Brevet FR2851046A1 — publié le 20040813

L'invention concerne un test de diagnostic in vitro d'entérovirus basé sur la révélation d'une réaction immunologique de type reconnaissance antigène-anticorps. Les entérovirus forment le genre Entérovirus au sein de la famille des Picornaviridae. Il s'agit de virus de 25 à 30 nm de diamètre, non enveloppés, à symétrie icosaédrique et à ARN (acide ribonucléique) monocaténaire linéaire, non fragmenté et positif. Leur absence d'enveloppe leur confère une résistance aux agents physico-chimiques; ils sont stables entre pH 3 et 10 ; ils sont inactivés par la chaleur au-delà de 45 C (et même 50 C en présence de cations divalents) et par les désinfectants et antiseptiques majeurs (povidone iodée, hypochlorite de sodium, aldéhydes). Il existe 65 sérotypes d'entérovirus : 3 poliovirus, 23 coxsackievirus A (CVA), 6 coxsackievirus B (CVB), 29 échovirus (EV) et 4 entérovirus non classés. Plus de 80% du génome des entérovirus d'environ 7500 nucléotides est constitué d'un cadre de lecture unique flanqué de deux régions non codantes en 5' et 3'. La volumineuse protéine codée par ce cadre de lecture est clivée en 4 protéines matures structurales VP1, VP2, VP3 et VP4 (VP=viral protein) et en protéines non structurales comme des protéases et l'ARN polymérase. Les entérovirus sont l'objet d'une grande variabilité génétique due aux erreurs de transcription de l'ARN polymérase virale sources de mutations ponctuelles et aux recombinaisons entre génomes de virus différents. Cette variabilité contribue à la diversité des tropismes tissulaires et des spectres pathologiques des entérovirus. Les entérovirus ont un mode de transmission fécal-oral par contacts interhumains ou par le biais d'eaux ou d'aliments contaminés. Certains sérotypes ont une transmission respiratoire ou cutanéo-muqueuse. Les entérovirus qui pénètrent par voie digestive se multiplient d'abord dans l'intestin (d'où le terme entérovirus), avant de diffuser, par voie hématogène, vers des organes cibles (système nerveux central, muscles striés, peau...). Les infections inapparentes constituent la grande majorité des entéroviroses. Parmi les formes symptomatiques, on distingue les infections aiguës et les infections persistantes. Les infections aiguës sont très polymorphes. Les entérovirus sont les agents infectieux les plus fréquents responsables d'infections du système nerveux central (méningites lymphocytaires, méningo-encéphalites, paralysies de type poliomyélite). Ils participent à de nombreuses autres pathologies : infections respiratoires (rhinites, bronchites, bronchiolites, pneumonies), infections cardiaques (péricardites, myocardites), myosites, éruptions maculo-papuleuses ou purpuriques, syndromes fébriles et, plus rarement, hépatites, néphrites, orchites ou arthrites. Des manifestations cliniques sont très spécifiques des entérovirus et même de certains sérotypes : pleurodynie ou maladie de Bornholm (CVB) qui correspond à une sorte de grippe hyperalgique, éruptions vésiculeuses de type herpangine ou syndrome pied-main-bouche (CVA, CVB, entérovirus 70), conjonctivite hémorragique (CVA-24, entérovirus 70). Les pathologies humaines chroniques associées aux entérovirus sont au moins au nombre de quatre : méningoencéphalites chroniques, syndrome post-poliomyélitique, affections cardiaques et diabète insulino-dépendant. En effet, il existe de forts arguments en faveur de l'implication des coxsackievirus B dans le diabète mellitus insulino-dépendant de type 1 (IDDM). Plusieurs auteurs ont détecté la présence d'ARN entéroviral de forte homologie avec CVB dans le sang périphérique de patients IDDM au début des manifestations cliniques de la maladie (Cléments et al., 1995 ; Andreoletti et al., 1997 ; et al., 1999; Lonnrot et al., 2000). Récemment la Demanderesse a montré que des taux élevés dans le plasma d'interféron a (IFNa) sont corrélés dans 50% des cas avec la présence de