilisé est l'hydrogénosulfate de potassium (KHS04) ou l'hydrogénosulfate de sodium. L'utilisation d'hydrogénosulfate comme catalyseur permet l'obtention d'un excellent rendement pour la réaction de condensation et présente l'avantage, contrairement aux autres catalyseurs, de permettre l'obtention d'une condensation complète des réactifs, de pouvoir être éliminé totalement de la phtaléine obtenue et de ne pas induire la formation de goudrons dans le milieu réactionnel. A l'issue de la réaction de condensation, on obtient un produit brut dont la pureté organique est déjà beaucoup plus élevée que celle des produits issus des procédés de l'art antérieur puisqu'elle est égale ou supérieure à 95%. Néanmoins cette pureté n'est pas encore suffisante pour permettre une utilisation pharmaceutique notamment par voie injectable. D'autre part, comme montré ci-dessus, les méthodes de purification décrites dans l'art antérieur ne conduisent pas à un procédé permettant d'améliorer notablement cette pureté. A l'issue de recherches approfondies et de façon tout à fait inattendue, les inventeurs ont trouvé qu'il était possible d'augmenter considérablement la pureté des phtaléines brutes obtenues par la réaction de condensation en les traitant par un acide fort ou un de ses précurseurs dans un milieu organique anhydre. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé conforme à l'invention comporte, par conséquent, après la réaction de condensation, une étape consistant à acidifier le produit résultant de la condensation, en milieu organique anhydre, par addition d'un acide fort ou un de ses précurseurs choisi dans le groupe comprenant notamment l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide iodhydrique, l'acide polyphosphorique, le pyrophosphate (P205), et leurs mélanges. Cette acidification est conduite jusqu'à la conversion des cristaux de phtaléine résultant de la condensation, en cristaux de phtaléine de structure différente. Cette étape d'acidification a pour effet de convertir la phtaléine brute insoluble et dispersée dans le milieu organique en une forme de structure cristalline différente et peu soluble dans ce même milieu. Cette conversion est très rapide, et s'effectue en passant par une phase de solubilisation intermédiaire au cours de laquelle les impuretés sont libérées et éliminées totalement des cristaux de phtaléine. Ce nouveau procédé de purification est très avantageux car il nécessite très peu de solvant et permet l'obtention d'une pureté très élevée en un temps très bref. Selon le procédé de la présente invention, cette étape de purification est réalisée en dispersant la phtaléine brute issue de la condensation, dans un solvant anhydre, de préférence dans un alcool, une cétone, un éther, un solvant halogéné, utilisé seul ou en mélange, plus préférentiellement encore dans l'éthanol absolu ou l'acétone seul ou en mélange. La dispersion de phtaléine brute ainsi obtenue est acidifiée par addition d'un acide fort ou un de ses précurseurs choisi dans le groupe comprenant notamment l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide iodhydrique, l'acide polyphosphorique, le pyrophosphate (P2O5) et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acidification est réalisée soit en faisant barboter de l'acide chlorhydrique gazeux dans la dispersion de phtaléine, soit en ajoutant de l'acide chlorhydrique préalablement dissous dans un solvant organique. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, le produit obtenu après acidification est lavé à l'aide d'une solution de lavage choisie dans le groupe comprenant l'eau, les solvants polaires comme les alcools, les cétones, ou les solvants légèrement polaires comme les éthers et les solvants halogénés, utilisés purs ou en mélange. A l'issue de l'étape de purification, les phtaléines ainsi traitées ont une pureté supérieure à 98%, de préférence supérieure à 99 %, plus préférentiellement supérieure à 99,5%, et encore plus préférentiellement de 99,8%. Les phtaléines ainsi obtenues ont une qualité adaptée pour permettre la préparation d'une autre phtaléine de formule (I) par modification chimique des groupements RI, R2, R3, R4, R5 selon les procédés classiques de l'art, notamment pour l'obtention de phtaléines utilisables pour le marquage des molécules biologiques (acides nucléiques, protéines, lipoprotéines, lipides membranaires) et dans le domaine des applications en biotechnologie (par exemple pour le marquage de molécules et de leur activité biochimique intra ou extracellulaire). L'invention est particulièrement adaptée pour la préparation de fluorescéine de très grande pureté, c'est à dire telle que sa teneur en chacun des sous-produits de la réaction est inférieure ou égale à 0,2% et de préférence inférieure ou égale à 0,1%, la somme des teneurs en chacun de ces sous-produits étant inférieure ou égale à 0,5%. Le procédé de préparation d'une fluorescéine présentant la susdite pureté comprend les étapes successives suivantes : - condensation de l'anhydride phtalique avec le résorcinol, dans un solvant qui est un ester d'acide organique aliphatique ou aromatique, de préférence le benzoate de méthyle, en présence d'un catalyseur choisi dans le groupe des acides de Bronsted, - mise en suspension des cristaux de couleur rouge obtenus à l'étape précédente dans un solvant anhydre choisi dans le groupe comprenant les alcools tels que l'éthanol absolu, les cétones telles que l'acétone, les éthers, les solvants halogénés, ou leurs mélanges, - acidification de la suspension obtenue par addition d'un acide fort ou un de ses précurseurs choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide iodhydrique, l'acide polyphosphorique, le pyrophosphate (P205) , ou leurs mélanges, jusqu' à l' obtention de cristaux de couleur jaune, - lavage des cristaux ainsi obtenus à l'aide d'une solution de lavage choisie dans le groupe comprenant l'eau, les alcools, les cétones, les éthers et les solvants halogénés, purs ou en mélange, jusqu'à l'obtention de cristaux de couleur rouge. Les cristaux de fluorescéine de couleur rouge présentent un cristallographe RX tel que celui représenté sur la figure 1 ; les cristaux de fluorescéine de couleur jaune présentent un cristallographe RX tel que celui représenté sur la figure 2 ; ces cristallographes étant réalisés sur l'appareillage suivant : Générateur PHILIPS 1729, Goniomètre PHILIPS 1050, Radiation Cu Ka, Logiciel acquisition GONIO et Logiciel traitement RAYON, dans les conditions opératoires suivantes: Tension : 40mV Intensité : 40mA Nombredepoints 4000 Nombredepassages :10 Périoded'acquisition : 250ms Anglededépart ( 0) : 3.000 Angledefin( #) : 23.000 Etalon : Silicium Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la fluorescéine, le catalyseur utilisé pour la réaction de condensation est de l'hydrogénosulfate d'un métal alcalin, de préférence de l'hydrogénosulfate de potassium ou de sodium. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la fluorescéine, l'acidification est réalisée par barbotage d'acide chlorhydrique gazeux dans la suspension de fluorescéine ou par l'action, sur cette fluorescéine, d'acide chlorhydrique en solution dans un solvant organique anhydre, choisi de préférence dans le groupe comprenant les alcools, les cétones, les éthers et les solvants halogénés utilisés isolément ou en mélange, plus préférentiellement encore, l'isopropanol, l'éthanol absolu ou l'acétone, purs ou en mélange. De façon avantageuse, l'étape de lavage est réalisée à l'aide d'un mélange d'eau, d'éthanol et d'acétone. Grâce à ce procédé conforme à l'invention, il est possible de préparer de la fluorescéine présentant une pureté égale ou supérieure à 99,7%, ce qui présente des avantages incontestables notamment pour les utilisations pharmaceutiques en diagnostic notamment en imagerie médicale ou encore dans le domaine des applications en biotechnologie. Les inventeurs ont mis en évidence une nouvelle forme cristallographique de la fluorescéine présentant des cristaux de couleur jaune. Cette nouvelle forme cristalline est identifiée par le spectre de radiocristallographie de la Figure 2 qui a été réalisé dans les conditions mentionnées ci-dessus. Ils ont également mis en évidence une nouvelle forme cristallographique des composés suivants 4',5'dihydroxyfluorescéine et 4',5'-diméthylfluorescéine. Ainsi, l'invention porte sur les cristaux de fluorescéine de couleur jaune dont le spectre de radiocristallographie est donné sur la Figure 2. L'invention porte également sur les cristaux de 4',5'dihydroxyfluorescéine de couleur jaune dont le spectre de radiocristallographie est donné sur la Figure 4. Elle porte également sur les cristaux de 4',5'diméthylfluorescéine de couleur rouge sombre dont le spectre de radiocristallographie est donné sur la Figure 6. Tous les spectres ont été réalisés avec l'appareillage et dans les conditions mentionnés ci-dessus. L'invention va être décrite de façon plus détaillée à l'aide des exemples suivants qui ne sont pas limitatifs mais relatifs à des modes de réalisation avantageux. EXEMPLES EXEMPLE 1: Préparation de fluorescéine de pureté élevée Synthèse de la fluorescéine : Un mélange comprenant 55 g de résorcinol, 30 g d'anhydride phtalique, 2 g d'hydrogénosulfate de potassium et 500 ml de benzoate de méthyle est porté à 200 C pendant 6 heures. Après refroidissement, les cristaux rouges de fluorescéine brute sont lavés à l'acétone et séchés. Masse obtenue = 51,8 g (78%). Ces cristaux sont analysés par radiocristallographie dans les conditions opératoires suivantes: Appareil GénérateurPHILIPS 1729 GoniomètrePHILIPS 1050 RadiationCuKa LogicielacquisitionGONIO LogicieltraitementRAYON Conditions Tension : 40mV Intensité : 40mA Nombredepoints 4000 Nombredepassages :10 Périoded'acquisition :250ms Anglededépart ( 8) : 3.000 Angledefin( #) : 23.000 Etalon : Silicium On obtient le radiocristallographe de la figure 1, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distance ( ) % intensités Nombre de coups 5. 3600 8. 2457 18. 09 647 5. 9500 7. 4306 31. 10 1112 6. 7000 6. 6020 36.30 1298 8. 3750 5. 2883 45. 95 1643 9. 1050 4. 8675 10. 79 386 9. 4300 4.7012 14. 09 504 9. 9950 4. 4379 8. 03 287 10. 9150 4. 0678 9. 73 348 11.6200 3. 8241 16,41 587 11.7300 3. 7888 5. 40 193 12. 4200 3. 5813 2. 82 101 13. 2150 3. 3694 100. 00 3576 13. 5050 3. 2983 7. 47 267 13. 8850 3. 2097 79. 03 2826 14. 9650 2. 9828 5. 62 201 15. 3100 2. 9172 3. 91 140 15. 7600 2. 8359 11.69 418 16. 0000 2. 7945 8. 67 310 16. 9100 2. 6481 4. 28 153 17. 4750 2. 5650 3. 97 142 17. 8550 2. 5122 3. 80 136 18. 2300 2. 4622 2. 52 90 18. 5150 2. 4256 2. 96 106 18. 8250 2. 3871 5. 03 180 19. 0800 2. 3563 3. 27 117 20. 4300 2. 2066 3. 05 109 20. 6800 2. 1811 4. 53 162 20. 9300 2. 1562 3. 08 110 21. 1800 2. 1319 2. 38 85 22. 9400 1. 9762 4. 