Brevet FR2848781A1 — publié le 20040625

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une matière active, et plus particulièrement d'une matière active insecticide, à partir de litières arborescentes décomposées, les matières actives ainsi obtenues et leur utilisation dans la lutte contre les insectes nuisibles. L'un des objectifs majeurs des recherches menées en démoustication réside dans la mise au point de nouveaux larvicides compatibles avec l'environnement et la santé, et présentant une efficacité opérationnelle satisfaisante. Les stratégies insecticides conventionnelles ont subi une évolution (Casida JE, Quistad GB (1998) Golden age of insecticide research : past, present, or future ? An. Rev. Entomol. 43,1-16) où les composés chimiques de synthèse (e. g., organo-phosphorés) sont peu à peu remplacés par des bactério-insecticides (e .g., Bacillus thuringiensis (Feitelson JS, Payne J, Kim L (1992) Bacillus thuringiensis: insects and beyond BioTechnology 10, 271-275.); Bacillus sphaericus (Baumann P, Clark MA, Baumann L, Broadwell AH (1991) Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen: properties of the organism and its toxins Microbiol. Rev. 55,425-436). L'apparition de phénomènes de résistance au sein des populations de moustiques traitées par des insecticides chimiques (Georghiou GP (1994) Principles of insecticide resistance management Phytoprotection 75,51-59) ou des bactério-insecticides (Tabashnik BE (1994) Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis An. Rev. Entomol. 39,47-49) a conduit au développement de nouvelles stratégies basées sur l'utilisation de molécules naturelles. Ainsi, par exemple, les polyphénols, issus du métabolisme secondaire des végétaux, présentent une forte toxicité vis-à-vis d'insectes phytophages (Barbehenn R, Martin MM (1994) Tannin sensitivity in larvae of Malacosoma disstria (Lepidoptera) : roles of the peritrophic envelope and midgut oxidation. J. Chem. Ecol. 20,1985-2001.) et de certaines espèces de moustiques détritivores (Mercer DR, Anderson JR (1994) Tannins in treehole habitats and their effects on Aedes sierrensis (Diptera: Culicidae) production and parasitism by Lambomella clarki (Ciliophora: Tetrahymenidae). J. Medic. Entomol. 31,159-167). Les travaux de David et al. (David JP, Rey D, Marigo G, Meyran JC (2000) Larvicidal effect of a cell-wall fraction isolated from aider decaying leaves J. Chem. Ecol. 26, 901-913) ont permis de mettre en évidence, dans certains gîtes à moustiques de la région Rhône-Alpes, une forte toxicité des litières arborescentes décomposées vis à vis des larves de moustiques qui les consomment. Cette toxicité, mesurable par des bioessais standardisés, a pu être reliée à la présence, dans la matière végétale décomposée, d'un complexe constitué notamment de lignines associées à des formes azotées apparentées à des protéines (Tilquin M et al. (2002) Hot extraction and characterization of a lignin fraction involved in the larvicidal effects of decomposed leaf litter against mosquito J. Chem. Ecol. 28,1497-1510 ; Tilquin M, Meyran JC, Marigo G (2002) Dietary toxicity of decomposed arborescent leaf litter against larval mosquito : involvement of a lignin-polypeptidic complex J. Agric. Food Chem. 50 : 6378-6382). Cependant, l'apparition in natura de la toxicité dans ces litières brutes semblant sous la dépendance de paramètres environnementaux complexes, difficilement contrôlables, la formation de ces complexes toxiques demeure aléatoire. Ainsi, des complexes toxiques ne peuvent être isolés que de litière brute présentant au préalable des propriétés toxiques et dans lesquelles des complexes toxiques se sont donc naturellement formés au cours de la décomposition de la litière. Or, les paramètres permettant l'apparition de ces complexes toxiques insecticides dans les litières brutes en décomposition ne sont pas connus. L'isolement de ces complexes toxiques ou insecticides reste donc difficilement reproductible. Pour remédier à ces inconvénients la présente invention propose un procédé de préparation de matière active, plus particulièrement de matière active insecticide et larvicide, à partir de litière brute en décomposition. Ce procédé selon l'invention est simple et rapide, permettant, à partir de litières arborescentes décomposées brutes, d'isoler une nouvelle