Brevet FR2851163A1 — publié le 20040820

Utilisation de l'énantiomère dextrogyre du milnacipran pour la préparation d'un médicament La présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter des pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la recapture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou de toxicité organique et/ou tissulaire. Plus particulièrement, le mélange d'énantiomères selon l'invention est destiné à traiter la dépression, les syndromes de fatigue chronique et l'incontinence urinaire. Le Milnacipran ( Z ()-2-(amino méthyl)-N,N-diéthyl-1-phényl cyclopropane carboxamide), molécule synthétisée au Centre de Recherche PIERRE FABRE MEDICAMENT (Castres, France), également appelé TN-912, Dalcipran, Minalcipran, Midalcipran ou Midalipran est connu comme inhibiteur double de la recapture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA). Le Milnacipran et son procédé de préparation sont décrits dans le brevet US n 4,478,836. D'autres informations relatives au Milnacipran peuvent être trouvées dans la douzième édition de l'index Merck, sous l'entrée n 6 281. Les inhibiteurs doubles de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline correspondent à une classe bien connue d'agents antidépresseurs qui inhibent de manière sélective la recapture à la fois de la sérotonine et de la noradrénaline. A titre d'exemple, la venlafaxine et la duloxétine sont également des inhibiteurs doubles de la sérotonine et de la noradrénaline. Des études ont montré que le ratio entre l'inhibition de la recapture de la noradrénaline et l'inhibition de la sérotonine par le Milnacipran est d'environ 2 :1 (Moret et al., 1985 Neuropharmacology 24(12) : 1211-1219 ; Palmier et al., 1989, Eur J Clin Pharmacol 37 : 235-238). Le brevet US4,478,836 décrit l'utilisation du Milnacipran pour le traitement de pathologies du système nerveux central, notamment de la dépression. La demande de brevet W001/26623 décrit l'utilisation du Milnacipran en association avec de la phénylalanine et de la tyrosine dans des indications telles le traitement de la fatigue, des syndromes associés à la douleur, du syndrome de fatigue chronique, de la fibromyalgie, du syndrome de l'intestin irritable. La demande de brevet WO01/62236 décrit une composition comprenant du Milnacipran en association avec un ou plusieurs agents anti-muscariniques dans un grand nombre d'indications dont la dépression. La demande W097/35574 décrit une composition pharmaceutique contenant du Milnacipran et de l'idazoxan comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour traiter la dépression et ses différentes formes, ainsi que les pathologies dans lesquelles les antidépresseurs sont utilisés. Le Milnacipran est également utilisé dans une indication de traitement de l'incontinence urinaire (FR 2 759 290). Le Milnacipran existe sous la forme de deux énantiomères optiquement actifs : l'énantiomère dextrogyre ou encore Z-(1S,2R)-2-(amino méthyl)-N,N-diéthyl-1-phényl cyclopropane carboxamide et l'énantiomère lévogyre Z-(1R, 2S)-2-(amino méthyl) -N, N-diethyl-1 -phényl cyclopropane carboxamide. Le Milnacipran sous sa forme chlorhydrate (encore appelée F2207) est actuellement commercialisé (IXEL, PIERRE FABRE MEDICAMENT, France) sous forme de mélange racémique en tant que médicament antidépresseur sérotoninergique-noradrénergique. F2695 et F2696 désignent respectivement les énantiomères dextrogyre et lévogyre du chlorhydrate de Milnacipran (F2207) : Ces deux énantiomères peuvent être séparés et isolés selon des procédés décrits dans la littérature (Bonnaud et al., 1985, Journal of Chromatography, Vol. 318 : 398- 403 ; Shuto et al., Tetrahedron letters, 1996 Vol. 37 :641-644 ; Grard et al., 2000, Electrophoresis 2000 21 : 3028-3034;Doyle et Hu, 2001, Advanced Synthesis and Catalysis, Vol. 343 : 299-302). Les inventeurs ont maintenant réalisé une étude pharmacocinétique chez l'homme du racémate et des deux énantiomères du Milnacipran qui met en #uvre des méthodes de dosage d'énantio-sélectivité. Ils ont ainsi démontré l'absence de racémisation des énantiomères in vivo. Par ailleurs, bien que le racémate ait été résolu, aucune analyse des propriétés pharmacologiques et toxicologiques des deux énantiomères n'a été réalisée, qui utilise les méthodes modernes actuellement à disposition telles les mesures cardiovasculaires par télémétrie, ou les analyses de prédictivité pharmaco-toxico-génomique in vitro. Les antidépresseurs, comme tout principe actif, peuvent générer des effets indésirables ou certaines toxicités qui découlent pour l'essentiel des propriétés pharmacologiques de ces médicaments, mais également de la posologie, de la variabilité individuelle du patient (polymorphisme génétique, insuffisance organique, sexe, âge) ou d'interactions médicamenteuses. Ainsi les antidépresseurs représentent la troisième classe de produits responsables d'intoxication, après les hypnotiques et les tranquillisants (Nores et al., 1987 Thérapie 42 : 555-558). Le risque de surdosage avec des antidépresseurs est grave puisqu'il peut conduire à la mort. Parmi les causes d'intoxications aiguës par les antidépresseurs, il convient de citer l'ingestion involontaire par les enfants (d'autant que certains antidépresseurs sont utilisés pour le traitement de l'énurésie), la tentative de suicide, le surdosage involontaire par le médecin, la co-médication associée chez la personne âgée, les modifications physiologiques et pharmacocinétiques liés à l'âge (insuffisance cardiaque, insuffisance hépatique et/ou rénale ...), un métabolisme ralenti d'origine génétique ou médicamenteuse (inhibition enzymatique). Après les enfants, la personne âgée constitue donc la seconde population à risque parmi les patients traités. Ces personnes ont des concentrations plasmatiques plus élevées, liées à une clairance rénale et/ou hépatique amoindrie, et les risques d'intoxication y sont plus graves (Meadoer-Woodruff et al., 1988 J. Clim. Psychopharmacol. 8 : 28-32). Les effets secondaires indésirables, généralement bénins, observés durant le traitement par le Milnacipran sont surtout notés durant la première voire les deux premières semaines du traitement et s'estompent par la suite, parallèlement à l'amélioration de l'épisode dépressif. Les évènements indésirables les plus communément rapportés en mono-thérapie ou lors d'association avec d'autres psychotropes sont des vertiges, une hyper-sudation, l'anxiété, des bouffées de chaleur, et de la dysurie. Certains effets indésirables moins communément rapportés sont des nausées, des vomissements, une sécheresse buccale, une constipation, des tremblements, des palpitations, une agitation, des éruptions cutanées. Il est par ailleurs connu que chez les patients présentant des antécédents cardiovasculaires ou recevant simultanément un traitement à visée cardiaque, l'incidence des effets indésirables de nature cardiovasculaire (hypertension, hypotension, hypotension orthostatique, palpitations) peut être augmentée par le Milnacipran. Chez les patients hypertendus ou atteints de cardiopathies, il est ainsi recommandé de renforcer la surveillance clinique car le Milnacipran sous forme de mélange racémique est susceptible d'augmenter la fréquence cardiaque. Ainsi, lors de rares cas de surdosage observés avec le Milnacipran (aux doses de 800 mg à 1 g) en mono-thérapie, les principaux symptômes observés sont les vomissements, les troubles respiratoires et une tachycardie (Dictionnaire Vidal, 78ème édition, 2002). Un autre effet indésirable exceptionnellement induit par le Milnacipran est une élévation élevée des transaminases pouvant traduire une certaine toxicité hépatique. De fait, les populations à risque susceptibles de développer un certain nombre de manifestations cliniques indésirables au cours ou à la suite d'un traitement par le Milnacipran, sont les enfants, les personnes âgées, les insuffisants hépatiques et/ou rénaux, les patients recevant un traitement induisant des toxicités organiques et/ou tissulaires, notamment des toxicités hépatiques et/ou rénales, les patients recevant un traitement à visée cardiaque ou induisant des effets secondaires cardiovasculaires, les patients présentant des antécédents cardiovasculaires et/ou atteints de troubles cardiovasculaires, notamment les patients présentant des troubles du rythme cardiaque, de la pression artérielle (patients hypo- ou hypertendus) ou les patients atteints de cardiopathies. Dans un souci de prévenir, toujours plus avant, la survenue d'éventuels effets secondaires susceptibles de constituer un risque, aussi minime soit-il, pour la santé des patients traités au Milnacipran, les inventeurs ont maintenant découvert de manière surprenante et inattendue que l'énantiomère dextrogyre du Milnacipran, qui présente l'essentiel de l'activité d'inhibition sélective de la re-capture de la sérotonine et de la noradrénaline, induit moins d'effets secondaires de nature cardiovasculaire et de toxicité organique et/ou tissulaire, notamment hépatique, que le mélange racémique. En particulier, les inventeurs ont découvert que l'administration chez le chien de l'énantiomère dextrogyre du Milnacipran provoque une augmentation moindre de la fréquence cardiaque et de la pression artérielle, en particulier de la pression artérielle diastolique, que celle susceptible d'être provoquée par l'administration du mélange racémique. Les inventeurs ont en outre découvert que l'énantiomère dextrogyre du Milnacipran (F2695) présente un meilleur profil toxico-génomique que l'énantiomère lévogyre (F2696) sur un modèle expérimental d'hépatocytes primaires de rat. Les inventeurs ont en outre démontré que l'énantiomère lévogyre (F2696) présente un profil toxico-génomique semblable à celui obtenu avec la Clomipramine, utilisée comme psychotrope de référence connue pour sa relative hépato-toxicité. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter des pathologies ou affections pouvant être soignées par l'inhibition double de la recapture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant les risques de toxicité organique et/ou tissulaire. On entend par troubles cardiovasculaires , des effets secondaires cardiovasculaires indésirables du médicament administré en mono-thérapie ou en association avec d'autres principes actifs. Au sens de la présente invention, on entend par effet secondaire , l'activité prévisible d'un médicament dans un domaine autre que celui pour lequel il est administré, qui peut être gênante ou indésirable lorsqu'elle limite l'utilisation du médicament. On entend par toxicité , la propriété d'un médicament d'entraîner des effets nocifs au niveau organique et/ou tissulaire, notamment au niveau des organes ou tissus impliqués dans le métabolisme du Milnacipran, notamment le métabolisme hépatique et/ou rénal du Milnacipran, et plus particulièrement lors du premier passage du Milnacipran au niveau hépatique. De préférence, la toxicité organique est la toxicité cardiaque et la dite toxicité tissulaire est la toxicité hépatique et/ou rénale. Dans le cadre de la présente invention, on entend par tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires ou tout en limitant les risques de toxicité le fait d'empêcher que ces risques n'augmentent significativement chez un patient suite à l'administration du médicament. Dans le cadre de la présente invention, énantiomère dextrogyre du Milancipran désigne l'énantiomère dextrogyre du Milnacipran, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci. De préférence, il s'agit de l'énantiomère dextrogyre du chlorhydrate de Milnacipran (F2695). Enantiomère lévogyre di Milnacipran désigne l'énantiomère lévogyre du Milnacipran, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci (F2696). Mélange racémique désigne un mélange 50 :50 poids d'énantiomère dextrogyre du Milnacipran et d'énantiomère lévogyre du Milnacipran, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables de ceux-ci. Dans le cadre de la présente invention, mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre signifie un mélange d'énantiomère dextrogyre et d'énantiomère lévogyre du Milnacipran, dans lequel le ratio massique entre l'énantiomère dextrogyre et l'énantiomère lévogyre est supérieur à 1:1. Dans le mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre, le ratio massique entre l'énantiomère dextrogyre et l'énantiomère lévogyre est avantageusement supérieur ou égal à 55 :45, avantageusement supérieur à 60 :40, plus avantageusement supérieur à 65 :35, plus avantageusement supérieur à 70 :30, plus avantageusement supérieur à 75 :25, plus avantageusement supérieur à 80:20. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le ratio massique entre l'énantiomère dextrogyre et l'énantiomère lévogyre est supérieur à 82 :18, manière plus avantageuse supérieur à 84:16, de manière encore plus avantageuse supérieur à 86 : 14, de manière encore plus avantageuse supérieur à 88 :12, manière encore plus avantageuse supérieur à 90:10. Dans un mode de réalisation préféré, le ratio massique entre l'énantiomère dextrogyre et l'énantiomère lévogyre est supérieur à 91:9, de manière plus préférée supérieur à 92 :8, manière encore plus préférée supérieur à 93 :7, de manière encore plus préférée supérieur à 94 :6, manière encore plus préférée supérieur à 95 :5, manière encore plus préférée supérieur à 96 :4, manière encore plus préférée supérieur à 97 :3, manière encore plus préférée supérieur à 98 :2, manière encore plus préférée supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5 :0,5. manière particulièrement préférée, le mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre est substantiellement pur, c'est-à-dire contenant environ 100% en poids d'énantiomère dextrogyre. Il entre également dans le cadre de la présente invention d'utiliser les métabolites, de préférence les métabolites actifs in vivo du Milnacipran, sous leur forme Z ou E, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, tels que : o le chlorhydrate de l'acide Z-phényl-1 aminométhyl-2 cyclopropane carboxylique (F1567): Masse moléculaire : 277,7 Caractéristiques : cristaux blancs Point de fusion : 230 C Chromatographie sur plaque : support : silice Solvant : Butanol/Ethanol/eau (6/2/2) Révélation : Ultra-violet et ninhydrine Rf : 0,6 o le phényl-3 méthylène-3-4 pyrrolidone-3 (F1612) : Masse moléculaire : 173,2Caractéristiques : cristaux blancs Point de fusion : 70 C Chromatographie sur plaque : support : silice Solvant : Benzène/dioxane/éthanol (90/25/4) Révélation : Ultra-violet et iode Rf : 0,46 o le chlorhydrate de Z-(para-hydroxyphényl)-l diéthylaminocarbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2782) : Masse moléculaire : 298,82Caractéristiques : cristaux blancs Point de fusion : 250 C Chromatographie sur plaque : support : silice Solvant : Butanol/Ethanol/eau (6/2/2) Révélation : Ultra-violet et iode - ninhydrine Rf : 0,42 o l'oxalate acide de Z-phényl-1-éthylamino carbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2800) : Masse moléculaire : 308,33 Caractéristiques : cristaux blancs Point de fusion: 150 C Chromatographie sur plaque : support : silice Solvant : CHC13/méthanol/NH40H (90/9/1) Révélation : Ultra-violet et ninhydrine Rf : 0,40 o le chlorhydrate de Z-phényl-1 aminocarbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2941) Masse moléculaire : 226,74 Caractéristiques : cristaux blancs Point de fusion : 245 C Chromatographie sur plaque : support : silice Solvant : CHCl3/méthanol/NH4OH (80/18/2) Révélation : Ultra-violet et ninhydrine Rf:0,30 Tout comme le Milnacipran, ces métabolites présentent un centre chiral conférant une isomérie optique à ces métabolites qui existent sous la forme d'énantiomères dextrogyre et lévogyre. Le ratio racémique des deux énantiomères du métabolite du Milnacipran dans le mélange d'énantiomères est tel que décrit précédemment pour les énantiomères du Milnacipran. La présente invention couvre donc ces métabolites actifs, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi que leur utilisation à titre de médicament pour le traitement des pathologies décrites dans le présent brevet comme par exemple la dépression, la douleur, la fibromyalgie et l'incontinence urinaire. Les métabolites selon l'invention sont sous la forme de racémate ou de préférence sous la forme d'un mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère le plus actif. De manière préférée, le métabolite actif utilisé provient de l'énantiomère F2695 et il s'agit de l'énantiomère dextrogyre du métabolite actif. De manière plus préférée, il s'agit de l'énantiomère dextrogyre du chlorhydrate de Z-(para-hydroxyphényl)-l diéthylaminocarbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2782). Par métabolite actif, on entend désigner un dérivé du Milnacipran métabolisé in vitro ou in vivo et qui présente une aptitude à inhiber la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline ;de préférence, il s'agit du F2782, F2941, F2800, F1612 et F1567. Au sens de la présente invention, les métabolites actifs in vivo décrits et revendiqués dans la présente invention, incluent tous les énantiomères, les isomères ou les tautomères lorsque le composé est capable d'être présent sous une forme énantiomérique, isomérique ou tautomérique. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères de préférence enrichi en énantiomère dextrogyre d'au moins un métabolite du Milnacipran, de préférence choisi parmi F2782, F2941, F2800, F1612, F1567, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter des pathologies ou affections pouvant être soignées par l'inhibition double de la recapture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité cardiaque, hépatique et/ou rénale. Il entre également dans la portée de la présente invention d'utiliser un mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre, de préférence l'énantiomère F2595 substantiellement pur, et d'au moins un de ses métabolites, de préférence choisi parmi F2782, F2941, F2800, F1612, F1567, enrichi de préférence en énantiomère dextrogyre, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter des pathologies ou affections pouvant être soignées par l'inhibition double de la recapture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité cardiaque, hépatique et rénale. Sel pharmaceutiquement acceptable désigne tous les sels qui conservent l'efficacité et les propriétés d'un principe actif et qui ne présentent pas d'effets secondaires. De tels sels peuvent être préparés à partir d'acides ou de bases, organiques ou minéraux. De préférence, il s'agit de sels d'acides minéraux ou organiques pharmaceutiquement acceptables. A titre d'exemples préférés, mais non limitatifs, on mentionnera les halogénohydrates, tels que chlorhydrate et le bromhydrate, le fumarate, le maléate, l'oxalate, le citrate, le méthane sulfonate, le glutamate, le tartrate, le mésylate, et leurs hydrates éventuels. Au sens de la présente invention, le terme mélange d'énantiomères signifie le mélange d'énantiomères du Milnacipran enrichi en énantiomère dextrogyre, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables , et/ou le mélange d'énantiomères d'au moins un des métabolites du Milnacipran, de préférence enrichi en énantiomère dextrogyre ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, sont administrés à tout type de patients nécessitant un tel traitement, que ce soit dans un but thérapeutique et/ou prophylactique. Dans un but thérapeutique, on vise l'éradication ou l'amélioration de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme (s) Dans un but prophylactique, on vise la prévention de l'apparition de l'affection à traiter et/ou d'un ou plusieurs symptôme (s) Néanmoins, le mélange d'énantiomères selon l'invention est plus particulièrement adapté à des populations de patients à risque qui seraient susceptibles de développer certaines manifestations cliniques indésirables au cours ou à la suite d'un traitement par le Milnacipran sous forme racémique. Il s'agit notamment des enfants, des personnes âgées, des insuffisants hépatiques et/ou rénaux, des patients recevant un traitement induisant des toxicités organiques et/ou tissulaires, hépatiques ou rénales, des patients recevant un traitement à visée cardiaque, des patients recevant un traitement induisant des effets secondaires cardiovasculaires, des patients présentant des antécédents cardiovasculaires (par exemple l'infarctus du myocarde) et/ou atteints de troubles cardiovasculaires, tels des patients présentant des troubles du rythme cardiaque (tachycardie, bradycardie, palpitations), des patients présentant des troubles de la pression artérielle (patients hypo- ou hypertendus) ou des patients atteints de cardiopathies. Parmi les multiples pathologies ou affections qui présentent comme symptôme des troubles du rythme cardiaque et pour lesquelles la présente invention est particulièrement adaptée au traitement des patients à risque qui en sont affectés, il convient de citer plus particulièrement la tachycardie qui correspond à une accélération du rythme des battements cardiaques (la tachycardie est modérée lorsque les pulsations sont de 80 à 100 par minutes, intense quand elles dépassent 100), les palpitations, les extrasystoles (sporadiques, fréquentes ou au cours de l'infarctus du myocarde), la fibrillation auriculaire, le flutter et la tachysystolie auriculaires, la bradycardie, l'insuffisance cardiaque, et l'infarctus du myocarde. Parmi les multiples pathologies qui présentent comme symptôme des troubles de la pression artérielle et pour lesquelles la présente invention est particulièrement adaptée au traitement des patients à risque qui en sont affectés, il convient de citer plus particulièrement : l'hypertension artérielle, l'hypertension artérielle maligne, l'hypertension artérielle pulmonaire, l'hypertension portale, l'hypertension paroxystique essentielle, l'hypotension, l'hypotension orthostatique, l'hypertension intra-crânienne. Avantageusement, les troubles cardiovasculaires dont les risques peuvent être limités par l'administration du mélange d'énantiomères selon l'invention, et de préférence par l'administration de l'énantiomère F2695 substantiellement pur, sont : # l'élévation de la pression artérielle diastolique et/ou systolique mesurée en millimètres de mercure (mm de Hg) ; particulièrement, il s'agit de l'augmentation de la pression cardiaque diastolique, et/ou, > des troubles du rythme cardiaque, notamment une augmentation de la fréquence cardiaque chez le patient. La pression artérielle systolique est la valeur maximale de la pression artérielle, et elle correspond au moment où on entend les premiers battements cardiaques au niveau de l'artère humérale lors de la mesure de la pression artérielle. La systole est la période de la révolution cardiaque au cours de laquelle les cavités du c#ur se contractent, entraînant ainsi l'éjection du sang. La pression artérielle diastolique est la valeur minimale de la pression artérielle, qui correspond à la disparition des bruits cardiaques au niveau de l'artère humérale lorsque l'on dégonfle le brassard tensionnel lors de la mesure de la pression artérielle. La diastole est la période de la révolution cardiaque au cours de laquelle les cavités du c#ur se remplissent de sang. L'élévation de la pression systolique et/ou diastolique implique l'élévation de la tension artérielle qui caractérise l'hypertension artérielle systémique (et ses variantes) dont les symptômes peuvent être les suivants : maux de tête, fatigue, troubles sensoriels légers tels des vertiges, des bourdonnements d'oreilles, des palpitations, un saignement de nez, de la confusion ou de la somnolence, des crampes, engourdissements ou des fourmillements dans les pieds et les mains. L'hypertension artérielle systémique (et ses variantes) peut aboutir à des complications graves, voire parfois mortelles : accidents neurologiques d'origine vasculaire, insuffisance ventriculaire gauche, insuffisance rénale, cardiopathies ischémiques (infarctus du myocarde, angor et leurs variantes). Selon les recommandations actuelles, on considère qu'un patient est affecté d'hypertension artérielle lorsque la pression artérielle est supérieure à 90 mm d'Hg pour la pression diastolique et 140 mm d'Hg pour la pression systolique. La toxicité dont les risques peuvent être limités par l'administration du mélange d'énantiomères selon l'invention est avantageusement la toxicité organique, notamment la toxicité cardiaque, et/ou la toxicité tissulaire, notamment