Brevet FR2848224A1 — publié le 20040611

PROCEDE DE DETECTION DE MICROORGANISMES A L'AIDE D'UN DISPOSITIF DE FILTRATION PAR FLUX TANGENTIEL La présente invention concerne le domaine de l'analyse biologique et environnementale. Plus précisément, la présente invention se rapporte à un procédé de détection d'organismes et spécialement de microorganismes cibles. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes pathogènes contenus dans les milieux complexes, en faible concentration. Par milieux complexes, on entend les milieux contenant des matières biologiques, organiques et minérales en suspension, et notamment les microorganismes cibles. La réglementation concernant la présence de microorganismes pathogènes dans le 15 domaine environnemental et dans le domaine agroalimentaire est de plus en plus stricte. En effet, la détection de tout microorganisme susceptible d'être nuisible pour l'homme doit être réalisée dans un délai de plus en plus court et avec une sensibilité de plus en plus importante. Ces microorganismes peuvent être présents en très faible quantité dans des milieux 20 complexes tels que les eaux de rivières, les eaux d'égouts, les boues, les milieux liquides agroalimentaires, etc... Pour pouvoir les mettre en évidence, il est donc nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment conséquents afin de s'assurer de récupérer une quantité 25 minimale de microorganismes. Il faut ensuite les concentrer, les isoler et les identifier. Plusieurs méthodes de concentration existent, parmi lesquelles on peut citer la centrifugation, la floculation et la filtration sur membrane ou dans des systèmes de capsules filtrantes, comme par exemple le dispositif Envirochecke pour Cryptosporidium. Ces méthodes, bien que référencées, présentent plusieurs inconvénients majeurs. Elles sont peu adaptées pour traiter des échantillons de grand volume. Elles sont traumatisantes pour les microorganismes à concentrer. Ainsi, à l'issue de ces traitements, plus de 50% des microorganismes disparaissent ou sont détruits. Elles sont également peu sélectives: les microorganismes centrifugés ou floculés se 35 retrouvent en présence de contaminants qui inhiberont les méthodes d'analyses ultérieures telles que la Réaction de Polymérisation en Chaîne. Ces contaminants peuvent également fausser ces analyses. Les laboratoires sont donc dans l'attente d'un procédé de détection et de microorganismes, en particulier des microorganismes pathogènes, qui soit adapté aux échantillons de grand volume, qui permettent de récupérer la population entière de microorganismes contenus dans les échantillons et d'éliminer en grande partie les contaminants contenus dans les échantillons. Un premier objectif de la présente invention est de pallier les inconvénients cités supra en proposant un procédé de détection de microorganismes adapté à l'analyse d'échantillons de grand volume, issus de milieux complexes. Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection de microorganismes qui préserve l'intégrité de ces derniers. Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection de microorganismes qui puisse facilement être couplé avec les différentes techniques de détection et d'identification existantes. Pour atteindre ces objectifs, la demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence de façon surprenante et inattendue que le dispositif Cytomate E) commercialisé par la société Baxter et initialement destiné au domaine hématologique, en particulier au lavage des cellules sanguines, pouvait être utilisé pour concentrer des microorganismes d'intérêt 20 contenus dans un échantillon de grand volume issu de milieux complexes. La présente invention concerne donc un procédé de détection de microorganismes présents dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend principalement les étapes suivantes: - concentrer lesdits microorganismes au moyen d'un dispositif de filtration par flux tangentiel; - récupérer lesdits microorganismes ainsi concentrés; et identifier lesdits microorganismes. Selon une première variante avantageuse de l'invention, ce procédé comporte une étape préalable de grossissement desdits microorganismes. Cette étape de grossissement comprend les sous-étapes suivantes > introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; > former un complexe microorganisme particule par adsorption réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. Selon une seconde variante avantageuse, le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire consistant à isoler les microorganismes desdites particules préalablement à l'étape de révélation des