Brevet FR2852326A1 — publié le 20040917

La présente invention concerne l'amélioration de la digestibilité de plantes fourragères, et plus particulièrement du maïs. L'utilisation du maïs comme fourrage, 5 notamment sous forme d'ensilage, est de plus en plus répandue. En effet, le maïs fourrage présente de nombreux avantages son rendement au champ est relativement élevé, sa récolte et son stockage sont aisés. Il constitue un apport alimentaire riche en énergie dont les 10 qualités nutritionnelles sont stables, qui peut être complémenté en protéines par des protéagineux ou par des tourteaux d'oléoprotéagineux comme le soja, et permet d'obtenir notamment une production laitière régulière et d'un niveau élevé. L'amélioration des variétés de maïs fourrager a initialement porté principalement sur l'augmentation de rendement, sur la rusticité et sur la résistance à la verse (BARRIERE et ai., Fourrages, 107-119, 2000). Toutefois, il a été observé que parallèlement, la valeur 20 alimentaire qui n'était pas prise en compte dans les critères de sélection, avait diminué en moyenne et présentait une grande variabilité d'un hybride à l'autre, se traduisant par des écarts importants dans la production de lait. Un effort de sélection a donc été 25 entrepris pour améliorer la valeur alimentaire des maïs fourragers, en particulier après la mise au point des équations de prédiction de la valeur énergétique et l'adoption d'une solubilité enzymatique de référence (ANDRIEU, Prod. Anim., 273-274, 1995). Une composante importante de la valeur alimentaire est la digestibilité. Par exemple, différentes expérimentations menées avec des vaches laitières ont montré que l'utilisation de variétés plus digestibles permet une augmentation de la production de 35 lait et une meilleure prise de poids des vaches, quand le niveau de complémentation ne permet pas aux animaux d'exprimer leur potentiel avec les variétés normales. En outre, ces variétés plus digestibles permettent aux animaux d'atteindre leur potentiel avec un plus faible niveau de complémentation, ce qui permet en particulier de réduire les coûts de production. Un facteur important limitant la digestibilité 5 des plantes fourragères est lié à la présence dans les parois des cellules végétales, de composés phénoliques, en particulier de lignines. Les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux et forment un maillage serré qui gène 10 l'accessibilité des enzymes digestives aux glucides pariétaux, principales sources d'énergie pour les herbivores. La part de résidus non digérés varie au cours du développement de la plante. Le taux de lignification augmente au cours de la maturation de la plante et 15 provoque une diminution de sa digestibilité. Toutefois, il existe une variabilité génétique de l'intensité et de la qualité de la lignification entre les lignées ou les hybrides, pour un niveau de maturité donnée, associée à une variabilité de digestibilité (MECHIN et al., J. Sci. 20 Food Agric., 80, 574-580, 2000). Cette variabilité est aussi illustrée par les modifications de quantité et qualité de lignine et l'amélioration de la digestibilité observée chez les mutants " brown-midrib ", en particulier le mutant bm3. Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration de la valeur alimentaire du maïs fourrager concerne la sélection ou la production par génie génétique de plantes dont les lignines sont modifiées qualitativement ou quantitativement. Les lignines sont des polymères insolubles de 3 monomères d'alcools ou monolignols, dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer Verlag, 143, 1968) : l'alcool p-coumarylique (sous- unités H), 35 l'alcool coniférylique (sous-unités G) et l'alcool sinapylique (sous-unités S). Chez le maïs les proportions respectives des unités H/S/G sont voisines de 3/35/62 (MECHIN, Thèse INAPG, 2000). Chacun de ces précurseurs peut former diverses liaisons avec les autres et ainsi constituer la lignine. D'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau 5 tridimensionnel complexe. Les monolignols libèrent par oxydation un radical permettant leur association spontanée. La formation de ces radicaux dépendrait de peroxydases et de laccases ou d'autres oxydases. Un nombre important de ces enzymes en association avec des 10 protéines de régulation serait nécessaire dans l'assemblage des sous-unités H, G et S (BOUDET, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000) Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans la biosynthèse de la lignine ne soient pas complètement 15 élucidés, il est généralement considéré que les laccases pourraient intervenir dans la formation des dimères et des trimères alors que les peroxydases permettraient d'obtenir un degré de polymérisation supérieur à partir des dimères et trimères (ROS BARCELO, International 20 Review of Cytology, 176, 87-132, 1997). Les peroxydases appartiennent à une famille multigénique et sont très largement représentées dans le génome des plantes. Par exemple le génome d'Arabidopsis thaliana compterait plus de 70 peroxydases (WELINDER et 25 al., Eur. J. Biochem., 269(24), 6063-6081, 2002). En outre, les peroxydases intervenant dans des voies métaboliques très variées, il est très difficile de déterminer lesquelles sont impliquées dans la lignification (BOUDET et al, Plant Physiol. Biochem., 38, 30 8196, 2000). QUIROGA et al, (Plant Physiol., 122, 11191127, 2000) et OSTERGAARD (Plant Mol. Biol., 44, 231-243, 2000) ont identifié des peroxydases