Brevet FR2859113A1 — publié le 20050304

La présente invention a trait à une méthode de séparation bidimensionnelle des constituants d'un mélange, mettant en oeuvre la technique de l'électrophorèse capillaire. Cette technique, en particulier adaptée à la séparation de mélanges de polymères (synthétiques ou naturels) chargés s électriquement, tels que des mélanges de protéines, s'avère notamment utile pour l'analyse des constituants de tels mélanges. Les techniques de séparation dites "bidimensionnelles" consistent à effectuer la séparation des constituants d'un mélange selon deux critères successifs distincts. Ainsi, ces méthodes mettent en général en oeuvre une io première étape qui consiste à séparer les constituants du mélange dans de premières conditions de séparation, puis une deuxième étape consistant à soumettre tout ou partie des fractions séparées obtenues à l'issue de la première étape à une nouvelle séparation dans de nouvelles conditions. Les deux étapes successives de séparation utilisées dans ces procédés mettent généralement en oeuvre deux séparations de types différents, fondées sur deux caractéristiques distinctes des constituants à séparer. Ces deux étapes de séparation successives sont dites "orthogonales" entre elles. Le terme de "séparation bidimensionnelle" provient du fait qu'à l'origine, ce type de séparation désigne une séparation effectuée sur des supports à deux dimensions, tel que des plaques. Ainsi, par exemple, la chromatographie bidimensionnelle consiste à déposer un échantillon de mélange sur une plaque, à réaliser une élution du mélange par un premier éluant dans une première direction de la plaque, puis à éluer chacune des fractions séparées du mélange (alignées selon la première direction) à l'aide d'un second éluant dans une direction orthogonale à la première direction, ce par quoi on obtient une séparation des constituants dans les deux dimensions de la plaque. De façon similaire, on a développé des techniques bidimensionnelles d'électrophorèse sur couche de gel, comprenant une première séparation électrophorétique des composés d'un mélange par migration selon une première direction du gel, suivie d'une seconde migration dans une direction orthogonale, dans d'autres conditions d'électrophorèse. Ces techniques sont largement utilisées, notamment dans le domaine de la séparation et de l'analyse de mélanges de protéines. Dans ce cadre, on a notamment développé des techniques d'électrophorèse bidimensionnelle sur gel dites (IEF/SDS-PAGE), adaptées à la séparation de protéines ou de peptides, dans lesquelles la première séparation est effectuée par une focalisation isoélectrique (IEF) qui permet une séparation selon le point isoélectrique dans une première direction du gel, et à la seconde étape est une migration électrophorétique dans une direction orthogonale, réalisée en présence d'un gel de polyacrylamide et de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Pour plus de renseignements concernant les techniques d'électrophorèses bidimensionnelles, et notamment les techniques de type (IEF/SDS-PAGE), on pourra notamment se reporter à l'article de P. A. Haynes, S. P. Gygi, D. Figeys, R. Aebersold, dans Electrophoresis, 19, 1862-1871 (1998). Par extension, le terme de séparation "bidimensionnelle" a ensuite été étendu à toute méthode mettant en oeuvre deux étapes de séparation monodimensionnelle successives, et où la deuxième étape consiste à séparer les composés d'au moins une des fractions séparées lors de la première étape. Par analogie avec les techniques sur support bidimensionnel, on dit que la deuxième étape de séparation est effectuée "selon une direction orthogonale", même dans les cas où aucun support bidimensionnel n'est concrètement mis en oeuvre. Différentes techniques de séparation bidimensionnelles sont actuellement connues, qui couplent deux (voire plusieurs) étapes successives de séparations "monodimensionnelles" telle que des étapes de chromatographie ou d'électrophorèse. A titre d'exemples de techniques de séparation bidimensionnelle de ce type, on peut notamment citer les techniques décrites dans l'ouvrage High Performance Capillary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, n 17, 581-612 (1998) ou celles décrites par J. M. Hille, A.L. Freed, et H. Watzig, dans Electrophoresis, 22, 4035-4052 (2001). En particulier, on a développé des techniques de séparation bidimensionnelles mettant en oeuvre au moins une étape d'électrophorèse capillaire dans leurs étapes de séparation. Dans ce cadre, certains auteurs ont notamment décrit le couplage de deux étapes successives d'électrophorèse capillaire. A ce sujet, on pourra notamment se reporter aux articles de Mark R; Shure dans Anal.Chem. 71, 1645-1657 (1999), ou de Deepa Mohan et Cheng S. Lee dans Electrophoresis 23, 3160-3167 (2002). Ces méthodes de séparation bidimensionnelle semblent a priori séduisantes, notamment dans la mesure où elles semblent à même de combiner les avantages de la séparation bidimensionnelle à l'efficacité particulièrement prononcée de la séparation électrophorétique. Toutefois, en pratique, ces méthodes nécessitent en général la mise en oeuvre de dispositifs complexes et le plus souvent onéreux, et la séparation réalisée n'est pas toujours à la hauteur de la qualité escomptée. io En particulier, les techniques mettant en oeuvre deux étapes successives d'électrophorèse capillaire consistent actuellement à réaliser le couplage de deux capillaires, de façon à pouvoir réaliser les deux électrophorèses dans des milieux distincts. Ce couplage de deux capillaires est en général difficile à mettre en oeuvre, et il nécessite des dispositifs de couplages souvent onéreux. De plus, comme souligné notamment par Shure et al. dans Anal.Chem. 71, 1645-1657 (1999), la mise en oeuvre de ces dispositifs de couplage affecte en général la qualité de la séparation réalisée, en conduisant notamment à des phénomènes d'étalement des pics qui ne peuvent être limités que très difficilement. De plus, le couplage de deux capillaires passe le plus souvent par des étapes d'échantillonnage, au cours desquelles une partie des composés à analyser est susceptible d'être perdue, ou par des processus de dilution qui s'avèrent notamment préjudiciables pour la sensibilité de la détection des composés séparés, tout particulièrement lorsque le mélange initial à analyser est un milieu dilué. Ainsi, les techniques de séparation bidimensionnelle par couplage de deux étapes successives d'électrophorèse capillaire actuellement connues s'avèrent insatisfaisantes, en terme d'efficacité et/ou de coût. Compte tenu de ces inconvénients, ce type de séparation bidimensionnelle est très peu utilisé en pratique. Or, contre toute attente, les inventeurs ont 'maintenant découvert qu'il est possible de réaliser une séparation' bidimensionnelle mettant en oeuvre deux étapes successives d'électrophorèse capillaire de façon particulièrement simple et performante, en mettant en oeuvre pour les deux étapes d'électrophorèse un unique capillaire, ce qui permet notamment de s'affranchir des problèmes techniques et/ou de coût liés à la mise en oeuvre des systèmes de couplage capillaire/capillaire actuellement utilisés. Plus précisément, les travaux des inventeurs ont permis d'établir que si, suite à une séparation par électrophorèse réalisée au sein d'un capillaire, on isole, dans le capillaire utilisé, une fraction des composés séparés, il est ensuite possible, sans utiliser de capillaire supplémentaire, d'effectuer une nouvelle io séparation de la fraction isolée par électrophorèse, en injectant dans le capillaire un milieu séparateur ayant une vitesse de migration plus importante que la fraction isolée au sein du capillaire. Il s'avère en outre que la