Brevet FR2850756A1 — publié le 20040806

L'invention concerne un procédé de prélèvement d'un échantillon dans le but d'effectuer ultérieurement une détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie qui pourrait être contenue dans cet échantillon, l'échantillon étant prélevé dans un conduit, servant 5 essentiellement à la circulation d'un gaz, au moins dans une zone du conduit dans laquelle une condensation a pu se produire. L'invention concerne également un procédé de détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie, comprenant une étape de prélèvement d'un échantillon dans un conduit servant essentiellement à la 10 circulation d'un gaz. L'invention trouve une application avantageuse dans la détection de la présence d'au moins une bactérie dans un conduit de climatisation d'un local. ETAT DE L'ART Les conduits servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, et notamment l'air climatisé, sont sujets à la prolifération bactérienne. Il est aisément compréhensible que cette prolifération 20 bactérienne puisse être gênante, pour toute personne sensible, lors de l'utilisation de ces conduits. Cette prolifération est d'autant plus gênante lorsqu'elle intervient dans le cadre de conduit de climatisation. En effet, la probabilité de prolifération bactérienne dans les conduits de climatisation est accrue de par la possibilité de présence d'humidité, notamment aux 25 endroits ou zones susceptibles de condensation. Plusieurs brevets apportent des solutions permettant le contrôle ou la limitation de cette prolifération. Notamment le brevet FR 2 819 306 décrit un dispositif de captage des bactéries dans une installation de climatisation. Ce dispositif vise à détruire les bactéries contenues dans les condensats. Cependant, ce type de technologie nécessite l'installation d'un dispositif particulier de manière à récupérer les condensats. D'autre part, le brevet FR2 704 867 décrit un collecteur de germes de l'air. Ce collecteur vise comme son nom l'indique à limiter le 5 nombre de germes contenus dans l'air. Cet appareil présente également l'inconvénient de devoir être installé au sein du conduit. Une autre solution permettant de limiter la prolifération bactérienne consiste à effectuer le nettoyage des conduits. Ce nettoyage présente l'inconvénient de s'effectuer en aveugle et s'avère inutile en cas 10 d'absence de bactéries. L'ensemble de ces solutions présente essentiellement l'inconvénient d'un cot élevé d'intervention, la mise en place d'une multitude de dispositifs lorsque le réseau de conduits est vaste ou complexe. Ces solutions ont également l'inconvénient de nécessiter la 15 condamnation des locaux pendant un temps plus ou moins long. D'autre part leur efficacité est limitée dans le temps. Notamment les industries, les petites, moyennes, grandes surfaces alimentaires, et centres commerciaux, les hôpitaux ou cliniques, ont généralement un réseau aéraulique et notamment de conduits de 20 climatisation vastes ou complexes. D'autre part la bactérie susceptible de se développer dans les conduits précités peut être la legionella pneumophila, et notamment la legionella pneumophila sérogroupe 1. Cette bactérie est connue pour sa nocivité envers l'homme. Nombre de brevets et autres publications font 25 références à des méthodes ou procédés de détection de la présence ou non de cette bactérie. La détection, dans l'eau, de la bactérie legionella pneumophila sérogroupe 1 suit la norme actuelle NFT 90-431. Cependant cette norme nécessite le prélèvement de 1 litre d'eau. En recherchant cette bactérie 30 dans des conduits servant essentiellement à la circulation d'un gaz, ce volume n'est jamais atteint et la norme précitée ne peut pas être utilisée telle quelle. Le test effectué pour cette norme est également relativement coteux. Un des problèmes technique que l'invention vise à résoudre est la 5 fourniture d'un procédé de détection de la présence ou non de legionella pneumophila, et notamment la legionella pneumophila sérogroupe 1, dans l'air à moindre cot, tout en se rapprochant du protocole donné par la norme NFT 90-431. BUTS DE L'INVENTION L'invention a pour but principal de résoudre l'ensemble des problèmes techniques énoncés ci-dessus, et notamment: L'invention a pour but principal de résoudre le problème 15 technique consistant en la fourniture d'un procédé de prélèvement d'un échantillon, dans le but d'effectuer ultérieurement la détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie qui pourrait être contenue dans cet échantillon; ce procédé comprenant le prélèvement dudit échantillon dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un 20 gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé, au moins dans une zone du conduit dans