Brevet FR2847038A1 — publié le 20040514

La présente invention est relative à un procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient à partir d'un échantillon de liquide céphalorachidien préalablement prélevé chez ledit patient dans lequel on mesure la concentration des 3 composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA, ou de leurs dérivés sulfates, présents dans ledit échantillon, notamment les rapports des concentrations [DHEA] / ([7a-hydroxy-DHEA] + [7(3-hydroxy-DHEA]) et [7a-hydroxyDHEA] / [7(3-hydroxy-DHEA]. L'invention comprend également l'utilisation de ces 3 composés comme marqueurs pour le diagnostic in vitro précoce ou tardif d'une maladie neurodégénérative chez un patient ainsi qu'un kit de diagnostic comprenant les éléments spécifiques nécessaires au dosage de ces composés. La présente invention est ainsi relative au dosage dans le liquide céphalorachidien (LCR) de stéroïdes produits dans le cerveau (neurostéroïdes) aux fins de diagnostic de maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la démence vasculaire. Ces neurostéroïdes sont identifiés en tant que déhydroépiandrostérone (DHEA), 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA, et leurs dérivés sulfates. Dans le cerveau humain, la DHEA est produite à partir d'un précurseur inconnu par le biais de radicaux libres de l'oxygène et de fer (Brown et coll., Neurobiol. Aging, 2002, in press). Cette production est considérablement augmentée en présence de protéine (3-amyloïde. Par ailleurs, la DHEA est soumise dans le cerveau à une 7hydroxylation particulièrement intense dans les neurones de l'hippocampe où se situent de grandes quantités du cytochrome P4507B1 responsable de cette hydroxylation (Trincal et coll., in: DHEA and the brain, Morfin ed., Francis & Taylor, 2002, 117-128). On connaît aussi une sulfotransférase (BR-STL) spécifique du cerveau humain (Falany et coll., Biochem. J., 2000, 346:857-864) qui peut transformer les stéroïdes 3p-hydroxylés en leurs dérivés sulfates.Le LCR contient donc à la fois la DHEA, ses dérivés 7-hydroxylés, et leurs dérivés sulfates. Dans le sérum humain, la DHEA circulante provient des productions surrénaliennes et gonadiques. Sa circulation l'amène dans le foie et la peau où elle subit une 7-hydroxylation et une sulfatation importantes. Dans le sérum humain, les taux de DHEA ne reflètent pas ceux produits dans le cerveau car la plupart des traitements affectent son métabolisme hépatique et cutané et particulièrement sa 7-hydroxylation (Attal-Khémis et coil., Life Sci., 1998, 63:1543-1553). Chez l'individu normal, les taux de DHEA dans le LCR sont nettement inférieurs à ceux mesurés dans le sérum (Murakami et coll., Maturitas, 1999, 33:7180). Dans le sérum humain, les taux de DHEA, de DHEA sulfate et de 7-hydroxy- DHEA varient avec l'âge (Sulcova et coil., J.Endocrinol., 1997, 154:57-62; Hampl et coll., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2001, 78:367-372), ceux de DHEA et DHEA sulfate ont été trouvés augmentés (Nasman et coll., Psychoneuroendocrinol., 1995, 20:83-94) et diminués (Dodt et coll., J. Clin. Endocr. Metab., 1991, 89:1567-1571) chez les malades atteints de la maladie d'Alzheimer. Les taux sériques de 7a-hydroxyDHEA et de son sulfate sont augmentés dans cette maladie (Attal-Khémis et coll., J. Gerontol. A, 1998, 53:B125-B132). On peut également citer le document Jellinck et coll. (J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2001, 78:313-317) et le document Mao & Barger (Neuroreport, 1998, 9:759-763) qui attribuent aux 7-hydroxystéroïdes et à la DHEA sulfate une potentialité d'effets neuroprotecteurs. Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'une méthode fiable et facile à mettre en u̇vre de diagnostic précoce et/ou de confirmation d'une maladie neurodégénérative chez un patient à partir d'un échantillon prélevé chez ce patient, et, le cas échéant, de pouvoir distinguer la nature de cette maladie neurodégénérative. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Alors qu'aucune publication ne mentionne actuellement les taux de 7-hydroxyDHEA et de leurs dérivés sulfates dans le LCR, l'inventeur a mesuré les taux de DHEA, de DHEA sulfate, de 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA dans le LCR de malades atteints de maladies neurodégénératives (démence vasculaire, maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer) et de patients contrôles non atteints de maladies neurodégénératives (épileptiques, hydrocéphales, paralytiques, neuralgiques) du même âge. Après ajustement des valeurs pour l'âge, il a été mis en évidence de manière surprenante que les taux de DHEA dans le LCR étaient particulièrement augmentés, et ceux de DHEA sulfate et de 7-hydroxy-DHEA diminués chez tous les malades atteints de pathologies neurodégénératives, et ce particulièrement en fonction de l'état d'avancement de la pathologie Alzheimer.Il apparaît ainsi que la disparition de la DHEA sulfate et des 7-hydroxystéroïdes neuroprotecteurs, et l'accumulation de DHEA dépourvue d'effets neuroprotecteurs propres seraient impliquées dans le déclenchement de la pathologie Alzheimer et d'autres formes de pathologies neurodégénératives résultant d'un stress oxydatif. La présente invention est donc relative à l'utilisation d'une méthode quelconque de dosage dans le LCR humain des stéroïdes suivants : DHEA, 7a-hydroxy-DHEA, 7phydroxy-DHEA, ou de leurs dérivés sulfates, aux fins d'établir le rapport des concentrations de ces stéroïdes [DHEA] / ([7alpha -hydroxy-DHEA] + [7p-hydroxy-DHEA]), ou de celui de leurs dérivés sulfates [DHEA sulfate] / ([7a-hydroxy-DHEA sulfate] + [7p-hydroxy-DHEA sulfate]), et, le cas échéant, le rapport des concentrations [7ahydroxy-DHEA] / [7beta -hydroxy-DHEA]), ou de celui de leurs dérivés sulfates [7ahydroxy-DHEA sulfate] / [7p-hydroxy-DHEA sulfate], pour diagnostiquer une maladie neurodégénérative et, le cas échéant, la potentialité cérébrale d'un patient à développer la maladie d'Alzheimer. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient à partir d'un échantillon de liquide céphalorachidien préalablement prélevé chez ledit patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mesure de la concentration des 3 composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7beta hydroxy-DHEA, ou la mesure de la concentration des 3 composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon ; b) la comparaison des concentrations mesurées à l'étape a) aux concentrations de cesdits composés préalablement déterminées pour un échantillon de contrôle issu d'un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. Les composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA, 7p-hydroxy-DHEA, et leurs dérivés sulfates DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate, 7p-hydroxy-DHEA sulfate, peuvent être représentés par les formules suivantes : De préférence, la présente invention est relative à un procédé de diagnostic selon l'invention, caractérisé en ce que ladite maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la démence vasculaire. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on cherche à observer l'apparition d'un excès de DHEA associé à un déficit des formes 7hydroxylées de la DHEA, ou à observer l'apparition d'un taux de DHEA sulfate associé à un déficit des formes 7-hydroxylées de la DHEA sulfate, par rapport à un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on compare le rapport des concentrations [DHEA] / ([7a-hydroxy-DHEA] + [7beta hydroxy-DHEA]) ou le rapport des concentrations [DHEA sulfate] / ([7a-hydroxy-DHEA sulfate] + [7p-hydroxy-DHEA sulfate]), ou leur inverse, obtenu pour ledit patient à tester à celui obtenu pour un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic selon l'invention, caractérisé en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [DHEA] / ([7a-hydroxy-DHEA] + [7p-hydroxy-DHEA]) ou en ce qu'une variation significative du rapport des concentrations [DHEA sulfate] / ([7a-hydroxy-DHEA sulfate] + [7p-hydroxy-DHEA sulfate]) obtenu pour ledit patient à tester comparé à celui obtenu pour un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative, indique que ledit patient à tester est atteint d'une maladie neurodégénérative. Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient, ledit procédé permettant en outre de distinguer si ce patient est atteint de la maladie d'Alzheimer ou d'une démence vasculaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le diagnostic d'une maladie neurodégénérative par un procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient selon l'invention ; et, si ce diagnostic est positif, b) la comparaison du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA] / [7p-hydroxyDHEA] ou du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA sulfate] / [7p-hydroxyDHEA sulfate]), ou leur inverse, obtenu pour ledit patient à tester, à celui obtenu pour un sujet atteint de la maladie d'Alzheimer et/ou obtenu pour un sujet atteint d'une démence vasculaire. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention est relative à un procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative permettant en outre de distinguer si ce patient est atteint de la maladie d'Alzheimer ou d'une démence vasculaire selon l'invention, caractérisé en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA] / [7(3-hydroxy-DHEA] ou en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA sulfate] / [7p-hydroxy-DHEA sulfate]), notamment de plus de 2 fois, obtenu pour ledit patient à tester comparé à celui obtenu pour un sujet atteint de démence vasculaire, indique que ledit patient à tester est atteint de la maladie d'Alzheimer. Pour les procédés de diagnostic selon l'invention, les concentrations de DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA ou les concentrations de leurs dérivés sulfates DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate présents dans ledit échantillon à tester seront mesurées par toute méthode appropriée permettant de réaliser un dosage spécifique de ces composés. Parmi ces méthodes permettant de réaliser un dosage spécifique de ces composés, on préfère les méthodes de dosages pour lesquelles les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées à l'aide d'anticorps, polyclonaux, monoclonaux, synthétiques ou recombinants, ou leurs fragments, capables de reconnaître spécifiquement ces composés, ces anticorps ou fragments d'anticorps pouvant être, le cas échéant, marqués. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de diagnostic selon l'invention, les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7phydroxy-DHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7phydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées par une méthode radio-immunologique ou immuno-enzymatique. Des anticorps polyclonaux anti-DHEA, anti-7a-hydroxy-DHEA et anti-7phydroxy-DHEA ont déjà été décrits (Lapcik et coll., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, 67:439-445 ; et Lapcik et coll., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, 71:231-237). En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et al. (Nature, 256:495-497, 1975).Les anticorps monoclonaux antiDHEA spécifique, anti-7a-hydroxy-DHEA spécifique et anti-7p-hydroxy-DHEA spécifique, ou dirigés spécifiquement contre leurs dérivés sulfates, peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé spécifiquement contre ces composés. Par fragment d'anticorps capable de reconnaître spécifiquement les composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou leur dérivé sulfate, on entend désigner en particulier les fragments d'anticorps comprenant tout fragment dudit anticorps capable de se fixer spécifiquement sur l'épitope dudit composé sur lequel se fixe l'anticorps dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Ces fragments d'anticorps peuvent être obtenus à partir des anticorps polyclonaux ou monoclonaux par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique.D'une autre manière, ces anticorps, ou leursdits fragments, pourront également être obtenus par synthèse chimique ou par recombinaison génétique (anticorps recombinants). Les anticorps ou leurs fragments, capables de reconnaître spécifiquement les composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou leurs dérivés sulfates, peuvent également, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal directement ou indirectement quantifiable. Les anticorps marqués, ou leurs fragments, incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la beta -D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués à ces anticorps ou leurs fragments et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, l'umbelliférone, etc..Dans de tels conjugués, les anticorps ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate, etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate. D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine. Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur ces anticorps ou leurs fragments, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que 14C, 36Cl, 57Co, 58Co, 51Cr, 152 Eu, 59Fe, H, 25I, 131I, 32P, 35S, 75 SE et 99mTc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations, par autoradiographie, etc.. Toute procédure ou méthode classique dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène peut être mise en oeuvre pour réaliser un tel dosage. Ladite méthode radio-immunologique ou immuno-enzymatique peut être une méthode par compétition ou par sandwich, ou toute méthode connue de l'homme de l'art. Suivant les méthodes utilisées, l'anticorps ou l'un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radioimmunologique (RIA) ou équivalent, notamment les méthodes radio-immunologiques, où un anticorps reconnaissant spécifiquement un stéroïde marqué permet son dosage par mesure de la dilution isotopique effectuée ou les méthodes immuno-enzymatiques, où un anticorps ayant lié le stéroïde à doser est mesuré par le biais de la réaction enzymatique générée sur un anticorps secondaire couplé à une enzyme. Parmi les méthodes permettant de réaliser un dosage spécifique de ces composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester, on préfère également les méthodes de dosage dans lesquelles les composés à mesurer sont piégés sur un polymère comprenant les empreintes moléculaires spécifiques de ces composés puis détectés physiquement ou chimiquement. Dans ces méthodes, les empreintes moléculaires peuvent être générées comme décrit par Mosbach et Ramstrôm (Biotechnology, 1996, 14:163-170) à partir du stéroïde à doser et d'un polymère, et utilisées pour des mesures avec des méthodes de détection physiques ou chimiques diverses bien connues de l'homme de l'art. Parmi les méthodes permettant de réaliser un dosage spécifique de ces composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7beta -hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester, on préfère également les méthodes de dosage dans lesquelles les concentrations desdits composés sont mesurées par une méthode de séparation chromatographique couplée à un détection par mesure optique ou électrométrique. De telles méthodes de dosage sont basées sur les principes chromatographiques, où les stéroïdes d'un extrait sont séparés et détectés pour leur mesure par des systèmes optiques (UV, visible, fluorescence) ou spectrométriques (masse) ou électrométriques (ionisation de flamme, capture d'électrons). Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation des 3 composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou des 3 composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate, comme ensemble de marqueurs pour le diagnostic in vitro précoce ou tardif d'une maladie neurodégénérative chez un patient. Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou kit pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la DHEA ; b) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7a-hydroxy-DHEA ; et c) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7p-hydroxy-DHEA. Sous ce même aspect, la présente invention a également pour objet une trousse ou un kit pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la DHEA sulfate ; b) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7a-hydroxy-DHEA sulfate ; et c) un anticorps, de préférence monoclonal ou polyclonal, ou l'un de ses fragments, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7beta -hydroxy-DHEA sulfate. Sous ce même aspect, la présente invention a aussi pour objet une trousse ou un kit de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend un polymère ou un ensemble de polymères comprenant les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples ci-après. Dans les exemples ci-après, le principe d'affinité a été utilisé sur le LCR avec des dosages radio-immunologiques utilisant des anticorps polyclonaux de lapin reconnaissant soit la 7a-hydroxy-DHEA, soit la 7p-hydroxy-DHEA, selon les méthodes publiées par Lapcik et coll. (J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, 67:439-445 ; J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, 71:231.237), et avec des dosages par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse utilisée en ionisation négative selon la méthode publiée par Attal-Khémis et coli. (J. Gerontol. A, 1998, 53:B125-B132) pour le dosage des 7a-hydroxy-DHEA, 7p-hydroxy-DHEA et de leur sulfate dans le sérum humain. Exemple 1 : Mesure des concentrations de 7a-hydroxy-DHEA, et de son dérivé sulfate dans le sérum humain de malades atteints de la maladie d'Alzheimer (A) et de sujets contrôles Cet exemple a pour but d'illustrer la possibilité du dosage de ces stéroïdes et de leurs dérivés par l'emploi d'une méthode chromatographique (chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire) couplée à la détection des stéroïdes par spectrométrie de masse en ionisation négative. Les sérums sanguins de deux groupes de patientes ont été obtenus. Un groupe était constitué de 10 patients atteints de la maladie d'Alzheimer, l'autre groupe était constitué de 8 sujets sains du même âge.Les patientes atteintes de la maladie d'Alzheimer (A) avaient toutes des évaluations mentales minimales (dénommées MMSE pour Mini Mental State Evaluation ) très basses reflétant un grand avancement de la maladie, alors que les contrôles avaient des MMSE élevés. Les sérums étaient extraits par l'acétate d'éthyle : isooctane (1:1, vol/vol) afin de récupérer la 7a-hydroxy-DHEA. La phase aqueuse restante contenant les dérivés sulfates était soumise à la solvolyse (addition d'acide sulfurique jusqu'à pH 1 et de 1g de NaCI) pour libérer la 7a-hydroxy-DHEA qui était ensuite extraite par l'acétate d'éthyle.Chacun des extraits obtenus était traité par passage sur microcolonnes de 600 mg d'alumine (activité grade III) montées dans le benzène et éluées successivement par 5 ml de benzène, 19 ml de benzène à 0,15 % d'éthanol, puis 9 ml de benzène à 2 % d'éthanol, puis encore 9 ml de benzène à 2 % d'éthanol. Cette dernière fraction contenait la 7a-hydroxy-DHEA dont le taux de purification était déterminé par comptage de la même molécule radioactive (utilisée en tant que traceur (2 pg) introduit dans le sérum) dans une partie aliquote de la fraction. La 7a-hydroxy-DHEA récupérée de chaque sérum était ensuite traitée par le Ntrifluoroacétyl imidazole pour obtenir le di-trifluoroacétate de 7a-hydroxy-DHEA.Ce dérivé était ensuite injecté sur la colonne capillaire (HP1) d'un chromatographe en phase gazeuse, élué par l'hélium à 180[deg]C jusqu'à 310[deg]C (gradient de température à 15.C/minute), et détecté par un spectromètre de masse quadrupole utilisé en mode d'ionisation chimique négative. La sensibilité d'un tel système permettait la détection efficace de 1 pg du dérivé injecté et d'assurer la mesure par intégration de l'aire sous le pic obtenu. Les résultats présentés dans le tableau I ci-après montrent que le sérum des patientes atteintes de la maladie d'Alzheimer contenait significativement plus de 7ahydroxy-DHEA sulfate que celui des contrôles (p Ces résultats démontrent que le dosage du dérivé sulfate de la 7a-hydroxyDHEA peut être effectué de manière précise avec la technique décrite. Par ailleurs, ce dosage appliqué au sérum peut être transposé au LCR obtenu à partir de patients atteints de maladies neurodégénératives. Néanmoins, les résultats obtenus à partir du sérum ne peuvent pas être utilisés pour un diagnostic sur le la maladie d'Alzheimer. En effet, les taux sériques en 7a-hydroxy-DHEA reflètent essentiellement la production hépatique et non la production cérébrale de 7a-hydroxy-DHEA, et nous avons démontré que des traitements par certains médicaments peuvent influer considérablement les taux de 7a-hydroxy-DHEA produits par le foie et circulant ensuite dans le sang (Attal-Khémis et coll., Life Sci., 1998, 63:1543-1553). TABLEAU 1 : Mesure des concentrations de 7a-hydroxy-DHEA et de 7a-hydroxyDHEA sulfate dans le sérum de patientes atteintes de la maladie d'Alzheimer (A1-A10) et de sujets contrôles (C1-C8) Exemple 2 : Mesure des concentrations de DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxyDHEA et de leurs rapports dans le LCR de malades atteints de démence vasculaire, de malades atteints de la maladie de Parkinson, de malades atteints de la maladie d'Alzheimer (A) et de sujets contrôles (C) Les patients atteints de démence vasculaire avaient tous des MMSE supérieurs à 10 et des CDR inférieurs à 3. Les patients atteints de la maladie de Parkinson avaient des MMSE supérieurs à 25 et des évaluations cliniques de démence (dénommées CDR pour Clinical Demential Rating ) de zéro.Les patients atteints de la maladie d'Alzheimer étaient tous sévèrement atteints, avec des MMSE inférieurs à 8 et des CDR égaux ou supérieurs à 3. Les contrôles étaient atteints de maladies non neurodégénératives (épileptiques, hydrocéphales, paralytiques, neuralgiques). Les taux de DHEA et des deux épimères 7a- et 7p-hydroxy-DHEA dans le LCR ont été dosés par radio-immunologie avec les techniques décrites par Lapcik et coll. (J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, 67:439-445) et Lapcik et coll. (J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, 71:231-237). Ces méthodes utilisent deux lots d'anticorps polyclonaux de lapin générés respectivement à partir d'haptènes 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA couplés à la sérum albumine bovine. Ces anticorps sont ensuite marqués par le ,51 pour l'utilisation radio-immunologique.Les autres stéroïdes (DHEA, DHEA sulfate) sont dosés par des méthodes employant les kits commerciaux actuels. Les résultats présentés dans le Tableau Il ci-après montrent que les taux de DHEA sont considérablement augmentés (p Ces rapports ne permettent cependant pas de distinguer parmi les maladies neurodégénératives la démence vasculaire de la maladie d'Alzheimer. Par contre, les rapports [7a-hydroxy-DHEA] / [7p-hydroxy-DHEA] présentés dans le tableau montrent des valeurs nettement et significativement plus élevées (p Il en ressort donc que : - la DHEA produite en excès par le cerveau et retrouvée dans le LCR des malades atteints de maladie neurodégénérative n'est plus transformée en quantités suffisantes de DHEA sulfate et de dérivés 7-hydroxylés (et de leurs formes sulfatées ou dosées ici) pour assurer la neuroprotection, - l'excès de DHEA dans le LCR n'est pas seul associé aux maladies neurodégénératives.Il doit être associé à un déficit en DHEA sulfate et/ou en dérivés 7-hydroxylés pour que l'association soit flagrante, - le rapport [DHEA] / ([7a-hydroxy-DHEA] + [7p-hydroxy-DHEA]) est associé au développement de la maladie d'Alzheimer pendant lequel les radicaux libres de l'oxygène et le fer catalysent une formation accrue de DHEA alors que la capacité du cerveau à conduire sa 7-hydroxylation est diminuée, - la distinction entre la maladie d'Alzheimer et la démence vasculaire peut être faite par comparaison des rapports des concentrations de 7a- et 7[3-hydroxy-DHEA dans le LCR, les rapports de ces concentrations (7a/7p) étant deux à trois fois plus élevés chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer que chez ceux atteints de démence vasculaire,- la distinction des patients atteints de la maladie de Parkinson est moins complexe puisque facilitée par les signes cliniques qui lui sont particuliers et par les MMSE élevés et les CDR bas chez ces malades. Cependant les dosages de stéroïdes dans le LCR de ces malades peuvent confirmer le diagnostic de maladie neurodégénérative. Ces conclusions constituent une découverte quant à l'importance des taux de 7-hydroxy-DHEA dans le LCR vis-à-vis des maladies neurodégénératives et de leur développement. TABLEAU Il : Mesure des concentrations de DHEA, DHEA sulfate (DHEAS), 7ahydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA et de leurs rapports dans le LCR de malades atteints de démence vasculaire (V), de malades atteints de la maladie de Parkinson (P), de malades atteints de la maladie d'Alzheimer (A) et de sujets contrôles (C). REVENDICATIONS 1 Procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient à partir d'un échantillon de liquide céphalo-rachidien préalablement prélevé chez ledit patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mesure de la concentration des 3 composés DHEA, 7a-hydroxyDHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou la mesure de la concentration des 3 composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon ; b) la comparaison des concentrations mesurées à l'étape a) aux concentrations de cesdits composés préalablement déterminées pour un échantillon de contrôle issu d'un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. 2. Procédé de diagnostic selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la démences vasculaire. 3. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on cherche à observer l'apparition d'un excès de DHEA associé à un déficit des formes 7-hydroxylées de la DHEA, ou à observer l'apparition d'un taux de DHEA sulfate associé à un déficit des formes 7-hydroxylées de la DHEA sulfate, par rapport à un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. 4. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on compare le rapport des concentrations [DHEA] / ([7a-hydroxy-DHEA] + [7p-hydroxy-DHEA]) ou le rapport des concentrations [DHEA sulfate] / ([7a-hydroxyDHEA sulfate] + [7p-hydroxy-DHEA sulfate]), ou leur inverse, obtenu pour ledit patient à tester à celui obtenu pour un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative. 5. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [DHEA] / ([7ahydroxy-DHEA] + [7(3-hydroxy-DHEA]) ou en ce qu'une variation significative du rapport des concentrations [DHEA sulfate] / ([7a-hydroxy-DHEA sulfate] + [7p-hydroxyDHEA sulfate]) obtenu pour ledit patient à tester comparé à celui obtenu pour un sujet non atteint par une maladie neurodégénérative, indique que ledit patient à tester est atteint d'une maladie neurodégénérative. 6. Procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative chez un patient, ledit procédé permettant en outre de distinguer si ce patient est atteint de la maladie d'Alzheimer ou d'une démence vasculaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le diagnostic d'une maladie neurodégénérative par un procédé selon l'une des revendications 1 à 5 ; et, si ce diagnostic est positif, b) la comparaison du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA] / [7beta hydroxy-DHEA] ou du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA sulfate] / [7phydroxy-DHEA sulfate]), ou leur inverse, obtenu pour ledit patient à tester à celui obtenu pour un sujet atteint de la maladie d'Alzheimer et/ou obtenu pour un sujet atteint d'une démences vasculaire. 7. Procédé de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA] / [7(3-hydroxy-DHEA] ou en ce qu'une augmentation significative du rapport des concentrations [7a-hydroxy-DHEA sulfate] / [7(3-hydroxy-DHEA sulfate]), notamment de plus de 2 fois, obtenu pour ledit patient à tester comparé à celui obtenu pour un sujet atteint de démence vasculaire, indique que ledit patient à tester est atteint de la maladie d'Alzheimer. 8. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxyDHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7j3-hydroxyDHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées à l'aide d'anticorps, monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître spécifiquement ces composés, ces anticorps pouvant être, le cas échéant, marqués. 9. Procédé de diagnostic selon la revendication 8, caractérisé en ce que les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7(3-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées par une méthode radioimmunologique ou immuno-enzymatique. 10. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxyDHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7(3-hydroxyDHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées par une méthode dans laquelle les composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7(3-hydroxy-DHEA, ou les composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7(3-hydroxy-DHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont piégés sur un polymère comprenant les empreintes moléculaires spécifiques de ces composés puis détectés physiquement ou chimiquement. 11. Procédé de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les concentrations des composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxyDHEA, ou des composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxyDHEA sulfate, présents dans ledit échantillon à tester sont mesurées par une méthode de séparation chromatographique couplée à un détection par mesure optique ou électrométrique. 12. Utilisation des 3 composés DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxyDHEA, ou des 3 composés DHEA sulfate, 7a-hydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxyDHEA sulfate, comme marqueur pour le diagnostic in vitro précoce ou tardif d'une maladie neurodégénérative chez un patient. 13. Kit pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la DHEA ; b) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7a-hydroxy-DHEA ; et c) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7p-hydroxy-DHEA. 14. Kit pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la DHEA sulfate ; b) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7a-hydroxy-DHEA sulfate ; et c) un anticorps, le cas échéant marqué, capable de reconnaître spécifiquement la 7p-hydroxy-DHEA sulfate. 15. Kit pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, caractérisé en ce qu'il comprend un polymère ou un ensemble de polymères comprenant les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA sulfate, 7ahydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate. comprenant les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA, 7a-hydroxy-DHEA et 7p-hydroxy-DHEA, ou les empreintes moléculaires spécifiques de la DHEA sulfate, 7ahydroxy-DHEA sulfate et 7p-hydroxy-DHEA sulfate.