Brevet FR2856298A1 — publié le 20041224

La présente invention concerne un procédé d'extraction de maca, l'extrait obtenu, une composition cosmétique le contenant ainsi que son utilisation à titre d'agent cosmétique anti-âge. Le nom botanique de la maca est le Lepidium meyenii Walp. Parmi ses noms vernaculaires on peut encore citer en anglais: maca, peruvian ginseng, quechua; en espagnol: maca, maka, maca-maca et en kechua: ayak 10 chichica, ayak willku, maka. Elle appartient à la famille des Brassicaceae (Cruciferae) de la Tribu Lepidieae. La maca est une petite plante herbacée de 12 à 20 cm de 15 haut. Sa partie souterraine mesure de 2 à 5 cm. Elle comprend une racine pivot surmontée de la partie basse d'un hypocotyle élargi et charnu. A l'état sec, l'ensemble rappelle la forme d'un petit navet. Pour simplifier, la partie souterraine de la plante qui 20 constitue la fraction employée sera dénommée "tubercule". Les feuilles forment une rosette et se renouvellent depuis son centre. Les petites fleurs sont autogames. Le fruit est une petite silique (4 à 5 mm) à deux 25 valves comprenant chacune une graine. La Maca et les autres Lepidium sauvages botaniquement proches sont localisées jusqu'à présent dans quelques zones montagneuses de la cordillère des Andes (Pérou, 30 Bolivie, Equateur). Ces plantes sont capables de supporter des gelées même au cours de leur période de croissance. Considérées longtemps comme des plantes "à jour court" en raison de leur habitat, des travaux relatifs à leur photopériodisme ont révélé que leur croissance est similaire dans des conditions de jours courts et de jours longs. La plante présente un comportement annuel lorsque les conditions climatiques lui sont favorables (sol suffisamment humide et température tempérée). Son cycle végétatif est alors de 11 mois. Elle devient 10 bisannuelle en climat de haute montagne en conservant sa partie souterraine en dormance pendant la saison sèche. La Maca fut probablement "domestiquée" à San Blas au 15 Pérou, il y a 1300 à 2000 ans. Depuis, sa culture a toujours été confinée aux montagnes centrales du Pérou entre 3 500 et 4 500 mètres d'altitude dans les départements du Junin et du Pasco. Les zones de culture les plus importantes sont concentrées autour du lac de 20 Junin. Moins restreintes autrefois, elles s'étendaient jusqu'à Cusco et le lac Titicaca. Dans ces contrées, les basses températures et les vents violents limitent fortement d'autres cultures en dehors de la pomme de terre. La maca est actuellement cultivée dans de petites parcelles de 500 m2 selon des méthodes très artisanales. Les graines sont semées au début de la période des pluies en septembre-octobre. Les tubercules 30 sont habituellement récoltés 8 à 10 mois après semis. La récolte commence en mai-juin. Après récolte, les tubercules sont laissés sécher au soleil pendant 6 à 15 jours. Ils seront conservés à l'abri de la lumière et de l'humidité en attendant d'être consommés. Les tubercules se conservent bien. Les principaux résultats d'analyse de la composition chimique de la maca ont été publiés par Dini et al. en 1994 (Dini A., Migliuolo G., Rastrelli L., Saturnino P., Schettino O. Chemical composition of Lepidium meyenii. Food chemistry, 1994, 49, 4, pp. 347-349 10 (eng)) puis par Comas et al. en 1997 (Comas M., Miquel X., Arias G., de la Torre M.C. Bromatological studies on Lepidium meyenii. Alimentaria (Madrid), 1997, 286, pp. 85-90 (spa)) : - humidité : 10 à 20 % - matières minérales les plus intéressantes (mg/ 100 g) : - Potassium 1150 à 2050 - Calcium 150 à 260 Fer 3 à 16 - Cuivre 0.2 à 6 - Zinc 1.5 à 6 - Aluminium 3 à 7 - Glucides: 60 à 65 % - amidon 30 à 35 % - Saccharose 3 à 20 % 30 - Fructose 8 à 10 % - Glucose 3 à 7 % - Fibres: 4 à 8 % - Protéines: 10 à 14 % - Lipides: 0,5 à 2 % La maca est traditionnellement utilisée comme aliment, mais aussi pour ses propriétés thérapeutiques. La valeur nutritive du tubercule de la maca, proche de céréales classiquement utilisées en alimentation, en 5 fait un aliment de choix et d'intérêt majeur pour les populations de haut plateaux péruviens. Le tubercule de la maca