Brevet FR2851471A1 — publié le 20040827

COMPOSÉS COMPRENANT AU MOINS UNE SUBSTANCE ACTIVE ET AU MOINS UN VECTEUR RELIÉS PAR UN AGENT DE LIAISON, LEURS UTILISATIONS ET LESDITS AGENTS DE LIAISON DOMAINE DE L'INVENTION La vectorisation des substances actives pour augmenter leur entrée dans les cellules vivantes ou dans un tissu donné revêt un grand intérêt tant pour la recherche que pour l'utilisation thérapeutique. Cependant, dans certains cas, le couplage de la substance active avec le vecteur résulte en une diminution de l' affinité de ladite substance à son récepteur ou de son efficacité. Une des priorités de la recherche dans ce domaine est de trouver des moyens efficaces pour relarguer la substance active une fois qu'elle arrive à son site d'action. C'est pour cela que le développement de linkers ou agents de liaison revêt un grand intérêt dans la vectorisation des médicaments. La présente invention se rapporte donc à l'utilisation d'un agent de liaison permettant de coupler une substance active à un vecteur capable de modifier temporairement les propriétés physico-chimiques ou pharmaco-cinétiques de ladite substance active, ainsi que sa libération sous la forme initiale. L'agent de liaison permet d'accrocher de façon covalente un vecteur sur la substance active, pour faciliter son transport à travers des barrières biologiques ou sa pénétration cellulaire, ou pour modifier sa bio-disponibilité, ou encore pour modifier sa solubilité dans un milieu aqueux ou organique. La présente invention se rapporte aussi à l'utilisation desdites substances modifiées pour le diagnostic ou pour la préparation de médicaments utiles en thérapie. LA SUBSTANCE ACTIVE A titre de substances actives, l'invention envisage notamment des molécules d'intérêt biologique telles que des protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entendu, des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux, etc... Dans le domaine du diagnostic, la substance active peut être un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie. On désignera également par substance active la famille entière de molécules comme décrite ci-dessus, incluant la molécule, tous ses dérivés, variants, isotopes, métabolites, comprenant des dérivés hydroxylés, glucuronides, phosphates, et sels. Dans la présente invention, on entend par substance modifiée , une substance active telle que décrite ci-dessus liée par l'intermédiaire d'un bras de liaison à un vecteur tel que défini ci-après. VECTEUR On désignera ci-après par le terme de vecteur, tout composé permettant de modifier les propriétés physicochimiques ou pharmaco-cinétiques de la substance active. Cela inclut de façon non restrictive, des acides aminés naturels ou non naturels, des protéines (Dubowchick G.M. et al., 2002 - Kratz F. et al., 2000), des peptides vecteurs (Temsamani et al., 2000 et 2001 - Rousselle et al., 2000 et 2001 - Demandes de brevet français No. 97/10297 et 00/08633 respectivement déposées le 12 août 1997 et le 3 juillet 2000), des saccharides (Takahashi et al., 1998), des lipides (Torchilin et al., 2001), des polysaccharides (Schacht et al., 1985), des polymères naturels ou de synthèse (Conover et al., 1998 - Pendri A. et al., 1998) ou tout autre agent permettant une modification des propriétés de la molécule. DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention fournit des méthodes pour accrocher une substance active à des vecteurs puis libérer ladite substance sous sa forme initiale. Ainsi, l'invention se rapporte tout d'abord à des composés comprenant au moins une substance active et au moins un vecteur, lesdits substance active et vecteur étant reliés par un agent de liaison. De façon avantageuse, l'agent de liaison est choisi parmi les structures suivantes : -C()-R4-NRWC()-(-'H2)n-NH-(CHz)m--'(0)- (I) -C( 0 )-R4-NR1-C( 0 )-R2-NH-R3-C ( 0 ) - ( II ) -C ( 0 ) -R4-NR1-Hyp-O-C ( 0 ) -R5-C ( 0 ) - ( III ) -C ( 0 ) -R4-NR1-C ( 0 ) -CH(NH2) -R5-O-C ( 0 ) -R8-C ( 0 ) - ( IV ) -C ( 0 )-R4-NRI-C( 0 )-R5-NH-O-R8-C ( 0 ) - ( V ) -C ( 0 ) -R4-NRl-C ( 0 ) -R5-0-NH-R.-C ( 0 ) - ( VI ) -C ( 0 ) -R4-NR1-C ( 0 ) -R5-NR7-NR6-R8-C ( 0 ) - (VII) -C ( O ) -R4-NH-R5-C ( 0 ) - (VIII) dans lesquelles : n et m sont des entiers indépendants supérieurs ou égaux à 1, R1 est H, OR6, N(R6)R7. un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, R2 et R3 sont des alkyls dont au moins un est ramifié par un ou deux ou une combinaison d'alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl) ou tout autre alkyl ramifié pouvant porter des groupes hétéroatomiques, R4, R5 et R8 sont, indépendamment, des alkyls linéaires (CH2),, ou ramifiés par un ou deux ou une combinaison d'alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié pouvant porter des groupes hétéroatomiques, R6 et R7 sont, indépendamment H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, Hyp-0 représente un résidu hydroxyproline où le groupe hydroxy est en position 2,3 ou 4 de la proline, la liaison au reste du bras de liaison se faisant par l'intermédiaire de l'oxygène du groupe hydroxy de l'hydroxyproline, les carbones asymétriques présents dans les groupes R1, R2, R3, R4 , R5, R6 , R7, R8 ou Hyp-0 pouvant être de configuration R ou S. De façon préférée, lorsque l'agent de liaison répond à une des formules (I), (II), (V), (VI) et (VII) telles que définies ci-dessus dans lesquelles - R4 est égal à CH2, - R1 est choisi parmi H, OH, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, - R2, R3, R5 et R8 sont choisis parmi des alkyls linéaires (CH2)n ou des alkyls ramifiés par un alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié, - R6 est égal à H et R7 est H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl - R7 est égal à H et que R6 est H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl (situation 1), la substance active n'est pas la cyclosporine et le vecteur n'est pas un vecteur peptidique. De la même façon, lorsque l'agent de liaison répond à la formule VIII et que R4 et R5 sont choisis parmi des alkyls linéaires (CH2),, ou des alkyls ramifiés par un alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié (situation 2), la substance active n'est pas la cyclosporine et le vecteur n'est pas un vecteur peptidique. L'homme du métier comprend aisément que, dans ces deux situations, la cyclosporine peut être utilisée comme substance active lorsque elle est couplée à un vecteur autre qu'un vecteur peptidique et que, de la même façon, un vecteur peptidique peut être utilisé comme vecteur lorsqu'il est couplé à une substance active autre que la cyclosporine. La libération de la substance active sous sa forme initiale intervient lorsque la substance modifiée est placée dans des conditions de pH proches des conditions de pH physiologique. Par contre, la libération de la substance active n'intervient pas ou peu, lorsque la substance modifiée est placée dans des conditions de pH acides inférieure ou