53 162 longueur d'onde : 1.54051Â Purification de la fluorescéine brute : 50 g de fluorescéine brute obtenus à l'étape précédente sont agités dans 1000 ml de mélange éthanol/acétone. A ce mélange est ajouté de l'acide sulfurique concentré jusqu'à conversion complète des cristaux rouges en cristaux jaunes. Les cristaux jaunes obtenus sont analysés par radiocristallographie comme précédemment. On obtient le radiocristallographe de la figure 2, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distances (Â) % Intensités Nbre de coups 3. 3500 13. 1813 8. 55 56 4. 0050 11.0283 47. 18 309 4. 8550 9. 1010 12. 98 85 5. 2650 8. 3940 9. 01 59 5. 4500 8. 1099 11. 45 75 5. 7900 7. 6352 52. 98 347 6. 3000 7. 0193 16. 95 111 6. 7700 6. 5340 17. 86 117 7. 4900 5. 9090 17.56 115 8. 0300 5. 5140 69.77 457 8. 4250 5. 2572 33. 13 217 8. 7800 5.0462 8. 40 55 9. 1550 4. 8411 15. 88 104 9. 3400 4. 7461 42. 44 278 9. 6550 4.5926 34. 66 227 9. 8800 4. 4891 24. 43 160 10. 1950 4. 3518 57. 71 378 10. 5800 4. 1951 58. 02 380 10. 7350 4. 1352 38. 17 250 11.1650 3. 9779 28. 85 189 11.4800 3. 8701 30. 23 198 11.7200 3. 7919 59. 85 392 12. 1100 3. 6716 26. 41 173 12. 3950 3. 5884 58. 47 383 12. 6400 3. 5200 100. 00 655 12. 9450 3. 4384 30. 84 202 13. 1550 3. 3845 56. 64 371 13. 8350 3. 2211 14. 66 96 14. 0550 3. 1717 24. 12 158 14. 3550 3. 1068 36. 34 238 14. 6700 3. 0415 42. 90 281 15. 1300 2. 9511 42. 90 281 15. 7500 2. 8377 18. 47 121 15. 9400 2. 8047 18. 17 119 16. 2500 2. 7526 15. 42 101 16,7550 2. 6719 17. 71 116 16. 8500 2. 6573 19. 39 127 17. 2250 2. 6011 18. 17 119 17. 7300 2. 5293 15. 73 103 18. 4200 2. 4377 10. 23 67 18. 5750 2. 4180 10. 23 67 @ 19. 2650 2. 3345 15. 88 104 19. 5800 2. 2984 10. 84 71 19. 8000 2. 2739 11. 91 78 20. 1150 2. 2397 13. 28 87 20. 6500 2. 1841 14. 81 97 21. 1500 2.1348 11.30 74 21. 2750 2. 1228 10. 08 66 21. 8100 2. 0732 7. 94 52 22. 2500 2. 0342 9. 16 60 22. 6250 2. 0022 9. 62 63 22. 9100 1. 9786 9. 01 59 Longueur d'onde . 1. 54051 Â Ces cristaux sont filtrés puis lavés avec un mélange éthanol/acétone/eau (40/40/20). Le lavage reconvertit les cristaux de fluorescéine jaune en cristaux de fluorescéine rouge dont la pureté est plus élevée. Pureté en CLHP : 99,8% EXEMPLE 2: Préparation de la 4',5'-diméthylfluorescéine de pureté élevée. Synthèse de la 4' ,5'-diméthylfluorescéine Un mélange comprenant 62 g de 2-méthylrésorcinol, 30 g d'anhydride phtalique, 2g d' hydrogénosulfate de potassium et 500 ml de laurate d'éthyle est porté à 200 C pendant 3 heures. Après refroidissement, le produit brut est filtré et lavé à l'acétone puis séché. Le produit obtenu est une poudre orange foncé. Masse obtenue = 49,7 g (69%) Ces cristaux sont analysés par radiocristallographie de la même façon que dans l'exemple 1. On obtient le radiocristallographe de la figure 3, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distances Â % Intensités Nbre de coups 3,5700 12. 3700 7. 38 81 5. 0290 8. 7938 45. 49 499 6. 6650 6. 6365 62. 26 683 6. 7400 6. 5630 60. 07 659 7. 1300 6. 2057 87. 24 957 7. 4550 5.9366 20. 97 230 8. 3700 5. 2915 6. 56 72 8. 9300 4.9621 30. 63 336 9. 0950 4. 8728 10. 12 111 9. 3300 4. 7511 21. 24 233 9. 4550 4. 6889 19. 05 209 10. 0350 4. 4204 12. 12 133 10. 3250 4. 2975 18. 87 207 10. 6000 4. 1873 11. 49 126 10. 8300 4. 0994 39. 65 435 11. 2900 3. 9344 12. 49 137 11. 4500 3. 8801 10. 85 119 11.7550 3. 7808 28. 17 309 11.9050 3. 7339 52. 42 575 12. 2550 3. 6288 79. 95 877 12. 7050 3. 5023 8. 11 89 13. 2400 3.3631 21. 15 232 13. 4200 3. 3188 100. 00 1097 13. 7100 3. 2499 10. 85 119 14. 5250 3.0712 8. 84 97 14.8350 3.0084 2 255 15. 0550 2. 9654 17. 59 193 15. 1550 2. 9463 15. 13 166 15. 3650 2. 9070 25. 80 283 15. 7050 2. 8456 20. 51 225 16. 1900 2. 7625 14. 13 155 16. 7550 2. 6719 9. 02 99 17. 5400 2. 5558 7. 47 82 17. 8850 2. 5081 8. 75 96 18. 1050 2. 4786 6. 75 74 18. 4900 2. 4288 19. 51 214 18. 7950 2. 3907 6. 11 67 18. 8900 2. 3791 6. 84 75 19. 