Brevet FR2849041A1 — publié le 20040625

La présente invention est relative à une protéine recombinante chimérique dérivée des sous- unités [alpha]1 et (3 de canaux calciques haut-seuil, ainsi qu'à ses applications pour l'étude des voies de signalisation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et l'identification de composés modulant l'activité des protéines G. La classe des RCPG comprend plus de mille membres identifiés, codés par des gènes représentant 2 à 5 % du potentiel de codage du génome de vertébrés (El Far et Betz, Biochem. J., 2002,365, 329-336) ; on dénombre 27 gènes codant pour des sous-unités Ga, 5 pour les sous-unités Gp, et 14 pour les sous-unités Gy, (Albert et Robillard, Cell, 2002,14, 407-418). De nombreux processus biologiques comme la régulation synaptique, la réponse aux hormones et aux phéromones, le guidage cellulaire (chémoattraction ou chémorépulsion) ou la vision impliquent les récepteurs liés aux protéines G (RPCG). En effet, les RCPG sont capables d'assurer la reconnaissance et la transduction de messages aussi variés que ceux des acides aminés (acide glutamique...), des peptides (angiotensine, neurotensine, somatostatine...), des protéines (thyrotropine (TSH), hormone folliculo-stimulante (FSH)...), des amines (acétylcholine, adrénaline, sérotonine...), des lipides (prostaglandines, leukotriènes...), des nucléotides et des nucléosides (adénosine ou ATP). Les ions (Ca), les molécules odorantes et gustatives, les photons et les phéromones font également partie des signaux extracellulaires reconnus par les RCPG (pour revue, voir Gether, Endocrine reviews, 2000,21, 90-113 et Albert et Robillard, précités). Le signal extracellulaire est transduit à l'intérieur de la cellule par l'intermédiaire des protéines G hétérotrimériques liant les nucléotides guanyliques (GDP et GTP), composées des sous-unités nommées Ga, Gss, Gy ; la reconnaissance du signal extracellulaire par le RCPG entraîne l'activation des protéines G qui se traduit par la dissociation de l'hétérotrimère en Ga, et Gpy et la liaison de la sousunité Ga au GTP. Plusieurs effecteurs intracellulaires peuvent être modulés directement ou indirectement par l'activation des différentes sous-unités Ga et Gss[gamma], des protéines-G. Les effecteurs contrôlés par les sous-unités Ga, peuvent être des enzymes (phospholipases A2 et C, adénylyl- et guanylylcyclases, c-jun kinase, tyrosine-phosphatase (SH-PTP2)...), dont l'activation va influer sur le taux de seconds messagers produits ou libérés (phosphoinositides et diacyls-glycérols, Ca++, cAMP, cGMP...), des canaux (à conductances potassiques, calciques, sodiques ou chlores), des échangeurs ioniques (sodium/proton) ou plus récemment des kinases (tyrosines kinases Btk (Bruton's tyrosine kinase), MAP kinases (Mitogen-Activated protein kinase), (Albert et Robillard, précité). Gss[gamma] peut également moduler l'activité d'effecteurs au moins aussi nombreux que ceux contrôlés par Ga, à savoir : les canaux (à conductances sodique, calcique dépendante du voltage (N et P/Q) ou potassique à rectification entrante (GIRK : G protein inward rectifyer K+ channel)...), les enzymes dites classiques (phospholipases A2 et C, adénylyl-cyclase I, II, IV, tyrosine-phosphatase (SHPTP1)...) ainsi qu'un nombre important de kinases (phosphoinositide 3-kinase, récepteur (3-adrénergique kinases, c-jun kinase, MAP kinases, tyrosine kinases Btk et T-cell-specific kinase (Tsk), (pour revue voir Albert et Robillard, précité). Ainsi, l'étude de ces voies de signalisation et la recherche de drogues agissant sur ces voies de signalisation présentent un intérêt thérapeutique important pour la recherche de nouveaux médicaments. Il ressort de ce qui précède que l'activation des protéines G et leur dissociation en sous-unités Ga et Gss[gamma] est le carrefour d'un grand nombre de voies de signalisation et de régulation cellulaires. Par conséquent, l'analyse de l'activation de ces protéines G permet d'étudier les voies de signalisation cellulaire, dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G et de cribler des agonistes et des antagonistes de ces voies de signalisation. Pour analyser l'activation des protéines G, Janetopoulos et al., (Science, 2001,291, 2408-2411) ont décrit une technique de suivi in vivo en temps réel de l'interaction Ga-Gp. Cette technique, mise au point chez l'amibe Dictyostelium discoideum, est basée sur la cotransfection de deux constructions codant pour deux protéines chimères fluorescentes : Gp-YFP et Ga2-CFP. L'interaction entre les deux chimères induit un processus de transfert de fluorescence (FRET) qui permet un suivi en temps réel de leur interaction dans le cellule vivante. Les deux chimères construites par Janetopoulos et al. sont capables de former un complexe qui interagit de manière fonctionnelle avec le récepteur à l'AMPc et peut être activé par du GTPyS. Cette technique utilisant la fluorescence est adaptable aux approches de criblage à haut débit. Toutefois, du fait de la compétition avec des sous-unités Ga ou Gss[gamma] endogènes supprimant le processus de FRET, cette approche ne peut fonctionner que dans des cellules délétées génétiquement de leur protéine G équivalente endogène. De plus, chez les vertébrés, les différents isoformes de protéines G sont impliquées dans la réponse à l'activation des différents récepteurs de type RCPG. En conséquence, l'approche de Janetopoulos et al. suppose la construction d'une chimère et d'une lignée cellulaire spécifiquement délétée pour chaque isotype de protéine G étudié. Il ressort de ce qui précède qu'il n'existe pas d'outil ubiquitaire, simple à mettre en #uvre pour évaluer l'activation des protéines G dans des cellules eucaryotes. Les canaux calciques comprennent des canaux de type bas-seuil s'activant par de faibles dépolarisations et des canaux de type haut-seuil s'activant par de fortes dépolarisations. Les canaux de type haut-seuil représentent un complexe hétéromultimérique aa28 et y, dans lequel la sous-unité ai membranaire, constituant le canal proprement dit, est associée à une sous-unité intracellulaire régulatrice /3 (ou Ca(3), par l'intermédiaire de son domaine d'interaction (domaine AID pour alpha interaction domain ), présentant un motif conservé : QQ-E--L-G-- WI---E (code à une lettre ; - représentant n'importe quel acide aminé ; Pragnell et al., Nature, 1994,368, 67-70 ; figure 1) dans lequel les résidus Y392, W395 et 1396 sont essentiels pour la liaison de la sous-unité ? (De Waard et al., FEBS, 1996,380, 272- 276). La sous-unité régulatrice (3 se lie au domaine AID par l'intermédiaire de son domaine BID (beta interaction domain ; DeWaard et al., J. Biol. Chem., 1995,270, 12056-12064) qui est inclus dans un domaine GK-like (Hanlon et al., FEBS, 1999, 445,366-370). Sept sous-unités ai ont été identifiés : alA(Ca,,a2.,), a1B (Cava2.2), [alpha]1E (Cava2.3), formant respectivement les canaux neuronaux de type P/Q et N et les canaux de type R, régulés par les protéines G (canaux sensibles aux protéines G) et ais (Cavai.l), a,(Caal,2), aid (Cavai.3) et alf(Ca"a1.4), formant les canaux de type L, insensibles aux protéines G, incluant les canaux cardiovasculaires (ale) et squelettiques (as), (Lory et al., m/s, 2001, 10, 979-988). Dans le système nerveux central, les canaux calciques haut-seuil de type N et P/Q sont directement impliqués dans le déclenchement du fonctionnement de la synapse : leur ouverture sous l'effet d'un potentiel d'action induit une entrée de calcium dans la terminaison présynaptique. Ce signal déclenche la sécrétion de neuromédiateurs tels que le glutamate dans la fente synaptique et, ainsi la propagation de l'influx nerveux dans la dendrite post-synaptique. Les canaux N et P/Q sont régulés par des récepteurs liés aux protéines G trimériques (RCPG) tels que les récepteurs métabotropiques de classe III du glutamate (pour revue : El Far et Betz., précité) ou les récepteurs noradrénergiques, muscariniques, GABAergiques (GABA 5 yaminobutyric acid), sérotoninergiques, dopaminergiques, et aux opiacées (pour revue : Hille, Trends NeuroSci., 1994,17, 531-536). Il a été montré que le sous-complexe Gss[gamma] est directement responsable d'une inhibition de l'activité des canaux P/Q qui résulte d'une fixation directe de G(3y sur la boucle intra-cytoplasmique reliant les domaines membranaires I et II (boucle I-II) de la sous-unité ai (De Waard et al., Nature, 1997,385, 446-450). De fait, cette boucle présente plusieurs sites d'interaction avec G(3y, chevauchants le domaine de liaison à la sous-unité régulatrice Ca"(3 (domaine AID ; Figure 1), dont un motif consensus QQ--R-L-GY inclus dans le domaine AID, est essentiel pour la liaison de Gss[gamma] (Figure 1 ; De Waard et al., Nature 1997, 385, 446-450 ; Zamponi et al., Nature, 1997,385, 442-446). De plus, la sous- unité régulatrice Ca(3 semble contrecarrer l'effet fonctionnel des protéines G (Bourinet et al., P. N.A.S., 1996,93, 1486-1491). Ainsi, il semblerait que cet anta- gonisme implique une compétition physique entre la sous-unité Ca,,(3 et la protéine G(3y au niveau de la région AID de la boucle I-II (Dolphin et al., J. Physiol., 1998, 506,3-11). Les Inventeurs ont construit des protéines chimériques par fusion NH2 et/ou COOH terminale : (i) de la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 de canaux calciques haut-seuil sensibles ou insensibles aux protéines G (respectivement, alA ou Ca"a2, constitutive d'un canal neuronal de type P/Q et aie ou Cavai.2 constitutive d'un canal de type L cardiovasculaire) ou un fragment de celle-ci ; ladite boucle correspond aux positions 367 à 487 en référence à la séquence de la sous-unité Ca,,a2.,, et comprend le domaine de liaison à une sous-unité (3 d'un canal calcique (ou domaine AID) et les sites de liaison à une sous-unité Gss d'une protéine G (figure 1), et (ii) d'une sous-unité p d'un canal calcique haut-seuil, capable de se lier audit fragment de la sous-unité [alpha]1. Ils ont montré que l'ensemble des protéines chimériques obtenues comprenant la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1 issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID, - possède des propriétés surprenantes d'interaction intramoléculaire entre les domaines de liaison des sous-unités ai et ss du canal calcique qui empêchent la fixation de la chimère sur le domaine AID d'une sous-unité [alpha]1. Ils ont confirmé que ce masquage du domaine de liaison de la sous-unité (3 était bien dû à son interaction intramoléculaire avec le domaine AID, car la délétion du domaine AID de la chimère rétablit cette fixation. Ils ont également montré que la fixation de la chimère comprenant la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1A "sensible aux protéines G", sur le domaine d'interaction de la sous-unité [alpha]1 est rétablie par addition de Gss[gamma]. Ce résultat a été confirmé par la mise en évidence ex vivo de l'interaction d'une sous-unité (3 recombinante marquée avec un fluorophore de type Cy3 avec une chimère fluorescente de la sous-unité [alpha]1A (GFP-aiA), par mesure du transfert de fluorescence (FRET) en microscopie confocale. Ces propriétés leur ont permis de démontrer que de manière inattendue, la régulation des canaux P/Q passe par un déplacement, par le complexe Gss[gamma], de l'interaction entre la sous-unité régulatrice (3 et la sous-unité a du canal calcique et non par son inhibition comme cela avait été suggéré précédemment. De manière plus précise, les Inventeurs ont montré que la protéine chimérique dérivée d'une sous-unité [alpha]1 sensible aux protéines G existe sous deux formes "fermée" ou "ouverte", respectivement en l'absence ou en présence de sousunité Gp capable de se lier audit fragment de la sous-unité [alpha]1, soit sous forme de monomère Gp, soit sous forme d'hétérodimère G(3y. En l'absence de Gap (ou G(3y), la protéine chimérique est capable de se replier permettant ainsi aux domaines d'interaction des sous-unités [alpha]1 et (3 du canal calcique de s'associer par une liaison intramoléculaire stable (forme fermée). En présence de Gp (ou Gss[gamma]), la liaison intramoléculaire est détruite et les domaines d'interaction des sous-unités [alpha]1 et (3 du canal calcique se dissocient (forme ouverte), permettant ainsi à chacun des domaines d'interagir respectivement avec Gss (domaine d'interaction de la sous-unité [alpha]1 : domaine AID) et/ou une sous-unité [alpha]1 d'un canal calcique (domaine d'interaction de la sous-unité (3 : domaine BID). De façon similaire, la protéine chimérique dérivée d'une sous-unité ai insensible aux protéines G est capable de se replier permettant ainsi aux domaines d'interaction des sous-unités [alpha]1 et (3 du canal calcique de s'associer par une liaison intramoléculaire stable (forme fermée). En conséquence, en présence d'antagonistes de cette liaison, autres que Gss ou Gss#09, la liaison intramoléculaire peut également être détruite et les domaines d'interaction des sous-unités [alpha]1 et 5 du canal calcique se dissocier (forme ouverte), permettant ainsi à chacun des domaines d'interagir respectivement avec ledit antagoniste autre que Gp ou Gss[gamma] (domaine d'interaction de la sous-unité ai : domaine AID) et/ou une sous-unité [alpha]1 d'un canal calcique (domaine d'interaction de la sous-unité (3 : domaine BID). En conséquence, du fait du remaniement de leur structure en présence de sous-unités Gp ou Gss[gamma] libres ou bien d'autres antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et ss (passage de la forme fermée à la forme ouverte), les protéines chimériques dérivées des sous-unités [alpha]1 et (3 de canaux calciques haut-seuil représentent des outils simples à mettre en oeuvre, sensibles, spécifiques et utiles pour les applications suivantes : - les protéines chimériques dérivées d'une sous-unité [alpha]1 sensible aux protéines G (par exemple : alA, alB et alE) permettent de déterminer les variations de la concentration cellulaire en sous-unités Gss[gamma] libres, ex vivo, en temps réel et donc de mesurer l'activation des protéines G dans les cellules : de telles protéines chimériques représentent des biocapteurs ubiquitaires de l'activation des protéines G parfaitement adaptés à l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G et au criblage d'agonistes/antagonistes de ces voies de signalisation capables d'augmenter ou de diminuer la