Brevet FR2846667A1 — publié le 20040507

corps de camélidés à chaîne unique, dirigés contre le peptide (3-amyloïde 1-42 (Ass42), ainsi qu'à leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuro- agrégatives comme la maladie d'Alzheimer. Au sens de la présente invention, on entend par maladies neuro- agrégatives des maladies du système nerveux impliquant une accumulation (agréga- tion) intracellulaire de produits dérivés de constituants cellulaires comme des produits dérivés de protéine(s). La maladie d'Alzheimer est un désordre neurodégénératif ou neuroagrégatif qui affecte 1 à 6 % de la population âgée de plus de 65 ans. L'une de ses caractéristiques est la présence de plaques séniles qui contiennent du (3-amyloïde, produit toxique dérivé de la protéine ssAPP (ss Amyloïd Precursor Protein), constitué de peptides de 39 à 42 acides aminés (peptides Ass), engendrés par le clivage de la ssAPP par des sécrétases. Les mécanismes responsables de la toxicité du P-amyloïde ne sont pas connus et la relation entre le (3-amyloïde et la pathologie n'est pas élucidée. Jusqu'à maintenant, il n'existe pas de traitement de la maladie d'Alzheimer mais l'immunothérapie à base d'anticorps semble être une voie extrêmement prometteuse. En effet, dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (souris transgéniques pour la protéine PAPP), il a été montré que l'immunisation par le peptide (3-amyloïde 1-42 (peptide AP42) empêche le dépôt cérébral de (3-amyloïde chez les jeunes souris, élimine les dépôts de (3-amyloïde chez les souris âgées et surtout prévient les pertes de mémoire chez ces souris (Schenk et al., Archives of Neurology, 2000,57 : 934-936 ; Weiner et al., Annals of Neurology, 2000, 48): 567- 579 ; Janus et al., Nature, 2000,408 : 979-982 ; Morgan et al., Nature, 2000,408: 982-9857 ; Bard, F., et al., Nature Medicine, 2000.6: 916-9 ; Solomon et al., P.N.A.S., 1997, 94 : 4109-4112). Deux mécanismes non-exclusifs ont été proposés pour expliquer l'action des anticorps anti-Ap42 : - un effet direct des anticorps à l'intérieur du cerveau (Bard et al., précité ; Solomon et al., DNA & Cell Biology, 2001,20 : 697-703) ; les anticorps se fixeraient au peptide Ass42 du cerveau d'une manière qui empêche la conversion de la forme soluble du peptide en la forme insoluble trouvée sur les plaques (Solomon et al., 2001, précité). Cette hypothèse est appuyée par les travaux sur l'immunisation contre la protéine du prion (Peretz et al., Nature, 2001, 412: 739-743), - un effet indirect sur les échanges dynamiques du peptide Ap42 entre le sang et le cerveau (DeMattos, R. B., et al., P.N.A.S., 2001, 98: 8850-8855) ; les anticorps anti-A(342 ne pénétreraient pas dans le cerveau, mais agiraient plutôt à la périphérie. Le peptide Ap42 semble passer la barrière hémato-encéphalique par transport actif et être en situation d'équilibre entre le cerveau et le sang. En se fixant aux peptides Ap42 en solution dans le sang, les anticorps pourraient modifier cet équilibre, causant la séquestration du peptide Ass42 dans le sang ou peut-être son extraction du cerveau. Toutefois, les anticorps monoclonaux de souris ou leurs fragments (scFv) présentent les inconvénients suivants pour une utilisation en thérapie humaine : - les anticorps monoclonaux de souris qui sont immunogènes chez l'Homme ne peuvent pas être administrés de façon répétée, sur une longue période, et - les fragments scFv sont peu solubles et peu stables in vivo. Afin de traiter plus efficacement les maladies neuroagrégatives telles que la maladie d'Alzheimer, il existe un réel besoin de disposer de nouveaux anticorps mieux adaptés aux besoins de la pratique. Les camélidés (chameaux, dromadaires, lamas, alpagas, etc...) ont la particularité de posséder à la fois des immunoglobulines classiques possédant deux chaînes lourdes et deux chaînes légères et des immunoglobulines dénommées immunoglobulines à chaîne lourde (HCAbs) ou immunoglobulines à chaîne unique qui possèdent deux chaînes lourdes mais pas de chaînes légères (Pour une revue voir NGUYEN et al., Advances in Immunology, 2001,79: 261-296 et Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology, 2001,74: 277-302). Leur chaîne lourde qui possède un poids moléculaire compris entre 43 kDa et 47 kDa selon les espèces, est constituée d'un domaine variable (VHH) d'environ 16 kDa, séparé de deux domaines constants (CH2 et CH3) par une région charnière. Leur paratope (domaine de liaison à l'antigène) est constitué d'un seul domaine