Brevet FR2847474A1 — publié le 20040528

L'invention a pour objet l'utilisation de la canthin-6-one, des extraits de plantes la contenant et de certains de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des trypanosomiases, en particulier au traitement de la maladie de Chagas. En Amérique Latine, environ 90 millions de personnes vivent dans des régions où la maladie de Chagas est endémique. Environ 18 à 20 millions de personnes sont déjà infectées par l'agent responsable de cette maladie : Trypanozoma (Schizotrypanum) cruzi. Les traitements chimiothérapeutiques de cette maladie reposent à ce jour sur deux familles de molécules : les nitrofuranes, comme par exemple le nifurtimox, et les nitroimidazoles, comme par exemple le benznidazole. Ces composés peuvent avoir une efficacité sur la maladie de Chagas au début de l'infection, mais ils en ont peu ou pas du tout sur cette maladie lorsque Trypanosoma cruzi s'est installé dans l'organisme et que la maladie a pris un caractère chronique. A ce stade, cette maladie est considérée à ce jour comme incurable. Les traitements au nifurtimox et au benznidazole sont en outre confrontés à l'apparition de souches résistantes de Trypanosoma cruzi, ce qui diminue encore leur efficacité dans la phase première de la maladie de Chagas. Enfin, ces deux molécules ont des effets secondaires non négligeables tels que l'anorexie, les vomissements, la neuropathie périphérique et la dermopathie allergique. Le besoin se faisait donc sentir d'un traitement de la maladie de Chagas qui soit efficace tant dans la première phase de la maladie, où Trypanosoma cruzi est présent essentiellement dans le sang, que dans la seconde phase de cette maladie, où l'on trouve Tryponosoma cruzi essentiellement dans les organes : c#ur, système digestif. La canthin-6-one est un composé connu qui a été isolé à partir de plantes telles que : Ailanthus altissima (Simaroubaceae) par Ohmoto et al., Chem. Pharm. Bull., 1976,24, 1532-1536 ; Brucea antidysenterica (Simaroubaceae) par Fukamiya et al., Planta Med., 1987, 53, 140-143 ;Eurycoma harmandiana (Simaroubaceae) par Kachanapoom et al., Phytochemistry, 2001, 56, 383-386 ; Pegamim higellastrzct2 (Zygophyllaceae) par Ma et al., Phytochemistry, 2000, 53, 1075-1078. La canthin-6-one a été identifiée dans un extrait de Zanthoxylum elephantiasis (Rutaceae) par Mitscher et al., Lloydia, 1972, 35, 177-180. Des activités thérapeutiques de la canthin-6-one ou d'extraits végétaux la contenant ont été rapportées dans les indications suivantes : le traitement de la malaria par Kordono et al., J. Nat. Prod., 1991, 54(5), 1360-1367 ; comme agent antitumoral, par Fukamiya et al., Planta Med., 1987, 53(2), 140- 143 ; comme agent antifongique par Mitscher et al., Lloydia, 1972, 35(2), 177-180. Zanthoxylum chiloperone, d'où l'on a extrait la canthin-6-one pour la mise en #uvre de l'invention, est connu pour son utilisation en médecine traditionnelle comme antiinflammatoire, comme antipyrrhétique, contre les rhumatismes et comme antiparasitaire général. Toutefois, rien dans l'art antérieur ne laissait supposer que la canthin-6one était susceptible de constituer un traitement de la maladie de Chagas, tant dans sa phase première ou aiguë que dans sa phase chronique. L'invention a donc pour objet l'utilisation de la canthin-6-one, d'extraits de plante la contenant et de certains de ses dérivés qui seront définis ci-dessous pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des trypanosomiases, en particulier le traitement de la maladie de Chagas. La canthin-6-one a été isolée à partir de l'écorce du tronc d'une rutacée identifiée comme Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. Cette plante a été récoltée au Paraguay, près de Piribebuy dans le département de Cordillera. Un exemplaire de cette plante a été enregistré auprès de l'Herbarium de la Faculté de Chimie d'Asuncion au Paraguay sous le numéro AF917. Par un procédé qui sera décrit