laquelle une condensation du gaz a pu se produire. La présente invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à la fourniture d'un procédé de détection rapide de la présence ou non d'au moins un type de bactérie dont 25 l'étape de prélèvement de l'échantillon est réalisé selon le procédé de prélèvement décrit ci-dessus. L'invention a pour but général le diagnostic de la présence ou non d'au moins un type de bactérie dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz et notamment d'un conduit de 30 climatisation. L'invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un procédé de détection rapide de la présence ou non de legionella pneumophila, et notamment la legionella pneumophiia sérogroupe 1 à moindre cot en se rapprochant du protocole donné parla norme NFT90-431. L'invention a notamment pour but d'effectuer un prélèvement afin de diagnostiquer la nécessité d'un nettoyage et/ou d'une décontamination du conduit sur lequel le prélèvement est effectué. DESCRIPTION DE L'INVENTION Ainsi, la présente invention décrit, selon un premier aspect, un procédé de prélèvement d'au moins un échantillon, dans le but d'effectuer ultérieurement la détection de la présence ou non d'au moins un type de 15 bactérie qui pourrait être contenue dans cet échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend le prélèvement dudit échantillon dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé, au moins dans une zone du conduit dans laquelle une condensation du gaz a pu se produire. Ce conduit est également appelé 20 conduit aéraulique. Dans l'invention le conduit est entendu par tout type de conduit ou gaine permettant essentiellement la circulation d'un gaz, ce conduit étant de préférence un conduit ou une gaine de climatisation. Dans la présente invention, le prélèvement est réalisé sur une 25 zone du conduit c'est à dire qu'il s'effectue sur une partie bien ciblée du conduit. Cette zone, endroit ou partie du conduit, est définie par l'homme de l'art avant d'effectuer le prélèvement. Cette zone sera généralement localisée dans la partie d'un conduit o les bactéries sont dans des conditions favorisant la prolifération bactérienne. Cette prolifération 30 bactérienne est notamment facilitée par des conditions de température et d'humidité adéquates. Ces conditions sont connues de l'homme de l'art. Les zone privilégiées o peuvent proliférer les bactéries sont notamment les zones o la condensation du gaz (ou d'au moins un composant du gaz lorsque ce gaz est un mélange) est susceptible de se produire. Dans le cas d'une climatisation, le gaz considéré est l'air. Cet air comprend une certaine fraction d'eau (humidité) qui peut se condenser en certaines parties du circuit de climatisation formant ainsi un lieu susceptible de prolifération bactérienne. La zone du conduit, dans laquelle une condensation du gaz a pu 10 se produire, est choisie parmi le groupe consistant en un coude, un regard, un clapet anti-feu, un point bas, un pont thermique, une bouche de soufflage ou de reprise. Le prélèvement est notamment effectué de manière à permettre une détection ultérieure de la présence ou non d'au moins un type de 15 bactérie qui pourrait être contenue dans cet échantillon. De ce fait, le prélèvement n'est pas effectué par un nettoyage et/ou une décontamination d'une partie de conduit. L'invention a notamment pour but d'effectuer ce prélèvement afin de diagnostiquer la nécessité d'un nettoyage et/ou d'une 20 décontamination du conduit sur lequel le prélèvement est effectué. Le prélèvement, de préférence le prélèvement et la détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie qui pourrait être contenue dans l'échantillon prélevé, s'effectue(nt) avant le nettoyage et/ou la décontamination du conduit précité. L'invention comprend un premier mode de réalisation qui se trouve être le prélèvement d'un échantillon sous forme liquide dans une zone du conduit. Cet échantillon liquide est avantageusement prélevé par aspiration d'au moins une partie du liquide présent, de préférence en effectuant un trou permettant, par exemple, le passage d'un cathéter afin d'aspirer au moins une partie du liquide et de préférence un maximum de ce dernier. Dans ce premier mode de réalisation, il est avantageux de récupérer le liquide dans des flacons qui seront conservés après 5 prélèvement, de préférence peu de temps après le prélèvement, dans un réfrigérateur à une température adéquate à la conservation d'un échantillon pouvant contenir des bactéries et devant subir une détection ultérieure de la présence ou non d'au moins un type de bactérie. Les conditions de conservation sont bien connues de l'homme de l'art. Ces échantillons serviront à la détection d'au moins un type de bactérie qui