la toxicité hépatique et/ou rénale. Cette toxicité tissulaire peut être révélée par la présence d'ictères ou par des marqueurs biologiques. Il entre également dans la portée de la présente invention d'utiliser le mélange d'énantiomères selon l'invention en médecine vétérinaire pour le traitement d'animaux, notamment d'animaux domestiques ou d'élevage nécessitant un tel traitement. De par leurs propriétés pharmacologiques, notamment d'inhibiteurs doubles de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), le mélange d'énantiomères est particulièrement utile à la préparation de médicaments destinés au traitement préventif et/ou curatif de nombreuses pathologies ou affections (syndrome) décrites ci-après tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité cardiaque hépatique et/ou rénale. Parmi ces pathologies ou affections, il convient de citer les pathologies du système nerveux central telles que définies dans The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders -IV (DSM-IV), 1995 American Psychiatrie Association . A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, il convient de citer, la dépression, notamment la dépression profonde, la dépression résistante, la dépression du sujet âgé, la dépression psychotique, la dépression induite par des traitements interféron, l'état dépressif, le syndrome maniaco-dépressif, les épisodes dépressifs saisonniers, les épisodes dépressifs liés à une condition médicale générale, les épisodes dépressifs liés à des substances agissant sur l'humeur, le syndrome bipolaire, la schizophrénie, l'anxiété généralisée, les états de morosité et de marasme, les maladies liées au stress, les attaques de panique, la phobie, notamment l'agoraphobie, les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles de la conduite, les troubles oppositionnels, les syndromes de stress posttraumatiques, la dépression du système immunitaire, la fatigue et les syndromes de douleur qui l'accompagnent, le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, et autres pathologies de nature somatique fonctionnelle, l'autisme, les pathologies caractérisées par une absence d'attention dues à des conditions médicales générales, les troubles de l'attention dus à de l'hyperactivité, les troubles des conduites alimentaires, la névrose boulimique, la névrose anorexique, l'obésité, les désordres psychotiques, l'apathie, la migraine, la douleur, et notamment la douleur chronique, le syndrome du colon irritable, les maladies cardio-vasculaires, et notamment le syndrome anxiodépressif dans l'infarctus du myocarde ou dans l'hypertension, les maladies neurodégénératives et les syndromes anxio-dépressifs associés (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson), les incontinences urinaires, notamment l'incontinence urinaire liée au stress et l'énurésie, la dépendance aux drogues, et notamment l'anxio-dépendance au tabac, notamment à la nicotine, à l'alcool, aux stupéfiants, aux drogues, aux antalgiques lors du sevrage de ces états de dépendance. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter la dépression ou l'état dépressif tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité hépatique et/ou rénale. Dans le cadre de la présente invention, on entend par dépression un ensemble de symptômes comprenant d'une part un aspect psychique constitué de troubles de l'humeur avec pessimisme, douleur morale, idées de mort et de suicide, inhibition psychique, et d'autre part un aspect physique d'inhibition motrice constitué notamment d'un ralentissement moteur, de troubles de l'appétit, de constipation, de troubles du sommeil et de la régulation du poids. La dépression correspond donc à un état psychique pathologique associant une modification pénible de l'humeur et un ralentissement de l'activité intellectuelle et motrice. On entend par état dépressif un état mental caractérisé par un fléchissement du tonus neuropsychique, se manifestant par la lassitude, la fatigabilité, le découragement et la tendance au pessimisme et s'accompagnant quelquefois d'anxiété. Egalement, la présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter la fibromyalgie et/ou le syndrome de fatigue chronique tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité hépatique et/ou rénale. Le syndrome de fibromyalgie est un syndrome chronique caractérisé par une sensation de douleur ou de brûlure avec enraidissement matinal touchant principalement les tissus fibreux articulaires et périarticulaires, et par un sentiment de fatigue profonde. La fibromyalgie comporte un ensemble de symptômes. Les plus fréquents sont un sommeil non réparateur, des maux de tête, des troubles digestifs, un état dépressif, des spasmes musculaires, des douleurs au visage, des engourdissements, etc. Le syndrome de fatigue chronique est caractérisé par un état d'épuisement ou de fatigue. Les symptômes les plus courants sont un état de faiblesse, des spasmes et/ou des douleurs musculaires, un besoin de sommeil excessif, de la fièvre, une angine, des pertes de mémoire et/ou des problèmes de concentration, des insomnies, une dépression. Egalement, la présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter douleur et notamment la douleur chronique tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité hépatique et/ou rénale. La douleur peut être associée à différentes pathologies et/ou blessures. Elle peut être aiguë ou chronique. Des études épidémiologiques ont démontré les relations existant entre des états de douleurs chroniques et les anxiodépressions. Ainsi, des patients souffrant de douleur chronique peuvent développer des problèmes émotionnels qui conduisent à une dépression, et, dans le pire des cas, à une tentative de suicide. On considère qu'un patient est atteint de douleurs chroniques s'il se plaint de souffrir depuis une période excédant six mois. Parmi les douleurs chroniques il convient de citer à titre d'exemple illustratif et non limitatif, les douleurs associées à la fibromyalgie et/ou provenant de tissus fibreux, des muscles, des tendons, des ligaments et autres sites, les douleurs abdominales et les diarrhées dans le syndrome du colon irritable, et également les douleurs du bas du dos. Egalement, la présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter les incontinences urinaires, notamment l'incontinence urinaire liée au stress et l'énurésie, tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires et/ou tout en limitant la toxicité organique et/ou tissulaire, notamment la toxicité hépatique et/ou rénale. Le traitement prophylactique et thérapeutique des pathologies ci-dessus est réalisé en délivrant à un animal, de préférence l'homme, une quantité thérapeutiquement efficace d'un mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, seul ou en association avec au moins un autre principe actif. Dans la plupart des cas, il s'agit de l'homme, mais le traitement est également adapté aux animaux, notamment aux animaux d'élevage (bétail, rongeurs, volailles, poissons,...) et aux animaux de compagnie (chiens, chats, lapins, chevaux,...). Le mélange d'énantiomères, enrichi en énantiomère dextrogyre, du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, tel que précédemment décrit, est avantageusement administré à des patients recevant simultanément, séparément ou de manière décalée dans le temps au moins un second composé actif dans le traitement des pathologies précédemment citées. De manière préférée, la présente invention a également pour objet l'utilisation comme médicament: a) dudit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) d'au moins un composé actif choisi parmi les psychotropes, notamment les anti-dépresseurs, et les agent anti-muscariniques, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention de la dépression, notamment la dépression profonde, la dépression résistante, la dépression du sujet âgé, la dépression psychotique, la dépression induite par des traitements interféron, l'état dépressif, le syndrome maniaco-dépressif, les épisodes dépressifs saisonniers, les épisodes dépressifs liés à une condition médicale générale, les épisodes dépressifs liés à des substances agissant sur l'humeur. Par psychotrope, on entend désigner une substance d'origine naturelle ou artificielle capable de modifier l'activité mentale et dont l'action essentielle s'exerce sur le système nerveux central et le psychisme. Les psychotropes sont divisés en trois groupes : 1) les psycholeptiques (hypnotiques, neuroleptiques et anxiolytiques), 2) les psychoanaleptiques (antidépresseurs et psychotoniques) et 3) les psychodysleptiques (hallucinogènes). De préférence, ledit psychotrope est un antidépresseur. A titre d'exemple non limitatif, l'antidépresseur est choisi parmi (i) les inhibiteurs de la mono-amine-oxydase (IMAO) tels que l'iproniazide, la pargyline, la sélègine, (ii) les agonistes 5HT1D tels que le sumatriptan, l'adrénaline et la noradrénaline (sympatho-mimétiques alpha et bêta) (iii) les antidépresseurs tricycliques, tels l'imipramine, la clomipramine, (iv) les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (SSRI) tel la fluoxétine, (v) les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la norépinéphrine, tels par exemple la tandamine, le fluparoxan, la mirtazapine (vi) les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la norépinéphrine, tels la venlafaxine et la duloxétine. A titre d'exemple non limitatif, l'agent anti-muscarinique est sélectionné parmi la toltérodine, la propivérine, l'oxybutynine, le trospium, la darifénacine, la témivérine, l'ipratropium. De manière préférée, la présente invention a également pour objet l'utilisation comme médicament: a) dudit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) d'au moins un autre principe actif sélectionné parmi les composés actifs induisant une toxicité organique et les composés actifs induisant une toxicité tissulaire, notamment hépatique et/ou rénale ou avec un ou plusieurs principes actifs destinés au traitement de l'insuffisance hépatique et/ou rénale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention des affections ou pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA). De manière préférée, la présente invention a également pour objet l'utilisation comme médicament: a) dudit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) d'au moins un autre principe actif sélectionné parmi les composés actifs induisant des effets secondaires cardiovasculaires et les composés à visée cardiaque, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention des affections ou pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA). Avantageusement, les effets secondaires cardiovasculaires induits sont ceux précédemment évoqués, et plus particulièrement une hypertension artérielle, une hypotension, des troubles du rythme cardiaque (tachycardie, bradycardie, palpitations). La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant les produits de combinaison précédemment décrits. Dans le cadre de la présente invention, le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, est avantageusement administré, de façon non limitative, par voie orale, voie nasale, transdermique, rectale, intestinale, parentérale, par injection intramusculaire, souscutanée ou intraveineuse, seul ou en association avec d'autres principes actifs, comme précédemment décrit. Quand ils sont administrés seuls, le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, peut être administré per se ou sous la forme d'une composition pharmaceutique dans laquelle le dit mélange d'énantiomères ou de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, est en association ou en mélange avec un ou plusieurs supports, excipients et/ou diluants pharmaceutiquement acceptables, facilitant notamment la biodisponibilité. Quand le mélange d'énantiomères selon l'invention, et de préférence l'énantiomère dextrogyre F2695 du Milnacipran substantiellement pur, est administré en association avec d'autres principes actifs, ledit mélange et les autres principes actifs peuvent être formulés en mélange ou à part sous une forme identique ou différente. Ils peuvent être administrés par la même voie ou une voie différente. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées de manières conventionnelles bien connues de l'homme de l'art en utilisant un ou plusieurs supports physiologiquement acceptables comprenant des excipients, adjuvants et des auxiliaires tels par exemple des agents conservateurs, des stabilisants, des agents de mouillage ou d'émulsification. La méthode de formulation choisie dépend de la voie d'administration désirée. Dans le cas d'une administration par injection, on utilise avantageusement une solution aqueuse, notamment une solution tampon physiologiquement acceptable, telle qu'une solution de Hank, une solution de Ringer ou une solution tampon saline physiologique. Dans le cas d'une administration transdermique ou au niveau des muqueuses, on utilise avantageusement des agents pénétrants appropriés à la muqueuse à traverser. De tels agents pénétrants sont bien connus de l'homme du métier. Dans le cas d'une administration orale, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont avantageusement administrées sous formes unitaires ou multidoses d'administration en mélange avec des supports pharmaceutiques adéquats connus de l'homme du métier. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent notamment les comprimés éventuellement sécables, les gélules, les poudres, les granulés et les solutions ou suspensions orales, les aérosols. Les formes multidoses d'administration appropriées comprennent notamment les gouttes buvables, les émulsions et les sirops. Lors de la préparation de comprimés, le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, est formulé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable tel que notamment la polyvinylpyrrolidone, le gal carbopol, le polyéthylène glycol, la gélatine, le talc, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, la gomme arabique ou leurs analogues. A titre d'exemple, le comprimé contient les excipients suivants : hydrogénophosphate de calcium déshydraté, carmellose calcique, povidone K30, silice colloïdale anhydre, stéarate de magnésium, talc. Les comprimés peuvent éventuellement être enrobés, c'est-à-dire recouverts de plusieurs couches de substances diverses telles que du saccharose, afin de faciliter la prise ou la conservation. L'enrobage peut aussi contenir des pigments ou des colorants afin de distinguer et de caractériser les comprimés en fonction de leur dosage, par exemple. Les comprimés peuvent encore présenter une formulation plus ou moins complexe destinée à modifier la vitesse de libération du principe actif. La libération du principe actif dudit comprimé peut être accélérée, ralentie ou retardée en fonction de l'absorption désirée. Le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, peut être ainsi préparé sous une forme galénique à libération prolongée obtenue selon le procédé décrit dans le brevet EP 939 626. Cette forme galénique se présente sous forme multiparticulaire réunissant une pluralité de minigranules et présente un certain profil de libération in vitro. La libération du mélange d'énantiomères selon l'invention peut être retardée et/ou contrôlée via l'utilisation d'un implant ou via une libération transcutanée, notamment sous-cutanée ou intramusculaire, via une injection intramusculaire ou via un patch transdermique. Ledit mélange est alors formulé avec notamment des substances hydrophobes ou polymériques adéquates et des résines échangeuses d'ions. La quantité à administrer au patient du mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, dépend des affections à traiter, de l'effet visé, notamment un effet thérapeutique ou prophylactique, de l'état de santé et de l'âge du patient, notamment de ses antécédents cardiovasculaires, des conditions de traitement et du mode d'administration du médicament. Les quantités efficaces thérapeutiques ou prophylactiques à administrer à un patient humain peuvent être déterminées à partir de modèles animaux ou des données, connues de l'homme du métier, lors du traitement de la dépression chez l'homme par exemple par l'utilisation d'un mélange racémique du Milnacipran. Dans le cadre du traitement prophylactique et/ou thérapeutique des pathologies citées ci-dessus, et notamment de la dépression, des états dépressifs, de la fibromyalgie, du syndrome de fatigue chronique, de la douleur, le médicament selon l'invention est avantageusement administré à des doses comprises entre 0,01 mg et 10 mg/kg de poids corporel par jour en une ou plusieurs prises, encore plus avantageusement à des doses comprises entre 0,05 mg et 5 mg/ kg de poids corporel par jour en une ou plusieurs prises, encore plus avantageusement à des doses comprises entre 0,1 mg et 1 mg/ kg de poids corporel par jour en une ou plusieurs prises. D'une manière particulièrement avantageuse, l'administration dudit médicament à des doses telles que définies ci-dessus est répartie en deux prises quotidiennes, de préférence sous forme de gélule. A titre d'exemple, le mélange d'énantiomères selon l'invention, de préférence l'énantiomère F2695 substantiellement pur, est administré sous la forme de gélule dont la teneur en principe actif est avantageusement d'environ 6,75 mg/gélule, 12,5 mg/gélule, 25 mg/gélule, 50 mg/gélule. D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront des exemples qui suivent. L'invention ne se trouve pas limitée aux exemples particuliers mentionnés à simple titre illustratif et qui doivent être lus en regard des figures suivantes : Légende des Figures Figure 1 : Effets des divers traitements sur la fréquence cardiaque après administration unique (valeurs moyennes) Figure 2 : Effets des divers traitements sur les valeurs moyennes de pressions artérielles diastoliques (moyennes sur les 6 heures suivant le dernier traitement, après 5 jours de traitement consécutifs). *** p# 0. 001 versus eau désionisée ** : p# 0.01 versus eau désionisée p : p# 0. 05 versus F2207 Figure 3 : Effets des divers traitements sur les valeurs moyennes de pressions artérielles systoliques (moyennes sur les 6 heures suivant le dernier traitement, après 5 jours de traitement consécutifs). *** p# 0.001versus eau désionisée ** : p# 0.01 versus eau désionisée p p# 0. 05 versus F2207 Figure 4 : Représentation schématique du mode de calcul de l'index de toxicité. L'index de toxicité est la somme de tous les gènes up et down-régulés (en fonction du facteur d'induction défini par l'utilisateur). Figures 5a, 5b, 5c : Test au MTT sur des hépatocytes primaires de rats. Les concentrations sont exprimées en M EXEMPLES EXEMPLE ? 1 : Etudes pharmacocinétiques du Milnacipran et de ses énantiomères Des études pharmacocinétiques du Milnacipran (F2207) et de ses énantiomères (F2695 et F2696) ont été réalisées dans différentes espèces animales et chez l'homme. Chez l'animal, la pharmacocinétique de chaque énantiomère a été étudiée suite à l'administration du racémate ou d'un seul énantiomère. Les taux plasmatiques des énantiomères F2695 et F2696 sont approximativement équivalents dans les espèces testées (singe et rat). Une étude pharmacocinétique chez l'homme comprenant 12 sujets sains a été réalisée en leur administrant le racémate ou un seul des deux énantiomères. Il ressort que le profil pharmacocinétique de chaque énantiomère est indépendant du fait qu'ils aient été administrés soit séparément soit sous forme de racémate indiquant l'absence d'interactions entre les deux énantiomères (Tableau 1). Tableau 1 : Tableau des principales variables pharmacocinétiques du Milnacipran (F2207) et de ses deux énantiomères F2695 et F2696. Cmax : Concentration plasmatique maximale estimée directement à partir des données expérimentales Tmax : Temps d'obtention de la concentration plasmatique maximale AUC0## : Aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps extrapolé à l'infini T1/2: Demi-vie terminale de décroissance des concentrations plasmatiques Dose administrée F2207 F2695 (D) F2696 (L) (mg) (50 mg) (25 mg) (25 mg) F2695 (D) F2696 (L) Cmax (nmol.l-1) 214 179 216 212 Tmax (heure) 3,42 2,87 3,08 2,21 AUC 0-> (nmol.h.l-1) 2896 1563 2869 1543 T (heures) 9,28 5,75 9,38 5,58 Ces résultats indiquent qu'aucune bioconversion des énantiomères F2695 et F2696) n'a été détectée dans les espèces analysées. EXEMPLE N 2 : Etudes biochimiques du Milnacipran et de ses énantiomères Les deux énantiomères (F2695 et F2696) du milnacipran (F2207) ont été étudiés in vitro sur les captures de noradrénaline et sérotonine ainsi que sur la liaison (binding) de la paroxétine au niveau du cerveau du rat. La présence d'un carbone asymétrique dans la structure chimique du Milnacipran a amené à réaliser une étude chirale sur cette molécule. De façon à étudier les différentes formes isomériques, les deux énantiomères, F2695 (Zd), F2696 (Zl) ont été séparés à partir du F2207 sous sa configuration racémique (Z dl), et soumis aux tests de capture de monoamines, noradrénaline et sérotonine, et de binding de la paroxétine. 2. 1. MATERIELS ET METHODES 2. 1.1. Capture de noradrénaline par un homogénat (P2) d'hypothalamus de rat. Préparation du P2 Des rats mâles, Sprague-Dawley, de 200 à 300 g sont assommés et décapités, puis l'hypothalamus prélevé rapidement. Deux hypothalami sont homogénéisés dans 4 ml de sucrose 0,32 M au Potter S par 16 allers et retours complets à 800 tours/min, puis centrifugés 10 mn à 1 000 g pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est centrifugé 20 mn à 10 000 g et le P2 ainsi obtenu repris dans 4 ml de sucrose 0,32 M et homogénéisé au Dounce. Capture ( Uptake ) On utilise de la 3H-(1)-NA : 13 Ci/mmole (Amersham). L'uptake se fait en tampon phosphate (contenant par litre : 8 g de NaCI, 1,21 g de K2HP04 et 0,34 g de KH2P04) préoxygéné 30 mn avant utilisation par un mélange O2/CO2 (95 %/ 5 %). Dans des tubes en plastique de 5 ml placés au bain marie à 37 C sont introduits : - 100 l de tampon ou inhibiteur, - 700 l de tampon (contenant de la pargyline 25 M), - 100uldeP2. Après équilibration de la température, la réaction démarre par addition de 100 l de 3H-NA, 50 nM en final. 10 mn exactement après, la réaction est stoppée par addition de 2,5 ml de tampon glacé et filtration sur filtres GF/F. Puis le tube est rincé une fois et le filtre une fois avec 2,5 ml de tampon glacé. Le filtre est ensuite introduit dans une mini-fiole Beckman et après addition de 3 ml de liquide scintillant Instagel (Packard), la radioactivité est mesurée dans un compteur à scintillation liquide Tricarb Packard. L'uptake non spécifique (NS) est mesuré en présence de DMI 10-5 M. Le pourcentage d'inhibition est calculé par la formule : (uptake total - NS) - (uptake en présence d'inhibiteur - NS) (uptake total - NS) L'IC5o est déterminée graphiquement sur la courbe moyenne des pourcentages d'inhibition (4 essais) en fonction du log de la concentration en inhibiteur. 2. 1.2. Capture de sérotonine La méthode a été réalisée d'après Gray et Whittaker (1962, J Anat., 96 : Après homogénéisation du tissu cérébral dans une solution de sucrose, les terminaisons présynaptiques se détachent de l'axone et se referment pour former des synaptosomes obtenus par fractionnement subcellulaire. Des rats mâles Sprague-Dawley (Janvier) de 180-200 g ont été utilisés. Après sacrifice de l'animal, l'hypothalamus a été prélevé, pesé, homogénéisé au Dounce dans du sucrose 0,32 M à 0 C. Cet homogénat a été centrifugé 10 mn à 1 000 g (2 400 tours/mn - Hettich, Rotenta). Le surnageant a été récupéré et centrifugé 20 mn à 10 000 g (8 000 tours/mn - Beckam, modèle J2-21 M : rotorJ14). Le culot (appelé fraction P2) a été repris dans du sucrose selon une concentration de 50 mg/ml. On a incubé pendant 5 mn à 37 C : o 350 l de tampon glacé (NaCI 136mM, KH2PO4 2,4mM, K2HP04 6,9 mM, pH 7,2) préoxygéné 30 mn avant, o 50 l de membranes (5 mg/ml final), o 50 l de citalopram (10-5 M final) pour la capture non spécifique, o 50 l de 3H-5-HT (50 nM final) (NEN, France, 28,4 Ci/mmol). Exactement 5 mn après le début de l'incubation, la réaction a été arrêtée par filtration sous vide sur filtres Whatman GF/F (prédilution avec 2,5 ml de tampon glacé puis rinçage avec 3 fois 2,5 ml). La radioactivité recueillie sur le filtre a été mesurée (Packard Tricarb 4640) par scintillation liquide avec Emulsifier-Safe (Packard). Les IC50 ont été déterminées en portant graphiquement les pourcentages d'inhibition en fonction du log de la concentration en produit (6 concentrations en duplicate). 