Brevet FR2851165A1 — publié le 20040820

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un antigène polypeptidique dérivant de la protéine gp41 pour une immunisation contre les infections liées au VIH. La mise au point d'une méthode d'immunisation contre le VIH est aujourd'hui l'une des priorités de la recherche scientifique. Les obstacles majeurs que sont la grande variabilité génétique du virus et la faible exposition au système immunitaire d'épitopes viraux neutralisants freinent considérablement l'élaboration d'une immunité neutralisante. La glycoprotéine d'enveloppe du VIH qui est requise pour conférer au virus son caractère infectieux représente la cible d'anticorps neutralisants. Ces caractéristiques ont fait de cette dernière un sujet d'investigations intenses. L'enveloppe glycoprotéique (env), du virus d'immunodéficience humaine-1 (VIH1) est synthétisée à partir du précurseur gpl60 qui donne sous l'action d'une protéase les 15 sous-unités gpl 20 et gp41. La fixation de gpl20/gp41 aux récepteurs cellulaires induit un changement de conformation de la gp41 d'un état latent (non-fusogène) à un état fusion-actif (fusogène). Entre ces deux états, existe un état transitoire dit "intermédiaire" pendant lequel la gp41 se présente comme une protéine membranaire à la fois dans les membranes virale et 20 cellulaire (Weissenhorn et al Nature (1997), 387 (6631), 426-30). L'utilisation à des fins vaccinales de la gp41 dans sa conformation fusogénique est décrite dans WO00/40616. Selon cette demande, les hélices N peuvent être utilisées seules ou en association avec les hélices C pour reproduire dans ce dernier cas la conformation fusogène de la gp41. Des expériences de liaison ont permis d'établir d'autre part que l'état latent nonfusogène est caractérisé par l'inaccessibilité de larges portions de l'ectodomaine de la gp41. La gpl20 interagit en effet de sorte à masquer les épitopes. Il a par ailleurs été montré que l'inhibition du changement de structure de l'état intermédiaire vers l'état fusogène par des peptides utilisés en tant que compétiteurs pouvait affecter l'infection 30 virale (Weissenhorn W. et al, Molecular Membrane Biology, 1999, 16, 3-9 et US2002/0119922). La demanderesse propose une nouvelle méthode d'immunisation thérapeutique et prophylactique contre les infections liées au VIH utilisant un antigène polypeptidique - 2 dérivant de la protéine gp41. La demanderesse a en effet mis en évidence pour la première fois qu'un polypeptide dérivant de l'hélice C de la protéine gp4l était capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du VIH. La présente invention concerne donc l'utilisation d'un antigène polypeptidique 5 comprenant la séquence de l'hélice C de la protéine gp4l dans laquelle entre 3 et 8 mutations en alanine sélectionnées dans le groupe consistant en: N114A; M11 SA; M118A; E119A; R122A; E123A; N125A; N126A; S129A; L13OA; H132A; S133A; E136A; E137A; Q139A; N140A; E143A; K144A; Q147A et E148A ont été introduites pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour l'induction d'anticorps 10 neutralisant le VIH. Selon un mode de réalisation préféré, deux mutations consécutives en alanine sont séparées par 6 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, l'antigène polypeptidique selon l'invention comprend en N-terminal une séquence supplémentaire APKE. Selon un autre mode de réalisation l'antigène polypeptidique comprend en Cterminal une séquence supplémentaire KQGI. Selon un mode de réalisation préféré, l'antigène polypeptidique selon l'invention comprend une séquence supplémentaire APKE en N-terminal et une séquence supplémentaire KQGI en C-terminal. Selon un mode de réalisation particulièrement 20 préféré l'antigène selon l'invention comprend la séquence SEQ ID N 5. La présente invention a également pour objet un conjugué comprenant un antigène polypeptidique tel que défini ci-dessus lié par covalence à une protéine ou un peptide porteur ainsi que son utilisation pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour l'induction d'anticorps neutralisant le VIH. La présente invention couvre également la séquence d'ADN codant pour un tel conjugué et le vecteur d'expression contenant une telle séquence. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un antigène polypeptidique tel que défini ci-dessus, un excipient pharmaceutiquement acceptable et un adjuvant. La présente invention concerne aussi une 30 composition pharmaceutique comprenant au moins un conjugué tel que défini ci-dessus ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, un excipient pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant. L'invention est décrite plus en détails dans la description qui suit. Le phénomène de changement de conformation de la gp4l précédant la fusion des membranes cellulaire et virale est illustré à la figure 1. La fixation de la gpl20 sur le récepteur et le co-récepteur du virus provoque une première modification qui entraîne le dépliement du peptide de fusion et son ancrage dans la membrane cellulaire. A ce moment 5 un état intermédiaire se forme dans lequel il n'y a pas d'interaction entre les hélices N et C. Le second événement illustré à la figure 1 est le repliement de la gp4l qui correspond à l'adoption d'une conformation thermodynamiquement plus stable de la molécule. L'énergie libérée au cours de ce repliement permet le rapprochement et la fusion des lipides des membranes cellulaire et virale. La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que le polypeptide selon l'invention qui mime l'hélice C de l'état intermédiaire de la protéine gp4l induit des anticorps IgG spécifiques neutralisant les isolats primaires du VIH. L'induction d'anticorps neutralisant les isolats primaires peut être déterminée par le test de neutralisation tel que décrit dans l'article de C. Moog et al (AIDS Research and Human 15 Retroviruses, vol. 13(1), 13-27, 1997) auquel on pourra se référer pour un descriptif complet de ce dernier. On estime dans le cadre de la présente invention que des anticorps neutralisants ont été induits par l'antigène testé selon la technique de C. Moog lorsque le sérum dilué au moins au 1/4 en présence de VIH entraîne une réduction de 90% du titre viral en comparaison au VIH seul, le titre viral étant évalué par la quantité de p24 produite 20 dans le surnageant de culture. L'induction d'anticorps neutralisant les isolats primaires peut également être déterminée par le test de neutralisation de D. Montefiori tel que décrit dans J. Infect. Dis. 1996, 173:60-67. Dans ce test, le titre neutralisant est exprimé par le pourcentage de réduction d'antigène p24 produit dans les surnageants de culture lorsque le virus est 25 incubé en présence de sérum dilué au moins au 1/4 par comparaison au virus en absence de sérum. On considère dans le cadre de la présente invention que des anticorps neutralisants ont été induits lorsque la réduction du taux de p24 produit atteint au moins 80% avec un sérum dilué au moins au 1/4. On considère dans le cadre de la présente invention que les anticorps induits par l'antigène 30 polypeptidique selon l'invention sont neutralisants si une activité neutralisante est détectée pour un isolat donné dans au moins un des deux tests ci-dessus. L'induction d'anticorps neutralisant la souche VIH-1 de laboratoire MN peut être estimée en utilisant la lignée cellulaire MT-2 selon la méthode de D. Montefiori (décrite - 4 dans: DC Montefiori et al. J Clin Microbiol. 1988, 26: 231-5). Dans cette méthode, le titre neutralisant est exprimé comme l'inverse de la dilution du sérum (en valeur arithmétique) protégeant au moins 50% des cellules de l'effet cytopathogène du virus VIH. Cette propriété fait de l'antigène selon l'invention un candidat d'intérêt pour 5 l'immunisation contre les infections liées au VIH chez l'homme. L'antigène polypeptidique selon l'invention comprend la séquence de l'hélice C de la protéine gp4l dans laquelle entre 3 et 8 mutations en alanine sélectionnées dans le groupe consistant en: N114A; M115A; M118A; E119A; R122A; E123A; N125A; N126A; S129A; L13OA; H132A; S133A; E136A; E137A; Q139A; N14OA; E143A; K144A; Q147A et E148A ont 10 été introduites. On entend par " la séquence de l'hélice C " dans le cadre de la présente invention la séquence de la protéine gp4l allant de l'acide aminé 116 à l'acide aminé 163 ainsi que tous les fragments de cette séquence comportant au moins 15 et de préférence au moins 19 acides aminés. La numérotation utilisée est établie par rapport à la séquence de la protéine 15 gp4l LAI donnée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID N0 1 dans laquelle le premier acide aminé porte le numéro 1. La séquence de l'hélice C selon la présente invention peut être issue du domaine correspondant à l'hélice C de toute