séparation ainsi effectuée est particulièrement efficace, et que, dans la plupart des cas, la séparation peut être obtenue sans observer les phénomènes d'élargissement de pics qui sont généralement obtenus dans le cadre de procédés de séparation actuellement connus qui couplent deux étapes d'électrophorèse capillaire. Sur la base de ces découvertes, un but de la présente invention est de fournir un procédé de séparation bidimensionnelle mettant en oeuvre deux étapes successives d'électrophorèse capillaire, qui soit à la fois efficace et peu onéreux. Dans ce cadre, l'invention se fixe en particulier pour but de fournir un procédé de séparation bidimensionnelle par électrophorèse capillaire, qui s'affranchisse des inconvénients liés à l'utilisation des systèmes de couplage capillaire/capillaire mis en oeuvre dans les techniques d'électrophorèse capillaire bidimensionnelle actuellement connues. A cet effet, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé de séparation des constituants d'un mélange M comprenant des composés électriquement chargés, par électrophorèse capillaire au sein d'un unique capillaire, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : (A) introduire et faire migrer les composés du mélange M au sein du capillaire selon la technique de l'électrophorèse capillaire, (à savoir sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire), de façon à réaliser une séparation des composés du mélange M au sein du capillaire, selon leur vitesse de migration dans les conditions de l'étape (A) ; (B) isoler dans le capillaire une fraction F des composés séparés dans l'étape (A), en mettant en oeuvre l'une et/ou l'autres des étapes suivantes: (B.1) évacuer hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus élevées dans les conditions de l'électrophorèse de io l'étape (A), en laissant migrer ces composés en sortie du capillaire, le plus souvent en maintenant la différence de potentiel de l'étape (A) ; et/ou (B.2) évacuer hors du capillaire une partie des composés. ayant les vitesses de migration les plus faibles dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), en faisant migrer ces composés vers l'entrée du capillaire, en général en appliquant une surpression en sortie du capillaire et/ou en appliquant entre l'entrée et la sortie du capillaire une différence de potentiel de polarité contraire à celle de l'étape (A), cette étape (B) étant éventuellement suivie d'une étape (B') consistant à faire éventuellement migrer la fraction F isolée vers l'entrée de la colonne; et (C) sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, (qui induit un flux électroosmotique), introduire, dans le capillaire contenant la fraction F isolée, un milieu séparateur MS ayant une vitesse de migration supérieure à celle des composés de la fraction F, de façon à ce que ledit milieu séparateur rattrape la fraction isolée F au sein du capillaire, et modifie ainsi l'environnement de la fraction F, et par conséquent les conditions d'électrophorèse de cette fraction, et maintenir la différence de potentiel jusqu'à obtenir une séparation des composés compris dans la fraction isolée en fonction de leur vitesse de migration dans les nouvelles conditions d'électrophorèse obtenues. Ainsi, le procédé de l'invention est un procédé de séparation bidimensionnelle des.composés du mélange M, permettant de réaliser une première séparation des constituants du mélange M par électrophorèse capillaire ("première dimension" de l'étape (A)), suivie d'une deuxième séparation des constituants d'une fraction des composés ainsi séparés ("deuxième dimension" de l'étape (C)). De façon caractéristique, dans le procédé de l'invention, ces deux séparations successives sont réalisées au sein d'un même et unique capillaire, ce qui est permis par l'étape d'isolation (B). Le mélange M dont on sépare les constituants selon le procédé de l'invention peut être tout mélange de composés électriquement chargés, adapté à lo une séparation par électrophorèse capillaire. Pour plus de précisions concernant les mélanges séparables par électrophorèse capillaire, on pourra notamment se reporter à l'article de M. G. Khaledi dans High Performance Caplllary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, (1998), ou encore à l'ouvrage de S. F. Y. Li "Capillary electrophoresis: principles, practice and applications", Journal of Chromatography Library, vol. 52, troisième impression En général, le mélange M est un mélange de plusieurs composés chargés, de même charge. Ainsi, selon un premier mode de réalisation, le mélange M est un mélange d'espèces chargées négativement, tel que, par exemple, un mélange comprenant des polymères synthétiques porteurs de groupements anioniques et/ou de charge négatives, des protéines et/ou des peptides à un pH suffisamment élevé pour qu'elles portent des charges négatives, de polysaccharides chargés négativement, et/ou de molécules anioniques (par exemple des acides sous forme déprotonée, notamment des acides organiques déprotonés). Selon un autre mode de mise en oeuvre, le mélange M est un mélange d'espèces chargées positivement, comprenant par exemple des polymères synthétiques chargés positivement porteurs de groupements cationiques et/ou de charge positives, de protéines et/ou de peptides à un pH suffisamment faible pour qu'elles portent des charges positives, de polysaccharides chargés positivement, ou des molécules cationiques (par exemple des bases sous forme protonée, et notamment des bases organiques protonées). Dans les étapes d'électrophorèse capillaires (A) et (C) précitées, on préfère le plus souvent que les espèces chargées à séparer migrent dans le capillaire à contre-flux électroosmotique. A cet effet, on préfère que la surface s interne du capillaire utilisé soit recouverte par des charges de même signe que celles des espèces chargées à séparer dans le mélange M. Ainsi, lorsque le mélange M est un mélange d'espèces chargées négativement, le capillaire mis en oeuvre est avantageusement un capillaire dont la surface interne est porteuse de charges négatives. Ainsi, il peut s'agir d'un lo capillaire ayant une paroi interne de silice vierge (qui est chargée négativement en milieu aqueux de pH supérieur à 2), cette paroi pouvant éventuellement être recouverte par des groupements protecteurs anioniques (par exemple des groupements sulfonates), ou bien par plusieurs couches de polyélectrolytes, avec une dernière couche (en contact avec le milieu interne du capillaire) à base d'un polyélectrolyte anionique, tel que, par exemple, un dextrane sulfate. Une telle modification de la surface d'un capillaire de silice par des multicouches de polyélectrolytes, est décrite notamment par H. Katayama, Y. Ishihama et al. dans Anal. Chem., 70, 2254-2260 (1998). L'utilisation de capillaire de silice de surface interne modifiée des types précités s'avère notamment avantageuse lorsque tout ou partie des composé du mélange M sont susceptibles d'interagir avec la silice, et en particulier de se fixer sur les groupements de type silanols que présente une paroi de silice. Lorsque le mélange M est un mélange d'espèces chargées positivement, le capillaire mis en oeuvre est avantageusement un capillaire dont la surface interne est porteuse de charges positives, tel qu'un capillaire de silice greffé par des groupements ammonium quaternaire, ou recouvert avec des multicouches de polyélectrolytes dont la dernière couche est un polyélectrolyte cationique tel que, par exemple, le polybrène. De façon plus générale, l'étape (A) du procédé de l'invention est une étape de séparation par électrophorèse capillaire classique, qui est avantageusement conduite de façon à séparer au mieux les constituants du mélange M, en général selon leur charge ou sélon leur rapport