2. 1.3. Liaison ( Binding ) de la paroxétine Des rats mâles Sprague-Dawley (Janvier ) de 180-200 g ont été utilisés. Les hypothalami de plusieurs rats ont été rassemblés et homogénéisés dans 5 ml de tampon glacé (50 mM Tris-HCL, 120 mM NaCI, 5 mM KCI, pH 7,5) au Dounce, et l'homogénat centrifugé à 30 000 g (27 000 t/mn - Beckman . L5-50E, rotor T40) pendant 10 mn. Le culot obtenu a été repris dans 5 ml de tampon et recentrifugé dans les mêmes conditions. Le nouveau culot a été repris dans le même tampon et finalement réhomogénéisé au Dounce à une concentration tissulaire de 10 mg/ml. La suspension membranaire (100 fil) a été incubée avec la 3H-paroxétine (NEN, France, 28,6 Ci/mmol) à la concentration (finale) de 0,1nM, à 20 C, dans un volume final de 1 ml pendant 2 h. Au bout des 2 h d'incubation, la réaction a été arrêtée par filtration sous vide sur filtres Whatman GF/F prétraités dans une solution de polyéthylénimine à 0,05 % 30 mn auparavant (prédilution avec 4 ml de tampon glacé puis rinçage du tube avec 2 fois 4 ml). La radioactivité a été mesurée par spectrométrie de scintillation liquide (Packard, Tricarb 4640) en utilisant l'Emulsifier-Safe (Packard) comme agent scintillant. Le binding spécifique de la 3H-paroxétine a été défini comme la différence entre le binding total et celui restant en présence de 10 M de fluoxétine. Les IC50 ont été déterminées en portant graphiquement les pourcentages d'inhibition en fonction du log de la concentration en produit (6 concentrations en duplicate). 2. 1.4. Produits utilisés F2207 : lot n 10-CTN3 Clé Pl 18 F2695 : lot n PL-I-205 F2696 : lot n PL-I-204C. 2. 2. RESULTATS Les effets du F2207 et de ses deux énantiomères sur la capture de noradrénaline et sérotonine et sur le binding de la paroxétine sont représentés sur un graphe avec en ordonnée le pourcentage d'inhibition en fonction (%) et en abscisse la concentration (M) du F2207, F2695 ou du F2696 (données non montrées). Les valeurs des pourcentages d'inhibition correspondant à chaque concentration de produit, testée en duplicate, sont les moyennes des résultats de quatre expériences indépendantes. Les valeurs des IC50 des trois produits ont été déterminées à partir de ces courbes et figurent dans le tableau 2. Tableau 2 : Inhibition des captures de 3H-noradrénaline, 3H-sérotonine et liaison (binding) de la 3H-paroxétine. IC50 (M) Liaison (binding) Composes Capture 3H-Paroxétine @ 3H-Noradrénaline 3H-Sérotonine F2695 1,5 X 10-8 4,6 X 10-8 6,0 X 10-8 F2207 3,0 X 10-8 15 X 10-8 13 X 10-8 F2696 75 X 10-8 60 X 10-8 70 X 10-8 Les trois composés sont actifs sur ces trois tests pharmacologiques, mais des différences existent : - sur la capture de noradrénaline : Le F2695 est 2 fois plus actif que le F2207. Le F2695 est 25 fois plus actif que le F2696. - sur la capture de sérotonine : Le F2695 est 3 fois plus actif que le F2207. Le F2695 est 12 fois plus actif que le F2696. - sur la liaison (binding) de la paroxétine : Le F2695 est 2 fois plus actifque le F2207. Le F2695 est 10 fois plus actif que le F2696. Les trois composés sont actifs sur ces tests pharmacologiques avec cependant une moindre activité pour la forme lévogyre (F2696) et le racémate (F2207). La forme dextrogyre du Milnacipran (F2695) est 2 à 3 fois plus active que le F2207. EXEMPLE N 3 : Activité comparative par voie orale du Milnacipran (F2207) et de son énantiomère actif (F2695) sur la fréquence cardiaque et la pression artérielle chez le chien vigile. 3. 1. INTRODUCTION Cette étude se propose d'étudier les effets du F2207 (lot n PHA343) et du F2695 (lot n PL-I-221) a) en administration unique par voie orale sur la fréquence cardiaque, et b) après traitement réitéré de 5 jours par voie orale sur les pressions artérielles systolique et diastolique chez le chien. Cette étude a été menée à équidoses pharmacologiquement actives de F2695 chez 6 chiens équipés d'implants (Data Sciences International) permettant l'acquisition de la fréquence cardiaque et des paramètres tensionnels par télémétrie. Ces animaux ont été répartis en 3 groupes de traitement : - groupe 1 (témoin) traité à l'eau désionisée, - groupe 2 traité au F2207 à la dose de 20 mg/kg/J, - groupe 3 traité au F2695 à la dose de 10 mg/kg/J. 3. 2. METHODOLOGIE Compte tenu du faible nombre d'animaux équipés à disposition, et de sorte à constituer 3 groupes de traitement de 6 animaux chacun, l'étude a été réalisée en trois séries séparées par une période de lavage et de ré-initialisation de sondes ( wash-out ). Chaque série était elle-même constituée de 2 phases comme suit : - une première phase de 5 jours durant lesquels tous les animaux ont été traités à l'eau désionisée pour une habituation à la contention et au traitement oral par sonde de gavage, - une deuxième phase de 5 jours durant lesquels les animaux ont reçu leur traitement respectif. Le schéma de traitement et le calendrier associé ont été les suivants : - le 16 septembre 2002 (J-7) : réception des animaux dans l'étude, - du 18 au 22 septembre 2002 (de J-5 à J-1) : traitement d'habituation à l'eau désionisée de l'ensemble des animaux, - du 23 au 27 septembre 2002 (de J1à J5) : 1ère série de traitement : les animaux ont reçu leur traitement respectif, - du 28 septembre au 01 octobre 2002 (de J6 à J9) : de wash-out, - du 02 au 06 octobre 2002 (de J10 à J14) : traitement d'habituation à l'eau désionisée de l'ensemble des animaux, - du 07 au 11octobre 2002 (de J15 à J 19) : 2ème série de traitement : les animaux ont reçu leur traitement respectif, - du 12 au 15 octobre 2002 (de J20 à J23) : de wash-out, - du 16 au 20 octobre 2002 (de J24 à J28) : traitement d'habituation à l'eau désionisée de l'ensemble des animaux, - du 21 au 25 octobre 2002 (de J29 à J33) : 3ème série de traitement : les animaux ont reçu leur traitement respectif. La répartition des animaux dans les différents groupes et les traitements associés sont récapitulés dans le tableau 3. Le schéma expérimental global est décrit dans le tableau 4. Tableau 3 : Tableau de répartition des chiens dans les différents groupes et traitement associé. A noter : la randomisation initiale prévoyait que chaque animal reçoive à l'occasion de chaque série, un traitement différent. Une erreur commise à J15 nous a toutefois conduit à revoir cette randomisation. L'animal portant l'identification provisoire 102 a en effet été présenté par erreur et traité au F2207, cet animal a donc reçu deux fois le traitement au F2207. Afin de conserver les mêmes effectifs par groupe de traitement, l'animal portant l'identification provisoire 103 a également reçu deux fois le même traitement, soit le F2695. Numérotation Numérotation définitive des animaux et traitement associé provisoire des 1ère série de 2ème série de 3ème série de traitement animaux traitement traitement (de J29 à J33) (deJlàJ5) (de J15 à J19) chien n 102 chien n 3 chien n 9 chien n 13 F2207 (20 mg/kg/J) F2207 (20 mg/kg/J) eau désionisée chien n 103 chien n 1 chien n 11 chien n 17 eau désionisée F2695 (10 mg/kg/J) F2695 (10 mg/kg/J) chien n 104 chien n 4 chien n 8 chien n 18 F2207 (20 mg/kg/J) eau désionisée F2695 (10 mg/kg/J) chien n 106 chien n 2 chien n 12 chien n 16 eau désionisée F2695 (10 mg/kg/J) F2207 (20 mg/kg/J) chien n 109 chien n 5 chien n 7 chien n 15 F2695 (10 mg/kg/J) eau désionisée F2207 (20 mg/kg/J) chien n 110 chien n 6 chien n 10 chien n 14 F2695 (10 mg/kg/J) F2207 (20 mg/kg/J) eau désionisée Tableau 4 : Schéma expérimental global pour l'étude par télémétrie des effets du Milnacipran et du F2695 administrés oralement pendant 5 jours chez le chien conscient. GROUPE 3 NUMERO ANIMAUX Nombre 6 6 6 Identification 1-2-7-8-13-14 3-9-10-15-16 5-6-11-12-17-18 TRAITEMENT Identification Eau désionisée F2207 F2695 Dose 20 mg/kg/J 10 mg/kg/J Voie ........................................................ orale ................................................ Volume ...................................................... 5 ml/kg ............................................. Fréquence/ Durée ................................ administration quotidienne/ 5 jours ....................... Les effets des différents traitements sur la fréquence cardiaque ont été analysés après administration unique. L'analyse a porté sur les temps d'acquisition suivants : - avant traitement unique, - toutes les 30 minutes suivant les 6 heures après traitement unique. Les effets des différents traitements sur la pression artérielle ont été analysés à l'état d'équilibre, à J5, J29 et J33 (dernier jour de traitement effectif pour chacune des séries). L'analyse a porté sur les temps d'acquisition suivants : - avant traitement, - toutes les 30 minutes suivant les 6 heures après traitement. 3. 3. RESULTATS 3. 3.1. En ce qui concerne la fréquence cardiaque, un test de Tukey a été réalisé pour chacun des 13 temps expérimentaux. Ont été ainsi objectivées, par rapport aux animaux témoins recevant l'eau désionisée (figure 1): ≈une augmentation significative de la fréquence cardiaque pour la moitié des temps d'acquisition (6/12) après administration unique de F2207 (20 mg/kg/J), particulièrement marquée une à deux heures après traitement (p# 0. 01 à 1. 5 et 2. 0 heures après traitement), suivie d'une diminution lente, mais encore présente et significative 5,5 heures après traitement (p# 0. 01). ≈une absence de toute élévation significative de la fréquence cardiaque pour la quasi totalité des temps d'acquisition (11/12), après administration unique de F2695 (10 mg/kg/J) ; une seule faible significativité statistique est observée au temps 1. 5 heures (p# 0. 05). 3. 3.2. En ce qui concerne la pression artérielle, une valeur moyenne de pression artérielle diastolique (figure 2 et tableau 5), ainsi qu'une valeur moyenne de pression artérielle systolique (figure 3 et tableau 6) ont été calculées pour chaque chien et pour les 6 heures suivant le dernier traitement, après 5 jours consécutifs d'administration. Ces valeurs moyennes de pressions ont été analysées par une ANOVA suivie d'un test de Tukey lorsque cette dernière le permettait (données non montrées). Ont ainsi été objectivés : - une augmentation significative (p# 0. 001) de la pression artérielle diastolique après administration réitérée 5 jours de F2207 (20 mg/kg/J) ou de F2695 (10 mg/kg/J) comparativement au traitement à l'eau désionisée, - une différence significative (p# 0. 05) de la valeur de pression artérielle diastolique moyennée suivant administration réitérée 5 jours de F2207 (20 mg/kg/J) comparativement à la valeur moyennée de pression artérielle diastolique suivant l'administration réitérée de F2695 (10 mg/kg/J), - aucun effet significatif au niveau de la pression artérielle systolique ; on peut toutefois remarquer que les valeurs de PAS après administration réitérée 5 jours de F2695 sont proches des valeurs de PAS suivant traitement à l'eau désionisée. Les données individuelles de pressions artérielles diastolique et systolique sont présentées dans les tableaux 5 et 6 respectivement. Tableau 5 : Données individuelles de pression artérielle diastolique PRESSION ARTERIELLE DIASTOLIQUE (PAD exprimée en mm Hg) Données individuelles après administration réitérée 5 jours consécutifs GROUPE 1 2 TRAITEMENT VEHICULE F2207 (20 mg/kg/J) F2695 (10 mg/kg/J) Animal N 1 2 7 8 13 14 Moy. e. s.m. 3 4 9 10 15 16 Moy. e. s.m. 5 6 11 12 17 18 Moy. e.s.m. Tps avant traitement 79 77 73 77 101 76 81 4 112 89 93 88 86 91 93 4 73 89 80 71 76 78 78 3 Tps après traitement (h) 0.50 84 76 70 63 80 70 74 3 103 106 96 92 88 87 95 3 91 91 99 90 108 85 94 3 1,00 82 84 77 72 72 76 77 2 130 117 113 113 90 106 112 5 112 96 75 97 87 96 94 5 1.50 102 81 79 75 82 68 81 5 131 127 137 96 100 91 114 8 109 83 88 97 87 112 96 5 2.00 83 75 71 98 77 75 80 4 123 113 99 88 107 109 107 5 115 88 93 95 84 109 97 5 2.50 85 75 75 84 85 79 81 2 137 111 116 101 115 107 115 5 111 88 97 89 92 107 97 4 3.00 91 95 99 85 79 84 89 3 121 118 112 116 106 92 111 4 104 91 96 96 100 106 99 2 3.50 83 72 78 73 77 65 75 3 120 106 133 116 103 103 114 5 96 106 94 107 77 103 97 5 4.00 81 79 75 77 82 68 77 2 133 114 105 111 110 103 113 4 125 91 99 108 80 109 102 6 4.50 82 76 91 84 113 85 89 5 135 110 126 109 104 108 115 5 103 104 92 100 85 108 99 3 5.00 97 79 67 95 81 82 84 5 116 120 98 97 97 105 106 4 126 100 92 95 110 102 104 5 5.50 94 80 70 ND 85 82 82 4 103 107 115 106 92 93 103 4 88 86 105 98 89 99 94 3 6.00 83 74 82 82 78 77 79 1 115 133 120 104 103 104 113 5 101 113 98 105 109 108 106 2 PAD moyenne 87 79 78 81 83 76 81 2 122 115 114 104 101 101 # 110 4 107 95 94 98 92 104 98 2 après traitement ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ #################### ####### ###################'####### ND : non déterminé Tableau 6 : Données individuelles de pression artérielle systolique PRESSION ARTERIELLE SYSTOLIQUE (PAS exprimée en mm Hg) Données individuelles après administration réitérée 5 jours consécutifs GROUPE 1 2 3 TRAITEMENT VEHICULE F2207 (20 mg/kg/J) F2695 (10 mg/kg/J) Animal N 1 2 7 8 13 14 Moy. e. s.m. 3 4 9 10 15 16 Moy. e. s.m. 5 6 11 12 17 18 Moy. e.s.m. Tps avant traitement 139 141 120 157 172 138 145 7 188 164 176 149 130 169 163 8 136 141 138 130 134 149 138 3 Tps après traitement (h) 0. 