est employé depuis des centaines d'années en usage populaire à des fins 10 médicinales pour augmenter la fertilité des animaux et des êtres humains (Leon J., The maca (Lepidium meyenii), a little-known food plant of Peru. Economic botany, 1964, 18, 2 pp. 122-127 (eng)). Les Kallawaya, guerisseurs itinérants des Andes, 15 prescrivaient aux femmes stériles désirant être fécondées, le tubercule frais découpé en fines rondelles, en décoction, trois ou quatre jours après les dernières règles (Girault L. Kallawaya. Guérisseurs itinérants des Andes. ORSTOM éd. , Paris, 1984, pp. 21820 219 (fra). De nos jours, la popularité de la maca s'accroît en raison des propriétés stimulantes et aphrodisiaques qui lui sont attribuées. Le tubercule de la maca est 25 apparenté (abusivement en raison d'un marché potentiel prometteur), au ginseng (Panax ginseng) d'o son nom de ginseng péruvien. Parmi les autres utilisations du tubercule figurent son 30 intérêt en cas de troubles respiratoires (tuberculose), fatigue chronique, troubles de la mémoire, symptômes de la ménopause, en cures lors de crises rhumatismales, etc Le but de la présente invention est de proposer un extrait de maca permettant de stimuler le métabolisme 5 et la prolifération des fibroblastes pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané chronologique, extrinsèque (soleil, tabac, pollution, stress) et ménopausique. En effet, le vieillissement cutané est notamment 10 caractérisé par une diminution du nombre, ainsi que de l'activité des fibroblastes. En effet, la maca brute, qui se présente généralement sous la forme d'une poudre déshydratée, est quasiment 15 insoluble dans l'eau. De ce fait, son utilisation dans les produits de soins cosmétiques est difficilement envisageable en l'état. Par ailleurs, la biodisponibilité des molécules constitutives du végétal (sels minéraux, glucides, protéines, vitamines, . ) est 20 quasi nulle par voie cutanée...DTD: Ainsi l'invention concerne un extrait peptidique de maca, totalement hydrosoluble, son procédé d'obtention, les compositions cosmétiques le contenant ainsi que 25 leur utilisation en tant qu'actif anti- vieillissement. L'extrait peptidique peut être liquide ou solide suivant si l'extrait a subi une lyophilisation ou non en deuxième étape du procédé d'obtention. 30 Le vieillissement cutané peut se manifester notamment par l'affaissement des tissus, la diminution de l'épaisseur de la peau ou encore par l'apparition de rides ou ridules. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un 5 procédé de préparation d'un extrait peptidique aqueux de maca, caractérisé en ce qu'il est effectué à partir de farine de tubercules de maca broyés, en ce qu'il comprend au moins une étape d'hydrolyse enzymatique des protéines. L'hydrolyse est de préférence enzymatique. L'hydrolyse enzymatique peut notamment être menée avec un mélange amylase et protéase. De préférence, le ratio amylase/protéase est compris entre 50/50 et 90/10 de 15 préférence entre 75/25 et 85/15 afin de transformer la fraction protéique du végétal, en peptides hydrosolubles. L'extrait aqueux ainsi obtenu peut ensuite être 20 concentré pour éliminer les insolubles tels que les fibres. Selon une variante du procédé de l'invention, l'extrait aqueux peut ensuite être purifié par ultrafiltration afin d'extraire les éventuelles traces de protéines 25 résiduelles. Dans ce cas, on choisira avantageusement un seuil de coupure de 10 kD de sorte à conserver les peptides présentant un poids moléculaire inférieur à kD. Ainsi, selon une variante préférée de l'invention, le procédé comprend les étapes suivantes: - un lavage et un séchage sous courant d'air chaud, (par exemple à 60 OC) des tubercules de maca, - le broyage des tubercules de maca en une farine fine, - la mise en suspension dans l'eau de la farine, avantageusement entre 1 et 25% en poids, - l'hydrolyse des protéines en présence d'une protéase et d'une amylase par exemple dans un rapport 80/20. - une centrifugation pour éliminer les insolubles 10 (fibres), - une étape d'ultrafiltration de la solution (avantageusement seuil de coupure 10 