concentration en sous-unités Gss[gamma] libres dans les cellules et donc de moduler l'activité de ces voies de régulation et de signalisation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. - les protéines chimériques dérivées d'une sous-unité [alpha]1 sensible ou résistante aux protéines G (par exemple : a,A, UIB, alE, aie, ad, als et aif) repré- sentent des outils simples, sensibles et spécifiques, parfaitement adaptés au criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et ss, capables de moduler l'activité de l'ensemble des canaux calciques haut-seuil. - les protéines chimérique dérivées d'une sous-unité [alpha]1 et d'une sous-unité (3 d'un canal calcique haut-seuil telles que définies ci-dessus sont également utiles pour le contrôle systématique pharmaco-toxicologique de nouveaux médicaments en phase I et la recherche d'agonistes naturels de récepteurs orphelins. En effet, le clonage du génome humain a permis d'identifier environs 350 récepteurs RCPG. Parmi ceux-ci, seulement 200 ont un ligand identifié. Les autres, appelés récepteurs orphelins, constituent potentiellement des cibles clefs pour l'identification de nouvelles voies de signalisation et de régulation cellulaire. La recherche d'agonistes et d'antagonistes de ces récepteurs revêt donc un intérêt majeur tant sur le plan de la recherche fondamentale que sur le plan thérapeutique. En conséquence, la présente invention a pour objet une protéine chimérique dérivée d'un canal calcique haut seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sous-unité P ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine BID, fusionné (e) son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité ai ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID. Conformément à l'invention les domaines AID et BID sont tels que définis ci-dessus ; la boucle I-II de la sous-unité ai comprend le domaine AID de liaison à la sous-unité (3 et les sites de liaison à la sous-unité Gss d'une protéine G, dont un site consensus de liaison qui est inclus dans ce domaine AID. Ces différents domaines sont illustrés à la figure 1. L'invention englobe les protéines chimérique issues des sous-unités [alpha]1 et (3 de vertébrés, notamment de mammifères humains ou non-humains et de leurs orthologues chez les invertébrés. Des protéines chimériques conformes à l'invention sont représentées notamment par : - une sous-unité (3 fusionnée à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1, et - le domaine GK-like d'une sous-unité (3 incluant le domaine BID (Hanlon et al., précité), fusionné à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1. Conformément à l'invention, la boucle I-II ou son fragment est, soit fusionné directement à l'extrémité NH2 ou COOH de la sous-unité (3 ou de son fragment, soit les deux séquences sont séparées par un peptide espaceur dont la taille et la séquence en acides aminés sont tels que les domaines AID et BID de la protéine chimérique contenant ledit espaceur sont aptes à interagir pour former une liaison intramoléculaire qui est déplacée en présence d'antagoniste (passage de la forme fermée à la forme ouverte) ; tel peptide espaceur est notamment représenté par une séquence polyglycine. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, elle est issue d'un canal calcique haut-seuil sensible aux protéines G. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine chimérique comprend un fragment d'une sous-unité [alpha]1 sélectionnée parmi (Y IA, UIB et CLIE. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, ladite sous unité (3 est sélectionnée dans le groupe constitué par (3,, P2, p3 et ss4. L'invention englobe également les protéines chimériques constituées par des séquences fonctionnellement équivalentes aux séquences telles que définies cidessus, c'est-à-dire dont la sous-unité (3 et la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 ou leurs fragments tels que définis ci-dessus sont capables de former une liaison intramoléculaire par l'intermédiaire de leurs domaines d'interaction ; ladite liaison étant éventuellement détruite en présence de sous-unités Gss ou Gss[gamma] libres ou bien d'autres antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et (3 ("forme ouverte"). Parmi ces séquences, on peut citer par exemple les séquences dérivées des séquences précédentes par : - mutation (substitution et/ou suppression, et/ou addition) d'un ou plusieurs acides aminés des séquences telles que définies ci-dessus, - modification d'au moins une liaison peptidique-CO-NH- de la chaîne peptidique de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, notamment par remplacement par une liaison différente de la liaison-CO-NH- (méthylène amino, carba, cétométhylène, thioamide....) ou par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso, et/ou, - substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, par un résidu d'acide aminé non protéinogénique. Par résidu d'acide aminé non protéinogénique, on entend tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel, notamment tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe-CHR-, situé entre-CO- et-NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. La présente invention a notamment pour objet une protéine chimérique variant issue d'une protéine chimérique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation d'au moins un acide aminé dans les séquences de la dite sous-unité (3 et/ou de la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, ledit variant possède une mutation qui modifie l'affinité de la sous-unité 5 pour la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 et/ou réciproquement ; de telles mutations permettent d'obtenir une protéine chimérique plus ou moins sensible à la concentration en sous-unité Gss ou Gss[gamma] libres. Parmi ces mutations on peut citer les mutations du domaine AID de la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1, telles que décrites dans Pragnell et al., précité et De Waard et al. FEBS, 1996,380, 272-276, à savoir : Q383A, Q384A, E386D, E386S, L389H, G391R, Y392S, Y392F, W395A, I396A et E400A. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique ou de son variant, elle est couplée, de préférence de manière covalente, à au moins un marqueur approprié permettant la détection et/ou la purification et/ou l'immobilisation de ladite protéine, par exemple : un épitope antigénique, une étiquette du type polyhistidine, un composé luminescent (fluorophore telle que la GFP ou l'un de ses variants : CFP,YFP et BFP), radioactif, ou enzymatique. Conformément à l'invention le dit couplage est réalisé par tout moyen approprié, notamment par une liaison peptidique par l'intermédiaire des fonctions COOH et/ou NH2 terminales de la chaîne peptidique, ou bien par une autre liaison covalente, telle que par exemple : une liaison ester, éther, thioéther, thioester, par l'intermédiaire de fonctions réactives de la chaîne latérale d'un acide aminé de la chaîne peptidique. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la dite protéine chimérique comprend un fluorophore accepteur ou donneur respectivement à son extrémité NH2 et/ou COOH. Les fluorophores accepteurs, par exemple CFP ou BFP, peuvent être couplés indifféremment à l'extrémité NH2 ou COOH de la protéine chimérique, les fluorophores donneurs, par exemple GFP ou YFP sont fusionnés à l'extrémité opposée de ladite protéine chimérique. De telles protéines chimériques sont utiles pour l'étude ex vivo en temps réel de l'activation des protéines G et le criblage de molécules capables de moduler cette activation par mesure du transfert de fluorescence (FRET). En effet, le marquage par un composé luminescent présente l'avantage d'obtenir un signal localisé qui ne nécessite pas la présence d'autres réactifs comme c'est le cas pour les marquages enzymatiques. Ce type de marquage permet également l'utilisation de phénomène tel que le transfert d'énergie qui peut s'effectuer selon différents mécanismes : transfert d'énergie par résonance, transfert d'énergie radiatif (l'accepteur absorbe la lumière émise par le donneur) et transfert d'électron. Ce transfert d'énergie, entre un composé "donneur" (D) luminescent et un composé "accepteur" (A) luminescent ou non, et qui est dépendant de la distance entre A et D, a été utilisé pour la réalisation de nombreux dosages. On choisit D et A, qui sont couplés à chaque extrémité de la protéine chimérique afin que le transfert d'énergie n'ait lieu que lorsque l'intercation intramoléculaire entre les domaines BID et AID a lieu (forme fermée). Ce phénomène se traduit par une diminution ou extinction de la luminescence de D et une émission de luminescence de A si celui-ci est luminescent, lorsque D est excité. Lors de ces dosages on mesure soit la variation de la luminescence de A, soit la variation de la luminescence de D ; nature de A et de D étant variable. Par exemple, pour mesurer la variation de luminescence de A on peut utiliser comme donneur et accepteur deux protéines fluorescentes ou bien comme donneur un complexe de terres rares (europium, terbium) avec un chélate, un cryptate ou un macrocycle et comme accepteur une protéine fluorescente. La mesure de la variation de luminescence de D repose sur la capacité d'un composé (A) à diminuer ou supprimer la luminescence d'un autre composé (D) lorsque ceux-ci sont suffisamment proches ("Quench"). La gamme de molécules A pouvant être utilisées est donc plus étendue et inclut ainsi des composés non luminescents tels que des métaux lourds, des atomes lourds, des molécules chimiques comme par exemple le rouge de méthyle, des nanoparticules telles que celles vendues sous la dénomination Nanogold@ par la société Nanoprobes (USA), ou bien encore les molécules vendues sous les dénominations DABCYL@ (Eurogentec, Belgique), QSY Dyes (Molecular Probes Inc., USA), ElleQuencher (Oswell/Eurogentec) ou Black Hole Quenchers (Biosearch Technologies Inc., USA). La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'au moins 7 acides aminés de la séquence de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, situés à la jonction de la sous-unité (3 et de la boucle I-II de la sous-unité ai ou de leurs fragments tels que définis-ci-dessus ; de tels peptides permettent notamment de produire des anticorps spécifiques de la protéine chimérique selon l'invention. La présente invention a également pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine chimérique ou un peptide tels que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anti- corps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. De tels anticorps sont utiles notamment pour immobiliser la protéine chimérique sur un support solide, la purifier ou bien la détecter. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une protéine chimérique ou un peptide tels que définis ci- dessus et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. L'invention a également pour objet des sondes et des amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction de la sous-unité (3 et de la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 ou de leurs fragments tels que définis-ci-dessus ; ces sondes et ces amorces permettent de détecter/amplifier spécifiquement lesdites molécules d'acide nucléique codant la protéine chimérique selon l'invention. L'invention a également pour objet d'autres amorces permettant d'amplifier spécifiquement la sous-unité (3 et/ou la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 ou leurs fragments tels que définis-ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 4,6, 7,8 et 9. Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Les séquences codant pour une protéine chimérique selon l'invention peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR à l'aide d'une paire d'amorces appropriée ou bien par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue. Les molécules d'acides nucléiques dérivées, codant pour un variant de la protéine chimérique selon l'invention, sont obtenues par les méthodes classiques, permettant d'introduire des mutations dans une séquence d'acide nucléique, connues en elles-mêmes, suivant les protocoles standards précités. Par exemple, la séquence codant pour un variant de la protéine chimérique selon l'invention peut-être obtenue par mutagenèse dirigée selon la méthode de Kunkel et al., (P.N.A.S., 1985,82, 488- 492). La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par les molécules d'acides nucléiques codant pour une protéine chimérique telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en euxmêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides. Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en- elles-mêmes. Selon un mode de réalisation dudit vecteur recombinant, il s'agit d'un vecteur d'expression eucaryote présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10 ; le plasmide SEQ ID NO: 5 contient la boucle I-II de la sous-unité Cav[alpha]2.1 de lapin fusionnée à l'extrémité C-terminale de sous-unité CaVss3 de rat, sous le contrôle du promoteur CMV et le plasmide SEQ ID NO: 10 contient un insert constitué de 5' en 3' par la fusion en phase des fragments suivants : la séquence GAP-43, l'ADNc codant pour l'EGFP (donneur de fluorescence), le domaine GK-like de la sous-unité Cavp3 de rat, la boucle I-II de la sous-unité Cav[alpha]2.1 de lapin et l'ADNc codant pour la CFP (accepteur de fluorescence). La présente invention a également pour objet des cellules modifiées par une protéine chimérique, une molécule d'acide nucléique ou bien une vecteur recombinant tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites cellules sont des cellules eucaryotes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites cellules expriment au moins un récepteur capable de se lier aux protéines G (RCPG) ; lesdites cellules sont, soit des cellules exprimant constitutivement au moins un RCPG, soit des cellules modifiées qui expriment un RCPG recombinant. Des cellules modifiées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique ou une protéine dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence nucléotidique (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) ou peptidique avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte. La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques non-humains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit une séquence codant pour la protéine chimérique selon l'invention sous contrôle le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. De tels animaux transgéniques sont utiles, notamment pour les étapes de criblages secondaires : i) pour évaluer le ciblage cellulaire, voire tissulaire d'une molécule active sur les RCPG ou les canaux calciques, identifiée lors d'un criblage primaire, ii) pour étudier la biodisponibilité d'une telle molécule, et iii) pour la recherche, en première approche, d'effets secondaires éventuels d'une telle molécule. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus pour l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus pour le criblage d'agonistes et/ou d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus pour le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et (3 des canaux calciques hautseuil ; de tels antagonistes sont utiles pour moduler l'activité de l'ensemble des canaux calciques haut-seuil et représentent donc des médicaments susceptibles d'être utilisées dans le traitement des maladies liées à un dysfonctionnement de l'homéostasie calcique et des pathologies où la modulation de l'entrée calcique peut compenser un déficit cellulaire, notamment les épilepsies, les ataxies, les migraines, les hypo- et hyper-calcémies musculaires, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G est réalisée par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a1) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé au protéine G, telles que définies ci-dessus, b1) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, et CI) la détermination, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans lesdites cellules qui est liée à une sous-unité Gpy. Une telle détermination permet d'évaluer les variations de la concentration cellulaire en sous-unités Gss[gamma] libres et donc de mesurer l'activation des protéines G dans les cellules. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le criblage d'agonistes/d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G est réalisée par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé au protéine G telles que définies ci-dessus, b2) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, C2) la détermination comparative, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans les cellules qui est liée à une sous-unité Gss[gamma], avant et après la mise en contact desdites cellules en b2) avec une molécule à tester, et d2) l'identification des molécules agonistes/antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, correspondant à celles capables respectivement d'augmenter et de diminuer la concentration cellulaire en sous-unités Gss[gamma] libres. De manière avantageuse, lesdites cellules modifiées en a1) ou en a2) expriment une protéine chimérique telle que définie ci-dessus couplée à ses extrémités NH2 et COOH, respectivement à un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur de fluorescence et ladite détermination en ci) ou en c2) est effectuée par la technique de transfert de fluorescence (FRET). Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et (3 des canaux calciques hautseuil est réalisé par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a3) la mise en contact d'une molécule à tester avec une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G telle que définie ci-dessus et avec un peptide comprenant le domaine AID d'une sous-unité [alpha]1 insensible aux protéines G, b3) la mesure, par tout moyen approprié, de la liaison de ladite protéine chimérique audit peptide, et c3) l'identification des antagonistes de l'interaction entre les sousunités [alpha]1 et (3 correspondant à ceux avec lesquels on observe une liaison de ladite protéine chimérique audit peptide. Selon un mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé, ledit peptide comprenant le domaine AID est immobilisé sur un support solide, et ladite protéine chimérique est couplée à un marqueur permettant la mesure de ladite liaison en b3), tel que défini ci-dessus, notamment un fluorophore. L'invention a également pour objet une trousse pour la mise en #uvre des méthodes telles que définis ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins l'un des produits suivants : une protéine chimérique, un anticorps, un vecteur recombinant, une cellule modifiée ou un mammifère non-humain transgénique, tels que définis ci-dessus. La protéine chimérique selon l'invention présente les avantages suivants : - elle constitue un biocapteur ubiquitaire des sous-unités Gpy libres endogènes, adapté à l'étude en temps réel des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés au protéine G, et au criblage systématique (criblage à haut-débit) de molécules capables de les moduler, potentiellement utilisables comme médicament pour le traitement des maladies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement de ces voies, notamment des pathologies du système immunitaire (pour revue voir Lombardi et al, Crit. Rev. Immunology, 2002, 22, 141- 163 ; Onuffer et Horuk, Trends in Pharmacol, 2002,23, 459-467) et des pathologies neuropsychiatriques et cardiovasculaires (Seifert et Wenzel-Seifert, NaumynSchmeideberg's Arch. Pharmacol. , 2002, 366, 381-416). En outre son utilisation est simple dans la mesure elle est permet de s'affranchir partiellement des problèmes de stoechiométrie puisque son utilisation ne fait intervenir que deux molécules (Ca"(3/Caa-G(3y) au lieu de trois partenaires (CaaJCa3/G(3y) pour les méthodes de l'art antérieur. - elle est adaptée au criblage systématique (criblage à haut-débit) de molécules capables de moduler l'activité des canaux calciques à haut-seuil, potentiellement utilisables comme médicament pour le traitement des maladies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement de l'homéostasie calcique et des pathologies où la modulation de l'entrée calcique peut compenser un déficit cellulaire telles que définies ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de la protéine chimérique objet de la présente invention ainsi qu'au dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre le chevauchement, dans la boucle I-II de la sous-unité Cava.2.i, des domaines de liaison à la sous-unité (3 (domaine AID) et au complexe Gss[gamma]. Le domaine AID est représenté par une boîte noire (positions 383 à 400). Les sites de liaison pour la sous-unité Gss (Gpy) sont représentés par des boîtes hachurées ; le site en position centrale (QQ--R-L-GY) qui est essentiel pour la liaison de la sous-unité Gss (Gpy) est inclus dans le domaine AID. - les figures 2 et 3 illustrent le déplacement de l'interaction CaV[alpha]2.1- Ca"j3 par le complexe G3y des protéines G : - la figure 2a illustre la liaison de la sous-unité ss3 (1 à 3 pM) avec le domaine AID,.2 de la protéine de fusion GST-AID1.2 (1 M), - la figure 2b montre que la fusion de la sous-unité ss3 avec la boucle I-II de la sous-unité 02.1 (Chimère Ca(33- I-IIz,I) empêche sa liaison avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AID1.2, - la figure 2c montre que la délétion des 18 acides aminés du domaine AID2.1 (Chimère Cavp3- I-II2.1AAID) restore la liaison de la sous-unité z33 avec le domaine AID 1.2 de la protéine de