ci-dessous ont été isolés plusieurs extraits de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. On a également isolé la canthin-6-one elle-même à partir de cette plante. Toutefois on peut également mettre en #uvre l'invention à partir de canthin-6-one isolée des autres plantes qui la contiennent et qui ont été énumérées plus haut. On peut également utiliser des extraits de Ailanthus altissima, de Brucea antidysenterica, d'Eurycoma harmandiana, de Peganum nigellastrum ou de Zanthoxylum elephantiasis la contenant pour mettre en #uvre l'invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention les extraits de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium et l'isolement de la canthin-6-one ont été réalisés suivant un procédé comportant une première étape qui consiste à broyer les écorces séchées du tronc de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium puis à les traiter par une solution alcaline aqueuse, comme par exemple par une solution aqueuse d'ammoniaque. Le mélange obtenu est extrait par un solvant organique chloré comme par exemple du dichlorométhane. La canthin-6-one peut ensuite être isolée et purifiée par des moyens bien connus de l'homme du métier tels que l'extraction, le lavage, la chromatographie, la précipitation, la recristallisation. Le même procédé ou un procédé analogue peut être utilisé sur d'autres plantes contenant la canthin-6-one pour en obtenir des extraits comprenant la canthin-6one ou pour isoler ce composé. D'autres composés dérivés de la canthin-6-one peuvent être isolés des plantes citées ci-dessus par des méthodes analogues. On peut également préparer des dérivés de la canthin-6-one par des méthodes de synthèses bien connues de l'homme du métier en utilisant comme produit de départ la canthin-6-one ou tout autre composé approprié. En particulier, l'invention concerne les dérivés répondant à la formule (I) cidessous : (I) dans laquelle RI, R2, R3, Rua, R5, R6, R7, Rs représentent indépendamment l'un de l'autre : # un atome d'hydrogène, # un groupement alkyle en C1-C12 linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, # un atome d'halogène choisi parmi le chlore, le fluor, le brome et l'iode, # un groupement halogénoalkyle en C1-C12 dont la chaîne alkyle peut être linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, et le ou les atomes d'halogène sont choisis parmi le fluor, le chlore, le brome et l'iode, # une fonction hydroxyle, # une fonction nitro-NO # une fonction cyano-CN # une fonction-SH # une fonction acide carboxylique-COOH # une fonction amide -CONH2 # une fonction amine -NH2 # une fonction alcoxy en C1-C12 dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, # une fonction ester d'alkyle en Ci -Ci 2, dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé # une fonction alkyl amide secondaire ou tertiaire dans laquelle le ou les groupements alkyle en CI-CI2 peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques, saturés ou insaturés, # une fonction alkylamine secondaire ou tertiaire dans laquelle le ou les groupements alkyle en Ci -Cipeuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques, saturés ou insaturés, # une fonction alkylthio en C,-CI2, dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé. La canthin-6-one correspond à la formule (I) dans laquelle : Ri = R2 = R3 = R4 R5 = Rô = Rv = Rg = H. On connaît deux formes de trypanosomiases, l'une est causée par l'agent Trypanosoma brucei et est plus connue sous le nom de maladie du sommeil, l'autre est causée par l'agent Trypanosoma cruzi et est connue comme la maladie de Chagas. L'invention s'intéresse préférentiellement à la préparation d'un traitement efficace contre Trypanosoma cruzi. La canthin-6-one a montré dans les tests d'activité qui sont exposés en détail ci-dessous une efficacité étonnante contre Trypanosoma cruzi, en particulier à des doses dix fois plus faibles que les doses auxquelles le benznidazole est efficace. Selon