Brevet FR2857873A1 — publié le 20050128

La présente invention concerne un procédé et un produit cosmétique destinés à limiter la croissance des tissus adipeux par inhibition de la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. Les adipocytes sont des cellules qui stockent l'énergie sous forme de triglycérides pendant des phases d'excès énergétiques et qui ré-émettent cette énergie en cas de besoin. Pour ce faire, la différenciation de cellules, appelées pré-adipocytes, en adipocytes matures par accumulation à l'intérieur même des cellules de lipides, d'abord sous forme de fines gouttelettes puis, par fusion, sous forme d'une volumineuse vacuole lipidique de triglycérides joue un rôle fondamental. Elle joue également un rôle important dans la croissance, souvent non-souhaitée voire non souhaitable, des tissus adipeux. La différenciation peut être induite par exemple par addition d'acides gras ou d'agents qui accroît le niveau de CAMP (Cyclic Adenosine Monophosphate) intracellulaire, par exemple au moyen d'un inhibiteur de Phosphodiesterase PDE. Elle est régulée par des promoteurs de transcription tels que le promoteur dit C/EBPa ou la protéine SREBP1 (Sterol response element binding protein) qui coordonnent l'expression des gènes impliqués dans la création et le maintien du phénotype des adipocytes, notamment le transporteur de glucose GLUT4 et la stéaroylCoA désaturase 1 SCD1. Pour limiter une expansion des tissus adipeux, il est connu d'utiliser des substances qui peuvent agir sur les adipocytes, soit en stimulant la lipolyse des triglycérides intra-cellulaires et le re-largage extra-cellulaire des acides gras et du glycérol, soit au contraire en inhibant la lipogénèse de nouveaux triglycérides. Des extraits de plantes ayant ce type d'activité ont ainsi pu être utilisés dans la composition de produits cosmétiques et/ou pharmaceutiques destinés à affiner la silhouette. A titre d'exemple, on peut citer le document de brevet FR-A-2 693 917 qui décrit un extrait aqueux de l'algue brune Laminaria digitata lequel a montré in vitro un effet stimulant de la lipolyse des adipocytes isolés d'hypoderme humain. On peut également citer le document de brevet FR-A-2 774 905 qui décrit un extrait lipidique de graines de Garcinia mangostana ayant également une activité de stimulation de la lipolyse. Toujours à titre d'exemple, on peut citer le document de brevet FR-A-2 795 958 qui décrit un extrait lipidique de la micro-algue Odontella aurita (riche en acides gras polyinsaturés) montrant un effet inhibiteur de la néosynthèse des acides gras dans des adipocytes isolés d'hypoderme humain et donc un effet inhibiteur de la lipogénèse ou encore le document de brevet FR-A-2 817 150 qui décrit un extrait lipidique de graines de Polygonumfogopyrum (riche en phytostérols) montrant un effet semblable. Le but de la présente invention est de proposer un nouveau procédé et un nouveau produit cosmétique destinés à limiter la croissance des tissus adipeux par inhibition de la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes matures et, ce, soit par l'utilisation directe de p-endomorphine, soit par l'utilisation de composants stimulant la production de p-endomorphine. Les béta-endorphines sont des peptides composés de 31 acides aminés et initialement connus pour être produits et largués par les cellules nerveuses (neurones). Elles sont donc des neuropeptides. Elles sont produites à partir d'un précurseur de plus grande taille : la pro-opiomélanocortine (dite POMC). Le nom d'endorphine est la contraction d'endomorphine. L'action principale de la (3-endorphine est de diminuer la sensation de douleur qui résulte d'une agression. Elle a donc un rôle dans la lutte contre le stress. Différents types de récepteurs aux (3-endorphines ont été mis en évidence : les récepteurs (sur lesquels la morphine végétale se fixe avec la plus grande affinité) qui modifient la perception de la douleur, les récepteurs 8 (spécifiques des encéphalines) qui se situent dans le système limbique et seraient en relation avec le contrôle des émotions, et les récepteurs s (spécifiques de la (3-endorphine) qui paraissent doués d'un effet de relâchement sur certains muscles. Des travaux récents ont montré que les (3-endorphines sont également produites par d'autres cellules que les neurones, notamment par les cellules de la peau, et plus précisément par les kératinocytes de l'épiderme (voir par exemple l'article intitulé "An immunocytochemical approach to the study of beta-endorphin production in human keratinocytes using confocal microscopy", paru dans Ann. N. Y Acad Sci 1999, Oct 20 885:85-99 aux noms de Zanello SB et al. ), ou par les fibroblastes du derme humain (voir par exemple l'article intitulé "POMC and fibroblast biology" paru dans Ann. N. Y. Acad Sci. 1999 Oct 20 ; 885:262-7 au nom de Lotti T, Teofoli et al.). Le largage de (3-endorphine par les cellules de la peau est stimulé par des stress extérieurs, notamment par les rayonnements ultra-violets de faible intensité (voir à ce sujet l'article intitulé "Condition-dependent présence of ss-lipotropin peptide in human keratinocytes" paru dans Peptides 2000 May,- 21 (5) :691-7 au nom de Wintzen et al.) et serait responsable d'une diminution des douleurs provoquées par ces