50 135 132 119 131 149 138 134 4 158 154 152 128 126 129 141 6 135 129 140 135 160 139 140 4 1.00 134 158 129 144 141 143 142 4 180 167 157 150 126 130 152 9 159 135 124 148 131 143 140 5 1.50 158 151 145 150 153 137 149 3 186 181 189 129 136 138 160 12 164 119 138 158 127 156 144 8 2.00 138 136 145 173 151 144 148 5 171 160 146 122 140 163 150 7 168 125 135 141 127 156 142 7 2.50 142 143 145 159 160 148 150 3 195 168 168 144 153 161 165 7 165 124 142 141 134 154 143 6 3. 00 149 167 162 163 150 154 158 3 173 177 164 157 141 146 160 6 156 131 145 144 151 157 147 4 3. 50 135 129 149 154 153 137 143 4 165 153 184 167 139 155 161 6 146 147 141 169 123 156 147 6 4. 00 142 143 149 166 164 144 151 4 180 157 151 154 150 153 158 5 180 132 145 160 124 164 151 9 4.50 137 140 159 170 190 152 158 8 184 161 180 155 145 168 166 6 158 151 138 163 131 163 151 5 5.00 150 146 127 177 160 145 151 7 161 171 146 141 139 166 154 6 182 144 137 150 162 158 156 6 5. 50 153 149 132 ND 148 144 145 4 151 154 173 152 132 155 153 5 142 127 152 153 141 153 145 4 6.00 146 144 151 176 146 143 151 5 158 192 171 154 148 172 166 7 156 170 148 159 160 166 160 3 PAS moyenne 143 145 143 160 155 144 148 3 172 166 165 146 140 153 157 5 159 136 140 152 139 155 147 après traitement ~~~~~~~ ND : non déterminé 3. 4. CONCLUSION Dans les conditions expérimentales du présent essai en administration par voie orale chez le chien vigile appareillé en télémétrie : # en administration unique et comparativement au groupe témoin, l'augmentation de la fréquence cardiaque est très faiblement significative et fugace avec le F2695 à la dose de 10 mg/kg/J, nettement significative et durable avec le F2207 à l'équidose pharmacologiquement active de 20 mg/kg/J, a le F2695, à la dose de 10 mg/kg/J, ne provoque aucune modification statistiquement significative de la pression artérielle systolique moyennée sur les 6 heures suivant le dernier traitement, à l'état d'équilibre après administration réitérée 5 jours, a une différence statistiquement significative est mise en évidence sur les valeurs de la pression artérielle diastolique moyennée sur les 6 heures suivant le dernier traitement, à l'état d'équilibre après administration réitérée 5 jours, entre l'énantiomère actif F2695 (98 2 mm Hg) et le racémique F2207 à équidoses pharmacologiquement actives (110 4 mm Hg). Ces différences témoignent clairement d'une meilleure tolérance cardiovasculaire de l'énantiomère actif F2695. EXEMPLE 4 : TEST de PREDICTIVITE PHARMACO-TOXICO-GENOMIQUE IN VITRO. 4. 1. MATERIELS ET METHODES Les composés F2695 et F2696, énantiomères de la molécule racémique F2207, ainsi qu'un produit de référence, la clomipramine (codée dans l'essai C218) ont été évalués au cours de la présente étude. Les deux énantiomères F2695 et F2696 ont été tout d'abord évalués dans un test préliminaire de cytotoxicité (test au MTT) sur des hépatocytes primaires de rat, de façon à sélectionner les trois concentrations à utiliser dans le test définitif. Après traitement d'hépatocytes primaires de rat en culture, l'ARN a été extrait de façon à générer des sondes d'ADN complémentaire marquées, qui ont été ensuite hybridées sur une membrane contenant 682 fragments d'épissage alternatif spécifiques du stress cellulaire. Des index de toxicité ont été obtenus, pour chaque produit testé, en comparant le profil d'hybridation des cellules traitées avec celui obtenu à partir de cellules non traitées. 4.1.1. Principe et but de l'étude Safe-Hit est un test de pharmaco-toxicogénomique prédictif sensible, robuste, fiable, rapide et sûr qui permet la comparaison et le classement de produits, basé sur l'évaluation optimisée de leur potentiel toxique. Safe-Hit bénéficie d'une technologie, propriété de EXONHIT (DATASTM : Differential Analysis of Iranscripts with Alternative Splicing), permettant d'isoler et, par conséquent, de cloner les évènements d'épissage résultant d'un état biologique donné, comparativement à une condition contrôle. Cela permet l'isolement d'isoformes d'ARNm, exprimées différemment en fonction de la condition biologique. Safe-Hit permet le classement des molécules au sein d'une série chimique, en fonction d'un Index Toxique, déterminé après les étapes de base suivantes (systématiquement mises en #uvre en duplicate pour chaque produit) : - traitement des lignées cellulaires avec les différents produits, à trois concentrations déduites d'un test préalable de toxicologie cellulaire (test MTT) : une concentration de référence correspondant à 80% de viabilité cellulaire, une concentration 10 fois supérieure - quand cela est possible - et une concentration 10 fois inférieure, - préparation de l'ARN total et des sondes radiomarquées de cADN correspondantes, - hybridation des sondes de cADN : Safe-Hit macro-array contenant 682 clones indépendants, correspondant à des modifications d'épissage induites par la surexpression de WTp53 (p53 est le médiateur le plus ubiquitaire du stress cellulaire choisi pour le développement de cette méthodologie), - acquisition et détermination de l'Index de Toxicité. 4. 1.2. Cellules Les cellules utilisées pour l'étude (test MTT préalable de cytotoxicité et test principal) sont des hépatocytes cryopréservés de rat Sprague-Dawley en primoculture (lots Hep 184005 et Hep 184006 - Biopredic), cultivés en conditions standard. 4.1.2.1 Milieux de culture - milieu de décongélation : milieu de Leibovitz 15 avec glutamax 1, additionné de 100 IU/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine et 0,6 M de glucose (lot MIL 210009-Biopredic), - milieu d'ensemencement : milieu de Williams E avec glutamax 1, additionné de 100 IU/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine, 4 ug/ml d'insuline bovine et 10 % v/v de sérum de veau f#tal (lot MIL 260005) - Biopredic), milieu d'incubation : milieu de Williams E avec glutamax 1, additionné de 100 IU/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine, 4 ug/ml d'insuline bovine et 50 M d'hémisuccinate d'hydrocortisone (lot MIL 260009-260007 - Biopredic). 4.1.2.2 Conditions de culture 37 C, atmosphère C02 (5%), hygrométrie relative (95%). 4.1.2.3 Procédé de culture Test de toxicité cellulaire Etude principale Cellules ensemencées le jour du traitement Densité d'ensemencement 35 000 cellules/ puits 1,5 million de cellules (plaque 96 puits) par plaque de 30 mm Volume de milieu 0,1 ml 3 ml 4. 1.3. Test de cytotoxicité Ce test de cytotoxicité (test MTT) détecte les cellules vivantes grâce à une réaction colorimétrique qui révèle l'intégrité de la respiration cellulaire impliquant l'activité des mitochondries. Le MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide), soluble dans l'eau, est transformé par clivage, sous l'action d'une enzyme mitochondriale des cellules vivantes, en un formazan pourpre insoluble. Le formazan est solubilisé dans un solvant organique et la solution obtenue peut être mesurée par spectrophotométrie. L'absorbance mesurée est proportionnelle au nombre de cellules survivantes. Les cellules sont mises en contact pendant 16 heures avec le produit à tester à 5 concentrations différentes (0 - 1- 10 - 25 - 50 et 100 M). Après cette phase d'exposition, une solution de MTT (0,5 mg/ml dans le milieu d'incubation des hépatocytes primaires) est ajoutée pendant 3 heures. Après solubilisation des cristaux de formazan, les plaques multi puits sont lues par un spectrophotomètre à 500 nm afin de déterminer le pourcentage de viabilité cellulaire. 4. 1.4 Etude principale de pharmaco-toxicogénomique L'étude principale est réalisée en duplicate, à partir des cultures ensemencées et exposées à chaque produit, afin d'accroître la cohérence entre les expériences et valider les résultats obtenus. 4.1.4.1 Ensemencements cellulaires et traitement Les cellules sont ensemencées et cultivées pendant 16 heures avec chaque produit, aux trois concentrations choisies à partir du test préalable MTT ; contrôles (cellules non traitées, solvant seul) sont ajoutés pour la série. 4.1.4.2 Extraction de l'ARN total et dosage Après traitement, l'ARN est extrait et analysé comme suit : - recueil des cellules et centrifugation, - extraction réalisée avec un réactif phénol prêt-à l'emploi (Trizol - lot 1106266 et 1121067 - Invitrogen) suivant le protocole du fabricant, - solubilisation de l'ARN dans l'eau, - dosage de l'ARN en spectrophotométrie (densité optique mesurée à 260,280 et 300 nm), - vérification de la qualité de l'ARN par Agilent. 4.1.4.3 Préparation des sondes d'ADNc Les sondes d'ADNc sont préparées par transcription inversée radioactive (alpha dATP 33P - Amersham). La quantification d'ADNc radioactif (Instant Imager - Packard) est réalisée pour confirmer l'activité des sondes. 4.1.4.4 Hybridation sur membrane Safe-Hit Sur les membranes Safe-Hit en nylon prédécoupé (Q-BIOgene) sont déposés en double 682 clones DATAS (motifs d'épissage alternatif), à l'aide d'un appareillage de QPix (GENETIX). Les sondes d'ADN sont hybridées durant la nuit sur les membranes, puis celles-ci sont lavées. 4.1.1.5. Préparation des sondes d'ADNc : - matrice : 5 g d'ARN total (pour chaque série de traitement et pour chaque concentration), - amorce : 100 ng d'oligonucléotide oligo-dTV, pour la 1ère et 2ème hybridation sur le rat (lot 12. 00, Invitrogen), mélange principal : 10 l de tampon First Strand 5x Premier (lot 1131226 - Invitrogen) 1 l dCTP+dGTP+dTTP 20 mM (lot 1105201 - Invitrogen) 1 M d'ATP 120 M (lot 1105201 - Invitrogen) 5 l Dithiotréitol (DTT) 0,1 M (lot 133609 - Invitrogen) 1 (il RNase Out 40 U (lot 1113345 - Invitrogen) 5 l d'a 33P dATP 3 OOOCi/mmol 10 mCi/ l (lot B0239 - Amersham) 4 l Superscript II (lot 1137806 - Invitrogen) 1 l de glycogène (lot 1129328 - Invitrogen) - procédure : incuber l'ARN et l'oligo-dTV à 70 C pendant 10 minutes puis mettre dans la glace. Ajouter 27 l de MasterMix puis incuber à 43 C / lh puis à 50 C / 15 minutes. Ajouter 20 l d'eau, puis 20 l d'EDTA 50 mM, puis 4 l de NaOH ION. Incuber 20 minutes à 65 C puis mettre dans la glace. Quantification : Instant Imager, Packard : 1 l de mélange réactionnel, ajouter 8 l d'acide acétique, 100 l d'isopropanol et 1 l de glycogène (20 g/ l). Incuber à -20 C pendant 20 minutes, centrifuger 20 minutes à 13000 t/mn à 4 C. Remettre en suspension dans 200 l d'eau, quantification : Instant Imager, Packard : 1 l de mélange réactionnel. - Milieux et tampons Solutions communes : Tampon de lavage 1 : 20X SSC (Invitrogen) 2X SSC 50X Denhardt's 50 % (w/v) Sulfate de Dextran (ICN) 20 % SDS (v/v)(Quantum biotech. ) 10 mg/ml ADN de sperme de saumon (Q-Biogene) Tampon de pré-hybridation : Tampon de lavage 2 : 6X SSC 2X SSC lOX Denhardt's 0,1 % SDS 10 % Sulfate de Dextran 0,5 % SDS H20 Tampon d'hybridation: Tampon de lavage 3 : 5X SSC 0,5X SSC 5X Denhardt's 0,1 % SDS 0.1 % SDS H20 Tampon de lavage 4 : IX SSC 0,1 % SDS Pré-Hybridation: Aliquoter 5ml de tampon de pré-hybridation dans les tubes d'hybridation, ajouter le volume correspondant d'ADN de sperme de saumon pour une concentration finale de 100 g/ml, imbiber les membranes de 5X SSC, placer la membrane dans le tube d'hybridation et pré-hybrider 2 heures à 65 C. Hybridation : Eliminer le tampon de pré-hybridation et rincer avec 10-2 0ml de 5X SSC, éliminer le 5 X SSC, remplacer par 5ml de tampon + ADN de sperme de saumon, dénaturer les sondes RT par 5 mn à 95 C, puis placer sur la glace / 1 minute, centrifuger pour reconstitution, puis récupérer le volume approprié de sondes RT dénaturées dans le tube (100. 