matière active utilisable contre de nombreuses espèces d'insectes et plus particulièrement contre les espèces culicidiennes anthropophiles, invasives et vectrices potentielles de maladies (e. g., Aedes, Culex). Avantageusement, dans les procédés selon l'invention, il n'est pas nécessaire d'utiliser comme produit de départ une litière en décomposition ayant des propriétés toxiques ou insecticides. Les procédés de préparation de matière active à partir de litière brute selon l'invention permettent à la fois de maîtriser la formation in vitro des matières actives insecticides ou toxiques et de maîtriser leur isolement de façon reproductible. L'intérêt majeur du procédé est donc de recréer, in vitro, des conditions favorables à l'association des différents éléments constitutifs de la matière active. Le procédé, qui peut être appliqué aussi bien à des litières toxiques qu'à des litières non encore toxiques, collectées à partir d'espèces arborescentes banales, très représentées dans les plaines alluviales des régions tempérées (e.g., aulne, peuplier, chêne, ...), se révèle d'un emploi facile et général. Description de l'invention Ainsi un premier objet de la présente invention consiste donc à proposer un nouveau procédé de préparation d'une matière active, plus particulièrement d'une matière active insecticide et larvicide, à partir de litière arborescente. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matière active comprenant les étapes suivantes : a) on dispose de litière arborescente décomposée brute ; b) on broie ladite litière brute ; c) on extrait la fraction soluble de ladite litière broyée obtenue à l'étape b) ; d) on chauffe ladite fraction obtenue à l'étape c) à une température comprise entre 40 C et 80 C ; e) on précipite, à température ambiante, pendant au moins 24h, la matière active insoluble se formant progressivement dans ladite fraction de l'étape d); f) on isole ladite matière active insoluble précipitée à l'étape e). De préférence, on dispose à l'étape a) de litière arborescente décomposée brute de l'horizon Olv. De préférence, l'étape b) comprend le séchage puis le broyage de ladite litière arborescente décomposée brute. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on extrait la fraction soluble à l'étape c) dans un tampon phosphate 25mM. Avantageusement, à l'étape d) on chauffe la fraction soluble à 70 C. Avantageusement, après le chauffage de la fraction soluble à l'étape d), on élimine les impuretés insolubles apparues au cours dudit chauffage par centrifugation de ladite fraction. Préférentiellement, on précipite la matière active insoluble à l'étape e) pendant 72h. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la matière active insoluble est isolée à l'étape f) par centrifugation. On entend par matière active le constituant d'une préparation ou d'une composition auquel est attribué tout ou partie de son efficacité. Dans la présente invention, la matière active extraite de litière brute en décomposition a des propriétés toxiques et plus particulièrement des propriétés insecticides et plus particulièrement larvicides. Toute litière brute arborescente à différents stades de décomposition et de différentes origines peut être utilisée dans les procédés selon la présente invention. De préférence, la litière arborescente décomposée brute est collectée dans des forêts décidues ripariales et alluviales à saules, aulnes, frênes, chênes et ormes de type G11, G12 selon la nomenclature EUNIS (European Nature Information System, European Environment Agency, 2002). Préférentiellement, la litière arborescente brute en décomposition est prélevée dans l'horizon 0 du sol de forêt et plus préférentiellement dans l'horizon Olv du sol de forêt. Par horizon on entend une couche de sol plus ou moins parallèle à la surface, et qui se distingue des couches voisines, qui lui sont généralement liées, par ses caractères morphologiques, physiques, chimiques ou biologiques. Par horizon O on entend l'horizon organique superficiel, résultant de l'accumulation et de la dégradation en surface, surtout aérobique, des matières organiques de forêts. De préférence, la litière brute est prélevée dans l'horizon Olv correspondant à la litière vieillie faite de feuilles plus ou moins transformées, brunies, blanchies, ramollies et/ou en paquets collés, mais ne présentant aucune matière organique fine (Green, R N, Trowbridge, R L, Klinka, K (1993) Towards a taxonomic classification of humus forms, Forest Sci. Monogr., 29, 1-49 ; Jabiol B, Brêthes A, Ponge J-F, Toutain F, Brun J-J (1995) L'humus sous toutes ses formes, ENGREF edn. Nancy). Après prélèvement la litière brute est broyée selon des techniques habituelles. Typiquement, la litière est broyée et tamisée jusqu'à l'obtention de particules de 0. 