protéine gp4l du VIH, incluant les souches VIH-1 et VIH-2, incluant les souches de laboratoire et les isolats primaires. De préférence la 20 séquence de l'hélice C selon la présente invention est issue d'une souche VIH-1 et en particulier d'une souche VIH-1 LAI. Les séquences nucléotidiques et peptidiques d'un grand nombre de protéines gp4l sont connues et disponibles par exemple sur Internet sur le site http://hiv-web.lanl.gov/ ainsi que dans les compendium correspondant de Los Alamos. Il est clair que toute séquence dans laquelle ont été introduites une ou plusieurs 25 mutations conservatives qui n'altèrent pas substantiellement sa capacité à induire des anticorps neutralisants est également incluse dans le cadre de la présente invention. L'antigène polypeptidique selon la présente invention comprend entre 3 et 8 mutations en alanine. Les mutations sont identifiées par le code L1NNL2 dans lequel l'acide aminé LI se trouvant en position NN est muté en l'acide aminé L2. Les acides 30 aminés sont tous représentés par le code international à une lettre. De préférence deux mutations consécutives dans la séquence polypeptidique sont séparées par 6 acides aminés. - 5 De préférence la séquence de l'hélice C utilisée dans le cadre de la présente invention correspond aux acides aminés 127-162 ou 117-135 dans laquelle au moins 3 mutations en alanine ont été introduites, et en particulier aux séquences SEQ ID N02 et 3. Selon un mode de réalisation spécifique, l'antigène polypeptidique tel que défini 5 ci-dessus comprend en outre en N-terminal une séquence d'acides aminés supplémentaires APKE. Selon un mode de réalisation préféré l'antigène est représenté par la séquence SEQ ID N04 Selon un autre mode de réalisation, l'antigène polypeptidique tel que défini cidessus comprend en C-terminal une séquence d'acides aminés supplémentaires KQGI. 10 L'antigène selon la présente invention comprend de préférence une séquence APKE en Nterminal et une séquence KQGI en C- terminal. Un antigène particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention est identifié sous le numéro SEQ ID N05. La séquence de l'hélice C de la protéine gp4l n'adopte une conformation hélicodale que lorsque la protéine se trouve dans l'état intermédiaire ou dans l'état 15 fusogène (cf fig. 1). La séquence de l'hélice C seule n'adopte aucune conformation structurée. Les mutations en alanine ainsi que les séquences supplémentaires ajoutées en N- et C-terminal ont pour fonction de déplacer l'équilibre entre la forme non structurée et la forme hélicodale vers cette dernière. La présence dans la séquence de l'hélice C des trois éléments mentionnés ci-dessus (i.e. mutations et addition des séquences APKE et 20 KQGI) conduit à une composition contenant environ 100% de l'antigène polypeptidique sous forme hélicodale. Une composition dans laquelle au moins environ 30 % de l'antigène polypeptidique est présent sous forme hélicodale est appropriée pour une utilisation dans le cadre de la présente invention. On utilisera de préférence une composition dans laquelle au moins environ 60 % et de préférence environ 100% de 25 l'antigène polypeptidique adopte une conformation hélicodale. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'antigène polypeptidique comprend une séquence APKE liée en N-terminal d'une séquence d'au moins 15 de préférence d'au moins 19 acides aminés de l'hélice C incluant la séquence de l'épitope 2F5 (i.e. ELDKWASLWNWF). La présence des mutations en alanine et de la séquence 30 APKE conduit à l'obtention d'une composition comprenant au moins environ 60% d'antigène adoptant une conformation hélicodale sur toute sa longueur à l'exception de la séquence correspondant à l'épitope 2F5 qui conserve sa conformation immunogénique caractéristique en boucle fermée. La bonne conformation de l'épitope 2F5 peut être aisément déterminée en évaluant par un test immunologique, tel qu'un ELISA, la réactivité de l'antigène selon l'invention avec l'anticorps monoclonal humain recombinant 2F5. Le pourcentage du peptide présent sous forme hélicodale peut 8tre facilement déterminé par une analyse par dichrosme 5 circulaire. Cette technique permet de comparer rapidement l'hélicité du polypeptide de départ avec celle du polypeptide selon l'invention. La conformation hélicodale d'un polypeptide se caractérise en effet par un certain nombre de paramètres mesurables par la technique de dichroisme circulaire qui est décrite en détails par S.M. Kelly et N.C. Price (Biochim. Biophys. Acta. (1997) 1338, 161-185). 