charge/masse. Il est des compétences du spécialiste en électrophorèse d'adapter les conditions à mettre en oeuvre pour obtenir une séparation la plus efficace possible dans l'étape (A). Pour plus de détails concernant les conditions générales de mise en oeuvre d'une électrophorèse conduite de façon à séparer un mélange de composés selon leur charge ou selon leur rapport chargelmasse, on pourra notamment se reporter à l'article de M. G. Khaledi dans High Performance Caplllary Electrophoresis, Chemical Analysis Series, vol. 146, (1998), ou à l'ouvrage précité de S. F. Y. Li "Capillary electrophoresis: principles, practice and applications", Journal of Chromatography Library, vol. 52, troisième impression (1996). io A l'issue de l'électrophorèse de l'étape (A), on obtient, de façon générale, une séparation des composés du mélange en plusieurs fractions, chacune de ces fractions comprenant les composés ayant une vitesse de migration donnée dans les conditions de l'étape (A). Chacune de ces fractions apparaît sous la forme d'un pic unique sur un électrophérogramme. Toutefois, en particulier dans le cas de mélanges complexes tels que des mélanges de protéines, chacun des pics observés contient souvent un mélange de plusieurs constituants. La fraction F isolée dans l'étape (B) est un mélange de composés ayant des vitesses de migration comprises entre deux valeurs de coupure Vmin et Vmax (avec Vmin Le plus souvent, la fraction F isolée dans l'étape (B) est un mélange de composés ayant sensiblement la même vitesse de migration dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), à savoir une fraction constituée par les composés correspondant à un des pics électrophorétiques obtenu suite à l'électrophorèse de l'étape (A). L'étape (B) consiste alors à évacuer hors du capillaire les composés ayant une vitesse de migration différente, correspondant aux autres pics de l'électrophérogramme, et l'étape (C) consiste à effectuer une séparation des constituants du mélange de composés correspondant au pic isolé dans le capillaire. L'isolation d'une fraction F constituée par les composés correspondant à un pic électrophorétique unique s'avère souvent avantageuse, notamment dans la mesure où elle présente l'avantage d'éviter tout phénomène de recouvrement de pics lors de la séparation électrophorétique de l'étape (C). Toutefois, selon un mode de réalisation envisageable, la fraction F isolée dans l'étape (B) peut également être un mélange de composés correspondant à une série de pics électrophorétiques successifs obtenu suite à l'électrophorèse de l'étape (A). Dans ce cas, l'étape (B) consiste à évacuer hors du capillaire les composés correspondant aux pics de l'électrophérogramme situés avant et/ou après la série de pics à isoler. En fonction de la fraction F qu'on souhaite isoler dans l'étape (B), trois grands modes de réalisation sont envisageables pour l'étape (B). Ainsi, selon un premier mode de réalisation du procédé de l'invention, la fraction F est une fraction de tête, à savoir une fraction constituée par un mélange de composés ayant une ou des vitesse(s) de migration supérieure(s) à celle des composés qu'on fait migrer hors du capillaire. Dans ce cas, l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre uniquement l'étape (B.2), sans mettre en oeuvre l'étape (B.1). Selon ce premier mode de réalisation, la fraction F isolée dans l'étape (B) est avantageusement constituée par les composés du pic de tête observable sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A), à savoir un mélange des composés ayant la vitesse de migration (Vtête) la plus élevée dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), qui apparaissent donc en premier sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). Dans ce cas, l'étape (B.2) consiste à faire sortir du capillaire les autres composés que les composés du pic de tête, qui ont une vitesse de migration inférieure à VteteÉ Alternativement, la fraction de tête isolée dans l'étape (B) peut être constituée par les composés de deux ou plusieurs des premiers pics apparaissant sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). Le i0 cas échéant, l'étape (B.2) consiste à faire sortir du capillaire les composés correspondant aux autres pics. Pour isoler une fraction de tête, quelle que soit sa nature (composés correspondant à un unique pic électrophorétique ou à plusieurs pics), l'étape 5 (B.2) peut avantageusement consister à appliquer une surpression en sortie du capillaire, jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler. Par "application d'une surpression en sortie du capillaire", on entend, au sens de la description et des revendications, l'application d'une différence de io pression positive entre la sortie et l'entrée du capillaire. En pratique, cette différence de pression positive est généralement induite en appliquant une surpression au niveau de la sortie du capillaire. Toutefois, selon certains modes de réalisation particuliers, cette différence de pression peut également être induite en appliquant une dépression à l'entrée du capillaire, éventuellement is conjointement à une surpression à la sortie du capillaire. La "surpression en sortie du capillaire" à laquelle il est fait référence dans le présent document désigne de façon générale la différence de pression positive appliquée entre la sortie et l'entrée du capillaire. Lorsqu'une surpression est appliquée en sortie du capillaire, le diamètre du capillaire utilisé est avantageusement inférieur à 50 microns et plus préférentiellement inférieur ou égal à 30 microns et encore plus avantageusement inférieur ou égal à 20 microns, et la surpression imposée en sortie du capillaire est de préférence la plus faible possible, notamment de façon à éviter des phénomènes de dispersion, qui se traduiraient par un étalement des pics observés sur un électrophérogramme, ce qui nuirait à la qualité de la séparation obtenue. Ainsi, on préfère en général que la surpression imposée dans l'étape (B) soit une surpression inférieure à 100 millibars, et de préférence inférieure à 80 millibars, avantageusement inférieure 1 psi, (inférieure à 69 millibars) [valeurs indicatives, explicitées ci-après]. Le plus souvent, la valeur limite de la surpression imposable sans observer un étalement de pic trop important est à adapter en fonction du diamètre interne du capillaire employé. Ainsi, plus le capillaire sera fin, plus une surpression importante pourra être imposée. A titre d'exemple, pour un capillaire de diamètre interne inférieur à 20 microns (10 microns par exemple), on pourra envisager d'imposer une surpression allant jusqu'à 100 millibars, voire jusqu'à 2 psi (138 millibars) sans observer de phénomènes de dispersion trop marqués. En revanche, pour des capillaires de diamètre interne compris entre 20 et 30 microns (typiquement 25 microns), il est préférable de ne pas dépasser une surpression de 1 psi (69 millibars). Pour des capillaires de diamètre interne supérieurs à 30 microns, la surpression envisageable sans observer de phénomènes de dispersion gênant est de préférence inférieure à 0,5 psi, et encore plus avantageusement inférieure à 0,2 psi. Pour un diamètre interne de 50 microns, il est préférable de ne pas dépasser 0,1 psi. Alternativement, dans certains cas, l'étape (B.2) mise en oeuvre pour isoler une fraction de tête peut également consister à : (i) appliquer, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A), en prenant soin de ne pas recombiner la fraction F à isoler avec les autres composés séparés du mélange M; puis (ii) appliquer une surpression en sortie du capillaire jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler, le plus souvent en maintenant la différence de potentiel de l'étape (i). La mise en oeuvre