6800 2. 2872 15. 50 170 20. 2100 2. 2296 7. 38 81 20. 3950 2. 2103 9. 66 106 20. 6800 2.1811 6. 84 75 20. 9950 2. 1498 5. 38 59 21. 4650 2. 1049 7. 11 78 21. 6500 2. 0878 8. 84 97 21. 9350 2. 0620 9. 21 101 22. 1250 2.0451 9. 02 99 22.5300 2.0102 5.47 60 22. 7850 1.9889 5. 93 65 Longueur d'onde : 1. 54051 Â Purification de la 4' ,5'-diméthylfluorescéine 40 g de 4' ,5' -diméthylfluorescéine brute sont ajoutés dans 800 ml de mélange éthanol/acétone. A ce mélange est ajouté de l'acide sulfurique concentré jusqu'à conversion complète de cristaux de couleur orange foncé en cristaux de couleur jaune. Les cristaux jaunes obtenus sont analysés par radiocristallographie comme précédemment. On obtient le radiocristallographe de la figure 4, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distances (À) % Intensités Nbre de coups 3. 7050 11. 9199 22. 22 172 4. 6150 9. 5732 45. 61 353 4. 9300 8. 9629 46. 77 362 6. 3300 6.9861 8. 53 66 6. 6150 6.6864 6. 20 48 7. 3000 6.0619 19. 51 151 7. 4500 5. 9405 32. 56 252 7. 6500 5. 7861 26. 61 206 8. 1250 5. 4499 64. 21 497 8. 6300 5. 1332 22. 48 174 9. 5950 4. 6211 6. 59 51 10. 4450 4. 2487 41. 34 320 10. 8500 4. 0919 10. 21 79 11. 3550 3. 9122 14. 60 113 11. 7000 3. 7983 9. 17 71 11. 7950 '3.7682 9. 30 72 12. 2250 3. 6375 23. 13 179 12. 4500 3. 5728 58. 79 455 12. 7650 3. 4861 19. 90 154 12. 8950 3. 4515 18. 60 144 13. 1000 3. 3984 100. 00 774 13. 6350 3. 2675 67. 44 522 14. 1400 3. 1530 30. 75 238 14. 5250 3. 0712 14. 08 109 14. 8400 3. 0074 22. 74 176 15. 1750 2. 9425 19. 38 150 15. 3500 2. 9098 30. 23 234 15. 6950 2. 8474 20. 93 162 16. 0950 2. 7784 7. 24 56 16. 2850 2. 7468 7. 49 58 16. 5950 2. 6969 8. 01 62 16. 9100 2. 6481 14. 08 109 17. 3200 2. 5873 8. 66 67 17. 5400 2. 5558 7. 88 61 17. 9150 2. 5040 13. 31 103 18. 3550 2. 4460 9. 69 75 18. 4800 2. 4300 10. 59 82 18. 8600 2. 3828 15. 37 119 19. 2350 2. 3380 9. 43 73 19. 4850 2. 3092 7. 75 60 20. 2100 2. 2296 14. 99 116 20. 7100 2. 1781 7. 11 55 20. 8350 2. 1656 6. 59 51 21. 0850 2. 1411 6. 33 49 21. 5250 2. 0993 12. 92 100 21.6500 2. 0878 8. 79 68 21. 8400 2. 0705 6. 98 54 22. 0900 2. 0482 10. 34 80 226550 1. 9997 7. 11 55 Longueur d'onde : 1. 54051 À Après filtration et recristallisation dans un mélange acétone/eau ou lavage dans éthanol/acétone/eau, les cristaux de couleur jaune se reconvertissent en cristaux de couleur orange foncé. EXEMPLE 3: Préparation de la 4',5'-dihydroxyfluorescéine Synthèse de la 4' ,5'-dihydroxyfluorescéine Un mélange comprenant 63 g de pyrogallol, 30 g d'anhydride phtalique, 2g d'hydrogénosulfate de potassium et 500 ml de myristate d'éthyle est porté à 200 C pendant 3 heures. Après refroidissement, le produit brut est filtré et lavé à l'acétone puis séché. Le produit obtenu est une poudre marron-gris ou anthracite. Masse obtenue = 43,5 g (59,7%) Les cristaux obtenus sont analysés par radiocristallographie comme précédemment. On obtient le radiocristallographe de la figure 5, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distances ( ) % Intensités Nbre de coups 3. 6450 12. 1158 73. 08 980 5. 9200 7. 4681 8. 13 109 6. 7200 6. 5824 13. 35 179 7. 3350 6. 0331 10. 29 138 8. 5050 5. 2081 11. 78 158 9. 2300 4. 8021 15. 59 209 9. 7400 4. 5529 18. 20 244 10. 3400 4. 2914 21. 40 287 10. 9150 4. 0678 6. 71 90 11.2600 3. 9447 8. 80 118 12. 2550 3. 6288 18. 64 250 12. 5550 3. 5434 12. 75 171 13. 2000 3. 3731 11.86 159 13. 7200 3. 2476 100. 00 1341 14. 7150 3. 0324 17,75 238 14. 8600 3. 0034 13. 57 182 16. 1600 2. 7675 6. 79 91 17. 2550 2. 5967 7. 83 105 18. 3550 2. 4460 6. 86 92 Longueur d'onde : 1. 