séquences entérovirales, en particulier CVB3 et CVB4, dans le sang circulant d'adultes et d'enfants atteints de diabète de type 1 (Chehadeh et al., 2000). La Demanderesse a également démontré que CVB4, par des interactions avec des anticorps IgG circulants ou associés à des cellules, peut fortement induire la production d'IFNa par des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patients IDDM (Hober et al., J. Gen. Virol., 2002). La production d'interféron a est un marqueur de l'infection virale. CVB4 induit peu cette production sauf quand il est mis en présence d'anticorps dits "facilitants" qui facilitent l'infection virale. CVB4 peut donc infecter des monocytes, en majorité CD14+, par un mécanisme anticorps-dépendant par des interactions entre le virus, des anticorps antiviraux et des récepteurs spécifiques à la surface des cellules (CAR, Fcy RII, Fcy RIII) qui résultent en la production d'IFNa. Cette synthèse d'IFNa induite par des IgG anti-CVB4 reflète l'entrée de CVB4 dans les monocytes mais pas la réplication virale et requiert la présence d'ARN de CVB4 dans les cellules. Si l'on bloque la production d'IFNa induite par ces IgG antiCVB4, des particules virales produites par les PBMC peuvent être détectées (Hober et al., 2001). De plus, l'activité inductrice d'IFNa de plasma de patients IDDM préincubé avec CVB4 avant d'être apporté à des PBMC isolées de sujets sains est élevée si on la compare à celle de plasma de sujets sains (Hober et al., 2002). Les patients IDDM ont une prévalence plus élevée de ces anticorps anti-CVB dits "facilitants" qui augmentent la synthèse d'IFNa induite par CVB par rapport aux contrôles. Les patients atteints d'infections entérovirales portent donc dans leur plasma, en plus des anticorps neutralisants connus jusqu'à présent qui "immobilisent" le virus et qui sont dans la majorité des cas dirigés contre des épitopes de la protéine structurale de surface VP1, des anticorps "facilitants" qui favorisent l'infection virale. Les outils diagnostiques utilisés jusqu'à présent dans le diagnostic des entéroviroses sont des moyens directs : culture cellulaire, inoculation au souriceau nouveau-né, amplification génomique en utilisant des amorces dans la région 5' non codante du génome et des moyens indirects : séroneutralisation et techniques immuno-enzymatiques. La culture cellulaire et la séroneutralisation ne sont pas applicables à tous les coxsackievirus A, les sérotypes Al, A19 et A22 ne sont pas cultivables. L'inoculation au souriceau nouveau-né est une technique lourde et longue qui permet de diagnostiquer une infection à coxsackievirus et permet de différencier les CVA (paralysies flasques) des CVB (paralysies spastiques). Les techniques de biologie moléculaire comme l'amplification génomique par PCR (Polymerase Chain Reaction) ont permis de détecter les entérovirus en faible quantité en choisissant des amorces dans les régions très conservées. Cependant, elles ne permettent pas de détecter toutes les infections entérovirales, en particulier si l'infection est localisée et le taux de réplication du virus faible, ni de différencier tel ou tel sérotype. De même, les techniques immunoenzymatiques différencient tout au plus les groupes et celles-ci, basées sur la détection des anticorps neutralisants, se sont heurtées à l'absence d'un antigène commun parmi les entérovirus. Il n'existe donc pas parmi ces tests une méthode de détection très fine à l'échelon du sérotype ou des variants (différenciation entre souches sauvages et vaccinales) ni de méthode de quantification de la charge virale chez des individus infectés. Pour combler ce manque, la Demanderesse a développé un test de diagnostic in vitro des entérovirus spécifique et quantitatif. Ce test repose sur l'existence d'antigènes induisant des anticorps "facilitant" l'infection virale et pas d'anticorps neutralisants. En effet, la Demanderesse a identifié la protéine virale