des étapes (i) et (ii) précitées pour réaliser l'étape (B.2) permet notamment de limiter les phénomènes d'étalement des pics qui peut être observé lorsque (B.2) consister uniquement à appliquer une surpression en sortie du capillaire. Lorsqu'elle est mise en oeuvre, l'étape (i) est conduite pendant une durée suffisamment courte pour ne pas mener à une recombinaison du ou des pic(s) de tête à isoler avec les pics qu'on souhaite éliminer du capillaire. Lorsque la fraction F à isoler n'est pas constituée d'un seul pic de tête, mais de plusieurs, l'étape (i) est en outre avantageusement conduite pendant un temps suffisamment court pour qu'on n'observe pas de recombinaison des pics de la fraction F à isoler. En pratique, la différence de potentiel appliquée entre la sortie et l'entrée du capillaire dans l'étape (i) est en général la même différence de potentiel (en valeur absolue) que celle appliquée dans l'étape (A), mais avec un signe opposé. En d'autres termes, l'étape (i) est avantageusement conduite en inversant la polarité aux bornes du capillaire, par rapport à l'étape (A). En particulier dans ce cas, la durée de mise en oeuvre de l'étape (i) peut être facilement déterminée à l'aide d'un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A), qui donne accès à la vitesse de migration de chacun des composés et à l'espacement des différents pics entre eux. Ces deux paramètres permettent de calculer l'espacement de deux pics après inversion de la polarité pendant une durée donnée. De préférence, lorsqu'elle est mise en oeuvre, l'étape (i) est de io préférence conduite de façon à ce que l'espacement entre la fraction F à isoler et les autres pics à éliminer soit d'au moins 5 mm, et de préférence d'au moins 10 mm au sein du capillaire. Lorsqu'on met en oeuvre la succession d'étape (i) et (il) à titre d'étape (B.2) pour isoler une fraction F de tête, la surpression imposée dans l'étape (ii) à la sortie du capillaire est de préférence une surpression inférieure à 100 millibars, cette surpression étant avantageusement inférieure à 80 millibars, et avantageusement inférieure à 1 psi (69 millibars), en particulier lorsque le capillaire utilisé a un diamètre interne compris entre 20 et 50 microns. Là encore, la valeur limite de la surpression imposable dépend du diamètre interne du capillaire utilisé. Selon un deuxième mode de réalisation du procédé de l'invention, l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.1) pour évacuer une fraction de tête, puis l'étape (B.2) pour évacuer une fraction de queue, et la fraction F isolée dans l'étape (B) est alors une fraction de coeur. Selon ce deuxième mode de réalisation, la fraction de coeur F isolée est avantageusement constituée par les composés d'un des pics compris entre le pic de queue et le pic de tête observables sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A), à savoir un mélange des composés ayant une même vitesse de migration V dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), intermédiaire entre la vitesse des composés de tête (Vtête) et la vitesse des composés de queue (Vqueue). Dans ce cas, l'étape (B.1) consiste à faire sortir du capillaire tous les composés de vitesse de migration supérieure à v, et l'étape (B.2) consiste à faire sortir du capillaire tous les composés de vitesse de migration inférieure à V. Alternativement, selon ce deuxième mode, la fraction de coeur F isoléedans l'étape (B) peut être constituée par les composés de deux ou plusieurs pics intermédiaires compris entre le pic de queue et le pic de tête, à savoir un mélange des composés ayant des vitesses de migration comprise entre une valeur V' supérieure à Vqueue et une valeur V" supérieure à V' et inférieure à Vtéte dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A). Le cas échéant, l'étape (B.1) consiste à faire sortir du capillaire tous les composés de vitesse de migration supérieure à v", et l'étape (B.2) consiste à faire sortir du capillaire tous les composés de vitesse de migration inférieure à v'. Ainsi, l'isolation d'une fraction de coeur passe par une première étape (B.1) qui consiste à éliminer une fraction de tête, ce par quoi la fraction F à isoler devient la fraction de tête dans le capillaire. Dès lors, l'isolation de cette fraction F revient à isoler une fraction de tête selon l'étape (B.2), comme dans le premier mode de réalisation du procédé. Ainsi, pour isoler une fraction de coeur, l'étape (B.2) mise en oeuvre suite à l'étape (B.1) est avantageusement être conduite dans les conditions du premier mode de réalisation du procédé. Ainsi, l'étape (B.2) utilisée dans la cadre de l'isolation d'une fraction de coeur consiste de préférence à : - selon une première possibilité : appliquer une surpression en sortie du capillaire, de préférences dans les gammes avantageuse indiquées pour le premier mode de réalisation du procédé, jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler, à savoir les composés de vitesse de migration inférieure à v' dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A) ; ou - selon une deuxième possibilité, adaptée notamment pour limiter les phénomènes d'étalement des pics: (i) appliquer, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A), en prenant soin de ne pas recombiner la fraction F à isoler avec les autres composés séparés du mélange M; puis (ii) appliquer une surpression en sortie du capillaire, de préférences dans les gammes avantageuse indiquées pour le premier mode de réalisation du procédé, jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler, à savoir les composés de vitesse de migration inférieure à v' dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A). Selon un troisième mode de réalisation du procédé de l'invention, la fraction F isolée dans l'étape (B) du procédé est une fraction de queue, à savoir une fraction constituée par un mélange de composés ayant une (ou des) vitesse(s) de migration inférieure(s) à celle des composés qu'on fait migrer hors du capillaire. Dans ce cas, l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre uniquement l'étape (B.1), sans mettre en oeuvre l'étape (B.2). Selon ce premier mode de réalisation, la fraction F isolée dans l'étape (B) est avantageusement constituée par les composés du pic de queue observable sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A), à savoir un mélange des composés ayant la vitesse de migration (Vqueue) la plus faible dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), qui sortent donc en dernier lieu sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). Dans ce cas, l'étape (B.1) consiste à faire sortir du capillaire les autres composés que les composés du pic de queue, à savoir tous les composés qui ont une vitesse de migration supérieure à VtêteÉ Alternativement, la fraction de tête isolée dans l'étape (B) peut être constituée par les composés de deux ou plusieurs des derniers pics apparaissant sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). Le cas échéant, l'étape (B.1) consiste à faire sortir du capillaire les composés correspondant aux autres pics. Lorsque l'étape (B) consiste à isoler une fraction de queue au sein du 3o capillaire, la fraction de queue isolée F obtenue à l'issue de l'étape (B. 1) est en général localisée vers la sortie du capillaire, et il s'avère le plus souvent avantageux, notamment pour pouvoir effectuer une séparation efficace dans l'étape (C), de faire migrer les composés de la fraction F vers l'entrée du capillaire. De façon plus générale, il est souvent avantageux, préalablement à l'introduction du milieu séparateur de l'étape (C), de faire migrer la fraction F isolée au sein du capillaire en direction de l'entrée du capillaire, de préférence de façon à ce que la fraction isolée se situe