Brevet FR2856076A1 — publié le 20041217

De nos jours les bactéries du genre Salmonella sont des pathogènes majeurs. Elles sont à l'origine de la majorité des toxi-infections alimentaires à l'échelle mondiale et plus particulièrement dans les pays occidentaux. Le vecteur principal d'infection est l'ingestion de denrées alimentaires 5 contaminées. Les salmonelles peuvent être présentes dans tous types d'aliments avec des prévalences plus élevées dans les ovoproduits, les produits laitiers et carnés crus. Les symptômes cliniques de la salmonellose sont des diarrhées aiguës associées à une déshydratation importante qui nécessitent une hospitalisation. La salmonellose peut être mortelle 10 notamment pour les enfants en bas âge et les personnes âgées. Face à ce risque sanitaire important, de nombreux pays ont établi une réglementation qui interdit la commercialisation de denrées alimentaires dans lesquelles une salmonelle peut être détectée dans une prise d'essai de 15 25 g. Aussi de nombreux outils de diagnostic ont été développés pour effectuer ces recherches. Les méthodes normalisées peuvent se schématiser en 6 étapes successives: un pré-enrichissement de la prise d'essai à analyser (16 à 20 heures) une phase d'enrichissement en bouillons sélectifs (24 à 48 heures) - une phase d'isolement sur gélose sélective (24 à 48 heures) - une phase de purification (18 à 24 heures) -une étape de confirmation biochimique (24 à 48 heures) - une étape de confirmation sérologique (24 à 48 heures) Ainsi la libération de lot de denrées alimentaires peut nécessiter jusqu'à plus de 10 jours. Ce délai est fortement pénalisant pour les industriels 30 des filières alimentaires: le blocage des lots est coûteux car il nécessite des aires de stockage importantes (parfois à température dirigée), la durée de commercialisation du produit fini est également réduite. Dans le secteur de la santé humaine, les délais de réponse sont 35 également élevés. Ils sont très souvent mal adaptés à la mise en oeuvre rapide d'une antibiothérapie appropriée. Les efforts réalisés par tous les acteurs des filières alimentaires ont contribués à réduire notablement la prévalence des lots de denrées alimentaires contaminés par des salmonelles à des taux inacceptables (moins de 5 % dans les pays occidentaux). Ainsi, les laboratoires d'analyse ont 5 maintenant besoin de techniques qui leur permettent de libérer rapidement les lots exempts de salmonelles. Tout réactif ou toute méthode qui permet de diminuer le nombre d'étapes nécessaires à l'obtention du résultat ou qui permet de réduire le temps d'une ou plusieurs étapes s'inscrit pleinement dans cette exigence de gain de temps. Des réactifs permettent ainsi de 10 combiner plusieurs étapes. C'est notamment le cas du milieu de culture semisolide M.S.R.V (Modified Semi Solid Rappaport Vassiliadis) ou du milieu D.I.A.S.A.L.M (Diagnostic Semi Solid Salmonella Medium). Le principe de ces deux milieux de culture repose sur la mobilité de plus de 99% des salmonelles en milieu semisolide. Constitués d'une base sélective, ils ne contiennent 15 qu'un faible taux de l'agent gélifiant universellement utilisé en microbiologie analytique: I'agar-agar. Ainsi, le dépôt d'une fraction de la culture préenrichie sur le bord ou le centre d'une boîte de Petri contenant l'un de ces milieux contribuera à l'enrichissement sélectif des salmonelles (si l'échantillon en contient) et à leur migration dans la gélose molle. Après une phase 20 d'incubation de 18 à 24 heures à une température appropriée (classiquement 42 C), I'apparition d'un arc de migration typique est alors synonyme d'une suspicion de salmonelle dans l'échantillon analysé. L'absence d'arc de migration permet de conclure à l'absence de salmonelle dans l'échantillon et autorise donc la libération du lot. Ces deux milieux de culture sont intéressants pour l'utilisateur car ils