5 mm de diamètre. De manière avantageuse, la litière collectée est séchée à température ambiante avant le broyage. La fraction soluble dans l'eau de la litière broyée est ensuite extraite selon des techniques habituelles. On entend par fraction soluble les éléments solides de la litière broyée pouvant se dissoudre dans l'eau ou dans une solution aqueuse en formant un mélange homogène. De préférence, on extrait la fraction soluble dans un tampon phosphate de molarité égale ou inférieure à 25mM et de pH compris entre 5.5 et 8. 5. De préférence, le tampon d'extraction est un tampon phosphate 25mM de pH 7. 5 et préférentiellement, le tampon d'extraction est un tampon phosphate monopotassique-disodique 25 mM de pH 7. 5. D'autres tampons phosphates pourront être utilisés à la même molarité et au même pH (tampon phosphate monopotassique-soude, tampon phosphate disodique-acide citrique par exemple). Dans les procédés selon l'invention, la fraction soluble est ensuite traitée à la chaleur. Le chauffage est effectué à une température comprise entre 40 C et 80 C, de préférence à une température comprise entre 50 C et 75 C. Avantageusement, on chauffe la fraction soluble à 70 C pendant 10 minutes. Cette étape de chauffage entraîne l'apparition d'impuretés insolubles. Ces impuretés insolubles sont préférentiellement éliminées selon des techniques connues de l'homme du métier. Après le chauffage, les impuretés insolubles sont par exemple éliminées par centrifugation de la fraction soluble et élimination du culot solide. Consécutivement au traitement par la chaleur, la matière active insoluble insecticide se forme progressivement dans la fraction soluble et précipite. On entend par précipitation une réaction chimique au cours de laquelle des composés précédemment en solution forment un solide insoluble qui s'isole de son solvant et se dépose au fond. De préférence, on laisse la précipitation s'effectuer à température ambiante pendant au moins 24h. Avantageusement, on laisse précipiter la matière active insoluble pendant 72h. La température de précipitation étant préférentiellement de 25 C. De manière avantageuse, l'étape de précipitation est effectuée à un pH compris entre 6. 5 et 7.5. Après l'étape de précipitation, les matières actives insolubles sont isolées selon des techniques habituelles. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les matières actives insolubles sont isolées par centrifugation de la fraction. A l'issue de cette centrifugation, seul le culot solide de matière active insoluble est conservé. La centrifugation est par exemple effectuée à 5000t/min pendant 30 minutes. Dans un autre mode de réalisation, les matières actives sont isolées par centrifugations fractionnées. Un autre objet de la présente invention est de proposer une nouvelle matière active susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention. Dans la présente invention, la matière active extraite de litière brute a des propriétés toxiques, et/ou insecticides plus particulièrement larvicides. On entend par insecticide une substance toxique pour les insectes soit avant leur maturité (larvicide), soit au stade adulte. Plus particulièrement, la matière active et les compositions de la présente invention sont toxiques pour les insectes anthropophiles et donc pour les insectes qui piquent exclusivement ou préférentiellement l'homme. En particulier, la matière active et les compositions de la présente invention sont toxiques pour les larves de moustiques et plus particulièrement pour les larves de moustiques anthropophiles. Un autre objet de la présente invention est une composition insecticide comprenant une matière active selon l'invention. De préférence, la composition selon l'invention a des propriétés larvicides. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les compositions selon l'invention comprennent également un support solide ou liquide et/ou un ou plusieurs agents tensio-actifs. Les compositions selon l'invention se présentent donc sous des formes assez diverses, solides ou liquides. Par le terme "support", on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, qui entre dans la formulation de la composition insecticide pour faciliter son application, améliorer sa stabilité ou sa biodisponibilité. Ce support est généralement inerte. Le support peut être solide ou liquide. Des mélanges de tels supports peuvent être également utilisés. Par le terme tensio-actif on entend un composé qui introduit dans un liquide en abaisse la tension superficielle ce qui a pour effet d'en augmenter les propriétés mouillantes. L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique ou un mélange de tels agents tensioactifs. La présente invention a également pour objet, l'utilisation d'une matière active et/ou d'une composition selon l'invention pour la lutte à titre préventif ou curatif contre les insectes. Plus particulièrement, les matières actives et les compositions selon l'invention sont utilisées comme larvicides. Description des figures Figure 1 : Effet de la molarité du tampon d'extraction (tampon phosphate, pH 7. 5) sur la toxicité des formes insolubles constituées in vitro. ES : erreur standard calculée à partir de trois répétitions. Figure 2 : de la température de traitement de l'extrait sur la toxicité des formes insolubles constituées in vitro. ES : erreur standard calculée à partir de trois répétitions. Figure 3: Recherche du moment optimal pour l'application du traitement par la chaleur. Les extraits protéiques sont chauffés à 70 C soit immédiatement (to), soit 5,12, 24 ou 48 heures après leur obtention. Les formes insolubles sont collectées après 72 heures de précipitation. ES : standard calculée à partir de trois répétitions. Figure 4 : d'apparition de la toxicité sous forme insoluble après traitement par la chaleur. Les formes insolubles sont collectées par centrifugation au cours de la phase de précipitation à 20 C, soit immédiatement après chauffage à 70 C (tO), soit après 12,24, 48,60 ou 72 heures ; leur toxicité est mesurée par bioessai (#). Parallèlement, la quantité de protéines restant dans les extraits (#) est dosée après centrifugation. ES : erreur standard calculée à partir de trois répétitions. Figure 5 : Profils chromatographiques des polypeptides (a) extraits dans le tampon phosphate, (b) recueillis dans le précipité après 72 heures. Figure 6 : Effet du pH lors de la phase de précipitation de la toxicité. Figure 7: Protocole standard retenu pour isoler le complexe toxique in vitro. Les symboles + et - indiquent la présence (> 80 %) ou l'absence ( Exemples Exemple 1 : Collecte du matériel végétal Les litières arborescentes utilisées proviennent de gîtes à moustiques de la région Rhône-Alpes, initialement décrits par Maire A (Maire A (1971) Indice des opérations de démoustication sur les biotopes larvaires à Aedes dans la région Rhône-Alpes. Université Joseph Fourier) Les prélèvements ont été effectués dans l'horizon Olv correspondant à la litière vieillie (Jabiol B, Brêthes A, Ponge J-F, Toutain F, Brun J-J (1995) L'humus sous toutes ses formes, ENGREF edn. Nancy), sur 5 plots standardisés (50 x 50 cm), dans deux sites connus pour générer des litières toxiques ou non selon l'année (Tilquin M, Meyran JC, Marigo G (2002) Dietary toxicity of decomposed arborescent leaf litter against larval mosquito : involvement of a ligninpolypeptidic complex J. Agric. Food Chem., 50 :6378-6382). Après séchage à température ambiante, les litières sont broyées, tamisées (diamètre des particules : 0. 5 mm) et stockées à-25 C. Exemple 2 : Contrôles de toxicité La toxicité des échantillons est testée à l'aide de bioessais standards sur larves d'Aedes aegypti élevées en conditions contrôlées au laboratoire (Rey D, Cuany A, Pautou MP, Meyran JC (1999) Differential sensitivity of mosquito taxa to vegetable tannins J. Chem. Ecol. 25,537-548). Les bioessais sont conduits à 25 C, sur des lots homogènes de 20 larves de stade IV mises en contact avec 10 ml de suspension d'échantillon à tester. La mortalité larvaire est mesurée après 2 heures de contact et exprimée en %. Exemple 3 : Extraction des protéines du complexe toxique Les protéines sont extraites dans la glace, à partir de 50 mg de litière brute finement broyée, dans 5 ml de tampon phosphate mono potassique /disodique 25 mM (pH 7. 