présentant le ou les épitopes reconnus par les anticorps "facilitants" dans le cas d'une infection aux coxsackievirus B3 et B4. Cette protéine est la protéine structurale interne VP4 et la démonstration en a été faite comme suit : a) tout d'abord, les virus CVB3 et CVB4 E2 ont été cultivés et purifiés b) ensuite, les protéines VP4 d'une part et l'antigène H (également appelé AEC pour "artificial empty capsids") d'autre part ont été isolés et purifiés à partir des virus CVB3 et CVB4 E2 dissociés c) enfin, il a été démontré que la protéine VP4 inhibe l'augmentation de la production d'IFNa induite par le couple CVB/plasma. En effet, quand VP4 est préincubée avec du plasma avant d'ajouter CVB, VP4 fixe les anticorps anti-VP4 et il reste moins d'anticorps anti-VP4 pour fixer CVB et faciliter l'infection de PBMC in vitro et l'augmentation de la production d'IFNa par celles-ci. Ceci prouve que les anticorps "facilitants" sont les anticorps anti-VP4. Par contre, il n'y a pas de réaction croisée entre les anticorps anti-VP4CVB3 et anti-VP4cvB4- Quand VP4CVB4 a été préincubée avec du plasma avant d'ajouter CVB3, le niveau d'IFNa induit par CVB3 dans des cultures de PBMC est resté inchangé. De même, la protéine VP4 dissociée de CVB3 n'affecte pas le niveau d'IFNa induit par CVB4. Les épitopes présentés par les protéines VP4 de ces deux sérotypes sont donc suffisamment différents pour que les anticorps "facilitants" soient spécifiques de tel ou tel sérotype. La Demanderesse a tiré parti de cette démonstration pour mettre au point un test de diagnostic in vitro d'entérovirus basé sur la révélation d'une réaction immunologique de type reconnaissance antigène-anticorps caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des antigènes ou des épitopes de ceux-ci qui n'induisent pas d'anticorps antiviraux neutralisants mais qui induisent des anticorps "facilitants" qui augmentent l'infection virale. La présente invention a donc pour objet un test de diagnostic d'entérovirus caractérisé en ce que soit les antigènes sont fixés sur un support pour la détection des anticorps "facilitants" correspondants, soit les anticorps "facilitants" sont fixés sur un support pour la détection des antigènes correspondants. Ce support est de type plaque à puits multiples pour microtitration ou "puce". On entend par "puce" un support miniaturisé plat, en matériau solide organique ou inorganique, de type verre, silicium ou polymères synthétiques, sur lequel sont liés de manière covalente des polypeptides. Quand le test selon l'invention consiste en la détection des anticorps "facilitants" par les antigènes correspondants fixés sur un support, la réaction est révélée par un anticorps secondaire anti-espèce marqué (par exemple anti-humain). Quand le test selon l'invention consiste en la détection des antigènes par les anticorps "facilitants" correspondants fixés sur un support, la réaction est révélée par un anticorps anti-viral marqué ou par un anticorps antiviral (par exemple humain) puis un anticorps secondaire anti-espèce marqué (par exemple anti-humain). Le marqueur des anticorps secondaires est de préférence une enzyme comme la HRP ("horseradish peroxydase") qui montre une réaction colorée ou luminescente avec son substrat, un radioisotope, un composé fluorescent, un composé chimioluminescent, un composé bioluminescent ou un chélate de métaux. On préfère en tant qu'antigène induisant des anticorps antiviraux "facilitants" une protéine virale interne, pleine longueur ou un fragment de celle-ci. Cette protéine peut être purifiée à partir du virus, peut être une protéine recombinante présentant les mêmes propriétés immunogènes ou peut être synthétisée chimiquement et présenter les mêmes propriétés immunogènes. En particulier, on préfère que la protéine virale interne en question soit la protéine structurale VP4. Ce test permet en particulier de diagnostiquer une infection par les coxsackievirus