Brevet FR2855832A1 — publié le 20041210

La présente invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique. L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique. Le syndrome septique, réponse systémique à l'infection, représente l'une des premières causes de mortalité dans les services de réanimation. Il peut résulter d'une infection bactérienne, virale, mycosique ou parasitaire. Parmi ce syndrome septique, on distingue par ordre croissant de gravité le sepsis, le sepsis sévère et le choc septique. Un groupe d'experts a ainsi proposé en 1992 des critères de définitions de ces trois syndromes cliniques (R. C. Bone et al, The ACCP/SCCM Consensus Conférence Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest 101(6):1644-1655, 1992). : # le sepsis est ainsi une réponse systémique inflammatoire liée à une infection, # un sepsis sévère est un sepsis accompagné du disfonctionnement d'au moins un organe, # le choc septique est un sepsis sévère associé à une hypotension persistante et peut être qualifié par : o la présence d'un site infectieux identifié, o une réponse inflammatoire généralisée se manifestant par au moins trois des signes suivants : a) température supérieure à 38 C ou inférieure à 36 C ; b) rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ; c) rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ; d) nombre de leucocytes supérieur à 12000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3, o une hypotension persistante malgré des remplissages adéquats et des traitements vasopresseurs. D'une manière générale, les signes d'un sepsis, d'un sepsis sévère et d'un choc septique sont proches, et la différence entre ces 3 situations réside principalement dans l'importance de la perturbation de toutes les fonctions vitales. Lors d'un choc septique, on observe principalement une chute de pression artérielle, tachycardie, polypnée, marbrures cutanées, hypo- ou hyperthermie, frissons. Ces signes s'accompagnent également d'un dysfonctionnement d'organes "cibles" avec une altération de fonction d'organes à distance du foyer infectieux (reins, poumons, système nerveux central, appareil digestif et système hématologique le plus souvent atteints) se traduisant par une oligurie ( L'évolution d'un syndrome septique depuis le stade de sepsis vers un stade de sepsis sévère, puis de choc septique n'est pas systématique puisque environ 64% des patients septiques développent un sepsis sévère, et 23% des patients en sepsis sévère évoluent en choc septique. Avant cette étape ultime de choc septique, des traitements doivent être prescrits au patient afin d'interrompre et d'inverser le processus physiopathologique. Il faut ainsi restaurer un état hémodynamique satisfaisant et assurer une ventilation efficace. Il faut également mener de front le traitement symptomatique du choc et un traitement antibiotique adapté dès que possible aux données bactériologiques. Il apparaît ainsi que si certains patients développant un syndrome septique, et notamment un choc septique, peuvent être réanimés par un traitement relativement simple, tel qu'un traitement antibiotique de large spectre mis en place avant les résultats des analyses bactériologiques indiquant la source infectieuse, d'autres patients, développant un syndrome septique beaucoup plus grave, nécessitent un traitement drastique et coûteux, tel qu'une injection de protéine C activée, dont le coût de l'injection est très élevé. De tels traitements sont non seulement couteux, mais exposent également les patients à des risques d'effets indésirables très importants (troubles de la coagulation ...). Ce traitement ne doit donc être proposé qu'aux patients de mauvais pronostic nécessitant absolument ce traitement. De ce fait, le diagnostic précoce d'un syndrome septique est essentiel et permet de proposer un traitement adapté au patient. De plus, le pronostic du syndrome septique, et notamment d'un choc septique est primordial pour proposer à chaque patient un traitement adapté, et discriminer au plus tôt les patients présentant un syndrome septique de mauvais pronostic, et qui nécessitent une thérapie lourde, des patients de bon pronostic. Actuellement, le diagnostic et le pronostic d'un syndrome septique, et notamment d'un choc septique sont essentiellement basés sur le nombre des défaillances viscérales, la réponse au traitement symptomatique, l'accessibilité à la thérapeutique médicale et/ou chirurgicale du foyer infectieux initial et des éventuels foyers métastatiques. Ceci présente toutefois l'inconvénient de n'être applicable qu'à un stade avancé du syndrome septique, et notamment du choc septique, réduisant les chances de survie du patient. Le diagnostic et le pronostic d'un syndrome septique peuvent également être basés