Brevet FR2858688A1 — publié le 20050211

Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé de détection multiple dans le domaine du diagnostic in vitro utilisant des microbilles magnétiques colorées dont la finalité est de générer un signal mesurable comme par exemple dans la détection multiple des acides nucléiques et des protéines. Etat de l'art antérieur L'utilisation des microbilles magnétiques dans le domaine des immunodosages ou des acides nucléiques est un procédé connu de longue date. En effet, les microbilles magnétiques permettent d'extraire une molécule cible d'un échantillon et de 10 transporter des microbilles d'un milieu réactionnel à un autre. L'utilisation de disposables en plastique dans lesquels les réactions sont pratiquées est également pratiqué de longue date car ces objets restent maîtrisables par les fabricants et permettent de garantir le bon déroulement d'un test de diagnostic. Plus récemment, les systèmes de diagnostic ont évolué vers des solutions qui 15 permettent de détecter plusieurs analytes dans un milieu réactif, ceci étant souvent appelé le multiplexage. Une tendance parallèle est aussi de détecter des analytes en multiplexage dans des volumes de plus en plus réduits, ce qui augmente le potentiel de multiplexage, mais également permet des économies substantielles de réactif. Aussi, on a vu récemment émerger des dispositifs appelés biopuces, où des 20 réactions sont effectuées sur une surface de verre ou une membrane de polymère, car des ligands sont fixés sous forme de spot sur ces supports qui capturent des molécules cibles, lesquelles sont ensuite révélées par d'autres ligands pouvant générer un signal, grâce à un réactif qui réagit simultanément sur tous les spots. La position des spots est connue, et la lecture des spots effectuée par exemple par une 25 caméra CCD permet de détecter un changement de couleur d'un spot. Ces dispositifs permettent donc de révéler plusieurs analytes dans un même milieu réactionnel et par là même permettent des économies de réactifs. Le système des biopuces offre de plus l'avantage d'un dispositif jetable permettant une bonne maîtrise de la qualité et une sécurité complémentaire pour l'utilisateur. Mais le 30 système des biopuces souffre de l'inconvénient de manquer de souplesse pour le diagnostic. En effet, la fabrication oblige à figer la géométrie de la biopuce et l'analyse requiert peu souvent tous les analytes fixés, il y a donc un gaspillage coûteux. D'autres systèmes, dérivés de la cytométrie de flux, comme celui commercialisé 35 par la société Luminex, utilisent des microbilles colorées sur lesquelles sont fixés des ligands qui capturent des molécules cibles comme décrits ci dessus. Les microbilles après réaction sont envoyées par un flux liquide dans une étroite cellule de lecture et passent devant deux rayons laser. La lecture du signal est effectuée par mesure de la lumière reémise par les microbilles qui apportent deux 40 informations sur chaque microbille, la première la couleur qui est indexée au type de molécule recherchée et la deuxième par exemple la fluorescence générée s'il y a la molécule cible; de plus, le comptage des microbilles est effectué ce qui permet de savoir combien de microbilles ont détecté quelle molécule recherchée. Ce système offre une bonne souplesse d'utilisation car le choix de multiplexage 45 peut être effectué avant mise en oeuvre des microbilles, mais il reste toutefois limité à un système de lecture qui est unique et nécessite de nombreux et coûteux lavages entre les comptages des microbilles qui sont indispensables, sinon des contaminations croisées apparaissent. D'autres évolutions récentes, comme celle de la société Febit décrite dans le 50 document WO 00/12123 utilisent le même principe précédemment décrit des microbilles colorées, mais associées à un dispositif plastique transparent qui les maintient côte à côte dans un plan, car leur densité ne permet pas une bonne sédimentation. Ce dispositif autorise alors à les lire avec une caméra CCD comme pour les biopuces. Cet objet est équipé d'une entrée qui conduit vers le dispositif en 55 plan et nécessite une circulation d'un liquide qui va porter les microbilles. Cette solution combine l'avantage d'une bonne souplesse de définition des analytes du multiplexage associée aux microbilles et l'avantage d'un dispositif jetable contenant les microbilles, le tout jetable. Par contre, l'objet plastique nécessite un liquide porteur qui contient les microbilles, et une cellule de lecture qui maintient 60 les microbilles dans un plan; ceci reste une source de problème associée à la microfluidique et donc aux frottements qui gênent le bon écoulement des microbilles dans la partie en plan. Un objet de la présente invention est d'apporter une solution à l'art antérieur, qui permet d'éliminer ces problèmes. Exposé de l'invention (fig. 1) L'invention utilise des microbilles magnétiques colorées (1) afin d'indexer par la couleur le paramètre à doser et permettre un multiplexage souple associé à une lecture par une caméra CCD (2) des microbilles multiplexées. Un objet