fusion GST-AID1.2, - la figure 3 montre que l'addition de complexe Gss[gamma] déplace l'interaction intramoléculaire entre la sous-unité Cavp et la boucle I-II de la sous-unité a.2.1 de la chimère Cavp3- I-II2.1, permettant ainsi à la sous-unité P3 de se lier avec le domaine AID).2 de la protéine de fusion GST-AID1.2 ; la concentration de G(3y, capable de déplacer 50 % de la liaison entre la sous-unité Ca"(3 et domaine AIDEZ ; (IC50) est de l60nM, - les figures 4 à 7 illustrent l'analyse en FRET, du désassemblage du canal calcique P/Q induit par le complexe Gss[gamma] : - la figure 4a illustre le marquage au Cy3 de la sous-unité His-Cavss3 purifiée. CB : coloration au bleu de Coomassie d'un gel SDS-PAGE illustrant la pureté de la protéine. FS = enregistrement de la fluorescence d'un gel non coloré montrant le marquage covalent de la protéine, - la figure 4b illustre l'effet de la sous-unité Cavss3 couplée à un fluorochrome (Cy3-Cav(33) sur la relation courant-voltage de canaux Cav[alpha]2.1 exprimés dans des ovocytes de xénopes, par comparaison avec la sous-unité Cavss3 non marquée (injection d'ARNc), - la figure 5a illustre l'observation en microscopie confocale de deux régions distinctes, d'ovocytes de xénopes contenant Ca"a2,1 et Cy3-Ca"(33. T = trans- mission, F = fluorescence, - la figure 5b illustre le spectre d'émission de la fluorescence de GFP-Ca"a2,1, Cy3-Cavp3 et (GFP-Cava2.i + Cy3-Cayp3), - la figure 6 illustre la cinétique de diminution du transfert de fluorescence induit par l'injection de 100 nM de Gss[gamma]. Panneau du haut : variations du spectre d'émission de la fluorescence et panneau du bas : variations du rapport des insensités de fluorescence (Rf) à 585 nm et 525 nm, - la figure 7 illustre les valeurs Rf des ovocytes non-injectées (-), injectées avec Gpy (100 nM) ou avec du Gss[gamma] inactivé par la chaleur (HI- Gpy). - la figure 8 (a à c) illustre la séquence du plasmide pcDNA3Cavp3- 1-112.1 (SEQ ID NO: 5) contenant la boucle I-II de la sous-unité Ca,,a2.1 de lapin fusionnée à l'extrémité C-terminale de sous-unité Cavss3 de rat, sous le contrôle du promoteur CMV. - la figure 9 (a à c) illustre la séquence du plasmide pCHIC (SEQ ID NO: 10) dérivé du vecteur pEYFPmemb.(CLONTECH), contenant un insert constitué de 5' en 3' par la fusion en phase des fragments suivants : la séquence GAP-43, l'ADNc codant pour l'EGFP (donneur de fluorescence), le domaine GK-like de la sous-unité Ca"i3 de rat, la boucle I-II de la sous-unité Cava2.i de lapin et l'ADNc codant pour la CFP (accepteur de fluorescence). Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : D'UNE PROTEINE CHIMERIQUE RECOMBINANTE Cavi3-I-IIZ,i 1). Matériels et méthodes L'amplification PCR et le clonage de l'ADN recombinant sont réalisés par les techniques classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier, en suivant le protocoles standards tels que ceux décrits par exemple dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA). Un plasmide d'expression contenant un ADNc codant une protéine chimérique selon l'invention, constituée par la fusion C-terminale de la sous-unité ss3 de rat avec la boucle intracellulaire I-II de la sous-unité [alpha]1 de lapin et a été construit de la façon suivante: L'ADNc de la sous-unité Cavss3 de rat (correspondant aux positions 98 à 1545 de la séquence GENBANK M88755) est amplifiée par PCR à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes: - 5'-TTTGGTACCATGGATGACGACTCCTACGTGCCCGGGTTTGAGGACTCGGAGGCGGGTT-3' (SEQ ID NO: 1), et - 5'-GCGGAATTCGTAGCTGTCCTTAGGCCAAGGCCGGTTACGCTGCCAGTT-3', (SEQ ID NO: 2). Le fragment ainsi obtenu a été cloné entre les sites Kpn I et EcoR I du plasmide d'expression (pcDNA3, IN VITROGEN) pour donner le plasmide recom- binant pcDNA3-Ca,,(33. Le fragment d'ADNc correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cav[alpha]2.1 de lapin (positions 1383 à 1754 de la séquence GENBANK X57477), dont la séquence est illustrée par la figure 1, a été amplifié par PCR à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes : - 5'-GGGGAATTCGCCAAAGAAAGGGAGCGGGTGGAGAAC-3' (SEQ ID NO: 3 ; De Waard et al., précité et Bichet et al., Neuron, 2001,25, 177-190), et - 5'-TTTGAATTCTTACTGAGTTTTGACCATGCGACGGATGTAGAAACGCATTCT-3' (SEQ ID NO: 4). Le fragment obtenu a été cloné au site EcoR I du plasmide pcDNA3-Cavp3 pour donner le plasmide recombinant pcDNA3-Cavp3-I-Il2.i. Un plasmide contrôle contenant un ADNc codant une protéine chimérique constituée par la fusion C-terminale de la sous-unité ss3 de rat avec la boucle intracellulaire I-II de la sous-unité Cav[alpha]2.1 de lapin délétée du domaine AID a été construit de façon similaire ; le plasmide recombinant ainsi obtenu est dénommé pcDNA3-Cavp3-I-112.,AAID. 2) Résultats Le plasmide recombinant pcDNA3-Cavp3-I-Il2.i présente la séquence SEQ ID NO: 5. La séquence peptidique déduite de la séquence nucléotique obtenue par séquençage automatique de l'insert cloné dans le plasmide pcDNA3- Ca,p3-I-II2.1 présente la séquence attendue pour une protéine chimérique selon l'invention. De même la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotique obtenue par séquençage automatique de l'insert cloné dans le plasmide pcDNA3- Ca"(33-I-IIZ.1AID correspond à celle attendue pour une protéine chimérique délétée du domaine AID. EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE IN VITRO DU DEPLACEMENT DE L'INTERACTION Cava2.i-Cavp PAR LE COMPLEXE Gpy DES PROTEINES G. 1) Matériels et méthodes L'expression de l'ADN recombinant et l'analyse des protéines recombinantes sont réalisés par les techniques classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier, en suivant le protocoles standards tels que ceux décrits par exemple dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) et dans Current protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). a) Expression des protéines chimériques recombinantes et de la fusion GST-AID2 Les protéines chimériques Cav3-I-Ih.1 et Ca,p3-1-II2.,AAID et la sous-unité Cavss3 sont transcrites et traduites in vitro en présence de [35S]-méthionine à partir des plasmides tels que décrits à l'exemple 1, à l'aide du kit TNT system PROMEGA, en suivant les instructions du fabricant. La protéine de fusion GST-AIDI.2 décrite dans Pragnell et al., précité. est produite et purifiée comme décrit par les auteurs précédents. La protéine GST produite et purifiée dans les mêmes conditions est utilisée comme contrôle. b) Analyse in vitro de la de la régulation de l'interaction Cava2.I-Cav par le complexe Gss[gamma] des protéinesG. L'analyse in vitro de la régulation de l'interaction Cava2.i-Cavp par le complexe Gpy des protéines G est réalisée en suivant les protocoles tels que décrits dans De Waard et al., Nature, 1997, 385, 446-450. De manière plus précise, la sous- unité P3 et les protéines chimériques marquées ([35S] Cave3, [35S] Cavp3-I-Il2.[ et [35S] Ca,,[33-I-IIZ,,DAID) sont incubées en l'absence ou en présence de la protéine de fusion GST-AID,.2 ou de la protéine GST, et éventuellement en présence de quantités croissantes de Gss[gamma] (10 à 900 nM, CALBIOCHEM). Le produit d'incubation est séparé par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et le gel est autoradiographié. 