microorganismes. De façon remarquable, l'étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprend les sous-étapes suivantes: > mettre les complexes microorganisme - particule en suspension dans une solution appropriée; > désolidariser les microorganismes desdites particules par tout moyen approprié, en particulier chimique; 1 0 > séparer les microorganismes des particules par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel et concentration desdites particules; et > récupérer lesdits microorganismes. Avantageusement, le dispositif de filtration par flux tangentiel est un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines. Ce dispositif de lavage est de concentration de cellules sanguines est le dispositif CytoMate(k, commercialisé par la société Baxter. Le dispositif Cytomatee a été présenté au public lors du septième symposium annuel ISHAGE (International Society for 20 Hematotherapy and Graft Engineering), qui s'est tenu à Québec en juin 2001. De façon avantageuse, les particules sont des particules constituées d'un matériau pris dans le groupe comprenant: la silice, la maghémite, la magnétite, les polymères tels que le polystyrène, le polyméthylméthacrylate, le polyester et/ou leurs mélanges, ou tout 25 composé équivalent. Selon une variante avantageuse de l'invention, le procédé comporte une étape supplémentaire de sélection de microorganismes purifiés. Cette étape intervient avant l'identification. Cette sélection se fait par réaction par affinité. Une telle réaction est 30 préférentiellement effectuée au moyen de particules magnétiques dirigées spécifiquement contre les microorganismes cibles. De telles particules portent avantageusement à leur surface des anticorps dirigés spécifiquement contre les microorganismes cibles. Il peut être alors aisé de récupérer les microorganismes cibles, fixés sur les particules en retenant lesdites particules au moyen d'un dispositif approprié tel qu'un aimant. Une telle technique 35 est par exemple l'IMS (Immuno-Magnetic Separation). Selon un mode de réalisation particulier, l'étape d'identification consiste à: - marquer les microorganismes purifiés et éventuellement sélectionnés; - révéler lesdits microorganismes, ainsi marqués. L'étape de marquage peut être avantageusement réalisée dans le dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines. En effet, une fois purifiés, les microorganismes peuvent être incubés avec le marqueur en excès dans une suspension 5 appropriée. Une fois la période d'incubation achevée, les complexes microorganisme marqueur sont séparés du marqueur en excès par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel. Le marqueur est alors éliminé et les microorganismes marqués sont récupérés et prêts à être révélés par la technique appropriée. Les marqueurs utilisés peuvent être à titre exemplatif, des anticorps couplés à un fluorochrome ou une enzyme, des microparticules fluorescentes, des substrats d'enzyme(s) spécifique(s) du microorganisme cible. Toutefois, tout autre marqueur connu de l'homme du métier peut avantageusement être utilisé. 15 Des méthodes d'identification des microorganismes peuvent être prises dans le groupe comprenant: la mise en culture, la Réaction de Polymérisation en Chaîne, la cytométrie, les techniques d'immuno-essai, les biopuces ou tout technique équivalente. L'invention concerne dans un autre objet, un procédé de détection de microorganismes dont la taille est supérieure à 2,5 ptm, dans un échantillon liquide qui comprend: - une étape de concentration comprenant les sous-étapes suivantes: a) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage 25 dans la poche " lavage "; b) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; c) transfert de l'échantillon concentré de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale "; d) transfert du tampon de la poche "tampon" vers la poche " lavage" et agitation manuelle de cette dernière; e) introduction d'air dans la poche " lavage " et agitation manuelle de cette dernière afin de rincer la tubulure; f) transfert du reliquat de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " 35 g) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; h) transfert du tampon de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale ". i) lavage manuel de la poche " lavage " par transfert de tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; j) récupération des microorganismes dans la poche " collecte finale " ; et - une étape d'identification des microorganismes ainsi concentrés. Des microorganismes pouvant être avantageusement détectés par ce procédé, sont par exemple, les amibes, les Cryptosporidium