5), pendant 30 minutes sous agitation. L'extrait est séparé du résidu solide par centrifugation (5 000 rpm pendant 5 minutes) puis filtration sur papier filtre (Whatman n 4) et stocké dans la glace. L'extraction est répétée à trois reprises en renouvelant le milieu d'extraction : 15 ml d'extrait sont ainsi collectés. Le résidu solide, correspondant à la fraction lignine, est séché et conservé à -25 C. Exemple 4: Identification et dosage des protéines du complexe toxique Après dissociation en présence de dodecylsulfate de sodium (SDS) 0,2 % dans du tampon phosphate (1 heure dans l'eau bouillante), les polypeptides extraits sont identifiés par chromatographie sur couche mince de silice greffée en phase inverse (silice RP 18 F 254) avec du tampon phosphate 25 mM (pH 8. 5) comme solvant de migration. Après migration, les plaques sont révélées par la ninhydrine à 0. 1 % dans l'éthanol (révélateur des acides aminés). Les protéines extraites sont dosées par colorimétrie en utilisant la ninhydrine selon le protocole de Sameijama K (Sameijama K (1971) Reagent for detecting and assaying peptides, amino acids, amines and amino sugars, Anal. Biochem. 42,222). Exemple 5 : Protocole d'isolement du principe larvicide à partir de litières non toxiques Si le principe larvicide a pu être isolé de litières brutes toxiques après extraction par l'eau chaude (1 heure à 50 C) puis par précipitation progressive à température ambiante (Tilquin M et al. (2002) Hot extraction and characterization of a lignin fraction involved in the larvicidal effects of decomposed leaf litter against mosquito J. Chem. Ecol. 28,1497-1510), nous avons obtenu un principe non larvicide en appliquant ce protocole à des litières brutes non toxiques du même âge (résultat non présenté). Ces résultats peuvent s'expliquer par un comportement différent des éléments constitutifs du complexe toxique. Contrairement à ce qui se passe dans la litière toxique, ces éléments demeurent compartimentés dans la litière non toxique, ce qui empêcherait leur association en vue de la toxicité. La fraction protéique est extraite à froid, en présence de tampon phosphate 25 mM (pH 7,5), le résidu végétal déprotéinisé contenant les lignines. Ces deux éléments sont ensuite associés grâce à un traitement d'1 heure à 50 C (étape 1), permettant d'extraire les lignines du résidu déprotéinisé et de les mettre directement en contact avec la fraction protéique (Tableau 1 : Essai). Le principe est ensuite isolé par précipitation (étape 2). L'extrait protéique seul (Contrôle 1) et le matériel déprotéinisé en suspension dans du tampon phosphate (Contrôle 2) subissent les mêmes traitements. Tableau 1 : d'isolement du principe actif à partir de litières non toxiques Essai Contrôle 1 Contrôle 2 Matériel végétal déprotéinisé" b Matériel végétal déprotéinisé" + extrait protéique Extrait protéique seul + tampon phosphate Chauffage 1 heure à 50 C Protocole ############################################### Précipitation 72 heures à 25 C Toxicité des formes insolubles + + - - a Le matériel déprotéinisé correspond au résidu végétal après extraction des protéines par le tampon phosphate. b L'extrait protéique contient les protéines végétales solubilisées dans le tampon phosphate. e Les formes insolubles sont collectées par centrifugation de l'extrait protéique et testées par bioessai. La toxicité observée après 2 h de contact avec les larves est représentée par + lorsqu'elle est supérieure à 80 % et par - lorsqu'elle est inférieure à 10 %. La comparaison de ces résultats montre que, pour engendrer des formes toxiques, il n'est pas indispensable de ré-associer les protéines à des lignines de type conventionnelles (Essai) puisque l'extrait protéique global manifeste, à lui seul, le même niveau de toxicité après traitement (Contrôle 1). Cette observation suggère qu'au delà des protéines, l'extraction par le tampon phosphate solubilise des éléments (peut être dérivés des lignines) pouvant se substituer aux lignines conventionnelles dans la formation du complexe toxique. Le contrôle 2 souligne le rôle important du tampon phosphate dans la phase d'extraction et l'obtention finale du principe actif. La première étape importante dans la