dans le premier dixième du capillaire, de préférence dans le premier vingtième du capillaire, et typiquement, de façon à ce lo que la fraction isolée se situe à un distance de l'entrée du capillaire comprise entre 0, 5 et 2 cm et, de préférence, à une distance de l'ordre de 1 cm. En d'autres termes, on préfère en général que, dans le procédé de l'invention, l'étape (B') soit mise en oeuvre. De préférence, lorsque l'étape (B') est mise en oeuvre, la migration de la fraction 'F isolée au sein du capillaire vers l'entrée du capillaire est induite en appliquant une surpression en sortie du capillaire, en particulier lorsque l'étape (B.2) est mise en oeuvre. En fait, lorsque l'étape (B.2) et l'étape (B') sont mises en oeuvre, ces deux étapes sont en général fondues dans une seule et même étape consistant à faire migrer la fraction F à isoler le plus près possible de l'entrée du capillaire (de préférence dans le premier dixième du capillaire, et avantageusement dans le premier vingtième), ce par quoi on obtient de facto une élimination des composés de vitesse de migration inférieure à celle de la fraction F par l'entrée du capillaire. Alternativement, selon une autre variante envisageable de l'étape (B'), adaptée en particulier lorsque l'étape (B) consiste uniquement à mettre en oeuvre l'étape (B.1), la migration de la fraction F isolée au sein du capillaire vers l'entrée du capillaire peut être induite en appliquant, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A). Cette migration présente notamment l'avantage d'éviter toute possibilité de phénomènes d'élargissement du ou des pics de la fraction F du type de ceux observés lors d'un écoulement hydrodynamique induit par l'application d'une surpression en sortie du capillaire. Lorsque l'étape (B') est mise en oeuvre, il est indispensable que la migration de la fraction F vers l'entrée du capillaire soit arrêtée avant que la fraction F ne sorte du capillaire. En effet, les étapes (B) et (B') ont pour but d'isoler la fraction F au sein du capillaire. Pour éviter un départ de la fraction F à isoler vers le milieu extérieur, il peut être avantageux de disposer un détecteur à l'entrée du capillaire (ou proche de l'entrée du capillaire, typiquement à une distance de 1 à 10 cm de l'entrée), permettant de contrôler d'une part la sortie des différentes fractions à éliminer par l'entrée du capillaire, et d'autre part le maintien de la fraction F à conserver au sein du capillaire. De façon générale, il est en général indiqué que le capillaire possède de même un détecteur avant la sortie du capillaire, permettant de contrôler l'élimination des différentes fractions à éliminer par la sortie du capillaire et le maintien de la fraction F à conserver au sein du capillaire. Dans ce cadre, la plupart des dispositifs d'électrophorèse capillaire usuels peuvent être utilisés pour conduire le procédé de l'invention. Par exemple, le procédé de l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre dans un appareil d'électrophorèse capillaire de type 3DCE commercialisé par Agilent Technologie, ou bien un appareil de type PACE MDQ vendu par Beckman Coulter. Par ailleurs, de façon plus générale, le capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (C) est avantageusement un capillaire de diamètre interne compris entre 5 et 100 microns. Notamment de façon à pouvoir conduire les étapes (B2) et (B') de façon optimale, ce diamètre interne est avantageusement inférieur ou égal à 50 microns, de préférence inférieur ou égal à 40 microns, et avantageusement inférieur ou égal à 30 microns, voire, dans certains cas, inférieur à 20 microns. Il est toutefois préférable que ce diamètre interne reste égal ou supérieur à 10 microns, voire à 15 microns, notamment de façon à ne pas diminuer de façon trop importante la sensibilité de la détection en sortie de capillaire. Ainsi, à titre de capillaire avantageusement utilisable pour mettre en oeuvre le procédé de séparation selon l'invention, on peut notamment citer les capillaires de diamètre interne entre 10 et 50 microns, tels que les capillaires usuels de diamètre interne égal à 10 microns, 25 microns ou à 50 microns, les capillaires de 25 microns se révélant en particulier bien adaptés dans la plupart des cas. Par ailleurs, notamment de façon à optimiser la qualité de la séparation des étapes (A) et (C), un capillaire utilisé pour le procédé de l'invention est de préférence un capillaire de longueur la plus faible possible, de préférence inférieure à 1 ni et avantageusement inférieure à 50 cm. En général, et en io particulier lorsque l'étape (B.2) est mise en oeuvre, on préfère que la longueur du capillaire reste inférieure ou égale à 40 cm, cette longueur étant avantageusement inférieure ou égale à 35 cm, notamment pour permettre d'effectuer l'étape (B.2) sans observer de phénomènes d'élargissement de pics trop prononcés. Ainsi, typiquement, la longueur d'un capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (C) du procédé de l'invention est avantageusement compris entre 20 et 60 cm, de préférence entre 20 et 40 cm (typiquement de l'ordre de 30 à 35 cm). Ainsi qu'on l'a souligné, le procédé de l'invention permet de réaliser la séparation des constituants de nombreux mélanges. Ainsi, le procédé de l'invention peut être conduit sur tout mélange adapté à une séparation par électrophorèse. La nature du milieu séparateur introduit dans l'étape (C) peut varier en une assez large mesure en fonction de la nature exacte des constituants du mélange M et des constituants de la fraction F qu'on sépare dans l'étape (C). Toutefois, dans le cas le plus général, il s'agit avantageusement d'un composé neutre, par exemple un polymère neutre. Ainsi, selon une première variante, le mélange M séparé en différents constituants selon le procédé de l'invention peut être un mélange contenant des macromolécules porteuses de charge électriques, par exemple un mélange M comprenant des protéines, des peptides, des acides nucléiques tels que de l'ADN ou de l'ARN, des polysaccharides, des acides humiques, des acides fluviques, ou bien encore des polymères synthétiques. Le mélange peut ainsi être par exemple un milieu biologique (contenant des macromolécules (protéines, ADN, polysaccharides...) et des molécules de plus petite taille (peptides notamment), ou bien encore un milieu issu d'une réaction de polymérisation. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la séparation d'un mélange M de protéines. Selon cette variante particulière, l'étape (A) est avantageusement une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur ("en milieu libre"), permettant une séparation des macromolécules selon leur rapport charge/masse, le milieu séparateur MS introduit dans l'étape (C) étant alors de préférence une solution d'un polymère non chargé adaptée à une séparation des composés présent dans la fraction isolée F selon leur masse. Les polymères utilisables dans les solutions permettant une séparation des composés de la fraction f selon leur masse peuvent notamment être choisis parmi les polymères de haut poids moléculaire utilisés en électrophorèse capillaire classique pour-ce type de séparation selon la masse. Ces polymères sont, en règle générale, des polymères neutres hydrosolubles, de masse moléculaire avantageusement supérieure ou égale à 104 g/mole, et de préférence d'au moins 105 g/mole. Lorsqu'une détection par infrarouge ou ultraviolet des constituants à séparer au sein du capillaire est mise en oeuvre, ce qui est en pratique quasiment toujours le cas, il est en outre préférable que le milieu séparateur MS soit transparent à la longueur d'onde utilisée pour la détection. Pour effectuer une séparation selon la masse dans l'étape (C), on peut ainsi utiliser, à titre de milieu