de l'invention est caractérisé en ce que le liquide n'est pas utilisé pour 70 porter les microbilles mais les microbilles colorées sont magnétiques et c'est un aimant (3) qui les déplace dans les différents compartiments d'échantillon (7) ou de réactifs (8) jusque vers la cellule de lecture (4). Un autre objet de l'invention est caractérisé en ce que c'est l'aimant qui permet de maintenir les microbilles dans un plan contre la paroi du plastique disposable (5), ce 75 qui est nécessaire à la lecture par caméra CCD; ceci permet également de s'affranchir des problèmes d'écoulement des microbilles car il n'y a pas de contrainte géométrique pour les microbilles. Un autre objet de l'invention est caractérisé en ce que l'aimant permet de passer les microbilles d'un compartiment à un autre du dispositif jetable en franchissant des 80 seuils (6) séparant des compartiments contenant différents réactifs qui ne doivent pas se mélanger. Exemple: Des microbilles colorées magnétiques de taille 50pm et de couleur jaunes et rouges sont revêtues d'une sonde ADN dirigée contre la bactérie E.coli et la bactérie 85 B.subtilis respectivement et spécifiquement. Une solution 1 contenant de i'ADN amplifié de E.coli est préparée en tampon phosphate pH 5,2, NaCl 0,15SM. Cette solution est obtenue par amplification à l'aide d'un couple de primers dont un est biotinilé. Une solution 2 contenant de l'ADN amplifié de B.subtilis est préparée en tampon 90 phosphate pH 5,2, NaCl 0,15SM. Cette solution est obtenue par amplification à l'aide d'un couple de primers dont un est biotinilé. Une solution 3 contenant de l'ADN amplifié de B.subtilis et de E. coli est préparée par mélange des deux précédentes. Un réactif est préparé, contenant un système de révélation constitué d'une enzyme 95 peroxidase en solution liée à une molécule de streptavidine. L'enzyme est révélée par la dégradation d'un substrat tétraméthylbenzidine (TMB) en un dépôt bleu précipitant. Trois microcupules à fond plat de 200 ffl reçoivent chacune environ 50 microbilles jaunes et environ 50 microbilles rouges revêtues de sondes E. coli et B.subtilis 100 respectivement dans 50 il de solution tampon. Les trois solutions sont distribuées à raison de 50,tl par microcupule, chaque microcupule ne recevant qu'une solution, et incubées 30min à 60 C. -3 - Un aimant est ensuite appliqué sous la cupule et la cupule vidée de son contenu, les microbilles étant retenues par l'aimant. 100 pl de tampon de lavage sont mis en 105 place et vidés en utilisant l'aimant pour retenir les microbilles. Cette opération de lavage des microbilles est répétée trois fois. L'enzyme liée à la streptavidine est mise en place dans les microcupules à raison de 50tl par microcupule et incubée 30min à 37 C. Après lavage comme précédemment, 50 pl de TMB est distribué par microcupule. Les microcupules sont ensuite lues par le dessus à intervalle régulier pendant 30 min par une caméra CCD, les microbilles étant maintenues au fond des microcupules par l'aimant. Les images sont analysées et permettent de mettre en évidence les résultats par la modification des couleurs. Les ADNs biotinilés vont s'hybrider avec les sondes qui leur correspondent sur les 115 microbilles de couleur correspondante. Les ADNs hybridés vont ensuite par affinité entre la biotine et la streptavidine, retenir l'enzyme qui va permettre un dépôt local de la couleur bleue, induisant une modification de couleur de la microbille. Une microcupule contient des microbilles jaunes et des microbilles rouges sombre à violettes, ce qui correspond à la révélation de la solution d'ADN de B subtilis. La 120 précipitation de substrat bleu de TMB modifie la couleur des microbilles rouges en rouge sombre/violet révélant la présence de B. subtilis. Une microcupule contient des microbilles vertes et des microbilles rouges, ce qui correspond à la révélation d'ADN de E. coli. La précipitation de substrat bleu de TMB modifie la couleur des microbilles jaunes en vert révélant la présence de B. 125 subtilis. Une microcupule contient des microbilles vertes et des microbilles rouges, ce qui correspond à la révélation d'ADN de E. coli et de B. subtilis. La précipitation de substrat bleu de TMB modifie la couleur des microbilles jaunes en vert et de microbille rouges en rouge sombre/violet révélant la présence de B. subtilis et de 130 E.coli. Revendications: 1) Un procédé de détection multiple dans le domaine du diagnostic in vitro caractérisé en ce que des microbilles magnétiques colorées sont utilisées pour indexer par la couleur le paramètre à doser et qu'un aimant est utilisé pour déplacer les microbilles lors de l'analyse. 2) Un procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les microbilles sont maintenues dans un plan par un aimant lors de la lecture par une caméra CCD. 3) Un procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'on utilise un objet disposable pour effectuer les réactions et que l'aimant est utilisé pour transférer les 10 microbilles d'un compartiment à l'autre en franchissant les seuils (6) séparant les compartiments dudit objet disposable.