égale à 5. De plus, la libération de la substance active n'intervient pas ou peu, lorsque la substance modifiée est placée dans le plasma ou le sang. Suivant un mode de réalisation préféré, la substance active telle que définie précédemment peut être liée directement ou indirectement à l'agent de liaison par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel de type alcool -OH thiol -SH, ou amine. Ces groupes fonctionnels sont présents naturellement ou peuvent être insérés sur la substance active. Suivant un mode de réalisation préféré, le vecteur peut être lié directement ou indirectement à l'agent de liaison par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel de type amine, alcool, thiol, carbonyl, ou par l'intermédiaire d'un groupe de type alkyl linéaire ou ramifié, ou aryl, ou alkylaryl. Ces groupes fonctionnels peuvent être présents naturellement ou peuvent être insérés sur le vecteur. Le couplage entre, d'une part, le vecteur et l'agent de liaison et, d'autre part, entre l'agent de liaison et la substance active peut être effectué à n'importe quel site du vecteur ou de la substance active. L'homme du métier saura déterminé les conditions dudit couplage en tenant compte de la nature chimique à la fois du vecteur et de la substance active. De préférence, dans les composés objet de la présente invention, le vecteur est un composé permettant de modifier les propriétés physico-chimiques ou pharmacocinétiques de la substance active. Plus particulièrement, le vecteur est choisi parmi des acides aminés naturels ou non naturels, des protéines, des peptides vecteurs, des saccharides, des polysaccharides et des polymères naturels ou de synthèse. Dans une première forme de mise en #uvre d'un composé objet de la présente invention, la substance active est choisie parmi des molécules d'intérêt biologique telles que des protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entendu, des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux. Dans cette forme de mise en #uvre, le composé objet de l'invention sera avantageusement utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile dans le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales. Dans une seconde forme de mise en #uvre d'un composé objet de la présente invention, la substance active est choisie parmi un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie. Dans cette seconde forme de mise en #uvre, le composé objet de la présente invention sera avantageusement utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le diagnostic d'une pathologie humaine ou animale. Des modes de réalisation additionnels de l'invention fournissent des composés comprenant une substance active liée à plusieurs vecteurs ou plusieurs substances actives liées à un vecteur, et ce, via un ou plusieurs agents de liaison. La présente invention concerne des polymères de tels composés. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un des composés cités ci-dessus. Un autre sujet de la présente invention est l'utilisation dudit composé pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement ou la prévention d'une maladie choisie. De manière préférentielle, la composition pharmaceutique est de forme appropriée pour l'administration via toute voie convenable incluant la voie systémique, orale, sublinguale, buccale, nasale, inhalation, parentérale et une voie cérébrale artérielle sélective ou suprasélective, la perfusion rétrograde à travers le système veineux cérébral, via un cathéter dans le parenchyme cérébral ou les ventricules, La présente invention inclut la possibilité de gérer la durée et la séquence de délivrance des traitements médicamenteux pour y inclure un pré-traitement et un post-traitement, de manière simultanée avec le traitement. La présente invention concerne également un agent de liaison tel que défini précédemment. Plus particulièrement, un agent de liaison objet de la présente invention répond à l'une des structures suivantes : -C,'(0)-R4-NRl-C'(0)-(fH2)n-NH-(CHZ)m--'(0)- (I) -C( 0 ) -R4-NR1-C ( 0 ) -R2-NH-R3-C( 0 ) - ( II ) -C( 0 ) -R4-NR1-Hyp-O-C ( 0 ) -R5-C( 0 ) - ( III ) -C( 0 )-R4-NR1-C ( 0 )-CH (NH2) -R5-O-C ( 0 )-R8-C ( 0 ) - ( IV ) -C ( 0 ) -R4-NRl-C ( 0 ) -RS-NH-0-R$-C ( 0 ) - (V) -C ( 0 ) -R4-NR,-C ( 0 ) -R.-O-NH-R.-C ( 0 ) - ( VI ) -C ( 0 ) -R4-NR1-C ( 0 ) -R5-NR7-NR6-R8-C ( 0 ) - (VII) -C ( O ) -R4-NH-R5-C ( O ) - (VIII) dans lesquelles : n et m sont des entiers indépendants supérieurs ou égaux à 1, R1 est H, OR6, N(R6)R7, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, R2 et R3 sont des alkyls dont au moins un est ramifié par un ou deux ou une combinaison d'alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl) ou tout autre alkyl ramifié pouvant porter des groupes hétéroatomiques, R4, R5 et R8 sont, indépendamment, des alkyls linéaires (CH2), ou ramifiés par un ou deux ou une combinaison d'alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié pouvant porter des groupes hétéroatomiques, R6 et R7 sont, indépendamment H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, Hyp-0 représente un résidu hydroxyproline où le groupe hydroxy est en position 2,3 ou 4 de la proline, la liaison au reste du bras de liaison se faisant par l'intermédiaire de l'oxygène du groupe hydroxy de l'hydroxyproline, les carbones asymétriques présents dans les groupes RI, R2, R3, R4, R5, R6 , R7, R8 ou Hyp-0 pouvant être de configuration R ou S. à l'exception des agents de liaison répondant à une des formules (I), (II), (V), (VI) et (VII) dans lesquelles : - R4 est égal à CH2, - R1 est choisi parmi H, OH, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, - R2, R3, R5 et R8 sont choisis parmi des alkyls linéaires (CH2)n ou des alkyls ramifiés par un alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié, - R6 est égal à H et R7 est H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl - R7 est égal à H et que R6 est H, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl et à l'exception des agents de liaison répondant à la formule VIII avec R4 et R5 choisis parmi des alkyls linéaires (CH2)n ou des alkyls ramifiés par un alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié. La présente invention concerne également un agent de liaison répondant à l'une des formules suivantes : -C(O)-CHZ-NCHZ(C6H5}-C(O)-(CH2)-NH-(CHZ)-C(O)- (Linker 1) -C (0) -CH2-N (NH2) -C (0) - (CH2)-NH-(CH2 ) -C ( 0 ) - (Linker 2) -C (0) -CH2-NCH2 (C6H5 -C (0) -CH2-NH-NH-CH2-C (0) - (Linker 3) -C (0) -CH2-NCH2(C6H5 -C (0) -CH2-NH-0-CH2-C (0) - (Linker 4) -C (0) -CH2-NCH2(C6H5 ) -C (0) -CH2-NH-C(CH3) 2-C (0) - (Linker 5) -C (0) -CH2-NCH2(C6H5 -C (0)-C(CH3 2-NH-CH2-C(O)- (Linker 6) -C(O)-(CH2)4-NH-CH2-C(O)- (Linker 7) -C(O)-CH2-NCH2(C6H5 -C (0) -CH2-NH-CH(CH3)-C(O)- (Linker 8) -C (0) -CH2-NCH2(C6H5 -C (0) -(CHz ))-NH-(CH2)2-C(O)- (Linker 9) -C ( 0 ) -CH2-NCH2 (C6Hs) -C ( 0 ) -CH ( nez ) -CH2-O-C ( 0 ) - (CH2 ) 2-C (0) - (Linker 10) -C ( O ) -CHZ-NCHZ ( C6H5 ) -Hyp-O-C ( O ) - ( CHz ) 2-C ( O ) - (Linker 11) La présente invention sera mieux comprise en lisant la description du travail expérimental accompli dans le cadre de ses travaux de recherche par la Demanderesse, qui ne doit pas être interprété comme étant de nature restrictive. Les figures 1 à 12 représentent des schémas réactionnels pour la préparation d'un composé selon l'invention comprenant la cyclosporine et différents vecteurs peptidiques mettant en #uvre différents linkers. Les figures 13 à 17 représentent la libération de la cyclosporine à différents pH et ce, dans le cadre du conjugué CsA-linkerl-SynB3 (figure 13), du conjugué CsAlinker2-SynB3 (figure 14), du conjugué CsA-linker3-SynB3 (figure 15), du conjugué CsA-linker9-SynB3 (figure 16) et du conjugué CsA-linkerll-SynB3 (figure 17). La figure 18 représente l'évaluation de la solubilité dans l'eau du conjugué CsA-linkerl-SynB3. A. SYNTHESE CHIMIQUE DES CONJUGUES. I. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl-SynB3. Il sera fait référence à la figure 1 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur. Le peptide SynB3 de séquence RRLSYSRRRF (SEQ ID NO : 1) est assemblé sur phase solide selon une stratégie Fmoc/tBu, clivé et déprotégé par l'acide trifluoroacétique, puis purifié par chromatographie liquide haute pression (HPLC) préparative en phase inverse et lyophilisé. Sa pureté (>95%) et son identité sont confirmées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. De la Cyclosporine A (414 mg - n = 344 mol) et de l'anhydride d'acide chloroacétique (m = 500 mg) sont mélangés dans 1 ml de pyridine. Chauffé 3h à 50 C, le mélange obtenu est étendu par 6 ml d'eau. Après extraction à Et2O, la phase organique est lavée par une solution de NaHC03 saturée puis à l' eau. La phase éthérée séchée sur Na2SO4, est concentrée sur évaporateur rotatif donnant 441 mg de cristaux jaunes de chloroacétyl-cyclosporine (M+H 1+ = 1279 - Rdt brut = 100%) qui sont solubilisés dans 1 ml d'acétonitrile. Après agitation pendant 14h à 40 C, en présence de chlorhydrate de benzylamine (2 éq. - m = 98 mg - 680 mol), de diisopropyléthylamine (3 éq. - 177 l - 1,02 mmol) et de NaI (0,5 éq. - m = 25 mg - 170 mol), le mélange réactionnel est ensuite concentré sur évaporateur rotatif puis étendu par 7 ml de DMSO et purifié par HPLC préparative pour donner 416 mg de poudre jaune de (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine (M+H 1+ = 1351 - Msel TFA = 1464 - Rdt = 82%). Un mélange d'acide N-Boc-iminodiacétique (m = 11,9 mg - 51,1 mol), de diisopropycarbodiimide (1 éq. - 7,9 l - 51,1 mol) dans 400 l de dichlorométhane et 100 l de DMF est agité à température ambiante pendant 30 minutes. Transféré sur une solution de (2-benzylamino-acétyl)cyclosporine (68 mg - 46,4 mol), de DIEA (3 éq. - 23ul - 139 mol) dans 300 l de DMF le produit est agité à température ambiante pendant 3h. On purifie par HPLC préparative et on obtient 62 mg de poudre blanche d'intermédiaire Boc de la cyclosporine (M+H 1+ = 1566 - Rdt = 85%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. Une solution d'intermédiaire Boc de la cyclosporine précédent (62 mg - 36,9 jumol), de peptide SynB3 (1,1 éq. - 84 mg - 40,6 mol), de PyBOP (1,1 éq. - 21,1 mg - 40,6 mol), DIEA (2 éq.- 11,5 l - 73,8 jumol) dans 2 ml de DMF est agité à température ambiante pendant 2h. Le conjugué est purifié par HPLC préparative. On obtient 89,5 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 2941 - Msel TFA = 3510 - Rdt = 67%). Le conjugué Boc (61,5 mg - 17,5 jumol) est solubilisé dans 540 l de HCl 4N dans du dioxane et 54ul de DMF, agité 30 minutes à température ambiante puis purifié par HPLC préparative. On obtient 49 mg de conjugué CsAlinkerl-SynB3 (M+H 1+ = 2841 - Msel TFA = 3524 - Rdt = 80%). Le linker 1 correspond à un linker de formule I telle que définie précédemment dans laquelle n et m sont égaux à 1, R4 est un groupe alkyl (CH2) et R1 est un alkylaryl (CH2Ph). II. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl-SynB3 L/D. Il sera fait référence à la figure 2 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. La méthode de synthèse du peptide SynB3 L/D de séquence RRLSYSrrrf (SEQ ID NO : 2) est identique à celle du peptide SynB3 ; la synthèse de la (2-benzylaminoacétyl)-cyclosporine a été décrite précédemment. 2. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3 L/D. Un mélange d'acide N-Boc-iminodiacétique (m = 11,9 mg - 51,1 mol), de diisopropycarbodiimide (1 éq. - 7,9 l - 51,1 mol) dans 400 l de dichlorométhane et 100 l de DMF est agité à température ambiante pendant 30 minutes. Transféré sur une solution de (2-benzylamino-acétyl)cyclosporine (68 mg - 46,4 mol), de DIEA (3 éq. - 23 l - 139 mol) dans 300 l de DMF le produit est agité à température ambiante pendant 3h. Le peptide SynB3 L/D (1,1 éq. - 106 mg - 50,9 mol) mélangé à du PyBOP (1,1 éq. - 26. 5 mg - 50,9 mol), de la DIEA (4 éq. - 29 l - 204 jumol) et 2,5 ml de DMF est ajouté au mélange précédent puis agité à température ambiante pendant 14h. Le conjugué est purifié par HPLC préparative. On obtient 126 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 2941 - Msel TFA = 3510 - Rdt = 77%). Le conjugué Boc (103 mg - 35 mol) est solubilisé dans 900 l de HC1 4N dans du dioxane et 90 l de DMF, agité 30 minutes à température ambiante puis purifié par HPLC préparative. On obtient 75 mg de conjugué CsA-linkerl-SynB3 L/D (M+H 1+ = 2841 - Msel TFA = 3524 - Rdt = 60%). III. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker2-SynB3. Il sera fait référence à la figure 3 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (Bochydrazino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la chloroacétyl-cyclosporine ont été décrites précédemment. De la chloroacétyl-cyclosporine (m = 130 mg - 100 mol) est solubilisée dans 2 ml d'acétonitrile en présence de tert-Butyl carbazate (1 éq. - m = 13 mg - 100 mol), de diisopropyléthylamine (4 éq. - 69 l - 400 mol) et de NaI (1 éq. - m = 15 mg - 100 jumol). Le mélange réactionnel est agité à 65 C pendant 24 heures, étendu par 1,5 ml de DMSO et purifié par HPLC préparative pour donner 62 mg de dérivé carbazate de la cyclosporine A (M+Na = 1397 - Rdt = 42%). 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de dérivé carbazate (m = 45 mg - 30 mol), d'acide N-Boc-iminodiacétique (5 eq. - m = 35 mg - 150 mol), de PyBroP (5 éq. - 70 mg - 150 mol), de diisopropyléthylamine (10 éq. - 52 l - 300 mol) dans 75 l de dichlorométhane et 250 l de DMF, est agité à température ambiante pendant 3 jours. On purifie par HPLC préparative et obtient 31 mg de poudre blanche d'intermédiaire diBoqué de la cyclosporine (M+H 1+ = 1590 Rdt = 65%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. Une solution d'intermédiaire diBoqué de la cyclosporine (23 mg - 14,4 mol), peptide SynB3 (1,2 éq. - 36 mg - 17,4 mol), de PyBOP (1,2 éq. - 9 mg - 17,4 mol), DIEA (3 éq. - 7,5 l - 43 jumol) dans 600 l de DMF est agité à température ambiante pendant 1h. Le conjugué est purifié par HPLC préparative. On obtient 14 mg de conjugué diBoc de cyclosporine A (M+H 1+ = 2968 - Msel TFA = 3536 - Rdt = 27%). Le conjugué diBoc (12 mg - 3,4 mol) est solubilisé dans 200 l de DMF et 800 l de TFA. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures 30 minutes, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 5,1 mg de conjugué CsA-linker2-SynB3 (M+H 1+ = 2767 - Msel TFA = 3564 - Rdt = 42%). Le linker 2 correspond à un linker de formule I telle que définie précédemment dans laquelle n et m sont égaux à 1, R4 est un groupe alkyl (CH2) et R1 est de la forme N(R6)R7 avec R6 = R7 = H. IV. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker3-SynB3. Il sera fait référence à la figure 4 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. A un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 85 mg - 58 jumol), HATU (2 éq. - 44,1 mg - 116 mol) et DIEA (4 éq. - V = 38 l - 232 mol) dans 425 l de DMF et 425 l de dichlorométhane, on ajoute une solution d'acide glyoxilique hydraté (1 éq. - m = 5,27 mg - 58 mol) dans 425 l de DMF. On agite à température ambiante pendant 12h. Le brut réactionnel est purifié par HPLC préparative. On obtient 47,5 mg de dérivé glyoxylamide de la CsA (M+H 1+ = 1406 - M+Na 1+ = 1428 - Rdt = 58%). Un mélange de peptide SynB3 (m = 150 mg - 72 mol), d'anhydride d'acide chloroacétique (4 éq. - 49 mg - 288 mol) et DIEA (6 éq. - V = 68 l - 432 mol) dans 1 ml de DMF est agité à température ambiante pendant 6h. Le peptide brut est précipité à l'éther diéthylique puis centrifugé. Le solide obtenu est solubilisé dans 400 l de DMF. On ajoute de l'hydrazine monohydratée (11,4 éq. - 40 l - 825 mol) et agite à température ambiante pendant 3 h. Le mélange réactionnel est purifié par HPLC préparative. On obtient 80 mg de peptide hydrazine (M+H 1+ = 1468 - Rdt = 49%). 3) Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé glyoxylamide de la CsA (m = 6 mg - 4,2 pmol), le peptide hydrazine SynB3 (1,06 éq. - 25 mg - 4,5 mol) dans 400 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (1,4 éq. - 0,4 mg - 6 mol). On agite à température ambiante pendant 3h, ajoute 400 l d'une solution aqueuse contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique puis purifie par HPLC préparative. On obtient 3,5 mg du conjugué CsA-linker3-SynB3 (M+H = 2856 - Msel TFA = 3654 - Rdt = 22%). Le linker 3 correspond à un linker de formule VII telle que définie précédemment dans laquelle R4, R5 et R8 sont des groupes alkyls identiques (CH2) et R1 est un alkylaryl (CH2Ph) et R6 = R7 = H. V. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker4-SynB-.. Il sera fait référence à la figure 5 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptidyl résine SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de peptidyl résine SynB3 (m = 0,8g), d'anhydride d'acide chloroacétique (170 mg - 1,8 mmol) et DIEA (V = 200 l - 1,2 mmol) dans 9 ml de DMF est agité à température ambiante pendant 3h. La résine est lavée au DMF et au dichlorométhane. On ajoute sur la résine un mélange de N-hydroxyphtalimide (m = 150 mg - 920 mol), K2C03 (m = 65 mg - 470 mol) dans 9 ml de DMF et agite 12h à température ambiante. La résine est lavée au DMF et au dichlorométhane puis on ajoute une solution d'hydrazine 5% dans DMF (V = 9ml) et agite 14h à température ambiante. La résine est lavée au DMF et au dichlorométhane puis le peptide est clivé à l'acide trifluoroacétique, précipité à l'éther diéthylique puis centrifugé. Après purification par HPLC préparative, on obtient 97 mg de peptide hydroxylamine (M+H 1+ = 1469). Ce dérivé est solubilisé dans une solution d'acide bromoacétique (1 éq - m= 97 mg - 45 mol), DIEA (4 éq. - V = 30 l - 45 mol) dans 1 ml de DMF. On agite à température ambiante pendant 2 jours puis purifie en HPLC préparative. On obtient 28 mg de peptide hydroxylamine alkylé (M+H 1+ = 1524 - Rdt = 28%). On solubilise le dérivé peptidique obtenu dans une solution de di-tbutyl-dicarbonate (6 éq - m= 12 mg - 53 mol), de DIEA (6 éq - V = 9 ml - 53 mol) dans 1 ml de DMF et chauffe 12h à 50 C. On isole le peptide boc (1 à 3 fois) brut par précipitation à l'éther diéthylique puis centrifugation (M+H = 1624 - 1724-1824 ). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB,. Une solution de dérivé peptidique boc brut (8,9 mol), de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (4,1 éq. - 54 mg - 36,6 mol), de PyBroP (4 éq. - 17 mg 36,5 mol), de DIEA (8,5 éq. - 13 l - 76 mol) dans 300 l de DMF et 50 l de dichlorométhane, est agitée à température ambiante pendant 14h. On purifie par HPLC préparative et obtient 10 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 2955-3055- 3155 - Rdt = 32% environ). Le conjugué Boc (10 mg - 2,8 mol) est solubilisé dans 900 l de HCl 4N dans du dioxane et 90 l de DMF. Le produit est purifié par HPLC préparative. On obtient 0,94 mg de conjugué CsA-linker4SynB3 (M+H 1+ = 2859 - Msel TFA = 3541 - Rdt = 9,5%). Le linker 4 est un linker de formule générale V telle que définie précédemment dans laquelle R4, R5 et R8 sont des groupes alkyls identiques (CH2) et R1 est un alkylaryl (CH2Ph). VI. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker5-SynB3. Il sera fait référence à la figure 6 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et du dérivé glyoxylamide de la CsA ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de peptide SynB3 (m = 100 mg - 48 jumol), d'acide N-Fmoc-a-Aminoisobutyrique (6 éq. - 15,6 mg - 48 pmol), PyBOP (1 éq. - 25 mg - 48 mol) et DIEA (6 éq. - V = 50 l - 290 mol) dans 500 l de DMF est agité à température ambiante pendant lh. On ajoute 50 l de pipéridine (6 éq. - V - 50 .1 - 290 umol) et poursuit l'agitation pendant 12h. Le peptide brut est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis purifié par HPLC préparative. On obtient 77 mg de dérivé peptidique AibSynB3 (M+H 1+ = 1480 - Msel TFA= 2164- Rdt = 73%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé glyoxylamide de la CsA (m = 9 mg - 6,4 mol), le peptide Aib-SynB3 (1,1 éq. - 15 mg - 6,9 mol) dans 400 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (1,2 éq. - 0,5 mg - 8 mol). On agite à 45 C pendant 60h, ajoute 100 l d'une solution aqueuse contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique puis on purifie par HPLC préparative. On obtient 5,3 mg du conjugué CsA-linker5SynB3 (M+H 1+ = 2871 - Msel TFA = 3553 - Rdt = 23%). Le linker 5 est un linker de formule générale II telle que définie précédemment dans laquelle R4 et R2 sont des groupes alkyls linéaires identiques (CH2), R1 est un alkylaryl (CH2Ph) et R3 est un groupe alkyl ramifié par deux alkyls -C(CH3)2. VII. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker6-SynB3. Il sera fait référence à la figure 7 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de peptide SynB3 (m = 50 mg - 24 mol), d'acide N-Boc-Serine (1 éq. - m = 4,9 mg - 24 jumol), HATU (1 éq. - 9,2 mg - 24 mol) et DIEA (7 éq. - V = 29 \il - 170 mol) dans 60 l de DMF est agité lh à température ambiante. On ajoute 5 ml d'acide trifluoroacétique, agite à température ambiante pendant 12 heures puis précipite le peptide à l'éther diéthylique. Après centrifugation, on reprend le résidu dans un tampon phosphate et ajoute du periodate de sodium NaI04 (5 éq. - m = 24,6 mg - 120 mol), agite une heure à température ambiante et purifie par HPLC préparative. On obtient 10,8 mg de dérivé glyoxylamideSynB3 (M+H 1+ = 1452 - Msel TFA = 2022-Rdt = 22%). Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 16 mg - 10,9 mol), d'acide N-Boc-a-aminoisobutyrique (6 éq. - m = 13,2 mg - 65,4 mol), HATU (8 éq. - 33,2 mg - 87 mol) et DIEA (6 éq. - V = 11,2 l - 65,4 mol) dans 80 l de DMF est agité à 40 C pendant 60h. On purifie par HPLC préparative et obtient 7 mg de dérivé Boc-Aib de la CsA (M+H = 1535 - Rdt = 41%). Ce dérivé est solubilisé dans 80 l de DMF et 200 [il d'une solution d'acide trifluoroacétique et agité une nuit à température ambiante. On dilue par 2 ml d'eau-acétonitrile, lyophilise et obtient 6mg huile jaune de dérivé Aib de la CsA (M+H 1+ = 1435 - Msel TFA = 1549 - Rdt = 85%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le peptide glyoxylamide-SynB3 (4,2 mg - 2,1 mol), le dérivé Aib de la CsA (1,85 éq - m = 6 mg - 3,9 mol) dans 145 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique et 25 l de DMF. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (3,8 éq. - 0,5 mg - 8 mol). On agite à 45 C pendant 60h, ajoute 50 l d'une solution aqueuse contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique puis purifie par HPLC préparative. On obtient 1,1 mg du conjugué CsA-linker6-SynB3 (M+H 1+ = 2870 - Msel TFA = 3553 - Rdt = 15%). Le linker 6 est un linker de formule générale II telle que définie précédemment dans laquelle R4 et R3 sont des groupes alkyls linéaires identiques (CH2), R1 est un alkylaryl (CH2Ph) et R2 est un groupe alkyl ramifié par un alkyl -C(CH3)2. VIII. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker7-SynB3. Il sera fait référence à la figure 8 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du dérivé glyoxylamide de SynB3 et de la (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange d'acide N-Boc-aminovalérique (10 éq. - 68 mol - 15,6 mg), de diisopropylcarbodiimide (5 éq. - 34 mol - 5,2 l) est solubilisé dans 180 l de DMF et 30 l de dichlorométhane. Après concentration, au solide repris dans 80 l de DMF, on ajoute de la (2-benzylamino-acétyl)cyclosporine (1 éq. - m = 10 mg - 6,8 mol), de la diméthylaminopyridine (1 éq. - m = 1 mg - 6,8 jumol) et agite à 40 C pendant 48h. On purifie par HPLC préparative et obtient 1,3 mg de dérivé Boc-aminovalérique de la CsA (M+Na = 1424 - Rdt = 13%). Ce dérivé est solubilisé dans 50 l de DMF et 140 \il d'une solution d'acide trifluoroacétique et agité 4h à température ambiante. On dilue par 2 ml d'eau-acétonitrile, lyophilise et obtient 0,8 mg de dérivé aminovalérique de la CsA (M+H 1+ = 1302 Msel TFA = 1415 - Rdt = 62%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le peptide glyoxylamide-SynB3 (8 mg - 3,9 mol), le dérivé aminovalérique de la CsA (1,3 éq. - m = 7,3 mg - 5,2 mol) dans 125 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique et 7,51 de DMF. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (1 éq. - 0,2 mg - 3,9 mol). On agite à 45 C pendant 16h, ajoute 500 l d'une solution aqueuse contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique puis purifie par HPLC préparative. On obtient 1,8 mg du conjugué CsA-linker7-SynB3 (M+H 1+ = 2737 - Msel TFA = 3420 - Rdt = 13%). Le linker 7 est un linker de formule générale VIII telle que définie précédemment dans laquelle R5 = CH2 et R4 = (CH2)4- IX. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker8-SynB3. Il sera fait référence à la figure 9 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. La synthèse du dérivé glyoxylamide de la CsA a été décrite précédemment. La méthode de synthèse du peptide Ala-SynB3 de séquence ARRLSYSRRRF (SEQ ID NO : 3) est identique à celle de SynB3. 2. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé glyoxylamide de la CsA (m = 5 mg - 3,5 mol), le peptide Ala-SynB3 (1,4 éq. - 10,5 mg - 4,9 mol) dans 200 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (3,5 éq. - 0,8 mg - 12,4 jumol). On agite à température ambiante pendant 12h, ajoute 100 l d'eau puis purifie par HPLC préparative. On obtient 1 mg du conjugué CsA-linker8-SynB3 (M+H 1+ = 2855 - Msel TFA = 3539 - Rdt = 8%). Le linker 8 est un linker de formule générale II telle que définie précédemment dans laquelle R4 et R2 sont des groupes alkyls linéaires identiques (CH2), RI est un alkylaryl (CH2Ph) et R3 est un groupe alkyl ramifié par un alkyl -CH (CH3) - X. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker9-SynB3. Il sera fait référence à la figure 9 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. La synthèse du dérivé glyoxylamide de la CsA a été décrite précédemment. La méthode de synthèse du peptide PAla-SynB3 de séquence (3Ala-RRLSYSRRRF (SEQ ID NO : 4) est identique à celle de SynB3. 2. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé glyoxylamide de la CsA (m = 6,7 mg - 4,7 mol), le peptide ssAla-SynB3 (1,5 éq. - 15 mg - 7 mol) dans 300 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (3,5 éq. - 3,5 mg - 16,4 mol). On agite à température ambiante pendant 12h, ajoute 100 l d'eau puis purifie par HPLC préparative. On obtient 2 mg du conjugué CsA-linker9-SynB3 (M+H 1+ = 2856 - Msel TFA = 3539 - Rdt = 12%). Le linker 9 est un linker de formule générale I telle que définie précédemment dans laquelle R4 est un groupe alkyl linéaire (CH2), RI est un alkylaryl (CH2Ph), n = 1 et m = 2. XI. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linker 10-SynB3. Il sera fait référence à la figure 10 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2- benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 52,8 mg - 36 mol), N-Boc-serine (1,2 éq. - m = 8,9 mg - 43 mol), HATU (1,2 éq. - 16,4 mg - 43 mol) et DIEA (3 éq. - V = 18,8 l - 108 mol) dans 150 l de DMF est agité à température ambiante pendant 6h. On ajoute alors de l'anhydride succinique (4 éq. - m = 14,4 mg - 144 mol), de la DIEA (2 éq. - 12,5 l - 72 mol) et de la DMAP (1,2 éq m = 5,2 mg - 43 mol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 12h. Le brut réactionnel est purifié par HPLC préparative. On obtient 24 mg de dérivé succinylé de la CsA (M+H 1+ = 1638 - M+Na 1+ = 1660 - Rdt = 40%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé succinylé de la CsA (m = 14,3 mg - 8,7 mol) dans 200 l de DMF, ajoute le peptide SynB3 (1,3 éq. - 23 mg - 11 jumol), du PyBOP (1,3 éq. - 7,5 mg - 11 jumol), de la DIEA (3 éq. - 4,5 l - 26 mol). On agite à température ambiante pendant 2h. On ajoute 800 l de TFA. Après agitation à température ambiante pendant 30 minutes, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 21 mg de conjugué CsA-linkerlO-SynB3 (M+H 1+ = 2913 - Msel TFA = 3597 - Rdt = 67%). Le linker 10 est un linker de formule générale IV telle que définie précédemment dans laquelle R4 et R5 sont des groupes alkyls linéaires identiques (CH2), R8 est un groupe alkyl linéaire (CH2)2, R1 est un alkylaryl (CH2Ph). XII. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerll-SynB3. Il sera fait référence à la figure 11 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 50 mg - 34,1 mol), N-Boc-L-trans-4-hydroxyproline (1,2 éq. - m = 9,5 mg - 41 mol), HATU (1,2 éq. - 15,5 mg - 41 jumol) et DIEA (3 éq. - V = 17,8 l - 102 mol) dans 200 l de DMF est agité à température ambiante pendant 12h. On ajoute du HATU (0,38 éq. - 5 mg - 13 mol) et agite lh supplémentaire. On ajoute alors de l'anhydride succinique (4 éq. - m = 13,6 mg - 136,4 mol), de la DIEA (3 éq. - 23 l - 139 mol) et de la DMAP (1 éq - m = 4,1 mg - 34,1 mol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 12h. Le brut réactionnel est purifié par HPLC préparative. On obtient 40 mg de dérivé succinylé de la CsA (M+H 1+ = 1665 - M+Na 1+ = 1687 - Rdt = 70%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On solubilise le dérivé succinylé de la CsA (m = 20 mg - 12 jumol) dans 600 l de DMF, ajoute le peptide SynB3 (1 éq. - 25 mg - 12 jumol), du PyBOP (1,2 éq. - 7,5 mg - 14,4 mol), de la DIEA (3 éq. - 6,2 l - 36 jumol). On agite à température ambiante pendant 4h puis purifie par HPLC préparative. On obtient 30 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 3041 - Msel TFA = 3611 - Rdt = 69%). Le conjugué Boc (19 mg - 5,3 jumol) est solubilisé dans 300 l de DMF puis on ajoute 700 l de TFA. Après agitation à température ambiante pendant 14h, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 7,4 mg de conjugué CsA-linkerll-SynB3 (M+H 1+ = 2941 - Msel TFA = 3625 - Rdt = 39%). Le linker 11 est un linker de formule générale III telle que définie précédemment dans laquelle R4 est un groupe alkyl linéaire (CH2), R5 est un groupe alkyl linéaire (CH2)2 et Ri est un alkylaryl (CH2Ph). XIII. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl2-SynB3. Il sera fait référence à la figure 12 en annexe qui représente schématiquement la structure chimique du composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment . 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 80 mg - 56 mol), N-Boc-D-trans-4-hydroxyproline (3 éq. - m = 38,6 mg - 168 mol), PyBroP (3 éq. - 79 mg - 168 mol) et DIEA (10,3 éq. - V = 100 l - 580 mol) dans 380 l de DMF est agité à température ambiante pendant 18h. On ajoute alors de l'anhydride succinique (8 éq. - m = 44,8 mg - 448 mol) en deux fois sur 24 heures. Le brut réactionnel est purifié par HPLC préparative. On obtient 55,2 mg de dérivé succinylé de la CsA (M+H 1+ = 1662 - Rdt = 60%). 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB. On solubilise le dérivé succinylé de la CsA (m = 55,2 mg - 33 mol) dans 332 l de DMF, ajoute le peptide synB3 (2 éq. - 104 mg - 66 mol), du PyBOP (2 éq. - 35 mg - 66 mol), de la DIEA (8 éq. - 46,4 l - 264 mol). On agite à température ambiante pendant 14h puis purifie par HPLC préparative. On obtient 55,5 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 3040 - Msel TFA = 3611 - Rdt = 46%). Le conjugué Boc (53 mg - 14,6 mol) est solubilisé dans 800 l de DMF puis on ajoute 3 ml de TFA et 200 l de triisopropylsilane. Après agitation à température ambiante pendant lh, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 27,6 mg de conjugué CsA-linkerl2-SynB3 (M+H 1+ = 2939 - Msel TFA = 3625 - Rdt = 52%). XIV. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl3-SynB3. Il sera fait référence à la figure 12 en annexe qui représente schématiquement la structure chimique du composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 40 mg - 27,3 mol), N-Boc-D-cis-4-hydroxyproline (2,25 éq. - m = 14,4 mg - 61 jumol), PyBroP (3,25 éq. - 42 mg - 110 mol) et DIEA (7,5 éq. - V = 36 l - 210 mol) dans 255ul de DMF est agité à température ambiante pendant 48h. On purifie par HPLC préparative et obtient 9,5 mg de dérivé N-Boc-D-cis-4-hydroxyproline de la CsA (M+H 1+ = 1563 - Rdt = 22%). On solubilise 9 mg de ce dérivé dans 50 l de DMF, ajoute de l'anhydride succinique (3 éq. - m = 1,7 mg - 17 mol), de la DMAP (1 éq - m = 0,7 mg - 5,7 mol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 24h. 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On ajoute le peptide SynB3 (2 éq. - 11,8 mg - 11,4 mol), du PyBOP (2 éq. - 11,8 mg - 11,4 mol), de la DIEA (15 éq. - 15 l - 87 mol). On agite à température ambiante pendant 14h puis purifie par HPLC préparative. On obtient 4,3 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 3039 - Msel TFA = 3611 - Rdt = 21%). Le conjugué Boc (1,0 mg - 0,28 mol) est solubilisé dans 11 l de DMF puis on ajoute 3 l de triisopropylsilane et 44 l de TFA. Après agitation à température ambiante pendant 3h, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 0,37 mg de conjugué CsA-linkerl3-SynB3 (M+H 1+ = 2941 - Msel TFA = 3625 - Rdt = 36%). XV. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl4-SynB3. Il sera fait référence à la figure 12 en annexe qui représente schématiquement la structure chimique du composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. Les synthèses du peptide SynB3 et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine ont été décrites précédemment. 2. Synthèse du conjugué de Cyclosporine A. Un mélange de (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine (m = 80 mg - 54,6 mol), N-Boc-L-cis-4-hydroxyproline (6 éq. - m = 76 mg - 328 mol), PyBroP (6 éq. - 160 mg - 328 pmol) et DIEA (10,6 éq. - V = 100 l - 580 mol) dans 380 l de DMF est agité à température ambiante pendant 48h. On purifie par HPLC préparative et obtient 22 mg de dérivé NBoc-L-cis-4-hydroxyproline de la CsA (M+H 1+ = 1563 - rdt = 25%). On solubilise ce dérivé dans 200 l de DMF, ajoute de l'anhydride succinique (4 éq. - m = 6 mg - 56 mol), de la DIEA (12 éq - m = 30 l - 174 jumol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 24h. 3. Couplage de la Cyclosporine A sur SynB3. On ajoute le peptide synB3 (2 éq. - 58 mg - 28 jumol) , du PyBOP (2 éq. - 14,5 mg - 11,4 mol), agite à température ambiante pendant 4h puis purifie par HPLC préparative. On obtient 10 mg du conjugué Boc de cyclosporine A (M+H 1+ = 3041 - Msel TFA = 3611 - Rdt = 20%). Le conjugué Boc (lOmg - 2,7 mol) est solubilisé dans 111 l de DMF puis on ajoute 444 l de TFA et 28 l de triisopropylsilane. Après agitation à température ambiante pendant 2h, le produit est précipité à l'éther diéthylique, centrifugé puis le culot est purifié par HPLC préparative. On obtient 6 mg de conjugué CsA-linkerl4-SynB3 (M+H 1+ = 2939 - Msel TFA = 3625 - Rdt = 60%). Les linkers 12 à 14 sont des stéréoisomères du linker 11 décrit ci-dessus. XVI. Synthèse Chimique de la Cyclosporine vectorisée CsA-linkerl-SynB1. Il sera fait référence à la figure 9 en annexe qui représente schématiquement la synthèse chimique d'un composé vectorisé de la cyclosporine. 