10 Cette technique permet d'évaluer la structure secondaire d'une protéine par mesure de l'ellipticité moléculaire en fonction de la longueur d'onde. Une hélice alpha est caractérisée par des minima en ellipticité moléculaire à 208nm et 222nm ([O]obs222). La valeur du signal à 222nm est utilisée pour déterminer le pourcentage d'hélice alpha selon, _ _ /tO1,222)X10O la formule pourcentage en hélice = ([0obs222 []coil222) ]helix222 - []co222) X 100 % 15 (comme décrit par Taylor, J., and Kaiser E.T. dans Methods Enzymol. 154, 473-498 (1987)) dans laquelle [0]obs222= la valeur mesurée, [0]coil222 = ellipticité moléculaire à 222 nm d'un peptide 100 % non-structuré et [0] helix222 = ellipticité moléculaire à 222 nm d'un peptide présent à 100 % sous forme hélicodale. Cette technique permet de mettre en évidence que le polypeptide selon l'invention conduit à une composition comprenant au 20 moins 30 % environ, de préférence 60% environ et en particulier 100% environ de polypeptide sous forme hélicodale. Dans le cadre de la présente invention, le pourcentage de polypeptide sous forme hélicodale est mesuré par un spectropolarimètre Jasco J-810 dans des cuvettes offrant un trajet optique de 0,1 mm. Les mesures sont effectuées à 37 C sur une solution de 25 polypeptide à 2mg/ml dans du PBS. La gamme des longueurs d'ondes scannées va de 190 à 260 nm. Un spectre de référence est réalisé dans les mêmes conditions sur une solutions sans polypeptide et soustrait aux spectres obtenus avec les polypeptides testés. L'évaluation de la fraction hélicodale dans la composition est calculée par la formule suivante: pourcentage d'hélice =([0]obs222- [0]coil222) ([0]helix222 - [O]coi222) X 100 % 30 comme décrit par Taylor, J. et Kaiser E.T. Le polypeptide selon l'invention peut être obtenu par toute technique classique de synthèse chimique. La synthèse chimique peut être réalisée en phase solide ou en solution, ces deux techniques de synthèse étant bien connues de l'homme de l'art. Ces techniques sont décrites notamment par Atherton et Shepard dans " Synthèse peptidique en phase solide (IRL press Oxford, 1989) et par Houbenweyl dans " method der organischen chemie " 5 édité par E.Wunsch vol, 15-1 et II thieme, Stuttgart, 1974, ainsi que dans les articles suivants auxquels on peut se référer pour un descriptif précis des techniques: Dawson PE et al (Science 1994; 266(5186):776-9); Kochendoerfer GG et al ( Curr Opin Chem Biol 1999;3(6):665-71); et Dawson PE et al (Annu Rev Biochem 2000; 69:923-60). En particulier le polypeptide selon l'invention peut être synthétisé et purifié selon le procédé 10 décrit dans la demande de brevet US 2002/0119922. On peut donc se reporter à l'enseignement fourni dans ce document pour un descriptif précis du procédé de synthèse et de la purification du polypeptide selon l'invention. La dernière étape du procédé de purification est une lyophilisation visant à supprimer toute trace de solvant. Le polypeptide lyophilisé peut être ensuite repris dans une solution 15 stérile injectable pour être utilisé dans une composition pharmaceutique injectable. La présente invention a également pour objet les conjugués comprenant un polypeptide selon l'invention lié par covalence à une protéine porteur ou un peptide porteur. La protéine (ou peptide) porteur renforce l'immunogénicité du polypeptide selon 20 l'invention notamment en augmentant la production d'anticorps spécifiques. Ladite protéine (ou peptide) porteur comprend de préférence un ou plusieurs épitope(s) T helper. Par " épitope T helper ", on entend un enchaînement d'acides aminés qui, dans le contexte d'une ou de plusieurs molécules du MHC classe II, active les lymphocytes auxilliaires encore appelés T helper. Selon un mode de réalisation avantageux, la protéine (ou peptide) 25 porteur utilisée améliore également la solubilité dans l'eau du polypeptide selon l'invention. Comme protéine porteur on peut utiliser par exemple les protéines de surface de phages comme la protéine pIII ou pVIII du phage M13, les protéines de surface bactériennes comme les protéines LamB, OmpC, ompA, ompF et PhoE d'E. coli, la 30 protéine CotC ou CotD de B. Subtilis, les porines bactériennes comme la porine P1 de Neisseria gonorrheae, la porine P1 ou P2 d'H. influenzae