pourrait être contenue dans ceux-ci. L'invention concerne dans un second mode de réalisation, un procédé de prélèvement d'un échantillon sous forme solide susceptible de contenir au moins un type de bactérie ou d'un échantillon contenant du 15 liquide (susceptible de contenir au moins un type de bactérie) en quantité insuffisante pour permettre son prélèvement et/ou son utilisation dans le but de la détection d'au moins un type de bactérie. Avantageusement, lorsque la partie du conduit susceptible de contenir des bactéries présente un dépôt de tartre, ou une trace d'eau ou 20 de biofilm, ou de la graisse, ou d'un indice équivalent quant à la possibilité de la présence d'au moins un type de bactérie, le prélèvement consiste à prélever au moins une partie de la zone du conduit, de préférence par découpe d'une partie de la zone du conduit, contenant au moins une partie de la surface du dépôt de tartre, ou au moins une partie d'une trace d'eau, 25 ou au moins un partie du biofilm, ou au moins une partie de la graisse ou au moins une partie d'un indice équivalent quant à la possibilité de la présence d'au moins un type de bactérie. Un biofilm est une couche de micro-organismes (mélange de bactéries, algues et champignons), contenus dans une matrice solide, se 30 formant sur des surfaces en contact avec de l'eau. Dans le cas d'un prélèvement solide, l'échantillon à prélever est constitué par une partie de la conduite prélevée et par le dépôt de tartre, les traces d'eau, de biofilm, de graisse susceptibles de contenir au moins un type de bactérie, ou autres indices équivalents quant à la possibilité de la 5 présence d'au moins un type de bactérie. Dans ce cas les inventeurs parlent indifféremment d'échantillon ou de prélèvement solide. Avantageusement la découpe du conduit peut être effectuée par l'utilisation d'une scie cloche. Afin de déterminer la zone ou l'endroit de prélèvement de 10 l'échantillon, qu'il soit solide ou liquide, il est avantageux d'utiliser un moyen permettant de localiser au sein du conduit la zone o le prélèvement doit s'effectuer. Les inventeurs préconisent l'utilisation d'une caméra endoscopique, introduite au sein du conduit par un orifice adéquat. Le procédé comprend donc de préférence les étapes de repérage 15 de la zone à prélever et de prélèvement de l'échantillon sous forme liquide ou solide. Selon un second aspect, l'invention concerne un procédé de détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie dans un conduit comprenant une étape de prélèvement d'un échantillon sur lequel 20 la détection doit être réalisée, l'étape de prélèvement de l'échantillon étant réalisée selon un procédé de prélèvement tel que décrit ci-dessus. Il est avantageux de réaliser la détection sur un échantillon liquide, de ce fait, la détection peut être effectuée directement lorsque le prélèvement est liquide ou après remise en suspension des bactéries 25 éventuelles contenues dans l'échantillon solide. Avantageusement, l'invention concerne un procédé de détection tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes: de prélèvement de l'échantillon, éventuellement de remise en solution lorsque l'échantillon est sous forme " solide ", de concentration de la bactérie éventuellement présente, d'analyse de la présence ou non de la bactérie au sein de l'échantillon. Cette mise en suspension est avantageusement réalisée par addition d'un diluant, de préférence du sérum physiologique. L'homme de l'art peut alors réaliser les analyses nécessaires à la mise en évidence de la présence ou non d'au moins un type de bactérie. L'homme de l'art saura effectuer le protocole de détection nécessaire, notamment quant aux dilutions, conditions opératoires et appareillages à utiliser. Les inventeurs préconisent tout particulièrement cette méthode dans le cadre du diagnostic de la bactérie legionella pneumophila, de préférence legionella pneumophila sérogroupe 1. L'invention est cependant réalisable de manière générale sur tout type de microorganisme ou bactérie pouvant être détecté par une 15 méthode connue de l'homme de l'art et dont la prolifération est favorisée par la présence de condensats d'un gaz, notamment de condensats d'eau contenues dans l'air. Ainsi l'invention est particulièrement applicable pour mettre en oeuvre un procédé de détection de la présence ou non de la bactérie 20 legionel/la pneumophila, de préférence est legionella pneumophila sérogroupe 1, dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé, ce procédé comprenant avant la réalisation de la détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie une étape de prélèvement selon le procédé de 25 prélèvement tel que décrit précédemment. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION: Les inventeurs s'attachent dans cette partie à décrire le mode 30 préféré de réalisation de l'invention, c'est à dire à l'application au diagnostic de la présence ou non de la bactérie legionella pneumophila sérogroupe 1, dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé. Dans ce qui suit le terme la bactérie fait référence à la bactérie 5 legionella pneumophila sérogroupe 1 qui est une illustration d'un mode de réalisation de l'invention ne limitant pas la portée de l'invention. L'invention se réalise de préférence dans l'ordre suivant: Dans un premier temps, le procédé de prélèvement consiste à identifier le point de prélèvement, par un moyen de repérage d'une zone du 10 conduit susceptible de contenir la bactérie. Ce repérage s'effectue avantageusement par l'intermédiaire d'un endoscope. L'utilisation de l'endoscope s'effectue, par exemple, en perçant un trou dans le conduit permettant le passage de l'endoscope. Après observation de l'intérieur de la gaine, l'homme de l'art identifie et/ou repère 15 la o les zones à prélever s'il y a lieu. Avantageusement, le prélèvement s'effectue, selon deux modes de réalisation. Le premier mode de réalisation consiste, lorsqu'il y a présence de liquide, au prélèvement d'au moins une partie de celui-ci. Ce prélèvement est avantageusement effectué par un cathéter relié à une 20 seringue permettant l'aspiration d'au moins une partie du liquide à prélever. Le deuxième mode de réalisation consiste, lorsqu'il y a trace de la présence éventuelle de la bactérie, telle qu'une trace d'eau, ou de biofilm, ou de dépôt de tartre, ou de graisse, ou tout autre indice équivalent quant à la possibilité de la présence de la bactérie, à prélever au 25 moins une zone de la partie du conduit contenant au moins une partie de l'échantillon à prélever. L'échantillon comprend alors le dépôt tartre, le biofilm, la graisse ou la trace d'eau ou tout autre indice équivalent quant à la possibilité de la présence de la bactérie ainsi que la partie du conduit prélevée. Cette zone du conduit, ou morceau du conduit peut être avantageusement découpée en utilisant une scie cloche. Cette zone du conduit, ou morceau de conduit, prélevée ou découpée est avantageusement remplacée par un moyen adéquat pour 5 assurer le bon fonctionnement du conduit, notamment en assurant l'étanchéité, etc. Ce moyen peut être avantageusement du scotch aluminisé. Les prélèvements sont avantageusement conservés par un moyen adéquat connu de l'homme de l'art, tel qu'une conservation dans un 10 réfrigérateur à une température, par exemple, d'environ 40C. Les inventeurs préconisent d'effectuer la détection sur un échantillon liquide. De ce fait, lorsque le prélèvement est solide, ou se présente sous forme d'une trace d'eau ou d'un dépôt de tartre ou d'un biofilm ou de 15 graisse ou d'indice équivalent de la présence de la bactérie, (on parlera de manière abusive ici " d'échantillon ou de prélèvement solide ") une étape préalable de solubilisation ou de remise en suspension de la biomasse bactérienne éventuellement présente est nécessaire. Cette remise en suspension est notamment effectuée par addition d'un diluant adéquat à la 20 conservation de la bactérie éventuellement contenue dans l'échantillon, dans le but de réaliser la détection de la présence ou non de cette bactérie. De préférence dans ce mode de réalisation particulier le diluant est un sérum physiologique permettant la détection de la présence de bactéries lorsque qu'il y a des bactéries dans l'échantillon. Les conditions de 25 remise en suspension sont celles connues de l'homme de l'art et nécessitent notamment des étapes d'agitation, de dilution et rinçage des différents récipients utilisés. Les échantillons, liquide ou " solide " remis en suspension, sont concentrés par filtration sur un filtre adéquat (par exemple: membrane en il polycarbonate) en séparant la bactérie du liquide diluant (sérum physiologique). Les bactéries sont ensuite récupérées par exemple - soit en grattant la membrane dans un volume déterminé de sérum physiologique à analyser; soit en plaçant au milieu d'une cuve à ultrasons un récipient contenant le filtre (la membrane en polycarbonate) immergée dans un volume déterminé de sérum physiologique à analyser pendant un temps compris entre environ 2 et 10 min. Le volume final de diluant est de préférence de 5 mL. Ce volume est préféré puisqu'il correspond au volume décrit par la norme NFT 90-431. Le volume contenant la bactérie à détecter peut être analysé par les techniques connues de l'homme de l'art, mais les inventeurs préconisent 15 avantageusement une analyse de la présence de la bactérie par la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). La méthode ELISA est décrite ci -après. De