1. Synthèse du peptide vecteur et de la (2benzylamino-acétyl)-cyclosporine. La méthode de synthèse du peptide Gly-SynBl de séquence GRGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO : 5), dérivé du peptide SynBl de séquence RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO : 6), est identique à celle du peptide synB3. La synthèse de la (2-benzylamino-acétyl)-cyclosporine a été décrite précédemment . 2. Couplage de la Cyclosporine A sur SynBl. On solubilise le dérivé glyoxylamide de la CsA (16,2 mg - 11,5 jumol), le peptide Gly-SynBl (1,5 éq. - 50,9 mg - 17 mol) dans 400 l d'une solution de méthanol contenant 1% d'acide acétique et 200 l de DMF. On ajoute du cyanoborohydrure de sodium (1 éq. - 1 mg - 11,5 mol). On agite à 40 C pendant 48h, ajoute 4ml d'eau-acétonitrile puis purifie par HPLC préparative. On obtient 8,6 mg du conjugué CsA-linkerl-SynBl (M+H 1+ = 3546 - Msel TFA = 4344 Rdt = 18%). B. TESTS DES COMPOSES I. Composés testés. Les composés testés sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. Composé Structure CsA-linkerl-SynB3 Cyclosporine A-linkerl-RRLSYSRRRF CsA-linker2-synB3 Cyclosporine A-linker2-RRLSYSRRRF CsA-linker3-SynB3 Cyclosporine A-linker3-RRLSYSRRRF CsA-linker4-SynB3 Cyclosporine A-linker4-RRLSYSRRRF CsA-linker5-SynB3 Cyclosporine A-linker5-RRLSYSRRRF CsA-linker6-SynB3 Cyclosporine A-linker6-RRLSYSRRRF CsA-linker7-SynB3 Cyclosporine A-linker7-RRLSYSRRRF CsA-linker8-SynB3 Cyclosporine A-linker8-RRLSYSRRRF CsA-linker9-SynB3 Cyclosporine A-linker9-RRLSYSRRRF CsA-linkerlO-SynB3 Cyclosporine A-linkerlO-RRLSYSRRRF CsA-linkerll-SynB3 Cyclosporine A-linkerll-RRLSYSRRRF CsA-linkerl-SynB3 L/D Cyclosporine A-linkerl-RRLSYSrrrf Tableau 1 : Composés testés II. Essais de Cinétique de libération de la Cyclosporine A native dans un tampon de pH proche d'un milieu biologique. 1. Libération dans un tampon phosphate. Le conjugué testé est solubilisé à une concentration finale de 10 M dans un tampon phosphate 10 mM de pH 7,5 additionné de 30% d'acétonitrile. On réalise une cinétique de libération de la cyclosporine A par le conjugué à 37 C, en prélevant une partie de la solution à un temps choisi et en l'analysant par une chromatographie HPLC couplée à un spectromètre de masse tandem (mode d'ionisation électrospray). En s'appuyant sur une courbe de calibration, l'intensité de la transition 1203,3 > 675,6 représentative de la cyclosporine A, permet de calculer la quantité de cyclosporine présente dans chaque échantillon. On peut ainsi tracer les courbes représentant la quantité de cyclosporine A libérée en fonction du temps d'incubation du conjugué dans le tampon. Un temps de demi-libération de la quantité de CsA (temps où 50% de la CsA libre est relarguée du produit vectorisé) est ensuite estimé pour le conjugué testé. 2. Résultats. Les temps de demi-libération estimés sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous : Composé testé T 1/2 libération (en heure) CsA-linkerl-SynB3 0,83 CsA-linker2-synB3 3 CsA-linker3-SynB3 8 CsA-linker4-SynB3 >20 CsA-linker5-SynB3 >48 CsA-linker6-SynB3 >18 CsA-linker7-SynB3 >48 CsA-linker8-SynB3 >48 CsA-linker9-SynB3 4,7 CsA-linkerlO-SynB3 48 CsA-linkerll-SynB3 1,5 Tableau 2 : Temps de demi-libération estimés Les conjugués testés libèrent la cyclosporine A avec des vitesses qui diffèrent selon le linker présent dans le conjugué. Le choix du linker permet donc de moduler la vitesse de libération de la cyclosporine A dans un tampon aqueux proche d'un milieu biologique. III. Essais de Cinétique de libération de la Cyclosporine A dans des tampons de différents pH. 1. Effet du pH sur la vitesses de libération. Le conjugué testé est solubilisé à une concentration finale de 10 M dans des tampons aqueux de divers pH additionné de 30% d'acétonitrile. On réalise une cinétique de libération de la cyclosporine A par le conjugué à 37 C, en prélevant une partie de la solution à un temps choisi. La quantité de cyclosporine A présente dans chaque échantillon est mesurée comme décrit précédemment. On peut ainsi tracer les courbes représentant la quantité de cyclosporine A libérée en fonction du temps d'incubation du conjugué dans le tampon et en fonction du pH de la solution d'incubation. 2. Résultats. Les pourcentages de Cyclosporine A libérée sont indiqués dans les tableaux 2 à 6 ci-dessous : % de Cyclosporine A libérée à divers pH Temps(h)/pH 3 6 6. 5 7 7. 5 9 0 0 0 0,4 0,7 0,8 0,4 0,5 0 9,3 17,6 26,4 29,2 13,9 2 0 38 54,9 64,8 66,1 47,6 4 0 61,6 72,3 77,1 74,2 70,3 8 0,5 75,3 79 83,1 77,2 63,4 19 0,8 81,7 81,5 81,4 77,8 87,2 44 1,8 98 93,3 100 90,5 69,7 Tableau 2 : CsA-linkerl-SynB3 % de Cyclosporine A libérée à divers pH Temps(h)/pH 3 6 6,5 7 7,5 9 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 3,0 6,2 8,2 11,0 4,5 2 0,0 12,1 22,9 28,6 35,7 17,4 4 0,0 24,9 40,7 44,7 51,5 35,1 8 0,0 39,1 55,1 55,9 60,9 55,0 19 0,0 58,3 65,7 60,6 63,7 74,6 44 0,0 69,1 77,3 72,9 74,5 100,0 Tableau 3 : CsA-linker2-SynB3 % de Cyclosporine A libérée à divers pH Temps(h)/pH 3 6 6,5 7 7,5 9 0 0,0 0,0 0,6 0,7 0,9 3,9 0,5 0,0 0,7 0,8 1,1 11,6 22,2 2 0,6 1,8 2,7 4,2 9,3 62,9 4 1,1 13,9 22,8 30,1 47,4 100,0 8 1,0 23,5 33,1 51,4 69,0 93,6 19 1,5 36,9 48,0 70,9 81,6 82,9 44 0,0 69,1 77,3 72,9 74,5 100,0 Tableau 4 : CsA-linker3-SynB3 % de Cyclosporine A libérée à divers pH Temps(h)/pH 3 6 6,5 7 7,5 9 0 0,0 0,0 0,0 0,9 0,7 1,0 0,25 0,0 1,3 1,6 5,5 4,0 5,7 2 0,0 15,6 13,2 42,3 21,6 24,3 4 0,0 49,3 78,2 83,2 93,7 100,0 8 0,6 87,6 94,9 96,8 95,1 99,3 19 0,6 82,7 82,7 85,0 87,6 77,8 44 0,0 69,1 77,3 72,9 74,5 100,0 Tableau 5 : CsA-linker9-SynB3 % de Cyclosporine A libérée à divers pH Temps (h)/pH 3 6 6,5 7 7,5 9 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,8 0,5 0,0 5,2 9,9 13,8 22,5 97,4 2 0,0 21,1 35,0 44,3 57,6 97,8 4 0,0 37,4 54,8 60,3 72,0 99,5 8 0,0 61,9 75,3 75,5 81,7 96,7 19 0,0 75,8 82,6 79,1 82,3 95,5 44 2,1 92,6 100,0 89,6 90,7 98,0 Tableau 6 : CsA-linkerll-SynB3 Les cinétiques de libération des conjugués à divers pH sont représentées dans les figures 13 à 17. Les conjugués testés, donc les linkers testés, libèrent la cyclosporine A avec des vitesses qui diffèrent en fonction du pH du milieu d'incubation. Les vitesses de libération restent élevées dans la gamme de pH proche du pH physiologique (pH=6 à pH=9). Par contre, en milieu acide (pH=3), la libération de la cyclosporine A est très lente. IV. Essais de Stabilité dans un milieu acide. 