variable (VHH). Malgré l'absence de diversité due à la combinatoire entre les domaines variables des chaînes lourdes et légères (VH-VL), ces anticorps à chaîne unique possèdent une grande capacité de reconnaissance des antigènes grâce à des CDRs qui possèdent un nombre d'acides aminés plus important que les CDRs classiques . La préparation d'anticorps à partir de camélidés immunisés par un antigène (toxine bactérienne ou venin) et le criblage, par la technique d'exposition sur phage (phage display), de banques de ces domaines VHH sont décrits dans la Demande EP 0739 981. Les banques fabriquées à partir de ces domaines VHH uniques contiennent des anticorps fonctionnels qui ont subi une maturation in vivo. Les VHH issus de ces banques possèdent une affinité et une spécificité élevées pour l'antigène. En outre, ils sont capables de reconnaître des épitopes peu immunogènes pour les anticorps "classiques" et certains d'entre eux sont des inhibiteurs d'enzyme très puissants grâce à un mécanisme très original ; le CDR 3 qui est beaucoup plus long que la moyenne est capable de former une boucle qui va s'insérer dans le site actif de l' enzyme. Les VHH, sélectionnés à partir de ces banques, sont bien exprimés, très solubles et très stables. En outre, du fait de leur petite taille et de l'homologie de leurs séquences FR avec celles des immunoglobulines humaines, les VHH sont peu immunogènes chez l'Homme. En conséquence, les VHH offrent des perspectives incontestables pour le diagnostic et le traitement de pathologies humaines ou animales, par rapport aux anticorps monoclonaux ou aux fragments d'anticorps conventionnels (ScFv). Les Inventeurs ont préparé une banque de fragments variables d'anticorps de camélidés, dirigés contre le peptide (3-amyloïde 1-42 ; à partir de cette banque, les Inventeurs ont isolé des fragments d'anticorps qui répondent mieux aux besoin de la pratique en ce qu'ils présentent les propriétés suivantes : - ils se lient spécifiquement au peptide 1-42 du précurseur de la protéine (3-amyloïde avec une affinité élevée, - ils possèdent un faible poids moléculaire et sont solubles, - ils sont très stables, et - ils sont peu immunogènes. Les fragments variables d'anticorps à chaîne unique anti-Ap42 représentent des candidats pour une immunothérapie de la maladie d'Alzheimer. En outre, ils sont utiles pour le diagnostic de cette maladie, par exemple des VHH marqués peuvent être utilisés en imagerie médicale. En conséquence, la présente invention a pour objet une banque immune d'ADNc de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigés contre le peptide P-amyloïde 1-42 (SEQ ID NO: 1), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2937. La banque immune d'ADNc selon l'invention est préparée à partir de lymphocytes de camélidés immunisés par le peptide Ass42, par clonage de fragments VHH, comme décrit dans la Demande EP 0739981. La présente invention a également pour objet un fragment variable d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigé contre le peptide P-amyloïde 1-42, caractérisé en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - la culture de la banque d'ADNc de fragments variables d'anticorps telle que définie ci-dessus, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables, - la mise en contact desdits fragments variables avec le peptide ssamyloïde 1-42 (Ap42), dans des conditions permettant la liaison dudit fragment variable d'anticorps avec ledit peptide, et - l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticorps capables de se lier audit peptide. Les conditions de culture de la banque d'ADNc et d'incubation des fragments variables avec le peptide Ass42 sont des conditions classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier. Conformément à l'invention, lesdits fragments variables d'anticorps à chaîne unique sont issus de n'importe quel animal de la famille des camélidés, par exemple de chameau, dromadaire, lama ou d'alpaga. Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment variable d'anticorps, il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3,5, 7 et 9. La présente invention a également pour objet un anticorps ou un fragment d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet une molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule d'ADNc, elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 2,4, 6 et 8. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc telle que définie ci-dessus. De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression procaryote ou eucaryote, comprenant au moins une cassette d'expression comprenant l'ADNc codant les fragments variables d'anticorps (VHH) tels que définis ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié, notamment un promoteur permettant l'expression desdits fragments VHH dans des cellules hôtes modifiées. Avantageusement, ledit ADNc est cloné dans ledit vecteur, en phase avec une séquence étiquette, éventuellement clivable (épitope, séquence polyHistidine...) ; une telle construction permet de produire ledit fragment VHH sous forme d'une protéine de fusion qui est ensuite purifiée sur une colonne appropriée (colonne d'immunoaffinité ou colonne de nickel), ladite séquence étiquette pouvant éventuellement être clivée par tout moyen approprié. La présente invention a également pour objet une cellule hôte eucaryote ou procaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modi- fiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH de séquence SEQ ID NO: 3. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2934.; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH de séquence SEQ ID NO: 5. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935.; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH de séquence SEQ ID NO: 7. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH de séquence SEQ ID NO:9. Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son ne, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les techniques de production et de purification de protéines recombinantes, les méthodes d'immunisation et de production d'anticorps et les techniques immunologiques reposant sur la détection de complexes antigène-anticorps (ELISA, RIA, Western-Blot) sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple on peut citer celles décrites dans Current Protocols in Molecular Biology, précité et dans Current protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Du fait de leurs propriétés telles que définies ci-dessus, les frag- ments variables d'anticorps selon l'invention sont utiles pour le diagnostic et le traite- ment des maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer. En conséquence la présente invention a pour objet l'utilisation d'un fragment variable d'anticorps ou bien d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps déri- vés, tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection de maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer. Ladite détection peut-être effectuée par toute technique appropriée, notamment par des techniques d'imagerie médicale. La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic de maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticorps ou bien un anticorps ou un fragment d'anticorps comprenant ledit fragment variable d'anticorps, tels que définis cidessus. La présente invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticorps ou bien un anticorps ou un fragment d'anticorps comprenant ledit fragment variable d'anticorps, tels que définis ci-dessus, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a également pour objet l'utilisation des anticorps tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neuroagrégatives, notamment de la maladie d'Alzheimer. Du fait de leurs propriétés telles que définies ci-dessus, les fragments variables d'anticorps selon l'invention présentent les avantages suivants par rapport aux anticorps ou fragments d'anticorps existants : - ils sont produits facilement, en grande quantité, à un coût peu élevé, - ils se lient au peptide Ass42 de façon spécifique et avec une affinité élevée, - ils possèdent une demi-vie importante, - ils n'induisent pas de réponse immunitaire du type HAMA (Human anti-mouse antibody) et peuvent donc être administrés chez un patient humain ou animal, de façon répétée sur une longue durée. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de la banque de VHH anti-p42 selon l'invention, ainsi qu'au Tableau 1 illustrant les séquences de la Demande et aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la cinétique en ELISA, des anticorps sériques spécifiques chez les alpagas immunisés avec le peptide Ass42. Les valeurs représentent la densité optique à 295 nm des sérums dilués au 1/3200, respectivement aux jours Jo, J35, J77 et J131 du protocole d'immunisation. - la figure 2 illustre la diversité de la banque de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, spécifiques du peptide Ass42 (VHH anti- AP42), analysée sur 6 clones (VHH-03, VHH-05, VHH-07, VHH-25, VHH-11 et VHH-33, respectivement SEQ ID NO : 26,24, 22,23, 25 et 27) pris au hasard. - la figure 3 illustre la séquence en acides aminés des VHHs des clones VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ L1-3, VHH ALZ V31-1 (SEQ ID NO: 3,5, 7 et 9). Les séquences indiquées en gras correspondent respectivement au CDRl,CDR2etCDR3. - la figure 4 illustre la liaison des VHHs solubles des clones VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ LI-3, VHH ALZ V31-1 au peptide As42, analysée par un test ELISA direct. Tableau I: Séquences de la Demande Numéro d'identification Séquence SEQ ID NO: 1 peptide Ass42 SEQ ID NO: 2 ADNc VHH-61 SEQ ID NO: 3 peptide VHH-61 SEQ ID NO: 4 ADNc VHH-L35 SEQ ID NO: 5 peptide VHH-L35 SEQ ID NO: 6 ADNc VHH-L 1-3 SEQ ID NO: 7 peptide VHH-L 1-3 SEQ ID NO: 8 ADNc VHH-V31-1 SEQ ID NO: 9 peptide VHH-V31-1 SEQIDNO: 10 amorce VHBACK A6 SEQ ID NO: 11 amorce CH2FORT A4 SEQ ID NO: 12 amorce VHBACKA4 SEQIDNO: 13 amorce VHFOR36 SEQIDNO: 14 amorce LH SEQ ID NO: 15 ADNc VHH-07 SEQ ID NO: 16 ADNc VHH-25 SEQ ID NO: 17 ADNc VHH-05 SEQ ID NO: 18 ADNc VHH-11 SEQ ID NO: 19 ADNc VHH-17 SEQ ID NO: 20 ADNc VHH-03 SEQ ID NO: 21 ADNc VHH-43 SEQ ID NO: 22 peptide VHH-07 SEQ ID NO: 23 peptide VHH-25 SEQ ID NO: 24 peptide VHH-05 SEQ ID NO: 25 peptide VHH-11 SEQ ID NO: 26 peptide VHH-03 SEQ ID NO: 27 peptide VHH-33 Exemple 1 : Préparationd'une banque de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, spécifiques du peptide Ass42 (VHH anti- AP42) 1) Immunisation d'alpagas avec le peptide Ap42 Le peptide Ap42 (SEQ ID NO: 1) est synthétisé en phase solide selon la méthode décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85 : 2149). Un alpaga a été immunisé avec le peptide Ass42 en suivant le proto- cole suivant : Jo : Saignée pré-immune - Jo: 200 g de peptide Ass42 en Adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée - Jio : 200 g peptide Ass42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée - J21 : 200 g peptide Ass42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée J35 : saignée 2 - J42 : 200 g peptide Ap42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée - J4g : 200 g peptide Ass42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée - J70 : 200 g peptide Ass42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée J77 :saignée 3 - J101 : prélèvement des lymphocytes - J101 : 200 g peptide Ap42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée - J 115 : 200 aug peptide Ap42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée - J129 : 200 g peptide Ass42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée J131 : saignée 4 La cinétique de la réponse en anticorps sériques spécifiques du peptide Ass42 est analysée, en ELISA, aux jours Jo, J35, J77 et J131, sur des peptides à la dilution 1/3200. Les résultats présentés à la figure 1 montrent un pic d'anticorps à J77. 2) Purification des ARNm et synthèse des ADNc Les lymphocytes sanguins sont préparés à partir du sang hépariné prélevé à J131, par centrifugation en gradient de ficoll. De manière plus précise, le sang (120 ml) hépariné (25 000 UI d'héparine) est dilué dans du tampon HBSS (120 ml), centrifugé sur un gradient de ficoll, pendant 30 min à 400 g, puis les lymphocytes sont récoltés, lavés trois fois dans du tampon HBSS, centrifugés pendant 5 min à 1000 g. Les lymphocytes ainsi obtenus (1,7.108 cellules) sont aliquotés (3.107 cellules par tube) puis les ARNm sont extraits à partir de 107 lymphocytes, à l'aide du kit RNAXEL (Eurobio), en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc est synthétisé à partir de 5 à 10 g d'ARNm dans les conditions suivantes : 2 [il de B-mercaptoéthanol (1M) et 2 l de RNAsine 40 U/ l (PROMEGA) sont ajoutés à 20 l de la préparation d'ARNm purifié et le mélange est incubé 5 min à température ambiante, puis 2 heures à 42 C, dans un volume de 96 \il contenant 400 UI de MLV (GIBCO) dans du tampon MLV(GIBCO) 8,33 mM DTT, 500 M de chacun des dNTPs et 6 à 30 pmoles d'amorce hexanucléotidique aléatoire (PdN6). Les fragments VHH sont amplifiés par des réactions de PCR imbriquées (nested PCR) : -1ère réaction PCR Un produit de 600 pb correspondant au fragment VHH-chamièreCH2 est amplifié à l'aide du couple d'amorces : - VHBACK A6 :5' GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG 3' (SEQ ID NO: 10) - CH2FORT A4 :5' CGCCATCAAGGTACCAGTTGA 3' (SEQ ID NO: Il) De manière plus précise, la réaction PCR est réalisée dans