Brevet FR2852605A1 — publié le 20040924

L'invention concerne un procédé de préparation de fragments d'ADN et ses applications, notamment pour l'hybridation d'acides nucléiques. De nombreuses techniques reposant sur le principe d'hybridation de molécules d'acides nucléiques possédant des séquences complémentaires sont utilisées dans des domaines extrêmement variés de la biologie, notamment pour détecter la présence d'acides nucléiques (ARNm, ADN) à partir d'échantillons à analyser, identifier d'éventuelles variations dans leur séquence ou bien déterminer cette séquence. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer : l'analyse des génomes, la cartographie génétique, le génotypage et l'identification d'espèces, de variétés, d'individus (animal, végétal, microorganisme) par recherche d'empreintes génétiques (DNA fingerprinting), la détection de polymorphisme (SNP ou Single Nucleotide Polymorphism), la recherche de mutations ou de gènes liés à des caractères phénotypiques et le miniséquençage, ainsi que l'analyse des transcriptomes, en particulier, l'établissement de profils d'expression géniques. De manière générale, l'hybridation est effectuée sur des échantillons constitués d'ADN double-brin (extrait d'ADN génomique ou ADNc synthétisé à partir d'un extrait d'ARN). L'ADN double-brin est fragmenté à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction, les fragments d'environ 200 à 400 pb sont purifiés, liés de façon covalente - par hybridation (extrémités cohésives) puis ligation à l'aide de ligase (extrémités franches ou cohésives) - à des oligonucléotides double-brin (adaptateurs) dont l'extrémité correspond à la séquence du ou des site(s) de restriction desdites enzymes, puis les fragments sont amplifiés par des réactions d'amplification en chaîne (PCR) à l'aide d'amorces oligonucléotidiques incluant le ou les sites de restriction précédents et dont l'une au moins est marquée à son extrémité 5', de façon à obtenir une quantité suffisante de cibles marquées pour l'hybridation avec la sonde (Demande EP 0 534 858 au nom de KEYGENE). Les produits PCR ainsi obtenus constituent les cibles qui sont hybridées avec une ou plusieurs sondes immobilisées sur un support approprié (plastique, membrane de nylon, verre, gels, silicium..), chaque sonde étant constituée par une molécule d'acide nucléique simple-brin, dont la séquence est complémentaire de tout ou partie de celle de la cible. Des supports miniaturisés sur lesquels sont fixés de nombreuses sondes (puces à ADN) permettent ainsi de visualiser simultanément des centaines de réactions d'hybridation de fragments cibles (marqués) avec des sondes spécifiques. De nombreuses applications, en particulier celles qui impliquent la discrimination d'une base entre la séquence de la cible et de la sonde (détection de SNP), requièrent l'utilisation de sondes courtes. Dans ce cas, l'hybridation de produits PCR, c'est-à-dire de cibles de plusieurs centaines de paires de bases avec des sondes de 10 à 20 bases est souvent de mauvaise qualité (signaux faibles, faux négatifs et faux positifs) pour les raisons suivantes : - la présence de structures secondaires dans la cible diminue l'efficacité de l'hybridation de la sonde, du fait de la diminution de l'accessibilité à la cible et de l'impossibilité d'optimiser les conditions d'hybridation en raison de la présence d'un grand nombre de fragments, de structures différentes, à hybrider avec une même sonde, et - des réactions d'hybridation non-spécifique ou d'hybridation croisée avec des séquences non-cibles possédant des similarités avec la séquence cible conduisent à des faux positifs qui réduisent la capacité à détecter de faibles quantités de séquences spécifiques et la capacité de discrimination de ces techniques, du fait de l'augmentation du bruit de fond. Ainsi, différentes améliorations ont été proposées pour augmenter la sensibilité (signaux faibles, faux négatifs) et la spécificité (faux positifs) de ces techniques : - augmentation de la durée d'hybridation (de l'ordre de 12 h à 18 h ; Dai et al., NAR, 2002,30 (13), e86 ; Ramakrishnan et al., NAR, 2002,30, 1-12 ; Rodriguez et al., Molecular Biotechnology, 1999, 11, 1 à 12 ; Kane et al., NAR, 2000, 28, 4552-4557) ; cette approche qui permet d'obtenir un bon signal d'hybridation spécifique de la séquence à détecter est incompatible avec les objectifs actuels d'analyse à haut-débit impliquant le traitement rapide d'un grand nombre d'échantillons (miniaturisation, parallélisation des expériences..), - hybridation de la sonde avec un produit PCR simple brin, obtenu par une réaction de PCR asymétrique (Guo et al., Genome