Brevet FR2854803A1 — publié le 20041119

i La présente invention est relative au domaine des vaccins, et notamment au domaine des compositions vaccinales comprenant un adjuvant. Plus particulièrement, la présente invention concerne un vaccin dans lequel l'adjuvant comprend du phosphate de fer. On connaît dans l'art antérieur des compositions vaccinales comprenant des adjuvants destinés à accroître ou à modifier qualitativement la réponse immunitaire induite lors de 1' administration d'un antigène. En effet, les développements réalisés dans l'industrie du vaccin, conduisent à utiliser des antigènes obtenus à partir de virus ou de bactéries, mais 10 avec des procédés de purification de plus en plus élaborés, ainsi que des antigènes issus de la biotechnologie. Ces antigènes présentent l'avantage d'être généralement plus purs que certains des antigènes utilisés dans le passé, mais en contrepartie, ils sont souvent moins immunogènes et nécessitent donc l'utilisation d'un adjuvant. De nombreux adjuvants ont déjà été décrits saponines, émulsions, lipides 15 cationiques...etc. Cependant, à ce jour, les seuls adjuvants couramment utilisés dans les produits commercialisés sont les adjuvants à base d'aluminium. Or, il serait souhaitable de pouvoir disposer d'autres adjuvants. Parmi l'art antérieur relatif aux adjuvants, on peut citer notamment le brevet US5895653 20 qui décrit à titre d'adjuvant des composés d'hydroxyde de fer sous forme de solution colloidale dont le pouvoir adsorbant serait amélioré par rapport aux hydroxydes de fer précédemment décrits sous forme de gel. Cependant, de tels adjuvants, s'ils présentent une alternative aux adjuvants à base d'aluminium actuellement utilisés, ne peuvent pas toujours les remplacer efficacement, et il 25 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'autres composés, dont les caractéristiques sont telles qu'ils présentent à la fois une bonne tolérance vis-à-vis des organismes auxquels ils sont administrés, qu'ils peuvent être produits dans des conditions compatibles avec les contraintes de l'industrie pharmaceutique, et surtout qu'ils permettent d'accroître ou de modifier la réponse immunitaire aux antigènes vaccinaux de façon au moins aussi efficace 30 que les composés à base d'aluminium actuellement utilisés. Dans ce but, la présente invention a pour objet une composition Vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et au moins un adjuvant, caractérisée en ce que l'adjuvant comprend du phosphate de fer. Selon une caractéristique particulière, le phosphate de fer est présent sous forme d'une suspension de particules dont la taille est comprise entre 0,01gm et 300.tm, et plus particulièrement entre 1 et 40 prm, avec en particulier une grande proportion des particules dont la taille est d'environ 7 pm. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le phosphate de fer est préparé à partir d'une solution de sel de fer et de sel de phosphate. Une telle préparation permet d'obtenir un produit blanchâtre non cristallin assurant toutes les conditions de sécurité nécessaires pour une administration à des être humains, généralement en bonne santé. De nombreux avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre en référence aux figures qui illustrent des résultats obtenus lors des tests décrits à l'exemple 3; la figure 1 représente les résultats en IgG1 après une 1ère immunisation alors que la figure 2 représente les résultats obtenus après la 2nde immunisation; la figure 3 représente les résultats en IgG2a obtenus après la lère immunisation alors que la figure 4 15 représente les résultats obtenus après la 2nde immunisation. Par composition vaccinale au sens de la présente invention, on entend une composition susceptible d'être administrée à l'homme ou à l'animal afin d'induire une réponse du système immunitaire; cette réponse du système immunitaire pouvant se traduire par une production d'anticorps ou simplement, par une activation de certaines cellules, notamment 20 les cellules présentatrices d'antigènes, les lymphocytes T, les lymphocytes B. La composition vaccinale peut être une composition à visée prophylactique ou à visée thérapeutique, ou encore les deux. Par antigène au sens de la présente invention, on entend tout antigène susceptible d'être utilisé dans un vaccin, qu'il s'agisse de germe entier ou de sous-unité et quelle que soit sa 25 nature: peptide, protéine, glycoprotéine, polysaccharide, glycolipide, lipopeptide...etc. Il peut s'agir d'antigènes viraux, bactériens ou autres; le terme antigène comprend également les polynucléotides dont les séquences sont choisies pour coder les antigènes que l'on souhaite voir