B, la porine de classe I de N. meningitidis B, la porine P40 de K. pneumoniae, des lipoprotéines telles que OspA de B. bugdorfi, PspA de S. pneumoniae, TBP2 de N. meningitidis B, TraT d'E. coli ainsi que - 8 l'adhésine A de S. pneumoniae; les " heat shock " protéines telles que Hsp65 ou Hsp7l de M. tuberculosis ou bovis ou Hin 47 d'H. infuenzae type B. Sont également particulièrement appropriées dans le cadre de la présente invention, les toxines bactériennes détoxifiées comme l'anatoxine tétanique ou diphtérique, la sous unité B de la 5 toxine cholérique, la sous unité B de l'endotoxine A de P. aeruginosa ou l'exotoxine A de S. aureus. Comme peptide porteur on peut utiliser par exemple dans le cadre de la présente invention les peptides p24E, p24N, p24H et p24M décrits dans W094/29339 ainsi que les peptides PADRE tels que décrits par Del guercio et al (Vaccine (1997); voll5/4, p44110 448). Les protéines/peptides porteurs utilisés de préférence dans le cadre de la présente invention sont l'anatoxine tétanique ou diphtérique ou les peptides p24 décrits ci-dessus. La protéine (ou peptide) porteur est liée à l'extrémité N ou C terminale du polypeptide selon l'invention par tout procédé de conjugaison chimique bien connu de 15 l'homme de l'art utilisant des agents bi-fonctionnels. De plus, la séquence codant pour la protéine (ou peptide) porteur peut avantageusement être fusionnée à la séquence codant pour le polypeptide selon l'invention et la séquence résultante peut être exprimée sous la forme d'une protéine de fusion par tout procédé classique. Toutes les techniques de génie génétique utiles pour ce faire sont décrites dans le Maniatis et al. Classiquement, la séquence d'ADN codant pour le conjugué selon l'invention peut être produite par la technique de PCR. La séquence d'ADN ainsi obtenue est ensuite insérée dans un vecteur d'expression. Le vecteur d'expression renfermant la séquence d'intérêt est alors utilisé pour transformer une cellule hôte permettant l'expression de la séquence d'intérêt. Le conjugué produit est ensuite isolé du milieu de culture par des techniques 25 classiques bien connues de l'homme de l'art, telles que précipitation à l'éthanol ou au sulfate d'ammonium, extraction par l'acide, chromatographie d'échange d'anion/cation, chromatographie sur phosphocellulose, chromatographie d'interaction hydrophobe, chromatographie d'affinité, chromatographie sur hydroxyapatite et chromatographie sur lectine. De préférence, la chromatographie liquide à haute performance (HIPLC) est 30 utilisée dans la purification. Pour mettre en oeuvre la synthèse du conjugué, tout vecteur d'expression classiquement utilisé pour l'expression d'une protéine recombinante peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. Ce terme englobe donc aussi bien les vecteurs d'expression dits " vivants " tels que les virus et les bactéries que les vecteurs d'expression de type plasmidique. On utilise de préférence des vecteurs dans lesquels la séquence d'ADN du conjugué selon l'invention est sous la dépendance d'un promoteur fort, inductible ou non 5 inductible. On peut citer à titre d'exemple de promoteur utilisable, le promoteur de l'ARN polymérase T7. Les vecteurs d'expression incluent de préférence au moins un marqueur de sélection. De tels marqueurs incluent, par exemple, le gène de la dihydrofolate réductase ou le gène de résistance à la néomycine pour la culture des cellules d'eucaryote et les gènes de 10 résistance à la kanamycine, tétracycline ou ampicilline pour la culture dans E. coli et des autres bactéries. On peut citer à titre de vecteur d'expression utilisable dans le cadre de la présente invention les plasmides pET28 (Novagen) ou pBAD (Invitrogen) par exemple; les vecteurs viraux tels que: baculovirus, poxvirus en particulier les poxvirus décrits dans les 15 brevets US 5,942,235, US 5, 756,103 et US 5,990,091 dont l'intégralité est incorporée ici à titre de référence, les virus de la vaccine recombinants, en particulier les virus recombinants décrits dans les brevets EP 83286, US 5,494,807 et US 5,762, 938 dans lesquels est cloné la séquence d'ADN codant pour un conjugué selon l'invention. Pour favoriser l'expression et la purification du conjugué, ce dernier peut être 20 exprimé dans une forme modifiée incluant par exemple un signal de sécrétion et/ou une région fonctionnelle hétérologue supplémentaire. Par