permettent de statuer sur la non-contamination d'un échantillon par une salmonelle dans des délais compris entre 40 et 48 heures. Toutefois, compte tenu de leur faible taux en agent gélifiant agaragar, ils entraînent un nombre de contraintes élevé pour l'utilisateur. Ils ne 30 peuvent ainsi être commercialisés que sous forme d'une base déshydratée qui doit être reconstituée par l'utilisateur. La commercialisation de ces milieux en boîte de Petri est impossible compte tenu de leur faible force de gel. La commercialisation en flacons prêts à l'emploi est à proscrire car elle nécessite une remise en fusion du milieu par l'utilisateur avant la répartition en boîte de 35 Petri. En effet, ces milieux sont caractérisés par des pH particulièrement bas (compris entre 5 et 5,5), ainsi des traitements thermiques répétés contribuent à hydrolyser l'agar-agar, la force de gel finalement obtenue n'est plus adaptée (le milieu devient liquide). Ainsi la seule alternative pour l'utilisateur est de reconstituer par lui5 même le milieu de culture. Cette opération qui est consommatrice en temps n'est par ailleurs pas toujours aisée à réaliser. La force de gel finale du milieu est très dépendante du procédé, du temps et de la température de chauffe au cours de la préparation. Or, comme le principe de ces milieux est basé sur la mobilité des salmonelles, la reproductibilité des résultats obtenus d'une 10 production de milieu à une autre sera très fortement liée à la force de gel finale et donc à une parfaite maîtrise des conditions de fabrication. L'Homme du métier comprendra aisément que ces contraintes et que la difficulté d'obtenir des milieux d'une qualité spécifiée reproductible est peu adaptée aux besoins de l'utilisateur final. Il est également à noter que le même type de 15 difficulté sera rencontré avec d'autres gélifiants classiques comme l'agarose. Aussi le but de la présente invention est-il de fournir des nouveaux milieux de culture semi-solide, adaptés à la culture et à la mobilité des salmonelles, qui se caractérisent en ce que leurs propriétés rhéologiques sont 20 compatibles avec des présentations commercialisables sous forme prêt à l'emploi (boîtes de Petri et/ou flacons). Le milieu de culture permet de détecter les salmonelles d'une manière rapide, notamment en moins de 48 heures, et d'une manière pratique, I'opérateur n'ayant pas à préparer la boîte de Petri, qui peut elle être fournie à l'avance, prête à l'emploi, alors qu'auparavant, il lui 25 fallait la faire extemporairement avec les biais que cela entraîne. L'invention a pour objet un milieu de culture comprenant un polysaccharide de motif répétitif, ayant la structure indiquée ci-dessous, un nutriment à azote organique et de l'eau, caractérisé en ce que le 30 polysaccharide a une viscosité apparente à 20 C au viscosimètre Brookfield, modèle DV Il de module 4 à une vitesse de 6 comprise entre 7 000 et 50 000 mPa.s et le milieu comprend un indicateur coloré qui vire à un pH compris entre 6,4 et 8 et un agent sélectif inhibant la croissance de souches autres que les bactéries de l'espèce Salmonella. De préférence, le polysaccharide est présent à raison de 10 à 30 g/I du milieu, I'agent sélectif à raison de 5 à 50 mg/l du milieu; le nutriment à raison de 2 à 20 g/I du milieu; un sel de croissance de magnésium à raison de 2 à 20 g/I notamment du chlorure de magnésium; un sel de sodium de 5 croissance et d'augmentation de la force de gel à raison de 2 à 16 g/I du milieu, notamment du chlorure de sodium; et le nutriment azoté est une peptone. L'indicateur coloré est du rouge de phénol, du rouge de méthyl, du bleu de bromothymol, du bleu de bromocrésol. Le milieu comprend de 0,1 à 5 g/I du milieu d'un autre polysaccharide, ce qui rend le milieu plus rigide et plus 10 facile à transporter. Le brevet français publié sous le N0 02 13 095 décrit un polysaccharide permettant