54051 Â Purification de la 4' ,5'-dihydroxyfluorescéine 40 g de 4' ,5' -dihydroxyfluorescéine brute sont ajoutés dans 800 ml de mélange éthanol/acétone. A ce mélange est ajouté de l'acide sulfurique concentré jusqu'à conversion complète de cristaux de couleur marron-gris ou anthracite en cristaux de couleur marron-rouge ou acajou. Les cristaux obtenus sont analysés par radiocristallographie comme précédemment. On obtient le radiocristallographe de la figure 6, dont les pics sont identifiés ci-après. Thêta (degrés) Distances (Â) % Intensités Nbre de coups 3. 2500 13. 5865 90. 53 526 3. 5350 12. 4923 18. 76 109 3. 7850 11. 6683 11. 70 68 3. 9450 11. 1958 13. 25 77 4. 1650 10.6053 15. 15 88 4. 5400 9. 7310 10. 33 60 4. 6350 9. 5319 10. 15 59 6. 3950 6. 9154 9. 29 54 6. 5500 6. 7525 11. 53 67 6. 8200 6. 4863 27. 71 161 7. 1150 6. 2187 10. 50 61 7. 4800 5. 9168 21. 51 125 7. 8700 5. 6253 12. 91 75 8. 2200 5. 3874 27. 88 162 8.7800 5. 0462 41.48 241 9. 2200 4. 8073 10. 15 59 9. 5350 4. 6499 11. 70 68 9. 7950 4. 5276 42. 17 245 10. 1000 4. 3923 17. 21 100 10. 5400 4.2108 16. 70 97 10. 8850 4. 0789 16. 52 96 11.6500 3. 8144 25. 13 146 11. 8900 3. 7385 13. 60 79 12. 0450 3. 6911 13. 08 76 12. 3900 3. 5898 16. 52 96 12. 5800 3. 5365 14. 80 86 12. 8750 3. 4568 27. 37 159 12. 9950 3. 4254 25. 82 150 13. 2900 3. 3507 67. 64 393 13. 5750 3. 2816 27. 02 157 13. 7150 3. 2488 27. 02 157 14. 1100 3. 1596 100.00 581 14. 6200 3. 0516 15. 66 91 14. 7750 3.0203 18. 24 106 15. 0400 2.9683 25. 13 146 15. 3050 2. 9181 24. 78 144 15. 6850 2. 8491 16. 35 95 15. 9400 2. 8047 11. 02 64 16. 2500 2. 7526 10. 67 62 16. 5950 2. 6969 12. 22 71 17. 1650 2. 6099 9. 81 57 17. 5700 2. 5516 8. 78 51 17. 7600 2. 5252 9. 81 57 18. 0750 2. 4826 11. 36 66 18. 5150 2. 4256 8. 43 49 18. 7650 2. 3944 13. 08 76 19. 0450 2. 3605 11.36 66 20. 1950 2. 2312 50,09 291 20. 6150 2. 1877 9. 12 53 21. 0550 2. 1440 12. 56 73 21. 4650 2. 1049 9. 29 54 21. 6850 2. 0846 9. 98 58 22. 0600 2. 0509 9. 81 57 Longueur d'onde : 1. 54051 Â Après filtration et lavage dans l'eau, les cristaux de couleur marron-rouge ou acajou se reconvertissent en cristaux de couleur marron-gris ou anthracite. REVENDICATIONS 1. Phtaléine de formule générale (I) : (I) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5 qui sont identiques ou différents les uns des autres, sont choisis dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, hydroxyle, halogène, acétyle, amino, phosphate, nitro, sulfonate, carboxy, alkyl-carboxy de 2 à 30 atomes de carbone, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, carboxyalkyle ayant de 2 à 30 atomes de carbone, aminoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, sulfoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, aryl-alkyle, halogénoaryle, arylester, succinimidylester, isothiocyanate, maléimide, iodoacétamide, halogénoacétamide, chlorosulfonique, les bases puriques ou pyrimidiques, les oses, de préférence les hexoses ou les pentoses, les oligosides et les polyosides, les polypeptides, les protéines et les phospholipides, R1 et R5 ne représentant pas chacun l'hydrogène lorsque R1 représente un groupe -CH2-CH2-COOH, R2 représente un groupe hydroxy et R4 représente un groupe-COOH, ces phtaléines ne contenant pas plus de 1% en poids, de préférence pas plus de 0,5% en poids et plus préférentiellement encore pas plus de 0,2% en poids d'impuretés résiduelles. 2. Phtaléine selon la revendication 1 constituée par la fluorescéine. 