un volume final de 50 l, en présence de 5 l d'ADNc, 6 à 30 pmoles de chacune des amorces, 25 mM MgCl2, 200 M de chacun des dNTPs et 5 unités de Taq polymérase Hot start (QIAGEN). L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 95 C pendant 15 min est suivie de 40 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec, une étape d'hybridation des amorces à 52 C pendant 30 sec et une étape d'extension à 72 C pendant 30 sec, puis la réaction est terminée par une étape finale d'extension à 72 C pendant 2 min. Le produit d'amplification de 600 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (TrisBorate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL). - 2ème réaction PCR : Un produit d'environ 350 pb correspondant au fragment VHH est amplifié à partir du produit de 600 pb, à l'aide des couples d'amorces suivants : * Couple 1 : - VHBACKA4 (Sfi: 5' CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSCA GCT 3' (SEQ ID NO: 12) et - VHFOR36 (Notl): 5' GGACTAGTTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTG 3' (SEQ ID NO: 13). * Couple 2 : - VHBACKA4 (Sfil) et - LH (NotI) : 5' GG ACT AGT TGC GGC CGC TGG TTG TGG TTT TGG TGT CTT GGG 3' (SEQ ID NO: 14) Le couple 1 amplifie les VHH de tous les isotypes d'immunoglobulines à chaîne unique alors que le couple 2 est spécifique de l'isotype IgG3. De manière plus précise, la réaction PCR est réalisée dans un volume final de 50 fil, en présence de 5 l du produit de 600 pb, 10 pmoles de chacune des amorces, 25 mM MgCl2 , 200 M de chacun des dNTPs et 5 unités de Taq polymérase. L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 95 C pendant 15 min est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec, une étape d'hybridation des amorces à 45 C pendant 30 sec et une étape d'extension à 72 C pendant 60 sec, puis la réaction est terminée par une étape finale d'extension à 72 C pendant 2 min. Le produit d'amplification de 350 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (TrisBorate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL). 3) Clonage des ADNc dans le vecteur pHEN 1 Le phagemide pHENI (Hoogenbaum et al., N.A.R., 1991,19: 4133- 4137) est purifié à l'aide du kit Nucleobond AX (MACHEREY/NAGEL), digéré par les enzymes Sfi I et Not I (BIOLABS), en suivant les instruction du fabricant, purifié sur gel d'agarose comme décrit ci-dessus, puis traité à la phosphatase alcaline (CIP). Le phagemide pHENl linéarisé et déphosphorylé et le produit d'amplification de 350 pb préalablement digéré par les enzymes Sfi I et Not I, sont ensuite incubés en présence de ligase, puis des bactéries E.coli SURE sont transformées par électroporation avec le produit de la ligation. Les bactéries transformées sont étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu 2YT gélosé, additionné de 100 g/ml d'ampicilline et de 1 % de glucose. Les colonies résistantes (2 x 106 clones) sont remises en suspension dans du milieu 2YT et la banque est conservée à -80 C dans du glycérol. La banque ainsi obtenue qui contient des clones incluant un insert VHH amplifié avec le couple d'amorces 1 (sous-banque 1) et des clones incluant un insert VHH amplifié avec le couple d'amorces 2 (sous-banque 2 spécifique de l'isotype IgG3), est dénommée banque immune VHH ALZ, a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002., sous le numéro 1-2937. 4) Contrôle de la diversité de la banque L'ADN plasmidique de 12 colonies résistantes est extrait à l'aide du kit Nucleospin Plasmid (MACHEREY/NAGEL). La présence d'un insert est contrôlée par restriction enzymatique de l'ADN plasmidique, à l'aide de Sfi I et Not I (BIOLABS), en suivant les instructions du fabricant. La diversité de la banque est contrôlée par amplification de l'ADN plasmidique, par PCR à l'aide du couple d'amorces VHBACKA4 et VHFOR36 comme décrit ci-dessus puis restriction enzymatique du produit PCR, à l'aide de Bst NI (BIOLABS), en suivant les instructions du fabricant et séparation des produits de digestion par électrophorèse en gel d'agarose (3 %). Alternativement, la séquence des inserts est déterminée par séquençage automatique. Les résultats sont les suivants : - 90 % des clones ont un insert (VHH-07, VHH-25, VHH-05, VHH- 11, VHH-17, VHH-03, VHH-43, VHH-61, VHH-L35, VHH-L1-3, VHH-V31-1 et VHH-33, respectivement SEQ ID NO: 15 à 21, 2, 4, 6 et 8). -. le profil de restriction par Bst NI montre une diversité des inserts. La figure 2 montre que la banque possède une grande diversité étant donné que parmi 6 clones pris au hasard, 5 codent pour des VHH dont les CDRs sont tous différents entre eux (VHH-05, VHH-07, VHH-25, VHH-11et VHH-33, respectivement SEQ ID NO: 24, 22, , 23,25 et 27) et 1 code pour un VH tronqué sans CDR3 (VHH-03, SEQ ID NO: 26). Exemple 2 : de la banque de VHH anti-Ap42 par la technique d'exposi- tion sur phage 1) Matériels et méthodes Les phagemides de la banque de VHH anti-Ap42 sont encapsidés dans des phages filamenteux (M13) et les phages sont amplifiés et titrés selon les techniques classiques de Biologie moléculaire en suivant les protocoles standard tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). 