l'invention, la canthin-6-one, des extraits de plantes la contenant, ou des dérivés de la canthin-6-one, seront mis en #uvre pour traiter des individus infectés par une typanosomiase, en particulier pour traiter des individus infectés par Trypanosoma cruzi, à une dose comprise entre 0,01et 100 mg/kg/j de canthin-6-one ou d'un dérivé, de préférence entre 0,1 et 50 mg/kg/j, encore plus préférentiellement entre 1 et 20 mg/kg/j. Avantageusement, le traitement sera formulé sous forme de doses quotidiennes comprenant de 0,2 mg à 1 g de canthin-6-one ou d'un dérivé, préférentiellement de 2 à 500 mg, encore plus préférentiellement de 5 à 200 mg. La canthin-6-one, les extraits de plantes la contenant et ses dérivés peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, associés à tout véhicule pharmaceutique approprié. Préférentiellement, la canthin-6-one est administrée par voie orale. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants destinés à l'illustrer. EXEMPLES : Matériel et méthodes Les spectres UV ont été obtenus sur un spectromètre Philips PU 8720. Les spectres IR ont été mesurés sur un spectromètre Perkin-Elmer 257 dans des pastilles de KBr. Les spectres NMR 1H et 13C (CDCl3) ont été obtenus sur un appareil Bruker AC-200 or AC- 400 à une fréquence de respectivement 200 et 50 MHz ou de 400 et 100 MHz, respectively. Les EIMS et CIMS (méthane) ont été mesurés sur un spectromètre Nermag R10-10C. La CLHP semi-préparative a été faite à l'aide d'un détecteur Waters 590 relié à un enregistreur ABB SE 120, avec un système Millipore-Waters (Milford MA, USA) équipé d'une pompe 590, d'un injecteur SSV, et d'une colonne Prepak 1000 Millipore C18. Exemple 1 : Isolement de la canthin-6-one et de la 5-méthoxycanthin-6-one : Le procédé d'extraction des écorces de Zanthoxylum chiloperone est représenté sur la figure 1 : L'écorce séchée du tronc de Zanthoxylum chiloperone (1,9 kg) est traitée au dichlorométhane dans un appareil Soxhlet pour donner, après évaporation du solvant 44g d'extrait de plante. Cet extrait est redissout puis purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un mélange acétate d'éthyle/dichlorométhane (8 : 2) comme éluant. On récupère 9 fractions de 250 ml chacune, numérotées 1 à 9 dans l'ordre d'élution. Les fractions f3 à f5 sont combinées pour donner 3,2 g de la canthin-6-one après évaporation des solvants et cristallisation dans l'acétone. La fraction f6 est purifiée par CLHP préparative en utilisant comme solvant un mélange de méthanol et d'eau (7: 3) pour donner 150 mg de 5-méthoxycanthin-6-one après cristallisation dans l'acétone. Canthin-6-one C 4HgN20 : 220 La canthin-6-one cristallise dans l'acétone sous forme d'aiguilles jaune pâle. Le point de fusion (PF), déterminé sur banc de Kôfler, est de 162 C. Spectre UV : MEOH max nm (log s) (dans le MeOH à 0,05g/I) : 225 (1,70), 251 (1,35), 260 (1,40), 268 (1,40), 362 (1,33), 379 (1,29) ; (+ HC1 0,5N) : 225 (Non déterminable), 266 (1,49), 273 (1,49), 304 (1,56), 360 ; (+ NaOH IN) : 225 (Non déterminable), 251 (1,54), 259 (1,55), 267 (1,50), 362 (1,33), 379 (1,29). Spectre IR : 1665, 1630 cm-1 Spectre RMN 'H : 400 MHz (CDC13) ~ ppm : 6,90 (d, 1H, J= 9,8 Hz, Hs) ; 7,50 (td, 1H, J= 8,5 ; 7,5 et 1 Hz, H 10) ; 7,70 (td, 1H, J= 8,2 ; 8,5 et lHz, H9) ; 7,90 (d, 1H, J= 5 Hz, Hi) ; 8,00 (d, 1H, J= 9,8 Hz, H4) ; 8,10 (dt, 1H, J= 7,5 et 1 Hz, Hl) ; 8,65 (dt, 1H, J= 8,2 et 1 Hz, H8) ; 8,80 (d, 1H, J= 5 Hz, H2). Spectre RMN 13C : 50MHz (CDCI3) ~ppm : 116,4 (C,H), 117,2 (CgH), 122,6 (C11H), 124,3 (C,2), 125,7 (C10H), 129,0 (c5H), 130,1(C,3), 130,7 (C9H), 131,9 (C14), 136,2 (C3a), 139,3 (C7a), 139,6 (C4H), 145,9 (C2H), 159,0 (C6). Spectre de masse : [fragment ion] m/z (%) [M+TTa]+243 (100%) Analyse élémentaire : C : 76,42 ;H : 3,68 ;N : 12,86 %. Exemple 2 : Méthodologie des essais in vivo sur Trvpanosoma cruzi : Animaux et parasites : Les souris de type Pearl Bright sont élevées dans l'animalerie de l'Institut d'Investigations des