kD), - éventuellement suivie par une étape de concentration en matière sèche par diafiltration 15 (avantageusement 100 Da) et/ou une étape d'évaporation contrôlée, et enfin éventuellement suivie par une étape de filtration stérilisante (préférentiellement sur une cartouche de 0,2 pm). L'invention a en outre pour objet un extrait peptidique aqueux de maca susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus selon toutes ses variantes. Cet extrait peptidique aqueux de maca présente avantageusement une teneur en matière sèche comprise entre 1 et 300 g/l, de préférence entre 2 et 10 g/l. Par rapport à la matière sèche, la teneur en sucres 30 réducteurs pourra être comprise entre 2 et 70 % et de préférence entre 35 et 45 %. Par sucres réducteurs on entend des sucres réactifs: ils ont la faculté de donner des électrons à une molécule. On peut citer le glucose, le fructose et le maltose. Historiquement, ce terme vient de la découverte de Fehling au l9eme siècle 5 qui prouva que certains sucres réagissaient avec des ions cuivriques pour les transformer en ions cuivreux. Visuellement, cette réaction dite " de réduction " s'observe par un changement de couleur de la liqueur de Fehling: au départ bleue, elle vire au rouge brique en 10 présence de sucres réducteurs. Le pH d'une solution à 20 g/l de matière sèche pourra être compris entre 5 et 8, de préférence entre 6 et 7. De plus, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait peptidique solide de maca, caractérisé en ce que l'extrait peptidique aqueux, éventuellement concentré et/ou stérilisé est lyophilisé. On obtient autrement dit une poudre solide 20 (extrait sec), qui présente notamment l'avantage d'être hydrosoluble, ce qui n'est pas le cas de la farine de tubercule de maca originelle. L'invention a aussi pour objet un extrait peptidique solide de maca susceptible d'être obtenu par le procédé 25 décrit ci-dessus. Cet extrait peptidique solide de maca peut en outre être caractérisé par sa teneur en azote alpha aminé. Elle peut ainsi être comprise entre 2 et 70 De préférence, l'extrait peptidique solide de maca selon l'invention présente la composition en acides aminés suivante (en pourcentage en poids par rapport au 9poids total d'acides amins) poids total d'acides aminés) Alanine 5-9 % Arginine 15-20 % Acide aspartique 8-12 % Cystine-cysteine Une telle composition cosmétique peut être notamment destinée à lutter contre le vieillissement cutané. L'invention a donc aussi pour objet une méthode de traitement cosmétique comprenant l'application d'une telle composition sur la surface cutanée d'un individu. Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation d'un extrait peptidique aqueux ou solide selon l'invention en tant qu'actif anti-vieillissement. Plus particulièrement, cet extrait acqueux ou solide peut être utile pour stimuler le métabolisme cellulaire à savoir l'activité mitochondriale et notamment les fibroblastes dermiques. De même, cet extrait aqueux ou solide peut être utile pour stimuler l'énergie 10 cellulaire. Par " énergie cellulaire " on entend le réservoir d'énergie dans lequel la cellule puise pour réaliser l'ensemble de ses activités vitales (notamment mitose, croissance, synthèse des macromolécules, réparation de l'ADN). Enfin il peut être utile pour 15 lutter contre les agressions extérieures de type soleil, tabac, pollution ou stress. L'invention est maintenant illustrée par les exemples de réalisation décrits ci-après. 20 EXEMPLE i: préparation d'un extrait kg de farine de maca sont dispersés dans 80 litres d'eau déminéralisée, en présence de 0, 25 kg d'amylase. 25 Le mélange est maintenu à 50 C, pendant 5 heures, à pH constant de 5. Dans une seconde étape, 0,25 kg de protéase Alcalase commercialisé par la société Novo Nordisk sont ajoutés. 