impliquées dans la synthèse de la lignine chez la tomate (TPX1) et chez Arabidopsis thaliana (ATP A2). MOROSHI et KAJITA (Journal of Plant Research, 517-523, 2001) sont parvenus à sousréguler une peroxydase impliquée dans la synthèse des lignines chez un arbre. Dans ce cas, la diminution de l'activité de cette enzyme entraîne une augmentation de la teneur en sousunités S et des liaisons non condensées ainsi qu'une diminution de la quantité de lignines dans la paroi. Les inventeurs ont cartographié le gène d'une peroxydase, qu'ils ont dénommée peroxydase Pox3/U19, sur le chromosome 6 (bin 6.06), et ont établi qu'il existait une colocalisation entre ce gène et des QTL de digestibilité et de teneur en lignines de la paroi. Ce 10 gène correspond à la séquence Pox3 répertoriée dans GenBank sous le numéro d'accès AJ401276. La séquence d'ADN génomique de Pox3/U19, obtenue à partir de la lignée de maïs F2, est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en 15 annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La séquence polypeptidique correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Les Inventeurs ont en outre découvert que chez certaines lignées de maïs plus digestibles le gène de la 20 peroxydase Pox3/U19 était interrompu par un fragment de transposon de type MITE (Miniature Inverted-repeat Transposable Element; WESSLER et al., Current Opinion in Genetics and Development, 5, 814-821, 1995), introduisant au début du second exon un codon stop résultant en la 25 production d'une protéine tronquée et donc nonfonctionnelle. Ils ont montré une corrélation significative entre la présence de cet élément transposable et la digestibilité de la lignée. La séquence d'ADN génomique de Pox3/U19 30 obtenue à partir de la lignée de maïs F7 à digestibilité élevée, est représentée sur la Figure 2, ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3. La séquence polypeptidique correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le 35 numéro SEQ ID NO: 4. L'alignement de séquences d'ADN génomique de Pox3/U19, obtenues à partir des lignées à digestibilité élevée F226, F227, F7012, et F7, des lignées à digestibilité moyenne F2, W64, et des lignées à faible digestibilité F271, L212, B73, et B14 est représenté sur la Figure 3. La mise en évidence par les Inventeurs de 5 l'implication de Pox3/U19 dans la digestibilité fournit un ensemble de moyens permettant d'obtenir des plantes, en particulier des plantes monocotylédones, notamment le maïs, le sorgho, ou le panicum, possédant une digestibilité accrue. Ces nouveaux moyens font l'objet de la présente invention. La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer la digestibilité d'une plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement 15 l'expression et/ou l'activité de la peroxydase Pox3/U19 de ladite plante. On définit ici comme " peroxydase Pox3/U19 " toute protéine possédant une activité peroxydase et dont la séquence polypeptidique présente au moins 75%, de 20 préférence au moins 85%, de manière tout à fait préférée au moins 95%, et avantageusement au moins 94% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 sur une fenêtre de comparaison correspondant à la totalité de la séquence SEQ ID NO: 2. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués ici sont établis à l'aide du logiciel BLAST2 (ALTSCHUL et ai., Nucleic Acids Res., 25, 33893402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut. L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la peroxydase Pox3/U19 peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes. De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de 35 la production de la peroxydase Pox3/U19, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction. La mutagenèse du gène codant pour la peroxydase Pox3/U19 peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple 5 procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, on citera la mutagenèse insertionnelle: on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable, (élément 10 AC ou Mutator chez le maïs), et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de la peroxydase Pox3/U19. On peut également introduire une ou plusieurs 15 mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la 20 traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de Pox3/U19 peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène. Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des 25 techniques de type " TILLING " (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes; McCALLUM et ai, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000). On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant le gène codant pour la peroxydase 30 Pox3/U19. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou doublebrin dérivés du gène de la peroxydase Pox3/U19, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation 35 d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d'inhibition antisens cf. par exemple: WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants: Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York: Marcel DEKKER, 255-281, 1992; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21(11), 992-996, 2001; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents cf. HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002). La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un polynucléotide choisi parmi: a) un polynucléotide codant pour une peroxydase Pox3/U19 telle que définie ci-dessus; b) un polynucléotide complémentaire d'un 10 polynucléotide a) ci-dessus; c) un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 15, avantageusement au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs, spécifique d'un polynucléotide a) ou b) cidessus, ou capable de s'hybrider sélectivement avec ledit polynucléotide, pour obtenir une plante possédant une digestibilité accrue. On définit ici comme " polynucléotide codant 20 pour une peroxydase Pox3/U19 " tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse de ladite peroxydase. Ceci englobe notamment l'ADN génomique, par exemple la séquence SEQ ID NO: 1 représentée en annexe, 25 ainsi que l'ADNc correspondant. On définit comme " fragment spécifique " d'un polynucléotide a) ou b) cidessus, tout fragment dudit polynucléotide dont la séquence n'est pas trouvée dans d'autres gènes de la même plante, et notamment dans 30 d'autres gènes de ladite plante codant pour des peroxydases. On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé 35 en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de la même plante (notamment une banque d'ADN génomique, ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres peroxydases. Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi 10 que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 50C à 100C à la 15 température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire. A titre d'exemple de fragment spécifique d'un polynucléotide a) ou b) cidessus, ou capable de 20 s'hybrider sélectivement avec ledit polynucléotide, on citera notamment un polynucléotide susceptible d'être obtenu à partir d'ADNc ou d'ADN génomique non intronique de maïs, par amplification en conditions stringentes avec les amorces: OL 321: CACCGGAGTGGCTGCG (SEQ ID NO: 5) ET OL 322: ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG (SEQ ID NO: 6), ainsi que les fragments d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 15, avantageusement 30 au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins nucléotides consécutifs, dudit polynucléotide. Les positions des amorces SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6 sont encadrées sur la séquence représentée sur la Figure 1. La présente invention a en particulier pour objet un procédé pour augmenter la digestibilité d'une plante, par inhibition totale ou partielle de la peroxydase Pox3/U19 endogène de ladite plante, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante avec une construction d'ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, placé en orientation sens ou en orientation antisens, ou 5 pouvant être transcrit en ARN double brin, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. La présente invention a également pour objet des constructions d'ADN recombinant, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus. Ces constructions peuvent être notamment: - des cassettes d'expression, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de régulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. i - des vecteurs recombinants, comprenant un 20 polynucléotide, ou avantageusement une cassette d'expression tels que définis ci-dessus. Des constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de 25 sélection. L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention. A titre d'exemples non-limitatifs de 30 promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera: - des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et ai. (Science, 236, 4805, 1987), 35 ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande PCT WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine ou le promoteur " Actine-Intron-actine ", du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991; GenBank numéro d'accès S 44221). - des promoteurs inductibles ou tissuspécifiques, afin de ne modifier la teneur ou la 5 composition en lignines qu'à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les spathes, le cortex ou le xylème. A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera des terminateurs, tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genet., 15 1, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Cell, 21, 285-294, 1980; GenBank numéro d'accès V00141). A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la 20 présente invention, on citera notamment des gènes conférant une résistance à un antibiotique (HERRERAESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que 25 le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamyine (BEVAN et ai., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984). La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de 30 l'homme du métier. On peut par exemple transformer des cellules végétales, des protoplastes ou des explants, et régénérer une plante entière à partir du matériel transformé. La transformation peut ainsi être réalisée, à titre 35 d'exemples non-limitatifs: - par transfert des vecteurs conformes à l'invention dans des protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PG) en présence de cations divalents (Ca 2+) selon la méthode décrite dans l'article de KRENS et al. (Nature, 296, 72-74, 1982) ; - par électroporation notamment selon la 5 méthode décrite dans l'article de FROMM et al. (Nature, 319, 791-793, 1986) ; - par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, 10 délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de FINER et al. (Plant Cell Report, 11, 323328, 1992); -par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire. On peut également utiliser Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de BEVAN et ai. (Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984) et d'AN et al. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 20 1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de JOUANIN et al. (Plant Sci., 53, 53-63, 1987). Par exemple, la transformation de cellules végétales peut être effectuée par le transfert de la région T du plasmide circulaire 25 extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994) . On peut aussi utiliser Agrobacterium tumefaciens sur des plantes entières, par exemple par dépôt au niveau 30 de la blessure d'une plante monocotylédone, de la bactérie hébergeant l'ADN à transférer, en présence de substances libérées au niveau de la blessure d'une plante dicotylédone. La présente invention a également pour objet 35 les cellules végétales et les plantes transgéniques susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon l'invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention. De préférence, lesdites plantes 5 sont des monocotylédones, avantageusement du maïs, du sorgho ou du panicum. L'invention comprend également les cellules et tissus végétaux, ainsi que les organes ou parties de plantes, y compris feuilles, tiges, racines, fleurs, 10 fruits, et/ou graines- obtenues à partir d'une plante conforme à l'invention. La présente invention a aussi pour objet un procédé de sélection de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche chez les plantes à tester d'un 15 allèle du gène de la peroxydase Pox3/Ul9 possédant une mutation résultant en une inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite protéine. Les allèles mutants favorables à la digestibilité ainsi identifiés peuvent ensuite être 20 introgressés dans des lignées choisies, et notamment dans des " lignées élites " à savoir des lignées présentant un potentiel agronomique et commercial important. On peut en particulier utiliser, dans le cadre de ce procédé, des polynucléotides spécifiques de la 25 peroxydase Pox3/Ul9, tels que définis ci-dessus, et notamment: - des amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19 ou des sondes d'acide nucléique permettant la détection 30 sélective de ce gène. A titre d'exemples non-limitatifs d'amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19, on citera notamment le couple d'amorces défini par les séquences suivantes 35 GACGAAGCGGCACTGCTTGCGCTTCACCA (SEQ ID NO: 7) et TGCCACAGTAACAAGCGAGCTTACCAAGA (SEQ ID NO: 8). Les positions de ces amorces sont indiquées en gris et soulignées sur les séquences représentées sur les Figures 1 et 2. L'utilisation de ces amorces permet, par 5 comparaison du produit d'amplification avec celui obtenu à partir de plantes possédant une peroxydase Pox3/U19 active, de détecter les mutations pouvant affecter l'expression ou l'activité de ladite protéine. Par exemple, la comparaison des tailles des produits 10 d'amplification permet de détecter la présence d'insertions ou de délétions, susceptibles de résulter en la production d'une protéine inactive. - des amorces ou des sondes d'acide nucléique permettant de détecter une mutation déterminée, 15 préalablement identifiée comme affectant l'expression ou l'activité de la peroxydase Pox3/U19 ou des sondes d'acide nucléique permettant la détection sélective de ce gène: A titre d'exemple non limitatif, on citera 20 notamment le couple d'amorces défini par les séquences suivantes, qui permet d'amplifier sélectivement l'ADN de plantes possédant l'insertion du transposon MITE dans le gène codant pour Pox3/U19: GGCACTGGAGGCTCAGGGTGTGTT (SEQ ID NO:9) 25 AGGAGACAACGCCGGGGCAC (SEQ ID NO: 10) Ces deux types d'amorces peuvent être utilisés séparément ou en combinaison; par exemple, la combinaison d'un couple d'amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19 et d'un 30 couple d'amorces permettant de détecter une mutation déterminée est utilisable pour détecter des plantes hétérozygotes pour cette mutation. L'invention a également pour objet les couples d'amorces définis cidessus, ainsi que les kits 35 comprenant ces couples d'amorces individuellement ou en combinaison. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'implication de la peroxydase Pox3/U19 dans la digestibilité, et son utilisation pour l'obtention de plantes possédant une digestibilité améliorée. EXEMPLE 1: OBTENTION DE L'ADN GENOMIQUE DE POX3/U19 Des amorces spécifiques de Pox3/U19 ont été définies à partir de la séquence d'ADNc de la peroxydase Pox3/U19. L'amorce sens (U19S1) située position 1 à 29 10 de l'ADNc est représentée par la séquence (SEQ ID NO: 7) ci-dessous: 5'-GACGAAGCGGCACTGCTTGCGCTTCACCA-3' (29 bases Tm=75 C) L'amorce antisens (U19AS1) située position 1170-1198 de l'ADNc est représentée par la séquence 15 (SEQ ID NO: 8) ci- dessous: 5'TGCCACAGTAACAAGCGAGCTTACCAAGA-3' (29 bases Tm=71 C) La position de ces amorces est indiquée sur la Figure 1. Les amplifications par PCR sont réalisées à 20 partir de 100-150 ng d'ADN selon le protocole suivant: Mix PCR: 100-150 ng d'ADN génomique 0,2 pM de chaque amorce pM de chaque dNTP 2,5 unités de polymérase REDTaq (Sigma) / 50pL de réaction pL de tampon 10X pH 8,3 comprenant 100 mM de tris-HCL, 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl2 et 0,01% de gélatine Cycle: 5 min à 95 C cycles: 30 sec à 95 C 30 sec à 60 C 1 min 40 à 72 C min à 72 C La séquence obtenue par amplification a une taille d'environ 1,44 kb. Elle se compose de 3 exons et de 2 introns respectivement