séparateur MS, une solution (généralement aqueuse) de cellulose hydroxyéthylée (hydroxyéthyl cellulose) ou une solution d'une autre cellulose modifiée adaptée (telle que l'hydroxy-propyl-cellulose ou l'hydroxy-propyl-methyl-celullose), ou bien encore une solution d'autres polymères adaptés, tels que, notamment, des solutions de dextrane, de pullulane, de polyoxyéthylène, de polyacrylamide ou de poly(alcool vinylique). Quelle que soit la nature du polymère utilisé, la concentration en polymère au sein du milieu MS est avantageusement au moins égale à 0,5 g/L, et le plus souvent au moins égale à 1 g/L, cette concentration étant généralement inférieure à 200 g/L, de préférence inférieure ou égale à 100 g/L. Ainsi, cette concentration peut typiquement être comprise entre 1 et 50 g/L. De façon plus générale, il est souvent avantageux que la concentration en polymère soit suffisante pour que les polymères forment au sein du milieu MS une structure enchevêtrée, notamment pour permettre une séparation selon la masse prononcée lors de l'étape (C). En particulier, le milieu MS utilisé peut être une solution de cellulose hydroxyéthylée (hydroxyéthyl cellulose), de masse moléculaire supérieure ou égale à 105 g/mole (par exemple comprise entre 2.105 et 5.105 g/mole, et typiquement de l'ordre de 2,5.105 g/mole), et de concentration supérieure ou égale à 0,3 g/l (par exemple comprise entre 4 et 6 g/I, et typiquement de l'ordre de 5 g/1). Selon une deuxième variante envisageable, le mélange M séparé en différents constituants selon le procédé de l'invention est un mélange de molécules chargées ayant une masse molaire inférieure à 1000 g/mole, telles que par exemple des peptides, des acides aminés, des molécules acides ou leurs sels (carboxylates, sulfonates, sulfates, phosphates...) ou basiques (notamment des amines ou leurs sels ammonium correspondant), ou bien encore des principes actifs. Selon cette deuxième variante, l'étape (A) est avantageusement une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur, permettant une séparation des macromolécules selon leur rapport charge/masse. Le milieu séparateur introduit dans l'étape (C) peut varier en une large mesure, est alors avantageusement: - une solution comprenant des composés chiraux non chargés, par exemple des cyclodextrines (ou dérivés de cyclodextrine comme des cyclodextrines substituées), des éthers couronnes, des antibiotiques macrocycliques comme la vacomycine, des polysaccharides chiraux tels que les maltodextrines, ou bien encore des micelles chirales neutres (par exemple des cholates, ou des déoxycholates). Dans ce cas, on effectue dans l'étape (C) une séparation des composés présents dans la fraction isolée F selon leur affinité vis-à-vis du composé chiral, ce qui conduit à une séparation des composés selon leur chiralité propre; - une solution d'un tensioactif, non ionique ou éventuellement zwitterionique utilisé dans les conditions de pH où il est non porteur de charge, avantageusement à une concentration supérieure à sa concentration micellaire critique, ce par quoi on effectue dans l'étape (C) une séparation des composés présents dans la fraction isolée F selon leur caractère hydrophobe. A titre de tensioactifs utilisables dans ce cadre, on peut notamment citer les tensioactifs neutres à tête polyoxyéthylène (tels que ceux commercialisés sous le nom générique de "Brij") ou les tensioactifs zwitterioniques tels que le DAPS (N-dodécyl-N,N-diméthyl-3- ammonio-1-propanesulfonate). De façon plus générale, tout milieu adapté à titre de milieu séparateur peut être introduit dans le capillaire lors de l'étape (C), à la condition qu'il soit introductible dans le capillaire par un flux électroosmotique et qu'il possède une vitesse de migration plus élevée que celle de la fraction F. A cet effet, de façon ls générale le milieu séparateur MS introduit lors de l'étape (C) comprend avantageusement un ou plusieurs composés non chargés. Comme on l'a souligné, le procédé de séparation de la présente invention est un procédé à la fois simple et efficace à mettre en oeuvre, qui permet le plus souvent d'obtenir une séparation particulièrement résolutive de constituants du mélange M. Le procédé de l'invention, présente en outre l'intérêt d'être conduit au sein d'un unique capillaire, ce qui permet de récupérer les composés séparés à la sortie dudit capillaire comme dans le cas d'une électrophorèse capillaire classique. Cette caractéristique permet notamment d'envisager l'analyse des constituants séparés obtenus à l'issu de l'étape (C). Pour ce faire, suite à la séparation de l'étape (C), les composés sous forme séparée sont injectés du capillaire vers un dispositif d'analyse, tel qu'un spectromètre de masse (quadrupôle, trappe d'ions, temps de vol), ou bien encore un détecteur conductimétrique ou électrochimique (injection en ligne du capillaire vers un autre dispositif d'analyse). Cette utilisation particulière du procédé constitue un autre objet spécifique de la présente invention. Différents aspects et avantages du procédé apparaîtront de façon encore plus explicite au vu des exemples donnés ci-après, et au vu des figures annexées dans lesquelles: - La Figure 1 est un schéma illustratif de la séparation effectuée dans l'exemple 1 - La Figure 2 est un schéma illustrant la séparation opérée dans l'exemple 2. EXEMPLE 1: Séparation bidimensionnelle dans un seul capillaire d'un w mélange de trois polymères anioniques (polyélectrolytes anioniques). Dans cet exemple, on a utilisé un capillaire en silice vierge, de diamètre interne de 50 microns et de longueur égale à 30 cm. Pour suivre l'évolution des séparation au sein du capillaire, on a placé un détecteur à 20 cm de l'entrée du capillaire. Selon le procédé de l'invention, on a effectué la séparation d'un mélange des trois polymères suivants: polymère P1: copolymère statistique d'acrylamide (90% en masse) et de 2-acrylamido-2-méthyl-propane-sulfonate (10% en masse) ayant un 20 taux de charge de 10% et une masse molaire de 2.105 g/mole; polymère P2: polystyrène sulfonate (taux de charge 100%) de masse molaire égale à 3,33.105 g/mole (indice de polymolécularité inférieur à 1,2) polymère P'2: polystyrène sulfonate (taux de charge 100%) de masse 25 molaire égale à 1,45.105 g/mole (indice de polymolécularité inférieur à 1,2). Le mélange testé des polymères P1, P2 et P'2 est une solution aqueuse des polymères, avec une concentration en polymère PI de 5 g/I, une concentration en polymère P2 de 0,5 g/I, et une concentration en polymère P'2 de 0,5 g/I. 1.1: Séparation électrophorétique des polymères selon leur taux de charge (première dimension de la séparation) Le polymère PI, d'une part, et les polymères P2 et P'2, d'autre part, 5 présentent des taux de charge différents qui permettent leur séparation par électrophorèse en milieu libre. Pour ce faire, on a rempli le capillaire par un tampon de séparation (tampon borate 80 mM, de pH 9,2), injecté sous pression dans le capillaire. Le capillaire a été purgé pendant 5 minutes par le tampon borate. io On a ensuite injecté dans le capillaire, hydrodynamiquement (sous une pression de 0,3 psi pendant 3 secondes), 4 nL (nanolitre) de la solution des polymères PI, P2 et P'2. On a ensuite appliqué, entre l'entrée et la sortie du capillaire, plongées dans des solutions tampons borate, une différence de potentiel de +20 kV, de 15 façon à séparer les polymères selon leur taux de charge, par électrophorèse. Dans les conditions de l'électrophorèse effectuée, la surface de silice du capillaire est chargée négativement, ce qui induit un flux électroosmotique cationique dirigé de l'entrée vers la sortie du capillaire. Les polymères anioniques migrent par conséquent à contre-flux électroosmotique. Par conséquent, le polymère le moins chargé, à savoir le polymère PI, possède une vitesse de migration supérieure à celle des deux autres polyélectrolytes P2 et P'2. On a observé, au niveau du détecteur, l'apparition d'un premier pic (pic de tête) correspondant au polymère PI, suivi par un second pic (pic de queue) correspondant au mélange des polymères P2 et P'2. 