manière générale, l'homme de l'art saura effectuer le nombre d'analyses ou détections de la présence ou non de la bactérie nécessaire 20 permettant d'obtenir des résultats fiables. A l'issue de ces résultats, l'homme de l'art pourra diagnostiquer la présence ou non de la bactérie ou la possibilité de la présence de cette bactérie, auquel cas des analyses complémentaires sont nécessaires. Les inventeurs, dans le souci de s'approcher de la norme NFT 25 90-431, suivent un protocole permettant la détection de la bactérie legionella pneumophila sérogroupe 1 par la méthode ELISA, selon les étapes générales suivantes. Ce protocole n'est pas limitatif de la méthode de détection ni du protocole de la méthode ELISA pouvant être utilisé. La norme NFT 90-431 30 impose une détection sur des échantillons concentrés dans un volume de 5 mL de sérum physiologique. De ce fait les inventeurs préconisent de réaliser des échantillons prêts à l'analyse du même volume de ce diluant. Quand l'ensemble des échantillons est déposé, la (les) plaque(s) de microtitration est(sont), incubée(s) environ une nuit. Les sites non 5 spécifiques sont bloqués avec un mélange de PBS-3% BSA. Dans chaque puits est ajouté l'anticorps anti-Legionella Pneumophila type 1 (sérogroupe 1). Dans chaque puits est ajouté un anticorps secondaire, couplé à la peroxydase par exemple mais cela n'est pas limitatif à ce seul chromophore, capable de reconnaître l'anticorps anti-Legionel/a 10 pneumophila type 1 (sérogroupe 1). La révélation se fait par exemple en utilisant le TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine). Après blocage de la réaction de révélation, la lecture de la densité optique est faite à 450 nm dans le cas de l'utilisation du TMB. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention 15 apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et 20 toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLES Dans les exemples l'ensemble du matériel utilisé doit être de préférence propre ou stérile selon le cas. Avantageusement, Le matériel courant de laboratoire de microbiologie est utilisé dont notamment: Un appareil pour la stérilisation en chaleur humide (autoclave) A l'exclusion du matériel livré stérile, particulièrement celui en plastique, la verrerie doit être stérilisée à l'autoclave en la maintenant à une 10 température et pendant un temps suffisant à la stérilisation. Une étuve ou enceinte thermostatée, assurant une bonne répartition thermique et une humidité suffisante. Des appareils de filtration montés soit sur une rampe spéciale, soit sur une fiole à vide. Des membranes filtrantes en polycarbonate, de pores 0,22 pm ou 0,45 pm, d'environ 47 mm de diamètre. Un générateur d'ultrasons. Des plaques ELISA comportant 96 puits, à fond plat, dont le matériau qui les compose est optiquement inerte et permet une fixation 20 optimum des bactéries. Un lecteur de microplaques capable de faire l'analyse de plaques ELISA 96 puits et équipé de filtres dont la longueur d'onde de lecture est compatible avec le révélateur de la péroxydase utilisé. D'autre part les prescriptions générales préférées pour les exemples 25 sont les suivantes: Les produits chimiques doivent être de qualité analytique. Préparer les diluants à l'aide d'eau distillée, ou à défaut d'eau déminéralisée, exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l'essai. Les sérums doivent être spécifiques et avoir été testés avec un grand nombre de souches médicales et de l'environnement. Dans les échantillons d'eau issus des prélèvements faits sur site, la possibilité de réactions croisées avec d'autres micro-organismes est fréquente. L'Eau distillée exempte de substances inhibant la croissance dans les conditions de l'essai. Le Sérum physiologique est de composition Chlorure de sodium (NaCI) ...... .........9 9g Eau distillée................. 1 litre Exemple 1i: Méthode de prélèvement d'un échantillon liquide Se munir du plan du réseau aéraulique à visiter, sur lequel ont été repérés les différents sites d'intervention. 15 Prévoir par point de prélèvement: - deux flacons pour recueillir les échantillons - une seringue de 100 ml avec cathéter Percer un trou d'un diamètre de 10 mm et y faire passer l'endoscope...DTD: Observer l'intérieur de la gaine et repérer les parties les plus 20 représentatives de l'état de la gaine. Identifier les zones de prélèvement s'il y a lieu. Réaliser le prélèvement: Pour cela, se servir d'un clou et faire un trou dans la gaine et vérifier la position du clou avec l'endoscope. Quand la zone est bien repérée, faire le 25 prélèvement: Faire un trou d'un diamètre de 10 mm un peu au-dessus de la zone et faire passer le cathéter pour aspirer un maximum de liquide. Répartir ce liquide dans les deux flacons. Après utilisation, les seringues seront mises dans un bidon-poubelle pour les décontaminer. 