d'environ 130 et 100 pb. Les sites d'épissage consensus des monocotylédones sont présents. EXEMPLE 2 MISE EN EVIDENCE DE L'ASSOCIATION D'UNE AMELIORATION DE LA DIGESTIBILITE, AVEC UNE PEROXYDASE POX3/U19 INACTIVE. Association sites polymorphes/digestibilité La séquence codant pour la peroxydase Pox3/U19 a été amplifiée chez 37 lignées. Les séquences ainsi obtenues ont été alignées. Le pourcentage de 10 polymorphisme est de 2,2% soit 1 SNP toutes les 45 bases environ. Le taux de polymorphisme de la séquence d'acides aminés est de 1,39% soit seulement 5 changements d'acides aminés sur 358. La construction d'un arbre phylogénétique 15 selon la méthode UPGMA sur les séquences nucléiques permet de distinguer deux groupes: Le premier groupe comprend la lignée F7, et des lignées apparentées dont l'amplification PCR du gène codant pour Pox3/U19 aboutit à l'obtention d'un fragment 20 de 1744 pb. Le second groupe comprend les lignées dont l'amplification PCR du gène codant pour Pox3/U19 donne un fragment d'environ 1410 pb. Cette différence de taille entre les 25 amplifiats des deux groupes est due à la présence dans le deuxième exon d'un élément de 321 pb possédant les caractéristiques structurales d'un élément transposable. En effet, à chacune de ses extrémités une quinzaine de paires de bases est répétée de manière imparfaite et 30 inversée. Une répétition directe de 5 paires de bases est présente de part et d'autre du site d'insertion de l'élément. Celui-ci correspond à un élément MITE (Miniature Invertedrepeat Transposable Element) (WESSLER et ai., Current Opinion in Genetics and Development, 5, 35 814-821, 1995). Une analyse de variance (test ANOVA) réalisée sur chaque site polymorphe permet de repérer les sites pouvant intervenir dans la digestibilité. Ensuite, une étape de régression par la méthode des moindres carrés (pour un modèle linéaire) est réalisée afin de repérer le site le plus significatif ainsi que les associations avec 5 d'autres sites polymorphes qui explique la plus grande part de la variabilité du caractèredigestible. La probabilité pour que le polymorphisme correspondant à l'insertion de l'élément MITE soit liée à la digestibilité est significative à un seuil de 5% 10 (probabilité de 0,032). Recherche d'association entre la digestibilité et la présence de l'insertion MITE Un couple d'amorces amplifiant spécifiquement l'insertion de l'élément MITE a été défini. L'amorce sens est représentée par la séquence (SEQ ID NO: 9) ci-dessous: U19MITES 5'-GGCACTGGAGGCTCAGGGTGTGTT-3' (24 bases, Tm= 67,8 C) et l'amorce antisens par la séquence 20 (SEQ ID NO: 10) ci-dessous: U19MITEAS 5'-AGGAGACAACGCCGGGGCAC-3' (20 bases, Tm=65,5 C) Les amplifications par PCR sont réalisées à partir de 100 ng d'ADN selon le protocole suivant: 25 Mix PCR: ng d'ADN génomique 0,2 pM de chaque amorce pM de chaque dNTP 1,25 unités de polymérase REDTaq (Sigma} / 25pL de 30 réaction 2,5 pL de tampon 10X pH 8,3 comprenant 100 mM de trisHCL, 500 mM de KCl, 11 mM de MgCl2 et 0,01% de gélatine Cycle: min à 95 C 25 cycles: 30 sec à 95 C sec à 65 C sec à 72 C min à 720C Ce couple d'amorces amplifie spécifiquement l'insertion MITE dans le gène de Pox3/U19. Il n'y a aucune amplification avec ce couple d'amorces lorsque les 5 individus n'ont pas cette mutation dans le gène de Pox3/U19. Caractéristiques de la peroxydase de la lignée F7 La lignée F7 et certaines lignées apparentées, dont le gène codant pour la peroxydase a été séquencé, 10 ont une séquence de 1744 pb au lieu de 1440 pb. La séquence génomique obtenue se compose de la région codante constituée de trois exons et de deux introns. Les introns sont de petite taille soit respectivement 130 et pb. La différence de taille est due à l'insertion dans le deuxième exon d'un transposon de type MITE de 321 pb. La traduction de l'allèle de Pox3/U19 possédant l'insertion de l'élément MITE permet d'obtenir 20 une séquence d'acides aminés homologue aux traductions des allèles de Pox3/U19 ne possédant pas cette insertion pour les 111 premiers acides aminés, correspondant à la traduction du premier exon et du premier tiers du deuxième exon. En effet, l'insertion de l'élément MITE 25 introduit un codon stop dans la séquence 75 nucléotides après le début de l'insertion. Il apparaît donc que contrairement à la peroxydase sauvage qui comporte 358 acides aminés, la peroxydase de la lignée F7 et des lignées dont le gène 30 est interrompu par l'insertion du MITE, ne comporte que 111+25 acides aminés. L'insertion de l'élément transposable entraîne, dans le produit de traduction, la délétion d'acides aminés putativement impliqués dans l'activité catalytique. En effet, par analyse 35 bioinformatique (Prosite release 10.0), le domaine peroxydase 1 se positionnerait des position 163 à 212, le domaine peroxydase 2 des positions 36 à 87. Par conséquent, l'insertion de l'élément MITE empêcherait la traduction du domaine peroxydase 1 et rendrait l'enzyme totalement ou partiellement inactive. Génotypage de lignées de maïs Le génotypage est réalisé par PCR sur quelques lignées (F7012, Lan496 et F192) puis sur une collection plus vaste. Les amorces utilisées sont U19S, U19AS, U19MITES, U19MITEAS. En fonction du couple d'amorces 10 utilisé, il est possible d'avoir un marqueur dominant ou codominant. Par exemple, le couple U19S/U19MITEAS permet de distinguer les plantes homozygotes pour l'allèle muté ou sauvage des plantes hétérozygotes. F7012 est une lignée fixée (homozygote) issue 15 de F7 qui possède l'élément MITE. Lan496 est aussi une lignée fixée non apparentée à F7 et qui ne possède pas l'insertion. L'hybride présente les 2 allèles du gène de Pox3/U19. F192, qui est une lignée fixée issue du croisement F7xF2 a été typée et présente l'insertion de 20 l'élément MITE. Les résultats attendus pour chaque couple d'amorces sont résumés dans la Figure 4. Dans un second temps, une collection plus vaste de lignées ayant le parent F7 dans leur généalogie 25 et ayant un niveau de digestibilité variable a été typée. Les résultats du typage pour les individus apparentés à F7 et les notes de digestibilité correspondante sont représentés dans le tableau I ciaprès. Les lignées ont été notées 1 quand l'élément MITE est présent au niveau du gène de Pox3/U19. 