Research, 2002,12, 447- 457) ; cette solution qui permet d'augmenter le signal d'hybridation d'un facteur 4 à 5, implique des étapes supplémentaires de purification du produit PCR double-brin et d'amplification d'un fragment PCR simple-brin marqué. - optimisation de la longueur et de la composition de la séquence de la sonde, à l'aide de logiciels appropriés ; cette solution qui permet d'améliorer la qualité de l'hybridation en limitant le nombre de structures secondaires et en homogénéisant les températures d'hybridation des sondes ne résout pas les problèmes de réactions croisées liées à la taille et à la structure des cibles. - utilisation d'oligonucléotides auxiliaires (Rodriguez et al., précité), consistant en une préhybridation de la cible avec de courtes séquences oligonucléotidiques aléatoires et variées avant l'étape d'hybridation avec la sonde, dans le but de rompre les structures secondaires de la cible dans la région à analyser et de limiter la baisse du rendement d'hybridation, due à la présence de séquences redondantes dans la cible ; cette stratégie est coûteuse et n'est pas efficace, dans la mesure où les oligonucléotides ajoutés entrent finalement en compétition avec la sonde et diminuent le signal d'hybridation. Il ressort de ce qui précède qu'il existe un réel besoin de disposer de méthodes d'hybridation d'acides nucléiques, mieux adaptées aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'elles sont rapides, sensibles, spécifiques et simples à mettre en #uvre. De telles méthodes permettant ainsi d'analyser simultanément un grand nombre d'échantillons sur des supports du type puces à ADN, quelle que soit la technique utilisée, seraient donc parfaitement adaptées à l'ensemble des applications précitées, dans le domaine de la génomique et de la protéomique. C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont mis au point un procédé de préparation de fragments d'ADN qui permet avantageusement d'obtenir de courts fragments d'ADN et par conséquent d'obtenir une hybridation rapide, efficace et spécifique de molécules d'acides nucléiques (ADN, ARN) ; procédé est utile aussi bien pour la préparation d'ADN-cibles aptes à s'hybrider avec des sondes nucléotidiques et en particulier avec des sondes oligonucléotidiques, que pour la préparation de sondes à ADN, notamment de puces à ADN aptes à s'hybrider avec des acides nucléiques-cibles (ADN, ARN). La présente invention a ainsi pour objet, un procédé de préparation de fragments d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la préparation de fragments d'ADN double-brin, à partir d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser, b) la ligation des extrémités desdits fragments d'ADN à un oligonucléotidique double-brin (adaptateur AA') comprenant le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction dont le site de coupure est situé en aval dudit site de reconnaissance, c) l'amplification desdits fragments liés audit adaptateur, à l'aide d'un couple d'amorces appropriées, l'une au moins étant éventuellement marquée à son extrémité 5', et d) la coupure desdits fragments d'ADN à proximité d'une de leurs extrémités, à l'aide de ladite enzyme de restriction, de façon à générer des fragments courts. Au sens de la présente invention, on entend par fragment court, un fragment inférieur à 100 bases ou 100 paires de bases, de préférence d'environ 20 à 50 bases ou paires de bases. Le procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'invention permet avantageusement d'obtenir des fragments courts c'est-à-dire d'une longueur équivalente à celle des sondes oligonucléotidiques ; de tels fragments courts comme cibles ou sondes dans des techniques d'hybridation, présente les avantages suivants par rapport aux techniques d'hybridation de l'art antérieur : # sensibilité et spécificité La sensibilité et la spécificité de l'hybridation sont augmentées du fait de : - la diminution des réactions d'hybridation croisée et des fauxpositifs, par élimination des séquences non-cibles , - l'augmentation du signal d'hybridation par diminution des structures secondaires de l'ADN, - l'harmonisation des conditions d'hybridation (température), - la pureté de l'ADN (élimination de l'enzyme, des tampons et des longs fragments d'ADN restants.) # simplicité La préparation de fragments d'ADN (cible ou sonde) comprend des étapes simples à mettre en #uvre (digestion enzymatique, ligation et amplification PCR). En outre, l'optimisation de l'ADN (cible ou sonde) permet d'obtenir une hybridation de bonne qualité (pas de faux-positifs, peu de bruit de fond...) et donc de minimiser le nombre de contrôles nécessaires et par