1. Effet du pH sur la vitesses de libération. Le conjugué testé est solubilisé à une concentration finale de 2,7 mM dans un tampon aqueux de pH 3. On chauffe pendant 1 mois à 37 C puis mesure la quantité de conjugué présente dans chaque échantillon en l'analysant par une chromatographie HPLC couplée à un spectromètre de masse tandem (mode d'ionisation électospray). En s'appuyant sur une courbe de calibration, l'intensité de la transition 559,7 > 553,7 représentative du conjugué, permet de calculer la quantité de conjugué présente après 1 mois. On peut la comparer à la quantité de conjugué présente initialement et ainsi évaluer la stabilité du linker en milieu acide. 2. Résultats. Les pourcentages de quantité de conjugué présente après 1 mois à 37 C par rapport à la quantité présente initialement sont indiqués dans le tableau 7 ci-dessous : Conjugué testé % de conjugué présent CsA-linkerl-SynB3 94,9 CsA-linkerl-SynB3 L/D 92,7 Tableau 7 : % de conjugué présent après 1 mois à 37 C V. Essais de Stabilité dans du plasma de souris. 1. Effet du pH sur la vitesses de libération. Les stabilités ont été étudiées dans du plasma de souris femelles. Les temps choisis pour les cinétiques sont 0,10, 20,30, 40,50, 60,120, 180 et 240 min. En partant du temps cinétique le plus grand, 200 l de plasma à 37 C sont introduits après agitation dans un tube. 70 /il d'une solution de PBS (pH 7,4 - 42,85 mM) et 30 ul d'une solution de conjugué (1 mM dissous dans DMF/H20, 30/70, v/v) sont ajoutés, le mélange est agité et incubé à 37 C. Les concentrations finales en conjugué et en PBS sont respectivement de 100 M et 10 mM; le pH est alors de 7. La réaction est arrêtée en ajoutant 400 l d'H2O/TFA 1% dans chaque tube. Les milieux sont alors chauffés 10 min à 50 C. L'extraction est réalisée avec des colonnes SPE C18 lml préalablement conditionnées. Les cartouches sont lavées à l'eau et l'élution est effectuée avec ACN/isoPOH/H20/TFA (50/40/10/ 5%). Les fractions d'élution sont alors analysés en MS (MALDI-TOF) et en HPLC analytique. 2. Résultats. Le rendement d'extraction est donné par le rapport de l'aire du pic correspondant au conjugué pour le recovery sur l'aire du pic du conjugué du blanc. Le rapport de l'aire du pic du conjugué à T=0 sur l'aire du pic du conjugué pour le recovery correspond à l'influence de la matrice. Les différents rendements obtenus pour les trois conjugués testés et la CsA seule sont présentés dans le tableau ci-dessous : Rendement d'extrac- Influence de la Composés tion (Rec/blc) matrice (To/rec) CsA 105 77 CsA-linkerl-SynB3 93,3 82,8 CsA-linkerll-SynB3 70 (TO/blc)CsA-linkerl-SynBl 80,2 97,6 L'analyse par MS et par HPLC permet de déterminer les différents sites de coupures enzymatiques au niveau des peptides (données non présentées) et montre également que la cyclosporine A est très faiblement libérée dans du plasma de souris après 4 heures à 37 C (non détectable en HPLC). III. Modifications des propriétés physico-chimiques de la substance active. 1. Augmentation de la solubilité en milieu aqueux. La cyclosporine A est décrite pour avoir une faible solubilité dans l'eau, soit à 20 C, 33 g/ml correspondant à une concentration de 0,027 mM. La solubilité dans l'eau du conjugué est évaluée en utilisant la spectrophotométrie UV et un contrôle visuel de l'échantillon. Des quantités croissantes de conjugués sont ajoutées à un volume fixé d'eau. Après centrifugation, l'absorbance du surnageant est mesurée à 280 nm, On considère que le produit est soluble tant que la courbe Abs = fonction (concentration théorique) reste linéaire. 2. Résultats. Pour le composé CsA-linkerl-SynB3 (Msel TFA = 3525), la courbe Abs = fonction (concentration) représentée dans la figure 18 reste linéaire jusqu'à la concentration de 123 mg/ml correspondant à une concentration de 34,8 mM. Si on augmente la concentration à 156 mg/ml, un début de précipitation apparaît, correspondant à la limite de solubilité du conjugué. L'augmentation de la solubilité dans l'eau de la cyclosporine A par son couplage au vecteur, est donc supérieure à un facteur 1000. REFERENCES Dubowchik G.M., Firestone, R.A., Padilla, L., Willner, D., Hofstead, S.J., Mosure, K., Knipe, J.O., Lasch, S. 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REVENDICATIONS 1) Composé comprenant au moins une substance active et au moins un vecteur, lesdits substance active et vecteur étant reliés par un agent de liaison caractérisé en ce que l'agent de liaison présente la structure suivante : -C (O) -R4-NRl-Hyp-O-C (O) -R5-C (O) - (III) dans laquelle : R1 est H, OR6, N(R6)R7, un alkyl, un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, R4 et R5 sont, indépendamment, des alkyls linéaires (CH2)n ou ramifiés par un ou deux ou une combinaison d'alkyl, aryl, alkylaryl, acyl, allyl ou tout autre alkyl ramifié pouvant porter des groupes hétéroatomiques, n étant un entier indépendant supérieur ou égal à 1, R6 et R7 sont, indépendamment H, un alkyl , un aryl, un alkylaryl, un acyl ou un allyl, Hyp-0 représente un résidu hydroxyproline où le groupe hydroxy est en position 2,3 ou 4 de la proline, la liaison au reste du bras de liaison se faisant par l'intermédiaire de l'oxygène du groupe hydroxy de l'hydroxyproline, les carbones asymétriques présents dans les groupes R4, R5, R6, R7 ou Hyp-0 pouvant être de configuration R ou S. 2) Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent de liaison répond à la formule suivante : -C(O) -CH2-N(CH2-C6H5) -Hyp-O-C (O) - (CH2)2-C(O) - (Linker 11). 3) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite substance active est liée directement ou indirectement à l'agent de liaison par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel. 4) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit vecteur est lié directement ou indirectement à l'agent de liaison par l'intermédiaire d'un groupe fonctionnel. 5) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit vecteur est un composé permettant de modifier les propriétés physico-chimiques ou pharmaco-cinétiques de ladite substance active. 6) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi des acides aminés naturels ou non naturels, des protéines, des peptides vecteurs, des saccharides, des polysaccharides et des polymères naturels ou de synthèse. 7) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite substance active est choisie parmi des molécules d'intérêt biologique telles que des protéines, des polypeptides, des peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques, des oligonucléotides, des ribozymes, des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales. 8) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite substance active est choisie parmi un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie. 9) Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile dans le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales. 10) Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 8, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le diagnostic d'une pathologie humaine ou animale. 11) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 12) Agent de liaison tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8.