exprimés par les individus auxquels sont administrés les polynucléotides, dans le cas de la technique d'immunisation que l'on appelle immunisation ADN. Il peut également s'agir d'un ensemble d'antigènes, notamment dans le cas d'une composition vaccinale multivalente qui comprend des antigènes susceptibles de protéger contre plusieurs maladies et que l'on appelle alors généralement une combinaison vaccinale, ou dans le cas d'une composition qui comprend plusieurs antigènes différents pour protéger contre une seule maladie, ainsi que cela est le cas pour certains vaccins contre la coqueluche ou la grippe par exemple. De particulièrement bons résultats ont notamment été obtenus avec une composition vaccinale comprenant des antigènes contre la diphtérie, le tétanos et la poliomyélite. Aux fins de la présente invention, le phosphate de fer est un composé minéral inerte à base de phosphate de fer amorphe, cristallin ou pseudocristallin. Des essais très satisfaisants ont été obtenus avec un phosphate de fer amorphe. Un tel composé est préparé à partir d'une solution de sel de fer et de sel de phosphate. Comme sel de fer, on peut notamment utiliser le citrate de fer ou de façon particulièrement avantageuse le chlorure de fer. Comme sel de phosphate, on peut notamment utiliser le phosphate de sodium. La préparation du phosphate de fer peut se faire par mélange simultané ou successif des deux composants de départ. L'ordre du mélange peut être soit ajout de chlorure de fer dans 15 du phosphate de sodium ou à l'inverse, ajout de phosphate de sodium dans du chlorure de fer. La vitesse d'ajout peut être très rapide ou au contraire au goutte à goutte. Pour l'obtention d'un phosphate de fer convenant aux besoins de l'invention, un rapport de 2 fois plus de sel de fer que de sel de phosphate a été noté comme satisfaisant. De façon alternative, on peut préparer le phosphate de fer à l'aide d'un nébuliseur. Dans ce 20 cas, on peut nébuliser le phosphate de sodium dans une solution de chlorure de fer ou inversement le chlorure de fer dans le phosphate de sodium. Lors de la préparation des compositions vaccinales selon l'invention, le phosphate de fer peut être introduit dans la composition vaccinale au tout début de la formulation. Le phosphate de fer est alors dilué à une certaine concentration, puis les antigènes d'intérêt y sont ajoutés. Alternativement, il est possible d'ajouter le phosphate de fer à un. lyophilisat comprenant déjà la portion de la composition vaccinale qui contient les antigènes d'intérêt. Selon l'invention, le phosphate de fer est présent dans la composition vaccinale, en quantité suffisante pour exercer une action adjuvante. Dans le cas o il est le seul adjuvant utilisé, la dose de composition vaccinale administrée peut comprendre entre 0.2 et 1.4 mg de phosphate de fer. Dans le cas o il est associé à un autre adjuvant, les quantités présentes peuvent être réduites, en fonction de l'effet adjuvant recherché et de la puissance des autres adjuvants présents. Des essais de toxicité locale et systémique sur lapins ont montré que le phosphate de fer était aussi bien toléré que l'hydroxyde d'aluminium. Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation particuliers de la présente invention. Exemple 1: Préparation de phosphate de fer et d'hydroxyde de fer. Le phosphate de fer est préparé par mélange de FeCl3, 6H20 à 0.5 M ( fourni par SIGMA sous la référence de lot 55H 1251) dans une solution de Na2HPO4, 2H2O à 0.25 M (fourni 15 par Merck sous la référence de lot FA004911). Les 2 produits sont mélangés dans les proportions suivantes: à une solution de 800ml d' H20 ultrafiltrée comprenant 108,12g de FeCl3, 6H20, on associe 11 d'eau ultrafiltrée comprenant 44.5 g de Na2HPO4, 2H20. Le mélange est effectué à température ambiante. On agite pendant 15 minutes au moyen d'un agitateur-tige puis on effectue des centrifugations successives avec lavage du précipité par de l'eau. Après chaque lavage, on détecte la présence d'ions chlorures grâce à un dosage des ions chlorure au nitrate d'argent. Lorsqu'il n'y a plus d'ions chlorure, c'est -à-dire après 10 lavages, le précipité est repris en eau et autoclavé lh à 118 C afin d'assurer sa stérilité. La solution obtenue de cette façon est une solution de phosphate de fer contenant 16 g Fe/l. 25 On prépare de l'hydroxyde de fer par mélange à température ambiante de citrate de fer 0.5 M et de NaOH 2M. A 100ml de citrate de fer on ajoute goutte à goutte de la NaOH jusqu'à obtention d'un pH de 8. De la même façon que pour la préparation du phosphate de fer, on agite pendant 15 minutes puis on effectue des centrifugations successives avec lavage à 30 