une biodisponibilité optimale des substrats dans les milieux de culture. Nous avons mis en évidence que, d'une façon 15 surprenante, ils permettent également d'obtenir des milieux de culture dont la force de gel est optimale pour la mobilité des salmonelles et dont l'élasticité est adaptée au transport des milieux prêt à l'emploi (boîtes de Petri et/ou flacons). On peut préparer ce polysaccharide dont la structure chimique est la suivante: / S \ / / HO4O. \ O OH C04 H CH ou +1,9 acétates F \ -ff"1zHio1+tHO. G \ vbff1wJHlciq /, Pynruvu n n étant un nombre entier ce polymère contenant 7 sucres dont 1 acide glucuronique (A), 3 résidus 15 glucose (B, C et D), 3 résidus galactose (E, F et G), un groupement pyruvate et 1 à 3 groupements acétate non localisés par un procédé dans lequel on dissout dans de l'eau, à une concentration comprise entre 1 et 40 g par litre, un polymère natif traité thermiquement pouvant être obtenu en cultivant un microorganisme bactérien déposé sous le numéro 1-1809 auprès de la CNCM 20 à l'institut Pasteur sur un milieu riche en glucose et en matière azotée pour obtenir un moût de fermentation, en diluant le moût de fermentation entre 1 et 1/20 en volume par de l'eau et en le chauffant entre 70 et 130 C, puis en le centrifugeant ou en le soumettant à une filtration tangentielle pour obtenir un surnageant, en soumettant le surnageant à une filtration à 0,2 pm pour obtenir 25 un filtrat, en concentrant le filtrat et en le mettant en contact avec de l'éthanol pour obtenir un précipité, en séparant le précipité et en le séchant. Avantageusement, de tels milieux comprennent des concentrations en polysaccharides comprises entre 2 et 30 g/I. Ils comprennent également 30 les composants nécessaires à l'obtention des propriétés de fertilité et de sélectivité attendues pour la culture de salmonelles. A titre d'exemples non limitatifs les composants additionnels pourront être des agents nutritifs (glucides, peptones, extraits de levure, de viande de caséine...), des agents sélectifs (vert malachite, sélénite, chlorure de 35 magnésium, tergitol...), des indicateurs de pH ou des substrats chromogéniques ou indicateurs colorés (rouge de phénol, rouge de méthyl, bleu de bromothymol, bleu de bromocrésol...). L'invention vise aussi un procédé de préparation d'un milieu suivant l'invention caractérisé en ce que l'on mélange les constituants à l'exception de 5 I'agent sélectif dans un ordre quelconque lorsque le nutriment n'induit pas une augmentation du pH au-delà de 7, mais en n'additionnant le polysaccharide qu'après avoir ajusté le pH de la solution aqueuse contenant un nutriment induisant ladite augmentation de pH à une valeur de 5,2 + 0,2, puis on stérilise la solution contenant les constituants mélangés en la chauffant au 10 moins à 100 C pendant au moins dix minutes, de préférence, au moins à 110 C pendant 15 minutes, on laisse refroidir et on ajoute un des agents sélectifs. L'invention vise enfin un procédé de détection de la présence du genre Salmonella dans une denrée alimentaire ou dans un tissu corporel 15 constituant une matière à analyser en faisant: - incuber dans un bouillon aqueux de culture stérile contenant un nutriment à azote organique tamponné à un pH de 7,2 + 0,2, un échantillon d'au moins 5 g et de préférence d'au moins 25 g de la matière à analyser, la quantité de bouillon étant comprise entre 1 fois et 10 000 le volume de 20 l'échantillon pendant au moins 16 H, entre 20 et 45 C et, de préférence, à 37 C pour obtenir un échantillon préenrichi, - déposer en un point de dépôt, de préférence au bord de la boîte, au moins 50 microlitres d'échantillon préenrichi sur moins de 2,5 % de la surface d'un milieu suivant l'invention contenu dans une boîte de Petri, - incuber la boîte de Petri à une température comprise entre 20 et 50 C, et de préférence à 42 C, entre 12 et 24 heures, et - on