ou tout microorganisme de taille équivalente ou supérieure. Un autre objet de l'invention est un procédé de concentration de microorganismes de taille inférieure à 1,5 Ulm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend: 10 - une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes: a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible 15 desdits microorganismes sur lesdites particules. - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes: c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage dans la poche " lavage "; d) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; e) transfert de l'échantillon concentré de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale "; f) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; g) introduction d'air dans la poche "lavage " et agitation manuelle de cette dernière; h) transfert du reliquat de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " i) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; j) transfert du tampon de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale ". k) lavage manuel de la poche " lavage " par transfert de tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; 1) récupération des complexes microorganisme - particule dans la poche " collecte finale ". L'étape préalable de grossissement des microorganismes dans une des variantes de l'invention est particulièrement avantageuse quand la taille des microorganismes cibles est inférieure au seuil de coupure du système de filtration tangentielle. En effet, la demanderesse a mis au point ce protocole permettant de concentrer des microorganismes pathogènes dont la taille est inférieure au seuil de coupure du système de filtration tangentielle. Ces microorganismes sont grossis artificiellement et de façon réversible, afin de les empêcher de passer à travers le filtre lors du processus de 5 concentration. Ce grossissement se fait par fixation du microorganisme cible sur des particules telles que décrites ci-dessus, qui présentent un diamètre supérieur au seuil de coupure du système de filtration tangentielle. Les microorganismes peuvent donc être facilement concentrés dans le dispositif CytoMate(D. En effet, les complexes sont retenus sur le filtre du système de filtration par 10 flux tangentiel, alors que les contaminants passent à travers le filtre et sont récupérés dans un conteneur à déchets. Les complexes microorganisme - particule ainsi concentrés peuvent alors être facilement récupérés afin d'être identifiés extemporanément. Les particules utilisées pour le grossissement des microorganismes peuvent être également des particules spécifiques des microorganismes cibles, de telle sorte que le 15 complexe microorganisme - particule peut faire l'objet d'une étape d'identification subséquente. Selon un autre objet, l'invention concerne également, un procédé de détection de microorganismes de taille inférieure à 1,5 Ulm, dans un échantillon liquide, caractérisé en 20 ce qu'il comprend: - une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes: a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes: c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage dans 30 la poche " lavage "; d) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; - une étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprenant les sous-étapes suivantes: e) transfert de tampon (d'élution) dans la poche de "lavage" f) circulation du liquide pendant 30 minutes (incubation dans le tampon d'élution) g) lavage et concentration du mélange dans la poche de "lavage" en utilisant le tampon d'élution; h) récupération des microorganismes dans la poche " déchets " et des particules dans la poche " collecte finale " ; et - une étape d'identification des microorganismes ainsi récupérés. Selon le procédé, la population de microorganismes purifiés peut être très facilement récupérée, de façon originale, en procédant à une nouvelle étape de concentration au moyen du CytoMateO. Les particules se concentrent sur le filtre alors que les microorganismes de taille inférieure au seuil du filtre, passent à travers celui-ci et suivent la même voie que les contaminants lors de la première étape de concentration. Ils 10 sont alors récupérés dans un conteneur vierge, qui a pris la place du conteneur à déchets de la première étape de concentration. La suspension de microorganismes purifiés peut être utilisée en l'état pour la détection et éventuellement leur quantification, via une des techniques décrites ci-dessus. Un tel procédé est particulièrement adapté aux microorganismes pris dans le groupe comprenant les Legionella, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus, Escherichia coli, Entérovirus. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un 20 échantillon liquide Un dernier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un échantillon liquide. Un tel dispositif est avantageusement le dispositif CytoMateOE, commercialisé par la société Baxter. Ce dispositif comporte un système de filtration tangentielle, avec un seuil de coupure de 4 ptm. Il permet donc de retenir les microorganismes présentant une taille supérieure à 4 jim. D'autres détails et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de l'exemple donné ci-dessous, uniquement à titre indicatif et à fin d'illustration. EXEMPLE Exemple 1: Essais sur automate de concentration CvtoMate Deux séries d'essais ont été réalisées sur des échantillons naturels vivants prélevés dans une tranche de la centrale de Civaux puis acheminés à la DRD Chatou. La première série d'essais a pour but d'évaluer l'efficacité du programme et du protocole de concentration. Lors de la deuxième série d'essais, le système a été validé par des répétitions interessais et par l'évaluation de la sensibilité. 1.1/ Evaluation du protocole et du programme de concentration par le CvtoMate a. Déroulement des essais. Chaque jour, un échantillon est prélevé dans une tranche de la centrale nucléaire de Civaux et est acheminé à la DRD Chatou. Les échantillons ont été analysés par la méthode du " Nombre le Plus Probable " (NPP) qui est une méthode statistique par dénombrement sur boite de Pétri 1 5 b. Principe de la concentration par le CytoMateOE. L'échantillon de départ est placé dans la poche n04 (poche source) du CytoMatee. Il est pompé et transféré dans la poche de lavage. A partir de la poche de lavage, le liquide circule dans le système de filtration tangentielle qui permet d'éliminer les particules 20 inférieures à 4 1im. Au fur et à mesure que la concentration est réalisée, le volume de la poche de lavage diminue pour atteindre le volume minimal fixé (environ 50 ml). Le "concentrat" ainsi obtenu est transféré vers la poche n0 3 (poche finale). La poche de lavage est rincée par 100 ml de tampon, cette fraction sera récupérée et analysée. La poche de lavage est de nouveau rincée par 100 ml de tampon. La fraction est cette fois récupérée manuellement, après avoir sectionné le capillaire inférieur de la poche. Ceci permet de récupérer les grosses particules qui ont décanté au fond de la poche et qui n'ont pu être récupérées par l'appareil. 1.2/ Essais de concentration sur échantillon vivant. Ces essais ont pour but d'évaluer: - la répétabilité inter-essais; - la sensibilité de la méthode Cytomate ; - la capacité de concentration en fonction de la quantité de matières en suspension de l'échantillon (MES). Les échantillons utilisés sont prélevés sur une tranche du CNPE Civaux puis acheminés à la DRD Chatou le jour même afin de pouvoir traiter des amibes naturelles vivantes. A. Répétabilité inter-essai. - Principe. La concentration de IL d'échantillon issu du CNPE Civaux par le CytoMate est répétée 3 fois avec un nouveau kit à chaque essai. Trois séries de répétitions inter-essais 10 ont ainsi été réalisées sur des journées différentes. Trois fractions (concentrat, rinçage et poche) sont récupérées et mises en culture. En témoin, l'échantillon non concentré est directement mis en culture. Le programme de concentration utilisé comprend une phase d'évacuation du concentrat par poussée d'air permettant une récupération plus efficace. La fraction éliminée dans la poubelle n'a pas été analysée car les essais précédents ont montré une perte très faible voire nulle. - Programme CytoMate : - installation du kit (poches, tubulures, filtre, dispositif de pompage) - pause - lavage des cellules de la poche " source " (volume final programmé de 20ml, coefficient de lavage " réduction" de 1, rinçage de la poche " source " avec 1 00ml de tampon) - transfert de l'échantillon concentré de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " (volume de rinçage des tubulures 10 ml pour essai 1 du 26/08/02 puis 1 ml pour le reste des essais) - transfert du tampon vers la poche " lavage " (vol 30 ml) - pause " air ", la poche " lavage " est agitée manuellement, - transfert la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " (volume d'air pour le rinçage des tubulures = 100 ml). Retrait du tuyau 2 au moment de l'affichage " rinçage.... " (Concentrat) - pause " rinçage " - transfert du tampon vers la poche " lavage " (volume 1 OOml) 35 - pause " mix " - transfert de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale ". Retrait du tuyau 2 quand