3 criblages successifs de la banque de VHH anti-Ap42 ont été réalisés par la technique d'exposition sur phage, en suivant le protocole suivant : - le criblage 4 ml de peptide A42 (25 ig/ml) dilué dans du tampon PBS sont répartis dans des immunotubes (maxisorp, 5 ml, NUNC) puis incubés une nuit à 37 C ou à 4 C. Après 5 lavages dans du PBS , 4 ml de tampon PBS contenant 2 % de lait écrémé (tampon de saturation) sont ajoutés et incubés 2 h à 37 C. Après des lavages avec du tampon PBS, 1012 à 1013 phages dilués dans 4 ml de tampon PBS contenant 2 % de lait écrémé sont ajoutés et incubés une heure à température ambiante sur une roue, puis une heure à température ambiante sans agitation. Après 10 lavages avec du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20 suivis de 10 lavages avec du tampon PBS, 3 ml d'une culture d'E. coli TG1 (supE hsd65thi 6(lac-proAB) F' [traD36 proAB+ lac1q lacZ DM15], STRATAGENE), à la densité optique de 0,5, sont ajoutés dans les immunotubes et incubés 45 min à 37 C, sous agitation. A la fin de l'incubation, les bactéries sont diluées (dilutions 10-2, 10-4 et 10-6) dans un volume de 100 l, étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu 2YTAG gélosé (milieu 2YT additionné de 100 g/ml d'ampicilline et de 1 % de glucose) et incubées une nuit à 37 C. Le reste de la culture (3 ml) est étalé sur une grande boîte de Pétri contenant le même milieu et incubé une nuit à 30 C. -2ième et 3ième criblages Le lendemain, les bactéries survivantes sont récoltées dans 5 ml de milieu 2YT puis 50 l sont mis en culture dans 100 ml de milieu 2YTAG et le volume restant est congelée à -80 C dans du glycérol. La culture est incubée à 37 C jusqu'à l'obtention d'une D06oo de 0,5 puis 10 ml de la culture sont infectés par 0,5 ml de phage auxiliaire (helper phage), incubés 130 min à 37 C sans agitation puis centrifugés 10 min à 5000 rpm. Le culot est remis en suspension dans 50 ml de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 (ig/ml) et de kanamycine (25 )J.g/mI) et la suspension obtenue est incubée une nuit à 30 C. Ensuite, 40 ml de cette culture sont centrifugés 10 min à 8000 rpm et le surnageant additionné de 8 ml d'une solution de PEG/NaCl (20 % PEG 8000,2,5 M NaCI) est incubé 2 à 4 h à 4 C puis centrifugé 2 fois à 10 min à 8000 rpm. Le culot de phage est remis en suspension dans 2 ml de PBS puis les phages sont titrés comme décrit ci-dessus et 1 ml de phage est criblé sur immunotube, comme décrit pour le 1er criblage, à l'exception que la concentration de peptide déposée dans les immunotubes est diminuée et la composition des tampons de saturation et de lavage des phages non fixés sont modifiés comme indiqué dans le Tableau II cidessous : Tableau II : Conditions des criblages successifs Criblage Concentration Tampon de satura- Tampon de lavage en e tide tion le criblage 25 .g/ml PBS + 2 % de poudre PBS + 0,1 % Tween 20 de lait écrémé 2'eme criblage 12,5 . ml PBS + 0,5 % gélatine PBS + 0,3 % Tween 20 3ième criblage 12,5 g/ml PBS + 3 % BSA PBS + 0,5% Tween 20 3) Résultats Le rendement de chaque criblage, représenté par la proportion de phages liés au peptide Ass42 est illustré par le Tableau III ci-dessous. Tableau III : Rendement des criblages criblage Nbre total Nbre de phages Rapport de phages liés au peptide ~~~~~~~~~~ A 42 1er criblage 2x10" 10'' 5x10 2'ème criblage 3xlO'3 2xlO"' 6xl 04 3"" criblage ~~~~~. 