Brevet FR2853328A1 — publié le 20041008

DESCRIPTION Le domaine de l'invention est celui de l'analyse microbiologique par voie biochimique, et en particulier de la détection et de l'identification de microorganismes, tels que notamment de bactéries ou de levures par ensemencement de milieux réactionnels. Dans le cadre de l'invention, on s'intéresse plus particulièrement à la détection / identification de microorganismes, tels que notamment des bactéries ou des levures, pathogènes ou indicateurs de qualité, que ce soit dans le milieu médical ou le milieu 10 industriel. Il existe actuellement de très nombreux milieux permettant la détection de ces microorganismes. Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de substrats particuliers, spécifiques d'une enzyme du microorganisme que l'on souhaite détecter. D'une manière générale, les substrats synthétiques d'enzymes sont constitués d'une 15 première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, et d'une seconde partie faisant office de marqueur, généralementchromogène ou fluorescent. Ainsi dans le cas des bactéries, par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Ainsi, dans le cas de bactéries, les souches d'Escherichia coli sont souvent mises en 20 évidence par la révélation d'une activité enzymatique du type osidase telle que l'activité P-glucuronidase ou,3-galactosidase. De la même façon, le genre Listeria est détecté par la mise en évidence d'une activité P-glucosidase. Une activité aminopeptidase peut également être utilisée pour révéler un groupe, un genre ou une espèce de bactéries. Ainsi, l'activité alanineaminopeptidase, par exemple, 25 permet de différencier les bactéries à Gram négatif des bactéries à Gram positif. Enfin, on peut citer également la détection d'une activité estérase pour notamment la mise en évidence du genre Salmonella. En effet, le genre Salmonella possède des estérases non spécifiques capables d'hydrolyser des substrats synthétiques chromogènes, par exemple indigogéniques. Dans le cas de la détection de salmonelles, et plus 30 généralement dans le cas de bactéries à activité estérase, la détection et/ou l'identification de ces bactéries est classiquement réalisée sur des milieux gélosés ou liquides d'isolement, qui permettent la détection et/ou l'identification des colonies suspectes de bactéries à activité estérase. Toutefois, on observe lors de certains prélèvements, notamment de fécès, la libération d'enzymes, non spécifiques du microorganisme que l'on souhaite détecter, et qui 5 peuvent ultérieurement réagir avec le substrat chromogène. Cela induit la présence de faux positifs: certains prélèvements sont considérés comme contaminés alors qu'ils ne le sont pas, ce qui peut avoir des conséquences dramatiques pour le diagnostic ultérieur. Ainsi, dans le cas de la détection de salmonelles mises en évidence par une activité enzymatique de type estérase, il peut se produire une libération d'estérases par des 10 selles, non contaminées par des salmonelles, qui hydrolysent alors le substrat présent dans le milieu de culture, ce qui provoque la libération d'une coloration magenta, normalement spécifique des salmonelles. La présente invention se propose donc d'améliorer les milieux permettant la détection de microorganismes actuellement commercialisés en limitant la présence de faux 15 positifs. A cet effet, la présente invention concerne un milieu de détection de microorganismes comprenant un milieu de culture et au moins un substrat qui peut être hydrolysé en un produit marqué par au moins une première enzyme, spécifique desdits 20 microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un inhibiteur d'au moins une deuxième enzyme, différente de la première enzyme ou identique à celle ci mais non spécifique desdits microorganismes. Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, les levures, et plus généralement, les organismes généralement unicellulaire, invisibles à 25 l'oeil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire. Au sens de la présente invention, on entend par milieu de culture, un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes. En pratique, l'homme du métier choisira le milieu de culture en fonction des microorganismes cibles, selon des critères parfaitement connus et à la portée de cet 30 homme de l'art. Pour les bactéries, on peut citer à titre indicatif, les milieux sélectifs de type: Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud GentamycineChloramphénicol, et les milieux non sélectifs de type Trypcase soja, milieu nutritif, Sabouraud. Le milieu de culture selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple: un ou plusieurs substrats enzymatiques par exemple chromogène ou fluorogènes, des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des 5 hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Petri. Le substrat est choisi parmi tout substrat pouvant être hydrolysé en un produit qui peut permettre la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat comprend 10 une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur, fluorescente ou chromogène. Comme substrat fluorescent, on peut citer notamment les substrats à base d'umbelliférone ou d'aminocoumarine, à base de résorufine ou encore à base de fluorescéine. Comme substrat chromogène, mieux adapté aux supports solides (filtre, 15 gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des 20 activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et ses dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique 25 telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase. Par première enzyme, on entend une enzyme spécifique du microorganisme que l'on souhaite détecter. Cette enzyme peut être notamment, mais de façon non limitative, une osidase, peptidase, estérase, sulfatases, phosphatase... Par deuxième enzyme, on entend une enzyme, différente de la première enzyme, ou 30 identique à celle ci mais non spécifique du microorganisme que l'on souhaite détecter mais qui est libérée lors du prélèvement de l'échantillon. Cette deuxième enzyme est susceptible de réagir avec le substrat, ce qui peut induire la présence de faux positifs. Cette enzyme peut être notamment, mais de façon non limitative, une osidase, peptidase, estérase, sulfatases, phosphatase... Par échantillon, on entend tout type d'échantillon dans lequel on souhaite détecter la 5 présence de microorganismes. Cet échantillon peut provenir notamment, mais de façon non limitative, d'un prélèvement de sang, d'urine, de selles, d'aliments... Selon un mode préféré de l'invention, le microorganisme est une bactérie, qui appartient préférentiellement au genre Salmonella. Selon un autre mode préféré de l'invention, ladite première enzyme est une estérase. 10 Selon un autre mode préféré de l'invention, l'inhibiteur appartient à la famille des organophosphates, et est préférentiellement le 0,0-Diethyl p-nitrophenyl phosphate (Paraoxon ethyl, CAS n 311-45-5) ayant la formule suivante: N' o et/ou le 0,0-Di (2-chloroethyl)-O-(3-chloro-4-methylcoumarin-7-YL) phosphate (Haloxon, CAS n 321-55-1) ayant la formule suivante: Xoi o et/ou au moins un dérivé de ces molécules. En effet, d'une façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de certaines molécules de type Paraoxon et Haloxon , qui sont des pesticides de la 5 famille des organophosphates, permettent, une fois incluses dans le milieu de culture, d'inhiber l'expression des estérases libérées par le prélèvement. La concentration en 0,0-Diethyl p-nitrophenyl phosphate ou son dérivé dans le milieu de détection est préférentiellement comprise entre 0,1 et 15 mg/l, et encore plus préférentiellement entre 1 et 10 mg/l. La concentration en O,O-Di(2-chloroethyl)-O-(3-chloro-4-methylcoumarin-7YL) phosphate ou son dérivé dans le milieu de détection est préférentiellement comprise entre 1 et 1000 mg/l, et encore plus préférentiellement entre 30 et 100 mg/l. Selon un mode préféré de l'invention, ledit substrat est un substrat chromogène, préférentiellement un ester d'indoxyl ou de ses dérivés, et encore plus 15 préférentiellement un ester d'indoxyl ayant la formule suivante H avec n compris entre 2 et 12 et W, X, Y, Z sont choisis parmi H, Br, Cl, F, I. D'une façon encore plus préférentielle, le substrat est le 5-Bromo6-chloro-3-indoxyl caprylate (Magenta C8). L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant: * l'ensemencement desdits microorganismes