s'affiche " rinçage de la poche "lavage "... " pour transférer tout le liquide (Rinçage) - fin du programme - manuellement, on effectue un lavage de la poche " lavage " par " transfert de tampon vers la poche " lavage ", vol 100 ml ", on coupe la partie inférieure de la poche au niveau de la tubulure d'entrée de liquide (Poche). Les fractions récupérées et mises en culture sont: - le concentrat - la fraction " rinçage >> - la fraction " poche " - Résultats. L'analyse des résultats est basée sur la comparaison des intervalles définis par les limites inférieures (L.inf) et supérieures (L.sup) des données. a- Première série de répétition. Tableau 1: Nombre d'amibes présentes dans IL d'échantillon analysé directement Témoin Prélèvement 1 Témoin NPP L.inf L.sup Naegleria totales (N.t) 2292 1354 3881 Naegleriafowleri (N.f) 560 291 1080 Tableau 2: Nombre d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate Essai 1 (IL) Essai 2 (IL) Essai 3 (IL) Prélèvement 1 NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.t 4175 1795 9713 2212 1077 4540 2023 997 4104 Concentrat N.f 1183 592 2387 608 272 1357 1189 592 2387 N.t 27 3 108 77 32 189 110 50 244 Rinçage Rinçage N.t Le nombre d'amibes des fractions " rinçage " et " poche " est largement inférieur à celui du concentrat. La très grande majorité des amibes se trouve dans le concentrat. b- Deuxième série de répétition. Tableau 3: Nombre d'amibes présentes dans 0.75 L d'échantillon analysé directement Prélèvement 2 Témoin (0.75L) Prélèvement 2 NPP L.inf L.sup N. t 1346 759 2252 N.f 1346 759 2252 Tableau 4: Nombre d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate xrlè n 2 Essai 1 (0.75 L) Essai 2 (0.75 L) Essai 3 (0.75 L) Prélèvement 2 NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.T 1469 737 2928 1235 615 2479 1567 786 3124 Concentrat N.f 553 243 1257 1087 535 2206 1235 615 2480 a N.T 30 8 120 30 8 120 30 8 108 Rinçage.f 15 2 102 était particulièrement Les résultats des essais 1, 2 et 3 sont équivalents. La méthode semble répétable. Le nombre d'amibes du concentrat des essais 2, 3 et 4 est équivalent à celui du témoin. Le système concentre de façon efficace tout en respectant la viabilité de l'amibe. Le nombre d'amibes dans les fractions "rinçage" et "poche" est dix fois inférieur à celui du concentrat. La quantité d'amibes restante dans la poche est non-significative. c. Troisième série de répétition. Tableau 5: Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon témoin analysé directement Témoin (1L) Prélèvement 3 Témoin (L) NPP L.inf L.sup N.t 2579 1503 4425 N.f 1099 640 1888 Tableau 6: Nombres d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate Prélèvement 3 Essai 1 (IL) Essai 2 (IL) Essai 3 (IL) Pr61bvement 3 NPP L. inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.t 1781 868 3656 2154 1049 4422 1970 971 3997 Concentrat N.f 1228 616 2447 2154 1049 4422 1470 738 2929 N.t 420 222 794 108 59 198 94 50 176 Rinçage N.f 420 222 794 59 28 123 49 22 80 N.t 36 16 80 5 0 37 16 4 50 Poche N.f 23 60 d. Récapitulatif des essais de répétabilité inter-essais. Le récapitulatif sépare les résultats exprimés en Naegleria totales des résultats 15 exprimés en Naegleriafowleri. Tableau 7: Comparaison du nombre de Naegleria totales présentes dans le témoin et dans les concentrats de CytoMate Naegleria totales Témoin Essai 1 Essai 2 Essai 3 Série i NPP 2292 4175 2212 2023 L.inf/L.sup 1354- 3881 1795-9713 1077-4540 997-4104 Série 2 NPP 1346 1469 1235 1794 Sdrie 2 L.inf/L.sup 759-2252 737-2928 615-2479 1012-3003 Série 3 NPP 2579 1781 2154 1970 ___ _ 3 L.inf/L.sup 1503-4425 868-3656 1049-4422 971-3997 La valeur NPP du témoin de la série 1 est comprise dans l'intervalle [L.infL.sup] des concentrats. Le nombre de Naegleria totales du témoin est équivalent à celui des concentrats. Dans les séries 2 et 3, les trois essais sont répétables. Les valeurs des concentrais sont équivalentes aux valeurs des témoins correspondants. Tableau 8: Comparaison du nombre de Naegleriafowleri présentes dans le témoin et dans les concentrats de CytoMate Naegleriafowleri Témoin Essai 1 Essai 2 Essai 3 Série 1 NPP 560 1183 608 1189 L.inf/L.sup 291-1080 592-2387 272-1357 592-2387 Série 2 NPP 1346 553 1087 1794 L.inf/L.sup 759-2252 243-1257 535-2206 1012-3003 Série 3 NPP 1099 1228 2154 1470 L.inf/L.sup 640-1888 616-2447 1049-4422 738-2929 Les résultats en Naegleriafowleri sont légèrement différents. Dans la série 1, deux essais sont répétables mais les valeurs sont supérieures aux valeurs témoins. Le nombre d'amibes du concentrat de l'essai 2 est comparable à celui du témoin. Dans la série 2, seul l'essai 2 donne des résultats similaires au témoin. Dans la série 3, deux essais sur trois donnent des résultats répétables. Le nombre d'amibes des concentrats est équivalent à celui du témoin. La répétabilité est moins marquante lorsque l'on compare les résultats en Naegleria 20 fowleri. -Discussion. Les variations inter-essais sont relativement faibles. 