observe la présence ou non d'un halo d'une coloration différente de celle du milieu initial d'une longueur, définie par la distance entre le point de dépôt et le point du halo le plus éloigné du point de dépôt supérieure à 2 30 cm, I'absence de ce halo indiquant l'absence de bactérie Salmonella dans la matière à analyser. D'autres caractéristiques des milieux selon l'invention apparaîtront à la lumière des exemples ci-dessous. On peut préparer l'échantillon de matière à analyser comme suit: prélever 25 grammes l'échantillon potentiellement contaminé, - ajouter 225 ml d'eau peptonée tamponnée, - incuber 16 à 20 heures à 37 0C +/- 1 0C déposer 0,1 ml du milieu pré-enrichi précédemment sur un des bords de la boite de Pétri contenant le milieu de l'invention, - incuber de 12 à 24 heures la boite à l'endroit dans une étuve à 420C +/- 1 C. On élimine ainsi les bactéries autres que les salmonelles et on rend la gélose plus molle, en y favorisant la mobilité des salmonelles. lire le résultat: o Présence d'un halo rouge d'un diamètre supérieur à 2cm => présence présomptive de salmonella o Présence d'un halo inférieur à 2 cm =>absence de salmonella Ainsi qu'il a été dit précédemment, la présente invention concerne 15 aussi un procédé pour obtenir ce milieu de culture, selon lequel: a) On mélange les agents nutritifs, I'indicateur coloré et les éléments sélectifs; b) On met en solution le mélange ainsi obtenu par adjonction d'eau en quantité suffisante afin de satisfaire aux recommandations pour le milieu 20 considéré; c) On ajuste le pH à 5.2 +/0.2; d) On ajoute à ce mélange le polysaccharide (2 à 30 g/Il); e) On stérilise l'ensemble à 1 10 C-15 minutes; f) On ajoute les autres éléments sélectifs thermolabiles; g) On coule le produit stérilisé dans des récipients ad hoc (boîte de Petri, tube, Flacon...), à 55 C; h) On laisse reposer 24 heures entre 2 et 8 C Les exemples de réalisation qui suit et qui ne présente aucun 30 caractère limitatif, permettra à l'homme de métier de mieux comprendre la présente invention et ses nombreux avantages. Exemple 1: Impact du polysaccharide sur la migration des 35 salmonelles Préparation des milieux de culture: Milieu 1: - Peptones: 10 g/I - NaCI: 8 g/I - Vert de malachite: 0.04 g/I - Chlorure de Magnésium: 12 g/I Novobiocine * : 20 mg/l - Polysaccharide (viscosité : 7000 15 50000 mPa.s Milieu 3 Ce milieu sera la gélose semisolide formulée selon Rappaport et Vassiliadis (MSRV: AES Laboratoire; AEB140672) On dépose 100 pl d'un inoculum bactérien (préparé à partir d'un bouillon cerveau-coeur saturé) sur le bord des boîtes et on l'incube 12 à 24 h à 42 C. La croissance des Salmonelles sera représentée par la présence 25 d'un arc de migration caractéristique. Les résultats obtenus pour des souches de Salmonelles et d'interférentes sont regroupés dans le tableau ci-dessous: TABLEAU 1 Souches testées Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 Salmonella typhimurium + - + Salmonella heidelberg + - + Salmonella virchow + - + Salmonella dublin + + Salmonella derby + - + Salmonella enteritidis + - + Citrobacter freundii - - Enterobacter sakazakii - - Escherichia coli - - Serratia nulidae - Klebsiella terrigena - - Proteus mirabilis Staphylococcus aureus - +: arc de migration > 2 cm -: arc de migration Z 2 cm Sur les milieux comportant le polysaccharide, seul le n 1 pour lequel 7000 La migration des salmonelles sur le MSRV(milieu 4) est quant à elle identique au milieu 1. Exemple 2: Influence du couple substrat spécifique / indicateur 15 coloré sur le diaqnostic différentiel des Salmonelles Milieu 1: La composition de ce milieu est identique à celle du milieu 1 de l'exemple 1. Milieu 2: La composition du milieu est identique à celle du milieu 1 de l'exemple 1 avec en plus un indicateur coloré ( rouge de Phénol) ainsi qu'un substrat dégradé spécifiquement par les Salmonelles, comme par exemple