0 quand l'élément MITE est absent au niveau du gène de Pox3/U19. Tableau I MITE présence/absence Digestibilité F7 1 4 F192 1 3 F7012 1 4,5 F226 1 3,5 F227 1 3 F324 1 5,5 2058 1 4,5 2068 1 5 LGFS 1 3,5 CP1718 0 3 CP1622 0 3 SK02 0 3,5 SK122 0 2,5 SK132 0 3 F268 0 2,5 F7023 0 1,5 LGD3 0 2,5 LGI9 0 1,5 LGI2 0 2 LGI1 0 3 La note de digestibilité résulte des expérimentations à long terme conduites depuis 1992. Les lignées ont été phénotypées en valeur propre pour leur 5 valeur de digestibilité in vitro des parois (critère DINAG, ARGILLIER et ai., Euphytica, 82, 175-184, 1995). Ces valeurs ont ensuite été homogénéisés et synthétisés sous forme de note de 1 (très peu digestible comme F271) à 5 (très digestible comme F324). Le tableau II ci-après illustre la comparaison des moyennes des notes de digestibilité des individus ayant l'insertion MITE et des individus ne l'ayant pas. Tableau II Moyenne de Ecart-type Variance lignbede digestibilité E lignoes d Lignées possédant le 4,06 0,88 0,78 9 MITE Lignées ne possédant 2,55 0,65 0,42 11 pas le MITE Comparaison des moyennes Estimation Degrés F tabulé F tabulé de la or un.. pour un variancel F calculé D3e suide pou Signicatif? u Significatif ? variance liberté seuil de seuil de commune be 5% 1% 0,58 4,41 18 2,101 OUI 2,878 OUI Le test de comparaison de moyennes entre les lignées possédant l'insertion MITE et celles ne la possédant pas montre que les moyennes des notes de 5 digestibilité pour les lignées ayant et n'ayant pas l'élément MITE sont significativement différentes à un seuil de 1%. Ces résultats montrent une association entre la présence d'une peroxydase inactive et un niveau de 10 digestibilité accru. Association entre la digestibilité et la présence de l'insertion MITE dans une population recombinante Lan496 x F7012 L'impact de l'allèle muté de Pox3/U19 a été 15 évalué d'une autre façon par typage d'une population d'haploïdes doublés issus du croisement de Lan496 (absence d'insertion de l'élément MITE et de digestibilité moyenne) par F7012 (insertion de l'élément MITE et bonne digestibilité) : 46 haploïdes doublés ont été typés 0, 48 haploïdes doublés typés 1 La ségrégation est de type 1 d. L'effet de l'insertion de l'élément MITE sur les caractères de parois (digestibilité, lignification, 25 composition en glucides pariétaux) a été étudié à partir de l'estimation de ces caractéristiques faite sur des plantes récoltées à une date normale ensilage en 2002 (10 septembre 2002) . Ceci étant, la différence de précocité de floraison entre les parents et les conditions peu favorables à la maturation des maïs en 2002 ont fait qu'il existait à la récolte un écart important de niveau de maturation entre les différentes lignées étudiées. Les caractéristiques pariétales et les valeurs de digestibilité ont été évaluées par NIRS (Near Infra Red Spectroscopy), calibration du Centre de Recherches Agronomiques de Libramont, Belgique. Les mesures de NDF, ADF et ADL sont réalisées 10 selon les protocoles décrits dans GOERING et ai., Agric. Handb., 379, US Gov. Print Office, Washington DC, 1971; celles de lignine Klason selon DENCE et al., Methods in Lignin Chemistry Springer (ed.) Berlin, 33-62, 1992; les mesures de DINAG et DINAGZ respectivement selon ARGILLIER 15 et al., Euphytica, 82, 175-184, 1995 et BARRIERE et al., Fourrages, 163, 221-238, 2000. Enfin, les mesures de dNDF sont réalisées selon STRUIK, thèse doctorale, Université de Wageningen, 1983 et DOLSTRA et MEDEMA, Proceedings of The 15th Congress Maize And Sorghum Section of Eucarpia, 20 4-8 juin 1990, Baden, Austria, 258-270. Une analyse de variance a été réalisée avec des effets bloc, sous-bloc, matière sèche, marqueur MITE et génotype, une covariable matière sèche étant nécessaire en raison du décalage de précocité entre les 25 deux parents, en particulier après un été froid peu favorable à la maturation des lignées. Les résultats obtenus avec la variable " marqueur MITE " sont illustrés par le tableau ci-dessous. Tableau III. Marqueur MITE Carré moyen Carré moyen F (Fisher) P MITE résiduel (Probabilité en %) ADL/NDF 0,28 0,14 2,0 16,0ns LK/NDF 30,5 0,65 47,1 0, 00** NDF 92,9 2,23 41,5 0,00** ADF 52,0 1,15 45,2 0,00** NDF-ADF 38,4 0, 87 43,9 0,00** ADF-ADL 5,9 0,35 17,0 0,00** DINAGZ 89,7 1,33 67,4 0,00** dNDF 26,6 2,93 9,1 0,39** NDF: teneur en paroi ns: non significatif (P> 10%) ADF: teneur cellulose et lignine ADL **: significatif au seuil de 1% NDF-ADF: teneur en hémicellulose ADUNDF: teneur en lignine ADL LK/NDF: teneur en lignine Klason dNDF: digestibilité de la paroi DINAGZ: digestibilité des parois (sauf amidon, glucide soluble) A un stade de récolte représentatif du stade 10 ensilage (compris entre 30 et 35 % de matière sèche en moyenne), l'effet