25 La répétabilité est considérée comme concluante. Le facteur moyen de concentration est de 13. Comme il a déjà été observé précédemment, le système concentre l'échantillon de façon efficace tout en respectant la viabilité. En effet, le nombre d'amibes présentes dans le concentrat est équivalent au nombre 30 d'amibes présentes dans l'échantillon témoin. La majorité des amibes est dans le concentrat. Le nombre d'amibes résiduelles est faible dans la fraction "rinçage" et infime voire nul dans la fraction "poche". Les variations parfois importantes des valeurs NPP ne sont pas significatives car ces variations sont inhérentes à l'incertitude de la méthode NPP. Les résultats en nombre de Naegleriafowleri présentent de plus grandes variations que les résultats Naegleria totales. Les intervalles [L.inf-L.sup] des témoins se chevauchent avec les intervalles [L.inf-L.sup] des concentrats. Le nombre de Nf présentes dans les concentrats est équivalent à celui des témoins. L'ensemble des résultats montre une bonne reproductibilité de la méthode. 10 B. Sensibilité du CytoMate. - Principe. Afin de déterminer la limite minimum de la méthode de concentration, des essais ont été réalisés sur un échantillon d'eau naturellement contaminée, non traité et dilué en eau de Civaux autoclavée. Les eaux utilisées pour les dilutions sont des eaux de Civaux utilisées lors des essais du mois de juin, autoclavées afin d'éliminer les amibes. Ces essais de sensibilité ont été répétés sur des échantillons prélevés lors de journées différentes. L'échantillon ainsi dilué deux fois est concentré par le CytoMatee en utilisant le même programme que précédemment. Le volume traité est de IL. Les fractions "concentrat", "rinçage" et "poche" sont mises en culture. 25 - Résultats. a. Premier essai. L'échantillon témoin est dilué au 1/10 et au 1/100. 30 Tableau 9: Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon Témoin Prélèvement 4 Témoin (iL) NPP L.inf L.sup N.t 742 408 1350 N.f 647 346 1209 Tableau 10: Sensibilité de la méthode de concentration, résultats exprimés en nombre d'amibes présentes dans les fractions Eau brute (IL) Eau brute 1/10 (IL) Eau brute 1/100 (IL) Prélèvement 4 NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.t 1157 576 2324 108 64 181 2 1 8 Concentrat N.f 553 243 1257 73 42 127 2 1 8 a N.t 71 29 242 7 1 48 b. Deuxième essai Tableau 11: Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon témoin Prélèvemen 5 Témoin (IL) Prélèvement 5 NPP L.inf L. sup N.T 1462 870 2457 N.f 717 392 1312 Tableau 12: Sensibilité de la méthode de concentration, résultats nombres d'amibes présentes dans les fractions exprimés en Eau brute (IL) Eau brute 1/10 (IL) Eau brute 1/100 (IL) Prélèvement 5 NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.T 945 457 1951 103 61 174 18 10 33 Concentrat N.f 748 348 1610 51 27 95 8 4 18 N.T 115 64 206 Cependant, les résultats de l'échantillon dilué au 1/10 semblent confirmer les résultats du premier essai. c. Troisième essai. Tableau 13: Nombre d'amibes dans l'échantillon témoin Témoin (1L) Prélèvement 6 Témoin (L) NPP L.inf L.sup N.T 2293 1354 3881 N.f 1937 1156 3247 Tableau 14: Sensibilité de la méthode de concentration, résultats exprimés en nombre d'amibes présentes dans les fractions Prélèvement 6 Eau brute (IL) Eau brute 1/50 (IL) Eau brute 1/200 (IL) NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup NPP L.inf L.sup N.T 3214 1444 7157 49 26 91 39 25 62 Concentrat N.f 3214 1444 7157 29 14 62 35 22 56 a N.T 61 32 114 8 2 29 - Discussion. Le nombre d'amibes présentes dans les concentrats varie proportionnellement au facteur de dilution. De plus les valeurs sont comparables à celles du témoin correspondant. 20 L'appareil permet de concentrer des échantillons contenant un très faible nombre de cellules, de l'ordre de 10 amibes/L. C. Capacité de pré-concentration en fonction de la charge en MES. MES = matières en suspension L'eau de Civaux analysée lors des essais du mois de juin, provoquant une saturation du système de concentration dès un volume de IL, avait une teneur en MES de l'ordre de 100 mg/L en poids sec. 15 - Préparation de l'échantillon Des eaux de Seine autoclavées puis filtrées sur une membrane de porosité 0,45 Ulm sont artificiellement contaminées en MES issues de centrale, à différentes concentrations. Les échantillons sont préparés avec différentes teneurs en MES - SLàlOmg/L - 3 Là20mg/L - 2Là5Omg/L - 1 LàlOOmg/L - lLàlSOmg/L - 1 L à 200 mg/L Ces échantillons sont traités par le CytoMatee. Un nouveau programme est utilisé de manière à traiter l'échantillon en 5 pompages de liquide afin d'évaluer le volume limite. 