30 Placer les flacons à 40C. Exemple 2: Préparation de la détection à partir d'un échantillon prélevé sous forme liquide: L'échantillon considéré est un échantillon obtenu selon l'exemple 1. A l'aide d'une éprouvette graduée par exemple de 500 mL, déterminer le volume contenu dans le flacon de l'échantillon. Dans un flacon stérile en verre de 500 mL, verser le contenu de l'éprouvette. Rincer trois fois cette dernière avec du sérum physiologique, 10 ainsi que le flacon ayant contenu l'échantillon, et verser les liquides de rinçage dans le flacon de 500 mL. Compléter à 500 mL avec du sérum physiologique. Fermer le flacon et le mélanger plusieurs fois pour bien homogénéiser. Filtrer la préparation précédente sur membrane(s) en polycarbonate puis soit gratter la membrane dans 5 mL de sérum physiologique à analyser soit placer au milieu d'une cuve à ultrasons un récipient contenant la membrane en polycarbonate immergée dans 5 mL de sérum physiologique à analyser pendant un temps compris 20 entre 2 et 10 min. L'échantillon est prêt pour être analysé. Exemple 30: Méthode de prélèvement d'un échantillon solide Se munir du plan du réseau aéraulique à visiter, sur lequel ont été repérés les différents sites d'intervention. Prévoir par point de prélèvement: - deux flacons pour recueillir les échantillons; Percer un trou d'un diamètre de 10 mm et y faire passer l'endoscope. Observer l'intérieur de la gaine et repérer les parties les plus représentatives de l'état de la gaine. Identifier les zones de prélèvement s'il y a lieu. Réaliser le prélèvement: Pour cela, se servir d'un clou et faire un trou dans la gaine et vérifier la position du clou avec l'endoscope. Quand la zone est bien repérée, faire le prélèvement: - Passer la scie-cloche à la flamme du chalumeau pour la stériliser. La laisser refroidir 1 minute. Découper des rondelles de gaines directement sur la zone o se trouvent ces traces. Faire deux découpes et les mettre chacune dans un flacon de prélèvement. Dans ce cas de figure et préalablement à la préparation du concentrat, il est nécessaire de remettre les bactéries en suspension. Mettre 20 ml de sérum physiologique dans le flacon contenant la rondelle de gaine de ventilation. Bien agiter soit manuellement; soit à l'aide d'un agitateur de type vortex pendant 1 à 2 minutes. Compléter à 50 ml avec du 15 sérum physiologique et laisser reposer 1 nuit à 40C. Exemple 4: Préparation de la détection à partir d'un échantillon prélevé sous forme solide: L'échantillon considéré est un échantillon obtenu selon l'exemple 3. Pour la préparation de l'échantillon, il faut suivre le protocole de l'exemple 2. Exemple 5: Préparation et mise en oeuvre de l'analyse de la 25 présence ou non de la bactérie Legionella Pneumophila sérogroupe 1: L'analyse s'effectue sur les échantillons obtenus selon les exemples 2 et 4. L'analyse s'effectue par la méthode ELISA et comprend notamment parmi 30 les étapes connues de l'homme de l'art les étapes suivantes: - Chaque échantillon est analysé en triplicat. Pour cela, trois puits d'une plaque de microtitration sont utilisés par prélèvement. Quand l'ensemble des échantillons est déposé, la (les) plaque(s) de microtitration sont placées une nuit à environ 37 C. - Les sites non spécifiques sont bloqués avec un mélange de PBS 1X 3% BSA. L'incubation se fait pendant 90 minutes à environ 37 C. - Dans chaque puits est ajouté l'anticorps anti-Legione//a Pneumophila type 1(sérogroupe 1). La dilution de travail de cet anticorps est de 1/40. L'incubation se fait pendant 60 minutes à environ 37 C. - Dans chaque puits est ajouté un anticorps secondaire, couplé à la peroxydase, capable de reconnaître l'anticorps anti-Legione//a pneumophil/a type 1 (sérogroupe 1). L'incubation se fait pendant 60 minutes à environ 37 C. - La révélation se fait en utilisant le TMB (3,3',5,5'15 tetramethylbenzidine). Après blocage de la réaction de révélation avec H2SO4 1M, la lecture est faite à 450 nm. Entre chaque étape, les plaques de microtitration sont lavées 4 fois avec du PBS 1X- 0,2% tween 20. Les dilutions des différents anticorps sont réalisées dans du PBS 1X. 20 Réactifs et diluants avantageusement utilisés: Le Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X: Composition Sodium Phosphate dibasique (Na2HPO4.2H20) .. ........ ..............7,2075 g Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) ........................................ 1 g Chlorure de sodium (NaCI) ................................................................. 40 g Chlorure de potassium.......................................... ..... ............................1 g Eau distillée....................... 