30 Le mélange est alors maintenu à 60 C, pendant 1 heures, à pH constant de 8. Les enzymes hydrolytiques sont ensuite dénaturées par chauffage à 90 C, pendant 20 minutes. Le mélange est centrifugé à 5500 tr/min en présence 5 d'un adjuvant argileux de filtration puis filtré sur des toiles de 1 pm pour être clarifié. Le solution récupérée est alors ultrafiltrée (seuil de coupure 10 kD), le filtrat concentré par diafiltration 10 (10 Da) jusqu'à un titre de 10 % en matière sèche, puis filtrée stérilement (0,2 pm). L'extrait obtenu présente les caractéristiques suivantes: Aspect / Couleur Solution limpide de coloration jaune Odeur Caractéristique Matière sèche (p/p) 10,4 % pH en solution à 20g/l 6,8 Absorbance 0,530 à 420 nm 0,093 à 550 nm Composition par rapport à la matière sèche (p/p) Azote alpha aminé 4 % Azote total 1,7 % Sucres réducteurs 42 % Profil HPLC de l'hydrolysat de Répartition des masses moléculaires farine de maca - Pic HPLC Masse molaire % relatif moyenne (g/mol) 1 1170 38,9 2 360 29,3 3 180 16,2 4 41 15,6 EXEMPLE 2: Activité biologique 2-1 Effet sur des fibroblastes humains normaux Matériel & Méthode Cellule: modèle de fibroblastes humains normaux cultivés en monocouche. Traitement: Les cellules ont été cultivées en l'absence (Contrôle) ou en présence de 0,1% de l'extrait peptidique obtenu à l'exemple 1. Evaluation du métabolisme cellulaire: L'effet de cet extrait a été évalué par la mesure de l'activité mitochondriale (test au MTT ou 3-(4,5dimethylthiazole2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), tous les jours pendant une semaine. Résultats En moyenne, l'extrait peptidique de maca à la dose de 0,1% stimule le métabolisme des fibroblastes dermiques de 20% par rapport aux cellules contrôles non traitées. 5 La figure 1 illustre la viabilité des cellules cultivées en l'absence (Contrôle) ou en présence d'extrait peptidique de maca. Conclusion L'extrait peptidique de maca permet de stimuler le métabolisme cellulaire des fibroblastes dermiques. 2-2 Effet sur des fibroblastes humains vieillis artificiellement in vitro Modèle d'étude Nous avons utilisé dans cette étude un modèle de fibroblastes cutanés vieillis artificiellement in vitro, caractérisé par l'utilisation de fibroblastes issus de chirurgie plastique (femme de 26 ans), et cultivés jusqu'à des passages élevés >p15. En effet, à chaque passage ou dédoublement de population, les fibroblastes: a) changent d'apparence et sont plus étalés b) se multiplient beaucoup plus lentement en comparaison avec les mêmes fibroblastes utilisés à des passages plS)). Le vieillissement artificiel in vitro ou phénomène de sénescence réplicative a été mis en évidence par Léonard Hayflick en 1961 (Hayflick L and Moorhead PS. The serial cultivation of human diploid cell strains. 5 Exp Cell Res, 25: 585-621 1961). Dans un premier temps, Hayflick a montré que les cellules ne peuvent se diviser qu'un nombre de fois limité dès lors qu'elles sont placées en culture, puis a décrit le lien possible entre sénescence réplicative et vieillissement 10 cellulaire (Hayflick L. The limited lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 37). Les cellules disposeraient d'une horloge interne qui influencerait ou qui limiterait directement leurs capacités de division. Cet arrêt programmé de la division cellulaire 15 pourrait être lié à la perte des télomères (extrémités des chromosomes). Une correspondance acceptable entre in vivo (perte d'environ 50 paires de base/dédoublement cellulaire) et in vitro (perte d'environ 70 paires de base/dédoublement cellulaire) tend à montrer que le 20 modèle de division cellulaire in vitro préfigure ce qui se réalise in vivo. Résultats Les cellules ont été cultivées pendant 7 jours en 25 présence ou en l'absence d'extrait peptidique de maca à la dose de 0,01%. La viabilité cellulaire a été mesurée par un test au MTT. Les résultats sont exprimés en % de croissance/au premier de jour de culture (jl) selon la formule: [(DO jX - DO jl)/DO J1] x 100, avec DO = 30 densité optique mesurée à 570 nm; j = jour de culture. Dans ces conditions expérimentales, l'hydrolysat de maca, à la dose de 0, 01%, permet d'augmenter les capacités de division des fibroblastes " jeunes " (passages pl5), +26 et 29% respectivement à j4 et j7 (Figure 3B). Les figures 3A et 3B sont annexées. Conclusion L'hydrolysat de maca en stimulant les capacités prolifératives des fibroblastes " âgés " peut donc compenser la diminution de la