rayonnements. Or, on a pu montrer que la (3-endorphine avait des effets sur la différenciation des cellules de la peau, particulièrement sur les kératinocytes et les adipocytes. Pour ce faire, on a mené une étude de l'effet d'endorphine sur une lignée de préadipocytes 3T3-L1 induits en adipocytes. L'endorphine utilisée était de la (3-endorphine humaine et son numéro CAS est 61214-51-5. Cette étude a été menée selon un protocole qui est connu et qui est notamment décrit dans le document paru dans Annu. Rev. Biochem., 1995, 64 : 345-373, intitulé "Transcriptional regulation of gene expression during adipocyte differentiation" ayant pour auteurs MacDougald OA et Lane Md. On rappelle ci-dessous brièvement ce protocole. Les cellules pré-adipocytaires de la lignée 3T3-L1 ont été maintenues en culture en milieu de Eagle modifié par Dulbelcco (DMEM) contenant 2 mM de glutamine, 4,5 g/1 de glucose, 0,11 g/1 de pyruvate de sodium, 10 % de sérum de veau (SVD) et des antibiotiques (50 U pénicilline et 50 g de streptomycine par ml de milieu). Leur différenciation en adipocytes a été provoquée de la manière suivante : dans un premier temps, les cellules pré-adipocytaires ont été cultivées à confluence pendant deux jours. Au temps que l'on appelle ci-après J0, le milieu de culture a été remplacé par un milieu d'induction de la différenciation (MID) composé de DMEM contenant 10 % de sérum de veau f#tal (SVF), additionné de 0,25 mM d'un inhibiteur de Phosphodiesterase PDE, en l'occurrence de l'isobutyl methyl xanthine (IBMX), de 0,25 M d'un anti-inflammatoire, en l'occurrence du dexamethasone et de 1,74 M d'insuline. Après deux jours d'incubation, donc au temps J2, le milieu d'induction a été délicatement retiré et remplacé par un nouveau milieu de culture contenant 10 % de SVF et 0,174 M d'insuline. Ensuite, le milieu de culture a été renouvelé tous les deux jours. Après sept jours de culture, c'est-à-dire au temps J7, le contenu lipidique des cellules pré-adipocytaires a été évalué par la coloration à l'huile rouge. Plus précisément, les cellules pré-adipocytaires ont été fixées au formaldéhyde à 3,7 %, puis incubées pendant 10 minutes avec une solution de colorant Red Oil (à 0,5% dans un mélange isopropanol/eau). Après 10 minutes, le tapis cellulaire a été rincé à l'eau et les cellules pré-adipocytaires ont été lysées avec de l'isopropanol pure. La densité optique (DO) du milieu a alors été mesurée à 540 nm. En présence du milieu inducteur de différenciation MID pendant 2 jours comme expliqué ci-dessus, mais en l'absence de p-endorphine, la majeure partie des cellules 3T3-L1 contient une multitude de gouttelettes lipidiques montrant par là que la différenciation a bien été induite. Ces fines gouttelettes lipidiques sont visibles au microscope après 7 jours de culture et coloration à l'huile rouge. L'absorbance observée a alors augmenté de 40 + 11 %. Cette augmentation est statistiquement significative (p On notera que l'on a vérifié au préalable qu'en l'absence du milieu inducteur de différenciation MID, les cellules 3T3-L1 sont en grande majorité des cellules préadipocytaires et qu'en tout état de cause peu sont différenciées spontanément en adipocytes. La [3-endorphine a été testée sur les cellules 3T3-L1 au cours de la phase d'induction par le milieu inducteur MID qui commence donc au jour JO et ce pour des quantités respectivement égales à 1,10 et 100 pg/ml du milieu inducteur. Ainsi, on a pu montrer qu'en présence de (3-endorphine et malgré la présence également du milieu inducteur de différenciation, le nombre et la taille des gouttelettes lipidiques étaient diminués. De même, après 7 jours de culture, coloration à l'huile rouge et lyse des cellules 3T3-L1, l'absorbance était diminuée de respectivement 81 + 19 %, 85 + 23 % et 121 + 7 % (moyennes et écart types de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicate). Cette diminution est statistiquement significative (p On notera qu'un pourcentage supérieur à 100 % indique que le produit à la concentration testé inhibe la différenciation induite par le milieu inducteur de différenciation MID ainsi que la différenciation induite spontanée. En conséquence la présente invention concerne : d'une part, l'utilisation de (3-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de -endorphine dans une composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à limiter l'expansion des tissus adipeux par son effet sur la différenciation adipocytaire. D'autre part, une composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à limiter l'expansion des tissus adipeux par son effet sur la différenciation adipocytaire qui est caractérisée en ce qu'elle comporte de la (3-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de (3-endorphine. REVENDICATIONS 1) Utilisation de P-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de [3-endorphine dans une composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à limiter l'expansion des tissus adipeux par son effet sur la différenciation adipocytaire. 2) Composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à limiter l'expansion des tissus adipeux par son effet sur la différenciation adipocytaire, caractérisée en ce qu'elle comporte de la P-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de (3-endorphine.