500 mL Le PBS lX- 0,2 % Tween 20: Composition Tween 20.................... .......................................................................... DTD: .2 ml PBS 1X.............. ............................................... DTD: .......................................1 litre Remarque: la solution n'a pas besoin d'être stérile, mais doit être préparée à partir de PBS stérile...DTD: Le PBS 1X- 3% BSA (Bovine Serum Albumin) La BSA (Bovine Serum Albumin) utilisée doit avoir une pureté de 98 % minimum, pH 7, recommandée comme diluant pour les applications ELISA selon les fiches techniques des fournisseurs. Pour réduire le bruit de fond 10 du test, elle doit avoir la quantité d'acides gras la plus réduite possible ( Composition: BSA.......................................................... .................................................10 g PBS lX.............. DTD: .......................................................................... DTD: .............1 litre Remarque: la solution n'a pas besoin d'être stérile, mais doit être préparée à partir de PBS stérile...DTD: Les Révélateurs de la péroxydase Deux révélateurs sont plus communément utilisés comme révélateurs de la 20 péroxydase: - I'o-Phenylenediamine dihydrochloride ou OPD, - la 3,3',5,5'-Tétramethylbenzidine ou TMB. Les deux produits peuvent être achetés prêt à l'emploi ou à préparer extemporanément. Dans tous les cas, suivre les consignes données par les 25 fournisseurs. L'Anticorps ou sérum anti-Legionella pneumophila sérogroupe 1: Utiliser un sérum polyclonal, ou mieux, un anticorps monoclonal issu de la souris capable de réagir spécifiquement avec le type 1 de Legionell//a pneumophila. L'Anticorps secondaires marqués à la péroxydase Utiliser un anticorps marqué de type Peroxidase-conjugated Goat antiMouse IgG (H+L). Le seuil de détection de la méthode a été déterminé à 103 bactéries pour 100 pIl placés dans la plaque de microtitration. De ce fait, pour 100 pl placés dans la plaque de microtitration, il est possible de diagnostiquer la présence ou non d'au moins 103 bactéries. D'autre part, il est également possible d'obtenir une relation entre la densité optique (DO) et la concentration en bactéries par mL, et ainsi 10 connaître quantitativement le nombre de bactéries présentes dans l'échantillon. Le tableau suivant permet d'illustrer à titre indicatif la correspondance entre différentes concentrations et les densités optiques obtenues. Tableau 1: Tableau de relation entre la concentration en bactéries et la densité optique (DO) lue à 450 nm Concentration en bactéries DO à 450 nm (nombre de bactéries/mL) 0,43.10u 1,734 5,4.106 1,190 3,4.105 0,526 1,1.104 0,2 2.103 0,1 Les valeurs présentées dans ce tableau sont pondérées par rapport à l'intensité du signal du bruit de fond. Exemple 6: Exemple de différents prélèvements effectués et 25 résultat de la détection de la bactérie legionella pneumophila séroroupe 1 par la méthode ELISA: Exemple 6.1: Prélèvement d'un échantillon liquide dans une gaine aéraulique de reprise au-dessus d'un groupe frigorifique externe: mL d'échantillon sont prélevés dans une gaine aéraulique de reprise au5 dessus d'un groupe frigorifique externe. Le prélèvement est effectué selon l'exemple 1. L'échantillon a été concentré deux fois pour obtenir 5 mL de concentrat. Les analyses, selon l'exemple 5, ont donné une densité optique (DO) moyenne de 0,110, ce qui correspond environ à 1500 bactéries par mL 10 d'échantillon, soit 750 bactéries par mL de la suspension de départ. Il y a donc présence de la bactérie Legionella pneumophi/a sérogroupe 1 dans la gaine aéraulique étudiée à une concentration faible, cette zone de la gaine aéraulique ne nécessite pas de décontamination. Exemple 6.2: Prélèvement d'un échantillon liquide dans une gaine aéraulique de soufflage: mL d'échantillon sont prélevés selon l'exemple 1, dans une gaine aéraulique de soufflage. Cette gaine présente de forts problèmes de 20 condensation, ce qui a permis de définir la zone de prélèvement permettant de recueillir une quantité importante de liquide. L'échantillon a été concentré dix fois pour obtenir 5 mL de concentrat. Les analyses, selon l'exemple 5, ont donné une DO moyenne de 0,916, ce qui correspond à environ 2,5 millions de bactéries par mL de concentrat, soit 25 250 000 bactéries par mL de la suspension de départ. Cette valeur est supérieure au seuil maximum autorisé de 100 000 bactéries de type Legionella pneumophila. L'installation doit donc être arrêtée d'urgence et décontaminée le plus rapidement possible. Exemple 6.3: Prélèvement d'un échantillon solide dans une gaine de soufflage: Un échantillon solide est prélevé, selon l'exemple 3, dans une gaine de soufflage. L'échantillon