à identifier sur un milieu de détection, tel que définit précédemment, * l'incubation du milieu de détection ensemencé avec lesdits 10 microorganismes à identifier, et * la détermination de la présence desdits microorganismes par la détection du ou des substrats hydrolysés en un produit marqué. L'ensemencement des microorganimes, tels que notamment les bactéries ou levures peut être réalisée par toutes les techniques d'ensemencement bien connues de l'homme 15 du métier. De même, l'incubation est réalisée préférentiellement à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est maximale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. Dans le cas de la détection de l'activité esterasique des salmonelles, l'incubation est préférentiellement réalisée entre 36 et 380C. L'invention concerne enfin l'utilisation du milieu de détection et/ou d'identification tel que défini ci dessus. Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère 25 limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1: Inhibition des enzymes libres par le paraoxon éthyl (O,ODiethyl pnitrophenyl phosphate) Le but des expériences présentées dans cet exemple est de démontrer l'effet inhibiteur 30 des enzymes libres du paraoxon éthyl (Riedel-deHaën, St Quentin Fallavier, France) sur des selles contaminées par des salmonelles. Préparation du milieu de détection: un volume de 250 ml de milieu de détection est préparé à partir d'une poudre de milieu ayant la composition suivante: Peptones 6,25 g/l Tris 0,16 g/1 Lactose 6 g/l Sels biliaires 1,5 g/l NaC1 5 g/l Agar 14 g/l1 La fonte est réalisée à 100 C, et le milieu est autoclavé 15 minutes à 121 C. On ajoute ensuite les additifs dans le milieu: Magenta C8 (500mg/l1; B-7102, BIOSYNTH, Staad, Suisse); X-glucoside (75 mg/l; B-7250, BIOSYNTH, Staad, Suisse); cefsulodine (10 mg/1; C 4786, Sigma, St Quentin Fallavier, France) et différentes concentrations de Paraoxon éthyl (O,O-Diethyl p-nitrophenyl phosphate; 36186, Riedel-deHaën, St 15 Quentin Fallavier, France; 0; 1; 5 ou 10 mg/1). Les différents milieux de détection ainsi obtenus sont ensuite coulés en boîte de Petri. Ensemencement des bactéries Salmonella: 101il de selles sont déposés sur boîte de Petri, cette suspension de selle est mélangée ou non à 10i1 d'une suspension de 20 Salmonella (0,5 McF) et isolée en 3 cadrans sur une boîte de Petri. Différentes selles et différentes souches de Salmonella provenant de la collection de la demanderesse sont utilisées selon ce protocole. Les boites de Petri sont incubées 24 heures à 37 C. La lecture de l'apparition d'une coloration au niveau du point de dépôt de la selle et au niveau des colonies de Salmonella est effectuée selon une échelle semi-quantitative: 25 0 = absence de coloration 0,5 = trace de coloration 1 = coloration faible 2 = coloration forte. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. [Paraoxon éthyl] en mg/1 N souche N selle Dépôt Colonies Dépôt Colonies Dépôt Colonies Dépôt Colonie s absence 1 1 0 0,5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 6006 1 1 2 0,5 2 0 2 0 2 2 0 2 0 2 0 2 0 2 2006 1 1 2 0,5 1 O 1 0 1 2 0 2 0 1 0 1 0 1 1089 1 1 2 0,5 2 0 2 0 2 2 0 2 0 2 0 2 0 2 1053 1 1 1 0,5 1 0 1 0 1 2 0 1 0 1 0 1 0 1 Tableau 1: Effets du Paraoxon éthyl (0; 1; 5 ou 10 mg/1) sur l'activité des enzymes libres Ces résultats montrent que les réactions enzymatiques aspécifiques sont inhibées fortement en présence de Paraoxon ethyl, ce qui limite la détection de faux positifs. Exemple 2: Inhibition des enzymes libres par l'Haloxon (0,0-Di (2chloroethyl)-O-(3-chloro-4-methylcoumarin-7-YL) phosphate) Le but des expériences présentés dans cet exemple est de démontrer l'effet inhibiteur des enzymes libres de l'Haloxon (Sigma, St Quentin Fallavier, France) sur des selles 10 contaminées par des Salmonelles. Préparation du milieu de détection: 250ml du milieu de l'exemple 1 dans lequel le paraoxon éthyl est remplacé par différentes concentrations d'Haloxon (R276995, Sigma, St Quentin Fallavier, France; 0; 1; 10; 100 ou 1000 mg/l) sont préparés selon 15 le procédé de l'exemple 1. Les différents milieux de détection ainsi obtenus sont ensuite coulés en boîte de Petri. Ensemencement des bactéries