mise en #uvre du protocole d'isolement consiste donc en l'extraction, par le tampon phosphate, de formes potentiellement actives dans la toxicité. En l'absence de traitement par la chaleur ou lorsque l'on supprime la phase de précipitation, aucune toxicité n'apparaît (résultats non présentés). Ces deux traitements complémentaires apparaissent donc incontournables dans la réalisation du protocole. Enfin, aucune toxicité n'a pu être observée dans les phases solubles des essais/contrôles effectués, ce qui confirme la nature insoluble du principe actif isolé. Il semble que ce soit l'étape de recombinaison des différentes composantes du complexe toxique qui soit limitante dans l'apparition de la toxicité, ces dernières pouvant demeurer compartimentées dans le matériel foliaire non toxique (Tilquin M, Meyran JC, Marigo G (2002) Dietary toxicity of decomposed arborescent leaf litter against larval mosquito : involvement of a lignin-polypeptidic complex J. Agric. Food Chem. 50 : 6378-6382). Le procédé mis au point repose donc sur une décompartimentation par extraction des différents éléments impliqués, suivie d'une précipitation favorisant leur association in vitro. Ce procédé comporte trois étapes : (1) l'extraction des différents éléments impliqués dans la toxicité, en présence de tampon phosphate 25 mM (pH 7,5) ; (2) l'élimination de substances inhibant l'apparition de la toxicité, après traitement par la chaleur; (3) la reconstitution du principe actif, par précipitation des éléments pré-extraits. La purification des formes toxiques reconstituées, par centrifugations fractionnées, permet d'optimiser le protocole. Exemple 6 : Optimisation de l'étape d'extraction Différents tampons d'extraction ont été testés, montrant une très grande spécificité du tampon phosphate qui apparaît comme le seul permettant la formation du principe actif in vitro (Tableau 2). Alors que le pH n'influence pas nettement l'étape d'extraction lorsqu'il demeure compris entre 5. 5 et 8.5 (résultat non présenté), la molarité du tampon phosphate semble déterminante, avec un optimum très marqué à 25 mM (Figure 1). Tableau 2 : de la nature du tampon d'extraction sur la toxicité des formes constituées in vitro. Nature du tampon d'extraction Phosphate TRIS MES HEPES MOPS Toxicité des formes insolubles + - - - a L'étape d'extraction est réalisée dans 5 tampons différents (pH 7. 5), utilisés à 25 mM. b Les formes insolubles sont collectées par centrifugation de l'extrait protéique après chauffage et précipitation, puis testées par bioessai. La toxicité observée après 2 h de contact avec les larves est représentée par + lorsqu'elle est supérieure à 80 % et par lorsqu'elle est inférieure à 10 %. Exemple 7 : Optimisation du traitement par la chaleur Le traitement par la chaleur est optimal à 70 C (Figure 2), 10 minutes à cette température suffisant à engendrer une toxicité maximale (résultat non présenté). Immédiatement après chauffage, il est à noter l'apparition de formes insolubles que l'on peut éliminer sans affecter la toxicité du précipité final ( Figure 7). Nous avons recherché à quel moment le traitement par la chaleur devait être appliqué au cours de la phase de précipitation du principe actif. Les résultats de la Figure 3 montrent la nécessité d'effectuer cette étape pendant les 12 premières heures suivant l'extraction. Il semble que le chauffage permette d'éliminer des impuretés qui, lorsqu'elles demeurent en solution durant la phase de précipitation, inhibent la formation du principe toxique. Exemple 8 : Optimisation de la phase de précipitation Consécutivement au traitement par la chaleur, la toxicité n'apparaît dans l'extrait qu'après un délai d'au moins 24 heures (Figure 4), sous la forme de composés qui précipitent progressivement et que l'on isole par centrifugation (30 minutes à 5 000 rpm). L'apparition de ces formes insolubles toxiques se déroule corrélativement à une précipitation des protéines initialement solubilisées dans l'extrait (Figure 4). De plus, après précipitation, on retrouve dans le principe actif isolé les 4 polypeptides majeurs extraits, à partir de la litière, par le tampon phosphate (Figure 5). Ces observations vont dans le sens d'une implication de ces molécules dans la toxicité. Parmi les autres facteurs modulables dans la phase de précipitation, on peut relever un effet déterminant de la température, optimale aux alentours de 25 C (aucune toxicité n'est observée lorsque la précipitation est effectuée à 5 ou à 50 C : Tableau 3), et un effet plus modeste du pH, optimal entre 6. 