de type A ou B Ce test comprend les étapes suivantes: a- immobilisation des anticorps "facilitants" ou de la protéine virale induisant des anticorps "facilitants" ou d'un fragment de celle-ci sur un support b- immobilisation de protéines contrôles ou d'un fragment de celles-ci sur un support c- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration d- saturation de la surface de support non recouverte par une solution tamponnée de protéines irrelevantes e- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration f- application des échantillons à étudier à différentes dilutions dans du tampon de saturation g- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration h- amplification de la réponse par application d'anticorps marqués i- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration j- lecture de l'intensité du marquage Le test de l'invention peut en particulier être mis en oeuvre à l'aide d'un coffret ou d'un kit qui comprend : - les antigènes ou les anticorps "facilitants" selon l'invention, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction antigène-anticorps, - les réactifs permettant la détection du complexe formé. Selon l'invention le test peut notamment être appliqué au diagnostic d'une infection à CVB3 ou CVB4 par détection et dosage des anticorps anti-VP4 en les piégeant par la protéine purifiée VP4 fixée à un support. En effet, on a mis en évidence l'existence d'une relation dose-réponse entre la quantité de protéine VP4 préincubée avec le plasma et le niveau de production d'IFNa. Ainsi, la protéine VP4 préincubée avec le plasma piège les anticorps anti-VP4 du plasma. Plus on augmente la quantité de protéine VP4 dans ce test, plus on diminue la quantité d'anticorps anti-VP4 "facilitants" libres pour reconnaître CVB, plus la production d'IFNa est faible. On a de plus mis en évidence l'existence d'une corrélation dose-dépendante entre la quantité d'anticorps anti-VP4 préincubés avec CVB3 ou CVB4 avant d'être ajoutés à des PBMC et le niveau de production d'IFNa. Aucune production d'IFNa n'est détectée en présence de plasma appauvri en anticorps anti-VP4 ou d'anticorps irrelevants. Le test objet de l'invention, en permettant de doser les anticorps "facilitants" ou la protéine virale portant le ou les épitopes reconnus par ces anticorps, permet de mesurer la réponse des cellules à l'infection virale, comme par exemple la production d'IFNa. Le test décrit ci-dessus peut être réalisé avec d'autres protéines VP4 d'autres entérovirus pour effectuer un criblage de l'infection par différents virus. Ce test peut être appliqué dans le cas de maladie chronique associée à une infection par un entérovirus pour établir la valeur prédictive du déclenchement de la maladie. En particulier, ce test peut être utilisé pour prédire le déclenchement chez des patients prédiabétiques d'un diabète de type 1 associé à une infection par CVB. Ce test peut également être utilisé pour corréler la quantité d'anticorps facilitants détectés et le stade de la maladie. En particulier, ce test peut permettre d'évaluer le stade d'un diabète de type 1 associé à une infection par CVB. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Légende des figures: Figure 1 : effet de la protéine VP4 ou de l'antigène H sur la production d'IFNa induite par CVB/plasma de 5 sujets sains Figure la : diminution dose-dépendante de la production d'IFNa induite par CVB3/plasma en présence de la protéine VP4CVB3 Figure lb : augmentation dose-dépendante de la production d'IFNa induite par CVB3/plasma en présence d'antigène H Figure le : diminution dose-dépendante de la production d'IFNa induite par CVB4/plasma en présence de la protéine VP4CVB4 Figure Id : augmentation dose-dépendante de la production d'IFNa induite par CVB4/plasma en présence d'antigène H Figure 2 : comparaison de la moyenne des valeurs indice d'anticorps anti-VP4 des patients IDDM par rapport à celle des sujets