Sciences Médicales (IICS, Asuncion, Paraguay) et sont âgées de 6 à 8 semaines lors des protocoles expérimentaux. Pour ces essais, la souche CL (clône Brener) de T. cruzi est employée sous la forme circulante du parasite (trypomastigotes). Les animaux sont infectés par voie intrapéritonéale avec 5000 parasites, cette souche produit son pic de parasites 21 à 25 jours après l'infection. Chaque semaine le nombre de parasites est contrôlé par prélèvement sanguin au niveau de la queue de la souris. Infection et traitement : Les traitements avec le benznidazole, le médicament de référence et la canthin-6-one débutent 11jours après l'infection parasitaire à raison de 50 mg/kg ou 200 mM/kg pour le benznidazole et à la concentration de 5 mg/kg ou 20 mM/kg pour la canthin-6-one. La durée des traitements est fixée à deux semaines et la voie d'administration choisie est la voie orale pour le benznidazole et la canthin-6-one, par ailleurs un groupe de souris est traité avec la canthin-6-one par voie sous cutanée. Les souris non traitées et infectées reçoivent 100 (il d'une solution saline phosphatée tamponnée. Critères d'évaluation de l'efficacité des traitements : - comptage hebdomadaire du nombre de parasites circulant dans le sang périphérique pendant la durée de l'expérimentation, soit 10 semaines, exprimé par 103 parasites par ml de sang. - observation de la mortalité, - deux évaluations sérologiques, 40 jours post-infection soit 15 jours après cessation du traitement et 68 jours post-infection soit 45 jours post-traitement. L'évaluation sérologique est effectuée à l'aide d'un test ELISA (enzyme linked immunoassay) kit Chagas, IISC, Asuncion, Paraguay. Les densités optiques sont mesurées avec un lecteur de plaques ELISA (Titerek, Unistan, 1). Etudes statistiques : La moyenne et les déviations standard de chaque groupe sont calculées, les différences entre les groupes sont déterminées par le test de Student et le test non-paramétrique d'analyse de variance de Kruskal-Wallis. Les comparaisons s'effectuent entre le groupe non traité et les groupes traités, P Les résultats sont exposés dans les tableaux 1 et II et sur les figures 2,3 et TABLEAU Efficacité de la canthin-6-one, du benznidazole sur des souris infectées expérimentalement avec Trypanosoma cruzi Evaluation parastitologique (Moyenne du nombre de parasites, 103 parasites/ml de sang Déviation standard) Jours post- Témoins non Benznidazole Canthin-6-one Canthin-6-one infection traités (n = 8) Oral (n = 7) Sous cutanée (n = 8) (n = 8) 4 0 0 0 11* 91 ~257 0 0 0 18* 314:i:469 35 t 99 286 516 766 719 25* 387 ~ 671 250 503 402 838 88 ~ 143 32 242 ~ 553 297 625 426 ~ 664 267 ~ 546 39 870 1902 118 193 37 58 2077 2214 45 836 1023 301 432 34 77 314 499 P=0,05 53 1273 1648 23 66 58 81 473 922 P=0,01 P=0,05 60 1050 2605 65 93 16 36 130 194 P P=0,03 P=0,02 P=0,03 * Période de traitement (deux semaines) n = nombre de souris TABLEAU II : Effet du traitement avec la canthin-6-one ou du benznidazole sur des souris Pearl Bright infectées avec T. cruzi. Evaluation sérologique (test ELISA) Sérologie Sérologie Traitement Nb Voie la sérologie négative/ 2a sérologie négative/ Souris adm. survivant # survivant Témoins non traités 8 Oral 0,3985 ~ 0,092 0/8(0%) 1,598 0/8(0% (PBS) 0.382 Benznidazole (médicament de 8 Oral 0,1692 0,1179 6/8 (75%) 0,7934 3 référence) P 0,001 0,8607 (37,5%) (50 mg) P 0.05 Canthin-6-one 7 Oral 0,1105 0,0387 7/7(100%) 0,3953 1 3 (5 mg) P 0,001 0,7531 (42,9%) P 0,05 Canthine-6-one 8 SC 0,1426 4/7(57,1%) 1,3476 ~ 2 @ ( 5 mg) 0,1447 0,6327 (33,3%) P 0,05 P 0,001 Sérologie: ELISA anti-T. cruzi. # 40 jours post-infection; 15 jours post-traitement V 68 jours post-infection; 45 jours post-traitement. Valeur de P versus témoins non traités Comme on peut le constater sur la figure 2, la canthin-6-one administrée par voie orale, à une dose de 5 mg/kg/j montre à partir du 39ème jour après l'infection parasitaire, et 15 jours après la fin du traitement, une activité bien supérieure au benznidazole employé à la dose de 50 mg/kg/j. Elle induit une éradication totale de Trypanosoma cruzi de l'organisme infecté, ce qui ne permet pas d'obtenir le benznidazole. Ces résultats sont confirmés en sérologie par le test ELISA à 15 et 48 jours après la fin du traitement comme cela est illustré sur les figures3 et 4. REVENDICATIONS 1. Utilisation de la canthin-6-one, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une trypanosomiase. 