du MITE mesuré par le critère du test F de Fisher est très significatif sur de nombreux caractères liés à la digestibilité des parois. Il y a ainsi un effet significatif de l'insertion MITE sur les 15 caractères de digestibilité in vitro des parois DINAGZ et dNDF. De même, il y a un effet du MITE sur la composition en glucides pariétaux hémicellulose et cellulose. Sur la lignification de la parois, l'effet du MITE est très significatif sur la lignine totale, estimée par le 20 critère lignine Klason dans le NDF, mais ne l'est pas sur la partie la plus résistante de la lignine estimée par l'ADL dans le NDF. EXEMPLE 3: AMELIORATION DE LA DIGESTIBILITE PAR INACTIVATION DE LA PEROXYDASE POX3/U19 Transformation par Agrobacterium tumeúfaciens de plantes de maïs par un antisens du gène de Pox3/U19 Construction d'un plasmide comprenant la séquence 3'UTR de la peroxydase Pox3/U19 en orientation antisens: Le vecteur utilisé pour la transformation du 30 maïs par Agrobacterium tumefaciens se présente sous la forme d'un plasmide superbinaire d'environ 50 kb (pREC 520). Ce vecteur comporte: - une région ori: origine de réplication plasmidique Col EI, nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans Escherichia coli. 5 Cette origine de réplication n'est pas fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens - une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens et dans Escherichia coli, - la région cos du bacteriophage lambda, pouvant présenter une utilité pour la manipulation du vecteur in vitro, - les régions virB, virC et virG supplémentaires d'Agrobacterium tumefaciens qui augmentent l'efficacité de transformation les gènes de résistance à la tétracycline (Tétra) et à la spectinomycine (Spect) qui s'expriment uniquement dans les bactéries, un ADN-T porteur de deux cassettes 20 d'expression: l'une contient le promoteur CsVMV, la séquence 3'UTR de Pox3/U19 en orientation antisens et le terminateur NOS et l'autre comporte un gène de sélection (par exemple, un gène de résistance aux herbicides) sous contrôle du promoteur d'actine de riz et suivi du 25 terminateur 3'NOS. Protocole de transformation par Agrobacterium tumefaciens (d'après ISHIDA et al., Nature Biotechnology, 14, 745-750, 1996). Des épis immatures d'une lignée produite en 30 serre, sont prélevés 10 jours après la pollinisation et stérilisés pendant 15 minutes. Les embryons sont prélevés et mis en contact 5 minutes avec une suspension d'Agrobacterium contenant le vecteur super binaire tel que décrit cidessus. Après avoir été retirés de la 35 suspension d'Agrobacterium, les embryons sont mis en culture sur un milieu ne contenant ni de bactériostatique, ni d'agent sélectif. Cette coculture a lieu 4 à 7 jours à l'obscurité. Après la coculture, les embryons sont repiqués sur un milieu de callogénèse frais contenant le 5 bactériostatique et l'agent sélectif. Un cal va s'initier et se développer à partir de cellules transformées de ces embryons. L'étape de callogénèse se passe à 25 OC à l'obscurité et dure 5 semaines. Les embryons-cals sont repiqués sur milieu frais toutes les 2 à 3 semaines. Au terme de cette étape les cals blancs, transformés, sont excisés de l'explant primaire et sont repiqués sur un milieu de régénération contenant de la zéatine au lieu d'auxine. L'étape de régénération dure aussi 5 semaines entrecoupées d'un repiquage du cal sur 15 milieu frais toutes les 2 à 3 semaines. Après 2-3 semaines sur ce milieu, des plantules régénèrent à partir des cals. Une fois que les plantules sont assez développées, elles sont mises en enracinement en tube. Après 10-15 jours en tube, les plantules sont acclimatées en phytotron avant d'être transférées en serre. Les transformants sont ensuite cultivés et croisés avec du pollen d'une plante non transgénique pour produire la génération Tl. Transformation par biolistique de plantes de maïs par un antisens du gène de Pox3/U19 Construction d'un plasmide comprenant la séquence 3'UTR de la peroxydase Pox3/U19 en orientation antisens: Une banque d'EST comprenant la séquence 3'UTR 30 de Pox3/U19 en orientation antisens a été construite dans le vecteur pTriplEX2 (SMARTTM cDNA Library construction Kit, CLONTECH). Le fragment Hind III - EcoR I encadrant la séquence d'intérêt a été introduit dans le vecteur E 919 également ouvert aux sites de restriction Hind III et 35 EcoR I, sites situés respectivement en aval du promoteur CsVMV et en amont du terminateur NOS. On obtient ainsi le plasmide d'intérêt E 1105. La technique de transformation par biolistique implique de co-transformer des cellules végétales d'une part avec le gène d'intérêt (E 1105), et d'autre part avec un plasmide porteur d'une cassette d'expression 5 (pDM302) comprenant un gène de sélection (par exemple, un gène de résistance à un herbicide) précédé du promoteur adéquat et suivi du terminateur adapté. Protocole de transformation Des embryons immatures de HiII sont prélevés 10 10 jours après la pollinisation. Ils sont mis en culture sur un milieu osmotique. 