Brevet FR2847266A1 — publié le 20040521

METHODES DE CRIBLAGE DE COMPOSES MODULANT LE FLUX DE CHOLESTEROL ET UTILISATIONS. La présente invention se rapporte à des méthodes pour identifier, sélectionner ou caractériser des composés biologiquement actifs, notamment des composés actifs sur le système vasculaire, lesdites méthodes étant basées sur la modulation de l'activité de l'adipophiline à travers des cellules ou préparations membranaires. Les méthodes de l'invention peuvent comprendre des tests de liaison in vitro, des tests de liaison en système cellulaire (ou sur des préparations membranaires naturelles ou synthétiques) ou des tests fonctionnels en système cellulaire ou artificiel. Elle concerne en particulier une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés capables de moduler le flux de cholestérol comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline. Elle concerne également les utilisations des composés ainsi sélectionnés, identifiés ou caractérisés. L'athérosclérose est une maladie multifactorielle des vaisseaux, d'évolution lente, au cours de laquelle de nombreux facteurs de risque génétiques et/ou environnementaux agissent pour favoriser le développement des lésions. Elle correspond à une réaction inflammatoire chronique de la paroi artérielle, transformée en événement clinique aigu à l'occasion de la rupture d'une plaque d'athérome et de la formation d'un thrombus occlusif. L'athérosclérose est une cause majeure de morbidité, de mortalité, d'infarctus du myocarde, d'ischémie cérébrale, de maladies cardiovasculaires et de la vascularisation périphérique. L'hypercholestérolémie et la surcharge en cholestérol des macrophages, impliquée dans l'inflammation vasculaire, sont des facteurs majeurs qui contribuent à l'athérosclérose. L'hypercholestérolémie est actuellement traitée grâce à la combinaison d'un régime alimentaire et d'une intervention médicamenteuse avec, par exemple, des agents séquestrant les acides biliaires ou les statines. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est cependant nécessaire pour pallier aux limites des thérapies existantes. Le transport inverse du cholestérol, mis en #uvre par les HDLs ( High Density Lipoproteins ou Lipoprotéines de Haute Densité), permet de décharger le cholestérol qui s'accumule dans les tissus périphériques et assure son élimination métabolique via le foie. Il contribue ainsi à la protection de l'organisme contre l'athérosclérose. L'apolipoprotéine A-I est un constituant fondamental des HDL, responsable de leur efficacité. A cet égard, l'augmentation de l'expression de l'apoA-1 a un effet protecteur contre l'athérosclérose. L'athérosclérose est initiée par une infiltration, à travers l'endothélium, des LDL ( Low Density Lipoproteins ou Lipoprotéines de Basse Densité). Les particules de LDL se lient aux glycosaminoglycanes et, une fois piégées dans la matrice extracellulaire du sous endothélium, s'accumulent dans certains sites de prédilection. Dans ce micro-environnement pariétal, les particules commencent à subir des modifications oxydatives. On observe également une infiltration massive par les monocytes circulants de l'intima de l'artère à laquelle ils adhèrent au niveau de la matrice extracellulaire. Ils se différencient ensuite en macrophages matures. Ces cellules, grâce à des récepteurs spécifiques (récepteurs scavengers ) captent et dégradent les LDL modifiées accumulées dans l'espace intimai de l'artère. Les macrophages sont présents à tous les stades de l'athérogénèse. Leur participation est prédominante dans le processus athéromateux (par opposition à la sclérose) puisqu'ils participent à la constitution du noyau lipido-nécrotique, déterminant pour la vulnérabilité de la plaque. L'importance de l'infiltration macrophagique semble en effet directement corrélée à l'instabilité et à la fragilité de la plaque. Les fonctions des macrophages sont multiples : présentation d'antigènes aux lymphocytes T, épuration de débris et de matériaux toxiques, sécrétion d'une extraordinaire variété d'enzymes, de cytokines et de facteurs de croissance. Dans les modèles animaux, les macrophages sont en première ligne en cas "d'agression lipidique". La première réponse artérielle à une hypercholestérolémie diététique, observée en quelques jours, est une adhérence massive des monocytes sanguins à l'endothélium. Les monocytes assurent normalement un nettoyage régulier de l'intima. Devenus macrophages "éboueurs", ils débarrassent la zone sousendothéliale des débris moléculaires (notamment lipoprotéiques) et retournent éventuellement dans le sang pour être captés par la rate, les ganglions ou le foie. Si la charge d'épuration qui leur est imposée devient excessive, ils s'accumulent, se transforment en macrophages spumeux, précurseurs de plaques d'athérome. En effet, les macrophages et les cellules spumeuses piégés dans l'intima sont des cellules actives sécrétant de multiples substances qui modifient les composantes cellulaires et extracellulaires de la paroi. C'est ainsi qu'un phénomène physiologique d'épuration se transforme en un processus pathologique local. La participation des monocytes-macrophages au développement de l'athérosclérose se décompose en trois grandes étapes : (a) pénétration et activation dans l'intima, (b) interactions avec les cellules musculaires lisses et les lymphocytes T, et (c) transformation en cellules spumeuses. Les cellules endothéliales (CE) activées produisent des chimio-attractants qui recrutent les monocytes circulant, migrant par diapédèse entre les jonctions endothéliales. Les principaux facteurs chimiotactiques pour les monocytes sont: le "Monocyte Chemotactic Peptide-1" (MCP-1) , les "Colony Stimulating Factors" (CSFs), le "Transforming Growth Factor-p" (TGF-p), et les LDL oxydées. Ces dernières induisent notamment la synthèse, par l'endothélium, de glycoprotéines d'adhésion comme l'''intercellular Adhesion Molecule-1" (ICAM) ou la "Vascular Cell Adhesion Molecule-1" (VCAM-1) qui provoquent l'adhérence des monocytes et sont abondamment exprimées dans les plaques athéroscléreuses humaines. L'expression par les cellules endothéliales de ces molécules d'adhésion est augmentée par des cytokines (IL-1 et TNF-a). L'activation des monocytes exposés aux lipoprotéines modifiées, aux cytokines, aux molécules chimio-attractantes et aux facteurs de croissance, suit leur pénétration dans le tissu artériel. Elle est caractérisée par l'acquisition d'une capacité à synthétiser et à exprimer d'autres facteurs qui à leur tour stimuleront l'activité des cellules environnantes. A priori, les capacités de phagocytose, d'épuration des lipides et des débris indésirables, et enfin la possibilité de retourner dans la circulation afin d'être épurés par le foie, confèrent aux macrophages un rôle protecteur. Cependant, les macrophages synthétisent de multiples protéases, des facteurs de croissance, des espèces actives d'oxygène, des lipides péroxydés, des facteurs chimiotactiques qui peuvent être toxiques pour d'autres types cellulaires et leur permettent de jouer un rôle important dans le développement de l'athérosclérose. Toutes les cellules de l'organisme auto-régulent leurs besoins en cholestérol grâce aux récepteurs aux LDL exprimés sur leur membrane cellulaire et finement rétro-régulés. Elles sont donc naturellement mises à l'abris d'une surcharge en cholestérol. De la même manière, les macrophages mis en présence de LDL natives in vitro en concentration élevée ne se transforment pas en cellules spumeuses. Les macrophages disposent donc d'autres récepteurs, les récepteurs scavengers, capables de capter les LDL modifiées (LDL glycosylées ou oxydées) et d'accumuler ainsi d'énormes quantités de lipides. Le phénomène d'oxydation