la Lysine. La dégradation de la lysine par la Lysine-décarboxylase des salmonelles va provoquer une alcalinisation du milieu et un virage de l'indicateur du vert au rouge. Milieu 3: Ce milieu est le MSRV. Les mêmes souches que dans l'exemple précédent ont été testées et les résultats sont présentés dans le tableau ci dessous TABLEAU 2 Souches testées Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 D M D M D M Salmonella typhimurium - + + + - + Salmonella heidelberg - + + + - + Salmonella virchow - + + + - + Salmonella dublin - + + + - + Salmonella derby - + + + - + Salmonella enteritidis - + + + - + Citrobacter freundii -. . Enterobacter sakazakii -.. Escherichia coli. Klebsiella terrigena - - + Proteus mirabilis -. Serratia nulidae -. . Staphylococcus aureus -. D: Différenciation +: virage de l'indicateur coloré 20 (> 2 cm) M: Migration ou migration des germes ensemencés -: pas de différenciation spécifique ou pas de migration Les résultats du tableau 2 montrent que l'ajout d'un substrat dégradé spécifiquement par les salmonelles couplé à un indicateur coloré permet une 5 visualisation ainsi qu'une différenciation très aisée de la migration des salmonelles dans le milieu. Sur le MSRV la différentiation n'étant pas basée sur le virage d'un indicateur coloré, la migration des salmonelles se caractérise par la présence 10 d'un halo blanc non spécifique. Exemple 3: Résistance aux conditions de transport Milieu 1: Ce milieu est identique au milieu 1 de l'exemple 2 15 Milieu 2 Ce milieu est identique au milieu 1 supplémenté par 0.5 g/I d'Agar agar. Milieu 3 Ce milieu est identique au milieu 1 avec substitution du polysaccharide par de l'Agar Agar à 2.7 g/l. Milieu 4: Ce milieu est le MSRV. Dans cet exemple sont étudiés l'interaction de l'agar avec le polysaccharide ainsi que l'effet de l'Agar seul dans le milieu et leurs influences sur la migration des salmonelles ainsi que sur la tenue en boîte de Petri du 30 milieu. Cette tenue en boîte représentant la capacité du milieu à résister à des conditions de transports défavorables. Afin de simuler ces conditions, nous avons fait subir aux milieux une 35 contrainte mécanique: - La contrainte "choc" consiste à laisser tomber la boîte d'une hauteur de un mètre sur une surface solide et à observer l'aspect de la gélose. D'autre part nous avons fait subir à des boîtes de chacun des milieux un aller/retour en Allemagne et nous avons contrôler, à réception, l'état des géloses et leur propriétés. Les résultats sont résumés dans les deux tableaux ci-dessous: TABLEAU 3 Souches testées Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 Milieu 4 Salmonella typhimurium + + + + Salmonella heidelberg + + + + Salmonella virchow + + + + Salmonella Dublin + + + + Salmonella derby + + + + Salmonella enteritidis + + + + Citrobacter freundii - Enterobacter sakazakii - - Escherichia coli - - Klebsiella terrigena - - Proteus mirabilis - - Serratia nulidae - Staphylococcus aureus - - +: Migration > 2 cm -: Migration TABLEAU 4 Validation des conditions Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 Milieu 4 de transport Choc - + -Transport +: Gélose intacte -: Renversement de la gélose Les résultats du tableau 3 démontrent que la supplémentation du milieu en Agar agar ou l'utilisation de l'Agar seul dans le milieu aux concentrations utilisées n'influe en rien sur la mobilité des salmonelles dans le milieu. Cependant, comme le montrent les résultats du tableau 4, seule 10 I'interaction Agar / polysaccharide permet au milieu de résister à la contrainte " Choc ".. On constate, de plus, que le transport du MSRV en boîtes de Pétri n'est pas possible compte tenu de son incapacité à résister aux diverses contraintes mécaniques. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture comprenant un polysaccharide c la structure chimique est la suivante: /H10 COî \ O ON 0 Aà 1 groupement pyrunvyle et 1 à 3 groupements acétyles \t // \ Pût"Mu fi Je motif répétitif, dont ou -Z-O--E--) I- n F I G n: étant un nombre entier ce polymère contenant 7 sucres dont I acide glucuronique (A), 3 résidus 20 glucose (B, C et D), 3 résidus galactose (E, F et G), un groupement pyruvate et 1 à 3 groupements acétate non localisé,s un nutriment à azote organique et de l'eau, caractérisé en ce que le polysaccharide a une viscosité apparente à 20 C au viscosimètre Brookfield de modèle DV II de module 4 à une vitesse de 6 comprise entre 7 000 et 50 000 mPa.s et le milieu comprend un 25 indicateur coloré qui vire à un pH compris entre 6,4 et 8 et un agent sélectif inhibant la croissance de souches autres que les bactéries de l'espèce Salmonella. 2.Milieu suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est présent à raison de 10 à 30 g/I du milieu. 30 3. Milieu suivant la revendication I ou 2, caractérisé en ce que les agents sélectifs sont présents à raison de 5 à 50 mg/I du milieu. 4.Milieu suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que 35 le nutriment azoté est présent à raison de 2 à 20 g/I du milieu. 5. Milieu suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu comprend un sel de croissance de magnésium à raison de 2 à 20 g/I notamment du chlorure de magnésium. 6. Milieu suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu comprend un sel de sodium de croissance et d'augmentation de la force de gel à raison de 2 à 16 g/I du milieu, notamment du chlorure de sodium. 7. Milieu suivant l'une de revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le nutriment azoté est une peptone 8. Milieu suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'indicateur coloré est du rouge de phénol, du rouge de méthyl, du bleu 15 de bromothymol ou du bleu de bromocrésol. 9. Milieu suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,1 à 5 g/I du milieu d'un autre polysaccharide. 1O.Procédé de détection de la présence de bactéries du genre Salmonella dans une denrée alimentaire ou dans un tissu corporel constituant une matière à analyser, caractérisé en ce que: - on fait incuber dans un bouillon aqueux de culture stérile contenant un nutriment à azote organique tamponné à un pH de 7,2 + 0,2, un échantillon 25 d'au moins 5 g et de préférence d'au moins 25 g de la matière à analyser, la quantité de bouillon étant comprise entre 1 fois et 10 000 le volume de l'échantillon pendant au moins 16 H, entre 20 et 450 C et, de préférence, à 37 C pour obtenir un échantillon préenrichi, - on dépose en un point de dépôt, de préférence au bord de la boîte, 30 au moins 50 microlitres d'échantillon préenrichi sur moins de 2,5 % de la surface d'un milieu suivant les revendications 1 à 8 contenu dans une boîte de Petri, - on incube la boîte de Petri à une température comprise entre 20 et 50 C, et de préférence à 42 C, entre 12 et 24 heures, et - on observe la présence ou non d'un halo d'une coloration différente de celle du milieu initial d'une longueur, définie par la distance entre le point de dépôt et le point du halo le plus éloigné du point de dépôt supérieure à 2 cm, I'absence de ce halo indiquant l'absence de bactérie Salmonella dans la matière à analyser. 11.Procédé de préparation d'un milieu suivant les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on mélange les constituants à I'exception de l'agent sélectif dans un ordre quelconque lorsque le nutriment n'induit pas une augmentation du Ph au-delà de 7, mais en additionnant le polysaccharide qu'après avoir ajusté le pH de la solution aqueuse contenant un nutriment 10 induisante ladite augmentation de pH à une valeur de 5,2 + 0,2, puis on stérilise la solution contenant les constituants mélangés en la chauffant au moins à 100 C pendant au moins dix minutes, de préférence, au moins à 110 C pendant 15 minutes, on laisse refroidir et on ajoute l'agent sélectif.