sur la détection de certaines protéines ou facteurs solubles impliquées dans ce syndrome. Ainsi, le dosage de certaines cytokines, impliquées lors du développement d'un syndrome septique peut être un moyen de diagnostic et de pronostic d'un syndrome septique. Certains auteurs ont ainsi décrit une corrélation positive entre la teneur plasmatique d'IL-1 (Interleukine-1) et un syndrome septique de mauvais pronostic (Thijs & Hack, Intensive Care Med 31 :S258-263, 1995). Toutefois, d'autres auteurs n'ont trouvé aucune corrélation entre l'IL- 1 et un mauvais pronostic du syndrome septique, suggérant une grande variabilité de ce facteur. De plus, des dosages élevés de TNF (Tumor Necrosis Factor) ont été associés aussi à un mauvais pronostic (Casey et al., Ann Intem Med. 1993.119:771-778). Le TNF-a puis l'IL-1(3 sont les deux premières cytokines pro-inflammatoire libérées par monocytes après le déclenchement d'un état septique. D'autres auteurs ont montré que la teneur en IL-10 (Interleukine-10) plasmatique est plus élevée chez les patients développant un sepsis de mauvais pronostic alors qu'elle décroît significativement chez les patients présentant un sepsis de bon pronostic pour ne pas être détectable chez les patients sains (Van der Poil, J. Infect. Dis. 175 :118-122, 1997). L'IL-10 est une cytokine anti inflammatoire très importante, et, qui, par sa capacité à inhiber la production du TNF-a et de l'IL-1(3 participe à la mise en place de l'état d'immuno-paralysie. Toutefois, cette augmentation de la teneur en IL-10 n'étant détectable que chez 80% des patients en choc septique, la détection unique de ce facteur reste insuffisante pour pronostiquer l'évolution du choc septique. On peut citer également le brevet US-B-6,303,321 qui décrit une méthode de pronostic de la sévérité d'un syndrome septique comprenant la mesure de la concentration sérique en HMG1 (high mobility group 1 protein) par une technique immunoblot de type ELISA. L'HMG1 est, à l'inverse du TNF-a et de l'IL-1(3, décrit comme un médiateur pro-inflammatoire tardif des syndromes septiques. Une forte concentration en HMG est corrélée à un mauvais pronostic, la concentration sérique en HMG1 n'étant pas détectée chez les patients sains. Il a par contre été décrit chez la souris une régulation post transcriptionnelle du gène HMG1, suggérant que l'expression de ce gène ne doit être analysé qu'au niveau protéique (Wang et al, Science, 1999, vol 285, p248-251). Il est toutefois important de noter que, actuellement, aucune cytokine n'est reconnue de manière consensuelle comme outil de diagnostic ou de pronostic d'un syndrome septique. La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil fiable de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que notamment un choc septique. D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le diagnostic et/ou le pronostic d'un syndrome septique peut être déterminé par l'étude de l'expression de gènes sélectionnés parmi IL-10, TGFss, HMG1, T-bet (T cell spécifie T-box transcritption factor T bet), IL-1 [3, GATA-3 (GATA - binding protein 3), TNF-a . Ainsi, l'invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins deux réactifs spécifiques d'au moins deux gènes cibles choisi parmis : IL-10, TGFss, HMG1, T-bet , IL-1(3, TNFa, GATA-3. c. on détermine l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL-1(3, TNFa, GATA-3. Au sens de la présente invention, on entend par syndrome septique, une réponse systémique à l'infection. Ce syndrome septique peut être à un stade de sepsis, sepsis sévère ou de choc septique. Préférentiellement, le syndrome septique est un choc septique. On entend par échantillon biologique, tout matériel issu du patient, susceptible de contenir un matériel biologique permettant de détecter l'expression d'un gène, et peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive ou de tissu ou de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier, tel que notamment une prise de sang. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. On entend par matériel biologique tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène, comme notamment un acide nucléique ou une protéine. L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique) tel qu'un ARNm (ARN messager). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique, et encore plus préférentiellement un ARNm (ARN messager). L'extraction du matériel biologique de l'échantillon biologique lors de l'étape a) peut être réalisée par tous les protocoles d'extraction d'acides nucléiques ou de protéines bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut notamment être réalisée par : # une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse : o WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et o WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809). # une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n 28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSilTM Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM). Préférentiellement, on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique. On entend par réactif spécifique un réactif qui réagit avec le matériel biologique afin de mettre en évidence, d'une manière directe ou indirecte l'expression d'un gène cible, qui peut être déterminé par l'analyse des ARNm issus de ce gène, ou par l'analyse de la protéine codée par ce gène. Selon l'invention, le gène cible est choisi parmi IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL-1(3, TNFa, GATA-3. A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse de la protéine codée par ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins un anticorps spécifique de la protéine codée par ce gène cible. A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse des ARNm transcrits à partir de ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification spécifique de l'ADN complémentaire de cet ARNm (on parle alors d'amorce d'amplification spécifique d'un gène cible). L'ADN complémentaire d'un ARNm peut être obtenu selon un protocole bien connu de l'homme du métier. A titre indicatif, on extrait lors de l'étape a) du procédé selon l'invention les ARN totaux (comprenant les ARN ribosomaux, les ARN de transfert, les ARNm) de l'échantillon biologique. On réalise ensuite une réaction de transcription reverse à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment complémentaire d'ADN. La réalisation d'une telle étape est bien connue de l'homme du métier. Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADN complémentaires des ARN messagers, on réalise cette étape enzymatique en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des différents ARNm afin de former un complexe polyTpolyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique. Dans la suite de l'exposé, on entend par ADNc, un ADN complementaire d'un ARN messager. Par amorce d'amplification, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible à l'aide d'amorces d'amplification spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WOA-91/02818, et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491. On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique. Préférentiellement, lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification spécifiques afin d'amplifier une région particulière de l'ADN complémentaire de l'ARNm issu du gène cible. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGF(3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG1 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMG1, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-1(3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-1 (3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif spécifique selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique d'un gène cible. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 6 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique cible. Dans la présente invention, le fragment nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n 45 (4), p. 453-458 ou Keller G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I. Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR-A-2 780 059 de la Demanderesse. Un autre mode préférentiel de détection utilise l'activité exonucléase 5'-3' d'une polymérase, tel que décrit par Holland P. M., PNAS (1991) p 7276-7280. Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WOA-95/08000 et, dans ce cas, la réaction préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de capture. Dans ce cas, le fragment nucléotidique cible peut être préalablement marqué au moyen d'un marqueur. La sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de détection et le fragment nucléotidique cible marqué. La sonde d'hybridation peut également être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde d'hybridation peut être marquée au moyen d'un marqueur .On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de capture et le fragment nucléotidique cible. Que l'on utilise une sonde dite de capture ou une sonde dite de détection, la réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéines commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l' analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADN complémentaires des ARNm issues du ou des gènes cibles que l'on souhaite analyser. Après hybridation, le support ou puce est lavé (e), par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996,274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de vingt nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 40-44 ; F.Ginot, Human Mutation, 1997, n 10, p.