2) Résultats Les résultats illustrés dans les figures 2 et 3 sont les suivants: - la figure 2a montre que la sous-unité (33 (1 à 3 pM) se lie avec le domaine AID 12 2 de la protéine de fusion GST-AID 1.2 (1 qM), - la figure 2b montre que la fusion de la sous-unité P3 avec la boucle I-II de la sous-unité a2,, (Chimère Ca,P3- I-II2,1) empêche sa liaison avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AIDI.2, - la figure 2c montre que la délétion des 18 acides aminés du domaine AID21 (Chimère Cave3- 1-112. laid) restore la liaison de la sous-unité z3 avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AIDI.2, - la figure 3 montre que l'addition de complexe Gss[gamma] déplace l'interaction intramoléculaire entre la sous-unité Cavss et la boucle I-II de la sous-unité a.2.1 de la chimère Cavp3- I-II2.1, permettant ainsi à la sous-unité z3 de se lier avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AID1.2 ; la concentration IC50 de Gss[gamma], capable de déplacer 50 % de la liaison entre la sous-unité Cavss et domaine AID2.1, après 30 min d'incubation à 30 C, est de 160nM; cette valeur est 2 à 3 fois plus élevée que celle relatives à l'affinité de Gss[gamma] pour la boucle I-II 2.1, précédemment rapportées (De Waard et al., Nature, 1997,385, 446-450). EXEMPLE 3 : EN EVIDENCE EX VIVO DU DEPLACEMENT DE L'INTERACTION Ca,,aZ,l-Ca,,(3 PAR LE COMPLEXE G(3y DES PROTEINES G. 1) Matériels et méthodes a), Marquage au Cy3 de la protéine recombinante His-Ca purifiée. La protéine recombinante His-Ca"(33 purifiée (Geib et al., Biochem J., 2002,364, 285-292 ; Fathallah et al., Eur. J. Neurosci., 2002,16, 219-228) est couplée au maleimide de Cy3 monoréactif en suivant les instructions du fabricant (Amersham Pharmacia Biotech). b) Injection des ovocytes de xénope et enregistrements électrophysiologiques. La préparation, l'injection des ovocytes de xénopes et les enregistre ments électrophysiologiques sont réalisés comme décrit dans Geib et al., précité. Les effets des complexes Gss[gamma] sur la relation courant-voltage et l'inactivation de l'état d'équilibre sont analysés 30 min après l'injection. c) Mesure du transfert de fluorescence (FRET). Les ovocytes sont analysés en microscopie confocale (microscope TCS-SP2, LEICA, en mode XY# ), 4 à 7 jours après l'injection. L'émission de fluorescence est enregistrée à l'aide d'un laser à argon avec une excitation à 488 nm et un miroir dichroïque (488/543/633). La fluorescence est mesurée au travers de 14 filtres (10 nm d'épaisseur) pour reconstruire le spectre d'émission. Pour chaque mesure, deux régions différentes sont analysées afin d'assurer la reproductibilité de la mesure. Les niveaux de FRET sont estimés par le rapport (585/525) entre la fluorescence à 585 nm (pic d'émission de l'accepteur Cy3) et la fluorescence à 525 nm (pic d'émission du donneur GFP). 2) Résultats - La sous-unité Cavss3 couplée au Cy3 (figure 4a) est aussi active que la sous-unité Cavp3 sur la régulation des canaux Cava2.l exprimés dans des ovocytes de xénope (Figure 4b). - L'injection de la protéine Cy3-Cavp3 ou GFP-Ca,,a2., ou bien de l'ADNc codant pour ladite protéine, seul (e) en combinaison, résulte dans l'émission d'un signal de fluorescence élevé au niveau de la membrane plasmique (Figure 5a). L'analyse de l'émission de fluorescence entre 500 et 640 nm, après excitation à 488 nm (figure 5b) montre que GFP-Cava2.i produit un signal élevé avec un maximum à 525 nm alors que Cy3-Ca,,(33 seul est peu excité et produit un signal faible avec un maximum à 585 nm. Lorsque les deux protéines sont dans les ovocytes, le signal émis à 525 nm diminue de façon drastique alors que celui à 585 nm augmente significativement. Ces changements sont facilement quantifiables par la détermination du rapport des signaux de fluorescence à 585 nm et 525 nm (Rf= 0,34 0,03 pour GFP-Ca"a2., (n=3), Rf= 1,9 0,10 pour Cy3-Cavp3 (n=3) et Rf= 3,9 0,22 pour GFP-Ca"a2.1 + Cy3-Cavp3 (n=7). D'aussi grands changements résultant d'un transfert important de fluorescence, démontrent la proximité des fluorochromes GFP- Cava21et Cy3-Cavp3. - L'injection de Gss[gamma] dans les ovocytes contenant à la fois GFP- Cav[alpha]2.1 et Cy3-Cavp3 induit une disparition rapide du transfert de fluorescence (figure 6). Par comparaison, l'injection de Gss[gamma] est sans effet dans les cellules contenant uniquement GFP- Cav[alpha]2.1 ou Cy3-Cavp3. Le rapport final des signaux de fluorescence (0,82 0,06, n=7) est de l'ordre de celui observé dans les ovocytes contenant uniquement GFP- Cava.2.1ou Cy3-Cavss3 indiquant que la dissociation du canal de Cy3-CavP3 est importante (figure 7). Par comparaison, l'injection de Gpy inactivé par la chaleur est sans effet (Rf= 3,74 0,4, n=3). Ces résultats démontrent que Gss[gamma] est aussi capable de déplacer ex vivo la sous-unité CavP3 de son site de liaison au canal Cav[alpha]2.1 EXEMPLE 4 : D'UN BIOCAPTEUR POUR MESURER L'ACTIVITE DES PROTEINES G PAR LA TECHNIQUE DE FRET Une protéine chimérique contenant un fluorophore donneur de fluorescence (EGFP) à son extrémité NH2 et un fluorophore accepteur de fluorescence (CFP) à son extrémité COOH est construite à partir du vecteur pEYFPmemb (CLONTECH ). Ce vecteur présente l'avantage de posséder : - une séquence GAP-43 qui permet un ancrage de la chimère à la membrane plasmique via son extrémité NH2. L'ancrage à la membrane présente l'intérêt d'une part de maintenir la protéine à la membrane et d'autre part d'augmenter la probabilité de rencontre entre la protéine chimère et son ligand Gss[gamma] qui est luimême ancré à la membrane par une liaison de type palmitoylation, et - une séquence EYFP en aval de GAP-43. La construction est réalisée en deux étapes : - 1 ère étape de clonage : Le fragment d'ADN codant pour le domaine GK-like de la sous-unité (3 (Hanlon et al., FEBS, 1999, 445, 366-370) fusionné à la boucle I-II de la sous-unité ai est amplifié par PCR à partir du plasmide pcDNA3-Cavp3-I-Il2 1 (exemple 1) puis il est cloné en 3' du gène EYFP. De manière plus précise, l'amplification PCR est réalisée à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes : BsiWI Pvu I - 5'- AGCCGTACGCGATCGCATCTCTAGCCAAGCAGAAGCAAA - 3' (SEQ ID NO: 6) Hpa I Spe I 5'- CCCGTTAACCCCACTAGTCTGAGTTTTGACCATGCGACGGAT-3' (SEQ ID NO: 7) Le produit PCR obtenu est cloné entre les sites BsiW I et Hpa I du plasmide pEYFPmemb pour donner le plasmide pEYFmemChimBéta3I-II. - 2ième étape de clonage : L' ADNc codant pour l'ECP est amplifié par PCR puis cloné dans le lasmide précédent, en 3' de l'insert ss3-I-II. De manière plus précise, l'ECFP est amplifiée par PCR à partir du vecteur pECFP (Clontech), à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes : Spe I - 5'- GGGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG- 3'(SEQ ID NO: 8) Hpa I - 5'- CCCGTTAACTGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGT-3' (SEQ ID NO: 9) Le produit PCR obtenu est cloné entre les sites Spe I et Hpa I du plasmide pEYFmemChimBéta3I-II pour donner la plasmide pCHIC correspondant à la séquence SEQ ID NO: 10. REVENDICATIONS 1 ) Protéine chimérique dérivée d'un canal calcique haut seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sous-unité {3 ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine BID, fusionné (e) son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité ai ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID. 2 ) Protéine chimérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une sous-unité [3 fusionnée à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]1,. 