exemple, une région d'acides aminés supplémentaires, particulièrement des acides aminés chargés, peut être ajoutée au Nterminal du conjugué pour améliorer la stabilité et le maintien dans la cellule hôte et éventuellement sa purification. La présente invention a également pour objet les séquences d'ADN codant pour les polypeptides et les conjugués selon l'invention ainsi que les vecteurs d'expression comprenant lesdites séquences et les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs. Les séquences d'ADN codant pour les polypeptides selon l'invention peuvent être aisément produites par PCR en utilisant comme matrice la séquence nucléotidique d'une protéine 30 gp4l. Plutôt que d'extraire et de purifier le conjugué exprimé par le vecteur d'expression il est souvent plus facile et parfois plus avantageux d'utiliser le vecteur d'expression luimême dans la méthode d'immunisation selon l'invention. La présente invention a donc - 10 également pour objet tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus ainsi que leur utilisation dans une méthode d'immunisation selon la présente invention. Dans un tel cas de figure, le vecteur d'expression est dépourvu de marqueur et correspond de préférence à un vecteur viral, en particulier un poxvirus tel que ALVAC ou NYVAC. Toute cellule hôte telle que définie ci-dessus transformée par un tel vecteur d'expression est également incluse dans le cadre de la présente invention. La présente invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les polypeptides et conjugués tels que décrits ci-dessus. La préparation de tels anticorps est mise en oeuvre par les techniques classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et 10 monoclonaux bien connues de l'homme de l'art. Ces anticorps sont particulièrement appropriés pour être utilisés dans un schéma d'immunisation passive. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques utiles pour l'induction d'anticorps neutralisants antiVIH qui sont appropriés pour l'immunisation thérapeutique et prophylactique des infections liées au VIH. Les 15 compositions selon la présente invention comprennent au moins un polypeptide, au moins un conjugué ou au moins un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, un excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable et un éventuellement un adjuvant. La quantité de polypeptide, de conjugué ou de vecteur dans la composition pharmaceutique selon la présente invention dépend de nombreux paramètres comme le 20 comprendra l'homme de l'art, tels que la nature de la protéine porteur, le vecteur utilisé ou, la voie d'administration. Une quantité appropriée est une quantité telle qu'une réponse immunitaire humorale capable de neutraliser des isolats primaires du VIH est induite après administration de cette dernière. La quantité de polypeptide à administrer est de l'ordre de lOntg à lmg, la quantité sélectionnée variant en fonction de la voie d'administration. La 25 quantité de conjugué à administrer sera déduite des quantités indiquées ci-dessus en tenant compte du PM de la protéine porteur. La quantité de vecteur d'expression à administrer est de l'ordre de 10 à 5000 micro grammes dans le cas d'un vecteur non viral et de l'ordre de 104 à 108 TCID50 dans le cas d'un vecteur viral. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable 30 classiquement utilisé dans le domaine des vaccins peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. La quantité d'adjuvant utilisé dépend de la nature de l'adjuvant et peut être aisément déterminée par l'homme de l'art. Des agents auxiliaires classiques tels qu'agents - il mouillants, charges, émulsifiants, tampons etc. peuvent également être additionnés à la composition selon l'invention. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être préparées par tout procédé classique connu de l'homme de d'art. Classiquement les 5 antigènes selon l'invention sont mélangés avec un excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable, tel qu'eau ou solution saline tamponnée au phosphate. L'excipient ou diluant va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les excipients ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation 10 pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Pharmaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine. Les compositions pharmaceutiques mentionnées ci-dessus peuvent être administrées par toute voie classique, habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire, intradermique, sous-cutanée, 15 etc..). On utilisera de préférence dans le cadre de la présente invention pour les compositions pharmaceutiques injectables une administration intramusculaire ou intradermique. Une telle administration peut être réalisée avantageusement au niveau des muscles de la cuisse ou du bras ou au niveau du derme du bras. Une administration via la muqueuse nasale, vaginale ou rectale peut être également recommandée dans le cadre de 20 la présente invention. L'administration peut être réalisée par l'administration d'une dose uniqueou de doses répétées, par exemple à JO, à 1 mois, à 3 mois, à 6 mois et à 12 mois. On utilisera de préférence les injections à JO, à 1 mois et à 3 mois avec un rappel dont la périodicité pourra être aisément déterminée par le médecin traitant. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut avantageusement 25 être administrée selon un schéma posologique comprenant la co-administration d'un vecteur d'expression selon l'invention et d'un polypeptide ou d'un conjugué selon l'invention ou selon un schéma de " prime-boost " dans lequel le vecteur selon l'invention est administré en premier et le polypeptide ou le conjugué en tant qu'injection de rappel ou inversement. Dans ces deux schémas posologiques, le vecteur d'expression selon 30 l'invention peut être remplacé par tout vecteur d'expression exprimant en outre un ou plusieurs antigènes ou épitopes du VIH différents du polypeptide selon l'invention, et en particulier par un poxvirus de préférence ALVAC ou NYVAC. On peut citer à titre d'exemple de vecteur ALVAC et NYVAC utilisables à cette fin les vecteurs décrits dans - 12 les brevets US 5,942,235, US 5,756,103 et US 5,990,091; EP 83286, US 5,494,807 et US 5,762,938 La présente invention entend également couvrir une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme médicament, en particulier pour 5 l'induction d'anticorps neutralisant le VIH à des fins d'immunisation prophylactique et thérapeutique du corps humain contre les infections liées au VIH. La présente invention concerne donc en particulier une méthode d'induction d'anticorps neutralisant le VIH comprenant l'administration d'une quantité appropriée d'une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus. La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que le polypeptide selon l'invention était capable après administration d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Les antigènes décrits ici sont donc particulièrement avantageux dans le cadre d'une immunisation pour la protection et/ou le traitement des sujets à risques ou infectés par le VIH. Sans vouloir être liée par aucune théorie, la demanderesse pense que la conformation hélicodale du polypeptide selon l'invention rend accessible des domaines de la gp4l qui ne sont accessibles durant le phénomène de fusion des membranes virale et cellulaire que dans la conformation intermédiaire qui est adoptée de façon transitoire. Ces domaines rendus accessibles constitueraient la cible des anticorps induits par le 20 polypeptide selon l'invention, ces derniers bloquant ainsi le phénomène de fusion membranaire à un stade pré-fusogénique. La conformation ouverte adoptée par le polypeptide selon l'invention mimerait donc la conformation adoptée par l'hélice C dans l'état intermédiaire. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic comprenant la mise 25 en contact d'un polypeptide selon l'invention avec un échantillon biologique et la détection des complexes anticorps/polypeptide qui se sont formés. Les sujets VIH+ contiennent en effet des anticorps sériques anti-gp41. Un test immunologique (tel qu'un test ELISA dans lequel le polypeptide selon l'invention est fixé sur la plaque de test puis mis en contact avec le sérum à tester et les complexes anticorps/polypeptide sont ensuite 30 détectés) permettrait donc de diagnostiquer les sujets infectés. La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans l'exemple qui suit par référence à la figure 1 annexée qui est une représentation schématique du phénomène - 13 de changement de conformation de la gp4l qui précède la fusion des membranes cellulaire et virale. L'exemple décrit ci-dessous est donné à titre purement illustratif de l'invention et ne peut en aucun cas être considéré comme limitant la