1014 3,5x10" ' 3x10'' La proportion de phages se liant au peptide Ass42, en ELISA, est illustrée par le Tableau IV ci-dessous : Tableau IV : Proportion de phages se liant au peptide Ass42 en ELISA Sous-banque 1 Sous-banque 2 Etat de la banque ~~~~ ~~~~~ DO 0,5 DO > 0,5 DO > 0,5 DO > 0,5 Avant criblage 3/8 0/8 3/8 0/8 Après le criblage 3/24 3/24 5/24 0/24 Après terne criblage 11/32 2/32 5/35 4/32 Après 3ième criblage 15/64 16/64 27/64 1/64 Le Tableau IV indique que la proportion de phages se liant avec une bonne affinité au peptide Ass42 augmente au cours des criblages successifs. Exemple 3 : Production de VHH solubles et analyse de la spécificité et de l'affi- nité des VHH solubles pour le peptide Ass42 1) Matériels et méthodes a) Production de VHH solubles - microculture en plaque à 96 puits Une colonie de E. coli HB2151 (Carter et al., N.A.R., 1991,19: 4133-4137) contenant le plasmide pHEN-VHH est mise en culture toute la nuit dans un puits d'une microplaque de 96 puits contenant 200 IIIde milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 ug/ml) et de glucose 1% (culture I). 3 III de la culture I sont ensuite transférés dans un puits d'une microplaque de 96 puits contenant 200 l de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 ug/ml) et de glucose 0,1% et la culture est incubée pendant 3 heures à 37 C (culture II). A la fin de cette incubation, 25 III de milieu 2YT contenant de l'IPTG 20 mM (soit 2 mM final) sont ajoutés dans les puits et la culture II est ensuite incubée toute la nuit à 30 C avec agitation. Le lendemain, la culture en plaque est centrifugée 10 min à 2500 rpm et le surnagent contenant les VHH solubles est récolté. - culture à moyenne échelle Une colonie de E. coli HB2151 (Carter et al., précité) contenant le plasmide pHEN-VHH est mise en culture dans 75 ml de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 g/ml) et de glucose 1% pendant 2 heures puis la culture est induite par l'IPTG (2mM final) pendant 4 h à 25 C et centrifugée pendant 10 min à 4000 rpm. Le culot est ensuite remis en suspension dans 1 ml de tampon 200 mM Tris HCI, pH 8. 0, 1 mM EDTA, 17,2 % sucrose (P/V) puis la suspension est incubée 30 min à 1 h sur de la glace, sous agitation, centrifugée à 13000 rpm ; à4 C, pendant 5 min et le surnageant (périplasme) contenant les VHH solubles est récolté. b) Test ELISA (cultures en microplaques) Le peptide Ass42 dilué dans du tampon PBS (1 g/ml -100 ul/puits) est distribué dans les puits d'une microplaque et la plaque est incubée une nuit à 37 C. des plaques recouvertes de BSA (1 ug/ml -100 ul/puits) sont utilisées comme contrôle. Après des lavages avec du tampon PBS contenant 0,1% Tween 20 (PBS-T), 50 ul du surnageant de culture II obtenu comme décrit ci-dessus, mélangé à 50 III de tampon PBS-T contenant 0,5 % gélatine sont ajoutées dans chaque puits et la plaque est incubée pendant 2 heures à 37 C. Après des lavages dans le même tampon que précédemment, l'anticorps murin anti-c myc 9E10 (référence sc-40, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) dilué dans du tampon PBS-T (1 ug/ml - 100 l par puits) est ajouté dans les puits et la plaque est incubée pendant 1 heure à 37 C. Après des lavages dans le même tampon que précédemment, un anticorps anti-immuno- globulines de souris couplé à la peroxydase diluée dans du tampon PBS-T (1 ug/ml - 100 l par puits ) est ajouté dans les puits et la plaque est incubée pendant 1 heure à 37 C. La réaction est révélée par addition d'O-phénylènediamine (0,2 % dans du tampon citrate 0. 1 M, pH 5. 2 contenant 0. 03 % H2O2-100 ul /puits) et incubation des plaques à température ambiante, à l'obscurité. La réaction est ensuite stoppée par addition d'HCl 3 M (50 l /puits) et l'absorbance à 492 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur automatique. Les valeurs significatives correspondent à un rapport DO (A P42)/DO (BSA) supérieur à 5. c) Test ELISA en compétition Des quantités variables du peptide Ass42 dans du tampon PBS sont incubés avec une concentration fixe de surnageant de culture contenant le VHH, pendant 2 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite transféré dans les puits d'une microplaque recouverte de peptide Ass42, dans les conditions telles que décrites ci-dessus puis la plaque est incubée pendant 30 min à température ambiante et lavée avec du tampon PBS-T et les VHHs libres (VHHs non liés au peptide AP42), présents dans le mélange réactionnel sont dosés en ELISA, selon le protocole tel que décrit ci-dessus. Pour chaque concentration , le pourcentage d'inhibition correspond à la valeur Io-Ic#/I 100 où Io et le sont les absorbances à 492 nm obtenues respectivement, en l'absence et en présence du peptide Ass42 dans le milieu réactionnel. 