3 ) Protéine chimérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par le domaine GK-like d'une sous-unité P fusionné à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité [alpha]. 4 ) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la sous-unité (3 ou son fragment et la boucle I-II ou son fragment sont séparés par un peptide espaceur. 5 ) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un canal calcique haut-seuil sensible aux protéines G. 6 ) Protéine chimérique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend la boucle I-II d'une sous-unité al sélectionnée parmi alA, alB et alE ou un fragment de celle-ci. 7 ) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-unité (3 sélectionnée dans le groupe constitué par Pi, P2, P3 et P4 ou un fragment de celle-ci. 8 ) Protéine chimérique variant issue d'une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation d'au moins un acide aminé dans les séquences de la dite sous-unité [3 et/ou de la boucle I-II d'une sous unité ai. 9 ) Protéine chimérique variant selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite mutation modifie l'affinité de la sous-unité P pour le fragment de la boucle I-II de la sous-unité a et/ou réciproquement. 10 ) Protéine chimérique variant selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites mutations sont sélectionnées parmi les mutations suivantes du domaine AID de la boucle I-II de la sous-unité ai : Q383A, Q384A, E386D, E386S, L389H, G391R, Y392S, Y392F, W395A, I396A et E400A. 11 ) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est couplée, de préférence de manière covalente, à au moins un marqueur approprié permettant la détection et/ou la purification et/ou l'immobilisation de ladite protéine. 12 ) Protéine chimérique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend un fluorophore accepteur ou donneur respectivement à son extrémité NH2 et/ou COOH. 13 ) Protéine chimérique selon la revendication 12, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est la protéine fluorescente CFP ou BFP et le fluorophore donneur est la protéine fluorescente GFP ou YFP. 14 ) Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'au moins 7 acides aminés de la séquence de la protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 situés à la jonction de la sous-unité P et de la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 d'un canal calcique ou de leurs fragments tels que définis à la revendication 1. 15 ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou un peptide selon la revendication 14. 16 ) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou un peptide selon la revendication 14, et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens. 17 ) Sondes et amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction de la sous-unité (3 et de la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 d'un canal calcique ou de leurs fragments tels que définis à la revendication 1. 18 ) Amorces aptes à amplifier la sous-unité ss et/ou la boucle I-II de la sous-unité [alpha]1 d'un canal calcique ou leurs fragments tels que définis à la revendi- cation 1, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ IDNO: 1, 2, 4, 6, 7,8 et 9. 19 ) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16. 20 ) Vecteur recombinant selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression eucaryote présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10. 21 ) Cellules modifiées par un vecteur recombinant selon la revendication 19 ou 20, par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 ou par une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 22 ) Cellules modifiées selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes. 23 ) Cellules modifiées selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles expriment au moins un récepteur capable de se lier aux protéines G. 24 ) Mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 16. 25 ) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24, pour l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. 26 ) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24 pour le criblage d'agonistes et/ou d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. 27 ) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24 pour le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sousunités [alpha]1 et ss des canaux calciques haut-seuil. 28 ) Méthode d'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé au protéine G selon la revendication 23, b1) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, et ci) la détermination, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans lesdites cellules qui est liée à une sous-unité Gss[gamma]. 29 ) Méthode de criblage d'agonistes/d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé aux protéines G selon la revendication 23, b2) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, C2) la détermination comparative, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans les cellules qui est liée à une sous-unité Gss[gamma], avant et après la mise en contact desdites cellules en b2) avec une molécule à tester, et d2) l'identification des molécules agonistes/antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, correspondant à celles capables respectivement d'augmenter et de diminuer la concentration cellulaire en sous-unités Gss[gamma] libres. 30 ) Méthode selon la revendication 28 ou la revendication 29, caractérisée en ce que lesdites cellules modifiées en a1) ou en a2) expriment une protéine chimérique couplée, à ses extrémités NH2 et COOH, respectivement à un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur de fluorescence et ladite détermination en ci) ou en C2) est effectuée par la technique de transfert de fluorescence (FRET). 31 ) Méthode de criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités [alpha]1 et P des canaux calciques haut-seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a3) la mise en contact d'une molécule à tester avec une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et avec un peptide comprenant le domaine AID d'une sous-unité ai insensible aux protéines G, b3) la mesure, par tout moyen approprié, de la liaison de ladite protéine chimérique audit peptide, et C3) l'identification des antagonistes de l'interaction entre les sousunités [alpha]1 et ss, correspondant à ceux avec lesquels on observe une liaison de ladite protéine chimérique audit peptide. 32 ) Méthode de criblage selon la revendication 31, caractérisée en ce que ledit peptide comprenant le domaine AID est immobilisé sur un support solide et ladite protéine chimérique est une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13. 33 ) Trousse pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 28 à 32, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24.