1.2: Elimination du polymère P1 (pic de tête) On a maintenu la différence de potentiel de +20 kV appliquée dans l'étape 1.1, de façon à laisser sortir du capillaire le polymère PI (pic de tête) et à ne conserver dans le capillaire les polyélectrolytes P2 et P'2 (pic de queue). Pour procéder à cette élimination, on a mesuré le temps T (de l'ordre d'un 30 peu moins de 13 minutes) mis par le polymère PI pour parcourir les 20 premiers centimètres du capillaire (de l'entrée au détecteur) et, à compter du moment où le polymère PI a été détecté, on l'a laissé migrer pendant le temps T/2 (nécessaire pour parcourir les 10 centimètres restant), plus quelques dizaines de secondes pour s'assurer que tout le polymère PI a quitté le capillaire. En pratique, on a laissé la migration s'effectuer pendant 1,7 minutes. En bilan, au cours des étapes 1.1 et 1.2, on a donc maintenu la différence de potentiel de +20 kV entre l'entrée et la sortie du capillaire durant 3 minutes. 1.3: Migration des polymères P2 et P2 isolés (pic de queue) vers l'entrée du capillaire io On a inversé la polarité entre l'entrée et la sortie du capillaire (différence de potentiel imposée de -20 kV), ce par quoi on a inversé le sens de migration des composés. Les polymères P2 et P'2 isolés dans le capillaire ont alors migré vers l'entrée du capillaire. On a observé au niveau du détecteur le retour de ces polymères, toujours sous la forme d'un pic unique et on a vérifié la disparition du pic correspondant au polymère PI. - - On a maintenu la différence de potentiel de -20 kV pendant la durée totale de migration à +20 kV effectuée dans les étapes 1.1 et 1.2, minorée de quelques secondes, de façon à s'assurer de ne pas faire sortir les composés P2 et P'2 par l'entrée du capillaire. La différence de potentiel de -20 kV a ainsi été maintenue pendant 2 minutes et 45 secondes. 1.4: Introduction d'un milieu séparateur et séparation des polymères P2 et P2 dans le capillaire (seconde dimension de la séparation), On a plongé l'entrée du capillaire dans une solution constituée par un 25 tampon borate 80 mM/L de pH égal à 9,2 et comprenant 5 g/L d'hydroxyéthylcellulose de masse molaire égale à 2,5.105 g/mole. On a appliqué une différence de potentiel de +6 kV entre l'entrée du capillaire plongée dans la solution d'hydroxyéthylcellulose, et la sortie plongée dans un tampon borate (solution aqueuse 80 mM de pH 9,2, sans polymère). On a ainsi créé un flux électroosmotique entraînant l'hydroxyéthylcellulose dans le capillaire avec une vitesse apparente supérieure à celle des polyélectrolytes P2 et P'2. L'hydroxyéthylcellulose a ainsi rattrapé les polymères P2 et P'2 au sein du capillaire, et on a obtenu une séparation des polymères P2 et P'2 selon leur taille. On a observé au niveau du détecteur une séparation des polymères P2 et P'2 selon leur masse molaire dans les nouvelles conditions de l'électrophorèse. EXEMPLE 2: Séparation bidimensionnelle dans un seul capillaire d'un mélange de quatre composés anioniques (3 polymères anioniques et une molécule anionique de plus faible taille). Dans cet exemple, on a utilisé un capillaire en silice vierge, de diamètre interne de 25 microns et de longueur égale à 30 cm. Pour suivre l'évolution des séparation au sein du capillaire, on a placé un détecteur à 20 cm de l'entrée du capillaire, comme dans l'exemple 1. Selon le procédé de l'invention, on a effectué la séparation d'un mélange 20 des quatre composés suivants: le polymère P1 de l'exemple 1; le polymère P2 de l'exemple 1; le polymère P'2 de l'exemple 1; et un composé P3: l'acide orthophtalique, ionisé sous forme d'anions 25 orthophtalate (dans les conditions de la séparation, le pH est de 9,2). Le mélange testé des composés P1, P2, P'2 et P3 est une solution aqueuses de ces composés, avec une concentration en polymère P1 de 5 gll, une concentration en polymère P2 de 0,5 g/I, une concentration en polymère P'2 de 0,5 g/l, et une concentration en composé P3 de 0,5 g/l. 2.1: Séparation électrophorétique des composés du mélange (première dimension de la séparation). On a rempli le capillaire par un tampon de séparation (tampon borate 90 mM, de pH 9,2), injecté sous pression dans le capillaire [à confirmer]. Le 5 capillaire a été purgé pendant 5 minutes par le tampon borate. On a ensuite injecté dans le capillaire, hydrodynamiquement (sous une pression de 0,3 psi pendant 12 secondes), 4 nL (nanolitres) de la solution des polymères PI, P2, P'2 et P3. On a ensuite appliqué, entre l'entrée et la sortie du capillaire, plongées io dans des solutions tampons, une différence de potentiel de + 20 kV, de façon à séparer les composés par électrophorèse. Dans les conditions de l'électrophorèse effectuée, on a observé, au niveau du détecteur, l'apparition d'un premier pic (pic de tête) correspondant au polymère PI, suivi par un second pic (pic de coeur) correspondant au mélange des polymères P2 et P'2, puis un dernier pic (pic de queue) correspondant au composé P3. 2.2: Elimination du polymère PI (pic de tête) On a maintenu la différence de potentiel de +20 kV appliquée dans l'étape 2.1, de façon à laisser sortir du capillaire le polymère PI (pic de tête) et à ne conserver dans le capillaire les polyélectrolytes P2 et P'2 (pic de coeur) et le composé P3 (pic de queue). Pour procéder à cette élimination, comme dans l'exemple 1, on a mesuré le temps T mis par le polymère PI pour parcourir les 20 premiers centimètres du capillaire (de l'entrée au détecteur) et, à compter du moment où le polymère PI a été détecté, on l'a laissé migrer pendant un temps T12, plus quelques dizaines de secondes pour s'assurer que tout le polymère PI a quitté le capillaire. En bilan, au cours des étapes 2.1 et 2.2, on a maintenu la différence de potentiel de +20 kV entre l'entrée et la sortie du capillaire pendant 4,7 minutes. 2.3: Elimination du composé P3 (pic de queue) et migration des polymères P2 et P'2 (pic de coeur) vers l'entrée du capillaire On a inversé la polarité entre l'entrée et la sortie du capillaire (différence de potentiel imposée de -20 kV), ce par quoi on a inversé le sens de migration 5 des composés. On a appliqué cette différence de potentiel durant 3 minutes. On a observé au niveau du détecteur le retour des polymères P2 et P'2, toujours sous la forme d'un pic unique, et du pic de queue correspondant au composé P3. On a vérifié la disparition du pic correspondant au polymère PI. On a ensuite continué à appliquer cette différence de potentiel de -20 kV 10 pendant 1,4 minutes tout en appliquant une surpression de 0,3 psi en sortie du capillaire. Ces étapes permettent d'évacuer le composé P3 hors du capillaire (par l'entrée) et de faire migrer les polymères P2 et P'2 vers l'entrée ducapillaire, sans les en faire sortir. - 2.4: Introduction d'un milieu séparateur et séparation des polymères P2 et P'2 dans le capillaire (seconde dimension de la séparation). On a plongé l'entrée du capillaire contenant les polymères P2 et P'2 isolés précédemment dans un tampon borate 90 mM/L de pH 9,2, contenant 5 g/L 20 d'hydroxyéthylcellulose de masse molaire égale à 2,5.105 glmole. On a appliqué une différence de potentiel de +6 kV entre l'entrée du capillaire plongée dans la solution d'hydroxyéthylcellulose, et la sortie plongée dans un tampon borate (solution aqueuse 80 mM de pH 9,2, sans polymère). On a ainsi créé un flux électroosmotique entraînant l'hydroxyéthylcellulose dans le capillaire