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n 22 (15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A- 5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'IL10 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGF(3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGI, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-1(3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-1 (3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3. Cette sonde peut être une sonde de détection ou une sonde de capture, telle que notamment une sonde de capture immobilisée sur une biopuce. Lors de l'étape c) la détermination de l'expression de gènes cibles peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier. L'expression d'un gène cible peut être analysée par l'expression des ARNm qui sont transcrits à un moment donné. Dans ce cas, le matériel biologique est un acide nucléique, et le réactif spécifique peut être indifféremment une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telles que définies précédemment. L'expression d'un gène cible peut être également analysé par l'expression des protéines codées par le gène cible. Dans ce cas, le matériel biologique est une protéine et le réactif spécifique peut être un anticorps spécifique de la protéine codée par le gène cible. L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression des gènes cibles par l'analyse de l'expression des ARNm, selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. A titre indicatif, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que défini lors de l'étape a) du procédé selon l'invention telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on amplifie spécifiquement les ADNc . Dans ce cas, le réactif spécifique utilisé comprend au moins une amorce d'amplication spécifique du gène cible, telle que définie précédemment. Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par touet autre technique d'amplification telle que définie précédemment. On peut également amplifier simultanément les ADNc de plusieurs gènes cibles : on parle alors d'amplification en multiplex. 3) on détermine l'expression du gène cible en quantifiant les ADNc. Les ADNc peuvent être quantifiés notamment par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression du gène cible des différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se referer notammant aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 :386-401. On peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante: 1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que défini lors de l'étape a) du procédé selon l'invention telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc) 2) on immobilise les ADNc sur une membrane 3) on détermine l'expression du gène cible en hybridant les ADNc à des sondes d'hybridation spécifiques du gène cibl, e préalablement marquées. De telles techniques d'hybridation sont bien connues de l'homme du métier, et on peut citer notamment la technique du Northem blot. Cette réaction d'hybridation peut être réalisée après une étape d'amplification spécifique des ADN complémentaires des ARN messagers d'un gène cible lorsque notamment le gène est faiblement exprimé. On peut également utiliser une biopuce afin d'étuder simultanement l'expression de plusieurs gènes cibles. L'analyse de l'expression d'un gène cible permet alors de disposer d'un outil pour le diagnostic et/ ou le pronostic d'un syndrome septique. On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le pronostic de son syndrome septique, et en comparant avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de mauvais pronostic, déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitemen adapté. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins deux réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : TGFss, HMG1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose, lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois, préférentiellement d'au moins quatre et encore plus préférentiellement d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, réactif spécifique du gène T-bet ; spécifique du gène IL-1(3, réactif spécifique du gène TNFa, réactif spécifique du gène GATA-3, et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins 3 préférentiellement d'au moins 4 et encore plus préférentiellement d'au moins 5 gènes choisis parmi IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL- 1ss, TNF[alpha], GATA-3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, réactif spécifique du gène IL-1(3 et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins trois gènes cibles choisis parmi : TGFss, HMG 1, IL-1(3. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, réactif spécifique du gène IL-1(3, réactif spécifique du gène d'IL-10 et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : TGFss, HMG1, IL-1(3, IL-10. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, réactif spécifique du gène IL-1ss, réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène T-bet et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins cinq gènes cibles choisis parmi : TGFss, HMG1, IL-1(3, IL-10, T-bet. L'invention concerne également un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que défini précédemment, selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient, tel que défini précédemment, et on extrait du matériel biologique, tel que défini précédemment, de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi les gènes suivants : T-bet ; GATA-3. c. on détermine l'expression, telle que définie précédemment, d'au moins un gène cible choisi parmi : T-bet, GATA-3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique est une amorce d'amplification, telle que définie précédemment, spécifique d'un gène choisi T-bet, GATA 3 . Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de T-bet, ou de GATA 3 est une sonde d'hybridation telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles T-bet, et GATA 3. L'invention concerne également un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique du gène HMG1 c. on détermine l'expression des ARNm du gène HMG1. Il est bien évident que dans ce procédé, on ne souhaite pas détecter l'expression du gène HMG1 au niveau proteique mais uniquement au niveau des ARNm. Préférentiellement, le réactif spécifique du gène HMG1 est une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telle que définie précédemment. L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que défini précédemment, comprenant au moins deux réactifs spécifiques d'un gène choisi parmi : IL-10, TGFss, HMG1, T-bet , IL-1(3, TNFa, GATA-3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ce kit comprend au moins 3, préférentiellement au moins 4 et encore plus préférentiellement au moins 5 réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMGI, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène IL-1 (3, réactif spécifique du gène TNFa, réactif spécifique du gène GATA-3. Préférentiellement, le réactif spécifique de l'ILlO, de TGFb, de HMG1, de T-bet, de l'IL-lb , de TNFa et/ou de GATA 3 est une amorce d'amplification, telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles IL10, TGFb, HMG1, T-bet, l'IL-lb , TNFa et GATA 3 ou une sonde d'hybridation telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles IL10, TGFb, HMG1, T-bet, l'IL-lb , TNFa et GATA 3. L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que défini précédemment, comprenant au moins un réactif spécifique, tel que défini précédemment, sélectionné parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène Tbet ; réactif spécifique du gène GATA-3. Préférentiellement, le réactif spécifique de T-bet, ou de GATA 3 est une amorce d'amplification, telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles IL 10, T-bet, et GATA 3 ou une sonde d'hybridation, telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles IL 10, T-bet, et GATA 3. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 - Etude de l'expression des gènes IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL- 1ss, TNFa, GATA-3 pour le diagnostic d'un syndrome septique L'étude a été réalisée sur 42 patients ayant développé un syndrome septique, et admis dans le service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon-Sud. Quinze volontaires sains ont également été utilisés, afin de comparer l'expression des gènes IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL-1(3, TNFa, GATA-3 dans le sang périphérique de patients sains et de patients en syndrome septique. On distinguait alors un groupe de 15 patients sains (S), et un groupe de 42 patients développant un syndrome septique (SEP) Extraction des ARN et synthèse des cDNA - Pour chaque patient, l'échantillon biologique était un prélèvement sanguin, été régulièrement obtenu pendant les 11premiers jours suivant le début du syndrome septique développé par les patients SEP. Un prélèvement a également été effectué selon un même protocole chez les patients sains (S). Ces prélèvements ont été collecté directement dans des tubes PAXGeneTM Blood RNA (PreAnalytix, Frankin Lakes, USA). Après l'étape de prélèvement sanguin et afin d'obtenir une lyse totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 h puis conservés à -20 C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus préciment, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXGene Blood RNA# (PreAnalytix) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min, 3000g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min à 55 C). Une nouvelle centrifugation (5 min 19000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgene RNA spin column et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNAse free DNAse set (Qiagen Ltd, Crawley, UK). Pour chaque extraction, la qualité des ARN totaux a été vérifiée par une électrophorèse sur gel d'agarose et un marquage au bromure d'éthidium.Une réaction de transcription reverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 Fil. L'ARN total (1 g) a été mélangé avec 1 l de polyT à 50 M et 1 l de dNTP mix (ThermoScriptTM RT-PCR system, Invitrogen), puis incubé 5 min à 65 C. Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 4 l de 5x cDNA synthesis buffer, 1 l de RNAse out (40 U/ul), 1 l d'eau traitée au DEPC et 1 III de Thermoscript RT (15 U/ul), tous ces produits étant issus du ThermoScriptTM RT-PCR system (Invitrogen). La transcription reverse a été effectuée pendant 1 h à 50 C puis stoppée par une incubation de 5 min à 85 C. Pour finir, chaque solution de cDNA a été diluée au 1/10 dans de l'eau DEPC. Préparation des standards pour la génération des gammes de quantification - Le standard HMGI a été préparé par une amplification PCR (polymerase chain reaction) conduite jusqu'à saturation. Les amplicons obtenus ont été purifiés (PCR purification kit, Qiagen Ltd) et la présence d'un amplicon unique a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d' éthidium. Les standards du gène de ménage cyclophilin B et des gènes cibles TGFss, IL-1(3, T-bet, GATA3 et IL-10 ont été obtenus chez Search-LC (Heidelberg, Allemagne). Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel - Les ARNm des gènes cibles TGFss, IL-1[3, T-bet, GATA3, IL-10 et TNFa ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant le LightCyclerTM (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast-StartTM DNA Master SYBR Green 1 real-time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 l contenant 1 III de LC-Fast Start Reaction Mix SYBR Green I, 1 III de LC-Fast Start DNA Master SYBR Green I/Enzyme (incluant la Taq DNA polymerase, le tampon de réaction et un mélange de deoxynucleotides triphosphate), du MgCl2 (3 mM concentration finale), les amorces sens et anti-sens (0. 5 M concentration finale ; chacunes obtenues auprès de Search-LC - Heidelberg, Allemagne), et 10 l de solution de cDNA. Après une étape de dénaturation de 10 min à 95 C, l'amplification a été effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocole de "touch-down" PCR (10 s à 95 C, 10 s d'hybridation à 68-58 C, suivi d'une extension de 16 s à 72 C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée. Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCyclerTM - Roche).. Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98 C avec une augmentation de 0,l C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. La combinaison des amorces pour la quantification de HMG1 utilisée est celle décrite par Sotiriou et al (Brest Cancer Res. 2002,4:1-8 correspondant aux amorces sens : 5'- GCG GAC AAG GCC CGT TA-3' et anti-sens : 5'-AGA GGA AGA AGG CCG AAG GA-3' (produit PCR: 119 pb). Les combinaisons d'amorces nécessaires à la quantification du gène de ménage cyclophilin B et des gènes cibles TGFb, IL-lb, T-bet, GATA3 et IL-10 ont été obtenu chez Search-LC (Heidelberg, Allemagne).Ainsi, pour le gène de ménage Cyclophilin B, le n d'accesion Genbank était M60857 et on amplifiait la région 105-338. Pour l'IL-lb, le n d'accesion Genbank était M15330 et on amplifiait la région 438-642. Pour TNFa, le n d'accession Genbank était X01394, et on amplifiait la région 373-783. Pour T-bet , le n d'accession Genbank était AF241243, et on amplifiait la région 461-669. Pour GATA3, le n d'accession Genbank était X55037, et on amplifiait la région 1023-1294. Pour TGF-bl, le n d'accession Genbank était X02812, et on amplifiait la région 1540-1818. Pour IL-10, le n d'accession Genbank étaitAY029171 , et on amplifiait la région 126-413 . La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gène de ménage cyclophilin B a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCyclerTM (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond. Cinq dilutions en séries au 1/10 ont été réalisées en quadruplicate avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci dessous. Patients S Patients SEP p IL-10 0,0020 0,0002 0,0259 0,0048 0,001 TNFa 0,0176 0,0025 0,0817 0,0150 IL-10 0,8121 0,0544 1,0114 0,2110 0,43 HMG1 0,9736 0,0656 1,4807 0,0815 0,001 GATA3 0,0329 0,0026 0,0077 0,0010 0,001 T-bet 0,0002 ~ 0,0001 0,0051 0,0010 0,001 TGFss 0,5835 ~ 0,0607 0,2759 0,0200 0,001 Tableau 1 Ce tableau 1 présente le niveau d'expression des ARNm IL-10, IL-1ss, TNFa, HMG1, GATA3, TGFss et T-bet chez 15 patients sains (S) et 42 patients developpant un syndrome septique (SEP), obtenus à partir de prélèvements de sang total obtenu au cours des trois premiers jours suivant le début du syndrome septique. La comparaison entres le groupe des patients S et SEP a été effectuée à l'aide du test U non paramétrique de Mann Whitney et la valeur de probabilité (p) a été calculée. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 1 sont les moyennes obtenues la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05. Les patients SEP présentaient un niveau d'expression des ARNm IL-10 et TNFa significativement augmenté par rapport aux volontaires sains S (respectivement + 10% et + 4%). D'une manière surprenante, les inventeurs ont également montré une surexpression des ARNm d'HMGI chez les patients SEP (+ 50 %). De plus, les inventeurs ont également mis en évidence que le niveau d'expression des ARNm T-bet était significativement augmenté par rapport aux volontaires sains S (+ 24%). A l'inverse, l'expression des ARNm GATA3 était significativement diminuée chez les patients SEP par rapport aux volontaires sains S (- 70%). Conclusion - L'étude de l'expression des ARNm des gènes codant T-bet, et GATA3, mais également HMG1. à partir de prélèvements de sang total permet ainsi le diagnostic d'un patient développant un syndrome septique. Exemple 2 - Etude de l'expression des gènes IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL- 1ss, TNFa, GATA-3 pour le pronostic d'un syndrome septique Dans un deuxième temps, les inventeurs ont recherché un outil pour le pronostic d'un syndrome septique. Pour cela, une étude a été réalisée sur 42 patients développant un syndrome septique, et admis dans le service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon-Sud. Plus précisément, ces patients en syndrome septique ont été sélectionnés au cours des premières 72 h suivant le début d'un choc septique selon les critères d'inclusions de l'American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine tels que définis précédemment. Chaque patient a été suivi au cours d'une période maximum de 28 jours. On distinguait alors un groupe de 26 patients développant un syndrome septique de bon pronostic (BP), et un groupe de 16 patients développant un syndrome septique de mauvais pronostic (MP). Extraction des ARN et synthèse des cDNA - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1. Préparation des standards pour la génération des gammes de quantification - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1. Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1. Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci après. Patients MP Patients BP IL-10 0,042 0,010 0,016 0,003 0,1 TNFa 0,103 0,028 0,069 0,017 0,22 IL-1 1,147 0,530 0,928 0,117 0,14 HMGl 1,809 0,142 1,278 0,077 0,01 GATA3 0,006 0,001 0,009 0,001 - 0,25 T-bet 0,003 0,001 0,006 0,001 0,18 TGFss 0,244 0,022 0,296 0,033 0,28 Tableau 2 Ce tableau présente le niveau d'expression des ARNm IL-10, IL-1(3, TNFa, HMG1, GATA3, TGFss et T-bet chez des patients de bon pronostic (BP) et de mauvais pronostic (MP) obtenus à partir de prélèvements de sang total obtenus au cours des trois premiers jours suivant le début du choc septique. La comparaison entre le groupe des patients de bon pronostic et de mauvais pronostic a été effectuée à l'aide du test U non paramétrique de Mann Whitney et la valeur de probabilité (p) a été calculée. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 2 sont les moyennes obtenues la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05. Les patients de mauvais pronostic présentaient un niveau d'expression des ARNm IL-10, TNFa et HMG1 augmenté par rapport aux patients de bon pronostic. La différence était statistiquement significative pour l'IL-10 et HMG1. A l'inverse de l'IL-10, du TNFa et de HMG1, les patients de mauvais pronostic avaient tendance à présenter des niveaux d'expression des ARNm GATA3, T-bet, IL-1[3 et TGF(3 plus faibles que les patients de bon pronostic. Les inventeurs ont mis en évidence que l'étude d'un profil d'expression de plusieurs gènes permet d'obtenir un outil de pronostic du syndrome septique, et notamment du choc septique. A ce titre, le tableau ci dessous présente une analyse de clustering hiérarchique de 36 patients BP et MP en utilisant l'expression de 2 à 5 gènes mesurés au cours des trois premiers jours suivant le début du choc septique. La fonction de clustering hiérarchique du logiciel Spofire a été utilisée pour faire cette analyse. Les résultats utilisés pour l'analyse sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Afin de tenir compte des différences constitutives d'expression entre les gènes, les niveaux d'expression de chaque gène ont été