4 jours après ils sont bombardés avec des particules d'or enrobées de plasmide contenant le gène d'intérêt et un plasmide portant le gène de sélection. Les embryons sont ensuite repiqués sur un milieu de callogénèse. Cette étape, à l'obscurité et à 25 OC, dure environ 2 mois, entrecoupés de repiquage sur milieu frais tous les 15 jours. Une fois que les cals transformés sont sélectionnés, ils sont cultivés sur 20 milieu de maturation, puis sur milieu de régénération. L'étape de régénération se fait à la lumière et dure 2 à 4 semaines. Dès 1 à 2 semaines après le passage sur ce milieu des plantules régénèrent à partir d'embryons 25 somatiques initiés pendant l'étape de maturation. Ces plantules sont ensuite mises en enracinement en tube. Comme dans le cas des plantes produites par transformation par Agrobacterium, les plantules enracinées sont ensuite acclimatées au phytotron avant 30 transfert en serre pour production de graines Tl Inactivation de la peroxydase Pox3/U19 par RNAi Construction d'un vecteur comprenant la séquence 3'UTR de la peroxydase Pox3/U19 en orientation sens et antisens Ce vecteur est construit en utilisant le 35 système Gateway (Invitrogen). Un fragment 3'UTR du gène de Pox3/U19, est amplifié par PCR, à partir d'ADNc de maïs contenu dans un plasmide dénommé E1100. Les amorces utilisées sont les suivantes: O1 321: (CACCGGAGTGGCTGCG; SEQ ID NO: 5) comportant une extension CACC en 5', nécessaire pour le clonage dans le vecteur d'entrée, et Ol 322: (ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG; SEQ ID NO: 6). Les conditions d'amplification utilisées sont les 10 suivantes: plasmide E 1100 (10 ng/pl) : 2 pl Tampon xlO (Cloned Pfu Buffer) 2 pl dNTP (5mM each) 0,8 u1 01 321 10 pM 1 pl 01 322 10 pM 1 pl Pfu (2.5U/pl)(Stratagene) 1 pl H20 10,7 pl Cycle: 10 min 95 sec 92 30 sec 55 20 fois sec 72 10 min 72 Le fragment amplifié est ensuite cloné en antisens et en sens dans le vecteur dans le vecteur pENTR 25 D/Topo (Invitrogen), pour donner le vecteur d'entrée E1121. Parallèlement le vecteur de destination E1122, qui contient l'intron de tubuline de riz est construit. Une double recombinaison entre ces 2 vecteurs aboutit à 30 l'obtention du vecteur E1129, qui contient une cassette comprenant la 3'UTR de Pox3/U19 en orientation antisens, l'intron de tubuline de riz, et la 3'UTR de Pox3/U19 en orientation sens. De part et d'autre de cette cassette se trouvent deux sites de restriction Sac I. Le fragment Sac 35 I est cloné dans un vecteur de clonage intermédiaire portant un gène de résistance à la kanamycine. Le vecteur obtenu est dénommé E 1137. Le fragment Sac I de E 1137 est introduit dans le vecteur E 919 ouvert au site Sac I, pour obtenir le vecteur E 1142. Ce vecteur porte une cassette d'expression constituée du promoteur CsVMV, de la séquence 3'UTR de U19 en orientation antisens, du premier intron du gène de la tubuline de riz, de la séquence 3'UTR de Pox3/U19 en orientation sens et du terminateur NOS. Il peut être utilisé pour la transformation du maïs par biolistique, comme décrit ci-dessus. REVENDICATIONS 1) Procédé pour améliorer la digestibilité d'une plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité 5 dans ladite plante, d'une peroxydase, dénommée ci-après peroxydase Pox3/U19, dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2. 2) Procédé selon la revendication 1, 10 caractérisé en ce que ladite plante est le maïs. 3) Utilisation d'au moins un polynucléotide choisi parmi: a) un polynucléotide codant pour une peroxydase Pox3/U19 telle que définie dans la 15 revendication 1; b) un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide a) ci-dessus; c) un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs, d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou 20 capable de s'hybrider sélectivement avec ledit polynucléotide, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Utilisation selon la revendication 3, 25 caractérisée en ce que ledit polynucléotide est choisi parmi: - un polynucléotide susceptible d'être obtenu à partir d'ADNc ou d'ADN génomique de maïs, par amplification avec les amorces 30 CACCGGAGTGGCTGCG (SEQ ID NO: 5) et ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG (SEQ ID NO: 6) - un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs dudit nucléotide. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'inhibition de l'expression et/ou de l'activité de la peroxydase Pox3/U19 est obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite peroxydase. 6) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend 5 la transformation de ladite plante avec une construction d'ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 7) Cassette d'expression comprenant un 10 polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 8) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon la revendication 7. 9) Plante génétiquement modifiée, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 6. 10) Procédé de sélection de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche chez les plantes à tester d'un allèle du gène de la peroxydase 20 Pox3/U19 possédant une mutation résultant en une inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite peroxydase. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur le maïs. 12) Utilisation d'au moins un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 10 ou 11. 13) Utilisation selon la revendication 12, 30 caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre du couple d'amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8. 14) Utilisation selon une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre du couple d'amorces SEQ ID NO: 35 9 et SEQ ID NO: 10. 15) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6. 16) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8. 17) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10. 18) Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces selon une quelconque des revendications 16 ou 17.