prélevé a une surface d'environ 7,1 cm2. Sur cet échantillon, aucune trace d'eau, de biofilm, ou de graisse n'est présente. Les analyses effectuées selon l'exemple 5, ont donné une DO qui n'est pas différente du bruit de fond. La concentration en bactéries est donc inférieure à 1000 bactéries par mL. Cette gaine ne nécessite donc pas de décontamination. Exemple 6.4: Prélèvement d'un échantillon solide en tête de centrale de traitement d'air: Un échantillon solide est prélevé, selon l'exemple 3, en tête d'une centrale de traitement d'air se trouvant sous le vent d'une bouche d'extraction. L'inspection visuelle a révélé la présence d'un biofilm. L'échantillon solide a une surface d'environ 7,1 cm2. Les analyses effectuées, selon l'exemple 5, ont donné une DO moyenne de 0,302, ce qui correspond environ à 40 000 bactéries par mL. Cette valeur est supérieure à 10 000 bactéries Legionella pneumophila, ce qui correspond à un seuil nécessitant le suivi mensuel de l'installation afin d'éviter de dépasser le seuil maximum autorisé de 100 000 bactéries 25 Legionella pneumophila, REVENDICATIONS 1. Procédé de prélèvement d'au moins un échantillon, dans le but 5 d'effectuer ultérieurement la détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie qui pourrait être contenue dans cet échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend le prélèvement dudit échantillon dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé, au moins dans une zone du conduit dans 10 laquelle une condensation du gaz a pu se produire. 2. Procédé de prélèvement, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le conduit est un conduit de climatisation. 3. Procédé de prélèvement, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la zone du conduit, dans laquelle une condensation du gaz a pu 15 se produire, est choisie parmi le groupe consistant en un coude, un regard, un clapet anti-feu, un point bas, un pont thermique, une bouche de soufflage ou de reprise. 4. Procédé de prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lorsque l'échantillon à prélever est sous forme 20 liquide, le prélèvement est effectué par aspiration d'au moins une partie du liquide présent dans ladite zone du conduit, notamment en effectuant un trou dans le conduit. 5. Procédé de prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lorsque l'échantillon à prélever est sous forme 25 solide, le prélèvement consiste à prélever au moins une partie de la zone du conduit, de préférence par découpe d'une partie de la zone du conduit, contenant au moins une partie de l'échantillon solide. 6. Procédé de prélèvement, selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'échantillon solide est constitué d'au moins une partie d'un dépôt de 30 tartre, ou au moins une partie d'une trace d'eau, ou au moins une partie du biofilm, ou au moins une partie de graisse, ou au moins une partie d'un indice équivalent quant à la possibilité de la présence d'au moins un type de bactéries. 7. Procédé de prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 5 1 à 6, caractérisé en ce que le prélèvement, de préférence le prélèvement et la détection, s'effectue(nt) avant le nettoyage et/ou la décontamination du conduit précité. 8. Procédé de prélèvement, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes de repérage 10 de la zone à prélever et de prélèvement de l'échantillon sous forme liquide ou solide. 9. Procédé de détection de la présence ou non d'au moins un type de bactérie dans un conduit comprenant une étape de prélèvement d'un échantillon sur lequel la détection doit être réalisée et une étape de 15 détection proprement dite caractérisé en ce que l'étape de prélèvement de l'échantillon est réalisée selon le procédé de prélèvement tel que décrit aux revendications 1 à 8. 10. Procédé de détection, selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence de la bactérie legionella 20 pneumophila, de préférence legionella pneumophi/a sérogroupe 1, dans un conduit servant essentiellement à la circulation d'un gaz, notamment l'air, de préférence de l'air climatisé, et comprend avant la réalisation de cette détection une étape de prélèvement selon le procédé de prélèvement tel que décrit aux revendications 1 à 8. 11. Procédé de détection, selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes: de prélèvement de l'échantillon, éventuellement de remise en solution lorsque l'échantillon est sous forme " solide ", de concentration de la bactérie, d'analyse de la présence ou non de la bactérie au sein de l'échantillon. 2850756 24 12. Procédé de détection, selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend un dosage ELISA de la bactérie legionella pneumophila, de préférence legionella pneumophila sérogroupe 1.