population cellulaire dermique liée à l'âge et donc s'opposer au 15 vieillissement cutané intrinsèque. Exemple 3: exemple de formulation cosmétique crème anti-âge. Crème anti-âge Aqua QSP 100 Isononyl Isononanoate 7,00 Di-C12-13 Alkyl Malate 7,00 Isocetyl Stearate 5,00 Butylene Glycol 3,00 Extrait peptidique de maca Aqueux préparé selon l'exemple 1 2,00 30 Dicaprylyl Ether 2,00 Silanediol Salicylate 2,00 Arachidyl Alcohol 1,65 Tromethamine 1,18 Cetyl Alcohol 1,00 Glycine 1,00 Tocopheryl Acetate 1,00 Behenyl Alcohol 0,90 Squalane 0,79 Sodium Citrate 0,66 PPG-12/SMDI Copolymer 0,50 Arachidyl Glucoside 0,45 Parfum 0,40 Sclerotium Gum 0,16 Cetearyl Alcohol 0,13 Citric Acid 0,11 Sepigel 305* 0.10 Système conservateur QS *produit commercialisé par la société Seppic Revendications 1. Procédé de préparation d'un extrait peptidique 5 aqueux de maca, caractérisé en ce qu'il est effectué à partir de farine de tubercules de maca broyés, en ce qu'il comprend au moins une étape d'hydrolyse enzymatique des protéines. 2. Procédé de préparation d'un extrait peptidique hydrosoluble de tubercules de maca selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrolyse est de type enzymatique. 3. Procédé de préparatioh d'un extrait peptidique hydrosoluble de tubercules de maca selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'hydrolyse est menée avec un mélange amylase et protéase. 4. Procédé de préparation d'un extrait peptidique hydrosoluble de tubercule de maca selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ratio amylase/protéase varie de 50/50 à 90/10. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'extrait aqueux est ensuite concentré pour éliminer les insolubles. 6. Procédé selon l'un quelconque des revendications 1 30 à 5, caractérisé en ce que l'extrait aqueux est ensuite purifié par ultrafiltration. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ultrafiltration présente un seuil de coupure de 10 kD. 8. Extrait peptidique aqueux de maca susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Extrait peptidique aqueux de maca selon la 10 revendication 8, caractérisé en ce qu'il présente une teneur en matière sèche comprise entre 1 et 300 g/l, de préférence entre 2 et 10 g/l. 10. Procédé de préparation d'un extrait peptidique 15 solide de maca, caractérisé en ce que l'extrait peptidique aqueux selon la revendication 8 ou 9, éventuellement concentrée et/ou stérilisée est lyophilisé. 11. Extrait peptidique solide de maca susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 10. 12. Extrait peptidique solide de maca selon la revendication 11, caractérisé en ce que la teneur en 25 azote alpha aminé est comprise entre 2 et 70%. 13. Extrait peptidique solide de maca selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il présente la composition en acides aminés suivante (en 30 pourcentage en poids par rapport au poids total d'acides aminés) : Alanine 5-9 % Arginine 15-20 % Acide aspartique 8-12 % Cystine-cysteine 15. Extrait peptidique de maca selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 et 11 à 13, utile pour 10 stimuler l'activité mitochondriale des cellules cutanées et plus particulièrement des fibroblastes. 16. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait peptidique de maca selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 etll à 13 et au moins un excipient cosmétiquement acceptable. 17. Méthode de traitement cosmétique pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer sur la 10 peau une composition selon la revendication 16. 18. Méthode de traitement cosmétique pour lutter contre les agressions extérieures, choisies parmi le soleil, le tabac, la pollution et le stress, caractérisée en ce 15 qu'elle consiste à appliquer sur la peau une composition selon la revendication 16. 19. Utilisation d'un extrait selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 et 11 à 13 en tant qu'actif anti20 vieillissement. 20. Utilisation selon la revendication 19 pour stimuler le métabolisme cellulaire et notamment des fibroblastes dermiques. 21. Utilisation selon la revendication 19 pour stimuler l'énergie cellulaire.