l'eau du précipité, et dosage des ions chlorures au nitrate d'argent. Lorsqu'on ne détecte plus d'ions chlorure, le précipité est repris en eau et autoclavé lh à 118 C pour être stérile. La solution alors obtenue est une solution d'hydroxyde de fer à 6,3 g Fe/l. Exemple 2: Préparation des compositions vaccinales A partir des solutions préparées comme indiqué ci-dessus, d'une suspension aqueuse d'hydroxyde d'aluminium ( fourni par Reheis) comprenant 10,8 g d'Al/l, ainsi que d'une préparation de PTP( Protéine Tétanique Purifiée) à une concentration de 330 unités floculantes ou Lf /ml (soit une concentration en protéines de 0,9125g/1), on effectue les compositions suivantes: * PTP seul: 840 pl H20 + 120,ul NaCl 9% + 240 PTP à 100 Lf/ml, * PTP et A1OOH: 618 pl H20 + 222 pi A1OOH à 10.8 g d'Al/l + 120p1 NaCl à 9% + 10 240 PTP à 100 Lf/ml, * PTP et FePO4: 690 pl H20 + 150 gl FePO4 à 16 g/l + 120p1 d'une solution tampon PBS concentrée 10 fois ( soit 95 mM Na2HPO4.2H20)+ 240 PTP à 100 Lf/ml, * PTP et FeOOH: 458 pi H20 + 382 pl FeOOH à 6.3 g de Fe/l + 120pl d'une solution tampon PBS concentrée 10 fois + 240 PTP à 100 Lf/ml 15 Exemple 3: Dosage des anticorps antitétaniques. On dispose de 11 groupes de 6 souris OF1 femelles âgées de 6 semaines. On administre à chaque groupe de souris, l'une des formulations préparées à l'exemple 2. L'administration est réalisée par voie intra-musculaire dans les quadriceps sous anesthésie, 20 à raison de 2 injections de 50 pl aux jours J1 et J22. La quantité administrée est donc de 2 unités floculantes ou Lf de PTP et de 0,2 mg de minéral ( soit de l'aluminium, soit du fer) dans le cas des formulations comprenant un adjuvant. A J1 5, on effectue sur chaque souris une prise de sang d'environ 300pl au sinus rétroorbitaire. A J36, les souris sont exsanguinées sous anesthésie, par section de la carotide. Sur chacun des sérums correspondants aux sangs recueillis, on dose par la méthode ELISA les IgG1 et les IgG2a spécifiques de la PTP. Les résultats obtenus sont indiqués aux figures 1 à 4 et montrent que le phosphate de fer est un bon adjuvant; en ce qui concerne les IgG1, les résultats obtenus sont nettement 30 supérieurs à ceux obtenus lorsque l'antigène est administré seul même s'ils sont légèrement inférieurs à ceux obtenus avec l'hydroxyde d'aluminium; en ce qui concerne les IgG2a, les taux obtenus sont aussi élevés que ceux obtenus avec l'hydroxyde d'aluminium. Exemple 4: Vérification de l'activité antitétanique. On vérifie l'activité antitétanique des compositions selon l'invention grâce à un test consistant à évaluer, chez la souris, l'activité de ces compositions vis à vis d'une dose létale de toxine administrée par voie sous-cutanée. L'activité des compositions testées est déterminée en comparant la dose nécessaire pour protéger 50% des animaux (DE50so) des effets de la toxine à celle d'un vaccin de référence étalonné en UI/ml. Les formulations testées sont obtenues par mélange de l'adjuvant (0.6 mg/dose) avec de l'eau, 30 Lf d'ADP (anatoxine diphtérique) et 10 Lf d'ATP (anatoxine tétanique), puis ajout de 20 pig/dose de merthiolate et une solution saline ( solution à 90 g/l NaCl et 5 mM Na2HPO4.2H20). Les compositions vaccinales testées comprennent soit de l'hydroxyde d'aluminium, soit du phosphate de fer, soit de l'hydroxyde de fer. Les résultats obtenus avec chacun des adjuvants testés, sont repris dans le tableau ci-après, et montrent que le phosphate de fer est un bon adjuvant, bien meilleur que l'hydroxyde de fer dans les mêmes conditions adjuvants Activité tétanique (UI/dose) AlOOH 103 (76-139) FePO4 32 (24-43) FeOOH 8.2 (5.4-12.5) REVENDICATIONS 1. Composition vaccinale comprenant au moins un antigène vaccinal et au moins un adjuvant, caractérisée en ce que l'adjuvant comprend du phosphate de fer. 2. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le phosphate de fer est présent sous forme d'une suspension de particules dont la taille est comprise entre 0,01 ptm et 300 gm. 3. Composition vaccinale selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la taille des particules est comprise entre 1 et 40 gm. 4. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que 15 la taille des particules est centrée autour de la valeur de 7im. 5. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le phosphate de fer est préparé à partir d'une solution de sel de fer et de sel de phosphate. 6. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'antigène du tétanos. 7. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins l'antigène de la diphtérie. 25 8. Composition vaccinale selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène de la poliomyélite.