tient le rôle pathologique central au sein de la plaque. Tous les types cellulaires de la paroi artérielle peuvent oxyder les LDL. La transformation des macrophages en cellules spumeuses peut s'accompagner de modifications importantes, déplaçant par exemple l'équilibre vers des agents pro-coagulants dans la plaque d'athérome. En effet, l'accumulation intracellulaire de cholestérol libre et estérifié induit une stimulation de l'expression du facteur tissulaire, une des principales molécules initiant la voie extrinsèque de la coagulation. Le passage de la maladie silencieuse à la maladie symptomatique est pratiquement toujours la conséquence d'une rupture de la plaque, même si, à l'inverse, de nombreuses ruptures n'ont pas d'expression clinique et participent simplement-après incorporation du thrombus et cicatrisation- au mécanisme de croissance de la plaque. La richesse en macrophages des plaques est un marqueur des plaques instables : les plaques coronaires des patients atteints d'angor instable contiennent plus de macrophages que celles des patients coronariens stables. De fait, 20% des plaques seraient responsables de 80% des symptômes. Les résultats concordants des grandes études de prévention secondaire ont montré que l'incidence des événements cliniques diminue très rapidement sous traitement par des hypolipidémiants (en quelques mois) malgré une très modeste régression anatomique des lésions (estimée par angiographie ou par échographie en mode B). Les traitements hypolipidémiants ont donc d'autres mécanismes d'action, notamment la stabilisation des plaques les rendant moins vulnérables mais pas forcément moins volumineuses. La vulnérabilité n'est pas une caractéristique permanente de la plaque: elle dépend de sa composition bien plus que de sa taille, et est donc susceptible de changer plus vite que le volume globale de la plaque. Les composants associés à la vulnérabilité (lipides et macrophages) sont susceptibles de régresser plus vite que les composants associés à la stabilité (collagènes et cristaux de cholestérol). L'adipophiline humaine est une protéine d'environ 50 kDa (437 acides aminés) qui est définie comme un marqueur de l'accumulation des lipides dans les cellules. Elle a tout d'abord été nommée ADRP (pour adipose differentiation-related protein) car son homologue chez la souris a été isolé à partir d'adipocytes en 1992 par Serrero et al.. En effet, son ARN messager est sur-exprimé lors de la différenciation des adipocytes. Elle a donc été principalement décrite dans les adipocytes. L'adipophiline humaine possède 83,5 % d'identité avec l'ADRP de souris, ainsi que 12 acides aminés supplémentaires (Heid HW, 1998). La région N-terminale de l'adipophiline présente des homologies avec d'autres protéines telles que les périlipines A/B et TIP47 (Londos C, 1999). Elles forment une famille de protéines s'associant avec les particules lipidiques. L'adipophiline, TIP47 et les périlipines se colocalisent au niveau des gouttelettes lipidiques (Miura S, 2002). La fixation de ces protéines est hydrophobe (Wolins NE, 2001). L'adipophiline ne possède pas de séquence signal N-terminale et ne semble pas être glycosylée mais la présence de deux formes ayant un point isoélectrique de 7,0 et de 7,2 suggère des modifications post-traductionnelles. Elle fixerait des acides gras augmentant ainsi son hydrophobicité et sa capacité à fixer les particules lipidiques. Enfin, la forme microsomale de l'adipophiline est plus petite d'environ 5 kDa que la forme associée aux particules lipidiques (Heid HW, 1996 ;Mather IH, 2000). L'adipophiline et les périlipines recouvrent la surface des gouttelettes afin de protéger les lipides d'une hydrolyse par des lipases (Shen WJ, 1999 ; Brasaemle DL, 2000 ; Van Meer G, 2001). Cependant, l'adipophiline n'est pas détectée dans les cellules qui expriment les périlipines. L'adipophiline est retrouvée à la surface des petites gouttelettes lipidiques des préadipocytes et des adipocytes en cours de différentiation mais est absente des adipocytes en fin de maturation. Inversement, les périlipines sont absentes au début de la différentiation des adipocytes, mais sont retrouvées sur les petites et grosses gouttelettes à la fin de la maturation (Brasaemle D, 1997). La distribution des périlipines étant strictement limitée aux adipocytes et aux cellules stéroïdiennes, cette transition n'est pas observée dans les autres types cellulaires. L'adipophiline, bien que présente en plus faible quantité que dans les tissus adipeux, a été détectée dans de nombreuses lignées cellulaires en culture (cellules épithéliales, endothéliales, hépatiques HepG2, fibroblastes, monocytes, macrophages) et tissus (foie, testicules, poumon, rein, c#ur, épithélium mammaire, cortex surrénalien) où elle est associée aux particules lipidiques (Brasaemle D, 1997 ; Heid HW, 1998). Cette distribution ubiquitaire de l'adipophiline implique donc un rôle essentiel dans le métabolisme et le stockage des lipides. De plus, l'adipophiline est une des rares protéines associées aux particules lipidiques identifiées dans les cellules capables de stocker les lipides. Elle pourrait être impliquée dans la formation et la stabilisation des gouttelettes lipidiques. Il a ainsi été démontré que l'adipophiline favorise la captation des acides gras à longue chaîne carbonée dans les cellules COS-7 et que ces acides gras stimulent l'expression de son ARN messager dans les précurseurs des adipocytes (Gao J, 1999 ; Gao J, 2000 ; Serrero G, 2000). D'autres études récentes ont montré que l'adipophiline est induite dans les cellules spumeuses macrophagiques (Wang X, 1999). De plus, son ARN messager est fortement exprimé au niveau de la plaque d'athérome dans les régions enrichies en macrophages et en lipoprotéines de basse densité (LDL) modifiées (Wang X, 1999, Shiffman D, 2000). Or, les LDL oxydées (LDLox) ou acétylés (LDLac) induisent à la fois l'expression de l'adipophiline et la transformation des macrophages en cellules spumeuses. Cette induction pourrait résulter de l'activation du récepteur hormonal nucléaire PPARy (peroxisome proliferator-activated receptor y) qui régule l'expression de gènes impliqués entre autres dans le métabolisme des lipides et dans la différentiation des monocytes en macrophages (Buechler C, 2001). Les PPARy et 8 induisent, par exemple, l'expression de récepteurs scavengers au niveau des macrophages ce qui facilite la fixation des LDL modifiées qui sont alors captées en excès par les macrophages. Toutefois, parmi cette famille de récepteurs nucléaires, il semble que seul le PPAR5 soit spécifiquement impliqué dans l'accumulation des lipides dans les macrophages humains et les cellules THP-1 (cellules dérivées d'une lignée de monocytes humains) ainsi que dans le contrôle de l'expression de l'adipophiline (Vosper H, 2001 ; Patel L, 2002). Dans les macrophages qui n'ont pas accumulé de lipides, l'adipophiline est présente en faible quantité. L'adipophiline est régulée positivement lors de l'accumulation des lipides et négativement lors de la lipolyse. L'expression de l'adipophiline est donc liée au métabolisme des particules lipidiques qui est régulé par l'activité de la protéine kinase C (PKC) (Chen JS, 2001). Cependant, il a été montré chez les murins que la PKC n'est pas associée biochimiquement à l'ADRP et que l'activation de la PKC par le Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA) ou son inhibition par la calphostin C n'ont pas d'effet sur la distribution de l'ADRP à la surface des gouttelettes lipidiques (Fong TH, JCB 2002 ; Chen JS, JCB 2002). En 1998, Ye H. et Serrero G. ont montré que l'expression de l'ADRP est stimulée par des inhibiteurs de la cyclooxygénase dans les adipocytes de souris (Ye H, 