000 à 200.000 cpm/ml), incuber une nuit à 55 C. - Lavage : Rincer les membranes avec 10-20 ml de tampon de lavage 1, éliminer le tampon et le remplacer par 50 ml de tampon de lavage 2, incuber 30 mn à 55 C, puis éliminer et remplacer en lavant avec le tampon 4, incuber 30mn à 55 C, puis décanter le lavage final, ôter les membranes des tubes, placer sur une cassette et laissez l'acquisition se faire pendant 3 heures. 4.1.4.5 Acquisition et Analyse d'image Les membranes sont placées sur un écran (FX Imaging ScreenK - Bio- rad) pendant 3 heures. Le film est ensuite lu en utilisant un Personal Molecular Imager FX (Bio-rad). L'analyse d'image est réalisée en employant le Safe-Hit Reader Software (COSE). 4.1.4.6 Calcul de l'Index de Toxicité Toutes les données sont transférées dans un programme de calcul automatique qui normalise les différentes membranes et calcule un Index de Toxicité = somme du nombre de gènes up-régulés et down-régulés par un composé donné à une concentration donnée, comparativement aux résultats des contrôles non traités. Les résultats des deux analyses Safe-Hit sont alors comparés et combinés pour évaluer la toxicité potentielle des divers composés testés. Deux paramètres modifiables par l'utilisateur sont impliqués dans le calcul d'Index de Toxicité: # le Background Threshold (BT) lisse les signaux faibles, proches du bruit de fond et non attribuables à une expression significative de gène. Il détermine donc le seuil de détection ; # le Facteur d'Induction (IF) est déterminé comme étant le facteur multiplicateur, versus les échantillons de contrôle, pour que les clones soient up ou down régulés. La valeur de ce paramètre est généralement 2 ou au dessous de 2 pour obtenir des résultats relevants. L'augmentation progressive de la valeur de l'IF sélectionne les clones qui sont de plus en plus fortement up ou down régulés. Le procédé de calcul de l'Index de Toxicité a été développé par comparaison des profils de référence (R : cellules non traitées) avec un profil expérimental (E) et suit les étapes suivantes (voir figure 4) pour une vue schématique du procédé) : - transformation de toutes les valeurs obtenues en valeurs log, - calcul de la moyenne des valeurs log pour chacun des essais dupliqués (M1R et M1E), - établissement d'une matrice avec MiR - M,E pour tous les signaux (= Di), - normalisation des MiE individuelles en soustrayant à M,E la médiane des 14 valeurs proximales de Di (= NMiE), - comparaison des valeurs normalisées avec les valeurs référence (C, = NMiE - MIR), - transformation exponentielle de C, (= Fi), - comparaison de Fi avec le Facteur d'Induction choisi par l'utilisateur : # si F, >IF, le gène est considéré comme up-régulé, # si 1/IF 4. 2. RESULTATS DU TEST AU MTT Ces tests ont été réalisés en triplicate sur des hépatocytes primaires de rat exposés pendant 16 heures. La clomipramine, référencée C218, présente une toxicité importante à 100 M puisqu'aucune viabilité n'est observée après exposition des cellules pendant 16 heures. En revanche, aucune toxicité n'est observée à 25 M. A 50 M, la viabilité supérieure à 80% est tout à fait compatible avec une étude pharmaco-toxicogénomique. Les composés F2695 et F2696 ne présentent aucune cytotoxicité dans ce test, même à la concentration de 100 M. Pour réaliser les évaluations pharmaco-toxicogénomiques , 3 concentrations d'un même composé sont utilisées : la concentration qui permet d'obtenir 80% de viabilité (C), ainsi que les concentrations qui correspondent à (C)x10 et à (C)/10. De façon à comparer la capacité de F2695 et F2696 à produire un score dans le test mis en #uvre, les mêmes concentrations ont été utilisées pour chacun d'entre eux : 1 M, 10 M et 100 M. Dans le cas de la clomipramine, les concentrations de 1 M, 10 M et 50 M ont été utilisées. Voir les figures 5a, 5b et 5c. 4. 3 RESULTATS SUR HEPATOCYTES PRIMAIRES DE RAT Les Index de toxicité (IT) ont été déterminés comme décrit ci-dessus. Dans ces index, n'ont été pris en compte que les clones qui ont été trouvés modulés par rapport aux contrôles dans les deux expériences indépendantes, ne considérant que les clones dont le signal est 2 fois supérieur au bruit de fond (BT). Deux analyses différentes ont été réalisées en prenant deux niveaux de différence (Facteur d'Induction - IF) par rapport à la situation non traitée : - au moins 1,7 fois par rapport à la situation non traitée. Ce facteur de 1,7 fois représente la valeur la plus faible qui permet de ne pas obtenir d'index lors de la comparaison de deux situations non traitées. - au moins 2 fois par rapport à la situation non traitée. Ce facteur de 2 fois permet de prendre en compte les signaux les plus robustes. 4. 3.1. Facteur d'induction de 1,7 par rapport à la situation non traitée (tableau 7) Tableau 7: Clones up- et down-régulés avec des hépatocytes primaires de rat (Facteur d'Induction = 1,7 fois) F2695 F2695 F2695- F2696 F2696 F2696 C 218- C 218- C 218- -1 M - 100 M -1 M - - 1 M 10 M 100 M 10 M 10 M 100 M Up >1,7 Up 1 15 2 2 13 Down Down 1 2 5 7 7 13 15 8 TI 2 2 5 22 9 15 28 Pos nb U nb D Gene A09 3 2,90 2,23 2,14 H. sapiens mitochondrion, 12S A20 1 0,56 H. sapiens initiation factor elF-5A gène B20 2 0,14 0,27 H. sapiens chromosome 19, BAC CIT-B-191n6 B22 2 0,17 0,32 H. sapiens Genomic séquence from 17 COI 4 3,20 1,93 1,82 1,91 #H. sapiens mitochondrion, 16S E01 1 1,73 H. sapiens mRNA for lipocortin II E05 2 0,22 0,35 H. sapiens DNA sequence from clone 740A11 on chromosome Xq22.2-23. Contains part of the COL4A5 gene for Collagen Alpha 5 (IV) Chain Precursor. Contains GSS1, complète séquence E11 1 2,12 #H. sapiens chlordecone reductase homolog liver, mRNA E19 1 1,72 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 E21 2 0,56 0,58 H. sapiens ribosomal protein S14 gène F24 1 0,52 H. sapiens LIM homeobox protein cofactor (CLIM-1 ) mRNA GO 1 2,04 H. sapiens estrogen receptor-related protein (variant ER from breast cancer) mRNA G05 1 2,02 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 G09 2 2,09 1,76 H. sapiens mitochondrion, cytochrome b l0l 1 2,05 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 118 2 2,38 1,88 H. sapiens 18S rRNA gene Lol 1 2,05 H. sapiens divalent cation tolerant protein CUTA mRNA L22 1 1,78 H. sapiens mRNA for Lon protease-like protein L23 1 1,75 #H. sapiens cDNA NIH~MGC~16 clone IMAGE :3350241 5',mRNA séquence M07 2 2,25 1,75 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 M12 3 0,21 0,16 0,39 H. sapiens mRNA; cDNA DKFZp564C 1563 M23 1 1,95 Séquence 21 from patent US 5851764 P05 1 1,78 H. sapiens PAC clone DJ404K21 from Xq23 Q11 2 1,81 1,92 unk Q24 1 1,77 H. sapiens 28S ribosomal RNA gène SOI 2,98 Mus muculus TCR beta locus T08 6 0,50 0,22 0,20 0,35 0,14 0,22 H. sapiens mRNA for KIAA1185 protein U04 6 0,57 0,26 0,19 0,48 0,22 0,37 H. sapiens translation initiation factor elF-2alpha mRNA V22 H. sapiens mRNA for elongation factor 1 -alpha (clone CEF4) W 17 1 2,96 H. sapiens mitochondrion, hypoxia inducible gène- 14 X02 5 0,29 0,20 0,36 0,24 0,31 unk X05 2 0,15 0,24 H. sapiens microsomal epoxide hydrolase (EPHX) gène X06 5 0,2 0,16 0,23 0,15 0,23 H. sapiens Genomic séquence from 9q34 X23 1 1,92 #unk Y17 1 2,65 H. sapiens 28S ribosomal RNA gène Z13 3 0,34 0,29 0,27 unk Z20 1 0,57 Homo sapiens cDNA wc44hO9,xl NCI~CGAP~Pr28 clone IMAGE:2321537 3' similar to SW:RB24~Mouse P35290 RAS~RELATED PROTEIN RAB-24;, mRNA séquence AA11 3 0,38 0,27 0,31 H. sapiens Repeat sequence AluJb fragment inserted into a cDNA coding or an unknown protein #AA13# 1 1,79 H. sapiens 18S rRNA gène #AC13 5 0,22 0,16 0,28 #0,16 0,28 #H. sapiens 7S RNA L gène Les index de toxicité suivants ont été obtenus : F2695 Index de Toxicité 1 M 0 10 M 0 100 M 17 F2696 Index de Toxicité 1 M 2 10 M 5 100 M 22 C218 Index de Toxicité 1 M 9 10 M 15 50 M 28 Le classement suivant peut donc être établi, du plus toxique au moins toxique C218 (clomipramine) > F2696 > F2695. La clomipramine, molécule de référence codée dans le présent essai C218, montre une augmentation des signatures en relation avec les concentrations testées : respectivement 9,15 et 28 signatures aux concentrations de 1,10 et 50 uM (concentration maximale définie dans le test préalable de cytotoxicité). Fort logiquement, la totalité des signatures survenant aux concentrations faible et moyenne est retrouvée aux concentrations supérieures. Aux concentrations de 1 et 10 M, le F2695 n'induit aucune signature sur les 682 possibles signatures de stress testées dans le présent essai. A la concentration la plus élevée de 100 M, seules sont identifiées deux signatures, dont une commune avec le C218 mais de signification inconnue. Le F2696 montre une augmentation des signatures en relation avec les concentrations testées : respectivement 2,5 et 22 signatures aux concentrations de 1,10 et 100 M. La totalité des signatures survenant aux concentrations faible et moyenne est retrouvée aux concentrations supérieures. Aucune des 22 signatures n'est commune avec le F2695. En revanche, les signatures qui apparaissent aux concentrations faible et moyenne (5 dont les 2 présentes dès la faible concentration), font toutes les 5 partie des 9 signatures objectivées pour la clomipramine dès la faible dose de 1 M. A la forte concentration de 100 M, 10/26 signatures du F2696 sont retrouvées parmi les 28 identifiées avec la clomipramine à 50 uM. Sur le plan qualitatif, est à souligner pour le F2696 et la clomipramine l'impact sur les transcrits mitochondriaux, notamment au niveau de la Coxl et du cytochrome b. Ces signatures ne sont pas présentes avec le F2695 (positions G05/G09/101). 4. 3.2. Facteur d'induction de 2 par rapport à la situation non traitée (tableau 8) Tableau 8 : Clones up- et down-régulés avec des hépatocytes primaires de rat (Facteur d'Induction = 2 fois) F2695- F2695- F2695- F2696- F2696- F2696- C 218-#C 218- C 218- 1 M 10 M 100 M 1 M 10 M 100 M 1 M 10 M 100 M Up >1,7 Up 10 1 1 4 Down Down 5 6 7 12 12 TI 5 16 8 13 16 Pos nb U nb D Gene A09 3 2,90 2,23 2,14 H. sapiens mitochondrion, 12S B20 2 0,14 0,27 H. sapiens chromosome 19, BAC CIT-B-191n6 B22 2 0,17 0,32 H. sapiens Genomic séquence from 17 COI 3,20 H. sapiens mitochondrion, 16S E05 2 0,22 0,35 H. sapiens DNA sequence from clone 740A1 on chromosome Xq22.2-23. Contains part of the COL4A5 gene for Collagen Alpha 5 (IV) Chain Precursor. Contains GSS1, complet séquence E11 1 2,12 H. sapiens chlordecone reductase homolog liver, mRNA GO1 1 2,04 H. sapiens estrogen receptor-related protein (variant ER from breast cancer) mRNA G05 1 2,02 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 G09 1 2,09 H. sapiens mitochondrion, cytochrome b I0l 1 2,05 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 118 1 2,38 H. sapiens 18S rRNA gene J03 1 2,12 H. sapiens CLP mRNA L01 1 2,05 H. sapiens divalent cation tolerant protein CUTA mRNA M07 1 2,25 H. sapiens mitochondrion, cytochrome c oxidase subunit 1 M12 3 0,21 0,16 0,39 H. sapiens mRNA; cDNA DKFZp564C 1563 SO1 1 2,98 Mus muculus TCR beta locus T08 5 0,22 0,20 0,35 #0,14 0,22 #H. sapiens mRNA for KIAA 1185 protein U04 5 0,26 0,19 0,48 0,22 0,37 H. sapiens translation initiation factor elF-2alpha mRNA W17 1 2,96 H. sapiens mitochondrion, hypoxia inducible gène- 14 X02 5 0,29 0,20 0,36 0,24 0,31 unk X05 2 0,15 0,24 H. sapiens microsomal epoxide hydrolase (EPHX) gène X06 5 0,20 0,16 0,23 0,15 0,23 H. sapiens Genomic séquence from 9q34 Y17 1 2,65 H. sapiens 28S ribosomal RNA gène Z13 3 0,34 0,29 0,27 unk AA11 3 0,38 0,27 0,31 H. sapiens Repeat sequence AluJb fragment inserted into a cDNA coding for an unknown protein AC13# 5 0,22 0,16 0,28 0,16 0,28 #H. sapiens 7S RNA L gène Les index suivants ont été obtenus : F2695 Index de Toxicité 1 M 0 10 M 0 100 M 0 C218 Index de Toxicité 1 M 8 10 M 13 50 M 16 F2696 Index de Toxicité 1 M 0 10 M 5 100 M 16 Selon ces paramètres, le classement suivant peut être proposé, du plus toxique au moins toxique : C218 (clomipramine) > F2696 > F2695. En considérant les clones sur- ou sous-exprimés d'un facteur 2, le F2695 n'induit aucune signature, même à la concentration de 100 M. L'effet de la concentration sur l'apparition des signatures se confirme par la disparition des signatures de faible intensité pour le F2696 à 1 M, présentes dans l'analyse précédente avec un facteur d'induction de 1,7. Sur le plan qualitatif, l'impact du F2696 et de la clomipramine sur la Coxl et le cytochrome b est également confirmé (positions G05/G09/I01). Le F2695, énantiomère pharmacologiquement actif du F2207, est dépourvu d'impact significatif dans ce test, alors que la clomipramine est utilisée comme produit de référence témoin positif. En revanche, le F2696, énantiomère inactif du F2207 présente un profil de signatures quantitativement et qualitativement proche de la clomipramine, et ne présente aucune signature commune avec le F2695. Tout ceci témoigne d'un meilleur profil toxicogénomique pour l'énantiomère actif F2695 dont, sur ce modèle expérimental, le coefficient de sécurité est très significativement meilleur que pour le F2696. 