conséquent de réduire la complexité de la puce. # rapidité La durée d'hybridation est réduite de façon importante et est infé- rieure à 1 h (environ 15 à 20 min), au lieu de 12 h à 18 h dans les techniques de l'art antérieur. # coût peu élevé Le procédé de préparation d'ADN selon l'invention est peu coûteux, comparé à l'utilisation d'oligonucléotides auxiliaires. En outre, la réduction de la complexité de la puce permet de réduire le coût de cette dernière. En raison de ces différents avantages, le procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'invention est particulièrement bien adapté à : - l'analyse rapide d'un grand nombre d'échantillons d'ADN-cible sur des puces à ADN et ce, quelle que soit la technique d'hybridation utilisée, et par conséquent les applications envisagées (miniséquençage, génotypage, recherche de polymorphisme par SNP, établissement de profils d'expression géniques), - la préparation de sondes de taille réduite et contrôlée à partir d'ARN ou d'ADN génomique, notamment pour la fabrication de puces à ADN sur lesquelles sont immobilisées lesdites sondes. Conformément au procédé de l'invention, les étapes a) et b) sont réalisées successivement ou simultanément. Conformément au procédé de l'invention, les fragments d'ADN double-brin de l'étape a) sont obtenus par les techniques classiques connues en elles mêmes. Par exemple, l'ADN génomique extrait de l'échantillon à analyser est fragmenté de façon aléatoire à l'aide d'une ou plusieurs endonucléase (s) de restriction), sélectionnée (s) fonction de leur fréquence de coupure de l'ADN à analyser, de façon à obtenir des fragments inférieurs à 1000 pb, de l'ordre de 200 à 400 pb. L'ARN (ARNm, ARN génomique d'un microorganisme...) est extrait de l'échantillon à analyser, converti en ADNc double-brin par rétro-transcription, puis fragmenté de façon analogue à l'ADN génomique. Parmi les endonucléases utilisables pour couper l'ADN de mammifères, on peut citer de façon non-limitative : EcoR I, Dra I, Ssp I, Sac I, BamHI, BbvC I, Hind III, Sph I, Xba I et Apa I. Conformément au procédé de l'invention, l'adaptateur de l'étape b) est un oligonucléotide d'au moins 6 pb, formé de deux brins complémentaires (A et A', figure 2) comprenant le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction (zone 2) dont le site de coupure est situé en aval du site de reconnaissance. Parmi ces enzymes de restriction, on peut citer de façon non-limitative : Bpm I, Bsg I et BpuE I qui coupent 16 nucléotides en aval de leur site de reconnaissance, et Eci I, BsmF I, Fok I, Mme I et Mbo II qui coupent respectivement 11, 10, 9, 20 et 8 nucléotides en aval de leur site de reconnaissance. Ledit adaptateur est lié aux extrémités dudit fragment d'ADN par tout moyen approprié, connu en lui-même, notamment à l'aide d'une ligase à ADN, telle que la T4 ligase. Conformément au procédé de l'invention, l'amplification de l'étape c) est réalisée à l'aides d'un couple d'amorces (B, B') dont la séquence correspond à celle des oligonucléotides de l'adaptateur (respectivement A et A'). Conformément au procédé de l'invention, la coupure à l'extrémité du fragment d'ADN double-brin de l'étape d), permet d'obtenir de courts fragments d'ADN susceptibles de contenir la séquence à détecter (séquence informative) par hybridation avec une sonde nucléotidique spécifique, en particulier un oligonucléotide complémentaire de ladite séquence informative. Selon un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, les étapes a) et b) sont réalisées simultanément. Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, il comprend une étape additionnelle de purification des fragments inférieurs à 1000 pb, préalablement à l'étape b) de ligation. Ladite purification est effectuée par tout moyen approprié connu en lui-même, notamment par séparation des produits de digestion obtenus en a) par électrophorèse en gel d'agarose, visualisation des bandes correspondant aux différents fragments obtenus, prélèvement de(s) bande (s) du gel correspondant aux fragments inférieurs à 1000 pb et extraction desdits fragments d'ADN double-brin selon les techniques classiques. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, ledit adaptateur d'au moins 6 pb (étape b) comprend, en amont du site de reconnaissance (zone 2), une zone 3 d'au moins 6 paires de bases ; une telle zone permet d'améliorer l'hybridation par allongement de l'adaptateur (figure 2). La séquence de la zone 3 est sélectionnée par tout moyen approprié connu en lui-même, notamment à l'aide de logiciels de prédiction de séquences appropriés permettant d'optimiser la longueur, la structure et la composition des oligonucléotides (pourcentage de GC, absence de structures secondaires et/ou d'auto-appariement...). Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, ledit adaptateur (étape b) comprend sur l'un des brins (A ou A'), en aval du site de reconnaissance (zone 2), une zone 1 complémentaire du site de restriction utilisé pour l'obtention des fragments d'ADN double-brin à l'étape a), (figure 2). De préférence, ledit adaptateur comprend au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans ledit site de restriction, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire précédente ; cette base permet de ne pas reconstituer ledit site de restriction après la ligation de l'adaptateur à l'étape b) et donc d'éviter le clivage de l'adaptateur lié à l'extrémité dudit fragment d'ADN double-brin. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, ledit adaptateur (étape b) comprend un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin A' ; résidu de phosphate permet à une enzyme (par exemple une ligase à ADN telle que la T4 ligase) de lier ledit adaptateur aux extrémités 3'-OH du fragment d'ADN double-brin, par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'une des amorces (étape c) est liée à son extrémité 5' à un marqueur approprié permettant la détection d'hybrides d'acide nucléique (ADN-ADN, ADN-ARN), par exemple un fluorophore. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, lesdites amorces (étape c) contiennent à leur extrémité 3', plusieurs bases spécifiques de séquence(s) informative(s) à détecter, de façon à amplifier seulement certains des fragments (amplification différentielle), notamment pour éviter la saturation de la puce par un nombre trop important de fragments d'ADNcible. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'un des brins du produit amplifié à l'étape c) est protégé à son extrémité 5' par un marqueur approprié ; il est ainsi possible d'éliminer le brin complémentaire par l'action d'une phosphatase puis d'une 5' exonucléase. Le brin marqué n'est pas détruit par l'enzyme, le marqueur empêchant la progression de l'exonucléase le long du brin et donc sa digestion. Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, il comprend une étape additionnelle e) d'obtention, par tout moyen approprié, de fragments simple-brin à partir des fragments courts obtenus à l'étape d). Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, il comprend une étape additionnelle e') de purification, par tout moyen approprié, des fragments courts obtenus à l'étape d) ou une étape f) de purification des fragments simple-brin obtenus à l'étape e). Conformément au procédé de l'invention, l'obtention de fragments d'ADN simple-brin est réalisée par tout moyen approprié connu en lui-même, par exemple par action d'une phosphatase alcaline puis d'une 5' exonucléase. Conformément au procédé de l'invention, la purification des fragments courts, éventuellement simple-brin, est réalisée par tout moyen approprié connu en lui-même, par exemple : la chromatographie d'exclusion, la filtration, la précipitation à l'aide de mélanges d'éthanol et d'acétate d'ammonium ou de sodium. La présente invention a également pour objet un fragment d'ADN, susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce qu'il présente une longueur inférieure à 100 bases ou paires de bases et en ce qu'il comprend au moins une séquence informative bordée à ses extrémités 5' et 3', respectivement par le site de reconnaissance et le site de clivage d'une enzyme de restriction coupant à distance de son site de reconnaissance ; de préférence ledit fragment est un ADN simple-brin. Conformément à l'invention, la séquence informative ou séquence cible correspond à la séquence d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser, qui est détectée spécifiquement par la sonde utilisée pour l'hybridation ; ladite séquence informative représente par exemple un marqueur génétique utile pour la détection d'une espèce, d'une variété ou d'un individu (animal, végétal, microorganisme) ou d'une zone de polymorphisme ou bien un marqueur d'ADNc spécifique d'une protéine, utile pour l'étude de transcriptomes et l'établissement de profils d'expression géniques. Conformément à l'invention, ledit fragment d'ADN peut comprendre également, en amont et/ou en aval du site de reconnaissance de ladite enzyme de restriction, les séquences correspondant à la zone 1 et à la zone 3, telles que définies ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment d'ADN est marqué à son extrémité 5' par un marqueur approprié permettant la détection d'hybrides ADN-ADN, par exemple un fluorophore. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment d'ADN est immobilisé sur un support approprié. Les supports sur lesquels on peut immobiliser des acides nucléiques sont connus en eux-mêmes ; à titre d'exemple non-limitatif on peut citer ceux qui sont réalisés dans les matériaux suivants : plastique, nylon, verre, gel (agarose, acrylamide...) et silicium. De préférence, ledit fragment d'ADN est immobilisé sur un support miniaturisé, du type puce à ADN. La présente invention a également pour objet une méthode d'hybridation d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle met en #uvre un fragment d'ADN, tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre d'une méthode d'hybridation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN (cible ou sonde), tel que défini ci-dessus et une molécule d'acide nucléique complémentaire dudit fragment d'ADN, notamment une sonde oligonucléotidique. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un adaptateur tel que défini ci-dessus, pour la préparation de fragments d'ADN tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un couple d'amorces (B, B') tel que défini ci-dessus, pour la préparation de fragments d'ADN tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet un adaptateur formé d'un oligonucléotide double-brin (AA') d'au moins 10 pb comprenant de 5' en 3' (figure 2) : zone 3 d'au moins 6 pb, telle que définie ci-dessus, une zone 2 comprenant le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction dont le site de coupure est situé en aval du site de reconnaissance, une zone 1 complémentaire d'un site de restriction, notamment le site de restriction utilisé pour l'obtention des fragments d'ADN double-brin à l'étape a) du procédé tel que défini ci-dessus et un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin A'. De préférence, ledit adaptateur comprend également au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans ledit site de restriction, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire de ladite zone 1. La présente invention a également pour objet un couple d'amorces, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de respectivement les brins A et A' de l'adaptateur tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un adaptateur et un couple d'amorces, tels que définis dans le procédé ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'invention et de son utilisation pour l'hybridation d'acides nucléiques, en particulier à des sondes oligonucléotidiques, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre le principe du procédé de préparation de fragments d'ADN (cible ou sonde) selon l'invention. - la figure 2 illustre la structure générale de l'adaptateur (AA') - la figure 3 illustre un exemple des étape a) à c) du procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'invention : - étape a) : les fragments d'ADN double-brin sont générés par coupure avec EcoR I qui reconnaît le site GAATTC, - étape b) : l'adaptateur AA' (16/20 pb), comprend respectivement de 5' en 3' : séquence de 10 paires de bases (zone 3: séquence 5' GGAAGCCTAG 3'sur le brin A), le site de reconnaissance de l'enzyme Bpm I (zone 2 : séquence 5' CTGGAG 3'sur le brin A), ainsi que la séquence complémentaire du site EcoR I et une paire de bases supplémentaire, ainsi qu'un résidu de phosphate à l'extrémité 5' du brin A' (zone 1 : séquence5'phosphate-AATTG sur le brin A'). L'ADN ligase permet la liaison de l'adaptateur aux extrémités cohésives des fragments EcoR I par l'intermédiaire de liaisons phosphodiester, et - étape c) : les fragments liés à l'adaptateur sont amplifiés par PCR à l'aide du couple d'amorces B, B' (20 bases), l'amorce B étant marquée à son extrémité 5' par un fluorophore. - la figure 4 illustre un exemple des étapes d) et e) du procédé de préparation d'ADN- cibles selon l'invention : les fragments marqués obtenus à l'étape c) sont coupés à leur extrémité 5', à l'aide de l'enzyme Bpm I qui coupe 16 nucléotides en aval du site de reconnaissance (14 nucléotides en aval sur le brin complémentaire), de façon à générer des fragments courts (32/30 pb) qui sont purifiés, puis le brin complémentaire non-marqué est éliminé par digestion successivement, par une phosphatase alcaline et une 5' exonucléase. Les fragments d'ADN marqués ainsi obtenus présentent une longueur de 32 bases comprenant 12 bases de séquence informative, spécifique des acides nucléiques à analyser. Exemple 1 : Préparation de fragments d'ADN (cible ou sonde) selon le procédé de l'invention. La préparation des acides nucléiques, les digestions enzymatiques, les ligations, les amplification PCR et la purification des fragments