2. Utilisation de la canthin-6-one,pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une trypanosomiase selon la revendication 1, caractérisée en ce que la canthin-6-one est présente sous forme d'un extrait de plante. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la canthin- 6-one est présente sous forme d'un extrait d'une plante choisie parmi : Ailanthus altissima, Brucea antidysenterica, Eurycoma harmandiana, Peganum nigellastrum, Zanthoxylum elephantiasis et Zanthoxylum chiloperone. 4. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la canthin- 6-one est présente sous forme d'un extrait de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. 5. Utilisation de la canthin-6-one selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une trypanosomiase dans sa phase chronique et sa phase aiguë. 6. Utilisation de la canthin-6-one selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Chagas. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement d'une trypanosomiase causée par l'agent Trypanosoma brucei. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement d'une trypanosomiase causée par l'agent Trypanosoma cruzi 9. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'extrait de plante contenant la canthin-6-one est obtenu par un procédé comportant une première étape qui consiste à broyer les écorces séchées du tronc de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium puis à les traiter par une solution alcaline aqueuse. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'extrait de plante contenant la canthin-6-one est obtenue par un procédé comportant une seconde étape consistant en une extraction par un solvant organique chloré. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré à une dose comprise entre 0,01 et 100 mg/kg/j de canthin-6-one, de préférence entre 0,1 et 50 mg/kg/j, encore plus préférentiellement entre 1 et 20 mg/kg/j. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré par voie orale. 13. Utilisation d'un dérivé de la canthin-6-one répondant à la formule (I) ci-dessous : (I) dans laquelle Ri, R2, R3, Ruz,, R5, Re, R7, Rs représentent indépendamment l'un de l'autre : # un atome d'hydrogène, # un groupement alkyle en Ci -Cilinéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, # un atome d'halogène choisi parmi le chlore, le fluor, le brome et l' iode, # un groupement halogénoalkyle en Ci -Cidont la chaîne alkyle peut être linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, et le ou les atomes d'halogène sont choisis parmi le fluor, le chlore, le brome et l'iode, # une fonction hydroxyle, # une fonction nitro-NO # une fonction cyano-CN # une fonction -SH # une fonction acide carboxylique-COOH # une fonction amide -CONH2 # une fonction amine -NH2 # une fonction alcoxy en C1-C12 dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, # une fonction ester d'alkyle en Ci -Ci 2, dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé # une fonction alkyl amide secondaire ou tertiaire dans laquelle le ou les groupements alkyle en C1-C12 peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques, saturés ou insaturés, # une fonction alkylamine secondaire ou tertiaire dans laquelle le ou les groupements alkyle en C1-C12 peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques, saturés ou insaturés, # une fonction alkylthio en C1-C12 dans laquelle le groupement alkyle peut être linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une trypanosomiase.