4. 4 CONCLUSION Les études pharmaco-toxicogénomiques réalisées sur les molécules F2695 et F2696, énantiomères du F2207 (aux concentrations de 10,50 et 100 M), et C218 (clomipramine, aux concentrations de 1,10 et 50 M), à partir d'hépatocytes de rat en primoculture, ont permis d'obtenir des signatures de stress et des index de toxicité concentration-dépendants. Ces études confirment la capacité du test pharmacotoxicogénomique à révéler des signatures de stress dans des conditions de traitement (concentrations, durée de traitement) qui ne provoquent aucune toxicité dans un test classique de viabilité tel que le MTT. Plusieurs faits marquants se dégagent de cette étude : # sur ce modèle d'hépatocytes primaires de rat, seul le F2695, énantiomère pharmacologiquement actif du F2207, n'induit pas d'index de toxicité significatif ; a le F2696, énantiomère inactif du F2207, et la clomipramine, psychotrope de référence, induisent des index importants formés de signatures de stress communes ou très proches. Dans ce système, la clomipramine, molécule de référence produit positif, est le produit induisant le plus de signatures de stress, des index significatifs étant obtenus dès les concentrations les plus faibles. A ce titre, il est intéressant de mentionner que la clomipramine peut induire un certain nombre d'effets indésirables chez l'homme tels par exemple la tachycardie, l'hypotension orthostatique, des troubles de la conduction ou du rythme, et exceptionnellement des hépatites. En cas de surdosage accidentel à la clomipramine, on peut observer entre autres des syncopes, des troubles hématologiques, des manifestations cardiovasculaires sévères. Sans préjuger d'une identité de mécanisme physiopathologique, il est intéressant de noter que F2696 présente des signatures de stress communes ou très proches de celles de la clomipramine et induit également des effets indésirables tels que les troubles cardiovasculaires précédemment décrits. Il est ainsi légitime d'avancer que les signatures observées sont indépendantes de tout profil antidépresseur ou plus largement psychotrope. Elles doivent bien en revanche être considérées comme des signatures de stress (le F2696 provoque en particulier une diminution d'expression d'un gène impliqué dans la synthèse protéique et d'un facteur d'initiation de translation). Tout ceci témoigne d'un meilleur profil toxicogénomique pour l'énantiomère actif F2695 dont, sur ce modèle expérimental, le coefficient de sécurité est très significativement meilleur que pour le F2696. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un mélange d'énantiomères du Milnacipran (Z()-2-(amino méthyl)-N,N-diéthyl-1-phénylcyclopropanecarboxamide) et/ou d'au moins un de ses métabolites, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, ledit mélange étant enrichi en énantiomère dextrogyre, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou traiter des affections ou pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA), tout en limitant les risques de troubles cardiovasculaires. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les troubles cardiovasculaires correspondent à une élévation de la pression artérielle et/ou une augmentation de la fréquence cardiaque. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'élévation de la pression artérielle correspond à une élévation de la pression artérielle diastolique. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, tout en limitant en outre les risques de toxicité organique et/ou tissulaire. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la dite toxicité organique est la toxicité cardiaque et la dite toxicité tissulaire est la toxicité hépatique et/ou rénale. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le dit énantiomère dextrogyre du Milnacipran est le chlorhydrate de Z- (1 S,2R)-2-(aminométhyl)-N,N-diéthyl- 1 -phényleyclopropanecarboxamide (F2695). 7. Utilisation l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le dit métabolite est sélectionné parmi : o le chlorhydrate de l'acide Z-phényl-l-aminométhyl-2-cyclopropane carboxylique (F 1567), o le phényl-3 méthylène-3-4-pyrrolidone-3 (F1612), o le chlorhydrate de Z-(para-hydroxyphényl)-l diéthylaminocarbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2782), o l'oxalate acide de Z-phényl-1-éthylamino carbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2800), et o le chlorhydrate de Z-phényl-1 aminocarbonyl-1 aminométhyl-2 cyclopropane (F2941). 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le dit métabolite est le chlorhydrate de Z-(para-hydroxyphényl)-l-diéthylaminocarbonyl-l aminométhyl-2-cyclopropane (F2782). 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le ratio massique entre l'énantiomère dextrogyre et l'énantiomère lévogyre dans le dit mélange est supérieur à 95 :5 lévogyre) , de préférence supérieur à 99:1, de manière encore plus préférée supérieur à 99,5:0,5. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en chlorhydrate de Z-(l S,2R)-2-(aminométhyl)-N,N-diéthyl-1-phénylcyclo propanecarboxamide (F2695). 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce le dit mélange d'énantiomères est substantiellement pur en chlorhydrate de Z- (para-hydroxyphényl)-1-diéthylaminocarbonyl-1-aminométhyl-2-cyclopropane (F2782). 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le médicament est destiné à traiter ou prévenir une pathologie ou affection sélectionnée dans le groupe composé de la dépression, notamment la dépression profonde, la dépression résistante, la dépression du sujet âgé , la dépression psychotique, la dépression induite par des traitements interféron, l'état dépressif, le syndrome maniaco-dépressif, les épisodes dépressifs saisonniers, les épisodes dépressifs liés à une condition médicale générale, les épisodes dépressifs liés à des substances agissant sur l'humeur, le syndrome bipolaire, la schizophrénie, l'anxiété généralisée, les états de morosité et de marasme, les maladies liées au stress, les attaques de panique, la phobie, notamment l'agoraphobie, les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles de la conduite, les troubles oppositionnels, les syndromes de stress post-traumatiques, la dépression du système immunitaire, la fatigue et les syndromes de douleur qui l'accompagnent, le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, et autres pathologies de nature somatique fonctionnelle, l'autisme, les pathologies caractérisées par une absence d'attention dues à des conditions médicales générales, les troubles de l'attention dus à de l'hyperactivité, les troubles des conduites alimentaires, la névrose boulimique, la névrose anorexique, l'obésité, les désordres psychotiques, l'apathie, la migraine, la douleur, et notamment la douleur chronique, le syndrome du colon irritable, les maladies cardio- vasculaires, et notamment le syndrome anxio-dépressif dans l'infarctus du myocarde ou dans l'hypertension, les maladies neuro-dégénératives et les syndromes anxio-dépressifs associés (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson), les incontinences urinaires, notamment l'incontinence urinaire liée au stress et l'énurésie, la dépendance aux drogues, et notamment l'anxio-dépendance au tabac, à l'alcool, aux stupéfiants, aux drogues, aux antalgiques lors du sevrage de ces états de dépendance. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la dite pathologie est sélectionnée dans le groupe composé de la dépression, notamment la dépression profonde, la dépression résistante, la dépression du sujet âgé, la dépression psychotique, la dépression induite par des traitements interféron, l'état dépressif, le syndrome maniaco-dépressif, les épisodes dépressifs saisonniers, les épisodes dépressifs liés à une condition médicale générale, les épisodes dépressifs liés à des substances agissant sur l'humeur. 14. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la dite pathologie est sélectionnée dans le groupe composé de la fatigue et les syndromes de douleur qui l'accompagnent, le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, et autres pathologies de nature somatique fonctionnelle. 15. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la dite pathologie est sélectionnée dans le groupe composé des incontinences urinaires, notamment l'incontinence urinaire liée au stress et l'énurésie. 16. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que la dite affection est sélectionnée parmi la dépendance aux drogues, et notamment l'anxio- dépendance au tabac, à l'alcool, aux stupéfiants, aux drogues, aux antalgiques lors du sevrage de ces états de dépendance. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, chez des patients choisis parmi les enfants, les personnes âgées, les insuffisants hépatiques et/ou rénaux, les patients recevant un traitement induisant des toxicités organiques et/ou tissulaires hépatique ou rénale, les patients recevant un traitement à visée cardiaque, les patients recevant un traitement induisant des effets secondaires cardiovasculaires, les patients présentant des antécédents cardiovasculaires et/ou atteints de troubles cardiovasculaires. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les antécédents cardiovasculaires et/ou troubles cardiovasculaires sont choisis parmi l'infarctus du myocarde, les troubles du rythme cardiaque (tachycardie, bradycardie, palpitations), les troubles de la pression artérielle (patients hypo- ou hypertendus) et les cardiopathies. 19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le médicament contient : a) ledit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) au moins un composé actif choisi parmi les psychotropes, notamment les anti-dépresseurs, et les agent anti-muscariniques, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention de la dépression, notamment la dépression profonde, la dépression résistante, la dépression du sujet âgé, la dépression psychotique, la dépression induite par des traitements interféron, l'état dépressif, le syndrome maniaco-dépressif, les épisodes dépressifs saisonniers, les épisodes dépressifs liés à une condition médicale générale, les épisodes dépressifs liés à des substances agissant sur l'humeur. 20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le médicament contient : a) ledit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) au moins un autre principe actif sélectionné parmi les composés actifs induisant une toxicité organique et les composés actifs induisant une toxicité cellulaire, notamment hépatique et/ou rénale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention des affections ou pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA). 21. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le médicament contient : a) ledit mélange d'énantiomères enrichi en énantiomère dextrogyre du Milnacipran et/ou d'au moins un de ses métabolites ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, et b) au moins un autre principe actif sélectionné parmi les composés actifs induisant des effets secondaires cardiovasculaires, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps pour le traitement ou la prévention des affections ou pathologies pouvant être soignées par l'inhibition double de la re-capture de la sérotonine (5-HT) et de la noradrénaline (NA).