ainsi obtenus, ont été réalisées en utilisant les techniques classiques, selon les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). De manière plus précise, des fragments d'ADN ont été préparés de la façon suivante : L'ADN génomique a été extrait à partir de sang de bovin (Bos taurus), à l'aide du kit PAXgene Blood DNA (référence 761133, QIAGEN), selon les instructions du fabricant. Les adaptateurs et les amorces suivants ont été synthétisés par MWG BIOTECH : - adaptateur - brin A : 5'-GGAAGCCTAGCTGGAGC-3' -brin A' : 5'-P-AATTGCTCCAGCTAGGCTTCC-3' - amorces B : 5'-Cy- GGAAGCCTAGCTGGAGCAATT-3' B' : 5'-AATTGCTCCAGCTAGGCTTCC-3' L'ADN génomique purifié (5 g) et l'adaptateur (5 g) ont été incubés, 3 h à 37 C, dans 40 l de tampon 50 mM Tris-HCI, pH 7,5,10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM ATP et 1 mg BSA, contenant 50 UI d'EcoR 7 et 2 UI de T4 ADN-ligase. Les fragments d'ADN liés à leurs extrémités à l'adaptateur AA' ainsi obtenus, ont été amplifiés par PCR à l'aide du couple d'amorces B, B' dans un volume réactionnel de 50 l contenant : 1 ng de fragments d'ADN, 150 ng de chacune des amorces et 2 UI d'AmpliTaq GOLD (PERKIN ELMER) dans un tampon 15 mM Tris HCI, pH 8,0,10 mM KCI, 5 mM MgCl2 et 200 M dNTPs. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur, pendant 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 s, suivie d'une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 s et d'une étape d'extension à 72 C pendant 2 min. Les fragments amplifiés par PCR ont été purifiés à l'aide du kit MinElute PCR Purification (référence LSKG ELO 50, QIAGEN), en suivant les instructions du fabricant. Les fragments amplifiés ont été digérés 1 h à 37 C, dans un mélange réactionnel de 40 Fil contenant 2,5 UI de Bpm I (NEB) dans un tampon 50 mM TrisHCl, pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2,1 mM DTT et 100 g/ml BSA. Les enzymes et les tampons ont ensuite été éliminés par filtration (Microcon YM3, MILLIPORE) et l'ADN retenu sur le filtre a été élué à l'aide du kit Micropure-EZ (MILLIPORE), puis les fragments courts ont été purifiés par filtration (Microcon YM 30, MILLIPORE) ; les fragments d'ADN de moins de 100 pb correspondant à l'éluat, les fragments de plus grande taille étant retenus sur le filtre. Les fragments courts ont ensuite été digérés, 1 h à 37 C, dans un volume réactionnel de 40 l contenant 5 UI de phosphatase alcaline et 3UI de 5'exonucléase dans un tampon 500 mM Tris-HCl-1 mM EDTA, pH 8,5 puis la réaction a été stoppée par chauffage à 90 C pendant 3 min. Les fragments d'ADN-cible simple-brin marqués par un fluorophore, ainsi obtenus ont été conservés en vue d'une utilisation ultérieure pour l'hybridation avec des sondes nucléotidique(s). Exemple 2: Utilisation des ADN-cibles pour hybrider des sondes oligonucléotidiques Un support en verre du type puce à ADN, sur lequel sont immobilisées des sondes oligonucléotidiques dont certaines sont complémentaires aux fragments d'ADN-cible obtenus à l'exemple 1, a été préparé selon les techniques connues en elles-mêmes. Lesdits ADN-cibles ont ensuite été dilués dans du tampon d'hybridation (H7140, SIGMA) et 10 l ont été déposés sur le support en verre, entre lame et lamelle. L'hybridation a ensuite été réalisée, en chambre humide dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : 80 C pendant 3 min, puis la température est abaissée à 50 C par palier de 0,l C/s et enfin la température est maintenue à 50 C pendant 10 minutes. La réaction d'hybridation est ensuite stoppée par dépôt des lames de verre sur la glace. L'excès de fragments d'ADN-cible non-complémentaires des sondes est ensuite éliminé par des lavages successifs : 30 s avec du SSC 2X (SIGMA, S6639), 30 s avec du SSC 2X additionné de 0,1% SDS (L4522, SIGMA), et 30 s avec du SSC 0,2X, à + 4 C. Les lames de verre ont ensuite été séchées et l'hybridation a été visualisée et analysée à l'aide d'un scanner (modèle Genetac, GENOMIC SOLUTION). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la préparation de fragments d'ADN double-brin, à partir d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser, b) la ligation des extrémités desdits fragments d'ADN à un oligonucléotidique double-brin (adaptateur AA') comprenant le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction dont le site de coupure est situé en aval dudit site de reconnaissance, c) l'amplification des fragments liés audit adaptateur, à l'aide d'un couple d'amorces appropriées, l'une au moins étant éventuellement marquée à son extrémité 5', et d) la coupure desdits fragments d'ADN à proximité d'une de leurs extrémités, à l'aide de ladite enzyme de restriction, de façon à générer des fragments courts. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont réalisées simultanément. 3 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle de purification des fragments inférieurs à 1000 pb, préalablement à l'étape b) de ligation. 4 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit adaptateur comprend, en amont du site de reconnaissance (zone 2), une zone 3 d'au moins 6 pb. 5 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit adaptateur comprend sur l'un des brins (A ou A'), en aval du site de reconnaissance (zone 2), une zone 1 complémentaire du site de restriction utilisé pour l'obtention des fragments d'ADN double-brin à l'étape a). 6 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit adaptateur comprend au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans ledit site de restriction, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire correspondant à la zone 1. 7 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit adaptateur comprend un résidu de phosphate lié de façon covalent à l'extrémité 5' du brin A'. 8 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé ce que l'une des amorces est liée à son extrémité 5' à un marqueur approprié. 9 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lesdites amorces contiennent à leur extrémité 3', plusieurs bases spécifiques de séquence(s) informative(s) à détecter. 10 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'un des brins du produit amplifié à l'étape c) est protégé à son extrémité 5' par un marqueur approprié. 11 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle e) d'obtention, par tout moyen approprié, de fragments simple-brin à partir des fragments courts obtenus à l'étape d). 12 ) Procédé de préparation de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape additionnelle e') de purification des fragments courts obtenus à l'étape d) ou une étape f) de purification des fragments simple-brin obtenus à l'étape e). 13 ) Fragment d'ADN, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il présente une longueur inférieure à 100 bases ou paires de bases et en ce qu'il comprend au moins une séquence informative bordée à ses extrémités 5' et 3', respectivement par le site de reconnaissance et le site de clivage d'une enzyme de restriction coupant à distance de son site de reconnaissance. 14 ) Fragment d'ADN selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment simple-brin. 15 ) Fragment d'ADN selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est marqué à son extrémité 5' par un marqueur approprié. 16 ) Puce à ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'une quelconque de revendications 13 à 15. 17 ) Méthode d'hybridation d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle met en #uvre un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 ou une puce à ADN selon la revendication 16. 18 ) Kit pour la mise en #uvre d'une méthode d'hybridation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 13 à 15ou une puce à ADN selon la revendication 16, et une molécule d'acide nucléique complémentaire dudit fragment. 19 ) Kit selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite molécule d'acide nucléique est une sonde oligonucléotidique. 20 ) Utilisation d'un adaptateur tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 7, pour la préparation de courts fragments d'ADN. 21 ) Utilisation d'un couple d'amorces tel que défini à l'une quelconque des revendications 1, 8 et 9, pour la préparation de courts fragments d'ADN. 22 ) Adaptateur, caractérisé en ce qu'il est formé d'un oligonucléotide double-brin (AA') d'au moins 10 pb comprenant de 5' en 3' : zone 3 d'au moins 6 pb, une zone 2 comprenant le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction dont le site de coupure est situé en aval du site de reconnaissance, une zone 1 complémentaire d'un site de restriction et un résidu de phosphate lié de façon covalente à l'extrémité 5' du brin A' . 23 ) Adaptateur selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend également au moins une base située entre la zone 1 et la zone 2, différente de celle qui dans ledit site de restriction, est immédiatement adjacente à la séquence complémentaire de ladite zone 1. 24 ) Couple d'amorces, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de respectivement les brins A et A' de l'adaptateur selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23. 25 ) Kit pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un adaptateur selon l'une quelconque des revendications 1,4 à 7,22 ou 23 et un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1,8, 9 ou 24.