sains Exemple 1 : en évidence de la protéine virale de CVB3 ou CVB4 induisant des anticorps "facilitants" anti-CVB3 ou anti-CVB4 : a) Culture et purification des virus CVB3 et CVB4: CVB3 (American Type Culture Collection, Manassas, USA) et CVB4 E2 diabétogène (fourni par Ji-Won Yoon, Julia McFarlane Diabetes Research Center, Calgary, Alberta, Canada) ont été cultivés dans les cellules Hep-2 (Biowhittaker, Verviers, Belgique) en milieu essentiel minimum de Eagle (Gibco BRL, Eragny, France) additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (Gibco BRL) et 1% de L-Glutamine (Eurobio, France). Après une incubation de 24 heures à 37 C, 5% CO2, la suspension cellulaire a été congelée et décongelée trois fois et centrifugée à 2000 x g pendant 10 min. Le virus issu du surnageant a été culotté par centrifugation à 500 000 x g pendant 3 heures à 4 C dans un rotor Beckman TLA-100. 4. Le culot a été resuspendu dans 3 ml de Tris-HCl 0,01 M pH 7.2, contenant 0.5% (vol/vol) Nonidet P40, incubé à 4 C pendant 20 heures, homogénéisé, et centrifugé à 4000 x g pour ôter les débris insolubles. Seulement 0,5 ml de la suspension virale clarifiée a été disposé en couches sur 0,5 ml de sucrose (30%, poids/vol) et 3 ml CsCl (40%, poids/vol). Après centrifugation à 348,000 x g à 4 C dans un rotor Beckman TLA-100.4 pendant 4 h, les fractions du gradient ont été récupérées et les titres viraux des fractions du gradient ont été déterminées par le test de la dose infectieuse de 50% de la culture tissulaire (TCID50) sur une culture confluente de cellules Hep-2. Les fractions contenant les titres au pic d'infectiosité ont été groupées, dialysées et équilibrées avec du Tris-HCl 0,01 M pH 7. 2 par centrifugation à 4000 x g sur membrane MacrosepTM (pall Filtron Corporation, Saint Germain en Laye, France) à exclusion de poids moléculaire (MWCO) de 300 K. Des aliquots ont été stockés congelés à -80 C. Des préparations contrôles ont été obtenues par le même protocole excepté que les cellules Hep-2 étaient infectées uniquement par le solvant du virus. b) Purification de la protéine VP4 et de l'antigène H des virus CVB3 et CVB4 La protéine VP4 et l'antigène H ont été dissociés des virus complets CVB3 et CVB4 comme décrit précédemment dans la littérature pour le poliovirus (Maizel et al., 1967). Brièvement, les particules virales CVB purifiées et concentrées (- 1 mg) ont été incubées à 56 C pendant 5 min dans 0,5 ml de tampon sodium (NaCl 0. 1 M, NaCi 0. 005 M, pH 7. 0). Ce traitement résulte en la dissociation de l'ARN, VP4 et l'antigène H. VP4 a été séparée du mélange par centrifugation à 4000 x g sur membrane MacrosepTM à MWCO de 100 K. L'antigène H et l'ARN ont été retenus par la membrane, et VP4 est passée au travers de la membrane. L'ARN a été dégradé par ajout de 0,05 mg de ribonucléase A bovine pancréatique (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Allemagne) et incubation à 37 C pendant 10 min. L'antigène H et VP4 ont été dialysés et équilibrés avec du tampon phosphate salin (PBS), pH 7. 2, par centrifugation à 4000 x g sur membranes Macrosep TM à MWCO de 100 K et 3 K respectivement. L'antigène H et VP4 ont été concentrés en utilisant un Savant Speed Vac Concentrator SVC100H (Global Medical Instrumentation, Minnesota, USA). La dissociation contrôle a été de même opérée avec le surnageant de cellules Hep-2 non-infectées purifié tel que décrit ci-dessus et a fourni des protéines contrôles pour ce qui suit. La concentration protéique a été calculée à partir de l'absorbance à 280 nm correspondant à un coefficient d'extinction de 1 mg/ml. c) Inhibition par la protéine VP4 de la production d'IFNa induite par le couple CVB/plasma : VP4, l'antigène H ou des protéines contrôles ont été préincubés pendant 1h à 37 C à différentes concentrations avec du plasma de 5 sujets sains et dilué à une dilution optimale (1/10 ou 1/100). CVB3 ou CVB4 ont alors été ajoutés pendant 1h avant l'incubation