1998). Cependant, les inhibiteurs de la cyclooxygénase sont aussi des activateurs du PPARy. Il se peut donc que l'effet observé ne soit pas direct, mais modulé par le PPARy ou que les inhibiteurs agissent au niveau transcriptionnel. Etant donné que d'autres agonistes du PPARy ne sont pas de bons stimulateurs de l'expression de l'ADRP et qu'aucun élément de réponse aux PPAR (PPRE) n'a pu être identifié sur le promoteur de l'ADRP ou de l'adipophiline, le PPARy ne semble pas être impliqué. Le mécanisme reste donc à élucider. Cet article montre que l'ibuprofen et l'indomethacin augmentent l'expression de l'ADRP dans les adipocytes de souris, mais les auteurs n'étudient pas l'effet de l'ADRP et se contentent d'étudier la régulation de son gène, qui est néanmoins une cible potentielle des inhibiteurs de la cyclooxygénase. La régulation du gène codant pour l'adipophiline a été de nouveau étudiée en 1999 par Wang et al. Ces derniers ont remarqué que la quantité d'ARNm de l'adipophiline était augmentée dans les macrophages stimulés par des LDL oxydées, mais pas par les LDL natives, suggérant un rôle potentiel de cette protéine dans la formation des cellules spumeuses et dans l'athérogenèse. Ils ont également montré que les facteurs pro-inflammatoires n'induisaient pas l'expression de l'adipophiline. Une nouvelle fois les auteurs suggèrent un rôle indirect des LDLox, la surexpression de l'adipophiline pouvant être la conséquence de la stimulation du PPARy. Dans cet article, les auteurs s'étendent sur la régulation de l'adipophiline par les LDLox et sa localisation au niveau de la plaque d'athérome mais n'étudient pas sa fonction dans les macrophages. Dans un article plus récent, Vosper et al. (JBC 2001) montrent que le composé F (agoniste du PPAR#) induit l'expression des récepteurs scavengers SR-A et CD36 (impliqués dans la captation des lipides) et régule négativement des gènes tels que apoE et cyp27 (impliqués dans l'efflux des lipides), ce qui contribue à l'accumulation des lipides. En revanche, le traitement des macrophages par le composé F ou la surexpression du PPAR# induit également des effets opposés sur une autre voie d'efflux des lipides (indépendante de apoE et cyp27) en stimulant l'expression d'ABCAl (impliquée dans l'efflux du cholestérol dépendant de l'apoA-I). L'efflux total est cependant bien diminué mais cette induction d'ABCAl par le traitement avec l'agoniste du PPAR# ou la sur-expression du PPAR# dans les macrophages a pour conséquence l'augmentation de l'efflux de cholestérol dépendant de l'apoA-1 (voir aussi dans PNAS : Oliver WR et al., 2001). Les inventeurs ont cherché à savoir si l'adipophiline jouait un rôle dans le métabolisme et la régulation des flux (influx et efflux) de lipides à travers ces cellules. Ils ont décidé d'observer l'effet de l'augmentation de l'adipophiline dans les cellules macrophagiques. Pour cela, deux techniques ont été développées en parallèle : - l'utilisation d'un vecteur d'expression exprimant l'adipophiline sous la dépendance d'un promoteur fort (CMV), et - l'utilisation d'un adénovirus exprimant l'adipophiline. L'effet de la surexpression de l'adipophiline dans les macrophages a pu être observé par des techniques mesurant l'efflux du cholestérol en présence d'apoA-I, de HDL et de divers inhibiteurs, tels que les inhibiteurs de l'acyl CoA:cholesterol acyltransferase. L'apoA-1 est synthétisée dans le foie et l'intestin. Elle est principalement retrouvée dans les HDL (High Density Lipoprotein) mais aussi en faible quantité dans les chylomicrons (Lipoprotéines les moins denses) et les VLDL (Very Low Density Lipoprotein). L'apoA-1 favorise l'efflux du cholestérol de la membrane, mais est également impliquée dans le maintien de la structure des HDL et dans l'activation de la Lécithine Cholestérol Acyltransferase (LCAT). La LCAT est retrouvée dans les HDL et réalise, dans le plasma, l'estérification du cholestérol libre en esters de cholestérol, participant à la maturation des HDL. Les inhibiteurs de l'acyl CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT) empêchent la re-estérification du cholestérol au niveau du réticulum endoplasmique et par conséquent le dépôt des lipides dans les gouttelettes lipidiques. En effet, après leur captation les composants des LDL modifiées, incluant les esters de cholestérol, sont hydrolysés dans les lysosomes. Le cholestérol libre est ensuite transféré dans le réticulum endoplasmique où il est re-estérifié en ester de cholestérol par l'ACAT puis s'accumule dans le cytosol où il forme les gouttelettes lipidiques (figure 1, Brown MS and Goldstein, 1983, Annu. Rev. Biochem. 52:223-261). La présence dans le milieu de culture d'accepteurs de cholestérol, tel que l'apoA-1 ou des HDL, permet l'efflux du cholestérol. Cependant, l'efflux de cholestérol n'est possible que si le pool d'ester de cholestérol stocké dans les particules lipidiques est hydrolysé par une hydrolase neutre (Small CA, FEBS Lett. 1989 ; 247 (2):205-208). La figure 1 représente le flux du cholestérol au niveau des macrophages et les techniques utilisées pour moduler l'activité de l'adipophiline au niveau des cellules macrophagiques THP-1. Les inventeurs ont donc transfecté de façon transitoire des macrophages avec un plasmide surexprimant l'adipophiline. Les résultats montrent de façon surprenante que si l'on agit sélectivement sur l'adipophiline, l'efflux du cholestérol dépendant de l'apoA-1 est réduit significativement. Ce résultat peut s'expliquer par le fait que la quantité d'adipophiline présente dans les cellules est directement modulée alors que les agonistes du PPAR8 agissent sur de nombreux autres gènes impliqués à la fois dans l'absorption, le transport, le métabolisme et l'efflux des lipides. Bien que l'article de Vosper et al. indique que le composé F augmente l'expression de l'adipophiline, aucune de leurs expériences ne démontre l'implication de cette protéine dans la rétention ou l'efflux du cholestérol. RESUME DE L'INVENTION La présente invention est donc fondée sur l'observation du rôle de l'adipophiline dans la modulation de l'efflux de cholestérol. La présente invention démontre ainsi pour la première fois une modulation de l'efflux de cholestérol par l'adipophiline. La présente invention fournit ainsi de nouvelles cibles et de nouvelles approches pour la recherche de composés capables de réguler l'efflux des lipides, et en particulier l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol). L'invention fournit également des méthodes pour accroître le transport inverse du cholestérol basées sur l'utilisation de composés qui diminuent, voire inhibent, l'activité de l'adipophiline. L'invention fournit aussi des méthodes de criblage destinées à identifier des substances thérapeutiques capables de moduler l'efflux de cholestérol, en particulier moduler le transport inverse du cholestérol, en déterminant in vitro ou ex vivo la capacité des substances testées à moduler l'activité de l'adipophiline. La présente invention concerne en particulier une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler l'efflux de cholestérol, en particulier l'efflux de cholestérol dépendant de l'apoA-I, comprenant la mise en contact d'un composé test avec l'adipophiline et la détermination de la capacité dudit composé test à modifier l'activité de l'adipophiline. Selon une variante de l'invention, la mise en contact du composé test avec l'adipophiline consiste à mettre en contact le composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline. L'invention concerne par ailleurs un procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, et potentiellement actif sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. Elle concerne également un procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline, - la détermination de la capacité dudit composé à moduler le flux de cholestérol à travers ladite cellule ou la dite membrane cellulaire, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. Elle concerne en outre un procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Elle concerne par ailleurs un procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulant le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline, - la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Elle concerne enfin l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline pour la préparation d'un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et/ou la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le transport inverse du cholestérol est un processus qui permet la sortie du cholestérol cellulaire en excès dans les tissus périphériques. Celui-ci est ensuite estérifié pour être incorporé aux HDL, qui peuvent ensuite le transférer aux lipoprotéines de basse et très basse densité qui vont le transporter jusqu'au foie où il sera éliminé ou recyclé. Ce processus contribue au maintien de l'homéostasie du cholestérol cellulaire. Etant donné qu'il n'y a pratiquement aucune sortie d'esters de cholestérol, l'efflux du cholestérol peut être défini comme la sortie des molécules de cholestérol libre de l'intérieur de la cellule vers l'extérieur à travers la membrane plasmique, soit par diffusion passive grâce à un gradient de concentration entre la membrane plasmique et des particules acceptrices contenant des phospholipides (par exemple, HDL), soit par une seconde voie impliquant des lipoprotéines pauvres en lipides (prépl-HDL) et riches en apoA-1 ou enfin par une voie impliquant le récepteur scavenger SR-BI. Au niveau des macrophages, une autre voie d'efflux résulte de l'hydroxylation des stérols par la sterol 27-hydroxylase et est dépendante de l'expression endogène de l'apoE. La sterol 27-hydroxylase convertit le cholestérol en 27-hydroxycholestérol et en acide 3ss-hyroxy-5-cholesténoique. En absence d'accepteurs de cholestérol dans le milieu, ces oxystérols traversent les membranes lipophiles plus rapidement que le cholestérol libre et sont transportés vers le foie pour être convertis en acides biliaires (Babiker A, JBC 1997,272(42) : 26253-26261 ; Westman J, Arterioscler TVB, 1998, 18 :554-561). La diffusion passive ne requiert pas nécessairement de contact entre la cellule et une particule acceptrice, mais peut être modulée par la taille et la composition des HDL acceptrices. L'efflux passif peut être augmenté par l'activité de la LCAT qui maintient un gradient de cholestérol entre la surface cellulaire et les particules acceptrices. L'efflux dépendant de SR-BI permet la diffusion passive du cholestérol vers les HDL mais serait limité aux régions de la membrane plasmique riches en cholestérol. Ainsi, lorsque les cellules mises en présence de LDLac se chargent en cholestérol via le récepteur scavenger SR-A, le pool intracellulaire de cholestérol n'est pas accessible à SR-BI. La seconde voie d'efflux, dépendante de l'apoA-I, est reliée à l'activité d'un ATP-binding transporter nommé ABCA1 (Owen JS, Lancet 1999 354 :1402-1403 ; Young SG, Felding CJ, Nat Genet. 1999, 22 :316-318). ABCA1 permet l'efflux du cholestérol et des phospholipides, qu'ils soient situés au niveau de la membrane plasmique ou dans les pools intracellulaires, en facilitant leur transfert entre les feuillets interne et externe des membranes cellulaires. Une interaction entre ABCA1 et l'apoA-1 est nécessaire pour obtenir l'efflux de cholestérol et de phospholipides. Ce mécanisme d'efflux du cholestérol est différent de celui dépendant de SR-BI qui passe préférentiellement par les HDL. L'activité d'ABCAl est inhibée par SR-BI qui facilite le retour du cholestérol des HDL naissantes vers la cellule. Ce rôle compétitif de SR-BI permettrait le maintien d'un niveau minimal de cholestérol dans les membranes plasmiques lorsque ABCA1 est actif. En effet, les macrophages chargés en cholestérol surexpriment ABCA1 ce qui entraîne une augmentation de l'efflux de cholestérol. De même, l'expression d'ABCAl dans les macrophages THP-1 peut être stimulée par des activateurs des récepteurs nucléaires PPARa et y ainsi que par les oxystérols. Inversement, quand les macrophages ne sont pas chargés en cholestérol et que l'expression d'ABCAl n'est pas augmentée, SR-BI stimulerait l'efflux du cholestérol vers les HDL (Chen W, JBC 2000,275(40) : 30794-30800). En résumé, SR-BI est impliqué dans le flux bidirectionnel du cholestérol libre entre les cellules et les lipoprotéines en fonction d'un gradient de concentration, pompe sélectivement les esters de cholestérol à partir des HDL, augmente le contenu cellulaire en cholestérol libre et agit sur la distribution membranaire des pools de cholestérol (Jian B, JBC 1998,273 : 5599-5606 ; LleraMoya M, J of Lipid Research 2001, 42 :1969-1978; Bultel-Brienne S, JBC 2002, 277 (39) :36092-36099). La présente invention propose donc d'identifier des composés modulant le transport inverse du cholestérol ou l'efflux de cholestérol et en particulier des composés modulant l'efflux de cholestréol dépendant de l'apoA-1. L'invention concerne donc des méthodes pour identifier, sélectionner ou caractériser des composés biologiquement actifs, notamment des composés actifs sur le système vasculaire, lesdites méthodes étant basées sur la modulation de l'activité de l'adipophiline et/ou du flux de cholestérol à travers des cellules ou préparations membranaires. Les méthodes de l'invention peuvent comprendre des tests de liaison in vitro, des tests de liaison en système cellulaire (ou sur des préparations membranaires, naturelles ou synthétiques) ou des tests fonctionnels en système cellulaire ou artificiel. La présente invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler le flux de cholestérol comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline. Une méthode particulière de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler le flux de cholestérol comprend la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline, éventuellement en présence de cholestérol, via la mise en évidence d'une modulation du flux de cholestérol à travers une cellule ou préparation membranaire exprimant ladite adipophiline. La détermination de la modulation de l'activité de l'adipophiline peut être réalisée par la mesure de l'activité de l'adipophiline et la comparaison de l'activité à celle obtenue en l'absence de composé test. La mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline est accomplie de préférence via la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline. Par adipophiline , il faut entendre, dans le cadre de la présente invention, la protéine complète ou un fragment de celle-ci, notamment un fragment conservant la capacité d'association avec les lipides, en particulier la capacité de liaison au cholestérol. Ainsi, les composés identifiés, sélectionnés ou caractérisés selon les procédés de l'invention sont des composés modulant l'efflux de cholestérol, en particulier au niveau des macrophages ou des cellules spumeuses. L'efflux de cholestérol correspond plus spécifiquement à celui dépendant de l'apoA-1 tel que défini ci-dessus. La liaison du composé test peut être mise en évidence de différentes manières, comme par exemple par migration sur gel ou électrophorèse des complexes formés. D'autres méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) bien connue de l'homme du métier ou la technique SPA ( Scintillation Proximity Assay ), peuvent être mises en oeuvre, dans le cadre de la présente invention, pour déterminer la liaison éventuelle du composé test à l'adipophiline. La liaison du composé test à l'adipophiline peut également ëtre mise en évidence par exemple en utilisant un composé test marqué, un ligand marqué de l'adipophiline ou un anticorps marqué spécifique d'une enzyme de synthèse ou d'un transporteur de cette dernière, le déplacement de la liaison du ligand marqué reflétant la liaison du composé test. Le ligand marqué peut être tout produit liant la molécule cible (anticorps, agoniste ou antagoniste, fragment ou dérivé d'un ligand endogène, etc.). Le ligand peut être marqué par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par incorporation d'un élément radioactif, fluorescent, luminescent, enzymatique, colorimétrique, etc.. De manière préférée, la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline est réalisée en présence d'un ligand marqué de l'adipophiline par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué. Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est un anticorps marqué, spécifique de la cible moléculaire considérée. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir d'un fragment ou d'un dérivé d'anticorps, comme par exemple des fragments Fab, F(ab')2, CDR, etc. Les anticorps peuvent être produits de manière conventionnelle, par immunisation vis-à-vis de la cible moléculaire (ou une partie immunogène de celle-ci), et récupération du sérum (polyclonal) ou des cellules de la rate (pour fabriquer des hybridomes par fusion avec une lignée appropriée), comme décrit par exemple dans Vaitukaitis et al. (J Clin Endocrinol Metab. 1971,33(6), 988- 91) ou dans Harlow et al. (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988). Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par exemple selon Riechmann et al., 1988, Nature 332,323-327. Dans un autre mode de réalisation particulier, le ligand de l'adipophiline est un ligand endogène, un agoniste ou un antagoniste, marqué. Dans un mode de mise en #uvre spécifique, on utilise du cholestérol marqué, notamment radiomarqué, en particulier tritié. Selon un mode particulier, la méthode comprend donc la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant l'adipophiline et la mise en évidence d'une liaison du composé test à ladite adipophiline. Selon un autre mode particulier, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant l'adipophiline, en présence d'un ligand marqué de ladite adipophiline, et la mise en évidence d'une liaison du composé test par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué. Dans une autre variante, le procédé de l'invention comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule ou une préparation membranaire exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de ladite adipophiline. L'effet biologique ou pharmacologique peut être l'expression d'une ou plusieurs protéines cellulaires ou des ARNm correspondants, l'expression de l'adipophiline ou de l'ARNm de l'adipophiline, l'internalisation de l'adipophiline, l'activation d'un gène, l'apparition d'un courant électrique, d'un efflux ou d'un influx d'ions, d'un efflux ou d'un influx de cholestérol, de phospholipides, de triglycérides ou d'acides gras, etc.. La mise en évidence de cet effet peut être réalisée par tous moyens appropriés, comme la mesure de l'expression d'un gène rapporteur, la mesure de l'expression membranaire de l'adipophiline, le dosage du cholestérol total (libre et estérifié) et des triglycérides, des ions ou d'un courant électrique, etc.. Classiquement, l'effet du composé test est comparé à l'effet déterminé en l'absence dudit composé. En outre, l'effet du composé test peut être déterminé en présence de cholestérol, notamment lorsqu'une activité de modulation ou d'inhibition de l'activité de l'adipophiline est recherchée. L'invention comprend donc une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de l'adipophiline et la comparaison de l'effet mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test. Selon une variante particulière, l'invention comprend une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure du flux dudit cholestérol à travers lesdites cellule ou préparation membranaire et la comparaison du flux mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test. Les cellules utilisées dans les tests peuvent être toute cellule exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'adipophiline, notamment l'adipophiline. Il peut s'agir de cellules exprimant naturellement cette molécule, ou de cellules modifiées génétiquement ou traitées pour sur-exprimer ladite molécule. Il s'agit, dans un mode préféré de l'invention, de cellules endothéliales, endothéliales HUVEC, de cellules épithéliales, hépatiques HepG2, de fibroblastes, de monocytes, de macrophages de mammifères. De manière encore plus préférée, ces cellules sont des cellules humaines. Il peut également s'agir de cultures primaires ou de lignées établies (cellules THP-1 différenciées en macrophages par le PMA). Dans un autre mode de mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules procaryotes (bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc. ), etc.. Ces cellules peuvent être isolées, cultivées et caractérisées selon des techniques connues, notamment celles décrites dans les exemples. La découverte du rôle de l'adipophiline dans la modulation des flux de cholestérol permet, selon la présente invention, de mettre en évidence de nouveaux composés biologiquement actifs, capables de moduler le flux de cholestérol. La démonstration du rôle pharmacologique de l'adipophiline souligne l'importance de la mise à disposition de tels composés actifs. Dans un mode particulier, pour la mise en #uvre des procédés ci-dessus, on utilise une préparation membranaire exprimant l'adipophiline. La préparation membranaire peut être, avantageusement, d'origine naturelle, c'est-à-dire produite à partir d'une cellule exprimant l'adipophiline. On peut produire des préparations membranaires par lyse mécanique, chimique, physique, électrique, etc., et notamment par traitement avec des détergents, ultrasons, congélation/décongélation, etc.. Cette préparation membranaire se caractérise essentiellement par la présence de fragments de membrane, comprenant une bicouche lipidique dans laquelle tout ou partie de l'adipophiline est présente. Ces préparations membranaires sont généralement dépourvues de cellule intacte. En outre, elles peuvent être enrichies en débris membranaires par des traitements appropriés (centrifugation, etc. ). On peut également utiliser une préparation membranaire d'origine synthétique, comme par exemple un liposome dans lequel tout ou partie de l'adipophiline a été introduit, ou une membrane supportée. Pour les tests de liaison ou les tests fonctionnels mentionnés ci-dessus, les composés peuvent être mis au contact des cellules (ou des préparations membranaires) à différents moments, selon leur(s) effet (s), leur concentration ou la nature des cellules et pour des périodes variées, qui peuvent être ajustées par l'homme du métier. Le test peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une plaque, une lame, une boîte, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée dans une plaque multi-puits, ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques, on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler. Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en #uvre des méthodes décrites. De manière classique, 102 à 2#106 cellules sont mises en contact avec un type de composé test, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 103 et 105 cellules. Lorsqu'une préparation membranaire est utilisée, on applique généralement 0,01 à 50 mg de protéine par essai, plus préférentiellement de 0,05 à 2 mg de protéine par essai. Les essais peuvent être réalisés dans tout type de milieu approprié, comme par exemple des solutions salines, des tampons, etc. On peut citer notamment des tampons Tris, Pipes, Hepes, etc. La température est, typiquement, proche de la température ambiante. Le pH du milieu est avantageusement compris entre 5,5 et 8, plus préférentiellement entre 7 et 8. Il est entendu que ces paramètres peuvent être ajustés par l'homme du métier, suivant les indications fournies dans les exemples. La quantité (ou la concentration) de composé test peut également être ajustée par l'utilisateur selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc. ), la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement, les cellules (ou membranes) sont exposées à des quantités de composés test qui varient de 1nM à 1 mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut, de plus, être testé, en parallèle, à différentes concentrations et sur différentes périodes. Par ailleurs, des adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques, des polymères, des peptides issus de virus, etc., peuvent, en outre, être utilisés, si nécessaire. Le contact peut être maintenu pendant une période comprise entre 1 heure et plusieurs heures (72 heures). Dans le cas de la transfection, le contact est maintenu typiquement de 4 heures à 48 heures. La présente invention peut être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou ne pas être défini. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test susceptibles de moduler l'activité de l'adipophiline selon l'invention peuvent être de nature et d'origine variées. Les composés test peuvent être des produits inorganiques ou organiques et notamment un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), un acide nucléique, plus particulièrement un acide nucléique antisens ou un RNAi (ARN interférence), un lipide, un polysaccharide, un composé chimique ou biologique tel qu'un facteur nucléaire, un cofacteur ou tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de clones d'acides nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN, etc. Dans ce cadre, des composés de type RNAi ont été identifiés et synthétisés. Des RNAi et l'utilisation de siRNAs (small interference RNA ou petits ARN interférence) dans les cellules de mammifères sont notamment décrits dans la publication de Brummelkamp, TR et al. (2002). Les ARNi de la présente invention sont des ARNi spécifiques de l'adipophiline. Ils inhibent l'activité, en particulier l'expression, de l'adipophiline en se fixant sur une séquence cible de l'ARNm de l'adipophiline. Cette séquence cible peut se situer dans les régions codantes ou non de l'ARNm de l'adipophiline, les régions non codantes peuvent se situer par exemple dans des séquences 5' ou 3' UTR. Les ARNi de la présente invention sont plus spécifiquement des ARNsi et sont avantageusement utilisés sous forme double-brin (matrice antisens et matrice sens). La présente invention a donc en outre pour objet les ARN interférence de l'adipophiline. En particulier, les ARN interférence sont construits à partir des séquences cibles sur l'ARNm de l'adipophiline, lesdites séquences cibles sur l'ARNm de l'adipophiline sont choisies parmi les séquences suivantes : - dans le 5' UTR : 5'- aatggcatccgttgcagttga -3' (SEQ ID 1), - dans la séquence codante : 5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCA -3' (SEQ ID 2) 5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCA -3' (SEQ ID 3) - dans le 3'UTR : 5'- AAAAGGCGTCTTCACTGCTTT -3' (SEQ ID 4) De préférence, les ARNsi comprennent une matrice antisens et une matrice sens, ladite matrice antisens comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID 1, 2,3 et 4. Avantageusement, les matrices antisens et les matrices sens des ARNsi comprennent au moins 21 bases, de préférence présentent une longueur de 29 bases. Avantageusement, les ARNsi sont choisis parmi les ARNs de séquences suivantes : - ARNs@-adipophiline : Matrice antisens : 5'- AATGGCATCCGTTGCAGTTGACCTGTCTC -3' (SEQ ID 5) Matrice sens : 5'- AATCAACTGCAACGGATGCCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 6) - ARNsi2-adipophiline Matrice antisens : 5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 7) Matrice sens : 5'- AATGCAATTTGCGGCTCTAGCCCTGTCTC -3' (SEQ ID 8) - ARNsi3-adipophiline Matrice antisens : 5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 9) Matrice sens : 5'- AATGAGTCAGGTTGCGGGCAACCTGTCTC -3' (SEQ ID 10) - ARNsi4-adipophiline Matrice antisens : 5'- AAAAGGCGTCTTCACTGCTTTCCTGTCTC -3' (SEQ ID 11) Matrice sens : 5'- AAAAAGCAGTGAAGACGCCTTCCTGTCTC -3' (SEQ ID 12) Les ARNsi de la présente invention qui inhibent l'expression de l'adipophiline modulent, et en particulier augmentent, l'efflux de cholestérol. A ce titre, ils peuvent être utilisés en tant que médicament, notamment pour traiter de manière préventive ou curative l'athérosclérose, l'hypercholestérolémie ou la surcharge en cholestérol des macrophages. Ils peuvent également traiter de manière préventive ou curative l'infarctus du myocarde, l'ischémie cérébrale, les maladies cardiovasculaires ou les pathologies de la vascularisation périphérique. De manière générale, un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, et potentiellement actif sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline, en particulier à moduler l'expression de l'adipophiline, in vitro ou ex vivo, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. L'invention comprend également un procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulant le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline, - la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline, - la détermination du flux de cholestérol à travers ladite cellule ou ladite membrane cellulaire, la modulation dudit flux indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Les ARNi de l'adipophiline définis ci-dessus ont été produits selon les procédés définis ci-dessus. Dans le contexte de l'invention, le terme analogue structural désigne toute molécule obtenue par modélisation moléculaire ou variation structurale à partir d'un composé test. L'effet du composé test préférentiellement mesuré est la faculté dudit composé à moduler l'activité (i.e., l'action ou l'expression) de l'adipophiline. Une utilisation particulièrement avantageuse d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline consiste à préparer un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. De manière préférée, le composé diminue l'activité de l'adipophiline pour augmenter l'efflux de cholestérol et diminuer la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. De manière préférée le médicament ainsi préparé est destiné à limiter l'accumulation des lipides et/ou la formation des cellules spumeuses et à ainsi traiter l'athérosclérose en limitant la formation de la plaque d'athérome. Le composé modulant l'activité de l'adipophiline est avantageusement choisi parmi un ARNsi tel que défini précédemment. Les composés, compositions ou médicaments selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être injectés par voie systémique ou orale, de préférence systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, intra-cérébrale, intra-péritonéale, intra-cérébrovasculaire, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 g et 1000 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 500 mg/kg, typiquement entre 1 et 200 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes retard ou prolongés peuvent être avantageux. Les doses préférées pour obtenir une diminution de l'athérosclérose chez l'animal sont des doses inférieures à 50 mg/kg. Un effet significatif est avantageusement obtenu chez l'animal à des doses comprises entre 100 et 200 mg/kg L'invention comprend en outre des outils et kits pour la mise en #uvre de ces méthodes. La faisabilité, la réalisation et d'autres avantages de l'invention sont illustrés plus en détails dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : Flux du cholestérol au niveau des macrophages et techniques utilisées pour moduler l'activité de l'adipophiline au niveau des cellules macrophagiques THP-1. ACAT, acyl CoA:cholesterol acyltransferase ; CL, Cholestérol Libre ; EC, Cholestérol Estérifié ; CEHn, Cholestéryl ester hydrolase neutre ; LDLac, LDL acétylées ; SR, Récepteurs scavengers. Figure 2 : Analyse par (A) Western Blot de l'expression de l'adipophiline après transfection des macrophages THP-1 par l'Effectene et (B) Northern blot de l'expression de l'ARNm de l'adipophiline après transfection des macrophages THP-1 par le jetPEI-Man. Figure 3 : Accumulation des triglycérides et du cholestérol dans les macrophages THP-1 après charge avec les LDL acétylées pendant 48h. Figure 4 : de l'efflux du cholestérol dans les macrophages THP-1 après transfection, expression du vecteur pCI-adipophiline puis charge avec les LDL acétylées tritiées pendant 48h (C : contrôle sans ApoA-I). Figure 5 : Analyse par Western Blot de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline par le siRNA3-adipophiline (transfection des macrophages THP-1 avec le jetSI) en présence ou absence de LDL acétylées. EXEMPLES Culture cellulaire Les macrophages utilisés proviennent d'une lignée continue (THP-1) de monocytes humains. Le milieu de base correspond à du milieu RPMI 1640 (Gibco) contenant, 4 mM de L-glutamine, 20 UI/ml de pénicilline et 20 pg/ml de streptomycine. Les cellules en suspension se multiplient à 37 C dans 5% de CO2 dans du milieu de base contenant 10% de sérum de veau foetal décomplémenté (milieu complet). La différenciation des monocytes en macrophage est obtenue en déposant 2.106 cellules/puits (boîtes à 6 puits) dans du milieu complet en présence de 1,6.107 M de PMA (Phorbol 12-Myristate 13-acétate) pendant 72 heures. Les THP-1 différenciées adhèrent au support. Transfection des macrophages Les macrophages (0,7.106 à 2.106 cellules/puits, boîtes à 6 puits) sont transfectés transitoirement par 1 à 3 g de plasmide en utilisant l'EffecteneTM (Qiagen) ou le jetPEITM-Man (Qbiogene) et/ou par 2 à 3 g de siRNA en utilisant le jetSITM (Qbiogene) comme produits de transfection. Les macrophages sont incubés de 24 à 72 h puis analysés. Constructions des plasmides II a été choisi de cloner l'ADNc de l'adipophiline humaine dans le vecteur d'expression pCI (Promega) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire CMV. Après amplification de la séquence codante à partir d'ARNm macrophagique par RT-PCR, ce vecteur a été séquence et nommé pCI-adipophiline. Une transfection des THP-1 différenciées en macrophages par le PMA a été ensuite réalisée. L'efficacité de la transfection a été étudiée en réalisant des co-transfections avec un plasmide rapporteur pEGFP-C3 permettant de visualiser la protéine autofluorescente GFP (" green fluorescent protein "). Design des ARNSsi : des cibles sur l'ARNm Chaque séquence de dinucléotides AA sont scannées tout le long de l'ARNm de l'adipophiline (régions codantes et non codantes). Les 19 nucléotides suivants, adjacents à ces deux nucléotides AA, sont sélectionnés comme cibles potentielles. Plus d'une centaine de séquences ont été sélectionnées, puis comparées (notamment à l'aide de www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) avec les banques du génome humain. Toutes les séquences cibles, sélectionnées sur l'ARNm de l'adipophiline, ayant une homologie importante avec d'autres séquences codantes ou un pourcentage de nucléotides GC non compris entre 35 et 60% ont été éliminées. Après cette étape de sélection, quatre séquences de 21 nucléotides (voir la description des séquences) ont été retenues pour la production de siRNA afin d'inhiber l'expression de l'adipophiline. Production in vitro de ARNsi Les siRNA sont produits avec le kit SilencerTM siRNA Construction Kit (Ambion) selon les instructions du fournisseur. Extraction des protéines et analyse par Western Blot Les protéines totales sont extraites à partir de cellules cultivées dans des boîtes de 35 mm. Les cellules sont lavées trois fois au PBS (tampon phosphate salin), lysées (Triton X100 1%, Deoxycholate 0,5%, 10 mM Na pyruvate phosphate, 2 mM Na vanadate, NaF 100 mM, Aprotinine, PMSF 0,5 mM, inhibiteur ICN, PBS) puis centrifugées 30 min à 10000 g, 4 C. La concentration en protéines est déterminée par la méthode de Peterson (Peterson GA, 1977). Les échantillons (20 g de protéines) sont séparés par SDS-PAGE (10% d'acrylamide) selon la méthode de Laemmli (Laemmli UK, 1970), en utilisant le système Cuve Mini Protean 3 (Bio-Rad). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert (10 mA/cm2) (Amersham). Les membranes sont saturées dans du tampon de base (10 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% Tween 20) contenant 5% de lait pendant 1 h à température ambiante. Elles sont incubées avec un premier anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, lavées à nouveau par du tampon de base puis incubées avec un second anticorps dirigé contre le premier anticorps. Après lavage, les protéines d'intérêt sont révélées par chimioluminescence (ECL, Amersham), puis quantifiées par analyse densitométrique. L'expression de la protéine p-actine étant constante dans nos conditions expérimentales, les inventeurs ont utilisé cette protéine pour normaliser les différences entre chaque échantillon. Extraction des ARN , analyse par Northern Blot et RT-PCR Les ARN totaux ont été extraits en suivant les indications des kits RNeasy Mini ou Midi (Qiagen). Les échantillons d'ARN (15 pg/puits) ont migré 3 h à 100 V à travers un gel de formaldéhyde-agarose 1% puis ont été transférés sur une membrane de nylon (Pall Gelman Sciences). Les sondes d'ADN ont été marquées au [a-32P]dCTP (3000 Ci/mmol, EASYTIDESTM , PerkinElmer Life Sciences) en utilisant le kit de marquage random-priming DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim). La préhybridation, l'hybridation et les lavages ont été réalisés suivant les conditions décrites précédemment (Tontonoz P, 1994a). Les membranes séchées ont ensuite été exposées sur des films autoradiographiques (Kodak Biomax) à -80 C, le signal étant quantifié par analyse densitométrique. L'expression du gène de la GAPDH étant constante dans ces conditions expérimentales, les inventeurs l'ont utilisée pour normaliser les différences entre chaque échantillon. Préparation des lipoprotéines L'isolement des LDL (densité 1,03-1,063) a été réalisé à partir de plasmas humains par ultracentrifugation séquentielle comme décrit précédemment (Havel RJ, 1955). Les LDL isolées ont été stérilisées par filtration sur membrane (0,22 m) et conservées à 4 C dans du tampon phosphate salin contenant 10 mM d'éthylènediaminetetraacétate disodium dihydrate (PBS-EDTA). Modification des LDL Les LDL ont été modifiées chimiquement au niveau des protéines par l'anhydride acétique. Ce composé réagit sur les résidus lysines pour former une liaison amide. L'acétylation augmente la charge des LDL. Les LDL acétylées ont été dialysées pendant 24 heures en changeant le milieu régulièrement contre du PBSEDTA. Elles ont ensuite été filtrées sur membrane (0,22 m). La concentration protéique a été déterminée par la méthode de Peterson (Peterson GA, 1977). Les LDLac ont été marquées au 3H en incubant 33,3 Ci (par mg de protéines LDLac) de cholestérol libre tritié (1a, 2a (n)-[3H] cholestérol, Amersham) en présence d'éthanol, pendant 24 h à 37 C. Mesure de triglycérides, du cholestérol cellulaire et du contenu en protéines Les quantités de cholestérol total et libre ont été mesurées suivant les conditions du kit FC-test (Wako Pure Chemicals). La quantité de cholestérol estérifié a été déterminée par le calcul de la différence entre le cholestérol total et le cholestérol libre. La quantité de triglycérides a été mesurée suivant les conditions du kit Triglycérides enzymatique PAP 1000 (Biomérieux). La concentration en protéines extraites des cellules a été déterminée par la méthode de Lowry (Lowry OH, 1951). Efflux de cholestérol Les macrophages THP-1, transfectés par le plasmide d'intérêt, ont été chargés en lipides par incubation pendant 48 h avec 100 g/ml de LDLac-cholestérol libre-[3H] dans du milieu de base contenant 10% de sérum de veau foetal. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS puis incubées pendant 24 h dans du milieu de base contenant 2 mg/ml de BSA. L'efflux de cholestérol (ou lipides) des cellules vers le milieu de culture a été réalisé dans du milieu de base sur une période de 24 h, en prélevant 120 l d'échantillon (milieu d'efflux) à 0, 2, 4, 8,12 et 24 h. Les échantillons ont été centrifugés et 100 l de ces différents surnageants ont été comptés dans du liquide de scintillation (compteur (3 Wallac 1410). RESULTATS L'approche consiste soit à surexprimer l'adipophiline ou au contraire à l'inhiber. La surexpression est obtenue dans un premier temps à partir d'un vecteur d'expression puis grâce à un vecteur adénoviral au niveau de macrophages en culture. Ce travail permet d'évaluer l'impact de la surexpression de l'adipophiline à la fois sur la charge lipidique et sur l'efflux de cholestérol. Il a été choisi de cloner l'ADNc de l'adipophiline humaine dans le vecteur d'expression pCI (Promega) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire CMV. Après amplification de la séquence codante à partir d'ARNm macrophagique par RT-PCR, ce vecteur a été séquence et nommé pCI-adipophiline. Une transfection des THP-1 différenciées en macrophages par le PMA a été réalisée. L'étude de l'expression du vecteur dans ces cellules est représentée à la figure 2. Il a ensuite été évalué l'impact de cette surexpression de l'adipophiline sur la charge lipidique en dosant le cholestérol et les triglycérides (figure 3). Les résultats du dosage montrent une augmentation de 76% pour les triglycérides et de 45% pour le cholestérol total dans les cellules transfectées surexprimant l'adipophiline par rapport aux cellules transfectées par le vecteur pCI vide. L'accumulation du cholestérol intracellulaire se traduit par une augmentation du cholestérol estérifié et du cholestérol libre. Il a également été étudié l'effet de la surexpression de l'adipophiline sur l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-1 au niveau des macrophages en culture (figure 4). L'ApoA-1 a été utilisée comme accepteur de cholestérol et il a été suivi l'efflux pendant 24 h, en réalisant des prélèvements aux temps 2,4, 8,12 et 24h. A également été mesuré le cholestérol tritié présent dans cellules au temps to. Les résultats ont été comparés avec ceux obtenus avec des macrophages THP-1 ayant subi les mêmes traitements mais incubés dans du milieu sans ApoA-1 (témoin RPMI). Après incubation des cellules chargées en lipides, on observe une diminution significative de l'efflux dans les cellules transfectées avec le vecteur exprimant l'adipophiline en comparaison aux cellules témoins (pCI). L'efflux de cholestérol est en effet réduit de 47% après 24 h d'incubation avec l'apoA-1 (figure 4) confirmant le rôle de l'adipophiline dans le stockage et la rétention des lipides. Les résultats de l'analyse par Western Blot de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline par le ARNsi3-adipophiline (transfection des macrophages THP-1 avec le jetSI) en présence ou absence de LDL acétylées sont donnés à la figure 5. REFERENCES 1. Babiker, A., et al., Elimination of cholesterol in macrophages and endothelial cells by the sterol 27-hydroxylase mechanism. Comparison with high density lipoprotein-mediated reverse cholesterol transport. J Biol Chem, 1997.272(42): p. 26253-61. 2. Brasaemle, D.L., et al., Adipose differentiation-related protein is an ubiquitously expressed lipid storage droplet-associated protein. J Lipid Res, 1997. 38(11): p. 2249- 63. 3. Brasaemle, D. 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Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler l'efflux de cholestérol comprenant la détermination in vitro ou ex vivo de la capacité des substances testées à moduler l'activité de l'adipophiline. 2. Méthode selon la revendication 1, comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, d'un composé test avec l'adipophiline. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline est réalisée par la mise en évidence d'une modulation du flux de cholestérol à travers une cellule ou préparation membranaire exprimant ladite adipophiline. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline comprend la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la liaison du composé test est mise en évidence par migration sur gel, électrophorèse, FRET, SPA ou par détermination du déplacement d'un ligand marqué par le composé test. 7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline est réalisée en présence d'un ligand marqué de l'adipophiline par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué. 8. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline comprend la mise en évidence d'une modulation d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de l'adipophiline. 9. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure du flux dudit cholestérol à travers lesdites cellule ou préparation membranaire et la comparaison du flux mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test. 10. Procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline, en particulier à moduler l'expression de l'adipophiline, in vitro ou ex vivo, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. 11. Procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline, - la détermination du flux de cholestérol à travers ladite cellule ou la dite membrane cellulaire, la modulation dudit flux indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci. 12. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. 13. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulani le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline, - la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'effet du composé est la faculté dudit composé à moduler l'activité de l'adipophiline. 15. Utilisation d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline pour la préparation d'un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et/ou la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le composé diminue l'activité de l'adipophiline pour augmenter l'efflux de cholestérol et/ou diminuer la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que le médicament est destiné à traiter l'athérosclérose. 18. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que le composé modulant l'activité de l'adipophiline est un ARNi choisi parmi les double-brins d'ARNs de séquences suivantes : - ARNsi1-adipophiline : Matrice antisens : 5'- AATGGCATCCGTTGCAGTTGACCTGTCTC -3' (SEQ ID 5) Matrice sens : 5'- AATCAACTGCAACGGATGCCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 6) - ARNsi2-adipophiline Matrice antisens : 5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 7) Matrice sens : 5'- AATGCAATTTGCGGCTCTAGCCCTGTCTC -3' (SEQ ID 8) - ARNsi3-adipophiline Matrice antisens : 5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 9) Matrice sens : 5'- AATGAGTCAGGTTGCGGGCAACCTGTCTC -3' (SEQ ID 10) - ARNsi4-adipophiline Matrice antisens : 5'- AAAAGGCGTCTTCACTGCTTTCCTGTCTC -3' (SEQ ID 11) Matrice sens : 5'- AAAAAGCAGTGAAGACGCCTTCCTGTCTC -3' (SEQ ID 12)