2) Résultats Des VHHs solubles ont été préparés selon le protocole tel que décrit ci-dessus, à partir de 4 clones positifs en ELISA, à savoir : - VHH ALZ 61 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VH-61 (SEQ ID NO: 2) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-I/VHH-61), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le.20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933. - VHH ALZ L35 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VHH-L35 (SEQ ID NO: 4) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-L35), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002., sous le numéro 1-2934. - VHH ALZ L1-3 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VH-L1-3 (SEQ ID NO: 6) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-Ll-3), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935. - VHH ALZ V31-1 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VHH-V31-1 (SEQ ID NO: 8) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-V31-1), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936. La séquence en acides aminés des VHH de ces clones (SEQ ID NO: 3,5, 7 et 9) est illustrée par la figure 3. La spécificité et l'affinité du VHH produit par ces clones pour le peptide Ass42 ont été analysées, respectivement en ELISA direct et par un test ELISA en compétition. Les résultats sont les suivants : - les clones produisent un VHH qui se lie spécifiquement au peptide A(342 (figure 4), et - les clones produisent un VHH qui présentent une affinité élevée pour le peptide Ass2 : une inhibition de respectivement 56 % et 42 % pour le VHHL35 et VHH-L1-3 est observée pour une concentration de 3. 10-8M de peptide Ass42, correspondant à une constante d'affinité (Kd) d'environ 10-8M. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Banque immune d'ADNc de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigés contre le peptide (3-amyloïde 1-42, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2937. 2 ) Fragment variable d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigé contre le peptide P-amyloïde 1-42, caractérisé en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : - la culture de la banque d'ADNc de fragments variables d'anticorps selon la revendication 1, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables, - la mise en contact desdits fragments variables avec le peptide ssamyloïde 1-42, dans des conditions permettant la liaison dudit fragment variable d'anticorps avec ledit peptide, et - l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticorps capables de se lier audit peptide. 3 ) Fragment variable d'anticorps selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 5, 7 et 9. 4 ) Anticorps ou fragment d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable selon la revendication 2 ou la revendication 3. 5 ) Molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini à la revendication 2. 6 ) Molécule d'ADNc selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 2, 4, 6 et 8. 7 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc selon la revendication 5 ou la revendication 6. 8 ) Cellule hôte procaryote ou eucaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 5 ou la revendication 6 ou un vecteur recombinant selon la revendication 7. 9 ) Cellule hôte procaryote selon la revendication 8, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933. 10 ) Cellule hôte procaryote selon la revendication 8, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2934. Il') Cellule hôte procaryote selon la revendication 8, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935. 12 ) Cellule hôte procaryote selon la revendication 8, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936. 13 ) Utilisation d'un fragment variable d'anticorps selon la revendication 2 ou la revendication 3 ou bien d'un anticorps ou un fragment d'anticorps selon la revendication 4 pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection de maladies neuroagrégatives. 14 ) Kit de diagnostic de maladies neuroagrégatives, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticorps selon la revendication 2 ou la revendication 3 ou bien un anticorps ou un fragment d'anticorps selon la revendication 4. 15 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticorps selon la revendication 2 ou la revendication 3 ou bien un anticorps ou un fragment d'anticorps selon la revendication 4, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 16 ) Utilisation d'un fragment variable d'anticorps selon la revendication 2 ou la revendication 3 ou bien d'un anticorps ou un fragment d'anticorps selon la revendication 4 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neuroagrégatives.