25 - Programme CytoMateg - installation du kit - pause échantillon 1 - lavage de la poche " source " (réduction final 20 ml) pause échantillon 2 lavage de la poche " source " (réduction final 20 ml) - pause échantillon 3 - lavage de la poche " source " (réduction final 20 ml) - pause échantillon 4 - lavage de la poche " source " (réduction final 20 ml) pause échantillon 5 - lavage de la poche " source " (réduction final 20 ml) - pause mix 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume transfert de poche " lavage " vers la poche " collecte finale " (évacuation par l'air en retirant le tuyau 2 " tampon ") - transfert du tampon dans la poche " lavage " - transfert de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " (évacuation par l'air). - Résultats. a. Evaluation du volume de saturation en fonction de la charge en MES. Tableau 15: Capacité de concentration par le CytoMate en fonction de la 10 concentration en MES mg/L 20 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L 200 mg/L Volume 4.5 L 3L 2L IL IL IL - Discussion. Les échantillons d'eaux reconstituées à différentes concentrations ne saturent pas l'appareil. Le système est capable de concentrer sans saturer iL d'échantillon reconstitué comportant de fortes concentrations de MES (100, 150, 200 mg/L). Le CytoMate concentre sans problème les échantillons reconstitués, le volume 20 limite de traitement n'est atteint dans aucune expérience. Ces échantillons ont été préparés avec une eau préalablement filtrée sur une membrane de porosité 0,45 gm. Cette étape élimine une grande partie des particules collodales qui sont souvent responsables de la saturation des filtres. La saturation est dépendante du diamètre des MES et non de la concentration. 25 Conclusion. Le CytoMate(V permet de concentrer, sans perte, un échantillon naturel vivant tout 30 en respectant la viabilité de l'amibe. Un échantillon d'un volume de IL est ramené à 70 mL, soit un facteur de concentration de 14. La reproductibilité des essais démontre la robustesse de la méthode. L'évaluation de la sensibilité a montré que la concentration minimum traitée est très basse, de l'ordre de 10 amibes/L. Des échantillons reconstitués de teneurs différentes en MES ont été concentrés sans 5 entraîner de saturation du système de filtration. Une suspension de i L à 200 mg/L de MES a ainsi été traitée par l'appareil. Cependant, il a été observé qu'un échantillon naturel de IL à 100 mg/L de MES provoque la saturation du CytoMatee. La capacité de concentration d'un échantillon reconstitué n'est pas extrapolable à 10 un échantillon naturel o la qualité et le diamètre des MES varient énormément d'un échantillon à l'autre. Par conséquent, une validation sur différents échantillons naturels devra être réalisée. Cette méthode de pré-concentration est envisageable en aval de différentes techniques d'analyses telles que: - la mise en culture laPCR - la Cytométrie. 20 La méthode de pré-concentration par le CytoMate couplée à la méthode de dénombrement NPP permettrait de ramener la limite de détection actuelle de 200 amibes/L à 15 amibes/L. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de microorganismes présents dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend principalement les étapes suivantes: - concentrer lesdits microorganismes au moyen d'un dispositif de filtration par flux tangentiel; - récupérer lesdits microorganismes ainsi concentrés; et - identifier lesdits microorganismes. 2. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable de grossissement desdits microorganismes. 3. Procédé de détection selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape de grossissement comprend les sous-étapes suivantes: introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; - former un complexe microorganisme particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. 4. Procédé de détection selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire consistant à isoler les microorganismes desdites particules préalablement à l'étape de révélation des microorganismes. 5. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape consistant à 25 isoler les microorganismes desdites particules comprend les sous-étapes suivantes: - mettre les complexes microorganisme - particule en suspension dans une solution appropriée; - désolidariser les microorganismes desdites particules par tout moyen approprié, en particulier chimique; - séparer les microorganismes des particules par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel et concentration desdites particules; et - récupérer lesdits microorganismes. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif de filtration par flux tangentiel est un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que les particules sont des particules constituées d'un matériau pris dans le groupe comprenant: la silice, la maghémite, la magnétite, les polymères tels que le polystyrène, le polyméthylméthacrylate, le polyester et/ou leurs mélanges, ou tout composé équivalent. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire de sélection des microorganismes purifiés par réaction par affinité. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'identification consiste à: - marquer les microorganismes purifiés et éventuellement sélectionnés; - révéler lesdits microorganismes ainsi marqués. 15 10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les microorganismes sont identifiés par une méthode prise dans le groupe comprenant: la mise en culture, la Réaction de Polymérisation en Chaîne, la cytométrie, les techniques d'immuno-essai, les biopuces ou tout technique équivalente. 20 1. Procédé de détection de microorganismes de taille supérieure à 1,5 jlm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de concentration comprenant les sousétapes suivantes: a) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage 25 dans la poche " lavage "; b) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; c) transfert de l'échantillon concentré de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale "; d) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; e) introduction d'air dans la poche " lavage " et agitation manuelle de cette dernière afin de rincer la tubulure; f) transfert du reliquat de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale "; g) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; h) transfert du tampon de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale "; i) lavage manuel de la poche " lavage " par transfert de tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; j) récupération des microorganismes dans la poche " collecte finale " ; et - une étape d'identification des microorganismes contenus dans la poche " collecte finale ". 12. Procédé de concentration de microorganismes de taille inférieure à 1, 5 gm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes: a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes: c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage dans 15 la poche " lavage "; d) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; e) transfert de l'échantillon concentré de la poche "lavage" vers la poche " collecte finale "; f) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; g) introduction d'air dans la poche " lavage " et agitation manuelle de cette dernière; h) transfert du reliquat de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale " i) transfert du tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; j) transfert du tampon de la poche " lavage " vers la poche " collecte finale ". k) lavage manuel de la poche " lavage " par transfert de tampon de la poche " tampon " vers la poche " lavage "; 1) récupération des complexes microorganisme - particule dans la poche " collecte finale ". 13. Procédé de détection de microorganismes de taille inférieure à 1,5 Ulm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes: a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes: c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche " source " et stockage dans la poche " lavage "; d) rinçage de la poche " source " et transfert du volume de rinçage dans la poche " lavage "; - une étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprenant les sous-étapes suivantes: e) transfert de tampon d'élution dans la poche de "lavage" f) circulation du liquide pendant 30 minutes (incubation dans le tampon d'élution); g) lavage et concentration du mélange dans la poche de "lavage" en utilisant le tampon d'élution; h) récupération des microorganismes dans la poche " déchets " et des 15 particules dans la poche " collecte finale " ; et - une étape d'identification des microorganismes contenus dans la poche " déchets ". 14. Utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un échantillon liquide. 20 15. Utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la concentration et le lavage de microorganismes dans un échantillon liquide.