avec des PBMC. On observe sur la Figure 1, une diminution dose-dépendante de la production d'IFNa induite par CVB3/plasma en présence de la protéine VP4CVB3 alors qu'en présence de l'antigène H on n'observe pas de diminution dose-dépendante de la production d'IFI (Figure la et 1b). Des résultats similaires ont été obteni avec la protéine VP4CVB4 dans le système CVB4/plasma (Figu le et 1d). Au contraire, les protéines contrôles isolées partir de cellules Hep-2 non infectées n'ont eu aucun effe sur la production d'IFNa. Exemple 2 : Diagnostic d'une infection à CVB3 ou CVB4 grâce la détection des anticorps anti-VP4 - Corrélation entre détection des anticorps anti-VP4 de CVB3 et CVB4 et diabète de type 1 Pour détecter les anticorps anti-VP4 dans le plasr d'un donneur, des plaques de microtitration de 96 puits or été hybridées pendant une nuit à température ambiante av@ la protéine VP4 dissociée à partir de CVB3 ou CVB4 à 5 g/I dans du PBS pH 7.4. De la même façon, des plaques @ microtitration ont été hybridées avec des protéine contrôles. Les puits ont été lavés trois fois avec ui solution de lavage (PBS pH 7. 4, 0,05% Tween 20), satura pendant 1 h à 37 C avec du tampon de saturation (PBS, I 7. 4, 2,5% lait écrémé, 0,5% Tween 20), et lavés à nouveau fois. Ensuite, 0,1 ml des échantillons, dilués dans @ tampon de saturation à une dilution optimale (1/50), ont éi ajoutés aux micropuits. Après 2 h d'incubation à températui ambiante, les puits ont été lavés 4 fois et 0,1 ml @ mélange d'anticorps IgA, G, M anti-humains marqués à la H] ("horseradish peroxydase") dilué au 1/10000ème ont é1 ajoutés et incubés pendant 1 h. Après 4 cycles de lavage 0,1 ml de la solution substrat (0,4 mg/ml ( phénylènediamine, 0,012% H202 dans du tampon phosphai citrate 0,05 M, pH 5. 0) ont été ajoutés pendant 30 min. ] réaction est arrêtée par l'addition de 25 l d'aci( sulfurique 2 N. Les mesures de l'absorbance ont et effectuées à 490 nm dans un lecteur de microplaques Dyne MRX# (Thermo Life Science, Cergy-Pontoise, France). I valeur limite du test immunologique a été déterminée e additionnant l'absorbance de l'échantillon sur les plaquE contrôles à celle du blanc sur les plaques VP4. LE échantillons du test avec un indice (ratio échantillon/valeur limite) supérieur à 1,0 ont été considérés comme positifs pour la présence d'anticorps antiVP4. Ce test a été utilisé pour détecter et doser les anticorps anti-VP4 dans le plasma de sujets sains et de patients IDDM. 14 des 40 sujets sains (35%) et 25 des 40 patients IDDM (62,5%) étaient positifs pour les anticorps anti-VP4cvB3. 6 des 40 sujets sains (15%) et 32 des 40 patients IDDM (80%) étaient positifs pour les anticorps anti-VP4cvB4- La moyenne des indices obtenue dans le groupe des patients IDDM était significativement plus élevée que celle obtenue dans le groupe des sujets sains (Figure 2). Le test développé dans cet exemple montre que la détection et le dosage des anticorps anti-VP4 peuvent être utilisés dans le diagnostic d'une pathologie associée à une infection aux coxsackievirus. En effet, les patients IDDM présentent une plus forte prévalence d'anticorps anti-VP4 et une plus grande quantité de ces anticorps que les sujets sains. Certains patients présentent un taux d'anticorps antiVP4 au-dessous du seuil de détection du test de l'exemple mais ceci peut s'expliquer par le fait que leur maladie est associée à d'autres virus que CVB3 ou CVB4 comme CVB2. REVENDICATIONS 1- Test de diagnostic in vitro d'entérovirus basé sur la révélation d'une réaction immunologique de type reconnaissance antigène-anticorps caractérisé en ce qu'il met en oeuvre des antigènes ou des épitopes de ceux-ci qui n'induisent pas d'anticorps antiviraux neutralisants mais qui induisent des anticorps "facilitants" qui augmentent l'infection virale. 