avec une vitesse apparente supérieure à celle des polyélectrolytes P2 et P2 (migration des polyélectrolytes en mode contreélectroosmotique). L'hydroxyéthylcellulose a ainsi rattrapé les polymères P2 et P'2 au sein du capillaire, et on a obtenu une séparation des polymères P2 et P'2 selon leur taille. On a observé au niveau du détecteur une séparation des polymères P2 et P'2 selon leur masse molaire dans les nouvelles conditions de l'électrophorèse. REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation des constituants d'un mélange M comprenant des composés électriquement chargés, par électrophorèse capillaire au sein d'un unique capillaire, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : (A) selon la technique de l'électrophorèse capillaire, introduire et faire migrer les composés du mélange M au sein du capillaire, de façon à réaliser une séparation des composés du mélange M au sein du capillaire, selon leur vitesse de migration dans les conditions de l'étape (A) ; (B) isoler dans le capillaire une fraction F des composés séparés dans l'étape io (A), en mettant en oeuvre au moins l'une des étapes suivantes: (B.1) évacuer hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses de migration les plus élevées dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), en laissant migrer ces composés en sortie du capillaire; et/ou (B.2) évacuer hors du capillaire une partie des composés ayant les vitesses 15 de migration les plus faibles dans les conditions de l'électrophorèse de l'étape (A), en faisant migrer ces composés vers l'entrée du capillaire; et (C) sous l'effet d'une différence de potentiel appliquée entre l'entrée et la sortie du capillaire, introduire, dans le capillaire contenant la fraction F isolée, un milieu séparateur MS ayant une vitesse de migration supérieure à celle des composés de la fraction F, de façon à ce que ledit milieu séparateur rattrape ladite fraction F au sein du capillaire, et modifie les conditions d'électrophorèse de cette fraction, et maintenir la différence de potentiel jusqu'à obtenir une séparation des composés compris dans la fraction F en fonction de leur vitesse de migration dans les nouvelles conditions d'électrophorèse obtenues. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.2) sans mettre en oeuvre l'étape (B.1), la fraction F isolée au sein du capillaire étant alors une fraction de tête. 3. Procédé selon la revendication 2, où la fraction de tête F est constituée par les composés du pic de tête observable sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape (B.2) consiste à appliquer une surpression en sortie du capillaire, jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape (B.2) consiste à : io (i) appliquer, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A), en prenant soin de ne pas recombiner la fraction F à isoler avec les autres composés séparés du mélange M; puis (ii) appliquer une surpression en sortie du capillaire jusqu'à faire sortir par 15 l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.1) pour évacuer une fraction de tête, puis l'étape (B.2) pour évacuer une fraction de queue, la fraction F isolée au sein du capillaire étant alors une fraction de coeur. 7. Procédé selon la revendication 6, où la fraction de coeur F est constituée par les composés d'un des pics compris entre le pic de queue et le pic de tête observables sur un électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'étape (B.2) consiste à appliquer une surpression en sortie du capillaire, jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'étape (B.2) consiste à : (i) appliquer, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A), en prenant soin de ne pas recombiner la fraction F à isoler avec les autres composés séparés du mélange M; puis (il) appliquer une surpression en sortie du capillaire jusqu'à faire sortir par l'entrée du capillaire les composés ne faisant pas partie de la fraction de tête F à isoler. io 10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (B) consiste à mettre en oeuvre l'étape (B.1) sans mettre en oeuvre l'étape (B.2), la fraction F isolée au sein du capillaire étant alors une fraction de queue. 11. Procédé selon la revendication 10, où la fraction de queue F est constituée par les composés du pic de queue observable sur un 15électrophérogramme de l'électrophorèse de l'étape (A). 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que, préalablement à l'introduction du milieu séparateur de l'étape (C), on fait migrer la fraction F isolée au sein du capillaire vers l'entrée du capillaire. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la migration 20 de la fraction F isolée au sein du capillaire vers l'entrée du capillaire est induite en appliquant une surpression en sortie du capillaire. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la migration de la fraction F isolée au sein du capillaire vers l'entrée du capillaire est induite en appliquant, entre l'entrée et la sortie du capillaire, une différence de potentiel, de polarité contraire à celle de l'étape (A). 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (C) est un capillaire de diamètre interne compris entre 5 et 100 microns. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le capillaire mis en oeuvre dans les étapes (A) à (C) est un capillaire de longueur inférieure à 1 m. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, où le 5 mélange M est un mélange contenant des macromolécules porteuses de charge électriques. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le mélange M comprend des protéines, des peptides, des acides nucléiques, des polysaccharides, des acides humiques, des acides fluviques ou des polymères synthétiques. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le mélange M est un mélange de protéines. 20. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que l'étape (A) est une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur, dite "milieu libre", permettant une séparation des macromolécules selon le rapport charge/ masse, et en ce que le milieu séparateur introduit dans l'étape (C) est une solution d'un polymère non chargé adapté à une séparation des composés présent dans la fraction isolée F selon leur masse. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le milieu séparateur introduit dans l'étape (C) est une solution de cellulose hydroxyéthylée, d'une hydroxypropylcellulose, de dextrane, de pullulane, de polyoxyéthylène, de polyacrylamide ou de poly(alcool vinylique). 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, où le mélange M est un mélange de molécules chargées ayant une masse molaire 25 inférieure à 1000 g/mole. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape (A) est une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur, permettant une séparation des macromolécules selon leur rapport charge/masse, et en ce que le milieu séparateur introduit dans l'étape (C) est une solution d'un composé chiral non chargé, ce par quoi on effectue dans l'étape (C) une séparation des composés présents dans la fraction isolée F selon leur affinité vis-à-vis du composé chiral. 24. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape (A) est une étape d'électrophorèse sans milieu séparateur, permettant une séparation des macromolécules selon leur rapport charge/masse, et en ce que le milieu séparateur introduit dans l'étape (C) est une solution d'un tensioactif, ce par quoi on effectue dans l'étape (C) une séparation des composés présents io dans la fraction isolée F selon leur caractère hydrophobe. 25. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, pour l'analyse des constituants séparés à l'issue de l'étape (C), les composés séparés étant injectés du capillaire vers un dispositif d'analyse.