normalisés en calculant une variable centrée réduite. Pour chacune des analyses effectuées, 2 sous clusters ont été obtenus, l'un regroupant essentiellement des patients de mauvais pronostic (MP), et l'autre, des patients de bon pronostic (BP). Le tableau 3 représente, pour chacun des 2 groupes, le pourcentage de patients clusterisés ensemble, c'est à dire le pourcentage de patients classé MP qui étaient effectivement de mauvais pronostic, et le pourcentage de patients classé BP qui étaient effectivement de bon pronostic. Gènes analysés % de patients MP bien classés % de patients BP bien classés TGFss, HMG1 82 68 TGFss, IL-1ss, HMG 82 72 IL- 10, TGFss, IL-1 , HMG1 @ 82 80 I IL-10, TGF/3, IL-1(3, HMG1, T-bet 82 80 Tableau 3 Ces résultats montrent que l'étude simultanée de l'expression de 2 gènes choisis parmi IL-10, TGFp, IL-1 (3, HMG1, T-bet, TNFa, GATA3, et notamment TGF(3 et HMG1, permet de bien classer plus de 80% des patients MP. Des résultats comparables étaient obtenus lors de l'étude simultanée de l'expression de 3 gènes choisis parmi IL-10, TGF(3, IL-1(3, HMG1, T-bet, TNFa, GATA3, et notamment TGFss, IL-1(3 et HMGI, l'étude simultanée de l'expression de 4 gènes choisis parmi IL-10, TGF(3, IL-1(3, HMG1, T-bet, TNFa, GATA3, et notamment TGFp, IL- 1ss, IL-10, et HMG1, l'étude simultanée de l'expression de 5 gènes choisis parmi IL-10, TGF(3, IL-1/3, HMG1, T-bet, TNFa, GATA3, et notamment TGFp, IL-1(3, IL-10, T-bet et HMG1 Conclusion - L'analyse du profil d'expression d'au moins deux gènes choisis parmi IL-10, TGFp, IL-1(3, HMG1, T-bet, TNFa, GATA3 à partir de prélèvements de sang total permet ainsi un pronostic précoce de la survie des patients présentant un syndrome septique, et développant notamment un choc septique. Ceci peut permettre au médecin réanimateur d'identifier rapidement les patients de mauvais pronostic et donc d'orienter la prise en charge du patients vers l'utilisation de traitements lourds et coûteux. REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins deux réactifs spécifiques, permettant de mettre en évidence l'expression d'un gène cible, sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : spécifique du gène cible IL-10, réactif spécifique du gène cible TGFss, réactif spécifique du gène cible HMG1, réactif spécifique du gène cible T-bet, réactif spécifique du gène cible IL-1(3, réactif spécifique du gène cible TNFa, réactif spécifique du gène cible GATA-3 c. on détermine l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : IL-10, TGFss, HMG1, T-bet, IL-1(3, TNFa, GATA-3. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le matériel biologique est un acide nucléique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGFss comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG1 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMG1, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-10 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-1 (3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique de l'IL 10 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGFss comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG1comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMG1, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-1 (3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-1 (3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3. 6. Kit de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'un syndrome septique comprenant au moins deux réactifs spécifiques, permettant de mettre en évidence l'expression d'un gène cible, sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFss, réactif spécifique du gène HMG1, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène IL-lp, réactif spécifique du gène TNFa, réactif spécifique du gène GATA-3. 7. Kit selon la revendication 6 selon lequel le réactif spécifique de l'IL 10 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGFss comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG1 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMG1, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL- 1ss comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-1 (3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3. 8. Kit selon la revendication 6 selon lequel le réactif spécifique de l'IL 10 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique de TGFss comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFss, le réactif spécifique de HMG comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMG1, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-1(3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-1 [3 , le réactif spécifique de TNFa comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFa et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.