2- Test de diagnostic selon la revendication 1 caractérisé en ce que la réaction immunologique de type reconnaissance antigène-anticorps est révélée soit par un anticorps anti-espèce marqué quand le test selon l'invention consiste en la détection des anticorps "facilitants" par les antigènes correspondants fixés sur un support, soit par un anticorps anti-viral marqué ou par un anticorps anti-viral puis un anticorps secondaire anti-espèce marqué quand le test selon l'invention consiste en la détection des antigènes par les anticorps "facilitants" correspondants fixés sur un support. 3- Test de diagnostic selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'anticorps marqué porte un marqueur de type enzyme, radioisotope, composé fluorescent, composé chimioluminescent, composé bioluminescent ou chélate de métaux. 4- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'antigène induisant des anticorps antiviraux "facilitants" est une protéine virale interne. 5- Test de diagnostic selon la revendication 4 caractérisé en ce que la protéine virale interne est la protéine pleine longueur ou un fragment de celle-ci. 6- Test de diagnostic selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce que la protéine virale interne ou un fragment de celle-ci est obtenu soit par purification à partir du virus, soit est une protéine recombinante présentant les mêmes propriétés immunogènes, soit est synthétisée chimiquement et présente les mêmes propriétés immunogènes. 7- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que la protéine virale interne est la protéine structurale VP4. 8- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les entérovirus diagnostiqués sont les coxsackievirus de type A ou B 9- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que sa mise en oeuvre comprend la succession des étapes suivantes: a- immobilisation des anticorps "facilitants" ou de la protéine virale induisant des anticorps "facilitants" ou d'un fragment de celle-ci sur un support b- immobilisation de protéines contrôles ou d'un fragment de celles-ci sur un support c- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration d- saturation de la surface de support non recouverte par une solution tamponnée de protéines irrelevantes e- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration f- application des échantillons à étudier à différentes dilutions dans du tampon de saturation g- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration h- amplification de la réponse par application d'anticorps marqués i- lavages avec une solution saline tamponnée additionnée ou non d'un détergent à faible concentration j- lecture de l'intensité du marquage 10- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que les antigènes ou les anticorps "facilitants" correspondants sont fixés sur un support de type plaque à puits multiples pour microtitration. 11- Test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que les antigènes ou les anticorps "facilitants" correspondants sont fixés sur un support de type puce. 12- Coffret ou kit pour la mise en oeuvre d'un test de diagnostic in vitro d'entérovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 qui comprend : - les antigènes ou les anticorps "facilitants", - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction antigène-anticorps, - les réactifs permettant la détection du complexe formé. 13- Utilisation du test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour prédire le déclenchement d'une pathologie chronique associée à une infection par un entérovirus. 14- Utilisation du test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour prédire le déclenchement d'un diabète de type 1 chez un patient prédiabétique. 15- Utilisation du test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour définir le stade d'une pathologie chronique associée à une infection par un entérovirus. 16- Utilisation du test de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour définir le stade d'un diabète de type 1 associé à une infection par CVB.