5 et 7. 5 (Figure 6). Il est à noter, par ailleurs, qu'aucune précipitation significative de la fraction protéique n'est observée à 5 et 50 C (Tableau 3). Tableau 3 : de la température au cours de la phase de précipitation. Température de précipitation 5 C 25 C 50 C Toxicité des formes insolubles* - + Quantité de protéines solubles 2.2 0.5 2.1 (mg / 15 ml d'extrait) a Après traitement par la chaleur, les extraits sont conservés pendant 72 heures à 5, 25 ou 50 C. 6 Les formes insolubles sont collectées par centrifugation des extraits protéiques et testées par bioessai. La toxicité observée après 2 h de contact avec les larves est représentée par + lorsqu'elle est supérieure à 80 % et par - lorsqu'elle est inférieure à 10 %. c La quantité de protéines solubles dans les extraits est dosée après élimination des protéines insolubles par centrifugation. Exemple 9: Protocole standard retenu et généralisation du procédé Le procédé standard utilisé en routine, résumé sur la Figure 7, a pu être appliqué avec succès à des litières prélevées sur un même site à différentes périodes de l'année, ou sur différents sites dans la région RhôneAlpes. Le procédé est généralisable à des litières arborescentes à différents stades de décomposition et de différentes origines. L'efficacité de la matière active isolée a été vérifiée sur différentes espèces larvaires de moustiques. La matière toxique recueillie selon ce procédé s'est avérée active sur différentes espèces de moustiques, parmi lesquelles de nombreuses espèces d'Aèdes (A. cataphylla, A. rusticus, A. cantans), connues pour leur invasivité et leur vulnérance. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une matière active caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose de litière arborescente décomposée brute ; b) on broie ladite litière brute ; c) on extrait la fraction soluble de ladite litière broyée obtenue à l'étape b) ; d) on chauffe ladite fraction obtenue à l'étape c) à une température comprise entre 40 C et 80 C ; e) on précipite, à température ambiante, pendant au moins 24h, la matière active insoluble se formant progressivement dans ladite fraction de l'étape d); f) on isole ladite matière active insoluble précipitée à l'étape e). 2. Procédé de préparation d'une matière active selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on dispose à l'étape a) de litière arborescente décomposée brute de l'horizon Olv. 3. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-2 caractérisé en ce que l'étape b) comprend le séchage puis le broyage de ladite litière arborescente décomposée brute. 4. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-3 caractérisé en ce que à l'étape c) on extrait ladite fraction soluble dans un tampon phosphate 25mM. 5. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-4 caractérisé en ce que à l'étape d) on chauffe ladite fraction à 70 C. 6. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-5 caractérisé en ce que à l'étape d), après le chauffage de ladite fraction, on élimine les impuretés insolubles, apparues au cours dudit chauffage, par centrifugation de ladite fraction. 7. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-6 caractérisé en ce que à l'étape e) on précipite ladite matière active insoluble pendant 72h. 8. Procédé de préparation d'une matière active selon l'une des revendications 1-7 caractérisé en ce que à l'étape f) on isole ladite matière active insoluble par centrifugation. 9. Matière active caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1-8. 10. Composition insecticide caractérisée en ce qu'elle comprend une matière active selon la revendication 9. 11. Composition larvicide caractérisée en ce qu'elle comprend une matière active selon la revendication 9. 12. Composition selon l'une des revendications 10-11 caractérisée en ce qu'elle comprend également un support solide ou liquide et/ou un ou plusieurs agents tensio-actifs. 13. Utilisation d'une matière active selon la revendication 9 et/ou d'une composition selon l'une des revendications 10-12 pour la lutte à titre préventif ou curatif contre les insectes.