Salmonella: les boîtes de Petri sont inoculées, incubées et lues comme dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2. [Haloxon] en mg/1 N N Dépôt Colo- Dépôt Colo- Dépôt Colo- Dépôt ColoDépôt Colosouche selle -nies -nies -nies -nies -nies absence 1 2 0 1 1 1 0 0,5 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6006 1 2 2 1 2 1 2 0,5 2 0 2 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 2006 1 2 2 1 2 1 2 0,5 1 0 0,5 2 0 2 0 2 0 2 0 1 0 0,5 1089 1 2 2 1 2 1 2 0,5 2 0 2 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 1053 1 2 1 1 1 1 1 0,5 1 0 1 2 0 1 0 0 1 0 1 0 1 Tableau 2: Effets de l'Haloxon (0; 1; 10; 100 ou 1000 mg/l) sur l'activité des enzymes libres s Ces résultats montrent que les réactions enzymatiques aspécifiques sont inhibées fortement en présence d'Haloxon, ce qui limite la détection de faux positifs. A noter qu'une variante consiste à ajouter l'inhibiteur dans le milieu de prélèvement des bactéries au lieu de l'ajouter directement dans le milieu de culture Exemple 3: Méthode pour identifier des inhibiteurs d'au moins une deuxième enzyme selon l'invention Cette méthode consiste à effectuer l'expérience des exemples 1 ou 2 en remplaçant: i) le milieu de culture décrit (y compris les substrats enzymatiques) par celui approprié aux microorganismes recherchés 15 ii) les selles par l'échantillon dans lequel on recherche lesdits microorganismes et qui produit une réaction parasite avec un ou plusieurs des substrats enzymatiques inclus dans le milieu iii) le paraoxon ou l'haloxon par l'inhibiteur potentiel à tester à différentes concentrations. REVENDICATIONS 1. Milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant un milieu de culture et au moins un substrat qui peut être hydrolysé en un produit 5 marqué par au moins une première enzyme, spécifique des microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un inhibiteur d'au moins une deuxième enzyme, différente de la première enzyme ou identique à celle-ci mais non spécifique desdits microorganismes. 2. Milieu de détection et/ou d'identification, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie. 3. Milieu de détection et/ou d'identification, selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite bactérie appartient au genre Salmonella. 15 4. Milieu de détection et/ou d'identification, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite première enzyme est une estérase. 5. Milieu de détection et/ou d'identification, selon l'une quelconque des revendications l à 4, caractérisé en ce que l'inhibiteur appartient à la famille des organophosphates. 6. Milieu de détection et/ou d'identification selon la revendication 5, caractérisé en 25 ce que l'inhibiteur est le O,O-Diethyl p-nitrophenyl phosphate et/ou le O,O-Di (2-chloroethyl)-O-(3-chloro-4-methylcoumarin-7-YL) phosphate et/ou au moins un dérivé de ces molécules. 7. Milieu de détection et/ou d'identification selon la revendication 6, caractérisé en 30 ce que la concentration en O,O-Diethyl p-nitrophenyl phosphate ou son dérivé dans le milieu de détection est comprise entre 0, 1 et 15 mg/l, préférentiellement entre 1 et 10 mg/l. 8. Milieu de détection et/ou d'identification selon la revendication 6, caractérisé en 5 ce que la concentration en O,O-Di(2-chloroethyl)-O-(3chloro-4methylcoumarin-7-YL) phosphate ou son dérivé dans le milieu de détection est comprise entre 1 et 1000 mg/l, préférentiellement entre 30 et 100 mg/l 9. Milieu de détection et/ou d'identification selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 8 caractérisé en ce que ledit substrat est un substrat chromogène, préférentiellement un ester d'indoxyl ou de ses dérivés 10. Procédé détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant: * l'ensemencement des microorganismes à identifier sur un milieu de 15 détection, selon l'une quelconque des revendications I à 9, * l'incubation du milieu de détection ensemencé avec les microorganismes à identifier, et * la détermination de la présence de microorganismes par la détection du ou des substrats hydrolysés en un produit marqué. 20 11. Utilisation du milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes selon l'une quelconque des revendications l à 9