3. Procédé de préparation des phtaléines, débarassées de leurs impuretés résiduelles, présentant la formule générale (I) : (I) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5 qui sont identiques ou différents les uns des autres, sont choisis dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, hydroxyle, halogène, acétyle, amino, phosphate, nitro, sulfonate, carboxy, alkyl-carboxy de 2 à 30 atomes de carbone, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, carboxyalkyle ayant de 2 à 30 atomes de carbone, aminoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, sulfoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, aryl-alkyle, halogénoaryle, arylester, succinimidylester, isothiocyanate, maléimide, iodoacétamide, halogénoacétamide, chlorosulfonique, les bases puriques ou pyrimidiques, les oses, de préférence les hexoses ou les pentoses, les oligosides et les polyosides, les polypeptides, les protéines et les phospholipides, RI et R5 ne représentant pas chacun l'hydrogène lorsque RI représente un groupe -CH2-CH2-COOH, R2 représente un groupe hydroxy et R4 représente un groupe-COOH, caractérisé par le fait que l'on condense un dérivé de l'anhydride phtalique de formule (II) avec un composé phénolique ou naphtolique de formule (III) (II) (III) dans lesquelles RI, R2, R3, R4, R5 ont les mêmes significations que ci-dessus, la condensation étant effectuée dans un solvant constitué par un ester d'acide organique. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le composé de formule (III) est choisi dans le groupe comprenant le résorcinol, l'orcinol, le naphtol, le pyrogallol, l'alkylaminophénol et l'arylaminophénol. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, dans lequel le solvant est un ester d'acide organique de formule (IV) R6-COOR7 (IV) dans laquelle R6 est choisi dans le groupe comprenant les radicaux ou groupements suivants : hydrogène, alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, alkylaryle, aryl-alkyle, aryl-alkyle substitué, halogénoaryle, arylester, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone, R7 représentant un groupe alkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, cycloalkyle ayant de 3 à 12 atomes de carbone, halogénoalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, hydroxyalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, nitroalkyle ayant de 1 à 30 atomes de carbone, aryle, aryloxy, alkyl-aryle, aryl-alkyle, arylalkyle substitué, halogénoaryle, arylester, alkylester ayant de 2 à 40 atomes de carbone, alkyloxy ayant de 1 à 30 atomes de carbone. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que l'ester d'acide organique est choisi dans le groupe comprenant le benzoate, l'heptanoate, l'octanoate, le laurate, le myristate ou le palmitate de méthyle, d'éthyle, de propyle ou de butyle, et leurs mélanges. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que la réaction de condensation est conduite entre 150 C et 250 C, éventuellement sous pression. 8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé par le fait qu'il est conduit en présence d'un catalyseur choisi dans le groupe comprenant notamment les acides de Lewis, tels que ZnCl2 ou A1C13, les acides de Bronsted tels que H2SO4 ou l'acide polyphosphorique, de préférence un hydrogénosulfate alcalin et plus préférentiellement l'hydrogénosulfate de potassium (KHS04) ou l'hydrogénosulfate de sodium (NaHS04). 9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé par le fait qu'il comprend une étape consistant à acidifier le produit résultant de la condensation, en milieu organique anhydre, par addition d'un acide fort ou un de ses précurseurs choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide iodhydrique, l'acide polyphosphorique, le pyrophosphate (P205) et leurs mélanges, l'acidification étant menée jusqu'à conversion des cristaux de phtaléine résultant de la condensation en cristaux de phtaléine de structure différente. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'il comporte une étape de lavage du produit obtenu après acidification, ladite étape de lavage étant effectuée à l'aide d'une solution de lavage choisie dans le groupe comprenant l'eau, les alcools, les cétones, les éthers et les solvants halogénés, purs ou en mélange. 11. Procédé de préparation d'une fluorescéine présentant une pureté telle que sa teneur en chacun des sousproduits de la réaction est inférieure ou égale à 0,2% et de préférence inférieure ou égale à 0,1%, la somme des teneurs en chacun de ces sous-produits étant inférieure ou égale à 0,5%, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : - condensation de l'anhydride phtalique avec le résorcinol, dans un solvant constitué par un ester d'acide organique aliphatique ou aromatique, de préférence le benzoate ou le palmitate d'éthyle ou de méthyle, en présence d'un catalyseur choisi dans le groupe comprenant notamment les acides de Lewis ou les acides de Bronsted, et de préférence un hydrogénosulfate alcalin, - mise en suspension des cristaux de couleur rouge obtenus à l'étape précédente dans un solvant anhydre choisi dans le groupe comprenant les alcools tel que l'éthanol absolu, les cétones telles que l'acétone, les éthers, les solvants halogénés, ou leurs mélanges, - acidification de la suspension ainsi obtenue par addition d'un acide fort ou un de ses précurseurs choisi dans le groupe comprenant notamment l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide fluorhydrique, l'acide iodhydrique, l'acide polyphosphorique, le pyrophosphate (P2O5), et leurs mélanges, jusqu'à conversion des cristaux de couleur rouge er. cristaux de couleur jaune présentant le spectre de radiocristallographie de la figure 2, - lavage des cristaux obtenus à l'aide d'une solution de lavage choisie dans le groupe comprenant l'eau, les alcools, les cétones, les éthers et les solvants halogénés, purs ou en mélange, ce lavage étant poursuivi jusqu'à la reconversion des cristaux de couleur jaune en cristaux de rouge. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait que l'acidification est réalisée par barbotage d'acide chlorhydrique gazeux dans la suspension de phtaléine ou par l'action sur cette phtaléine d'acide chlorhydrique en solution dans le solvant organique anhydre, de préférence un alcool, une cétone, un éther, un solvant halogéné utilisés isolément ou en mélange, plus préférentiellement encore, l'isopropanol, l'éthanol absolu ou l'acétone, purs ou en mélange. 13. Procédé selon l'une des revendications 3 à 12, caractérisé par le fait que le catalyseur utilisé pour la réaction de condensation est constitué par l'hydrogénosulfate d'un métal alcalin, de préférence de l'hydrogénosulfate de potassium ou de sodium. 14. Cristaux de fluorescéine de couleur jaune présentant le spectre de radiocristallographie de la figure 2. 15. Cristaux de 4',5'-diméthylfluorescéine de couleur jaune présentant le spectre de radiocristallographie de la figure 4. 16. Cristaux de 4',5'-dihydroxyfluorescéine de couleur marron-rouge ou acajou présentant le spectre de radiocristallographie de la figure 6. 17. Phtaléines obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 13. 18. Fluorescéine obtenue par ur. procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 13. 19. 4',5'-diméthylfluorescéine obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 13. 20. 4',5'-dihydroxyfluorescéine obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 13. 21. Utilisation de la fluorescéine selon la revendication 2 ou obtenue selon le procédé des revendications 3 à 13 dans des applications pharmaceutiques en diagnostic notamment en imagerie médicale ou dans le domaine des applications en biotechnologie.