portée de cette dernière. Exemple 1: Détermination de l'immunité humorale induite par les polypeptides selon l'invention L'antigène polypeptidique SEQ N0 5 a été testé chez le cobaye selon le protocole décrit ci-dessous. L'antigène obtenu par synthèse chimique et purifié sous forme lyophilisé est repris dans une solution saline injectable (NaCI 0,4% à pH physiologique). Des groupes de 5 cobayes ont été injectés 3 fois, à 3 semaines d'intervalle, dans les cuisses (muscle biceps femoris) avec 10 gig d'antigène polypeptidique par cuisse, soit 20 1g d'antigène par immunisation. A chaque injection, les animaux ont reçu 0,5 ml de la 15 composition (0,25 ml dans chaque cuisse). Les sérums des animaux ont été prélevés pour l'analyse des anticorps avant immunisation, puis 3 et 2 semaines après les 2'de et 3èm immunisations, respectivement. Deux compositions ont été testées en parallèle: l'une comprenant le polypeptide seul, l'autre comprenant en outre un adjuvant (phosphate d'aluminium 6 mg par dose de 20 0,5ml). La présence d'anticorps spécifiques du polypeptide selon l'invention dans les sérums des animaux immunisés est testée par la technique ELISA. Pour ce faire, des microplaques ELISA 96 puits sont sensibilisées avec le polypeptide, les parties des puits n'ayant pas fixé l'antigène sont saturées avec un tampon phosphate pH7,2 + 5% de lait 25 écrémé, puis les microplaques sont incubées avec une série de dilutions de chaque sérum (à partir du 1/100, puis de 2 en 2). Les anticorps se fixant au polypeptide sont révélés par mesure densitométrique après incubation avec un conjugué anti-IgG de cobaye couplé à la peroxydase, puis addition du substrat TMB (3, 3', 5, 5' - Tetramethyl Benzidine). La capacité des anticorps sériques anti-polypeptide à neutraliser in vitro l'infection 30 de PBMC humaines par des souches VIH-1 primaires est évaluée par la technique publiée par C. Moog et al (AIDS Research & Human Retroviruses, 1997, 13: 19-27). - 14 Brièvement, chaque souche virale, à une dose infectieuse donnée (proche de la TCID50), est pré incubée avec différentes dilutions de sérums (à partir du 1/4, puis de 2 en 2), puis le mélange est mis en présence de PBMC humaines activées par la PHA (phytohémagglutinine). Après 7 jours de culture en présence d'IL-2, l'infection virale est 5 évaluée par mesure de la p24 virale dans les surnageants de culture. Les titres anticorps neutralisants sont exprimés comme l'inverse de la dernière dilution de sérum réduisant de 90% le titre viral (par rapport au virus VIH- 1 sans sérum). - 15 REVENDICATIONS. 1.- Utilisation d'un antigène polypeptidique comprenant la séquence de l'hélice C de la 5 protéine gp41 dans laquelle entre 3 et 8 mutations en alanine sélectionnées dans le groupe consistant en: N114A; M115A; M118A; E119A; R122A; E123A; N125A; N126A; S129A; L130A; H132A; S133A; E136A; E137A; Q139A;N140A; E143A; K144A; Q147A et E148A, ont été introduites pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour l'induction anticorps neutralisant le VIH. 10 2.- L'utilisation selon la revendication 1 dans laquelle deux mutations en alanine consécutives sont séparées par 6 acides aminés. 3.- L'utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle l'antigène polypeptidique 15 comprend en N-terminal une séquence supplémentaire APKE. 4.- L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle l'antigène polypeptidique comprend en C-terminal une séquence supplémentaire KQGI. I 5.- L'utilisation selon la revendication 4 dans laquelle l'antigène polypeptidique comprend la séquence SEQ ID N 5. 6.- L'utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l'antigène est conjugué à une protéine ou un peptide porteur. 25 7.- Conjugué comprenant un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 lié par covalence à une protéine ou un peptide porteur. 8.- Séquence d'ADN codant pour le conjugué selon la revendication 7. 30 9.- Vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN selon la revendication 8. - 16 10.- Composition pharmaceutique comprenant au moins un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, un excipient pharmaceutiquement acceptable et un adjuvant. 1i.- Composition pharmaceutique comprenant au moins un conjugué tel que défini dans la revendication 7 ou au moins un vecteur tel que défini dans la revendication 9, un excipient pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant.