Brevet FR2847588A1 — publié le 20040528

METHODE D'EXPRESSION INDUCTIBLE D'ARNi DANS DES CELLULES, LES MOLECULES D'ACIDE NUCLEIQUE POUR SA MISE EN OEUVRE ET LES CELLULES TRANSFORMEES PAR CES MOLECULES. L'invention concerne le domaine de la biologie et plus particulièrement la préparation d'oligonucléotides double brin pour être utilisés dans un processus d'interférence ARN (RNAi ou ARNi). L'interférence ARN désigné aussi " SiRNA" ou duplex d'oligonucléotides de 20 à 22 nucléotides. L'interférence ARN a maintenant été appliquée aux mammifères pour inhiber spécifiquement des gènes pour des applications en génétique fonctionnelle. En effet, les siRNAs permettent d'identifier la fonction des gènes mis en évidence par le séquençage du génome humain, soit dans des modèles de culture cellulaire, soit dans des modèles animaux en particulier chez la souris. L'interférence ARN est aussi utile dans le domaine thérapeutique pour le traitement ou la prévention de cancers, de maladies infectieuses et plus généralement de maladies mettant en jeu un gène hétérologue ou homologue muté (Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interférence in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498; Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001b). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J 20, 6877-6888). Les siRNAs sont de courtes séquences d'ARN double brin, qui peuvent être introduites sous forme d'oligonucléotide synthétique ou sous forme de plasmide permettant leur transcription. La mise en oeuvre de plasmides présente de nombreux avantages, en particulier pour les applications de génétique fonctionnelle. Elle permet d'exprimer l'ARN double brin de manière stable dans les cellules, et donc d'inhiber plus facilement des protéines à longue demi-vie. En effet, les siRNA synthétiques ont une durée de demi-vie de 3 jours dans les cellules de mammifère. Elle permet aussi d'analyser des effets à long terme. Par contre, elle nécessite d'établir des lignées exprimant la construction de manière stable, ce qui présente plusieurs inconvénients. En particulier, il faut comparer des lignées stables entre elles, ce qui est en général difficile d'interprétation parce que les lignées cellulaires dérivent. D'autre part, il est impossible d'étudier les protéines indispensables pour la cellule, puisque leur inhibition bloquera la prolifération des cellules et empêchera donc l'établissement de la lignée stable. Il est donc indispensable de pouvoir induire à volonté l'expression du siRNA. L'invention vise précisément à palier ces inconvénients en offrant un système d'expression d'un siRNA de manière stable et inductible. Ce but est atteint grâce à l'emploi du système CRE-lox pour l'expression d'un siRNA dans des cellules de mammifères. L'invention a donc pour objet une méthode d'expression d'ARNi dans des cellules comprenant: - l'introduction dans des cellules eucaryotes d'une molécule d'acide nucléique comprenant les séquences sens et antisens de l'ARNi placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription unique, lesdites séquences sens et antisens étant séparées par une séquence d'ADN comprenant une séquence d'arrêt de ladite transcription, ladite séquence d'ADN étant encadrée à chacune de ses extrémités par un site lox, - la mise en contact des sites lox avec Cre, pour obtenir par recombinaison site-spécifique l'élimination de la séquence d'ADN et de la séquence d'arrêt de la transcription de façon à ce que lesdites séquences sens et antisens ne soient plus séparées que par la séquence lox restante et ainsi permettre la transcription de l'ARNi dans son intégralité avec la séquence lox résiduelle comme boucle. Selon une forme particulière de mise en oeuvre de la méthode de l'invention, ladite molécule d'acide nucléique comprend de 5' vers 3', comme montré à la figure 1, un promoteur de transcription compatible avec lesdites cellules, la séquence sens de l'ARNi, un premier site lox, une séquence d'ADN comprenant un terminateur de transcription, le second site lox et la séquence antisens de l'ARNi. Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est un plasmide. Il peut aussi s'agir d'un rétrovirus. Les cellules transfectées avec cette molécule d'acide nucléique sont des cellules de mammifères. La méthode s'applique aussi bien à la transfection de cellules en culture que directement chez l'animal. En effet, l'invention permet d'analyser de manière fiable les gènes humains d'un point de vue fonctionnel, dans des cellules en culture ou dans des animaux, en particulier dans des souris. En effet, il existe des systèmes permettant l'expression inductible de CRE, dans les cellules et dans les animaux. Chez la souris, la CRE peut également être exprimée de manière tissu spécifique, permettant l'inactivation d'un gène spécifiquement dans ces tissus. La CRE peut être mise en contact avec les sites lox via la transfection des cellules avec une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence régulatrice et le gène cre. La séquence d'ADN séparant les séquences sens et antisens de l'ARNi et comprenant le terminateur de transcription est avantageusement un gène de résistance à un antibiotique, comme la néomycine, permettant ainsi en outre de sélectionner les cellules transfectées. L'invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique décrite ci-dessus pour la mise en oeuvre de la méthode d'expression inductible d'ARNi dans des cellules. L'invention se rapporte encore à une cellule ou une lignée de cellules transfectées par une molécule d'acide nucléique décrite précédemment et les animaux dont des cellules ont été transfectées par ladite molécule d'acide nucléique. L'invention a enfin pour objet des compositions notamment pharmaceutiques comprenant comme substance active au moins une molécule d'acide nucléique ci-dessus ou des cellules transformées par celle-ci éventuellement associées dans la composition à un excipient compatible. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels: La figure 1 représente la stratégie pour l'expression de siRNAs de manière inductible selon l'invention. La figure 2 représente l'induction de l'activité de l'ARNi par la CRE. La figure 3 représente l'inhibition du marqueur GFP par l'ARNi. Le plasmide plox siRNA comporte un promoteur Pol II contrôlant un gène de résistance à un antibiotique, la néomycine. La cassette néomycine est entourée de sites lox. Dans un premier temps, un promoteur Pol III (Hi) a été inséré dans le sens opposé au promoteur Pol II. Le promoteur Hi introduit dans le plasmide derrière la deuxième région loxp, avec les enzymes de restriction Nhel et Xbal est obtenu par PCR à partir des amorces suivantes: ' CTAGCTAGCCCATGGAATTCGAACGCTGACGTC 3' Forward (SEQ ID NO. 1) ' GCTCTAGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC 3' Reverse (SEQ ID NO. 2) Ce plasmide est inspiré du plasmide pSUPER, permettant l'expression constitutive de siRNA et décrit par Brummelkamp et al. Les séquences d'ADN correspondant au SiRNA sens ont ensuite été introduites immédiatement après le promoteur Hi au niveau du site Xbal. SiRNA sens: ' CTAGACCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATT 3' (SEQ ID NO. 3) SiRNA sens complémentaire: ' CTAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCGGT 3' (SEQ ID NO. 4) Enfin, les séquences d'ADN correspondant au siRNA anti-sens ont été introduites à la suite de la deuxième région loxp au niveau des sites Bamhl et Kpnl. SiRNA anti-sens: 'GATCCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTTTGGAAAGGTAC 3' (SEQ ID NO. 5) SiRNA anti-sens complémentaire: 5'CTTTCCAAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATG 3' (SEQ ID NO. 6) Le psiRNA lox est obtenu en insérant la totalité de la séquence ADN du siRNA directement après le promoteur Hl au niveau du site Xbal. Les siRNA sens et anti-sens sont séparés par une boucle. SiRNA: 'CTAGTTTCCAAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCTCTTGAAATGAACT TCAGGGTCAGCTTGCGGGT 3' (SEQ ID NO. 7) SiRNA complémentaire: 5'CTAGACCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTCAAGAGAATGAACTTCAGGGT CAGCTTGCTTTTTTGGAAA 3' (SEQ ID NO. 8) Des cellules de mammifères COS-7 ont été transfectées avec du polyfect (Qiagen) avec 4 pg de vecteurs d'expression des siRNA (plox siRNA, psiRNAlox or plox) comme indiqué et un vecteur exprimant la CRE recombinase ou le vecteur vide correspondant (8 pg) ainsi qu'un vecteur d'expression de la Green Fluorescent Protein ou GFP (500 ng). Soixante heures après la transfection, un western blot a été réalisé à partir des extraits totaux en utilisant un anticorps dirigé contre la GFP (Santa cruz) ou la tubuline cellulaire (Sigma) afin d'évaluer la quantité de protéines utilisée pour ce test. En absence de CRE, les deux parties constituantes du siRNA (brin sens et antisens) sont séparées par le gène néomycine qui comporte une séquence d'arrêt de transcription pour la Pol III. Dans ces conditions, seul le brin sens du siRNA est transcrit et le siRNA est inactif: la protéine cible est exprimée normalement comme montré à la Figure 2, 3ème et 4ème ligne. En présence de CRE, le plasmide subit dans la cellule un processus de recombinaison, donnant un produit dans lequel la séquence néomycine est éliminée, et dans lequel les deux 1/2 siRNAs ne sont plus séparés que par la séquence lox restante, dans laquelle il n'y a pas de séquence d'arrêt de transcription pour la Pol III. Le siRNA est donc transcrit dans son intégralité, avec la séquence lox résiduelle qui sert de " boucle ". Ce siRNA est actif et la protéine cible est inhibée (comparer les lignes 1 ou 2 avec les lignes 3 ou 4). L'inhibition est bien liée à l'activité du siRNA, puisque en présence de CRE, l'inhibition n'est observée qu'en présence du siRNA complet, et pas en présence du vecteur d'expression du siRNA vide (ligne 1). Son activité est équivalente à celle d'un siRNA servant de contrôle positif, exprimé de manière constitutive (parce que l'intégralité de la séquence à partir de laquelle il est transcrit est placée avant le gène néomycine). D'autre part, l'analyse par Northern montre le processing du précurseur et la synthèse du siRNA induite par la CRE (Figure 3). L'ARN total des cellules COS-7 a été extrait après 60h de transfection puis analysé par northern blot avec une sonde marquée au 32P dirigée contre le brin antisens des siRNAs produits: ' CTTTCCAAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATG 3' (SEQ ID NO. 9) La figure 3 montre que l'inhibition est bien liée à l'expression du siRNA, induite par la CRE. REVENDICATIONS 1) Méthode d'expression d'ARNi dans des cellules comprenant: l'introduction dans des cellules eucaryotes d'une molécule d'acide nucléique comprenant les séquences sens et antisens de l'ARNi placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription unique, lesdites séquences sens et antisens étant séparées par une séquence d'ADN comprenant une séquence d'arrêt de ladite transcription, ladite séquence d'ADN étant encadrée à chacune de ses extrémités par un site lox, - la mise en contact des sites lox avec Cre, pour obtenir par recombinaison site-spécifique l'élimination de la séquence d'ADN et de la séquence d'arrêt de la transcription de façon à ce que lesdites séquences sens et antisens ne soient plus séparées que par la séquence lox restante et ainsi permettre la transcription de l'ARNi dans son intégralité avec la séquence lox résiduelle comme boucle. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dite molécule d'acide nucléique comprend de 5' en 3', un promoteur de transcription compatible avec lesdites cellules, la séquence sens de l'ARNi, un premier site lox, une séquence d'ADN comprenant un terminateur de transcription, le second site lox et la séquence antisens de l'ARNi. 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite molécule d'acide nucléique est un plasmide. 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les cellules transfectées sont des cellules de mammifères. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence d'ADN séparant les séquences sens et antisens de 1'ARNi et comprenant le terminateur de transcription est avantageusement un gène de résistance à un antibiotique, comme la néomycine. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules sont également transfectées avec une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence régulatrice et le gène cre. 7) Une molécule d'acide nucléique comme définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8) Une cellules ou une lignée de cellules transfectées par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 7. 9) Composition notamment pharmaceutique comprenant comme substance active au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou une cellule ou lignée de cellules selon la revendication 8, éventuellement associée dans la composition à un excipient compatible.